DESCRIPTION
L'invention a pour objet un procédé pour la microencapsulation par separation de phases de substanccs médicamenteuses hydrosolubles.
La microencapsulation de substances médicamenteuses est une technique éprouvée, permettant notamment la protection et l'administration contrôlée de substances médicamenteuses ayant une courte durée de demi-vie in vivo. La forme galenique résultante se présente le plus souvent sous la forme d'une suspensions injectable, de tres haute efficacité.
Divers modes de réalisation sont décrits dans la littérature (voir par exemple demande de brevet EP N" 0052510). L'une des métho- des les plus usitées de microencapsulation par separation de phases (phase-separation microencapsulation) peut etre décrite comme suit:
a) un polymere biocompatible est premièrement dissous dans un solvant organique non miscible à l'eau (CH2CI2 par exemple); b) une solution aqueuse de la substancc médicamenteuse choisie est ensuite dispersée dans la solution organiquc susmentionnee; c) un polymere dit non compatible telle une huile de silicone est ensuite introduit, sous agitation, dans la dispersion obtenue sous lettre b, provoquant la formation de microcapsules embryonnaires par dépôt du polymere initialement dissous sur la substancc médica- menteuse dispersèe;
d) le melange obtenu sous lettre c est ensuite verse dans un excès de solvant organiquc non miscible à l'eau et de non-solvant du poly mere déposé, tel l'heptane par exemple, provoquant ainsi le durcissement des microcapsules par extraction du solvant organique initial (CH2CI2 par exemple) encore contenu dans la masse de polymere déposé; e) les microcapsules ainsi durcies sont ensuite filtrées, lavées et séchées, voire sterilisees selon les techniques usuelles.
Les analyses effectuées ont montre que les microcapsules séchées jusqu'à poids constant contenaient encore une portion pondérale élevée de composés organiques indésirables, tel l'heptane utilisé lors de l'étape d ci-dessus. Dans de nombreux cas en effet, il s'est avere que la quantite de solvant organique résiduelle pouvait etre equivalente, voire superieure, à celle du principe actif (substance médica- menteuse) microencapsule, ce qui compromettait fortement toute application pharmaceutique de telles preparations.
Indépendamment de ce qui précède, il a ete constate que l'on obtenait souvent des agrégats de microcapsules, tant au niveau de la separation des phases que du durcissement des microcapsules, d'où des pertes importantes de rendement, voire le rejet total de certains lots devenus de la sorte inutilisables.
Selon le brevet US N 4.166.800, on peut eviter l'apparition d'un tel phénoméne en opérant à des températures comprises entre - 100 et -40 C C, tant au niveau de la separation des phases que du durcissement par addition d'un non-solvant du polymere. L'heptane est indiqué comme un non-solvant de choix pour le durcissement.
La conduite d'opérations industrielles à d'aussi basses temperatures est onereuse et source de complications. A l'échelle industrielle, en outre, l'emploi de solvants organiques tel l'heptane par exemple presente un inconvenient majeur, c'est-à-dire l'émanation de vapeurs inflammables, voire toxiques, en grandes quantites.
Les difficultés exposees ci-dessus peuvent etre avantageusement resolues par la presente invention. Il a en effet ete découvert, de façon inattendue, qu'en opérant à une température comprise entre 0 et 25 C pour le durcissement des microcapsules et en utilisant à titre de non-solvant lors de l'étape de durcissement un hydrocarbure fluoré ou fluorohalogéné ou un melange de tels hydrocarbures, en excès par rapport au volume total de solvant et non-solvant provenant de l'étape de separation de phases, on supprimait avantageusement toute formation d'agrégats.
On a en outre constate que l'on obtenait ainsi des microcapsules presentant un tres faible résidu en composes organiques indésirables, ou tout au moins un résidu parfaitement acceptable pour l'administration thérapeutique desdits mi crocapsules.
Outre la qualite d'être aisement éliminés lors des operations de séchage usuelles, lesdits hydrocarbures presentent encore l'avantage d'être non toxiques et ininflammables, et de ce fait appropries à un emploi ä l'échelle industrielle.
