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CN104004817A - 利用极体或胚胎的单细胞基因组测序来选择试管婴儿的胚胎 - Google Patents

利用极体或胚胎的单细胞基因组测序来选择试管婴儿的胚胎 Download PDF

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CN104004817A
CN104004817A CN201310057440.6A CN201310057440A CN104004817A CN 104004817 A CN104004817 A CN 104004817A CN 201310057440 A CN201310057440 A CN 201310057440A CN 104004817 A CN104004817 A CN 104004817A
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polar body
embryo
genome
ovum
cell
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汤富酬
闫丽盈
樊伟
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Peking University Third Hospital
Harvard University
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Peking University
Peking University Third Hospital
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Abstract

本发明涉及利用极体或胚胎的单细胞基因组测序来选择试管婴儿的胚胎。本发明公开一种利用第一极体和第二极体以及胚胎单细胞进行全基因组非指数扩增和基因组高通量测序的方法，进行遗传性疾病植入前遗传学诊断及反复流产致病基因的检查。本发明的方法包括如下步骤：（1）获得卵母细胞及胚胎，进行第一极体和第二极体、单个胚胎细胞的分离及基因组扩增；（2）建立基因组测序文库及测序并进行基因组生物信息学分析，获得基因图谱，染色体及其片段的拷贝数信息；（3）确定极体及胚胎细胞的染色体倍性及染色体片段的缺失、重复、基因点突变信息；（4）选择正常或合适的胚胎移植。本发明的单细胞遗传学分析方法，适用范围广，经过实验证明效果可靠。

Description

利用极体或胚胎的单细胞基因组测序来选择试管婴儿的胚胎
技术领域
本发明涉及一种利用第一极体和第二极体或者胚胎单个细胞基因组扩增与高通量测序以便选择用于试管婴儿的胚胎的方法。
背景技术
随着生殖医学与试管婴儿技术的迅猛发展，体外受精-胚胎移植（IVF-ET）及其相关衍生技术已成为目前不孕症治疗最重要的手段。据估计，目前世界上不孕夫妇约6000～8000万对，中国不孕夫妇约1200～1500万对，2010年数据显示，世界上已有400余万试管婴儿诞生。据报道，美国2009年ART治疗14.62万个周期；在中国，仅2012年约有30万对夫妇选择辅助生殖技术进行不孕症治疗。总体来说，目前IVF-ET活胎分娩率在35%左右，很大一部分比例胚胎未着床或不能发育到期导致停育、流产，胚胎染色体异常占很大比例。
现代社会，随着工作压力的不断增加，越来越多的女性推迟生育年龄，在不孕症夫妇中，高龄妇女占20-30%，经辅助生殖治疗后成功率只有20%左右，而年轻的妇女成功率40%-50%。主要原因在于随着年龄的增加卵母细胞的质量明显下降，卵母细胞非整倍体率明显增加；
随着环境污染加重、精神压力的增加以及免疫、遗传等因素的影响，复发性流产的发生率逐年升高，在育龄妇女的发病率约为1%左右，占不孕妇女的5-10%。目前大部分患者都不能找到确切的病因，卵母细胞以及胚胎质量的异常是重要因素之一；
尽管辅助生殖技术解决了很多不孕夫妇的实际问题，但有很大一部分患者要经历胚胎反复着床失败的痛苦，已成为临床实践中常见与棘手的问题；
以上三种情况都需要对卵母细胞极体及胚胎的染色体进行胚胎植入前遗传学筛查，选择正常的胚胎进行移植，提高成功率，减少妇女经受反复流产的痛苦。
遗传疾病是指人体中的遗传物质（染色体或者线粒体DNA上的基因序列）改变而引起的疾病，根据所设计的遗传物质类型可将遗传疾病分为染色体遗传病，单基因遗传病和多基因遗传病。常见的染色体遗传病有唐氏综合症，18三体综合症等；常见的单基因遗传病有红绿色盲、血友病和白化病等；常见的多基因遗传病有先天性心脏病、少年型糖尿病和多囊肾等。近年来，遗传病的发病率逐年增高，据WHO统计，活婴中出现先天性缺陷的患儿比例在1956年约为4‰，1977年比例增至10.84‰，我国每年有数万例染色体异常的患儿出生。染色体异常患儿至今仍无法治愈，解决这一问题的根本途径就是进行出生前或胚胎移植前诊断，避免此类患儿出生。
遗传病的胚胎植入前遗传学诊断是生殖医学重要内容，可以阻断在胚胎着床前，避免患儿出生，从而避免和减少遗传病的发生，减轻家庭和社会的经济负担。
目前，胚胎着床前遗传学诊断主要采用荧光原位杂交（FISH）和单细胞聚合酶链式反应（PCR）技术，而应用FISH进行胚胎筛选，受探针限制，不能同时检测所有染色体状态，最多只能检测23条染色体中的11条染色体的缺失或者重复等染色体异常。而且单细胞固定易导致检测信号丢失，假阴性率比较高，检测成功率比较低。同时由于需要多轮洗脱和探针杂交、同一种荧光信号要被不同的探针反复使用，因而假阳性率很高。单细胞PCR技术由于只能针对一个或者少数几个位点、易造成等位基因脱扣，因此易导致误诊。近两年应用到临床植入前产前诊断（PGD)的技术有微阵列比较基因组杂交技术（array CGH）(Munne,S.PreimplantationGenetic Diagnosis for Aneuploidy and Translocations Using ArrayComparative Genomic Hybridization.Curr.Genom,2012,13:463-470.)和单核苷酸多态性微阵列技术（SNP array）技术(Harper,J.C.,and Harton,G.Theuse of arrays in preimplantation genetic diagnosis and screening.Fert.and Ster.,2010,94:1173-1177)。Array CGH只能诊断染色体数目改变及大片段染色体结构（非平衡易位，重复、缺失），SNP array能进行所有CGH能诊断的染色体异常，分辨率较CGH提高，但只能对少数几种单基因疾病进行诊断，目前已经有一千多种单基因遗传疾病的致病基因已经被发现并证实，其中绝大部分都无法用SNP array和array CGH技术进行诊断。
因此，迫切需要一种新方法，用于对所有染色体小片段的拷贝数异常进行检测和鉴定，对所有致病基因已经确定的单基因疾病进行精确诊断，从而大大提供试管婴儿的植入成功率和出生成功率，降低出生缺陷率。
发明内容
