CN104087531A - 一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法。该粪产碱杆菌突变株的保藏编号为CGMCC No.9291。以上述菌株制备可得然胶的方法，包括斜面培养、种子培养、发酵和后提取工艺。其中后提取为：发酵液中溶菌酶，搅拌均匀后离心分离，固形物加入水，搅拌后再次离心分离；取固形物加入乙醇，搅拌均匀后板框压滤，干燥得到产品。本发明的发酵初糖浓度高达7％，分批发酵最终胶得率高达4.8％，且发酵过程中发酵液不粘稠，传质传氧效果良好，该菌株发酵过程中所用碳酸钙用量仅为0.05％，发酵结束后碳酸钙几乎无残留，提取得到的产品纯度可高达90％以上。所得胶体为半透明状，韧性佳，后处理工艺简单易行。

Description

一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法

技术领域

本发明涉及一种可得然胶的制备方法，具体是涉及一株粪产碱杆菌突变株，用它发酵生产可得然胶的方法及产品后提取的方法。 

背景技术

可得然胶(Curdlan)是一种新型的微生物胞外多糖，由于该多糖具有在加热条件下形成凝胶的独特性质，故又称作热凝胶。化学与酶学分析都已确定，可得然胶是由单一的D-葡萄糖在C1和C3位置以β-1,3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物。一般情况下，每个可得然胶分子由300-500个葡萄糖残基组成，平均聚合度为450，相对分子量约为74000，分子式为(C₆H₁₀O₅)n，n>250。据分析，分子聚合度的不同可能是由于菌种及发酵条件不同造成的，菌种及发酵过程中的供氧及营养状况都会影响可得然胶的聚合度，从而影响可得然胶的质量。凝胶强度随着聚合度值的变化而变化，当聚合度小于50时，可得然胶在水中不能形成凝胶，当聚合度较低时，形成的凝胶强度较小，随着聚合度的增高，凝胶强度变大。通常情况下，由300-500个葡萄糖残基连接而成的可得然胶就具有较强的热凝胶特性。可得然胶具有许多特殊的理化性质，在生物医学和食品加工等领域有广阔的应用前景。美国FDA于1996年准许将其作为食品的稳定剂、增稠剂和调质剂应用于食品配料中。可得然胶因此成为继黄原胶、结冷胶之后第三个经FDA批准的发酵生产的食品用多糖，这为可得然胶的进一步推广应用提供了更为广阔的空间，可得然胶的应用与食品开发也达到了一个新的水平。我国于2006年正式批准可得然胶为食品添加剂新品种。 

目前，可得然胶主要采用土壤杆菌Agrobacterium biovarl或粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis 发酵蔗糖或葡萄糖制备而来，所用氮源则为酵母膏，这就导致发酵产品颜色偏暗，且皆存在发酵效率偏低以及碳酸钙用量偏高而导致发酵结束后碳酸钙大量残留，从而出现产物纯度低、透明度低且可得然胶强度偏低等问题。由于存在上述问题，想要取得高质量的产品需要进行繁琐复杂的提取工艺，同时提取过程中还容易造成可得然胶的强度遭受破坏，产生大量的废品。如申请号为200410041271.8(发明名称为：一种微生物多糖-热凝胶的提取工艺)的中国专利，其精品热凝胶的提取过程需要经过高浓度碱溶液，高转速离心，大量盐酸回调及大量水洗涤等过程，不仅工艺复杂，容易破坏凝胶强度，而且污染严重，不适合大批量生产，而且最终所得产品纯度仅为83-86％；未经酸碱处理直接离心洗涤得到的产品，纯度仅为66.7％。申请号为201110218879.3(发明名称：可得然胶的后提取方法)的中国专利，其整个提取过程虽然用到酶处理除杂，但同样需经过大量酸碱处理及大量水洗涤。 

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，通过突变筛选得到了一株新的粪产碱杆菌菌株JSYM-1。本发明以葡萄糖、蔗糖及无机氮源为原料，采用该粪产碱杆菌突变株JSYM-1发酵生产可得然胶，发酵液中碳酸钙加量仅为0.05％，发酵结束后几乎无残留，后提取工艺简单易行，提取得到的产品纯度可高达90％以上。 

本发明的粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)JSYM-1，是以粪产碱杆菌CICC20602为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍诱变处理并涂布高糖苯胺蓝筛选培养基分离筛选得到的高产菌株，该菌株的生长活性好，发酵制备的可得然胶聚合度高，得率高。该菌株已于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.9291。 

