BRPI0715844A2 - Composição farmacêutica para tratamento do colangiocarcinoma, método de inibição do crescimento ou invasão do colangiocarcinoma e método de tratamento do colangiocarcinoma - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO COLANGIOCARCINOMA, MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO OU INVASÃO DO COLANGIOCARCINOMA E MÉTODO DE TRATAMENTO DO COLANGIOCARCINOMA". A presente invenção revela uma composição farmacêutica para inibição do crescimento ou metástase do colangiocarcinoma, compreendedo um inibidor da atividade de L1CAM ou supressor de expressão e um método de tratamento usando a composição. O fundamento por trás disso é a descoberta de que a L1CAM é superexpressa no colangiocarcinoma e desempenha papel importante no crescimento e da metástase do colangiocarcionoma, e de que a mortalidade dos pacientes com colangiocarcinoma aumenta à medida que a taxa de expressão de L1CAM aumenta. Além disso, foi descoberto que os anticorpos inibidores da atividade de L1CAM, ou siRNAs suprimindo a expressão de L1CAM, reduzem o crescimento e a invasão das células de colangiocarcinoma. Anticorpos monoclonais de camundongos, reconhecendo a proteína L1CAM na superfície celular do colangiocarcinoma e ligando-se especificamente aos tecidos com colangiocarcinoma, ou siRNAs, oligonucleotídeos de sentido negativo ou shRNAs, podem ser úteis no tratamento do colangiocarcinoma, inibindo o crescimento, a invasão e a migração das células do colangiocarcinoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DO COLANGIOCARCINOMA, MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO OU INVASÃO DO COLANGIOCARCINOMA E MÉTODO DE TRATAMENTO DO COLANGIOCARCINOMA ".

[Campo Técnico]

A presente invenção relaciona-se a uma composição farmacêutica para a inibição do crescimento ou metástase do colangiocarcinoma, compreendendo uma substância que inibe a atividade ou expressão da L1CAM, que é uma proteína presente na superfície das células do colangiocarcinoma, e a um método de tratamento usando a composição.

[Estado da Técnica] O colangiocarcinoma é um câncer dos dutos

biliares, que drenam a bílis do fígado para o intestino delgado. Evidências recentes afirmam que o câncer de fígado pode decorrer de uma célula-tronco heáptica pluripotente (Sell and Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363, 1989). O colangiocarcinoma responde por um número de mortes menor do que o câncer de fígado no mundo inteiro, tendo ocorrência maior no sudeste asiático do que na Europa ou na América do Norte. O colangiocarcinoma não pode ser tratado de maneira eficaz por remoção cirúrgica por causa de seu grande índice de reincidência. Os tratamentos gerais por quimioterapia e radioterapia também não são úteis ao tratamento do colangiocarcinoma (Pederson e col. Câncer Res. 4325- 4332, 1997). Além disso, o diagnóstico do colangiocarcinoma é difícil, e foi observado que a inflamação crônica, atribuída à infecção de bactérias ou parasitas dentro dos dutos biliares, tem propensão a se desenvolver em um colangiocarcinoma (Roberts e col., Gastroenterology 112:269- 279, 1997).

Apesar da grande quantidade de resultados de pesquisas, a patogênese do colangiocarcinoma ainda é desconhecida. Também há pouco conhecimento das moléculas alvo para o tratamento do colangiocarcinoma. Apenas poucas linhagens celulares foram estabelecidas, graças a alguns estudos citogenéticos (Yamaguchi e col., J. Nat Ί Câncer Inst 75: 29-35, 1985; Ding e col., Br J Câncer 67: 1007-1010, 1993). No entanto, não há notícia de métodos de preparação de um anticorpo específico para o colangiocarcinoma usando essas linhagens celulares.

Recentemente, foram estabelecidas as linhagens celulares Choi-CK e SCK do colangiocarcinoma de pacientes que sofriam de colangiocarcinoma (Kim e col., Genes, chromosome & Câncer 30:48-56, 2001). Se os anticorpos monoclonais específicos à superfície celular forem preparados a partir dos camundongos injetados com a linhagem celular do colangiocarcinoma, eles podem ser aplicados ao tratamento do colangiocarcinoma. O gene do receptor do fator de crescimento

epidérmico (EGFR), conhecido como um fator de prognóstico, é um proto-oncogene. 0 EGFR está envolvido na tumorigênese e no comportamento de crescimento agressivo. O EGFR é superexpresso em vários cânceres, inclusive no câncer de mama, no câncer de pulmão, no câncer colorretal, no câncer renal, no carcinoma da vesícula biliar, no câncer de cabeça e pescoço, no câncer de ovário, no câncer de próstata, em tumorais cervicais cancerosos e no câncer de estômago (Modjtahedi, H. and Dean, C, The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in câncer. Int. J. Oncol. 4: 277-296, 1994). Além disso, a associação da expressão de EGFR com o prognóstico do câncer diverge de um câncer para outro (Nicholson, R.I. e col. EGFR and câncer prognosis. Eur. J. Câncer 37, S9-S15, 2001). Por exemplo, o EGFR pode ser usado como um forte fator de prognóstico para o câncer de bexiga, tumores cervicais cancerosos, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço e câncer ovariano, mas é reconhecido como um fraco indicador de prognóstico para o carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC). No entanto, não há informação conhecida sobre os fatores de prognose para o colangiocarcinoma. Quando anticorpos contra o EGFR são

aplicados ao tratamento de cânceres, foi verificado que a eficiência de sua atividade inibitória contra o crescimento das células cancerosas varia em 15 a 50% para cada tipo de câncer. Além disso, há uma diferença entre os efeitos de inibição de crescimento in vitro e in vivo, mesmo em tipos de cânceres iguais (Dassonville, 0. e col., EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Criticai Reviews in Oncology/Hematology 62, 53-61, 2007). Atualmente, os anticorpos contra EGFR são usados como agentes terapêuticos para o câncer colorretal e para o câncer de cabeça e pescoço, mas não são aplicados ao tratamento de todas as doenças cancerosas exemplificadas acima, nas quais o EGFR é superexpresso. Como explicado acima, a expressão nas células cancerosas não garante simplesmente que a proteína seja um fator de prognóstico para o câncer. Além disso, o fato de a expressão de uma proteína nas células cancerosas estar ou não associada ao prognóstico do câncer depende do tipo de câncer. Um fator de prognóstico forte e fraco para o câncer pode ser utilizado não apenas para prever imediatamente os efeitos do tratamento e do prognóstico de um agente terapêutico, mas também para desenvolver um agente terapêutico direcionado ao fator de prognóstico que possa ser aplicado de forma seletiva e eficaz ao câncer em questão. Sendo assim, a descoberta de tais fatores de prognóstico específicos para cânceres é importantíssima no diagnóstico e tratamento dos cânceres. A molécula de adesão celular Ll (LlCAM) é

uma glicoproteína de membrana integral de 220 kDa, que é um membro da superfamília de imunoglobulinas das moléculas de adesão celular (CAMs), que mediam a adesão entre células na superfície celular. A L1CAM, originalmente identificada em neurônios (Bateman e col, EMBO J. 15:6050- 6059; 1996), desempenha papel fundamental na migração neuronal, no crescimento neurítico e na migração celular. O gene LlCAM humano foi isolado de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano embriônico usando oligonucleotídeos degenerados derivados de homólogos LlCAM de camundongos e ratos como sondas (Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991; U. S. Pat. No. 5,872,225, issued on Feb. 16, 1999). A LlCAM é expressa primariamente no cérebro, e sua expressão também é detectada em alguns tecidos normais, e recentemente foi detectada em vários tipos de câncer. Parece haver uma associação entre a LlCAM e

o câncer. Foi relatado que a LlCAM é expressa em diversos tipos de células tumorais, incluindo melanoma, neuroblastoma, carcinoma de ovário e carcinoma colorretal (Takeda, e col., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies e col., Eur. J. Câncer, 38:1708-1716, 2002; ArIt e col. , Câncer Res. 66:936-943, 2006; Gavert e col. , J. Cell Biol. 168:633-642, 2005). A LlCAM foi encontrada não apenas na forma ligada à membrana mas também como um produto da clivagem, que é segregado para a matriz extracelular (Gutwein e col., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). Recentemente, demonstrou-se que a LlCAM é uma molécula que desempenha um importante papel no crescimento das células tumorais (Primiano, e col., Câncer Cell. 4(1):41 -53 2003) e vem surgindo como um novo alvo para a terapia do câncer (US2004/0115206 Al, depositada em 17 de junho de 2004). Estudos recentes também mostraram que a LlCAM é expressa no fronte invasivo do tecido do câncer de cólon humano (Gavert, e col., J Cell Biol. 14; 168(4) :633-42. 2005) e os anticorpos anti- LlCAM funcionam de forma a inibir o crescimento e a metástase das células do câncer de ovário (Arlt, e col., Câncer Res. 66:936- 943. 2006). A expressão da LlCAM nas células do colangiocarcinoma mencionada nos relatórios anteriores não aparece em lugar nenhum. Além do mais, ainda não há nenhuma informação sobre se a LlCAM está envolvida no crescimento e na metástase do colangiocarcinoma. Além disso, ainda não foram publicados totalmente dados sobre se os pacientes com colangiocarcinoma apresentam mortalidade superior quando a LlCAM é expressa em um nível superior nas células cancerosas, isto é, se a LlCAM é um fator de prognóstico fraco para o colangiocarcinoma. Sendo assim disso, antes da presente invenção, não se sabia que um anticorpo contra a LlCAM tem potencial como fármaco terapêutico, inibindo também a proliferação e metástase do colangiocarcinoma.