本发明涉及一种利用第一极体和第二极体或者胚胎单个细胞进行基因组扩增与高通量测序用于试管婴儿胚胎的植入前产前基因组筛选的方法，所用的非指数单细胞基因组扩增技术(Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,and Xie,X.S.Genome-wide detection ofsingle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.Science,2012,338:1622-1626.)克服了已有多重置换扩增（MDA）等其他单细胞基因组扩增技术(Dean FB,Hosono S,Fang L,et al.Comprehensive human genome amplification using multipledisplacement amplification.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:5261-5266.)（Blainey,P.C.,and Quake,S.R.Digital MDA forenumeration of total nucleic acid contamination.Nucl.Acids Res,2011,39:e19.）(Wang J,Fan HC,Behr B,Quake SR.Genome-widesingle-cell analysis of recombination activity and de novo mutationrates in human sperm,2012,150(2):402-12.)引入的扩增误差和覆盖不均匀等问题，可以精确检测DNA拷贝数变异，因此可以用于小片段DNA拷贝数异常的检测和鉴定，能够在低测序深度（<=1X）的情况下精确地鉴定全部23条染色体中所有可能的非整倍体性染色体异常，染色体平衡异位、非平衡异位、倒位等各种染色体异常，筛选含有特定等位基因以及相应的特定表型性状的胚胎，本发明特点是检测流程少，样品处理时间短，能够快速得到测序分析结果，特别是本发明能对所有染色体小片段的拷贝数异常进行检测和鉴定，能对所有其致病基因已经确定的单基因疾病进行精确诊断。
根据本发明的第一方面，提供通过分析一个供体女性的卵母细胞的极体来确定供体女性基因组单体型的方法，该方法包括如下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精；
（2）从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
（3）对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）将测序结果与人类参考基因组数据库以及单碱基多态性位点（SNP）数据库比对，找出杂合的单碱基多态性位点，并解析出女性供体的单体型。
根据本发明的上述方法，优选地，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞基因组DNA进行扩增。
根据本发明的上述方法，优选地，所述解析出女性供体的单体型的步骤为根据第一极体和/或第二极体中杂合SNP位点的连锁关系解析出女性供体的单体型。
根据本发明的第二方面，提供一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)由第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝；并选择其第一极体和第二极体中所有23条染色体中每号染色体在两个极体中拷贝数总和均为3的卵细胞进行胚胎移植。
根据本发明的第三方面，提供一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)根据第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况；并选择根据其第一极体和第二极体中染色体异常情况推断出卵细胞本身染色体并无异常的卵细胞进行胚胎移植。
根据本发明的第四方面，提供一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出卵细胞中含有产生遗传疾病的点突变的卵细胞，并将其排除掉，不用于胚胎移植。
根据本发明的第五方面，提供一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有来自女性供体的基因序列多态性以及相应的等位基因，并选择根据其第一极体和第二极体中基因序列多态性以及相应的等位基因情况推断出卵细胞本身具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的卵细胞进行胚胎移植。
根据本发明第二至第五方面的方法，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞全基因组DNA进行扩增。
根据本发明第二方面的方法，步骤（4）中先由本发明第一方面所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝。
根据本发明第四方面的方法，其特征在于，步骤（4）中先由本发明第一方面所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体的点突变信息，再通过第一极体和第二极体的点突变信息鉴定卵细胞中含有这些产生遗传疾病的点突变的卵细胞。
根据本发明第五方面的方法，其特征在于，步骤（4）中先由本发明第一方面所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体中所有来自女性供体的基因序列多态性以及相应的等位基因。
根据本发明的第六方面，提供一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23条染色体每号染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝，并选择这一细胞中所有23条染色体中每号染色体拷贝数均为2、因而没有染色体非整倍体异常的胚胎进行胚胎移植。
根据本发明的第七方面，提供一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况，并选择这一细胞中所有23条染色体中均无易位、倒位等染色体异常的胚胎进行胚胎移植。
根据本发明的第八方面，提供一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因点突变，并把那些由此推断出含有产生遗传疾病的点突变的胚胎排除掉，不用于胚胎移植。
根据本发明的第九方面，提供一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因突变形成的等位基因，并选择这一细胞中具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的胚胎进行胚胎移植。
根据本发明第六至第九方面所述的方法，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞全基因组DNA进行扩增。
根据本发明的上述多个方面的方法，其第（3）步所述的单细胞全基因组包括细胞核基因组和/或线粒体基因组。
根据本发明的上述多个方面的方法，其中所述遗传疾病优选为染色体遗传病例如唐氏综合症，18三体综合症等；单基因遗传病如红绿色盲、血友病和白化病等；多基因遗传病有先天性心脏病、少年型糖尿病和多囊肾等。
本发明适用范围广、不仅能对有染色体异常的遗传性疾病的家庭进行正常胚胎的筛选，而且能对有点突变等遗传性疾病的家庭进行正常胚胎的筛选。本发明还可以大大提高试管婴儿的植入成功率和出生成功率，特别是可用于反复流产、高龄妇女的胚胎遗传筛选，提高出生成功率，降低出生缺陷率。
