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CH626651A5 - - Google Patents

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Publication number
CH626651A5
CH626651A5 CH1010476A CH1010476A CH626651A5 CH 626651 A5 CH626651 A5 CH 626651A5 CH 1010476 A CH1010476 A CH 1010476A CH 1010476 A CH1010476 A CH 1010476A CH 626651 A5 CH626651 A5 CH 626651A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
bacterial strains
poly
phb
cbs
carbon source
Prior art date
Application number
CH1010476A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert M Lafferty
Original Assignee
Agroferm Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agroferm Ag filed Critical Agroferm Ag
Priority to CH1010476A priority Critical patent/CH626651A5/de
Priority to DE19772733203 priority patent/DE2733203A1/de
Priority to NL7708517A priority patent/NL7708517A/xx
Priority to SE7708844A priority patent/SE7708844L/xx
Priority to GB32783/77A priority patent/GB1535632A/en
Priority to BE179923A priority patent/BE857493A/xx
Priority to DK351877A priority patent/DK351877A/da
Priority to FR7724203A priority patent/FR2360667A1/fr
Priority to AU27660/77A priority patent/AU510376B2/en
Priority to IT68816/77A priority patent/IT1082252B/it
Priority to JP9458077A priority patent/JPS5320478A/ja
Priority to US05/822,756 priority patent/US4138291A/en
Priority to CA284,313A priority patent/CA1098463A/en
Publication of CH626651A5 publication Critical patent/CH626651A5/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/85—Flavobacterium

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Bakterienstämmen, welche imstande sind, fermentativ aus billigen, nicht erschöpflichen Rohstoffen 55 Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) in grosstechnischem Massstabe zu produzieren. Die Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) kann unter anderem zur Herstellung von Gebilden und Formkörpern, wie Fäden, Fasern, Folien und dergleichen, welche biologisch abbaubar sind, verarbeitet werden.
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Der heutige Stand der Technik ist unter anderem ohne Zweifel der Verwendung von synthetischen, hochmolekularen Stoffen zu verdanken, die aufgrund ihrer breit gestreuten physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer leichten Verarbeit-barkeit im täglichen Geschehen eine unersetzliche Rolle spielen. Die bekannten chemisch-synthetisch gewonnen Polymere sind jedoch mit einer grossen Zahl von schwerwiegenden Nachteilen behaftet. Ihre monomeren Ausgangsmaterialien werden fast ausnahmslos Fraktionen der Erdölspaltung oder der Kohleverarbeitung entnommen, wie zum Beispiel das Äthylen, Propylen - das heisst lineare Kohlenwasserstoffe - oder das Cyclohexan - das heisst cyclische Kohlenwasserstoffe -oder deren Reaktionsprodukte, wie zum Beispiel Äthylenoxyd oder Cyclohexanon. Die genannten Quellen für die Ausgangsstoffe von chemisch-synthetischen Polymeren sind bekanntlich begrenzt und werden noch für andere lebenswichtige Zwecke eingesetzt, so dass das Angebot einer steigenden Verknappung unterworfen wird.
