CN104093423A - 使用抗pcsk9抗体的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单独用PCSK9拮抗抗体或者与他汀类药物组合治疗易感于或经诊断患有特征在于血浆中低密度脂蛋白颗粒显著升高的疾病的人类患者的给药方案。

Description

使用抗PCSK9抗体的治疗

相关申请

本申请要求2011年7月14日申请的美国临时申请号61/507,865、2012年3月22日申请的美国临时申请号61/614,312及2012年5月4日申请的美国临时申请号61/643,063的权益，所有文献全文引入本文。

发明领域

本发明涉及治疗特征在于血浆中低密度脂蛋白(LDL)颗粒显著升高的疾病的治疗方案。所述治疗方案包括施用抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)抗体，其单独施用或者与他汀类药物组合施用。所述治疗方案增强了血液中LDL-胆固醇水平的降低，可用于预防和/或治疗胆固醇和脂蛋白代谢疾病，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征及更普遍地，心血管疾病。

发明背景

在美国，数百万人有心脏病及因此发生的心脏事件的风险。尽管可针对其多个风险因素进行治疗，心血管疾病及潜在的动脉粥样硬化在所有人群中仍是致死的主要原因。动脉粥样硬化是一种动脉疾病，是工业化国家中与很多死亡相关的冠心病的原因。目前已经鉴定了一些冠心病的风险因素：血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、不良饮食、不运动及压力。临床上最相关且常见的血脂异常的特征在于伴随高胆固醇血症的β-脂蛋白(极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL)升高，不伴随或伴随高甘油三酯血症。Fredrickson et al.,1967,N Engl J Med.276:34-42,94-103,148-156,215-225及273-281。尽管用他汀类药物治疗(目前动脉粥样硬化的标准治疗)，但是长期以来，仍明显不能满足治疗心血管疾病的需要，所述心血管疾病的60-70%为心血管事件、心脏病发作和中风。此外，新的指南建议应达到更低的LDL水平以保护高危患者，使其免于过早发生心血管疾病(NationalCholesterol Education Program(NCEP)2004)。

已经表明PCSK9是血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的主要调节因子，并且已经有希望用以预防和治疗冠心病(CHD)。Hooper et al.,2011,Expert Opin Ther Targets15(2):157-68。人类遗传学研究鉴定了功能获得型突变，其与升高的血清LDL-C水平及CHD的提前和发生相关，而功能缺失型突变与低LDL-C水平及CHD危险降低相关。Abifadel,2003,Nat Genet.43(2):154-6；Cohen,2005,Nat Genet.37(2):161-5；Cohen,2006,N Engl J Med.354(12):1264-72；Kotowski,2006,Am J Hum Genet.78(3):410-22。在人体中，PCSK9的完全缺失导致低血清LDL-C<20mg/dL，在健康对象中则否。Hooper,2007,193(2):445-8；Zhao,2006,Am J Hum Genet.79(3):514-523。

PCSK9属于丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶家族，是由一个N-末端前结构域(prodomain)、一个枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和一个C-末端富半胱氨酸/组氨酸结构域(CHRD)组成。PCSK9在肝脏中高度表达，其在前结构域自催化裂解后分泌，所述前结构域保留与催化结构域的非共价结合。PCSK9的催化结构域在血清pH7.4(血清pH值)与低密度脂蛋白受体(LDLR)的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域结合，在大约pH5.5-6.0(内涵体pH值)具有更高的亲和性。Bottomley,2009,J Biol Chem.284(2):1313-23。C-末端结构域参与LDLR-PCSK9复合物的内化，而不与催化结构域结合。Nassoury,2007,Traffic8(7):950；Ni,2010,J Biol Chem.285(17):12882-91；Zhang,2008,Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(35):13045-50。PCSK9的这两种功能都是靶向进行溶酶体降解和降低LDL-C的LDLR-PCSK9复合物所需的，这与功能缺失型和功能获得型相关的两个结构域中的突变一致。Lambert,2009,Atherosclerosis203(1):1-7。

目前正在开发各种治疗方法以抑制PCSK9，包括通过siRNA或反义寡核苷酸的基因沉默以及通过抗体破坏PCSK9-LDLR相互作用。Brautbar etal.,2011,Nature Reviews Cardiology8,253-265。例如，Chan,2009和Ni,2011均报道了在小鼠和非人灵长类动物中具有降低LDL-C的活性的抗-PCSK9单克隆抗体；据报道当施用3mg/kg的PCSK9拮抗抗体时，每种抗体在非人灵长类动物中的半衰期分别为大约61小时和77小时。Chan,2009,ProcNatl Acad Sci USA106(24):9820-5；Ni,2011,J Lipid Res.52(1):78-86。已经报道了PSCK9拮抗抗体7D4有效降低食蟹猕猴(cynomolgus monkeys)血清胆固醇水平；在施用单剂10mg/kg的PCSK9拮抗抗体时，7D4在食蟹猴中的半衰期低于2天。PCT专利申请公开号WO2010/029513。

从本领域且在本发明之前可获得的信息中，仍不清楚低剂量、非频繁施用PCSK9拮抗抗体在人类患者中是否有效降低高胆固醇血症及相关CVD发生，及如果如此，为了这种体内有效性需要什么样的给药方案。

发明概述

本发明涉及通过抑制PCSK9活性及PCSK9对LDL-C血浆水平的相应作用而延长血液中LDL-C水平降低的时间的治疗方案。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗易感于或被诊断患有疾病的疾病的人类患者的方法，该疾病特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，所述方法包括给患者施用初始剂量的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，初始剂量为至少大约0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、8mg/kg、12mg/kg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或者400mg；以及给患者施用多个后续剂量的抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此间隔至少大约1、2、3或4周。本发明可以使用例如PCSK9拮抗抗体L1L3实施。在一些实施方案中，本发明可以使用这样的抗体实施，所述抗体包含来自具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区的三个CDR及来自具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR。

在一些实施方案中，初始剂量可以是大约0.25mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg或者大约1.5mg/kg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔大约1周。

在另一些实施方案中，初始剂量可以是大约2mg/kg、大约4mg/kg、大约8mg/kg或者大约12mg/kg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔至少大约2周。

在另一些实施方案中，初始剂量可以是大约50mg、大约100mg、大约150mg或者大约175mg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔至少大约2周。

在另一些实施方案中，初始剂量可以是大约3mg/kg或者大约6mg/kg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔至少大约4周。在另一些实施方案中，初始剂量可以是大约200mg或者大约300mg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔至少大约4周。在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体是经皮下施用。在一些实施方案中，PCSK9拮抗体是经静脉内施用。

在一些实施方案中，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔大约4周。在一些实施方案中，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔大约8周。多次后续剂量都可以与初始剂量大约相同或者低于初始剂量。

在一些实施方案中，所述疾病可以是高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病、冠心病或者急性冠脉综合征(ACS)。在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，人类患者的空腹总胆固醇水平可为，例如大约600mg/dL或者更高。在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，人类患者的空腹LDL胆固醇水平可例如是大约130mg/dL或者更高。在一些实施方案中，在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，人类患者的空腹LDL胆固醇水平可以是大约145mg/dL或者更高。

在一些实施方案中，患者正在用他汀类药物治疗。在一些实施方案中，患者在用日剂量的他汀类药物治疗。在一些实施方案中，在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，可以对人类患者施用有效量的他汀类药物。在一些实施方案中，在初次施用PCSK9抗体之前，给患者施用稳定剂量的他汀类药物。所述稳定剂量可以是，例如日剂量或者隔日剂量。在一些实施方案中，在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，对人类患者每日施用稳定剂量的他汀类药物，施用至少大约2、3、4、5或者6周。在一些实施方案中，在初次施用PCSK9拮抗抗体之前，施用稳定剂量的他汀类药物的人类患者的空腹LDL胆固醇水平为，例如大约70或80mg/dL或者更高水平。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的他汀类药物。

在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体的初始剂量可以是大约3mg/kg或者大约6mg/kg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔大约4周或者大约1个月。在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体的初始剂量可以是大约200mg或者大约300mg，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此可间隔大约4周或者大约1个月。

所述他汀类药物可以是，例如阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)，或者选自如下的组合治疗：辛伐他汀加依泽替米贝(ezetimibe)，洛伐他汀加烟酸，阿托伐他汀(atorvastin)加氨氯地平(amlodipine)，以及辛伐他汀加烟酸。在一些实施方案中，所述他汀类药物剂量可以是，例如40mg阿托伐他汀、80mg阿托伐他汀、20mg罗苏伐他汀、40mg罗苏伐他汀、40mg辛伐他汀或者80mg辛伐他汀。

在一些实施方案中，所述方法包括给患者施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体L1L3，所述初始剂量为至少大约3mg/kg或者大约6mg/kg；以及给患者施用多个后续剂量的抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此间隔至少大约4周，其中所述患者正在用稳定的日剂量的他汀类药物治疗。在一些实施方案中，他汀类药物的稳定的日剂量可以是40mg阿托伐他汀、80mg阿托伐他汀、20mg罗苏伐他汀、40mg罗苏伐他汀、40mg辛伐他汀或者80mg辛伐他汀。

在一些实施方案中，所述方法包括给患者施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体L1L3，所述初始剂量为至少大约200mg或者大约300mg；及给患者施用多个后续剂量的抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此间隔至少大约4周，其中所述患者正在用稳定的日剂量的他汀类药物治疗。在一些实施方案中，所述方法包括给患者施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体L1L3，所述初始剂量为至少大约50mg、大约100mg、大约150mg或者大约175mg；及给患者施用多个后续剂量的抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用彼此间隔至少大约2周，其中所述患者正在用稳定的日剂量的他汀类药物治疗。在一些实施方案中，他汀类药物的稳定的日剂量可以是40mg阿托伐他汀、80mg阿托伐他汀、20mg罗苏伐他汀、40mg罗苏伐他汀、40mg辛伐他汀或者80mg辛伐他汀。

在一些实施方案中，所述PCSK9拮抗抗体是经皮下或者静脉内施用的。

本发明还提供了制造品，其包含容器，在该容器内包含PCSK9拮抗抗体的组合物，及含有用法说明的包装插页，所述用法说明涉及施用初始剂量及至少一次与初始剂量相同或低于其的后续剂量的PCSK9拮抗抗体，所述初始剂量为至少大约0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、6mg/kg、8mg/kg、12mg/kg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或者400mg。在一些实施方案中，本发明可以使用这样的抗体实施，所述抗体包含来自具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区的三个CDR以及来自具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR。在一些实施方案中，本发明可以使用PCSK9拮抗抗体L1L3实施。

初始剂量与后续剂量的施用可以间隔例如至少大约1、2、3、4、5、6、7或者8周。在一些实施方案中，用法说明可以是，例如通过静脉内注射施用初始剂量，通过静脉内或皮下注射施用至少一次后续剂量。在另一些实施方案中，用法说明可以是，例如通过皮下注射施用初始剂量，及通过静脉内或者皮下注射施用至少一次后续剂量。

在一些实施方案中，可以施用多个后续剂量。多次后续剂量的施用可以间隔例如至少2、3、4、5、6、7或者8周。

在一些实施方案中，包装插页可进一步包括将PCSK9拮抗抗体施用正在用他汀类药物治疗的患者的用法说明。所述他汀类药物可以是，例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀，或者选自如下的组合治疗：辛伐他汀加依泽替米贝，洛伐他汀加烟酸，阿托伐他汀加氨氯地平，及辛伐他汀加烟酸。

在一些实施方案中，所述制造品可进一步包含容器上或与容器相关的标签，该标签指明所述组合物可用于治疗特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇水平的疾病。所述标签可指明所述组合物可用于治疗，例如高胆固醇血症、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病和/或急性冠脉综合征(ACS)。

附图说明

图1描述在施用L1L3抗体后的绝对空腹LDL-C水平(mg/dL)。

图2描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。

图3描述在施用L1L3抗体后的空腹总胆固醇水平相对基线的变化百分比。

图4描述在施用L1L3抗体后的空腹阿朴脂蛋白B水平相对基线的变化百分比。

图5描述在施用L1L3抗体后的空腹高密度脂蛋白胆固醇水平相对基线的变化百分比。

图6描述在施用L1L3抗体后的空腹甘油三酯脂蛋白胆固醇水平相对基线的变化百分比。

图7A描述在施用L1L3抗体后绝对空腹LDL-C水平(mg/dL)。图7B描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。

图8描述在存在或不存在他汀类药物条件下施用L1L3抗体后空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。X-轴表示PCSK9拮抗抗体L1L3的剂量(mg/kg)。

图9A-F描述L1L3(A-C)和LDL-C(E-F)的模拟时间谱。(A)和(D)：PCSK9拮抗抗体L1L3，2mg/kg。(B)和(E)：PCSK9拮抗抗体L1L3，6mg/kg。(C)和(F)：安慰剂。X-轴表示时间(天)。

图10描述施用指定剂量L1L3之后的LDL-C模拟时间图。

图11描述L1L3单一治疗(monotherapy)的研究设计示意图。

图12描述在施用L1L3抗体后的绝对空腹LDL-C水平(mg/dL)。

图13描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。

图14描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的平均变化百分比的表。

图15描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比图表。

图16描述在施用L1L3抗体后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比图表，排除有剂量漏服的对象。

