BRPI1001299A2 - Formulações poliméricas paa tratamento de tumores de pele por terapia fotodinâmica - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÕES POLIMÉRICAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES DE PELE POR TERAPIA FOTODINÂMICA A presente invenção se refere a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele por terapia fotodinâmica, constituída de nanocápsulas poliméricas contendo compostos fotoativos encapsulados. TaI. invenção vrsa o tratamento de cancer de pele através de Terapia Fotodinâmica, baseado na injeção "in loco" das formulações poliméricas. Nesse aspecto, os resultados obtidos até o presente momento indicam a potencialidade dc aplicação dessas formulações no procedimento terapêutico visando, além do tratamento de tumores, também dc outras doenças de pele como psoriasis, vitiligo e leishmaniose, bem como para aplicações com fins estéticos

Description

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Relatório Descritivo de Patente de Invenção pa ra : "FORMULAÇÕES POLIMÉRICAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES DE PELE POR TERAPIA FOTODINÂMICA".

Campo da Invenção Δ presente invenção refere-se a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele e algumas outras moléstias por terapi’a fotodinâmica. Mais f v especificamente, a presente invenção se refere a emulsões compreendendo de micro e nanocápsulas poliméricas contendo drogas fotoativas sendo aplicada in loco. A presente invenção também se refere ao uso das referidas formulações para a fabricação de medicamentos para tratamento de tumores e de algumas outras moléstias por Terapia Fotodinâmica, baseado na injeção in loco das referidas formulações com nanocápsulas poliméricas especificas contendo drogas fotoativas.

Antecedentes da Invenção A Terapia Fotodinâmica (TFD) vem se consolidando como uma alternativa vantajosa para o tratamento de algumas doenças, particularmente de câncer e de algumas outras moléstias como psoriasis e vitiligo, além de doenças endêmicas como a leishmaniose. Este procedimento, empregado na oncologia há mais de 25 anos, apresenta inúmeras vantagens em relação aos tratamentos convencionais, entre elas a possibilidade de tratar os locais afetados de maneira seletiva, não atingindo',) tecidos saudáveis. Outras vantagens se referem à minimização de efeitos colaterais indesejáveis como enjôos e vômitos causados pela radioterapia e quimioterapia, de inconvenientes causados por intervenções cirúrgicas como mutilações e/ou cicatrizes, e do longo periodo de internação’ pós-tratamento. Isso é t \ resultante do fato do referido tratamento ser dependente da combinação de dois fatores principais: a presença de um agente fotossensibilizador e a irradiação do local desejado com luz de comprimento de onda apropriado.

De uma forma geral, o procedimento adotado na TFD consiste em administrar ao paciente (normalmente por via intravenosa, oral ou tópica) a droga fotossensibilizadora. Então, após determinado tempo, necessário para que a droga se distribua pelo corpo e atinja a concentração necessária nas células tumorais, as regiões afetadas são irradiadas com luz de comprimento de onda apropriado, geralmente na faixa conhecida como janela fotodinâmica (cerca de 600 a 900 nm) .

Todo o processo tem inicio quando o fotossensibilizador é excitado pela incidência de radiação e em seguida, dois mecanismos principais de reação podem ocorrer: os mecanismos do tipo I e do tipo l-'ϊ λ II. Nos mecanismos do tipo I, o fotossensibilizador nód estado excitado reage com moléculas do substrato por meio da transferência de prótons e/ou elétrons, gerando espécies radicalares capazes de reagir com o oxigênio no estado fundamental, produzindo uma série de intermediários de oxigênio altamente reativos capazes de causar danos diretos às biomoléculas. Já no caso do í \ \t mecanismo do tipo II, o composto fotoativo no estado excitado triplete interage com o oxigênio no estado fundamental, por meio de transferência de energia, ocasionando a formação de oxigênio singlete, uma espécie altamente reativa e citotóxica. O oxigênio singlete possui um caráter altamente eletrofilico, sendo capaz de causar danos em membranas, proteínas e DNA, tanto por ação direta quanto por formação· de espécies radicalares geradas a partir do mesmo.

Em ambos os mecanismos (tipo I e tipo II) as espécies reativas geradas tendem a se difundir pelo tecido afetado, iniciando uma cadeia de reações bioquímicas que resultam em danos às células. Na maioria dos casos, os agentes fototerapêuticos podem não causar a destruição direta do tumor, mas podem comprometer o sistema vascular, ou seja, o sistema de irrigação tumoral que transporta os nutrientes e oxigênio necessários para o crescimento do tumor, resultando em . X " ^ u hipoxia e morte celular.

No final da década de 80, foi desenvolvido o primeiro agente fototerapêutico para ser empregado em PDT com a autorização do FDA (Food and Drug Administration dos Estados Unidos da América): ο Photofrin®, desenvolvido pela QLT Photo-Therapeutics, baseada em oligômeros de hematopòrfirina com duas a nove v unidades de porfirina unidas por meio de ligações éter e éster. O Photofrin®, juntamente com o Levulan® Kerastick e o Visudyne®, são os três principais medicamentos utilizados em PDT, aprovados pela FDA.

Todavia, tais medicamentos apresentam algumas limitações ou inconvenientes. Por exemplo, o Photofrin® apresenta baixa absortividade na janela terapêutica e pode levar a sérios problemas de fotossensibilidade nos pacientes, que pode durar semanas ou até meses após a realização do tratamento. Além disso, aqueles fotossensibilizadores são administrados por via intravenosa, aumentando os riscos de toxicidade e fototoxicidade. Assim, os esforços no sentido de preparar novos fotossensibilizadores para uso em Terapia Fotodinâmica têm sido continuados, principalmente compostos apresentando propriedades fotofisicas e estruturais adequadas, além de maior biocompatibilidade.

Uma lipofilicidade relativamente elevada e o caráter anfifilico são importantes para garantir uma elevada afinidade e capacidade de penetração nas células tumorais, proporcionando maior atividade fotodinâmica das drogas ao serem irradiadas. Assim, os fotossensibilizadores atualmente empregados ou em desenvolvimento apresentam baixa ou nenhuma solubilidade/dispersibilidade ηοέ fluidos corpóreos como t v o sangue, limitando o emprego direto dos mesmos em TFD, pois podem provocar sérios problemas em decorrência da precipitação/aglomeração e o possível entupimento de veias e de artérias. Contudo, as propriedades desses compostos podem ser alteradas encapsulando-os em vesículas, micro e nanocápsulas, micro e nanoesferas, micelas e outros sistemas que exponham uma superfície biocompatível e aquo-solúvel, gerando veículos adequados para a dispersão daquelas drogas no meio biológico.