Anderseits stellen die chemisch-synthetischen Polymere eine Belastung der Umwelt dar. Erstens sind sie nur durch Verbrennung zu beseitigen, wobei in der Regel eine starke Russentwicklung, sowie eine unerwünschte Kohlenmonoxyd- und Koh-lendioxyd-Entwicklung auftritt. Zudem entstehen bei der Verbrennung vieler Kunststoffe äusserst schädliche Nebenprodukte, wie Salzsäure, Ammoniak, Stickstoffoxyde, Benzypyrene usw., welche nachgewiesenermassen stark korrosiv oder sogar krankheitserzeugend sind (zum Beispiel Krebs) und dadurch die Qualität des Lebensraumes eindeutig beeinträchtigen. Weil der Konsum von synthetischen Kunststoffen erhebliche Mengen erreicht hat, bedingt deren Beseitigung eine enorme Belastung der öffentlichen Abfallverbrennungsanlagen. Schliesslich beinhaltet die chemisch-synthetische Herstellung von Polymerstoffen ausnahmslos das Auftreten von gefährlichen Zwischenprodukten, die zum Teil hoch toxisch oder explosiv sind, weshalb durch die Behörden stets aufwendigere Vorkehrungen bei der Fabrikation verlangt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Beitrag zur Lösung dieser Probleme dar, indem sie Wege zur Herstellung von Polymeren aufzeigt, welche auf praktisch unerschöpflichen Ausgangsmaterialien, wie Kohlendioxyd oder Melasse, beruhen oder von Stoffen ausgehen, welche die Umwelt belastende Abfallprodukte darstellen, wie zum Beispiel die carbonsäurehaltige Ablauge der Caprolactamsynthese. Die zur Herstellung des Polymerstoffes notwendigen Schritte sind unter ungefährlichen und umweltfreundlichen Bedingungen realisierbar. Überdies sind die nach der Erfindung hergestellten Polymere biologisch abbaubar, indem daraus hergestellte Folien und dergleichen durch normal bearbeitete Ackererde innert Wochen bis Monaten vollständig aufgelöst werden. In der Tat enthalten sämtliche Böden genügend Mikroorganismen, welche den Polyester Polybetahydroxybuttersäure spalten und die resultierende Beta-Hydroxybuttersäure assimilieren können.
Trotz dieser ubiquitären biologischen Abbaubarkeit zeichnen sich aus dem erfindungsgemäss hergestellten Polymeren erzeugte Gebilde durch hohe Resistenz gegenüber Säuren, Alkalien, Licht, Luft und den meisten organischen Lösungsmitteln aus.
Die Polyester der D(—)-3-Hydroxybuttersäure (Kurzform Polybetahydroxybuttersäure oder PHB) entsprechen der Formel:
HO
\ /CÌÌ2\
CH NC
CH.
wobei n etwa 6-8000 bedeutet.
0
|/°\
r CH C
CH.
A
CH I
CH-
/°H
1
(1)
n
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Es wurde also ein Verfahren gefunden, durch welches Bakterienstämme gewonnen werden können, welche unter jedwel-chen Wachstumsbedingungen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Ablauge der Caprolactamsynthese, Melasse, Methanol, Äthanol und Kohlendioxyd weitgehend in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umzusetzen vermögen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man unter Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) produzierenden Bakterienstämmen (1) jene auswählt, welche (a) unter der fermentativen Synthese der Poly-(D-3-hydroxybutter-säure) abträglichen oder nicht förderlichen Wachstumsbedingungen das geringste spezifische Gewicht besitzen und (b) zudem bei kurzdauernder Überflutung mit einer Lösung von Sudanschwarz B die stärkste Anfärbung aufweisen, die derart ausgewählten Bakterienstämme (2) auf stets steigenden Konzentrationen einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Ablauge der Caprolactamsynthese, Melasse, Methanol, Äthanol und Kohlendioxyd züchtet und dadurch an die Assimilation hoher Konzentrationen dieser Kohlenstoffquelle adaptiert, wobei man die Bakterienstämme vor der Stufe (1) und/oder vor der Stufe (2) der Einwirkung mutagener Agenzien unterwirft, und unter den derart adaptierten Bakterienstämmen Wiederum jene auswählt, welche von der Kohlenstoffquelle einen grösseren Anteil in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umsetzen als zuvor, jedoch nur einen minimalen Änteil für den Energiestoffwechsel und die Synthese des übrigen Zellmaterials verbrauchen.
Die erhaltenen Stämme werden zur Herstellung von Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) verwendet, indem man sie in einem wässrigen Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Melasse, Methanol, Äthanol, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsynthese, die Mono-und Dicarbonsäuren enthalten, nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, züchtet und die gebildete Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) aus der Kulturbrühe isoliert.
Im folgenden soll die Erfindung ausführlich beschrieben werden.