发明详述

本发明提供了治疗特征在于血浆中LDL颗粒明显升高的疾病的治疗方案。所述治疗方案包括施用PCSK9拮抗抗体，其是单独施用或者与他汀类药物组合施用。本发明的治疗方案可以延长血液中LDL-胆固醇水平降低的时间，可用于预防和/或治疗胆固醇和脂蛋白代谢性疾病，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征(ACS)，及更普遍地，心血管疾病。

通用技术

除非特别指出，实施本发明将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。这些技术已经在文献中充分解释，如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley andSons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。

定义

“抗体”是一种免疫球蛋白分子，其能通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合靶，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖了完整的多克隆或单克隆抗体，也包含任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或者其单链，包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，例如但不限于：scFv、单域抗体(如鲨鱼和骆驼抗体)、大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、细胞内抗体(intrabodies)、双价抗体(diabodies)、三价抗体(triabodies)、四价抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(见例如Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology23(9):1126-1136)。抗体包括任何类型的抗体，如IgG、IgA或IgM(或者其亚类)，并且不必是任何特定类型的抗体。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分为不同类型。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。本领域熟知不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构型。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指完整抗体的一或多个片段，其保留特异性结合指定抗原(如PCSK9)的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段完成。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括Fab；Fab’；F(ab’)₂；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体一个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单域抗体(dAb)片段(Ward et al.,1989,Nature341:544-546)，以及分离的互补决定区(CDR)。

术语“单克隆抗体(Mab)”是指衍生自单拷贝或克隆的抗体，而不是根据其生产方法而定，所述单拷贝或克隆包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同种或基本同种群体中。

“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是嵌合的含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或者其它抗原结合亚序列)。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基由具有所希望的特异性、亲和性和能力(capacity)的来自非人物种如小鼠、大鼠或兔的CDR(供者抗体)的残基置换。

如本文所用，“人抗体”是指具有特定的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列相应于可由人产生的抗体和/或使用本领域技术人员已知的或者本发明公开的产生人抗体的技术产生的抗体的氨基酸序列。这个人抗体的定义包括包含至少一个人重链多肽或者至少一个人轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.,1996,Nature Biotechnology,14:309-314；Sheets et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162；Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。人抗体也可以通过免疫动物而产生，所述动物中已经转基因导入了人免疫球蛋白基因座以置换内源基因座，例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠。这种方法在美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中进行了描述。或者，人抗体可以通过使产生针对抗靶抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备(这种B淋巴细胞可以回收自个体或者可以已经在体外免疫)。见例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；以及美国专利号5,750,373。

抗体的“可变区”是指单独或者组合形式的抗体轻链的可变区或者抗体重链的可变区。如本领域公知的，重链和轻链的可变区均由四个构架区(FR)组成，所述框架区通过三个互补决定区(CDR)连接。互补决定区也称作超变区，参与抗体的抗原结合位点的形成。如果希望一个所述可变区的变体，特别是具有位于CDR区之外(即在构架区内)的氨基酸残基的替换，可以鉴定合适的氨基酸替换，优选保守氨基酸替换，上述鉴定通过对比所述可变区与其它抗体的可变区而进行，所述其它抗体含有与所述可变区相同标准类型(canonincal class)的CDR1和CDR2序列(Chothia and Lesk,J MolBiol196(4):901-917,1987)。当选择FR位于对象CDR的侧面时，例如当人源化或者优化抗体时，优选来自含有相同规范类型的CDR1和CDR2序列的抗体的FR。

可变结构域的“CDR”是根据Kabat、Chothia、Kabat与Chothia二者的累加、AbM、接触和/或构象定义或者本领域熟知的任何CDR确定方法鉴定的可变区内的氨基酸残基。抗体CDR最初根据Kabat等的定义可被鉴定为超变区。见例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR的位置最初根据Chothia及其它人所述也可以被鉴定为结构环结构。见例如Chothia et al.,1989,Nature342:877-883。其它CDR鉴定方法包括“AbM定义”，其是Kabat与Chothia所述方法的折中，使用OxfordMolecular's AbM抗体建模软件(现在的)获得，或者CDR的“接触定义”基于观测到抗原接触，如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745所述。在另一方法中，在本文称作CDR的“构象定义”，所述CDR的位置可以鉴定为热力学上(enthalpic)有助于抗原结合的残基。见例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。其它CDR边界定义可以不严格根据上述方法之一，尽管根据预测或实验发现CDR可以缩短或延长，但是其与Kabat CDR的至少一部分重叠，其中所述实验为发现特定残基或残基组或者甚至全部的CDR不显著影响抗原结合。如本文所用，CDR可以是指通过本领域已知的任何方法包括方法的组合定义的CDR。本发明使用的方法可利用根据任何这些方法定义的CDR。对于含有一个以上CDR的任何指定的实施方案，所述CDR可以根据任何Kabat、Chothia、扩展、AbM、接触和/或构象定义加以定义。

如本领域所已知，抗体的“恒定区”是指单独或者组合的抗体轻链的恒定区或者抗体重链的恒定区。

如本文所用，术语“PCSK9”是指保留至少一部分PCSK9活性的任何形式的PCSK9及其变体。除非特别指出，如特别提及人PCSK9，PCSK9包括有天然序列PCSK9的所有哺乳动物物种，如人、犬、猫、马和牛。人PCSK9的一个例子是Uniprot编号Q8NBP7(SEQ ID NO:1)。

如本文所用，“PCSK9拮抗抗体”是指抗PCSK9抗体，其能抑制PCSK9生物活性和/或由PCSK9信号传导介导的下游途径，包括PCSK9介导的LDLR下调，及PCSK9介导的LDL血液清除率降低。PCSK9拮抗抗体涵盖了这样的抗体，其阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度，包括显著地)PCSK9生物活性，包括由PCSK9信号传导介导的下游途径，如LDLR相互作用和/或对PCSK9的细胞应答的激发。对于本发明，应明确地理解术语“PCSK9拮抗抗体”涵盖了所有先前确定的术语、名称和功能状态及特性，由此PCSK9自身、PCSK9生物活性(包括但不限于其介导与LDLR相互作用、下调LDLR及降低血液LDL清除率的任何方面的能力)或者生物活性的后果被充分失效、降低或中和化至任何有意义的程度。在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体与PCSK9结合并阻止其与LDLR的相互作用。在例如美国专利申请公开号20100068199中提供了PCSK9拮抗抗体的例子，所述专利以其全部内容在此并入本文。

如本文所用，“完全拮抗剂”是在有效浓度基本完全阻断PCSK9的可测作用的拮抗剂。部分拮抗剂是指能部分阻断可测作用的拮抗剂，但是即使在最高浓度也不是完全拮抗剂。基本完全是指至少大约80%、优选至少大约90%、更优选地至少大约95、最优选至少大约98%或99%的可测作用被阻断。在本文中描述了相关的“可测作用”，其包括在Huh7细胞中体外测定的通过PCSK9拮抗剂下调LDLR，在体内降低血液(或者血浆)中总胆固醇水平，及在体内降低血液(或者血浆)中LDL水平。

如本文所用，术语“有临床意义的”是指人体中血液LDL-胆固醇水平降低至少15%，或者小鼠中血液总胆固醇水平降低至少15%。需明确的是在血浆或血清中的测量可以替代血液中水平的测量。

如本文所用，术语“给药方案”是指给患者施用的整个治疗过程，例如用PCSK9拮抗抗体治疗。

如本文所用，在血液中LDL胆固醇的平均水平在特定水平范围内的时间的背景下，术语“连续”是指所述平均水平在该特定范围内的时间不被任何平均水平不在特定水平范围内的时间打断。

如本文所用，在血液中LDL胆固醇的平均水平在特定水平范围内的时间的背景下，术语“不连续的”是指平均水平在特定范围内的时间被一些量的时间打断(如15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4,小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时18小时、20小时、24小时28小时、32小时、36小时、40小时、44小时、48小时、60小时、72小时、84小时、90小时，或者以任何上述特别陈述时间为上限和下限的任何范围的时间)，在此期间平均水平不在特定水平范围内。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸链，优选相对较短的链(如10-100个氨基酸)。氨基酸链可以是线性的或者是分支的，其可包含修饰的氨基酸，和/或可以由非氨基酸打断。该术语还涵盖了已经天然修饰或通过介入修饰的氨基酸链。例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化，或者任何其它处理或修饰，如与标记成分配合。该定义还包括例如含有一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应理解多肽可以作为单链或者结合的链的形式存在。

如本领域已知，“多核苷酸”或者“核酸”在本文互换使用，是指任何长度的核苷酸链，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，则可以在链装配之前或之后对核苷酸结构的进行修饰。核苷酸序列可以由非核苷酸成分打断。多核苷酸在聚合后可进一步修饰，如通过与标记成分配合而修饰。其它类型的修饰包括例如“帽”，用类似物替换一或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，如具有无电荷键(如甲基磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)及具有带电荷键(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂成分如蛋白质(如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚-L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(如吖啶，补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(如金属，放射性金属，硼，氧化金属等)的修饰，含有烷化剂的修饰，具有修饰的键(如α端基异构体核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸的修饰。进一步地，任何通常存在于糖中的羟基基团均可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团置换，由标准的保护基团保护，或者激活为制备与另外的核苷酸的另外的键，或者可以与固体支持物配合。5’和3’末端OH可以磷酸化的或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可以衍生为标准的保护基团。多核苷酸也可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的相似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或者2’-叠氮基-核糖，碳环状糖类似物，α-或β-异头糖，差向异构体糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚糖，无环类似物和无碱基核苷类似物如甲基核苷。一或多个磷酸二酯键可以由各种连接基团置换。所述各种连接基团包括但不限于其中磷酸酯由P(O)S(硫代)、P(S)S(二硫代)、(O)NR₂(酰胺酯(amidate))、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(甲缩醛(formacetal))置换，其中R或R’独立地是H或者是取代或非取代的烷基(1-20C)，任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或者芳烷基。多核苷酸中并非所有键都需要是相同的。前述内容适用于本文提及的所有多核苷酸，其包括RNA和DNA。

如本文所用，当平衡解离常数等于或低于20nM、优选低于大约6nM、更优选低于大约1nM、最优选低于大约0.2nM时，抗体与PCSK9“相互作用”，所述平衡解离常数是通过在美国专利申请公开No.20100068199的实施例2中揭示的方法测量的。

与表位“优先结合”或者“特异性结合”(在本文可互换使用)的抗体是本领域熟知的术语，确定这种特异性或优先结合的方法也为本领域熟知。如果一个分子与一特定细胞或物质较与另外的细胞或物质更频繁、更迅速、更持久和/或更亲和地反应或结合，则称该分子呈现出“特异性结合”或者“优先结合”。如果一种抗体与靶较与其它物质以更高的亲和性、亲合力、更容易和/或更持久地结合，则该抗体“特异性结合”或者“优先结合”所述靶。例如，特异性或优先结合一个PCSK9表位的抗体是与其结合其它PCSK9表位或非-PCSK9表位相比以更高的亲和性、亲合力、更容易地和/或更持久地结合这个表位的抗体。通过阅读这个定义，也应理解，如特异性或优先结合第一个靶的一种抗体(或部分或表位)可能特异性或优先结合第二个靶或者可能不特异性或优先结合第二个靶。因此，“特异性结合”或者“优先结合”不是必须要求(但是可以包括)专一结合。通常但非必须地，提及结合时是指优先结合。

如本文所用，“基本纯的”是指材料是至少50%纯的(即无污染物)、更优选至少90%纯的、更优选至少95%纯的、再优选至少98%纯的、最优选至少99%纯的。

“宿主细胞”包括可以是或者已经是掺入多核苷酸插入体的载体的接受体的细胞个体或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，以及可以是与原始亲代细胞非必需完全相同(在形态学或者在基因组DNA补体中)的后代，其中的不同是由于天然、偶然或有意的突变。宿主细胞包括在体内用本发明的多核苷酸转染的细胞。

正如本领域所已知，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或者变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但是人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226或者从Pro230的氨基酸残基至其羧基末端。Fc区中残基的编号是如Kabat所述EU索引编号。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即CH2和CH3。

如在本领域中所用，“Fc受体”和“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质结构域中有不同。FcR在Ravetch and Kinet,1991、Ann.Rev.Immunol.,9:457-92、Capel et al.,1994、Immunomethods,4:25-34及de Haas et al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中进行了综述。“FcR”也包括新生儿的受体FcRn，其与母亲IgG转移至胎儿相关(Guyer et al.,1976J.Immunol.,117:587；及Kim et al.,1994,J.Immunol.,24:249)。

如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一种抗体或其抗原结合部分结合表位的方式与第二种抗体或其抗原结合部分结合表位的方式足够相似，这样，与不存在第二种抗体的条件下相比，第一种抗体与其关联表位的结合的结果在存在第二种抗体的条件下明显降低。或者，可以但无须是第二种抗体与其表位结合在存在第一种抗体的条件下也明显降低的情况。即第一种抗体可抑制第二种抗体与其表位的结合，而无须第二种抗体抑制第一种抗体与其各自的表位的结合。然而，在每种抗体明显抑制另一抗体与其关联表位或配体结合的情况中，无论是相同、较高或较低程度，所述抗体均被称作彼此“交叉竞争”结合各自的表位。竞争和交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或者交叉竞争发生的机制是什么(如位阻、构象改变，或者结合共有表位或者其一部分)，技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明内，并可用于本发明公开的方法中。

