BRPI0911925B1 - Método para detectar um câncer - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETECTAR UM CÂNCER E REAGENTES PARA DETECTAR UM CÂNCER A presente invenção refere-se a um método para detectar câncer, que compreende medir a expressão de um polipeptídeo que tem uma reatividade de ligação a um anticorpo contra uma proteína CAPRINA-1 que tem uma sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 a 30 na Listagem de Sequências através de uma reação antígeno-anticorpo em uma amostra separada de um organismo vivo e um reagente para detectar um câncer que compreende a proteína CAPRINA-1 ou um fragmento deste, um anticorpo contra a proteína CAPRINA-1 ou um fragmento deste, ou um polinucleotídeo que codifica a proteína CAPRINA-1 ou um fragmento deste.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para detecção de câncer usando a CAPRINA-1 como um marcador tumoral.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é a principal causa de morte. O tratamento realizado atualmente para o câncer é principalmente a terapia sintomática que consiste principalmente no tratamento cirúrgico com uma combinação de radioterapia e quimioterapia. Devido aos avanços da tecnologia médica, o câncer é hoje uma doença quase curável se for detectado precocemente. Assim, um método para detectar o câncer é necessário agora em que a detecção pode ser convenientemente realizada usando soro, urina, ou similares, sem a imposição de sofrimento físico ou econômico aos pacientes com câncer.

[003] Como método de diagnóstico de câncer usando sangue ou urina, recentemente tornou-se popular um método para medir um produto do tumor como um marcador tumoral. O termo "produto do tumor" refere-se a um antígeno associado ao tumor, uma enzima, uma proteína específica, um metabólito, um gene do tumor, um produto do gene do tumor, um gene supressor do tumor e similares. O antígeno carcinoembrionário CEA, glicoproteína CA19-9, CA125, antígeno específico da próstata PSA, calcitonina, que são hormônios peptídeos produzidos na tireoide e similares são utilizados como marcadores tumorais para o diagnóstico de alguns tipos de câncer. No entanto, os marcadores tumorais úteis para o diagnóstico de câncer estão ausentes para vários tipos de câncer. Além disso, os marcadores tumorais mais conhecidos estão presentes atualmente em quantidades vestigiais (cerca de uma ordem de pg / ml) nos fluidos corporais. Portanto, métodos de medição altamente sensíveis ou técnicas especiais são necessárias para a detecção dos marcadores tumorais. Nas atuais circunstâncias, espera-se que a prestação de um meio de teste novo do câncer capaz de detectar vários tipos de câncer com alta sensibilidade que envolve um procedimento conveniente cria aplicações de diagnóstico para vários tipos de câncer.

[004] Além disso, os meios de testes de câncer são muito úteis se forem capazes de não apenas detectar o câncer, mas também diagnosticar o câncer que se desenvolveu em um local invisível a olho nu, a extensão do câncer, o curso da malignidade ou pós-operatório de câncer, recorrência, metástase, e similares.

[005] Especificamente, se o diagnóstico de câncer que se desenvolveu em um local invisível a olho nu se torna possível, esses meios de teste de câncer seriam úteis para a detecção precoce do câncer dentro de um local como uma parte intraperitoneal que é difícil de reconhecer. Além disso, um tumor que não tem um tamanho grosseiramente visível como o câncer, que é indetectável mesmo pela ultrassonografia, TC (tomografia computadorizada) ou RM (ressonância nuclear magnética) pode ser detectado.

[006] Além disso, a extensão do câncer é classificada com base no grau em que o tumor espalha-se no sítio primário e a presença ou ausência de metástase para os linfonodos regionais ou órgãos distantes. Em geral, existem cinco fases da doença (cada uma é referida como "estágio"), e números maiores de fase indicam estágios mais avançados da doença. A rigor, a definição a variação do estágio depende nos órgãos. No entanto, por exemplo, o câncer em estágio 0 é o câncer que continua intraepitelial e câncer no estágio IV é um câncer em que ocorre metástase para um local distante. Se esta extensão de câncer for encontrada, tornam-se possíveis as decisões sobre os cursos de tratamento adequado, assim como o diagnóstico dos efeitos terapêuticos de um agente anticancerígeno. Como exemplos específicos de decisões sobre os cursos de tratamento, no caso do câncer de próstata e similares, há um tipo que não requer tratamento porque tem malignidade muito baixa e quase nunca progride. Em contrapartida, há um tipo que requer tratamento porque é progressivo e faz metástase para o osso ou similar e faz com que os pacientes morram dolorosamente. Tratamentos como a terapia hormonal e a cirurgia extirpativa são associados a uma reação adversa. Assim, as terapias devem ser adequadamente determinadas e decididas. Além disso, se a avaliação relativa à seleção de um agente anticancerígeno pode ser feita de forma adequada ou se o tempo ou similar para o término da administração de um agente anticâncer pode ser adequadamente determinado, também podem ser reduzidos o sofrimento físico e econômico nos pacientes. Portanto, é importante ser capaz de diagnosticar a extensão do câncer.

[007] Uma das características das células cancerosas é que elas sofrem blastogênese, isto é, desdiferenciação. Exceto para alguns tipos de câncer, células cancerosas pouco diferenciadas ou indiferenciadas com um baixo grau de diferenciação crescem rapidamente depois da metástase e resultam em um prognóstico pior após a terapia. Este tipo de câncer é conhecido por ter um alto grau de malignidade. Por outro lado, as células cancerosas altamente diferenciadas com um elevado grau de diferenciação conservam as características estruturais e funcionais dos órgãos afetados. Este tipo de câncer é conhecido por ter uma malignidade relativamente baixa. Se a malignidade do câncer pode ser determinada, as seguintes medidas podem ser tomadas. Mesmo se o tumor for pequeno, uma ampla margem cirúrgica pode ser assegurada após a remoção do tumor, quando a malignidade for elevada. Além disso, é possível o acompanhamento tendo em atenção a uma vasta gama de tecidos periféricos.

[008] Se for possível o diagnóstico dos cursos de pós-operatório, incluindo recidivas e metástases à distância, torna-se possível um diagnóstico sobre se um tumor pode ser completamente removido pela cirurgia. A remoção incompleta do tumor causa provavelmente uma recorrência. Assim, esse diagnóstico pode fornecer critérios para determinar um o acompanhamento mais cuidadoso em intervalos curtos ou, se necessário, executar a re-operação precoce. Além disso, se a recorrência ocorre, há uma grande possibilidade de detecção precoce. A detecção é muitas vezes demorada quando ocorre a metástase distante. No entanto, se o diagnóstico de metástases torna-se possível, torna-se possível estabelecer critérios pelos quais a faixa de teste pode ser ampliada para incluir outras áreas que não a do local da remoção e periferia da mesma área.

[009] Sabe-se que os cães envelhecem sete vezes mais rápido que os seres humanos. Recentemente, os animais de companhia estão sendo criados como membros da família e muitas vezes têm hábitos semelhantes aos dos seus proprietários. Portanto, é previsível que o risco de um proprietário desenvolver câncer seria elevado quando seu animal de companhia desenvolver o câncer. Se o diagnóstico de câncer conveniente e preciso torna- se possível para animais de companhia, seria esperado que este fornecesse pistas para a prevenção do câncer dos proprietários.

[010] Atualmente, o número de cães domésticos no Japão é de aproximadamente 6.700.000, e o mesmo valor para os EUA é de cerca de 17.640.000. As vacinas combinadas quíntuplas, séptuplas e óctuplas e similares tornaram-se predominantes, além de injeções da raiva, e, assim, diminuiu-se as doenças infecciosas altamente letais, como a infecção de parvovirose canina, infecção pelo vírus da cinomose, parainfluenza canina (tosse dos canis), infecção de adenovírus canino tipo 2 (tosse dos canis), hepatite infecciosa canina, infecção pelo coronavírus canino e leptospirose. Portanto, o tempo médio de vida dos cães tem aumentado. Os cães idosos, que tem sete anos de idade ou mais, são 35,5% de todos os cães domésticos. As causas de morte de cães domésticos também são semelhantes aos dos seres humanos, como por câncer, hipertensão e doença cardíaca, que estão em ascensão. Nos EUA, cerca de 4.000.000 cães são diagnosticados com câncer todos os anos. Também no Japão, cerca de 1,6 milhões de cães são potencialmente afetados com tumores.

[011] Entretanto, são ausentes os agentes convenientes de diagnóstico de câncer para os animais. Além disso, no atendimento médico dos animais, não foram predominantes os métodos de teste que envolvem a fotografia ou filmagem usando raios-X, tomografia computadorizada, exames de ressonância magnética, ou similares. Após a palpação, é realizado um simples exame de sangue e teste usando a fotografia de raio-X, o diagnóstico atualmente depende significativamente na experiência dos veterinários. Os métodos de teste com soro parcialmente começaram, mas os métodos usam os marcadores tumorais humanos uma vez que nenhum marcador tumoral canino foi descoberto.

[012] Um diagnóstico preciso do câncer requer uma cirurgia abdominal, que impõe sofrimento físico significativo em cães e alto custo para os proprietários. Se o diagnóstico de câncer puder ser feito convenientemente para animais de companhia como cães e gatos, isto levaria à detecção precoce ou diagnóstico preciso do câncer e seria útil para a terapia do câncer em animais de companhia. Além disso, se o diagnóstico conveniente de câncer, com o soro se tornar possível, poderia se esperar, não só permitir um diagnóstico de câncer, mas também contribuir significativamente para os exames periódicos de saúde, diagnóstico pré-operatório, e as decisões sobre a estratégia terapêutica.

[013] O exame médico para animais de companhia não é predominante, ao contrário do caso dos humanos. Assim, em muitos casos, a detecção de câncer geralmente ocorre muito tarde, de forma que um proprietário descobre a doença e, em seguida, chega a um hospital apenas depois que o tumor tornou-se grande. Se o tumor que aumentou em tamanho for maligno, muitas vezes resulta em um tratamento que é tarde demais, mesmo quando é realizada a terapia cirúrgica, como cirurgia ou medicação usando um agente antineoplásico ou similar. Assim, quando um veterinário determina que o tumor é maligno, o tratamento do agente anticancerígeno é geralmente realizado sem a necessidade de cirurgia. Se a cirurgia for realizada, também devem ser rigorosamente tomadas as medidas durante a cirurgia, como a determinação do tamanho da margem a ser fixado, a determinação da quantidade de sangue necessária durante a cirurgia, e as medidas contra o espalhamento celular. É desejável que o tratamento do agente anticancerígeno seja iniciado imediatamente após a cirurgia e que o acompanhamento seja realizado em intervalos curtos. A incorporação do diagnóstico de câncer recente acima em exames de saúde dos cães cada vez mais prevalentes e são chamados de exames médicos completos para cães deverão levar à detecção precoce do câncer.

[014] Por outro lado, no caso de um tumor benigno, a cirurgia pode ser aconselhável, mesmo se um tumor for grande. Após a cirurgia, apenas as áreas ressecadas precisam de cuidados, sem a necessidade de qualquer tratamento do agente anticâncer caro e sem qualquer necessidade de preocupações relativas aos acompanhamentos.

[015] Na situação atual, o fornecimento de um meio prático para detectar o câncer com alta sensibilidade, que é aplicável ao diagnóstico de câncer nos animais, permite o tratamento preciso e eficiente e resulta em uma série de vantagens para proprietários e veterinários.

[016] A proteína 1 citoplasmática e associada com a proliferação (CAPRINA-1) é uma proteína intracelular que é expressa quando as células normais em fase de repouso são ativadas ou submetidas à divisão celular. Por exemplo, CAPRINA 1 também é conhecida por estar envolvida no transporte de mRNA através da formação intracelular de grãos de estresse intracelular com RNA e o controle de tradução. Enquanto isso, a CAPRINA-1 tem muitos nomes diferentes. Exemplos de tais nomes incluem a proteína 1 de membrana ancorada em GPI e a proteína marcadora de superfície do componente de membrana (M11S1), como se a proteína fosse conhecida por ser uma proteína da membrana. Estes nomes diferentes são derivados de um relatório (J Biol Chem. 270: 20717-20723 (1995)) que a sequência do gene da CAPRINA-1 originalmente tem uma região de ligação de GPI e a CAPRINA-1 é uma proteína de membrana expressa em grandes linhas de células derivadas do intestino. Mais tarde relatou-se que: a sequência do gene de CAPRINA-1 neste relatório é um erro, o deslocamento do quadro ocorre pela exclusão do nucleotídeo 1 da sequência do gene de CAPRINA-1 atualmente registrada com o GenBank ou similares, de modo que 80 aminoácidos são excluídos do terminal C e o artefato resultante (74 aminoácidos) corresponde à parte de ligação GPI do relatório anterior, e também está presente um erro no lado 5 ' da sequência do gene e a exclusão de 53 aminoácidos do terminal N foi comprovada (J Immunol. 172: 2389-2400 (2004)). Além disso, foi relatado que uma proteína encodificada pela sequência do gene de CAPRINA-1 atualmente registrada com o GenBank ou similares, não é uma proteína da membrana celular (J Immunol. 172: 2389-2400 (2004)).

[017] Além disso, com base no relatório da J Biol Chem. 270: 20717-20723 (1995) que CAPRINA-1 é uma proteína da membrana da célula, US2008/0075722 e WO2005/100998 divulgam que CAPRINA-1 sob o nome de M11S1 pode ser um alvo para terapia do câncer como uma proteína da membrana celular (não mencionado nos exemplos). No entanto, como foi relatado em J Immunol. 172: 2389-2400 (2004), foi aceito a partir do momento da apresentação do US2008/0075722 e WO2005/100998 até agora que CAPRINA-1 não é expresso na superfície das células. É óbvio que o conteúdo de US2008/0075722 e WO2005/100998 baseados apenas em informações falsas no sentido de que CAPRINA-1 é uma proteína da membrana celular, não deve ser entendido como do senso comum técnico dos técnicos no assunto. Além disso, nunca foi relatado que CAPRINA-1 é expressada em níveis mais altos nas células do câncer de mama ou similares do que em células normais.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[018] Um objeto da presente invenção é proporcionar um meio para detectar o câncer que seja útil para o diagnóstico de câncer.

MEIOS PARA A RESOLUÇÃO DO PROBLEMA

[019] Como resultado de estudos intensivos, os presentes inventores obtiveram o cDNA que codifica uma proteína que se liga a um anticorpo existente no soro derivado de um organismo vivo portador de câncer, determinada por um método SEREX usando uma biblioteca de cDNA derivado de testículo de cães e o soro de um cão portador de câncer e, portanto, eles preparam proteínas caninas CAPRINA-1 com as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID n°: 6, 8, 10, 12 e 14 com base no cDNA. Além disso, os presentes inventores preparam proteínas humanas CAPRINA-1 tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID n°: 2 e 4, com base em genes humanos homólogos aos genes obtidos. Os presentes inventores descobriram ainda que: os genes que codificam estas proteínas são expressos especificamente em testículos de caninos e humanos e nas células do câncer malignas (ver Exemplo 1 descrito mais tarde), polipeptídeos recombinantes preparados com base nas sequências de aminoácidos destas proteínas reagem especificamente apenas com soro de organismos vivos com câncer, e CAPRINA-1 pode ser especificamente detectada em um organismo vivo com câncer utilizando anticorpos preparados usando os polipeptídeos recombinantes. Assim, os presentes inventores concluíram a invenção presente.

[020] Especificamente, a presente invenção fornece um método para detectar o câncer incluindo a medição da expressão de CAPRINA-1, que é realizada nas amostras separadas de organismos vivos. Além disso, a presente invenção proporciona um reagente para a detecção de câncer compreendendo um anticorpo que é induzido in vivo contra CAPRINA-1 e um polipeptídeo que sofre uma reação de antígeno anticorpo. Além disso, a presente invenção proporciona um reagente para a detecção de câncer compreendendo um anticorpo que sofre uma reação de antígeno anticorpo com CAPRINA-1 ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos. Além disso, a presente invenção proporciona um reagente para a detecção de câncer compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza especificamente uma sequência parcial de 15 ou mais nucleotídeos, de preferência de 20 a 25 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, ou similar na Lista de Sequência.

[021] Especificamente, a presente invenção tem as seguintes características: (1) um método para a detecção de um câncer, incluindo a medição da expressão de um polipeptídeo tendo uma reatividade de ligação através de uma reação antígeno-anticorpo a um anticorpo contra uma proteína CAPRINA-1 com qualquer uma das sequências de aminoácidos mostrada nas SEQ ID n°: 2 a 30 de numeração par, na Lista de Sequência, em uma amostra separada de um organismo vivo; (2) o método de acordo com (1) acima, no qual o polipeptídeo a ser medido é uma proteína CAPRINA-1 com qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID n°: 2 a 30 (ou seja, SEQ ID n°: 2, 4, 6, 8 ... 30) ou um polipeptídeo com 85% ou mais de identidade de sequência com a proteína CAPRINA- 1; (3) o método de acordo com (1) ou (2) acima, sendo que o organismo vivo é um ser humano, um cão ou um gato; (4) o método de acordo com (3) acima, sendo que o organismo vivo é um cão e o polipeptídeo a ser medido tem uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das sequências de pares SEQ ID n°: 2 a 30; (5) o método de acordo com (4) acima, onde o organismo vivo é um cão e o polipeptídeo a ser medido tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID n°: 6, 8, 10, 12 ou 14; (6) o método de acordo com (3) acima, onde o organismo vivo é um ser humano e o polipeptídeo a ser medido tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID n°: 2 ou 4; (7) o método de acordo com qualquer um de (1) a (6) acima, onde a expressão do polipeptídeo é medida por um imunoensaio de um anticorpo que pode estar contido na amostra e é induzido in vivo contra o polipeptídeo a ser medido; (8) o método de acordo com qualquer um de (1) a (7) acima, onde a amostra é um soro, plasma sanguíneo, ascite ou derrame pleural; (9) o método de acordo com qualquer um de (1) a (6) acima, onde a expressão do polipeptídeo é avaliada através da medição da codificação do mRNA do polipeptídeo, que está contida na amostra; (10) o método de acordo com (9), compreendendo a análise da quantidade existente do mRNA na amostra usando um polinucleotídeo que hibridiza especificamente a uma sequência parcial de 15 ou mais nucleotídeos, de preferência de 20 a 25 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos do mRNA acima; (11) o método de acordo com (10) acima, sendo que o organismo vivo acima é um cão e o polinucleotídeo acima é um polinucleotídeo que hibridiza especificamente com uma sequência parcial de 15 ou mais nucleotídeos, de preferência de 20 a 25 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID n°: 5, 7, 9, 11 ou 13; (12) o método de acordo com (10) acima, sendo que o organismo vivo acima é um humano e o polinucleotídeo acima é um polinucleotídeo que hibridiza especificamente com uma sequência parcial de 15 ou mais nucleotídeos, de preferência de 20 a 25 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 ou mais nucleotídeos, na sequência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID n°: 1 ou 3; (13) o método de acordo com qualquer um dos (9) a (12), sendo que o exemplo acima é um tecido ou uma célula; (14) o método de acordo com qualquer um de (1) a (13) acima, sendo que o câncer é pelo menos um tipo de câncer selecionado a partir do grupo que consiste em tumor cerebral, carcinoma de célula escamosa da cabeça, pescoço, pulmão, útero ou esôfago, melanoma, adenocarcinoma do pulmão ou do útero, câncer renal, tumor misto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma das células basais, tumor gengival do tipo acantoma, tumor da cavidade oral, adenocarcinoma perianal, tumor do saco anal, adenocarcinoma da apócrinas do canal anal, carcinoma de células de Sertoli, o câncer do vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glândulas sudoríparas, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, câncer de tireóide, câncer de intestino grande, adenocarcinoma brônquico, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo compósito, tumor misto maligno de mama, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrossarcoma, hemangiopericitoma, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de tecido mole, sarcoma histiocítico, mixossarcoma, sarcoma indiferenciado, câncer de pulmão, mastocitoma, leiomioma cutâneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequenas a células médias, tumor adrenomedular, tumor de células granulosa e feocromocitoma; (15) o método de acordo com qualquer um de (1) a (14) acima, que inclui ainda a detecção de malignidade do câncer baseada no fato de que a malignidade de um câncer é alta quando o nível de expressão do polipeptídeo acima for maior do que de um controle; (16) método de acordo com qualquer um de (1) a (15) acima, compreendendo adicionalmente detectar a progressão do câncer com base no indicador de que a extensão do câncer é avançada quando o nível de expressão do polipeptídeo acima é mais alto do que de um controle; (17) reagente para detectar um câncer, compreendendo um polipeptídeo que tem uma reatividade de ligação por meio de uma reação antígeno-anticorpo a um anticorpo que é induzido in vivo contra uma proteína CAPRINA-1 tendo uma das sequências de aminoácidos mostradas nos SEQ ID N°: 2 a 30 de numeração par na Listagem de Sequências; (18) reagente para detectar um câncer, compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que é submetido a uma reação antígeno-anticorpo com um polipeptídeo, sendo que o polipeptídeo tem uma reatividade de ligação por meio de uma reação antígeno-anticorpo a um anticorpo contra uma proteína CAPRINA-1 tendo uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 2 a 30 de numeração par na Listagem de Sequências e é produzido in vivo (ou em um corpo vivo); (19) reagente para detectar câncer de acordo com (18), sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo que é submetido a uma reação antígeno-anticorpo com o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga à superfície de uma célula de câncer; (20) reagente para detectar câncer de acordo com (18) ou (19), sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que é submetido a uma reação antígeno-anticorpo com o polipeptídeo tem uma reatividade imunológica com: um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de 7 ou mais resíduos de aminoácido contínuo dentro da região de resíduo de aminoácido N° 50 a 98 ou resíduo de aminoácido N° 233 a 305 em qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 2 a 30 de numeração par, excluindo a SEQ ID N°: 6 e a SEQ ID N°: 18 ou um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo como uma sequência parcial; (21) reagente para detectar um câncer de acordo com um de (18) a (20), sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que é submetido a uma reação antígeno-anticorpo com o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à SEQ ID N°: 43, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 44 e 45, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 44 e 46, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 44 e 47, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 44 e 48, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 49 e 50, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 51 e 52, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 53 e 54, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 55 e 56, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 57 e 58, ou um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 59 e 60; (22) reagente para detectar um câncer, compreendendo um polinucleotídeo que se hibridiza especificamente a uma sequência parcial de 15 ou mais nucleotídeos, de preferência 20 a 25 ou mais nucleotídeos, e com maior preferência 30 ou mais nucleotídeos em qualquer uma das sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1 a 29 de número ímpar (isto é, SEQ ID N°: 1,3, 5, 7,... 29) na Listagem de Sequências.