Um veículo carreador de drogas ideal em TFD deve se acumular no tecido tumoral e liberar seu conteúdo de modo que atinja concentrações terapêuticas somente naquelas células, em detrimento das células sadias. O sistema carreador deve ainda apresentar uma alta eficiência de entrega da droga, não alterar sua atividade, além de ser biocompatível e/ou biodegradável.

Sabe-se que sistemas de liberação de drogas tendem a se acumular em tumores devido a um fenômeno conhecido como "aumento da permeabilidade e efeito de retenção".'?-· Isso se deve ao fato de que tecidos tumorais geralmente apresentam maior atividade metabólica e uma barreira endotelial mais permeável, que permite a difusão de partículas relativamente grandes para dentro das células alvo.

De fato, quando moléculas, hanopartícuias ou outros i materiais são colocados em contato com tecidos biológicos, a primeira interação ocorre com a superfície externa da membrana celular. Eventuais danos provocados à mesma podem levar ao extravasamento do conteúdo intracelular, liberação intracelular de Ca2+ e indução de apoptose. Pode ocorrer também a desnaturação ou degradação de proteínas, resultando em mudanças nas suas estruturas primária, secundária ou terciária, e conseqüente alterações funcionais, por exemplo, na atividade enzimática e de sinalização molecular. Também, há algumas evidências de que certas nanopartícuias podem atingir o núcleo, causando danos ao DNA.

Nos inúmeros estudos e desenvolvimentos realizados até o momento, os tratamentos se baseiam na administração intravenosa de formulações ou drogas que devem se distribuir pelo organismo e preferencialmente concentrar-se nos tecidos tumorais. Entretanto, essa metodologia aumenta os riscos de intoxicação e eventuais fc V efeitos colaterais como a f otossensibili zação da pelè;-por tempos mais ou menos prolongados. A presente invenção tem como finalidade minimizar tais problemas, empregando no tratamento uma formulação com elevada eficiência de entrega de moléculas fotoativas diretamente às células tumorais. A utilização de porfirinas è compostos similares em í i Terapia Fotodinâmica já é conhecida há algumas décadas.

Pedido de patente internacional WO 2010/033678 (PCT/US2009/057283 ) , intitulado: "Novel method and application of unsymmetrically meso-substituted porphyrins and chlorins for PDT"; em nome de CERAMOPTEC INDUSTRIES, INC, publicado em 25 de março de 2010 descreve compostos biologicamente ativos, que podem ser usados como fotossensibilizadores para aplicações diagnosticas e terapêuticas, especialmente para tratamento PDT, infecções e outras doenças hiperproliferativas, diagnóstico e diagnóstico de fluorescência e tratamento de PDT de uma indicação não-tumorosa, tal como artrite, doenças inflamatórias, infecções virais ou bacterianas, oftalmológica, dermatológica ou distúrbios urológicos. Uma modalidade consiste em um método para sintetizar uma porfirina com um arranjo definido de meso-substituintes e, em seguida, converter esse sistema porfirina a um sistema clorina Η por dihidroxilação ou redução, e se houver mais de Ü3n,, isômero se separa por cromatografia. Em outra modalidade é fornecido compostos anfifilicos com uma alta afinidade de membrana e aumentada eficácia PDT. A classe de compostos que é reivindicada no documento WO 2010/033678 consiste de anéis semelhantes às porfirinas, mas que são denòminadas de clorinas e * '.possuem um dos anéis que forma o macrociclo reduzido. Com relação aos substituintes nas posições meso do anel, estes diferem dos compostos da presente invenção, visto que a presente invenção descreve porfirinas e clorinas com quatro substituintes nas posições meso, sendo que três são fenilas e o quarto é um substituinte com carga positiva, que se trata de uma piridina ligada a uma metila (ou outros grupos alquila) ou complexo de rutênio.

De forma análoga aos compostos do documento WO 2010/033678, as porfirinas da presente invenção apresentam também um caráter anfifilico, entretanto, a presença do grupo periférico carregado positivamente tende a favorecer e intensificar a interação, por exemplo, com membranas celulares e mitocôndria. A formulação lipossomal que foi descrita no documento WO 2010/033678 trata-se de partículas lipidicas contendo essas clorinas encapsuladas, ou seja, «% além do principio ativo ser diferente do que é revelad^ na presente invenção, o material no qual é encapsulado também é diferente. A presente invenção consiste em uma formulação de porfirinas encapsuladas em material polimérico biocompativel e visando uma aplicação direta na pele. O Pedido de patente interAacional WO 2009/038659 v (PCT/US2008/010608), intitulado: "Organically modified silica nanoparticles with covalently incorporated photosensitizers for drug delivery in photodynamic therapy", em nome de HEALTH RESEARCH INC e THE RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK, publicado em 26 de março de 2009 revela nanoparticulas contendo moléculas fotossensibilizadoras covalentemente ligadas que superam a desvantagem da · liberação prematura e, assim, melhoram o resultado de PDT. Na reivindicação 4 do referido documento é descrito que a nanoparticula tem pelo menos um grupo Rl ou R3 selecionado do grupo consistindo de porfirinas, clorinas bacterioclorinas, benzoclorinas, benzoporfirinas e derivados dos mesmos. O documento WO 2009/038659 relata a invenção de nanoparticulas de silica que contém na sua superfície moléculas de porfirina ou derivados porfirinicos ligadas, as quais permitem ainda a ligação de peptideos, anti-corpos, radioisótopos e outros agente que permitam /- direcionar essas nanoparticulas para células alvo e' propiciem o diagnóstico e tratamento de doenças. A principal diferença com relação ao sistema polimérico da presente invenção é o fato de que a porfirina encontra-se encapsulada no interior do material polimérico, e não na superfície da partícula como descrito no documento WO 2009/038659. Alem disso, o 1 fato das formulações í v poliméricas da presente invenção serem desenvolvidas para aplicação local, não torna imprescindível a presença de grupos que possam direcionar as cápsulas para as células alvo, uma vez que elas serão aplicadas no local de interesse, isto é, não passando pela corrente sanguínea, deste modo, apresentando baixíssima ou nenhuma toxidade. O pedido de patente americano US 2009131500, intitulado: "Porphyrin derivates and their use as photosensitizers in photodynamic therapy", em nome de ROEDER BEATE; ERMILOV EUGENY, JUX NORBER e JASINSKI STEFAN, publicado em 21 de maio de 2009 se refere a novos derivados de porfirina de fórmula (I), especialmente para as porfirinas que carregam moléculas fenil substituídas na posição meso. Os derivados de porfirina do documento US 2009131500 são úteis como fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica (PDT), especialmente na terapia fotodinâmica do tumor. Devido às excelentes propriedades fotofisicas dos compostos % fórmula I, estes são extremamente eficientes no tratamento fotodinâmico.