Bekanntlich produzieren sehr viele aerobe Schizomyceten PHB als Energiereservestoff, wenn sie entweder ein Überangebot an Kohlenstoff erhalten, unter Stickstoffmangel stehen, oder geringen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt sind. Es wurde nun entdeckt, dass mit an sich bekannten Methoden Mikroorganismen gefunden werden können, welche stets, das heisst auch unter optimalen Lebensbedingungen, grosse Mengen von PHB aus wirtschaftlich günstigen, bis anhin für diesen Zweck nicht bekannten oder verwendeten Kohlestoffquellen, wie zum Beispiel Melasse, Methanol, Äthanol und Ablauge der Caprolactamsynthese, produzieren. Nachdem zum Teil bekannte PHB-Produzenten mittels mutagenen Agenzien behandelt wurden, konnten aufgrund besonderer morphologischer Merkmale, durch Anfärbung mit Sudanschwarz B, sowie auf der Basis des spezifischen Gewichtes Mutanten selektio-niert werden, welche konstitutiv, das heisst ungeachtet den Metabolismus des Kohlenstoffs beeinflussender Verhältnisse, wie Stickstoffmangel usw., PHB Produzieren. Durch wiederholte Mutation und Selektion wurden Mikrobenstämme erhalten, welche auf Melasse, Methanol, Äthanol, Ablauge der Caprolactamsynthese (hinfort mit der Abkürzung CAL bezeichnet) und CO2 PHB in einer Menge von bis zu 90% ihrer Zellmasse bilden.
Die Kettenlänge (n in Formel I) wird weitgehend durch die Wahl des zur Isolierung der Polymeren aus der Biomasse verwendeten Extraktionsverfahrens bestimmt. Polare Lösungsmittel, zum Beispiel Äthanol, bewirken vorwiegend die Extraktion von Polymeren mit kleineren Molekulargewichten und tieferen Schmelzpunkten, während lipophile Lösungsmittel selektiver sind für höher molekulare Polymere mit zum Beispiel n =
80-110 und Schmelzpunkten von 150 bis 190 °C. Durch die Art des Aufschliessens der Biomasse, wie zum Beispiel durch enzy-matische Lyse, Behandlung mit Alkalien oder Mineralsäuren, kann nebst einer Verbesserung der Extrahierbarkeit der Polymeren auch dessen Fraktionierung nach molekularer Grösse beeinflusst werden. Bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion von PHB aus der nativen Biomasse sind das Äthylencarbo-nat und das Propylencarbonat. Beide Lösungsmittel eignen sich für die Extraktion von PHB aus nasser Biomasse auf kontinuierlicher Basis und erlauben überdies durch die Regulation der Extraktionstemperatur eine weitgehende Beeinflussung des Molekulargewichtes der PHB. So erhält man zum Beispiel mit Propylencarbonat bei 120 °C und einer Verweilzeit von 1 bis 5 Minuten PHB mit Molekulargewichten über 1 000 000, während mit Äthylencarbonat bei 110 °C und einer Verweilzeit von 1 bis 10 Minuten PHB mit Molekulargewichten von etwa 100 000 bis 500 000 erhalten werden. Durch blosses Abkühlen dieser Lösungsmittel fällt reine PHB aus, welche sich leicht abtrennen lässt.
Zur Veränderung der physikalischen Eigenschaften von PHB kann man die PHB-Moleküle unter die Veresterung fördernden Bedingungen untereinander verestern, so dass daraus ein polymerer Stoff mit grösseren Molekulargewichten, das heisst einer vervielfachten Kettenlänge von I entsteht.
Dadurch erhält man Polymere mit veränderten thermoplastischen Eigenschaften.
Die Verfahrensprodukte können durch Methoden, die in der Kunststoffverarbeitung allgemein bekannt sind, wie zum Beispiel Tauchen, Walzen, Pressen, Strangpressen, Spritzgies-sen usw., zu Fasern, Folien oder Werkstücken verarbeitet oder aus Lösungen verarbeitet oder als Lacke verwendet werden.