O documento EP 1,172,654 Al e a Publicação de Patente US Ne 2004/0259084 revelam um método para o diagnóstico e prognóstico de tumores de ovário e endometriais, caracterizado pelo fato de que o nível de LlCAM é determinado em uma amostra do paciente baseando-se e que a presença de L1CAM é uma indicação da presença de um tumor de ovário ou endometrial ou uma predisposição a tal tumor, e um método de tratamento dos tumores ovarianos ou endometriais em um paciente que necessita de tal tratamento, compreendendo administrar, ao paciente, uma quantidade suficiente de um anticorpo LlCAM ou um fragmento deste conjugado a um fármaco citotóxico. Como revelado nessas patentes, a proteína LlCAM é descrita apenas como um marcador específico para tumores ovarianos ou endometriais.

A Publicação de Patente US N- 2004/0115206

revela um método e um reagente para induzir a morte celular em células tumorais usando um anticorpo que se liga especificamente a L1CAM, e composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo L1CAM. O método é caracterizado por colocar a célula tumoral em contato com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LICAM por um tempo e a uma concentração suficientes para inibir o crescimento celular ou induzir a morte celular na célula tumoral. Mencionando as células do câncer de mama, do câncer de cólon e do carcinoma cervical como exemplos de células tumorais expressando Ll CAM, essa publicação de patente oferece apenas resultados de testes in vitro, mas não é respaldada por dados in vivo. Também não é elucidada a relação entre a LlCAM e o colangiocarcinoma. Além disso, essa publicação de patente indica apenas que a célula tumoral entra em contato com o anticorpo anti-LICAM de modo a inibir o crescimento celular e induzir a morte celular, mas não relata que o anticorpo anti- LICAM é capaz de inibir a migração, invasão e metástase das células tumorais.

O Pedido de Patente Internacional N2 PCT/EP2005/008148 revela uma proteína L1CAM superexpressa no carcinoma ovariano e endometrial, uma composição farmacêutica para interferir na expressão de L1CAM, e um método para a prevenção e o tratamento do carcinoma ovariano e endometrial usando a composição. A composição farmacêutica, compreendendo um anticorpo anti-LICAM ou um derivado deste, é descrito como sendo capaz de tratar o carcinoma ovariano ou endometrial pela inibição da migração e do crescimento das células cancerosas. Esse pedido de patente também menciona apenas o carcinoma ovariano e endometrial, em que a LlCAM em uma forma ligada à célula ou em uma forma solúvel funciona de forma a promover a migração das células cancerosas.

Em suma, nenhuma das publicações anteriores à presente invenção revela que a LlCAM é expressa em níveis altos no colangiocarcinoma, podendo, portanto, ser utilizada como um fator de prognóstico fraco específico para o colangiocarcinoma, e que um inibidor da L1CAM, tal como um anticorpo para a L1CAM, pode ser consequentemente útil no diagnóstico e no tratamento do colangiocarcinoma.

[Revelação] [Problema Técnico] Os presentes inventores realizaram pesquisas

extensas e meticulosas voltadas para o desenvolvimento de anticorpos úteis no diagnóstico e no tratamento do câncer. Camundongos foram imunizados com a linhagem celular do colangiocarcinoma recentemente estabelecida (Kim e col., Genes, Chromosomes & Câncer 30:48-56, 2001), obtendo assim um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à LlCAM na superfície das células do colangiocarcinoma. O anticorpo monoclonal obtido recebeu a designação "A10-A3", e foi descoberto que esse anticorpo reconhece especificamente a L1CAM.

Além disso, foi verificado que a LlCAM é

expressa na superfície das células do colangiocarcinoma, mas não na superfície das células normais, como linfócitos periféricos, hepatócitos, células endoteliais vascular, etc., conforme ensaiado com o anticorpo A10-A3 e com os anticorpos anti-LICAM conhecidos. A LlCAM era conhecida por ser expressa no câncer de mama, no câncer de ovário, no câncer colorretal, no câncer de pele, etc., mas continuou sendo desconhecida quanto à expressão no colangiocarcinoma. Experimentos com o anticorpo A10-A3, realizados pelos presentes inventores, mostraram que a LlCAM foi superexpressa em 45,2% de 42 pacientes com colangiocarcinoma intra-hepático e em 39,8% de 103 pacientes com colangiocarcinoma extra-hepático, particularmente na fronte invasiva, o que explica a iniciação da metástase do colangiocarcinoma. Além disso, análises estatísticas da correlação entre a taxa de expressão de LlCAM e o índice de sobrevivência mostraram que a mortalidade dos pacientes com colangiocarcinoma com alta taxa de expressão de LlCAM foi muito maior do que a dos pacientes com colangiocarcinoma com baixa taxa de expressão de L1CAM. Demonstrando que a LlCAM é um fator de prognóstico fraco para o colangiocarcinoma, esse resultado indica que o LlCAM pode ser um alvo importante para o tratamento do colangiocarcinoma.

Embora seja expresso em nível elevado no colangiocarcinoma, o EGFR, por sua vez, que é usado como alvo de agentes terapêuticos para uso clínico atual no tratamento do câncer de cólon (por exemplo, cetuximab, um anticorpo quimérico para EGFR), demonstrou não ser um fator de prognóstico fraco para o colangiocarcinoma, pois nenhuma significância estatística foi encontrada na análise de uma correlação entre as taxas de expressão de EGFR e os índices de sobrevivência. Assim, o EFGR é reconhecido por não ser um fator de prognóstico fraco para o colangiocarcinoma. Portanto, nem todas as moléculas superexpressas no câncer podem ser usadas como alvos importantes para seu tratamento. Quando a expressão de LlCAM foi suprimida

introduzindo-se o siRNA contra LlCAM e linhagens celulares do colangiocarcinoma expressando LlCAM (Choi-CK, SCK), foi verificado que seu crescimento, migração e invasão foram suprimidos. Esses resultados indicam que a LlCAM desempenha papel importante no crescimento e na metástase do colangiocarcinoma.

Foi verificado que os anticorpos para LlCAM possuem atividade inibitória contra o crescimento, migração ou invasão das células do colangiocarcinoma, conforme ensaiado pelo tratamento das linhagens celulares do colangiocarcinoma (Choi-CK, SCK) com o anticorpos A10-A3 ou um anticorpo anti- LlCAM conhecido (UJ127). Além disso, a injeção do anticorpo A10-A3 inibiu o crescimento das células do colangiocarcinoma em camundongos nus que foram transplantados com uma linhagem celular do colangiocarcinoma. Além disso, o anticorpo monoclonal 4-63, produzido por um hibridoma (KCTC 10966BP) obtido de camundongos imunizados com células-tronco embriônicas humanas, reconheceu LlCAM na superfície das células cancerosas, e inibiu o crescimento do colangiocarcinoma. Sendo assim, pesquisas extensas e meticulosas, que deram origem à presente invenção, realizadas pelos presentes inventores, levaram-nos à conclusão de que os anticorpos anti-LICAM são úteis no diagnóstico e no tratamento do colangiocarcinoma.

[Solução Técnica]

É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer uma composição farmacêutica para inibir o crescimento e a metástase das células do colangiocarcinoma, compreendendo uma substância que inibe a atividade da LlCAM ou suprime a expressão da L1CAM.

Outro objetivo da presente invenção é oferecer um método para o tratamento do colangiocarcinoma baseado no uso da composição farmacêutica. Um objetivo adicional da presente invenção é oferecer um anticorpo anti-LICAM para inibir a atividade da L1CAM. Ainda outro objetivo da presente invenção é oferecer um oligonucleotídeo para inibir a expressão da L1CAM. Ainda outro objetivo da presente invenção é oferecer um método de inibição da proliferação ou metástase das células do colangiocarcinoma baseado no uso da composição farmacêutica.

[Descrição dos Desenhos]

A FIG.l apresenta os resultados da marcação das células com cor fluorescente e da citometria de fluxo para a capacidade de ligação dos anticorpos monoclonais de camundongos, A10-A3 (A) e 4-63 (B), e dos anticorpos conhecidos 5G3 (C) e UJ127(D) para a superfície celular de várias linhagens de células de carcinoma, inclusive colangiocarcinoma, e células normais.

A FIG. 2 apresenta os resultados da imunoprecipitação e do Western blotting, indicando que A10-A3 se liga especificamente à L1CAM. A: A superfície celular do colangiocarcinoma Choi-CK foi biotinilada, e a imunoprecipitação foi realizada com o anticorpo A10-A3 ou um anticorpo monoclonal anti-LICAM conhecido (UJ127). As proteínas precipitadas foram submetidas a SDS-PAGE a 10% e ao Western blotting com Estreptavidina-HRP. A LlCAM foi detectada pelo Western blotting. B: As proteínas foram imunoprecipitadas com o anticorpo A10-A3, separadas em SDS- PAGE a 10% e sujeitas ao Western blotting usando o anticorpo anti-LICAM conhecido (UJ127). A LlCAM foi detectada por Western blotting. O "pré-clareamento", como um controle negativo, indica a imunoprecipitação (IP) na ausência do anticorpo, "IP com A10-A3" indica IP usando o anticorpo AlO- A3, "IP com anti-LICAM" indica IP usando um anticorpo monoclonal anti-LICAM conhecido e "somente A10-A3" indica o SDS-PAGE apenas do anticorpo. C: Células HEK293T expressando Ll solúvel foram sujeitas ao Western blotting usando anticorpos conhecidos, UJ127 e 5G3, e os anticorpos A10-A3 e 4- 63. "-" indica um sobrenadante de cultura de células não contendo um vetor de expressão LI, e "+" indica um sobrenadante de cultura de células contendo um vetor de expressão Ll solúvel.

A FIG. 3 apresenta os resultados da análise Q- TOF. As proteínas das células Choi-CK foram imunoprecipitadas com um anticorpo A10-A3, separadas em SDS-PAGE, e digeridas por tripsina. Os peptídeos obtidos foram analisados usando Q- TOF, que revelou que a proteína imunoprecipitada é L1CAM. A seqüência de aminoácidos inferior representa a LlCAM de seqüência completa, e as seqüências de aminoácidos superiores apresentam as seqüências dos peptídeos analisados, correspondendo às partes sublinhadas da seqüência LlCAM completa.