Como discutido anteriormente, a classe de compostos revelada pela presente invenção são compostos fotoativos consistindo de porfirinas e clorinas meso-substituídas monocatiônicas. A principal vantagem dos compostos da t i presente invenção quando comparados aos compostos do documento US 2009131500 é o fato da carga positiva dos compostos sintetizados da presente invenção permitir uma maior incorporação/interação, por exemplo, com a membrana das células e organelas. Esse fato é de extrema importância, visto que uma interação mais efetiva com sistemas biológicos resulta em uma maior eficiência fotodinâmica, ou seja, maiores eficiências fotodinâmicas e melhores resultados no tratamento. O pedido de patente americano US 2007218049, intitulado: "Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same", em nome de CHEN WEI e ZHANG JUN, publicado em 20 de setembro de 2007 descreve um método para tratamento de câncer, que combina a radioterapia e a terapia fotodinâmica (PDT). Mais especificamente, as nanoparticulas luminescentes com fotossensibilizadores, tais como porfirinas, são usadas como um novo tipo de agente para a terapia fotodinâmica. O documento US 2007218049 relata mais uma v e /. a utilização de porfirinas como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinâmica, mas essas porfirinas contém grupos ligados ao anel que permitem a ligação com nanopartículas luminescentes. São essas partículas luminescentes que, uma vez excitadas por uma fonte externa de calor ou radiação iònizante, emitem luz, a { i qual é absorvida pela porfirina. Este sistema difere dos sistemas convencionais, onde o fotossensibilizador é excitado por uma fonte de luz externa. Entretanto, embora esse sistema descrito relate mais uma vez a importância da utilização de porfirinas como fotossensibilizadores, este difere das formulações poliméricas contendo as porfirinas e clorinas monocatiônicas encapsuladas da- presente invenção, uma vez que não são utilizadas nanopart ículas como fonte de luz, e sim, uma fonte de radiação externa. O pedido de patente internacional WO 03/064426 (PCT/CA03/00120), intitulado: "N,N'-dimethylated N- confused porphyrins", em nome de THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, publicado em 29 de janeiro de 2003 descreve compostos compreendendo o grupo porfirina mas com um anel pirrólico rotacionado. Estes compostos têm uma absorção intensa em torno de 7 90 nm. Eles tem, portanto, potencial para sensibilizadores PDT (terapia fotodinâmica) .

Como relato anteriormente, já é conhecido desde o inicio do século passado que porfirinas possuem propriedades de fotossensibilizadores. Entretanto, diferentes modificações podem ser feitas em sua estrutura a fim de aumentar a sua atividade fotodinâmica, por meio de uma interação mais efetiva com í v sistemas biológicos. Dessa forma, diferentes porfirinas podem ser sintetizadas, mas não necessariamente serão eficientes quando dispersas no meio biológico.

Sumário da Invenção Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação à formulação polimérica para tratamento de tumores e algumas outras moléstias por terapia fotodinâmica, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/beneficio mais favorável. A presente invenção trata de uma formulação eficiente para o tratamento de tumores, baseado na injeção in loco de uma formulação de micro e nanocápsulas poliméricas biocompativeis contendo fotossensibilizadores incorporados. Tais partículas apresentam elevada capacidade de entrega do conteúdo fotoativo e são capazes de interagir fortemente com as «fc-y /Λ células de modo a limitar sua migração ê'j biodistribuição, permitindo um tratamento localizado da região tumoral sem afetar outras partes do organismo. 0 tratamento utiliza derivados porfirinicos como moléculas fotoativas e se caracteriza pelo fato de não utilizar o método de administração intravenosa para a realização do tratamento, mas se vale da limitáda migração do material $ \ v fotoativo, que fica concentrado nas vizinhanças da região de inoculação, minimizando os efeitos colaterais ou tóxicos.

Breve Descrição dos Desenhos A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição: A Figura 1 mostra um esquema de sintese da meso-3-mono-piridil (trifenil)porfirina (3-MPyTPP) ; A figura 2 mostra um esquema de sintese da meso-3-raetil-mono-piridil(trifenil)porfirina, 3MMe; A Figura 3 mostra um esquema dos derivados porfirinicos coordenados ao complexo Ru[(bipy) 2C1 ] + A Figura 4 mostra a distribuição de tamanho das partículas submetidas a 10 minutos de ultrassonicação, nas concentrações de tween 20 de: (a) 0%; (b) 0,4%; (c) 0,8%; (d) 1,0%; (e) 1,2% e (f) 1,6%.

*P A Figura 5 raostra uma fotomicrografia das partículas submetidas a 10 minutos de ultrassonicação, nas concentrações de tween 20 de: (a) 0%; (b) 0,4%; (c) 0,8%; (d) 1,0%; (e) 1,2% e (f) 1,6%. A Figura 6 mostra imagens de microscopia Confocal de fluorescência de microcápsulas de atelocolágeno marinho: Figura 6(a) sem polfirina e Figura 6(b) í v contendo 1,0.10-4 Mol. L"1 da porfirina 3MMe, λΕχο = 514nm; A Figura 7 mostra os espectros de emissão obtidos para uma emulsão contendo 1,2% de tween 20, antes (linha continua )e após ser submetida a processamento por ultrassonicação durante 10 minutos (linha tracejada ----) e 20 minutos (linha pontilhada "") ; λΕχο = 421 nm; A Figura 8 mostra a porcentagem de células viáveis após 3 horas de incubação, na ausência (controle) e presença de cápsulas poliméricas de ACM sem o composto fotoativo (A e C) e contendo lxlO-6 mol L-1 de 3MMe (B e D) ; não irradiadas (A e B) ; e irradiadas (C e D) ; A Figura 9 representa um gráfico em blocos mostrando a influência do tempo de incubação na citotoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em cápsulas de ACM; A Figura 10 (A) e Figura 10 (B) representam gráficos em blocos mostrando a influência do tempo de incubação (A) e do tempo de irradiação (B) na ÇU4 fototoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em micrdjçe nanocápsulas de ACM; A Figura 11 mostra um gráfico em barras da comparação da toxicidade (A e B) e fototoxicidade (C e D) das formulações polimérica e lipidica. Os Experimentos A e C foram realizados com as micro e nanocápsulas poliméricas; e experimentos B e D foram f v realizados com os lipossomas de PC; A Figura 12 mostra histogramas de distribuição de tamanho das partículas (a) poliméricas e (b) lipídicas; e (c) espectros de fluorescência da porfirina 3MMe encapsulada nas partículas poliméricas (linha contínua) e lipídicas (linha tracejada), Aexc = 421 nm; A Figura 13 mostra um gráfico indicando a Intensidade de fluorescência em 655 nm (em contagem de fótons por segundo, cp.s-1) em função da concentração de 3MMe, na faixa de 1,0 x 1CT9 a 1,0 x 10“6 Mol.L-1, Xexc = 421 nm. As amostras foram diluídas em meio de cultura DMEM incolor; A Figura 14 mostra um gráfico indicando a porcentagem de incorporação da porfirina 3MMe em células HeLa, em função do tempo de incubação, para as formulações lipidica (indicada pelos quadrados) e polimérica de ACM (indicada pelos triângulos); A Figura 15 mostra imagens do tumor (A) antes da V'-;f ^ aplicação do tratamento; (B) 12 dias após a primeirâi' aplicação do tratamento de TFD; (C) 4 dias após a segunda aplicação da TFD; (D) 12 dias após a segunda aplicação do tratamento de TFD; A Figura 16 mostra um gráfico indicando a variação do volume tumoral durante o periodo do experimento. As setas indicam as duas aplicações 'do tratamento de TFD; e ? v A Figura 17 é uma representação esquemática do método de tratamento de tumores de pele, utilizando a Terapia Fotodinâmica, empregando as formulações desenvolvidas.