Selon les cas, la réduction du taux de non-solvant résiduel dans les microcapsules obtenues par le procédé de l'invention peut aller de 10 pour l'heptane à 1, voire moins, pour un hydrocarbure aliphatique fluore ou fluorohalogéné.
Les microcapsules obtenues au moyen du procédé de l'invention sont en outre nettement plus stables que celles obtenues à l'aide des méthodes usuelles. Il a été notamment observé que la couche d'enrobage de polymere etait nettement moins sujette à dégradation, par hydrolyse par exemple, lors des essais de vieillissement.
Le terme de non-solvant utilise plus haut sert en fait à designer un composé organique liquide non miscible à l'eau, n'exerçant aucune dissolution du polymere constituant la masse essentielle des microcapsules. Ajouté à une suspension organique aqueuse de mi crocapsules embryonnaires (étape c ci-dessus), il provoque le durcissement de celles-ci par extraction du solvant organique initial contenu dans la masse de polymere, par exemple CH2CI2.
Il a été observé que le procédé de la présente invention convenait à la microencapsulation de substances médicamenteuses hydrosolubles fort diverses. A titre d'exemple non limitatif de substances mé- dicamenteuses, on peut citer des polypeptides hydrosolubles telle l'hormone de libération de l'hormone lutéinisante et de l'hormone de stimulation des follicules (LH-RH) ou l'un de ses analogues syn thétiques (voir à ce sujet brevet CH N 615.662), ou encore la somatostatine ou l'une de ses analogues synthétiques, la calcitonine humaine ou animale, I'hormone de croissance humaine ou animale, I'hormone de libération de l'hormone de croissance,
un cardiopeptide tel l'ANP (humain 1-28) ou un interféron, naturel ou recombiné.
De façon plus générale, les substances médicamenteuses que l'on peut avantageusement microencapsuler à l'aide du procédé de l'invention peuvent être choisies parmi les substances à effet antiinflammatoire, antitumoreux, immunodépresseur, antithrombotique, neuroleptique, antidépresseur, antihypertenseur ou un sel hydrosoluble non toxique de telles substances.
A titre de non-solvant au sens de la présente invention, on peut avantageusement utiliser les hydrocarbures aliphatiques fluoren ou fluorohalogénés du commerce, tels ceux commercialisés sous l'appel- lation générique FRÉON. Lesdits hydrocarbures seront de préfé rence choisis parmi ceux qui se présentent sous forme liquide à pres sion ambiante et à une température comprise entre 0 et 25 C. Des résultats particulièrement intéressants ont été observés lors de l'emploi de trichlorofluorométhane et de 1,1,2-trichlorotrifluoro- éthane ou de 1,2-dichlorotétrafluoroéthane. Cette énumération n'est cependant pas exhaust*e.
Selon l'invention, ledit non-solvant est utilisé en excès par rapport au volume total de solvant et de non-solvant provenant de l'étape de separation de phases. On utilise de préférence un excès d'au moins 5:1, voire de 10:1 selon les cas. On évite ainsi avantageu- sement la formation d'agrégats.
Le procédé de l'invention s'applique avec succès à la préparation de microcapsules à base de polymeres biocompatibles fort divers. A titre d'exemple de tels polymeres, on citera des polymeres de L-lac tide, de D,L-lactide ou des copolymeres de D,L-lactide et de glyco lide.
Les exemples illustreront l'invention de façon plus détaillée, sans pour autant la limiter.
Exemple 1:
Enrobage par microencapsulation d'un placebo
A. 1,0 g de copolymere de D,L-lactide et de glycolide env. 50: 50 (poids moléculaire moyen 53 000) a été premièrement dissous à 25 C dans 50 g de chlorure de méthylène et plane dans un réacteur muni d'une turbine à agitation. On a ensuite progressivement ajouté
300 micro-l d'eau au mélange organique. Durant cette addition, l'agitation du mélange a été maintenue à environ 2000 tours/min.