抗体的一个表位与另一(第二个)表位或者与和LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面“重叠”，是指共享相互作用的PCSK9残基的空间。为了计算重叠百分比，例如要求保护的抗体的PCSK9表位与和LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面的重叠百分比，当与LDLR复合时隐藏的PCSK9表面积基于每个残基(per-residue)进行计算。还要计算在PCSK9:抗体复合物中这些残基的隐藏面积。为了防止可能的重叠超过100%，在PCSK9:抗体复合物中比在LDLR:PCSK9复合物中具有更高隐藏的表面积的残基的表面积根据LDLR:PCSK9复合物设定数值(100%)。表面重叠百分比是通过合计LDLR:PCSK9相互作用残基进行计算并且用相互作用面积加权。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一个效应子功能。“效应子功能”的例子包括C1q结合，补体依赖性细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，吞噬作用，细胞表面受体(如B细胞受体)的下调等等。这种效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(如抗体可变结构域)组合，且可以使用本领域已知的评估这种抗体效应子功能的各种测定评定。

“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含与天然序列Fc区由于至少一个氨基酸修饰而不同的氨基选序列，但是仍保留天然序列Fc区的至少一个效应子功能。优选地，变体Fc区与天然Fc区或者与亲代多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸替换，例如在天然序列Fc区或者亲代多肽的Fc区中具有大约1-10个氨基酸替换，优选大约1-5个氨基酸替换。本文变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少大约80%序列相同性，最优选具有至少大约90%、更优选至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%序列相同性。

如本文所用，术语“阿托伐他汀”、“西立伐他汀”、“氟伐他汀”、“洛伐他汀”、“美伐他汀”、“匹伐他汀”、“普伐他汀”、“罗苏伐他汀”和“辛伐他汀”分别包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀，及其药物可接受的盐或者立体异构体。如本文所用，术语“药物可接受的盐”包括患者生理学耐受的盐。典型地，这种盐是由无机酸或碱和/或有机酸或碱制备的。这些酸和碱的实例为本领域技术人员熟知。

如本文所用，“治疗”是获得有益或希望的结果的方法。对于本发明，有益或希望的临床结果包括但不限于如下一或多项：增强LDL清除及降低异常胆固醇和/或脂蛋白水平的发病率或加以改善，所述异常胆固醇和/或脂蛋白水平是由代谢和/或饮食失调造成的，或者包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、ACS及更普遍地，心血管疾病(CVD)。

“降低发病率”是指任何降低严重度(可包括减少通常用于这种病症的(如接受)其它药物和/或治疗的需要和/或量)。如本领域技术人员所理解，个体在其对治疗的反应方面可能不同，因此，如“降低发病率的方法”表达的是基于合理预期施用PCSK9拮抗抗体，这种施用可能导致特定个体的这种发病率降低。

“改善”是指与未施用PCSK9拮抗抗体相比，一或多个症状的减轻或改善。“改善”也包括缩短或减少症状的持续时间。

如本文所用，药物、化合物或者药物组合物的“有效剂量”或者“有效量”，是足以实现任一或多个有益或希望的结果的量。对于预防性用途，有益或希望的结果包括消除或降低疾病风险，减轻疾病严重度，或者延迟疾病发生，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发生期间存在的中间病理学表型。对于治疗性用途，有益或希望的结果包括这样的临床结果，如减少高胆固醇血症或者减少血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病或者冠心病的一或多个症状，降低治疗该疾病所需的其它药物的剂量，增强另一药物的作用，和/或延迟患者疾病的进展。有效剂量可以在一或多次用药中施用。对于本发明，药物、化合物或者药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防或治疗的量。如临床上所理解，药物、化合物或者药物组合物的有效剂量可以联合或者不联合另一药物、化合物或者药物组合物而实现。因此，在施用一或多种治疗剂的情况下，“有效剂量”可以认为是这样的，如果与一或多种其它物质联合时，单一药剂可以实现或实现了希望的结果，则可以认为其是以有效剂量施用的。

“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于家畜、比赛动物(sport animals)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。

如本文所用，“载体”是指一种构建体，其在宿主细胞中能输送及优选地，表达一或多个感兴趣的基因或序列。载体例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞如生产细胞。

如本文所用，“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或可诱导启动子，或者是增强子。表达控制序列与被转录的核酸序列可操纵地连接。

如本文所用，“药物可接受的载体”或者“药物可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时使得所述成分保留生物活性及与对象的免疫系统不反应的任何材料。例如包括但不限于任何标准药物学载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳状液如油/水乳状液，以及各种类型的增湿剂。对于喷雾或肠道外施用，优选的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者生理盐水(0.9%)。包含这种载体的组合物通过熟知的常规方法配制(见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；and Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20thEd.,Mack Publishing,2000)。

如本文所用，术语“k_on”是指抗体与抗原结合的速率常数。特别地，速率常数(k_on和k_off)及平衡解离常数是使用Fab抗体片段(即一价)和PCSK9测量的。

如本文所用，术语“k_off”是指抗体从抗体/抗原复合物中解离的速率常数。

如本文所用，术语“K_D”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

关于本文一个数值或参数所用术语“大约”包括(及描述了)针对该数值或参数的实施方案。例如，涉及“大约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包含在数字限定范围内。

应理解在本文无论何处用词语“包含”描述实施方案时，也提供了“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的类似的实施方案。

在以Markush组或其他并列组描述的本发明的方面或实施方案时，本发明不仅涵盖整体列出的整个组，还涵盖了所述组的所有单个成员和主要组中所有可能的亚组，以及缺少一或多个所述组成员的主要组。本发明还设想在要求保护的发明中明确排除任何所述组的成员中的一或多个。

除非特别指出，本文使用的所有技术和学术术语具有与本发明所属领域中的技术人员通常理解的相同含义。本文描述了方法和材料的例子，尽管也可以使用与本文所述方法和材料相似或等价的方法和材料实施或检测本发明。本文提及的所有出版物及其它参考文献均以其全部内容并入本文。在内容有冲突的情况中，以本说明书，包括定义为准。尽管本文引用了许多文献，但是这种引用不表示承认这些文献任何一篇组成本领域公知常识一部分。在本说明书和权利要求书中，单词“包含(comprise)”或其变化形式用语如“comprises”或“comprising”，应理解为意味着包含一个所陈述的整体或一组整体，但是不排除任何其它整体或其他组整体。除非特别指出，单数术语应包括复数形式，复数术语应包括单数形式。所述材料、方法和实施例只是举例说明本发明，无限制本发明之意。

关于抗PCSK9抗体的公开信息包括如下公开申请：PCT/IB2009/053990，2010年3月18日以WO2010/029513公开；及美国专利申请号12/558312，2010年3月18日以US2010/0068199公开，所述专利均以其全部内容并入本文。

用抗PCSK9抗体治疗

本发明提供了治疗特征在于血浆中LDL颗粒显著升高的疾病的治疗方案。所述治疗方案包括施用PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，所述治疗方案包括将PCSK9拮抗抗体施用于已经在接受稳定剂量他汀类药物治疗的患者。本发明公开的治疗方案提供了有效量的PCSK9拮抗抗体，其拮抗循环PCSK9，用于在个体中治疗或预防高胆固醇血症，和/或血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病、急性冠脉综合征(ACS)或者冠心病的至少一个症状。

有利地，本发明公开的治疗方案导致LDL-C显著而持久降低。优选地，血液胆固醇和/或血液LDL较施用前降低至少大约10%或15%。更优选地，血液胆固醇和/或血液LDL较施用所述抗体之前降低至少大约20、30、40、50、60、70或80%。

给药方案

在一些实施方案中，给药方案包括施用初始剂量为大约2mg/kg的PCSK9抗体，随后每4周施用一次大约2mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括施用初始剂量为大约4mg/kg的PCSK9抗体，随后每4周施用一次大约4mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括施用初始剂量为大约4mg/kg的PCSK9抗体，随后每8周施用一次大约4mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括施用初始剂量为大约8mg/kg的PCSK9抗体，随后每8周施用一次大约8mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括施用初始剂量为大约12mg/kg的PCSK9抗体，随后每8周施用一次大约12mg/kg的维持剂量。

在另一些实施方案中，给药方案包括每周施用一次大约0.25mg/kg的PCSK9抗体。在另一些实施方案中，给药方案包括每周施用一次大约0.5mg/kg的PCSK9抗体。在另一些实施方案中，给药方案包括每周施用一次大约1mg/kg的PCSK9抗体。在另一些实施方案中，给药方案包括每周施用一次大约1.5mg/kg的PCSK9抗体。

然而，根据执业医生希望达到的药动学衰退模式可以使用另一些给药方案。这种治疗的进展易于通过常规技术和试验进行监测。在优选的实施方案中，初始剂量与第一个后续剂量及再后续剂量彼此间隔时间至少4周。所述给药方案(包括使用的PCSK9拮抗剂)可以根据时间而变化。

通常地，对于施用PCSK9抗体，初始候选剂量可以是大约0.3mg/kg-18mg/kg的PCSK9拮抗抗体。对于本发明，根据上述因素，典型的剂量范围可以是大约3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更高剂量。例如，可以使用的剂量为大约0.3mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约1.5mg/kg、大约2mg/kg、大约2.5mg/kg、大约3mg/kg、大约3.5mg/kg、大约4mg/kg、大约4.5mg/kg、大约5mg/kg、大约5.5mg/kg、大约6mg/kg、大约6.5mg/kg、大约7mg/kg、大约7.5mg/kg、大约8mg/kg、大约8.5mg/kg、大约9mg/kg、大约9.5mg/kg、大约10mg/kg、大约10.5mg/kg、大约11mg/kg、大约11.5mg/kg、大约12mg/kg、大约12.5mg/kg、大约13mg/kg、大约13.5mg/kg、大约14mg/kg、大约14.5mg/kg、大约15mg/kg、大约15.5mg/kg、大约16mg/kg、大约16.5mg/kg、大约17mg/kg、大约17.5mg/kg、大约18mg/kg、大约18.5mg/kg、大约19mg/kg、大约19.5mg/kg、大约20mg/kg、大约20.5mg/kg、大约21mg/kg、大约21.5mg/kg、大约22mg/kg、大约22.5mg/kg、大约23mg/kg、大约23.5mg/kg、大约24mg/kg、大约24.5mg/kg，以及大约25mg/kg。对于在几天或更长时间重复施用，根据具体情况，持续治疗直至出现希望的症状抑制或者直至达到足够的治疗水平，例如降低血液LDL水平。

给药方案的例子包括施用初始剂量为大约0.25mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约1.5mg/kg、大约2mg/kg、大约2.5mg/kg、大约3mg/kg、大约4mg/kg、大约5mg/kg、大约6mg/kg、大约7mg/kg、大约8mg/kg、大约9mg/kg、大约10mg/kg、大约11mg/kg、大约12mg/kg、大约13mg/kg、大约14mg/kg、大约15mg/kg、大约16mg/kg、大约17mg/kg，或者大约18mg/kg，随后施用维持剂量为大约0.25mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约1.5mg/kg、大约2mg/kg、大约2.5mg/kg、大约3mg/kg、大约4mg/kg、大约5mg/kg、大约6mg/kg、大约7mg/kg、大约8mg/kg、大约9mg/kg、大约10mg/kg、大约11mg/kg、大约12mg/kg、大约13mg/kg、大约14mg/kg、大约15mg/kg、大约16mg/kg、大约17mg/kg，或者大约18mg/kg的PCSK9抗体。在一些实施方案中，维持剂量每周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量隔周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量每三周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量每四周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量大约每五周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量大约每六周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量大约每七周施用一次。在一些实施方案中，维持剂量大约每八周施用一次。在优选的实施方案中，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量施用时间彼此间隔至少大约四周。在一些实施方案中，维持剂量每月施用一次。