Descrição Detalhada da Invenção Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui. A presente invenção refere-se a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele e algumas outras moléstias por terapia fotodinâmica. Mais especificamente, a presente invenção se refere a emulsões compreendendo de micro e nanocápsulas poliméricas contendo drogas fotoativas sendo aplicada in yU --1.-.. loco. Tal procedimento combina a alta eficiêncí^ de í>\__ '1 „í/,ç - interação e de entrega do conteúdo às células doentes pelas partículas poliméricas, associada à posterior irradiação com luz de comprimento de onda adequado.

As formulações da presente invenção são constituídas principalmente de cápsulas poliméricas de diâmetros nanométricos, com ’elevada capacidade de v interação e entrega dos compostos fotoativos encapsulados (particularmente porfirinas, clorinas, benzoporfirinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, bem como outras moléculas lipofílicas com eficiência fotodinâmica comprovada, onde foi desenvolvida e testada.

As cápsulas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor· de um núcleo oleoso, estando a molécula fotoativa dissolvida no mesmo e/ou adsorvida à parede polimérica.

Como constituintes do núcleo oleoso das partículas, podem ser empregados os óleos de canola, de semente de uva, de amêndoas e ácido oléico, além de co-adjuvantes tais como tween 20, tween 80, Triton, propileno glicol, miristato de isopropila e palmitato de octila. O invólucro polimérico pode ser constituído de diversos materiais biocompatíveis e/ou biodegradáveis, especialmente ácido láctico/poliláctico, polietilenoglicol, goma xantana, goma arabicaf)., hidroxietilcelulose, atelocolágeno e alginato.

As formulações da presente invenção são constituídas de micro e nanocápsulas poliméricas, obtidas através do método de coacervação. Tal método utiliza elevada velocidade de agitação, seguida de ultrassonicação gue resulta na 1 formação de quantidade í v vconsiderável de partículas com diâmetros nanométricos na faixa de 100 a 1000 nm. A utilização de nanocápsulas para aplicação tópica se torna interessante devido a possibilidade de penetrarem nas camadas mais profundas da pele e de se dispersarem mais prontamente em tecidos biológicos. No caso do tratamento de tumores por Terapia Fotodínâmica, a utilização de nanossistemas poliméricos tem como principais objetivos superar os mecanismos de resistência celular e não-celular, solubilizar compostos lipofilicos e aumentar a seletividade frente à células tumorais em detrimento dos tecidos saudáveis.

Como citado anteriormente, o tratamento por Terapia Fotodínâmica é baseado na aplicação de compostos fotoativos seguido de irradiação com uma fonte de luz numa faixa específica, comumente um laser de radiação vermelha. Assim, a avaliação da toxicidade no escuro e com irradiação é fundamental para avaliar a eficiência de um agente terapêutico. vtt Nesse sentido, as formulações reveladas pela presente invenção apresentaram excelentes resultados, não tendo sido observado nenhuma toxicidade na ausência de luz nos ensaios realizados utilizando-se formulações com ACM e células do tipo HeLa. Entretanto, demonstraram elevada fototoxicidade quando’ irradiados com luz $ v v vermelha, provocando cerca de 60% de morte celular em apenas uma sessão de 10 minutos, em condições experimentais otimizadas. Verificou-se que tal atividade fotodinâmica se deve principalmente à incorporação de maior quantidade dos compostos fotoativos nas células, particularmente no citoplasma, onde a concentração aumenta significativamente em função do tempo de incubação.

As formulações reveladas pela presente invenção mostraram-se mais eficientes que formulações lipossomais de fosfatidilcolina, contendo a mesma concentração dos compostos fotoativos. De fato, uma taxa significativamente maior de morte celular foi verificada nas culturas de células HeLa tratadas com as formulações poliméricas e irradiadas, em relação as tratadas com as formulações de fosfatidilcolina, devido ao fato dos primeiros serem mais eficientes na entrega dos compostos fotoativos para as células, levando a uma concentração ν'Λ iíüó:,,„, maior das drogas nas mesmas condições de tratamento V i O · Estudos in vivo, utilizando melanomas desenvolvidos em camundongos, comprovaram a eficiência do tratamento, reduzindo em praticamente 100% o volume tumoral após aplicação de duas sessões do tratamento. A formulação foi aplicada por meio de uma injeção in loco e, após cerca de 60 minutos, o tumor' foi irradiado durante í \ apenas 7 minutos, com um laser vermelho e potência local de 100 mW/cm2. O tratamento foi repetido após cerca de 12 dias levando a eliminação quase total da massa tumoral e regeneração total da pele após 24 dias.