A FIG. 4 apresenta os resultados da coloração imunohistoquímica dos tecidos do carcinoma de pacientes com câncer usando os anticorpos A10-A3 (A e C) e 4-63 (B). Foi verificado que os anticorpos se ligam aos tecidos do colangiocarcinoma humano, mas não se ligam aos tecidos hepáticos normais. A FIG. 5 mostra tabelas em que as correlações entre a expressão de LlCAM no colangiocarcinoma intra- hepático (A) e no colangiocarcinoma extra-hepático (B) e as propriedades clinicopatológicas são resumidas.

A FIG. 6 apresenta gráficos que mostram as

correlações entre a taxa de expressão de LlCAM e os índices de sobrevivência dos pacientes com colangiocarcinoma extra- hepático (60 casos) expressos tanto como OS (sobrevivência geral) quanto como DFS (sobrevivência livre de doença), A FIG. 7 mostra os níveis de expressão de

LlCAM em células do colangiocarcinoma transfectadas com siRNA contra LlCAM e siRNA não-específico (A) e os níveis de proliferação, invasão e migração das células transfectadas (B).

A FIG. 8 mostra os efeitos inibitórios dos anticorpos anti-LICAM A10-A3 (A), 4-63 (B) e UJ127 e 5G3 (C) sobre o crescimento da linhagem celular do colangiocarcinoma Choi-CK e SCK. A linhagem celular do câncer de ovário SK- OV3 e a linhagem celular do câncer renal ACHN, às quais o anticorpo A10-A3 não se ligou, foram utilizadas como controle positivo de células e controle negativo de células, respectivamente. Para um controle negativo de anticorpos, o tratamento sem nenhum anticorpo (controle), um anticorpo inativado por calor (A10-A3b ou 4-63b fervido) ou IgG normal de camundongo foi realizado. O nível de crescimento celular foi expresso como uma porcentagem em relação a um controle não contendo nenhum anticorpo após as células terem sido incubadas por 72 horas com μg/mL de anticorpo.

A FIG. 9 mostra os efeitos inibitórios dos anticorpos anti-LICAM A10-A3, 4-63 e 5G3 sobre a invasão e a migração das células do colangiocarcinoma (Choi-CK, SCK). A linhagem celular do câncer renal ACHN, à qual o anticorpo AlO- A3 não se ligou, foi usada como um controle negativo de células, enquanto que, para um controle negativo de anticorpos, foi realizado o tratamento sem nenhum anticorpo (controle), um anticorpo inativado por calor (A10-A3b ou 4-63b fervido) ou IgG normal de camundongo. O nível de crescimento celular foi expresso como uma porcentagem em relação a um controle não contendo nenhum anticorpo após as células terem sido incubadas por 72 horas com μg/mL de anticorpo.

A FIG. 10 mostra que o anticorpo A10-A3 inibe a transdução do sinal envolvido no crescimento, migração e sobrevivência das células cancerosas. A linhagem celular do colangiocarcinoma Choi-CK ou SCK foi tratada com o anticorpo A10-A3 ou IgG de camundongo, ou não foi tratada com nenhum anticorpo, e foi então coletada. Os lisados celulares foram submetidos ao Western blotting usando anticorpos contra PCNA (A), fosfo-MAPK (A), fosfo-AKT (B) e fosfo-FAK (C). Usou-se um anticorpo anti-p-actina para detectar β-actina como um controle de carregamento.

A FIG. 11 mostra os efeitos inibitórios do anticorpo A10-A3 sobre o crescimento do câncer em modelos de camundongo xenoenxertados com colangiocarcinoma humano. O painel A mostra as mudanças no volume do tumor ao longo do tempo em 5 camundongos administrados com o anticorpo (grupo A10-A3) e 5 camundongos não administrados com um anticorpo (controle). O painel IlB mostra os pesos dos tumores três semanas após o transplante das células cancerosas. O painel C mostra os tecidos cancerosos em fotografias. O painel D é um gráfico no qual os pesos corporais dos camundongos foram monitorados por um período de tempo.

[Melhor Modo]

Em um aspecto, a presente invenção está voltada para uma composição farmacêutica para inibir o crescimento e a metástase do colangiocarcinoma, compreendendo uma substância que inibe a atividade da LlCAM ou suprime a expressão da L1CAM.

Em uma concretização, a presente invenção oferece uma composição farmacêutica compreendendo uma substância que inibe a atividade de L1CAM. De preferência, a substância inibidora de atividade é um anticorpo que reconhece especificamente um antígeno de superfície de célula do colangiocarcinoma ou um antígeno de superfície segregado (L1CAM). O anticorpo inclui todos os anticorpos monoclonais e anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos destes. Novos anticorpos, bem como anticorpos conhecidos na técnica, enquadram-se no âmbito da presente invenção. De preferência, o anticorpo é um novo anticorpo monoclonal anti-LICAM A10-A3 ou 4-63, ou um anticorpo monoclonal anti-LICAM UJ127 conhecido ou um anticorpo quimérico, humanizado ou humano deste. Os anticorpos A10-A3 e A-63 são segregados por hibridomas cujos números de acesso KCTC são, respectivamente: KCTC 10909BP e KCTC 10966BP.

Contanto que tenham a especificidade de ligação por L1CAM, os anticorpos incluem formas completas tendo duas cadeias leves de seqüência completa e duas cadeias pesadas de seqüência completa, ou podem ser na forma de fragmentos funcionais das moléculas de anticorpo. Como usado aqui, o termo "fragmentos funcionais das moléculas de anticorpos" se refere a fragmentos que mantêm ao menos uma função de ligação a antígeno, que são exemplificados por Fab, F(ab), F(ab')2 e Fv. Em outra concretização desse aspecto, de

acordo com a presente invenção, a composição farmacêutica pode incluir uma substância que suprime a expressão de L1CAM. Quando seu nível de expressão nas células tumorais expressando LlCAM é suprimido por um inibidor da expressão de L1CAM, o crescimento e a metástase das células tumorais diminuem, podendo, portanto, ser aplicado ao tratamento de tais cânceres. De preferência, o inibidor da expressão de LlCAM é selecionado dentre o grupo que consiste de siRNAs, shRNAs e oligonucleotídeos de sentido negativo, e prefere-se um siRNA contendo uma seqüência de 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3' ou 5'- CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'. Conforme usado no presente documento, o termo "siRNA" refere-se a uma pequena molécula de ácido nucléico de cerca de 20 nucleotídeos, que media a interferência do RNA ou o silenciamento gênico. O termo "shRNA" refere-se a um pequeno grampo de RNA em que as seqüências de sentido positivo e negativo de uma seqüência alvo siRNA são separadas por uma estrutura de laço de 5 a 9 bases. Recentemente, o fenômeno da interferência do RNA (RNAi) foi estudado para aplicação a um método para controlar a expressão da proteína a nível gênico. Em geral, foi demonstrado que o siRNA suprime a expressão da proteína ligando-se especificamente ao mRNA tendo uma seqüência complementar a um gene alvo.

O siRNA, que está contido na composição de acordo com a presente invenção, pode ser preparado por síntese química direta (Sui G e col, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520) ou transcrição in vitro (Brummelkamp TR e col., (2002) Science 296:550-553), mas a presente invenção não se limita a estes métodos. Além disso, os shRNAs, que são projetados para superar as desvantagens dos siRNAs, inclusive a biossíntese cara do siRNA e a baixa eficácia de transfecção, levando à persistência a curto prazo do efeito de interferência do RNA, podem ser expressos a partir de um promotor baseado na RNA polimerase III contido em um sistema de vetor de expressão adenoviral, rentiviral ou plasmideal, que foi introduzido nas células. As moléculas de shRNA são processadas em moléculas de siRNA funcionais usando uma enzima de processamento de siRNA (Dicer ou RNase III) dentro das células, e então induzem o silenciamento de um gene alvo.

Conforme usado no presente documento, o termo "sentido negativo" refere-se a um oligômero tendo uma seqüência de bases de nucleotídeos e uma estrutura entre sub- unidades que permite que o oligômero de sentido negativo se hibridize para uma seqüência alvo no RNA pelo pareamento de bases de Watson-Crick, para formar um heteroduplex RNA:oligômero dentro da seqüência alvo, tipicamente com mRNA. O oligômero pode ter a complementaridade de seqüência exata à seqüência alvo ou complementaridade próxima a esta. Esses oligômeros de sentido negativo podem bloquear ou inibir a tradução do mRNA, e/ou modificar o processamento do mRNA para produzir uma variante de processamento (splice) do mRNA. Desse modo, o oligômero de sentido negativo da presente invenção é um oligômero de sentido negativo complementar ao mRNA do gene L1CAM.

De preferência, a composição de acordo com a presente invenção pode incluir um agente terapêutico conhecido que é direta ou indiretamente conjugado ao anticorpo ou está presente em uma forma não conjugada. O agente terapêutico capaz de se ligar ao anticorpo inclui, mas não se limita a, radionuclídeos, fármacos, linfocinas, toxinas e anticorpos biespecíficos. Contanto que seja capaz de exercer efeitos terapêuticos sobre o câncer quando conjugado a um anticorpo ou administrado em combinação com um siRNA, um shRNA ou um oligonucleotídeo de sentido negativo, qualquer agente terapêutico conhecido pode ser usado na presente invenção.

Exemplos de radionuclídeos incluem, sem a isto se limitar: 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I e 186Re.

Os fármacos e toxinas úteis na presente invenção incluem etoposida, teniposida, adriamicina, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactionomicina, mitomicina, cis-platina e análogos da cis-platina, bleomicinas, esperamicinas, 5-fluorouracil, melfalan e mostarda de nitrogênio, sem a isto se limitar.

De preferência, a composição de acordo com a presente invenção pode incluir um veículo aceitável apropriado ao seu modo de administração. Formulações adequadas aos modos de

administração são conhecidas na técnica. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento do câncer. A dosagem típica pode ser otimizada pelo uso de uma técnica clínica convencional.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método de tratamento do colangiocarcinoma baseado no uso da composição farmacêutica.