VANTAGEM DA INVENÇÃO

[022] De acordo com a presente invenção, um novo método para detectar um câncer é apresentado. Conforme descrito especificamente nos Exemplos oferecidos anteriormente, um polipeptídeo recombinante preparado com base na sequência de aminoácido de CAPRINA-1 (ou também denominado de CAPRINA-1) reage com um anticorpo que existe especificamente no soro de um paciente com câncer. Portanto, o câncer que existe em um corpo vivo pode ser detectado medindo o anticorpo em uma amostra por meio do método da presente invenção. Além disso, o câncer que existe em um corpo vivo pode ser detectado medindo o próprio CAPRINA-1. De acordo com o método da presente invenção, o câncer de tamanho pequeno invisível a olho nu ou o câncer em uma parte profunda in vivo pode ser detectado. Por conseguinte, o método da presente invenção é utilizável para a detecção antecipada de câncer no momento do exame de saúde ou algo semelhante. Além disso, o câncer recorrente pode ser detectado antecipadamente por meio do uso do método da presente invenção para o acompanhamento de um paciente após o tratamento de câncer. Além disso, de acordo com o método da presente invenção, a extensão do câncer também pode ser diagnosticada, tal como o aumento de tumor, a infiltração para o tecido periférico, e a metástase de câncer para um nódulo linfático e um órgão distante. Além disso, o nível sérico de anticorpo é mais alto em um paciente com câncer altamente maligno do que em um paciente com câncer de baixa malignidade. De acordo com o método da presente invenção, a malignidade do câncer também pode ser diagnosticada. Além disso, conforme descrito nos Exemplos abaixo, o mRNA que codifica CAPRINA-1 é expresso especificamente em níveis altos em testes e células de câncer. Portanto, os cânceres também podem ser detectados medindo o mRNA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[023] A Figura 1 mostra os padrões de expressão do gene que codifica uma proteína CAPRINA-1 em tecidos normais e linhas de células de tumor. A Referência N° 1 indica os padrões de expressão do gene que codifica a proteína CAPRINA-1. A Referência N° 2 indica os padrões de expressão do gene GAPDH.

[024] A Figura 2 mostra os resultados da detecção por meio da coloração Coomassie sobre o polipeptídeo derivado de CAPRINA-1 canina que é um exemplo de polipeptídeos a serem usados na presente invenção, que foram produzidos e purificados usando Escherichia coli nos Exemplos. A Referência N° 3 indica a banda de um polipeptídeo derivado de CAPRINA-1 canina.

[025] A Figura 3 mostra alguns dos resultados de diagnóstico de câncer para cães portadores de câncer usando os polipeptídeos derivados de CAPRINA-1 canina preparados nos Exemplos.

[026] A Figura 4 mostra alguns dos resultados do diagnóstico de câncer detalhado para cães portadores de câncer usando os polipeptídeos derivados de CAPRINA-1 canina preparados nos Exemplos.

MODALIDADE PREFERIDA DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[027] De acordo com o método da presente invenção, a expressão de CAPRINA-1 é medida usando uma amostra separada de um organismo vivo. Os exemplos de um método para medir a expressão de CAPRINA-1 incluem um método (1° método) que envolve imunoensaio para um anticorpo contra CAPRINA-1 contida em uma amostra, um método (2° método) que envolve imunoensaio para a própria CAPRINA-1 contida em uma amostra, e um método (3° método) que envolve a medição de mRNA que codifica a CAPRINA-1 contida em uma amostra. No método da presente invenção, a expressão de CAPRINA-1 pode ser medida por meio de quaisquer desses métodos. Na presente invenção, o termo “medição” se refere a qualquer uma da detecção, determinação qualitativa, determinação quantitativa, e semideterminação quantitativa.

[028] A sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 é a sequência de aminoácido de CAPRINA-1 canina. A CAPRINA-1 canina tendo a sequência de aminoácido foi identificada como uma ligação de polipeptídeo a um anticorpo que existe especificamente no soro derivado de cão portador de câncer por meio do método SEREX usando uma biblioteca de cDNA derivada de testículo canino e o soro de um cão portador de câncer (vide Exemplo 1). De forma específica, um anticorpo contra CAPRINA-1 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 é induzida especificamente in vivo em um cão portador de câncer. Portanto, o câncer canino pode ser detectado medindo o anticorpo contra CAPRINA-1 acima tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 usando o 1° método acima (vide exemplos 3 e 4). O câncer canino também pode ser detectado medindo a própria CAPRINA-1 conforme um antígeno mostrado nas SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 usando o 2° método acima (vide exemplos 5 e 6). Além disso, o câncer canino pode ser detectado, conforme descrito nos seguintes Exemplos, medindo mRNA que codifica CAPRINA-1 tendo em vista que o mRNA é expresso em níveis significativamente altos em testes e células de câncer (vide Exemplo 1).

[029] O termo “tendo uma sequência de aminoácido”, conforme usado neste documento, refere-se a resíduos de aminoácido sendo alinhados na ordem relevante. Portanto, por exemplo, a expressão “polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2” se refere a um polipeptídeo tendo 709 resíduos de aminoácido, que consiste na sequência de aminoácido de Met Pro Ser Ala--(abreviada)--Gln Gln Val Asn mostrada na SEQ ID N°: 2. Além disso, por exemplo, a expressão “polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2” também pode ser abreviada como “o polipeptídeo da SEQ ID N°: 2.” O mesmo se aplica à expressão “tendo uma/a sequência de nucleotídeo.” Nesse caso, o termo “tendo” pode ser substituído pelas expressões “consistindo em”.

[030] Além disso, o termo “polipeptídeo”, conforme usado neste documento refere-se a uma molécula que é formada via aglutinação de peptídeo de uma pluralidade de aminoácidos. Exemplos de tal molécula incluem não somente moléculas de polipeptídeo com inúmeros aminoácidos constituintes, como também moléculas de peso molecular baixo (oligopeptídeos) com pequena quantidade de aminoácidos e proteínas de comprimento completo. A presente invenção abrange adicionalmente as proteínas CAPRINA-1 de comprimento completo com cada uma tendo uma sequência de aminoácido mostrada em uma ID de sequência de número par dentre as SEQ ID N°: 2 a 30.

[031] No método da presente invenção, não somente a CAPRINA-1 canina das SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14, como também a CAPRINA-1 de outros mamíferos (daqui por diante, também pode ser denominada de “homólogo” para a CAPRINA-1 canina. Quando denominada simplesmente de “CAPRINA-1,” a CAPRINA-1 a partir de não somente um cão como também a partir de outro mamífero também é abrangida neste documento) também são submetidas à medição. Conforme descrito especificamente nos seguintes Exemplos, o mRNA que codifica a CAPRINA-1 humana é expresso de forma significativa em um nível alto em testículos humanos e células de câncer, como no caso da CAPRINA-1 canina das SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12 ou 14. Entretanto, no anticorpo contra a CAPRINA-1 humana é detectado em um corpo humano saudável. Além disso, um anticorpo contra CAPRINA-1 felina não é detectado em um corpo de gato saudável, mas é detectado em um gato portador de câncer sozinho. Portanto, o câncer de um mamífero diferente de um cão pode ser detectado medindo a expressão de CAPRINA-1 no mamífero. Exemplos de CAPRINA-1 de mamíferos diferentes de cães, que são sujeitos de medição no método da presente invenção, incluem, mas não estão limitados a, CAPRINA-1 humana e CAPRINA-1 felina. Uma sequência de nucleotídeo que codifica CAPRINA-1 humana e a sequência de aminoácido da mesma estão, conforme mostrado separadamente, nas SEQ ID N°: 1 e 3, e 2 e 4, respectivamente, na Listagem de Sequências. A identificação de sequência com CAPRINA-1 canina é de 94% em termos de sequência de nucleotídeo e é de 98% em termos de sequência de aminoácido. Até mesmo cães e seres humanos que são mamíferos geneticamente distantes compartilham identificação de sequência tão alta quanto 98% em termos da sequência de aminoácido de CAPRINA-1. Portanto, pensa-se em um cão e um mamífero diferente de um ser humano; isto é, a CAPRINA-1 canina e o homólogo da mesma compartilham identificação de sequência tão alta quanto cerca de 85% ou mais. Portanto, a CAPRINA-1, cuja expressão é medida no método da presente invenção, tem de preferência 85% ou mais e com maior preferência 95% ou mais de identificação de sequência com a sequência de aminoácido de CAPRINA-1 canina mostrada nas SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14. Entretanto, tais exemplos não são limitados particularmente as mesmas.

[032] No 1° método acima, o anticorpo acima, que pode estar presente em uma amostra, pode ser medido facilmente por meio de imunoensaio usando uma substância antigênica que é submetida a uma reação antígeno-anticorpo com o anticorpo. O próprio imunoensaio é um método convencional conhecido, conforme descrito especificamente abaixo. Conforme uma substância antigênica para imunoensaio, a CAPRINA-1 canina das SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 que ocasiona a indução do anticorpo dentro de um corpo de cão portador de câncer pode ser usada. Além disso, um anticorpo tem reatividade cruzada. Desse modo, até mesmo uma molécula diferente de uma substância antigênica tendo servido efetivamente como um imunogene pode se ligar a um anticorpo induzido contra o imunogene via uma reação antígeno- anticorpo, desde que uma estrutura análoga ao epítopo do imunogene esteja presente na molécula. Em particular, uma proteína a partir de um mamífero e um homólogo da mesma a partir de outro mamífero compartilham identidade de sequência de aminoácido alta e têm, frequentemente, as estruturas de epítopo análogas uma a outra. Conforme descrito especificamente nos seguintes Exemplos, a CAPRINA-1 canina das SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, ou 14 é submetida a uma reação antígeno-anticorpo não somente com um anticorpo induzido contra a CAPRINA-1 canina dentro de um corpo de cão portador de câncer, como também com um anticorpo induzido contra CAPRINA-1 felina dentro de um corpo de gato portador de câncer. Além disso, a CAPRINA-1 humana é submetida a uma reação antígeno-anticorpo com o anticorpo acima induzido dentro dos corpos de gato portador de câncer ou cachorro portador de câncer. Assim sendo, no 1° método da presente invenção, a CAPRINA-1 a partir de qualquer mamífero pode ser usada conforme um antígeno para imunoensaio.

[033] Em geral, quando uma substância antigênica é uma proteína ou algo semelhante tendo uma estrutura complicada e peso molecular alto, uma pluralidade de sítios tendo estruturas diferentes está presente na molécula. Portanto, uma pluralidade de tipos de anticorpo capazes de reconhecerem e ligarem-se a sítios diferentes de tais substâncias antigênicas é produzida in vivo. De forma específica, um anticorpo que é produzido in vivo contra uma substância antigênica, tal como proteína, é um anticorpo policlonal que é uma mistura de uma pluralidade de tipos de anticorpo. Um anticorpo descrito pelos presentes inventores também é um anticorpo policlonal. O mesmo está presente especificamente em soro derivado de organismo vivo portador de câncer e se liga especificamente a uma proteína CAPRINA-1 recombinante via uma reação antígeno-anticorpo. O termo “anticorpo policlonal” usado na presente invenção se refere a um anticorpo que existe em soro a partir de um organismo vivo contendo uma substância antigênica no mesmo e é induzido in vivo contra a substância antigênica.

[034] Nos Exemplos descritos mais tarde, os polipeptídeos das SEQ ID N°: 6 e SEQ ID N°: 8 (CAPRINA-1 canina) e o polipeptídeo da SEQ ID N°: 2 (CAPRINA-1 humana) foram preparados como antígenos para imunoensaio de anticorpos específicos nos animais vivos portadores de câncer. Então, a reatividade entre esses polipeptídeos e o anticorpo acima em soro a partir de um organismo vivo portador de câncer foi confirmada. Entretanto, o anticorpo acima é um anticorpo policlonal, para que o mesmo se una naturalmente a um polipeptídeo consistindo no homólogo das SEQ ID N°: 6, 8, ou 2. Mesmo no caso de um fragmento dos ditos polipeptídeos, o mesmo pode se ligar ao anticorpo acima contido em soro a partir de um organismo vivo portador de câncer, tendo em vista que o anticorpo policlonal pode conter um anticorpo capaz de reconhecer a estrutura do fragmento relevante. Isto é, um polipeptídeo (isto é, a proteína CAPRINA-1 de comprimento completo) do homólogo das SEQ ID N°: 6, 8, ou 2 ou um fragmento da mesma pode ser usado de forma similar para a medição do anticorpo policlonal acima contido especificamente em soro de um organismo vivo portador de câncer e é utilizável para a detecção de câncer. Portanto, exemplos de um polipeptídeo a ser usado conforme um antígeno para imunoensaio no 1° método da presente invenção incluem, não somente um polipeptídeo que consiste na região de comprimento completo da CAPRINA-1 (por exemplo, SEQ ID N°: 6, 8, ou 2), como também um fragmento de polipeptídeo que consiste em 7 aminoácidos contínuos ou mais, de preferência 8 aminoácidos contínuos ou mais, 9 aminoácidos contínuos ou mais, ou 10 aminoácidos contínuos ou mais na sequência de aminoácido de CAPRINA-1 e é submetida a uma reação antígeno-anticorpo com um anticorpo policlonal contra CAPRINA-1 (daqui por diante, pode ser denominado de forma conveniente de “um polipeptídeo parcial especificamente reativo”). É conhecido no estado da técnica que um polipeptídeo de cerca de 7 ou mais resíduos de aminoácido exerce antigenicidade. Entretanto, se a quantidade de resíduos de aminoácido constituindo um polipeptídeo for muito baixa, tal polipeptídeo executa provavelmente reação cruzada com anticorpos, que existem na amostra, contra proteínas diferentes de CAPRINA-1. Assim sendo, com a finalidade de aumentar a precisão do imunoensaio, a quantidade desejável de resíduos de aminoácido de um fragmento de polipeptídeo pode ser de preferência de 30 ou mais ou 50 ou mais, adicionalmente de preferência de 100 ou mais ou 150 ou mais, adicionalmente de preferência de 300 ou mais, até mesmo com maior preferência de 600 ou mais, e adicionalmente de preferência de 1.000 ou mais e 1.500 ou mais.

[035] Exemplos preferenciais específicos dos polipeptídeos a serem usados como antígenos são os polipeptídeos das SEQ ID N°: 2 a 30 de número par ou fragmentos das mesmas.

[036] A sequência de nucleotídeos de polinucleotídeos que codificam proteínas consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID N°: 2 a 30 de número par (isto é, SEQ ID N°: 2, 4, 6---28, 30) é mostrada nas SEQ ID N°: 1 a 29 de número ímpar (isto é, SEQ ID N°: 1,3, 5-...-27, 29).

[037] Em geral, é amplamente conhecido por técnicos no assunto sobre os antígenos de proteína que mesmo quando poucos resíduos de aminoácido tenham sido substituídos, eliminados, adicionados, ou inseridos na sequência de aminoácido da proteína, o resultante pode reter antigenicidade quase equivalente àquela da proteína original. Portanto, um polipeptídeo: tendo uma sequência que tem uma substituição, uma eliminação, e/ou uma inserção de alguns (de preferência um ou diversos) resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácido de CAPRINA-1 e tem 80% ou mais, 85% ou mais, de preferência 90% ou mais, com maior preferência 95% ou mais, e adicionalmente de preferência 98% ou mais de identificação de sequência com a sequência original; e a ligação especificamente a um anticorpo policlonal contra CAPRINA-1 via uma reação antígeno-anticorpo (daqui por diante, pode ser denominado de forma conveniente de “polipeptídeo modificado especificamente reativo”) pode ser usado para detecção de câncer de uma maneira similar àquela para os polipeptídeos acima. De preferência, o polipeptídeo modificado especificamente reativo tem uma sequência de aminoácido que tem uma substituição, uma eliminação, uma adição, e/ou uma inserção de um ou diversos resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácido de CAPRINA-1. O termo “diversos”, conforme usado neste documento, refere-se a um número inteiro de 2 a 10, de preferência um número inteiro de 2 a 6, e adicionalmente de preferência um número inteiro de 2 a 4.

[038] O termo “identificação de sequência (de sequências de aminoácidos)”, conforme usado neste documento, é obtido por meio do alinhamento de duas sequências de aminoácidos a serem comparadas para que os resíduos de aminoácido sejam compatíveis tanto quanto possível, subtraindo o número de resíduos de aminoácido, que foram compatíveis, do número total de resíduos de aminoácido, e expressando, então, o resultado na forma de porcentagem. Mediante o alinhamento acima, se necessário, espaços são inseridos de forma apropriada no interior de uma ou ambas as sequências a serem comparadas. Tal alinhamento de sequência pode ser desempenhado usando um programa conhecido, tal como BLAST, FASTA, ou CLUSTAL W (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).

