CA2323831A1 - Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux vecteurs capables de diriger des acides nucléiques vers des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques.

Description

VECTEURS DE TRANSFERT D'ACmES NUCLEIOUES. COMPOSITIONS LES
CONTENANT. ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux vecteurs capables de diriger des acides nucléiques vers des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques.
Le transfert d'acides nucléiques est une technique à la base de toutes les applications majeures de la biotechnologie et l'augmentation de l'efficacité
du transfert des acides nucléiques constitue un enjeu très important pour le développement de ces Io applications. L'efficacité du transfert des acides nucléiques dépend de nombreux facteurs parmi lesquels la capacité des acides nucléiques à atteindre la cellule cible, leur faculté à franchir la membrane plasmique et leur aptitude à être transportés au sein de la cellule jusqu'au noyau.
Un des obstacles majeurs à l'efficacité du transfert des acides nucléiques provient du fait que l'information génétique est souvent peu ou pas dirigée vers l'organe cible auquel elle est destinée. Par ailleurs, une fois que l'acide nucléique a pénétré dans la cellule cible, il doit encore être dirigé vers le noyau afin d'y être exprimé. De plus, dans le cas de transfert d'acides nucléiques dans des cellules différenciées ou quiescentes, le noyau est limité par une enveloppe nucléaire qui 2o constitue une barrière supplémentaire au passage de ces acides nucléiques.
Les virus recombinants utilisés comme vecteurs possèdent des mécanismes évolués et efficaces pour guider les acides nucléiques jusqu'au noyau.
Cependant, les vecteurs viraux présentent certains inconvénients inhérents à leur nature virale, qu'il n'est malheureusement pas possible d'exclure totalement. Une autre stratégie consiste donc soit à transfecter l'ADN nu, soit à utiliser des agents non viraux capables de promouvoir le transfert d'ADN dans des cellules eucaryotes. Mais les vecteurs non viraux ne possèdent pas de signaux de ciblage sub-cellulaires ou nucléaires.
Ainsi, le passage de l'ADN nu, ou en combinaison avec un agent non-viral, du cytoplasme vers

2 le noyau est par exemple une étape qui présente une efficacité très faible (Zabner et al., 1995).
Différentes tentatives d'attachement de signaux de ciblage ont ainsi été
faites.
Notamment, des fragments peptidiques pour le ciblage ont été attachés covaIemment à
des oligonucléotides dans une stratégie de ciblage d'un oligonucléotide antisense [Eritja et al., Synthesis of deftned peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal seguence, Tetrahedron, Vol. 47, N° 24, pp.
4113-4120, 1991 ]. Les complexes ainsi formés sont de bons candidats comme inhibiteurs potentiels de l'expression de gènes endogènes.
1o Des vecteurs de transfection comprenant un polypeptide synthétique couplé
par des interactions électrostatiques à une séquence d'ADN ont également été
décrits dans la demande de brevet WO 95/31557, ledit polypeptide étant constitué d'une chaîne polymère d'acides aminés basiques, d'un peptide NLS, et d'une région charnière qui connecte le peptide NLS à 1a chaîne polymérique et permet d'éviter les interactions 1s stériques. Mais ce genre de constructions pose un problème de stabilité car les interactions mises en jeu entre l'ADN et le signal de ciblage sont de nature électrostatique.
Il existe par ailleurs des chimères acide nucléique-peptide de ciblage spécifique décrites dans la demande de brevet WO 95/34664, la liaison entre les deux étant de 2o nature chimique. Mais cette méthode passe notamment par des étapes enzymatiques difficilement contrôlables et ne permettant pas de produire de grandes quantités d'acides nucléiques.
Enfin, il a été montré qu'il est possible d'attacher une séquence NLS («
Nuclear Localisation Signal ») à un ADN plasmidique par l'intermédiaire d'un 25 cyclopropapyrroloindole (Nature Biotechnoiogy, Volume 16, pp. 80-85, janvier 1998).
Mais une inhibition totale de la transcription du gène d'intérêt du fait de l'attachement au hasard de plusieurs centaines de séquences NLS sur le plasmide a été
observée. Une solution proposée par les auteurs pour y remédier consiste à lier les séquences NLS
sur des fragments linéaires d'ADN, puis à coupler ces fragments modifiés avec d'autres

3 fragments non-modifiés. Cependant, cette technique présente comme précédemment l'inconvénient de passer par au moins une étape enzymatique.
Ainsi, toutes les méthodes proposées jusqu'à présent ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au ciblage des ADN
double brin.
La présente invention propose une solution avantageuse à ces problèmes. Plus particulièrement, la présente invention met en oeuvre des oügonucléotides conjugués à
des signaux de ciblage et capables de former des triples hélices avec une/des séquences) spécifiques) présentes) sur une molécule d'ADN double brin.
Un tel vecteur présente l'avantage de pouvoir diriger un ADN double brin vers 1o des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques grâce au signal de ciblage, sans que l'expression génétique ne soit inhibée. La demanderesse a en effet montré
que, grâce à la formation de triples hélices site-spécifiques stables, il est désormais possible de lier un signal de ciblage à un ADN double brin de façon site-spécifique. En conséquence, il est possible de fixer le signal de ciblage en dehors de la cassette d'expression du gène à transférer. La demanderesse a ainsi montré que l'expression génétique dans la cellule n'est pas inhibée malgré la modification chimique de l'ADN.
De plus, la présence d'une triple hélice comme moyen pour lier le signal de ciblage à
l'ADN est particulièrement avantageuse car cela permet de conserver une taille d'ADN
adaptée à la transfection.
Le vecteur obtenu présente de plus l'avantage d'incorporer des signaux de ciblage qui sont liés de façon très stable à l'ADN double brin, en particulier lorsque l'oligonucléotide susceptible de former la triple hélice est modifié par la présence d'un agent alkylant.
Un autre avantage de l'invention est de permettre de coupler l'ADN à
transférer à des signaux de ciblage dont on contrôle à la fois le nombre et la nature. En effet, il est possible de contrôler le nombre de signaux de ciblage liés à chaque molécule d'ADN double brin en introduisant un nombre adapté de séquences spécifiques propices à la formation de triples hélices sur ladite molécule d'ADN double brin. De la

4 même façon, il est possible d'introduire sur une même molécule d'ADN double brin plusieurs oligonucléotides liés à des signaux de ciblage différents (intracellulaires et/ou extracellulaires), et dans ce cas il est également possible d'en déterminer préalablement les proportions respectives. En outre, ces différents signaux de ciblage peuvent être fixés à la molécules d'ADN double brin de façon plus ou moins stable selon que la triple hélice est formée avec ou sans liaison covalente (c'est-à-dire avec ou sans l'utilisation d'un agent alkylant).
Enfin, la triple hélice fonctionnalisée obtenue ne résulte que d'étapes de transformations chimiques et peut donc être obtenue de façon simple, reproductible, et lo en très grandes quantités, notamment industrielles.
Un premier objet de l'invention concerne donc un vecteur utile en transfection capable de cibler une cellule et/ou un compartiment cellulaire spécifique.
Plus particulièrement, le vecteur selon l'invention comprend une molécule d'ADN
double brin et au moins un oligonucléotide couplé à un signal de ciblage et capable de former par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ladite molécule d'ADN double brin.
On entend au sens de l'invention par "ADN double brin" un acide désoxyribonucléique double brin qui peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc...Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banque, par synthèse chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. II peut être modifié chimiquement ou enzymat~quement.
Cet ADN double brin peut être sous forme linéaire ou circulaire. Dans ce dernier cas, l'ADN double brin peut être dans un état superenroulé ou relâché.
Préférentiellement, la molécule d'ADN est de forme circulaire et dans une conformation superenroulée.
L'ADN double brin peut également porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt WO 99!49067 PCT/FR99/00643 thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à
d'autres composants cellulaires, etc... De préférence, l'ADN double brin comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.