Em mais detalhes, o método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição farmacêutica ao corpo. A composição farmacêutica pode ser administrada por via parenteral, subcutânea, intrapulmonar ou intranasal. Para terapia imunossupressora local, a composição pode, se desejado, ser administrada com o uso de um método adequado, incluindo administração por via intralesional. As injeções parenterais incluem as vias intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitonial e subcutânea. Modos de administração preferidos incluem a via intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular e injeções de gota.

O colangiocarcinoma pode ser tratado

administrando-se a composição farmacêutica da presente invenção ao corpo, sendo que um anticorpo específico à L1CAM, contido na composição, se liga ao antígeno da superfície de células cancerosas L1CAM, dessa forma inibindo da proliferação ou metástase das células do colangiocarcinoma.

Além disso, o colangiocarcinoma pode ser tratado administrando-se a composição farmacêutica da presente invenção ao corpo para permitir que o anticorpo se ligue à LlCAM segregada, o que induz o bloqueio do crescimento e metástase das células cancerosas. Como alternativa, o anticorpo, quando injetado, se liga ao antígeno de superfícies de células cancerosas S1CAM, de modo que as células imunológicas reconheçam esta associação, levando à fagocitose, apoptose ou morte das células cancerosas. O tratamento do colangiocarcinoma pode

também ser obtido mediante a inibição da expressão de LlCAM usando o inibidor de expressão da LlCAM contido na composição farmacêutica da presente invenção. Neste caso, a ação estimulante da LlCAM no crescimento e metástase das células do colangiocarcinoma diminui.

De acordo com um aspecto adicional, a presente

invenção está voltada para um anticorpo contra a LlCAM para inibir a atividade da LlCAM ou um oligonucletídeo contra a LlCAM para inibir a expressão da L1CAM.

Em uma concretização desse aspecto, como descrito para a composição de acordo com a presente invenção, o anticorpo, contanto que se ligue especificamente à L1CAM, inclui formas completas tendo duas cadeias leves de seqüência completa e duas cadeias pesadas de seqüência completa, bem como fragmentos funcionais das moléculas de anticorpo. Os fragmentos funcionais das moléculas de anticorpo são fragmentos que mantêm pelo menos uma função de ligação ao antígeno, e incluem Fab, F(ab), F(ab')2 e Fv.

De preferência, o anticorpo reconhece o antígeno de superfície de células do colangiocarcinoma ou o antígeno de superfície segregado (L1CAM). O anticorpo é caracterizado por se ligar à proteína de superfície das células do colangiocarcinoma LlCAM para inibir ou neutralizar a ação da L1CAM, e pelo fato de que, através da ligação às células cancerosas, inibe o crescimento e metástase das células, fagocita as células, induz a apoptose dentro das células, ou mata as células. Conforme descrito no Pedido US20040115206, os anticorpos anti-LICAM nem sempre inibem a ação da L1CAM. O presente anticorpo é caracterizado pelo fato de que não estimula a ação da L1CAM, mas inibe a atividade da L1CAM.

Mais preferencialmente, o anticorpo é um novo anticorpo monoclonal A10-A3 ou 4-63.

Em outra concretização, o presente oligonucleotídeo contra a L1CAM, funcionando para suprimir a expressão da L1CAM, é selecionado dentre siRNAs, shRNAs e oligonucleotídeos de sentido negativo contra a L1CAM, que são especificados para a presente composição.

Em uma concretização adicional, células do colangiocarcinoma foram cultivadas em grande escala e injetadas na sola dos pés de camundongos. Os linfócitos foram extraídos dos nódulos linfáticos dos camundongos e fusionados com células tumorais de mieloma para produzir hibridomas de camundongos produzindo anticorpos ligando-se às células do colangiocarcinoma. Em detalhes, as linhagens celulares do

colangiocarcinoma SCK e Choi-CK foram injetadas na sola dos pés de camundongos, e foram extraídos linfócitos dos nódulos linfáticos dos camundongos. Os linfócitos isolados foram fusionados com células de mieloma FO, e foram selecionados clones expressando anticorpos. Dentre os clones selecionados, os sobrenadantes de hibridomas que segregaram anticorpos monoclonais de forma relativamente estável foram testados quanto à capacidade de ligação às células do colangiocarcinoma. O hibridoma de secreção do anticorpo monoclonal assim estabelecido recebeu a designação "hibridoma A10-A3". O hibridoma foi depositado junto uma autoridade depositária internacional, KCTC (Korean Collection for Type Cultures; Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Coréia) em 20 de fevereiro de 2006 e recebeu o número de acesso KCTC10909BP. Separadamente, outro anticorpo reconhecendo a

L1CAM, 4-63, foi obtido usando células tronco embriônicas humanas, e foi descoberto que este se liga ao colangiocarcinoma e às células do carcinoma pulmonar. Um hibridoma segregando o anticorpo 4-63 foi depositado junto ao KCTC e recebeu o número de acesso KCTC10966BP. Em detalhes, descobriu-se que os anticorpos monoclonais se ligam a linhagens celulares do carcinoma como, por exemplo, colangiocarcinoma (vide a FIG. 1), mas não se ligam às células normais, inclusive hepatócitos, HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) ou linfócitos do sangue periférico (vide a FIG. 1). Os anticorpos inibiram o crescimento, a migração ou a invasão do colangiocarcinoma. Além disso, foi observado que um anticorpo anti-LICAM 5G3 se liga às células do colangiocarcinoma, mas inibe o crescimento do câncer apenas com pouca eficiência (vide a FIG. 8), enquanto que outro anticorpo anti-LICam conhecido, UJ127, se liga às células do colangiocarcinoma e, dessa forma inibe o crescimento das células. Esses resultados indicam que os anticorpos anti-LICAM nem sempre inibem a ação da L1CAM.

Em outra concretização da presente invenção, foi observado que o nível de expressão da LlCAM é menor nas linhagens celulares Choi-CK e SCK respectivamente transfectadas com as seqüências de siRNA de 5- TGGTACAGTCTGGGdtdt-3 and 5-

CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3 do que nas mesmas linhagens celulares transfectadas com oligonucleotídeos não- específicos. Além disso, foi observado que um grupo de células cancerosas com o nocaute siRNA de LlCAM teve redução na proliferação, invasão e migração, se comparado a um grupo de células cancerosas que expressou a LlCAM normalmente.

Como comprovado nos Exemplos da presente invenção (refira-se aos Exemplos 5, 6 e 7), os presentes inventores descobriram primeiro que a LlCAM é expressa nas células do colangiocarcinoma até o nível de superexpressão de cerca de 40% nos pacientes com colangiocarcinoma. Também foi revelado pela primeira vez pelos presentes inventores que a LlCAM é um fator de prognóstico ruim que desempenha papel importante na progressão tumoral das células do colangiocarcinoma, aumentando, assim, o risco de morte, e que o EGFR, anteriormente conhecido por ser um fator de prognóstico ruim para o câncer, não é um indicador ruim para o colangiocarcinoma. Dessa forma, os inibidores contra a atividade ou expressão de LlCAM de acordo com a presente invenção podem ser aplicados especificamente ao diagnóstico e tratamento dos cânceres expressos por L1CAM, especialmente o colangiocarcinoma.

Além disso, ensaios de coloração imunohistoquímica mostraram que a LlCAM é expressa em um nível inferior a 10% nas células do carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC). Quando as linhagens celulares do NSCLC expressando LlCAM A549 e NCI-H522 foram tratadas com o anticorpo A10-A3, seu crescimento foi inibido nas proporções de 14% e 24%, respectivamente, o que está bem longe dos 40%, a taxa de inibição aproximada de A10-A3 no crescimento do colangiocarcinoma, demonstrando que a composição da presente invenção é eficaz do ponto de vista terapêutico, especialmente para o colangiocarcinoma. Essa comparação é descrita em detalhes em um Pedido de Patente Coreano (intitulado "A Pharmaceutical Composition for Treating Cholangiocarcinoma, A Method for Inhibiting Growth or Invasion of Cholangiocarcinoma and a Method for Treating Cholangiocarcinoma"), depositado na mesma data que o presente pedido, sendo todo o conteúdo do qual incorporado neste por referência.

Será possível entender melhor a presente invenção por meio dos exemplos a seguir, apresentados apenas para ilustrar a presente invenção, sem ter a intenção de limitá-la. [Modo para a Invenção]

EXEMPLO 1: Cultura das células cancerosas As linhagens de células do carcinoma foram cultivadas usando os meios a seguir, contendo soro bovino fetal a 10% (FBS; Gibco) em uma incubadora a 37°C sob CO2 a 5%. Células do SH-Jl (carcinoma hepatocelular), SCK (colangiocarcinoma), Choi-CK (colangiocarcinoma) e ACHN (adenocarcinoma de células renais) foram cultivadas usando meio MEM (Gibco), e SK-0V3 (adernocarcinoma de ovário) foram cultivadas usando Meio McCoy 5A (Gibco). Células do A549 (carcinoma pulmonar de células não-pequenas) foram cultivadas em meio F12K de Ham, e células de NCI-H522 (carcinoma pulmonar de células não pequenas), DMSl 14 (carcinoma pulmonar de células pequenas), DMS53 (carcinoma pulmonar de células pequenas) e NCI-H69 (carcinoma pulmonar pulmão de células pequenas) foram cultivadas em meio RPMI1640. As linhagens celulares SH-Jl, SCK e Choi-CK foram cedidas pelo Dr. Daegon Kim (Medicai School, Chonbuk National University), e outras linhagens celulares do carcinoma foram adquiridas da ATCC. Hepatócitos normais e HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana), que foram adquiridos da Cambrax, foram cultivados usando meio EGM-2 (Hyclone) contendo FBS a 10% (Gibco) em uma incubadora a 37°C sob CO2 a 5%. Linfócitos do sangue periférico (PBL) foram isolados do sangue humano por centrifugação em gradiente de Ficoil.