在另一些实施方案中，可以使用固定剂量。例如，可以使用的PCSK9拮抗抗体剂量为大约0.25mg、大约0.3mg、大约0.5mg、大约1mg、大约1.5mg、大约2mg、大约2.5mg、大约3mg、大约4mg、大约5mg、大约6mg、大约7mg、大约8mg、大约9mg、大约10mg、大约11mg、大约12mg、大约13mg、大约14mg、大约15mg、大约16mg、大约17mg、大约18mg、大约19mg、大约20mg、大约21mg、大约22mg、大约23mg、大约24mg、大约25mg、大约26mg、大约27mg、大约28mg、大约29mg、大约30mg、大约31mg、大约32mg、大约33mg、大约34mg、大约35mg、大约36mg、大约37mg、大约38mg、大约39mg、大约40mg、大约41mg、大约42mg、大约43mg、大约44mg、大约45mg、大约46mg、大约47mg、大约48mg、大约49mg、大约50mg、大约51mg、大约52mg、大约53mg、大约54mg、大约55mg、大约56mg、大约57mg、大约58mg、大约59mg、大约60mg、大约61mg、大约62mg、大约63mg、大约64mg、大约65mg、大约66mg、大约67mg、大约68mg、大约69mg、大约70mg、大约71mg、大约72mg、大约73mg、大约74mg、大约75mg、大约76mg、大约77mg、大约78mg、大约79mg、大约80mg、大约81mg、大约82mg、大约83mg、大约84mg、大约85mg、大约86mg、大约87mg、大约88mg、大约89mg、大约90mg、大约91mg、大约92mg、大约93mg、大约94mg、大约95mg、大约96mg、大约99mg、大约98mg、大约99mg、大约100mg,about101mg、大约102mg、大约103mg、大约104mg、大约105mg、大约106mg、大约107mg、大约108mg、大约109mg、大约110mg、大约111mg、大约112mg、大约113mg、大约114mg、大约115mg、大约116mg、大约117mg、大约118mg、大约119mg、大约120mg、大约121mg、大约122mg、大约123mg、大约124mg、大约125mg、大约126mg、大约127mg、大约128mg、大约129mg、大约130mg、大约131mg、大约132mg、大约133mg、大约134mg、大约135mg、大约136mg、大约137mg、大约138mg、大约139mg、大约140mg、大约141mg、大约142mg、大约143mg、大约144mg、大约145mg、大约146mg、大约147mg、大约148mg、大约149mg、大约150mg、大约151mg、大约152mg、大约153mg、大约154mg、大约155mg、大约156mg、大约157mg、大约158mg、大约159mg、大约160mg、大约161mg、大约162mg、大约163mg、大约164mg、大约165mg、大约166mg、大约167mg、大约168mg、大约169mg、大约170mg、大约171mg、大约172mg、大约173mg、大约174mg、大约175mg、大约176mg、大约177mg、大约178mg、大约179mg、大约180mg,about181mg、大约182mg、大约183mg、大约184mg、大约185mg、大约186mg、大约187mg、大约188mg、大约189mg、大约190mg、大约191mg、大约192mg、大约193mg、大约194mg、大约195mg、大约196mg、大约199mg、大约198mg、大约199mg、大约200mg、大约250、大约300、大约350、大约400、大约450或者大约500mg。在一些实施方案中，所述固定剂量是经皮下或静脉内施用的。

可以根据本发明公开的一或多个给药方案将PCSK9拮抗抗体施用于接受稳定剂量他汀类药物的个体。所述稳定剂量可以是，例如但不限于日剂量或者隔日剂量他汀类药物。本领域技术人员已知许多他汀类药物，包括，例如但不限于阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀，以及他汀类药物组合治疗。他汀类药物组合治疗的非限制性实例包括阿托伐他汀加氨氯地平(CADUET^TM)，辛伐他汀加依泽替米贝(VYTORIN^TM)，洛伐他汀加烟酸(ADVICOR^TM)，以及辛伐他汀加烟酸(SIMCOR^TM)。

在一些实施方案中，在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前，个体已经接受稳定剂量的他汀类药物至少1、2、3、4、5或6周时间。优选地，在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前，接受稳定剂量的他汀类药物的个体的空腹LDL-C水平高于或等于大约70mg/dL。在一些实施方案中，在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前，接受稳定剂量的他汀类药物的个体的空腹LDL-C水平高于或等于大约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/dL。

对于本发明，根据上述因素，典型的他汀类药物剂量范围可以是大约1mg-80mg。例如，可以使用的他汀类药物的剂量为大约0.3mg、大约0.5mg、大约1mg、大约2.5mg、大约3mg、大约4mg、大约5mg、大约6mg、大约7mg、大约8mg、大约9mg、大约10mg、大约11mg、大约12mg、大约13mg、大约14mg、大约15mg、大约16mg、大约17mg、大约18mg、大约19mg、大约20mg、大约21mg、大约22mg、大约23mg、大约24mg、大约25mg、大约26mg、大约27mg、大约28mg、大约29mg、大约30mg、大约31mg、大约32mg、大约33mg、大约34mg、大约35mg、大约36mg、大约37mg、大约38mg、大约39mg、大约40mg、大约41mg、大约42mg、大约43mg、大约44mg、大约45mg、大约46mg、大约47mg、大约48mg、大约49mg、大约50mg、大约51mg、大约52mg、大约53mg、大约54mg、大约55mg、大约56mg、大约57mg、大约58mg、大约59mg、大约60mg、大约61mg、大约62mg、大约63mg、大约64mg、大约65mg、大约66mg、大约67mg、大约68mg、大约69mg、大约70mg、大约71mg、大约72mg、大约73mg、大约74mg、大约75mg、大约76mg、大约77mg、大约78mg、大约79mg，或者大约80mg。

在优选的实施方案中，使用剂量为40mg或80mg的阿托伐他汀。在另一些实施方案中，使用剂量为20mg或40mg的罗苏伐他汀。在另一些实施方案中，使用剂量为40mg或80mg的辛伐他汀。

在一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约2mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约2mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约3mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约3mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约4mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约4mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约5mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约5mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约4mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每八周施用一次大约4mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约6mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约6mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约8mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每八周施用一次大约8mg/kg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约12mg/kg的PCSK9抗体，随后大约每八周施用一次大约12mg/kg的维持剂量.

在另一些实施方案中，给药方案包括经皮下注射对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约200mg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约200mg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约300mg的PCSK9抗体，随后大约每四周施用一次大约300mg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约50mg的PCSK9抗体，随后大约每两周施用一次大约50mg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约100mg的PCSK9抗体，随后大约每两周施用一次大约100mg的维持剂量。在另一些实施方案中，给药方案包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约150mg的PCSK9抗体，随后大约每两周施用一次大约150mg的维持剂量。

另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约0.25mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的0.25mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约0.5mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的0.5mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约1mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的1mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约1.5mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的1.5mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约2mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的2mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约3mg/kg的PCSK9拮抗抗体。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约4mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的4mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约5mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的5mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。另一给药方案的例子包括对接受稳定剂量他汀类药物的对象施用初始剂量为大约6mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在一些实施方案中，给药方案进一步包括每月施用一次大约的6mg/kg的PCSK9拮抗抗体的维持剂量。

然而，根据执业医生希望达到的药动学衰退模式，也可以使用其它给药方案。这个治疗的进展易于通过常规的技术和试验进行监测。在优选的实施方案中，初始剂量与第一次后续剂量及再后续剂量的施用时间彼此间隔至少四周。所述给药方案(包括使用的PCSK9拮抗抗体)随着时间可以变化。

PCSK9拮抗抗体

如下描述是产生本发明中使用的抗体的技术的例子。用于产生抗体的PCSK9抗原可以是例如全长人PCSK9、全长小鼠PCSK9以及PCSK9的各种肽片段。可用于产生抗体的其它形式PCSK9对本领域技术人员是显而易见的。

通过用重组全长PCSK9蛋白免疫PCSK9基因敲除小鼠产生单克隆抗体。这种抗体制备方式产生的拮抗抗体显示，其完全阻断PCSK9结合LDLR，完全阻断PCSK9-介导的降低Huh7细胞中LDLR水平，及降低体内包括在小鼠内LDL胆固醇水平至相当于在PCSK9-/-小鼠中的水平，如美国专利申请号12/558312的实施例7所示。

正如所理解的，用于本发明中的抗体可以衍生自杂交瘤，但是也可以在杂交瘤之外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可用于转化合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域熟知，包括可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)及人肝细胞癌细胞(如Hep G6)。也可以使用非哺乳动物细胞，包括细菌、酵母、昆虫和植物细胞。可优选定点突变抗体CH6结构域以消除糖基化，从而防止由非人糖基化引起的免疫原性、药动学和/或效应子功能的变化。谷氨酰胺合酶表达系统在欧洲专利616 846,656 055和363 997及欧洲专利申请89303964.4中进行了全部或部分讨论。此外，二氢叶酸还原酶(DHFR)表达系统，包括本领域已知的那些，可用于产生所述抗体。

在一些实施方案中，本发明使用PCSK9拮抗抗体L1L3实施。在一些实施方案中，本发明使用识别PCSK9表位的抗体实施，该表位与由L1L3抗体识别的表位相同。

在一些实施方案中，本发明使用包含来自具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区的三个CDR及来自具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR的抗体实施。

在一些实施方案中，本发明使用特异性结合PCSK9的抗体实施，所述抗体包含：VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQ ID NO:2(SYYMH)、SEQID NO:13(GYTFTSY)或者SEQ ID NO:14(GYTFTSYYMH)所示氨基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO:3(EISPFGGRTNYNEKFKS)或者SEQID NO:15(ISPFGGR)所示氨基酸序列；和/或VH CDR3，其具有SEQ ID NO:4(ERPLYASDL)所示氨基酸序列，或者在所述CDR1、CDR2和/或CDR3序列中具有一或多个保守氨基酸替换的其变体，其中所述变体基本保留与所述序列定义的CDR相同的结合特异性。优选地，所述变体包含上至大约10个氨基酸替换，及更优选地包含上至大约4个氨基酸替换。

在一些实施方案中，本发明使用这样的抗体实施，所述抗体包含：具有SEQ ID NO:5(RASQGISSALA)所示氨基酸序列的VL CDR1，具有SEQID NO:6(SASYRYT)所示氨基酸序列的CDR2，和/或具有SEQ ID NO:7(QQRYSLWRT)所示氨基酸序列的CDR3，或者具有在所述CDR1、CDR2和/或CDR3序列中具有一或多个保守氨基酸替换的其变体，其中所述变体基本上保留与所述序列限定的CDR1相同的结合特异性。优选地，所述变体包含直至大约10个氨基酸替换，更优选直至大约4个氨基酸替换。

在一些实施方案中，本发明使用具有包含或由SEQ ID NO:8或10组成的重链序列和包含或由SEQ ID NO:9组成的轻链序列的抗体实施。

在一些实施方案中，本发明使用具有包含或由SEQ ID NO:11组成的重链可变区和包含或由SEQ ID NO:12组成的轻链可变区的抗体实施。

在一些实施方案中，本发明使用识别人PCSK9上的表位的抗体实施，所述表位包含SEQ ID NO:1所示PCSK9氨基酸序列的153-155、194、195、197、237-239、367、369、374-379和381位氨基酸残基。优选地，人PCSK9上的抗体表位不包含SEQ ID NO:1所示PCSK9氨基酸序列的71、72、150-152、187-192、198-202、212、214-217、220-226、243、255-258、317、318、347-351、372、373、380、382和383位中的一或多个氨基酸残基。

在一些实施方案中，本发明使用这样的抗体实施，所述抗体识别PCSK9的第一个表位，其与由以下单克隆抗体识别的第二个表位相同或重叠，所述单克隆抗体选自：5A10，其由在美国典型培养物保藏中心(ATCC)以编号PTA-8986保藏的杂交瘤细胞系产生；4A5，其由在美国典型培养物保藏中心以编号PTA-8985保藏的杂交瘤细胞系产生；6F6，其由在美国典型培养物保藏中心以编号PTA-8984保藏的杂交瘤细胞系产生；以及7D4，其由在美国典型培养物保藏中心以编号PTA-8983保藏的杂交瘤细胞系产生。在优选的实施方案中，本发明使用PCSK9拮抗抗体L1L3实施(见PCT/IB2009/053990，2010年3月18日以WO2010/029513公开，及美国专利申请No.12/558312，2010年3月18日以US2010/0068199公开)。

优选地，变体包含上至大约20个氨基酸替换，更优选地，上至大约8个氨基酸替换。优选地，所述抗体进一步包含免疫学惰性恒定区，和/或所述抗体具有选自如下的同种型：IgG₂、IgG₄、IgG_2Δa、IgG_4Δb、IgG_4Δc、IgG₄S228P、IgG_4Δb S228P和IgG_4Δc S228P。在另一优选的实施方案中，所述恒定区是非糖基化(aglycosylated)的Fc区。

可用于本发明中的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源配合物(heteroconjugate)抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(如结构域抗体)、人抗体、人源化抗体，以及免疫球蛋白分子的任何另一些修饰的构型，其包含所需要的特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体，以及共价修饰的抗体。抗体可以是鼠类、大鼠、人或者任何另一些来源的抗体(包括嵌合或人源化抗体)。

在一些实施方案中，所述PCSK9拮抗抗体是单克隆抗体。所述PCSK9拮抗抗体也可以是人源化抗体。在另一些实施方案中，抗体是人抗体。

在一些实施方案中，所述抗体包含修饰的恒定区，如免疫学惰性的恒定区，具有降低的引发免疫应答的潜力。在一些实施方案中，所述恒定区如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624、PCT公开号WO99/58572和/或英国专利申请号9809951.8所述修饰。Fc可以是人IgG₂或者人IgG₄。Fc可以是含有A330P331突变为S330S331的人IgG₂(IgG_2Δa)，其中氨基酸残基参考野生型IgG2序列进行编号。Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624。在一些实施方案中，抗体包含一个IgG₄恒定区，其包含如下突变(Armour et al.,2003,Molecular Immunology40585-593)：E233F234L235突变为P233V234A235(IgG_4Δc)，其中编号参考野生型IgG4。在另一个实施方案中，Fc是人IgG₄E233F234L235突变为P233V234A235，具有G236删除(IgG_4Δb)。在另一个实施方案中，Fc是任何人IgG₄Fc(IgG₄、IgG_4Δb或IgG_4Δc)，其含有铰链稳定的突变，S228突变为P228(Aalberse et al.,2002,Immunology105,9-19)。在另一个实施方案中，Fc可以是非糖基化(aglycosylated)的Fc。

