CH645728A5

CH645728A5 - Procede de determination de la teneur en substances contenant des liaisons glucosidiques associees aux tumeurs, application de ce procede et necessaire pour sa mise en oeuvre.

Info

Publication number: CH645728A5
Application number: CH69280A
Authority: CH
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-01-30
Filing date: 1980-01-29
Publication date: 1984-10-15
Also published as: GB2043890B; ES488747A0; US4389392A; DE3003301A1; NL8000536A; IT1165552B; DK36980A; ES8102679A1; IT8047743A1; FR2461256A1; SE8000705L; GB2043890A; DE3003301C2; SE451508B; FR2461256B1; IT8047743A0

Description

La présente invention concerne la détermination de la teneur en substances contenant des liaisons glucosidiques associées aux tumeurs, c'est-à-dire des substances apparentées au sucre, y compris 25 les glucoprotéines, les glucopeptides, les glucolipides et les sucres (ci-après dénommées en abrégé TAG) dans un échantillon d'humeur de l'organisme chez les mammifères, plus particulièrement les TAG qui augmentent à mesure que les cellules indifférenciées, en particulier les cellules tumorales ou cancéreuses, prolifèrent, et un procédé de 30 diagnostic du cancer reposant sur cette détermination.

On a utilisé jusqu'à présent un procédé de détermination de la teneur en glucoprotéines spécifiques dans un échantillon d'humeur de l'organisme chez les patients atteints de cancer. Ce procédé utilise le caractère d'antigène que possède principalement la portion pro-35 téine des glucoprotéines. Par exemple, la teneur en c^-fœtoprotéine et la teneur en antigène carcinoembryonique (ci-après dénommé CEA) sont déterminées pour le diagnostic de l'hépatome primaire et des cancers des organes digestifs, en particulier le cancer du rectum, etc. [voir «Igaku no Ayumi», volume 106, N° 5, 5e édition spéciale 40 du samedi, pp. 235-250 (1978)]. Cependant, ces procédés ne sont pas satisfaisants, car leur application est limitée à certains types de cancers et de tumeurs.

Par contre, on ne connaît pas actuellement de méthode de diagnostic utilisant la spécificité de liaison du reste sucre des TAG. 45 On a besoin depuis longtemps d'une méthodologie quantitative peu coûteuse et simple pour déterminer les teneurs en TAG dans les humeurs de l'organisme pouvant avoir des applications étendues.

En tenant compte du fait que les humeurs de l'organisme des individus ou patients atteints de cancer contiennent des TAG produi-50 tes par des cellules indifférenciées (le plus souvent des cellules cancéreuses) et libérées dans les humeurs de l'organisme et que les TAG sont extrêmement différentes des substances contenant des liaisons glucosidiques produites par les cellules différenciées (le plus souvent des cellules normales) et libérées dans les humeurs de l'organisme 55 dans la structure chimique de la chaîne de sucre, sa longueur et la composition des résidus de sucre, la titulaire a effectué des recherches approfondies qui ont abouti à la découverte que les TAG possèdent un reste galactose-(ßl -» 3 ou ßl ->-4)-N-acétyIglucosamine et/ou -acétylgalactosamine terminal et se fixent de manière spécifi-6o que aux lectines, et que la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme peut être déterminée par réaction des TAG avec une lectine. La teneur en TAG indique la présence ou l'absence de cellules cancéreuses, leur degré de prolifération et leur accroissement ou leur diminution, et permet d'établir avec succès le diagnos-65 tic des divers cancers ou tumeurs. L'invention repose sur la découverte ci-dessus.

L'invention a donc pour objet un procédé de détermination de la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme, qui est

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caractérisé en ce que l'on fait réagir les TAG présentes dans un échantillon d'humeur de l'organisme avec une lectine pour former un complexe TAG-lectine et on mesure la quantité du complexe TAG-lectine ou de lectine non transformée.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre en référence aux figures des dessins annexés dans lesquels:

la fig. 1 représente graphiquement les quantités de TAG déterminées selon l'exemple 1, et la fig. 2 représente graphiquement les quantités de TAG déterminées selon l'exemple 2.

On peut utiliser dans l'invention diverses humeurs de l'organisme. Des exemples d'humeurs appropriées comprennent le sang, les humeurs des tissus, la lymphe, l'hydrothorax, les ascites, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébro-spinal, la salive, etc. Parmi ceux-ci, on préfère le sang, en particulier sous forme de sérum ou de plasma.

