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CN104105498A - 一种氧化ldl抑制剂 - Google Patents

一种氧化ldl抑制剂 Download PDF

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CN104105498A
CN104105498A CN201380008513.0A CN201380008513A CN104105498A CN 104105498 A CN104105498 A CN 104105498A CN 201380008513 A CN201380008513 A CN 201380008513A CN 104105498 A CN104105498 A CN 104105498A
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ldl
cell
oxidation ldl
oxidation
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CN201380008513.0A
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沢村达也
垣野明美
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National Cerebral and Cardiovascular Center
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Abstract

本发明提供了一种氧化LDL抑制剂，所述抑制剂可(i)与氧化LDL特异性结合、(ii)抑制氧化LDL的生理活性、以及(iii)抑制氧化LDL进入到细胞内。本发明所涉及的氧化LDL抑制剂的有效成分为Del-1蛋白质。Del-1蛋白质由一些氨基酸序列组成，例如，序列编号1所示的氨基酸序列。

Description

一种氧化LDL抑制剂
技术领域
本发明涉及氧化低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)抑制剂领域，该抑制剂可(i)与氧化LDL特异性结合、(ii)抑制氧化LDL进入到细胞内、以及(iii)抑制氧化LDL依赖性的细胞反应。本发明所涉及的氧化LDL抑制剂，靶向作用于氧化LDL，并抑制氧化LDL与其受体的相互作用。
背景技术
已知，低密度脂蛋白经氧化所生成的氧化LDL，会促进动脉硬化的进展，通过降低血液中氧化LDL的量，可起到抗动脉硬化作用。例如，公开了一种动脉硬化预防剂，按照干燥重量换算，其以含有低于重量的95％的原花青素的松树皮提取物为有效成分(例如，参考专利文献1)。松树皮提取物能有效地抑制血管中脂类的氧化，因此，服用松树皮提取物，可降低血液中氧化LDL的含量。
另一方面，有关氧化LDL促进动脉硬化进展的作用，被认为是由于氧化LDL通过凝集素样氧化LDL受体(LOX-1：Lectin-like oxidized low densitylipoprotein receptor1)进入到血管内皮细胞中而产生的。LOX-1已被鉴定为血管内皮细胞的氧化LDL受体，但是，目前我们所了解到的是，LOX-1是一种促进炎症、动脉硬化、血栓、心肌梗死、导管治疗后的血管再狭窄的心血管疾病的因子。总而言之，通过抑制氧化LDL与LOX-1的结合、以及氧化LDL进入到血管内皮细胞，也可获得抗动脉硬化的效果。
现有技术中，含有这类LOX-1抑制作用的预防剂，是一种含有以凤尾蕨科凤尾草植物提取物为有效成分的、具有LOX-1对抗作用的组成物(例如，参考专利文献2)，或者是含有以蜜柑科植物提取物为有效成分的、具有LOX-1对抗作用的动脉硬化抑制剂(例如，参考专利文献3)，或者是具有LOX-1对抗作用的、以三聚体以上的原花青素为有效成分的凝集素样氧化型LDL受体抑制药物(例如，参考专利文献4)等。
但是，现有技术中，发展型内皮蛋白质1(developmental endotheliallocus-1，以下称“Del-1”)是在血管内皮细胞或巨噬细胞中表达、分泌的蛋白质中的一种。Del-1具有以下几个特点。
(1)Del-1在脑或肺组织中高度表达(例如，参考非专利文献1)。
(2)Del-1通过Del-1的C末端的C1、C2结构域与磷脂酰丝氨酸(PS)相结合，促进巨噬细胞吞食凋亡细胞(例如，参考非专利文献2)。
(3)Del-1会促进血管新生(例如，参考非专利文献3)。
(4)Del-1抑制白细胞与内皮细胞的黏合(抗炎作用)(例如，参考非专利文献1)。
(5)可通过损伤血管或低氧状态诱导Del-1的表达(例如，参考非专利文献4)。
早期技术文献
专利文献
【专利文献1】日本专利公开公告“专利公开2005-23032号公报(公开日：2005年1月27日)”
【专利文献2】日本专利公开公告“专利公开2007-297381号公报(公开日：2007年11月15日)”
【专利文献3】日本专利公开公告“专利公开2007-320956号公报(公开日：2007年12月13日)”
【专利文献4】日本专利公开公告“专利公开2011-6326号公报(公开日：2011年1月13日)”
非专利文献
【非专利文献1】Choi EY et al.Del-1,an endogenousleukocyte-endothelial adhesion inhibitor,limits inflammatory cellrecruitment.Science 2008,Vol.322,no.5904,p1101-1104。
