La presente invenzione riguarda il campo dell'immunologia clinica e in particolare quello della profilassi e terapia nelle malattie degenerative associate ad abnorme espressione di citochine pro-infiammatorie.
In particolare l'invenzione descrive la formulazione di un prodotto che può essere impiegato nella profilassi attiva di malattie associate ad un rilascio incontrollato della citochina TNF-a, come ad esempio la sepsi, lo shock tossico e lo shock emorragico.
La sepsi, o setticemia, è una sindrome sistemica che si sviluppa in seguito ad amplificazione e de-regolazione della corretta risposta immunologia ad una massiccia infezione batterica. La patologia si manifesta inizialmente con stato febbrile, confusione mentale, ipotensione momentanea, diminuzione della capacità urinaria e trombocitopenia, ed evolve spesso ad uno stadio clinico (sepsi grave) caratterizzato da ipotensione farmacologicamente non controllabile, alterazione della coagulazione e disfunzioni d'organo, principalmente a carico di rene e polmone.
Un recente studio epidemiologico ha calcolato per la sepsi una incidenza negli Stati Uniti di 3 casi ogni 1000 abitanti, equivalente a circa 750.000 casi annui, per i quali si riscontra un indice di mortalità del 29%, corrispondente a 215 000 decessi, che aumenta fino al 50% in presenza di shock settico (Angus D.C. et al., 2001, Crit. Care Med., 29:1303-1310). -Occorre sottolineare che questo inaccettabile tasso di mortalità è riferito a soggetti che hanno comunque accesso alle unità di terapia intensiva degli ospedali e sono sottoposti ad adeguato trattamento antibiotico, in assenza dei quali il valore dell'indice può superare la soglia del 90%.
Infezioni batteriche massicce possono essere contratte nelle strutture ospedaliere durante talune pratiche terapeutiche o in seguito ad esposizione involontaria nelle aree con intensa contaminazione microbica, ad esempio quelle coinvolte in conflitti di tipo batteriologico.
L'impiego di un modello sperimentale basato sulla somministrazione di lipopolisaccaridi (LPS), endotossine prodotte dai batteri gram-negativi, ha evidenziato che il meccanismo patogeno della sepsi, e delle malattie ad essa correlate, prevede l'attivazione incontrollata della cascata citochinica proinfiammatoria con rilascio elevato di TNF- alpha , IL-1 e altri fattori secreti dai monociti attivati, che sono considerati mediatori precoci dell'endotossemia acuta (Dinarello C.A., 1997, Chest, 112:321S-329S). In condizioni fisiologiche il sistema immunitario dell'ospite reagisce all'aggressione batterica con una risposta infiammatoria adeguata al suo contenimento, cui fa seguito una risposta anti-infiammatoria in grado di limitarne e modularne l'attività.
Nella sepsi, un'attivazione massiccia dei fagociti determina il rilascio incontrollato delle citochine infiammatorie nel torrente circolatorio, seguito dall'attivazione delle cellule endoteliali che, a loro volta, amplificano lo stato infiammatorio mediando l'adesione di neutrofili circolanti all'endotelio con conseguente danno ossidativo e perdita dell'integrità vascolare. L'alterazione della rete capillare in organi come il polmone e il rene, la formazione di un edema e la depressione delle funzioni miocardiche sono considerate le cause principali di decesso nella fase terminale dello shock settico (Cohen J., 2002, Nature, 420:885-891).
Il trattamento terapeutico della sepsi basato sulla inibizione dei fattori rilasciati precocemente, come TNF- alpha e IL-1, ha ottenuto un limitato successo in quanto sono presenti altri fattori a rilascio ritardato, in particolare la molecola HMGB1, che possono sostenere la patogenesi della malattia e favorirne l'evoluzione letale (Yang H. et al., 2001, Shock, 15:247-253).
La molecola HMGB1, altrimenti conosciuta come HMG-1 (Bustin M., 2001, Trends Biochem. Sci., 26:152-153) o Anfoterina (Parkkinen J. et. al., 1993, J. Biol. Chem., 107:19726-19738), è una proteina umana di 215 amino acidi, ha peso molecolare di circa 25 kDa e risulta altamente conservata nei mammiferi. Inserita nella superfamiglia denominata "HMG-box", ha una struttura organizzata in tre domini, due in grado di legare il DNA che sono indicati come HMG box-A e HMG box-B, e un terzo situato nella regione C-terminale che è formato da 30 residui di acido aspartico e glutammico. I domini che legano il DNA comprendono circa 80 amino acidi, dei quali 29% identici e 65% simili, e sono assemblati in tre strutture ad alpha -elica disposte a forma di L (Read et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21:3427-3436).
La molecola HMGB1 è classificata come nucleoproteina cromosomica non istonica, risulta stabile in ambiente acido (acido perclorico 5%) e può essere separata dalla cromatina mediante estrazione salina con cloruro sodico 0,35 M. Presente in modo abbondante ed ubiquitario nel compartimento nucleare (approssimativamente 10<6> molecole per singolo nucleo), si lega al DNA con specificità strutturale, non sequenziale, e determina un ripiegamento caratteristico dell'elica che facilita la formazione di complessi nucleoproteici in grado di stabilizzarne la struttura e legare specifici fattori di trascrizione.
La proteina è stata inizialmente chiamata Anfoterina per la distribuzione dipolare delle cariche elettriche sulla sua superficie e rilevata nelle cellule cerebrali, non solo in sede nucleare e citoplasmatica ma anche nello spazio extracellulare dove partecipa ai processi di allungamento dei neuriti (Parkkinen J. et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:19726-19738). L'interazione tra HMGB1 e sistema di attivazione del plasminogeno, in particolare la molecola tPA (tissue-type plasminogen activator), comporta a livello extracellulare un aumento della formazione di plasmina che determina in situ una degradazione proteica capace di permettere e/o favorire l'avanzamento della cellula (Parkinnen J., 1991, J. Biol. Chem., 266:16730-16735).
La molecola HMGB1 è stata anche localizzata sulla membrana plasmatica nelle cellule dell'eritroleucemia murina da cui viene rilasciata durante i processi di differenziazione (Passalacqua M. et al., 1997, FEBS Lett., 400:275-279).
Questa molecola è anche un legante del recettore multifunzionale dei prodotti finali di glicosilazione avanzata (RAGE, receptor of advanced glycosylation end-products) che viene espresso da molteplici tipi di cellule, tra cui quelle endoteliali, della muscolatura liscia, i fagociti mononucleati e i neuroni, e che risulta implicato in numerosi processi sia patologici, come diabete e aterosclerosi, che fisiologici, come infiammazione ed allungamento dei neuriti durante lo sviluppo embrionale (Hutten et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:19919-19924).
L'inibizione del legame HMG1/RAGE blocca la crescita della massa tumorale e la formazione di metastasi poiché non consente l'attivazione degli enzimi MAP- chinasi e MMP che sono stati associati alla proliferazione dei tumori e alla loro invasione (Taguchi A. et al., 2000, Nature, 405:354-360).
Il recettore RAGE è anche localizzato nella tunica media dei grandi vasi a livello delle cellule della muscolatura liscia (SMC) e assume particolare rilievo nei processi infiammatori in quanto consente la trans-migrazione nella tunica intima delle cellule danneggiate che hanno fenotipo modificato. L'inibizione del legame tra HMGB1 e RAGE permette di evitare, ritardare o bloccare questa migrazione che svolge un ruolo fondamentale nella fisiopatologia dell'aterosclerosi e della re-stenosi dopo angioplastica coronaria (Brevetto WO 02/074337).
Infine, la molecola HMGB1 viene secreta da macrofagi e cellule pituitariche, sia murine che umane, in seguito a stimolazione con endotossine batteriche (Wang H. et al., 1999, Science, 285:248-251). Descrizione dell'invenzione
La presente invenzione descrive la composizione di un prodotto farmaceutico che può essere usato nell'immunoterapia e nell'immunoprofilassi delle patologie associate ad un rilascio incontrollato di citochine pro-infiammatorie, quando questo rilascio viene promosso e mantenuto dalla presenza della proteina HMGB1. Un esempio non limitativo per l'invenzione di queste patologie è rappresentato dalla sepsi, dallo shock tossico, dallo shock emorragico e dalle malattie ad esse correlate.