EXEMPLO 2: Preparação do anticorpo monoclonal A10-A3 ligando-se às células cancerosas Choi-CK e SCK As células de carcinoma Choi-CK e SCK cultivadas foram separadas usando um tampão de dissociação celular (Invitrogen), e 5 X 105 células foram suspensas em 30 μΕ de PBS. Camundongos Balb/c receberam a injeção de células Choi-CK na sola do pé direito, e de células SCK na sola do pé esquerdo após 3 dias. Os camundongos foram então estimulados seis vezes em intervalos de 3 a 4 dias, e foram finalmente imunizados um dia antes da fusão celular. A cultura das células de mieloma FO (ATCC, EUA), a serem fusionadas com as células do nódulo linfático, foi iniciada em DMEM contendo FBS a 10% (Gibco) duas semanas antes da fusão celular. Os nódulos linfáticos popliteais foram removidos dos camundongos imunizados com células Choi-CK e SCK, bem lavados com o meio DMEM (Gibco) e cortados em pedaços pequenos. A suspensão celular foi transferida para um tubo de 15mL. As células do mieloma FO foram coletadas por centrifugação, suspensas em 10 mL de meio DMEM, e contadas junto com as células do nódulo linfático. Logo em seguida, IO6 células de mieloma FO e IO7 células do nódulo linfático foram misturadas em um tubo de 50 mL e centrifugadas a 200 χ g por 5 minutos. Após o sobrenadante ser descartado, o tubo foi incubado por 2 minutos em um béquer contendo água a 37°C. Após uma leve batida no tubo para soltar o precipitado celular, 1 mL de PEG (Gibco) foi lentamente adicionado durante um minuto ao tubo, enquanto que o tubo foi suavemente agitado em banho-maria a 37°C. Após as células serem centrifugadas a 100 χ g por 2 minutos, 5 mL de meio DMEM foram adicionados lentamente durante 3 minutos ao tubo, e 5 mL de meio DMEM foram também adicionados lentamente durante 2 minutos. As células foram então coletadas por centrifugação a 200 χ g. De modo a aumentar a eficiência da fusão celular e a viabilidade celular, o meio basal (DMEM + FBS a 20%) foi suplementado antecipadamente com o Fator de Clonagem de Hibridoma a 10% (BioVeris, EUA). As células recuperadas foram cuidadosamente suspensas em 30 mL do meio normal (DMEM + FBS a 20%) suplementado com o Fator de Clonagem de Hibridoma. Após a suspensão celular ser incubada em uma incubadora de CO2 a 37°C por 30 minutos, 10 células (70 μΐ) foram divididas em alíquotas em uma placa de 96 poços e incubadas em uma incubadora de CO2 a 37°C. No dia seguinte, 70 μΐ de meio HAT foram adicionados a cada poço, e a placa foi observada quanto a se colônias foram formadas no meio HAT em um intervalo de 3 dias por um período de aproximadamente 2 semanas. Os sobrenadantes de cultura das colônias de hibridoma, obtidos pelo fusionamento de linfócitos, isolados dos nódulos linfáticos de camundongos imunizados com células Choi-CK e isolados dos nódulos linfáticos de camundongos imunizados com células SCK com células de mieloma, foram usados nos testes seguintes.

Foram selecionados clones expressando anticorpos, usando ELISA sanduíche (Imunoensaio Enzimático). 100 μΕ da cultura de hibridoma foram adicionados a uma placa revestida com 2 μg/mL de anticorpo anti IgG ou IgM de camundongo e deixados reagir a 37°C por 1 hora. A placa foi então incubada por uma hora em uma diluição de 1:5.000 de anticorpo anti-IgG ou IgM de camundongo conjugado à peroxidase de raiz-forte (HRP; Sigma). Após a placa ser lavada com tampão fosfato contendo Tween 20 a 0,08%, uma solução de substrato contendo OPD (Sigma) e H202 foi adicionada a cada poço, e a absorbância foi medida a 492 nm usando um espectrofotômetro de modo a selecionar clones produzindo anticorpos.

Dentre os clones selecionados, os sobrenadantes

de cultura de hibridomas que segregaram anticorpos monoclonais de forma relativamente estável foram testados quanto à capacidade de ligação às células SCK e Choi-CK. Detalhadamente, as células Choi-Ck cultivadas foram tratadas com um tampão de dissociação celular (Gibco) por 20 minutos a 37°C para serem dissociadas em células únicas, e passaram por um filtro de 40 μιη. 5

X IO5 células foram usadas na citometria de fluxo. As células SCK e Choi-CK, dissociadas em células únicas, foram suspensas em PBA (BSA a 1% em PBS), e os sobrenadantes de anticorpo foram deixados reagir a 4°C durante minutos. Após as células serem centrifugadas a 1200 rpm por minutos, 100 μΐ, do sobrenadante foram descartados, e as células foram deixadas reagir com uma diluição de 1:200 de anti- Ig-FITC de camundongo (BD) a 4°C por 30 minutos. Após as células serem lavadas com PBA duas vezes, células negativas de iodeto de propídio (PI) foram selecionadas e avaliadas quanto à capacidade de ligação às células SCK e Choi-CK usando um FACS calibre. Vários hibridomas segregando anticorpos ligando- se às células SCK e Choi-CK foram selecionados, estabilizados por subcultura contínua e então subclonados. Um hibridoma segregando um anticorpo, A10-A3, mantendo de forma estável a especificidade às células SCK e Choi-CK pela subclonagem, foi selecionado. O hibridoma segregando o anticorpo A10-A3 recebeu a designação "hibridoma A10-A3". O hibridoma foi depositado junto à KCTC (Korean Collection for Type Cultures; Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, Korea)) em 20 de fevereiro de 2006 e recebeu o número de acesso KCTC10909BP.

EXEMPLO 3: Avaliação da expressão da superfície celular de LlCAM em linhagens celulares do carcinoma pulmonar

A linhagem celular A10-A3 do hibridoma foi cultivada em um meio isento de soro (PFHM, Invitrogen), e o anticorpo A10-A3 segregado foi purificado usando uma coluna de proteína G-Sepharose (Pharmacia, Suécia) (Fike e col., Focus 12:79, 1990). O anticorpo A10-A3 purificado foi avaliado quanto à capacidade de ligação a células de carcinoma usando a coloração fluorescente de acordo com o mesmo método que no Exemplo 3 (FIG. 1). Na FIG. 1, os picos vazios contornados com linhas sólidas representam amostras tratadas com os anticorpos monoclonais A10-A3 e A-63 e os anticorpos 5G3 (Pharmigen, San Diego, EUA) e UJ127 (Chemicon) anti-LICAM conhecidos, enquanto que o pico preenchido é a fluoresceína de fundo na presença do anticorpo secundário sozinho. A capacidade de ligação dos anticorpos A10-A3, 4-63, 5G3 e UJ127 para várias células de carcinoma foi analisada usando o FACS calibre. A análise FACS revelou que os anticorpos monoclonais se ligam às células do carcinoma pulmonar NCI-H522, A549, DMSl 14, DMS53 e NCI-H69 (painéis A, B, C e D, FIG. 1), embora não se liguem às células do carcinoma ACHN, às células normais, aos hepatócitos, HUVEC ou aos linfócitos do sangue periférico (PBL).

EXEMPLO 4: Isolamento e identificação do antígeno reconhecido pelo anticorpo monoclonal A10-A3

EXEMPLO 4-1: Isolamento do antígeno Uma proteína de superfície celular reconhecida

pelo anticorpo monoclonal A10-A3 foi isolada como se segue. Primeiramente, as células Choi-CK foram lavadas com PBS e biotiniladas com EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockford, IL). As células foram incubadas em um tampão de Iise (25mM de Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, Nonideto P-40 a 1%, 2 μg/mL de aprotinina, 100 μg/mL de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 5 μg/mL de leupeptina) a 4°C durante 20 minutos. Após as células serem centrifugadas para remover os resíduos celulares, o sobrenadante foi recuperado, e as concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce). Deixou-se o lisado celular reagir com 20 μΐ de proteína G plus-sefarose (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz) a 4°C durante 2 horas, sendo centrifugado para remover proteínas ligando-se não especificamente à proteína G plus-sefarose. O sobrenadante foi recuperado e deixado reagir com cerca de 1 μg de anticorpo a 4°C durante 12 horas. Vinte μΐ, da proteína G plus- sefarose foram adicionados à mistura de reação, seguido de incubação a 4°C por 2 horas. A mistura de reação foi centrifugada e recuperou-se o precipitado. O precipitado recuperado foi lavado com tampão de Iise celular mais de dez vezes, e as proteínas remanescentes foram separadas usando SDS-PAGE a 10%.

As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas ao Western blotting. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com PBST contendo leite desnatado a 5% (PBS + Tween 20 a 0,1%) durante 1 hora, e lavada com PBST mais de duas vezes. O blot foi então incubado durante 1 hora com o conjugado Streptadivina-peroxidase de raiz forte (HRP) (1:1.500; Amersham Biosciences). Após o blot ser lavado com PBST cinco vezes, as proteínas biotiniladas foram reveladas com um reagente ECL (Amersham Biosciences).

Descobriu-se que o anticorpo A10-A3 se liga a uma proteína de cerca de 200 kDa (painel A, FIG. 2). De modo a coletar uma proteína imunoprecipitada pelo anticorpo A10-A3, os Usados celulares de 1 X IO8 células Choi-CK foram sujeitos à imunoprecipitação de acordo com o mesmo método conforme descrito acima e submetidos à eletroforese em um gel SDS- PAGE. 0 Gel foi corado com azul Coomassie G250 (Biorad).