5 On entend au sens de l'invention par « cassette d'expression d'un gène d'intérêt » un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sîtes de restriction spécifiques. Le fragment d'ADN comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt et comprend en outre les séquences nécesaires à l'expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...) de ladite séquence. La cassette et les sîtes de restriction sont conçus pour assurer une insertion de la cassette d'expression dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et la traduction.
Il s'agit généralement d'un plasmide ou d'un épisome portant un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. A titre d'exemple on peut citer les plasmides décrits dans les demandes de brevet WO 96/26270 et WO 97/10343 incorporées à la présente par référence.
Au sens de l'invention, on entend par gëne d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit thérapeutique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit 2o protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc...
Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité
déficiente

6 dans le cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les iymphokines [interleukines, interférons, TNF, etc (FR 92/03120)], les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques [BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS, HARP/pléiotrophine, etc, la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947)], la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs [p53, 1o Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93/04745)], les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation [Facteurs VII, VIII, IX], les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides [thymidine kinase, cytosine déaminase], les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine l3 choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la Iipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de 2o transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger, etc...
L'ADN d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de 25 gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes d'intérêt thérapeutique comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des

7 PCT/FR99/00643 ARN cibles (EP 321 20I ), ou les séquences codant des anticorps intracellulaires à
simple chaîne comme par exemple les ScFv.
Comme indiqué plus haut, l'acide désoxyribonucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. II peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de 1o l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", du virus de la grippe, du cytomégalovirus (CMV), d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide désoxyribonucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré
lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule transfectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, iI peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E 1 A, MLP, CMV, RS V, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc... Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Une triple hélice correspond à la fixation d'un oligonucléotide modifié ou non sur de l'ADN double brin par des liaisons hydrogènes dites "de Hoogsteen"
entre les bases du troisième brin et celles de la région en double hélice. Ces appariements se produisent dans le grand sillon de la double hélice et sont spécifiques de la séquence 3o considérée [Frank-Kamenetski, M.D., Triplex DNA Structures, Ann. Rev.
Biochem.,

8 1995, 64, pp. 65-95). La séquence spécifique en double hélice peut notamment être une séquence homopurique-homopyrimidique. On distingue deux catégories de triples hélices suivant la nature des bases du troisième brin [Sun, J. and C. Hélène, Oligorrucleotide,directed triple-helix formation, Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, 3, pp.
345-356] : les bases puriques permettent d'obtenir des appariements C-G*G et T-A*A, et les bases pyrimidiques permettent d'obtenir des appariements C-G*C+ et T-A*T (le symbole * correspond à l'appariement avec le troisième brin).
Ces structures ont été caractérisées du point de vue physico-chimique grâce à
de nombreuses études de RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), de température 1o d'hybridation ou de protection à des nucléases, ce qui a permis de définir leurs propriétés et leurs conditions de stabilité. Pour les triples hélices avec un troisième brin purique, ce brin est antiparallèle par rapport au brin purique de l'ADN et la formation de la triple hélice dépend fortement de la concentration en ions divalents :
les ions tels que Mg2+ stabilisent la structure formée avec le troisième brin. Pour les triples hélices avec un troisième brin homopyrimidique, celui-ci est parallèle par rapport au brin purique, et la formation de la triple hélice est dépendante du pH : un pH
acide inférieur à six permet la protonation des cytosines et la formation d'une liaison hydrogène supplémentaire stabilisant le triplet C-G*C+. Il existe également des triples hélices "mixtes" pour lesquelles le troisième brin porte des bases puriques et pyrimidiques.
2o Dans ce cas, l'orientation du troisième brin dépend de la séquence de bases de la région homopurique.
Les oIigonucléotides utilisés dans la présente invention sont des oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN double brin. Ces oligonucléotides peuvent contenir les bases suivantes - thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T
de l'ADN double brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859), - adénine (A), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T de l'ADN double brin, - guanine (G), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double brin,

9 - cytosine protonée (C+), qui est capable de former des triplets avec les doublets G. C de l'ADN double brin (Rajagopal et al précitée), - uracile (U) qui est capable de former des triplets avec les paires de bases A.U ou A.T.
Pour permettre la formation d'une triple hélice par hybridation, il est important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleures fixations et la meilleure sélectivité, on utilise pour le vecteur selon l'invention un oligonucléotide et une séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en particulier d'un oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA. A titre d'exemple, on peut citer foligonucléotide de séquence 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT),, SEQ ID N° 1 ), dans lequel les bases GAGG ne forment pas de triples hélice mais permettent d'espacer l'oligonucléotide du bras de couplage. On peut également citer la séquence (CTT), (SEQ ID N°2). Ces oligonucléotides sont capables de former une triple hélice avec une séquence spécif que comportant des motifs complémentaires (GAA). Il peut s'agir en particulier d'une région comportant 7, 14, ou 17 motifs GA.A. Une autre séquence d'intérët spécifique est la séquence : S'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID
N°3). Cette séquence forme une triple hélice avec les oligonucléotides 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID N°4) ou 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID N°5).
Dans ce cas, l'oligonucléotide se fixe dans une orientation antiparallèle au brin polypurique. Ces triples hélices ne sont stables qu'en présence de Mg2+ comme cela a été précisé précédemment (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251 ;
Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
La séquence spécifique peut être une séquence présente naturellement sur l'ADN double brin, ou une séquence synthétique ou d'origine naturelle introduite artificiellement dans celui-ci. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un oligonucléotide capable de former une triple hélice avec une séquence présente naturellement sur l'ADN double brin. En effet, cela permet avantageusement d'obtenir les vecteurs selon l'invention avec des plasmides non-modifiés, notamment des plasmides commerciaux de type pUC, pBR322, pSV, etc... Parmi les séquences homopuriques-homopyrimidiques naturelles présentes sur l'ADN double brin, on peut 5 citer une séquence comprenant tout ou partie de la séquence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ m N°6) présente dans l'origine de réplication ColEl de E. coli. Dans ce cas, l'oligonucléotide formant la triple hélice possède la séquence : 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ 1D N°7) et se fixe alternativement sur les deux brins de la double hélice, comme décrit par Beal et lo Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) et Jayasena et Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). On peut aussi citer. la séquence 5'-GAA.AAAGGAAGAG-3' (SEQ ID N°8) du gène de la ~3-lactamase du plasmide pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
Une autre séquence est AAGAAAAAAAAGAA (SEQ 1D N° 9) présente dans l'origine de réplication y des plasmides à origine de réplication conditionnelle tel que pCOR.
Bien que des séquences parfaitement complémentaires soient préférées, il est entendu toutefois que certains mésappariements peuvent être toiérés entre la séquence de l'oligonucléotide et la séquence présente sur l'ADN, dès lors qu'ils ne conduisent pas à une trop grande perte d'affinité. On peut citer la séquence 5'-2o AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ m n°10) présente dans le gène de la J3-lactamase de E. coli. Dans ce cas, la thymine interrompant la séquence polypurique peut être reconnue par une guanine du troisième brin, formant ainsi un triplet ATG qui est stable quand il est encadré par deux triplets TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non modifiées) ou modifiées chimiquement. En particulier, foligonucléotide peut présenter avantageusement certaines modifications chimiques permettant d'augmenter sa résistance, sa protection vis-à-vis des nucléases, son affinité vis-à-vis de la séquence spécifique ou permettant encore d'apporter d'autres propriétés additionnelles (J.
3U Goodchild, Corrjugates of Oligonucleotides a»d Modified Oligoriucleotides :
A

