CA3160242A1 - Utilisation de saccharides de dattes seuls ou en melange avec des polyphenols pour proteger les plantes contre des pathogenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de saccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pour la protection des plantes contre des pathogènes. En particulier, selon l'invention, un tel extrait est utilisé pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité élicitrice des mécanismes de défense.

Description

UTILISATION DE SACCHARIDES DE DATTES SEULS OU EN MELANGE AVEC DES POLYPHENOLS
POUR
PROTEGER LES PLANTES CONTRE DES PATHOGENES
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique des produits de protection agronomique ou agricole et a pour objet l'utilisation d'un extrait de saccharides, ou d'un mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pour protéger les plantes contre les pathogènes, en particulier pour stimuler les défenses naturelles des plantes et développer leur résistance contre des pathogènes.
Les plantes font l'objet d'attaques régulières de pathogènes avec pour conséquences des dommages importants pour les récoltes, voire des pertes totales de récoltes. Le mildiou de la vigne, par exemple, est une maladie provoquée par un oomycète, Plasmopara viticola, qui occasionne chaque année de nombreuses pertes et qui est susceptible de faire son apparition partout dans le monde. La prévention est nécessaire et nécessite la mise en place de traitements réguliers tout au long de l'année. D'autres pathogènes, tels que des champignons ou des insectes, sont également redoutés dans les milieux agronomiques et horticoles.
La lutte contre ces pathogènes implique souvent l'utilisation de produits issus de l'industrie chimique pour la mise en place des réactions de défense et de résistance de la plante nécessaires au maintien de la culture et du rendement. Cependant, si de tels traitements sont efficaces, l'impact de ces produits sur l'environnement et la santé des consommateurs est inquiétant. Par ailleurs, de tels traitements ne sont pas compatibles avec l'agriculture biologique.
Ainsi, depuis plusieurs années déjà, l'utilisation de substances d'origine naturelle à titre d'agents protecteurs des plantes contre les pathogènes a fait l'objet de recherches.
Ces substances peuvent être d'origine végétale, animale, ou minérale. Elles possèdent généralement une durée de vie courte ce qui limite leur présence dans les produits alimentaires et dans l'environnement. Elles peuvent agir de différentes façons, par exemple en stimulant les défenses naturelles de la plante ou en agissant directement sur une population de pathogènes pour inhiber sa croissance et son développement.
A titre de composés agissant en déclenchant les mécanismes de défenses de la plante, on citera par exemple la laminarine extraite des algues brunes ou encore l'extrait de marc de raisin.
Les plantes ne possèdent pas de système immunitaire équivalent à celui des humains et des animaux, cependant elles sont capables de mettre en place des mécanismes de défenses qui peuvent être induits par des composés agissant comme des signaux sur les gènes de défense pour déclencher la synthèse de molécules anti-pathogènes ou de molécules aptes à renforcer structurellement la plante.
De tels composés sont dits éliciteurs.
Ainsi, si l'on met une plante en contact avec un composé éliciteur avant qu'elle ne soit en contact avec un pathogène, la plante sera en quelque sorte immunisée contre ce pathogène.
Les éliciteurs sont donc extrêmement intéressants dans la lutte contre les pathogènes de plantes.

2 EXPOSE DE l'INVENTION
Ainsi, le besoin de proposer des composés d'origine naturelle, respectueux de l'environnement, des cultures et de la santé, pour la protection des plantes, est aujourd'hui au c ur des préoccupations.
En particulier, il existe un besoin d'identifier et de proposer de tels composés qui présentent une activité de stimulation du système de défense des plantes contre les pathogènes et d'inhibition de la croissance et du développement des pathogènes.
C'est dans ce contexte que la société déposante a travaillé et démontré que des composés issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pouvaient protéger les plantes contre les pathogènes, en particulier pouvaient induire et stimuler les réactions de défense des plantes contre les pathogènes.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix clactylifera pour la protection des plantes contre des pathogènes.
En particulier selon l'invention, un tel extrait est utilisé pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité
élicitrice des mécanismes de défense.
Les dattes peuvent être considérées comme une source intéressante de composés à activités biologiques variées. En outre, une part importante de la production de dattes est transformée en produits dérivés, tels que des confitures, des jus et des sirops. Par conséquent, une grande quantité
de noyaux de dattes et de fruits non commercialisés est produite comme un déchet qui peut être valorisé sur la base de sa teneur élevée en composés bioactifs tels que les polysaccharides.
En effet, un extrait de saccharides dans le cadre de l'invention peut comprendre une quantité de saccharides supérieure ou égale à 40%, 50% ou encore 60%, en poids de l'extrait.
Selon une caractéristique de l'invention, les saccharides contiennent du rhamnose, de l'arabinose, du fucose, du xylose, du mannose, du galactose, de l'acide galacturonique, du glucose et/ou de l'acide glucuronique.
Les saccharides, au sens de l'invention, sont des monosaccharides, des oligosaccharides ou des polysaccharides. Préférentiellement, il s'agira de polysaccharides.
Les polysaccharides sont des composés organiques abondants dans la nature. Ce sont des homo ou hétéropolymères formés par l'enchaînement linéaire ou ramifié d'oses.
Les polysaccharides que l'on trouve chez la datte sont la cellulose, la pectine et les hémicelluloses.
Ces polysaccharides font partie de la catégorie des fibres alimentaires et sont divisés en deux groupes : les fibres solubles, ou hydrosolubles, comprenant les pectines et certaines hémicelluloses, et les fibres insolubles, non solubles dans l'eau, comprenant la cellulose et certaines autres hémicelluloses.
Les saccharides, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, sont les polysaccharides naturellement hydrosolubles ou un mélange de tels polysaccharides avec des hydrolysats de polysaccharides naturellement non hydrosolubles.
En effet, l'extraction menée sur les fruits de dattes permet l'obtention d'une fraction enrichie en polysaccharides solubles et insolubles. Les polysaccharides initialement insolubles peuvent être valorisés dans le cadre de l'invention une fois rendu hydrosolubles, notamment après la mise en uvre d'une méthode d'hydrolyse enzymatique ou chimique, par exemple par hydrolyse acide.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides contient, en poids :