特别地，本发明提供一种利用第一极体和第二极体以及胚胎单个细胞进行基因组扩增与高通量测序的植入前产前基因组筛选方法，包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；对卵子提供者进行超数排卵后，取出其发育成熟的卵母细胞，优选2天内、更优选成熟当天的卵母细胞进行体外受精。
(2)从卵母细胞中分离出第一极体。成熟后的卵母细胞会将第一次减数分裂形成的第一极体排出细胞膜之外，透明带之内，利用显微操作仪即可在细胞膜和透明带之间取得第一极体而不会影响到卵细胞的继续发育。取第一极体尽量在受精卵排出第二极体之前，否则在形态上很难将第一极体和第二极体区分开。
(3)从卵母细胞中分离出第二极体。受精后的受精卵会将第二次减数分裂形成的第二极体排出细胞膜之外，透明带之内。利用显微操作仪即可在细胞膜和透明带之间取得第二极体而不会影响到受精卵的继续发育。
(4)对第一极体和第二极体进行多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）单细胞基因组扩增，再进行基因组测序。MALBAC单细胞基因组扩增步骤包括：裂解细胞；线性扩增；指数扩增。MALBAC单细胞基因组扩增技术采用线性扩增和指数扩增相结合的方法，避免了由一个拷贝的基因组直接进行指数扩增时引入的扩增错误和覆盖不均匀等问题。在第一轮多个循环的MALBAC线性扩增中采用一系列有多个可变碱基和20-35个固定锚定碱基的随机引物进行全基因组范围的扩增，其特点在于每个扩增循环后，温度程序会回到使两侧均带有锚定序列引物的扩增产物分子内部形成环状，从而防止上一个循环的扩增产物作为下一个循环的模板进行指数扩增，即达到了线性扩增的目的。在第二轮多个循环的指数扩增温度设定上和常规的PCR反应相同，采用特异识别第一轮所用随机引物中锚定序列的指数扩增引物，目的是指数增加扩增产物的数量，以达到微克量级的PCR产物用于高通量测序。
(5)通过与人类参考基因组数据库以及单碱基多态性位点即SNP数据库比对，找出杂合的单碱基多态性位点，我们首先将每个卵子单细胞(第一极体，第二极体，或者雌原核)的测序数据比对到最新版本的人类参考基因组上,这一步可以采用开源软件如bwa,bowtie等；然后逐个在每个基因组位点上，根据比对到该位置的全部碱基数据推测其最可能的基因型(genotype),这里采用最大似然估计法。在测序深度比较低(<=1X)的情况下,我们可以利用人类多态性数据库(dbSNP)中的SNP位点作为先验信息，通过贝叶斯算法来提高基因型推断的准确率。当有了每个卵子细胞的全基因组的基因型结果后，我们将来自于同一个供卵者的多个卵子单细胞基因组测序的结果放在一起比较，如果在某个基因组位置上，出现两种等位基因并且其各自出现频率接近于50%,我们则认定供卵者的基因组该位点为杂合位点。这些杂合SNP位点，则用于后面的单倍体分型和交叉互换模式的推断。
(6)根据第一极体和/或第二极体中杂合SNP位点的连锁关系，解析出供体女性的单体型。第二极体的基因组为单倍体，可以完全用于单倍体分型。第一极体的基因组为二倍体，但是部分为纯合，部分为杂合，其纯合的部分等效于单倍体，也可以用于单倍体分型。我们首先使用第二极体的测序数据，测序的单细胞数目理论上最低要求为3个，但是细胞数目越多单倍体分型的效果越好，一般8个以上最好。虽然第二极体的基因组为单倍体，但是，它是由母体的两条染色体重组之后形成的，因此，我们无法仅靠一个第二极体细胞推测出母本的两套染色体单体型。然而，交叉互换发生的频率非常低，平均每条染色体仅为1.9个。我们用第二极体推测母体单体型的前提假设是，两个独立的细胞几乎不会在同一个基因组位点发生交叉互换。因此，只要有3个或者3个以上的单细胞测序数据，我们便能够根据多数基因组位点的连锁信息与供卵者原始的单体型一致这一原则，成功推断出供卵者染色体全长的单体型（Lu S,et al.Probing meioticrecombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genomesequencing.Science,2012,338:1627-1630.）。为得到供卵者精确的单体型，该步骤在实现上可以采用动态规划和最大似然算法。
(7)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝；并选择其第一极体和第二极体中所有23条染色体中每号染色体在两个极体中拷贝数总和均为3，即没有非整倍体性染色体异常的卵细胞进行胚胎移植。减数分裂前，细胞的染色体数目加倍，因此，卵母细胞是四倍体。人的卵母细胞成熟后形成并排出第一极体，之后进行受精形成并排出第二极体产生雌原核，正常情况下，同一个卵母细胞的第一极体、第二极体和雌原核中每号染色体的总拷贝数加起来应该是4。通过对第一极体和第二极体进行单细胞全基因组测序，我们可以分析出这两个极体细胞中的染色体拷贝数，然后，用总数4减去这两个极体细胞的染色体拷贝数，就得到了雌原核中的染色体拷贝数。我们以500kb为窗口，沿着基因组滑动，计算每个窗口的测序覆盖深度，然后，除以该样品总的测序深度，进行测序量的归一化以便于后期分析。基因组不同部分有很大的GC含量和其他差别，造成测序过程中产生较高的覆盖度偏差。下一步，我们选用基因组为整倍体的细胞，同样按照500kb窗口，来计算平均的覆盖度偏差因子。最后，我们把每个第一极体和第二极体的覆盖深度进行覆盖度偏差的校正，最终得到的结果将接近于1，可以近似用来反映染色体及其不同区域的拷贝数目。为进一步提高预测的准确率，及分析的自动化程度，该步骤可以采用隐马尔可夫模型来进行计算。
(8)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况；并选择根据其第一极体和第二极体中染色体异常情况推断出卵细胞本身染色体并无异常的卵细胞进行胚胎移植。除了染色体拷贝数，我们还可以用第一极体和第二极体来推测雌原核中的染色体易位和倒位等染色体异常情况，因为这三个细胞中的这些变化是紧密关联的。我们在测序过程中采用双端（pair-end）测序,如果一对读数的一端比对到了一条染色体上，而另一端比对到了另一条染色体上，则说明发生了染色体易位。而当一对读数的两端都比对到了同一条染色体上，但是定位不符合正常的双端模式及其长度分布，则说明可能发生了染色体倒位或者其他更为复杂的染色体异常。
(9)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出卵细胞中含有这些产生遗传疾病的点突变的卵细胞，并将该卵细胞排除掉，不用于胚胎移植。
(10)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有来自母亲（供体女性）的基因序列多态性以及相应的等位基因。并选择根据其第一极体和第二极体中基因序列多态性以及相应的等位基因情况推断出卵细胞本身具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的卵细胞进行胚胎移植。
(11)从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞（卵裂球），并通过单细胞基因组扩增和高通量测序鉴定出这一细胞中所有23条染色体每号染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝。并选择这一细胞中所有23条染色体中每号染色体拷贝数均为2、因而没有非整倍体性染色体异常的胚胎进行胚胎移植。
(12)从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞（卵裂球），并通过单细胞基因组扩增和高通量测序鉴定出这一细胞中所有23条染色体每号染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝。并选择这一细胞中所有23条染色体中每号染色体拷贝数均为2、因而没有非整倍体性染色体异常的胚胎进行胚胎移植。