Die quantitative Bestimmung der Poly-(D-3-hydroxybutter-säure) und die Bestimmung des Molekulargewichtes der Verfahrensprodukte werden mit Vorteil folgendermassen durchgeführt.
Das Polymere, PHB wird gemäss J. H. Law und R. A. Sle-pecky, J. Bact. 82 (1961), 33, in konzentrierter Schwefelsäure durch Hydrolyse und gleichzeitige Dehydratisierung in die Cro-tonsäure übergeführt, welche im UV-Licht bei 235 nm ein Absorptionsmaximum aufweist. Zur quantitativen Analyse von PHB werden 5 ml der Gärlösung während 10 Minuten bei etwa 15 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Ohne das Sediment zu stören, wird das Überstehende dekantiert und zum Sediment 5 ml Natriumhypochloritlösung beigegeben. Nach guter Suspendierung wird das Gemisch unter gelegentlichem Schütteln während 1 Stunde bei 37 °C gehalten. Hernach wird durch einen Zellulosefaltenfilter filtriert und mit Wasser gut nachgespült. Der Filter samt Rückstand wird mit etwa 10 ml Aceton und hierauf etwa 10 ml Äthanol gewaschen. Filter und fester Rückstand werden in einen 100 ml Rundkolben gebracht, welcher mit 40 ml Chloroform angefüllt wird. Der Kolben wird nun in ein kochendes Wasserbad gehalten, bis das Gemisch gut siedet. Hernach wird das Filterpapier herausgenommen und mit siedendem Chloroform über einem in den Kolben mündenden Trichter gut nachgewaschen. Das Chloroform wird nun aus dem Kolben bis zum trockenen Zustand abgedampft. Zum ganz trockenen Kolben werden nun 5,0 ml konzentrierte Schwefelsäure pro analysi beigegeben und die gesamte mit Rückstand belegte Kolbenoberfläche gut befeuchtet und der Kolben mit einem Stopfen verschlossen während mindestens 10 Minuten bei 95 bis 100 °C gehalten. Während dieser Zeit erfolgt die Hydrolyse und Dehydratisierung der PHB zur Crotonsäure. Nach dem Abkühlen erfolgt die Verdünnung je nach Bedarf in zwei oder mehr Schritten, zum Beispiel 1:10 mit Wasser und hernach 1:10 mit Schwefelsäure, so dass die Messlösung betreffend die Säure mindestens 90%ig ist. Die Messung der optischen Dichte erfolgt in Quarzglasküvetten, welche mit Stopfen geschlossen werden müssen, um die störende Schlierenbildung
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möglichst zu verhindern. Es wird bei 235 nm gemessen. Die Menge an PHB lässt sich aus dem Et^m-Wert von 1524 errechnen.
Eine etwa 0,5%ige Lösung "eines bestimmten Präparates von (1) in Chloroform wies bei 25 °C eine Flotationskonstante von l,56x 10~13 Sekunden auf, woraus sich ein mittleres Molekulargewicht von etwa 10 000 errechnen lässt. Die Charakteristik des optischen Rotationsdispersionsspektrums von PHB (1) ist in Fig. 1 wiedergegeben.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
500 ml Erlenmeyerkolben, welche 50 ml der Nährlösung 3 % Glucose, 0,5% KNO;, 0,17% NaiHPCk- 2H2O,0,13% KH2PO4, 0,04% MgSo4- 7H20,0,002% FeSo4- 7H2O und 0,001 % MnCb*4H20 enthielten, wurden bei 121 °C autoklaviert und hernach mit einer Kultur von Bacillus megatherium NCIB 8508 beimpft und in Gegenwart von Luft bei 28 °C exzentrisch geschüttelt. Nach 48stündiger Inkubation wurden die Zellen aus der Nährlösung abgetrennt, mit H2O nachgewaschen und in bekannter Weise zum Beispiel mit UV-Licht, NaNCh, Nitro-nitroso-methylguanidin mutiert (siehe zum Beispiel R. C. Glowes und W. Hayes, Experiments in microbial Genetics, Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburg 1968). Die überlebenden Zellen wurden auf obiges Medium - versehen mit 1,5% Agar - ausgeplattet, so dass Streukolonien erhalten wurden. Stark milchig-weiss aussehende Kolonien, welche sich kuppelartig über die Agaroberfläche erhoben, wurden zur Prüfung auf PHB unter submersen Bedingungen ausgewählt.