在一些实施方案中，所述恒定区是通过突变寡糖附着残基(如Asn297)和/或是恒定区中糖基化识别序列一部分的侧翼残基而非糖基化的。在一些实施方案中，所述恒定区是针对N-连接的糖基化用酶进行非糖基化的。所述恒定区可以针对N-连接的糖基化用酶进行或者通过在糖基化缺陷的宿主细胞中表达进行非糖基化。

在一些实施方案中，可以存在一种以上的拮抗抗体。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的或更多的拮抗抗体和/或肽。通常地，这些PCSK9拮抗抗体或肽可具有互补活性，其彼此无不利影响。PCSK9拮抗抗体也可以与另一些PCSK9拮抗剂或PCSK9受体拮抗剂联合使用。例如，可以使用如下一或多种PCSK9拮抗剂：针对PCSK9的反义分子(包括针对编码PCSK9的核酸的反义分子)，PCSK9抑制化合物，及PCSK9结构类似物。PCSK9拮抗抗体也可以与增强和/或互补所述药剂效果的另一些药剂联合使用。

关于本发明所述的所有方法，PCSK9拮抗抗体还包括包含一或多种其它药剂的组合物。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，如药物可接受的赋形剂，包括缓冲液，这些为本领域熟知。本发明可以单独使用或者与其它常规治疗方法组合使用。

PCSK9拮抗抗体可以通过任何合适途径施用于个体。本发明描述的实施例只是例证可用技术而不是限制本发明，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在一些实施方案中，所述PCSK9拮抗抗体是根据已知方法施用于个体的，例如静脉内施用，如在一段时间内推注或持续输注，肌内、腹膜内、脑脊髓内、经皮、皮下、动脉内、舌下、滑膜内、通过吹入、鞘内、口服、吸入或者局部的途径。施用可以是全身性施用，如静脉内注射，或者局部施用。可以使用可商购的液体配制物雾化器，包括喷雾式雾化器和超声雾化器进行施用。液体配制物可以直接雾化，冻干粉末可以在冲调后雾化。或者，PCSK9拮抗抗体可以使用碳氟化合物配制物和计量吸入器气雾化，或者作为冻干和研磨粉末吸入。

在一个实施方案中，PCSK9拮抗抗体是通过部位特异性或者靶向局部输送技术施用的。部位特异性或靶向局部输送技术的例子包括PCSK9拮抗抗体的各种可植入持久药性(depot)源或者局部输送导管，如输注管、留置管或者针管，合成的移植物，外膜敷料(adventitial wraps)，分流装置(shunts)和支架(stents)或者其它可植入装置，位点特异性载体，直接注射，或者直接施用。见例如PCT公开号WO00/53211和美国专利号5,981,568。

可以使用PCSK9拮抗抗体的各种配制物进行施用。在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体可以单独(neat))施用。在一些实施方案中，PCSK9拮抗抗体与药物可接受的赋形剂可存在于多种配制物中。药物可接受的赋形剂为本领域已知，是相对惰性的物质，其辅助药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可以给予形状或稠度，或作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、增湿和乳化剂、改变渗透性的盐、包裹剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物输送的配制物如Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack Publishing(2000)所示。

这些药剂可以与药物学可接受的载体如盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等组合。特定的给药方案，即剂量、时间和重复，根据特定个体及个体的病史决定。

可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度上对于受者是无毒的，并可包含缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲液；盐如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；氯化苯甲烷铵、氯化苯乙铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水多聚体如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反荷离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或者聚乙二醇(PEG)。

通过本领域已知方法制备含有PCSK9拮抗抗体的脂质体，如在Epstein,et al.,Pro"Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA77:4030(1980)和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述。在美国专利号5,013,556中公开了循环时间提高的脂质体。通过反相蒸发法用脂质组合物可以产生特别有用的脂质体，所述脂质组合物含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通过指定孔径的滤器滤过脂质体以产生具有期望直径的脂质体。

活性成分也可以被包埋在通过凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚异丁烯酸甲酯微胶囊)，胶体药物运输(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中。在Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,MackPublishing(2000)中公开了这类技术。

可制备缓释制剂。合适的缓释制剂的例子包括含有抗体的固体疏水多聚体半渗透性基质，所述基质是有形状物体形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制物必须是无菌的。这可以通过例如无菌滤膜过滤轻易实现。治疗性PCSK9拮抗抗体组合物通常被置于具有无菌接入口的容器中，例如带有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉注射溶液袋或瓶。

合适的乳剂可以使用可商购的脂肪乳剂来制备，所述脂肪乳剂例如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofondin^TM和Lipiphysan^TM。活性成分可被溶于预先混合的乳剂组合物中，或者其可溶于油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合形成的乳剂中。应意识到可添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的弹性(tonicity)。典型地，合适的乳剂含有多至20%的油，例如5%和20%之间。脂肪乳剂包含0.1-1.0μm之间、尤其是0.1-0.5μm之间的脂肪微滴，并具有5.5-8.0范围内的pH。

乳剂组合物可以通过将PCSK9拮抗抗体与Intralipid^TM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备。

用于吸入或吹入的组合物包括在药物可接受的、水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有上述的合适的药物可接受的赋形剂。在一些实施方案中，通过口或鼻呼吸途径施用组合物用于局部或全身作用。优选地在无菌药物可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体进行雾化。被雾化的溶液可以从雾化装置中直接被呼吸，或者雾化设备可以附着于面罩、帷罩(tent)或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式输送所述配制物的装置中施用，优选经口或鼻。

编码抗体L1L3的重链和轻链可变区的多核苷酸于2009年8月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA90110,U.S.A.。L1L3重链可变区多核苷酸保藏物编号为ATCCAccession No.PTA-10302，L1L3轻链可变区多核苷酸保藏物编号为ATCCAccession No.PTA-10303。所述保藏物按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其规章的规定进行保藏。这确保保藏的存活培养物从保藏日起被维持30年。根据布达佩斯条约的规定，保藏物可以从ATCC获得，并且遵循Pfizer,Inc.与ATCC之间的协议，所述协议确保：相关美国专利公布或任何美国或外国专利申请公开后(先公开为准)，保藏的培养物后代永久和无限制地能够被公众获得，并根据35USC第122节及其委员规则(包括37CFR1.14节，尤其是指886OG638)确保美国专利和商标委员会授权的人能够获得所述后代。

本专利申请的受让人已经同意，如果保藏的材料的培养物在合适的条件下培养时死亡或丢失或损坏，将在通知后迅速用另一相同材料替换。保藏材料的可获得性不应被解释为可以违背任何政府当局根据其专利法授予的权利来实施本发明的许可。

实施例

如下实施例只是阐明本发明的方法和材料。本领域技术人员在本发明的精神和范围内可以对与本领域通常有冲突的条件和参数加以适当修改和调整。

实施例1：用人源化PCSK9拮抗抗体L1L3的治疗有效降低血清胆固醇和LDL胆固醇水平

本实施例举例说明了人源化PCSK9拮抗抗体在动物模型中降低血清胆固醇和LDL胆固醇水平中的效力。

L1L3是人源化(小鼠残基<5%)单克隆抗体，其结合分泌性PCSK9，有效阻止其下调LDLR，使得血清中LDL清除改善及LDL-C降低。

当将10mg/kg的L1L3以腹膜内(IP)单剂量施用正常饮食饲养的C57BL/6小鼠(n=10)时，在处理后48小时小鼠血清胆固醇水平降低至47mg/dL(降低37%)，相比之下盐水处理的对照小鼠血清胆固醇水平为75mg/dL，在处理后4天为44mg/dL(降低47%)，相比之下对照动物的水平为83mg/dL。在处理后7天，血清胆固醇水平恢复至69mg/dL。

在正常饮食饲养的Sprague-Dawley大鼠中进行剂量应答实验，施用单IP剂量0、0.1、1、10和80mg/kg(n=6/组)的L1L3。血清胆固醇水平呈现剂量依赖性降低，最大效应为在施用10和80mg/kg剂量后48小时可见降低50%。胆固醇水平下降的持续时间从1-21天也是剂量依赖性的。L1L3的降低胆固醇作用的量级和持续时间均与药物处理相关联。非空腹血清甘油三酯水平也是剂量依赖性升高，在80mg/kg剂量出现最大升高大约三倍，时程与药物暴露相关。由于在其它物种如小鼠和非人灵长类动物中未观测到L1L3对血清甘油三酯水平的相似作用(见下文)，并且血液甘油三酯水平改变在携带PCSK9突变的人体中未报道(Abifadel et al.,2003,Nat.Genet.,34:154-156；Cohen et al.,2005,Nat.Genet.37:161-165；Zhao et al.,2006,Am.J.Hum.Genet.79:514-523)，因此由L1L3处理所致血清甘油三酯水平增加看起来是在大鼠中物种特异性现象。

在正常饮食饲养的食蟹猕猴中，经IV施用单一剂量0.1、1、3和10mg/kg(n=4/组)的L1L3。施用0.1mg/kg L1L3导致在第2天LDL-C水平短暂降低50%，在第5天迅速恢复。施用1mg/kg剂量在第5天达到最大效应，LDL-C水平降低71%，之后立即开始恢复，在第14天达到给药前水平。施用3mg/kg剂量在第7天达到最大效应，LDL-C水平降低72%，在第13天开始恢复，在第22天恢复至基线水平。施用10mg/kg剂量在施用后直至21天仍保持LDL-C水平降低70%，在第31天动物完全恢复。L1L3的降低LDL-C作用的量级和持续时间均与药物处理相关联。在所有剂量组中，HDL-C水平均不受L1L3处理的影响。

在研究的第42天和56天(间隔2周)，将3mg/kg剂量组(n=4)的食蟹猕猴再施用两次额外的3mg/kg L1L3。这两次额外的剂量再次降低LDL-C及保持LDL-C水平低于50%持续4周时间。LDL-C水平在两周后恢复正常。血清HDL-C水平保持不变。

在食蟹猕猴中通过单次静脉内推注施用0.1、1.0、3.0、10.0和100.0mg/kg剂量L1L3进行PK研究，测量总抗体浓度。据估计在0.1mg/kg单剂量L1L3的β-相半衰期为0.67天，在1.0、3.0、10.0和100.0mg/kg剂量分别延长为1.91、2.33、3.49和5.25天。因此，在食蟹猕猴中，证实L1L3的半衰期的剂量依赖性和非线性缩短作用，这与抗原介导的降解及用具有膜结合的抗原的抗体治疗可见的结果一致。

概括而言，在动物模型中，L1L3结合并拮抗血清PCSK9功能，导致血清胆固醇和LDL胆固醇水平快速及显著降低。

实施例2：在单次、逐步增加剂量的经静脉内施用PCSK9拮抗抗体L1L3之后的药动学和药效学结果

这个实施例举例说明了评估其它方面健康的人对象中施用单次、逐步增加剂量的静脉内人源化PCSK9拮抗抗体L1L3给药之后的药动学和药效学的临床试验研究，所述人对象是降低胆固醇疗法的候选者。在所有评估的剂量组中，施用L1L3均使得LDL-C水平降低。

该研究限定是随机的、安慰剂对照的、增加的、单剂量的L1L3研究。所述对象、研究人员和现场工作人员(除了与准备药物相关的现场人员之外)对于治疗任务均是不知情的，是CRO指定人员；而赞助商临床研究组是知情的。这项研究是在每组8个对象共6组进行工作，以寻求最大耐受剂量或MTD(总共大约48个对象)。在每组中，向对象随机施用L1L3或安慰剂(3:1分配比率)。在前一夜空腹之后施用药剂，经静脉内输注60分钟。每个方案通过输注装置小心控制输注速度。单次输注60分钟。

剂量如下表1所示。

表1

调整给药方案以允许施用较低、中等或较高剂量，以获得最大耐受剂量及无作用剂量。无论其组别分配，登记入该研究中的每个对象，在其研究参与期间仅接受一次研究药物。为了安全性，对所有患者在其研究完成之前要再观测21天(共28天)。

该项研究的初级PK终点是L1L3的AUC₍₀-_t[last])、T_max和C_max。二级PK终点包括L1L3的终末消除半衰期(T_1/2)、清除率(CL)、稳态体积(Vss)及AUC_(0-∞)。评定血清脂质(总胆固醇，LDL，HDL，甘油三酯，非-HDL-C和Apoprotein B)的改变。

对每个对象在给药28天内进行筛查。对象在第0天接受单剂量L1L3，在限制期间(研究第-1、0和1天)以及在第4、7、14、21、28天，每天一次进行PK和安全性评定，第28天后根据初始PK结果评定。

这项研究的纳入标准如下：健康，非卧床、年龄在18-70岁之间的男性和/或女性(女性应为非备孕女性)，兼具以上；基础总胆固醇水平≥200mg/dl，基础LDL≥130mg/dl；体重指数(BMI)为18.5-35kg/m²BMI18.5-35，体重≤150kg，兼具以上；个人签名和注明日期的知情同意书表明该对象(或者法律可接受的代理人)已经被告知所有实验相关方面内容；并且自愿及能遵从计划的探访、治疗计划、实验室检查及其它实验程序。

