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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Erzeugung von Milch mit Antikarieswirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Kühe mit Streptococcus mutans zur Bildung entsprechender Antikörper immunisiert und von diesen Kühen die Milch gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Streptococcus mutans einer der Stämme AHT, BHT, 10 449 oder 6715 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Milch der gegen Streptococcus mutans immunisierten Kühe praktisch dann gewinnt, wenn der Antikörper-Titer im Serum einen Maximalwert erreicht hat.
4. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erzeugte Milch.
5. Milch gemäss Anspruch 4, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2.
6. Milch gemäss Anspruch 4, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3.
7. Verwendung der Milch nach einem der Ansprüche 4-6 zur Herstellung einer nicht der Ernährung dienenden Zubereitung mit Antikarieswirkung.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Zahnzerfall eine natürliche Folge von Mundbakterienprozessen (Streptococcus mutans) ist. Insbesondere ist bekannt, dass die Streptococcus mutans an die Zahnschmelzoberfläche der Zähne anhaften und dass unter entsprechenden Bedingungen von Temperatur, Acidität und Bakteriennährstoff-Verfügbarkeit eine Kolonisation erfolgt, wobei die Bakterienkolonie dann ihrerseits die eigentliche Kariesbildung erst im Zahnschmelz und dann in der Zahnstruktur verursacht.
Es ist bekannt, Bakterien in Kontakt mit Antikörpern zu bringen, die das Wachstum der Bakterienkolonien hemmen.
Wichtig ist dabei meist, dass der Antikörper regelmässig, vorzugsweise täglich, angewendet werden sollte, um ein wirksames Mittel gegen die Vermehrung von Streptococcus mutans darzustellen.
Die Gewinnung von Streptococcus mutans stellt kein Problem dar, weil diese Bakterienart im Mund der meisten Menschen vorhanden ist, und lediglich Ausmass oder Grad der natürlichen Widerstandsfähigkeit gegen die Bakterien unterscheidet sich von Individuum zu Individuum. Unter geeigneten Umgebungsbedingungen läuft die Kolonienbildung mit rascher Geschwindigkeit.
Es ist bekannt, dass Antikörper gegen Streptococcus mutans in Serumform aus den meisten Tieren gewonnen werden können. Zur Gewinnung eines Serum-Antikörpers wird häufig mit Kaninchen und Pferden gearbeitet.
Es ist auch bekannt, dass die Kühe wirksame Systeme zur Erzeugung von Antikörpern auf Antigene darstellen, die diesen Tieren durch Injektion verabreicht wurden. Speziell für Kühe gilt, dass nicht nur Serum-Antikörper, sondern auch Milch erzeugt wird, welche die gleichen Antikörper wie das Serum enthält. Tierserum ist kein normalerweise als Lebensmittel anzusehendes Produkt, wohingegen Kuhmilch ein Lebensmittel darstellt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis der Tatsache, dass die Kühe grosse Mengen spezifischer Antikörper gegen Streptococcus mutans in Form einer gerne genommenen Nahrung bilden können, die ohne Schaden konsumiert werden kann und die Kariesbildung inhibiert.
Die Erfindung bietet ein Verfahren zur Erzeugung von Milch, die Antikörper gegen Streptococcus mutans enthält.
Die Erfindung bietet ferner die Verwendung dieser Milch zur Herstellung einer nicht der Ernährung dienenden Zubereitung mit Antikarieswirkung.
Es wurde gefunden, dass durch Immunisieren von Kühen mit einem Streptococcus mutans-Antigen, insbesondere zu bestimmten Zeiten des gestativen Zyklus der Kuh, Kühe in ihrer Milch Antikörper gegen das Antigen erzeugen. Die Tatsache, dass der Antikörper in dem natürlichen Nahrungsmittel enthalten ist, macht dieses zu einem besonders ansprechenden wirksamen Produkt.
Erfindungsgemäss geschieht dies durch, dass man Kühe mit Streptococcus mutans zur Bildung entsprechender Antikörper immunisiert und von diesen Kühen die Milch gewinnt.
Die genaue Technik der Immunisierung von Kühen zur Erzeugung spezifischer Antikörper ist in der Veterinärkunde bekannt. Allgemein werden Kühe in zwei Stufen immunisiert. In der ersten Stufe werden meist vier Injektionen intramuskulär in Wochenabständen verabreicht. In der zweiten Immunisierungsstufe werden intramuskuläre Injektionen mit fünfzehntägigen Zwischenräumen gegeben. Die Einzelheiten der Immunisierungstechnik sind bekannte fachmännische Massnahmen.