Review of their Synthesis and Properties, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1 N°3, 1990, pp. 165-187).
Selon la présente invention on entend aussi par oligonucléotide tout enchaînement de nucléosides ayant subi une modification du squelette. Parmi les modifications possibles on peut citer, les oligonucléotides phosphorothioates gui sont capable de former des triples hélices avec l'ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), de même que les oligonucléotides possédant des squelettes formacétal ou méthylphosphonate (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113.
7767-7768). On peut également utiliser les oligonucléotides synthétisés avec des a lo anomères de nucléotides, qui forment également des triples hélices avec l'ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Une autre modification du squelette est la liaison phosphoramidate. On peut citer par exemple la liaison internucléotidique N3'-P5' phosphoramidate décrite par Gryaznov et Chen, qui donne des oligonucléotides formant avec l'ADN des triples hélices particulièrement stables (J.
Am. Chem. Soc., 1994, 116. 3143-3144). Parmi les autres modifications du squelette, on peut citer également l'utilisation de ribonucléotides, de 2'-O-méthylribose, de phosphotriester,...(Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116. 3143-3144). Le squelette phosphoré peut enfin être remplacé par un squelette polyamide comme dans les PNA (Peptide Nucleic Acid), qui peuvent également former des triples hélices (Nielsen et al., Science, 1991, 254. 1497-1500 ; Kim et al., J. Am. Chem.
Soc., 1993, 115. 6477-6481 ) ou par un squelette à base de guanidine, comme dans les DNG
(déoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92 6097-6101), analogues polycationiques de l'ADN, qui forment également des triples hélices.
La thymine du troisième brin peut aussi être remplacée par une 5-bromouracile, ce qui augmente l'a~nité de foligonucléotide pour l'ADN (Povsic et Dervan, J.
Am.
Chem. Soc., 1989, l I l, 3059-3061). Le troisième brin peut également contenir des bases non naturelles, parmi lesquelles on peut citer la 7-déaza-2'-déoxyxanthosine (Milligan et al., ~ Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), la I-(2-déoxy-b-D-ribofuranosyl)-3-méthyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-one (Koh et Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), la 8-oxoadénine, la 2-WO 99/49067 PCT/FR99/OOb43 aminopurine, la 2'-O-méthyl-pseudoisocytidine, ou toute autre modification connue de l'homme du métier (voir pour revue Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3 345-356).
Un autre type de modification de l'oligonucléotide a plus particulièrement pour objet d'améliorer l'interaction etlou l'affinité entre l'oligonucléotide et la séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse consiste à coupler un agent alkylant à l'oligonucléotide. La liaison peut se faire soit chimiquement, soit photochimiquement par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel photoréactif. Des agents alkylants avantageux sont notamment les agents alkylants photoactivables, par lo exemple les psoralènes. Sous l'action de la lumière, ils forment des liaisons covalentes au niveau de bases pyrimidiques de l'ADN. Quand ces molécules sont intercalées au niveau de séquences 5'-ApT-3' ou 5'-TpA-3' dans un fragment d'ADN double brin, ils forment des liens avec les deux brins. Cette réaction de liaison induite par la lumière peut se produire sur un site spécifique du plasmide.
1~ Comme cela a été souligné précédemment, un avantage de la présente invention est donc la possibilité de former des triples hélices très stables et site-spécifiques entre l'oligonucléotide et une séquence spécifique de l'ADN double brin grâce à une liaison covalente formée via un agent alkylant.
La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'au 2o moins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30 bases. On utilise de manière avantageuse un oligonucléotide de longueur comprise entre 10 et 30 bases. La longueur peut bien entendu être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la stabilité de l'interaction recherchées.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute 25 technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synthétiseurs d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut également être utilisée.

Au sens de l'invention, on entend par « signal de ciblage » des molécules de ciblage de nature variée. Il s'agit dans la plupart des cas de peptides connus pour le ciblage. Ils peuvent être utilisés pour interagir avec un composant de la matrice extracellulaire, un récepteur de la membrane plasmique, pour cibler un compartiment intracellulaire ou pour améliorer le trafic intracellulaire d'ADN, lors du transfert non viral de gènes en thérapie génique.
Ces signaux de ciblage peuvent comprendre par exemple les facteurs de croissance (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), les cytokines (IL-l, IL-2, TNF, Interferon, CSF), les hormones (insuline, hormone de croissance, prolactine, glucagon, lo hormone thyroïdienne, hormones stéroidiennes), les sucres qui reconnaissent des lectines, les immunoglobulines, les ScFv, la transferrine, les lipoprotéines, les vitamines telles que la vitamine B 12, les hormones peptidiques ou les neuropeptides (tachykinines, neurotensine, VIP, endothéline, CGRP, CCK, ...), ou tout motif reconnu par les intégrines, par exemple le peptide RGD, ou par d'autres protéines extrinsèques de la membrane cellulaire.
On peut utiliser des protéines entières, ou des séquences peptidiques dérivées de ces protéines, ou encore des peptides se fixant sur leur récepteur et obtenus par la technique de "phage display" ou par synthèse combinatoire.
Des signaux de cibiage intracellulaires peuvent être envisagés. Beaucoup de 2o séquences d'adressage nucléaire (NLS) de composition en acides aminés variée ont été
identifiées et permettent de cibler différentes protéines impliquées dans le transport nucléaire de protéines ou d'acides nucléiques. Parmi ces séquences figurent notamment des séquences courtes (le NLS de l'antigène T de SV40 (PKKICRICV, SEQ 117 N° I 1 ) est un exemple), des séquences bipartites (le NLS de la nucléoplasmine qui contient deux domaines essentiels pour le transport nucléaire KRPAATKKAGQAKKKKLDK, SEQ ID N°12), ou ia séquence M9 (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, SEQ ID N°13) de la protéine hnRNPAI. Les protéines portant ces séauencec NT.C ~P ~YP.,r ~",~
,~p~
récepteurs spécifiques, tels que les récepteurs de la famille des importines ou karyophérines par exemple. Le rôle de ces séquence est de diriger l'ADN à
l'intérieur du noyau, où il est alors immédiatement disponible pour Ia machinerie de transcription, et peut être exprimé.
Les signaux de ciblage "mixtes", c'est-à-dire qui peuvent à la fois servir pour le ciblage intracellulaire et extracellulaire, entrent également dans le cadre de la présente invention. On peut par exemple citer les sucres qui ciblent des lectines qui se situent sur la membrane cellulaire mais également au niveau des pores nucléaire. Le ciblage par ces sucres concerne donc aussi bien le ciblage extraceIlulaire que l'import nucléaire.
D'autres signaux sont impliqués dans le ciblage mitochondrial (par exemple, la partie N-terminale de l'ornithine transcarbamylase (OTC) de rat permet le ciblage des mitochondries) ou dans l'adressage vers le réticulum endoplasmique. Enfin, certains signaux permettent la rétention nucléaire ou au niveau du réticulum endoplasmique (tels que la séquence KDEL).
Avantageusement, les signaux de ciblage selon l'invention permettent de diriger spécifiquement l'ADN double brin vers certaines cellules ou certains compartiments cellulaires. A titre d'exemple, les signaux de ciblage selon l'invention peuvent cibler des récepteurs ou des ligands à la surface de la cellule, notamment les récepteurs de l'insuline, de la transferrine, de l'acide folique, ou tout autre facteur de croissance, 2o cytokines, ou vitamines, ou des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante.
La synthèse de chimères oligonucléotide-signal de ciblage se fait en phase soude ou en solution et tient compte des propriétés de stabilité chimique très différentes des oligonucléotides et des signaux de ciblage [Erijita, R. et al., Synthesis 2s of defrned peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113-4120]. En solution, des couplages en une étape sont envisageables : le signal de ciblage peut par exemple être synthétisé
avec un groupement portant des fonctions disulfirre, maléimide, amine, carboxyle, ester, époxyde, bromure de cyanogène, ou aldéhyde, et être couplé à un oligonucléotide modifié par un groupement terminal thiol, amine, ou carboxyle en position 3' ou 5'. Ces couplages se forment par établissement de liaisons disulfure, thioéther, ester, amide, ou amine entre I'oligonucléotide et le signal de ciblage. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que les réactifs de 5 couplage bifonctionnel par exempie.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un vecteur tel que défini précédemment.
Avantageusement, les vecteurs selon l'invention peuvent également être associés à un ou plusieurs agents connus pour transfecter l'ADN. On peut citer à titre

10 d'exemple les lipides cationiques qui possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont en effet constitués d'une partie polaire, cationique, interagissant avec l'ADN, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire et rendant l'interraction ionique avec l'ADN insensible au milieu externe. Des exemples particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques 15 (DOTMA : Lipofectin~), certains détergents cationiques (DDAB), les lipopolyamines et en particulier ta dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidyléthanolamine (DPPES) dont la préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 111.
Une autre famille intéressante de lipopolyamines est représentée par les composés décrits dans la demande de brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence.
De nombreux autres lipides cationiques ont été développés et peuvent être utilisés avec les vecteurs selon l'invention.
Parmi les agents de transfection synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran sont également avantageux. II
est aussi possible d'utiliser les polymères de polyéthylène imine (PEI) et de polypropylène imine (PPI) qui sont accessibles commercialement et peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 96/02655.
D'une manière générale, tout agent synthétique connu pour transfecter l'acide nucléique peut être associé aux vecteurs selon l'invention.