这项研究的排除标准如下：临床显著的血液、肾脏、内分泌、肺、胃肠道、心血管、肝、精神、神经或者过敏性疾病(包括药物过敏，但是排除在给药时未治疗的无临床症状的季节性过敏反应)的迹象或病史；继发高血脂症；对象在本发明处理之前至少1周不应服用其它处方药。如果患者已经接受降脂药治疗，这些药物应终止足够时间以使得血清脂质恢复至治疗前水平；在给药前5天内有发热病史；中风或短暂脑缺血发作病史；在过去的一年内有心肌梗塞病史；尿液药物筛查阳性；在筛选的6个月内有定期饮酒对女性超过7杯/周)或者对男性超过14杯/周(1杯=5盎司(150mL)葡萄酒或者12盎司(360mL)啤酒或者1.5盎司(45mL)烈性酒；在第一次施用实验药物之前30天内或者5个半衰期(选择更长的)内用研究性药物治疗；在筛选时12-导联ECG证实QTc>450msec；怀孕或哺乳女性；备孕女性；在给药前56天内献血大约1品脱(500mL)；肝素或肝素诱导的血小板减少症敏感性病史(如果肝素用于冲洗静脉内注射导管)；其它急性或慢性医学或精神病或实验室检查异常，其可增加与参与研究或施用学术研究产物相关的危险，或者可干扰研究结果的解释，以及研究人员的判断，使得对象不适合纳入这项研究中。

将对象随机进行研究，只要满足所有的对象选择标准即可。使用计算机产生的随机方案指定对象治疗顺序。

对于增加剂量，由赞助商和研究人员在回顾来自在施用前一次剂量水平之后至少7天的所有组的对象的可用的安全性和耐受能力数据之后决定施用更高剂量的L1L3。

L1L3药物制品(100mg)以无菌液体形式提供，浓度为10mg/mL，在玻璃小瓶中以供静脉内(IV)施用，具有一个橡皮塞和铝封。每个小瓶含有10mL(可取体积)的L1L3，浓度为10mg/mL，pH为5.5。L1L3和安慰剂根据药学手册中的剂量和施用说明(Dosage and Administration Instructions in thePharmacy Manual)要求在现场制备。药物由合格的非盲现场人员制备，并以不知情形式分配给患者和直属研究人员。根据位于药学手册和研究参考指南(Pharmacy Manual and Study Reference Guide)的施用剂量说明(DosageAdministration Instructions，DAI)，用大约60分钟通过控速静脉内输注施用L1L3。

研究方案

第-1天：在开始第0天活动之前至少12小时随机指定对象编号并录入临床研究单元(Clinical Research Unit)，需要保留在临床研究单元(CRU)内直至第1天的程序完成。对象在第0天进行计划血脂检测(Lipid Panel)之前晚上开始禁食至少10小时。完成如下程序：复查自筛选以来的病史中的改变；复查自筛选以来伴随的药物治疗中的改变；复查自筛选以来的药物、乙醇和烟草使用史；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；身体检查，包括体重；尿液药物筛查；获得仰卧位生命体征；获得大约间隔2-4分钟的三次重复12导联ECG。

第0天：在给药之前，完成如下程序：收集在空腹至少10小时后的空腹脂质谱(总胆固醇，LDL，HDL，非-HDL胆固醇，Apo B和甘油三酯)；收集进行常规和额外实验室检查的样品：血液学、化学、凝集淀粉酶、尿液分析；收集进行给药前(pre-dose)PK的样品；收集PCSK9水平/PD感兴趣的标志物的样品；收集抗-L1L3抗体的样品；复查自筛选以来伴随药物治疗中的改变；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；获得仰卧位生命体征；药学手册说明(Pharmacy Manual Instructions)施用研究药物输注(Study Drug Infusion)。

在给药后，完成如下程序：获得间隔大约2-4分钟的三次重复12导联ECG，自输注结束(EOI)10分钟内开始；获得在EOI的仰卧位生命体征；收集在EOI及在输注后如下时间点(即EOI+如下时间点)的血液样品进行PK分析：60分钟，120分钟及360分钟。

第1天：完成如下程序：收集在给药后1440分钟(24小时)+/-30分钟的血液样品进行PK分析；进行简短的身体检查；收集在空腹至少10小时后的空腹脂质谱(总胆固醇，LDLHDL非-HDL胆固醇，Apo B和甘油三酯)；收集感兴趣的PCSK9水平/PD标志物的样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；获得仰卧位生命体征；从CRU中撤出。

第4天：完成如下程序：收集进行常规实验室检查的样品：血液学、化学和尿液检查；收集空腹至少10小时后的空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、Apo B和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物的样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来伴随药物治疗中的改变；获得仰卧位生命体征。

第7天：完成如下程序：进行简短身体检查；收集进行常规和额外的实验室检查的样品：血液学、化学、凝集、淀粉酶、尿液分析检查；收集空腹至少10小时的空腹脂质概况(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、Apo B和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物样品；收集抗-L1L3抗体的样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；复查自筛选以来药物、乙醇和烟草使用史；获得仰卧位生命体征；获得间隔大约2-4分钟的三次重复12导联ECG。

第14天：完成如下程序：进行简短身体检查；收集进行常规和额外实验室检查的样品：血液学、化学、凝集、淀粉酶、尿液分析检查；收集空腹至少10小时的空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、ApoB和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物样品；收集抗-L1L3抗体样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；复查自筛选以来的药物、乙醇和烟草的使用史；获得仰卧位生命体征。

第21天：完成如下程序：进行简短身体检查；收集进行常规和额外实验室检查的样品：血液学、化学、凝集、淀粉酶、尿液分析检查；收集空腹至少10小时的空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、ApoB和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物样品；收集抗-L1L3抗体样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；复查自筛选以来的药物、乙醇和烟草的使用史；获得仰卧位生命体征。

第28天：完成如下程序：进行全面身体检查；获得对象体重；收集进行常规和额外实验室检查的样品：血液学、化学、凝集、淀粉酶、尿液分析检查；收集空腹至少10小时的空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、Apo B和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物样品；收集抗-L1L3抗体样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；复查自筛选以来的药物、乙醇和烟草的使用史；获得仰卧位生命体征；获得间隔大约2-4分钟三次重复的12导联ECG。

对延长的PK的额外随访：当适当时完成如下程序：进行简短身体检查；收集进行常规和额外实验室检查的样品：血液学、化学、凝集、淀粉酶、尿液分析检查；收集空腹至少10小时的空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、Apo B和甘油三酯)；收集单一血液样品进行PK分析；收集PCSK9水平/感兴趣的PD标志物样品；收集抗-L1L3抗体样品；通过自主报告不利事件及通过询问对象回答非引导性问题如“你感觉如何”等评定症状；复查自筛选以来的伴随药物治疗中的改变；复查自筛选以来的药物、乙醇和烟草的使用史；获得仰卧位生命体征；获得间隔大约2-4分钟三次重复的12导联ECG。

各个患者的总血液取样体积为大约183-210mL。在第0天给药之前、输注结束时、在输注结束后60、120、360和1440分钟(24-小时)收集血浆样品以分析L1L3水平。此外，在第4、7、14、21、28天及额外的PK随访(适当时)时获得单一PK样品。在每个时间点抽取一份样品。

在第0天给药之前和在第1、4、7、14、21、28天及适当时额外的随访时获得血液样品，以评定PCSK9水平及其它感兴趣的实验性药效学标志物。

收集在空腹至少10小时后空腹脂质谱(总胆固醇、LDL、HDL、非-HDL胆固醇、Apo B和甘油三酯)。

研究结果

L1L3PK NCA结果：以0.3mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是2.71天。以1mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是4.77天。以3mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是8.1天。以6mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是7.75天。以12mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是12.24天。以18mg/kg剂量施用L1L3的半衰期中值是11.76天。L1L3PK浓度-时间图是多相的，与靶-介导的药物分配一致。然而，在人对象中L1L3的半衰期意外地及显著长于L1L3在食蟹猕猴中的半衰期(即在食蟹猕猴中施用1.0、3.0、10.0和100.0mg/kg剂量的半衰期分别为1.91、2.33、3.49和5.25天(见实施例1))。施用0.3、1、3、6、12和18mg/kg剂量的L1L3的平均药物清除率(Cl)分别为8.70、6.58、4.54、4.33、3.28和3.85mL/天/kg。得自这项研究的PKNCA结果在下表2中概括示出。在该表的2-7列，上方数值表示平均值，下方数值是中值。

表2：PK NCA结果

用L1L3处理导致明显的及持久的剂量依赖性空腹LDL-胆固醇(LDL-C)水平降低。LDL-C vs.时间谱在图1中示出。空腹LDL-C基线水平为大约145mg/dL。在给药后第7天，用单一剂量0.3、1、3、6、12或18mg/kg的L1L3处理的对象中LDL-C水平在50-100mg/dL之间。相反，施用安慰剂的对象中LDL-C水平通常保持在大约基线水平。在给药后第14天，用1、3、6、12或18mg/kg L1L3处理的对象中LDL-C水平为大约70mg/dL或更低。在给药后第14天，用6mg/kg或12mg/kg L1L3处理的对象中LDL-C水平为大约55mg/dL，用18mg/kg L1L3处理的对象的LDL-C水平为大约20mg/dL。用单一12mg/kg剂量的L1L3处理的对象中LDL-C水平在直至给药后至少大约57天(研究结束)保持在或低于大约60mg/dL。用单一18mg/kg剂量的L1L3处理的对象中LDL-C水平在直至给药后至少大约57天保持在或低于大约50mg/dL。用单一6mg/kg剂量的L1L3处理的对象中LDL-C水平在给药后大约42天保持低于50mg/dL，在直至给药后至少大约57天低于100mg/dL。用单一3mg/kg剂量L1L3处理的对象中LDL-C水平在给药后第14天为大约70mg/dL，在给药后第21天为大约60mg/dL，在直至给药后大约36天保持低于100mg/dL。用单一1mg/kg剂量L1L3处理的对象中LDL-C水平在给药后第14天为大约65mg/dL，在直至给药后第21天保持低于100mg/dL。用单一0.3mg/kg剂量L1L3处理的对象中LDL-C水平在给药后第7天为大约85mg/dL，在直至给药后大约10天保持低于100mg/dL。

血液中空腹LDL-C水平相对基线的变化的百分比在图2中示出(数据以平均值+/-SE示出)并在下表3中概括示出。在该表中，“N”表示对象数，“平均值”表示空腹LDL-C水平相对基线的变化的平均百分比，“PBO”是安慰剂。

表3

接受安慰剂的对象中LDL-C水平通常保持在基线或之上，在图2中以“0”表示。如上所示，空腹LDL-C基线为大约145mg/dL。施用18mg/kgL1L3导致相对基线的变化百分比升高至大约83%(图2)。单一18mg/kg剂量的L1L3使LDL-C水平在给药后至少直至57天保持低于基线大约65%。单一6mg/kg或12mg/kg剂量的L1L3使LDL-C水平在给药后直至43天保持低于基线大约60%。单一3mg/kg剂量的L1L3使LDL-C水平在给药后第29天保持低于基线大约60%，在给药后直至50天保持低于基线20%。

用L1L3处理导致空腹总胆固醇(TC)明显和持久的剂量依赖性降低。血液中空腹TC水平相对基线的变化百分比在图3中示出(数据以平均值+/-2SE表示)。空腹TC基线为大约230mg/dL；基线在图3中以“0”表示。在给药后大约第9天，施用单一12或18mg/kg剂量的L1L3的对象中TC水平降低至低于基线大约30%或者更低；TC降低作用持续至少至给药后第57天(研究结束)。施用单一6mg/kg剂量L1L3的对象中TC水平在给药后第9天降低至低于基线大约30%或更低直至给药后大约52天。施用单一3mg/kg剂量L1L3的对象中TC水平在给药后第9天降低至低于基线大约30%，在给药后大约第22天低于基线大约40%。施用单一3mg/kg剂量L1L3的对象中TC水平在给药后大约第22天降低至低于基线大约40%。施用单一1mg/kg剂量L1L3的对象中TC水平在给药后第15天降低至低于基线大约36%。施用单一0.3mg/kg剂量L1L3的对象中TC水平在给药后大约第9天降低至低于基线大约25%。在施用单一12或18mg/kg剂量L1L3之后，在给药后第15天，大多对象的TC水平低于基线50%。在施用单一6mg/kg剂量L1L3之后，在给药后第30天，许多对象的TC水平低于基线50%。在研究期间，在施用安慰剂的对象中TC水平保持在基线或在基线下2%之上。

用处理导致空腹阿朴脂蛋白B(apo B)水平明显和持久地剂量依赖性降低。血液中空腹apo B水平相对基线的变化百分比在图4中示出数据以平均值+/-2SE示出。空腹apo B的基线为大约119mg/dL；基线在图4中以“0”表示。施用安慰剂的对象中Apo B水平在研究期间保持在大约基线。施用12或18mg/kg剂量L1L3的对象中Apo B水平在第14天降低至低于基线大约50%，在剩余的研究期间保持在低于基线大约50%或更低。施用6mg/kg剂量L1L3的对象中Apo B水平在第14天降低至低于基线大约40%，在第21天低于基线大约50%，在剩余的研究期间一般低于基线大约30%。施用3mg/kg剂量L1L3的对象中Apo B水平在第14天降低至低于基线大约40%，在第28天低于基线大约50%。施用1mg/kg剂量L1L3的对象中Apo B水平在第14天降低至低于基线大约40%。施用0.3mg/kg剂量L1L3的对象中Apo B水平在第7天降低至低于基线大约25%。