[039] Vinte tipos de aminoácidos que constituem proteínas naturais podem ser agrupados em aminoácidos neutros que têm cadeias laterais com baixa polaridade (Gli, Ile, Val, Leu, Ala, Met e Pro), aminoácidos neutros que têm cadeias laterais hidrofílicas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr e Cis), aminoácidos ácidos (Asp e Glu), aminoácidos básicos (Arg, Lis e His) e aminoácidos aromáticos (Phe, Tir, Trp e His) nos quais os membros de cada grupo têm propriedades análogas entre si. É de conhecimento que a substituição dentre estes aminoácidos (isto é, substituição conservadora) raramente altera as propriedades do polipeptídeo resultante. Portanto, quando resíduos de aminoácido de CAPRINA-1 são substituídos, a substituição é realizada entre os membros do mesmo grupo de modo que uma possibilidade de manter a ligação ao anticorpo correspondente se torne maior. No entanto, na presente invenção, a variante acima pode envolver substituição não- conservadora, desde que atividade imuno indutora equivalente a ou quase equivalente àquela de uma não variante seja transmitida.

[040] Um polipeptídeo (doravante pode ser referido, convenientemente, como “polipeptídeo de adição especificamente reativo”) que contém, como uma sequência parcial, o polipeptídeo acima para ser usado na presente invenção (isto é, preparado através da adição de outro (poli)peptídeo a uma extremidade ou ambas as extremidades de um polipeptídeo a ser usado na presente invenção) e se liga, especificamente, a um anticorpo policlonal contra CAPRINA-1 através de uma reação antígeno-anticorpo também pode ser usado para detecção de câncer de maneira similar àquela para os polipeptídeos acima.

[041] Os polipeptídeos acima a serem usados na presente invenção podem ser sintetizados de acordo com um método de síntese química como um método Fmoc (método fluorenilmetiloxicarbonil) e um método tBoc (método t-butiloxi-carbonil) (Ed., The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification e Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD (Japão), 1981). Além disto, os polipeptídeos também podem ser sintetizados através de um método convencional com o uso de vários sintetizadores de peptídeo comercialmente disponíveis. Alternativamente, os polipeptídeos podem ser preparados facilmente com o uso de técnicas de engenharia genética conhecidas (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons e similares). Por exemplo, a partir do RNA extraído de um tecido que expressa um gene que codifica a CAPRINA-1 humana de SEQ ID NO: 2 ou um homólogo deste, o cDNA do gene é preparado através de RT-PCR. A sequência de comprimento completo ou uma sequência parcial desejada do cDNA é incorporada a um vetor de expressão e, então, o vetor é introduzido nas células hospedeiras, de modo que um polipeptídeo de interesse possa ser obtido. As sequências de nucleotídeo de cDNAs que codifica CAPRINA-1 canina de SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12 e 14 são mostradas nas SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 e 13, respectivamente. Os fatores humanos homólogos deste; isto é, as sequências de nucleotídeo de cDNAs que codificam a CAPRINA-1 humana de SEQ ID NOS: 2 e 4 são mostrados nas SEQ ID NOS: 1 e 3, respectivamente. Por conseguinte, os iniciadores a serem usados para RT- PCR pode ser facilmente designados em referência àquelas sequências de nucleotídeo. Além disto, conforme descrito posteriormente, um gene que codifica CAPRINA-1 de um mamífero não humano pode ser amplificado com o uso dos iniciadores designados em referência às sequências de nucleotídeo das SEQ ID NOS de número ímpar: 1-29. Por exemplo, o cDNA que codificam CAPRINA-1 felina pode ser facilmente preparado através de técnicas similares àquelas técnicas descritas acima. A extração de RNA, RT-PCR, a incorporação de cDNA em um vetor, e introdução de um vetor em células hospedeiras podem ser realizadas através de métodos conhecidos, conforme os descritos acima, por exemplo. Além disto, os vetores e células hospedeiras a serem usados também são conhecidos e vários vetores e células hospedeiras estão comercialmente disponíveis.

[042] As células hospedeiras acima podem ser quaisquer células, desde que as mesmas possam expressar os polipeptídeos acima. Os exemplos de células hospedeiras procarióticas incluem Escherichia coli e similares. Os exemplos de células hospedeiras eucarióticas incluem células cultivadas de mamífero como células renais de macaco (COS1), células de ovário de hamster chinês (CHO), a linhagem de célula renal embrionária humana (HEK293) e a linhagem de célula de pele embrionária de rato (NIH3T3), levedura em germinação, levedura de fissão, células de bicho da seda e oócitos de Xenopus.

[043] Quando são usadas células procarióticas como células hospedeiras, um vetor de expressão que tem uma origem de replicação em células procarióticas, são usados um promotor, um sítio de ligação de ribossomo, um sítio de multi-clonagem, um terminador, um gene resistente à droga, um gene complementar auxotrópico e similares. Como vetores de expressão para Escherichia coli, vetores pUC, pBluescriptII, sistemas de expressão pET, sistemas de expressão pGEX, e similares podem ser exemplificados. Um DNA que codifica o polipeptídeo acima é incorporado em tal vetor de expressão, as células hospedeiras procarióticas são transformadas com o vetor e, então, o transformante obtido deste modo é cultivado, de modo que o polipeptídeo codificado pelo DNA possa ser expresso nas células hospedeiras procarióticas. Neste instante, o polipeptídeo também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína. Um DNA que codifica o polipeptídeo acima pode ser obtido ao preparar um cDNA através de RT-PCR conforme descrito acima, por exemplo. Mais adicionalmente, tal DNA que codifica o polipeptídeo acima também pode ser sintetizado através de um método convencional com o uso de sintetizadores de ácido nucleico comercialmente disponíveis conforme descrito abaixo. As sequências de nucleotídeo de cDNAs dos genes que codificam CAPRINA-1 de SEQ ID NOS: 2 e 4 são mostradas nas SEQ ID NOS: 1 e 3, respectivamente, na Listagem de Sequências.

[044] Quando são usadas células eucarióticas como células hospedeiras, são usados os vetores de expressão para células eucarióticas que têm um promotor, uma região de junção, um sítio adicional de poli(A) e similares. Os exemplos de tais vetores de expressão incluem pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vetor EBV, pRS, pcDNA3 e pYES2. Da mesma forma que acima, um DNA que codifica um polipeptídeo a ser usado na presente invenção é incorporado em tal vetor de expressão, as células hospedeiras eucarióticas são transformadas com o vetor e, então, o transformante obtido deste modo é cultivado, de modo que o polipeptídeo codificado pelo DNA acima possa ser expresso em células hospedeiras eucarióticas. Quando pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 ou similares são usados como um vetor de expressão, o polipeptídeo acima pode ser expresso como um a proteína de fusão com várias etiquetas, como uma etiqueta His (por exemplo, (His)6 a (His)10), uma etiqueta FLAG, uma etiqueta mic, uma etiqueta HA e GFP.

[045] Para introdução de um vetor de expressão em uma célula hospedeira, podem ser empregados métodos conhecidos como eletroporação, um método de fosfato de cálcio, um método de lipossomo, um método DEAE dextran, microinjeção, infecção viral, lipofecção e ligação com um peptídeo de célula de membrana permeável.

[046] O isolamento e purificação de um polipeptídeo de interesse de células hospedeiras podem ser realizados através do uso de técnicas de isolamento conhecidas em combinação. Os exemplos de tais técnicas conhecidas incluem tratamento com o uso de um agente desnaturante como ureia ou um tensoativo, ultrassonificação, digestão enzimática, precipitação por sal, precipitação e fracionamento de solvente, diálise, centrifugação, ultrafiltração, filtração por gel, SDS-PAGE, focalização isoelétrica, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade cromatografia de fase reversa.

[047] Os polipeptídeos obtidos através dos métodos acima incluem polipeptídeos sob a forma de proteínas de fusão com quaisquer outras proteínas. Um exemplo de tal proteína de fusão inclui uma proteína de fusão com glutationa-S-transferase (GST), uma etiqueta His ou similares. Os polipeptídeos sob a forma de tais proteínas de fusão também são exemplos dos polipeptídeos de adição especificamente reativos descritos acima e podem ser usados para o primeiro método de detecção da presente invenção. Mais adicionalmente, um polipeptídeo expresso nas células transformadas pode ser submetido a vários tipos de modificação nas células após translação. Tal polipeptídeo que é modificado após translação pode ser usado no primeiro método de detecção da presente invenção, desde que o mesmo seja capaz de se ligar a um anticorpo policlonal contra CAPRINA-1. Os exemplos de tal modificação pós-translação incluem a remoção de metionina do N-terminal, acetilação do N-terminal, glicosilação, proteólise limitada por protease intracelular, miristoilação, isoprenilação e fosforilação.

[048] Um anticorpo em uma amostra pode ser facilmente medido através de imunoensaio com o uso do polipeptídeo acima como um antígeno. O próprio imunoensaio é conhecido no estado da técnica. O imunoensaio é classificado em um método sanduíche, um método de competição, um método de aglutinação, método de transferência Western blot e similares com base nos tipos de reação. Além disto, o imunoensaio é classificado com base nos marcadores no radioimunoensaio, imunoensaio por fluorescência, imunoensaio por enzima e imunoensaio biotina, por exemplo. O imunoensaio do anticorpo acima pode ser realizado com o uso de quaisquer destes métodos. O ELISA sanduíche ou o método de aglutinação são aplicáveis, de preferência, como uma técnica de imunoensaio para o anticorpo acima no método da presente invenção, já que os procedimentos destes métodos são convenientes e não precisam de aparelhos extensivos e similares. Porém, as técnicas não se limitam a estas. Quando é usada uma enzima como um marcador para um anticorpo, tal enzima não é particularmente limitada, desde que a mesma cumpra as condições tal que: o número de renovação seja elevado; isto permaneça estável mesmo se liga a um anticorpo, causando especificamente o desenvolvimento de cor do substrato, e similares. Os exemplos de enzimas que podem ser usados para imunoensaio geral de enzima incluem peroxidase, β- galactosidase, fosfatase alcalina, glucose oxidase, acetilcolina esterase, glucose-6-fosforilação dehidrogenase e dehidrogenase de ácido málico. Além disto, podem ser usadas substâncias inibidoras de enzima, coenzimas e similares. A ligação destas enzimas aos anticorpos pode ser realizada através de métodos conhecidos com o uso de um agente reticulador como um composto de maleimida. Como um substrato, uma substância conhecida pode ser usada dependendo do tipo de uma enzima a ser usada. Por exemplo, que é usada peroxidase como uma enzima, 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina pode ser usada. Além disto, quando é usada fosfatase alcalina como uma enzima, para- nitrofenol ou similares podem ser usados. Como um isótopo de rádio, um isótopo de rádio que é geralmente usado para radioimunoensaio, como 125I e 3H pode ser usado. Como um corante fluorescente, um corante fluorescente que é usado para técnicas gerais de anticorpo fluorescente, como isotiocianato de fluorescência (FITC) e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) pode ser usado.

[049] Não há necessidade de se explicar as técnicas de imunoensaio acima no presente, já que as mesmas são bem conhecidas. No entanto, quando estas técnicas de imunoensaio são brevemente descritas, o método sanduíche envolve a imobilização do polipeptídeo acima a ser usado como um antígeno para uma fase sólida, reagindo isto com uma amostra como soro, lavagem, reagindo com um anticorpo secundário apropriado, lavagem e, então, medição do anticorpo secundário ligado à fase sólida, por exemplo. Um anticorpo secundário não ligado pode ser facilmente removido através da imobilização de um polipeptídeo de antígeno a uma fase sólida. Por conseguinte, isto é preferível como uma modalidade do método para detectar câncer da presente invenção. Como um anticorpo secundário, um anticorpo IgC anti-canino pode ser usado se uma amostra é derivada de um cão. Um anticorpo secundário é marcado com antecedência com uma substância de marcação exemplificada acima, de modo que o anticorpo secundário que se liga a uma fase sólida possa ser medido. A quantidade assim medida do anticorpo secundário corresponde à quantidade do anticorpo acima na amostra de soro. Quando é usada uma enzima como uma substância de marcação, a quantidade do anticorpo pode ser medida ao adicionar um substrato que é digerido para desenvolver cor através da ação enzimática e, então, medição óptica a quantidade do substrato degradado. Quando é usado um isótopo de rádio como uma substância de marcação, a quantidade de radiação do isótopo de rádio pode ser medida com o uso de contador de cintilação ou similares.

[050] No segundo método da presente invenção, a CAPRINA-1 que pode estar contida em uma amostra de um organismo vivo é medida. Conforme descrito acima, dentre pacientes de câncer, a quantidade de um anticorpo que passa por uma reação antígeno-anticorpo com CAPRINA-1 de um cão, uma humana, ou similares é significantemente elevada. Isto indica que a quantidade de CAPRINA-1 acumulada como um antígeno é significantemente elevada em células de câncer. O câncer também pode ser detectado através de medição direta de CAPRINA-1, conforme especificamente descritos nos Exemplos abaixo. Portanto, o câncer pode ser detectado in vivo através da medição da própria CAPRINA-1 de forma similar ao primeiro método acima.

[051] Um polipeptídeo em uma amostra pode ser facilmente medido através de técnicas de imunoensaio bem conhecidas. Especificamente, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que passa por uma reação antígeno-anticorpo com CAPRINA-1, é preparado, é realizado o imunoensaio com o uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno dito e, então, a CAPRINA-1 que pode estar presente na amostra pode ser medida. Conforme descrito acima, um anticorpo tem uma reatividade cruzada. Por conseguinte, por exemplo, com o uso de um anticorpo ou do fragmento de ligação a antígeno deste, que passa por uma reação antígeno- anticorpo com a CAPRINA-1 canina de SEQ ID NO: 6, não apenas a CAPRINA-1 canina de SEQ ID NO: 6, mas também seu homólogo em outros mamíferos (por exemplo, a CAPRINA-1 humana de SEQ ID NO: 2 ou 4 a CAPRINA-1 felina) podem ser medidas. Uma própria técnica de imunoensaio é uma técnica convencional conhecida conforme descrito acima.

[052] Este exame revelou que a CAPRINA-1 é uma proteína de membrana de célula que é expressa sobre as superfícies de células de câncer. Um organismo vivo com câncer contém muitos tipos de proteases. Especificamente, em um organismo vivo com câncer, uma porção extracelularmente expressa da sequência de CAPRINA-1 é separada das células de câncer através de degradação, de modo que tal porção exista a um nível mais elevado que uma porção intracelularmente expressa da sequência de CAPRINA-1. Portanto, quando um anticorpo contra CAPRINA-1 ou um fragmento de ligação a antígeno deste a ser usado nesta medição, que se liga à superfície da célula de câncer, é usado, a CAPRINA-1 pode ser detectada a níveis mais elevados e o câncer pode ser diagnosticado com sensibilidade mais elevada. Portanto, na presente invenção, os anticorpos que se ligam a uma porção da proteína CAPRINA-1 existente sobre as superfícies de células de câncer, são preferencialmente usados. Um exemplo de um peptídeo parcial da proteína CAPRINA-1 existente sobre as superfícies de células de câncer, é um polipeptídeo que compreende uma sequência de 7 ou mais resíduos de aminoácido contínuos na região de resíduo de aminoácido N°s (aa) 50-98 ou resíduo de aminoácido N°s. (aa) 233-305 nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 2-30 na Listagem de Sequências excluindo SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 18. Um exemplo específico disto é a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 61 (na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 61, uma região da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 63 é preferencial) ou uma sequência de aminoácido que tem 80% ou mais, preferencialmente 85% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácido relevante. Os exemplos de um anticorpo a ser usado na presente invenção incluem todos os anticorpos que se ligam a estes peptídeos. Os exemplos específicos do anticorpo incluem um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a SEQ ID NO: 43, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44 e 45, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44 e 46, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44 e 47, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44 e 48, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 49 e 50, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 51 e 52, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 53 e 54, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 55 e 56, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 57 e 58, ou a anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno deste que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 59 e 60.

[053] O termo “fragmento de ligação a antígeno” conforme usado no presente documento, se refere a um fragmento de anticorpo capaz de se ligar a um antígeno como a fragmento Fab e um fragmento F(ab’)2 contido em uma molécula de anticorpo. Um a ser usado no presente documento pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Para imunoensaio e similares, um anticorpo monoclonal com alta capacidade de reprodução é preferível. Um método para preparar um anticorpo policlonal e um anticorpo monoclonal com o uso de um polipeptídeo como um imunogênio é conhecido e pode ser facilmente realizado através de um método convencional. Por exemplo, a CAPRINA-1 é ligada a uma proteína transportadora como a hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), caseína ou albumina de soro e, então, um animal é imunizado com o resultante como um imunogênio juntamente com um adjuvante e, deste modo, um anticorpo contra CAPRINA-1 pode ser induzido. As células produtoras de anticorpo, como esplenócitos ou linfócitos, coletadas do animal imunizado, são fundidas às células de mieloma para preparar hibridomas e, então, produzir um anticorpo que se liga à CAPRINA-1 são selecionadas e, então, cultivadas, de modo que um anticorpo monoclonal, cujo antígeno correspondente é CAPRINA-1, possa ser obtido a partir de um sobrenadante cultivado. O método acima é um método convencional conhecido.

[054] No terceiro método da presente invenção, o mRNA que codifica a CAPRINA-1 que pode estar contida em uma amostra obtida a partir de um organismo vivo é medido. Conforme descrito especificamente nos Exemplos abaixo, o mRNA que codifica a CAPRINA-1 canina de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 ou 14 ou a CAPRINA-1 humana de SEQ ID NO: 2 ou 4 é expresso a um nível significantemente elevado em células de câncer. Portanto, o câncer pode ser detectado in vivo ao medir tal mRNA em uma amostra.

[055] O mRNA em uma amostra pode ser quantitativamente determinado por um método convencional como detecção RT-PCR em tempo real com o uso do mRNA como um modelo, por exemplo. Tal mRNA pode ser, em geral, quantitativamente determinado com base na intensidade de coloração ou similares no método de transferência Northern blot que é um método convencional. As sequências de cDNA que codificam polipeptídeos de CAPRINA-1 das SEQ ID NOS: 2-30 são mostradas nas SEQ ID NOS de número ímpar: 1-29, respectivamente. Por conseguinte, com base nestas sequências, um polinucleotídeo que hibridiza especificamente para uma região parcial na sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS de número ímpar: 1-29 (doravante, referido com “polinucleotídeo para detecção de câncer”) é preparado e, então, a quantidade do mRNA em uma amostra pode ser medida com o uso do polinucleotídeo como uma prova ou iniciador pata um método de amplificação de ácido nucleico. Conforme descrito posteriormente, se é um polinucleotídeo que hibridiza para uma região parcial na sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS de número ímpar: 1-29, o mRNA que codifica a CAPRINA-1 em mamíferos que não cães e seres humanos também pode ser determinado. Em adição, na presente invenção, um polinucleotídeo pode ser RNA ou DNA.

[056] O termo “se hibridizando especificamente a” conforme usado na presente invenção refere-se a que está sob condições gerais de hibridização, sendo que um sujeito é hibridizado a apenas uma região parcial de alvo, mas não se hibridiza substancialmente a outras regiões.