WO 99!49067 PCT/FR99/00643 Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de s'associer aux complexes vecteur selon l'invention/agent de transfection et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un vecteur tel que défini précédemment, un ou plusieurs agents de transfection tels que définis ci-avant et un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes vecteur selon l'invention/agent(s) de transfection et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés.
1o Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres dont l'utilisation est particulièrement avantageuse. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl-2U palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides {tels que notamment les asialoGM 1 et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, 3o Biochemistry).

La demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non directement au niveau de la condensation de l'ADN (WO 96/25508). La présence d'un tel composé, au sein d'une composition selon l'invention permet de diminuer la quantité de composé
s transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante.
Par composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un composé compactant, directement ou non, l'ADN. Plus précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'ADN à transfecter soit intervenir au 1o niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au . niveau de l'ADN.
Notamment, cet agent intervenant dans la condensation de l'ADN peut être tout polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation préféré, cet agent peut aussi être tout composé dérivant en tout ou partie d'une histone, d'une nucléoline, 15 d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel agent peut également être constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAICKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature biochimique, par 2o exemple par un ou plusieurs acides aminés, ou de nature chimique.
L'invention a également pour objet l'utilisation des vecteurs tels que définis ci-avant pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies par transfection d'ADN dans des cellules primaires ou dans des lignées cellulaires établies. Il peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules 25 gliales), hépatiques, de la lignée hématopoiétique (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc...), épithéliales, etc..., sous formes différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Les vecteurs de l'invention peuvent à titre illustratif ëtre utilisés pour la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'ADN codant pour des protéines ou des polypeptides.

Pour des utilisations in vivo, soit en thérapie soit pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe.
L'invention concerne en outre une méthode de transfection d'ADN dans les 2o cellules comprenant les étapes suivantes (1) synthèse de la chimère oligonucléotide - signal de ciblage selon le procédé
décrit précédemment, (2) mise en contact de la chimère synthétisée en (1) avec un ADN double brin pour former des triples hélices, (3) éventuellement, complexation du vecteur obtenu en (2) avec un ou plusieurs agents de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvant(s), et (4) mise en contact des cellules avec le complexe formé en (2) ou le cas échéant en (3 ).

La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour de utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse s pour le traitement de maladies par administration d'un vecteur selon l'invention contenant un acide nucléique apte à corriger ladite maladie. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou peptidique, l'ADN administré codant pour ledit produit protéique ou peptidique. La présente invention s'étend à toute utilisation d'un vecteur selon lo l'invention pour la transfection in vivo, ex vivo ou in vitro de cellules.
L'invention concerne également toute cellule recombinante contenant un vecteur tel que défini ci-avant. II s'agit préférentiellement de cellules eucaryotes, par exemple des levures, des cellules animales, etc... Ces cellules sont obtenues par toute technique permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée et connue de 15 l'homme du métier.
Les exemples suivants destinés à illustrer l'invention sans en limiter la portée"
permettent de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
FIG- URSS
2o Fi~~ure 1 : Couplage d'un oligonucléotide (ODN) et du peptide maléimide-NLS.
Fi ure 2 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère oligonucléotide -peptide (Pso-GA19-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo Pso-GA~9-SH
2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA,9-NLS
25 3 = chimère oIigonucléotide-peptide Pso-GA,9-NLS après digestion par la trypsine Fi ure 3 : représentation schématique du plasmide pXL2813.

Figure 4 : représentation schématique du plasmide pXL2652.
Figure 5 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la formation de triples hélices entre le plasmide pXI,2813 et la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAl9-NLS.
L'oligonucléotide pso-GA,9-NLS et le plasmide sont mélangés dans un tampon s contenant 100 mM de MgCl2. L'excès en molarité de l'oligonucléotide par rapport au plasmide varie de 0 à 200. Le mélange est photoactivé, après une nuit à
37°C, puis digéré par deux enzymes de restriction qui coupent le plasmide de part et d'autre de la région de formation des triples hélices.
1 = pas d'oligonucléotide 2 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de I S
3 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 50 4 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 100 5 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 200 6 = oligonucléotide seul photoactivé
15 7 = oligonucléotide seul non photoactivé
8 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 30, le mélange n'ayant pas été photoactivé.
Fi ure 6 : Expression in vitro du transgène (J3-galactosidase) pour des essais effectués avec le plasmide pXL2813 seul, le vecteur pXL,2813-Pso-GA,9-NLS, et sans plasmide.
2o Fi ure 7 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA,9-NLS par interaction avec l'importine 60-GST (analyse sur gel de polyacrylamide I S %).
1 = oligo Pso-GA19 ( I pg) 2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAl9-NLS (l~cg) 3 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'impor-tines 60 et de l'oligonucléotide Pso-GA,9, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant 4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de l'oligonucléotide Pso-GA19, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'impor-5 tines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA~9-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant 6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA19-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant.
Io Fi ure 8 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère oIigonucIéotide-peptide (GA,9-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo GA,9-SH (200 ng) 2 = chimère oligonucléotide-peptide GA,9-NLS ( 1 pg) avant purification par chroma-tographie liquide à haute pression 3 = chimère oligonucléotide-peptide GA~9-NLS ( 1 pg) après purification 4 = chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS après digestion par la trypsine ( 1 ~tg).
Fitxure 9 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples hélices (%
de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide pXL2813 et la chimère GA~9-NLS.
2o F_iRure 10 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère oligonucléotide-peptide GAl9-NLS par interaction avec l'importine 60-GST.
1 = chimère oligonucléotide-peptide GA~9-NLS, 2 = oligo GA,9, 3 - surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide GAIS-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant, 4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec ies importines) du surnageant, - surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de l'oligonucléotide GA,9 et séparation du culot de billes (contenant tes éléments interagissant avec les importines) du surnageant, 6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 5 et de l'oligonucléotide GA,9, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec ies importines) du surnageant.
Figuure 1 I : représentation schématique du plasmide pXL,2997.
Figure 12 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples hélices (% de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide pXL2997 et la chimëre pim-NLS.
Figure 13 : histogramme représentant l'activité ~3-galactosidase in vivo dans des tumeurs pulmonaires humaines H1299 des plasmides pXI,2813 (indiqué Bgal sur la figure) et pXL,2813-Pso-GA,9-NLS (indiqué NLS-Bgal sur la figure) en RLU
(« Relative Light Unit ») par tumeur.
La transfection a été faite en utilisant les techniques d'électrotransfert telles que décrites dans les demandes W099/01157 et WO 99/01158.
MATERIEL ET METAODES
1. Couplage des oligonucléotides et des peptides Les olitxonucléotides 2o Les oligonucléotides utilisés sont soit la séquence 5' AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ m N°4) d'une longueur de 19 bases et référencée sous le nom de « GA,9 » dans la suite du texte, soit la séquence 5' GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ )D N°15) d'une longueur de 13 bases et référencée sous le nom « pim » dans la suite du texte (car il s'agit de la séquence du protooncogène pim-1).
Les oligonucléotides notés GA,9-SH ou pim-SH ont les mêmes séquences que GA,9 et pim respectivement et un groupement thiol à l'extrémité 5', avec un espaceur de six carbones entre le tlliol et le phosphate de l'extrémité 5'. Les oligonucléotides notés Pso-GA19-SH ont un groupement thiol à l'extrémité 3' (SH), et en plus, un psoraiène à
l'extrémité 5' (Pso), avec un espaceur de six carbones entre le psoralène et le phosphate de l'extrémité 5'. Les oligonucléotides notés Pso-GA,9 n'ont pas de groupement thiol.
La nomenclature utilisée est résumée dans le tableau I ci-dessous nom de l'oligonuclotidemodification de l'extrmitmodification de l'extrmit 3' 5' GA,9 aucune aucune Pim aucune aucune GA,9-SH aucune ~ groupement thiol pim-SH aucune groupement thiol Pso-GA,9 aucune psoralne Pso-GA~9-SH groupement thiol psoralne Tableau I
Ces oligonucléotides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de triéthylammonium 100 mM, pH = 7.
Les peptides lo Les peptides utilisés pour les couplages sont synthétisés par un automate en phase solide. Ils contiennent - soit la séquence de localisation nucléaire de l'antigène T de SV40 (PKICKRKV, SEQ
ID N°11), - soit la même séquence mutée (PK1VICRKV, SEQ l'D N° 14) qui ne permet ni ie ciblage ni le transport nucléaire (du fait de la mutation).
Ces peptides portent également un espaceur de quatre acides aminés à
l'extrémité N-terminale : KGAG. La lysine N-terminale est modifiée chimiquement: elle contient un groupement maléimide sur le carbone E et un groupement protecteur 9-fluorenylméthyloxycarbonyl (Fmoc) sur l'amine du carbone a. Ce groupement Fmoc absorbe à 260 nm ce qui permet de suivre le peptide par chromatographie liquide à
haute pression en phase inverse. Le groupement C-terminal est également protégé
(groupement CONHZ), la protection étant ajoutée en fin de synthèse peptidique.
La représentation des peptides est indiquée dans le tableau II ci-dessous nom du peptide squence et modifications malimide-~GAGPKKKRK~-CONHz malimide-NL
S