In particolare il prodotto dell'invenzione contiene una quantità sufficiente di peptidi derivati dalla molecola HMGB1 in grado di determinare, dopo somministrazione, il rilascio nel soggetto trattato di anticorpi endogeni capaci di neutralizzare l'attività biologica delle molecole HMGB1 circolanti mediante inibizione della loro interazione con i recettori affini.
La presente descrizione comprende anche un metodo specifico per calcolare un indice di efficacia del trattamento profilattico che stabilisca il livello di protezione raggiunto dal soggetto in caso di esposizione a contaminazione batterica.
Il termine "molecola HMGB1" o "proteina HMGB1" è riferito ad una proteina che abbia una identità di sequenza di almeno 70%, preferibilmente maggiore di 80%, e più preferibilmente maggiore di 90% con la proteina indicata nel data-base NCBI-Entrez con numero di accesso P09429 (GI: 123369).
Il termine "peptide" è qui usato nel suo significato convenzionale, ovvero come sequenza di amino acidi che rappresenta una parte della proteina nativa, non limitata dal numero dei residui che la compongono o dalla presenza di modificazioni di tipo post-trascrizionale, come la glicosilazione, l'acetilazione, la fosforilazione e altre modificazioni conosciute allo stato dell'arte che possono essere prodotte per via naturale o artificiale. In particolare, i peptidi che interessano la presente invenzione sono sequenze di amino-acidi che contengono da 10 a 40 residui, preferibilmente da 10 a 30 residui, più preferibilmente da 10 a 20 residui, e che formano epitopi, ovvero determinanti antigenici responsabili delle proprietà immunologiche del peptide stesso, tali da rappresentare una porzione immunogenica della proteina HMGB1 da cui derivano.
Il termine "porzione immunogenica" identifica un frammento della molecola nativa immunologicamente reattivo, cioè capace di indurre nell'ospite una attività neutralizzante nei confronti del frammento somministrato, e per estensione della molecola da cui tale frammento deriva. Il livello di immunogenicità della porzione selezionata non deve risultare inferiore al 50%, preferibilmente al 70%, e più preferibilmente al 90% rispetto a quello mostrato dalla molecola nativa da cui deriva, sebbene in alcuni casi possa risultare uguale o superiore a quello espresso dalla molecola stessa.
Il termine "variante del peptide" indica un peptide che tipicamente differisce dal peptide descritto per una o più delezioni, sostituzioni o inserzioni di amino acidi. Varianti dei peptidi comprese nella presente invenzione sono quelle che tipicamente mostrano all'interno della loro lunghezza una identità di sequenza del 70%, preferibilmente del 80%, e più preferibilmente del 90% con i peptidi derivati dalla molecola nativa. Le sostituzioni prese in considerazione sono quelle definite "conservative", ovvero ottenute con lo scambio tra amino acidi che hanno proprietà simili, per cui sulla base delle attuali conoscenze della chimica dei peptidi, la struttura secondaria e l'idropaticità del peptide rimangono sostanzialmente immutate dopo la sostituzione.
Il modello animale di shock endotossico basato sulla somministrazione di lipopolisaccaride (LPS) è considerato un modello sperimentale adeguato per lo studio fisiopatologico della sepsi in quanto riproduce nell'animale i sintomi, il quadro ematico e l'evoluzione finale della patologia umana. In questo modello la somministrazione intraperitoneale di una dose di 25 mg LPS/kg in un topo Balb/C maschio di 20-25 gr. induce uno stato di letargia, erezione pilifera e diarrea seguito da decesso nelle 48 ore successive al trattamento. L'analisi ematica evidenzia nel topo un aumento del livello serico della citochina TNF-a che assume valori di concentrazione massimi 90 minuti dopo il trattamento per poi decrescere a livelli non significativi nelle 10 ore seguenti (Van der Poli T. et al., 1999, Infect. Dis. Clin. North Am. 13:413-426).
Differente risulta invece in questo modello la modulazione della proteina HMGB1 che compare nel siero 8 ore dopo la somministrazione dell'endotossina ed aumenta la sua concentrazione sono a raggiungere un plateau tra 16 e 32 ore dall'evento scatenante (Wang H. et al., 2001, Am. J. Crit. Care Med. 164:1768-1773).
Nel modello cellulare in vitro basato sulla linea macrofagica murina RAW 264.7 (ATCC, Cat.N. TIB-71) l'aggiunta di LPS al terreno di coltura (100 ng/mL) determina il rilascio e l'accumulo nel medium della proteina HMGB1 dopo 8 ore dal trattamento con endotossina batterica, attività simile a quella ottenuta utilizzando la citochina TNF-a come agente stimolante in sostituzione di LPS (Wang H. et al., 1999, Science 285:248-251).
La molecola HMGB1 ottenuta per via endogena nello shock endotossico è in grado di modulare il rilascio della citochina TNF- alpha in maniera dose-dipendente da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sia in vitro che in vivo, effetto che non può essere ottenuto impiegando i peptidi derivati dalla sua frammentazione al posto della molecola intera (Anderson U. et al., J. Exp. Med. 192:565-570). Sebbene non sia completamente conosciuto il meccanismo dell'interazione tra HMGB1 e cellule mononucleate, esistono evidenze sperimentali che suggeriscono il coinvolgimento del recettore RAGE nell'attivazione cellulare che determina il rilascio di TNF- alpha (Schmidt A.N. et al., J. Clin. Invest. 108:949-955).
Sulla base delle considerazioni esposte è possibile ipotizzare che l'evoluzione letale dello shock endotossico sia in parte dovuta alla presenza in circolo di una quantità eccessiva di TNF- alpha sostenuta dalla presenza di HMGB1 che agisce come fattore stimolante la produzione cellulare della citochina, la quale a sua volta promuove il rilascio del fattore stesso. Questa ipotesi trova riscontro nella presenza di livelli ematici elevati di HMGB1 nei pazienti con sepsi, con valori direttamente proporzionali alla severità della patologia, e nella impossibilità di rilevare questa stessa molecola nel siero di soggetti normali (Wang H. et al., 1999, Science 285:248-251).
E noto allo stato dell'arte che in presenza di anticorpi anti-HMGB1 l'attività biologica della proteina HMGB1 viene neutralizzata in quanto si inibisce la sua interazione con il recettore RAGE, condizione necessaria per l'attivazione del meccanismo citochinico che sostiene il processo flogistico. I dati sperimentali dimostrano che nella sepsi è possibile ridurre e/o eliminare l'evoluzione clinica avversa mediante somministrazione di anticorpi esogeni anti-HMGB1 (immuno-terapia passiva) mentre il trattamento diretto con HMGB1 aumenta la letalità di questa patologia (Van der Poll T., 2001, Lancet Infectious Dis- eases 1:165-174).
E altresì noto allo stato dell'arte che la somministrazione sottocutanea di HMGB1 induce nell'uomo la formazione di anticorpi specifici circolanti con attività citotossica nei confronti delle cellule tumorali, come rivendicato nel brevetto EP 1 079 849.
Queste informazioni depongono a favore della possibilità di ridurre e/o annullare l'effetto letale presente nella fase terminale della sepsi, e delle malattie ad essa correlate, mediante somministrazione di una o più dosi di proteina HMGB1 secondo un protocollo capace di indurre nel soggetto ricevente la formazione di anticorpi circolanti che possono neutralizzare l'effetto del rilascio ritardato di questa proteina nelle sindromi considerate.
La presente invenzione suggerisce l'impiego dei peptidi associati alle porzioni immunogeniche della molecola HMGB1 in sostituzione della molecola stessa, seppure utilizzata in quantità limitata, al fine di evitare durante il trattamento un effetto collaterale negativo dovuto all'impiego della molecola intera, o della sua espressione ricombinante, costituito da un maggiore rilascio della citochina TNF- alpha nel torrente circolatorio.
