BRPI1106310A2

BRPI1106310A2 - METHOD FOR MOLECULAR DETECTION AND FORECASTING OF ONCOGENICITY OF HUMAN PAPILOMAVIRUS (HPV)

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Publication number: BRPI1106310A2
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Publication date: 2017-01-03

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MÉTODO PARA DETECÇÃO MOLECULAR E PREVISÃO DA ONCOGENICIDADE DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) RELATÓRIO DESCRITIVOMETHOD FOR MOLECULAR DETECTION AND FORECASTING HUMAN PAPILOMAVIRUS (HPV) ONCOGENICITY DESCRIPTIVE REPORT

Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo métodos e dispositivos baseados em PCR, sequenciamento e plataformas microflúidicas para diagnóstico, com posterior comparação com banco de dados. Especificamente, refere-se a um método para detecção e tipificação in vitro de HPV através da amplificação e sequenciamento do DNA viral e permite prever a oncogenicidade, alto ou baixo risco para câncer, dos tipos de HPV não caracterizados, e de novos tipos não detectados, de forma rápida, antes mesmo dos estudos epidemiológicos.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the field based PCR-based methods and devices, sequencing and microfluidic diagnostic platforms, with subsequent database comparison. Specifically, it refers to a method for in vitro detection and typing of HPV by amplifying and sequencing viral DNA and allows predicting the oncogenicity, high or low risk for cancer, of uncharacterized HPV types, and of new undetected types. , quickly, even before epidemiological studies.

Antecedentes da Invenção A correlação entre o Papilomavírus humano (HPV) e o câncer do colo do útero vem sendo estudada desde 1974, mas foi em 2000 que a comunidade médica passou a considerar esta relação importante e após a comprovação da associação do vírus com o câncer do colo do útero, a Organização Mundial de Saúde (OMS) reconheceu o câncer cervical como o primeiro a estar necessariamente associado a uma infecção pelo HPV. Anteriormente associado somente ao colo do útero, e da região genital, o HPV vem sendo encontrado em diversos outros sítios como: trato digestivo superior, anus, colo, reto, pênis, boca, cavidade oral, língua, seios paranasais, faringe, laringe, pulmão, olhos, seios e estômago. Além destes sítios, o HPV ainda foi encontrado no sangue, unhas, folículo capilar, ouvido, próstata e bexiga. Em alguns casos o HPV está associado ao câncer nestes órgãos.BACKGROUND OF THE INVENTION The correlation between human papillomavirus (HPV) and cervical cancer has been studied since 1974, but it was in 2000 that the medical community began to consider this relationship important and after proving the association of the virus with cancer. Cervical cancer, the World Health Organization (WHO) recognized cervical cancer as the first to be necessarily associated with an HPV infection. Formerly associated only with the cervix and the genital region, HPV has been found in several other sites such as: upper digestive tract, anus, cervix, rectum, penis, mouth, oral cavity, tongue, paranasal sinuses, pharynx, larynx, lung, eyes, breasts and stomach. In addition to these sites, HPV was also found in blood, nails, hair follicle, ear, prostate and bladder. In some cases HPV is associated with cancer in these organs.