30 ml d'huile de silicone (Dow Corning Fluid 200) ont ensuite été introduits à 25 C dans le mélange réactionnel agité, à raison d'envi ron 2 ml/min. Une fois l'addition d'huile de silicone terminée, le mélange contenant les microcapsules embryonnaires a été versé à 25 C dans 21 de 1,1,2-trichlorotrifluoroéthane pour permettre le durcissement de celles-ci et agité durant 30 minutes à environ
800 tours/min. Après filtration, le produit résultant a été séché sous pression réduite durant 24 h. Le produit ainsi obtenu a été isolé avec un rendement de 76% (théorie).
B. Les opérations ci-dessus ont été répétées dans des conditions quasi identiques, le 1,1,2-trichlorotrifluoroéthane étant remplacé par une quantité identique de trichlorofluorométhane et le durcissement ayant lieu à 15 C.
C. A titre de comparaison, les opérations ci-dessus ont été répé- tées, le non-solvant utilisé lors de l'étape de durcissement étant l'heptane.
Chacun des échantillons ainsi préparés a ensuite été sechs sous vide sur une periode prolongée, jusqu'à obtention d'un poids constant. Les résultats observés sont rassemblés comme suit:
EMI2.1
Echantillon <SEP> Perte <SEP> en <SEP> poids <SEP> Résidu <SEP> de <SEP> solvant
<tb> A <SEP> 3% <SEP> 5% <SEP> (1,1,2-trichloro <SEP> trifluoroéthane) <SEP>
<tb> B <SEP> 15% <SEP> 0,5% <SEP> (trichloro <SEP> fluorométhane) <SEP>
<tb> C <SEP> 5% <SEP> 8% <SEP> (heptane)
<tb>
Exemple 2:
:
Enrobage par microencapsulation d'un décapeptide
Les opérations de microencapsulation conduisant à la prépara- tion d'un composé pharmacologiquement actif enrobé ont été effec tuées avec le composé de formule (= composé A) (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.
Ce composé avait été obtenu conformément au procédé décrit par exemple dans le brevet suisse N 615.662; il présentait un contenu en peptides de 80% environ en poids. 1,0 g de copolymere de D,L-lactide et de glycolide env. 50:50 (poids moléculaire moyen env. 53 000) a été premièrement dissous à 25 C de chlorure de mé- thylène et plane dans un réactuer muni d'une turbine à agitation. On a préparé séparément une solution de 30,4 mg de composé A dans
300 micro-l d'eau sterile, puis cette solution a été progressivement ajoutée au mélange organique.
Durant cette addition, I'agitation du mélange a été maintenue à environ 2000 tours/min. 30 ml d'huile de silicone (Dow Corning Fluid 200) ont ensuite été introduits à 25 C dans le melange réactionnel agité, à raison d'environ 2 ml/min. Une fois l'addition d'huile de silicone terminée, le mélange contenant les microcapsules embryonnaires a été versé à 15 C dans 2 I de trichlo- rofluorométhane pour permettre le durcissement de celles-ci et agité durant 30 minutes à environ 800 tours/min. Après filtration, le produit résultant a été séché sous réduite jusqu'à poids constant.
Le produit ainsi obtenu a été isolé avec un rendement de 70% (théorie).
Caractérisation: - particules sphériques de diamètre compris entre 30 et 40 mi crons (déterminé par photographies prises au microscope électroni- que à balayage); - contenu en composé enrobé 2,07 % en poids (efficacité de l'encapsulation: 70 % de la théorie). La teneur en composé enrobé est mesurée après dissolution des microcapsules dans le chlorure de méthylène, extraction à l'aide d'un tampon phosphate (pH 7,4) et titrage à l'aide d'un procédé de chromatographie liquide sous haute pression.
Les microcapsules ainsi obtenues peuvent être ensuite adminis trées in vivo après eventuelle irradiation gamma (2 Mrad).