Un altro aspetto per l'utilizzazione del prodotto è la necessità di individuare i peptidi della molecola HMGB1 capaci di produrre anticorpi circolanti che interagiscano con la molecola nativa. La selezione dei peptidi utili è stata effettuata mediante analisi dei profili di antigenicità e idropaticità della sequenza aminoacidica molecolare generati dal software ANTHEPROT 2000 v5.2 (Institut de Biologie et Chimie des Protéines UMR 5086 CNRS-UCBL, Lyon, France) e dal database pubblico ExPASy - ProtScale (Swiss Institute of Bioinformatics, Basel University, Basel, Switzerland). I risultati ottenuti hanno permesso di identificare alcuni peptidi che con elevata probabilità possiedono i requisiti utili per essere impiegati come induttori della risposta immunitaria e le loro sequenze amino-acidiche sono riportate in Appendice.
Queste sequenze identificano solo alcuni dei possibili peptidi immunogenici della molecola HMGB1 che possono essere impiegati nella presente invenzione e questo elenco è proposto a titolo di esempio e non limita il numero complessivo dei peptidi utilizzabili, né la quantità o la tipologia dei residui amino-acidici che potrebbero contenere. Ai fini dell'invenzione possono inoltre essere impiegati i peptidi ottenuti da sequenze considerate varianti di quelle presenti nella molecola nativa.
La presente invenzione riguarda la composizione del prodotto da somministrare che prevede l'associazione della sostanza immunogenica con una sostanza immunostimolante in grado di potenziare la risposta immune (sessile o circolante) indotta dalla sostanza immunogenica stessa (Powell M.F., Newman M.J., 1995. "Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach." Plenum Press Ed., New York).
La sostanza immunogena è rappresentata da una formulazione accettabile dei peptidi della molecola HMGB1 in forma naturale o variante, presenti in singolo o in associazione, al limite dall'intera molecola ottenuta con tecniche ricombinanti (HMGB1r). Per formulazione accettabile si intende l'impiego della sostanza in una forma che sulla base delle attuali conoscenze farmaceutiche sia idonea per l'inserimento in prodotti che possono essere iniettati, inalati o ingeriti da una specie animale, preferibilmente dalla specie umana.
La sostanza immunostimolante impiegata in questa invenzione è classificabile nella categoria degli adiuvanti, in cui rientrano sia le sostanze che proteggono l'antigene da un rapido catabolismo, come l'idrossido di alluminio o l'olio minerale, sia quelle che stimolano la risposta immune in modo generico, come il lipide A o le proteine derivate dal microrganismo Bortadella Pertussis. Essa può essere scelta nell'ambito degli adiuvanti commerciali che hanno impiego farmaceutico, tra i quali si ricordano, senza intenti limitativi per la formulazione del prodotto di questa invenzione, sostanze come ISA-51 e ISA-720 (Seppie, Francia), SAF e MF-59 (Chiron, USA), SBAS-2 e SBAS-4 (Smith Kline Beecham, Belgio), Detox e RC-529 (Corica, USA). Limpiego dell'adiuvante ImmunEasy (Quiagen, Svizzera) è invece limitato ai soli modelli sperimentali murini.
Il prodotto farmaceutico oggetto di questa invenzione può inoltre contenere tamponi fisiologici, carboidrati, mannitolo, proteine stabilizzanti, antiossidanti, batteriostatici, agenti chelanti o altre sostanze contemplate nelle Farmacopee Internazionali che sono generalmente utilizzate nella preparazione di farmaci o vaccini per animali a sangue caldo, preferibilmente ad uso umano.
Nella presente invenzione la quantità di sostanza immunogenica inserita nella composizione farmaceutica deve essere in grado di produrre un beneficio clinico al soggetto ricevente, ossia determinare un rilascio di anticorpi circolanti sufficiente a neutralizzare l'attività biologico/recettoriale della molecola HMGB1. La definizione della dose dipende dalla specie animale trattata, essendo per la specie umana accettabile una dose di immunogeno solitamente compresa tra 5 mu g e 2 mg per chilo di peso corporeo, preferibilmente tra 20 mu g e 500 mu g per chilo, e ancor più preferibilmente tra 50 mu g e 100 mu g per chilo, mentre nel topo sono utilizze dosi comprese tra 50 mu g e 8 mg per chilo di peso corporeo, preferibilmente tra 100 mu g e 4 mg per chilo, e ancor più preferibilmente tra 400 mu g e 1 mg per chilo.
Il volume finale di una dose somministrata per via intramuscolare è solitamente compreso tra 50 mu l e 1 mL, preferibilmente tra 100 mu l e 0,5 mL, ma volumi differenti potrebbero essere richiesti dalle altre vie di somministrazione.
Una valutazione di efficacia del trattamento di immunoprofilassi attiva associato all'uso del prodotto descritto può essere effettuata mediante determinazione del livello di citochina pro-infiammatoria rilascia dalle cellule competenti dopo stimolazione con HMGB1 in presenza del siero del soggetto trattato, confronto con il livello misurato in assenza di siero e calcolo di un indice parametrico che definisca la validità del trattamento. Il razionale del metodo proposto si basa sulla capacità degli anticorpi prodotti di inibire l'interazione tra la molecola HMGB1 ed il recettore RAGE presente sulla superficie delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e sulla conseguente possibilità di evidenziare l'evento inibitorio mediante una misura quantitativa del rilascio di citochine pro-infiammatorie promosso dalla stimolazione recettoriale.
La separazione delle cellule PBMC dal sangue fresco di un donatore umano viene effettuata mediante tecniche di centrifugazione comunemente note allo stato dell'arte, come quella descritta in Esempio 2. Dopo separazione una quantità costante di cellule, preferibilmente 5 x 10<5> cellule, viene incubata con 55 ng di HMGB1r e con un volume fisso, preferibilmente 100 mu L, di siero scomplementato (riscaldamento a 56 DEG C per 30 minuti) ottenuto da un soggetto trattato con il prodotto oggetto di questa invenzione. La presenza nel siero di anticorpi anti-HMGB1 impedisce alla molecola ricombinante esogena di interagire con i recettori RAGE presenti sulle cellule mononucleate ed inibisce il rilascio della citochina TNF- alpha nel mezzo extracellulare.
L'efficacia del modello descritto è verificata impiegando un siero iper-immune non specifico, che consente il massimo rilascio di TNF- alpha (Controllo Positivo), o evitando l'aggiunta di HMGB1r al sistema in modo da impedire il rilascio della citochina (Controllo Negativo). La fase successiva del protocollo analitico comporta la determinazione quantitativa della citochina presente nel mezzo di crescita cellulare mediante un metodo immunometrico commerciale. Esso prevede la rimozione di una frazione delle molecole TNF- alpha presenti nel terreno di coltura mediante interazione con anticorpi specifici adsorbiti ad una fase solida e la rivelazione delle molecole rimosse attraverso la reazione con un altro anticorpo specifico coniugato ad un opportuno tracciante.
La misura analitica quantitativa è ottenuta per confronto dosando nelle stesse condizioni un campione con contenuto noto di citochina. Un esempio, non limitante, di dosaggio immunometrico commerciale adatto per lo scopo sopra indicato è rappresentato dal kit human TNF- alpha Immunoassay Quantikine prodotto da R&D SYSTEM (Cat.N. DTA50).
La quantità massima di TNF- alpha rilasciata nel terreno di coltura è misurabile nel campione ottenuto in seguito all'aggiunta del siero iper-immune aspecifico, etichettato come Controllo Positivo (CP), mentre i campioni analitici (CA) in cui sono presenti quantità variabili e crescenti di anticorpo anti-HMGB1 esprimono concentrazioni decrescenti della citochina. Il rapporto tra la concentrazione di TNF- alpha presente nel campione in analisi (CA) e quella riferita al controllo positivo (CP) definisce un parametro numerico continuo (rapporto CA/CP) con intervallo di esistenza compreso tra 0 e 1. La classificazione di questo parametro mediante una scala a punteggio permette di assegnare al campione analitico un indice che definisce la sua capacità neutralizzante.