[057] O termo “(sob) condições gerais de hibridização” conforme usado na presente invenção refere-se a condições empregadas para o enrijecimento, em geral, PCR ou detecção com o uso de uma ponta de prova. Por exemplo, no caso do PCR com o uso de Taq polimerase, o termo refere-se a condições sob as quais a reação é executada em uma temperatura adequada de enrijecimento que varia de cerca de 54°C a 60°C com o uso de um tampão geral, como 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3 a 9,0), e 1,5 mM de MgCl2. Ainda, no caso de Hibridização de Northern, por exemplo, o termo refere-se a condições sob as quais uma reação é executada com o uso de uma solução geral de hibridização como 5 x SSPE, 50% de formamida, 5 x solução de Denhardt e 0,1%SDS a 0,5%SDS, ou 0,1 a 5 x SSC e 0,1 a 0,5% SDS em uma temperatura de hibridização adequada que varia de cerca de 42°C a 65°C.Ademais, após a hibridização, a lavagem é executada com 0,1 a 0,2 x SSC e 0,1% SDS, por exemplo. Entretanto, a temperatura adequada de enrijecimentos ou temperaturas de hibridização não são limitadas aos exemplos acima, e são determinadas com base no Valor de Tm para um polinucleotídeo para a detecção de câncer, que é usado como um iniciador ou uma ponta de prova, e a regra empírica de indivíduos que conduzem a experiência. Os técnicos no assunto podem determinar facilmente tal faixa de temperatura.

[058] A expressão “não se hibridiza substancialmente a” conforme usado na presente invenção refere-se a um sujeito que não se hibridiza realmente a uma região parcial de alvo ou um sujeito se hibridiza a uma região parcial de alvo em uma quantidade significativamente baixa; isto é, em uma quantidade relativa e significativamente pequena, mesmo quando a mesma é hibridizada à região parcial de alvo. Um exemplo de um polinucleotídeo que se hibridiza especificamente sob tais condições é um polinucleotídeo que tem identidade de sequência e um nível ou mais com a sequência de nucleotídeo de uma região parcial de alvo. Um exemplo específico de tal polinucleotídeo tem 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, 85% ou mais, com mais preferência 90% ou mais, com mais preferência 93% ou mais, com mais preferência 95% ou mais, e com mais preferência 98% ou mais de identidade de sequência. Com mais preferência, o polinucleotídeo tem uma sequência de nucleotídeo idêntica à sequência de nucleotídeo de uma região parcial de alvo. A identidade de sequência é definida da mesma maneira que a identidade de sequência da sequência de aminoácido acima. Mesmo se um término de um polinucleotídeo para detecção de câncer contém uma região que não se hibridiza a um sujeito, no caso de uma ponta de prova, o mesmo pode ser usado para a detecção contanto que uma região de hibridização ocupe até cerca de metade ou mais de toda a ponta de prova. Ainda, no caso de um iniciador, o mesmo pode ser usado para a detecção contanto que uma região de hibridização ocupe até cerca de metade ou mais de todo o iniciador e seja localizado na lateral de terminação 3’, já que o enrijecimento e reação de extensão normal podem ocorrer. Conforme descrito acima, quando o terminal de um polinucleotídeo para a detecção de câncer contém uma não-região de hibridização, a identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo alvo é calculada com foco apenas em uma região de hibridização sem levar a não-região de hibridização em consideração.

[059] O termo “sequência parcial” na presente invenção refere- se a uma sequência parcial na sequência de nucleotídeos mostrada nos números ímpares das SEQ ID Nos 1 a 29, especificamente a sequência parcial que tem uma sequência de 15 contínuos ou mais nucleotídeos, de preferência 18 contínuos ou mais nucleotídeos, com mais preferência 20 contínuos ou mais nucleotídeos ou 25 ou mais nucleotídeos, e com mais preferência 30, 40, ou 50 contínuos ou mais nucleotídeos. A expressão “a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID No 5” conforme usado na presente invenção refere-se a, em adição à sequência de nucleotídeo realmente mostrada na SEQ ID No 5, uma sequência complementar à sequência. Portanto, por exemplo, a expressão “um polinucleotídeo que tem a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID No: 5” refere-se a um polinucleotídeo com filamento único que tem a sequência de nucleotídeo realmente mostrada na SEQ ID No: 5, um polinucleotídeo com filamento único que tem uma sequência de nucleotídeo complementar à mostrada na SEQ ID No: 5, e um polinucleotídeo com filamento duplo que compreende os mesmos. Quando um polinucleotídeo a ser usado na presente invenção é preparado ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo a ser usado na presente invenção é preparado, qualquer sequência de nucleotídeo é adequadamente selecionada e esta seleção pode ser facilmente executada por técnicos no assunto.

[060] A quantidade de nucleotídeos em um polinucleotídeo para detecção de câncer é, de preferência, 18 ou mais nucleotídeos tendo em vista a garantia de especificidade. Quando usado como ponta de prova, o tamanho do polinucleotídeo é, de preferência, 18 ou mais nucleotídeos, é adicionalmente de preferência 20 ou mais nucleotídeos e o comprimento total ou menos da região de codificação. Quando usado como iniciador, o tamanho do polinucleotídeo é, de preferência, 18 ou mais nucleotídeos e 50 ou menos nucleotídeos. Um exemplo preferencial do polinucleotídeo para detecção de câncer é um polinucleotídeo que compreende 18 contínuos ou mais nucleotídeos em uma sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer SEQ ID Nos: 1 a 29 com números ímpares.

[061] É óbvio para técnicos no assunto que se referem a esta Descrição que: um polinucleotídeo se hibridizando especificamente a uma região parcial na SEQ ID No: 5, 7, 9, 11, ou 13 é usada para medição da quantidade de mRNA que codifica o CAPRINA-1 de canino da SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, ou 14, respectivamente; e um polinucleotídeo se hibridizando especificamente a uma região parcial na SEQ ID No: 1 ou 3 é usado para a medição da quantidade de mRNA que codifica o CAPRINA-1 humano da SEQ ID No: 2 ou 4, respectivamente. Entretanto, uma proteína proveniente de um mamífero e um homólogo da mesma proveniente de outro mamífero, em geral, compartilham alta identidade de sequência mesmo no nível da sequência de nucleotídeo. Dessa forma, a identidade de sequência dentre as sequências dos números ímpares das SEQ ID Nos: 1 a 13 também é tão alto quanto 94% a 100%. Consequentemente, um polinucleotídeo se hibridizando especificamente a uma região parcial da sequência da SEQ ID No: 5 pode também se hibridizar especificamente a uma região parcial que corresponde à região parcial relevante de qualquer um dentre os números ímpares das SEQ ID Nos: 1 a 29.

[062] Realmente, conforme descrito nos Exemplos abaixo, um par de iniciadores que têm as sequências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID NO: 33 e 34, respectivamente, se hibridiza especificamente a ambas as regiões parciais de qualquer uma dentre as sequências com números ímpares das SEQ ID Nos: 1 a 29 e uma região parcial da sequência de SEQ ID No: 5, de forma que ambos os mRNA que codifica o CAPRINA-1 de canino da SEQ ID No: 6 quanto o mRNA que codifica um homólogo do mesmo podem ser medidos, por exemplo. Consequentemente, por exemplo, com o uso de um polinucleotídeo se hibridizando especificamente a uma região parcial da sequência da SEQ ID No: 5, não apenas o mRNA que codifica o CAPRINA-1 de canino da SEQ ID No: 6, mas também o mRNA que codifica o CAPRINA-1 humano da SEQ ID No: 2 ou 4 pode ser medido. Similarmente, um mRNA que codifica o CAPRINA-1 de outro mamífero, como um gato, também pode ser medido. Quando um polinucleotídeo para a detecção de câncer é designado, é desejável selecionar as regiões parciais que têm uma identidade de sequência especificamente alta entre a SEQ ID números (números ímpares SEQ ID Nos: 1 a 29) (de preferência, as sequências de nucleotídeo são as mesmas). Se uma região parcial que tem identidade de sequência particularmente alta entre um cachorro e um humano está presente, espera-se que uma região que tem identidade de sequência muito alta com a região esteja presente em um gene homólogo de outra espécie de animal. Através da seleção de tais regiões parciais, precisão para a medição de mRNA que codifica o CAPRINA-1 de uma espécie de animal que não cachorros e humanos pode ser aumentada.

[063] Um próprio método para a medição de um ácido nucleico de teste com o uso de um polinucleotídeo se hibridizando especificamente a uma região parcial do ácido nucleico de teste como um iniciador ou uma ponta de prova para um método de ampliação do ácido nucleico como PCR é bem conhecido. Os Exemplos de tal método incluem, em adição ao RT-PCR que é especificamente descrito nos Exemplos abaixo, a hibridização Northern blot e In situ. Quando a quantidade de mRNA é medida na presente invenção, todos estes métodos de medição conhecidos podem ser empregados.

[064] Um método de ampliação do ácido nucleico, como PCR, é bem conhecido no estado da técnica e, dessa forma, os kits de reagentes e aparelhos estão comercialmente disponíveis, de forma que o método pode ser facilmente executado. Especificamente, por exemplo, as etapas de desnaturação, enrijecimento e extensão são, cada, executadas com o uso de um ácido nucleico de teste (por exemplo, o cDNA de um gene que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácido mostrada em qualquer um dos números pares das SEQ ID Nos: 2 a 30) como um modelo e um par de polinucleotídeos (iniciadores) para a detecção de câncer em um tampão conhecido na presença de DNA polimerase termoestável como Taq polimerase ou Pfu polimerase e dNTP (aqui, N = A, T, C, ou G) através da variação de temperatura da solução de reação. Em geral, a etapa de desnaturação é executada em 90°C a 95°C, sendo que a etapa de enrijecimento é executada em ou próxima ao Tm do modelo e dos iniciadores (de preferência dentro de ±4°C), e a etapa de extensão é executada a 72°C, que é uma ótima temperatura para DNA polimerase termoestável como Taq polimerase ou Pfu polimerase ou uma temperatura próxima à temperatura ótima. Cada etapa é executada por cerca de 30 segundos a 2 minutos, conforme adequadamente selecionado. Este ciclo de aquecimento é repetido cerca de 25 a 40 vezes, por exemplo, de forma que a região modelo de ácido nucleico flanqueada por um par de iniciadores é ampliada. Um método de ampliação do ácido nucleico não é limitado ao PCR e qualquer outro método de ampliação do ácido nucleico conhecido no estado da técnica pode ser aqui empregado. Conforme descrito acima, quando um método de ampliação do ácido nucleico é executado com o uso de um par de polinucleotídeos para a detecção de câncer, como iniciadores e um ácido nucleico de teste como um modelo, o ácido nucleico de teste é ampliado. Entretanto, se nenhum ácido nucleico de teste está contido em uma amostra, a ampliação não ocorre. Assim, através da detecção de produtos de ampliação, a presença ou a ausência do ácido nucleico de teste em uma amostra pode ser confirmada. Um produto de ampliação pode ser detectado por um método que envolve submeter uma solução de reação após a ampliação a eletroforese e, então, a marcação da banda com brometo de etídio ou similares ou um método que envolve a imobilização de um produto de ampliação após a dita eletroforese em uma fase sólida, como uma membrana de nylon que executa a hibridização com uma ponta de prova marcada que se hibridiza especificamente a um ácido nucleico de teste, lavagem e, então, detecção da marcação. Ainda, em outras palavras, o PCR de detecção em tempo real é executado com o uso de um tingimento fluorescente dissipador e um tingimento fluorescente repórter, e por isso a quantidade de um ácido nucleico de teste em uma espécie pode ser quantitativamente determinada. Já que os kits para PCR de detecção em tempo real estão comercialmente disponíveis, o PCR de detecção em tempo real pode ser facilmente executado. Ademais, a determinação semi-quantitativa de um ácido nucleico de teste também é possível com base em intensidade de banda de eletroforese. Um ácido nucleico de teste pode ser tanto mRNA quanto cDNA que resulta a partir de um mRNA através de transcrição reversa. Quando o mRNA é ampliado como um ácido nucleico de teste, um método NASBA (método 3SR ou método TMA) com o uso do par de iniciadores acima também pode ser empregado. O próprio método NASBA é bem conhecido e os kits para o método também estão comercialmente disponíveis, de forma que o método pode ser facilmente executado com o uso do par de iniciadores acima.

[065] Como uma ponta de prova, uma ponta de prova marcada que é preparada pela marcação de um polinucleotídeo para detecção de câncer com um marcador fluorescente, uma marcação por rádio, uma marcação por biotina ou similares podem ser usadas. Um método para a marcação de um próprio polinucleotídeo é bem conhecido. A presença ou a ausência de um ácido nucleico de teste em uma amostra pode ser examinada através da imobilização de um ácido nucleico de teste ou de um produto de ampliação do mesmo, executando a hibridização com uma ponta de prova marcada, lavando e, então, medindo a ligação por marcação à fase sólida. Alternativamente, um polinucleotídeo para a detecção de câncer é imobilizado, um ácido nucleico de teste é hibridizado ao mesmo e, então, o ácido nucleico de teste que se liga à fase sólida pode ser detectado com o uso de ponta de prova marcada ou similares. Em tal caso, um polinucleotídeo para a detecção de câncer ligado à fase sólida também é chamado de ponta de prova. Um método para a medição de um ácido nucleico de teste com o uso de uma ponta de prova de polinucleotídeo também é conhecido no estado da técnica. O método pode ser executado ao fazer com que, em um tampão, uma ponta de prova de polinucleotídeo entre em contato com um ácido nucleico de teste em Tm ou próximo ao Tm (de preferência, dentro de ±4°C) para a hibridização, lavagem e, então, medição da ponta de prova marcada que PE hibridizada ou o ácido nucleico modelo ligado à ponta de prova de fase sólida. Os Exemplos de tal método incluem métodos bem conhecidos, como Northern blot, hibridização in situ e métodos Southern blot. Na presente invenção, qualquer método bem conhecido é aplicável.

[066] É determinado pelo método de detecção da presente invenção se um animal sujeito tem ou não câncer, com base no nível de expressão de CAPRINA-1 medido, conforme descrito acima. O câncer pode ser detectado apenas pela medição de expressão de CAPRINA-1 em um animal sujeito. Entretanto, é preferível tendo em vista o fortalecimento da previsão de detecção a fim de examinar os níveis de expressão (nível de anticorpo, nível de polipeptídeo ou nível de mRNA) de CAPRINA-1 em um ou uma pluralidade de amostras de sujeitos saudáveis, a fim de obter um valor padrão de sujeitos saudáveis e, então, comparar o valor medido de um animal sujeito com o valor padrão obtido a partir de sujeitos saudáveis. Para fortalecer adicionalmente a precisão de detecção, os níveis de expressão de CAPRINA-1 são examinados para amostras obtidas a partir de diversos pacientes que têm câncer, a fim de obter um valor padrão de paciente com câncer e, então, o valor medido de um animal sujeito pode ser comparado com ambos os valores padrão de sujeitos saudáveis quanto o valor padrão de pacientes com câncer. Os valores padrões conhecidos podem ser determinados pela quantificação de nível de expressão de CAPRINA-1 em cada amostra e, então, pelo cálculo do valor médio do mesmo, por exemplo. Um valor padrão de sujeitos saudáveis e o mesmo de pacientes com câncer pode ser determinado anteriormente através do exame de níveis de expressão de CAPRINA-1 em diversos sujeitos saudáveis e pacientes com câncer. Portanto, quando a comparação com um valor padrão é executada no método da presente invenção, um valor padrão determinado anteriormente pode ser usado.

[067] No método de detecção da presente invenção, o diagnóstico com base em outros antígenos de câncer ou marcadores de câncer pode ser usado em combinação. Consequentemente, a precisão de detecção de câncer pode ser acentuada adicionalmente. Por exemplo, quando um anticorpo existe especificamente em pacientes com câncer, o mesmo é medido pelo método da presente invenção, outro polipeptídeo que é muito expresso em um tecido com câncer pode ser usado em combinação como um antígeno em uma maneira similar a dos polipeptídeos acima. Ainda, o método da presente invenção e diagnóstico com o uso de um marcador de câncer previamente conhecido pode ser executado em combinação.

[068] O câncer pode ser detectado in vivo de acordo com o método de detecção da presente invenção. Particularmente, conforme descrito nos Exemplos abaixo, mesmo um tumor com tamanho pequeno, que é invisível a olho nu, ou um tumor em uma parte profunda in vivo pode ser detectado, de acordo com o método da presente invenção. Dessa forma, o método da presente invenção é útil para a detecção precoce de câncer. Ainda, através da aplicação do método de detecção da presente invenção para um paciente durante o acompanhamento após o tratamento de câncer, o câncer pode ser detectado precocemente se uma recorrência de câncer ocorrer.

[069] Ainda, em um organismo vivo portador de câncer, conforme o número de células de câncer que expressam CAPRINA-1 medido na presente invenção aumenta, as quantidades de proteína e seu mRNA acumulado no organismo vivo aumentam e a quantidade de produção do anticorpo contra CAPRINA-1 em soro aumenta. Enquanto isso, conforme o número de células de câncer diminui, as quantidades de proteína e seu mRNA acumulado in vivo diminui e a quantidade do anticorpo contra CAPRINA-1 no soro diminui. Portanto, quando o nível de expressão de CAPRINA-1 é maior do que o de um controle, pode ser determinado que o aumento de um tumor ou uma metástase de câncer ocorre; isto é, a extensão do câncer é avançada. Na verdade, conforme descrito especificamente nos Exemplos abaixo, um aumento no nível de soro do anticorpo acima em um organismo vivo portador de câncer foi observado em associação com a progressão do câncer (maligno) como aumento do tumor e metástase. Conforme descrito acima, a extensão do câncer também pode ser detectada pelo método da presente invenção.

[070] Ainda, conforme descrito nos Exemplos abaixo, dentre os tumores do mesmo tipo, os níveis de anticorpo acima nos tumores de tipo maligno foram significativamente mais altos do que os presentes em tumores de tipo benignos. Consequentemente, quando o nível de expressão de CAPRINA-1 é alto, pode ser determinado que a malignidade do câncer seja alta. Especificamente, a malignidade do câncer também pode ser detectada pelo método da presente invenção.

[071] O câncer a ser submetido ao método para a detecção de câncer da presente invenção é o câncer que expressa CAPRINA-1. Os Exemplos de tal câncer incluem, mas não se limitam a, tumor no cérebro, carcinoma de célula escamosa da cabeça, melanoma no pescoço, pulmões, útero ou esôfago, adenocarcinoma de pulmão ou útero, câncer renal, tumor misto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula basal, tumor gengival similar a acantoma, tumor da cavidade oral, adenocarcinoma perianal, tumor anal, adenocarcinoma apócrina anal, carcinoma de célula Sertoli, câncer do vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glândula sudorípara, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, câncer de tireóide, câncer de intestino grosso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo compósito, tumor misto de mama maligno, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrossarcoma, hemangiopericitoma, osteossarcoma, chondrosarcoma, sarcoma de tecidos macios, sarcoma histiocítico, mixossarcoma, sarcoma não diferenciado, câncer de pulmão, mastocitoma, leiomioma cutâneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de célula pequena a célula média, tumor adrenomedular, tumor de célula granulosa e feocromocitoma. Ainda, um organismo vivo a ser submetido ao método da presente invenção é de um mamífero e é, de preferência, um humano, um cachorro ou um gato.

[072] Os Exemplos de uma amostra a ser submetida ao método da presente invenção incluem fluidos corpóreos, como sangue, soro, plasma sanguíneo, ascites e efusão pleural, tecidos e células. Em particular, no 1o método e no 2o método acima, o soro, plasma sanguíneo, ascites e efusão pleural podem ser, de preferência, usados e no 3o método acima para a medição de mRNA, tecidos amostras e amostras de célula são preferenciais.