EXEMPLO 4-2: Identificação do antígeno usando espectrometria de massa 0 gel SDS contendo uma proteína

imunoprecipitada pelo anticorpo A10-A3 foi corado com Coomassie G250 (BIO-RAD). Uma banda protéica foi removida do gel, lavada com metanol a 30% por 5 min e cortada em pequenos pedaços. Os segmentos de gel foram desidratados em acetonitrilo a 100% por 10 min, e seco completamente em uma centrífuga a vácuo por 30 min. Os segmentos de gel secos foram incubados com 300 ng de tripsina (Promega) em 50 mM de bicarbonato de amônio por 16 horas a 37°C. Os peptídeos digeridos foram extraídos com 100 μΐ de bicarbonato de amônio 50 mM três vezes, e secos na centrífuga a vácuo. A mistura de peptídeos foi analisada usando a espectrometria de massa em tandem por tempo de vôo do tipo quadripolar por "eletrospray" (ESI Q-TOF MS/MS) (Q-TOF micro, MicroMass). A proteína reconhecida pelo anticorpo A10-A3 foi identificada como a molécula de Adesão Celular Ll (LlCAM) (FIG. 3). Na FIG. 3, a região sublinhada representa a seqüência de aminoácidos realmente identificada pela Q-TOF. Desse modo, como descrito no Exemplo 3-1, um lisado de células Choi-CK marcadas com biotina foi imunoprecipitado com o anticorpo monoclonal anti- LlCAM JU 127.11, adquirido da Chemicon (EUA), e o blot foi revelado com ECL. Como mostra o painel A na FIG. 2, foi verificado que o anticorpo A10-A3 e o anticorpo anti-LICAM imunoprecipitam uma proteína no mesmo tamanho molecular de cerca de 200 kDa.

EXEMPLO 4-3: Identificação do antígeno L1CAM usando Western blotting

Com o intuito de confirmar que o anticorpo A10-A3 reconhece L1CAM, a imunoprecipitação foi realizada em um lisado de células Choi-CK usando o anticorpo A10-A3.

Deixou-se o lisado celular reagir com 20 μΐ de proteína G plus-sefarose (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz) a 4°C durante 2 horas, sendo centrifugado para remover proteínas ligando-se não especificamente à proteína G plus-sefarose. O sobrenadante foi recuperado e deixado reagir com cerca de 1 μg de anticorpo a 4°C durante 12 horas. Vinte μΐ de proteína G plus- sefarose foram adicionados à mistura de reação, seguido de incubação a 4°C durante 2 horas. A mistura de reação foi centrifugada, recuperando-se o precipitado (pré-limpeza da FIG. 2). O precipitado recuperado foi lavado com tampão de Iise celular mais de dez vezes, separando-se as proteínas restantes em SDS-PAGE a 10% sem mercaptoetanol.

As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e sujeitas ao Western blotting. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com PBST contendo leite desnatado a 5% (PBS + Tween 20 a 0,1%) por 1 hora, e lavada com PBST mais de duas vezes. O "blot" foi então incubado por 1 hora no anticorpo anti-LICAM UJ127 conhecido (Chemicon) como o anticorpo primário. Após ser lavado com PBST cinco vezes, o "blot" foi incubado por 1 hora com conjugado HRP-anti-IgG de camundongo (1:1.500; Sigma). Após o "blot" ser lavado com PBST cinco vezes, as proteínas biotiniladas foram reveladas com um reagente ECL (Amersham biosciences). Verificou-se que o anticorpo anti-LICAM se liga a uma proteína de cerca de 200 kDa, que foi imunoprecipitada com o anticorpo A10-A3 (painel B, FIG. 2). Esse resultado confirmou que o anticorpo A10-A3 reconhece a L1CAM. EXEMPLO 4-4: Expressão da LlCAM solúvel

De modo a construir um vetor de expressão para expressar LlCAM solúvel, o RNA total foi isolado das células de carcinoma Choi-CK usando um kit de extração de RNA (Roche co.). Usando um kit RT-PCR (Roche co.), a PCR foi realizada usando o RNA total isolado como modelo, dois iniciadores terminais Ig-dom-F (5'-GAG GAG GAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-31', 38 mer) e Ll-Fn-Stop-R (5'- CTC TAG AGT TCT CGA GTC AGA GCC TCA CGC GGC C- 3 , 34 mer), e pfu polimerase (Solgent co.). As condições da PCR incluíram pré-incubação a 95°C por 5 min, 25 ciclos de 30 seg a 95°C, 30 seg a 58°C e 2 min a 72°C, e, finalmente, alongamento por 10 min a 72° C.

O fragmento de DNA Ll solúvel amplificado foi digerido com EcoR T e Xho I e submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1%. O fragmento de DNA Ll foi removido do gel e purificado com um kit de purificação de gel (Intron co.). O fragmento de DNA Ll digerido foi ligado a um vetor de expressão pJK-dhfr2 (Aprogen), digerido com EcoR I e Xho I, usando T4 DNA ligase (Roche co.) a 16°C por 30 min, e transformado em E. coli DH5a por choque térmico. O DNA plasmideal foi isolado das células transformadas, e sua seqüência de DNA foi determinada. O sequenciamento do DNA revelou que o cDNA da LlCAM solúvel foi clonado com êxito. O vetor de expressão assim obtido foi denominado "monômero pJK-dhfr2- Ll".

O DNA do monômero pJK-dhfr2-Ll foi transfectado em células HEK293T (ATCC CRLl 1268, daqui em diante chamadas de 293T), de modo a expressar a LlCAM solúvel na forma monomérica.

Dez μg do DNA de vetor de expressão e Lipfectamine 2000 (Invitrogen co.) foram adicionados individualmente a 500 μΐ do meio Opti-MEM (Gibco BRL), e foram deixados em repouso à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, o DNA vetorial foi misturado com lipofectamina, e a mistura deixada reagir à temperatura ambiente por 15 min. Durante a formação dos complexos DNA-Lipofectamina, as células 293T foram lavadas cuidadosamente com PBS (pH 7,4), sendo adicionado o meio Opti-MEM cuidadosamente às células, em seguida removendo-o. Os complexos DNA-Iipofectamina foram misturados com 4 mL de meio Opti-MEM, e gotejados cuidadosamente sobre as células. As células foram incubadas em uma incubadora a 37°C. Após 6 horas, as células foram realimentadas com 5 mL de meio Opti-MEM e adicionalmente cultivadas por 3 dias.

EXEMPLO 4-5: Avaliação da especificidade de ligação dos anticorpos à LlCAM solúvel Um fluido de cultura das células 293T

expressando a LlCAM solúvel e outro fluido de cultura das células 293T não expressando a LlCAM solúvel foram submetidos a SDS-PAGE 10% e então ao Western blotting. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com TBST contendo leite desnatado a 5% (TBS + Tween 20 0,05%) a 4°C por 12 horas, e lavada com TBST mais de duas vezes. O "blot" foi então incubado por 1 hora com anticorpos primários, os anticorpos UJl 27 (Chemicon) e 5G3 (Pharmingen) anti-LICAM conhecidos e os anticorpos A10-A3 e 4-63, cada anticorpo diluído em 1:10.000 em TBST contendo leite desnatado a 5%. Após ser lavado com TBST cinco vezes, o "blot" foi incubado por 1 hora com conjugado HRP-anti-IgG de camundongo (1:5.000; Sigma). O "blot" foi lavado com PBST cinco vezes e revelado com um reagente ECL (Amersham biosciences). Verificou-se que cada anticorpo se liga à LlCAM solúvel de cerca de 200 kDa (painel C, FIG. 2). Além disso, a ELISA para a cultura de células expressa por Ll usando os anticorpos acima revelou que cada anticorpo tem uma especificidade de ligação para a LlCAM solúvel expressa.

EXEMPLO 5: Coloração imunohistoquímica do

tecido com Colangiocarcinoma Seções com 3 μπι de espessura foram preparadas a partir dos tumores para a coloração imunohistoquímica dos tecidos com colangiocarcinoma. As seções foram colocadas sobre uma lâmina revestida com poli-L- lisina e secas a 60°C por 3 horas. As seções foram então desparafinadas em xileno à temperatura ambiente por 5 min três vezes, e hidratadas em álcool 100%, 90%, 80% e então 70% por 1 minuto cada uma. A lâmina foi imersa em uma solução de recuperação do alvo (DAKO, Carpinteria, CA) para recuperar a antigenicidade, e lavada com TBST (Tris-solução salina tamponada-Tween 20), que foi pré-fervida por 4 minutos usando uma panela de pressão. Um Sistema de Amplificação de Sinal com Tiramida livre de biotina, CSA II (DAJO, Carpinteria, CA) foi usado para a detecção altamente sensível para coloração imunohistoquímica. A lâmina foi incubada em peróxido de hidrogênio a 3% por 5 min para bloquear a ligação não-específlca dos anticorpos. Após serem lavadas com TBST duas vezes por 5 min cada, as seções foram incubadas em um bloco de proteínas isento de soro suficiente por 5 min para bloquear a ligação não- específlca das proteínas. As seções dos tecidos foram incubadas com anticorpos primários (A10-A3 e 4-63, diluição de 1:50) por min, e então com imunoglobulina-HRP anti-camundongo por min. As seções foram então incubadas com um reagente de amplificação e HRP anti-fluoresceína por 15 minutos cada uma. Finalmente, as seções foram coradas com DAB por 5 min e contra-coradas com hematoxilina de Meyer, seguido da lavagem com TBST por 5 min duas vezes. Um controle negativo foi corado de acordo com o mesmo procedimento que o descrito acima, com a exceção de que se utilizou soro normal de ovelha não contendo o anticorpo primário ou soro IgGl normal de camundongos em vez do anticorpo primário. Verificou-se que nenhum dos anticorpos A10-A3 ou 4-63 se liga aos tecidos normais, mas foi observado que eles se ligam aos tecidos com colangiocarcinoma (FIG. 4).

Esse resultado explica a expressão da LlCAM nos tecidos com colangiocarcinoma.