La quantité de l'humeur de l'organisme pour les échantillons est ordinairement d'environ de 1 à 10 ml, de préférence de 2 à 5 ml.

Selon l'invention, la détermination de la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme peut être effectuée soit en isolant, soit en séparant les TAG de l'humeur de l'organisme, en les faisant réagir avec une lectine pour former un complexe TAG-lectine et en mesurant la quantité du complexe TAG-lectine ou de lectine non transformée après séparation, soit en ajoutant une lectine marquée à l'échantillon d'humeur de l'organisme directement pour former un complexe TAG-lectine marquée, en séparant le complexe résultant ou la lectine marquée non transformée et en mesurant sa quantité.

Pour séparer la fraction de TAG d'un échantillon d'humeur de l'organisme, on peut utiliser des techniques classiques pour l'extraction ou la séparation des substances contenant des liaisons glucosidiques, telles que relargage, précipitation, extraction par des solvants, centrifugation, dialyse, tamis moléculaires, inactivation enzymati-que, etc., ou une combinaison de deux ou plusieurs d'entre elles. Par exemple, on peut obtenir la fraction TAG en ajoutant une quantité, efficace pour la précipitation ou la dénaturation, d'acide sulfosalicy-lique, d'acide trichloroacétique ou de sulfate de zinc à du sérum ou à du plasma sanguin, ou en chauffant le sérum ou le plasma sanguin pour précipiter l'albumine, l'immunoglobuline, etc., en séparant par filtration les protéines précipitées et en dialysant le filtrat.

Dans les cas où l'on utilise une lectine marquée, on peut utiliser telles quelles les humeurs de l'organisme autres que le sang comme échantillon d'essai (ci-après échantillon). On préfère cependant ajouter une protéine ayant une faible teneur en sucre telle que la sé-rumalbumine de bœuf (BSA), etc., comme protéine protectrice pour éviter la dénaturation de l'échantillon et déclencher en même temps la réaction avec la lectine. En particulier, on ajoute une quantité appropriée de la protéine protectrice à des échantillons après séparation des albumines, immunoglobulines, etc., puisque cela permet la détermination dans des conditions plus contrôlées. Lorsqu'on utilise des échantillons de sang, on peut utiliser comme échantillon le sérum sanguin obtenu par la technique classique pour recueillir du sérum sanguin, ou du plasma sanguin obtenu par la technique classique pour recueillir du plasma sanguin au moyen d'un anticoagulant tel que l'héparine, l'EDTA, l'acide citrique, etc.; on préfère le plasma sanguin recueilli en utilisant l'héparine comme anticoagulant. Les échantillons peuvent être dilués par de l'eau ou par des solutions aqueuses tamponnées convenables, si nécessaire ou si désiré, par exemple lorsque la teneur en TAG est relativement élevée, comme dans les ascites, etc.

Selon l'invention, on peut utiliser des lectines qui peuvent se combiner ■spécifiquement avec la galactose-(ßl -<• 3 ou ßl ->4)-N-acétylglucosamine et/ou -acétylgalactosamine comme décrit dans «J.B.C.», 250, pp. 8518-8523 (1975); «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 62, p. 144 (1975); «Z. Immunitaetsforch.», 138, pp. 423-433 (1969); «Br. J. Exp. Pathol.», 27, pp. 228-236 (1946); «Proc. Nati. Acad. Sci. USA», 75, N° 5, pp. 2215-2219 (1978); «Biochemis-try», 13, pp. 196-204 (1974); «Carbohydrate Research», vol. 51,

pp. 107-118 (1976), etc., par exemple la lectine d'arachide, la lectine de ricin (Ricinus communis), etc.

■ Les substances que l'on peut utiliser pour marquer les lectines et qui permettent donc de les déceler par des techniques radiométri-ques, fluorométriques, colorimétriques et analogues sont les enzymes, les substances fluorescentes et les substances radioactives.