以该粪产碱杆菌突变株JSYM-1制备可得然胶的方法，具体包括以下步骤： 

(1)斜面培养： 

将粪产碱杆菌突变株划线接种于斜面培养基，于28-30℃静置培养48-72hr，4℃冰箱保藏1个月内可使用； 

(2)种子培养： 

将步骤(1)的培养物接种于种子培养基中，于28-30℃，通气搅拌培养18-26hr，得到种子液； 

(3)发酵： 

将步骤(2)的种子液接种于发酵培养基中，接种量为1-10％，28-30℃，通气搅拌培养84-96hr； 

(4)后提取工艺： 

发酵结束后，向发酵液中加入10-100ppm的溶菌酶(溶菌酶单位为50-500万)，维持发酵液温度在28-32℃，保温低速(速度为60-80转/分钟)搅拌30-40min；取发酵液进行离心分离(分离因数8000-10000)，弃上清，固形物加入原发酵液体积1.5-2倍的水，搅拌均匀后，再次离心分离(分离因数6000-8000)；弃上清，取固形物加入原发酵液体积0.4-0.6倍的浓度为90％-95％的乙醇，搅拌均匀后板框压滤，收集固体物料，经真空干燥机干燥得到产品。 

各培养基成分如下： 

斜面培养基为(wt％)：葡萄糖或蔗糖 1.00％，酵母膏 0.30％，蛋白胨 0.50％，NaCl0.50％，琼脂 1.50％，pH调至7.0； 

种子培养基(wt％)：葡萄糖2.00％，(NH₄)₂HPO₄0.50％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄·7H₂O0.10％，玉米浆粉0.05％，CaCO₃0.30％，pH7.2，121℃灭菌20min； 

发酵培养基(wt％)：葡萄糖 3.00％，蔗糖 4％，(NH₄)₂HPO₄ 0.20％，KH₂PO₄ 0.20％，MgSO₄·7H₂O 0.10％，CaCO₃ 0.05％，玉米浆粉 0.08％，pH7.0，121℃灭菌20min。 

本发明的有益效果是： 

1、本发明通过诱变处理筛选得到的粪产碱杆菌突变株JSYM-1，经发酵培养基及培养条件优化后，分批发酵条件下得率可达到48g/L。本发明突变株所用氮源为无机氮，培养基中几乎无任何不溶性及色泽深的物质，使得发酵液颜色为浅灰色，产品色泽较白。 

2、本发明的发酵初糖浓度高达7％，发酵过程中无低分子量粘性多糖产出，使得分批发酵最终胶得率高达4.8％，且发酵过程中发酵液不粘稠，传质传氧效果良好，该菌株发酵过程中所用碳酸钙用量仅为0.05％，发酵结束后碳酸钙几乎无残留，提取得到的产品纯度可高达90％以上。所得胶体为半透明状，韧性佳，后处理工艺简单易行。利用本菌株发酵生产可得然胶，发酵液得率高且成品品质优于现有产品。 

具体实施方式

实施例1粪产碱杆菌菌株的突变筛选 

本发明以CICC20602粪产碱杆菌为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍诱变处理后，涂布高糖苯胺蓝分离筛选培养基，培养基组成如下(wt％)：蔗糖 10％，(NH₄)₂HPO₄ 0.20％，KH₂PO₄ 0.20％，MgSO₄·7H₂O 0.10％，CaCO₃ 0.2％，玉米浆粉 0.08％，苯胺蓝加入量，pH7.0，苯胺蓝可以与可得然胶络合形成蓝色复合物，蓝色复合物的形成率依赖于可得然胶的浓度与聚合度，菌落蓝色越深说明可得然胶浓度及聚合度越高，菌落越大，说明此菌株生长活性越高，依据此可以选出产胶聚合度高及生长活性好的菌株。经多次筛选，最终选出JSYM-1号菌株，此菌株发酵得率较高，所产可得然胶几乎全部为高聚合度不溶性胶，发酵液不粘稠，易于分离提取。经发酵条件及发酵培养基组分优化后，发酵得率达到48g/L。 

该菌株已于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.9291。 

实施例2 

斜面培养基为(wt％)：葡萄糖或蔗糖 1.00％，酵母膏 0.30％，蛋白胨 0.50％，NaCl，0.50％，琼脂 1.50％，pH调至7.0。 

种子培养基(wt％)：葡萄糖2.00％，(NH₄)₂HPO₄0.50％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄·7H₂O0.10％，玉米浆粉0.05％，CaCO₃0.30％，pH7.2，121℃灭菌20min。 

所述发酵培养基(wt％)：葡萄糖 3.00％，蔗糖 4％，(NH₄)₂HPO₄ 0.20％，KH₂PO₄ 0.20％， MgSO₄·7H₂O 0.10％，CaCO₃ 0.05％，玉米浆粉 0.08％，pH7.0，121℃灭菌20min。 

(1)斜面培养： 

取一接种环粪产碱杆菌突变株，划线接种于斜面培养基，于28-30℃静置培养50hr，4℃冰箱保藏1个月内可使用； 

(2)种子培养： 

取步骤(1)的培养物1支，接种环接一环种子于装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，于28-30℃，180转/分钟摇床震荡培养20hr，得到种子液，种子液的有效活菌数为10¹²-10¹⁴/ml； 