FF'' moc malimide- KGAGPKNKRKV~--CONHz malimide-NLSmut ' ~
Fmoc Tableau II
Les peptides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de triéthylammonium 100 mM, pH = 7. La concentration est de 0,4 mglml.
Les coula es Pour le couplage avec les oligonucléotides, la stratégie utilisée consiste à
faire réagir le groupement thiol porté par l'oligonucléotide et le groupement maléimide porté
par le peptide [Eritja, R., et al., Synthesis of defrned peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp.

4120].
L'oligonucléotide est ajouté à la solution de peptide de façon équimolaire et le milieu réactionnel est laissé deux heures à température ambiante. La chimère oligonucléotide-peptide est purifiée par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse, sur colonne Vydac C8 contenant de la silice sphéroïdale de diamètre 5 pm et de porosité
300 A. On utilise un tampon acétate de triéthylammonium (TEAA) 0,1 M et un 2o gradient d'acétonitrile passant de 5 % à 50 % en 35 minutes. Les produits sont détectés à 260 nm.

Analyse des chimères par digestion à la trv,_psine Les conjugués oligonucléotide-peptide sont soumis à l'action protéolytique de la trypsine qui permet de mettre en évidence la partie peptidique de la chimère [Reed, M.W. et al, Synthesis and eraluation of nuclear targeting peptide-antisens 5 oligodeoxynucleotide conjugales, Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, pp.101-108J. Des solutions contenant 1 pg d'oligonucléotide-peptide dans 7 111 de tampon de purification tréthylammonium (TEAA) 0,1 M sont mélangés à 1 pl d'une solution de trypsine (5 mg/ml). On y ajoute 1 pl de tampon Tris 100 mM, HCl pH = 9, et 1 pl d'EDTA 500 mM. Après une digestion d'une heure, les échantillons sont déposés dans 10 les puits d'un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M. L'électrophorèse est faite en tampon Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,3. Les acides nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad.
2 . Formation de triples hélices avec les chimères Le plasmide 15 Le plasmide utilisé pour étudier la formation de triples hélices avec les chimères GA,9-peptide est appelé pXi,2813 (7257 pb, voir figure 3). Ce plasmide exprime le gène de Ia (3-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline.
En amont du promoteur, entre les positions 7238 et 7256, la séquence GA19 (5'-2o AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', SEQ ID N°4) a été clonée selon les méthodes classiques de biologie moléculaire.
Elle a été clonée dans le plasmide pXL2652 (de 7391 pb et dont la représentation est schématisée dans la figure 4) qui exprime le gène de la [3-Galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène 25 de résistance à l'Ampicilline. Ce promoteur provient de pCDNA3, le gène LacZ et son polyA proviennent de pCH110, et le reste provient de pGL2.
Les séquences ont été clonées en amont du promoteur entre les sites uniques de coupure des enzymes Muni et XmaI. Pour cela, les deux oligonucléotides complémentaires contenant la séquence à cloner 6651 (5'-3o AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3') et 6652 (3'-CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5') ont été chauffés pendant 5 minutes à
95°C, puis hybridés en laissant la température redescendre lentement.
Le plasmide pXL2652 a ensuite été digéré par les enzymes Muni et XmaI, pendant 2 heures à
37°C, et les produits de cette double digestion ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % et coloration au bromure d'éthidium.
Le fragment d'intérêt pour la suite du clonage a été élué selon le protocole Jetsorb (Genomed) et 200 ng de ce fragment ont été reliés à 10 ng du mélange d'oligonucléotides hybridés par la T4 ligase, pendant 16 heures à 16°C.
Des bactéries E.Coli, compétentes, de souche DHSoc ont été transformées par électroporation avec Ie produit de la réaction, étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu LB et de l'Ampicilline. Les clones résistants à l'Ampicilline ont été
sélectionnés et l'ADN a été extrait par lyse alcaline et analysé sur gel d'agarose à 1 %.
Un clone correspondant, en taille, au produit attendu a été séquencé.
Dans les cas où l'oligonucléotide est pim, le plasmide utilisé pour étudier la formation de priple hélice est pXL2997 représenté à la figure 11. Ce plasmide exprime le gène de la (3-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovin.~s (CM~, ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline.
En amont du promoteur, la séquence pim (SEQ ID N°15) a été clonée selon les méthodes classiques de biologie moléculaire.
zo Formation des triples hélices La formation des triples hélices s'effectue par mélange du plasmide pXL2813 (3 pmol de plasmide soit encore 15 pg) ou pXL2997 selon les cas et de quantités variables d'oügonucléotides ou de chimères dans un tampon Tris 100 mM, HCl pH = 7,5 , et MgCl2 I 00 mM.
2s La nhotoactivation des triples hélices Après une nuit d'incubation, le mélange est irradié, dans la glace, pendant 15 minutes, en utilisant une lampe monochromatique de longueur d'onde 365 nm (Biorad). Le produit de la photoactivation est digéré par les enzymes de restriction MfeI
et SpeI et analysé sur un gel de polyacrylamide 15 %, urée 7 M avec un tampon de migration 3o Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, et pH = 8,3. Les acides nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Musso, M., J.C.
Wang, and M. W. V. Dyke, Ilt VIVO persistence of DNA triple helices containi»g psoraleu-col jugated oligodeoxyribonucleotides, Nucleic Acid Research, 1996, 24(24), pp.4924-4932].
La méthode d'étude des triple hélices Cette méthode est basée sur le principe de chromatographie d'exclusion de solutions contenant le plasmide et l'oligonucléotide susceptibles de former une triple hélice. Les colonnes d'exclusion utilisées (Columns, Linkers 6, Boehringer Mannheim) sont composées de billes de sépharose et ont pour limite d'exclusion 194 paires de bases ce qui permet de retenir dans la colonne les oligonucléotides non appariés aux plasmides.
Dans un premier temps, les oligonucléotides sont marqués radioactivement en leur extrémité 3' par la Terminal Transferase à l'aide de dATPa35S. Le protocole utilisé
provient d'Amersham : 10 pmol d'oligonucléotides sont incubés pendant 2 heures à
37°C, avec 50 pCi de dATPa35S en présence de 10 unités de Terminal Transferase, dans un volume de 50 ui de tampon contenant du cacodylate de sodium. Le pourcentage d'oligonucléotides marqués est évalué selon la méthode suivante :