Andere Platten mit voll entwickelten Streukolonien wurden nach ihrer Abstempelung mittels Samtstempeln auf eine frische Agarplatte (siehe Hayes, 1. c. «Replication Technique») mit einer Lösung von Sudanschwarz B für kurze Zeit überflutet, um die am stärksten anfärbbaren Kolonien zu erkennen und die Replikakolonien derselben von der 2. Agarplatte für die Prüfung auf die PH B-Produktivität zu prüfen.
Beide Selektionsmechanismen führten zur Isolierung von Bacillus-megatherium-Mutanten, welche im obigen Medium bedeutend höhere PH B-Mengen speicherten als der Ausgangsstamm.
Beispiel 2
Gemäss Beispiel 1 wurden selektionierte Stämme unter Bedingungen angezüchtet, welche bekannterweise keine oder nur geringe PHB-Speicherung bewirken, das heisst im Medium von Beispiel 1 wurde die Stickstoffquelle um 50% erhöht, die Glucosekonzentration auf 0,5% gesenkt und die Kultur bei 30 °C für 36 Stunden stark geschüttelt, um hohe 02-Konzentra-tionen zu erhalten. Die so erhaltenen Kulturen wurden abzen-trifugiert, mit H2O gewaschen und in etwa 2 ml einer CsCl-Lösung mit einer spezifischen Dichte von etwa 1,15 aufgeschlemmt. Diese Suspension wurde auf eine lineare CsCl-Gra-dientenlösung von etwa 40 ml in einem 50 ml Zentrifugenröhr-chen aus Celluloïd vorsichtig aufgetröpfelt. Der CsCl-Gradient war in bekannter Weise so hergestellt worden, dass die oberste Flüssigkeitszone eine Dichte von 1,15 und die Bodenzone eine solche von 1,38 aufwies. Dieser Gradient wurde samt Zellsuspension für 20 Stunden bei 5 °C und etwa 250 OOOfacher Erdbeschleunigung zentrifugiert. Dadurch drangen PH B-lose Zellen, oder solche mit geringem PHB-Gehalt, in die höheren Dichtezonen des Gradienten ein, während Zellen mit hohen PHB-Gehalten nahe der Oberfläche des Gradienten zu liegen kamen. Nach Beendigung der Zentrifugierung wurden die Gra-dientenröhrchen am tiefsten Punkt mittels einer Nadel angestochen, so dass der Gradient sich tropfenweise entleeren Hess. Die Tropfen der Zonen mit geringer CsCl-Dichte wurden auf Agarplatten mit Nährlösung von Beispiel 1 ausgeplattet, so dass nach deren Bebrütung vorwiegend Streukolonien entstanden. Diese wurden in bekannter Weise auf ihre Fähigkeit zur PHB-Bildung geprüft. Auf diese Weise wurden von den Stämmen aus Beispiel 1 Mutanten gewonnen, welche konstitutiv PHB bildeten, das heisst welche in jeder Wachstumsphase PHB speichern und nicht nur unter speziellen, die PHB-Bildung fördernden Bedingungen, wie dies bei den sogenannten Wildtypen, wie zum Beispiel Bacillus megatherium NCIB 8508 und anderen bekannten Wildtypen der Fall ist.
Gleiche Selektionierungserfolge wurden mit linearen Saccharosegradienten erzielt.
