CH635128A5 - Procede de transformation du glucose en fructose. - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé de transformation du glucose en fructose au moyen d'un enzyme d'isomérisation du glucose. Le procédé selon l'invention est défini à la revendication 1.
Au cours des dernières années s'est développé un intérêt considérable pour la transformation enzymatique du glucose en fructose, en particulier en ce qui concerne la production, à partir d'amidon de maïs, de sirops contenant du fructose. La glucose-isomérase que l'on utilise pour cette transformation peut être obtenue à partir de microorganismes appartenant à divers genres, comprenant les genres Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus et Actinoplanes. Une autre source de glucose-isomérase a récemment été décrite dans le brevet des E.U.A. N° 3956066 qui décrit la production de glucose-isomérase par des membres de l'espèce Flavobacterium devorans.
La présente invention repose sur la découverte que certaines souches de l'espèce Flavobacterium arborescens peuvent produire de la glucose-isomérase en quantités significatives. Cet enzyme convient parfaitement pour l'utilisation dans un procédé d'isomérisation du glucose.
Bien que les organismes décrits ici soient identifiés comme des membres de l'espèce Flavobacterium arborescens, on notera qu'il y a, à l'heure actuelle, une certaine controverse quant à la classification appropriée de ces organismes. Les pages 362-363 de la 8e édition du «Manual of Determinative Bacteriology» de Bergey indiquent que l'espèce F. arborescens est classée de façon impropre comme un membre de l'espèce Flavobacterium. A l'heure actuelle, une nouvelle classification et une nomenclature révisée n'ont pas encore été établies pour ces organismes. On utilise donc ici la nomenclature existante, sachant qu'une autre désignation du genre sera finalement adoptée dans la reclassification de Flavobacterium arborescens. On notera également que Flavobacterium devorans, auquel on se réfère dans le brevet des E.U.A. N° 3956066, n'est pas sujet à une reclassification et appartient donc en fait à un genre différent.
Les organismes que l'on utilise de préférence pour la production dudit enzyme sont des souches mutantes isolées de la culture ATCC 4358, qui est disponible à l'American Type Culture Collection. Les souches préférées de F. arborescens pouvant produire des quantités significatives de glucose-isomérase ont été déposées à la Collection de cultures permanente de Northern Regional Research Laboratory,
1815 North University Street, à Peoria (Illinois, USA) et sont disponibles, depuis le 7 octobre 1976, sous le nom de cultures NRRL B-l 1 022 et NRRL B-l 1 023.
Les micro-organismes décrits ici peuvent être cultivés dans divers milieux contenant des sources de carbone et d'azote, et des sels minéraux. Un milieu type comprend de la protéine animale hydrolysée, de la liqueur de macération de maïs, un extrait de levure de brasserie, du phosphate monopotassique, du phosphate dipotassique et un glucide approprié. Les glucides que l'on peut utiliser comprennent le xylose, le glucose, le maltose, le saccharose et le lactose, ainsi que les hydro-lysats de xylane, d'amidon et de cellulose. Le pH initial du milieu de culture est d'environ 7 et l'on effectue la fermentation par voie aérobie, à environ 30° C, dans un fermenteur ou une fiole agitée appropriés. On atteint une activité maximale d'isomérase généralement en environ 48 à 72 h.
On titre l'activité d'isomérase produite par les micro-organismes en faisant incuber à 60° C, pendant 30 min, un mélange contenant 0,5 ml de préparation contenant l'enzyme et 1,5 ml d'une solution contenant suffisamment de dextrose, de tampon Tritine (pH 8) et de chlorure de magnésium pour obtenir, respectivement, des concentrations finales 1,0M, 0, IM et 0,03M. A la fin de la période d'incubation, on arrête la réaction d'isomérisation par addition de 0,5 ml d'acide chlorhydrique 1,0N. Après centrifugation, on dilue de façon appropriée la fraction surnageante limpide et on détermine le fructose produit par le mode opératoire de L. Messineo et E. Musarra décrit dans «Int. J. Biochem.» 5(18), 691-699 (1972). L'activité d'isomérase est exprimée en micro-unités, une micro-unité d'activité étant définie comme la quantité d'enzyme qui produira un microgramme de fructose par minute dans les conditions d'analyse décrites précédemment.