Exemple 3:
On a répété les opérations décrites à l'exemple 2, à cette diffé rence près que les 30,4 mg de décapeptide ont été mis en suspension dans le chlorure de méthylène sans avoir été préalablement dissous dans de l'eau.
Exemple 4:
On a répété les opérations de l'exemple 3, mais en remplaçant le trichlorofluorométhane utilisé lors de l'étape de durcissement par une quantité correspondante de 1,1,2-trichlorotrifluoroéthane. Dans ce cas, les opérations ont été effectuées à 25 C.
Les microcapsules ainsi obtenues ont été soumises à un test de vieillissement sur 12 mois: on a ainsi constaté que la cinétique de li bération du décapeptide in vitro ne s'était pas modifiée tout au long de cette période.
Des microcapsules durcies à l'heptane (échantillons témoins), soumises au meme test, ont par contre presente une alteration significative de leurs proprietes.
Exemple 5:
Les polypeptides ci-après ont été microcapsulés conformément au procédé de l'exemple 3, c'est-à-dire sans dissolution préalable dans l'eau. Tout comme dans l'exemple 3, l'étape de durcissement a ete effectuée à 15 C, le non-solvant utilise etant le trichlorofluorométhane: - Calcitonine humaine.
- Somatostatine.
- Hormone de croissance bovine.
Les microcapsules obtenues sont comparables à celles obtenues à partir du décapeptide de l'exemple 2, du point de vue stabilité et restitution du principe actif (mesure in vitro et in vivo).
DESCRIPTION
The invention relates to a process for microencapsulation by separation of phases of water-soluble medicinal substances.
Microencapsulation of medicinal substances is a proven technique, allowing in particular the protection and controlled administration of medicinal substances having a short half-life in vivo. The resulting dosage form is most often in the form of an injectable suspension, of very high efficiency.
Various embodiments are described in the literature (see for example patent application EP No. 0052510). One of the most used methods of microencapsulation by phase separation (phase-separation microencapsulation) can be described as follows:
a) a biocompatible polymer is first dissolved in an organic solvent immiscible with water (CH2Cl2 for example); b) an aqueous solution of the selected drug substance is then dispersed in the above-mentioned organic solution; c) a so-called non-compatible polymer such as a silicone oil is then introduced, with stirring, into the dispersion obtained under letter b, causing the formation of embryonic microcapsules by deposition of the polymer initially dissolved on the dispersed medicinal substance;
d) the mixture obtained under letter c is then poured into an excess of organic solvent immiscible with water and of non-solvent of the deposited polymer, such as heptane for example, thus causing the hardening of the microcapsules by extraction of the solvent initial organic (CH2Cl2 for example) still contained in the mass of polymer deposited; e) the microcapsules thus hardened are then filtered, washed and dried, or even sterilized according to the usual techniques.
The analyzes carried out showed that the microcapsules dried to constant weight still contained a high portion by weight of undesirable organic compounds, such as the heptane used during step d above. In many cases, in fact, it has been found that the amount of residual organic solvent could be equivalent to, or even greater than, that of the active principle (medicinal substance) microencapsulated, which greatly compromised any pharmaceutical application of such preparations.
Independently of the above, it has been observed that aggregates of microcapsules are often obtained, both in terms of phase separation and hardening of the microcapsules, resulting in significant yield losses, or even the total rejection of certain lots thus become unusable.
According to US Patent No. 4,166,800, one can avoid the appearance of such a phenomenon by operating at temperatures between - 100 and -40 CC, both in terms of phase separation and hardening by adding a non-solvent for the polymer. Heptane is indicated as a non-solvent of choice for curing.
Conducting industrial operations at such low temperatures is expensive and a source of complications. On an industrial scale, moreover, the use of organic solvents such as heptane for example presents a major drawback, that is to say the emanation of flammable or even toxic vapors, in large quantities.