[073] Os polipeptídeos acima a serem usados como antígenos no imunoensaio do 1° método (isto é, a CAPRINA-1 canina da SEQ ID N°: 2 e um homólogo do mesmo, um polipeptídeo parcial especificamente reativo, um polipeptídeo modificado especificamente reativo, e um polipeptídeo de adição especificamente reativo) podem ser fornecidos como reagentes para a detecção de câncer. O reagente pode consistir em apenas o polipeptídeo acima ou pode conter vários aditivos ou similares, por exemplo, úteis para a estabilização do polipeptídeo. Além disso, o reagente pode ser fornecido de uma forma imobilizada sobre uma fase sólida como uma placa ou uma membrana. Exemplos preferenciais do polipeptídeo são conforme descritos acima.

[074] Um anticorpo que é submetido a uma reação antígeno- anticorpo com CAPRINA-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que é usado no imunoensaio da própria CAPRINA-1 no 2° método, também pode ser fornecido como um reagente para a detecção de câncer. O reagente para a detecção de câncer nesse caso também pode consistir em apenas o anticorpo acima ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou pode conter vários aditivos ou similares úteis para a estabilização e similares do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Além disso, o anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode estar sob uma forma que se liga a um metal como manganês ou ferro. Quando esse anticorpo ligado a metal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado ao corpo de um organismo vivo, o anticorpo ligado a metal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é acumulado em um nível aumentado em um sítio em que a proteína de antígeno está presente em um nível mais alto. Portanto, o metal é medido por MRI ou similares, e dessa forma a presença de células cancerígenas produzindo a proteína de antígeno pode ser detectada.

[075] Além disso, o polinucleotídeo acima para a detecção de câncer a ser usado na medição de mRNA no 3° método também pode ser fornecido como um reagente para a detecção de câncer. O reagente para a detecção de câncer, nesse caso, também pode consistir em apenas o polinucleotídeo ou pode conter vários aditivos e similares úteis para a estabilização e similares do polinucleotídeo. O polinucleotídeo para a detecção de câncer contido no reagente é, de preferência, um iniciador ou uma ponta de prova. Condições e exemplos preferenciais do polinucleotídeo para a detecção de câncer são conforme descritos acima.

EXEMPLOS

[076] A presente invenção será descrita em mais detalhe com referência aos exemplos apresentados abaixo; entretanto, o escopo técnico da presente invenção não se limita aos exemplos.

EXEMPLO 1: OBTENÇÃO DE UMA NOVA PROTEÍNA DE ANTÍGENO DE CÂNCER PELO MÉTODO SEREX (1) CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE cDNA

[077] O RNA total foi extraído de um tecido testicular de um cão saudável através de um método ácido guanídio-Fenol-Clorofórmio, e então, um poliA RNA foi purificado com o uso do Kit de purificação Oligotex-dT30 mRNA (Takara Shuzo Co., Ltd.) de acordo com protocolos incluídos no kit.

[078] Uma biblioteca de fago de cDNA testicular de canino foi sintetizada com o uso do então obtido mRNA (5 μg). A biblioteca de fago de cDNA foi construída com o uso de um Kit de síntese de cDNA, um Kit de síntese de ZAP-cDNA, e um Kit de clonagem ZAP-cDNA GigapackIII Gold (STRATAGENE) de acordo com protocolos incluídos nos kits. O tamanho da então construída biblioteca de fago de cDNA era de 7,73x 105 pfu/ml.

(2) TRIAGEM DA BIBLIOTECA DE CDNA COM O USO DE SORO

[079] A Imunotriagem foi executada com o uso da biblioteca de fago de cDNA testicular de canino construída acima. Especificamente, a Escherichia coli hospedeira (XL1-Blue MRF’) foi infectada com o fago em uma placa de agarose NZY (Φ90x15mm) de modo a obter 2.210 clones. As células E. coli foram cultivadas a 42°C durante 3 a 4 horas para formar placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada com IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosideo) a 37°C durante 4 horas, de modo que a proteína foi induzida, expressa, e então transferida à membrana. Subsequentemente, a membrana foi coletada e, então, imersa em TBS (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, e pH 7,5) contendo 0,5% de leite em pó desnatado, seguida por agitação de um dia para o outro a 4°C, suprimindo, desse modo, reação não-específica. O filtro foi reagido com um soro diluído 500 vezes de um paciente canino em temperatura ambiente por 2 a 3 horas.

[080] Conforme o soro acima de um paciente canino, um soro coletado a partir de um paciente canino com câncer de mama foi usado. Esses soros foram armazenados a -80°C e então submetidos ao pré-tratamento imediatamente antes do uso. Um método para o pré-tratamento de soro é conforme segue. De forma específica, o hospedeiro Escherichia coli (XL1-Blue MRF’) foi infectado com um fago À ZAP Express em que nenhum gene estranho foi inserido e então cultivado de um dia para outro em um meio de placa NZY a 37°C. Subsequentemente, o tampão (0,2 M de NaHCO3 e pH 8,3) contendo 0,5 M de NaCl foi adicionado à placa, a placa foi deixada permanecer a 4°C por 15 horas, e, então, um sobrenadante foi coletado como um Escherichia coli/extrato de fago. A seguir, o então Escherichia coli/extrato de fago coletado foi aplicado a uma coluna de NHS (GE Healthcare Bio-Science), para que uma proteína derivada de fago de Escherichia coli fosse imobilizada.O soro de um paciente canino foi aplicado à coluna imobilizada por proteína para reação e, então, Escherichia coli e um anticorpo adsorvido ao fago foram removidos do soro. A fração de soro que passou através da coluna foi diluída 500 vezes com TBS contendo 0,5% de leite em pó desnatado. O resultante foi usado como um material de imunotriagem.

[081] Uma membrana sobre a qual o soro tratado e a proteína de fusão acima foram transferidos foi lavada 4 vezes com TBS-T (0,05% de Tween20/TBS) e então, induzida a reagir com IgG de cabra anti-canina (HRP conjugado de IgG-h+I de Cabra anti-Cão (BETHYL Laboratories)) diluído 5.000 vezes com TBS contendo 0,5% de leite em pó desnatado como um anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente. A detecção foi desempenhada via uma reação corante por enzima usando uma solução de reação NBT/BCIP (Roche). Colônias que foram compatíveis com sítios positivos para uma reação corante foram coletadas a partir da placa de agarose NZY (Φ90 x 15 mm) e então suspensas em 500 μl de um tampão SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01% de gelatina, e pH 7,5). Até que as colônias positivas para a reação corante fossem unificadas, a triagem secundária e a triagem secundária foram repetidas por meio de um método similar ao acima, para que 30.940 clones de fago reagissem com IgG de soro fossem submetidos à triagem. Desse modo, 5 clones positivos foram isolados.

(3) PESQUISA DE HOMOLOGIA PARA GENE DE ANTÍGENO ISOLADO

[082] Para a análise de sequência de nucleotídeo dos 5 clones positivos isolados por meio do método acima, um procedimento para a conversão a partir de vetores de fago para vetores de plasmídeo foi desempenhado. De forma específica, 200 μl de uma solução foram preparados para conter o hospedeiro Escherichia coli (XL1-Blue MRF’) para que a absorbância OD600 fosse de 1,0. A solução foi misturada com 250 μl de uma solução de fago purificada e, então, com 1 μl de um fago ajudador ExAssist (STRATAGENE), seguido por 15 minutos de reação a 37°C. Três milímetros de meio LB foram adicionados e, então, a cultura foi desempenhada a 37°C por 2,5 a 3 horas. Imediatamente, após a cultura, a temperatura da solução foi mantida a 70°C por meio de banho de água por 20 minutos, a centrifugação foi desempenhada a 4°C e 1.000 x g por 15 minutos, e, então, o sobrenadante foi coletado como uma solução de fagomídeo. Subsequentemente, 200 μl de uma solução foram preparados para conter hospedeiro de fagomídeo Escherichia coli (SOLR) para que a absorbância OD600 fosse de 1,0. A solução foi misturada com 10 μl de uma solução de fago purificada, seguida por 15 minutos de reação a 37°C. A solução (50 μl) foi produzida em meio de Agar LB contendo ampicilina (para uma concentração final de 50 μg/ml) e então cultivada de um dia para outro a 37°C. Colônias únicas de SOLR transformadas foram coletadas e então cultivadas em meio LB contendo ampicilina (concentração final: 50 μg/ml) a 37°C. Um DNA de plasmídeo contendo um inserto de interesse foi purificado usando um Kit de Minipreparação de plasmídeo QIAGEN (QIAGEN).

[083] O plasmídeo purificado foi submetido à análise da sequência de comprimento completo por meio de um método de primer walking usando o iniciador T3 de acordo com a SEQ ID N°: 31 e o iniciador T7 de acordo com a SEQ ID N°: 32. Como resultado da análise de sequência, as sequências de gene de acordo com as SEQ ID N°: 5, 7, 9, 11, e 13 foram obtidas. Um programa de pesquisa de homologia, pesquisa BLAST (http://www.ncbi.Nlm. Nih.gov/BLAST/), foi desempenhado usando as sequências de nucleotídeo das sequências de genes e aminoácidos (SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, e 14) das proteínas codificadas pelos genes. Como resultado dessa pesquisa de homologia com genes conhecidos, foi revelado que todos os 5 genes obtidos codificaram CAPRINA-1. Com relação às regiões a serem traduzidas para proteínas, a identidade de sequência entre os 5 genes foi de 100% em termos de sequência de nucleotídeo e 99% em termos de sequência de aminoácido. Além disso, com relação às regiões a serem traduzidas para proteínas, a identidade de sequência entre os genes e genes que codificam homólogo humano do mesmo foi de 94% em termos de sequência de nucleotídeo e 98% em termos de sequência de aminoácido. As sequências de nucleotídeo do homólogo humano são mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 3 e a sequência de aminoácidos do mesmo são mostradas nas SEQ ID N°: 2 e 4. Além disso, com relação às regiões a serem traduzidas para proteínas, a identidade de sequência entre os genes caninos obtidos e um gene que codifica um homólogo bovino foi de 94% em termos de sequência de nucleotídeo e 97% em termos de sequência de aminoácido. A sequência de nucleotídeo do homólogo bovino é mostrada na SEQ ID N°: 15 e a sequência de aminoácido do mesmo é mostrada na SEQ ID N°: 16. Com relação às regiões a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes que codificam o homólogo humano e o gene que codifica o homólogo do gado foi de 94% em termos de sequência de nucleotídeos, variando entre 93% a 97% em termos de sequência de aminoácidos. Além disso, em relação às regiões a serem traduzidas para em proteínas, a identidade de sequência entre os genes caninos obtidos e um gene que codifica um homólogo equino foi de 93% em termos de sequência de nucleotídeos e 97% em termos de sequência de aminoácidos. A sequência de nucleotídeos do homólogo equino é mostrada na SEQ ID n°: 17 e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID n°: 18. Com relação às regiões a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes que codificam o homólogo humano e o gene que codifica o homólogo equino foi de 93% em termos de sequência de nucleotídeos e 96% em termos de sequência de aminoácidos. Além disso, com relação as regiões a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes caninos obtidos e os genes que codificam os genes de camundongo variou entre 87% para 89% em termos de sequência de nucleotídeos, variando entre 95% a 97% em termos de sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeos do homólogo do camundongo são apresentadas na SEQ ID n°: 19, 21, 23, 25 e 27 e as sequências de aminoácidos do mesmo são mostradas na SEQ ID n°: 20, 22, 24, 26 e 28. Em relação às regiões a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes que codificam o homólogo humano e os genes que codificam o homólogo do camundongo variou entre 89% para 91% em termos de sequência de nucleotídeos, variando entre 95% a 96% em termos de sequência de aminoácidos. Além disso, em relação as regiões a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes caninos obtidos e um gene que codifica um homólogo de galinha foi de 82% em termos de sequência de nucleotídeos e 87% em termos de sequência de aminoácidos. A sequência de nucleotídeos do homólogo de galinha é mostrado na SEQ ID n°: 29 e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID n°: 30. Em relação as a serem traduzidas em proteínas, a identidade de sequência entre os genes que codificam o homólogo humano e o gene que codifica o homólogo de galinha variou entre 81% para 82% em termos de sequência de nucleotídeos e entre 86% em termos de sequência de aminoácidos.

(4) ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA EM CADA TECIDO

[084] A expressão dos genes obtidos pelo método acima em tecidos normais caninos e humanos e as várias linhas celulares foi examinada por um método de RT-PCR (transcrição reversa- PCR). A reação da transcrição reversa foi realizada da seguinte forma. Especificamente, o RNA total foi extraído de cada tecido (50 μg a 100 μg) e cada linha celular (5 a 10 x 10 6 células) usando um reagente Trizol (Invitrogen Corporation), de acordo com os protocolos incluídos neste cumprimento. O cDNA foi sintetizado utilizando o RNA total e Sistema de Síntese de Primeiro- Filamento de Sobrescrito para RT-PCR (Invitrogen Corporation), de acordo com protocolos incluídos neste cumprimento. A PCR foi realizada da seguinte forma utilizando primeiros iniciadores específicos para os genes obtidos (de acordo com a SEQ ID n°: 33 e 34). Especificamente, a PCR foi realizada através da preparação de uma solução de reação ajustada para uma quantidade total de 25 μl através da adição de cada reagente e um incluiu um tampão (0,25 μl de amostra preparada pela reação de transcrição reversa, os iniciadores acima (2 mm cada) dNTP ( 0,2 mm cada), e 0,65 U de polimerase ExTaq (Takara-baio Co., Ltd.)) e, em seguida, pela reação da solução através da repetição de 30 vezes um ciclo de 94 ° C/30 segundo, 60 ° C/30 segundo, e 72 ° C/30 segundo utilizando um Termociclador (BIO RAD). Os iniciadores específicos de gene mencionados acima foram utilizados para ampliar a região entre o nucleotídeo 206 e o nucleotídeo 632 na sequência de nucleotídeos SEQ ID n°: 5 (gene CAPRINA- 1 canina) e na região entre o nucleotídeo 698 e o nucleotídeo 1124 na sequência de nucleotídeos SEQ ID n°: 1 (gene CAPRINA-1 humana). Para o controle, os iniciadores GAPDH específicos (de acordo com a SEQ ID n°: 35 e 36) foram usados ao mesmo tempo. Como resultado, como mostrado na Figura. 1, foi observada uma forte expressão no testículo no caso dos tecidos de cães sadios, enquanto que a expressão foi observada no câncer de mama em cães e tecidos de adenocarcinoma. Além disso, a expressão do homólogo humano dos genes obtidos também foi confirmada. Como resultado, à semelhança dos genes CAPRINA- 1 canina, a expressão poderia ser confirmada apenas no testículo no caso dos tecidos normais. No entanto, no caso de células cancerígenas, a expressão foi detectada em muitos tipos de linhas de células cancerígenas, como linhas celulares de câncer de mama, tumor cerebral, leucemia, câncer de pulmão e câncer esofágico. A expressão foi confirmada em um número particularmente grande de linhas celulares de câncer de mama. Com base nos resultados, foi confirmado que a expressão CAPRINA-1 não foi observada em tecidos normais, com exceção dos testículos, enquanto que a CAPRINA- 1 foi expressa em muitas células cancerígenas e, em especial nas linhas celulares de câncer de mama.

[085] Além disso, na Figura 1, referência n ° 1 ao longo do eixo longitudinal indica o padrão de expressão de cada um dos genes identificados acima, e a referência n. ° 2 ao longo do mesmo indica o padrão de expressão do gene GAPDH para controle.

(5) A MANCHA IMUNO-HISTOQUÍMICA (5) -1 A EXPRESSÃO CAPRINA- 1 EM CAMUNDONGOS NORMAIS E TECIDOS CANINOS

[086] Os camundongos (Balb / c, fêmea) e cães (cães da raça beagle, fêmea) foram dessangrados sob anestesia com éter e anestesia com isoflurano/ cetamina. Após laparotomia, os órgãos (estômago, fígado, globo ocular, glândula timo, músculo, medula óssea, útero, intestino, esôfago, coração, rins, glândulas salivares, intestino grosso, glândula mamária, cérebro, ovário, pulmão, pele, glândula adrenal, pâncreas, baço e bexiga) foram transferidos para cada prato de 10 centímetros contendo PBS. Cada órgão foi aberto em PBS e, em seguida, fixados por perfusão durante a noite com um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) contendo paraformaldeído a 4% (PFA). O perfusato foi descartado, a superfície do tecido de cada órgão foi lavada com PBS e, em seguida, uma solução de PBS contendo sacarose 10% foi adicionada a um tubo de centrífuga de 50ml. Cada tecido foi então colocado em cada tubo e em seguida agitado com um rotor de 4 ° C por 2 horas. Cada solução foi substituída por uma solução de PBS contendo sacarose 20% e, em seguida, deixada em repouso a 4 ° C até que os tecidos precipitassem. Cada solução foi substituída por uma solução de PBS contendo sacarose 30% e, em seguida, deixado em repouso a 4 ° C até que os tecidos precipitassem. Cada tecido foi removido e uma parte necessária foi retirada com um bisturi cirúrgico. Em seguida, um composto de PTU (Tissue Tek) foi aplicado e espalhado sobre a superfície de cada tecido e, em seguida os tecidos foram colocados em crio molde. O crio molde foi colocado em gelo seco para um congelamento rápido. Os tecidos foram cortados em pedaços de 10a 20 mm de comprimento utilizando um criostato (Leica) e, em seguida, os pedaços de tecido cortados foram secados ao ar nas lâminas de vidro por 30 minutos, utilizando um secador de cabelo, de modo que se preparassem as lâminas de vidro em que os pedaços de tecidos cortados foram aplicados. Em seguida, cada lâmina de vidro foi colocada em um frasco de coloração com PBS-T (salina contendo Tween20 a 0,05%), de modo que um processo envolvendo troca com PBS-T a cada 5 minutos foi realizado três vezes. O excesso de água em torno de cada amostra foi removido utilizando Kimwipes e, em seguida, cada seção foi cercada usando DAKOPEN (DAKO). Como soluções de bloqueio, o reagente de bloqueio Ig de camundongo MOM (Vectastain) foi aplicado no tecido do camundongo e a solução de PBS-T contendo soro bovino fetal a 10% foi aplicado no tecido canino. Os resultantes foram deixados em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, uma solução preparada com a solução de bloqueio para um d anticorpo monoclonal (anticorpo monoclonal # 8) anti CAPRINA- 1 a 10 μg / μl, com a região variável da cadeia pesada da SEQ ID n°: 55 e de região variável da cadeia leve de SEQ ID n° : 56, que reage com as superfícies preparadas de células cancerosas no Exemplo 3, foi aplicada em cada lâmina de vidro e depois foi colocada em repouso dentro de uma câmara úmida a 4 ° C durante a noite. Depois de lavar três vezes por 10 minutos com PBS-T, o anticorpo anti-IgG marcado com biotina MOM (Vectastain) diluído 250 vezes com a solução de bloqueio foi aplicado em cada lâmina de vidro e foi colocado em repouso dentro de uma câmara úmida, em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de lavar três vezes por 10 minutos com PBS-T, um reagente avidina-biotina ABC (Vectastain) foi aplicado e, em seguida, foi colocado em repouso dentro de uma câmara úmida à temperatura ambiente por 5 minutos. Depois de lavar três vezes por 10 minutos com PBS-T, uma solução de coloração DAB (DAB 10 μg + 30% H2O2 10 μl/0,05 M Tris-HCl (pH 7,6) 50 μl) foi aplicada e, em seguida, as lâminas de vidro foram deixadas em repouso dentro de uma câmara úmida à temperatura ambiente por 30 minutos. As lâminas de vidro foram lavadas com água destilada e, em seguida, um reagente hematoxilina (DAKO) foi aplicado. Depois de serem deixadas à temperatura ambiente por 1 minuto, as lâminas de vidro foram lavadas com água destilada. As lâminas foram imersas em soluções de etanol a 70%, 80%, 90%, 95% e 100% nesta ordem por 1 minuto cada e depois deixadas em repouso em xilol durante a noite. As lâminas de vidro foram removidas, as lamínulas com Glycergel Mounting Medium (DAKO), e em seguida, observou-se. Como resultado, a expressão CAPRINA- 1 foi observada para um grau leve no interior das células em todas as glândulas salivares, tecidos do rim, cólon e estômago, mas a expressão de CAPRINA- 1 nunca foi observada na superfície das células. Além disso, absolutamente nenhuma expressão CAPRINA- 1 foi observada em tecidos de outros órgãos.