Für das erfindungsgemässe Verfahren können Stämme von Streptococcus mutans verwendet werden, die nach üblichen Arbeitsmethoden kultiviert worden sind. In der Praxis können Kulturen von Streptococcus mutans AHT (serologische Gruppe a), BRT (Gruppe b), 10 449 (Gruppe c) und 6715 (Gruppe d) in dialysiertem Tryptosemedium zum Wachsen gebracht, die Zellen dann durch Zentrifugieren bei 4000 x g gesammelt und fünfmal mit O,lm phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, gewaschen werden. Die Zellen können dann durch Erhitzen während 30 min auf 60 "C inaktiviert und für eine Endkonzentration an Streptococcus mutans AHT, BHT, 10 449 und 6715 von 5 x 108 Zellen pro ml erneut suspendiert werden. Diese Zubereitung wird beispielsweise zum Immunisieren von zwei Kühen wie folgt verwendet.
Jede Kuh wurde in zwei gesonderten Behandlungen mit frischem Antigen aus allen vier Gruppen von Streptococcus mutans (Gruppen a, b, c und d) immunisiert. Dann wurde eine Kuh nach den üblichen Methoden zur Erzeugung von Milch immunisiert. Nach der Immunisierung wurden Blutproben der Kuh genommen, bis der Serum-Antikörper-Titer seinen Höchswert erreicht hatte, und darauf die Milch gesammelt. Die Milch wurde nach üblichen Methoden zur Herstellung von Milchpulver getrocknet und pulverisiert, das in diesem Fall Antikörper gegen Streptococcus mutans enthält. Tatsächlich wurde ein Kuhmilch-Immunoglobulin erzeugt. Dieses Produkt kann dann beispielsweise als Basiskomponente für eines der folgenden Konsumentenprodukte verwendet werden: (a) Die Trockenmilch selbst kann mit 1-5 gleichen Teilen Wasser zur Bildung eines Mundspülmittels verdünnt werden.
Das Mundspülmittel wirkt einfach dadurch, dass man den Mund täglich damit spült und dadurch die Bildung von Streptococcus mutans-Kolonien auf der Zahnschmelzoberfläche inhibiert.
(b) Das produkt kann einer zuckerfreien Süssware, z.B. in
Form eines Kaugummis, Bonbons oder einer Eiscreme oder einer anderen Nahrungsmittelform, einverleibt werden, indem man erhebliche prozentuale Anteile Immunoglobulin in das Produkt einarbeitet, beispielsweise 25% oder mehr.
(c) Das Immunoglobulin kann in übliche Zahnreinigungs mittel, z.B. Pulver oder Zahnpasten, eingearbeitet werden, wie sie von Zahnärzten verwendet oder im Handel verkauft wer den. Empfehlenswert ist ein prozentualer Anteil von minde stens 25sie CTc Milch-Immunoglobulin als Zusatz zu bekannten
Handelsprodukten, was deren Wirksamkeit erheblich verbes sert.
(d) Tatsächlich ist die rekonstituierte Milch in und von sich zur Inhibierung der Bildung von Kolonien von Streptococ
cus mutans wirksam, d. h. durch einfaches Trinken der Milch kommt es zu einem für eine wirksame Behandlung ausreichenden Kontakt zwischen den Zähnen und dem Immunoglobulin.
Die Erfindung ist primär auf die Erzeugung des Milch-Immunoglobulins und die Anwendung des Milch-Immunoglobulins auf die Zahnoberfläche gerichtet. Das Milch-Immunoglobulin kann aber auch über den Verdauungstrakt vom Blut aufgenommen und dann über den Blutstrom an die Mundhöhle abgegeben werden. Auch dies ist eine Möglichkeit, um die Antikörper der eingenommenen Milch wirksam gegen Kariesbildung auszunützen.
Zusammenfassend lässt sich aufgrund der bisher ermittelten Daten sagen, dass das erfindungsgemäss erzeugte Milch Immunoglobulin Antikörper gegen Streptococcus mutans enthält und dass diese Antikörper, wenn sie in Kontakt mit den Zähnen gebracht werden, das Wachstum von Streptococcus mutans und damit auch den Zahnzerfall inhibieren.