Beispiel 3
Analog zu Beispiel 1 und 2 konnten auf dem Medium von Beispiel 1, in welchem Glucose durch 1 % Fruktose und KNO3 durch 0,4% NH4CI ersetzt war, von Bacillus megatherium DSM 32, Bacillus megatherium NCIB 8674, Pseudomonas sp. B 79 NCIB 9088 und Pseudomonas sp. B 175 NCIB 9089, P. facilis ATCC 11228 und ATCC 17695, P. pseudomallii ATCC 11668, Chromatium violaceum NCIB 8182, Rhizobium sp. HCCB 142, Azotobacter beijerinckii NCIB 9067, A. agilis NCIB 8637, A. chroococcum DSM 281, A. vinelandii NCIB 8789, Hydrogeno-monas eutropha ATCC 17699, Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Flavobacterium aquatile ATCC 11947, Mycoplana rubra CBS 385.76, Zoogloea ramigera ATCC 19623, Mutanten gewonnen werden, die konstitutiv PHB produzierten.
Beispiel 4
Auf konstitutive Weise PHB-produzierende Mutanten aus Beispiel 3, zum Beispiel diejenigen von Alcaligenes eutrophus ATCC 23 440, Bacillus megatherium DSM 32, Azotobacter chroococcum DSM 281 und Zoogloea ramigera ATCC 19 623 wurden aus 24 Stunden alten Submerskulturen des flüssigen Mediums von Beispiel 3 auf gleiches durch Agar verfestigtes Medium, welches 0,1 Gew.-% von neutralisierter CAL enthielt, ausgeplattet und bei 30 °C solange inkubiert, bis einige Kolonien gut angewachsen waren. Die grössten Kolonien, welche folglich durch die Anwesenheit von CAL nicht, oder am wenigsten im Wachstum beeinflusst wurden, wurden in der Folge nach in bekannter Weise durchgeführter Mutation auf analoges Medium ausgeplattet, welches nun aber nur noch 0,8% Fruktose, dafür aber 0,2% neutralisierte CAL enthielt, usw., bis von jeder Bakterienart Mutanten resultierten, welche auf CAL als einziger Kohlenstoffquelle gut wuchsen. Zur Adaptierung ' an höhere CAL-Konzentrationen eignete sich folgende Technik. Bakterienstämme wurden auf Fruktose und CAL enthaltende Agarplatten verimpft, so dass bei ungehemmtem Wachstum dichte Bakterien'rasen entstünden. Ins Zentrum solcher Platten wurde hernach eine Spatelspitze voll des das Wachstum hemmenden mutagenen Agens Nitro-Nitroso-Methyl-gua-nidin gebracht und solange inkubiert, bis sich gutes Wachstum ausgebildet hatte. Kolonien, welche sich sehr nahe dem mutagenen Agens gut ausbildeten, erwiesen sich oft als sehr gute CAL-Verwerter.
Durch fortgesetzte Anwendung dieser Methoden, resp. Kombinationen davon, wurden Mutanten erhalten, welche auch höhere Konzentrationen von CAL als einzige Kohlenstoffquelle unter konstitutiver Bildung von PHB durchaus verwerten konnten. Es wurden insbesondere die Mutanten GD-5 von Alcaligenes eutrophus ATCC 23440 und GB 1003 von Bacillus megatherium DSM 32 für weitere Arbeiten ausgewählt, welche 3% und mehr von neutralisierter CAL als einzige Kohlenstoffquelle assimilierten.
Beispiel 5
Analog zu Beispiel 4 wurden auf konstitutive Weise PHB-produzierende Mutanten aus Beispiel 3, zum Beispiel diejenigen von Bacillus megatherium DSM 32, Azotobacter chroo-
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coccum DSM 281 und Zoogloea ramigera ATCC 19623 so mutiert und selektioniert, dass sie auf Melasse als einziger Kohlestoffquelle hohe Mengen von PHB produzierten. In dieser Weise wurden Mutanten herausgezüchtet, welche auf 30 bis 40% Melasse gut wuchsen und etwa 80 bis 90% ihres Zellge- 5 wichtes an PHB speicherten. Es wurden insbesondere die Mutanten GBM-13 von Bacillus megatherium DSM 32 und GZ-1018 von Zoogloea ramigera ATCC 19623 für weitere Arbeiten verwendet.