本发明提供的利用第一极体和第二极体以及胚胎单细胞进行基因组测序的方法适用范围广、不仅能对有遗传性疾病的家庭进行正常胚胎的筛选，而且可用于反复流产、高龄妇女胚胎的遗传性筛选，效果可靠。经人卵母细胞极体及雌原核分析实验表明，利用本方法能够获得单细胞（极体、胚胎内单卵裂球）染色体的数目是否异常、拷贝数变化（CNV）以及基因的信息。
附图说明
图1：部分原核单细胞基因组扩增产物在一些染色体位点的荧光定量PCR结果。
图2：一个女性捐赠者的一个卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核的所有染色体倍性的对应关系。
图3：一个女性捐赠者的所有卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核染色体倍性列表。
图4：筛选卵子和精子捐赠者可用于筛选雌原核的SNP位点结果图。
图5：筛选一个女性捐赠者部分雌原核的结果图。
图6：一个女性捐赠者的一个卵母细胞中第一极体的单细胞基因组扩增产物进行片段化后的片段大小分析结果图。
图7：卵母细胞进行减数分裂时染色体同源重组变化的示意图。
图8：用显微操作仪吸取第一极体的操作图。
图9：用显微操作仪吸取第二极体的操作图。
图10：二倍体基因组单体型分型原理示意图。
图11：一个女性捐赠者一个卵母细胞的第二极体染色体同源重组模式。
图12：同一个卵母细胞中利用第一极体和第二极体的单体型信息推算卵细胞的原理示意图。
图13：一个女性捐赠者的一个卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核的染色体同源重组模式和倍性的对应关系。
图14：一个女性捐赠者的一个异常的卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核所有染色体同源重组模式和倍性的对应关系。
图15：一个女性捐赠者的一个异常的卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核所有染色体倍性的对应关系。
具体实施方式
在本发明一种具体的实施方式中，本发明提供一种分析一个供体女性的卵母细胞的极体来确定供体女性基因组单体型的方法，包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；对卵子提供者进行超数排卵后，取出其发育成熟的卵母细胞，优选2天内、更优选成熟当天的卵母细胞进行体外受精。
(2)从卵母细胞中分离出第一极体。成熟后的卵母细胞会将第一次减数分裂形成的第一极体排出细胞膜之外，透明带之内，利用显微操作仪即可在细胞膜和透明带之间取得第一极体而不会影响到卵细胞的继续发育。取第一极体尽量在受精卵排出第二极体之前，否则在形态上很难将第一极体和第二极体区分开。
(3)从卵母细胞中分离出第二极体。受精后的受精卵会将第二次减数分裂形成的第二极体排出细胞膜之外，透明带之内。利用显微操作仪即可在细胞膜和透明带之间取得第二极体而不会影响到受精卵的继续发育。
(4)对第一极体和第二极体进行多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）单细胞基因组扩增，再进行基因组测序。MALBAC单细胞基因组扩增步骤包括：裂解细胞；线性扩增；指数扩增。MALBAC单细胞基因组扩增技术采用线性扩增和指数扩增相结合的方法，避免了由一个拷贝的基因组直接进行指数扩增时引入的扩增错误和覆盖不均匀等问题。在第一轮多个循环的MALBAC线性扩增中采用一系列有多个可变碱基和20-35个固定锚定碱基的随机引物进行全基因组范围的扩增，其特点在于每个扩增循环后，温度程序会回到使两侧均带有锚定序列引物的扩增产物分子内部形成环状，从而防止上一个循环的扩增产物作为下一个循环的模板进行指数扩增，即达到了线性扩增的目的。在第二轮多个循环的指数扩增温度设定上和常规的PCR反应相同，采用特异识别第一轮所用随机引物中锚定序列的指数扩增引物，目的是指数增加扩增产物的数量，以达到微克量级的PCR产物用于高通量测序。
(5)通过与人类参考基因组数据库以及单碱基多态性位点即SNP数据库比对，找出杂合的单碱基多态性位点，我们首先将每个卵子单细胞(第一极体，第二极体)的测序数据比对到最新版本的人类参考基因组上,这一步可以采用开源软件如bwa,bowtie等；然后逐个在每个基因组位点上，根据比对到该位置的全部碱基数据推测其最可能的基因型(genotype),这里采用最大似然估计法。在测序深度比较低(<=1X)的情况下,我们可以利用人类多态性数据库(dbSNP)中的SNP位点作为先验信息，通过贝叶斯算法来提高基因型推断的准确率。当有了每个卵子细胞的全基因组的基因型结果后，我们将来自于同一个供卵者的多个卵子单细胞基因组测序的结果放在一起比较，如果在某个基因组位置上，出现两种等位基因并且其各自出现频率接近于50%,我们则认定供卵者的基因组该位点为杂合位点。这些杂合SNP位点，则用于后面的单倍体分型和交叉互换模式的推断。
(6)根据第一极体和/或第二极体中杂合SNP位点的连锁关系，解析出供体女性的单体型。第二极体的基因组为单倍体，可以完全用于单倍体分型。第一极体的基因组为二倍体，但是部分为纯合，部分为杂合，其纯合的部分等效于单倍体，也可以用于单倍体分型。我们首先使用第二极体的测序数据，测序的单细胞数目理论上最低要求为3个，但是细胞数目越多单倍体分型的效果越好，一般8个以上最好。虽然第二极体的基因组为单倍体，但是，它是由母体的两条染色体重组之后形成的，因此，我们无法仅靠一个第二极体细胞推测出母本的两套染色体单体型。然而，交叉互换发生的频率非常低，平均每条染色体仅为1.9个。我们用第二极体推测母体单体型的前提假设是，两个独立的细胞几乎不会在同一个基因组位点发生交叉互换。因此，只要有3个或者3个以上的单细胞测序数据，我们便能够根据多数基因组位点的连锁信息与供卵者原始的单体型一致这一原则，成功推断出供卵者染色体全长的单体型（Lu S,et al.Probing meioticrecombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genomesequencing.Science,2012,338:1627-1630.）。为得到供卵者精确的单体型，该步骤在实现上可以采用动态规划和最大似然算法。
为了验证我们的鉴定结果，我们可将供体的雌原核也进行单细胞基因组扩增和基因组测序，来和由极体解析出的结果相比较，雌原核是卵母细胞进行减数分裂后形成的单倍体生殖细胞（卵细胞）的细胞核。
本发明的另一个目的是提供一种用于着床前胚胎移植的在体外受精过程中筛选卵细胞的方法，其第前4步同确定供体女性基因组单体型的方法的（1）-（4）步。根据实际需要可用（5）-（8）步中的一个或多个步骤对卵细胞进行筛选。
(5)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝；并选择其第一极体和第二极体中所有23条染色体中每号染色体在两个极体中拷贝数总和均为3，即没有非整倍体性染色体异常的卵细胞进行胚胎移植。减数分裂前，细胞的染色体数目加倍，因此，卵母细胞是四倍体。人的卵母细胞成熟后形成并排出第一极体，之后进行受精形成并排出第二极体产生雌原核，正常情况下，同一个卵母细胞的第一极体、第二极体和雌原核中每号染色体的总拷贝数加起来应该是4。通过对第一极体和第二极体进行单细胞全基因组测序，我们可以分析出这两个极体细胞中的染色体拷贝数，然后，用总数4减去这两个极体细胞的染色体拷贝数，就得到了雌原核中的染色体拷贝数。我们以500kb为窗口，沿着基因组滑动，计算每个窗口的测序覆盖深度，然后，除以该样品总的测序深度，进行测序量的归一化以便于后期分析。基因组不同部分有很大的GC含量和其他差别，造成测序过程中产生较高的覆盖度偏差。下一步，我们选用基因组为整倍体的细胞，同样按照500kb窗口，来计算平均的覆盖度偏差因子。最后，我们把每个第一极体和第二极体的覆盖深度进行覆盖度偏差的校正，最终得到的结果将接近于1，可以近似用来反映染色体及其不同区域的拷贝数目。为进一步提高预测的准确率，及分析的自动化程度，该步骤可以采用隐马尔可夫模型来进行计算。