Zur Durchführung entsprechender Tierversuche wurde wie folgt gearbeitet:
Trächtige Rattenmuttertiere (COBS/CD-Stamm) wurden von den Charles River Laboratories (Wilmington, Mass.) beschafft. Jedes Muttertier wurde in einem sterilen Käfig gehalten und mit sterilem Wasser versorgt. Zur Unterdrückung der Bakterienflora wurde eine genau definierte Diät verwendet, die ausgewählte Antibiotika enthielt. Nach der Geburt wurde jeder Wurf auf neun Jungtiere pro Muttertier reduziert. Entsprechend der Arbeitsvorschrift wurden alle Würfe in drei Gruppen (A, B und C) geteilt. Jede Gruppe enthielt fünf Würfe mit neun Jungtieren pro Wurf oder insgesamt fünfundvierzig Jungtiere pro Gruppe. Nach der Entwöhnung (neunzehn Tage nach der Geburt) wurden die Jungtiere mit einer völlig definierten kariesfördernden Nahrung (siehe Tabelle I) gefüttert.
Die Ratten der Gruppe A erhielten die Nahrung mit Immunmilch, während die Gruppen B und C die entsprechende Nahrung mit Carnation -Trockenmilch erhielten.
Milch-Antikörpergehalt
Der Gehalt an Anti-Streptococcus mutans Antikörper in entfetter getrockneter Milch aus Kuh (1222) wurde jeweils wie folgt bewertet: 50 mg Trockenmilch wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und zu vier Sätzen von zweifachen Reihenverdünnungen mit Salzlösung angesetzt. Jedem Satz Verdünnungsrohre wurde mit Formalin getötetes Streptococcus mutans AHT, BHT, 10449 oder 6715 in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen pro ml zugesetzt. Die Rohre wurden zur Durchmischung geschüttelt und 4 Std. bei 37 C inkubiert.
Die Endpunkt-Agglutinations-Titerwerte wurden aufgezeichnet und die Rohre während 24 Std. bei 4 "C nochmals inkubiert, wonach die Titerwerte erneut aufgezeichnet wurden.
Kariesbewertung
Am Ende des Experiments (nach zweiundvierzig Tagen) wurden die Ratten gewogen und mit Hilfe einer Guillotine durch Köpfen getötet. Die Köpfe wurden zur Lockerung der weichen Gewebe 5 min. im Autoklav behandelt. Die Kinnbakken wurden herauspräpariert, gereinigt und mit 0,4 % Murexid in 70% Alkohol angefleckt. Nach dem Anbacken wurden die Molaren mit einem Zahnbohrer in zwei Hälften zerschnitten und die kariösen Befallsstellen nach der Arbeitsweise von Keyes (9) bewertet. Bisher wurden nach diesem Versuch insgesamt fünfzehn Ratten pro Gruppe analysiert. Die Bewertungsergebnisse jeder Rattengruppe wurde statistisch durch Berechnen, Standardabweichungen und Standardfehler reduziert.
Die Unterschiede der Mittelwerte wurden durch Varianzanalyse und Vergleich des Mehrfachen der Titerwerte nach dem Duncan-Test bewertet.
Ergebnisse
Milch-Antikörper-Titerwerte. Als Ergebnis verschiedener Doppeltitrationen wurden die folgenden Resultate erhalten: Verwendetes Antigen Immunmilch-Titer (Kuh 1222) S. mutans AHT 64 S. mutans BRT 1024 S. mutans 10449 < 2 S. mutans 6715 256 S. sanguis 0
Wie zu erkennen, zeigten drei der vier Stämme signifikante Agglutinintiter, doch konnten keine Antikörper gegen Streptococcus mutans 10 449 (Gruppe c) gefunden werden. Aus diesem Grunde wurden die Jungratten durch Infektion mit virulentem Streptococcus mutans AHT, BRT und 6715 (siehe Versuchsablauf) provoziert. Gegenüber einem zu Vergleichszwecken verwendeten Mundbakterienstamm, Streptococcus sanguis, konnten keine erkennbaren Antikörper festgestellt werden.
Zusammensetzung der Nahrung der Jungratten
Wie in Tabelle I gezeigt, war die verwendete Nahrung, abgesehen von der Milch, die anstelle von Protein verwendet wurde, vollständig definiert. Die Analyse von Immunmilch als auch von Camation -Trockenmiich zeigte, dass sie jeweils ungefähr 29 % Protein enthielten und wurden daher in die kariesfördernde Nahrung Nr. 305 in diesem Anteil für Lactalbumin eingesetzt. Die Jungratten wurden neunzehn Tage nach der Geburt entwöhnt und in sterile Käfige gebracht, wo sie mit der entsprechenden Nahrung bis zum fünfundvierzigsten Tag (Tötung) gefüttert wurden.