3 au moins 20% de mannose, au moins 7% d'arabinose, au moins 6 % de glucose, au moins 5% de galactose.
Cet extrait de saccharides est obtenu généralement à partir du noyau des fruits de dattes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides contient, en poids :
au moins 40% d'acide galacturonique, au moins 7% d'arabinose, au moins 3% de xylose.
Cet extrait de saccharides est obtenu quant à lui à partir des tissus de peau et de pulpe des fruits de dattes.
Comme le démontreront les exemples qui suivent, les polysaccharides extraits de datte présentent un effet inducteur des défenses naturelles des plantes très élevé. En particulier, ils permettent d'induire les gènes les plus représentatifs des protéines PR (Pathogenesis Related) impliquées dans les réactions de défense des plantes. Ils constituent donc de bons agents de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes.
Les protéines PR s'accumulent dans les tissus d'une plante en réponse à un stress biotique ou abiotique, ou suite à l'application d'un produit inducteur des défenses.
Chaque protéine PR possède sa propre fonction. Elles s'accumulent à un niveau local et systémique et leur présence est un indicateur de la mise en place des mécanismes de défense par la plante.
Les protéines PR1 seraient impliquées dans la séquestration des stérols. Elles auraient une action anti-fongique et anti-oomycète, à travers l'inhibition de la croissance et la germination des spores, notamment vis-à-vis du mildiou et de la pourriture grise de la tomate (Niderman et al., 1995; Garnir et al., 2016). Elles auraient également une action favorable dans la résistance à la sécheresse (Liu et al., 2013).
Les protéines PR2 ont une action glucanase glucanases), responsable de la dégradation du glucane, constituant polysaccharidique majeur de la paroi des champignons (Benhamou, 2009). La PR2 est induite en réponse à la voie de l'acide salycilique. La PR2 est une protéine qui peut être impliquée également dans les tolérances aux stress abiotiques comme celui de la sécheresse (Liu et al., 2013).
Les protéines PR3 ont une activité chitinase. Elles ont un effet antimicrobien direct à travers la dégradation de la paroi fongique et un effet indirect via la libération éventuelle de fragments inducteurs des gènes de défense (Benhamou, 2009).
Les protéines PR4 ont montré notamment une activité ribonucléase et chitinase.
Des études chez le blé ont suggéré une activité anti-fongique contre Fusarium culmorun (Bertini et al., 2009; Caruso et al., 2001; Filipenko et al., 2013). Une autre étude a rapporté une activité
antifongique possible chez le maïs (Bravo et al., 2003). La PR4 est une protéine qui semble être activée à la fois par les voies SA
et JA (Bertini et al., 2003; Wang et al., 2011).
Les protéines PRS sont des protéines Thaumatin like avec une activité
contre les oomycètes mais aussi contre les Verticillium, Fusarium, et les champignons nécrotrophes.
Cette protéine permet aussi d'induire une tolérance à la sécheresse (Liu et al., 2013).

4 Les protéines PR8 présentent une action antibactérienne à travers une activité
lysosomale et antifongique, en catalysant l'hydrolyse de la chitine des parois fongiques et en inhibant la croissance des hyphes. De par leur action de dégradation, elles seraient à l'origine de la production d'éliciteurs endogènes, déclenchant ainsi la mise en place de réactions de défense au sein de la plante attaquée (Métraux et al., 1988).
Les protéines PR14, sont des protéines de transfert lipidique, exprimées dans les jeunes feuilles et semblent avoir un rôle dans le transport de monomères de cutines ; elles sont associées à
l'assemblage de la cutine et de la cire (Sels et al., 2008). Elles ont des propriétés antimicrobiennes, par exemple contre les Pseudomonas, Fusarium, Pythium et Botrytis (Kido et al., 2010).
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait contient, de plus, au moins 5 %, en poids, de protéines, préférentiellement au moins 10%, plus préférentiellement entre 5 et 15%.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de saccharides hydrosolubles est un mélange avec un extrait de polyphénols également issu de fruits du dattier Phoenix clactylifera.
Le mélange se trouvera sous la forme d'une composition.
Les polyphénols sont des composés antioxydants spécifiques du règne végétal, et dotés de diverses activités biologiques démontrées par de nombreuses études décrites dans la littérature scientifique.
On citera notamment leur activité antioxydante, anti-inflammatoire, antimicrobienne, antivirale ou encore anticancéreuse.
Avantageusement selon l'invention, le ratio saccharides / polyphénols est compris entre 30/70 et 70/30, exprimé en poids.
Les polyphénols sont présents dans tous les organes de la plante. Ils présentent une très grande variété de structures. Ainsi, ils se répartissent dans différentes familles :
Les acides phénoliques, tels que les dérivés de l'acide hydroxy-benzoïque et les dérivés de l'acide cinnamique, Les flavonoïdes tels que les flavan-3-ols, dont les catéchines et les tanins, et les flavones, dont les flavonols.
Le fruit du dattier comprend trois tissus : le noyau, la pulpe et la peau. Il évolue également selon quatre stades de maturité : Hababouk, Blah (Kimri), Besser (Khalal) et Tamar.
La sélection du fruit en fonction de l'un de ces stades, et en fonction des tissus, permet d'obtenir des résultats différents en terme de teneur en polyphénols.
Avantageusement, l'extrait de polyphénols contient jusqu'à 80% de polyphénols, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec.
Préférentiellement, l'extrait de polyphénols contient au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
Les tanins condensés dans l'extrait selon l'invention sont des oligomères ou des polymères de pro-anthocyanidines.
L'extrait peut être plus ou moins concentré en polyphénols en fonction du tissu et du stade de maturité mais également en fonction de la méthode d'extraction. Ces choix pourront être guidés par les exemples qui suivent.

5 Selon un mode de réalisation de l'invention, une quantité efficace de l'extrait de saccharides, ou du mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, apportée aux plantes est d'au moins 0,01 g par litre, préférentiellement d'au moins 0,1 g par litre, plus préférentiellement d'au moins 0,7 g par litre, pour un apport sous forme liquide, ou d'au moins 10 g par hectare, préférentiellement d'au moins 100 g par hectare pour un apport sous forme solide.
La quantité efficace doit être suffisante pour induire des mécanismes de défense et de résistance et varie d'une plante à l'autre ou en fonction de la méthode de traitement. Cette quantité pourra être déterminée facilement par un homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides, ou le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, est appliqué à la plante entière, aux feuilles, aux fleurs, aux racines, aux fruits, aux graines, aux semis, au sol, au milieu de culture solide ou liquide, au matériel de culture.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application est réalisée par arrosage, irrigation, pulvérisation, trempage ou injection.
Selon une caractéristique de l'invention, les plantes sont des plantes agronomiques, ornementales, aromatiques ou médicinales, en particulier, les plantes sont des plants fruitiers, en particulier des vignes, des plants de légumes, des fleurs, des arbres, des arbustes.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les pathogènes de plantes sont des champignons, des bactéries, des virus, des nématodes, des plantes parasites, des protozoaires ou des insectes, en particulier Plasmopora viticola.
En effet, comme le démontreront les exemples qui suivent, le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols s'est particulièrement montré efficace contre le pathogène responsable du mildiou de la vigne.
L'invention concerne encore une méthode de protection d'une plante contre des pathogènes, en particulier pour activer des réactions de défense et de résistance de la plante, la méthode comprenant l'application à ladite plante, ou dans l'environnement de la plante, d'une quantité
efficace d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols issu de ce même dattier, les extraits étant tels que décrits précédemment et appliqués de la même manière que mentionnée précédemment.
L'invention concerne encore un produit phytosanitaire contenant une quantité
efficace d'un extrait de saccharides issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce même dattier, les extraits étant tels que décrits précédemment.
Selon un mode de réalisation, le produit phytosanitaire comprend, de plus, au moins un autre composant tel qu'un solvant, un tensioactif, un émulsifiant, un agent dispersant, une charge, un composé fertilisant ou un composé phytosanitaire.
Avantageusement, le produit phytosanitaire se présente sous une forme liquide, sous forme de gel, sous forme de poudre ou de granulés.
EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION

6 Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation.
Matériel végétal :
Toutes les variétés de dattes peuvent être utilisées. Les fruits peuvent être sélectionnés selon l'un ou l'autre des quatre stades de maturité suivants : Hababouk (stade 1), Blah (Kimri) (stade 2), Besser (Khalal) (stade 3), Tamar (stade 4). Les tissus, c'est-à-dire la peau, la pulpe et le noyau, sont séparés les uns des autres. Après une opération de broyage, les tissus sont séchés et réduits en poudre. Il convient de noter qu'au stade 1 de maturation, le fruit est étudié entièrement sans séparation des tissus car le noyau n'est pas encore formé.
Exemple 1 Obtention d'extraits de polysaccharides hydrosolubles Les extraits de saccharides peuvent être obtenus à partir des poudres de tissus selon un procédé
consistant à extraire dans un premier temps la matière insoluble à l'alcool (M
IA) puis, dans un second temps, à purifier les saccharides hydrosolubles, en particulier les polysaccharides, à partir de cette matière. Bien entendu, d'autres méthodes d'extraction peuvent être mises en oeuvre.
a) Obtention des matières insolubles à l'alcool :
La MIA est obtenue à l'aide du procédé ci-dessous :
= Etape d'extraction : la poudre de dattes est dispersée dans une solution d'éthanol (96 % + 1 % HCI) (V/P) préalablement portée à ébullition. Après agitation, les mélanges sont immédiatement refroidis et placés à 4 C pendant une nuit, = Etape de filtration, = Etape de rinçage par éthanol (65 % + 1 % HCI), = Etape de filtration, = Etape de rinçage avec l'acétone, = Séchage à l'étuve à 4.5 C, = Obtention d'une poudre contenant des polysaccharides.
Il convient de noter qu'en fonction des tissus et du stade de maturité du fruit, les pourcentages de matières insolubles à l'alcool varient mais peuvent atteindre près de 90%, en poids de matière fraîche.
b) Procédé de purification des polysaccharides hydrosolubles à partir de la MIA :
= Agitation des poudres obtenues en (a) dans de l'eau acidifiée à 1%
d'acide acétique, = Centrifugation, = Lyophilisation de surnageant pour obtenir une fraction contenant les fibres solubles sous forme d'une poudre,

7 = Le résidu, c'est à dire la fraction contenant les fibres insolubles, est passé à l'étuve à 45 C
pour séchage.
c) Détermination de la composition massique des monosaccharides des MIA et des fractions de polysaccharides solubles et insolubles obtenues à partir des MIA:
La détermination de la composition massique en monosaccharides neutres et acides est réalisée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (en anglais Gas chromatography-mass spectrometry ou GC-MS). Cette analyse est réalisée sur les MIA obtenues des noyaux et sur les fractions solubles issues des MIA des tissus de peau, de pulpe et de noyaux ainsi que sur les fractions insolubles issues des MIA de noyaux.
Les analyses par GC-MS des sucres simples constitutifs des structures polysaccharidiques des MIA
nous montrent une grande variabilité des quantités de polysaccharides en fonction des fractions issues de pulpe, de peau ou de noyaux.
Les résultats sont consignés dans le tableau 1 suivant dans lequel les unités sont exprimées en g/mg.
Tableau 1 Ech Ara Rha Fuc Xyl Man Gal GalA Glc GIcA Total MIA 20,080 11,654 11,723 19,976 267,786 25,120 15,741 8,108 6,708 386,895 FSN 71,679 10,582 11,604 13,455 252,771 57,996 9,616 62,852 8,379 498,934 FSC 74,696 20,724 12,902 31,348 7,072 30,069 468,936 15,518 6,426 667,690 FISN 16,183 10,000 9,806 17,524 291,122 26,061 12,459 8,209 5,743 397,108 Rha : rhamnose ; Ara : arabinose ; Fuc : fucose ; Xyl : xylose ; Man :
mannose; Gal : galactose ; GalA :
acide galacturonique, Glc : glucose, GIcA : acide glucuro nique.
MIA : fraction de Matières Insolubles à l'Alcool issue du noyau ; FSN :
fraction de polysaccharides solubles obtenue à partir de MIA de noyaux ; FSC fraction de polysaccharides solubles obtenue à
partir de MIA de pulpes et de peaux ; FISN :fraction de polysaccharides insolubles obtenue à partir de MIA de noyaux.
Ainsi, la fraction de polysaccharides solubles extraite à partir de noyaux (FSN) est caractérisée par une teneur en polysaccharides de près de 50%, en poids. La fraction de polysaccharides solubles extraite à partir de pulpes et de peaux (FSC) est quant à elle caractérisée par une teneur en polysaccharides de plus de 66 %, en poids.
Ces polysaccharides sont composés de monosaccharides de rhamnose, arabinose, fucose, xylose, mannose, galactose, acide galacturonique, glucose et acide glucuronique.
Dans la fraction issue du noyau FSN, le mannose est le monosaccharide qui se trouve en plus grande quantité. On note également une quantité importante de glucose. Ceci témoigne de la présence de polysaccharides de la famille des glucomannanes. Dans la fraction issue des tissus et peaux FSC, c'est l'acide galacturonique qui est en quantité importante. La présence dans cette fraction de galactose et de xylose témoigne de la présence de polysaccharides de type pectine.
La fraction de polysaccharides insolubles obtenue à partir de MIA de noyaux FISN est également riche en monosaccharides, en particulier en mannose. Le mannose forme environ 90% du poids massique de la fraction des fibres insolubles. Ceci témoigne de la présence de polysaccharides de la