(5) -2 EXPRESSÃO DE CAPRINA- 1 EM TECIDOS DE CÃES COM CÂNCER DE MAMA

[087] Com o uso de 108 amostras de tecido de câncer de mama caninos congeladas de cachorros diagnosticados por diagnostico patológico como tendo câncer de mama maligno, lâminas de seções congeladas foram preparadas por um método similar ao citado acima e marcação imunohistoquímica foi realizada como uso do anticorpo monoclonal #8 preparado no Exemplo 3. Como consequência, a expressão de CAPRINA-1 foi confirmada em 100 das 108 amostras (92,5%). CAPRINA-1 foi particularmente fortemente expressa nas superfícies de células de câncer altamente atípicas.

(5)-3 EXPRESSÃO DE CAPRINA-1 EM TECIDO DE CÂNCER DE MAMA HUMANO

[088] A marcação imunohistoquímica foi realizada como uso de 188 amostras de tecido de câncer de mama de uma disposição de tecido de câncer de mama humano embutido em parafina (BIOMAX). Após 3 horas de tratamento a 60°C, a disposição de tecido de câncer de mama humano foi imersa em uma garrafa de marcação preenchida com xileno e então a substituição de xileno a cada 5 minutos foi realizada 3 vezes. A seguir, um procedimento similar foi executado com o uso de etanol e PBS-T em vez de xileno. A disposição de tecido de câncer de mama humano foi imersa em uma garrafa de marcação preenchida com 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) que continha 0,05% de Tween20, tratada por 5 minutos a 125°C, e, então, deixada para descansar à temperatura ambiente por 40 minutos ou mais. O excesso de água em volta de cada amostra foi removido da disposição com o uso de Kimwipes, sendo que cada seção foi circundada com o uso de DAKOPEN (DAKO), e, então, uma quantidade apropriada de Peroxidase Block (DAKO) foi adicionada por gotejamento na disposição. Deixou-se a disposição descansar à temperatura ambiente por 5 minutos e, então, imersa em uma garrafa de marcação preenchida com PBS-T. a substituição de PBS-T a cada 5 minutos foi realizada 3 vezes. Como uma solução de bloqueio, uma solução de PBS-T contendo 10% de FBS foi aplicada na disposição e, então, a deixou-se a disposição descansar em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 1 hora. A seguir, o anticorpo monoclonal #8 preparado no Exemplo 3 ajustado para 10 μg/ml com o uso de uma solução de PBS-T contendo 5% de FBS foi aplicado e, então, deixou-se a disposição descansar por uma noite em uma câmara de umidade a 4°C. Após 3 ocorrências de 10 minutos de lavagem com PBS-T, uma quantidade apropriada de Conjugado de polímero marcado por peroxidase (DAKO) foi adicionada por gotejamento na disposição, e, então, deixou-se a disposição descansar à temperatura ambiente por 30 minutos em uma câmara de umidade. Após 3 ocorrências de 10 minutos de lavagem com PBS-T, uma solução de marcação DAB (DAKO) foi aplicada na disposição e, então, deixou-se que a disposição descansasse à temperatura ambiente por 10 minutos. A solução de marcação DAB foi descartada da disposição e, então, 10 minutos de lavagem foram executados com PBS-T por 3 vezes. A disposição foi lavada com água destilada e, então, imersa em 70%, 80%, 90%, 95%, e 100% de soluções etanol em ordem por 1 minuto cada e, então, deixou-se descansar em xileno pela noite. A disposição foi removida, colocada em vidro com Meio de Montagem Glycergel (DAKO), e, então, observada. Como consequência, a expressão forte de CAPRINA-1 foi observada em 138 (73%) do total de 188 amostras de tecido de câncer de mama.

(5)-4 EXPRESSÃO DE CAPRINA-1 EM TUMOR CEREBRAL MALIGNO HUMANO

[089] Com o uso de 247 amostras de tecido de tumor cerebral maligno de disposições de tecido de tumor cerebral maligno humano embutido em parafina (BIOMAX), a marcação imunohistoquímica foi realizada por um método similar àquele em (5)-3 acima com o uso do anticorpo monoclonal #8 preparado no Exemplo 3. Como consequência, a expressão forte de CAPRINA- 1 foi observada em 227 (92%) do total de 247 de amostras de tecido de tumor cerebral maligno.

(5)-5 EXPRESSÃO DE CAPRINA-1 EM NÓDULO LINFÁTICO METASTÁTICO DE CÂNCER DE MAMA

[090] Com o uso de 150 amostras de tecido de nódulos linfáticos metastáticos de câncer de mama humano de disposições de tecido de nódulo linfático metastático de câncer de mama humano embutidas em parafina (BIOMAX), a marcação imunohistoquímica foi realizada por um método similar àquele em (5)-3 acima com uso do anticorpo monoclonal #8 preparado no Exemplo 3. Como um resultado, a expressão forte de CAPRINA-1 foi observada em 136 (90%) do total de 150 amostras de tecido de nódulos linfáticos metastáticos de câncer de mama humano. Especificamente, foi revelado que CAPRINA-1 também é fortemente expressa em um tecido de câncer que sofreu metástase a partir de câncer de mama.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE NOVAS PROTEÍNAS DE ANTÍGENO DE CÂNCER HUMANAS E CANINAS (1) PREPARAÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

[091] Uma proteína recombinante foi preparada pelo seguinte método baseado no gene de SEQ ID NO: 5 obtido no Exemplo 1. A PCR foi executada ao preparar uma solução de reação ajustada para uma quantidade total de 50 μl através da adição de cada reagente e um tampão incluído (1 μl de um vetor preparado a partir da solução de fagomídeo obtida no Exemplo 1 e, então, submetido à análise de sequência, 2 tipos de iniciador (0,4 μM de cada; de acordo com SEQ ID NOS: 37 e 38) contendo as sequências de clivagem de enzima de restrição Nde I e Kpn I, 0,2 mM de dNTP, 1,25 U de polimerase PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)) e, então, ao reagir a solução através da repetição de 30 vezes de um ciclo de 98°C/10 segundos e 68°C/1,5 minutos com o uso de um Ciclador térmico (BIO RAD). os 2 tipos acima de iniciador foram usados para amplificar a região que encodifica o comprimento total da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (P47). Após a PCR, o DNA então amplificado foi submetido a 1% de eletroforese de gel de agarose e, então, um fragmento de DNA de cerca de 1,4 kbp foi purificado a partir do gel com o uso de um Kit de Extração de Gel QIAquick (QIAGEN).

[092] O fragmento de DNA purificado foi ligado a um vetor de clonagem pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). O vetor foi transformado em Escherichia coli e, então, o plasmídeo foi coletado. Foi confirmado com base na sequência, que o fragmento de gene amplificado era compatível com a sequência alvo. O plasmídeo que era compatível com a sequência de interesse foi tratado com as enzimas de restrição Nde I e Kpn I e, então, o resultado foi purificado com o uso de um Kit de Extração de Gel QIAquick. Então, a sequência de gene de interesse foi inserida em um vetor de expressão pET30b (Novagen) para Escherichia coli tratada com as enzimas de restrição Nde I e Kpn I. Uma proteína recombinante fundida com etiqueta His pode ser produzida com o uso do vetor. O plasmídeo foi transformado em Escherichia coli BL21 (DE3) para a expressão e, então, a indução de expressão foi realizada com o uso de 1 mM de IPTG, de modo que a proteína alvo foi expressa em Escherichia coli.

[093] Além disso, a proteína recombinante de um gene homólogo canino foi preparada através do seguinte método com base no gene de SEQ ID NO: 7. A PCR foi realizada ao se preparar uma solução de reação ajustada para uma quantidade total de 50 μl através da adição de cada reagente e um tampão incluído (1 μl de cDNA dentre cDNAs de vários tecidos e/ou células construídas no Exemplo 1, para as quais a expressão poderia ser confirmada por um método RT-PCR, 2 tipos de iniciador (0,4 μM de cada; de acordo com as SEQ ID NOS: 39 e 40) contendo as sequências de clivagem das enzimas de restrição Nde I e Kpn I, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de polimerase PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)) e, então, ao reagir a solução ao repetir 30 vezes um ciclo de 98°C/10 segundos e 68°C/2,5 minutos com o uso de um Ciclador Térmico (BIO RAD). os 2 tipos acima de iniciadores foram usados para amplificar a região que codifica a sequência de aminoácido de comprimento total de SEQ ID NO: 8. Após a PCR, o DNA então amplificado foi fracionado com 1% de eletroforese de gel de agarose e, então, um fragmento de DNA de cerca de 2,2 kbp foi purificado com o uso de um Kit de Extração de Gel QIAquick (QIAGEN).

[094] O fragmento de DNA purificado foi ligado ao vetor de clonagem pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). O vetor foi transformado em Escherichia coli, e, então, o plasmídeo foi coletado. Confirmou-se, então, com base na sequência que o fragmento de gene amplificado era compatível com a sequência de interesse. O plasmídeo que era compatível com a sequência de interesse foi tratado com as enzimas de restrição Nde I e Kpn I e, então, o resultado foi purificado com o uso de um Kit de Extração de Gel QIAquick. Então, a sequência de gene de interesse foi inserida em um vetor de expressão pET30b (Novagen) para Escherichia coli tratada com as enzimas de restrição Nde I e Kpn I. Uma proteína recombinante fundida por etiqueta His pode ser produzida com o uso do vetor. O plasmídeo foi transformado em Escherichia coli BL21 (DE3) para expressão e, então, a indução de expressão foi realizada com o uso de 1 mM de IPTG, de modo que a proteína de interesse foi expressa em Escherichia coli.

[095] Além disso, a proteína recombinante de um gene homólogo humano foi preparada pelo seguinte método no gene de SEQ ID NO: 1. A PCR foi realizada ao preparar uma solução de reação ajustada para uma quantidade total de 50 μl através da adição de cada reagente e um tampão incluído (cDNA (1 μl) dentre cDNAs de vários tecidos e/ou células construídas no Exemplo 1, para a qual a expressão poderia ser confirmada por um método RT-PCR, 2 tipos de iniciadores (0,4 μM de cada; de acordo com as SEQ ID NOS: 41 e 42) contendo as sequências de clivagem das enzimas de restrição Sac I e Xho I, 0,2 mM de dNTP, 1,25 U PrimeSTAR HS de polimerase (Takara- baio Co., Ltd.)) e, então, ao reagir a solução através da repetição de 30 vezes de um ciclo de 98°C/10 segundos e 68°C/2,5 minutos com o uso de um Ciclador Térmico (BIO RAD). Os 2 tipos acima de iniciadores foram usados para amplificar a região que codifica a sequência de aminoácido de comprimento total de SEQ ID NO: 2. Após a PCR, o DNA então amplificado foi submetido a 1% de eletroforese de gel de agarose e, então, um fragmento de DNA de cerca de 2,1 kbp foi purificado com o uso de um Kit de Extração de Gel QIAquick (QIAGEN).

[096] O fragmento de DNA purificado foi ligado a um vetor de clonagem pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). O vetor foi transformado em Escherichia coli, e, então, o plasmídeo foi coletado. Foi, então, confirmado com base na sequência que o fragmento de gene amplificado era compatível com a sequência de interesse. O plasmídeo que era compatível com a sequência de interesse foi tratado com as enzimas de restrição Sac I e Xho I e, então, o resultado foi purificado como uso de um Kit de Extração de gel QIAquick. Então a sequência de gene de interesse foi inserida em um vetor de expressão pET30a (Novagen) para Escherichia coli tratado com as enzimas de restrição Sac I e Xho I. uma proteína recombinante fundida por etiqueta His pode ser produzida com o uso do vetor. O plasmídeo foi transformado em Escherichia coli BL21 (DE3) para a expressão e, então, a indução de expressão foi realizada com o uso de 1 mM de IPTG, de modo que a proteína de interesse fosse expressa em Escherichia coli.

(2) PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

[097] A Escherichia coli recombinante obtida acima que expressa a SEQ ID NO: 1, 5, ou 7 foi cultivada a 37°C em meio LB contendo 30 μg/ml de kanamicina até a absorbância a 600 nm alcançada em cerca de 0,7. Então isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosida foi adicionado a uma concentração final de 1 mM, seguido por 4 horas de cultura a 37°C. Subsequentemente, as células foram coletadas por 10 minutos de centrifugação a 4800 rpm. A esfera celular foi suspensa em salina tamponada com fosfato e, então, centrifugada a 4800 rpm por 10 minutos para lavagem de células.

[098] As células foram suspensas em salina tamponada com fosfato e, então, submetidas à ultrasonicação em gelo. A solução de Escherichia coli então ultrasonicada foi centrifugada a 6000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante então obtido foi usado como uma fração solúvel e o precipitado então obtido foi usado como uma fração insolúvel.

[099] A fração solúvel foi adicionada a uma coluna de quelato de níquel (carreador: Chelating Sepharose (Marca Registrada) Fast Flow (GE Healthcare), capacidade de coluna: 5 mL, 50 mM de tampão de ácido clorídrico (pH 8,0) como tampão equilibrado)) preparada de acordo com um método convencional. A fração não aglutinada foi lavada com 50 mM de tampão de ácido clorídrico (pH 8,0) em uma quantidade 10 vezes a capacidade da coluna e 20 mM de tampão de fosfato (pH8,0) contendo 20 mM de imidazol. Imediatamente após a lavagem, 6 leitos foram eluídos com 20 mM de tampão de fosfato (pH8,0) contendo 100 mM de imidazol. Após a eluição da proteína de interesse ser confirmada por marcação Coomassie, uma fração de eluição de 20 mM de tampão de fosfato (pH8,0) contendo 100 mM de imidazol foi adicionada a uma coluna de troca de ânion forte (carreador: Q Sepharose (Marca Registrada) Fast Flow (GE Healthcare), capacidade de coluna: 5 mL, e 20 mM de tampão de fosfato (pH8,0) como tampão equilibrado). A fração não aglutinada foi lavada com 20 mM de tampão de fosfato (pH7,0) em uma quantidade 10 vezes a capacidade da coluna e 20 mM de tampão de fosfato (pH7,0) contendo 200 mM de cloreto de sódio. Imediatamente após a lavagem, 5 leitos foram eluídos com o uso de 20 mM de tampão de fosfato (pH7,0) contendo 400 mM de cloreto de sódio. Portanto, frações purificadas de proteínas, cada uma tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2, 6, ou 8, foram obtidas. Estas frações purificadas foram, então, usadas como materiais para um teste de administração. A Figura 2 mostra o resultado da proteína de SEQ ID NO: 2 fracionada por eletroforese e detectada por marcação Coomassie.

[0100] 200 μl de cada preparação purificada obtida pelo método acima foram dispensados em 1 ml de tampão de reação (20 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2 pH7,4) e então 2 μl de enteroquinase (Novagen) foram adicionados. Deixou-se que a preparação descansasse à temperatura ambiente pela noite em reação, a etiqueta His foi clivada, e, então, a purificação foi realizada de acordo com protocolos incluídos com o uso de um Kit de Captura de Clivagem de Enteroquinase (Novagen). A seguir, 1,2 ml de cada preparação purificada obtida pelo método acima foi substituído por tampão de fosfato fisiológico (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) com o uso de ultrafiltração NANOSEP 10K OMEGA (PALL). A filtração esterilizada foi realizada com o uso de 0,22 μm de HT Tuffryn Acrodisc (PALL) e, então, os resultados foram usados para os seguintes experimentos.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE ANTICORPO CONTRA CAPRINA-1 (1) PREPARAÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL CONTRA PEPTÍDEO DERIVADO DE CAPRINA-1

[0101] Para obter um anticorpo aglutinando a CAPRINA-1, peptídeo derivado de CAPRINA-1 (Arg-Asn-Leu-Glu-Lis-Lis-Lis-Gli-Lis-Leu- Asp-Asp-Tir-Gln (SEQ ID NO: 43)) foi sintetizado. Um miligrama do peptídeo como um antígeno foi misturado a uma solução de adjuvante de Freund incompleta (IFA) em uma quantidade equivalente ao peptídeo. A mistura foi subcutaneamente administrada a um coelho 4 vezes a cada 2 semanas. Subsequentemente, sangue foi coletado, de modo que um antisoro que continha um anticorpo policlonal fosse obtido. Além disso, o antisoro foi purificado com o uso de um carreador de proteína G (GE Healthcare BioSciences) e, então, um anticorpo policlonal contra o peptídeo derivado de CAPRINA-1 foi obtido. A seguir, a reatividade do anticorpo policlonal obtido à superfície de célula de câncer de mama foi examinada. Especificamente, 106 células da linhagem de célula de câncer de mama MDA-MB-231V foram submetidas à centrifugação em um tubo microcentrífugo de 1,5 ml. Uma solução de PBS suplementada com 0,1% de soro fetal de bezerro (FBS) contendo o anticorpo policlonal foi adicionada ao tubo. Deixou-se que a solução descansasse em gelo por 1 hora. Após a lavagem com PBS, um anticorpo IgG anti-camundongo de cabra etiquetado FITC (Invitrogen Corporation) diluído 500 vezes com PBS contendo 0,1% de FBS foi adicionado à solução, e, então, deixou-se que a solução descansasse em gelo por 1 hora. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida com o uso de um FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Enquanto isso, um procedimento similar ao acima foi executado de modo que um controle fosse preparado pela adição de PBS contendo 0,1% de FBS em vez de anticorpo policlonal. Como um resultado, revelou-se que a intensidade de fluorescência era mais forte em células tratadas com o anticorpo policlonal do que em células de controle. Portanto, foi demonstrado que o anticorpo policlonal obtido se aglutina à superfície de célula de câncer de mama.

(2) PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL CONTRA A PROTEÍNA CAPRINA-1

[0102] A proteína de antígeno (CAPRINA-1 humano) (100 μg) mostrada na SEQ ID NO: 2 preparada no Exemplo 2 foi misturada com um adjuvante MPL+TDM (Sigma) em uma quantidade equivalente àquela da proteína de antígeno. A mistura foi usada como uma solução de antígeno por camundongo. A solução de antígeno foi administrada intraperitonealmente a um camundongo Balb/c de 6 semanas de idade (Japan SLC Inc.) e, então, administrada ainda 3 vezes toda semana. O baço foi removido no dia 3 após a imunização final e, então, preso entre duas lâminas de vidro esterilizadas. O resultado foi lavado com PBS (-) (Nissui) e, então, centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos, de modo que um procedimento para remover sobrenadantes fosse repetido 3 vezes. portanto, as células de baço foram obtidas. As células de baço então obtidas foram misturadas com células de mieloma de camundongo SP2/0 (adquirido a partir ATCC) a uma razão de 10:1. A solução PEG preparada pela mistura de 200 μl de meio RPMI1640 contendo 10% de FBS aquecido a 37°C e 800 μl de PEG1500 (Boehringer) foi adicionada às células. Deixou-se que a solução descansasse por 5 minutos para fusão de célula. A centrifugação foi realizada a 1700 rpm por 5 minutos para remover sobrenadantes. As células foram suspensas em 150 ml de meio RPMI1640 (meio seletivo HAT) contendo 15% de FBS, ao qual 2% de solução HAT equivalente (Gibco) foi adicionado e então cultivado em quinze placas de 96 cavidades (Nunc) a 100 μl por cavidade. As células foram cultivadas por 7 dias sob condições de 37°C e 5% de CO2, de modo que hibridomas resultantes da fusão de células de baço a células de mieloma foram obtidos.

[0103] Os hibridomas foram selecionados usando como um índice a afinidade de aglutinação do anticorpo produzido pelos hibridomas preparados, então, para a proteína CAPRINA-1. A solução de proteína CAPRINA-1 (1 μg/ml) preparada no Exemplo 2 foi adicionada a 100 μl por cavidade de placas de 96 cavidades e, então, deixou-se que descansassem a 4°C por 18 horas. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS-T, e então 0,5% de solução de albumina de soro bovino (BSA) (Sigma) foi adicionada a 400 μl por cavidade, e, então, deixou-se que as placas descansassem à temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi removida e, então, cada cavidade foi lavada 3 vezes com 400 μl de PBS-T. Cada sobrenadante de cultura dos hibridomas obtidos acima foi adicionado a 100 μl por cavidade e, então, deixou- se que descansasse à temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS-T, um anticorpo IgG (H+L) anti-camundongo etiquetado HRP (Invitrogen Corporation) diluído 5000 vezes com PBS foi adicionado a 100 μl por cavidade e, então, deixou-se que descansasse à temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com solução de substrato PBS-T A TMB (Thermo) foi adicionado a 100 μl por cavidade e, então, deixou-se descansar por 15 a 30 minutos, de modo que uma reação de cor fosse realizada. Após o desenvolvimento de cor, 1N de ácido sulfúrico foi adicionado a 100 μl por cavidade para parar a ração. A absorbância foi medida a 450 nm e 595 nm com o uso de um espectrômetro de absorção. Como resultado, uma pluralidade de hibridomas produzindo anticorpos com absorbâncias altas foi selecionada.

[0104] Os hibridomas então selecionados foram adicionados a 0,5 hibridomas por cavidade de placas de 96 cavidades e, então, cultivados. Após 1 semana, os hibridomas que formam colônias únicas em cavidades foram observados. As células nessas cavidades foram adicionalmente cultivadas. Os hibridomas foram selecionados com o uso de um índice da afinidade de aglutinação do anticorpo produzido pelos hibridomas clonados para a proteína CAPRINA-1. A solução de proteína CAPRINA-1 (1 μg/ml) preparada do Exemplo 2 foi adicionada a 100 μl por cavidade de placas de 96 cavidades e, então, deixou-se de descansasse a 4°C por 18 horas. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS-T. Uma solução de 0,5% BSA foi adicionada a 400 μl por cavidade e, então, deixado permanecer à temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi removida e, então, cada cavidade foi lavada 3 vezes com 400 μl de PBS-T. Cada sobrenadante de cultura de hibridomas obtido acima foi adicionado em 100 μl por cavidade e, então, deixado permanecer à temperatura ambiente for 2 horas. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS-T. Um anticorpo anti-camundongo IgG (H+L) marcado com HRP (Invitrogen Corporation) diluído 5000 vezes com PBS foi adicionado a 100 μl por cavidade e, então, deixado permanecer à temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS-T, uma solução de substrato de TMB (Thermo) foi adicionada a 100 μl por cavidade e, então, deixada permanecer por 15 a 30 minutos, de modo que uma reação de cor fosse executada. Após o desenvolvimento de cor, ácido sulfúrico 1N foi adicionado a 100 μl por cavidade para parar a reação. A absorbância foi medida a 450 nm e 595 nm com o uso de um espectrômetro de absorção. Como um resultado, uma pluralidade de linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais que exercem reatividade à proteína CAPRINA-1 foi obtida. Os sobrenadantes de cultura de hibridomas foram purificados com o uso de um veículo de proteína G, de modo que 150 anticorpos monoclonais que se ligam à proteína CAPRINA-1 foram obtidos.

[0105] A seguir, dentre estes anticorpos monoclonais, os anticorpos monoclonais que exercem reatividade às superfícies de células de câncer de mama que expressam CAPRINA-1 foram selecionados. Especificamente, 106 células da linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-231V foram submetidas à centrifugação com um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml tube. O sobrenadante (100 μl) de cada hibridoma acima foi adicionado e, então, deixado permanecer em gelo por 1 hora. Após a lavagem com PBS, um anticorpo anti-camundongo IgG de cabra marcado com FITC (Invitrogen Corporation) diluído 500 vezes com PBS que contém 0,1% de soro de bezerro fetal foi adicionado e, então, deixado permanecer em gelo por 1 hora. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida com o uso de FACS Calibur (Becton, Dickinson e Company). Nesse ínterim, um procedimento similar ao acima foi executado de modo que um controle suplementado com um meio em vez do anticorpo foi preparado. Como um resultado, 10 anticorpos monoclonais (n°1-n°10) que têm intensidade de fluorescência mais forte que a do controle, ou seja, que reagem com as superfícies de células de câncer de mama foram selecionados. As regiões variáveis de cadeia pesada e as regiões variáveis de cadeia leve destes anticorpos monoclonais foram mostradas em SEQ ID NOS: 44-60. O anticorpo monoclonal n°1 acima compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45, o anticorpo monoclonal n°2 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 46, o anticorpo monoclonal n°3 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 47, o anticorpo monoclonal n°4 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 48, o anticorpo monoclonal n°5 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 50, o anticorpo monoclonal n°6 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 52, o anticorpo monoclonal n°7 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 54, o anticorpo monoclonal n°8 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 56, o anticorpo monoclonal n°9 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 58, e o anticorpo monoclonal n°10 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 60.

(3) IDENTIFICAÇÃO DE UM PEPTÍDEO NA PROTEÍNA CAPRINA-1, COM O QUAL UM ANTICORPO CONTRA CAPRINA-1 REAGE PARA LIGAÇÕES SUPERFICIAIS DE CÉLULA CANCERÍGENA

[0106] Com o uso de anticorpos monoclonais n°1-n°10 contra CAPRINA-1, que reagem com as superfícies de células cancerígenas obtidas acima, sequências parciais na proteína CAPRINA-1 a ser reconhecida por estes anticorpos monoclonais foram identificadas.

[0107] Primeiramente, DTT (Fluka) foi adicionada a 100 μl de uma solução de proteína CAPRINA-1 recombinante ajustada para conter a proteína a uma concentração de 1 μg/μl com PBS para uma concentração final de 10 mM, seguido por 5 minutos de reação a 95°C, de modo que a redução de ligações de dissulfeto na proteína CAPRINA-1 foi executada. A seguir, iodoacetamida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) com uma concentração final de 20 mM foi adicionada e, então, uma reação de alquilação foi executada para grupos tiol a 37°C por 30 minutos sob condições de escurecimento. Cinquenta microgramas de cada um dos anticorpos monoclonais n°1-n°10 contra CAPRINA-1 foram adicionados a 40 μg da proteína CAPRINA-1 alquilada reduzida obtida dessa forma. O volume da mistura foi ajustado para 1 mL de 20 mM tampão de fosfato (pH7,0) e, então, a mistura foi deixada em reação de um dia para o outro a 4°C enquanto se agitava e misturava cada mistura.

[0108] A seguir, tripsina (Promega) foi adicionada a uma concentração final de 0,2 μg. Após 1 hora, 2 horas, 4 horas e, então, 12 horas de reação a 37°C, os resultantes foram misturados com microesferas de vidro de proteína A (GE) submetidas em avanço para bloquear com PBS que contém 1% BSA (Sigma) e lavar com PBS em 1 mM carbonato de cálcio e tampão NP- 40 (20 mM tampão de fosfato (pH7,4), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, e 1% NP- 40), seguido por 30 minutos de reação.

[0109] As soluções de reação foram lavadas com 25 mM de tampão de carbonato de amônio (pH 8,0) e, então, complexos antígeno- anticorpo foram eluídos com o uso de 100 μl de ácido fórmico a 0,1%. A análise LC-MS foi conduzida para os eluídos com o uso de Q-TOF Premier (Waters- MicroMass) de acordo com os protocolos incluídos com o instrumento.

[0110] Como um resultado, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 61 foi identificado como uma sequência parcial de CAPRINA-1, que foi reconhecida por todos os anticorpos monoclonais n°1-n°10 contra CAPRINA-1. Adicionalmente, o peptídeo de SEQ ID NO: 62 foi identificado como uma sequência parcial no polipeptídeo de SEQ ID NO: 61 acima, que foi reconhecido pelos anticorpos monoclonais n°1-n°4, n°5-n°7, e n°9. Foi revelado adicionalmente que os anticorpos monoclonais n°1-n°4 reconheceram o peptídeo de SEQ ID NO: 63 que era um peptídeo de sequência parcial da mesma.

EXEMPLO 4: DIAGNÓSTICO DE CÂNCER COM O USO DE POLIPEPTÍDEO CAPRINA-1 (1) DIAGNÓSTICO DE CÂNCER CANINO

[0111] O sangue foi coletado a partir de 342 pacientes caninos confirmados com tumores malignos ou benignos e 6 cães saudáveis, e o soro foi separado. Com o uso do polipeptídeo CAPRINA-1 canino (SEQ ID NO: 8) e o anticorpo anti-caninino IgG preparado no Exemplo 2, o titulador do soro de anticorpo IgG que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido por um método ELISA.

[0112] A imobilização do polipeptídeo preparado dessa forma foi executada através da adição de uma solução de proteína recombinante diluída para 5 μg/mL com tampão de solução salina fosfatada para placas amino imobilizadoras com 96 cavidades (Nunc) a 100 μl/cavidade e, então, deixando as placas permanecerem a 4°C de um dia para o outro. O bloqueio foi executado através da adição de uma 50 mM solução de tampão de bicarbonato de sódio (pH 8,4) (doravante, solução de bloqueio) que contém 0,5% BSA (albumina de soro bovino) (Sigma Aldrich Japan) a 100 μl/cavidade e, então, agitando a solução à temperatura ambiente por 1 hora. O soro diluído 1000 vezes com a solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas para reação. As soluções de reação foram lavadas 3 vezes com tampão de solução salina fosfatada (doravante, PBS-T) que contém 0,05% de Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Um anticorpo IgG canino modificado por HRP( Goat anti-Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHIL Laboratories) diluído 3000 vezes com a solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade, seguido por 1 hora de reação à temperatura ambiente enquanto se agita a solução. Após 3 lavagens com PBS-T, o substrato de HRP TMB (1-Step Turbo TMB (tetrametilbenzidina), PIERCE) foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, uma reação de substrato-enzima foi conduzida à temperatura ambiente por 30 minutos. Subsequentemente, uma solução de ácido sulfúrico 0,5 M (Sigma Aldrich Japan) foi adicionada a 100 μl/cavidade para parar a reação. A absorbância a 450 nm foi medida com o uso de um leitor de microplaca. Como controles, um espécime em juntamente com o qual nenhuma proteína recombinante preparada foi imobilizada e um espécime juntamente com o qual uma reação com o soro de um cão com câncer não foi conduzida foram similarmente submetidos ao tratamento e à comparação acima.

[0113] Como um resultado de diagnóstico patológico com o uso de um tecido tumoral excisado, o diagnóstico definitivo foi feito indicando que 215 do total de 342 espécimes usados para o diagnóstico câncer foram malignos.

[0114] Especificamente, os espécimes foram diagnosticados como tendo câncer tais como melanoma maligno, tumor misto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma das células basais, tumor gengival do tipo acantoma, tumor de cavidade oral, adenocarcinoma perianal, tumor de canal anal, adenocarcinoma de apócrina de canal anal, carcinoma de célula de Sertoli, câncer de vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glândula sudorípara, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, câncer de tireóide, câncer de intestino grosso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo compósito, tumor misto maligno de mama, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrossarcoma, hemangiopericitoma, osteossarcoma, condrosarcoma, sarcoma de tecido mole, sarcoma histiocítico, mixossarcoma, sarcoma não diferenciado, câncer de pulmão, mastocitoma, leiomioma cutâneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, carcinoma de célula escamosa, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de célula pequena para célula média, tumor adrenomedular, tumor de célula granulosa e feocromocitoma.

[0115] Concluiu-se que os soros de corpos vivos destes cães com câncer possuem tituladores de anticorpo significativamente altos contra a proteína recombinante conforme mostrado na Figura 3. Quando o valor de referência como câncer maligno relacionado ao método de diagnóstico foi determinado como sendo duas vezes ou mais que o valor médio para cães saudáveis, foi demonstrado que malignidade poderia ser diagnosticada para 108 espécimes, que contabiliza 50,2% de todas as espécimes. Os tipos de câncer destes 108 espécimes são os seguintes. Embora o desenvolvimento de uma pluralidade de tipos de câncer tenha indicado para alguns espécimes, os seguintes valores numéricos são valores acumulativos totais para cada tipo de câncer:6 casos de melanoma maligno, 11 casos de linfoma, 1 caso de inflamação supurativa, 1 caso de tumor de célula granulosa, 4 casos de carcinoma hepatocelular, 3 casos de tumor testicular maligno, 3 casos de tumor de cavidade oral, 7 casos de adenocarcinoma perianal, 12 casos de sarcoma, 35 casos de adenocarcinoma de mama, 1 caso de câncer de pulmão, 6 casos de carcinoma ductal, 2 casos de adenocarcinoma sebáceo, 5 casos de mastocitoma, 1 caso de sarcoma de músculo liso, 3 casos de carcinoma de célula escamosa, 2 casos de tumor misto maligno, 1 caso de hemangiopericitoma, 1 caso de transitional epithelial cancer, 1 caso de hemangiopericitoma, 1 caso de hemangiopericitoma e 1 caso de epitelioma sebáceo.

[0116] Como um resultado de diagnóstico similar com o uso de efusões pleurais e ascites coletados de pacientes caninos com câncer terminal, valores similares aos resultados obtidos pelo método de diagnóstico com o uso de soro poderiam ser detectados e o diagnóstico de câncer poderia ser feito.

[0117] Ademais, foi demonstrado que o uso do método de diagnóstico permite o diagnóstico de câncer em um local invisível a olho nu, a extensão do câncer, malignidade ou curso pós-operatório de câncer, recorrência, metastase e similares. Diversos exemplos específicos de diagnóstico detalhado mostrados na Figura 4 são descritos abaixo.

(2)-1 DIAGNÓSTICO DE CÂNCER PARA TUMOR INVISÍVEL A OLHO NU

[0118] Em 7 de junho de 2007, nenhuma massa tumoral foi confirmada para o paciente canino 1 (Retriever de pêlo curto). Entretanto, cerca de 20 dias depois, em 24 de junho de 2007, uma massa tumoral peduncular com um diâmetro de 2 mm foi encontrada na gengiva na raiz do dente cúspide do maxilar esquerdo do paciente canino 1. No dia em que a massa foi encontrada, a porção peduncular foi ligada e excisada. A absorbância a 450 nm foi 0,06 antes que a massa tumoral pudesse ser visualmente confirmada, e esta figura foi quase igual 0,04, o que foi determinado quando o tumor foi encontrado. Também foi demonstrado pelo resultado que o diagnóstico de câncer em um local invisível a olho nu, tal como câncer intraperitoneal, é possível com o uso desta técnica.

[0119] Além disso, pode ser dito que um sinal de aviso de desenvolvimento de tumor foi detectado com sucesso, uma vez que uma elevação no nível supracitado poderia ser confirmada antes que o tumor pudesse ser confirmado com o olho nu. Por conseguinte, foi confirmado que a técnica também é útil para exames de saúde tais como verificações de saúde rotineiras.

(2)-2 DIAGNÓSTICO DA EXTENSÃO DE CÂNCER

[0120] A extensão do câncer é determinada com base no tamanho do tumor, profundidade do tumor, como o tumor afeta o tecido periférico, e a presença ou a ausência de metástase. Foi revelado que um nível mais alto foi detectado quando a metástase ocorreu ou o câncer progrediu.

(2)-3 DIAGNÓSTICO DE MALIGNIDADE DE CÂNCER

[0121] Os tumores de célula basal incluem tumores de célula basal malignos e tumores de célula basal benignos. Nos últimos anos, os tumores de célula basal malignos tenderam a ser classificados como exemplos de carcinoma das células basais e os tumores de célula basal benignos tendem a ser classificados como exemplos de tricoblastoma de acordo com o novo WHO.

[0122] O paciente canino 2 (Beagle) diagnosticado como tendo carcinoma das células basais (maligno) foi submetido ao sorodiagnóstico mediante cirurgia, de modo que a absorbância a 450 nm foi 0,04. Nesse ínterim, o paciente canino 3 (mestiço) diagnosticado com tricoblastoma (benigno) foi submetido ao sorodiagnóstico mediante cirurgia, de modo que a absorbância a 450 nm foi 0, indicando nenhuma detecção. Portanto, foi demonstrado que diferentes tipos de tumor celular basal, isto é, carcinoma das células basais maligno e tricoblastoma benigno, podem ser diagnosticados, mesmo se eles forem classificados como tumores de célula basal.

[0123] A seguir, os exemplos de tumores de glândula mamária são da seguinte forma. Os tumores de glândula mamária são classificados como tumores malignos tais como adenocarcinoma de mama e tumor misto maligno de mama, e tumores de glândula mamária benignos que não exibem achados malignos.

[0124] O paciente canino 4 (Pastor de Shetland) foi submetido à cirurgia extirpativa em 17 de julho de 2007, para adenocarcinoma de mama. O paciente canino 4 teve 3 tumores. O diagnóstico patológico que usa tecido isolado resultou no mesmo diagnóstico. O tecido da glândula mamaria invasivo e fortemente atípico sofreu algum crescimento de adenóide-papilar espalhado, e a invasão vascular também foi confirmada para os espécimes. Dessa forma, o paciente canino 4 foi diagnosticado as como tendo câncer de mama altamente maligno. Como um resultado do sorodiagnóstico com o uso de sangue coletado mediante cirurgia, a absorbância a 450 nm foi de 0,41.

[0125] Nesse ínterim, o paciente canino 5 (Poodle toy) teve cirurgia extirpativa em 9 de outubro de 2007, para um tumor de glândula mamária. O diagnóstico patológico que usa tecidos isolados neste instante revelou que: enquanto que os tumores foram formados, nos quais as células epitoliais da glândula mamária e as células mioepitoliais cresceram, os componentes da célula mioepitelial foram as células fusiformes uniformes e nenhuma malignidade foi detectada; e o componente de célula epitelial de glândula mamária exibiu uma pequena diferença em tamanho e discariose conforme observada. Por conseguinte, o paciente canino 5 foi diagnosticado como tendo um tumor de glândula mamária benigno para o qual nenhuma malignidade foi detectada. Como um resultado da coleta de sangue e sorodiagnóstico mediante cirurgia do mesmo, a absorbância a 450 nm foi de 0.

[0126] Os resultados acima para os 2 espécimes revelaram que a malignidade de um tumor altamente maligno é maior do que a de um tumor benigno com baixa malignidade.

[0127] Ademais, a distribuição dos diagnósticos para 54 espécimes com tumores malignos (câncer de mama), tais como espécimes de adenocarcinoma de mama ou tumor misto maligno de mama e 21 espécimes de tumor de glândula mamária benigno que não exibem malignidade, foi examinada. Enquanto que os espécimes de tumor de glândula mamária benigno mostraram uma distribuição similar ao caso de cães saudáveis, os espécimes com câncer de mama mostraram uma distribuição de valores altos.