Com o desenvolvimento de novas técnicas moleculares nos anos 1980 foi possível detectar um grande número de tipos de papillomavirus associados a lesões benignas e malignas nas mucosas. Mais de 200 tipos e subtipos são conhecidos, sendo mais de 100 destes genomas sequenciados e bem caracterizados, e outros 120 isolados parcialmente caracterizados. O gênero clinicamente mais importante é o alfa-papillomavirus onde estão presentes os tipos de HPV geralmente associados a lesões genitais e mucosas. A classificação dos tipos de HPV em categorias tais como "não-cancerígenos" ou "cancerígenos", baixo ou alto risco para câncer, baseia-se em estudos epidemiológicos, associações filogenéticas e predições por métodos computacionais. Epidemiologicamente, os tipos de HPV de baixo risco (LR-HPV) estão associados com verrugas e lesões genitais e cutâneas. Os tipos de alto risco (HR-HPV) estão associados diretamente com carcinoma invasivo, devido ao seu potencial oncogênico. O potencial oncogênico do HPV é principalmente devido às proteínas E6 e E7 que se ligam as proteínas p53 e pRb respectivamente. Estas proteínas são expressas em um estágio inicial da infecção e estão envolvidas com o desenvolvimento do câncer. O principal método na detecção de alterações celulares no tecido do colo do útero é o teste de Papanicolau, desenvolvido em 1949, antes mesmo da causa do câncer cervical ser conhecida. O teste tem uma especificidade alta, mas uma sensibilidade baixa, sendo impossível eliminar resultados falso-negativos e falso-positivos na citologia cervical.With the development of new molecular techniques in the 1980s it was possible to detect a large number of papillomavirus types associated with benign and malignant mucosal lesions. More than 200 types and subtypes are known, with more than 100 of these genomes sequenced and well characterized, and another 120 partially characterized isolates. The clinically most important genus is alpha-papillomavirus, where HPV types commonly associated with genital and mucosal lesions are present. The classification of HPV types into categories such as "non-carcinogenic" or "carcinogenic", low or high risk for cancer, is based on epidemiological studies, phylogenetic associations and predictions by computational methods. Epidemiologically, low-risk HPV (LR-HPV) types are associated with warts and genital and skin lesions. High-risk types (HR-HPV) are directly associated with invasive carcinoma due to their oncogenic potential. The oncogenic potential of HPV is mainly due to the E6 and E7 proteins that bind p53 and pRb proteins respectively. These proteins are expressed at an early stage of infection and are involved with cancer development. The main method for detecting cellular changes in cervical tissue is the Pap smear, developed in 1949, even before the cause of cervical cancer was known. The test has high specificity but low sensitivity and it is impossible to eliminate false negative and false positive results in cervical cytology.

Estudos demonstraram que o uso de metodologias baseados na detecção do D NA são mais sensíveis e mais eficientes na detecção da presença do HPV e alterações associadas ao câncer do colo do útero do que o teste de Papanicolau. Esta detecção do DNA do vírus pode ser utilizado para diferentes propósitos: na identificação de mulheres com risco de desenvolver o câncer cervical e em programas de triagem; em experimentos com vacinas e estudos epidemiológicos obtendo-se o máximo de informações sobre o HPV em determinada população e após o tratamento para ajudar a identificar a presença ou ausência de lesões residuais.Studies have shown that the use of methodologies based on detection of NAD are more sensitive and more efficient in detecting the presence of HPV and cervical cancer-associated changes than the Pap smear. This detection of virus DNA can be used for different purposes: in identifying women at risk of developing cervical cancer and in screening programs; Vaccine experiments and epidemiological studies provide maximum information on HPV in a given population and after treatment to help identify the presence or absence of residual lesions.

Um dos métodos de detecção direta do HPV, o método de captura híbrida (HC) é descrito na patente WO 93/10263 pela Digene onde sondas de sequências de RNA específicas para cada tipo de HPV são hibridizadas com o DNA viral, formando após incubação híbridos de RNA/DNA que podem ser detectados utilizando-se anticorpos monoclonais. A captura híbrida permite a diferenciação entre tipos de HPV de alto e baixo risco, mas não a identificação do tipo de HPV, além disso o coquetel de sondas utilizado resulta em reações cruzadas entre tipos de HPV das duas classes. A captura híbrida é um método que diferencia somente entre alto e baixo risco.One of the direct HPV detection methods, the hybrid capture (HC) method is described in WO 93/10263 by Digene where probes of HPV type-specific RNA sequences are hybridized to viral DNA, forming hybrid incubations after incubation. RNA / DNA that can be detected using monoclonal antibodies. Hybrid capture allows the differentiation between high and low risk HPV types, but not the identification of the HPV type, and the probe cocktail used results in cross reactions between HPV types of both classes. Hybrid capture is a method that differentiates only between high and low risk.