(3)发酵： 

将步骤(2)的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5％，于28-30℃通气搅拌培养96hr。发酵得率高达48.3g/L。不经任何处理，发酵液离心烘干后测得产品纯度即为87.2％。 

(4)后提取工艺： 

发酵结束后，向发酵液中加入50ppm的溶菌酶(溶菌酶单位为300万)，维持发酵液温度在28-32℃，保温低速(速度60转/分钟)搅拌35min；取发酵液进行离心分离(分离因数8000-10000)，弃上清，固形物加入原发酵液体积1.8倍的水，搅拌均匀后，再次离心分离(分离因数6000-8000)；弃上清，取固形物加入原发酵液体积的1/2的浓度为90％-95％的乙醇，搅拌均匀后板框压滤，收集固体物料；真空干燥机干燥，前期干燥温度不得高于40℃，当水分含量低于25％时，可升温至60℃进行干燥，至水分含量低于10％。 

所得产品达到以下标准：可得然胶纯度：91.10％，灰分2.06％，水分6.21％，2.0％(称取2g产品，加入100ml水)产品凝胶强度为960。 

实施例3 

培养基成分同上，制备方法如下： 

(1)斜面培养： 

取一接种环粪产碱杆菌突变株，划线接种于斜面培养基，于28-30℃静置培养60hr，4℃冰箱保藏1个月内可使用； 

(2)种子培养： 

取步骤(1)的培养物1支，接种环接一环种子于装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，于28-30℃，180转/分钟摇床震荡培养24hr，得到种子液，种子液的有效活菌数为10¹²-10¹⁴/ml； 

(3)发酵： 

将步骤(2)的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5％，于28-30℃通气搅拌培养92hr； 发酵得率高达48.2g/L。 

(4)后提取工艺： 

发酵结束后，向发酵液中加入50ppm的溶菌酶(溶菌酶单位为280万)，维持发酵液温度在28-32℃，保温低速(速度为80转/分钟)搅拌30min；取发酵液进行离心分离(分离因数8000-10000)，弃上清，固形物加入原发酵液体积1.8倍的水，搅拌均匀后，再次离心分离(分离因数6000-8000)；弃上清，取固形物加入原发酵液体积0.5倍的浓度为90％-95％的乙醇，搅拌均匀后板框压滤，收集固体物料，经真空干燥机干燥得到产品。 

所得产品达到以下标准：可得然胶纯度：91.17％，灰分2.05％，水分6.23％，2.0％产品凝胶强度为960。 

Claims (7)

1.粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)菌株JSYM-1，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.9291。 

2.用权利要求1所述的粪产碱杆菌菌株JSYM-1制备可得然胶的方法，其特征是， 

(1)斜面培养： 

将粪产碱杆菌菌株JSYM-1划线接种于斜面培养基，于28-30℃静置培养48-72hr，4℃冰箱保藏备用； 

(2)种子培养： 

将步骤(1)的培养物接种于种子培养基中，于28-30℃，通气搅拌培养18-26hr，得到种子液； 

(3)发酵： 

将步骤(2)的种子液接种于发酵培养基中，接种量为1-10％，28-30℃，通气搅拌培养84-96hr；所述发酵培养基为：葡萄糖3.00％，蔗糖4％，(NH₄)₂HPO₄0.20％，KH₂PO₄0.20％，MgSO₄·7H₂O0.10％，CaCO₃0.05％，玉米浆粉0.08％，pH7.0，121℃灭菌20min； 

(4)后提取工艺： 

发酵结束后，向发酵液中加入10-100ppm的溶菌酶，维持发酵液温度在28-32℃，保温低速搅拌30-40min；取发酵液进行离心分离，弃上清，固形物加入原发酵液体积1.5-2倍的水，搅拌均匀后，再次离心分离；弃上清，取固形物加入原发酵液体积0.4-0.6倍的浓度为90-95％的乙醇，搅拌均匀后板框压滤，收集固体物料，经真空干燥机干燥得到产品。 

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的斜面培养基为：葡萄糖或蔗糖 1.00％，酵母膏 0.30％，蛋白胨 0.50％，NaCl 0.50％，琼脂 1.50％，pH调至7.0。 

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤(2)的种子培养基为：葡萄糖2.00％，(NH₄)₂HPO₄0.50％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄·7H₂O0.10％，玉米浆粉0.05％，CaCO₃0.30％，pH7.2，121℃灭菌20min。 

5.如权利要求2-4中任意一项所述的制备方法，其特征是，所述步骤(4)溶菌酶的溶菌酶单位为50-500万。 

6.如权利要求2-4中任意一项所述的制备方法，其特征是，所述步骤(4)对发酵液进行离心分离的分离因数为8000-10000。 

7.如权利要求2-4中任意一项所述的制备方法，其特征是，所述步骤(4)再次离心分离的分离因数为6000-8000。