如图5所示，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平在用L1L3处理后不显著改变。在图5中示出的数据是平均值+/-2SE。空腹HDL-C的基线是大约49mg/dL；基线在图5中以“0”表示。施用安慰剂的对象中HDL-C水平在研究期间保持大约基线。空腹甘油三酯(TGs)水平在研究期间保持不变。血液中空腹TG水平相对基线的变化百分比在图6中示出。数据以平均值+/-2SE示出。空腹TG基线为173mg/dL；基线在图6中以“0”表示。

在这项研究中，未发生严重不利事件，也无对象由于处理出现的不利事件(TEAEs)而终止。大多数TEAEs强度是轻度的，无一是严重程度。

概括而言，施用L1L3导致在所有评估的剂量组中LDL-C水平均降低。通常地，在第15天或第22天测量出现LDL-C水平最大百分比降低。降低作用在早如第3天即可见。LDL-C水平降低的程度和持续时间是剂量依赖性的。结果表明L1L3具有长期持续作用，即施用0.3mg/kg和1.0mg/kg剂量L1L3抗体的最大作用分别在第7天和第14天，在3.0mg/kg剂量最大作用直至4周，在6mg/kg、12mg/kg和18mg/kg剂量最大作用超过6周。这些持续作用基于L1L3的T¹/₂数据是未曾预料的。

实施例3：单剂量PCSK9拮抗抗体L1L3组合他汀类药物的药动学和药效学

这个实施例举例说明了临床实验研究以评估在施用稳定剂量阿托伐他汀的人对象中施用单剂量PCSK9拮抗抗体(L1L3)的药动学和药效学。

在这项研究中，对接受稳定剂量阿托伐他汀的人对象施用单剂量L1L3抗体，剂量为0.5mg/kg或者4mg/kg的PCSK9拮抗抗体。在大约60分钟单次输注施用L1L3。每个方案通过输注装置小心控制输注速度。在本研究方案中如下文所述施用阿托伐他汀(每日40mg)。在这项研究中，在其参与期间(不包括在临床留观期间第1天至第7天之内)自行服用阿托伐他汀的对象，在留观期间由专业的现场人员施用相同剂量。

以无菌溶液呈现以经静脉内(IV)注射施用L1L3注射液，10mg/mL。每个含有100mg L1L3的10mL水相缓冲液的小瓶用镀膜的塞子和铝封条密封。阿托伐他汀(40mg)是一种白色药片，一面编码为“PD157”，另一面为“40”。

在对每个对象施用药剂的28天内进行筛选。在筛选之前施用对象稳定剂量的阿托伐他汀至少45天。对象在第4天接受单剂量L1L3，在留观其间进行多次PK和安全性评定(研究第-1，1-7天)。将对象送回临床研究单元随访。

对于对象而言的关键纳入标准是：在第1天之前施用稳定剂量阿托伐他汀(每日40mg)45天，体重指数(BMI)为18.5-40kg/m²，兼具以上，体重等于或低于150kg。对于对象而言的关键排除标准是：在过去一年期间的心血管事件病史(如心肌梗塞(MI))；控制不良的1型或2型糖尿病(定义：不受控制的糖尿病定义为HBIAc>9%)；及控制不良的高血压(不受控制的高血压定义为即使施用治疗时收缩压高于140mm Hg或者舒张压高于90mmHg)。可包括患有高血压及可以稳定剂量抗高血压药物控制的对象。所述研究包括两种性别，最小年龄限于18，最大年龄限于80。

在存在阿托伐他汀和阿托伐他汀条件下施用单剂量0.5或4mg/kgL1L3抗体之后评估L1L3抗体的药动学参数。测量在施用L1L3抗体之后空腹LDL胆固醇(LDL-C)相对基线的变化的绝对值和百分比。在这项研究中，测量对象经历毒性或不耐受剂量标准的发生率。也测量因治疗出现的不利事件(TEAEs)的发生率，以严重度和与研究药物的因果关系分类。测量每个上述结果的时间范围是2个月。

研究方案

第-1天：安排对象进入临床研究单元(CRU)，并完成如下程序：复查和更新纳入和排除标准；复查和更新病史；复查和更新在施用计划的第一次剂量之前28天内所有处方药和非处方药及饮食补充剂的服用史；简单身体检查；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；10小时空腹后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学、血液学、尿液分析、凝集、脂肪酶、淀粉酶、CRP检查)；尿液药物和乙醇筛查；尿妊娠试验(备孕女性)；收集血液样品进行免疫原性分析(抗-L1L3抗体)；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)；收集血液样品进行药物基因组学分析(任选，对象同意)；三次重复仰卧位ECG；评定乙醇、咖啡因和烟草使用情况；评定基线症状/不利事件；及随机化对象。

第1天：在给药之前，完成如下程序：三次重复仰卧位ECG(适当时在插入IV导管之前)；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集血液样品(第1天，0小时)进行PK(阿托伐他汀)；对象服用赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)；在给药后，在如下时间点收集血液样品进行PK(阿托伐他汀)：第1天，0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和12小时。完成如下程序：评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。对象在第2天进行血液样品脂质检查之前空腹至少10小时。

第2天：在给药之前，完成如下程序：仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集血液样品(第2天，0小时)进行PK(阿托伐他汀)；空腹10小时后收集脂质检查；对象服用赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)。完成如下程序：评定基线症状/不利事件及复查伴随药物治疗。

第3天：在给药之前，完成如下程序：收集血液样品(第3天，0小时)进行PK(阿托伐他汀)；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压，脉搏，体温)；对象服用赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)。完成如下程序：评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。对象空腹至少10小时之后，在第4天进行血液样品脂质检查。

第4天：在施用阿托伐他汀和L1L3之前，完成如下程序：三次重复仰卧位ECG；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集血液样品(第4天，0小时)进行阿托伐他汀PK；收集血液样品(第4天，0小时)进行L1L3PK；在空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学、血液学、尿液分析、脂肪酶、淀粉酶、CRP检查)；称重；空腹10小时后收集脂质检查；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)；收集血液样品进行免疫原性分析(抗-L1L3抗体)。给药：对象服用赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)。L1L3通过控制速度的静脉内输注在大约60分钟内施用。给药后，完成如下程序：在第4天施用阿托伐他汀后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和12小时收集血液样品进行PK(阿托伐他汀)；在第4天从输注开始1、4、8和12小时收集血液样品进行PK(L1L3)；给药后1小时三次重复仰卧位ECGt；在L1L3输注开始第1和4小时仰卧位和直立体位生命体征测量(血压，脉搏，体温)；评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。在第5和第6天进行血液样品脂质检查之前，对象空腹至少10小时。

第5和6天：在给药之前，完成如下程序：仰卧位和直立体位生命体征测量(血压，脉搏，体温)；收集血液样品(第5天，0小时)进行PK(阿托伐他汀)；收集(第5天)血液样品进行PK(L1L3)；空腹10小时后收集脂质检查。仅第5天：收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)。对象服用赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)。完成如下程序：评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。在第7天收集脂质检查血液样品之前，对象空腹至少10小时。

第7天：在给药之前，完成如下程序：三次重复仰卧位ECG；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集(第7天)血液样品进行PK(阿托伐他汀)；收集(第7天)血液样品进行(L1L3)；在空腹10小时后收集脂质检查；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)；空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学、血液学、尿液分析、凝集、脂肪酶、淀粉酶、CRP检查)。对象服用最后一次赞助商提供的阿托伐他汀(40mg)。在从所述单元撤出之前，完成如下程序：简单身体检查；评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。提醒对象回到临床门诊，在第15天收集脂质检查血液样品之前空腹至少10小时。在剩余的研究期间对象持续服用其处方药阿托伐他汀。

第15天(±1天)：完成如下程序：简单身体检查；阿托伐他汀顺应性检查；标准仰卧位ECG；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压，脉搏，体温)；收集(第15天)血液样品进行PK(L1L3)；空腹10小时后收集脂质检查；收集血液样品进行免疫原性分析(抗-L1L3抗体)；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)；在空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学，血液学，尿液分析，CRP)；评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。提醒对象回到临床门诊，在第22天收集脂质检查血液样品之前空腹至少10小时。

第22天(±1天)：完成如下程序：简单身体检查；检查对阿托伐他汀的依从性；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集(第22天)血液样品进行PK(L1L3)；空腹10小时后收集脂质检查；在空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学，血液学，尿液分析，CRP)；评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。提醒对象回到临床门诊，在第29天收集脂质检查血液样品之前空腹至少10小时。

第29天(±1天)：完成如下程序：全面身体检查；阿托伐他汀顺应性检查；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集(第29天)血液样品进行PK(L1L3)；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)；收集血液样品进行免疫原性分析(抗-L1L3抗体)；在空腹10小时后收集脂质检查；三次重复仰卧位ECG；在空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学、血液学、尿液分析、CRP)，尿液药物和乙醇筛查；血清妊娠试验(备孕女性)；评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。提醒对象回到临床门诊，在第36天收集脂质检查血液样品之前空腹至少10小时。

第36、43、50、57和64天(终止随访)：完成如下程序：简单身体检查；阿托伐他汀顺应性检查；标准仰卧位ECG；仰卧位和直立体位生命体征测量(血压、脉搏、体温)；收集血液样品进行PK(L1L3)；收集血液样品进行免疫原性分析(抗-L1L3抗体)；在空腹10小时后收集脂质检查；在空腹10小时后收集血液和尿液样品进行安全性实验室检查(血清化学，血液学，尿液分析，CRP)，评定基线症状/不利事件；复查伴随药物治疗。仅第64天：尿液妊娠试验(备孕女性)；凝集试验；称重；收集血液样品进行药效学分析(PCSK9和脂质颗粒)。

第78和92天：在一些情况中，在等待自第57天的药动学结果期间，增加两次随访，第78天和第92天。在这种情况中，第57天的程序后接续第78天程序，第64天程序随后续接第92天程序。第92天成为终止随访。

结果

在这项研究中没有中止的对象。没有严重的不利事件(SAE)，即偏头痛恶化，这不是药物相关的。TEAE通常是非特异性的，强度不严重。此外，TEAE是短暂的，丙氨酸转氨酶(ALT)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)高于3xULN，无临床迹象/症状，所有均在一周内解决。

表4概括示出这项研究的L1L3PK参数。

表5概括示出这项临床实验研究结果，评估在接受稳定剂量阿托伐他汀的人对象中单次施用L1L3的药动学和药效学结果。表中提供了在施用L1L3抗体后(表4)空腹LDL-C水平相对基线的平均变化百分比值。

在存在阿托伐他汀(剂量=40mg)条件下用L1L3处理导致空腹LDL-C水平明显及持久地剂量依赖性降低。空腹LDL-C基线为大约72.5mg/dL。图7A示出在施用L1L3抗体之后的绝对空腹LDL-C水平。图7B示出在施用L1L3抗体之后空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。基线在图7B中以“0”表示。使用0.5mg/kg剂量L1L3，在施用L1L3之后第3天观测到最大LDL-C降低作用。使用4mg/kg剂量L1L3，在施用L1L3之后直至32天均观测到最大LDL-C降低作用。LDL-C降低的剂量依赖性反应在图8中示出。如图8示出，每个L1L3的施用剂量均使接受稳定剂量他汀类药物的患者的LDL-C水平降低。此外，接受稳定剂量他汀类药物的患者中LDL-C降低作用高于仅施用L1L3的患者中的作用(图8)。

实施例4：PK-PD建模及模拟时间谱

基于上述研究中提供的数据，产生模拟血清L1L3-时间谱和LDL-C-时间谱。图9A-F示出在施用指定剂量L1L3或者安慰剂之后L1L3(上方)和LDL-C(下方)的模拟时间谱。该模拟图是施用2mg/kg L1L3(左侧)或6mg/kgL1L3(中间)相比施用安慰剂(右侧)而产生的。在第0天和第29天施用L1L3或安慰剂，即间隔四周施用两次。图10示出在施用如下剂量的L1L3之后的模拟LDL-C-时间谱：0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg和6mg/kg，每次在第0、29和56天施用(图10)。模拟L1L3-时间谱和LDL-C-时间谱证实每四周施用一次低剂量的L1L3产生持久的LDL-C降低。

实施例5：多次L1L3给药之后的药动学和药效学

这个实施例举例说明了一项临床实验研究，评估在人对象中多次PCSK9拮抗抗体(L1L3)静脉内给药之后的药动学和药效学。

这项研究是随机的、多中心的、双盲的、安慰剂对照的平行设计的实验，其具有28天筛查期，4周治疗期和8周随访期(图11)。在这项研究中，对日本人对象施用L1L3抗体，剂量为0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg或者1.5mg/kg的PCSK9拮抗抗体。对于每个对象，本研究由三个时期组成：审查期，治疗期和随访期。治疗期持续直至大约28天，在第1、8、15和22天施用4次单一I.V.L1L3或安慰剂给药。随访期持续大约8周，从大约第29天开始至最后随访(第78天)。对象定期在临床门诊进行安全性评定及收集进行常规实验室检查、脂质谱、PK、PD和免疫原性检查的血液样品。