Tabelle I
Zusammensetzung von gereinigter kariesfördernder
Nahrung Nr. 305 und Nahrung Nr. 305 mit Milchsubstitut Komponenten gereinigte milch-substituierte
Nahrung Nahrung Nr. 305
Nr 305 (%) (%) Saccharose (6x pulverisiert) 5,0 5,0 Lactalbumin (Milchprotein) 20,0 20,0 (69,0)* Salzmischung ( MIT ) 3,0 3,0 Vitaminmischung 1,0 1,0 Baumwollsamenöl 3,0 3,0 Cellulose 6,0 6,0 Maisstärke 62,0 62,0 * Immunmilch und Carnation -Trockenmilch enthalten etwa 29%
Protein, was 690 g/kg erfordert, um 200 g/kg Protein zu ergeben.
Provokation mit kariogenem Streptococcus mutans
18-Std.-Kulturen von Streptococcus mutans AHT, BRT und 6715 wurden wie im Versuchsablauf dargestellt verwendet. In die Mundhöhle jeder Ratte der Gruppen A und B wurden am fünfundzwanzigsten Tag Abstriche jeder Kultur eingeführt.
Die Gruppe C diente als ungeimpfte Vergleichsgruppe. An den Tagen 26 und 27 wurden Oralabstriche von drei bis vier Ratten pro Wurf in den Gruppen A und B genommen und zur Bestätigung der Kolonienbildung auf Nährplatten mit Blut und Mitis-salivarius Agar gezüchtet. In jedem Fall konnten Streptococcus mutans AHT, BRT und 6715 wieder isoliert werden.
Zusätzliche Abstriche, die an bestimmten getöteten Tieren (Tag 45) genommen wurden, zeigten ebenfalls positive Kulturen dieser drei Stämme, was auf eine andauernde Kolonienbildung von Streptococcus mutans hindeutet. Versuchsablauf
EMI3.1
<SEP> Tag
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> |
<tb> <SEP> -21 <SEP> 0 <SEP> 19 <SEP> 25
<tb> <SEP> Geburt <SEP> entwöhnt <SEP> Provokation
<tb> Mutter- <SEP> |
<tb> tiere <SEP> Träachtigkeit <SEP> Säaugezeit
<tb> <SEP> Futter: <SEP> gereingte <SEP> Nahrung <SEP> Nr. <SEP> 425
<tb> Jungtiergruppen
<tb> <SEP> S.mutans <SEP> AHT.
<tb>
<SEP> BHT, <SEP> 6715
<tb> A <SEP> |
<tb> <SEP> ernährt <SEP> mit <SEP> gereinigter <SEP> Nahrung <SEP> Nr. <SEP> 305
<tb> <SEP> mit <SEP> Immunmilch
<tb> <SEP> S. <SEP> mutans <SEP> AHT,
<tb> <SEP> BHT, <SEP> 6715
<tb> B <SEP> |
<tb> <SEP> ernährt <SEP> mit <SEP> gereinigter <SEP> Nahrung <SEP> Nr. <SEP> 305
<tb> <SEP> mit <SEP> Camation -Mich
<tb> <SEP> keine
<tb> <SEP> |
<tb> <SEP> ernährt <SEP> mit <SEP> gereinigter <SEP> Nahrung <SEP> Nr. <SEP> 305
<tb> <SEP> mit <SEP> Carnation -Mich
<tb> C
<tb> geimpften keimfreien Ratten erhalten wird. Bereits aufgrund der hier berichteten Ergebnisse kann gesagt werden, dass die mit Immunmilch ernährten Tiere signifikant weniger Kariesläsionen aufwiesen als die Ratten, deren Nahrung als Milchanteil in der Nahrung nur Carnation enthielt und die mit Streptococcus mutans provoziert worden waren.
Die Ernährung ist im übrigen an diesem Resultat nicht beteiligt, da sich das mittlere Gewicht der Ratten aus den drei Gruppen nicht signifikant unterschied.
Zusammenfassend zeigen die Tierversuche
1. Trockenmilchpulver kann anstelle von Protein in der sonst vollständig definierten kariesfördernden Nahrung Nr.
305 verwendet werden. In Gegenwart von virulentem Streptococcus mutans entwickeln sich Kariesläsionen, insbesondere in den Furchen.