A expressão de LlCAM foi observada em 45,2% de 42 pacientes com colangiocarcinoma intra-hepático e 39,8% de 103 pacientes com colangiocarcinoma extra-hepático, conforme analizado por coloração imunohistoquímica usando o anticorpo A10-A3 (FIG. 5). Particularmente, a LlCAM é expressa em um nível elevado na fronte invasiva, o que explica a iniciação da metástase do colangiocarcinoma (FIG. 4).

EXEMPLO 6: Análise estatística para a taxa de expressão de LlCAM no Colangiocarcinoma e para o índice de sobrevivência dos pacientes com Colangiocarcinoma

A correlação entre a taxa de expressão de LlCAM e o índice de sobrevivência foi analizada em pacientes sofrendo de colangiocarcinoma extra-hepático (60 casos). Foi verificado que os grupos de pacientes apresentando altas taxa de expressão de LlCAM dimunuíram com significância estatística na sobrevivência geral (OS) e nas sobrevivência livre de doença (FDS), isto é, houve aumento no risco de morte se comparado àqueles com baixas taxas de expressão de LlCAM (FIG. 6). Como visto no gráfico de sobrevivência, há grandes diferenças e significância estatística na OS de 2 anos entre os pacientes com colangiocarcinoma apresentando taxas de expressão de LlCAM altas e baixas. Além disso, a DFS de 2 anos dos pacientes com colangiocarcinoma com baixas taxas de expressão de LlCAM foi diferente, com significância estatística em relação a dos pacientes com colangiocarcinoma com altas taxas de expressão de L1CAM.

Em contrapartida, não há significância estatística na correlação entre a sobrevivência dos pacientes e a taxa de expressão do EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), conhecido por ser superexpresso no colangiocarcinoma ou em outros tumores (FIG. 6). Esses resultados implicam que os anticorpos para LlCAM são úteis para o diagnóstico e tratamento do colangiocarcinoma e podem ser aplicados ao diagnóstico precoce da metástase do colangiocarcinoma, aumentando assim seu efeito terapêutico sobre a doença. É evidente, com base nos dados da análise estatística para correlação entre a taxa de expressão de LlCAM e a sobrevivência, que a maior mortalidade ocorre nos pacientes com altas taxas de expressão de LlCAM se comparado aos que possuem baixas taxas de expressão de L1CAM.

Demonstrando que LlCAM é um fator de prognóstico ruim, os resultados indicam que LlCAM pode ser um alvo para o tratamento do colangiocarcinoma. Embora seja expresso em nível elevado no colangiocarcinoma, o EGFR, por sua vez, que é usado como alvo de agentes terapêuticos para uso clínico atual no tratamento do câncer de cólon (por exemplo, cetuximab, um anticorpo quimérico para EGFR), demonstrou não ser um fator de prognóstico ruim para o colangiocarcinoma, como se deduz da correlação entre as taxas de expressão de EGFR e os índices de sobrevivência. Isto é a prova de que nem todas as moléculas que são superexpressas no câncer são fatores de prognóstico ruins para o câncer, e, portanto, importantes alvos para seu tratamento.

EXEMPLO 7: Efeito da supressão da expressão de LlCAM sobre as células do colangiocarcinoma

EXEMPLO 7-1: Inibição da expressão de LlCAM em células do colangiocarcinoma usando siRNAs A expressão de LlCAM foi nocauteada nas

células Choi-CK e SCK. Para esse fim, as células do carcinoma foram transfectadas com dois oligonucleotídeos de siRNA para LlCAM (5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3' e 5'- CAGCMCTTTGCTCAGAGGdtdt-3') ou um oligonucleotídeo não-específico (5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt-3'), e cultivadas por 72 horas. O "nocaute" de LlCAM foi estimado por citometria de fluxo, RT-PCR e Western blotting usando o anticorpo A10-A3. Como resultado, comparado a um controle tratado com o siRNA não-específico, a medição das células Choi- CK e SCK tratadas com siRNAs apontou para a redução na expressão total de LlCAM e no nível LlCAM de superfície celular (painel A, FIG. 7).

EXEMPLO 7-2: Avaliação da atividade das células do colangiocarcinoma após o tratamento com siRNA contra LICAM

A proliferação, invasão e migração celular foram comparadas entre as células do colangiocarcinoma transfectadas com o siRNA contra LlCAM e com o siRNA não- específico. O grau de proliferação foi estimado contando-se o número de células com o auxílio de Azul Tripfano 72 horas após a cultura do mesmo número de células. Os graus de invasão e migração foram analisados usando um kit de ensaio de invasão celular de 24 poços QCM (Chemicon) e um kit de ensaio de migração celular colorimérico de 24 poços QCM (Chemicon), respectivamente. As células do carcinoma, nas quais LlCAM foi nocauteada pelo siRNA, apresentaram um grau reduzido de proliferação, invasão e migração se comparado às células do carcinoma expressando LlCAM a níveis normais. Esses resultados indicam que a LlCAM desempenha um papel no crescimento, migração e invasão das células do colangiocarcinoma (painel B, FIG. 7).

EXEMPLO 8: Inibição do anticorpo específico à LlCAM contra o crescimento das células do Colangiocarcinoma Os anticorpos anti-LICAM foram avaliados

quanto a seus efeitos inibitórios sobre o crescimento das células do colangiocarcinoma. As células Choi-CK e SCK, às quais o anticorpo A10-A3 se liga, foram utilizadas neste teste, enquanto uma linhagem celular do carcinoma de ovário (SK-OV-3) e ACNH serviram de controle positivo e controle negativo, respectivamente. Essas células foram semeadas a uma densidade de 2 X 10 células/poço em placas de 24 poços contendo 3 mL de um meio por poço, e cultivadas. O anticorpo monoclonal foi adicionado a cada poço a uma concentração de 10 μg/mL antes de as células serem incubadas em uma incubadora a 37°C por 10 io dias. Após serem coletadas, as células, vivas e mortas, foram contadas usando Azul Tripfano 0,2% e as taxas de sobrevivência das células foram expressas como porcentagens do número total de células. Quando tratadas com o anticorpo A10-A3, as células Choi-CK e SCK cresceram a uma taxa distintivamente reduzida, como as células SK-OV3, mas as células ACHN se proliferaram normalmente (painel A, FIG. 8). Por outro lado, foi verificado que o anticorpo 4-63 inibe o crescimento das células do colangiocarcinoma (painel B, FIG. 8).

Ao tratar as células do colangiocarcinoma com o mesmo, o anticorpo UJl27 (Chemicon), conhecido por se ligar especificamente à L1CAM, inibiu consideravelmente o crescimento das células cancerosas. Entretanto, no caso do 5G3 (Pharmingen), que também se liga especificamente à L1CAM, o crescimento da célula do colangiocarcinoma (Choi-CK) foi inibido apenas ligeiramente (painel C, FIG. 8). Foi verificado que o anticorpo 5G3 se liga à célula Choi-SK (painel C, FIG. 1). Esses resultados indicam que a ligação dos anticorpos anti-LICAM às células tumorais nem sempre inibe o crescimento das células tumorais.

EXEMPLO 9: Efeitos inibitórios dos anticorpos específicos à LlCAM sobre a invasão e migração das células do Colangiocarcinoma

Um ensaio de invasão celular foi realizado usando um kit de ensaio de invasão celular de 24 poços QCM (CHEMICON). A camada ECM de cada inserto foi reidratada com 300 μί de meio isento de soro pré-aquecido (RPMI, 10 mM HEPES, pH 7,4) à temperatura ambiente por 30 min. As células Choi-CK, SCK, SK-IV3 e ACHN foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com 3 mL de tripsina-EDTA em uma incubadora a 37°C.

As células separadas foram coletadas e

ajustadas a uma densidade de 1 X 10 células em 200 μΙ, de meio de invasão (RPMI, 10 mM de HEPES, pH 7,4, BSA 0,5%). As células foram então inseridas em cada inserto e incubadas com o anticorpo A10-A3, o anticorpo 4-63, com o anticorpo 5G3 (10 μg/mL) e IgG normal de camundongo (10 μg/mL). A câmara inferior foi preenchida com um meio de invasão suplementado com FBS a 10%, e incubada em uma incubadora a 37°C por 72 horas. Em seguida, as células e o meio remanescente em cada inserto foram removidos, e cada inserto foi transferido para um novo poço. Cada inserto foi colocado em 225 μι de solução de separação celular pré-aquecida, e incubado em uma incubadora a 37°C durante 30 min. O inserto foi agitado para separar completamente as células restantes, e 75 μί de tampão lise/solução de corante foram adicionados a cada poço contendo células e à solução de separação celular, seguido de incubação à temperatura ambiente por 15 min. 200 μί da mistura foram transferidos para uma placa de 96 poços, e a fluorescência foi lida a 480/520 nm. Verificou-se que o anticorpo A10-A3 inibe a invasão celular de Choi-SK, SCK e SK-OV3, mas não induz a inibição da invasão celular (painel A, FIG. 9). Além disso, o anticorpo 4-63 reduziu a invasão das células Choi-SK (painel A, FIG. 9). O anticorpo 5G3 inibiu a invasão das células Choi-SK com menos eficiência que os anticorpos A10-A3 e 4-63 (painel A, FIG. 7).

Um ensaio de migração celular foi realizado pelo mesmo procedimento descrito acima, com a exceção de que o colágeno tipo-I foi disposto em camadas a uma concentração de g/mL no fundo do inserto. Observou-se que o anticorpo AlO- A3 inibe a migração celular de Choi-SK, SCK e SK-OV3, mas não inibe a migração celular de ACHN (FIG. 9). Além disso, os anticorpos inibiram a migração de Choi-SK, SCK e SK-OV-3 (FIG. 9).