Na patente US 12645202 intitulada “HPV E6, E7 MRNA ASSAY AND METHODS OF USE THEREOF” de 13 e maio de 2010, descreve outro método de detecção direta onde a presença e a quantificação de mRNA dos genes E6 e E7 do HPV são identificados através da hibridização in situ via citometria de fluxo. O método tem a capacidade e a sensibilidade de detectar células anormais (cancerígenas e pré-cancerígenas) e células normais em estágio de transformação maligna. Entretanto o método também não diferencia o tipo viral detectado. Já para os métodos indiretos, que se utilizam da reação em cadeia da polimerase (PCR) como passo na detecção do DNA do HPV, foram desenvolvidos vários testes nos últimos anos. Após a amplificação do DNA pela PCR, o produto pode ser detectado por diferentes métodos como: sequenciamento de DNA, polimorfismo de comprimento do fragmento de DNA ou hibridização de ácido nucléico.US Patent 12645202 entitled "HPV E6, E7 MRNA ASSAY AND METHODS OF USE THEREOF" of May 13, 2010, describes another direct detection method where the presence and quantitation of HPV E6 and E7 mRNA genes are identified by in situ hybridization via flow cytometry. The method has the ability and sensitivity to detect abnormal cells (cancerous and precancerous) and normal cells in the stage of malignant transformation. However the method also does not differentiate the detected viral type. For indirect methods, which use polymerase chain reaction (PCR) as a step in the detection of HPV DNA, several tests have been developed in recent years. After DNA amplification by PCR, the product can be detected by different methods such as DNA sequencing, DNA fragment length polymorphism or nucleic acid hybridization.

Na patente US 5.182.377 intitulada “Probes for detection of Human Papillomavirus” de 26 de janeiro de 1993, descreve um método de detecção por primers consensos do gene L1 para os tipos 6, 11, 16, 18, 31 e 33. A patente US 10.529.447 intitulada “Method and kit for quantitative and qualitative determination of Human papillmavirus” de 15 de fevereiro de 2007, descreve um método de detecção e quantificação através de PCR em tempo real dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52 e 58.US Patent 5,182,377 entitled "Probes for detection of Human Papillomavirus" of January 26, 1993, discloses a method of detection by consensus primers of the L1 gene for types 6, 11, 16, 18, 31 and 33. The patent US 10,529,447 entitled "Method and Kit for Quantitative and Qualitative Determination of Human Papillmavirus" of February 15, 2007, describes a method for detection and quantification by real-time PCR of types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52 and 58.

Por fim a patente US 11.175.884 intitulada “Selective detection of oncogenic HPV” de 30 de julho de 2009 descreve um método de detecção do HPV baseado na amplificação e hibridização de primers e sondas na detecção dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59 e 68.Finally, US Patent 11,175,884 entitled "Selective detection of oncogenic HPV" of July 30, 2009 describes an HPV detection method based on amplification and hybridization of primers and probes for detection of types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59 and 68.

Nenhuma das patentes citadas acima, tipifica e diferencia os tipos de HPV entre alto e baixo risco. A presente invenção diferencia-se neste sentido, tipificando e pré-avaliando a oncogenicidade dos tipos virais encontrados na amostra.None of the above patents typifies and differentiates HPV types between high and low risk. The present invention differs in this regard by typifying and pre-evaluating the oncogenicity of the viral types found in the sample.

Desta forma, apesar de vários métodos existentes de detecção da presença do HPV, há uma necessidade de encontrar novos métodos eficientes e sensíveis para a detecção da presença do DNA viral, fornecendo informações de diagnóstico e prognóstico para os médicos que tratam pacientes infectados pelo HPV, principalmente aqueles considerados de alto risco para câncer. A observação e análise de padrões dos genes E6 e E7 podem auxiliar na classificação prévia de novos HPV encontrados, bem como elucidar a classificação divergente quanto ao oncogenicidade fazendo com o que o prognóstico de infecções de tipos ainda não estudos possa ser mais rápido.Thus, despite several existing methods for detecting HPV presence, there is a need to find new efficient and sensitive methods for detecting viral DNA, providing diagnostic and prognostic information for physicians treating patients with HPV, especially those considered at high risk for cancer. The observation and analysis of E6 and E7 gene patterns may help in the previous classification of new HPV found, as well as elucidate the divergent classification regarding oncogenicity, making the prognosis of type infections not yet studied faster.

Um dos objetivos da presente invenção é desenvolver pares de oligonucleotídeos que se liguem especificamente a porção C-terminal (final) do gene E6 e da porção N-terminal (inicial) do gene E7 do HPV para amplificação de grupos específicos. É ainda objetivo da presente invenção é por a disposição um método para identificação e diferenciação entre os tipos de HPV de baixo e alto risco para câncer através do DNA viral. Por fim é objetivo da presente invenção disponibilizar um método de identificação da oncogenicidade de novos tipos de papilomavírus humanos baseado em sequências de DNA específicas.It is an object of the present invention to develop pairs of oligonucleotides that specifically bind the C-terminal (final) portion of the E6 gene and the N-terminal (initial) portion of the HPV E7 gene for amplification of specific groups. It is a further object of the present invention to provide a method for identifying and differentiating low and high risk HPV types for cancer through viral DNA. Finally, it is an object of the present invention to provide a method for identifying the oncogenicity of novel types of human papillomavirus based on specific DNA sequences.