Abaixo são apresentados a preparação, caracterização e os resultados dos estudos- in vitro e in vivo obtidos utilizando-se uma das formulações da presente invenção com um · derivado porfirinico encapsulado em nanocápsulas poliméricas de atelocolágeno marinho (ACM). 1) Método de preparação dos derivados porfirinicos fotoativos Os derivados porfirinicos anfifilicos (a serem posteriormente encapsulados) foram preparados de acordo com metodologia desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa, baseada no método de Fleischer de sintese de porfirinas contendo diferentes substituintes periféricos. O macrociclo porfirinico meso-substituido foi preparado através da reação de ciclização entre o pirrol e o aldeido correspondente na proporção de 3:1, utilizando refluxo em ácido acético glacial. Foram utilizados três aldeidos: o 2-piridil-carboxaldeido, o 3-piridil-carboxaldeido e o 4-piridil-carboxaldeido, de forma a obter as porfirinas de interesse: a meso-2- monopiridil(trifenil)portirina ’(2-MPyTPP), a meso-3-vmonopiridil(trifenil)porfirina (3-MPyTPP) e a meso-4-monopiridil(trifenil)porfirina (4-MPyTPP), respectivamente. A figura 1 ilustra a reação para o caso do macrociclo apresentando a piridina ligada pela posição 3. Após a sintese, o solvente foi removido no evaporador rotatório e o sólido do balão disperso em metanol onde a porfirina precipitou instantaneamente, sendo posteriormente filtrada a vácuo, utilizando um funil de placa sinterizada. A figura 2 representa a preparação dos compostos metilados, em que se reagiu a meso-mono-piridil(trifenil)porfirina com um grande excesso de tosilato de metila, em dimetilformamida (DMF) em refluxo, por cerca de 4 horas. A reação foi monitorada por cromatografia em camada delgada (TLC), para verificar o final da reação. Após esfriar, o solvente da mistura reacional foi removido no evaporador rotatório. Ν.·-'\ Ο sólido foi dissolvido em DMF e a solução foi gotejada,,, em uma solução de cloreto de sódio, onde a porfirina precipitou instantaneamente. O sólido foi filtrado e lavado várias vezes com água. A porfirina foi purificada em coluna de alumina neutra usando como fase móvel diclorometano, o qual foi responsável pela eluição da pbrfirina não metilada, vseguida da adição de metanol que levou a eluição do composto desejado.

Os derivados porfirinicos coordenados ao complexo cloro-bis-bipiridinarutênio(II) , [Ru(bipy) 2C1 ] , foram sintetizados refluxando-se o complexo por cerca de 15 minutos na presença de quantidade adequada, quase estequiométrica de nitrato de prata, em uma mistura água:etanol, a fim de obter o respectivo aqua-complexo, conforme a reação descrita abaixo: [Ru (bipy) 2C12] + AgN03 -> [Ru (bipy) 2C1 (H20) ] + + AgCl<s) (D O cloreto de prata formado foi removido e o filtrado, contendo essencialmente o aqua-complexo, foi concentrado no evaporador rotatório, e adicionado a uma mistura de CH2C12: DMF contendo a massa de porfirina adequada. A figura 3 ilustra a reação de obtenção da porfirina contendo um complexo de rutênio coordenado a um dos anéis piridinicos. O sistema foi mantidõí·* em -Qte ■ refluxo por cerca de 1 hora e a reação foi acompanhada através de espectroscopia no ultravioleta-visivel. Após esfriar, o solvente foi removido, o sólido redissolvido em DMF, e essa solução foi gotejada sobre uma solução de trifluorometanossulfonato de litio (LiTFMS), precipitando o respectivo sal ’de TFMS“. O sólido foi í v posteriormente centrifugado e lavado várias vezes com água .

Uma purificação em coluna de alumina neutra foi realizada a fim de separar o composto de interesse das impurezas remanescentes. Para tal procedimento, foi utilizada como fase móvel uma mistura diclorometano:etanol, sendo a polaridade aumentada gradativamente. O centro do macrociclo porfirinico também foi metalado com o ion Zn2+, utilizando acetato de zinco em refluxo em ácido acético.

Dessa forma, foi obtida uma série de compostos monossubstituidos, cujas estruturas estão apresentadas abaixo: \ s s Estas séries de derivados porfirinicos apresentam um elevado caráter lipofilico, tendo uma grande capacidade de interação/penetração' com membranas biológicas e, consequentemente, uma elevada ação fotodinâmica.

Além disso, foi obtido uma série de compostos monossubstituidos, derivados porfirinicos com um dos anéis pirrólicos reduzido, cujas estruturas estão apresentadas abaixo. Essas clorinas foram obtidas pela reação de redução das respectivas porfirinas utilizando uma mistura de sulfonil hidrazina e carbonato de potássio em piridina, e purificadas por cromatografia em coluna de silica, utilizando mistura de CH2Cl2/etanol '7- como eluente. u t Além disso, outros derivados contendo grupos fenil alquil-substituidos e outros grupos alquila ligadas ao átomo de nitrogênio piridinico foram preparados utilizando-se procedimentos similares aos descritos acima, e as estruturas são mostradas abaixo. ■'t t n "H porfirinas clorinas R= Ph, p-toluil, fenil alquil R’- Alquil, aril, tipicamente grupos metila M= 2H+, Zn2+, Mg2+ Entretanto, todos esses derivados porfirinicos anfifilicos apresentam baixa ou nenhuma solubilidade em água. Essa característica limita a utilização direta destes compostos como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinâmica, pois podem ocasionar o entupimento de veias e artérias devido a formação de agregados. Assim a utilização de veículos e sistemas que possam permitir a dispersão destas drogas na corrente sanguínea (meio aquoso), bem como liberá-las de forma controlada é de extrema importância. 2) Formulação de Nanocápsulas Poliméricas '■V.

As moléculas fotoativas foram encapsuladas'? utilizando-se o método de coacervação simples. Primeiramente, a droga fotoativa, dissolvida em solvente adequado (tipicamente clorofórmio), foi dispersa na fase oleosa. Essa solução oleosa foi adicionada sobre uma solução aquosa do polimero, sob agitação vigorosa (tipicamente na faixa de l.C?00 a 24.000 rpm) e, i1 v finalmente, adicionou-se sulfato de sódio anidro ao sistema.

Nesta primeira etapa, o sistema é constituído principalmente por microcápsulas (partículas apresentando diâmetros superiores a 1000 nm) . Assim, a emulsão obtida foi reprocessada utilizando-se um ultrassonicador (VibraCell, da Sonics, durante 1 a 60 minutos), visando a redução do tamanho das partículas até atingir diâmetros nanométricos. A utilização de nanocápsulas para aplicação tópica se torna interessante devido a possibilidade de penetrarem nas camadas mais profundas da pele e de se dispersarem mais prontamente em tecidos biológicos.