(2)-4 DIAGNÓSTICO DE CURSO PÓS-OPERATÓRIO

[0128] O paciente canino 6 (mestiço) visitou o hospital devido ao mastocitoma e foi submetido à cirurgia extirpativa em 23 de maio de 2005. Como um resultado de sorodiagnóstico feito neste momento, a absorbância a 450 nm foi de 0,10. O mastocitoma é um tumor que sofre repetidamente de recorrência ou metástase quando amputado incompletamente. Por conseguinte, o fato de a amputação de tumor completa poder ser alcançada ou não por cirurgia é importante. Na sequência em 19 de dezembro de 2006, a absorbância a 450 nm foi de 0,05, de modo que um titulador de anticorpo diminuído foi confirmado. Neste instante, nenhuma recorrência foi confirmada. Por conseguinte, no caso de paciente canino 6, pode-se dizer que uma vez que o tumor poderia ser completamente amputado, os resultados do sorodiagnóstico foram menores que aqueles mediante cirurgia.

[0129] O paciente canino 7 (Beagle) foi submetido à cirurgia extirpativa em 14 de fevereiro de 2008, para mastocitoma. Como um resultado do sorodiagnóstico executado neste instante, a absorbância a 450 nm foi de 0,17. Como um resultado de diagnóstico histopatológico com o uso de tecidos excisados, a hiperplasia invasiva foi observada e o paciente canino 7 foi diagnosticado como tendo mastocitoma correspondente ao tipo moderadamente diferenciado (tipo Patnaik II). O paciente canino 7 visitou novamente para acompanhamento em 10 de março de 2008 e foi submetido ao sorodiagnóstico novamente. Como um resultado, a absorbância a 450 nm foi de 0.07. Neste instante, nem a metástase nem a recorrência foi confirmada. Dessa forma, no caso de paciente canino 7, pode-se dizer que os resultados do sorodiagnóstico foram menores que aqueles mediante cirurgia uma vez que o tumor poderia ser completamente amputado.

(2)-5 DIAGNÓSTICO DE RECORRÊNCIA

[0130] O paciente canino 8 (Husky) foi submetido à cirurgia extirpativa em 8 de maio de 2007, para adenocarcinoma de mama. Como um resultado do sorodiagnóstico executado no instante, a absorbância a 450 nm foi de 0,05. Como um resultado do diagnóstico patológico com o uso de tecido excisado, células epiteliais fortemente atípicas cresceram principalmente formando uma estrutura tubular. Dessa forma, o paciente canino 8 foi diagnosticado como tendo adenocarcinoma da glândula mamaria primária. Neste instante, a presença de muitas células cancerígenas em dutos de linfa já foi confirmada, indicando um alto risco de metástase ou recorrência nos nós de linfa ou locais distantes. Em 28 de junho de 2007, (cerca de 1 mês e meio após a cirurgia), a recorrência foi confirmada no mesmo local. O resultado de sorodiagnóstico neste instante foi 0,09 e, dessa forma, um valor aumentado foi confirmado. No caso de paciente canino 8, foi revelado que divo ao fato de a amputação de tumor ou recorrência do mesmo, os resultados dos diagnósticos foram superior no final de junho que no começo de maio.

(2)-6 DIAGNÓSTICO DE METÁSTASE

[0131] O paciente canino 9 (Terrier escocês) sofreu múltiplas metástases e recorrências, incluindo um tumor de glândula mamária em fevereiro de 2003, melanoma maligno intraoral em agosto de 2003, melanoma maligno labial em janeiro de 2005, e melanoma intraoral em 13 de abril de 2005. Todos estes tumores foram amputados por cirurgia. O paciente canino 9 visitou novamente o hospital em 17 de dezembro de 2006, para acompanhamento após a recorrência de melanoma intraoral em abril de 2005 e foi submetido ao sorodiagnóstico. Como um resultado, a absorbância a 450 nm foi de 0,09. Meio ano depois, o paciente canino 9 visitou novamente o hospital em 20 de junho de 2007 devido a um linfóide cervical e hiperplasia linfóide poplítea. No caso do linfoma, os nódulos linfáticos incharam de forma sistemática. O paciente canino 9 teve os nódulos linfáticos inchados em apenas dois sítios. Por conseguinte, o paciente canino 9 foi clinicamente diagnosticado como passível de ter linfoma devido à metástase. O diagnóstico feito por essa técnica também revelou que a absorbância a 450 nm foi aumentada para 0,10, indicando que o linfoma foi causado por metástase a partir do tumor anterior.

[0132] O paciente canino 10 (Shiba inu) foi submetido à tumorectimia em 11 de março de 2006, devido a um melanoma maligno intraoral do lábio direito. O paciente canino 10 teve um histórico de tratamento com um agente anticâncer (ciclofosfamida) de 10 de junho de 2006 a 26 de setembro de 2006, e esteve sob medicação com BIREMO S que tem germânio orgânico como um ingrediente principal desde 23 de maio de 2006. O sorodiagnóstico foi feito em 20 de março de 2007, sob a remoção de um tumor, acreditando-se que o mesmo tenha sido resultado da metástase do tumor anterior, de modo que a absorbância a 450 nm foi descoberta por ser quase 0,03, indicando quase nenhuma detecção. O diagnóstico patológico foi feito para o tecido excisado nesse momento, de modo que a doença fosse diagnosticada como melanoma maligno metastático. Entretanto, a metástase ocorreu novamente em 27 de junho de 2007, 3 meses após a cirurgia para o melanoma metastático. Um tumor desenvolveu na porção direita do cérvice em 20 de março de 2007, e, adicionalmente, o desenvolvimento do tumor ocorreu no lado oposto a tal porção em 27 de junho de 2007. Os tumores formaram massas pretas análogas àquelas dos achados prévios. O tamanho de tumor era de 3,1 x 3,2 x 0,8 cm, e os tumores foram diagnosticados clinicamente como tumores metastáticos. Como resultado de sorodiagnóstico nesse momento, a absorbância a 450 nm foi confirmada por ter aumentado para 0,23, sugerindo que os tumores resultaram da metástase de tumores prévios.

(2)-7 DIAGNÓSTICO DE CÂNCER USANDO POLIPEPTÍDEO DERIVADO DE CAPRINA-1 HUMANA

[0133] Com o uso do polipeptídeo (SEQ ID N°: 2) de CAPRINA-1 humana preparado no Exemplo 2, o título de anticorpo IgG de soro canino reagindo com o polipeptídeo foi medido de uma maneira similar àquela usada acima. Como resultado do exame usando soro de um cão saudável, quase nenhuma absorbância foi detectada a 450 nm, de forma similar ao caso acima.

[0134] Entretanto, o paciente canino 11 (Shih tzu) sofreu cirurgia extirpativa para adenocarcinoma de mama em 21 de junho de 2007. Conforme o resultado do diagnóstico patológico usando tecidos excisados, o paciente canino 11 foi diagnosticado como tendo adenocarcinoma de mama de malignidade moderada, sendo que tecidos glandulares mamários invasivos e fortemente atípicos foram submetidos a crescimento adenóide-tubular-papilar com a finalidade de formar massas pequenas e grandes, além da presença de hiperplasia um pouco difusa de tecidos conjuntivos fibrilares. A absorbância a 450 nm para paciente canino 11 foi encontrada para ser 0,26.

(3) DIAGNÓSTICO DE CÂNCER FELINO

[0135] A seguir, gatos portadores de câncer e gatos saudáveis foram diagnosticados. Com o uso do polipeptídeo de CAPRINA-1 canina (usado acima) e um anticorpo IgG anti-felino, o título de anticorpo IgG de soro felino que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido, de uma maneira similar à maneira acima. Como um anticorpo secundário, um anticorpo IgG anti-felino modificado de HRP (PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG (WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS) foi diluído 8.000 vezes com uma solução de bloqueio e foi então usada.

[0136] O paciente felino 1 (mestiço) sofreu cirurgia extirpativa de tumor para adenocarcinoma de mama em 8 de maio de 2007. A absorbância a 450 nm para o paciente felino 1 foi encontrada por ser de 0,21. Além disso, no caso do paciente felino 2 (Himalayans) que sofreu cirurgia extirpativa para carcinoma ductal em 17 de outubro 2006, a absorbância a 450 nm foi encontrada por ser de 0,18. Por outro lado, nenhuma absorbância foi detectada no caso dos gatos saudáveis.

[0137] Além disso, com o uso do polipeptídeo (SEQ ID NO: 2) of CAPRINA-1 humana preparada no Exemplo 2, o titulador de anticorpo IgG de soro felino que reage com o polipeptídeo foi medido foi medido de maneira similar acima. Como resultado, no caso de gatos saudáveis, quase nenhuma absorbância foi detectada a 450 nm quando o polipeptídeo foi imobilizado. Por enquanto, o paciente felino 3 (American Shorthair) passou por cirurgia extirpativa para adenocarcinoma de mama no dia 15 de abril de 2008. Como resultado do diagnóstico patológico com o uso de tecidos extirpados, o paciente felino 3 foi diagnosticado com tendo adenocarcinoma de mama altamente maligno associado aos grandes e pequenos tecidos mortos, em que tecidos de glândula mamária invasivo atípico foram submetidos ao crescimento em forma de lâmina formando pequenas e grandes massas. Além disso, no caso de paciente felino 3, a absorbância a 450 nm foi de 0,12.

[0138] Portanto, foi demonstrado que o diagnóstico de câncer também é possível para gatos através desta técnica, similar para cães, já que os valores foram detectados para espécimes a partir de gatos com câncer, mas nenhum foi detectado para espécimes a partir de gatos saudáveis.

(4) DIAGNÓSTICO DE CÂNCER HUMANO

[0139] Com o uso do polipeptídeo (SEQ ID NO: 2) de CAPRINA-1 humana preparada no Exemplo 2 e um anticorpo IgG anti-humano, o titulador de um anticorpo IgG de soro humano saudável que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido. A imobilização do polipeptídeo preparado foi realizada através da adição de uma solução de proteína recombinante diluída em 100 μg/mL com solução salina tamponada com fosfato em placas de imobilizador-amino de 96 cavidades (Nunc) a 100 μl/cavidade e, então, ao deixar as placas descansando de um dia para o outro a 4°C. O bloqueio foi realizado como segue. Quatro gramas de pó Block Ace (DS PHARMA BIOMEDICAL Co., Ltd.) foram dissolvidas em 100 ml de água purificada e, então, a solução foi diluída 4 vezes em água purificada. Então, a solução (doravante, solução de bloqueio) foi adicionada a 100 μl/cavidade e, então, agitadas a temperatura ambiente por 1 hora. O soro diluído 1000 vezes na solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, agitado a temperatura ambiente por 3 horas para reação. Após lavagem em 3 instâncias com solução salina tamponada com fosfato (doravante, PBS-T) contendo 0,05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), o anticorpo IgG anti- humano modificado por HRP (HRP-Goat Anti-Human IgG (H+L) Conjugate: Zymed Laboratories) diluído 10000 vezes na solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, agitado a temperatura ambiente por 1 hora para reação. Após 3 instâncias de lavagem com PBS-T, o TMB de substrato HRP (Turbo TMB de 1-Etapa (tetrametilbenzidina), PIERCE) foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, uma reação substrato-enzima foi realizada a temperatura ambiente por 30 minutos. Subsequentemente, foi adicionado 0,5 M de solução de ácido sulfúrico (Sigma Aldrich Japan) a 100 μl/cavidade para parar a reação e, então, a absorbância a 450 nm foi medida com o uso de um leitor de microplaca. Um antígeno de ovalbumina ajustado para 50 μg/ml com solução salina tamponada com fosfato foi imobilizado e, então, usado como um controle positivo. Como resultado, encontrou-se que a absorbância a 450 nm será tão alta quanto 0,45 em média como os resultados para 7 indivíduos saudáveis no caso do antígeno de ovalbumina, mas nenhuma absorbância (0) foi detectada no caso do polipeptídeo acima.

[0140] De maneira similar a anterior, 17 espécimes de soro (adquiridos junto à ProMedDx) de pacientes com câncer de mama maligno foram submetidos, ainda, à medição do titulador do anticorpo IgG de soro que reage especificamente com a proteína de antígeno de câncer derivado de humano (a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3). Como resultado, encontrou-se que a absorbância a 450 nm era tão alta quanto 0,48 no caso do polipeptídeo acima, em média como os resultados para 17 pacientes de câncer de mama.

[0141] Além disso, com o uso do polipeptídeo (SEQ ID NO: 8) de CAPRINA-1 canina preparada no Exemplo 2 e um anticorpo IgG anti-humano, o titulador de anticorpo IgG de soro humano que reage especificamente com o polipeptídeo foi medido de maneira similar a anterior. Como resultado, enquanto que a média dos resultados para 7 indivíduos saudáveis foi 0,04, a média dos resultados para 17 pacientes de câncer de mama foi mais alta que 0,55.

[0142] Com base nos resultados acima, foi demonstrado que câncer em humanos também pode ser detectado através desta técnica.

EXEMPLO 5: DIAGNÓSTICO DE CÂNCER ATRAVÉS DA MEDIDA DO POLIPEPTÍDEO DE ANTÍGENO

[0143] Com o uso do anticorpo policlonal contra peptídeo derivado de CAPRINA-1 (SEQ ID NO: 43) obtido no Exemplo 3 (1) e cada anticorpo monoclonal contra a proteína CAPRINA-1 obtida no Exemplo 3 (2) em combinação, o próprio polipeptídeo de antígeno contido nos espécimes (soro derivado de organismo vivo portador de câncer) reagiu positivo após diagnóstico de câncer com o uso do polipeptídeo de CAPRINA-1 no Exemplo 4 (1)a(3) foi detectado através de ELISA Sanduíche. O anticorpo policlonal foi usado como um anticorpo primário e cada anticorpo monoclonal foi usado como um anticorpo secundário. O nível de proteína de soro da proteína que reage especificamente com cada um dentre os anticorpos acima foi medido.

[0144] O anticorpo primário foi imobilizado através da adição do anticorpo policlonal diluído a uma concentração de 5 μg/ml em uma solução salina tamponada com fosfato em placas de imobilizador-amino de 96 cavidades (Nunc) a 100 μl/cavidade e, então, agitando as placas a temperatura ambiente por 2 horas. O bloqueio foi realizado através da adição de 50 mM de uma solução tampão de bicarbonato de sódio (pH 8,4) (doravante, solução de bloqueio) contendo 0,5% BSA (albumina de soro bovino, Sigma Aldrich Japan) a 100 μl/cavidade e, então, agitada a temperatura ambiente por 1 hora. Subsequentemente, um soro derivado de organismo vivo portador de câncer diluído com o uso da solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, os resultantes foram agitados a temperatura ambiente por 3 horas para reação. A taxa de diluição, neste instante, foi ajustada com série de diluição de 10 vezes (10 a 1000 vezes). Após 3 instâncias de lavagem com solução salina tamponada com fosfato (doravante, PBS-T) contendo 0,05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cada anticorpo monoclonal como um anticorpo secundário diluído a uma concentração de 1 μg/ml na solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl/cavidade e, então, os resultantes foram agitados a temperatura ambiente por 1 hora para reação. Após 3 instâncias de lavagem com PBS-T, um anticorpo IgG anti-camundongo (H+L) marcado por (Invitrogen Corporation) como um anticorpo terciário diluído 5000 vezes na solução de bloqueio foi adicionado a 100 μl por cavidade e, então, deixado para descansar a temperatura ambiente por 1 hora. Após 3 instâncias de lavagem de cavidades com PBS-T, uma solução de substrato TMB (Thermo) foi adicionada a 100 μl por cavidade e, então, deixada para descansar por 15 a 30 minutos para reação de cor. Após desenvolvimento de cor, 1 N de ácido sulfúrico foi adicionado a 100 μl por cavidade para parar a reação e, então, a absorbância a 450 nm foi medida com o uso de um espectômetro de absorção.

[0145] Como resultado, quando os anticorpos monoclonais n°1 a n°10 que reagem com as superfícies de células de câncer foram usados como anticorpos secundários, os valores de absorbância (níveis de polipeptídeo) de 0,3 ou superior foram detectados para todos os espécimes de cão com câncer e gatos portadores de câncer e, melanoma maligno, e similares, mas nenhuma absorbância foi detectada par cães saudáveis e gatos saudáveis. Por outro lado, quando anticorpos monoclonais que reagem com a própria proteína CAPRINA-1 mas que não reagem com as superfícies de células de câncer foram usado como anticorpos secundários, os níveis de polipeptídeo foram detectados para todos os espécimes, mas nenhum valor de absorbância foi de 0,05 ou menos, que foi menor que os resultados para combinações de anticorpos que reagem com as superfícies de células de câncer.

[0146] Portanto, o câncer também pode ser diagnosticado através desta técnica que envolve detecção de polipeptídeos de antígeno com o uso de anticorpos contra CAPRINA-1.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0147] A presente invenção apresenta utilidade industrial para diagnóstico ou detecção de câncer.

[0148] Esta descrição inclui parte ou todo o conteúdo conforme apresentado no presente e/ou desenhos do pedido de patente japonês N° 2008-202320, que é um documento prioritário do presente relatório descritivo. Além disso, todas as publicações, patentes e relatórios descritivos de patente citados no presente documento estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0149] SEQ ID NOS: 31-42: iniciadores.

Claims (11)

1. MÉTODO PARA DETECTAR UM CÂNCER, caracterizado por compreender a medição da expressão de um polipeptídeo que tem uma reatividade de ligação por meio de uma reação antígeno-anticorpo a um anticorpo contra uma proteína CAPRINA-1 expressa na superfície de uma célula cancerígena em uma amostra separada de um organismo vivo em que a proteína CAPRINA-1 consiste em uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 2-30 de numeração par.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo a ser medido ser uma proteína CAPRINA-1 que consiste em uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 2-30.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo organismo vivo ser um ser humano, um cachorro ou um gato.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo organismo vivo ser um cachorro e o polipeptídeo a ser medido ter uma sequência de aminoácidos mostrada em uma das SEQ ID NOS: 2-30 de numeração par.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo organismo vivo ser um cachorro e o polipeptídeo a ser medido ter a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 ou 14.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo organismo vivo ser um ser humano e o polipeptídeo a ser medido ter a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 2 ou 4.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela expressão do polipeptídeo ser medida através do imunoensaio de um anticorpo que pode estar contido na amostra e é induzido in vivo contra o polipeptídeo a ser medido.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela amostra ser soro, plasma sanguíneo, ascite ou efusão pleural.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo câncer ser ao menos um tipo de câncer selecionado a partir do grupo que consiste em tumor cerebral, carcinoma de célula escamosa da cabeça, pescoço, pulmão, útero ou esôfago, melanoma, adenocarcinoma do pulmão ou útero, câncer renal, tumor misto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma das células basais, tumor gengival do tipo acantoma, tumor da cavidade oral, adenocarcinoma perianal, tumor de canal anal, adenocarcinoma da apócrina do canal anal, carcinoma de células de Sertoli, câncer de vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glândulas sudoríparas, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, câncer de tireóide, câncer de intestino grosso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo compósito, tumor misto maligno de mama, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrossarcoma, hemangiopericitoma, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de tecido mole, sarcoma histiocítico, mixossarcoma, sarcoma não diferenciado, câncer de pulmão, mastocitoma, leiomioma cutâneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequenas a células médias, tumor adrenomedular, tumor de célula granulosa e feocromocitoma.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender adicionalmente a detecção da malignidade de um câncer com base no fato de que a malignidade de câncer é alta quando o nível de expressão do polipeptídeo for maior do que o de um controle.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente a detecção da progressão do câncer na base do indicador de que a extensão do câncer está avançada quando o nível de expressão do polipeptídeo for maior do que o de um controle.