2. Nach Injizieren von Kühen mit Streptococcus mutans Antigen können signifikante Anteile an agglutinierenden Antikörpern in der Kuhmilch festgestellt werden.
3. Wenn Milch von immunisierten Kühen in im übrigen definierte, kariesfördernde Nahrung eingeführt wird, führt dies zum Schutz gegen Karies, insbesondere in den Furchenregionen der Zähne.
Allgemein bietet die Erfindung unter anderem Kuhmilch Immunoglobulin, das Antikörper enthält, die gegen Streptococcus mutans-Antigen bzw. -Antigene spezifisch sind, und in einem entsprechenden, beispielsweise pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Kariesbekämpfung verwendet werden kann. z. B. als Zahnpaste, die als Zusatz das obige Kuhmilch Immunoglobulin enthält, oder als entsprechend zusammengesetztes Mundspülmittel. Zuckerfreie Süsswaren werden vorzugsweise mit mindestens 25 % der oben beschriebenen Antikörper versehen, wobei die Süssware als pharmazeutisch annehmbarer Träger dient.
Ferner können zuckerfreie natürliche Lebensmittelprodukte mit mindestens 25 % des oben beschriebenen Immunoglobulins versehen werden, wobei das Lebensmittelprodukt der pharmazeutisch annehmbare Träger ist. Man kann ferner auch handelsübliche Zahnpulver mit mindestens 25 % des oben beschriebenen Immunoglobulins versehen, wobei der restliche Teil des Zahnpulvers als pharmazeutisch annehmbarer Träger dient.
Tiergewichte und Kariesbewertung
Die Ergebnisse der Kariesbewertungen von fünfzehn Ratten jeder Gruppe sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II
Mittlere Karieswerte und Körpergewichte junger Ratten, die mit virulentem S. mutans AHT, BRT und 6715 infiziert und mit gereinigter kariesfördernder Nahrung Nr. 305 gefüttert wurden, die entweder Immunmilch oder Carnation
Trockenmilch enthält Gruppe Mittlere Karieswertea Mittleres
Schmelz Dentin Körpergewicht (g) A 1,8 + 0,5 0,5 + 0,2 116 (Immun-Trockenmilch, infiziert) (l7%)b (8%) B 10,8 6,2+0,8 110 ( Carnation Trockenmilch, infiziert) (100%) (100%) C 0,9+0,5 0,1+0,1 114 ( Carnation Trockenmilch, keine Infektion) (8%) (2%) "bewertet nach der Keyes-Methode (9). Werte + Standardfehler.
Gruppen A und C sind signifikant von Gruppe B (p 3 0,001) verschieden. Gruppen A und C sind nicht signifikant verschieden.
b Karieswerte der Gruppen A und C, ausgedrückt in Prozent der Karieswerte von Gruppe B.
Aus diesen Daten ist klar zu erkennen, dass der Immunschutz bei Ratten auftritt, die Nahrung erhalten hatten, welche Milch aus immunisierten Kühen enthielt. Dabei sind noch zwei an dere Punkte wesentlich: (1) zunächst traten bei diesem Ver such die meisten Läsionen in den Sulci, den Zahnrillen, auf, einem Gebiet, von dem man annimmt, dass dort durch Kom paktnahrung zusammen mit Kariogenen die Kariesläsionen ausgelöst werden. (2) Die zur Kontrolle verwendeten und nicht provozierten Ratten entwickeln praktisch keine Karies, was eine Basislinie darstellt, die normalerweise nur bei nicht
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. A method for producing milk with anti-caries action, characterized in that cows are immunized with Streptococcus mutans to form corresponding antibodies and the milk is obtained from these cows.
2. The method according to claim 1, characterized in that one of the strains AHT, BHT, 10 449 or 6715 is used as Streptococcus mutans.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the milk of the cows immunized against Streptococcus mutans is practically obtained when the antibody titer in the serum has reached a maximum value.
4. Milk produced by the method according to claim 1.
5. Milk according to claim 4, produced by the method according to claim 2.
6. Milk according to claim 4, produced by the method according to claim 3.
7. Use of the milk according to any one of claims 4-6 for the production of a non-nutritional preparation with anti-caries action.