I valori di questo indice sono stabiliti sulla base del seguente criterio: un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,9 corrisponde all'indice 0; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,75 e minore di 0,9 corrisponde all'indice +1; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,5 e minore di 0,75 corrisponde all'indice +2; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,25 e minore di 0,5 corrisponde all'indice +3; un rapporto CA/CP inferiore a 0,25 corrisponde all'indice +4.
L'efficacia del trattamento di immunoprofilassi, intesa come capacità indotta di contrastare l'evoluzione fatale della sepsi e delle malattie ad essa correlate, viene stabilita in base all'indice assegnato al campione analitico ed è considerata nulla per un indice 0, scarsa per un indice +1, accettabile per un indice +2, buona per un indice +3 e ottima per un indice +4.
La possibilità di utilizzare il trattamento proposto nella presente invenzione come profilassi per una infezione batterica severa da microrganismi Gram negativi è dimostrata nel modello murino dello shock endotossico. Gli animali sono preliminarmente immunizzati mediante somministrazione di tre dosi di peptide (25 mu g), o molecola intera (10 mu g), con frequenza bisettimanale e successivamente ricevono una quantità letale di LPS (1 mg) in grado di provocarne il decesso entro tre giorni dal trattamento con endotossina. Il confronto della sopravvivenza tra animali immunizzati e animali che hanno ricevuto il solo adiuvante evidenzia una differenza tra i due gruppi maggiore o uguale a 50% a favore del gruppo immunizzato.
Sono di seguito riportati alcuni esempi utili per illustrare la presente invenzione ma non limitativi per essa. Esempio 1 Protocollo di immunizzazione.
Questo esempio descrive la procedura adottata per l'immunoprofilassi attiva di topi Balb/C da impiegare in un modello sperimentale in vivo della sepsi.
16 topi Balb/C maschi di 6-7 settimane (20-25 gr) sono iniettati in sede intramuscolare con un composto che contiene la proteina HMGB1r (SIGMA-ALDRICH, Cat. N. H-4652) o alternativamente il peptide identificato come SEQ. ID. No. 1 in Appendice. Il peptide è prodotto con metodi e tecnologie ben conosciute, e di pubblico dominio, da società commerciali mediante sintesi automatica su un "core" di lisina in modo da formare una macromolecola, in seguito denominata MAP (Multiple Antigenic Protein). Questa molecola è composta da 8 peptidi a sequenza nota, covalentemente ancorati alla struttura interna di lisina che non è immunologicamente reattiva.
Il composto da iniettare viene preparato aggiungendo 10 mu g di HMGB1r (35 mu l Soluzione Fisiologica) o 25 mu g di MAP (50 mu l Tampone Fosfato Salino) a 50 mu l di ImmunEasy Mouse Adjuvant (QIAGEN AG, Basel). I reagenti sono miscelati accuratamente e lasciati incubare 5 minuti a temperatura ambiente (18-25 DEG C) prima di essere trasferiti in una siringa ed iniettati, come singola dose, nell'animale in sede intramuscolare a livello del quadricipite. Metà degli animali ricevono la proteina intera (Gruppo 1) mentre i restanti sono immunizzati con il complesso peptidico (Gruppo 2).
Il protocollo di trattamento prevede per entrambe i Gruppi tre somministrazioni con cadenza bisettimanale, rispettivamente 38 giorni (primer), 24 giorni (primo richiamo) e 10 giorni (secondo richiamo) prima di effettuare il prelievo per la valutazione della capacità neutralizzante degli anticorpi (vedi Esempio 2) o di indurre lo shock settico mediante inoculazione di endotossine batteriche (vedi Esempio 3). Il campione di controllo è costituito da 8 topi Balb/C maschi di identica età e peso (Gruppo 3) trattati secondo il medesimo protocollo con 50 mu l di ImmunEasy Mouse Adjuvant. Esempio 2
Valutazione della capacità neutralizzante degli anticorpi anti-HMGB1.
Questo esempio illustra il metodo adottato per valutare in vitro la capacità neutralizzante degli anticorpi ottenuti con la somministrazione di HMGB1r o del complesso MAP, e per calcolare l'indice di efficacia del trattamento di immunoprofilassi. La procedura si basa sulla determinazione quantitativa della citochina TNF- alpha rilasciata dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), preferibilmente monociti, come risposta alla stimolazione con HMGB1r.
I monociti sono ottenuti addizionando 5 mL di Tampone Fosfato Salino a 3 mL di sangue venoso umano raccolto in eparina o EDTA, miscelando per inversione e stratificando la sospensione in una provetta da centrifuga di 15 mL contenente 3 mL di Histopaque-1077 (SIGMA-ALDRICH, Cat.N. H-8889). Dopo centrifugazione a 400 x g per 30 minuti lo strato superiore è rimosso con una pipetta sino al limite del sottostante strato opaco che contiene le cellule mononucleate. Si trasferisce quindi lo strato opaco in una provetta da centrifuga vuota e si aggiunge 10 mL di Tampone Fosfato Salino miscelando per inversione. Dopo centrifugazione per 10 minuti a 250 x g, il supernatante viene aspirato e il precipitato cellulare sospeso in 5 mL di Tampone Fosfato Salino mediante gentile aspirazione con una pipetta.
Dopo ripetizione del lavaggio il precipitato è sospeso 1 mL di terreno di coltura RPMI 1640 (IRVINE, Cat.N. 9024) addizionato con 10% di Siero Fetale Bovino (SIGMA-ALDRICH, Cat.N. F2442), le cellule sono diluite alla concentrazione di 10<6> cellule/mL di terreno coltura e 0,5 mL della sospensione finale sono trasferiti nei pozzetti di una piastra sterile da 24 unità, calcolando sei pozzetti per i campioni da analizzare e due pozzetti per i campioni di controllo negativo e positivo. Dopo incubazione in termostato per 1 ora a 37 DEG C (5% MO 2 ) il terreno di coltura di ciascun pozzetto é rimosso per eliminare i linfociti in sospensione e sostituito con 0,4 mL di RPMI 1640 a cui sono aggiunti 100 mu L di siero murino scomplementato (30 minuti a 56 DEG C).
I campioni di siero immune contrassegnati CA #1-#3 e CA #4-#6 sono ottenuti dagli animali appartenenti rispettivamente al Gruppo 1 e al Gruppo 2, mentre quelli usati come controllo positivo o negativo del metodo (contrassegnati CP e CN) sono prelevati agli animali del Gruppo 3. Ad ogni pozzetto sono poi aggiunti 55 ng di HMGB1r (50 mu L di una soluzione 1,1 mu g/mL in terreno RPMI 1640), ad esclusione di quello contrassegnato CN che riceve un volume equivalente di terreno di coltura. Dopo incubazione in termostato della piastra per 4 ore (37 DEG C, 5% CO 2 ), sono prelevati da ciascun pozzetto 150 mu L di terreno di coltura, evitando di rimuovere le cellule cresciute in adesione sul fondo, e il contenuto di TNF- alpha determinato con il kit commerciale human TNF- alpha Immunoassay Quantikine (R&D SYSTEM, Cat.N.
DTA50) dopo diluizione del terreno di coltura 1:5 (v:v) con il tampone diluente RD5 contenuto nel kit. Il dosaggio è effettuato in doppio seguendo le istruzioni operative fornite dal produttore e il valore medio di concentrazione di ciascun campione, ottenuto moltiplicato il risultato per il fattore di diluizione, è riportato nella tabella sottostante. La seduta analitica si considera accettabile se la concentrazione di TNF- alpha nei campioni di controllo risulta inferiore a 100 ng/mL nel campione CN e superiore a 4.000 ng/mL nel campione CP. L'indice di efficacia dei prelievi è ottenuto dal rapporto tra la misura analitica del campione in esame (CA) e quella del controllo positivo (CP).