On a trouvé que la quantité d'isomérase produite par les souches préférées, dans des conditions de culture favorables, est très substantielle et significativement supérieure aux quantités obtenues avec d'autres micro-organismes producteurs d'isomérase décrits dans la technique antérieure. La production d'isomérase par les souches préférées varie considérablement selon les conditions de culture utilisées. Un résultat particulièrement surprenant et inattendu est que la production maximale d'isomérase se produit quand on utilise du lactose dans le milieu de culture. Par exemple, la culture de NRRL B-l 1 022, dans un milieu contenant 2% de lactose, donne 2892 micro-unités d'isomérase par millilitre de bouillon de fermentation. Ainsi, les souches préférées se caractérisent, et se distinguent en outre des organismes de la technique antérieure, par le fait qu'elles peuvent produire des quantités substantielles (c'est-à-dire 500 micro-unités par millilitre de bouillon ou plus) d'activité d'isomérase quand on les cultive dans un milieu nutritif contenant du lactose comme seule source de glucide. Une production d'enzyme très substantielle se produit également quand on n'ajoute pas de glucide au milieu. Cela est démontré par les résultats, indiqués dans le tableau 1, obtenus en cultivant à 30° C des souches de F. arborescens dans un milieu contenant 1 % de protéine animale hydrolysée (Bacto-Tryptone obtenu chez Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), 1 % de liqueur de macération de maïs, 1 % d'extrait de levure, 1 % de phosphate dipotassique, 0,5% de phosphate monopotassique et 2% du glucide quand il est indiqué.
Tableau 1
Production d'isomérase par F. arborescens
Glucide dans le milieu
Durée (h)
Activité d'isomérase (micro-unités/ml)
ATCC 4358
NRRL B-11022
NRRL B-l 1023
Aucun
72
0
1042
1480
Xylose
72
546
892
775
Glucose
72
0
89
1123
Lactose
72
0
2892
1679
Maltose
72
—
1314
—
Saccharose
72
—
1190
—
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
635 128
L'isomérase produite par F. arborescens présente une activité utilisable dans un intervalle de pH de 6 à 10, et à une température de 45 à 90" C. Le tableau 2 montre l'effet du pH, et le tableau 3 montre l'effet de la température sur l'activité d'isomérase associée à des cellules entières obtenues en cultivant NRRL B-l 1 022 dans un milieu nutritif contenant du lactose, à 30° C, pendant 72 h. La stabilité de l'enzyme est indiquée par les résultats du tableau 4. Pour obtenir les résultats des tableaux 2 et 3, on lave une fois avec de l'eau les cellules récoltées et on les remet en suspension dans de l'eau, à la concentration initiale des cellules dans le bouillon de fermentation. On utilise le mode opératoire d'analyse normalisé décrit précédemment pour mesurer l'activité d'isomérase, sauf que l'on fait varier le tampon dans l'étude du pH et que l'on fait varier la température dans les expériences sur l'effet de la température. Les études de stabilité résumées dans le tableau 4 comprennent l'incubation des cellules lavées dans un tampon Tricine 0,05M (pH 8) contenant du chlorure de magnésium (0,004M), et l'analyse des cellules incubées aux intervalles indiqués en utilisant le mode opératoire normalisé d'analyse.