Recent studies have shown that tooth decay is a natural consequence of oral bacteria processes (Streptococcus mutans). In particular, it is known that the Streptococcus mutans adhere to the enamel surface of the teeth and that colonization takes place under appropriate conditions of temperature, acidity and bacterial nutrient availability, the bacterial colony then in turn causing the actual caries formation first in the enamel and then in the tooth structure.
It is known to bring bacteria into contact with antibodies that inhibit the growth of the bacterial colonies.
It is usually important that the antibody should be used regularly, preferably daily, in order to be an effective means against the multiplication of Streptococcus mutans.
Obtaining Streptococcus mutans is not a problem because this type of bacteria is present in most people's mouths, and only the extent or degree of natural resistance to the bacteria differs from individual to individual. Under suitable environmental conditions, colonies form at a rapid rate.
It is known that antibodies to Streptococcus mutans can be obtained in serum form from most animals. Rabbits and horses are often used to obtain a serum antibody.
The cows are also known to be effective systems for generating antibodies to antigens that have been injected into these animals. It is especially true for cows that not only serum antibodies are produced, but also milk that contains the same antibodies as the serum. Animal serum is not normally a food product, whereas cow's milk is a food product.
The present invention is based on the knowledge that the cows can form large amounts of specific antibodies against Streptococcus mutans in the form of a popular food, which can be consumed without damage and which inhibits caries formation.
The invention provides a method for producing milk containing antibodies to Streptococcus mutans.
The invention further provides the use of this milk for the manufacture of a non-nutritional anti-caries preparation.
It has been found that by immunizing cows with a Streptococcus mutans antigen, particularly at certain times in the cow's gestative cycle, cows produce antibodies to the antigen in their milk. The fact that the antibody is contained in the natural food makes it a particularly appealing, effective product.
According to the invention, this is done by immunizing cows with Streptococcus mutans to form appropriate antibodies and extracting the milk from these cows.
The exact technique of immunizing cows to produce specific antibodies is known in veterinary science. Generally, cows are immunized in two stages. In the first stage, four injections are usually given intramuscularly at weekly intervals. In the second stage of immunization, intramuscular injections are given every fifteen days. The details of the immunization technique are well-known professional measures.
Strains of Streptococcus mutans which have been cultivated according to customary working methods can be used for the process according to the invention. In practice, cultures of Streptococcus mutans AHT (serological group a), BRT (group b), 10 449 (group c) and 6715 (group d) can be grown in dialyzed tryptose medium, the cells then collected by centrifugation at 4000 xg and five times with O, l in phosphate-buffered saline, pH 7.0. The cells can then be inactivated by heating at 60 ° C. for 30 minutes and resuspended for a final concentration of Streptococcus mutans AHT, BHT, 10 449 and 6715 of 5 × 108 cells per ml. This preparation is used, for example, to immunize two cows such as follows used.
Each cow was immunized in two separate treatments with fresh antigen from all four groups of Streptococcus mutans (groups a, b, c and d). Then a cow was immunized using the usual methods for producing milk. After immunization, blood samples were taken from the cow until the serum antibody titer reached its peak and the milk was then collected. The milk was dried and pulverized according to the usual methods for producing milk powder, which in this case contains antibodies against Streptococcus mutans. In fact, cow's milk immunoglobulin was produced. This product can then be used, for example, as a base component for one of the following consumer products: (a) The dry milk itself can be diluted with 1-5 equal parts of water to form a mouthwash.
The mouthwash works simply by rinsing the mouth with it daily and thereby inhibiting the formation of Streptococcus mutans colonies on the surface of the tooth enamel.
(b) The product can be a sugar-free confectionery, e.g. in
Form of chewing gum, candy or ice cream or other food form, by incorporating substantial percentages of immunoglobulin into the product, for example 25% or more.
(c) The immunoglobulin can be used in conventional dentifrices, e.g. Powder or toothpaste can be incorporated as used by dentists or sold commercially. A percentage of at least 25 you CTc milk immunoglobulin is recommended as an addition to known
Commercial products, which significantly improves their effectiveness.
(d) In fact, the reconstituted milk is in and of itself to inhibit the formation of streptococ colonies
cus mutans effective, d. H. simply drinking the milk results in adequate contact between the teeth and the immunoglobulin for effective treatment.
The invention is primarily directed to the production of milk immunoglobulin and the application of milk immunoglobulin to the tooth surface. The milk immunoglobulin can also be absorbed by the blood through the digestive tract and then released to the oral cavity via the bloodstream. This is also a way to effectively use the antibodies in milk taken against caries formation.