(6)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况；并选择根据其第一极体和第二极体中染色体异常情况推断出卵细胞本身染色体并无异常的卵细胞进行胚胎移植。除了染色体拷贝数，我们还可以用第一极体和第二极体来推测雌原核中的染色体易位和倒位等染色体异常情况，因为这三个细胞中的这些变化是紧密关联的。我们在测序过程中采用双端（pair-end）测序,如果一对读数的一端比对到了一条染色体上，而另一端比对到了另一条染色体上，则说明发生了染色体易位。而当一对读数的两端都比对到了同一条染色体上，但是定位不符合正常的双端模式及其长度分布，则说明可能发生了染色体倒位或者其他更为复杂的染色体异常。
(7)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出卵细胞中含有这些产生遗传疾病的点突变的卵细胞，并将该卵细胞排除掉，不用于胚胎移植。除了可以检测染色体及染色体片段的拷贝数异常、易位和倒位等染色体异常信息，我们还可以利用单体型中杂合SNP与某一致病基因点突变的连锁信息鉴定出卵细胞中是否含有某些导致遗传疾病的点突变。首先，根据第一极体、第二极体的测序信息和杂合SNP的连锁信息解析出女性供体的单体型，并确定欲筛查的导致遗传疾病的点突变在哪一种单体型上，即与哪种单体型上的杂合SNP位点有紧密的连锁关系。其次，解析出第一极体、第二极体的重组模式和单体型信息，并根据同一卵母细胞中极体与雌原核重组模式和单体型的对应关系，推算出雌原核中的重组模式和单体型信息。最后筛选不含有致病点突变基因的单体型进行胚胎移植。此发明特征在于可以允许由于单细胞扩增和测序等误差导致极体中点突变处的基因型不能准确测量的误差，而根据与点突变有紧密连锁关系的杂合SNP位点来判断卵细胞中点突变的基因型。因为在卵母细胞中平均每条染色体上只发生1.5-2.5次交叉互换，所以，理论上与某一特定碱基位点有99.9%以上连锁关系的杂合SNP位点就至少有几千个，因此足以克服扩增和测序覆盖率低的问题，达到准确筛选的目的。
(8)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有来自母亲（供体女性）的基因序列多态性以及相应的等位基因。并选择根据其第一极体和第二极体中基因序列多态性以及相应的等位基因情况推断出卵细胞本身具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的卵细胞进行胚胎移植。首先，根据第一极体、第二极体的测序信息和杂合SNP的连锁信息解析出女性供体的单体型，并确定欲筛查的特定等位基因在哪一种单体型上，即与哪种单体型上的杂合SNP位点有紧密的连锁关系。其次，解析出第一极体、第二极体的重组模式和单体型信息，并根据同一卵母细胞中极体与雌原核重组模式和单体型的对应关系，推算出雌原核中的重组模式和单体型信息。最后筛选特定等位基因的单体型进行胚胎移植。此发明特征在于可以允许由于单细胞扩增和测序等误差导致的极体中特定基因位点的基因型不能准确测量的误差，而根据与特定等位基因有紧密连锁关系的杂合SNP位点来判断卵细胞中特定等位基因的基因型。
本发明的另一个目的在于提供一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序。优选的，进行单细胞全基因组非线性扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞全基因组DNA进行扩增。
（4）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23号23条染色体每号染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝。并；并选择这一细胞中所有23号23条染色体中每号染色体拷贝数均为2、因而没有染色体非整倍体异常的胚胎进行胚胎移植。
（5）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23号23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况。并；并选择这一细胞中所有23号23条染色体中均无易位、倒位等染色体异常的胚胎进行胚胎移植。
（6）通过测序结果鉴定利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因点突变，并把那些由此推断出含有这些产生遗传疾病的点突变的胚胎排除，不用于胚胎移植。
（7）利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因突变形成的等位基因。并；并选择这一细胞中具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的胚胎进行胚胎移植。
根据实际需要可用（4）-（7）步中的一个或多个步骤对早期胚胎进行筛选。
以上方法中，单细胞全基因组为细胞核基因组和/或线粒体基因组。
本发明提供的利用第一极体和第二极体以及胚胎单细胞进行基因组测序的方法适用范围广、不仅能对有遗传性疾病的家庭进行正常胚胎的筛选，而且可用于反复流产、高龄妇女胚胎的遗传性筛选，效果可靠。经人卵母细胞极体及雌原核分析实验表明，利用本方法能够获得单细胞（极体、胚胎内单卵裂球）染色体的数目是否异常、拷贝数变化（CNV）以及基因的信息。
实施例
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂生产商购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
第一部分：利用第一极体和第二极体以及胚胎雌原核进行基因组测序的方法，包括如下步骤：
一、取卵母细胞的第一极体、第二极体和雌原核的流程：
1.0时：对MII期的卵子显微注射单精子（ICSI），将卵子放到（G-MOPS）操作液中，转移到显微操作仪平台上，进行显微操作。
2.1时左右：取出第一极体；用激光破透明带，平口显微操作针取出第一极体，用连接于口叼管上的内口径20um的毛细针将取出的第一极体转移到有5ul裂解液的0.2ml PCR管中，并将PCR管置于冰上孵育。
3.9-10时：取出第二极体；用激光破透明带，平口显微操作针取出第二极体，用连接于口叼管上的内口径20um的毛细针将取出的第二极体转移到有5ul裂解液的0.2ml PCR管中，并将PCR管置于冰上孵育。
为了验证我们的鉴定结果，我们可将供体的雌原核也进行单细胞基因组扩增和基因组测序，来和由极体解析出的结果相比较，因此需要从受精卵中提取雌雄原核，雄原核为受精卵中来源于精子的细胞核。
4.10-16时：取雌雄原核；将卵子放在细胞松弛素B中浸泡5-10分钟后，利用piezo破透明带和细胞膜，平口显微操作针将雌雄原核分别取出，用连接于口叼管上的内口径30um的毛细针将取出的雌原核和雄原核分别转移到有5ul裂解液的0.2ml PCR管中，并将PCR管置于冰上孵育。