每周一次施用所有检测剂量的L1L3处理，导致空腹水平持久、明显及长期的剂量依赖性降低。空腹LDL-C基线为大约155mg/dL。图12示出施用L1L3抗体之后的绝对空腹LDL-C水平。图13示出在施用L1L3抗体之后的空腹LDL-C水平相对基线的变化百分比。基线在图13中以“0”表示。

图14中的表概括示出这个临床实验研究结果，评估在接受稳定剂量阿托伐他汀的人对象中多次L1L3给药之后的药动学和药效学结果。图中提供了在施用L1L3抗体之后空腹LDL-C水平相对基线的变化平均百分比(平均值)(图14)。

实施例6：组合他汀类药物多次L1L3给药之后的药动学和药效学

这个实施例举例说明了一项临床实验研究，评估在服用阿托伐他汀、辛伐他汀或罗苏伐他汀的人对象中多次PCSK9拮抗抗体(L1L3)给药之后的药动学和药效学结果。

这项研究是随机的、多中心的、双盲的、安慰剂对照的平行设计的实验，3周筛查期，12周治疗期和8周随访期。

纳入这项研究中的对象符合所有如下标准：男性和女性对象年龄超过或等于18岁；体重指数为18.5-40kg/m²；总体重高于50kg(110lbs)及低于150kg(330lbs)；稳定日剂量的他汀类药物，规定为阿托伐他汀40或80mg，罗苏伐他汀20或40mg，或者辛伐他汀40或80mg，在第1天之前最少服用45天；在两次资格审查(qualifying visits)时(筛查和第-7天)脂质水平符合如下标准：空腹LDL-C水平高于或等于100mg/dL。

对象定期在临床门诊进行安全性评定及收集血液提供安全性实验、脂质谱、PK、PD和免疫原性样品。在筛查期间及在第3天每次随访之前进行电话联系，以提醒对象需要空腹10小时，评定不利事件并在对象源文件中记录该联系。对象在第1、29和57天接受一次1mg/kg L1L3、3mg/kgL1L3、6mg/kg L1L3或安慰剂输注，在治疗期和随访期进行多次效力、安全性和PK评定。每个方案通过输注装置小心控制输注速度。在大约60分钟内施用单一输注。

结果

3mg/kg的给药方案和6mg/kg的给药方案均达到LDL-C相对基线变化30%，这是统计学显著并且超出目标值的。观测到L1L3对甘油三酯无作用。可见HDL水平略微升高，最高升高9%。处理组和记录在表6中示出。

表6

预定的主要效力终点是在第85天LDL-C相对基线的变化百分比，这是使用ANCOVA模型分析的。最终的ANCOVA模型含有关于基线LDL-C和处理的期限(term)。为了防止主要终点分析在0.05水平的整体I型误差率，采用Haybittle-Peto，以0.001α损耗(alpha spent)为界限。

在3和6mg/kg治疗组中，通过由剂量漏服(missing-ness of doses)驱动的LDL-C变化观测到明确的剂量应答的强治疗作用(图15和16)。随后使用混合模型重复测量分析LDL-C数据，以预估这两种治疗的时间和根据经验的剂量应答谱。

当加入他汀类药物时另外降低30%LDL-C的预定目标值是成功的概念证明标准。当加入他汀类药物治疗时，在每4周施用3和6mg/kg剂量组明确实现了这个LDL-C降低30%或更多的目标水平(图15和16)。图15中的图表示出研究和治疗期相对基线的变化百分比，图16中的图表示出除了错过给药的对象之外的研究和治疗期的相对基线的变化百分比。在接受稳定日剂量他汀类药物的患者中，3mg/kg L1L3的给药方案在第29天实现LDL-C水平低于基线大约50%(图15)。在接受稳定日剂量他汀类药物的患者中，6mg/kg L1L3的给药方案在第29天实现LDL-C水平低于基线大约65%(图15)。施用3mg/kg和6mg/kg给药方案均使LDL-C水平降低30%以上持续28天(图16)。在表7中提供了在第85天由安慰剂调节的治疗效力的统计学概述。在表7中，脂质的基线定义为在第-7天和第1天观测数值的平均值。

表7：在第85天LDL-C数据相对基线的变化百分比的统计学分析(MMRM)总结

L1L3Cmax和低谷浓度在表8中示出。

表8:L1L3药动学

在接受稳定日剂量他汀类药物的患者中每月一次用3和6mg/kg剂量的L1L3处理导致血液中LDL-C水平相对基线降低30%以上。观测到HDL水平的升高较低(至多9%)，L1L3对甘油三酯的作用较小。L1L3通常是安全的并具有良好的耐受性。LFTs、CK、ECG和BP中的改变是短暂的、适度的，在大多数情况中被认为与治疗不相关。没有对象存在阳性ADA。

实施例7：组合他汀类药物多次L1L3给药之后的药动学和药效学

这个实施例举例说明了一项临床实验研究，评估在人对象中组合他汀类药物在多次经皮下PCSK9拮抗抗体(L1L3)给药之后的LDL-C水平。

这项研究是随机的、多中心的、双盲的、安慰剂对照的、平行设计组的、剂量变化研究设计的实验，在接受他汀类药物的高胆固醇血症患者中每月经皮下施用一次及每月经皮下施用两次，共施用L1L3六个月，以评定其效力、安全性和可耐受性。计划在两个给药方案(Q28d或Q14d)中共分7个剂量组，每组50个对象。方案设计在表9中示出。

表9

资格：18岁或更大年龄。

纳入标准：对象应接受稳定剂量的(至少6周)任何他汀类药物并在这个实验期间继续接受相同剂量他汀类药物。在筛查及在第1天随机化之前至少7天的2次筛查时脂质水平应符合以下治疗背景水平：空腹LDL-C高于或等于80mg/dL(2.31mmol/L)；空腹TG低于或等于400mg/dL(4.52mmol/L)；对象空腹LDL-C水平必须高于或等于80mg/dL(在最初筛查时2.31mmol/L，在随机化7天内第二次筛查时该数值必须不低于初始值的20%以符合这个实验的资格)。

初级的结果测量是在随机化后12周结束时从LDL-C基线变化的绝对值。次级结果测量包括如下内容：评定在随机化后12周结束时LDL-C的变化及相对基线的变化百分比；血浆稳态L1L3药动学参数；LDL-C低于指定限值(<100mg/dL，<70mg/dL，<40mg/dL，<25mg/dL)的对象的比例；评定在随机化后12周结束时总胆固醇的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时ApoB的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时ApoA1的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时脂蛋白(a)的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时HDL-胆固醇的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时极低密度脂蛋白的变化及相对基线的变化百分比；评定在随机化后12周结束时甘油三酯的变化及相对基线的变化百分比；及评定在随机化后12周结束时非-HDL-胆固醇的变化及相对基线的变化百分比。

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Claims (36)

1.前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，用于治疗特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病，其中所述PCSK9拮抗抗体以初始施用剂量为至少大约3mg/kg、大约4mg/kg、大约5mg/kg或者大约6mg/kg施用；随后施用多个后续剂量，所述后续剂量与初始剂量大约相同或低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一个后续及额外的后续剂量彼此间隔至少大约4周。

2.前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，用于治疗特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病，其中所述PCSK9拮抗抗体以初始施用剂量为至少大约200mg或大约300mg施用；随后施用多个后续剂量，所述后续剂量与初始剂量大约相同或低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一个后续及额外的后续剂量彼此间隔至少大约4周。

3.前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，用于治疗特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病，其中所述PCSK9拮抗抗体以初始施用剂量为至少大约50mg、大约100mg或大约150mg施用；随后施用多个后续剂量，所述后续剂量与初始剂量大约相同或低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一个后续及额外的后续剂量彼此间隔至少大约2周。

4.权利要求1-3任一项的PCSK9拮抗抗体，其中在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前已经施用了他汀类药物。

5.权利要求4的PCSK9拮抗抗体，其中施用日剂量的他汀类药物。

6.权利要求4或5的PCSK9拮抗抗体，其中在施用初始剂量的PCSK9抗体之前已经施用稳定剂量的他汀类药物至少大约2、3、4、5或6周。

7.权利要求4-6任一项的PCSK9拮抗抗体，其中所述他汀类药物是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、或者其任何药物可接受的盐或者立体异构体。

8.权利要求5的PCSK9拮抗抗体，其中他汀类药物的日剂量选自40mg阿托伐他汀、80mg阿托伐他汀、20mg罗苏伐他汀、40mg罗苏伐他汀、40mg辛伐他汀、及80mg辛伐他汀。

9.权利要求1-8任一项的PCSK9拮抗抗体，其中所述疾病是高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病或者急性冠脉综合征(ACS)。

10.权利要求1-19任一项的PCSK9拮抗抗体，其中所述抗体包含来自具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区的三个CDR，及来自具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR。

11.权利要求10的PCSK9拮抗抗体，其中所述抗体是L1L3。

12.权利要求1-11任一项的PCSK9拮抗抗体，其中所述抗体经皮下或者静脉内施用。

13.权利要求1-12任一项的PCSK9拮抗抗体，其中所述抗体大约每月施用一次。

14.治疗易感于或诊断为患有特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病的患者的方法，包括：

给患者施用初始剂量的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，所述初始剂量为至少大约3mg/kg、大约4mg/kg、大约5mg/kg，或者大约6mg/kg；

给患者施用多个后续剂量的所述抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一次后续剂量及额外的后续剂量彼此间隔至少大约4周。

15.治疗易感于或诊断为患有特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病的患者的方法，包括：

给患者施用初始剂量的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，所述初始剂量为至少大约200mg或者大约300mg，及

给患者施用多个后续剂量的所述抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一次后续剂量及额外的后续剂量彼此间隔至少大约4周。

16.治疗易感于或诊断为患有特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的疾病的患者的方法，包括：

给患者施用初始剂量的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)拮抗抗体，所述初始剂量为至少大约50mg、大约100mg或者大约150mg，及

给患者施用多个后续剂量的所述抗体，所述后续剂量与初始剂量大约相同或者低于初始剂量，其中所述初始剂量与第一次后续剂量及额外的后续剂量彼此间隔至少大约2周。

17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述患者正在用他汀类药物进行治疗。

18.权利要求17的方法，其中所述患者正在用日剂量的他汀类药物治疗。

19.权利要求17或18的方法，其中所述患者在施用初始剂量的PCSK9抗体之前已经接受稳定剂量的他汀类药物至少大约2、3、4、5或6周。

20.权利要求17-19任一项的方法，其中所述他汀类药物是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、或者其任何药物可接受的盐或者立体异构体。

21.权利要求18的方法，其中他汀类药物的日剂量选自40mg阿托伐他汀、80mg阿托伐他汀、20mg罗苏伐他汀、40mg罗苏伐他汀、40mg辛伐他汀及80mg辛伐他汀。

22.权利要求14-21任一项的方法，其中所述疾病是高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病或者急性冠脉综合征(ACS)。

23.权利要求14-22任一项的方法，其中所述患者在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前的空腹总胆固醇水平为大约70mg/dL或更高。

24.权利要求14-23任一项的方法，其中所述患者在施用初始剂量的PCSK9拮抗抗体之前的空腹LDL胆固醇水平为大约130mg/dL或更高。

25.权利要求14-24任一项的方法，其中所述抗体包含来自具有SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的重链可变区的三个CDR，及来自具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区的三个CDR。

26.权利要求25的方法，其中所述抗体是L1L3。

27.权利要求14-26任一项的方法，其中所述抗体经皮下或静脉内施用。

28.权利要求14-27任一项的方法，其中所述抗体大约每月施用一次。

29.一种制造品，其包含容器，置于所述容器内的包含PCSK9拮抗抗体的组合物，及含有施用PCSK9拮抗抗体的说明的包装插页，说明施用的初始剂量为至少大约3mg/kg、大约6mg/kg、大约200mg或者大约300mg，并施用至少一个后续剂量，所述后续剂量与初始剂量相同或低于初始剂量，其中初始剂量与后续剂量的施用彼此间隔至少大约4周。

30.权利要求29的制造品，其中所述包装插页包括给正用他汀类药物治疗的个体施用PCSK9拮抗抗体的说明。

31.权利要求30的制造品，其中所述他汀类药物是阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、或者其药物可接受的盐或者立体异构体。

32.权利要求29-31任一项的制造品，其中所述说明指明通过静脉内或皮下注射施用初始剂量，并通过静脉内或皮下注射施用至少一个后续剂量。

33.权利要求29-32任一项的制造品，其中施用多个后续剂量。

34.权利要求29-33任一项的制造品，进一步包含在所述容器上或与其关联的标签，所述标签指明所述组合物可用于治疗特征在于血液中升高的低密度脂蛋白胆固醇水平的病症。

35.权利要求29-34任一项的制造品，其中所述标签指明所述组合物可用于治疗高胆固醇血症、致动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、心血管疾病或者急性冠脉综合征(ACS)。

36.权利要求29-35任一项的制造品，其中所述抗体是L1L3。