In summary, based on the data determined so far, it can be said that the milk produced according to the invention contains immunoglobulin antibodies against Streptococcus mutans and that these antibodies, when brought into contact with the teeth, inhibit the growth of Streptococcus mutans and thus also tooth decay.
The following work was carried out to carry out corresponding animal experiments:
Pregnant rat dams (COBS / CD strain) were purchased from Charles River Laboratories (Wilmington, Mass.). Each mother animal was kept in a sterile cage and supplied with sterile water. A well-defined diet containing selected antibiotics was used to suppress the bacterial flora. After birth, each litter was reduced to nine hatchlings per mother. In accordance with the working instructions, all litters were divided into three groups (A, B and C). Each group contained five litters with nine pups per litter, or a total of forty-five pups per group. After weaning (nineteen days after birth), the young animals were fed a fully defined caries-promoting diet (see Table I).
The rats of group A received the diet with immune milk, while the groups B and C received the corresponding diet with Carnation dry milk.
Milk antibody content
The anti-Streptococcus mutans antibody content in defatted dried milk from cow (1222) was evaluated as follows: 50 mg of dry milk were dissolved in 1 ml of distilled water and made up to four sets of two-fold serial dilutions with saline. Streptococcus mutans AHT, BHT, 10449 or 6715, killed with formalin, was added to each set of dilution tubes at a concentration of 2 x 108 cells per ml. The tubes were shaken to mix and incubated at 37 C for 4 hours.
The endpoint agglutination titer values were recorded and the tubes were incubated again at 4 "C for 24 hours after which the titer values were recorded again.
Caries assessment
At the end of the experiment (after forty-two days), the rats were weighed and killed using a guillotine. The heads were loosened for 5 min to loosen the soft tissue. treated in an autoclave. The chin pads were dissected out, cleaned and stained with 0.4% murexide in 70% alcohol. After baking, the molars were cut in half with a dental drill and the carious infestations were assessed according to the method of Keyes (9). So far, fifteen rats per group have been analyzed after this experiment. The evaluation results of each group of rats were statistically reduced by calculation, standard deviations and standard errors.
The differences in the mean values were assessed by analysis of variance and comparison of the multiple of the titer values according to the Duncan test.
Results
Milk antibody titer values. As a result of various double titrations, the following results were obtained: Antigen used in immune milk titer (cow 1222) S. mutans AHT 64 S. mutans BRT 1024 S. mutans 10449 <2 S. mutans 6715 256 S. sanguis 0
As can be seen, three of the four strains showed significant agglutinin titers, but no antibodies to Streptococcus mutans 10 449 (group c) were found. For this reason, the young rats were provoked by infection with virulent Streptococcus mutans AHT, BRT and 6715 (see experimental procedure). No detectable antibodies were found against a strain of oral bacteria, Streptococcus sanguis, which was used for comparison purposes.
Composition of the young rats' diet
As shown in Table I, the food used was fully defined except for the milk used in place of protein. Analysis of immune milk as well as camation dry milk showed that they each contained approximately 29% protein and were therefore used in caries-promoting food no. 305 in this proportion for lactalbumin. The young rats were weaned nineteen days after birth and placed in sterile cages, where they were fed the appropriate food until the forty-fifth day (killing).
Table I
Composition of cleaned caries-promoting
Food No. 305 and Food No. 305 milk-substituted with milk substitute components
Food Food No. 305
No. 305 (%) (%) sucrose (6x powdered) 5.0 5.0 lactalbumin (milk protein) 20.0 20.0 (69.0) * salt mixture (MIT) 3.0 3.0 vitamin mixture 1.0 1 , 0 cottonseed oil 3.0 3.0 cellulose 6.0 6.0 corn starch 62.0 62.0 * immune milk and Carnation dry milk contain about 29%
Protein, which requires 690 g / kg to make 200 g / kg protein.
Provocation with cariogenic Streptococcus mutans
18 hour cultures of Streptococcus mutans AHT, BRT and 6715 were used as shown in the experimental procedure. Smears of each culture were introduced into the oral cavity of each group A and B rat on the twenty-fifth day.
Group C served as the unvaccinated control group. On days 26 and 27, oral swabs from three to four rats per litter were taken in groups A and B and cultured with blood and Mitis-salivarius agar to confirm the formation of colonies. In any case, Streptococcus mutans AHT, BRT and 6715 could be isolated again.