<tb><TABLE> Columns = 4 <tb>Head Col 1: CA <tb>Head Col 2: TNF- alpha (ng/ml) <tb>Head Col 3: CA/CP <tb>Head Col 4: Indice <tb><SEP> # 1<SEP> 3450<SEP> 0.80<SEP> 1+ <tb><SEP> # 2<SEP> 2030<SEP> 0,47<SEP> 3+ <tb><SEP> # 3<SEP> 4410<SEP> 1,02<SEP> 0 <tb><SEP> # 4<SEP> 2380<SEP> 0,55<SEP> 2+ <tb><SEP> # 5<SEP> 3075<SEP> 0,71<SEP> 2+ <tb><SEP> # 6<SEP> 515<SEP> 0,12<SEP> 4+ <tb><SEP> CN<SEP> 55 <tb><SEP> CP<SEP> 4.320 <tb></TABLE> Esempio 3 Efficacia della immunoprofilassi nello shock settico indotto.
Questo esempio mostra gli effetti della somministrazione di una quantità letale di endotossina agli animali preliminarmente sottoposti a trattamento profilattico con la molecola HMGB1r o con il complesso MAP derivato dal peptide con SEQ.N. 1.
Gli animali indicati in Esempio 1 e appartenenti al Gruppo 1 (somministrazione di HMGB1r), Gruppo 2 (somministrazione di MAP) e Gruppo 3 (somministrazione del solo adiuvante), sono trattati con una dose letale di endotossina LPS (SIGMA-ALDRICH Cat. N. L2262), mediante inoculazione in sede intraperitoneale di 1 mg di LPS in 1 mi di soluzione PBS. Dopo la somministrazione gli animali sono mantenuti alle normali condizioni climatiche con alimentazione standard e la loro sopravvivenza valutata al termine delle successive 72 ore. I risultati sperimentali ottenuti sono inclusi nella tabella sottostante.
<tb><TABLE> Columns = 4 <tb>Head Col 1: Gruppo 1 <tb>Head Col 2: Gruppo 2 <tb>Head Col 3: Gruppo 3 <tb><SEP> Immunogeno<SEP> HMGB1r<SEP> Peptide 1<SEP> - <tb><SEP> N. animali<SEP> 8<SEP> 8<SEP> 8 <tb><SEP> N. decessi<SEP> 2<SEP> 3<SEP> 7 <tb><SEP> Sopravvivenza %<SEP> 75<SEP> 63<SEP> 13 <tb></TABLE> Appendice
SEQ. ID. No. 1-13 amino acidi
Met-Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met
MGKGDPKKPRGKM-OH
SEQ. ID. No. 2-13 amino acidi
Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His-Pro-Asp-Ala-Ser-OH
CREEHKKKHPDAS
SEQ. ID. No. 3-13 amino acidi
Met-Ala-Lys-Ala-Asp-Lys-Ala-Arg-Tyr-Glu-Arg-Glu-Met-OH
MAKADKARYEREM
SEQ. ID. No. 4-11 amino acidi
Ile-Pro-Pro-Lys-Gly-Glu-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-OH
IPPKGETKKKF
SEQ. ID. No. 5-15 amino acidi
Lys-Gly-Glu-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-Lys-Asp-Pro-Asn-Ala-Pro-Lys-OH
KGETKKKFKDPNAPK
SEQ. ID. No. 6-15 amino acidi
Glu-Lys-Lys-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Glu-Lys-Tyr-Glu-Lys-Asp-Ile-OH
EKKAAKLKEKYEKDI
SEQ. ID. No. 7-13 amino acidi
Arg-Ala-Lys-Gly-Lys-Pro-Asp-Ala-Ala-Lys-Lys-Gly-Val-OH
RAKGKPDAAKKGV
SEQ. ID. No 8-15 amino acidi
Glu-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Asp-Glu-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp-Asp-Glu-OH
EDEEDEDEEEDDDDE
The present invention concerns the field of clinical immunology and in particular that of prophylaxis and therapy in degenerative diseases associated with abnormal expression of pro-inflammatory cytokines.
In particular, the invention describes the formulation of a product that can be used in the active prophylaxis of diseases associated with an uncontrolled release of the TNF-a cytokine, such as for example sepsis, toxic shock and hemorrhagic shock.
Sepsis, or septicemia, is a systemic syndrome that develops following amplification and de-regulation of the correct immunological response to massive bacterial infection. The pathology manifests itself initially with a feverish state, mental confusion, momentary hypotension, decreased urinary capacity and thrombocytopenia, and often evolves to a clinical stage (severe sepsis) characterized by pharmacologically uncontrollable hypotension, coagulation alteration and organ dysfunction, mainly borne by kidney and lung.
A recent epidemiological study has calculated for the sepsis an incidence in the United States of 3 cases per 1000 inhabitants, equivalent to about 750,000 annual cases, for which there is a mortality index of 29%, corresponding to 215,000 deaths, which increases until at 50% in the presence of septic shock (Angus DC et al., 2001, Crit. Care Med., 29: 1303-1310). -It should be emphasized that this unacceptable mortality rate refers to subjects who have access to intensive care units in hospitals and are subjected to adequate antibiotic treatment, without which the value of the index can exceed the threshold of 90%.
Massive bacterial infections can be contracted in hospital facilities during certain therapeutic practices or following involuntary exposure in areas with intense microbial contamination, such as those involved in bacteriological conflicts.
The use of an experimental model based on the administration of lipopolysaccharides (LPS), endotoxins produced by gram-negative bacteria, has shown that the pathogenic mechanism of sepsis, and related diseases, involves the uncontrolled activation of the proinflammatory cytokine cascade with high release of TNF- alpha, IL-1 and other factors secreted by activated monocytes, which are considered early mediators of acute endotoxaemia (Dinarello CA, 1997, Chest, 112: 321S-329S). In physiological conditions, the host's immune system reacts to bacterial aggression with an inflammatory response appropriate to its containment, followed by an anti-inflammatory response capable of limiting and modulating its activity.
In sepsis, a massive activation of phagocytes determines the uncontrolled release of inflammatory cytokines in the circulatory stream, followed by activation of endothelial cells which, in turn, amplify the inflammatory state by mediating the adhesion of circulating neutrophils to the endothelium with consequent damage oxidative and loss of vascular integrity. The alteration of the capillary network in organs such as the lung and kidney, the formation of an edema and the depression of myocardial functions are considered the main causes of death in the terminal phase of septic shock (Cohen J., 2002, Nature, 420: 885-891).
The therapeutic treatment of sepsis based on the inhibition of early released factors, such as TNF-alpha and IL-1, has achieved limited success because other delayed-release factors are present, in particular the HMGB1 molecule, which can support the pathogenesis of the disease and encourage its lethal evolution (Yang H. et al., 2001, Shock, 15: 247-253).
The HMGB1 molecule, otherwise known as HMG-1 (Bustin M., 2001, Trends Biochem. Sci., 26: 152-153) or Anfoterina (Parkkinen J. et. Al., 1993, J. Biol. Chem., 107 : 19726-19738), is a human protein of 215 amino acids, has a molecular weight of about 25 kDa and is highly conserved in mammals. Inserted in the superfamily called "HMG-box", it has a structure organized in three domains, two able to bind the DNA which are referred to as HMG box-A and HMG box-B, and a third located in the C-terminal region which is consisting of 30 residues of aspartic and glutamic acid. The DNA-binding domains comprise about 80 amino acids, of which 29% are identical and 65% similar, and are assembled in three alpha-helix structures arranged in the shape of an L (Read et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 3427-3436).
The HMGB1 molecule is classified as a non-histone chromosomal nucleoprotein, is stable in an acid environment (5% perchloric acid) and can be separated from the chromatin by saline extraction with 0.35 M sodium chloride. Present abundantly and ubiquitously in the nuclear compartment (approximately 10 <6> molecules per single nucleus), binds to DNA with structural, non-sequential specificity, and determines a characteristic folding of the helix that facilitates the formation of nucleoprotein complexes able to stabilize its structure and bind specific transcription factors.
The protein was initially called Anfoterina for the dipolar distribution of electric charges on its surface and detected in brain cells, not only in the nuclear and cytoplasmic area but also in the extracellular space where it participates in the processes of elongation of the neurites (Parkkinen J. et al. , 1993, J. Biol. Chem., 268: 19726-19738). The interaction between HMGB1 and plasminogen activation system, in particular the tPA molecule (tissue-type plasminogen activator), leads to an extracellular level of an increase in the formation of plasmin which determines in situ a protein degradation capable of permitting and / or favoring the cell advancement (Parkinnen J., 1991, J. Biol. Chem., 266: 16730-16735).
