CN104099423A - 用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记,选择刀鲚逆转座子SINE的多态性位点为目标,依据插入位点的侧翼序列,设计特异性引物,应用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分子克隆等方法获得SINE插入或缺失位点的DNA片段,用这些特异的DNA片段来识别刀鲚的不同种群。本发明可以快速、准确地确定刀鲚种群,在刀鲚的分子标记辅助育种、鱼苗的人工放流效果评价和种群动态监测等方面具有广泛用途。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类的分子生物学技术领域,具体地说,是一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记。
背景技术
鱼类物种的界定涉及两个层次,一是物种水平,二是种群水平。物种识别方法有外部形态判断法、生化法,以及最近十几年发展的一种分子标记的方法。形态判断法常用于物种水平的鉴别;种群水平的识别,曾使用生化方法,但该方法较为繁锁,且误判率也较高,现基本上不再采用,取而代之的是一种分子标记的方法。因为分子标记的稳定性好,现被广泛地应用于鱼类种群识别、种群遗传结构、遗传作图等理论研究,以及鱼类保护生物学和鱼类遗传育种等实践领域。
目前,基于DNA片段差异作为分子标记的主要有3种: (1) 基于PCR的分子标记技术,如限制性片段长度多态性,随机扩增多态性DNA,基因特异扩增片段长度多态性等;(2)基于重复序列的分子标记,如微卫星DNA和小卫星DNA;(3)基于转座子的插入和缺失的分子标记,如Tc1和SINE。
SINE
( short interspersed element , SINE )称短散在重复序列,序列长度一般仅为 100~ 500 bp, 在真核生物基因组中的拷贝数为103~105,散布于生物基因组内。SINE具有3个结构域:5’端tRNA相关区、tRNA非相关区、3’端尾区。SINE在相关的逆转座酶的介导下,通过“复制-插入”的机制,其复制子整合到宿主的基因组内。SINE插入到基因组内后,将会产生稳定的遗传;而且宿主对SINE的插入缺乏删除机制,使得不同种系基因组的等位点产生SINE的插入或缺失,通过“插入或缺失”性状,可识别不同的种系或种群。
中国专利文献CN103820467A公开了一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法,先分离出牡丹SINE类反转录转座子的部分序列,根据其序列设计引物;以所设计引物进行PCR反应,得到生物素标记的探针;提取牡丹基因组后进行酶切,得到基因组酶切片段;同时将两条寡聚核苷酸链退火,形成双链的寡聚核苷酸接头,之后将酶切后的基因组片段与接头连接,并以单引物的PCR扩增,进行基因组片段库的富集;将生物素标记的探针与所得基因组片段杂交,筛选出目的片段;所得目的片段进行接头PCR,将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后,测序,进行序列分析,得到牡丹SINE类反转录转座子序列。目前,针对鱼类开发的SINE分子标记非常稀少,本发明提供的对于名贵的刀鲚(Coilia nasus)的不同生态型种群的SINE标记还未见研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记,所述的分子标记为SINE插入位点的特异引物,所述的特异引物为Locus 18位点、Locus
40位点或Locus 58位点的引物的一种或者其组合,所述的引物序列分别为:
Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO.1所示,
Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO.2所示,
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示,
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
所述的分子标记用于识别刀鲚的不同种群。
所述的分子标记进行种群识别的方法,包括以下步骤:运用所述的分子标记通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,根据扩增片段数目、大小的差异性,识别出刀鲚的不同种群。
本发明优点在于:
基于SINE位点扩增片段的数目和大小的分子标记技术,可以快速、准确地确定刀鲚种群。
附图说明
附图1是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS),上海崇明(CM),江苏靖江(JJ),太湖(TH),江西鄱阳湖(PY),湖南洞庭湖(DT)种群,每个种群样本数10尾(1-10), Locus 18 DNA片段的扩增结果。
附图2是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS),上海崇明(CM),江苏靖江(JJ),太湖(TH),江西鄱阳湖(PY),湖南洞庭湖(DT)种群,每个种群样本数10尾(1-10), Locus 40 DNA片段的扩增结果。
附图3是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS),上海崇明(CM),江苏靖江(JJ),太湖(TH),江西鄱阳湖(PY),湖南洞庭湖(DT)种群,每个种群样本数10尾(1-10), Locus 58DNA片段的扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明通过选择SINE插入位点的侧翼序列,设计特异引物,利用PCR、分子克隆和测序等现代分子生物学技术,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统获得的图片,根据凝胶图片上DNA片段的大小和数目,识别刀鲚不同生态型种群。
实施例
1
实验材料
刀鲚按照样本来源,分为浙江象山港(XS),上海崇明(CM),江苏靖江(JJ),太湖(TH),江西鄱阳湖(PY),湖南洞庭湖(DT)6个种群,每个种群样本数为10尾。浙江象山港样本来自水产品市场,采集地不祥,其余样本为随船捕捞。
基因组
DNA
提取
样本基因组DNA的提取,按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒说明书操作,提取的DNA用紫外分光光度计检测其质量和浓度,-20℃保存备用。
位点分离
根据SINE的保守序列设计引物,通过PCR方法获得刀鲚基因组中SINE部分序列,此序列的5端连接生物素,作为探针,然后与磁珠形成“探针-生物素-磁珠”复合体后,与酶切的刀鲚基因组DNA文库杂交,捕获文库中包含SINE的DNA片段,克隆和测序,由此得到刀鲚基因组中SINE插入位点的信息。
引物设计
根据SINE插入位点的侧翼序列,用PrimerPremier6.0软件和Jellyfish1.4软件,设计SINE插入位点的特异引物,由上海Sangon生物工程公司合成,PCR对刀鲚不同生态型种群的DNA扩增后,有3对引物在不同种群中扩增出差异的DNA条带,其序列分别是:
Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO.1所示,
Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO.2所示,
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示,
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
扩增和克隆
PCR扩增反应在德国Eppendorf公司生产的Mastercycler® ep gradient热循环仪上进行,每个扩增反应总体积为20ul,其中模板基因组DNA10Ong,每种dNTP,每种引物各0.5ul,TaqDNA聚合酶0.25U,反应液在94℃预变性3 min,94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸8min,共35个循环,最后在72℃延伸10min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中分离,用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段,纯化方法参照产品手册进行,将回收的DNA片段克隆于载体pMD19-T(TakaRa公司),连接反应及细菌转化按pMD19-T载体试剂盒说明书进行操作。