Descrição da Invenção A presente invenção descreve métodos e composições para detectar a presença de uma região gênica relacionada aos organismos-alvo, evitando a detecção em organismos não-alvo.Description of the Invention The present invention describes methods and compositions for detecting the presence of a target organism-related gene region, avoiding detection in non-target organisms.

Especificamente, o primeiro aspecto da presente invenção inclui composições e métodos para detecção de sequências de ácidos nucléicos em vários tipos de HPV que podem estar presentes em uma amostra biológica provenientes de seres humanos. Em um segundo aspecto esta invenção diferencia os tipos oncogênicos dos tipos não oncogênicos através da região que compreende da porção C-terminal do gene E6 até a porção N-terminal do gene E7. Por fim a invenção utiliza-se de um método inovador de comparação de sequências do DNA viral encontrado na amostra para a identificação e predição da oncogenicidade dos tipos de HPV detectados. O método de predição da oncogenicidade da presente invenção está relacionado especificamente com a região entre os genes mencionados acima. Análises de bioinformática mostraram que nos HPVs considerados de baixo risco a porção final do gene E6 se sobrepõem ao início do gene E7. Já para os tipos considerados de alto risco existe uma região intergênica, uma distância entre os genes.Specifically, the first aspect of the present invention includes compositions and methods for detecting nucleic acid sequences in various types of HPV that may be present in a biological sample from humans. In a second aspect this invention differentiates oncogenic types from non-oncogenic types by the region comprising from the C-terminal portion of the E6 gene to the N-terminal portion of the E7 gene. Finally, the invention uses an innovative method for comparing viral DNA sequences found in the sample to identify and predict oncogenicity of the detected HPV types. The oncogenicity prediction method of the present invention is specifically related to the region between the above mentioned genes. Bioinformatics analysis showed that in low-risk HPVs the final portion of the E6 gene overlaps the beginning of the E7 gene. For the types considered high risk there is an intergenic region, a distance between genes.

Estas sequências e métodos são úteis para o diagnóstico de infecções por HPV, incluindo infecções persistentes na qual a detecção do vírus fornece informações prognosticas relativas à carcinogênese. As sequências e os ensaios também são úteis para monitorar o estado de um paciente que se encontra no grupo de risco para o desenvolvimento de câncer, e na avaliação e monitoramento da resposta de um paciente a um tratamento terapêutico, como por exemplo as vacinas já desenvolvidas contra o HPV.These sequences and methods are useful for the diagnosis of HPV infections, including persistent infections in which virus detection provides prognostic information regarding carcinogenesis. Sequences and assays are also useful for monitoring the status of a patient in the cancer risk group, and for evaluating and monitoring a patient's response to a therapeutic treatment, such as vaccines already developed. against HPV.

Para a comparação da região alvo de amplificação do DNA, sequências conhecidas foram obtidas a partir da base de dados do Genbank disponível publicamente. As sequências foram alinhadas utilizado-se algoritmos específicos e as regiões de interesse foram selecionadas. Nestas regiões foram selecionados oligonucleotídeos e testes de conteúdo GC, temperatura de melting, auto e inter-hibridização foram feitos afim de encontrar os melhores dentro dos critérios estabelecidos.For comparison of the DNA amplification target region, known sequences were obtained from the publicly available Genbank database. The sequences were aligned using specific algorithms and the regions of interest were selected. In these regions were selected oligonucleotides and tests of GC content, melting temperature, self and interhybridization were made in order to find the best within the established criteria.