EXEMPLO 10: Efeito inibitório do anticorpo A10-A3 sobre a transdução de sinal nas células do Câncer

EXEMPLO 10-1: Inibição do anticorpo A10-A3 contra a expressão de PCNA das células cancerosas O Western blotting foi realizado para examinar se a expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), responsável pela proliferação celular, foi inibida pelo anticorpo A10-A3. Sob esse aspecto, as células Choi-SK foram incubadas por 72 horas com A10-A3 ou IgG 10, coletadas e dissolvidas em um tampão de Iise celular. A concentração protéica foi determinada usando um kit de ensaio protéico BCA (ácido bicinconínico) (Pierce). 40 μg da proteína foram corridos sobre SDS-PAGE a 8% e transferidos para uma membrana de nitrocelulose a 25 V por 90 min. Os blots foram bloqueados durante a noite a 4°C em leite desnatado a 5% e incubados por 1 hora com anticorpo anti-PCNA monoclonal de camundongo (Novocastra Laboratories 1:500) e o anticorpo anti-P-actina (Oncogene, 1:4000). Em seguida, a membrana foi tratada com anticorpo conjugado à peroxidase de raiz-forte anti-camundongo (Cell Signaling, 1:1000) e lavada com PBST antes de visualizar o PCNA e a β-actina com um reagente de quimioluminescência aperfeiçoado (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech). Observou- se a expressão significativamente reduzida do PCNA apenas nas células Choi-SK tratadas com o anticorpo A10-A3.

EXEMPLO 10-2: Inibição da fosforilação por ERX da expressão do PCNA

O Western blotting foi realizado para determinar se o anticorpo A10-A3 reduz a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), que está envolvida no crescimento, na migração e na sobrevivência das células tumorais. As células Choi-SK foram incubadas com 10 μ§/ιτιΙ, do anticorpo A10-A3 ou IgG de camundongo por 72 horas, colhidas e submetidas à Iise com tampão de Iise celular. As concentrações protéicas foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce), e 40 μg de proteínas foram corridas sobre SDS-PAGE a 12%. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose a 25 V por 90 min. Os blots foram bloqueados com leite desnatado a 5% a 4°C durante a noite, e incubados durante a noite com o anticorpo policlonal de coelho anti-fosfo MAPK (Ab cam, diluído em 1:1000) em leite desnatado a 1%. A mesma quantidade de proteínas foi tratada de acordo com o mesmo procedimento descrito acima a fim de investigar a expressão da MAPK não fosforilada, e a membrana de nitrocelulose bloqueada foi incubada com anticorpo anti-MAPK (Ab cam, diluído em 1:1000) por 1 hora. Os blots foram incubados com anticorpo conjugado com anti-HRP de coelho (Cell Signaling, diluído em 1:10000) por 1 hora. Após os blots serem lavados com PBST, fosfo-MAPK e MAPK foram detectados usando ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Dentre as células Choi-CK expressando a mesma MAPK, apenas as que foram tratadas com o anticorpo A10-A3 diminuíram notavelmente no nível de fosfo-MAPK (FIG. 10A).

EXEMPLO 10-3: Inibição da fosforilação da AKT pelo anticorpo A10-A3 O Western blotting foi realizado a fim de

determinar se o anticorpo A10-A3 diminui a fosforilação da AKT, que está envolvida na sobrevivência das células tumorais. As células Choi-SK foram incubadas com 10 μg/mL do anticorpo A10-A3 ou IgG de camundongo por 1 hora, colhidas e submetidas à Iise com tampão de Iise celular. As concentrações protéicas foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA (Pierce), e 40 μg de proteínas foram corridas em SDS-PAGE a 12%. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose a 25 V por 90 min. Os blots assim formado foram bloqueados com leite desnatado a 5% a 4°C durante a noite, e incubados durante a noite com anticorpo anti-fosfo Akt policlonal de coelho (Ab cam, diluído em 1:1000) e anti-Akt policlonal de coelho (Abcam, diluído 1:1000) em leite desnatado a 1%, seguido da reação com HRO anti-IgG de coelho (Santa Cruz, diluído em 1:1000) por 1 hora. Após os blots serem lavados com PBST, fosfo-Akt e e o Akt total foram detectados usando ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Os níveis de fosfo-Akt diminuíram notavelmente apenas nas células Choi-CK tratadas com o anticorpo A10-A3 (FIG. 10B).

EXEMPLO 10-4: Inibição da ativação da FAK pelo anticorpo AlO-A3

O Western blotting foi realizado a fim de determinar se o anticorpo A10-A3 diminui a fosforilação da quinase de adesão focai (FAK), que desempenha papel importante no crescimento e migração das células tumorais. As células Choi- SK e SCK foram incubadas com 10 μg/mL do anticorpo A10-A3 por 0,5, 1, 1,5 e 2 horas, colhidas e submetidas à Iise com tampão de Iise celular. As concentrações protéicas foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA (Pierce), e 40 μg de proteínas foram corridas em SDS-PAGE a 7,5%. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose a 25 V por 90 min. Os blots assim formados foram bloqueados com leite desnatado a 5% a 4°C durante a noite, e incubado durante a noite com o anticorpo policlonal de coelho anti-fosfo FAK (Ab cam, diluído em 1:1000) em leite desnatado a 1% e então com anti-β- actina (Oncogene, diluído em 1:4000) por 1 hora. Os blots foram então incubados com anticorpo conjugado com anti-HRP de coelho (Cell Spring, diluído em 1:10000) por 1 hora. Após o blot ser lavado com TBST, os níveis de fosfo-FAK e β-actina foram detectados usando o agente de quimioluminescência aperfeiçoado (ECL) (Amersham Pharmmacia Biotech). Foi observado que ambas as células Choi-CK e SCK tratadas com o anticorpo AlO- A3 diminuíram no nível de fosfo-FAK (FIG. 10C).

EXEMPLO 11: Ensaio do anticorpo A10-A3 para atividade inibitória contra células cancerosas no modelo de camundongo

Camundongos nus Balb/c nu/nu, com idade

entre 6 e 8 anos e pesando de 18 a 22 g, foram adquiridos da Central Lab Animal Inc. da Japan SLC e aclimados por uma semana em um laboratório do Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology. As células Choi-CK (3x10) foram transplantadas por via subcutânea nos camundongos e cultivadas até uma massa tumoral com tamanho de 390 mm no vigésimo dia (Fig. 10Α). O volume do tumor foi estimado de acordo com a fórmula V=eixo longo (mm) χ eixo curto (mm) χ altura (mm) χ 1/2. No dia final, os camundongos foram sacrificados com gás CO2 e os tumores foram separados e pesados. Os pesos corporais dos camundongos também foram medidos para determinar a toxicidade. Os desvios padrão (SDs) e os valores de ρ foram avaliados usando ANOVA (Prism, GraphPad Software, EUA) e teste T de student.

Quando o anticorpo A10-A3 foi injetado a uma dose de 10 mg/kg em uma veia de cauda três vezes por semana a partir do dia 1, foram observados potentes efeitos anticâncer até o dia 20 (painel A, FIG. 1). Anticorpos IgG de camundongo foram injetados na mesma dose como controle. O volume padrão do tumor foi medido como sendo 232 mm, o que explica a atividade anticâncer cerca de 40% maior do que o controle (FIG. 1 IA). No dia final (Dia 20), os tumores foram separados e pesados (Painel B, FIG. 11). Os pesos padrão dos tumores do controle e do grupo administrado com A10-A3 foram de 872 mg e 516 mg, respectivamente, o que explica o fato de que a atividade anticâncer do anticorpo A10-A3 ter sido 40% maior do que a do controle.

Os camundongos nus foram monitorados em relação ao peso corporal por 20 dias a fim de prever a toxicidade do A10-A3. Além disso, o comportamento dos camundongos foi observado a olho nu (painel D, FIG. 11). Comparado ao controle no Dia 20, foi observado que os camundongos tratados com o anticorpo de interesse não passaram por alterações no peso corporal ou comportamentos anormais.

[Aplicabilidade Industrial]

Como descrito até agora, foi descoberto pela primeira vez na presente invenção que a LlCAM que é expressa na superfície celular do colangiocarcinoma desempenha importante função no crescimento e invasão do câncer e é um fator de prognóstico ruim para o colangiocarcinoma. Portanto, os anticorpos, ligando-se à proteína LlCAM na superfície celular do colangiocarcinoma ou siRNAs, oligonucleotídeos de sentido negativo ou shRNAs, suprimindo a expressão de LlCAM nas células do colangiocarcinoma, e uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos de acordo com a presente invenção, podem ser aplicados ao tratamento do colangiocarcinoma, pois foi comprovado que eles inibem o crescimento, a invasão e a migração do colangiocarcinoma.

Claims (8)

1. - Composição farmacêutica para inibição do crescimento ou metástase do colangiocarcinoma, caracterizada por compreender um inibidor da atividade ou expressão de L1CAM, o referido inibidor da atividade de LlCAM sendo selecionado dentre um anticorpo anti-LICAM inibindo a atividade de L1CAM, fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo anti-LICAM, variantes do anticorpo anti-LICAM e variantes dos fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo anti- L1CAM, o referido inibidor de expressão de LlCAM sendo um oligonucleotídeo que suprime a expressão de L1CAM.

2. - Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o inibidor da atividade de LlCAM reconhece uma forma ligada à membrana ou uma forma solúvel da L1CAM.

3. - Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo que suprime a expressão de LlCAM é selecionado dentre o grupo que consiste de um oligonucleotídeo de sentido negativo, um siRNA e um shRNA contra um gene codificando a Ll CAM.

4. - Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é 4-63, segregado por um hibridoma cujo número de acesso é KCTC 10966BP ou UJl27.

5. - Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o siRNA tem uma seqüência de 5 '-TGGTAC AGTCTGGGdtdt-3' ou 5'- CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'.

6. - Método de tratamento do colangiocarcinoma, caracterizado por compreender administrar a composição da reivindicação 1.

7. - Método de inibição do crescimento ou metástase do colangiocarcinoma, caracterizado pela inibição da atividade de LlCAM ou supressão da expressão de L1CAM.

8. - Método para diagnosticar o colangiocarcinoma, caracterizado por utilizar um anticorpo anti- LlCAM específico para a L1CAM.