Additional smears taken on certain sacrificed animals (day 45) also showed positive cultures of these three strains, suggesting continued colony formation of Streptococcus mutans. Test procedure
EMI3.1
<SEP> day
<tb> <SEP> | <SEP> | <SEP> | <SEP> |
<tb> <SEP> -21 <SEP> 0 <SEP> 19 <SEP> 25
<tb> <SEP> birth <SEP> weaned <SEP> provocation
<tb> mother <SEP> |
<tb> animals <SEP> pregnancy <SEP> suckling time
<tb> <SEP> food: <SEP> cleaned <SEP> food <SEP> no. <SEP> 425
<tb> groups of young animals
<tb> <SEP> S.mutans <SEP> AHT.
<tb>
<SEP> BHT, <SEP> 6715
<tb> A <SEP> |
<tb> <SEP> feeds <SEP> with <SEP> cleaned <SEP> food <SEP> no. <SEP> 305
<tb> <SEP> with <SEP> immune milk
<tb> <SEP> S. <SEP> mutans <SEP> AHT,
<tb> <SEP> BHT, <SEP> 6715
<tb> B <SEP> |
<tb> <SEP> feeds <SEP> with <SEP> cleaned <SEP> food <SEP> no. <SEP> 305
<tb> <SEP> with <SEP> Camation -Mich
<tb> <SEP> none
<tb> <SEP> |
<tb> <SEP> feeds <SEP> with <SEP> cleaned <SEP> food <SEP> no. <SEP> 305
<tb> <SEP> with <SEP> Carnation -Mich
<tb> C
<tb> vaccinated aseptic rats is obtained. Based on the results reported here, it can be said that the animals fed with immune milk had significantly fewer caries lesions than the rats whose diet contained only Carnation as part of the milk and which had been provoked with Streptococcus mutans.
The diet was not involved in this result, since the mean weight of the rats from the three groups did not differ significantly.
In summary, the animal experiments show
1. Dry milk powder can be used instead of protein in the otherwise fully defined caries-promoting food no.
305 can be used. In the presence of virulent Streptococcus mutans, caries lesions develop, especially in the furrows.
2. After injecting cows with Streptococcus mutans antigen, significant amounts of agglutinating antibodies can be found in the cow's milk.
3. If milk from immunized cows is introduced into otherwise defined, caries-promoting food, this leads to protection against caries, especially in the furrow regions of the teeth.
In general, the invention provides, inter alia, cow's milk immunoglobulin, which contains antibodies which are specific for Streptococcus mutans antigen or antigens, and which can be used in a corresponding, for example pharmaceutically acceptable carrier for combating caries. e.g. B. as toothpaste, which contains the above cow's milk immunoglobulin as an additive, or as an appropriately composed mouthwash. Sugar-free confectionery is preferably provided with at least 25% of the antibodies described above, the confectionery serving as a pharmaceutically acceptable carrier.
Furthermore, sugar-free natural food products can be provided with at least 25% of the immunoglobulin described above, the food product being the pharmaceutically acceptable carrier. Commercially available tooth powder can also be provided with at least 25% of the immunoglobulin described above, the remaining part of the tooth powder serving as a pharmaceutically acceptable carrier.
Animal weights and caries assessment
The caries scores of fifteen rats from each group are summarized in Table II below.
Table II
Mean caries and body weights of young rats infected with virulent S. mutans AHT, BRT and 6715 and fed with purified caries-promoting food No. 305, which is either immune milk or Carnation
Dry milk contains group Medium caries values Medium
Enamel dentine body weight (g) A 1.8 + 0.5 0.5 + 0.2 116 (immune dry milk, infected) (l7%) b (8%) B 10.8 6.2 + 0.8 110 (Carnation dry milk, infected) (100%) (100%) C 0.9 + 0.5 0.1 + 0.1 114 (Carnation dry milk, no infection) (8%) (2%) "rated according to the Keyes Method (9) .Values + standard error.
Groups A and C are significantly different from group B (p 3 0.001). Groups A and C are not significantly different.
b Caries values in groups A and C, expressed as a percentage of caries values in group B.
From these data, it can be clearly seen that immune protection occurs in rats that have received food containing milk from immunized cows. Two other points are essential here: (1) Initially, most of the lesions in the sulci, the tooth grooves, occurred in this test, an area which is believed to cause caries lesions there through compact food together with cariogens . (2) The rats used for control and not provoked develop practically no caries, which is a baseline that is normally only found in non-caries