8 famille des galactomannanes. Ainsi, il peut être intéressant, à partir de cette fraction de fibres insolubles, de préparer une fraction soluble de monosaccharides (voir exemple 4) qui pourra être utilisée dans le cadre des applications visées par l'invention.
d) Détermination de la composition massique en protéines des fractions de polysaccharides solubles et insolubles obtenues à partir des MIA de noyaux et de tissus (pulpe et peau) :
La méthode de détermination de la concentration en protéines des fractions MIA, FSC, FISN et FSN
repose sur le dosage de l'azote et de carbone par combustion d'échantillons de chacune de ces fractions, sous forme de poudre lyophilisée, selon la méthode bien connue de Dumas. Les résultats sont consignés dans le Tableau 2.
Tableau 2 % Carbone % Azote % Protéines' FSN 41,1 (+/- 1,6) 1,4 (+/- 0,2) 8,8 (+/- 1,6) FSC 49,5 (+/- 2,4) 1,0 (+/- 0,5) 6,2 (+/- 3,1) FISN 48,5 (+1-4,1) 2,2 (+/- 0,4) 13,7 (+/- 2,7) La valeur entre parenthèse correspond à l'intervalle de confiance a 0.05% avec n=3 ;1 conversion utilisant le facteur 6. 25 selon la norme 15016634 Selon les échantillons, les teneurs varient de 40 à 50% pour le carbone et de 1,0 à 2,2 % pour l'azote.
Ces données permettent d'estimer des teneurs en protéines variant de 6 à 14 %
selon les échantillons. La fraction FISN avec une teneur estimée en protéines de près de 14% est significativement plus riche en protéines que les autres fractions. Il n'y a pas de différence significative entre les teneurs en protéines estimées pour les fractions FSN
et FSC.
Exemple 2 Obtention d'extraits de polyphénols:
Les polyphénols peuvent être obtenus à partir des poudres de tissus selon un procédé d'extraction et de purification de polyphénols comprenant essentiellement les étapes suivantes :
- extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant, préférentiellement polaire, et récupération d'un extrait contenant des composés polyphénoliques, - purification des composés polyphénoliques de l'extrait par une méthode de chromatographie en phase solide, par exemple en phase inverse ou par échange d'ions, - récupération d'un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques.
La mise en oeuvre est la suivante :
10g de poudre de tissus de fruit sont mis en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation, puis filtrés, lors d'une première extraction. Le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation puis filtré. Le résidu obtenu est récupéré puis séché sous azote durant 1h. Cette étape est optionnelle.

9 Le résidu sec de l'extraction est mis en contact avec 30 ml de solvant polaire durant 15 min., sous agitation, puis filtré, lors d'une première extraction. Le solvant polaire est composé
d'éthanol/eau/acide acétique selon un ratio de 50 à 80 d'éthanol : 1 à 10 d'acide acétique : qsp en eau (V/V/V) (solvant hydroalcoolique). Par exemple, un ratio de 80 :19 :1 (Vol. éthanol/ Vol. eau! Vol.
acide acétique!) est adapté. Dans une variante, un solvant composé
d'acétone/eau/acide acétique selon un ratio de 50 à 80 d'acétone : 1 à 10 d'acide acétique : qsp eau (V/V/V) (solvant hydro-acétonique). Par exemple, un ratio de 50 :49: 1 peut être utilisé.
L'extrait obtenu, nommé El, est conservé, et le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé E2, est conservé et le résidu obtenu est récupéré et soumis à
une troisième extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré.
L'extrait obtenu, nommé E3, est conservé. Les extraits El, E2 et E3 sont mélangés. Une filtration est réalisée afin de récupérer le surnageant puis les composés phénoliques dans l'extrait sont concentrés par évaporation sous vide.
Les extraits sont centrifugés à 4500 tr/min pendant 10 min à 4 C afin de récupérer le surnageant qui sera utilisé pour la cartouche Sep Pack C18 (commercialisée par la société
Waters) pour la mise en oeuvre d'une extraction en phase solide (SPE).
Des cartouches SPE contenant 5 g de gel C18 (cartouche Sep Pack C18 commercialisée par la société
Waters) sont conditionnées à l'éthanol (20 mL) puis équilibrées à l'eau acidifiée (40 mL) avant que ne soient déposés les extraits aqueux de chaque échantillon (40 ml), préalablement centrifugés à 4500 tr/min pendant 10 min à 4 C. Un rinçage est effectué par 40 mL d'eau acidifiée (à 2% d'acide acétique), puis la fraction retenue est éluée par 40 mL de mélange éthanol/eau/acide acétique (50 à
80 éthanol : 1 à 50 acide acétique : qsp eau), préférentiellement 50: 49 :1 (V/V/V). La colonne est ensuite lavée par 30 mL d'éthanol pour éliminer les polyphénols très hydrophobes qui peuvent être encore fixés.
Dans une variante, la purification peut être réalisée à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions FPX 66 (Société Rohm & Haas France SAS).
Une concentration des extraits est réalisée par évaporation du solvant et une fraction purifiée de polyphénols est obtenue. La fraction est ensuite séchée pour obtenir une poudre de polyphénols.
Les extraits obtenus contiennent jusqu'à 80% de polyphénols, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec. De plus, les extraits contiennent au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
Exemple 3 Préparation d'une composition contenant un extrait de polysaccharides hydrosolubles et un extrait de polyphénols 70 mg de fibres solubles précédemment extraites sont dissoutes dans 200 mL
d'eau acidifiée à 0,1%
d'acide formique.