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Beispiel 6
Um methanolverwertende Mikroorganismen zu finden,
wurde ein 500 ml Becherglas mit etwa 100 ml der Nährlösung von Beispiel 1, welchem jedoch anstatt KNO3 0,4% NH4CI,
sowie 1 % Methylalkohol anstelle der Glucose beigemischt 15 wurde, im Laboratorium offen aufgestellt. Nach einigen Tagen war die Lösung trüb und konnten daraus nach entsprechenden Verdünnungen mit H2O auf Agarplatten, welche nun sterilisiertes Methanolmedium enthielten, einzelstehende Streukolonien erzeugt werden. Ausgewählte sudanophile Kolonien wurden 20 danach analog dem Verfahren von Beispiel 2 und 3 unterworfen. Der beste Stamm produzierte zu etwa 81 % seines trockenen Zellgewichtes PHB. Dieser Stamm wurde am 6. August 1976 als Bacterium in editio P-l beim Cetraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn (N iederlande), als 25 CBS 385.76 deponiert. Dieser Stamm wurde durch den Kurator der National Collection of Industriai Bacteria (Ministry of Agriculture, Fischeries and Food, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland) als Mycoplana-rubra-Stamm identifiziert.
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Beispiel 7
Die Mutante GD-5 (CBS 388.76) wurde in einem Kleinfer-menter mit 20 Liter Totalvolumen in 5 Litern des Mediums von Beispiel 1, worin KNCh durch 0,4% NH4CI und die Glucose durch 2 % neutralisierte CAL der Firma Emser Werke in 35
Domat/Ems, Schweiz, ersetzt war, bei 28 °Cund unter Begasung mit 0,5 vvm Luft unter Rühren gezüchtet. Dabei wurde pH-Wert durch Beigabe von verdünnter HCl bei 6.8 konstant gehalten. CAL enthielt etwa 150 g Carbonsäuren pro Liter,
welche gemäss gaschromatographischer Analyse der Methyl- 40 ester der Karbonsäuren folgende Zusammensetzung aufwiesen:
Bernsteinsäure Glutarsäure Adipinsäure Essigsäure Propionsäure Buttersäure Valeriansäure Capronsäure
6 g/Liter 9 g/Liter 57 g/Liter 2,5 g/Liter 3 g/Liter 6 g/Liter 28,5 g/Liter 14,5 g/Liter
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Die maximale Wachstumsgeschwindigkeit p.max betrug 0,24/ Stunde und die Ertragskonstanten betrugen:
y (g Zelltrockenmasse/ml CAL) = 0,13, das heisst y (g Zelltrockenmasse/g Carbonsäuren) = 0,65.
Dies entspricht der bemerkenswerten Kohlenstofftransfe-rierung von 68%. Die Biomasse enthielt etwa 78% PHB.
Beispiel 8
Die Mutante GD-5 von Alcaligenes eutrophus (am 6. August 1976 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn als CBS 388.76 hinterlegt) wurde im Kleinfermenter im Medium von Beispiel 7, jedoch ohne Kohlenstoffquelle, aber unter Begasung mit 0,11 vvm des Gemisches 10% CO2,20% O2 und 70% H2 bei 28 °C inkubiert. Es wurde festgestellt, dass die PHB-Speicherung exponentiell verläuft, das heisst parallel der Biomassenbildung. Die PHB-Bildungsrate betrug 3 (ig/Minute • mg Protein. Unter ansonst gleichen Bedingungen wurde mit dieser Mutante in einstufiger kontinuierlicher Fermentation im Chemostaten eine nmaxvon 0,23/Stunde und eine Produktivität von 0,46 g Zelltrockenmasse/L. Stunde mit einem Anteil von 68% PHB festgestellt.