测序和序列分析
选取阳性克隆菌落,经PCR鉴定后,由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序,采用Blastn软件进行核苷酸序列相似性比较,分析所得克隆序列是否在其他物种中存在同源性。依据Jellyfish软件分析SINE的插入或缺失。
综合运用以上实验方法与技术,扩增刀鲚不同生态型种群中SINE插入或缺失位点的DNA片段,下面将结合附图,进一步详述其扩增结果在刀鲚种群识别上的应用。
从图1可知,XS、CM、JJ、TH的种群中,样本能扩增出1条大小分别约为450 bp的条带;PY、DT的种群中,样本能扩增出450,200bp的条带,仅在PY5和DT6、DT7样本中不能扩增200 bp的条带。Locus 18位点的200bp的条带,用于识别PY和DT种群样本的准确率85%(17/20)。
从图2可知,XS、CM、JJ、TH的种群的样本,部分样本能扩增出450、250 bp的2条带;PY、DT群体样本都能扩增出1条大约450bp的条带。Locus 40位点的250bp的条带,用于识别CM、JJ、TH种群样本的准确率73%(22/30),从XS的群体中误判率为20%(2/10),可把CM、JJ、TH种群与XS、PY、DT群体相区分。
从图3可知,XS、CM、JJ、TH的群体样本都能扩增出1条大小约为400 bp的条带;PY、DT的群体样本能扩增出1条约为300bp的条带,仅PY9扩增出400bp的条带。Locus 58位点的300bp的条带,用于识别PY和DT种群样本的准确率95%(19/20),可把PY、DT种群与XS、CM、JJ、TH群体相区分。
综合使用上述3个位点的SINE分子标记,可快速、准确地识别出刀鲚的鄱阳湖和洞庭湖的种群。
实施例
2
实验方法
SINE插入位点的特异引物,其序列为:
Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO.1所示,
Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO.2所示,
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示,
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,根据扩增片段数目、大小的差异性,识别出刀鲚的不同种群。
实施例
3
实验方法
SINE插入位点的特异引物,其序列为:
Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO.1所示,
Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,分析Locus 18位点的测序结果,能够扩增出1条大小约为450bp的条带但不能扩增出200bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚,能扩增出450、200bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
实施例
4
实验方法
SINE插入位点的特异引物,其序列为:
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示。
通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,分析Locus 40位点的测序结果,能扩增出450bp、250bp的2条带的样本为崇明、靖江或太湖的刀鲚,能扩增出1条约为450bp的条带的样本为象山港、鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
实施例
5
实验方法
SINE插入位点的特异引物,其序列为:
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,分析Locus 58位点的测序结果,能够扩增出1条大小分别约为400 bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚,能扩增出1条约为300bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
实施例
6
实验方法
SINE插入位点的特异引物,其序列为:
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示,
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,分析Locus 40和Locus 58位点的测序结果:Locus 40位点能扩增出450bp、250bp的2条带,Locus 58位点能够扩增出1条大小分别约为400 bp的条带的样本为崇明、靖江或太湖的刀鲚;Locus
40位点能扩增出1条约为450bp的条带,Locus 58位点能够扩增出1条大小分别约为400 bp的条带的样本为象山港的刀鲚;Locus 40位点能扩增出1条约为450bp的条带,Locus 58位点能够扩增出1条大小分别约为300 bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>
上海海洋大学
<120>
用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 1
ggcatggttg acaatgtgct
ctg
23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 2
acctgctctt ccttgatttc
cactc
25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 3
ccatcggaga gcacgcaact
t
21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 4
acctgccgcc ttccaactga
20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 5
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gtt
23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213>
人工序列
<400> 6
gtgccaggat ggaggatgtc
att
23
Claims (3)
1.一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记,其特征在于,所述的分子标记为SINE插入位点的特异引物,所述的特异引物为Locus 18位点、Locus 40位点或Locus 58位点的引物的一种或者其组合,所述的引物序列分别为:
Locus 18位点的上游引物如SEQ ID NO.1所示,
Locus 18位点的下游引物如SEQ ID NO.2所示,
Locus 40位点的上游引物如SEQ ID NO.3所示,
Locus 40位点的下游引物如SEQ ID NO.4所示,
Locus 58位点的上游引物如SEQ ID NO.5所示,
Locus 58位点的下游引物如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记的用途,其特征在于,所述的分子标记用于识别刀鲚的不同种群。
3.根据权利要求1所述的分子标记进行种群识别的方法,其特征在于,包括以下步骤:运用所述的分子标记通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段,根据扩增片段数目、大小的差异性,识别出刀鲚的不同种群。
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