10 70 mg de polyphénols précédemment extraits sont dissouts dans 50 mL d'eau acidifiée à 0,1%
d'acide formique.
Les deux solutions sont mélangées, agitées puis centrifugées à 4500tr/min pendant 10nnin. Le surnageant est récupéré puis séché.
Les mélanges à étudier sont préparés par des fractions de fibres solubles-tanins (50 /50 w :w).
Exemple 4 Obtention et analyse d'un hydrolysat de polysaccharides initialement non hydrosolubles et issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera a) Obtention :
L'objectif est de préparer des fractions de saccharides solubles riches en mannoses oligomères à
partir de la fraction contenant des polysaccharides insolubles FISN issue de la MIA.
On utilise une bêta-mannanase bactérienne ou fongique, en particulier la bêta-mannanase extraite d'Aspergillus figer, notamment la bêta-mannanase purifiée d'Aspergillus figer commercialisée sous la marque Gamanase (NOVO-NORDISK, Danemark).
On définit l'unité de bêta-mannanase comme étant la quantité de bêta-mannanase qui libère, à
partir de gomme de caroube, une quantité de sucres réducteurs équivalente à 1 micromole de mannose par minute, à pH5 et à 30C.
La bêta-mannanase peut être immobilisée par liaison covalente à la surface d'un support traditionnel, ou encore immobilisée par polymérisation après avoir été
adsorbée à la surface d'un support traditionnel. On peut alors hydrolyser l'extrait liquide à une température de 40-70 C avec les enzymes immobilisées.
Des conditions d'incubation identiques ont été utilisées avec chaque R-mannanase (McCleary, B.
V.,1979). La fraction insoluble FISN (20 ml, 0,5% p / y, sans tampon) a été
incubée avec de la [3-mannanase (0,8 kat sur de la caroube galactomannane; 0,4 kat sur du mannane soluble). Des aliquotes (4 ml) ont été prélevées à des intervalles de 20 minutes, 1, 6 et 18 heures, chauffées pour dénaturer l'activité de la p-mannanase, lyophilisées et réajustées à 2% en poids de glucide. Des aliquotes (20 I) ont été appliquées sur des plaques préparées deux fois avec du n-PrOH-Et0H-H20 (7: 1: 2). Les taches ont été visualisées par pulvérisation de 5% de H2SO4 dans Et0H et chauffant à
110 C pendant environ 10 min.
Cette technique a permis de solubiliser 99,5 % de la fraction contenant des fibres insolubles.
b) Analyse : détermination de la composition massique en monosaccharides par GC-MS dans les fractions insolubles hydrolysées par voie enzymatique Les analyses par GC-MS des structures polysaccharidiques des fractions insolubles hydrolysées et solubilisées montrent la richesse de cette fraction en mannose. Ce mannose provient à l'évidence de polysaccharides de la famille des galactomannanes et glucomannanes puisque cette partie soluble est riche en glucose et galactose. Les sucres identifiés sont du mannose (Man) ; galactose (Gal) ; un trisaccharide avec un rapport galactose / mannose de 1: 2 (Gal-Man2) ; un tétrasaccharide avec un

11 PCT/EP2020/084058 rapport galactose / mannose de 1: 3 (Gal-Man3) ; et un pentasaccharide avec un rapport galactose /
nnannose de 1: 4 (Gal-Man4). Les résultats sont consignés dans le Tableau 3 et les unités en p.g/mg.
Tableau 3 Echantillon Gal-Man2 Gal-Man3 Gal-Man4 Man Gal Glc Fraction insoluble 10.3673 7.1482 9.8568 66.7821 10.0254 1.3697 hydrolysée Exemple 5 Mise en évidence de l'efficacité des polysaccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera, dans la stimulation des défenses naturelles du blé.
But: l'objectif est d'évaluer, en conditions semi-contrôlées, l'effet inducteur de l'extrait contenant des polysaccharides hydrosolubles (obtenu selon l'exemple 1 et nommé par la suite Polysaccharides ) sur l'expression de 7 gènes des protéines PR, marqueurs des mécanismes de défense, à l'aide de l'outil qPFDe (décrit dans la demande de brevet W02011/161388) sur plants de blé.
Matériel biologique Les plants de blé ont été produits à partir de semences de la variété de blé
tendre ALIXAN. Pour chaque modalité, 30 grains de blé ont été semés dans 3 pots (2 répétitions!
modalité) puis placés en conditions contrôlées pendant 1 semaine (25 C constant, 16h de photopériode), jusqu'au stade feuille F2 émergente. Les jeunes plants ont ensuite été transférés dans une chambre climatique dédiée à l'expérimentation.
Produits testés et témoins Les modalités suivantes ont été comparées (Tableau 4).
Tableau 4 Produit Nature du Dose Volume/quantité Nombre Délai entre produit Pour 50 mL d'applications applications Produit Polysaccharides 0,7% 350 mg 2 4 jours (J-4/J0) candidat Témoin Témoin SDP* 2 4 jours (J-4/J0) Témoin Eau 1 SDP : Stimulateur de Défense des Plantes reconnu Afin de faciliter l'adhésion du produit candidat sur les plants de blé, du Tween 20 a été ajouté à
chaque produit candidat, à une concentration de 0.05% soit 25 iil pour 50 ml de produit.
Marqueurs de défenses utilisés Les 7 gènes des protéines PR (Pathogenesis Related) ci-dessous ont été
sélectionnés comme étant représentatifs des protéines PR majeures impliquées dans la défense des plantes.
PR-1 : Pathogenesis-related protein 1 PR-2 : Pathogenesis-related protein 2 (glucanases) PR-4 : Pathogenesis-related protein 4 (hevein-like)

12 PR-5 : Pathogenesis-related protein 5 (thaumatin-like, osmotin) PR-8 : Pathogenesis-related protein 8 (class III chitinase) PR-14: Pathogenesis-related protein 14 (lipid transfer protein) PR-15: Pathogenesis-related protein 15 (oxalate oxidase) Protocole Deux répétitions de l'ensemble de l'expérience ont été réalisées, ainsi que deux analyses par PCR
quantitative.
Les tests sont conduits en chambre climatique, en conditions contrôlées (21 C
jour / 19 C nuit, 16h de photopériode) sur des plants de blé (stade 2/3 feuilles), randomisés en blocs de 7 pots.
Les produits de chaque modalité (2 pots) sont appliqués 2 fois, à l'exception du témoin EAU qui est appliqué 1 seule fois (JO). Le produit candidat et le témoin SDP sont appliqués à 4 jours d'intervalle, à
J-4 et à JO. Chaque modalité est ensuite traitée à J1 avec du peroxyde d'hydrogène (H202) pour simuler une attaque de bioagresseurs. Tous les traitements sont réalisés jusqu'à limite de ruissellement, avec un pulvérisateur relié à de l'air comprimé.
Pour chaque modalité, dix fragments foliaires (env. 1 cm) sont prélevés en combinant 5 feuilles F2 issues de 5 plants différents, aux dates suivantes :
- JO : prélèvement initial sur 5 plants n'ayant reçu aucun traitement - J2 : prélèvement 2 jours après traitement - J3 : prélèvement 3 jours après traitement Ces échantillons sont placés dans l'azote liquide puis conservés à -80 C
jusqu'à l'extraction des ARN.
Extraction d'ARN, rétro-transcription et PCR quantitative Les ARN ont été extraits à partir des tissus foliaires prélevés, à l'aide du kit NucleoSpin RNA Plant (Macherey-Nagel). Le rendement et la qualité des ARN extraits ont été évalués à l'aide d'un spectrophotomètre (Nanodrop ND-1000). Les ARN ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc et les niveaux d'expression de 7 gènes des protéines PR ont été suivis (3 répétitions techniques) par PCR
quantitative (agent intercalant SYBR Green) à l'aide de l'outil qPFD ( Puce à Faible Densité
Quantitative développé par l'INRA). Les niveaux d'expression relative ont été calculés avec la méthode du 2' : il s'agit d'expressions relatives par rapport au prélèvement JO (avant traitement) à
chaque temps de prélèvement, normalisées par la moyenne géométrique des expressions relatives de 3 gènes de référence (TuB, Actin, GAPDH). Ces expressions relatives sont transformées en 1og2 pour donner le même poids aux inductions et aux répressions des gènes.
Résultats Carte de densité des expressions relatives des gènes des protéines PR