二、MALBAC流程：
1.裂解细胞：将有5ul裂解液的PCR管放入PCR仪中裂解，50摄氏度3小时。
2.失活蛋白酶：将PCR管放入PCR仪中失活，70摄氏度30分钟。
3.第一轮线性扩增：
温度流程:95℃，3分钟---11个循环（4℃,50秒---10℃,50秒---20℃,50秒---30℃,50秒---40℃,45秒---50℃,45秒---65℃,4分钟---95℃,20秒---58℃,20秒）。
4.第二轮指数扩增：
温度流程：95℃,30秒---17个循环（95℃,20秒---58℃,30秒---72℃,3分钟）---72℃,5分钟。
三、扩增产物的鉴定以进行雌原核的筛选
雌雄原核皆是从卵子中提取出，扩增后并不知道哪个是雌原核，哪个是雄原核。为了节约测序成本，我们首先将雌原核和雄原核进行区分，再对雌原核进行测序。
1.荧光定量PCR鉴定单细胞扩增质量：取出MALBAC扩增产物5ul，加水稀释到50ul（1：10稀释），取稀释后的1ul作为模板进行定量PCR（QPCR）：
反应体系 10ul
Syber Mix 5ul
H2O 3.4ul
正向引物（Forward primer） 0.2ul
反向引物（Reverse primer） 0.2ul
ROX 0.2ul
模板（Template） 1u
引物可以随意选取常染色体上的位点，PCR温度条件：95℃,30秒—40个循环（95℃,5秒-60℃,34秒）。部分雌原核和雄原核的QPCR结果见图1。图1中的数值代表某一样品在对应引物位点的Ct值，Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。DYS是在Y染色体上有多个拷贝的位点，其位点的能够扩增出来说明有Y染色体的存在，即此原核为雄原核。由此可排除近一半的雄原核。
2.雌原核的筛选：
50%频率的单核苷酸多态性（SNP）筛选：
筛选dbSNP数据库中CHB和CHD数据中MAF在45-55%的SNP，在得到的结果中进一步筛选在基因编码区的SNP位点。并在这些SNP中筛选出包含MSP1酶切位点的SNP，针对这些位点设计PCR和酶切的引物。
杂合SNP位点的筛选：
a,先分别提取卵子和精子捐赠者的外周血DNA，稀释到10ng/ul。
b,检测卵子和精子捐赠者各个位点的基因型：取1ul稀释好的gDNA溶液，用各个杂合SNP位点的引物进行PCR，条件如下：
反应体系 20ul
10x缓冲液 2ul
2.5mM dNTP 1.6ul
正向引物 0.5ul
反向引物 0.5ul
Takara Ex Taq 0.2ul
模板 1ul
c,温度条件：95℃，3min-35个循环（95℃,30s--67℃,30s--72℃,1min）—72℃，3min
d,酶切：取5ul PCR产物作为酶切的模板，条件如下：
H2O 3.5ul
10X Tango缓冲液 1ul
Msp1 0.5ul
模板 5ul
温度条件：MSP1酶切37℃l,3h。
e,条带分析：分别取5ulPCR产物和酶切产物进行浓度为1.5%的琼脂糖电泳。筛选两个捐赠者是不同的纯合基因型的位点作为排除雄原核用的PCR位点。图4中展示了在一个SNP位点处三个卵子捐赠者和三个精子捐赠者的扩增酶切结果。在这个位点只有两种基因型，其中一种含有Msp1限制性内切酶的识别位点，所以能够被Msp1切开，而另一种基因型不能够被Msp1切开。左侧六条泳道部分是扩增后未经过酶切的片段，而右侧六条泳道是用Msp1酶切3个小时后的片段，可以看出前两个卵子捐赠者在这个位点是杂合的基因型，前两个精子捐赠者在此位点是纯合的基因型。第三对捐赠者在这个位点是不同的纯合基因型，可以用此位点区分第三位捐赠者卵子内的雌原核和雄原核，即如果一个原核是能够被Msp1切开的基因型，则此原核为雌原核，反之是不能被切开的基因型，则为雄原核。
用上述筛选出的SNP位点鉴定雌原核：
取1:10稀释好的雌雄原核的MALBAC扩增产物，用筛选好的杂合位点进行PCR和酶切检测，条件同上，根据基因型判断原核的来源。如图5所示为同一捐赠者的部分原核在同一SNP位点处的扩增及酶切结果。上半部分是未经过酶切的片段，而下半部分是用Msp1M酶切3个小时后的片段。已知在此SNP位点处卵子捐赠者的基因型为纯合且能被Msp1切开，而精子捐赠者的基因型为纯合且不能被Msp1切开，所以能被切开的原核为雌原核，不能被切开的原核为雄原核，由此可将雌雄原核区分出来。
扩增产物的纯化及测序文库的建立
1.扩增产物的纯化：用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒进行纯化，具体方法如下：
A,向PCR产物里加入5倍体积的PB（binding buffer），吹打混匀。
B,将PCR产物加到柱子上。10,000g离心1min。
C,将下层水倒掉，加入750ml PE洗柱子一次。10,000g离心1min。
D,最大转速空转2min。
E,将柱子放到标记好的1.5ml管子上，用30-50ul水加入到柱子中间，停滞1min，
F,最大转速离心1min，洗脱DNA。
2.扩增产物的片段化：
用covaris超声破碎仪进行单细胞MALBAC扩增产物DNA的超声破碎，使破碎片段主要分布在150-250个碱基之间，并进行片段大小的分析，图6所示为用AATI公司的fragment analysis试剂盒分析的破碎后片段大小的分布结果。
3.建库流程：采用Illumina公司的TruSeq DNA Sample Preparation试剂盒进行DNA测序文库的建立，流程如下：
A，末端修复
用枪吹打10次混匀，30°C反应30min。
B，磁珠纯化
加160ul XP磁珠，用枪混匀，室温放置15min。磁力架上放置5min，将枪调到127ul，分两次吸出上清。用200ul（或没过磁珠即可）80%新配的乙醇洗3次。吸干上清，在磁力架上开盖5min晾干磁珠，从磁力架上取下管子，加19ul RB或H2O，混匀，室温放2min，磁力架上放5min，转移17.5ul上清到一新管。
C，末端加A
用枪混匀，37°C反应30min。
D，加测序接头
枪调到40ul，吹10次混匀，30°C反应10min。
加5ul停止连接混合物，终止反应，吹10次混匀。
E，；两次磁珠纯化
向上述样品中加43ul XP磁珠，用枪混匀，室温放置15min。磁力架上放置5min，吸出79.5ul上清。用200ul（或没过磁珠即可）80%新配的乙醇洗3次。吸干上清，在磁力架上开盖5min晾干磁珠，从磁力架上取下管子，加52.5ul RB或H2O，混匀，室温放2min，磁力架上放5min，转移51ul上清到一新管。第二次磁珠纯化：向取出的上清中加入51ul XP磁珠，用枪混匀，室温放置15min。磁力架上放置5min，吸出79.5ul上清。用200ul（或没过磁珠即可）80%新配的乙醇洗3次。吸干上清，在磁力架上开盖5min晾干磁珠，从磁力架上取下管子，加22.5ul H2O重悬，吸出21ul上清转移到新的标记好的管子中。
F，DNA片段的扩增，取上步样品中的5ng进行有效DNA片段的扩增。
枪调到50ul，吹10次混匀。运行下面的PCR程序:
G，两次磁珠纯化
向上述样品中加50ul XP磁珠，用枪混匀，室温放置15min。磁力架上放置5min，吸出79.5ul上清。用200ul（或没过磁珠即可）80%新配的乙醇洗3次。吸干上清，在磁力架上开盖5min晾干磁珠，从磁力架上取下管子，加52.5ul RB或H2O，混匀，室温放2min，磁力架上放5min，转移51ul上清到一新管。第二次磁珠纯化：向取出的上清中加入51ul XP磁珠，用枪混匀，室温放置15min。磁力架上放置5min，吸出79.5ul上清。用200ul（或没过磁珠即可）80%新配的乙醇洗3次。吸干上清，在磁力架上开盖5min晾干磁珠，从磁力架上取下管子，加32.5ul H2O重悬，吸出31ul上清转移到新的标记好的管子中。并测量其浓度。