The HMGB1 molecule has also been localized on the plasma membrane in murine erythroleukemia cells from which it is released during the differentiation processes (Passalacqua M. et al., 1997, FEBS Lett., 400: 275-279).
This molecule is also a multifunctional receptor binding agent for advanced glycosylation end products (RAGE, receptor of advanced glycosylation end-products) which is expressed by multiple cell types, including endothelial cells, smooth muscle, mononuclear phagocytes and neurons, and which is implicated in numerous processes both pathological, such as diabetes and atherosclerosis, and physiological processes, such as inflammation and lengthening of neurites during embryonic development (Hutten et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 19919-19924).
The inhibition of the HMG1 / RAGE bond blocks the growth of the tumor mass and the formation of metastases since it does not allow the activation of the MAP-kinase and MMP enzymes that have been associated with tumor proliferation and their invasion (Taguchi A. et al ., 2000, Nature, 405: 354-360).
The RAGE receptor is also localized in the medium tunica of the large vessels at the level of the smooth muscle cells (SMC) and assumes particular importance in the inflammatory processes as it allows the trans-migration in the intimate tunic of the damaged cells that have modified phenotype. The inhibition of the link between HMGB1 and RAGE allows to avoid, delay or block this migration which plays a fundamental role in the pathophysiology of atherosclerosis and stenosis after coronary angioplasty (Patent WO 02/074337).
Finally, the HMGB1 molecule is secreted by macrophages and pituitary cells, both murine and human, following stimulation with bacterial endotoxins (Wang H. et al., 1999, Science, 285: 248-251). Description of the invention
The present invention describes the composition of a pharmaceutical product which can be used in immunotherapy and in the immunoprophylaxis of pathologies associated with an uncontrolled release of pro-inflammatory cytokines, when this release is promoted and maintained by the presence of the HMGB1 protein. A non-limiting example for the invention of these pathologies is represented by sepsis, toxic shock, haemorrhagic shock and related diseases.
In particular, the product of the invention contains a sufficient amount of peptides derived from the HMGB1 molecule capable of determining, after administration, the release into the subject subject of endogenous antibodies capable of neutralizing the biological activity of the circulating HMGB1 molecules by inhibiting their interaction with related receptors.
The present description also includes a specific method for calculating an efficacy index of the prophylactic treatment that establishes the level of protection achieved by the subject in the event of exposure to bacterial contamination.
The term "HMGB1 molecule" or "HMGB1 protein" refers to a protein that has a sequence identity of at least 70%, preferably greater than 80%, and more preferably greater than 90% with the protein indicated in the NCBI database Entrez with access number P09429 (GI: 123369).
The term "peptide" is used here in its conventional meaning, that is as a sequence of amino acids that represents a part of the native protein, not limited by the number of residues that compose it or by the presence of post-transcriptional modifications, such as glycosylation , acetylation, phosphorylation and other modifications known to the state of the art that can be produced naturally or artificially. In particular, the peptides affecting the present invention are amino acid sequences which contain from 10 to 40 residues, preferably from 10 to 30 residues, more preferably from 10 to 20 residues, and which form epitopes, or antigenic determinants responsible for the properties immunological properties of the peptide itself, such as to represent an immunogenic portion of the HMGB1 protein from which they derive.
The term "immunogenic portion" identifies a fragment of the immunologically reactive native molecule, that is capable of inducing in the host a neutralizing activity towards the fragment administered, and by extension of the molecule from which this fragment derives. The level of immunogenicity of the selected portion should not be less than 50%, preferably 70%, and more preferably 90% compared to that shown by the native molecule from which it derives, although in some cases it may be equal to or greater than that expressed by the molecule itself.
The term "peptide variant" refers to a peptide that typically differs from the peptide described by one or more deletions, substitutions or insertions of amino acids. Variants of the peptides included in the present invention are those which typically show within their length a sequence identity of 70%, preferably 80%, and more preferably 90% with the peptides derived from the native molecule. The substitutions taken into consideration are those defined as "conservative", that is obtained with the exchange between amino acids that have similar properties, so on the basis of current knowledge of peptide chemistry, the secondary structure and the hydropathicity of the peptide remain substantially unchanged after replacement.
The animal model of endotoxic shock based on the administration of lipopolysaccharide (LPS) is considered an adequate experimental model for the pathophysiological study of sepsis as it reproduces the symptoms, the blood picture and the final evolution of human pathology in the animal. In this model the intraperitoneal administration of a dose of 25 mg LPS / kg in a male Balb / C 20-25 gr. induces a state of lethargy, piliferous erection and diarrhea followed by death within 48 hours of treatment. The blood analysis shows in the mouse an increase in the serum level of the TNF-a cytokine that assumes maximum concentration values 90 minutes after the treatment and then decreases to non-significant levels in the following 10 hours (Van der Poli T. et al., 1999 , Infect Dis. Clin. North Am. 13: 413-426).
On the other hand, in this model the modulation of the HMGB1 protein that appears in the serum 8 hours after endotoxin administration and increases its concentration is different, reaching a plateau between 16 and 32 hours after the triggering event (Wang H. et al., 2001, Am. J. Crit. Care Med. 164: 1768-1773).
In the in vitro cellular model based on the murine macrophage line RAW 264.7 (ATCC, Cat.N. TIB-71) the addition of LPS to the culture medium (100 ng / mL) determines the release and accumulation in the medium of the HMGB1 protein 8 hours after treatment with bacterial endotoxin, an activity similar to that obtained using the cytokine TNF-a as a stimulating agent in place of LPS (Wang H. et al., 1999, Science 285: 248-251).
The HMGB1 molecule obtained endogenously in endotoxic shock is able to modulate the release of the TNF-alpha cytokine in a dose-dependent manner by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) both in vitro and in vivo, an effect that cannot be obtained by using peptides derived from its fragmentation instead of the whole molecule (Anderson U. et al., J. Exp. Med. 192: 565-570). Although the mechanism of the interaction between HMGB1 and mononuclear cells is not completely known, there is experimental evidence to suggest the involvement of the RAGE receptor in the cellular activation that determines the release of TNF-alpha (Schmidt AN et al., J. Clin. Invest . 108: 949-955).
Based on the above considerations, it is possible to hypothesize that the lethal evolution of endotoxic shock is partly due to the presence in the circulation of an excessive quantity of TNF-alpha sustained by the presence of HMGB1 which acts as a stimulating factor for the cellular production of the cytokine, which in turn promotes the release of the factor itself. This hypothesis is found in the presence of high blood levels of HMGB1 in patients with sepsis, with values directly proportional to the severity of the disease, and in the impossibility of detecting this same molecule in the serum of normal subjects (Wang H. et al., 1999, Science 285: 248-251).
It is known at the state of the art that in the presence of anti-HMGB1 antibodies the biological activity of the HMGB1 protein is neutralized as its interaction with the RAGE receptor is inhibited, a necessary condition for the activation of the cytokine mechanism that supports the inflammatory process . Experimental data show that in sepsis it is possible to reduce and / or eliminate the adverse clinical evolution by the administration of anti-HMGB1 exogenous antibodies (passive immuno-therapy) while direct treatment with HMGB1 increases the lethality of this pathology (Van der Poll T ., 2001, Lancet Infectious Dis-eases 1: 165-174).
It is also known in the state of the art that the subcutaneous administration of HMGB1 induces in humans the formation of specific antibodies circulating with cytotoxic activity against tumor cells, as claimed in the patent EP 1 079 849.
This information supports the possibility of reducing and / or canceling the lethal effect present in the terminal phase of sepsis, and of the diseases related to it, by administering one or more doses of HMGB1 protein according to a protocol capable of inducing the recipient the formation of circulating antibodies that can neutralize the effect of the delayed release of this protein in the considered syndromes.
The present invention suggests the use of the peptides associated with the immunogenic portions of the HMGB1 molecule in substitution of the molecule itself, although used in limited quantities, in order to avoid a negative side effect during the treatment due to the use of the whole molecule, or of its recombinant expression, consisting of greater release of the TNF-alpha cytokine in the circulatory stream.