13 Le Tableau 5 ci-dessous présente la carte de densité des expressions relatives des 7 gènes des protéines PR. Les niveaux d'expression des 7 gènes, transformés en 10g2, sont représentés par une carte de densité. Celle-ci permet d'avoir une vision globale du profil d'induction et de visualiser directement les différences de niveaux d'expression des gènes marqueurs entre les échantillons traités, après avoir retranché les variations d'expression du témoin EAU. Echelle de variation des 1og2 (expression relative) : plus la valeur s'étend dans le positif, plus l'induction est forte.
Tableau 5 TEMOIN EAU 12 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 J3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TEMOIN SDP J2 10,1 -0,4 8,7 7,3 1,9 0,8 0,5 J3 6,3 0,1 5,5 5,8 0,0 -1,4 0,5 POLYSACCHARIDES J2 4,1 -0,6 3,5 3,7 0,8 2,4 -0,2 J3 2,1 -0,1 2,9 3,1 0,3 0,1 0,4 Le témoin SDP présente une très forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 2 et 3 jours après le second traitement (J2). Il montre également une induction modérée du gène PR8 à la date J2. Le profil d'induction du témoin SDP dans cet essai correspond aux effets connus de ce produit.
L'essai est donc validé.
Les polysaccharides montrent une forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 2 jours après le second traitement (J2). Le gène PR14 est également induit à un niveau élevé, 2 jours après le dernier traitement (J2).
Fold change des gènes des protéines PR
Les valeurs Fold change des 7 gènes des protéines PR, pour chacune des modalités de traitement (produit candidat et témoin SDP), aux dates de prélèvement J2 et J3, sont détaillées dans les tableaux 6 et 7 ci-dessous.
Le Fold change correspond au rapport du niveau d'expression d'un gène pour une modalité de traitement (témoin SDP, produit candidat) par rapport au témoin EAU, sans transformation 1og2 et moyenne pour les 2 répétitions. Les valeurs Fold change supérieures ou égales à 2 représentent des inductions modérées à fortes.
Tableau 6 TEMOIN EAU 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 TEMOIN SDP 1514,6 0,8 548,8 253,5 4,1 3,1 1,4 POLYSACCHARIDES 31,3 0,7 23,1 39,9 1,8 6,6 0,9

14 Tableau 7 TEMOIN EAU 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 TEMOIN SDP 100,9 1,1 105,7 170,4 1,1 0,5 1,6 POLYSACCHARIDES 18,1 1,0 78,5 85,3 1,3 1,1 1,3 Deux jours après le traitement, le témoin SDP induit très fortement les gènes PR1, PR4 et PR5, à un niveau 253 à 1515 fois plus élevé que le témoin EAU. Les gènes PR8 et PR14 sont induits respectivement 4 et 3 fois plus qu'avec le témoin EAU. Les polysaccharides présentent une forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4, PRS et PR14, à un niveau 7 à 40 fois plus élevé que le témoin EAU.
Trois jours après le traitement, le témoin SDP présente un forte capacité
d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 100 à 170 fois plus élevée que le témoin EAU. Les polysaccharides induisent fortement les gènes PR1, PR4 et PR5, respectivement 18, 78 et 85 fois plus que le témoin EAU.
Conclusions :
Les polysaccharides issus des fruits du dattier Phoenix dactylifera présentent une grande capacité
d'induction des gènes des protéines PR chez le blé. Ils ont donc un effet inducteur des gènes de défense sur la culture de blé et peuvent être utilisés en tant qu'éliciteurs.
Exemple 6 Mise en évidence de l'efficacité d'un extrait de polysaccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera, dans la stimulation des défenses naturelles de la vigne.
But: L'objectif est de confirmer sur plants de vigne ce qui a été observé sur plants de blé dans l'exemple précédent.
Matériel biologique Les plants de vigne ont été produits à partir de pépins du cépage Chardonnay.
Ils ont été cultivés pendant 9 à 10 semaines sous serre en conditions semi-contrôlées (19 C, 16h de jour) puis sélectionnés au stade 4 - 6 feuilles et transférés dans une serre dédiée à
l'expérimentation.
Produits testés et témoins Les modalités suivantes ont été comparées (Tableau 8).
Tableau 8 Produit Nature du Dose Volume/quantité Nombre Délai entre produit Pour 50 mL d'applications applications

15 Produit Polysaccharides 0,7% 350 mg 2 4 jours (J-4/J0) candidat Témoin Témoin SDP* 2 4 jours (J-4/J0) Témoin Eau 1 SDP: Stimulateur de Défense des Plantes reconnu (COS-OGA) Afin de faciliter l'adhésion des produits candidats sur les plants de vigne, du Tween 20 a été ajouté à
chaque produit candidat, à une concentration de 0.05% soit 25 I pour 50 ml de produit.
Marqueurs de défenses utilisés Les 7 gènes des protéines PR mentionnés dans l'exemple 4 : PR-1; PR-2; PR-4;
PR-5 ;PR-8; PR-14; PR-15.
Protocole Deux répétitions de l'ensemble de l'expérience ont été réalisées, ainsi que deux analyses par PCR
quantitative.
Chaque bloc de chaque modalité est traité 2 fois, à l'exception du témoin EAU
qui est appliqué 1 seule fois (JO). Les produits candidats sont appliqués à 4 jours d'intervalle (J-4/10) et le témoin SDP à
6 jours d'intervalle (J-6/J0). Chaque modalité est ensuite traitée à J1 avec du peroxyde d'hydrogène (H202) pour simuler une attaque de bio agresseurs. Tous les traitements sont réalisés sur les 2 faces foliaires, jusqu'à limite de ruissellement, avec un pulvérisateur relié à de l'air comprimé.
Pour chaque modalité, 8 disques foliaires (diamètre de 6 mm) sont prélevés en combinant 4 feuilles développées issues de 4 plants différents, aux dates suivantes :
- JO : prélèvement initial sur 5 plants n'ayant reçu aucun traitement, - J2 : prélèvement 2 jours après traitement, - J3 : prélèvement 3 jours après traitement.
Ces échantillons sont placés dans l'azote liquide puis conservés à -80 C
jusqu'à l'extraction des ARN.
Extraction d'ARN, rétro-transcription et PCR quantitative Le déroulement est identique à celui de l'exemple 4.
Résultats Carte de densité des expressions relatives des gènes des protéines PR
Le Tableau 9 ci-dessous présente la carte de densité des expressions relatives des 7 gènes des protéines PR.
Tableau 9 PROTEINES PR

TEMOIN EAU J2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 J3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TEMOIN SDP J2 5,6 3,6 4,0 4,8 3,4 3,3 0,9