第二部分：利用第一极体和第二极体以及胚胎单个细胞进行基因组测序的方法的应用效果
图7所示为卵母细胞的减数分裂过程。图中画出了一个细胞中23条染色体的其中一条在减数分裂过程中发生变化的情况。其中绿色的部分代表人类二倍体基因组中来自父亲的单体型，而红色的部分代表来自母亲的单体型。初级卵母细胞经过DNA复制形成四倍体后进行第一次减数分裂，分裂中期四倍体的染色体进行联会，并发生同源交叉重组，来源于父本的基因组与来自于母本的基因组进行交叉互换，使同一条染色体上既含有来自于父本的遗传信息又含有母本的遗传信息。同源交叉重组事件在维持生物体的多态性上有重要的作用。联会的四倍体染色体进入到第一次减数分裂的后期，同源重组的染色体分离分别形成第一极体（二倍体）和次级卵母细胞（二倍体）。次级卵母细胞在受精以后进行第二次减数分裂，姐妹染色单体之间分离分别形成第二极体（单倍体）和卵细胞（单倍体）
图8所示为实例操作中用显微操作仪分离第一极体的照片。其中A，B两图为分离第一极体的先后过程。
图9所示为实例操作中用显微操作仪分离第二极体的照片。其中A,B,C,D四图为分离第二极体的先后过程。
图10所示为进行单体型分型的示意图，利用单倍体的第二极体对供卵者的二倍体基因组进行二倍性分型的原理，对多个单倍体的第二极体进行MALBAC单细胞基因组扩增测序得到杂合的单核苷酸基因型数据，并根据多个杂合位点的连锁位置信息推断出捐赠者二倍体基因型的分型信息。
图11所示为一个女性捐赠者一个卵母细胞的第二极体单细胞MALBAC基因组扩增和高通量测序的分析结果，测序深度为1X，从左到右每一条柱体代表一条染色体。其中绿色的部分代表来源于捐赠者父本(捐赠者父亲)的单体型，而红色的部分代表来源于母本（捐赠者母亲）的单体型，黄色的部分代表既有来源于母本也有来源于父本的杂合单体型，黑色的部分则代表人类参考基因组上没有明确信息的部分。每条染色体中黑色圆圈代表着丝粒的位置，十字交叉的部分代表此处在减数分裂时发生了一次交叉互换。每条染色体横坐标的数值代表对应位置测序覆盖深度，其中绿线代表此处来源于父本（捐赠者父亲）单体型的覆盖深度，而红线代表来源于母本（捐赠者母亲）单体型的覆盖深度。采用本发明可以准确找到卵母细胞在减数分裂时发生同源染色体交换的位置。图中为一个第二极体单细胞扩增后分析的结果，通过对卵子捐献者的单体型进行分型后，可以分析出极体和雌原核中单体型来自父本还是母本，以及同源重组发生的精确位置（交叉互换的位置）。通过对多个卵母细胞进行统计分析可以得出平均每条染色体上发生1.9次这种交换。此极体为整倍体，未发生染色体缺失和重复等染色体异常。
图12所示为在同一个卵母细胞中利用第一极体和第二极体的单体型信息推算卵细胞的原理示意图。其中绿色的部分代表来源于捐赠者父本（捐赠者父亲）的单体型，而红色的部分代表来源于母本（捐赠者母亲）的单体型，黄色的部分代表既有来源于母本也有来源于父本的杂合单体型，黑色的部分则代表人类参考基因组上没有明确信息的部分。每条染色体中黑色圆圈代表着丝粒的位置，十字交叉的部分代表此处在减数分裂时发生了一次交叉互换。每条染色体横坐标的数值代表对应位置测序覆盖深度，其中绿线代表此处来源于父本（捐赠者父亲）单体型的覆盖深度，而红线代表来源于母本（捐赠者母亲）单体型的覆盖深度。通过计算与第一极体（二倍体）和第二极体（单倍体）之和互补的单倍体细胞的染色体情况，并根据每条染色体在第一极体、第二极体和雌原核中拷贝数总和为4这一特点，就可以获得卵细胞中雌原核染色体的重组模式和倍性。图中下半部分第三个所示为根据第一极体和第二极体推算出的卵细胞内的重组模式和倍性，而图中下半部分第四个所示为实验中真实测到的卵细胞内的重组模式和倍性，两者结果非常一致。
图13为一个女性捐赠者的一个卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核的染色体同源重组模式和倍性的对应关系。图中从左到右每一条柱体代表一条染色体。其中绿色的部分代表来源于捐赠者父本（捐赠者父亲）的单体型，而红色的部分代表来源于母本（捐赠者母亲）的单体型，黄色的部分代表既有来源于母本也有来源于父本的杂合单体型，黑色的部分则代表人类参考基因组上没有明确信息的部分。每条染色体中黑色圆圈代表着丝粒的位置，十字交叉的部分代表此处在减数分裂时发生了一次交叉互换。图中画出了一个女性捐赠者卵的同一个母细胞的第一极体、第二极体和雌原核分离，并分别进行MALBAC单细胞基因组扩增及测序分析，卵母细胞的第一极体、第二极体和雌原核在染色体同源重组模式和倍性上有很好的互补对应关系，第二极体（单倍体）和雌原核（单倍体）组合在一起就相当于对应的第一极体（二倍体）的镜像。通过计算与第一极体（二倍体）和第二极体（单倍体）之和互补的单倍体细胞的染色体情况，就可以获得雌原核染色体的重组模式和倍性。因此，采用本发明提供的利用第一极体和第二极体以及胚胎单细胞进行基因组测序的方法能够获得对应的卵母细胞及胚胎的染色体倍性。
图14为一个女性捐赠者的一个异常的卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核所有染色体同源重组模式和倍性的对应关系。图中从左到右每一条柱体代表一条染色体，其中绿色的部分代表来源于捐赠者父本(捐赠者父亲)的单体型，而红色的部分代表来源于母本（捐赠者母亲）的单体型，黄色的部分代表既有来源于母本也有来源于父本的杂合单体型，黑色的部分则代表人类参考基因组上没有明确信息的部分，白色的部分代表丢失的染色体或者染色体片段。图中为一个女性捐赠者卵的同一个母细胞的第一极体、第二极体和雌原核分离，并分别进行MALBAC单细胞基因组扩增及测序分析，根据第一极体、第二极体和雌原核在染色体同源重组模式和倍性上的互补对应关系可以准确判断雌原核中是否有染色体缺失和重复等异常。在图中所示的第一捐赠者的S0120号卵的样品，第一极体中16号染色体和22号染色体有三个拷贝，19号染色体只有一个拷贝，2号染色体短臂末端上大片段有三个拷贝。第二极体中16号、19号和22号染色体均为一个拷贝（正常），2号染色体短臂末端的大片段缺失，根据一个卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核中每号染色体的拷贝总数为4个，推断出雌原核中应该为第16号和22号染色体缺失（拷贝数为0），19号染色体重复（拷贝数为2），此推断结果与雌原核的实际测序结果完全吻合。此结果说明本方法不但能够根据第一极体和第二极体的测序结果准确推断雌原核的整条染色体的缺失和重复，而且也能够准确推断出染色体某些片段的缺失或重复等异常。
图2中列出的是第一捐赠者的S0120号卵样品的第一极体、第二极体和雌原核中所有染色体的倍性关系。第一极体中16号染色体和22号染色体有三个拷贝，19号染色体只有一个拷贝，2*表示2号染色体短臂末端上大片段有三个拷贝。第二极体中16号、19号和22号染色体均为一个拷贝（正常），1#表示2号染色体短臂末端的大片段缺失，雌原核中为第16号和22号染色体缺失（拷贝数为0），19号染色体重复（拷贝数为2）。