The difficulties set out above can be advantageously resolved by the present invention. It has in fact been discovered, unexpectedly, that by operating at a temperature of between 0 and 25 ° C. for the hardening of the microcapsules and by using as a non-solvent during the hardening step a fluorinated or fluorohalogenated hydrocarbon or a mixture of such hydrocarbons, in excess relative to the total volume of solvent and non-solvent originating from the phase separation step, any formation of aggregates is advantageously eliminated.
It has also been observed that microcapsules are thus obtained having a very low residue of undesirable organic compounds, or at least a residue which is perfectly acceptable for the therapeutic administration of said mi crocapsules.
Besides the quality of being easily eliminated during the usual drying operations, said hydrocarbons also have the advantage of being non-toxic and non-flammable, and therefore suitable for use on an industrial scale.
Depending on the case, the reduction in the level of residual non-solvent in the microcapsules obtained by the process of the invention can range from 10 for heptane to 1, or even less, for a fluorinated or fluorohalogenated aliphatic hydrocarbon.
The microcapsules obtained by means of the process of the invention are also much more stable than those obtained using the usual methods. In particular, it has been observed that the polymer coating layer was clearly less subject to degradation, for example by hydrolysis, during aging tests.
The term non-solvent used above is used to designate a liquid organic compound immiscible with water, exercising no dissolution of the polymer constituting the essential mass of the microcapsules. Added to an aqueous organic suspension of embryonic mi crocapsules (step c above), it causes them to harden by extraction of the initial organic solvent contained in the polymer mass, for example CH2Cl2.
It has been observed that the process of the present invention is suitable for the microencapsulation of a wide variety of water-soluble drug substances. By way of nonlimiting example of medicinal substances, mention may be made of water-soluble polypeptides such as the hormone releasing luteinizing hormone and follicle stimulating hormone (LH-RH) or one of its synthetic analogues (see on this subject patent CH N 615.662), or somatostatin or one of its synthetic analogues, human or animal calcitonin, human or animal growth hormone, release hormone growth hormone,
a cardiopeptide such as ANP (human 1-28) or an interferon, natural or recombinant.
More generally, the medicinal substances which can advantageously be microencapsulated using the process of the invention can be chosen from substances with anti-inflammatory, anti-tumor, immunosuppressive, antithrombotic, neuroleptic, antidepressant, antihypertensive or a water-soluble salt non-toxic from such substances.
As a non-solvent within the meaning of the present invention, it is advantageous to use commercially available fluorenated or fluorohalogenated aliphatic hydrocarbons, such as those marketed under the generic name FREON. Said hydrocarbons will preferably be chosen from those which are in liquid form at ambient pressure and at a temperature between 0 and 25 C. Particularly interesting results have been observed when using trichlorofluoromethane and 1.1, 2-trichlorotrifluoroethane or 1,2-dichlorotetrafluoroethane. This list is not, however, exhaustive.
According to the invention, said non-solvent is used in excess relative to the total volume of solvent and non-solvent originating from the phase separation step. It is preferable to use an excess of at least 5: 1, or even 10: 1 depending on the case. This advantageously avoids the formation of aggregates.
The process of the invention is successfully applied to the preparation of microcapsules based on very diverse biocompatible polymers. Examples of such polymers include polymers of L-lac tide, D, L-lactide or copolymers of D, L-lactide and glycolide.
The examples will illustrate the invention in more detail, without however limiting it.
Example 1:
Coating by microencapsulation of a placebo
A. 1.0 g of copolymer of D, L-lactide and glycolide approx. 50:50 (average molecular weight 53,000) was first dissolved at 25 ° C. in 50 g of methylene chloride and floated in a reactor fitted with a stirring turbine. We then gradually added
300 micro-l of water in the organic mixture. During this addition, the stirring of the mixture was maintained at approximately 2000 rpm.
30 ml of silicone oil (Dow Corning Fluid 200) were then introduced at 25 ° C. into the stirred reaction mixture, at a rate of approximately 2 ml / min. Once the addition of silicone oil was complete, the mixture containing the embryonic microcapsules was poured at 25 ° C. into 21 of 1,1,2-trichlorotrifluoroethane to allow them to harden and stirred for approximately 30 minutes.