16 13 -3,0 -3,7 -1,4 -1,6 -0,5 -1,4 0,6 POLYSACCHARIDES J2 3,5 4,1 4,4 3,6 1,6 2,3 1,5 J3 -0,9 -0,4 0,8 -1,2 0,4 -0,2 0,7 Le témoin SDP présente une forte capacité d'induction des gènes des protéines PR, à l'exception du gène PR14, 2 jours après le second traitement (12). En revanche, il ne montre plus d'induction des gènes des protéines PR, 3 jours après le second traitement (13). Le profil et le fort niveau d'induction à J2 du témoin SDP dans cet essai correspondent aux effets connus de ce produit dans nos conditions. L'essai est donc validé.
Les polysaccharides montrent une forte capacité d'induction des gènes des protéines PR, 2 jours après la seconde application (J2).
Fold change des gènes des protéines PR
Les valeurs Fold change des 7 gènes des protéines PR, pour chacune des modalités de traitement (produits candidats et témoin SDP), aux dates de prélèvement J2 et 13, sont détaillées dans les tableaux 10 et 11 ci-dessous.
Tableau 10 TEMOIN EAU 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 TEMOIN SDP 157,6 13,1 17,4 27,0 11,5 10,4 2,0 POLYSACCHARIDES 21,8 49,7 36,1 28,1 3,0 5,1 2,7 Tableau 11 TEMOIN EAU 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 TEMOIN SDP 0,3 0,1 0,6 0,4 1,0 0,5 1,5 POLYSACCHARIDES 0,6 0,8 3,4 0,5 1,3 1,4 1,7 Deux jours après le traitement, le témoin SDP induit les gènes PR2, PR3, PR4, PRS, PR8 et PR14, à un niveau 2 à 27 fois plus élevé que le témoin EAU. Le gène PR1 est le plus induit, 158 fois plus qu'avec le témoin EAU. Les polysaccharides présentent une capacité d'induction des gènes PRS et PR14, à un niveau 3 fois plus élevé que le témoin EAU. Ils induisent fortement les gènes PR1, PR3, PR4 et PR8, à
un niveau 5 à 36 fois plus élevé que le témoin EAU. Le gène PR2 est le plus induit, 50 fois plus qu'avec le témoin EAU.
Trois jours après le traitement, le témoin SDP présente une faible capacité
d'induction du gène PR14, à un niveau 1.5 fois plus élevé que le témoin EAU. Il n'induit pas les autres gènes des protéines PR.
Les polysaccharides induisent le gène PR3 à un niveau 3 fois plus élevé que le témoin EAU.
Conclusions :
Les polysaccharides issus des fruits du dattier Phoenix clactylifera présentent une grande capacité
d'induction des gènes des protéines PR chez la vigne. Ils ont donc un effet inducteur des gènes de défense sur la culture de blé et peuvent être utilisés en tant qu'éliciteurs.

17 Exemple 7 Mise en évidence de l'efficacité d'un mélange d'extrait de polysaccharides hydrosolubles et d'extrait de polyphénols issus de fruits du dattier Phoenix clactylifera dans la protection des plantes contre le mildiou de la vigne But: L'étude est menée afin de déterminer l'efficacité de protection d'un mélange de polysaccharides hydrosolubles et de polyphénols contre le mildiou (Plasmopara viticole) de la vigne (Vitis vinifera), à trois différentes doses, en application préventive ou curative. Les essais sont réalisés sur disques de vigne en conditions contrôlées.
Modalités : Dans cette étude, des mélanges de polyphénols et polysaccharides hydrosolubles (ratio pondéral de 50/50) sont appliqués à différentes doses (0,01%; 0,1%; 0,7%) (g/L) à titre préventif, c'est-à-dire 24 h avant que la plante soit contaminée par Plasmopara viticole, et à titre curatif, c'est-à-dire 24 h après que la plante ait été contaminée.
A titre de témoins, de l'eau et de la bouillie bordelaise (produit de référence) sont également appliqués 24h avant ou 24h après contamination de la plante par Plasmopara viticole.
Le Tableau 12 illustre les modalités d'application.
Tableau 12 Produit Dose Application Volume Quantité Tween Nombre préparation de 20 d'application produit 0,05%
Eau -24H 50m1 polyphénols+polysaccharides 0,01% -24H 50 ml 5 ml de 25 pi 0,1%
polyphénols+polysaccharides 0,1% -24H 50 ml 0,05 g 25 pi polyphénols+polysaccharides 0,7% -24H 50 ml 0,35 g 25 I

Eau +24H 25 ml 1 polyphénols+polysaccharides 0,01% +24H 25 ml 2,5 ml de 12,5 I 1 0,1%
polyphénols+polysaccharides 0,1% +24H 25 ml 0,025 g 12,5 pi polyphénols+polysaccharides 0,7% +24H 25 ml 0,175 g 12,5 pl Bouillie Bordelaise 18,75 -24H 50 ml 0,9375 g 1 g/L
Matériel végétal : des semis de vigne sont obtenus à partir de pépins du cépage Chardonnay.
Plasmopara viticole : des feuilles de 5 cm de diamètre avec de larges taches de sporulation ont été
congelées. La souche est ensuite multipliée juste avant l'expérimentation sur des plants de vigne, pour avoir un inoculum frais.
Culture : les semis sont cultivés pendant 6 semaines en conditions contrôlées (25 C, 16h de photopériode) puis sélectionnés au stade 4 feuilles et transférés dans un module climatique dédié
pour l'expérimentation au moment de l'inoculation (21 C jour, 19 C nuit, 16h de photopériode).