Another aspect for the use of the product is the need to identify the peptides of the HMGB1 molecule capable of producing circulating antibodies that interact with the native molecule. The selection of useful peptides was carried out by analyzing antigenicity and hydropathicity profiles of the molecular amino acid sequence generated by the ANTHEPROT 2000 v5.2 software (Institut de Biologie et Chimie des Protéines UMR 5086 CNRS-UCBL, Lyon, France) and by the public database ExPASy - ProtScale (Swiss Institute of Bioinformatics, Basel University, Basel, Switzerland). The obtained results have allowed to identify some peptides that with high probability possess the requisites useful to be used as inducers of the immune response and their amino acidic sequences are reported in the Appendix.
These sequences identify only some of the possible immunogenic peptides of the HMGB1 molecule that can be used in the present invention and this list is proposed by way of example and does not limit the total number of usable peptides, nor the quantity or type of amino acid residues which may contain. For the purposes of the invention, peptides obtained from sequences considered to be variants of those present in the native molecule can also be used.
The present invention relates to the composition of the product to be administered which provides for the association of the immunogenic substance with an immunostimulatory substance capable of enhancing the immune response (sessile or circulating) induced by the immunogenic substance itself (Powell MF, Newman MJ, 1995. "Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach. "Plenum Press Ed., New York).
The immunogenic substance is represented by an acceptable formulation of the peptides of the HMGB1 molecule in natural or variant form, present in single or in association, at the limit from the entire molecule obtained with recombinant techniques (HMGB1r). By acceptable formulation we mean the use of the substance in a form which on the basis of current pharmaceutical knowledge is suitable for insertion in products that can be injected, inhaled or ingested by an animal species, preferably from the human species.
The immunostimulant substance used in this invention can be classified in the category of adjuvants, which include both substances that protect the antigen from rapid catabolism, such as aluminum hydroxide or mineral oil, and those that stimulate the immune response in generic way, such as lipid A or proteins derived from the Bortadella Pertussis microorganism. It can be chosen in the context of commercial pharmaceutical adjuvants, among which there are substances such as ISA-51 and ISA-720 (Seppie, Francia), SAF and MF-59 (Chiron, USA), SBAS-2 and SBAS-4 (Smith Kline Beecham, Belgium), Detox and RC-529 (Corica, USA). The use of the ImmunEasy adjuvant (Quiagen, Switzerland) is instead limited only to murine experimental models.
The pharmaceutical product object of this invention can also contain physiological buffers, carbohydrates, mannitol, stabilizing proteins, antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents or other substances contemplated in International Pharmacopoeias which are generally used in the preparation of drugs or vaccines for warm-blooded animals, preferably for human use.
In the present invention the quantity of immunogenic substance inserted in the pharmaceutical composition must be capable of producing a clinical benefit for the recipient subject, ie determining a release of circulating antibodies sufficient to neutralize the biological / receptor activity of the HMGB1 molecule. The definition of the dose depends on the animal species treated, being for the acceptable human species a dose of immunogen usually between 5 mu g and 2 mg per kilogram of body weight, preferably between 20 mu g and 500 mu g per kilo, and even more preferably between 50 mu g and 100 mu g per kilo, while in the mouse doses between 50 mu g and 8 mg per kilo of body weight are used, preferably between 100 mu g and 4 mg per kilo, and even more preferably between 400 mu g and 1 mg per kilo .
The final volume of a dose administered intramuscularly is usually between 50 mu l and 1 mL, preferably between 100 mu l and 0.5 mL, but different volumes could be required by the other routes of administration.
An efficacy evaluation of the active immunoprophylaxis treatment associated with the use of the described product can be carried out by determining the level of pro-inflammatory cytokine released by the competent cells after stimulation with HMGB1 in the presence of the treated subject serum, comparison with the level measured in absence of serum and calculation of a parametric index defining the validity of the treatment. The rationale of the proposed method is based on the ability of the produced antibodies to inhibit the interaction between the HMGB1 molecule and the RAGE receptor present on the surface of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and on the consequent possibility of highlighting the inhibitory event by means of a measurement quantitative of pro-inflammatory cytokine release promoted by receptor stimulation.
The separation of the PBMC cells from the fresh blood of a human donor is carried out by centrifugation techniques commonly known at the state of the art, such as that described in Example 2. After separation a constant quantity of cells, preferably 5 x 10 <5> cells, it is incubated with 55 ng of HMGB1r and with a fixed volume, preferably 100 mu L, of serum (up to 56 DEG C for 30 minutes) obtained from a subject treated with the product object of this invention. The presence of anti-HMGB1 antibodies in the serum prevents the exogenous recombinant molecule from interacting with the RAGE receptors present on the mononuclear cells and inhibits the release of the TNF-alpha cytokine in the extracellular medium.
The effectiveness of the described model is verified using a non-specific hyper-immune serum, which allows the maximum release of TNF-alpha (Positive Control), or avoiding the addition of HMGB1r to the system in order to prevent the cytokine release (Control Negative). The next phase of the analytical protocol involves the quantitative determination of the cytokine present in the cell growth medium by a commercial immunometric method. It involves the removal of a fraction of the TNF-alpha molecules present in the culture medium by interaction with specific antibodies adsorbed to a solid phase and the detection of the molecules removed through the reaction with another specific antibody conjugated to a suitable tracer.
The quantitative analytical measurement is obtained by comparison by dosing a sample with known cytokine content under the same conditions. A non-limiting example of a commercial immunometric dosage suitable for the purpose indicated above is represented by the human TNF-alpha Immunoassay Quantikine kit produced by R&D SYSTEM (Cat.N. DTA50).
The maximum quantity of TNF-alpha released in the culture medium is measurable in the sample obtained following the addition of the non-specific hyper-immune serum, labeled as Positive Control (CP), while the analytical samples (CA) in which variable quantities are present and increasing anti-HMGB1 antibodies express decreasing concentrations of the cytokine. The ratio between the concentration of TNF-alpha present in the sample being analyzed (CA) and that referred to the positive control (CP) defines a continuous numeric parameter (CA / CP ratio) with an existence interval between 0 and 1. The classification of this parameter through a score scale allows to assign to the analytical sample an index that defines its neutralizing capacity.
The values of this index are established on the basis of the following criterion: an AC / CP ratio greater than or equal to 0.9 corresponds to index 0; a CA / CP ratio greater than or equal to 0.75 and less than 0.9 corresponds to the index +1; an AC / CP ratio greater than or equal to 0.5 and less than 0.75 corresponds to the index +2; an AC / CP ratio greater than or equal to 0.25 and less than 0.5 corresponds to the index +3; an AC / CP ratio lower than 0.25 corresponds to the index +4.
The efficacy of immunoprophylaxis treatment, understood as the ability to counteract the fatal evolution of sepsis and related diseases, is established on the basis of the index assigned to the analytical sample and is considered null for an index 0, poor for a index +1, acceptable for an index +2, good for an index +3 and excellent for an index +4.
The possibility of using the treatment proposed in the present invention as a prophylaxis for a severe bacterial infection with Gram negative organisms is demonstrated in the mouse model of endotoxic shock. The animals are preliminarily immunized by administering three doses of peptide (25 mu g), or whole molecule (10 mu g), twice a week and subsequently receiving a lethal amount of LPS (1 mg) capable of causing death within three days after endotoxin treatment. The comparison of survival between immunized animals and animals that received the adjuvant alone shows a difference between the two groups greater than or equal to 50% in favor of the immunized group.
Some useful examples to illustrate the present invention, but not limiting it, are reported below. Example 1 Immunization protocol.
This example describes the procedure adopted for the active immunoprophylaxis of Balb / C mice to be used in an in vivo experimental model of sepsis.
16 male 6-7 week Balb / C mice (20-25 g) are injected intramuscularly with a compound containing the HMGB1r protein (SIGMA-ALDRICH, Cat. No. H-4652) or alternatively the peptide identified as SEQ . ID. No. 1 in the Appendix. The peptide is produced by well-known methods and technologies, and in the public domain, by commercial companies through automatic synthesis on a "core" of lysine to form a macromolecule, hereinafter referred to as MAP (Multiple Antigenic Protein). This molecule is composed of 8 known sequence peptides, covalently anchored to the internal structure of lysine which is not immunologically reactive.