No caso do tratamento de tumores por Terapia Fotodinâmica, a utilização de nanossistemas poliméricos tem como principais objetivos superar os mecanismos de resistência celular e não-celular, solubilizar compostos lipofilicos e aumentar a seletividade frente à células v. > *■' tumorais em detrimento dos tecidos saudáveis. * * Substâncias tensoativas podem ser utilizadas como aditivos para controlar o tamanho das partículas. Assim, um estudo detalhado da influência de tensoativos no diâmetro das cápsulas foi realizado, variando-se sua concentração na emulsão de 0 a 10%. A Figura 4 mostra um exfemplo de resultados na í v forma de histogramas das emulsões variando-se a concentração de um surfactante. Pode-se notar que inicialmente há uma distribuição de tamanho das partículas bastante larga, com um maior número de cápsulas de diâmetros superiores a cerca de 1500 nm. A adição dos tensoativos, mesmo em baixas concentrações, altera significativamente os histogramas, tornando a distribuição de tamanho de cápsulas menos dispersa e, principalmente, aumentando o número de partículas na região de 200-500 nm. Todavia, parece haver uma tendência de aumento do tamanho das partículas na emulsão final contendo a maior concentração de tensoativo investigada. As emulsões preparadas na faixa de cerca de 0,5-2,0% de tensoativo apresentaram o perfil de distribuição de tamanho das partículas mais adequados, visto que a população de cápsulas com diâmetros na faixa nanométrica aumenta consideravelmente. A figura 5 mostra imagens de microscopia ópticg ·*¥ £> obtidas para as emulsões preparadas com as várias concentrações de surfactantes pesquisadas, por exemplo, tween 20 . Pode-se acompanhar a redução do tamanho das partículas através da diminuição da população de microcápsulas com diâmetros passíveis de serem observados com o aumento de 900^ da lente utilizada. Na í v ausência e na presença de pequenas quantidades^ de surfactante, observa-se uma grande população de cápsulas com diâmetros em torno de 15 e 20 pm. Em concentrações mais elevadas essa população reduz consideravelmente, sendo observados basicamente cápsulas com tamanhos próximos a 5 pm como sendo as maiores partículas da emulsão. A distribuição de tamanhos das cápsulas com diâmetros superiores a 100 nm, e maior população de partículas com tamanhos inferiores a 1000 nm foi tomada como padrão para a preparação das formulações que foram posteriormente utilizadas nos estudos de interação com estruturas biológicas e das respectivas eficiências fotodinâmicas. Os resultados descritos a partir de agora são referentes a formulação contendo a porfirina meso-3-metil-mono-piridil (trifenil)porfirina (3MMe), cuja estrutura está representada abaixo, como composto fotoativo encapsulado. $ j A Figura 6 mostra imagens de microscopia Confocal acoplada ao modo de fluorescência de modo a detectar a presença da porfirina 3MMe no interior das microcápsulas de atelocolágeno marinho. A Figura 6a) sem porfirina e figura 6(b) contendo 1,0.10-4 Mol.L-1 da porfirina 3MMe, λΕχο = 514nm.

Na figura 6a tem-se uma imagem confocal obtida para uma emulsão preparada nas mesmas condições e submetida à excitação no mesmo comprimento de onda de excitação da porfirina (514 nm) , mostrando a ausência de emissão na emulsão preparada sem o corante. A figuras 6b mostra imagem de microscopia Confocal, acoplada ao modo de fluorescência detectando a presença da porfirina no interior das cápsulas. Estas imagens foram obtidas para a mesma formulação, apenas em dois diferentes modos de visualização. Na imagem da figura 6b, as setas indicam os principais pontos de detecção da emissão. Da mesma maneira que realizado anteriormente, a imagem foi obtida focando-se nas partículas maiores papa Ά; uma melhor visualização.

Espectros de fluorescência também foram obtidos utilizando-se emulsões igualmente diluídas, onde se observou que a porfirina encontra-se predominantemente na forma monomérica, pois a intensidade de emissão aumenta consideravelmente após processamento por -k vultrassonicação, como mostra a figura 7.

Sabe-se que a presença de agregados, mesmo em pequena extensão pode resultar em uma diminuição da intensidade de emissão de derivados porfirínicos. Assim, estes resultados indicam, provavelmente, que a quebra de cápsulas maiores em partículas menores promove uma certa diluição pelo aumento da área superficial interna das cápsulas e a diminuição da concentração de pequenos clusters de associação (provavelmente de dímeros), resultando no aumento da fluorescência. 3) Toxicidade e fototoxicidade da formulação polimérica Como citado anteriormente, o tratamento por Terapia Fotodinâmica é baseado na aplicação de compostos fotoativos seguido de irradiação com uma fonte de luz específica, comumente um laser de radiação vermelha. Assim, a avaliação da toxicidade no escuro e com irradiação é fundamental para avaliar a eficiência de um , 1- t V; > ·. agente terapêutico. ''"Λ Nesse sentido, as formulações poliméricas desenvolvidas pela presente invenção, por exemplo, contendo a porfirina 3MMe como composto fotoativo, apresentou excelentes resultados como pode ser observado na figura 8 . A figura 8 mostra a porcentagem de células viáveis \ após 3 horas de incubação, na ausência (controle) e presença de cápsulas poliméricas de ACM sem o composto fotoativo (A e C) e contendo lxlCT6 mol L-1 de 3MMe (B e D) ; não irradiadas (A e B) ; e irradiadas (C e D) . Portanto, não tendo sido observado nenhuma toxicidade na ausência de luz (experimento B) nos ensaios realizados utilizando-se células do tipo HeLa.

Entretanto, demonstrou elevada fototoxicidade quando irradiado com luz vermelha, provocando quase 60% de morte celular quando irradiadas durante 10 minutos (Experimento D) . Avaliou-se também a toxicidade e fototoxicidade da formulação da presente invenção preparada sem o composto fotoativo, onde em nenhum dos casos foi observada uma taxa de morte celular significativa (experimentos A e C, respectivamente).

Alguns fatores podem influenciar fortemente a ação de um agente terapêutico em linhagens celulares, como o tempo de incubação e de irradiação. ^ f vVA^ i < J, Assim, avaliou-se também a citotoxicidade V.,, e fototoxicidade das porfirinas encapsuladas, por exemplo, 3MMe, em tempos mais longos de incubação. A Figura 11 mostra um gráfico de barras indicando a influência do tempo de incubação na citotoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em cápsulas de ACM. De forma análoga ao observado na figuta 11, as formulações í v poliméricas da presente invenção não se mostraram tóxicas, mesmo quando incubadas durante 9 horas.

Em contrapartida, a atividade fotodinâmica aumentou consideravelmente de acordo com o tempo de incubação, alcançando uma taxa de morte celular de cerca de 90% no tempo máximo investigado, como observado na figura 12(A).