18 Traitement : les produits sont appliqués par pulvérisation à l'aide d'un pulvérisateur relié à l'air comprimé jusqu'au point de ruissellement sur les deux faces foliaires. Les traitements ont été
appliqués en préventif, à -24h avant inoculation, sur plants, ou en curatif, à
+24h sur disques.
Production de l'inoculum et inoculation : les feuilles avec une sporulation dense sont rincées à l'eau osmosée et la suspension est filtrée. La concentration finale de l'inoculum est ajustée à la concentration de 5.104 en sp/ml. Des disques foliaires sont réalisés à l'aide d'un emporte-pièce à
raison de 8 disques par boîte de Petri. L'inoculum est ensuite appliqué sur la face inférieure des disques avec un pulvérisateur à fines gouttelettes. Les boîtes sont maintenues à température ambiante jusqu'à la lecture.
Mode d'analyse : la lecture des résultats est réalisée entre 6 et 9 jours après inoculation en utilisant une échelle quantitative de sévérité de la maladie variant de 0 à 100% de sporulation recouvrant la surface des disques foliaires.
La sévérité (intensité) de la maladie est calculée en faisant la moyenne des notes (%) obtenues par modalité. L'incidence (fréquence) de la maladie est calculée et correspond au pourcentage de plantes atteintes par le mildiou. Enfin, le pourcentage de protection est calculé par la formule ((Note témoin eau-Note X/ Note témoin eau) x 100) à partir des notes de sévérité.
Les données ont été analysées avec le logiciel XLSTAT avec une ANOVA.
L'analyse statistique utilisée pour différencier les moyennes est la procédure des différences significatives minimales de Fisher (LSD). Elle indique des différences statistiquement significatives au niveau de confiance de 95%.
Cette analyse a été réalisée sur les notations des notes de sévérité. En cas de test non paramétrique, le test de Kruskal-Wallis est utilisé ; ce test est un équivalent non paramétrique de l'ANOVA à un facteur contrôlé. Ce test non paramétrique repose sur la comparaison des intervalles de confiance de la médiane sur une représentation en boîtes à moustaches de Tukey.
Résultats : l'incidence et la sévérité du mildiou sur les disques foliaires inoculés artificiellement en conditions contrôlées et les pourcentages de protection sont indiqués dans le Tableau 13 ci-dessous.
Tableau 13 Modalité Sévérité (%) Incidence (%) Protection (%) Eau 24h avant inoculation 89 100 polyphénols+polysaccharides 83 100 7 0,01% 24h avant inoculation polyphénols+polysaccharides 73 100 18 0,1% 24h avant inoculation polyphénols+polysaccharides 35 100 61 0,7% 24h avant inoculation Eau 24h après inoculation 96 100 polyphénols+polysaccharides 79 100 18 0,01% 24h après inoculation polyphénols+polysaccharides 80 10 17 0,1%2 4h après inoculation polyphénols+polysaccharides 71 100 26 0,7% 24h après inoculation Bouillie bordelaise 10 53 88

19 D'après ces données on observe, en application préventive, une note de sévérité
significativement plus faible que le témoin eau traitée correspondant pour les doses à 0,1 et 0,7% du mélange polyphénols et polysaccharides hydrosolubles, respectivement de 73 et 35%, avec un effet dose positif. Le taux de protection obtenu pour le mélange selon l'invention à la dose de 0,7% est élevé (61%).
En application curative, on observe également une note de sévérité
significativement plus faible que le témoin eau traitée correspondant pour les doses à 0,01%, 0,1% et 0,7%
du mélange selon l'invention, qui sont respectivement de 79, 80 et 71%, avec un effet dose positif. Le taux de protection obtenu pour le mélange à la dose de 0,7% est de 30%.
En conclusion : on observe que le mélange présente la capacité d'induire des réactions de défense naturelle de la plante et de protéger celle-ci avant qu'elle ne soit attaquée par le pathogène mais également d'induire des mécanismes de défense en traitement lorsque la plante est en contact avec le pathogène.
La combinaison d'un extrait contenant des polysaccharides et d'un extrait contenant des polyphénols s'avère donc très utile dans la protection des plantes contre des pathogènes. En effet, un tel mélange, une fois appliqué sur la plante, va pouvoir agir sur le long terme, à la fois en prévention, en induisant des mécanismes de défense et de protection, notamment par une activité
d'éliciteur, et en traitement. Il est donc possible de formuler un produit de soin des cultures à large spectre d'activité.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'un extrait de composés hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera, l'extrait contenant au moins 30%, en poids, de saccharides hydrosolubles, pour la protection des plantes contre des pathogènes.

2) Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait contient, de plus, au moins 5 %, en poids, de protéines, préférentiellement au moins 10%, plus préférentiellement entre 5 et 15%.

3) Utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité élicitrice des mécanismes de défense.

4) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient des polysaccharides naturellement hydrosolubles ou un mélange de tels polysaccharides avec des hydrolysats de polysaccharides naturellement non hydrosolubles.

5) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les saccharides contiennent du rhamnose, de l'arabinose, du fucose, du xylose, du mannose, du galactose, de l'acide galacturonique, du glucose et/ou de l'acide glucuronique.

6) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient, en poids :
au moins 20% de mannose, au moins 7% d'arabinose, au moins 6 % de glucose, au moins 5% de galactose.

7) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient, en poids :
au moins 40 % d'acide galacturonique, au moins 7% d'arabinose, au moins 3% de xylose.

8) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait de saccharides hydrosolubles est en mélange avec un extrait de polyphénols issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera.

9) Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle le ratio entre l'extrait de saccharides et l'extrait de polyphénols est compris entre 30/70 et 70/30, exprimé en poids.

10) Utilisation selon l'une des revendications 5 à 6, dans laquelle l'extrait de polyphénols comprend au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.

11) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la quantité efficace de l'extrait de saccharides, ou du mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, apportée aux plantes, est d'au moins 0,01 g par litre, préférentiellement d'au moins 0,1 g par litre, plus préférentiellement d'au moins 0,7 g par litre, pour un apport sous forme liquide, ou d'au moins 10 g par hectare, préférentiellement d'au moins 100 g par hectare pour un apport sous forme solide.

12) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait de saccharides, ou le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, est appliqué à la plante entière, aux feuilles, aux fleurs, aux racines, aux fruits, aux graines, aux semis, au sol, au rnilieu de culture solide ou liquide, au matériel de culture.

13) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'application est réalisée par arrosage, irrigation, pulvérisation, trempage ou injection.

14) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les plantes sont des plantes agronomiques, en particulier du blé, ornementales, aromatiques ou médicinales, en particulier des plants fruitiers, en particulier des vignes, des plants de légumes, des fleurs, des arbres, des arbustes.

15) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle lesdits pathogènes de plantes sont des champignons, des bactéries, des virus, des nématodes, des plantes parasites, des protozoaires ou des insectes, en particulier Plasmopore viticole.

16) Méthode de protection d'une plante contre des pathogènes, en particulier pour activer des réactions de défense et de résistance de la plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application à ladite plante, ou dans l'environnernent de la plante, d'une quantité efficace d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dectylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce dattier, ladite composition étant telle que décrite dans l'une ou l'autre des revendications 1 à 15.

17) Produit phytosanitaire contenant une quantité efficace d'un extrait de saccharides issu de fruits du dattier Phoenix dectylifera, seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce même dattier, lesdits extraits étant tels que décrits dans l'une ou l'autre des revendications 1 à 15.

18) Produit phytosanitaire selon la revendication 17, comprenant, de plus, au moins un autre composant tel qu'un solvant, un tensioactif, un émulsifiant, un agent dispersant, une charge, un composé fertilisant ou un composé phytosanitaire.

19) Produit phytosanitaire selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme liquide, sous forme de gel, sous forme de poudre ou de granulés.