Tableau 2
Effet du pH sur l'isomérase de NRRL B-l 1 022
Tampon
PH
Activité d'isomérase
(micro-unités/ml)
Pipes1
6,0
598
Pipes1
6,5
1204
Pipes1
7,0
1782
Pipes1
7,5
2202
Tricine2
7,5
2624
Tricine2
8,0
3016
Tricine2
8,5
3456
Tricine2
9,0
3408
1 Pipes est l'acide 1,4-pipérazinediéthanesulfoniquemonosodique.
2 Tricine est la N-[2-hydroxy-l,l-bis (hydroxyméthyl)éthyl]-glycine.
Tableau 3
Effet de la température sur l'isomérase de NRRL B-l 1022 à pH 8,0
Température en °C
Activité d'isomérase (micro-unités/ml)
45
775
50
1717
55
2776
60
3500
65
4400
70
5104
75
5960
80
6592
85
7088
Tableau 4
Stabilité de l'isomérase de NRRL B-l 1 022 à des températures choisies
Durée totale d'incubation (h)
Activité d'isomérase (micro-unités/ml)
Incubation à 60 °C
Incubation à 70 ° C
24
2212
2340
96
2276
2244
168
2276
2036
240
2262
2092
On voit d'après les résultats du tableau 4 que l'enzyme est essentiellement stable pendant au moins 200 h à pH 8 et 60° C, comme déterminé en analysant les cellules lavées contenant l'enzyme. La préparation enzymatique de cellules lavées est en outre caractérisée par le fait qu'elle conserve au moins 85% de son activité quand on la chauffe pendant 200 h à 70° C et à pH 8.
L'isomérase produite par F. arborescens est très efficace pour transformer le glucose en fructose, et l'on peut mettre enjeu le procédé de l'invention selon divers modes opératoires déjà décrits dans la technique antérieure. Par exemple, on peut utiliser les cellules entières directement dans une opération discontinue dans laquelle la préparation enzymatique comprend le matériau cellulaire provenant du micro-organisme, ou bien les cellules peuvent être immobilisées dans un lit fixe pour une opération continue. Selon une autre variante, on peut utiliser un extrait débarrassé des cellules dans lequel l'isomérase est libérée des cellules par des procédés connus et utilisée sous forme d'enzyme soluble dans un système discontinu, ou est immobilisée pour l'utilisation dans un procédé continu. Des procédés d'utilisation des enzymes sous de telles formes sont bien connus, comme indiqué par exemple par W.R. Vieth et K. Venkatasubrama-nian, «Chemtech» 3,677-684 (1973) et 4,47-55, 309-320 et 434-444 (1974).
Indépendamment de la forme sous laquelle on utilise l'isomérase pour l'isomérisation du glucose, la réaction doit être effectuée à une température comprise entre 45 et 90° C, et de préférence entre 70 et 75° C. Le pH de la solution contenant du glucose doit être maintenu entre 6 et 10, et de préférence entre 6,5 et 8,0, pour minimiser la formation de produits de dégradation à des températures élevées. L'enzyme est efficace avec des solutions de glucose relativement pur, ainsi qu'avec des hydrolysats d'amidon préparés par un traitement acide et/ou enzymatique. On préfère des concentrations en glucose de 30 à 60% en poids. L'activité de l'enzyme est améliorée par addition à la solution contenant le glucose de petites quantités d'ions magnésium. La solution contenant le fructose obtenue par l'isomérisation peut être raffinée en utilisant des procédés classiques, comme un traitement par du charbon activé et des résines échangeuses d'ions.
Les exemples suivants illustreront mieux l'utilisation et les avantages de l'invention. Les sections A, B et C se rapportent à l'obtention de l'enzyme.
A. Dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml, on place 100 ml du milieu nutritif contenant les ingrédients suivants:
(%)
Protéine animale hydrolysée 1,0
Liqueur de macération de maïs 1,0
Extrait de levure 1,0
K2HP04 0,1
KH2P04 0,5
Lactose 2,0
On inocule le milieu précédent avec un inoculum fraîchement préparé de F. arborescens NRRL B-l 1 022 et on agite le milieu inoculé, à 30° C, en utilisant un agitateur rotatif. Au bout de 72 h, on recueille les cellules et on les lave. Une analyse révèle la présence d'une activité d'isomérase équivalant à 2892 micro-unités/ml de bouillon entier.