Outro fator que se mostrou determinante na determinação da viabilidade celular foi o tempo de irradiação. A Figura 12(B) mostra a Influência do tempo de irradiação na fototoxicidade dos derivados porfirínicos encapsulados, por exemplo, 3MMe, em micro e nanocápsulas de ACM. Como apresentado na figura 12 (B) , uma taxa significativa de morte celular só é observada quando as células são irradiadas por mais de 5 minutos, de forma que no maior tempo investigado (10 minutos), a viabilidade celular é inferior a 50%. Vale ressaltar que nesses experimentos, onde se analisou a influência dò *■'1 tempo de incubação e de irradiação na fototoxicidade das formulações poliméricas, utilizando-se tempos fixos de irradiação (10 minutos) e de incubação (3 horas), respectivamente.

No sentido de comparar a eficiência das formulações poliméricas em relação as Respectivas formulações {lipidicas, foram realizados estudos avaliando a fototoxicidade das porfirinas encapsuladas em micro e nanocápsulas, por exemplo 3MMe em ACM, em relação a mesma porfirina incorporada em lipossomas de fosfatidilcolina (PC) foram realizados, sendo os resultados apresentados na figura 11.

Pode-se observar que, assim como as partículas poliméricas, as partículas lipidicas não apresentam uma citotoxicidade significativa (experimentos A e B).

Entretanto, a ação fotodinâmica dos derivados porfirínicos nas formulações poliméricas da presente invenção foram cerca de quatro vezes maior em relação às mesmas porfirinas incorporadas nas formulações lipidicas. A Figura 12 representa histogramas de distribuição de tamanho das partículas: Figura 12(a) para cápsulas poliméricas e Figura 12(b) para cápsulas lipidicas e Figura 12 (c) espectros de fluorescência da porfirina 3MMe encapsulada nas partículas poliméricas e lipídicas. λ0ΧΟ = 421 nm.

Assim como as partículas poliméricas que apresentam diâmetros nanométricos (figura 12a), na faixa de 100-1000 nm, os lipossomas também foram preparados de forma que apresentassem um tamanho na escala nanométrica, como t pode ser observado na figura 12b, onde o histograma t v obtido por espalhamento dinâmico de luz indica que o diâmetro médio das partículas lipídicas é de cerca de 100 nm. Vale lembrar também que os lipossomas foram preparados de forma a apresentar a mesma concentração dos derivados porfirínicos contidos nas cápsulas poliméricas aplicadas as células (Ι,ΟχΙΟ-6 Mol.L-1). Embora as duas formulações apresentassem as mesmas concentrações, o estado de agregação das mesmas nas duas partículas são diferenciados como mostrado nos espectros de fluorescência das formulações apresentados na figura 12c. A intensidade de fluorescência dos derivados porfirínicos nas formulações poliméricas da presente invenção é muito menor quando comparada a das formulações lipídicas.

Verificou-se que a maior atividade fotodinâmica da formulação polimérica se deve, principalmente, à incorporação de maior quantidade do composto fotoativo νΛ nas células . A incorporação dos derivados porfirínicos em células HeLa foi investigada através da incubação das células com os compostos fotoativos encapsulados da presente invenção em ACM. A técnica de espectroscopia de absorção é comumente utilizada nestes experimentos para avaliar a incorporação de drogãs. Entretanto, como se t v trata de um sistema particulado, a quantificação da absorção de luz da porfirina fica comprometida em virtude do espalhamento de luz gerado pelas partículas. Assim, utilizou-se a técnica de espectroscopia de fluorescência para avaliar a incorporação dos derivados porfirinicos, visto que exibem elevada fluorescência na região do vermelho. Inicialmente, registraram-se os espectros de emissão das formulações poliméricas, diluídas diferentes vezes em meio de cultura incolor, de forma a obter soluções onde a concentração dos derivados porfirínicos se encontrasse na faixa de concentração de 1,0 x 10“9 a 1,0 x 10“6 Mol. If1. Registrou-se a intensidade de emissão em 655 nm (comprimento de onda máximo de emissão) para todas as soluções, de maneira que verificaram-se excelentes correlações lineares (R = 0,9998) em função da concentração dos derivados porfirínicos, por exemplo 3MMe, como pode ser observado na figura 13, indicando que a técnica poderia ser empregada para a determinação da taxa de i ncorporação - ·"< dos derivados porfirinicos nas células. A incorporação dos derivados porfirinicos, calculadas através da equação 1, também seguem um perfil linear (R = 0,9980), aumentando significativamente com o tempo de incubação como pode ser observado na figura 14. ;í V ji V (Equação 1) De acordo com resultado apresentado anteriormente (figura 10a), a viabilidade celular diminui com o aumento do tempo de incubação, de forma que a eficiência fotodinâmica em tempos mais longos de incubação deve ser resultado da maior quantidade de fotossensibilizador incorporada.

Na figura 14 também estão os resultados referentes a incorporação dos derivados porfirinicos, por exemplo, 3MMe, quando incorporados em lipossomas, onde observa-se uma taxa de incorporação significativamente inferior em relação a das formulações poliméricas. Tal resultado provavelmente indica que a baixa taxa de morte celular observada com a aplicação das formulações lipidicas (dados apresentados na figura 11) é resultado da baixa incorporação dos derivados porfirinicos contidos nos lipossomas de PC, ao passo que a maior fototoxicidade V das formulações de ACM deve estar relacionada à maiot'; /· taxa de incorporação nas células. 4) Aplicação das Formulações da presente invenção no Tratamento de câncer de Pele.

Tendo em vista os excelentes resultados obtidos nos estudos in vitro, utilizando cultura de células HeLa, deu-se inicio aos testes utilizarido modelos animais, i v Estes estudos in vivo foram realizados utilizando melanomas desenvolvidos em camundongos (Figura 15A) , através da inoculação de células B16 na região dorsal dos animais. Após 21 dias após a inoculação, quando o volume tumoral era cerca de 1000 mm3, a formulação polimérica foi aplicada através de uma injeção intratumoral. Após um tempo de espera tipicamente de 10 a 240 minutos, deu-se inicio a irradiação, utilizando um laser vermelho (λ = 650 nm) , durante 7 minutos (irradiância de 34 mW/cm2; fluência de 14 J/cm2) . Observou-se uma redução significativa do volume tumoral, o qual foi reduzido a praticamente metade do volume inicial como pode ser observado na imagem da figura 15B.