A titre d'exemples d'enzymes appropriées, on peut citer la glu-coamylase, la glucose-oxydase, la Peroxydase, la phosphatase alcaline, la ß-galactosidase, l'héméoctapeptide, etc., et leurs fragments actifs. Des exemples de substances fluorescentes convenables comprennent la fluorescéine, l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhoda-mine, le chlorure de dansyle (chlorure de 5-diméthylamino-l-naph-talènesulfonyle), etc. Des exemples de substances radioactives convenables comprennent l'iode radioactif, le tritium, etc. Pour marquer les lectines avec les substances de marquage décrites ci-dessus, on peut utiliser n'importe quelle technique classique utilisée pour marquer les protéines connues, telles que les antigènes et les anticorps avec des enzymes, des substances fluorescentes et des substances radioactives. Par exemple, on peut marquer les lectines avec des isotopes radioactifs selon la méthode décrite par Kazuo Shizunome et Yuichi Kumahara dans «Radioimmunoassay», pp. 45-46 (1978), publiée par Asakura Publishing Co., Tokyo.

Dans le procédé de l'invention, on utilise de préférence les lectines marquées ou non marquées en mélange avec des solvants convenables. On peut utiliser n'importe quels solvants qui ne dénaturent pas les lectines marquées ou non marquées, par exemple solution saline physiologique, solution-tampon tris-HCl 0,1 M (pH environ 7,5), solution-tampon au phosphate 0,1 M (pH environ 7,4), etc. La quantité de lectine contenue dans le solvant ou le diluant peut être choisie selon l'indice d'agglutination (qui est défini par la dilution finale ou maximale d'échantillons dilués en série dans le rapport 2), le type de substance de marquage ou les substances à déterminer, etc., et elle est ordinairement d'environ 0,01 à 100 y/ml, de préférence de 0,03 à 40 y/ml. Les solutions de lectine marquée ou non marquée ci-dessus peuvent être encore diluées.

Pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, on mélange une quantité prédéterminée de la fraction de la TAG ou de l'humeur de l'organisme elle-même avec une quantité donnée de lectine ou de lectine marquée, respectivement, et on laisse reposer le mélange résultant pour le laisser réagir à environ 45° C ou moins, de préférence environ 4 à 40° C, plus particulièrement environ 20 à 40° C. On peut séparer du mélange de réaction le complexe TAG-lectine non marquée ou marquée, ou la lectine non marquée ou marquée n'ayant pas réagi, par n'importe quelle technique classique de séparation, par exemple Chromatographie, électrophorèse, relargage, fractionnement, dialyse, filtration sur gel, adsorption, ou une combinaison de ces techniques ou une méthode de séparation utilisant un gel de gélose, d'agarose ou de Polyacrylamide.

Plus précisément, pour séparer la lectine marquée ou non marquée non transformée du mélange réactionnel, on peut ajouter au mélange de réaction ci-dessus une quantité convenable d'un agent précipitant du complexe TAG-lectine et séparer le complexe résultant, par exemple par centrifugation, et l'on obtient ainsi la fraction de lectine marquée ou non marquée non transformée comme liquide surnageant. Des exemples caractéristiques de précipitants sont le po-lyéthylèneglycol, le sulfate d'ammonium (saturé), le lactate d'étha-cridine monohydraté (acrinol), etc. Les conditions de centrifugation peuvent être choisies de manière convenable selon les précipitants utilisés. Par exemple, lorsqu'on utilise le polyéthylèneglycol comme précipitant, on préfère effectuer la centrifugation à environ 1000 G pendant environ 30 à 60 min.

Dans les cas où l'on isole le complexe TAG-lectine marquée ou non marquée de la lectine n'ayant pas réagi, on peut séparer facilement le complexe de la lectine non transformée en utilisant la différence de vitesses de diffusion du complexe et de la lectine non transformée sur gel de gélose, d'agarose ou de Polyacrylamide. Plus particulièrement, lorsque l'on dépose le mélange de réaction sur le gel dans un récipient, la lectine non transformée diffuse dans le gel,

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tandis que le complexe TAG-lectine reste sur le gel, c'est-à-dire à l'extérieur du gel, sans diffuser. Ainsi donc, on peut les séparer l'un de l'autre facilement de manière classique. Il n'y a pas de limitation dans la préparation des gels et l'on peut utiliser à cet effet les techniques utilisées de manière classique. Par exemple, on ajoute une certaine quantité de gélose, d'agarose ou de Polyacrylamide à un diluant qui ne provoque pas la dénaturation des protéines, tel qu'eau distillée, solution-tampon de citrate ou de tris-HCl (pH environ 7,5), etc., puis on chauffe à 60-80° C en agitant doucement pour dissoudre, et on verse la solution dans un récipient convenable, tel qu'un tube à essais, et on laisse refroidir pour que le mélange prenne en gelée. La concentration du gel est choisie selon la dimension (par exemple poids moléculaire, stéréostructure, etc.) de la substance de marquage et du complexe TAG-lectine marquée. On utilise ordinairement dans l'invention des gels à environ 0,4 à 2,0% en poids, de préférence de 0,7 à 1,0% en poids. Le gel résultant peut contenir un conservateur, si nécessaire ou si désiré. La surface gu gel ainsi préparée peut être plane ou concave, cette dernière forme étant préférée, puisque les complexes à former n'adhèrent pas sur la paroi du récipient.