The compound to be injected is prepared by adding 10 mu g of HMGB1r (35 mu l Physiological Solution) or 25 mu g of MAP (50 mu l Saline Phosphate Buffer) to 50 mu l of ImmunEasy Mouse Adjuvant (QIAGEN AG, Basel). The reagents are mixed thoroughly and allowed to incubate 5 minutes at room temperature (18-25 DEG C) before being transferred to a syringe and injected, as a single dose, into the animal at the level of the quadriceps. Half of the animals receive the whole protein (Group 1) while the rest are immunized with the peptide complex (Group 2).
The treatment protocol foresees for both groups three weekly administrations, respectively 38 days (primer), 24 days (first booster) and 10 days (second booster) before taking the sample for the evaluation of the neutralizing capacity of the antibodies (see Example 2) or to induce septic shock by inoculation of bacterial endotoxins (see Example 3). The control sample consists of 8 male Balb / C mice of the same age and weight (Group 3) treated according to the same protocol with 50 mu l of ImmunEasy Mouse Adjuvant. Example 2
Evaluation of the neutralizing capacity of anti-HMGB1 antibodies.
This example illustrates the method adopted to evaluate the neutralizing capacity of antibodies obtained with HMGB1r or MAP complex in vitro, and to calculate the efficacy index of the immunoprophylaxis treatment. The procedure is based on the quantitative determination of the TNF-alpha cytokine released by peripheral blood mononuclear cells (PBMC), preferably monocytes, as a response to HMGB1r stimulation.
The monocytes are obtained by adding 5 mL of Saline Phosphate Buffer to 3 mL of human venous blood collected in heparin or EDTA, mixing by inversion and stratifying the suspension in a 15 mL centrifuge tube containing 3 mL of Histopaque-1077 (SIGMA-ALDRICH , Cat.N. H-8889). After centrifugation at 400 x g for 30 minutes the upper layer is removed with a pipette up to the limit of the underlying opaque layer containing the mononuclear cells. The opaque layer is then transferred to an empty centrifuge tube and 10 mL of Saline Phosphate Buffer is added by mixing by inversion. After centrifugation for 10 minutes at 250 x g, the supernatant is aspirated and the cell precipitate suspended in 5 mL of Saline Phosphate Buffer by gentle aspiration with a pipette.
After repeat washing, the precipitate is suspended 1 mL of RPMI 1640 (IRVINE, Cat.N. 9024) culture medium to which 10% of Bovine Fetal Serum (SIGMA-ALDRICH, Cat.N. F2442) has been added, the cells are diluted to concentration of 10 <6> cells / mL of culture medium and 0.5 mL of the final suspension are transferred to the wells of a sterile 24 unit plate, calculating six wells for the samples to be analyzed and two wells for the negative and positive control samples. After incubation in a thermostat for 1 hour at 37 DEG C (5% MO 2) the culture medium of each well is removed to remove the lymphocytes in suspension and replaced with 0.4 mL of RPMI 1640 to which are added 100 mu L of unbleached murine serum (30 minutes at 56 DEG C).
The immune serum samples marked CA # 1- # 3 and CA # 4- # 6 are obtained from animals belonging to Group 1 and Group 2 respectively, while those used as positive or negative control of the method (marked CP and CN) are taken from Group 3 animals. Each well is then added with 55 ng of HMGB1r (50 mu L of a 1.1 mu g / mL solution in RPMI 1640 soil), except for the one marked CN which receives an equivalent volume of soil of cultivation. After incubation in the thermostat of the plate for 4 hours (37 DEG C, 5% CO 2), 150 mL of culture medium are taken from each well, avoiding removing the cells grown in adhesion on the bottom, and the content of TNF- alpha determined with the human TNF-alpha Immunoassay Quantikine commercial kit (R&D SYSTEM, Cat.N.
DTA50) after dilution of the culture medium 1: 5 (v: v) with the RD5 diluent buffer contained in the kit. The dosage is carried out in duplicate following the operating instructions provided by the manufacturer and the average concentration value of each sample, obtained multiplied by the result by the dilution factor, is reported in the table below. The analytical session is considered acceptable if the TNF- alpha concentration in the control samples is lower than 100 ng / mL in the CN sample and greater than 4,000 ng / mL in the CP sample. The sampling effectiveness index is obtained from the ratio between the analytical measurement of the sample under examination (CA) and that of the positive control (CP).
<Tb> <TABLE> Columns = 4 <tb> Head Col 1: CA <tb> Head Col 2: TNF- alpha (ng / ml) <tb> Head Col 3: CA / CP <tb> Head Col 4: Index <Tb> <SEP> # 1 <SEP> 3450 <SEP> 0.80 <SEP> 1+ <Tb> <SEP> # 2 <SEP> 2030 <SEP> 0.47 <SEP> 3+ <Tb> <SEP> # 3 <SEP> 4410 <SEP> 1.02 <SEP> 0 <Tb> <SEP> # 4 <SEP> 2380 <SEP> 0.55 <SEP> 2+ <Tb> <SEP> # 5 <SEP> 3075 <SEP> 0.71 <SEP> 2+ <Tb> <SEP> # 6 <SEP> 515 <SEP> 0.12 <SEP> 4+ <Tb> <SEP> CN <SEP> 55 <Tb> <SEP> CP <SEP> 4.320 <Tb> </TABLE> Example 3 Effectiveness of immunoprophylaxis in induced septic shock.
This example shows the effects of the administration of a lethal amount of endotoxin to the animals previously subjected to prophylactic treatment with the HMGB1r molecule or with the MAP complex derived from the peptide with SEQ.N. 1.
The animals indicated in Example 1 and belonging to Group 1 (administration of HMGB1r), Group 2 (administration of MAP) and Group 3 (administration of the adjuvant only), are treated with a lethal dose of LPS endotoxin (SIGMA-ALDRICH Cat. N L2262), by inoculation in the intraperitoneal area of 1 mg of LPS in 1 ml of PBS solution. After administration the animals are maintained at normal climatic conditions with standard feeding and their survival assessed at the end of the following 72 hours. The experimental results obtained are included in the table below.
<Tb> <TABLE> Columns = 4 <tb> Head Col 1: Group 1 <tb> Head Col 2: Group 2 <tb> Head Col 3: Group 3 <Tb> <SEP> Immunogen <SEP> HMGB1r <SEP> Peptide 1 <SEP> - <Tb> <SEP> N. animals <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <Tb> <SEP> No deaths <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 7 <Tb> <SEP> Survival% <SEP> 75 <SEP> 63 <SEP> 13 <Tb> </TABLE> Appendix
SEQ. ID. No. 1-13 amino acids
Met-Gly-Gly-Asp-Lys-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met
MGKGDPKKPRGKM-OH
SEQ. ID. No. 2-13 amino acids
Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His-Pro-Asp-Ala-Ser-OH
CREEHKKKHPDAS
SEQ. ID. No. 3-13 amino acids
Met-Ala-Lys-Ala-Asp-Lys-Ala-Arg-Tyr-Glu-Arg-Glu-Met-OH
MAKADKARYEREM
SEQ. ID. No. 4-11 amino acids
Ile-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-OH
IPPKGETKKKF
SEQ. ID. No. 5-15 amino acids
Lys-Gly-Glu-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-Lys-Asp-Pro-Asn-Ala-Pro-Lys-OH
KGETKKKFKDPNAPK
SEQ. ID. No. 6-15 amino acids
Glu-Lys-Lys-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Glu-Lys-Tyr-Glu-Lys-Asp-Ile-OH
EKKAAKLKEKYEKDI
SEQ. ID. No. 7-13 amino acids
Ala-Arg-Lys-Lys-Pro-Gly-Asp-Ala-Ala-Lys-Lys-Gly-Val-OH
RAKGKPDAAKKGV
SEQ. ID. No 8-15 amino acids
Glu-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Asp-Glu-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp-Asp-Glu-OH
EDEEDEDEEEDDDDE