Beispiel 9
Analog zu Beispiel 7 wurde mit der Mutante GB-1003 von Bacillus megatherium (am 6. August 1976 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn als CBS 389.76 hinterlegt) verfahren, wobei (o.max 0,25 pro Stunde y (g Zelltrockenmasse/ml CAL) = 0,14 betrugen. Die Biomasse enthielt 81 % PHB.
Beispiel 10
Die Mutante GBM-13 von Bacillus megatherium (am 6. August 1976 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn als CBS 390.76 hinterlegt) wurde in einer 500 ml Erlen-meyerflasche mit 100 ml des Mediums von Beispiel 7, in welchem die CAL durch 10% Rübenmelasse ersetzt war, bei 30 °C für 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Nach dieser Zeit enthielt die Kulturlösung 2,5 g Bakterientrockenmasse mit einem Gehalt an PHB von 85%.
Beispiel 11
Die Mutante GZ-1018 von Zoogloea ramigera (am 6. August 1976 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn als CBS 391.76 hinterlegt) wurde unter gleichen Bedingungen wie bei Beispiel 10 auf 10% Rübenmelasse, welche 51 % Saccharose enthielt, gezüchtet. Es resultierten 2,35 g Bakterientrockenmasse mit 79% PHB.
sowie eine unbekannte Menge von Oxycapronsäure.
Beispiel 12
Die Mutante GD-5 (CBS 388.76) wurde analog zu Beispiel 10, jedoch anstatt auf Rübenmelasse auf 3% Äthanol für 24 Stunden gezüchtet. Es konnten 1,1 g Zellen mit einem PHB-Gehalt von 83% geerntet werden.
1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

  1. 626651
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zur Gewinnung neuer Bakterienstämme,
    welche unter jedwelchen Wachstumsbedingungen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Melasse, Methanol, Äthanol, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsyn- s these, die Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, weitgehend in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umzusetzen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass man unter Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) produzierenden Bakterienstämmen (1) jene auswählt, welche
    (a) unter der fermentativen Synthese der Poly-(D-3-hydroxy- io buttersäure) abträglichen oder nicht förderlichen Wachstumsbedingungen das geringste spezifische Gewicht besitzen und
    (b) zudem bei kurzdauernder Überflutung mit einer Lösung von Sudanschwarz B die stärkste Anfärbung aufweisen, die derart ausgewählten Bakterienstämme (2) auf stets steigenden Kon- is zentrationen einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Melasse, Methanol, Äthanol, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsynthese, die Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, züchtet und dadurch an die Assimilation hoher Konzentrationen dieser Kohlenstoffquelle adaptiert, wobei man die 20 Bakterienstämme vor der Stufe (1) und/oder vor der Stufe (2)
    der Einwirkung mutagener Agenzien unterwirft, und unter den derart adaptierten Bakterienstämmen wiederum jene auswählt, welche von der Kohlenstoffquelle einen grösseren Anteil in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umsetzen als zuvor, jedoch nur 25 einen minimalen Anteil für den Energiestoffwechsel und die Synthese des übrigen Zellmaterials verbrauchen.
  2. 2. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 gewonnene neue Bakterienstämme.
  3. 3. Als Bakterienstämme nach Anspruch 2 solche Mutanten 30 von Alcaligenes eutrophus ATCC 23 440, zum Beispiel die Mutante CBS 388.76 (GD-5), von Bacillus megatherium DSM
    32, zum Beispiel die Mutanten CBS 389.76 (GB-1003) und CBS 390.76 (GBM-13), von Zoogloea ramigera ATCC 19623, zum Beispiel die Mutante CBS 391.76 (GZ-1018), und der Stamm 35 Mycoplana rubra CBS 385.76.
  4. 4. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 gewonnenen Bakterienstämme zur Herstellung von Poly-(D-3-hydroxybuttersäure), dadurch gekennzeichnet, dass man besagte Bakterienstämme in einem wässrigen Nährmedium, 40 welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Melasse, Methanol, Äthanol, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsynthese, die Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, züchtet und die gebildete Poly-(D-3-hydroxy- 45 buttersäure) aus der Kulturbrühe isoliert.
    50
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