Exemple 1:
On effectue l'isomérisation du glucose en fructose en ajoutant 10 g de cellules entières lavées, obtenues par le mode opératoire de la section A, à 500 ml d'un sirop de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,01 M en chlorure de magnésium. On ajuste le pH du sirop à 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on fait incuber le sirop à 60° C en agitant doucement. Au bout de 20 h, on analyse la teneur en fructose du sirop et on trouve que 45% du glucose a été transformé en fructose.
B. On repète le mode opératoire de la section A, sauf que l'on utilise du xylose dans le milieu nutritif à la place du lactose et qu'on prépare l'inoculum à partir de F. arborescens ATCC 4358. Au bout de 72 h, on récolte les cellules et une anlyse indique la présence d'une activité d'isomérase équivalant à 546 micro-unités/ml de bouillon entier.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
635 128
4
C. On répète le mode opératoire de la section A, sauf que l'on remplace le lactose par du glucose dans le milieu nutritif et que l'on obtient l'inoculum à partir de F. arborescens NRRL B-l 1 023. Au bout de 64 h, on analyse les cellules recueillies et on trouve qu'elles ont une activité d'isomérase équivalant à 580 micro-unités/ml de bouillon entier.
Exemple 2:
On effectue la transformation enzymatique du glucose en fructose en introduisant 9 g de cellules humides, obtenues par le mode opératoire de la section C, dans 500 ml d'une solution de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,005M en chlorure de magnésium. On ajuste le pH du sirop à 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on fait incuber la solution à 60" C en agitant doucement. L'analyse de la solution après 27 h révèle une teneur en fructose de 38%.
Exemple 3:
On cultive F. arborescens NRRL B-l 1 022 à 30°C pendant 70 h dans unfermenteur New Brunswick de 101, en utilisant le milieu nutritif décrit dans la section A. On recueille les cellules et on les immo-5 bilise dans le mode opératoire de floculation décrit dans le brevet des E.U.A. N° 3821086, ce qui donne un agrégat de cellules floculées et séchées présentant 75 micro-unités d'activité d'isomérase par gramme. On utilise pour l'isomérisation continue du glucose une colonne de verre de 2,5 cm de diamètre contenant 5 g de l'agrégat séché. 10 On maintient la colonne à 60° C et on fait passer dans la colonne, à un débit de 26 ml/h, une solution de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,005M en chlorure de magnésium et dont le pH a été ajusté à 8,0-8,4. On analyse la teneur en fructose de l'efïluent de la colonne et on trouve que le degré de transformation du glucose en fructose est 15 environ 45%.
R
Claims (7)
1. Procédé de transformation du glucose en fructose, caractérisé* en ce qu'on met une solution contenant du glucose en contact avec un enzyme d'isomérisation du glucose: a) produit par culture d'un micro-organisme appartenant à l'espèce Flavobacterium arborescens dans un milieu nutritif, dans des conditions permettant la production dudit enzyme par ledit micro-organisme et recouvrement dudit enzyme, et b) identifié par une activité enzymatique s'exerçant à une température de 45 à 90° C et à un pH de 6 à 10, et qu'on recueille une solution contenant du fructose.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on opère à une température de 45 à 90° C et dans un intervalle de pH de 6 à 10.
2
REVENDICATIONS
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le micro-organisme mis enjeu est la souche Flavobacterium arborescens ATCC 4358.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le micro-organisme mis enjeu est la souche Flavobacterium arborescens NRRL B-11 022.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le micro-organisme mis enjeu est la souche Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 023.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'enzyme mis enjeu consiste en un extrait exempt de cellules du micro-organisme.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'enzyme mis enjeu consiste en matériau cellulaire obtenu à partir dudit micro-organisme.
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