Uma segunda aplicação do tratamento foi então realizada, adotando o mesmo procedimento descrito anteriormente. Na figura 15C tem-se a imagem do tumor no primeiro dia após a aplicação do tratamento, onde se observa a formação de uma ferida em decorrência dos danos provocados pela TFD as células tumorais. Após 24 dias (Figura 15D) , observa-se que a massa tumoral foi quase totalmente removida após uma segunda aplicação do tratamento, além do fato de que a cicatrização do local tratado foi total. A figura 14 apresenta um gráfico do volume tumoral em função do tempo, com indicações para as duas v aplicações do tratamento. Pode-se observar a redução quase que total do tumor após cerca de 30 dias do inicio do tratamento, não tendo sido observado rescidiva ou aumento do volume tumoral após uma semana do tratamento. A metodologia de aplicação da formulação desenvolvida, esta pode ser ilustrada como indicado na figura 17 . Uma região da pele (A) , na qual um tumor foi desenvolvido (B) , recebe uma pequena quantidade de uma das formulações poliméricas de nanocápsulas (D) por meio de uma injeção intratumoral (C) . As formulações contêm compostos fotoativos micro e nano-encapsulados, as quais interagem com a membrana das células tumorais (E), entregando seu conteúdo, que pode atingir diferentes regiões intracelulares. O tecido tumoral é irradiado com luz vermelha, provocando danos que ocasionam a morte das células. Após a eliminação natural dos tecidos tumorais tratados, a pele tende a se regenerar integralmente não deixando cicatrizes, além de não provocar perda de cartilagem o tecido, que levam ao aparecimento de s'·** \ depressões no local tratado.

Com relação à proposta de uma metodologia de aplicação da formulação desenvolvida pela presente invenção, esta pode ser ilustrada como indicado na figura 19. Uma região da pele (A), na qual um tumor foi desenvolvido (B) , recebe uma pequena quantidade de uma t vdas formulações poliméricas de micro e nanocápsulas (D) por meio de uma injeção intratumoral (C). As formulações contém compostos fotoativos micro e nano-encapsulados, as quais interagem com a membrana das células tumorais (E) , entregando seu conteúdo, que pode atingir diferentes regiões intracelulares. 0 tecido tumoral é irradiada com luz vermelha provocando danos que ocasionam a morte das células. Após a eliminação natural dos tecidos tumorais tratados, a pele tende a se regenerar integralmente não deixando cicatrizes, além de não provocar perda de cartilagem e tecido, que levam ao aparecimento de depressões no local tratado.

Como pode ser observado o uso de compostos meso- metilpiridinio(triaril)porfirinas e correspondentes clorinas como compostos fotoativos, tem a vantagem de poderem ser obtidas com alta pureza, em grandes quantidades e a custos menores que os dos compostos encontrados no estado da técnica. Outras substâncias fotoativas com propriedades fotoquimicas e de interação-' adequadas podem ser encapsuladas usando as cápsulas poliméricas da presente invenção, gerando produtos com propriedades similares.

As formulações da presente invenção são usadas na forma de suspensão de nanocápsulas poliméricas, preparadas utilizando polimèros, componentes e t v substâncias naturais biocompativeis. O método de aplicação associada às formulações da presente invenção constitui um aspecto totalmente inovador, visto que, os demais métodos de tratamento usam injeção intravenosa, isto é, aguardam a circulação pelo corpo e concentração natural ou induzida nos tumores, e posterior irradiação. Desta maneira estes métodos aumentam as possibilidades de aparecimento de efeitos colaterais como fotossensibilidade e toxicidade aguda, além de aumentar o volume injetado e o custo de produção. No caso da presente invenção, as formulações são injetadas localmente, e as propriedades foram controladas, de modo que não haja migração ou difusão significativas, de modo que o material ativo fique concentrado nas proximidades do local da injeção intradérmica intratumoral.

As formulações poliméricas da presente invenção têm maior estabilidade que as formulações lipossomais.

Assim, embora tenha sido mostrada apenas uma", modalidade da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações na forma das formulações poliméricas para tratamento de tumores por terapia fotodinâmica podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção. 1 > v É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção.

Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outro são também totalmente pretendidos e contemplado.

Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas. φ\ λ cud:

Claims (15)

1. Formulações poliméricas para tratamento de tumores por Terapia Fotodinâmica caracterizadas pelo fato de que compreendem: a) um dos compostos pertencentes ao grupo dos derivados porfirinicos monocatiônicos fotoativos: I t í porfirinas clorinas R= Ph, p-tolil, fenil alquil substituídas M= 2H+, Zn2+, Mg2+ b) micro e nanocápsulas de polímeros biocompatíveis; e c) veículo farmaceuticamente aceitável, preferencialmente, soro fisiológico ou tampão fosfato.

2) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que os derivados porfirínicos monocatiônicos fotoativos são,"d preferencialmente, a meso-3-monopiridil(trifenil)porfirina (3-MPyTPP) ou meso-4-monopiridil(trifenil)porfirina (4-MPyTPP).

3) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que estão na > forma de emulsões. > v x (

4) Formulações polimerrcas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que os polímeros biocompatíveis/biodegradáveis são selecionados do grupo compreendido por: ácido láctico/poliláctico; polietilenoglicol; goma xantana; goma arábica; hidroxietilcelulose; atelocolágeno e alginato.

5) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que o polímero biocompatível é preferencialmente o atelocolágeno.

6) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de as cápsulas poliméricas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor de um núcleo oleoso, estando a molécula fotoativa dissolvida no mesmo e/ou adsorvida à parede polimérica.

7) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que os •v\ ÇiJ.ib f l‘ -s, compostos fotoativos encapsulados são selecionado do grupp-, \ «f compreendido, particularmente, por: porfirinas, clorinas, benzoporfirinas e ftalocianinas, bem como outras moléculas lipofílicas com eficiência fotodinâmica comprovada.

8) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as micro e i napocápsulas de polímeros biocompativeis compreendem: $ v - um núcleo constituído de oleos naturais e biocompativeis; e um núcleo oleoso constituído por agentes coadjuvantes biocompativeis.

9) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que os referidos óleos naturais e biocompatíves são selecionados do grupo compreendendo: óleo de canola, óleo de semente de uva, óleo de amêndoas e de ácido oléico.

10) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as micro e nanocápsulas poliméricas, possuem diâmetro nanométrico na faixa de 100 a 1000 nm.

11) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que os referidos agentes coadjuvantes biocompativeis são selecionados do grupo compreendendo: tween 20, tween 80, Triton, propileno glicol, miristato de isopropila 6/·-·; palmitato de octila.

12) Formulações poliméricas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que o núcleo oleoso também contém moléculas fotoativas derivadas de porfirinas, bem como outros corantes adequados, dissolvidas e/pu adsorvidos na parede polimérica. i >

13) Uso das formulações poliméricas conforme definido pelas reivindicações 1 a 9 caracterizado pelo fato de serem para preparação de medicamentos para tratamento de tumores por Terapia Fotodinâmica.

14) Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a injeção é aplicada localmente sobre a área a ser tratada.

15) Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de outras doenças de pele, preferencialmente, psoriasis, vitiligo e leishmaniose, além de aplicações para fins estéticos.