La quantité de complexe TAG-lectine marquée ou non marquée, ou de lectine marquée ou non marquée non transformée, est mesurée par la technique classique et on peut calculer à partir de la valeur obtenue la teneur en TAG dans l'humeur de l'organisme.

Pour la mesure de la quantité de lectine non marquée résiduelle, on peut utiliser diverses techniques. On préfère cependant ajouter aux échantillons une substance capable de réagir spécifiquement avec la lectine pour l'agglutiner ou la précipiter et observer visuellement le changement, ou bien en mesurant, par exemple, la densité optique en utilisant une analyse optique. Des exemples de substances appropriées agglutinant la lectine comprennent les glucoprotéines ayant un reste galactose-(ßl -»3 ou ßl -*4)-N-acétylglucosamine et/ou -acétylgalactosamine terminal, par exemple érythrocytes de lapin, érythrocytes de mouton traités par la neuraminidase, etc., Se-phadex, billes de verre, etc., revêtus par les glucoprotéines décrites ci-dessus.

Dans la pratique, ce procédé peut être mis en œuvre de la manière suivante. Le mélange de réaction décrit ci-dessus est dilué en série avec une dilution 2X au moyen d'un diluant, par exemple solution-tampon au phosphate 0,15M, solution de sérum physiologique, etc., et on place des parties aliquotes de la solution diluée sur des plaques en V ou en U ou sur des plaques de verre ou dans de petits tubes à essais ou analogues, et on mélange chaque échantillon avec une substance capable d'agglutiner spécifiquement la lectine en agitant et on laisse reposer les plaques ou analogues portant le mélange à 45° C ou moins, de préférence 4 à 40° C, pendant 30 min ou plus, de préférence 60 à 90 min, pour observer la dilution finale ou maximale à laquelle l'agglutination se produit encore. Cette dilution maximale est définie comme l'indice d'agglutination. Les lectines qui peuvent être utilisées dans l'invention présentent sensiblement le même indice d'agglutination.

Dans les cas où l'on utilise des lectines marquées, la détermination de la teneur en TAG peut être effectuée par une méthode appropriée pour la mesure de substances marquées pour les lectines. Par exemple, après séparation du complexe TAG-lectine et de la lectine marquée non transformée, on peut déterminer la quantité de complexe TAG-lectine marquée ou de lectine marquée non transformée en choisissant un support approprié pour une enzyme, ce support pouvant être analysé par une méthode colorimétrique ou fluorimé-trique et en déterminant l'activité de l'enzyme lorsque la lectine est marquée avec celle-ci; en déterminant l'intensité de fluorescence lorsque la lectine est marquée avec une substance fluorescente; ou en déterminant la radioactivité lorsque la lectine est marquée au moyen d'une substance radioactive. Par exemple, lorsque l'on utilise pour marquer la lectine une enzyme, par exemple une Peroxydase, on ajoute goutte à goutte une quantité prédéterminée du mélange de réaction sur la surface du gel dans un tube à essais et on laisse reposer au voisinage de la température ambiante, de préférence à 4-

25° C, pendant 1 à 48 h. On ajoute ensuite au mélange de réaction ainsi traité une quantité donnée d'un substrat convenable pour l'enzyme (par exemple peroxyde d'hydrogène) pour effectuer la réaction enzymatique, puis on l'arrête après une durée appropriée et on mesure la densité optique du mélange résultant, si nécessaire, en utilisant un colorant ou un composé chromogène (par exemple o-phénylènediamine). Ou bien, lorsque l'on utilise une substance fluorescente pour marquer la lectine, on ajoute une quantité prédéterminée de diluant, tel qu'une solution-tampon, au mélange de réaction sur le gel après incubation, et on mesure l'intensité de fluorescence du mélange résultant.