图15中所示为一个女性捐赠者的一个异常的卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核所有染色体倍性的对应关系。图中横坐标代表不同染色体编号，纵坐标代表染色体片段的拷贝数，在第一极体中16号，22号染色体的拷贝数为3，19号染色体的拷贝数为1，2号染色体短臂末端大片段的拷贝数为3，其余染色体和染色体片段的拷贝数为2。在第二极体中，16号、19号和22号染色体的拷贝数均为正常（1个拷贝），而2号染色体短臂末端大片段的拷贝数异常（0个拷贝），其余染色体和染色体片段均为一个拷贝。根据一个卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核中每号染色体的拷贝总数为4个，推断出雌原核中应该为第16号和22号染色体缺失（拷贝数为0），19号染色体重复（拷贝数为2），此推断结果与雌原核的实际测序结果完全吻合。此结果说明本方法不但能够根据第一极体和第二极体的测序结果准确推断雌原核的整条染色体的缺失和重复，而且也能够准确推断出染色体某些片段的缺失或重复等异常。
图3为一个女性捐赠者的所有卵母细胞中第一极体、第二极体和雌原核染色体倍性列表。对一个女性捐赠者卵母细胞的第一极体、第二极体和雌原核分离，并分别进行MALBAC单细胞基因组扩增及测序分析，我们对第一个捐赠的22个卵母细胞进行了扩增测序分析，其中8个为第一极体、第二极体和雌原核完整的卵母细胞，能够互相推测及验证其倍性信息。从表中可以看出S0120号和S0122号为重组异常的卵母细胞，其异常率为25%。

Claims (17)

1.通过分析一个供体女性的卵母细胞的极体来确定供体女性基因组单体型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精；
（2）从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
（3）对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）将测序结果与人类参考基因组数据库以及单碱基多态性位点（SNP）数据库比对，找出杂合的单碱基多态性位点，并解析出女性供体的单体型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞基因组DNA进行扩增。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述解析出女性供体的单体型的步骤为根据第一极体和/或第二极体中杂合SNP位点的连锁关系解析出女性供体的单体型。
4.一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)由第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝；并选择其第一极体和第二极体中所有23条染色体中每号染色体在两个极体中拷贝数总和均为3的卵细胞进行胚胎移植。
5.一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）根据第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况；并选择根据其第一极体和第二极体中染色体异常情况推断出卵细胞本身染色体并无异常的卵细胞进行胚胎移植。
6.一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出卵细胞中含有产生遗传疾病的点突变的卵细胞，并将其排除掉，不用于胚胎移植。
7.一种在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获取卵细胞，体外受精；
(2)从卵母细胞中分离出第一极体和第二极体；
(3)对第一极体和第二极体分别进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
(4)结合第一极体和第二极体的测序结果鉴定出第一极体和第二极体中所有来自女性供体的基因序列多态性以及相应的等位基因，并选择根据其第一极体和第二极体中基因序列多态性以及相应的等位基因情况推断出卵细胞本身具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的卵细胞进行胚胎移植。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞全基因组DNA进行扩增。
9.根据权利要求4所述的在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，步骤（4）中先由权利要求1-3任一项所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体中所有23条染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝。
10.根据权利要求6所述的在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，步骤（4）中先由权利要求1-3任一项所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体的点突变信息，再通过第一极体和第二极体的点突变信息鉴定卵细胞中含有这些产生遗传疾病的点突变的卵细胞。
11.根据权利要求7所述的在体外受精过程中筛选卵细胞用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，步骤（4）中先由权利要求1-3之一所述的方法确定供体女性基因组单体型，再将单体型信息和第一极体和第二极体的测序结果结合鉴定出第一极体和第二极体中所有来自女性供体的基因序列多态性以及相应的等位基因。
12.一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23条染色体每号染色体的拷贝数是0个、1个、2个、3个、还是4个拷贝，并选择这一细胞中所有23条染色体中每号染色体拷贝数均为2、因而没有染色体非整倍体异常的胚胎进行胚胎移植。
13.一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定出这一细胞中所有23条染色体中的染色体易位、倒位等染色体异常情况，并选择这一细胞中所有23条染色体中均无易位、倒位等染色体异常的胚胎进行胚胎移植。
14.一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）通过测序结果鉴定利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因点突变，并把那些由此推断出含有产生遗传疾病的点突变的胚胎排除掉，不用于胚胎移植。
15.一种在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）获取卵细胞，体外受精，发育到八细胞阶段；
（2）从八细胞阶段的候选胚胎中分离出一个细胞；
（3）将获得的细胞进行单细胞全基因组非指数扩增，然后进行基因组高通量测序；
（4）利用基因连锁信息以及直接测序信息鉴定出这一细胞中所有来自母亲或者父亲以及在胚胎中新产生的基因突变形成的等位基因，并选择这一细胞中具有特定等位基因以及相应的特定表型性状的胚胎进行胚胎移植。
16.根据权利要求12至15任一项所述的在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，所述进行单细胞全基因组非指数扩增的步骤包括裂解细胞，再用MALBAC技术对单细胞全基因组DNA进行扩增。
17.根据权利要求1-16任一项所述的在体外受精过程中筛选早期胚胎用于着床前胚胎移植的方法，其特征在于，其第（3）步所述的单细胞全基因组包括细胞核基因组和/或线粒体基因组。
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