No aspecto que compete a detecção do DNA do HPV e sua identificação e/ou predição oncogênica a presente invenção compreende as seguintes etapas: (I) Amostras Clínicas: A separação/extração do DNA do restante do material biológico varia de acordo com a fonte da amostra obtida. As amostras serão tratadas com o kit de extração de DNA específico para cada tipo de amostra sendo esta extração manual ou automatizada. A extração do DNA (etapa I) é uma etapa importante neste método. O DNA extraído precisa estar limpo e livre de impurezas, e deve ser quantificado através de espectrometria de UV a fim de descobrir a quantidade de molde a ser usada na reação de PCR (etapa II), deste modo permitindo padronização dos resultados. (II) Amplificação do DNA viral: O DNA obtido de amostras clínicas (I) será amplificado por PCR utilizando-se os primers especificamente desenvolvido), que flanqueiam a região que compreende a porção C-terminal do gene E6 até a porção N-terminal do gene E7. (II) Diferenciação oncoaênica: O produto da amplificação da etapa (II) pode ser então sequenciado através de seqüenciadores automáticos (lia) e posteriormente analisado. Como método alternativo pode-se utilizar as plataformas microfluídicas (llb) onde o produto da amplificação será dimensionado e quantificado. (III) Análise e processamento: O resultado obtido na etapa de sequenciamento (llla) será analisado através da comparação direta da sequência obtida com os registros do banco de dados de DNA dos tipos virais. Já o resultado obtido pela plataforma de microflúidos (lllb) será analisado pela inspeção da imagem do gel e posterior comparação com o banco de dados. O método acima descrito assegura que no caso positivo para a detecção do DNA de HPV na amostra, é possível identificar e predizer a oncogenicidade do tipo viral por um processo rápido e simples. A figura 1 descreve o organograma básico da presente patente com os passos necessários para obtenção dos resultados. A figura 2 descreve uma árvore filogenética baseada nos genes E6 e E7 demonstrando que existe uma clara separação entre o grupo de alto risco e baixo risco.As far as HPV DNA detection and its oncogenic identification and / or prediction is concerned, the present invention comprises the following steps: (I) Clinical Samples: The separation / extraction of DNA from the remaining biological material varies according to the source of the DNA. sample obtained. Samples will be treated with the specific DNA extraction kit for each type of sample, either manual or automated extraction. DNA extraction (step I) is an important step in this method. The extracted DNA must be clean and free of impurities, and must be quantified by UV spectrometry in order to find out the amount of template to be used in the PCR reaction (step II), thus allowing standardization of the results. (II) Viral DNA Amplification: DNA obtained from clinical samples (I) will be PCR amplified using specifically developed primers), which flank the region comprising the C-terminal portion of the E6 gene to the N-terminal portion. of the E7 gene. (II) Oncoenic differentiation: The amplification product of step (II) can then be sequenced by automated sequencers (IIa) and further analyzed. As an alternative method one can use microfluidic platforms (11b) where the amplification product will be sized and quantified. (III) Analysis and Processing: The result obtained in the sequencing step (IIIa) will be analyzed by directly comparing the obtained sequence with the DNA database records of viral types. The result obtained by the microfluidic platform (lllb) will be analyzed by gel image inspection and subsequent comparison with the database. The method described above ensures that in the positive case for HPV DNA detection in the sample, it is possible to identify and predict viral type oncogenicity by a quick and simple process. Figure 1 depicts the basic organization chart of the present patent with the steps required to obtain the results. Figure 2 depicts a phylogenetic tree based on the E6 and E7 genes demonstrating that there is a clear separation between the high risk and low risk group.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Process in the form of a combination of oligonucleotides for detecting human papillomavirus (HPV) target sequences on multiple HPV types, represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68.

Process in the form of complementary sequences as described in claim 1 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68).

Process in the form of equivalent RNA sequences of claim 1 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68).

Process in the form of RNA equivalent and complementary sequences of claim 1 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68).

Process as a method for detecting HPV virus, characterized in that it comprises: a. Perform total DNA extraction from the sample; B. Perform an amplification of the viral DNA extracted from the sample to amplify the target region by a pair or more of the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 (claims 1 and 2); ç. Perform sequencing of the amplified target region in the previous step. As an alternative step one can use microfluidic platforms where the amplification product is scaled and quantified;

Process in the form of identification and prediction of oncogenicity characterized by comparing the sequence obtained in claim 5 with the HPV type DNA database records.

7. Product in the form of the use of any one or combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 (claim 1), complementary sequences (claim 2), RNA equivalent sequences (claim 3) and RNA equivalent and complementary sequences (claim 4) characterized by the manufacture of kits, their reagents, in vitro methods and / or biosensor equipment for use in HPV virus detection.

8. Product in the form of the use of any one or combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 (claim 1), complementary sequences (claim 2), RNA equivalent sequences (claim 3) and RNA equivalent and complementary sequences (claim 4) characterized by the development of equivalent databases and / or fabrication. comparative basis for the database in question.