800 rpm. After filtration, the resulting product was dried under reduced pressure for 24 h. The product thus obtained was isolated with a yield of 76% (theory).
B. The above operations were repeated under almost identical conditions, the 1,1,2-trichlorotrifluoroethane being replaced by an identical amount of trichlorofluoromethane and the hardening taking place at 15 C.
C. For comparison, the above operations were repeated, the non-solvent used during the curing step being heptane.
Each of the samples thus prepared was then dried under vacuum over an extended period, until a constant weight was obtained. The results observed are collated as follows:
EMI2.1
Sample <SEP> Loss <SEP> in <SEP> weight <SEP> Residue <SEP> of <SEP> solvent
<tb> A <SEP> 3% <SEP> 5% <SEP> (1,1,2-trichloro <SEP> trifluoroethane) <SEP>
<tb> B <SEP> 15% <SEP> 0.5% <SEP> (trichloro <SEP> fluoromethane) <SEP>
<tb> C <SEP> 5% <SEP> 8% <SEP> (heptane)
<tb>
Example 2:
:
Coating by microencapsulation of a decapeptide
The microencapsulation operations leading to the preparation of a coated pharmacologically active compound were carried out with the compound of formula (= compound A) (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu- Arg-Pro-Gly-NH2.
This compound had been obtained in accordance with the process described for example in Swiss patent N 615,662; it had a peptide content of about 80% by weight. 1.0 g of copolymer of D, L-lactide and glycolide approx. 50:50 (average molecular weight approx. 53,000) was first dissolved at 25 ° C of methylene chloride and floated in a reactor equipped with a stirring turbine. A solution of 30.4 mg of compound A was prepared separately in
300 micro-l of sterile water, then this solution was gradually added to the organic mixture.
During this addition, the stirring of the mixture was maintained at approximately 2000 rpm. 30 ml of silicone oil (Dow Corning Fluid 200) were then introduced at 25 ° C. into the stirred reaction mixture, at a rate of approximately 2 ml / min. After the addition of silicone oil, the mixture containing the embryonic microcapsules was poured at 15 ° C. into 2 l of trichlorofluoromethane to allow the curing of these and stirred for 30 minutes at around 800 rpm . After filtration, the resulting product was dried under reduction to constant weight.
The product thus obtained was isolated with a yield of 70% (theory).
Characterization: - spherical particles with a diameter between 30 and 40 mi crons (determined by photographs taken with a scanning electron microscope); - content of coated compound 2.07% by weight (efficiency of encapsulation: 70% of theory). The content of coated compound is measured after dissolving the microcapsules in methylene chloride, extraction using a phosphate buffer (pH 7.4) and titration using a high pressure liquid chromatography process.
The microcapsules thus obtained can then be administered in vivo after possible gamma irradiation (2 Mrad).
Example 3:
The operations described in Example 2 were repeated, with the difference that the 30.4 mg of decapeptide were suspended in methylene chloride without having been previously dissolved in water.
Example 4:
The operations of Example 3 were repeated, but replacing the trichlorofluoromethane used during the hardening step with a corresponding amount of 1,1,2-trichlorotrifluoroethane. In this case, the operations were carried out at 25 C.
The microcapsules thus obtained were subjected to an aging test over 12 months: it was thus found that the release kinetics of the decapeptide in vitro had not changed throughout this period.
Microcapsules hardened with heptane (control samples), subjected to the same test, on the other hand presented a significant alteration of their properties.
Example 5:
The following polypeptides were microcapsulated according to the method of Example 3, that is to say without prior dissolution in water. Just as in Example 3, the hardening step was carried out at 15 C, the non-solvent used being trichlorofluoromethane: - Human calcitonin.
- Somatostatin.
- Bovine growth hormone.
The microcapsules obtained are comparable to those obtained from the decapeptide of Example 2, from the point of view of stability and restitution of the active principle (measurement in vitro and in vivo).