Un mode opératoire particulièrement convenable pour mettre en œuvre le procédé de l'invention utilise un nécessaire pour la détermination des TAG dans une humeur de l'organisme, telle que plasma ou sérum. Ce nécessaire peut comprendre un réactif contenant une lectine végétale, telle qu'un agent agglutinant spécifique des TAG. Le réactif lectine peut également contenir un stabilisant et/ou un agent conservateur pour la lectine, tel que des protéines ayant une faible teneur en sucre, par exemple la sérumalbumine de bœuf. Dans un mode de mise en œuvre préféré, cette lectine végétale peut être lyophilisée et le nécessaire peut également comporter un réactif de reconstitution contenant un solvant aqueux ou miscible avec l'eau (pH d'environ 6 à 7,8, de préférence de 7 à 7,2). Les réactifs peuvent facultativement contenir aussi des substances-tampons pour maintenir le système réactif reconstitué à un pH réglé et/ou des stabilisants pour éviter la détérioration de la substance avant l'emploi. Bien que les substances-tampons ne soient pas considérées comme un composant essentiel des réactifs du nécessaire, on utilise de préférence un pH d'environ 6 à 7,8, en particulier de 7 à 7,2 dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Le réactif de reconstitution peut de préférence contenir de l'eau comme solvant. Par exemple, on peut utiliser comme agent de reconstitution une solution de sérum physiologique, une solution-tampon au phosphate, etc. En outre, on peut ajouter un solvant miscible avec l'eau qui ne gêne pas la réaction.

Comme indiqué précédemment, on peut déterminer avantageusement selon l'invention la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme. En outre, l'invention qui permet de reconnaître les liaisons glucosidiques associées aux tumeurs peut être largement appliquée à divers cancers ou tumeurs, par rapport aux procédés ou systèmes classiques utilisant l'antigénicité et reconnaissant principalement la portion protéine des glucoprotéines telles que CEA, a1-fœtoprotéine, etc., et peut s'appliquer avec facilité au diagnostic de n'importe quels cancers ou tumeurs, tels que cancer de l'estomac, cancer du sein, cancer du côlon, cancer du rectum, cancer de l'ovaire, cancer de la cavité buccale, cancer de la langue, cancer du larynx, cancer de la prostate, liposarcome, mélanome malin, lym-phome malin, sarcome primaire de l'estomac, hépatome, etc., dans leurs stades préliminaires ou avancés, et l'invention est donc très utile pour la détection des cancers à leurs stades initiaux.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

Dans ces exemples, les parties et pourcentages s'entendent tous en poids, sauf indication contraire.

Exemple 1 :

Détermination utilisant la réaction d'inhibition de l'agglutination des cellules sanguines i) Préparation de l'échantillon d'essai

On recueille du sang chez chacun de sept patients atteints de cancer de l'estomac, quatre patients atteints de cancer du poumon, trois patientes atteintes de cancer du sein et des malades ayant chacun un cancer du côlon, un cancer du rectum, un cancer de l'ovaire, un cancer de la cavité buccale, un cancer de la langue, un cancer du larynx, un cancer de l'utérus, un cancer de la prostate, un mélanome malin, un liposarcome, un lymphome malin et un sarcome primaire de l'estomac, ainsi que chez sept personnes saines, respectivement, et on prépare des échantillons de la manière classi5

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ii) Détermination

A chacun des échantillons d'essais obtenus en i) ci-dessus, on ajoute un égal volume d'une solution-tampon au phosphate 0,15M contenant en dissolution 0,8 y/ml de lectine d'arachide (produite par la société E. Y. Laboratories Inc.) et on fait réagir le mélange en agitant à 20-37° C pendant 30 min. On dilue le mélange de réaction par une solution-tampon au phosphate 0,15M pour obtenir une série de dilutions doubles que l'on place chacune sur une plaque en V à raison de 50 |xl et on mélange avec 50 (xl d'érythrocytes de lapin (MO8 à 2-108 cellules/ml) en agitant. Après avoir laissé la dilution reposer à 37° C pendant 1 h, on observe l'agglutination des érythrocytes dans chaque dilution. La valeur de la dilution maximale à laquelle l'agglutination se produit encore est définie comme indice d'agglutination et l'évaluation est effectuée en utilisant cette valeur. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau.

iii) Observations

Comme il ressort clairement des résultats indiqués dans le tableau, toutes les personnes saines présentent un indice d'agglutination de 128 ou plus, tandis que les patients atteints de cancer présentent un indice d'agglutination beaucoup plus faible que les patients sains. Six des sept patients atteints de cancer de l'estomac présentent un indice d'agglutination de 8 ou moins et le reste un indice de 32. Les quatre patients ayant un cancer du poumon présentent un indice d'agglutination de 1. En ce qui concerne les autres cancers, presque tous les patients ont des indices d'agglutination de 8 ou moins, à l'exception d'un indice de 32 observé chez une patiente atteinte de cancer de l'utérus et un patient atteint de sarcome primaire de l'estomac.