【非专利文献2】Hanayama R et al.Expression of developmentalendothelial locus-1in a subset of macrophages for engulfment of apoptoticcells.The Journal of imuunology 2004,vol.172,no.6,p3876-3882。
【非专利文献3】Penta K et al.Del1induces integrin signaling andangiogenesis by ligation of alphaVbeta3.JBiol.Chem.,1999,Vol.274,no.16,p11101-11109。
【非专利文献4】Rezaee M et al.Del1mediates VSMC adhesion,migration,and proliferation through interaction with integrin alpha(v)beta(3).AmJ Physiol Hert Circ Physiol 2002,vol.282,no.5,p1924-1932。
【非专利文献5】Scheurer SB et al.Modulation of gene expression byhypoxia in human umbilical cord vein endothelial cells:A transcriptomicand proteomic study.Proteomics 2004,vol.4,no.9,p1737-1760。
【非专利文献6】Steinbrecher UP.Receptors for oxidized low densitylipoprotein.Biochim Biophys Acta.1999,vol.436,no.3,p279-298。
发明内容
众所周知，氧化LDL进入到细胞内时，不仅仅是通过LOX-1进行，而且还会通过一种称为清道夫受体的一组氧化LDL受体进行(参考非专利文献6)。除LOX-1以外的氧化LDL受体，还存在以下几种，例如清道夫受体A(scavengerreceptor-A I/II，SR-A)、CD36、B族I型清道夫受体(scavenger receptor classB type I，SR-BI)等。
专利文献2-4中所记载的药物，为抑制LOX-1的药物，因此，这种药物对于通过LOX-1摄取氧化LDL的细胞是有效的，但是，未必对通过其他氧化LDL受体摄取氧化LDL的细胞有效。因此，仅仅依靠专利文献2-4中所记载的药物，有时未必是一种有效治疗动脉硬化的方法。
为了解决上述问题，需要分别准备抑制各种氧化LDL受体的抵抗体、或者是准备一种能够有效抑制全部氧化LDL受体的单一性抵抗体。但是，这类抵抗体目前尚未被发现。
因此，本发明所要解决的问题在于提供一种氧化LDL抑制剂，该氧化LDL抑制剂，并不是以氧化LDL受体为靶向物，而是以氧化LDL本身为目标起作用，进而抑制氧化LDL受体与氧化LDL的结合。
本发明的发明人等，为了得到所述的抑制剂，进行了各种深入研究，最终发现血管内皮细胞或巨噬细胞中分泌的蛋白质Del-1，这种蛋白质具有以下特性，即可(i)与氧化LDL特异性结合、(ii)抑制氧化LDL进入到细胞内、以及(iii)可抑制氧化LDL依赖性的细胞反应，至此本发明完成。也就是说，本发明包括以下几个发明。
本发明所涉及的氧化LDL抑制剂，其有效成分中含有Del-1(Developmentalendothelial locus-1)蛋白质。
本发明所涉及的氧化LDL抑制剂中，所述Del-1蛋白质，可以是
(a)由序列编号1所示氨基酸序列组成的蛋白质，或者
(b)由新的氨基酸序列组成的、且具有氧化LDL抑制活性的蛋白质，该新的氨基酸序列由序列编号1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加而获得。
而且，本发明也包括，含有所述本发明涉及的氧化LDL抑制剂的药学组成物。
本发明中得到的氧化LDL抑制剂，并不是如以前所知的药物一样，以氧化LDL受体为靶向物，而是以氧化LDL本身为目标进行结合，进而抑制氧化LDL进入到细胞内。因此，发明人认为，本发明中得到的氧化LDL抑制剂，可以抑制所有的通过氧化LDL受体摄取氧化LDL的细胞。所以，本发明中得到的氧化LDL抑制剂，将有可能成为有效治疗或预防因氧化LDL引起的动脉硬化性疾病等的药物。
而且，更为让大家惊叹的是，本发明中得到的氧化LDL抑制剂，可抑制氧化LDL依赖性细胞反应(例如，NF-κB以及SRF的激活)。
本发明中得到的氧化LDL抑制剂中所含有的有效成分Del-1，有关其存在上述作用的情况，人们此前对其一概不知，这种新型作用是由本发明的发明者新发现的。因此，即使是同行技术人员也无法轻易地完成本发明，而且，本发明所起到的效果，也是同行技术人员所无法预想得到的。
附图说明
图1表示Del-1的结构以及氨基酸序列。
图2中(a)表示对ELISA检测Del-1与LDL或氧化LDL结合的原理进行说明的概念图，图2中(b)表示对结合LDL或氧化LDL后的Del-1进行ELISA检测的结果。
图3表示对Del-1影响LDL受体表达细胞或LOX-1表达细胞摄取氧化LDL或LDL进行评价的结果，图3中(a)表示在不存在Del-1的条件下，对LDL受体表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3中(b)表示在Del-1存在条件下(30μg/ml)，对LDL受体表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3中(c)表示在不存在Del-1的条件下，对LOX-1表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3中(d)表示在Del-1存在条件下(30μg/ml)，对LOX-1表达细胞摄取DiI标记氧化LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3中(e)表示对LDL受体表达细胞，在Del-1不存在或存在(30μg/ml)条件下，摄取DiI标记LDL的细胞的荧光强度、以及对LOX-1表达细胞，在Del-1不存在或存在(30μg/ml)条件下，摄取DiI标记氧化LDL的细胞的荧光强度。