d'un échantillon dilué au 1/100 de la solution après marquage est déposé sur papier Whatman DE81, en double. L'un des deux papiers est lavé deux fois pendant 5 minutes avec du 2xSSC, pendant 30 secondes avec de l'eau et pendant 2 minutes avec 2o de l'éthanol. Les radioactivités des deux papiers sont comparées. La radioactivité du papier lavé correspond au 35S effectivement incorporé.
La formation des triple hélices se fait dans un volume de 35 ul. Les concentrations de plasmides (40 nM) et d'oligonucléotides (20 nNn, ie tampon utilisé (100 mM de Tris HCI pH = 7,5, 50 mM de MgCl2) et la température (37°C) sont fixes tandis que le temps d'incubation varie de 1 à 24 heures. Les colonnes de sépharose sont équilibrées, avant utilisation, avec le tampon de réaction et centrifugées à 2200 tr/min pendant 4 minutes, pour les tasser. 25 pl du milieu réactionnel sont déposés sur ies colonnes et celles-ci sont centrifugées dans les mêmes conditions que précédemment. 25 pl du WO 99149067 PC'T/FR99/00643 tampon de réaction sont ensuite déposés sur ies colonnes qui sont à nouveau centrifugées. L'éluat est récupéré.
La radioactivité contenue dans 5 pl du milieu réactionnel, notée cpm(dépôt), et celle contenue dans l'éluat, notée cpm(éluat), sont évaluées ce qui permet d'estimer le pourcentage d'oligonucléotides élués d'oligonucléotides élués = cpm(éluat) / [5 x cpm(dépôt}]x100.
Le pourcentage de plasmides qui sont effectivement élués au cours des expériences est évalué en estimant la densité optique à 260 nm de l'éluat et celle du dépôt, ce qui permet de calculer le pourcentage d'oligonucléotides fixés sur la totalité des plasmides d'oligonucléotides fixés = [% oligonucléotides élués / % plasmides élués]x100.
Ce paramètre permet d'évaluer le pourcentage de sites de formation de triples hélices (il en existe un par plasnûde pXL2813 ou pXL2997) qui sont effectivement occupés en tenant compte des concentrations de plasmides (notée [plasmide]) et d'oligonucléotides (notée [oligo]) utilisés lors de ia réaction de formation des triple hélices sites triple hélice occupés = % d'oligonucléotides fixés x [oligo] /
[plasmide].
3. Interaction avec les imnortines Les protéines recombinantes 2o La sous-unité importine 60 utilisée pour étudier l'interaction avec les conjugués oligonuciéotide-peptide (NLS ou NLSmuté) est d'origine murine et fusionnée à
la Glutathion S-Transferase (GST). La séquence de l'importine 60 a été clonée dans un vecteur pGEX-2T pour la fusionner à la GST. La protéine recombinante a été
produite dans Escherichia coli [Imamoto, N. et al., In vivo evidence for involvement of a 58kDa composent of nuclearpore-targeting complex in rruclear protein import, The EMBO
Journal, 1995, 14(15), pp. 3617-3626].
Les interactions avec les protéines recombinantes Toutes les expériences d'interaction sont menées dans le tampon de fixation (HEPES
20 mM, pH = 6,8, acétate de potassium 150 mM, acétate de magnésium 2 mM, DTT
2 mM, et BSA 100 pg/ml).
Dans un premier temps, les protéines recombinantes sont incubées en présence de billes de sépharose recouvertes de groupements glutathion (Pharmacie Biotech) 1 ug de protéine recombinante est utilisé pour 10 pl de billes. Après une incubation de 30 minutes, à température ambiante, dans 500 ul de tampon de fixation, le mélange est centrifugé à 2000 G pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. Les billes sont lavées cinq fois par resuspension dans 500 pl de tampon de fixation et centrifi.~gation, to comme décrit ci-avant. Les billes sont resuspendues dans du tampon de fixation pour obtenir une suspension contenant SO % de billes recouvertes de protéines recombinantes.
Dans un second temps, 60 pl de la suspension contenant 50 % de billes recouvertes de protéines recombinantes sont incubés avec 2 ug d'oligonucléotide ou d'oligonucléotide-peptide, dans un volume de 500 pl de tampon de fixation.
Après une incubation de 30 minutes, à température ambiante, le mélange est centrifugé à

pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. 30 pl du surnageant sont collectés pour analyser la fraction non fixée sur les billes. Les billes sont lavées cinq fois par resuspension dans 500 ul de tampon de fixation et centrifugation, comme décrit ci-2o avant. Les billes sont resuspendues dans 15 pl de tampon de charge (bleu de bromophénol 0,05 %, saccharose 40 %, EDTA 0,1 M, pH = 8, sodium lauryl sulfate 0,5 %) et chauffées 10 minutes à 90°C. Le contenu du surnageant et du culot est analysé sur un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M, avec un tampon de migration Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA I mM, pH = 8,3. Les acides nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Rexach, M.
and G.
Blobel, Protein import into nuclei : association a~:d dissociation reactions involving transport substrate, transport factors, and nucleoporins, Cell, 1995, 83, pp.
683-692).
4. Transfection de cellules Culture cellulaire Le type cellulaire utilisé est NIH3T3 (ATCC CRL-1658). Il s'agit de fibroblastes de souris. Ces cellules sont cultivées dans un milieu Dulbecco modifié, avec du glucose 4,5 g/1 (DMEM - Gibco), de la glutamine 2 mM, de la pénicilline (I00 U/ml) et de la streptomycine ( 100 pg/ml), et 10 % de sérum de veau foetal (Gibco). Elles sont 5 incubées à 37°C dans une étuve à 5 % de COz.
La transfection Un jour avant ia transfection, les puits d'une plaque de 24 puits sont ensemencés avec 50000 cellules par puit. Les vecteurs sont dilués dans du NaCI 1 SO mM et mélangés à
un lipide cationique (le composé de formule condensée 1o H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)~~CH3]2 décrit dans la demande brevet WO 97/18185 sous le numéro (6)), dilué dans dù NaCI 150 mM. Le mélange se fait avec 6 nmol de lipide par microgramme de plasmide. Ce mélange est dilué au 1/10 dans du milieu de culture sans sérum et déposé sur les cellules.
Après une incubation à 37°C dans une étuve à 5 % de COz pendant deux heures, on ajoute 15 I O % de sérum de veau foetal.
La quantification de la (3-galactosidase Après une incubation de 48 heures, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et lysées avec 250 111 de tampon de lyse (Promega). La (3-galactosidase est quantifiée selon le protocole « Lumigal (i-Galactosidase genetic reporter system »
(Clontech).
2o L'activité est mesurée sur un luminomètre Lumat LB9501 (Berthold). La quantité de protéines est mesurée avec le kit BCA (Pierre).
EXEMPLES
Exemple 1 Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide Pso-GA19-SH
au 25 peptide maléimide-NLS.
L'oligonucléotide Pso-GA,9-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', avec un groupement thiol à l'extrémité 3', a été couplé au peptide NLS qui porte un groupement maléimide à son extrémité N-terminale selon la méthode décrite précédemment dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "couplage des oligonucléotides et des peptides".
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. II s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total, et la chimère est purifiée par CLHP.
Le schéma réactionnel du couplage est représenté à la figure 1.
La chimère oligonucléotide-peptide (Pso-GA,9-NLS) a été analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide après action protéolytique de la trypsine qui permet de mettre en évidence la présence de la partie peptidique de la chimère, après migration sur gel 1o de polyacrylamide dénaturant et coloration des acides nucléiques par l'argent (comme indiqué dans la partie "Matériel et méthodes" sous la section "Analyse des chimères par digestion à ia trypsine").
La chimère Pso-GA~9-IVI,S présente une migration électrophorétique retardée par rapport à l'oligonucléotide Pso-GA19-SH, et le produit de la digestion protéolytique est visualisé à un niveau intermédiaire entre les niveaux de migration de Pso-NLS et de Pso-GA,9-SH, comme cela apparaît sur la figure 2.
La chimère Pso-GA19-NLS contient donc une partie peptidique accessible à la trypsine. Ces résultats montrent clairement que le couplage entre l'oIigonucléotide et le peptide s'est opéré, et le rendement du couplage est important.
2o Exemple 2 Cet exemple illustre la formation de triples hélices entre le plasmide pXL2813 et ia chimère Pso-GA19-NLS qui est modifiée par un agent alkylant photoactivable.
Cet exemple indique également quelle est la proportion de plasmides modifiés selon l'excès en molarité d'oligonucléotides par rapport au plasmide:
Le plasmide pXL2813, représenté à la figure 3, comporte la séquence homopurique complémentaire de GA19 qui est susceptible de former une triple hélice avec les oligonucléotides GA,9, Pso-GA19, Pso-GA~9-SH ou Pso-GA,9-NLS. Les cations divalents, tel que Mg2', stabilisent ces triples hélices. L'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS

et le plasmide sont mélangés dans un tampon contenant 100 mM de MgCl2. L'excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide varie de 0 à 200.
Après incubation pendant 12 heures à 37°C, le mélange est photoactivé
pendant 1 S
minutes (comme indiqué dans la partie "matériel et méthodes" sous la section "Photoactivation des triples hélices"), puis digéré par les deux enzymes de restriction MfeI et SpeI qui coupent le plasmide de part et d'autre de la région de formation des triples hélices. On libère ainsi un fragment d'acides nucléiques qui contient 70 paires de bases après digestion du plasmide pXL2813 non modifié. Le fragment obtenu avec le plasmide et l'oligonucléotide formant une triple hélice lié covalemment à
la double to hélice compte 70 paires de bases plus 19 bases de l'oligonucléotide. Par migration sur un gel de polyacrylamide dénaturant, on peut ainsi séparer ces fragments de taille différente: les fragments provenant de plasmides modifiés par une triple hélice ont une distance de migration plus courte que les fragments provenant de plasmides non modifié. On peut donc, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant, quantifier la proportion de plasmides modifiés selon l'excès en molarité
d'oligonucléotide par rapport au plasmide.
Les résultats sont indiqués à la figure 5. Pour un excès en molarité
d'oligonucléotide par rapport au plasmide supérieur à 50, tous les plasmides sont modifiés et sont associés à un oligonucléotide Pso-GA,9-NLS. Sans photoactivation, on perd le 2o retardement du fragment de digestion en gel dénaturant.
II apparaît ainsi que les triples hélices formées avec les oligonucléotides Pso-GA,9-SH
ou Pso-GA,9-NLS sont donc bien liées covalemment à la double hélice après photoactivation.
Par ailleurs, en digérant le reste du squelette plasmidique et en l'analysant comme précédemment, on peut vérifier que la photoactivation n'entraîne pas de liaison covalente non spécifique de l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS en dehors de la région contenant la séquence susceptible de former une triple hélice.
Ces résultats mettent clairement en évidence les conditions permettant d'associer spécifiquement et covalemment une séquence peptidique à un plasmide, et ce en dehors du promoteur régulant l'expression du transgène, ce qui évite que l'expression du transgène n'en soit affectée.
Exemple 3 Cet exemple illustre la capacité du transgène à être exprimé in vitro bien que le plasmide soit modifié.
L'expression de la /3-galactosidase par les plasmides pXL2813 non modifiés ou associés à un oligonucléotide Pso-GA,9-NLS a ainsi été comparée par transfection de cellules lVIFi3T3.
Les résultats sont reportés dans la figure 6, et les moyennes des valeurs obtenues (~ écart type) sont rassemblées dans le tableau III suivant expression du transgne plasmide (en RLU/pg de protine) pXL2813 253759 48545 pXL2813-Pso-GA19-NLS473984 111476 sans plasmide 129 85 Tableau III
On constate que l'expression du transgène augmente suite à la modification apportée par la fixation covalente d'une triple hélice en amont du promoteur.
Ces résultats mettent clairement en évidence que la formation des triples hélices n'affecte pas l'expression du transgène in vitro. Au contraire, grâce à
l'adressage nucléaire du plasmide du fait de son couplage à la séquence de ciblage NLS, davantage de plasmides ont atteint le noyau, et il en résulte une augmentation de l'efficacité de transfection.
Exemple 4 2o Get exemple a pour but de vérifier que l'expression in vivo n'est pas inhibée par la présence d'un signal de ciblage associé au plasmide via une triple hélice.

L'expérience consiste à transfecter pXL2813 et pXI,2813-Pso-GA19-NLS dans des tumeurs pulmonaires humaines H1299 en utilisant les techniques d'électrotransfert décrites dans les demandes WO 99/01157 et WO 99/01158. L'expérience a été
réalisée chez la souris nude femelle de 18 à 20 g.
Les souris sont implantées monolatéralement avec des greffons de tumeurs H1299 de 20 mm3. Les tumeurs se développent pour atteindre un volume de 200 à 300 mm3.
Les souris sont triées en fonction de leur tailles tumorales et réparties en lots homogènes.
Puis les souris sont anesthésiées avec un mélange Kétamine/Xylazine (disponible commercialement). La solution de plasmide (8 pg d'ADN/40 pl de chlorure de sodium lo I50 mM) est injectée longitudinalement en périphérie de la tumeur à l'aide d'une seringue Hamilton.
Les faces latérales de la tumeur sont enduites de gel conducteur et la tumeur est placée entre deux électrodes plates en acier inoxydable distante de 0,45 à 0,7 em.
Les impulsions électriques sont appliquées à l'aide d'un générateur d'impulsions carrées du commerce (Electro-puisateur PS 15, Jouan, France) 20 à 30 secondes après l'injection.
Un oscilloscope permet de contrôler l'intensité en volts, la durée en millisecondes et la fréquence en hertz des impulsions qui doivent ëtre délivrées à 500 V/cm pendant 20 millisecondes et à 1 hertz.
Pour l'évaluation de la transfection tumorale, 10 et 7 souris respectivement pour le plasmide pXL,2813 et pXL2813-Pso-GAl9-NLS sont euthanasiées 2 jours après l'injection du plasmide. Les tumeurs sont prélevées, pesées et boyées dans un tampon de lyse (Promega) additionné d'antiprotéases (Complete, Boehringer). La suspension obtenue est centrifugée afin d'obtenir un surnageant clair. Après avoir incubé
10 ltl de ce surnageant avec 250 pl de tampon de réaction (Clontech) pendant 1 heure à
l'obscurité, l'activité ~i-galactosidase est mesurée à l'aide d'un luminomètre du commerce. Les résultats sont exprimés en RLU (« Relative Light Unit ») totaux par tumeur.
On constate que le plasmide pXL2813-Pso- GA,9-NLS exprime le transgène in vivo à
un niveau supérieur ou égal à celui obtenu avec ie plasmide pXL2813 non-modifié
(voir figure 13).

Exemple 5 Cet exemple illustre la caractérisation de la partie peptidique des conjugués Pso-GA~9-NLS, c'est-à-dire la vérification des propriétés de ciblage du peptide NLS
associé aux constructions selon l'invention.
5 La séquence peptidique utilisée, ie signal NLS de l'antigène T de SV40, est reconnue par des récepteurs de la famille des karyophérines a. L'équivalent murin, appelé
importine 60, fusionné à un groupement glutathion S-transferase, a été utilisé
pour caractériser les conjugués oligonucléotide-peptide. Il a été opéré selon la méthode décrite dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "Interactions avec les 10 importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et les oligonucléotides GA,9-NLS ou Pso-GA19-NLS ont été étudiées. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant 15 Le résultat de cette caractérisation est reporté à la figure 7. Cette figure indique que l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS est associé aux billes de glutathion, tandis que l'oligonucléotide Pso-GA,9 reste dans le surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS à
interagir avec l'importine a. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est donc bien 2o reconnue par son récepteur, ce qui signifie que le peptide remplit effectivement son rôle de signal de ciblage.
Exemple 6 Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide GA19-SH au peptide maléimide-NLS. Contrairement à l'exemple 1, Ia chimère n'est pas modifiée par un 25 agent alkylant photoactivable.
L'oligonucléotide GA,9-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ m N° 4), avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé
au peptide maléimide-NLS qui possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale dans les mêmes conditions que pour l'oligonucléotide Pso-GA,9-SH (voir exemple 1), WO 99/49067 PCT/E'R99/00643 Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
La chimère oligonucléotide-peptide a été analysée par action protéolytique de la trypsine comme décrit dans la partie "Matériel et méthodes".
Le résultat est représenté sur la Figure 8. Il est comparable à celui obtenu avec l'oligonucléotide Pso-GAt9-SH.
Exemple 7 Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le plasmide l0 pXL2813 et la chimère GA,9-NLS en l'absence d'agent alkylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL,2813 et la chimère GA,9-NLS obtenue comme décrit dans l'exemple 5, a été menée et étudiée selon la technique décrite dans la partie"Matériel et Méthodes", sous la section "Formation des triples hélices avec la chimère".
La figure 9 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et en oligonucléotide de 20 nM, on forme une triple hélice stable.
Exemple 8 Cet exemple illustre ia caractérisation de la partie peptidique de la chimère GAl9-NLS.
2o La séquence peptidique utilisée, le signal IVLS de l'antigène T de SV40, est reconnue par des récepteurs de la famille des karyophérines a, comme cela a déjà été
mentionné
à i'exemple 4. L'équivalent murin, appelé importine 60, fusionné à un groupement glutathion S-transferase, a été utilisé pour caractériser les conjugués oligonucléotide peptide. Il a été opéré comme décrit dans "Matériel et Méthodes" sous la section "Interactions avec les importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et les oligonucléotides GA,9 ou GA,9-NLS ont été étudiées. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant ies éléments interagissant avec Ies importines) du surnageant.
Les résultats sont indiqués sur la figure 10. II aparait que l'oligonucléotide GA~9-NLS
est associé aux billes de glutathion, tandis que l'oligonucléotide GA19 reste dans le surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide GA~9-NLS à interagir avec l'importine a. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est donc bien reconnue par son récepteur, et remplie là encore son rôle de signal de ciblage.
Exemple 9 lo Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide' pim-SH au peptide maléimide-NLS.
L'oligonucléotide pim-SH, de séquence 5'-GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ ID
N°15), avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé au peptide maléimide-NLS qui possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale dans les mêmes conditions que pour l'oligonucléotide GAIS-SH (voir exemple 5).
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
Exem,- ple 10 2o Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le plasmide pXL2997 et la chimère pim-NLS en l'absence d'agent allrylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL2997 et la chimère pim-NLS (formation obtenue comme décrit dans l'exemple 8), a été menée et étudiée selon la technique décrite dans la partie "Matériel et Méthodes", sous la section 2s "Formation des triples hélices avec la chimère".
La figure 12 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et en oligonucléotide de 20 rtM, on forme une triple hélice stable.