Comme indiqué ci-dessus, l'indice d'agglutination observé chez les patients ayant une tumeur maligne ou un cancer est toujours de 32 ou moins, tandis que celui des personnes saines est de 128 ou plus.

Le procédé de l'invention est donc efficace pour déterminer la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme à l'extérieur de l'organisme et peut être utile pour le diagnostic de tumeurs malignes ou cancers divers.

Exemple 2:

Détermination utilisant le complexe enzyme-lectine marquée

Etape de référence:

i) Activation de la Peroxydase

A 1 ml d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium 0,3M dans laquelle on a dissous 5 mg de Peroxydase dérivée du raifort, on ajoute 0,1 ml de solution éthanolique de fluorodinitro-benzène 0,1 M et on agite doucement le mélange pendant 1 h à la température ambiante. On ajoute ensuite 1 ml de solution aqueuse de NaI04 0,06M au mélange que l'on agite doucement à la température ambiante pendant 30 min. On agite encore le mélange résultant avec 1 ml de solution aqueuse d'éthylèneglycol 0,1 M et on agite doucement à la température ambiante pendant 1 h, puis on dialyse le mélange de réaction avec une solution-tampon acide carbonique/hy-drogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 9,5) à 4°C pendant 1 d,

pour obtenir une préparation de Peroxydase activée.

ii) Marquage de la lectine par la Peroxydase

On dissout 5 mg de lectine (lectine d'arachide) dans 3 ml de la préparation de Peroxydase obtenue en i) ci-dessus et on agite doucement le mélange à la température ambiante pendant 2 à 3 h pour le laisser réagir. Après addition de 5 mg de NaBH4, on laisse reposer le mélange de réaction à 4°C pendant 3 h et on dialyse la solution résultante avec une solution au tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,4)

pendant 1 d, puis on la soumet à la filtration sur gel en utilisant la

Chromatographie sur colonne de gel Sephadex G 150 (éluant: solution-tampon tris-HCl 0,1 M à pH 7,4). On mesure les densités optiques (D28o et D403) de chaque fraction obtenue et on recueille les fractions dont les pics de D280 et D403 se chevauchent.

iii) Préparation du gel d'agarose

On met en suspension de l'agarose (produite par la société Iwai Kagaku Co., Ltd.) dans une solution-tampon tris-HCl 0,01M (pH 7,5), à raison de 1% en poids, et on chauffe la suspension à 70-80° C pour la dissoudre. On ajoute à cette solution 0,01% en volume de thimérosal et on verse la solution résultante dans des tubes à essais à raison de 1 ml par tube, puis on laisse reposer à la température ambiante pour préparer un gel d'agarose à 1 % en poids.

Exemple 2-1:

Méthode au polyéthylèneglycol i) Préparation de l'échantillon d'essai

On prélève 5 ml de sang chez chacun de vingt-cinq patients atteints de cancer, deux patients atteints de maladies autres que le cancer et vingt-trois personnes saines, en utilisant une seringue traitée à l'héparine (500 unités), et on centrifuge à 2000 tr/min pendant 10 min. On utilise comme échantillon d'essai le liquide surnageant résultant (plasma).

ii) Détermination

On place l'échantillon d'essai préparé en i) ci-dessus dans deux tubes à essais à raison de 200 ni par tube et on ajoute à chacun 50 ml de la préparation de lectine marquée à la peroxydase contenant 3,5 y/ml de lectine dans une solution-tampon tris-HCl (pH environ 7,5) préparée dans l'étape de référence de l'exemple 2. Après avoir agité légèrement, on laisse reposer le mélange à 20-30° C pendant 1 h pour le laisser réagir. On ajoute ensuite à l'un des tubes à essais 250 (il d'une solution de polyéthylèneglycol (poids moléculaire 6000) à 8% en poids par volume dans une solution-tampon tris-HCl 0,1 M et on agite doucement le mélange pour former l'échantillon A, et on ajoute à l'autre tube à essais 250 (il de solution-tampon tris-HCl 0,1M et on agite doucement le mélange pour former l'échantillon B. On centrifuge les deux échantillons A et B pendant 40 à 60 min en utilisant un rotor du type swing à 1000 G après avoir laissé reposer l'échantillon à 20-30° C pendant 30 à 60 min pour laisser réagir. On recueille 50 jj.1 du liquide surnageant résultant et on ajoute à 2 ml de solution de sérum physiologique préparée précédemment. Après avoir agité suffisamment, on mélange avec 500 ni d'une solution de substrat consistant en solution-tampon au citrate 0,1 M orthophény-lènediamine (concentration finale 6% en poids) et 0,1% en poids de peroxyde d'hydrogène et on fait réagir à 20-30° C pendant 30 min à l'obscurité. La solution de substrat est préparée au préalable et stockée à 4°C, ce qui est préférable. Ensuite, on ajoute 1 ml d'acide chlorhydrique 2N au mélange de réaction pour arrêter la réaction et on mesure la couleur de l'échantillon par spectrophotométrie et on l'exprime par sa densité optique à 492 nm.

La fig. 1 annexée représente la quantité de complexe TAG-lectine définie comme la différence c entre la densité optique a de l'échantillon A et la densité optique b de l'échantillon B, le symbole 0 présentant les personnes saines et les numéros 1 à 27 désignant les patients suivants: 1 et 18, cancer de l'estomac; 2, 6, 9, 16, 17, cancer du poumon; 3, 5, 7, 8 et 13, cancer de l'estomac (stade préliminaire); 4 et 14, cancer progressif de l'estomac; 10, défaillance cardiaque; 11, lymphadénite; 12, cancer du côlon avec métastases hépatiques; 15, cancer de l'utérus avec métastases pulmonaires; 19, môle hydati-forme; 20, cancer du côlon; 21, cancer de l'utérus; 22 et 26, cancer de l'ovaire; 23, cancer du rectum; 24, cancer de la prostate; 25, cancer de l'urètre, et 27, hépatome.

A partir des résultats indiqués dans la fig. 1, on peut voir que les échantillons présentant une valeur c supérieure à celle observée dans les échantillons prélevés sur les personnes saines contiennent des quantités de TAG supérieures à celles des échantillons des personnes saines. Cela suggère fortement que les personnes ayant des valeurs c élevées présentent des cellules tumorales ou cancéreuses.

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Exemple 2-2:

Méthode par filtration sur gel i) On recueille du sang chez quatorze patients atteints de cancer et huit personnes saines et on prépare des échantillons d'essai de la même manière qu'à l'exemple 2.

ii) Détermination

On mélange 5 pi de dilution de l'échantillon d'essai qui a été préparé en i) ci-dessus et dilué 104 fois par la solution H consistant en eau distillée contenant en dissolution 8% de chlorure de sodium, 0,4% de chlorure de potassium, 0,05% d'hydrogénophosphate de sodium, 0,06% de dihydrogénophosphate de potassium, 0,05% de sulfate de magnésium, 0,05% de chlorure de magnésium, 0,1% de chlorure de calcium et 0,1 % de glucose, avec 50 |il de la préparation de lectine marquée à la Peroxydase qui a été préparée à l'étape de référence de l'exemple 2, diluée 100 x par la solution-tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,4) et incubée pendant 15 min au bain-marie à 23° C. On incube le mélange résultant pendant 15 min à 23° C, puis on l'applique doucement sur la surface d'un gel d'agarose préparé par la méthode de l'étape de référence de l'exemple 2. Après incubation du tube à essais contenant le gel dans un bain-marie à 23° C pendant 1 h, on ajoute 2 ml de solution-tampon au phosphate 0,1M (pH environ 7,4) au gel d'agarose que l'on agite ensuite. On transvase immédiatement le liquide surnageant dans un tube à essais propre, auquel on ajoute ensuite 400 (il de la solution de substrat pour la Peroxydase préparée dans l'étape de référence de l'exemple 2. Après avoir agité suffisamment, on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 15 min pour le faire réagir. On arrête la réaction enzymatique avec 1 ml d'acide chlorhydrique IN et on agite suffisamment le mélange de réaction en utilisant un thermomixeur ou un dispositif analogue. On mesure la densité optique à 492 nm du mélange ainsi traité en utilisant un spectrophotomètre. On utilise comme témoin un mélange de 400 ml de la solution de substrat et 1 ml d'acide chlorhydrique IN. Les valeurs de densité optique obtenues sont traitées de la même manière qu'à l'exemple 2-1 et la quantité calculée de TAG-lectine est représentée à la fig. 2, dans laquelle le symbole 0 représente les personnes saines et les numéros 1 à 10 indiquent les patients suivants: 1, cancer de l'estomac; 2, môle hydatiforme; 3, cancer du côlon; 4, cancer de l'utérus; 5, cancer de l'ovaire; 6, cancer du rectum; 7, cancer de la prostate; 8, cancer de l'urètre; 9, hépatome, et 10, cancer du sein.

Comme il ressort clairement des résultats indiqués à la fig. 2, il y a une différence remarquable des teneurs de TAG dans les humeurs de l'organisme entre les personnes saines et les patients atteints de divers cancers.

L'invention se prête à l'application pratique dans les laboratoires cliniques dans la détermination des teneurs en TAG dans les humeurs de l'organisme, telles que sérum sanguin ou plasma.

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Claims

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1. Procédé de détermination de la teneur en substances contenant des liaisons glucosiques associées aux tumeurs (désignées ci-après par l'abbréviation TAG) dans un échantillon d'humeur de l'organisme, caractérisé en ce que l'on fait réagir les TAG présentes dans un échantillon de l'humeur de l'organisme avec une lectine pour former un complexe TAG-lectine et on mesure la quantité de complexe TAG-lectine ou la lectine n'ayant pas réagi.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une lectine marquée.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite lectine marquée est une lectine marquée par une enzyme, une substance fluorescente ou une substance radioactive.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on ajoute à ladite humeur de l'organisme une protéine protectrice.

5 TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme et on compare la teneur en TAG obtenue avec celle déterminée dans des échantillons d'humeur de personnes saines.

23. Nécessaire pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine comme agent io agglutinant spécifique de la TAG.

24. Nécessaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que ladite lectine a été lyophilisée et en ce qu'il contient en outre un réactif de reconstitution contenant un solvant aqueux ou miscible à l'eau.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite humeur de l'organisme est du sang, une humeur tissulaire, la lymphe, l'hydrothorax, un acide liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal ou la salive.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite humeur de l'organisme est le sérum sanguin ou le plasma sanguin.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est effectuée à 45° C ou moins pendant au moins 30 min.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction est effectuée à 4-40° C.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction est effectuée à 20-40° C.

10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction est effectuée pendant 60 à 90 min.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lectine est une lectine qui se fixe spécifiquement sur la liaison galac-tose-(ßl ->3 ou ßl ->4)-N-acétylglucosamine, et/ou -acétylgalactos-amine.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite lectine est la lectine d'arachide ou la lectine de graines de ricin.

13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de ladite lectine n'ayant pas réagi est déterminée par agglutination de ladite lectine n'ayant pas réagi.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la lectine n'ayant pas réagi est agglutinée avec une glucoprotéine contenant une liaison galactose-(ßl -» 3 ou ßl -<-4)-N-acétylglucosamine et/ou acétylgalactosamine terminale, ou avec un dérivé polymérique du dextran ou des billes de verre revêtues par ladite glucoprotéine.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite glucoprotéine consiste en érythrocytes de lapin ou en érythro-cytes de mouton traités à la neuraminidiase.

16. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite enzyme est la glucoamylase, la glucose-oxydase, la Peroxydase, la Phosphatase alcaline ou l'héméoctapeptide ou un fragment actif de celui-ci.

17. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite substance fluorescente est la fluorescéine, l'hydrogénothiocyanate de fluorescéine ou le chlorure de dansyle.

18. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite substance radioactive est l'iode radioactif ou le tritium.

19. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite enzyme est la Peroxydase.

20. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on sépare une fraction de TAG de l'humeur de l'organisme, on fait réagir cette fraction avec la lectine marquée ou non marquée, on sépare la lectine n'ayant pas réagi du mélange de réaction et on mesure la quantité de lectine n'ayant pas réagi ou de lectine ayant réagi avec les TAG.

21. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir une humeur de l'organisme avec la lectine marquée ou non marquée, on sépare la lectine ayant réagi de la lectine n'ayant pas réagi sur un gel, et on mesure la quantité de lectine ayant réagi ou n'ayant pas réagi.

22. Application du procédé selon la revendication 1 au diagnostic d'un cancer, caractérisée en ce que l'on détermine la teneur en

15 25. Nécessaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que ladite lectine est une lectine d'arachide.