图4表示Del-1是否可以抑制各种氧化LDL受体表达细胞(LOX-1表达细胞、SR-A表达细胞、CD36表达细胞、SR-BI表达细胞)摄取氧化LDL的研究结果。
图5表示Del-1是否可以抑制内源性表达氧化LDL受体的人血管内皮细胞(HUVEC)以及巨噬细胞(分化诱导为巨噬细胞的THP-1)摄取氧化LDL的研究结果，图5中(a)表示采用人血管内皮细胞(HUVEC)时的荧光显微镜图像以及图表，图5中(b)表示采用巨噬细胞(分化诱导为巨噬细胞的THP-1)时的荧光显微镜图像以及图表。
图6表示对Del-1抑制氧化LDL依赖性细胞反应(NF-κB以及SRF的激活)的效果进行评价的结果，图6中(a)表示对NF-κB激活的研究结果，图6中(b)表示对SRF激活的研究结果。
图7中的(a)以及(b)，表示使24周龄的野生型小鼠(图中以“WT”表示)自由摄取高脂肪饲料20周，其主动脉根部的脂质染色图像(oil Red O染色图像)，(c)以及(d)表示24周龄的Del-1过度表达小鼠(图中以“Del-1-Tg”表示)的主动脉根部的脂质染色图像(oil Red O染色图像)，(e)表示对主动脉根部所观察到的脂质沉降面积进行定量测定后的结果。
具体实施方式
以下，将对本发明进行详细阐述，但本发明的范围并不仅仅局限于这些说明，除了以下示例以外，在不影响本发明主旨的范围内，也可通过其他方式进行适当变更而得到本发明。另外，本说明书中所记载的全部已公开文献，在本说明书中将作为参考进行引用。
[本发明中得到的氧化LDL抑制剂]
本发明中得到的氧化LDL抑制剂，以含有Del-1(developmentalendothelial locus-1)蛋白质为有效成分。
已知，此处的“Del-1”是在人血管内皮细胞或巨噬细胞中表达、分泌的蛋白质(例如，参考非专利文献2)。图1表示Del-1的结构及其氨基酸序列。Del-1也被称为“Homo sapiens EGF-like repeats and discoidin I-like domains3(EDIL3)”，其氨基酸序列以及核苷酸序列，在基因数据库(Genbank)中以登录号：NM005711进行了公开。序列编号1表示Del-1的氨基酸序列、序列编号2表示其核苷酸序列。
Del-1是由480个氨基酸组成的蛋白质，从N末端开始分为S、E1、E2、E3、C1、C2结构域。“S”表示Signal peptide、“E”表示EGF-like domain、“C”表示factor5/8C-terminal domain。尤其是，Del-1在C末端的C1、C2结构域与磷脂酰丝氨酸(PS)结合，促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞食(例如，参考非专利文献2)。已知Del-1具有促进血管新生的作用(例如，参考非专利文献3)、以及抗炎症作用(例如，参考非专利文献1)。另外，在Del-1的E2中存在由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸组成的RGD序列(RGD肽)。在多种构成细胞矩阵(ECM)的蛋白质中，RGD序列是一种通用的氨基酸序列，与细胞黏合紧密相关。
本发明的发明者等，发现了Del-1的新型作用，即(i)可与氧化LDL特异性结合、(ii)可抑制氧化LDL进入到细胞内、以及(iii)可抑制氧化LDL依赖性的细胞反应，最终完成了有效成分中含Del-1的氧化LDL抑制剂的发明。
此处，本发明中的“Del-1蛋白质”，不仅仅是指(a)由序列编号1所示的氨基酸序列所组成的Del-1，而且指(b)由新的氨基酸序列组成的、且具有氧化LDL抑制活性的Del-1的突变体，该新的氨基酸序列由序列编号1所示氨基酸序列，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加而获得。在此值得说明的是，只要“Del-1蛋白质”具有氧化LDL抑制活性，就也包括上述(a)以及(b)所示的蛋白质。另外，“Del-1蛋白质”并不仅限于序列编号1所示的人源Del-1，也包括其他哺乳动物源的Del-1。例如，猴源Del-1(Genbank登录号：NM001132845等)、牛源Del-1(Genbank登录号：XM618255)、猪源Del-1(Genbank登录号：XM003123766)、鸡源Del-1(Genbank登录号：XM424906)、大鼠源Del-1(Genbank登录号：XM002728994)、小鼠源Del-1(Genbank登录号：NM001037987)等，皆可适用于本发明。而且，“Del-1蛋白质”中具有序列编号1所示氨基酸序列以外的其他氨基酸序列，且也包括与“Del-1”具有相同活性的Del-1样蛋白质。总而言之，除非本说明书中有特殊说明，则“Del-1”就是指由序列编号1所示氨基酸组成的蛋白质，“Del-1蛋白质”也表示Del-1、人源以外的Del-1、Del-1突变体、Del-1部分蛋白质、以及Del-1样蛋白质。
此处所述“经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加”，是指根据定位诱发突变方法等已公开的突变体多肽制作方法，对多个(优选10个以下、更优选7个以下、最优选5个以下)可进行取代、缺失、插入或添加的氨基酸，进行取代、缺失、插入、或添加操作。这种蛋白质突变体，并不仅局限于，具有通过已公开的突变体多肽制作方法人为导入的突变的蛋白质，也可以是天然存在的、将突变蛋白质进行单离精制操作后的物质。
在此值得说明的是，本发明中的Del-1蛋白质，也可包括附加的多肽。附加的多肽，可列举以下几种，例如，His或Myc、Flag等表位标记多肽。
另外，本发明中的Del-1蛋白质，也可以是将编码Del-1蛋白质的多核苷酸(称为“Del-1基因”)导入到宿主细胞，然后在细胞内表达该蛋白质的状态；也可以是从细胞、组织等中进行单离精制的情况。另外，Del-1蛋白质也可以是化学合成的物质。
此处所述“具有氧化LDL抑制活性”，是指Del-1的突变体具有(i)与氧化LDL特异性结合、(ii)抑制氧化LDL进入到细胞内、以及(iii)抑制氧化LDL依赖性的细胞反应的作用。有关Del-1的突变体是否具有氧化LDL抑制活性，可根据实施例中所记载的方法进行确认。
具体而言，如果可以根据实施例1所记载的方法，可以确认Del-1的突变体与氧化LDL特异性结合的话，则可判断所述(i)与氧化LDL特异性结合的事实。另外，如果根据实施例2所记载的方法，在Del-1突变体存在条件下氧化LDL对细胞内的进入，较Del-1突变体不存在条件下明显减少的话，则可判断Del-1突变体(ii)抑制氧化LDL进入到细胞内的事实。另外，如果根据实施例3所记载的方法，Del-1突变体存在条件下的NF-κB以及SRF信号，较Del-1突变体非存在条件下明显减少的话，则可判断Del-1突变体(iii)抑制氧化LDL依赖性的细胞反应的事实。在此值得说明的是，有关Del-1突变体存在条件下的数据，对于Del-1突变体不存在条件下的数据而言是否存在显著减少的情况，可通过以下进行判断，例如，实施Student t检验，如果前者数据较后者数据存在显著减少的话(危险率5％以下)，则可判断“显著减少”。
因此，同行业技术人员将能够理解记载在说明书中的“(b)由新的氨基酸序列组成的、且具有氧化LDL抑制活性的Del-1的突变体，该新的氨基酸序列由序列编号1所示氨基酸序列，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加而获得”。此外，同行业技术人员无需进行过多的实验，即可根据本说明书的记载得到Del-1的突变体。
本发明中得到的氧化LDL抑制剂中所含有的Del-1蛋白质的量，无特别限制，只要是充分的能使氧化LDL抑制活性奏效的量即可，可考虑到Del-1蛋白质的精炼度、剂型或摄取方法等，适当的进行决定。例如，在本发明中，为了能更为充分地发挥氧化LDL抑制活性，Del-1蛋白质的含有率，优选为氧化LDL抑制剂的50％(w/w)以上、更优选80％(w/w)以上、最优选100％(w/w)。
[本发明中得到的药学组成物]
本申请发明的药学组成物，含有所述本发明中得到的氧化LDL抑制剂。本发明中得到的药学组成物，可抑制氧化LDL进入到细胞内，且也可抑制氧化LDL依赖性细胞反应，因此，可以预见该药学组成物在治疗或预防氧化LDL引起的各种疾病、尤其是动脉硬化性疾病方面，起到一定的效果。
本发明中得到的药学组成物，在不影响氧化LDL抑制活性的前提下，也可以添加药学上允许的、氧化LDL抑制剂以外的其他成分(例如，药学上可接受的载体等)。
此处，将对所述“药学上可接受的载体”进行如下说明。本说明书中“药学上可接受的载体”(以下，只称为“载体”)，是指在生产药品、或农药(如兽药)时，以辅助处方为目的而采用的物质，该物质不影响有效成分。而且，在接受本发明所涉及的药学组成物的个体中，应该是无毒性的、且载体本身也不会诱导有害抗体的产生。
所述载体，采用可作为药剂材料使用的各种有机或无机载体物质，可根据后述的药学组成物的给药形式以及剂型，进行适当选择。例如，可配合固体制剂中的赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂等；液体制剂中的溶剂、溶解辅助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、舒缓剂等；防腐剂；抗氧化剂；稳定剂；调味剂等，但本发明不仅仅限于此。
所述“赋形剂”可以为以下物质，例如，乳糖、白糖、D-甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、淀粉、结晶纤维素等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述润滑剂可以为以下物质，例如，硬脂酸镁、硬脂酸钙、石蜡、滑石、胶态硅石等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“结合剂”可以为以下物质，例如，α-淀粉、甲基纤维素、结晶纤维素、白糖、D-甘露糖醇、海藻糖、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“崩解剂”可以为以下物质，例如，淀粉、羟甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉纳等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“溶剂”可以为以下物质，例如，注射用水、酒精、丙二醇、聚乙二醇、香油、玉米油、三辛酸甘油酯等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“溶解辅助剂”可以为以下物质，例如，聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“悬浮剂”可以为以下物质，例如，硬脂、月桂基硫酸钠、月桂胺基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等界面活性剂，或者聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等亲水性高分子等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“等渗剂”可以为以下物质，例如，氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“缓冲剂”可以为以下物质，例如，磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“舒缓剂”可以为以下物质，例如，苯甲醇等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“防腐剂”可以为以下物质，例如，对羟基苯甲酸酯类、丙酮氯仿、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
所述“抗氧化剂”可以为以下物质，例如，亚硫酸盐、抗坏血酸等，但无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
另外，所述稳定剂、调味剂，无特殊限定，只要是在制药领域中通常可采用的物质即可。
本发明所涉及的药学组成物，其给药形式可以是口服给药，也可以是非口服的、静脉内、直肠内或皮下给药，可根据制剂形态选择适当的给药途径。其中，从方便给药的观点来看，本发明所涉及的组成物，优选口服给药。在此值得说明的是，本说明书中，上述“非口服”是指包括脑室内、静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下以及关节内注射、以及注入给药的形式。
对本发明所涉及的药学组成物进行口服给药时，相关药学组成物(以下，也称为“口服剂”)的剂型，可以是以下几种剂型，例如，粉剂、颗粒剂、片剂、微脂粒、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、散剂等固体制剂、或糖浆剂等的液体制剂。
所述“液体制剂”的载体，可采用以下物质，例如，水；甘油、乙二醇、聚乙二醇等有机溶剂；这些有机溶剂与水的混合物等，在制药领域按照通常所采用的方法即可制得。另外，所述液体制剂，也可包括溶解辅助制剂、缓冲剂、等渗剂、稳定剂等。
所述“固体制剂”的载体，可采用以下物质，例如，赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、稳定剂、调味剂等，在制药领域按照通常所采用的方法即可制得。
配制所述口服剂时，根据使用目的，也可进一步配合润滑剂、流动促进剂、着色剂、香料等。
另外，对本发明所涉及的药学组成物进行非口服给药时，相关药学组成物(以下，也称为“非口服剂”)的剂型，可以是以下几种剂型，例如，注射剂、栓剂、丸剂、点滴剂等。相关非口服剂，可以按照制药领域已公开的方法，将本发明所涉及的药学组成物，溶解或悬浮到稀释剂(例如，注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、香油、花生油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等)中，根据使用目的，进一步添加杀菌剂、稳定剂、等渗剂、舒缓剂等进行配制。
另外，作为本发明所涉及的药学组成物的具体实施形式之一，在制药领域也可按照通常所采用的技术，制成缓释制剂。
本发明所涉及的药学组成物，可单独给药，也可联用其他药剂进行给药。本发明对联用给药的方法并无限定，可以是以下几种方法，例如，可以作为与其他药物的混合物进行给药，也可作为单独的药物与其他药物同时或并行给药，或者也可随时间的推移进行给药。
另外，本发明所涉及的药学组成物，其每天的给药次数无特殊限定。只要是本发明中得到的氧化LDL抑制剂的给药量，在每天所需的给药量的范围之内，可以一天给药一次，也可分多次给药。
在此值得说明的是，本发明中得到的药学组成物，不仅可对人体给药，也可应用于人类以外的其他哺乳类动物(例如，小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、牛、马、猪、以及猴子等)，这对于同行业技术人员而言，应该很容易理解。
本发明中得到的药学组成物中氧化LDL抑制剂(或Del-1蛋白质)的量无特别限制，只要是充分地能使氧化LDL抑制活性奏效的量即可，可考虑到Del-1蛋白质的精炼度、剂型或摄取方法、或摄取对象者的性别、年龄、体重、健康情况等因素，适当的进行决定。
为了得到氧化LDL抑制活性的效果，可以使本发明中得到的药学组成物中所含Del-1蛋白质的量如下，例如，以干燥重量计，成人每天摄取量10～3000mg、优选150～1000mg。
以下将结合实施例，对本发明的实施方式进一步详细说明。当然，本发明并不仅限于以下实施例，有关细节可能会有各种各样的实施方式，这就不用再说了。
实施例
[实施例1]通过ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay：酶联免疫吸附测定法)评价Del-1与氧化LDL的结合
(方法)
(1)Del-1
实验中所使用的人源Del-1，从R&D公司购入。该Del-1是在C末端添加His标记后的重组蛋白，经CHO细胞表达、精制而得。
(2)配制LDL
通过将健康者的血液采集到添加有ACD(acid-citrate-dextrose)缓冲液的采血管内，从该血液中分离回收血浆。向所得到的血浆中加入溴化钾，将比重调整至1.019后，在58000转/每分钟(rpm)条件下离心分离20小时。回收下层，通过溴化钾将比重调整至1.063后，在58000转/每分钟(rpm)条件下离心分离20小时。超离心机采用Beckman公司生产的L-80。
采用透析膜(Slid-A-Lyzer Dialysis Cassettes10K MWCO、Pierce公司生产)，将PBS(-)作为外液，对所回收到的上层进行透析(更换外液4次)，得到精制的人LDL。
(3)配制氧化LDL
采用BCA蛋白测定仪(BCA Protein Assay Kit，Pierce公司生产)，对精制人LDL的蛋白质量进行测定，通过PBS(-)调整浓度至3mg/ml，向该溶液中加入硫酸铜，调整浓度至7.5μM，然后，在37℃、5％CO2的培养箱内培养16小时。接着，以含2mM EDTA的0.15M氯化钠溶液作为透析外液，对该溶液进行透析(更换外液4次)，作为人氧化LDL。在此值得说明的是，在表示实施例结果的图中，有时会将氧化LDL表述为“oxLDL”。
(4)ELISA
在384孔微孔板(Greiner公司生产)中，将抗ApoB抗体(Bindingsite公司生产)固相化，通过25％Block Ace封闭液(大日本住友制药株式会社生产)进行封闭后，结合氧化LDL或LDL。用PBS(-)洗净微孔板2次后，添加经溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)稀释的Del-1，室温下使之反应1小时，通过抗His抗体(Invitrogen公司生产)检测已结合的Del-1。图2(a)表示利用ELISA检测Del-1与LDL或氧化LDL结合的原理进行说明的概念图。
(结果)
图2(b)表示通过ELISA对结合LDL或氧化LDL后的Del-1进行检测的结果。
根据图2(b)，可确认到Del-1在1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml的浓度下与氧化LDL特异性结合。另一方面，未观察到Del-1对LDL的特异性结合。
[实施例2]评价Del-1对氧化LDL进入细胞的抑制效果
(方法)
(1)制作DiI标记LDL或DiI标记氧化LDL(DiI-oxLDL)
采用含2mM EDTA的0.15M氯化钠溶液，稀释人LDL或人氧化LDL，调整至1mg/ml。分别向该溶液中添加DiI(D282，Invitrogen公司生产)调整最终浓度至0.3mg/ml、添加低脂蛋白血清(Lipoprotein deficient serum，Sigma公司生产)调整最终浓度至5mg/ml，在37℃条件下使之反应18小时。DiI采用悬浮在DMSO中的浓度为30μg/ml的溶液。
反应后，通过氯化钠以及溴化钾将比重调整至1.15，然后，在58000转/每分钟(rpm)条件下离心分离处理20小时。采用透析膜(Slid-A-Lyzer DialysisCassettes10K MWCO)，将含2mM EDTA的0.15M氯化钠溶液作为透析外液，对所回收的上层进行透析(更换外液4次)，得到DiI标记LDL或DiI标记氧化LDL。在此值得说明的是，在表示实施例结果的图中，有时会分别以“DiI-LDL”以及“DiI-oxLDL”来表述DiI标记LDL以及DiI标记氧化LDL。
(2)各种受体表达细胞
采用含10％FBS的DMEM培养基(GIBCO公司)，在37℃、5％CO2的条件下，对培养48小时后的各种细胞应用在本实施例中。各种受体表达细胞，以如下方式制作。
采用Lipofectamin2000(Invitrogen)，向COS7细胞中导入各种氧化LDL受体的表达载体或LDL受体表达载体。有关各种氧化LDL受体的表达载体或LDL受体表达载体的详细信息，如下所述。
通过在人cDNA程序库中，克隆人LOX-1cDNA(Genbank登录号：NM002543)、人SR-A cDNA(Genbank登录号：NM002445)、人CD36cDNA(Genbank登录号：NM000072)、人SR-BI cDNA(Genbank登录号：NM005505)以及人LDLR cDNA(Genbank登录号：NM000527)，来制作LOX-1表达载体(pcDNA6.2-human LOX-1-V5)、SR-A表达载体(pcDNA6.2-human SR-A-V5)、CD36表达载体(pcDNA6.2-humanCD36-V5)、SR-BI表达载体(pcDNA6.2-human SR-BI-V5)、以及LDL受体(LDLR)表达载体，然后将它们分别插入到哺乳动物表达载体pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO(Invitrogen公司生产)中，制作各种受体表达载体。在此值得说明的是，各种受体的C末端侧添加有V5标记。
(3)HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells：正常人脐静脉内皮细胞)
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)是从LONZA公司购入。培养时采用EGM-2培养基(LONZA公司生产)，在37℃、5％CO2条件下进行培养。实验中采用继代次数为7次以下的细胞。
(4)THP-1(人单核细胞白血病细胞株)
采用RPMI1940培养基(GIBCO公司生产)，该培养基包括含有20μM 10％FBS的2-Mercaptoethanol，在37℃、5％CO2条件下进行培养。实验时，在100nM PMA(Phorbol12Myristate13Acetate)存在条件下培养72小时，采用被分化诱导为巨噬细胞样的细胞。
(5)细胞摄取氧化LDL或LDL的试验
通过无血清DMEM培养基，洗净接种在384孔微孔板(Greiner公司生产)上的各种细胞后，加入Del-1与DiI标记LDL或DiI标记氧化LDL的混合液，在37℃、5％CO2条件下使其反应。通过INCell Analyzer 1000(GE healthcare公司生产)，对被摄取到细胞中的DiI标记LDL或DiI标记氧化LDL的荧光信号，进行检测、定量评价。
(结果)
就Del-1对LDL受体表达细胞或LOX-1表达细胞摄取氧化LDL或LDL的影响进行了评价，图3表示其评价结果。图3(a)表示在Del-1不存在条件下，对LDL受体表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3(b)表示在Del-1存在条件下(30μg/ml)，对LDL受体表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像。另外图3(c)表示在Del-1不存在条件下，对LOX-1表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光显微镜图像；图3(d)表示在Del-1存在条件下(30μg/ml)，对LOX-1表达细胞摄取DiI标记氧化LDL的细胞的荧光显微镜图像。
另外图3(e)表示在Del-1不存在或存在(30μg/ml)条件下，对LDL受体表达细胞摄取DiI标记LDL的细胞的荧光强度，以及在Del-1非存在或存在(30μg/ml)条件下，对LOX-1表达细胞摄取DiI标记氧化LDL的细胞的荧光强度。在图3(e)中，在Del-1存在(30μg/ml)下摄取DiI标记LDL(或DiI标记氧化LDL)时的荧光强度，以对Del-1不存在下摄取DiI标记LDL(或DiI标记氧化LDL)时的荧光强(100)度的相对值来表示。
观察Del-1对表达氧化LDL受体LOX-1的细胞摄取氧化LDL的影响时，发现Del-1在30μg/ml的浓度下，抑制了90％以上的LOX-1表达细胞对氧化LDL的摄取(根据Student t检验的显著差异检验，危险率5％以下时存在显著差异)。而另一方面，Del-1未抑制LDL受体表达细胞(LDLR表达细胞)对LDL的摄取。
另外，图4表示Del-1是否可以抑制各种氧化LDL受体表达细胞(LOX-1表达细胞、SR-A表达细胞、CD36表达细胞、SR-BI表达细胞)摄取氧化LDL的研究结果。
根据图4可知，Del-1不仅对表达LOX-1的细胞，而且对表达其他氧化LDL受体SR-A、CD36、SR-BI的细胞，也可抑制其对氧化LDL的摄取。因此，认为Del-1并不是以氧化LDL为靶向物，来抑制细胞摄取氧化LDL的，而是以氧化LDL本身为靶向物，来抑制细胞摄取的。
其次，图5表示Del-1是否可以抑制内源性表达氧化LDL受体的人血管内皮细胞(HUVEC)以及巨噬细胞(分化诱导为巨噬细胞的THP-1)摄取氧化LDL的研究结果。图5(a)表示采用人血管内皮细胞(HUVEC)时的结果，图5(b)表示采用巨噬细胞(分化诱导为巨噬细胞的THP-1)时的结果。图5(a)以及图5(b)中的照片为荧光显微镜图像，记载“+Del-1 30μg/ml”的照片，为Del-1存在(30μg/ml)条件下摄取氧化LDL时的荧光显微镜图像，未记载“+Del-130μg/ml”的照片，为Del-1不存在条件下摄取氧化LDL时的荧光显微镜图像。
根据图5可知，通过基因导入，Del-1不仅仅可以抑制强制性表达氧化LDL受体的细胞(参考图4)，而且还可抑制内源性表达氧化LDL受体的人血管内皮细胞(HUVEC)以及巨噬细胞(分化诱导为巨噬细胞的THP-1)对氧化LDL的摄取。
在此值得说明的是，在图5所示的实验中，采用了BSA作为Del-1的对照，但是，未观察到BSA的摄取抑制作用(参考图5中记载BSA的部分)。图5中记载BSA的部分显示，使BSA浓度保持在30μg/ml下，摄取氧化LDL时的DiI标记氧化LDL的摄取量。
[实施例3]评价Del-1对氧化LDL依赖性细胞反应的抑制效果
(方法)
(1)为了研究氧化LDL引起的细胞反应，采用了TetOn hLOX-1-V5-His/HA-Flag hAT1/CHO细胞(称“LOX-1-AT1/CHO细胞”)。
LOX-1-AT1/CHO细胞以如下方式进行制作。将人LOX-1cDNA(Genbank登录号：NM002543)编入到表达载体pTRE2hyg(Clontech公司生产)中，制作h LOX-1表达载体(pTRE2hyg-hLOX-1)。采用Lipofectamin2000将pTRE2hyg-hLOX-1对CHO细胞进行基因导入。为了得到稳定表达株，在100μg/ml的G418(Calbiochem公司生产)以及400μg/ml的hygromycin B(和光纯药株式会社生产)存在条件下进行培养，将因药物选择而剩余的细胞进行克隆后用于了实验中。
对上述所得到的TetOn-hLOX-1-V5His细胞，采用Lipofectamin2000共转染pTRE2hyg-HA-Flag-hAT1与pSV2bsr(Funakoshi公司生产)。为了得到稳定表达株，在hygromycin B(和光纯药株式会社生产)400μg/ml与blasticidin S100μg/ml(Funakoshi公司生产)存在条件下进行培养，将因药物选择而剩余的细胞进行克隆后用于了实验中。
对上述所得到的LOX-1-AT1/CHO细胞，采用含10％FBS、100μg/ml的G418、400μg/ml的潮霉素B(hygromycin B)、以及10μg/ml的杀稻瘟菌素S(blasticidin S)的F12培养基(GIBCO公司)，在37℃、5％CO2条件下进行培养。
(2)荧光素酶检测
在对氧化LDL引起的细胞反应进行评价时，采用了荧光素酶检测。同行业技术人员对通过氧化LDL激活NF-κB以及SRF的情况，都充分了解(例如，参考“Circulation Research.2011；108:797-807,Myocardin-RelatedTranscription Factor A Mediates OxLDL-Induced Endothelial Injury”)。将荧光素酶报告载体pGF1-NFκB或pGF1-SRF(均为System Biosciences公司生产)与pRL-CMV(Promega公司生产)混合后，采用Lipofectamin LTX(invitrogen公司生产)，对LOX-1-AT1/CHO细胞进行基因导入。基因导入16小时后，更换为含0.1％FBS以及300ng/ml的多西环素(doxycycline)的F12培养基，在5％CO2条件下培养24小时。
用PBS(-)洗净细胞后，添加含0.1％FBS和100ng/ml的多西环素(doxycycline)的200μl/well的F12培养基。在Del-1存在或不存在条件下添加氧化LDL，在0.5％CO2培养箱内使其反应20小时。
进行荧光素酶检测时，采用双荧光酶报告测定系统(Dual-LuciferaseReporter Assay System，Promega公司生产)。具体而言，是将反应后的细胞用PBS(-)洗净1次后，通过Passive lysis buffer回收细胞，溶解，在10000rpm下离心处理2分钟后，取上清作为样本。采用光度计Centro LB960(Berthold公司生产)，测定发光强度，计算出荧光虫荧光素酶/海萤荧光素酶(fireflyluciferase/Cypridina luciferase)的值。将未添加氧化LDL条件下的发光强度作为1，将各发光强度进行图表化(参考图6)。
(结果)
根据图6可知，在LOX-1-AT1/CHO细胞中，Del-1(10μg/ml以及30μg/ml的浓度)显著抑制了氧化LDL引起的NF-κB以及SRF的激活。此时，未观察到BSA的抑制作用。图6所示数据已进行显著差异检验(Student t检验)，危险率不足5％时存在显著差异的情况，在图6中附有“*”标记；危险率不足1％时存在显著差异的情况，在图6中附有“**”标记。
因此，确认到了Del-1可抑制氧化LDL依赖性细胞反应的情况。
[实施例4]评价Del-1的动脉硬化抑制效果
(方法)
(1)制作Del-1高表达小鼠
Del-1高表达小鼠(称“Del-1-Tg小鼠”)以如下方式进行制作。
通过人脑cDNA克隆人Del-1基因(序列编号2)，插入到哺乳动物表达载体pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO(Invitorogen公司生产)中，制作人Del-1表达载体pcDNA6.2-hDel-1。
Del-1-Tg小鼠的制作，通过Gordon等的方法(1980.Proc.Nalt.Acad.Sci.77:7380-7384)的改良版方法实施。也就是说，用限制酶(MfeI、SmaI)处理人Del-1表达载体(pcDNA6.2-hDel-1)，配制含CMV启动子与Del-1基因的DNA片段。将该DNA片段显微注射到C57BL/6JJcl原核阶段胚胎的雄性原核中。麻醉状态下将该DNA注入胚胎，移植到假妊娠雌性小鼠(ICR小鼠)的输卵管内，使其自然分娩，得到第一代(Founder)小鼠幼崽(Del-1-Tg小鼠)。
(2)脂质染色
使24周龄的Del-1高表达小鼠(称为“Del-1-Tg小鼠”)以及野生型小鼠，自由摄取高脂肪饲料(商品名：Atherogenic Rodoent Diet(型号：D12336)、Research Diets公司生产)20周。对这些小鼠进行解剖，从各个体中切除主动脉，通过oil Red O染色液(和光纯药工业株式会社生产)，对主动脉中的脂质进行染色。具体操作如下。
对进行20周高脂肪饮食负荷的小鼠，在异氟醚吸入麻醉状态下，进行开腹以及开胸，并使用生理盐水(大塚制药生产)灌注主动脉，然后，从小鼠体内切除主动脉。对离体主动脉，在生理盐水中用手将周边组织剥离，然后，采用4％(v/v)多聚甲醛-PBS进行固定。通过60％(v/v)异丙醇洗净以及平衡已固定的主动脉后，使用oil Red O染色液(和光纯药工业株式会社生产)，对沉降到主动脉上的脂质进行染色。然后，使用60％(v/v)异丙醇进行脱色。
对染色后的组织，进行光学显微镜观察。
(结果)
结果如图7所示。图7(a)以及(b)为自由摄取20周高脂肪饲料后的、24周龄野生型小鼠(图中以“WT”表示)的主动脉根部的脂质染色图像(oil RedO染色图像)。另外。图7(c)以及(d)为24周龄的Del-1过度表达小鼠(图中以“Del-1-Tg”表示)的主动脉根部的脂质染色图像(oil Red O染色图像)。图7(a)-(d)中，用箭头表示阳性染色部位。另外，图7(e)表示在主动脉根部中所观察到的脂质沉降面积的定量结果。
通过图7，可见Del-1-Tg小鼠中的脂质沉降现象明显少于野生型小鼠(p＜0.001)。因此，可确认到通过在小鼠中过度表达Del-1，可抑制动脉硬化的进展。也就是说，通过在药理学上采用Del-1蛋白质，存在抑制动脉硬化等循环系统疾病的可能性。
从上述阐述，发明人认为，本发明可(i)与氧化LDL特异性结合、(ii)抑制氧化LDL进入到细胞内、以及(iii)抑制氧化LDL依赖性的细胞反应。因此，本发明中得到的氧化LDL抑制剂，将有可能成为有效治疗或预防因氧化LDL引起的动脉硬化性疾病等的药物。
故，本发明可应用于某些工业领域，例如，医疗以及医药品相关工业。

Claims (3)

1.一种氧化LDL抑制剂，其特征在于，所述氧化LDL抑制剂的有效成分为Del-1蛋白质。
2.根据权利要求1所述的氧化LDL抑制剂，其特征在于，所述Del-1蛋白质是，
(a)由序列编号1所示氨基酸序列组成的蛋白质，或者
(b)由新的氨基酸序列组成的、且具有氧化LDL抑制活性的蛋白质，所述新的氨基酸序列是由序列编号1所示氨基酸序列，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、或添加而获得。
3.一种药学组成物，其特征在于，所述药学组成物包含如权利要求1或2所述的氧化LDL抑制剂。
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