L'invention étant à présent complètement décrite, il est évident que de nombreuses modifications peuvent être apportées à la présente invention sans pour autant s'écarter de l'esprit de l'invention et de la portée des revendications qui suivent.

WO 99/49067 , PCT/FR99/00643 LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
( i. ) DÉPOSANT:
in) NOM: RHONE POULENC ROBER
(D) RUE: 20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY CEDEX
( E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TÉLÉPHONE: Oï.55.71.73.26 (H) TÉLÉCOPIE: 01.55.71.72.91 (ü ) TITRE DE L'INVENTION: VECTEURS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLÉIQUES, COMPOSITIONS LES CONTENANT, ET LEURS UTILISATIOlJS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES:15 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible ' (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Pater.tIn Release I(1.0, Version N1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR IA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOhIBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUR.~TION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ai) DESCRIPTIOl4 DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (CI NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: A:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA . 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 5:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT lg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERTSTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGIE 26) WO 99!49067 PCT/FR99/00643 (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 9:

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 10:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(1) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp Lys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 13:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26) (i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés (B1 TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly Azg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro Arg Asn Gln Gly Gly Tyr (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 14:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés fB) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Pro Lys Asn Lys Arg Lys Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 15:
fi) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 15:

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGIE 26)

Claims (42)

REVENDICATIONS

1. Vecteur de transfert d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double brin et au moins un oligonucléotide couplé à un signal de ciblage et capable de former une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ladite molécule d'ADN double brin.

2. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin est un plasmide ou un épisome.

3. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 2 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin est un plasmide sous forme circulaire et dans un état superenroulé.

4. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actif dans les cellules de mammifères.

5. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène d'intérêt est un acide nucléique codant pour un produit thérapeutique.

6. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à

caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin est une séquence homopurique-homopyrimidique.

7. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à

caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin est une séquence présente naturellement sur l'ADN double brin ou une séquence synthétique ou naturelle introduite artificiellement dans l'ADN double brin.

8. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à

caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend une séquence poly-CTT et la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin est une séquence poly-GAA.

9. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à

caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend la séquence GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID NO 1 ) ou bien la séquence (CTT)7 (SEQ ID NO 2).

10. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin comprend la séquence 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID NO 3) et l'oligonucléotide comprend la séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ
ID NO 4) ou 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID NO 5).

11. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin comprend tout ou partie de la séquence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID NO 6) comprise dans l'origine de réplication CoIE 1 de E. coli, et l'oligonucléotide possède la séquence 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ
ID NO 7).

12. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin comprend la séquence 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO 8) ou la séquence 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID NO 10) comprises dans le gène .beta.-lactamase du plasmide pBR322 et de E. Coli respectivement.

13. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN
double brin comprend la séquence 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID no 9) présente dans l'origine de réplication .gamma. des plasmides à origine de réplication conditionnelle tel que pCOR.

14. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend au moins 3 bases.

15. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon 1a revendication 14 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend 5 à 30 bases.

16. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que l'oligonucléotide présente au moins une modification chimique le rendant résistant aux, ou protégé vis-à-vis des nucléases, ou augmentant son affinité
vis-à-vis de la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin.

17. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que l'oligonucléotide est un enchaînement de nucléosides ayant subi une modification du squelette.

18. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que l'oligonucléotide est couplé à un agent alkylant formant une liaison covalente au niveau des bases de l'ADN double brin.

19. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 18 caractérisé en ce que ledit agent alkylant est photoactivable.

20. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 18 et 19 caractérisé en ce que ledit agent alkylant est un psoralène.

21. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 20 caractérisé
en ce que le signal de ciblage interagit avec un composant de la matrice extracellulaire, un récepteur de la membrane plasmique, cible un compartiment intracellulaire, et/ou améliore le trafic intracellulaire de l'ADN double brin.

22. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisé en ce que ledit signal de ciblage comprend les facteurs de croissance (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), les cytokines (IL-1, IL-2, TNF, Interferon, CSF), les hormones (insuline, hormone de croissance, prolactine, glucagon, hormone thyroïdienne, hormones stéroidiennes), les sucres qui reconnaissent des lectines, les immunoglobulines, la transferrine, les lipoprotéines, les vitamines telles que la vitamine B12, les hormones peptidiques ou les neuropeptides (tachykinines, neurotensine, VIP, endothéline, CGRP, CCK, ...), ou tout motif reconnu par les intégrines, par exemple le peptide RGD, ou par d'autres protéines extrinsèques de la membrane cellulaire.

23. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisé en ce que le signal de ciblage est un signal de ciblage intracellulaire, tel qu'une séquence d'adressage nucléaire (NLS).

24. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 23 caractérisée en ce que ledit signal d'adressage nucléaire est la séquence NLS de l'antigène T
de SV40.

25. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisée en ce que le signal de ciblage permet à la fois le ciblage extracellulaire et le ciblage intracellulaire.

26. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 25 caractérisé
en ce que le couplage du signai de ciblage à l'oligonucléotide est obtenu par synthèse en phase solide ou en solution, notamment par l'établissement de liaisons disulfure, thioéther, ester, amide, ou amine.

27. Composition caractérisée en ce qu'elle contient au moins un vecteur tel que défini dans l'une des revendication 1 à 26.

28. Composition selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs agents transfectant.

29. Composition selon la revendication 28 caractérisée en ce que l'agent transfectant est un lipide cationique, une lipopolyamine, ou un polymère cationique.

30. Composition selon les revendications 27 à 29 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs adjuvant(s) capable de s'associer aux complexes vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 à 25/agent transfectant.

31. Composition selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'adjuvant est un ou plusieurs lipides neutres choisis parmi les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.

32. Composition selon l'une des revendications 30 ou 31 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les lipides à deux chaînes grasses.

33. Composition selon les revendications 30 à 32 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines), et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2).

34. Composition selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'adjuvant est ou comprend un composé intervenant au niveau de la condensation de l'ADN.

35. Composition selon la revendication 34 caractérisée en ce que ledit composé
dérive en tout ou en partie d'une histone, d'une nucléoline, et/ou d'une protamine, ou est constitué en tout ou en partie de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA) répétés de manière continue ou non, le nombre de motifs pouvant varier entre 2 et 10.

36. Composition selon l'une quelconque des revendications 27 à 35 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.

37. Composition selon l'une quelconque des revendications 27 à 35 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou sur les muqueuses.

38. Utilisation d'un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26 pour la fabrication d'un médicament destiné à soigner les maladies.

39. Méthode de transfection d'acides nucléiques dans des cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes:
(1) synthèse de la chimère oligonucléotide - signal de ciblage, (2) mise en contact de la chimère synthétisée en (1) avec un ADN double brin pour former des triples hélices, (3) éventuellement, complexation du vecteur obtenu en (2) avec un ou plusieurs agent de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvant(s), et (4) mise en contact des cellules avec le complexe formé en (2) ou le cas échéant en (3).

40. Méthode de traitement de maladies par administration d'un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26 contenant un ADN double brin apte à corriger ladite maladie.

41. Cellule recombinante contenant un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26.

42. Cellule recombinante selon la revendication 41 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote.