BRPI0715581A2

BRPI0715581A2 - proteÍna de fusço hÍbrida imunogÊnica, composiÇço, uso de uma proteÍna ou uma partÍcula, mÉtodo para tratar um paciente suscetÍvel À infecÇço por plasmàdio, sequÊncia de nucleotÍdeo, hospedeiro, e, processo para a produÇço de proteÍna

Info

Publication number: BRPI0715581A2
Application number: BRPI0715581-6A
Authority: BR
Inventors: Joseph D Cohen; Martine Marchand; Christian F Ockenhouse; Anjali Yadava
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa; Us Of America As Represented By The Secretary Of Tus Army
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2013-04-24
Also published as: NZ574238A; AU2007276217B2; AU2007276217A1; TW200819462A; MA30671B1; CO6150187A2; CA2657353A1; JP5592110B2; US20100062028A1; WO2008009652A3; ZA200900386B; JP2009543846A; WO2008009652A2; KR20090094213A; US9592282B2; CR10561A; JP2009543569A; JP5222289B2; IL196471A0; MX2009000650A

Abstract

PROTEÍNA DE FISçO HÍBRIDA IMUNOGÊNCIA, COMPOSIÇçO, USO DE UMA PROTEÍNA OU UMA PARTÍCULA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE SUCETÍVEL À INFECÇçO POR PLASMàDIO, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO, HOSPEDEIRO, E, PROCESSO PARA A PRODUÇçO DE PROTEÍNA.A presente invenção diz respeito a uma nova proteína híbrida de fusão derivada da proteína CS de plasmodium vivax (P.vivax), métodos para preparar e puruficar a mesma, seu uso na madicina, particularmente na prevnção de infecções malarianas, por exemplo, aquelas causadas por P.vivax, composições/vacinas contendo a proteína ou anticorpos contra a proteína, tais como anticorpos monoclonais ou policlonais e o uso dos mesmos, particularmente, na terapia.A invenção tembém estende-se a partículas de lipoproteína da dita proteína híbrida e formulações e vacinas que compreendem as mesmas e o uso destas.Em particular, este diz respeito a uma proteína de fusão híbrida imunogência que compreende:a. pelo menos uma unidade de repetição derivada da região de repetição de uma proteína de um circunsporozóite do tipo I de P.vivax,b.pelo menos uma unidade de repetição derivada da região de repetição de uma proteína de um circunsporozóite do tipo II de P.vivax, e antígeno de superfície S derivado de vírus da Hepatite B ou um fragmento do mesmo.

Description

"PROTEÍNA DE FUSÃO HÍBRIDA IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA PROTEÍNA OU UMA PARTÍCULA, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE SUSCETÍVEL À INFECÇÃO POR PLASMÓDIO, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO, HOSPEDEIRO, E, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA"

A presente invenção diz respeito a uma nova proteína híbrida/de fusão, métodos para preparar e purificar a mesma, seu uso na medicina, particularmente na prevenção de infecções malarianas, por exemplo, aquelas causadas por Plasmodium vivax (P. vivaxj, composições/vacinas contendo a proteína ou anticorpos contra a proteína tais como anticorpos monoclonais ou policlonais e o uso dos mesmos, particularmente na terapia. A invenção também estende-se a partículas de lipoproteína da dita proteína híbrida/de fusão e formulações e vacinas que compreendem as mesmas e o uso destas.

A malária é um dos problemas de saúde mundiais principais com mais do que 2 a 4 milhões de pessoas morrendo da doença a cada ano. Uma das formas mais prevalecente da doença é causada pelo parasita protozoário P. vivax, que é encontrado em regiões tropicais e sub-tropicais. Interessantemente, o parasita pode completar seu ciclo de mosquito em temperaturas tão baixas quanto 15 graus Celsius, permitindo que a doença se dissemine em climas temperados.

O ciclo de P. vivax é complexo, requerendo dois hospedeiros, homem e mosquito para a finalização. A infecção do homem é iniciada pela introdução de esporozóites na saliva de um mosquito infectado. Os esporozóites migram para o fígado e estes infectam os hepatócitos onde estes se diferenciam, por intermédio do estágio intracelular exoeritrocítico, no estágio de merozóite que infecta as células sangüíneas vermelhas (RBC) para iniciar a replicação cíclica no estágio sangüíneo assexual. O ciclo é completado pela diferenciação de diversos merozóites no RBC nos gametócitos do estágio sexual que são ingeridos pelo mosquito, onde estes se desenvolvem através de uma série de estágios no intestino médio para a produção de esporozóites que migram para a glândula salivar.

Devido ao fato que a doença causada por P. vivax é raramente letal, esforços para prevenir e tratar a malária, foram focalizados na forma mais mortal da doença causada pelo Plasmodium falciparum (P. falciparum).

Embora a doença causada por P. vivax não resulte usualmente na morte do paciente, devido ao volume de casos, que parece estar aumentando, o impacto significante na qualidade de vida do paciente, os relatos crescentes das incidências graves da doença resultante em anemia e morte e o impacto econômico, uma vacinação eficaz contra a doença ainda é requerida.

Uma característica do P. vivax é que algumas cepas são capazes de causar a infecção atrasada permanecendo latente no fígado antes de emergir na circulação periférica para manifestar os sintomas clínicos. Desta maneira, os indivíduos, por exemplo, quando viajam através da área infectada, podem ser infectados e ainda podem não apresentar sintomas por vários meses. Este tem o potencial de causar a disseminação da doença e por esta razão, pessoas que viajam por estas áreas não são deixadas doar sangue para transfusão por um período definido de tempo após a viagem à região infectada. A infecção por malária por P. vivax permanece latente dentro

do fígado enquanto o parasita está sofrendo a shizogony pré-eritrocítica. Se o parasita for controlado neste estágio, antes deste escapar do fígado, nenhum sintoma clínico da doença é observado no paciente.

O estágio de esporozóite de P. vivax foi identificado como um alvo potencial de uma vacina contra a malária. A vacinação com esporozóite desativado (irradiado) mostrou induzir a proteção contra a malária humana experimental (Am. J, Trop. Med. Hyg 24: 297-402, 1975). Entretanto, não foi possível, prática e logisticamente, fabricar uma vacina contra malária para a população geral com base em sua metodologia, utilizando-se esporozóites irradiados. A proteína de superfície principal do esporozóite é conhecida como a proteína circunsporozóite (proteína CS). Pensa-se que esta esteja envolvida na motilidade e invasão do esporozóite durante sua passagem do local inicial de inoculação pelo mosquito na circulação, quando este migra para o fígado.

A proteína CS de espécies Plasmodia é caracterizada por um domínio repetitivo central (região de repetição) flanqueada por fragmentos amino (terminal N) e carbóxi (terminal C) não repetitivos. O domínio central de P. vivax é composto de diversos blocos de uma unidade de repetição, no geral, de nove aminoácidos em tandem.

Em certas cepas asiáticas, após a região de repetição central, uma seqüência adicional de aproximadamente 12 aminoácido está presente (ver SEQ ID N0 11). A função do último não e conhecida. Entretanto, esta é hipotetizada por alguns que os ditos aminoácidos podem estar ligados ao início atrasado de sintomas clínicos da doença, embora isto não tenha sido investigado. É pensado que o terminal N é caracterizado por uma seqüência de 5 aminoácidos conhecidos como a região I (ver SEQ ID N0 1). Também é pensado que o terminal C é caracterizado por compreender uma seqüência de 18 aminoácidos conhecidos como a região Π. O último contém um motivo adesivo de celular, que é altamente conservado entre todas as proteínas CS de malária (ver SEQID N0 2).

Diversos grupos propuseram vacinas de subunidade com base na proteína circunsporozóite. Duas testas vacinas passaram por teste clínico; uma é um peptídeo sintético, a outra é uma proteína recombinante (Bailou et al Lancet: i 1277 (1987) e Herrington et al Nature 328:257 (1987)). Estas vacinas foram bem sucedidas na estimulação de uma resposta anti-esporozóite. Entretanto, a magnitude da resposta foi frustrante, com algumas vacinas não realizando uma resposta em todos. Além disso, a ausência de "intensificação" de níveis de anticorpo em infecções subseqüentes e resultados de ensaios de proliferação de linfócito in vitro sugeriram que as células T na maioria destes voluntários não reconhece a repetição imuno-dominante. Entretanto, um voluntário vacinado em cada estudo não desenvolveu parasitemia.

O WO 93/10152 e o WO 98/05355 descrevem uma vacina derivada da proteína CS de P. falciparum e parece que houve algum progresso feito com relação à vacinação contra P. falciparum usando-se o método descrito neste, ver também Heppner et al. 2005, Vaccine 23, 2243-50.

A proteína CS em P. falciparum tem uma região de repetição central que é conservada. Em contraste, pelo menos duas formas (denominadas VK210 ou tipo I e VK247 ou tipo II) da proteína CS para P. vivax são conhecidas. Isto torna mais difícil identificar uma construção da proteína CS com todas as propriedades desejadas, tais como imunogenicidade, que fornece proteção geral contra P. vivax indiferente do tipo específico de proteína CS porque os anticorpos direcionados na região de repetição central do tipo I não reconhecem necessariamente os epítopos na região correspondente do tipo II e vice versa.

Uma proteína CS de P. vivax recombinante foi expressada e testada como uma vacina nos anos de 1980 a 1990 com sucesso limitado (Collins et al, 1989. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40, 455-64). Algum trabalho foi realizado para desenvolver uma vacina com base em Peptídeos de Antígeno Múltiplo (MAP) que utilizam um ou mais epítopos que são reticulados (Nardelli and Tam, 1995, Pharm. Biotechnol. 6, 803-19).

A presente invenção fornece um novo antígeno melhorado para o uso em vacinas contra malária, que é acreditado produzir uma resposta humoral e também uma resposta imune celular. Acredita-se que o antígeno/partícula induza a produção de anticorpos contra a proteína CS do tipo I e tipo II. O antígeno/partícula também podem induzir células auxiliares T, por exemplo, células Thl e/ou Th2.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece uma proteína de fusão híbrida imunogênica que compreende: a. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de um circunsporozóite do tipo I de P. vivax,

b. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de um circunsporozóite do tipo II de P.

vivax e

c. antígeno de superfície S derivado de vírus da Hepatite B. Listagem de Seqüência

SEQ. ID. N0 1 Região I no terminal N (descrito acima) SEQ. ID. N0 2 motivo da Região II no terminal C (descrito

acima)

SEQ. ID. N0 3-9 Vários monômeros do proteína CS do tipo I SEQ. ID. N0 10 Monômero principal proteína CS do tipo II SEQ. ID. N0 11 Aminoácidos adicionais encontrados em

cepas asiáticas

SEQ. ID. N0 12 Seqüência de nucleotídeo para a proteína

híbrida (otimizado para a expressão em E Coli)

SEQ. ID. N0 13 Seqüência de aminoácido para a proteína

híbrida

CSV

SEQ. ID. N0 14 Proteína CS de monômero inferior do tipo II

SEQ. ID. N0 15 Seqüência de nucleotídeo para a proteína híbrida CSV (otimizado para a expressão em levedura)

SEQ. ID. N0 16 Seqüência de nucleotídeo para a proteína de fusão híbrida CSV-S

SEQ. ID. N0 17 Seqüência de aminoácido para a proteína de

fusão híbrida CSV-S

SEQ. ID N0 18 Seqüência de nucleotídeo para um cassete de expressão RTS e proteína RTS,S predita.

SEQ. ID N0 19 Seqüência de nucleotídeo para o gene de fusão híbrido CSV-S (clonado em vetor de expressão de Pichia pastoris integrativo de pHIL-D2)

SEQ. ID N0 20 Seqüência de aminoácido para a proteína de fusão híbrida CSV-S expressada em Pichia pastoris

SEQ ID N0 21 Mostrada na Figura 12 é uma comparação da seqüência de uma proteína de CSV-S recombinante de comprimento total e uma proteína truncada (CSVtr-S) Figuras

Figura 1 Mostra uma micrografia eletrônica de partículas multiméricas de lipoproteína da proteína híbrida da invenção produzida na cepa de levedura S. cerevisiae (com um promotor constitutivo)

Figura 2 É um Western Blot de uma proteína híbrida da invenção e proteínas comparadoras (parte de gel)

Figura 2a É um Western Blot de uma proteína híbrida da invenção e proteínas comparadoras (gel total da Figura 2, em que as linhas 1, 2 e 3 na Figura 2 são linhas 1, 2 e 8 na Figura 2a)

Figura 3 Mapa de plasmídeo para o vetor recombinante de pRIT 15546 utilizado para introduzir a seqüência codificadora para a proteína de fusão CSV-S na célula hospedeira de levedura (vetor epissomal).

Figura 4 Mapa de plasmídeo de pGFl-S2, um plasmídeo preparado por GSK utilizado na formação da proteína de fusão de um antígeno desejado com o antígeno S da Hepatite B.

Clonagem de seqüências de DNA heterólogas entre os locais Smal (após a excisão do fragmento de DNA Smal de 12 bp) cria a fusão em estrutura com o gene S.

Figura 5 Mapa de plasmídeo de Prit 15607 utilizado na formação da proteína de fusão de um antígeno desejado com o antígeno S da Hepatite B

A digestão com NotI libera um fragmento de DNA de linear de 6,8 kb que carrega o cassete de expressão CSV-S mais o marcador seletivo HIS4, sendo usado para a inserção no cromossomo de levedura.

Figura 6 Mostra um Western Blot de proteína recombinante expressada em Yl 840 Figura 7 Mostra uma micrografia eletrônica de partículas

multiméricas de lipoproteína da proteína híbrida da invenção produzida na Pichia pastoris (uma "levedura não convencional", uma levedura mielotrófica, em que a expressão recombinante é conduzida por um promotor indutível por metanol). As partículas de CSV-S foram purificadas a partir de extratos

solúveis (com base no processo de purificação de RTS,S) e submetidos à análise de microscopia eletrônica. As partículas foram visualizadas após o tingimento negativo com ácido fosfotúngstico. A escala é equivalente a 100 nm.

Fig 8 Mapa de plasmídeo de pRIT15582 A digestão com Xhol libera um fragmento de DNA linear de

8,5 kb que carrega o cassete de expressão de CSV-S mais o marcador seletivo LEU2, sendo usado para a inserção no cromossomo de levedura.

Fig 9 Mapa de restrição do fragmento de Xhol linear usado para integrar o cassete de CSV-S Fig 10 Western blot de proteínas recombinante expressadas

na cepa Yl835.

Painel A: WB revelado com anticorpo anti-S Amostras carregadas (100 μg de proteína total/reservatório): 1: Yl631 (cepa produtora de RTS,S, como comparação) 2: Y1835

3: Y1835 4: Y1834

Painel B: WB revelado com anticorpo anti-CSV Amostras carregadas (100 μg de proteína total/reservatório): 1: Yl631 (Cepa produtora de RTS,S, como comparação) 2: Y1295 3: Y1835 4: Y1834

5: nr (uma outra construção CSVS)

6: nr (uma outra construção - apenas antígeno S) Fig 11 A micrografia eletrônica de partículas mistas de CSV-S5S produzidas na cepa Y183 5

As partículas de CSV-SjS foram purificadas a partir de extratos celulares solúveis (com base em processo de purificação de RTS,S) e submetido à análise de microscopia eletrônica. As partículas foram visualizadas após o tingimento negativo com ácido fosfotúngstico. A escala é equivalente a 1 OOnm.

Fig 12 Mostra uma comparação de proteína de comprimento total recombinante CS e uma versão truncada da proteína CS (C SVtr-S).

Proteína híbrida refere-se aqui a derivado de proteína de P. vivax tipo I e tipo II.

A proteína de fusão híbrida refere-se aqui a derivado de proteína de P. vivax tipo I e tipo II fundido a uma outra proteína ou fragmento desta.

Em um aspecto, a proteína de fusão híbrida da invenção compreende uma proteína híbrida derivada das proteínas CS de P. vivax (CSV) e um antígeno de superfície da Hepatite B, no geral, a proteína de superfície principal conhecida como o antígeno S, tal como o antígeno S derivado de um sorotipo adw.

O componente de antígeno derivado de CSV (isto é, a proteína híbrida) da invenção é, no geral, fundida à extremidade de terminal amino da proteína S. Mais especificamente a extremidade de terminal C do fragmento de CSV é fundido no terminal N do dito antígeno S. Acredita-se que a presença do antígeno de superfície da Hepatite B intensifica a imunogenicidade da porção da proteína CS da proteína híbrida, auxilia a estabilidade e/ou auxilia a fabricação reprodutível da proteína.

No geral, a proteína híbrida também conterá um fragmento de terminal N a partir de uma proteína CS de Plasmodium, tal como P. vivax (tipo I ou II), por exemplo, um fragmento que compreende região I tal como os aminoácidos mostrados na SEQ ID N0 1.

Alternativamente, a proteína híbrida pode conter um fragmento de terminal N a partir da proteína CS de P. falciparum.

Em um aspecto, a proteína híbrida pode compreender uma ou mais unidades de repetição da região central de P. falciparum. Por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais unidades de repetição.

Usualmente, a proteína híbrida conterá um fragmento de terminal C de uma proteína CS de Plasmodium, tal como P. vivax (tipo I ou II), por exemplo, um fragmento que compreende região II, tal como mostrado na SEQ ID N0 2.

Alternativamente, a proteína híbrida pode conter um fragmento de terminal C a partir da proteína CS de P. falciparum.

Enquanto não deseja-se estar ligado pela teoria, pensa-se que os fragmentos de terminal NeC incluem diversos epítopos de célula TeB.

Nas proteínas recombinantes freqüentemente, aminoácidos não naturais são introduzidos no processo de clonagem e são observados na proteína expressada final. Por exemplo, vários, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos podem ser inseridos no início (terminal N) da proteína. Se 4 aminoácidos forem inseridos no início da proteína estes podem ser, por exemplo, MMAP. Além de ou alternativamente 1, 2 ou 3, tal como 1 aminoácido pode ser inserido no corpo/meio da proteína em, por exemplo, em torno do aminoácido, 259, 260, 261 ou 262. A inserção de aminoácido pode ser o aminoácido com o símbolo P. Em um aspecto, a proteína utilizada não inclui quaisquer aminoácidos inseridos pelo processo de clonagem no corpo/meio da proteína.

A invenção também estende-se e uma denominada versão

"trancada" da proteína híbrida, por exemplo, como mostrado na Figura 12 e CSVtr-S rotulado.

Desta maneira, a invenção fornece proteína híbrida trancada em que pelo menos a região rica em arginina observada no terminal N da proteína CS (em torno do aminoácido 60) é removido/anulado.

Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína híbrida trancada, em que pelo menos os aminoácidos 1 a 55 (ou 1 a 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70) são anulados. Esta proteína híbrida trancada pode incluir até 4 aminoácidos inseridos no início da proteína, tal como MMAP.

Em um aspecto, a invenção diz respeito à proteínas híbridas, que exclui o amino 5 a 64 (inclusive) da proteína recombinante de comprimento total.

Estas proteínas híbridas trancadas podem ser utilizadas em outros aspectos da invenção descritos abaixo.

Qualquer cepa adequada de P. vivax pode ser utilizada na invenção incluindo: América Latina/América do Sul (isto é, Sal 1, Belém), Coréia, China, Tailândia, Indonésia, índia e Vietnã. A construção na SEQ ID N0 13 é fundamentada em uma cepa coreana (mais especificamente uma cepa da Coréia do Sul).

P. vivax com proteínas CS tipo I é mais prevalecente do que P. vivax com a proteína CS do tipo II. Portanto, em um aspecto da invenção mais unidades de repetição do tipo I são incluídas no híbrido do que nas unidades de repetição do tipo II. Mais especificamente, a proteína híbrida da invenção pode incluir 1 a 15 unidades de repetição, tais como 9 unidades de repetição do tipo I.

Os exemplos de monômeros adequados das proteínas CS do tipo I são dados nas SEQ ID N°s 3 a 9.

Em uma forma de realização a invenção fornece uma proteína híbrida que compreende uma mistura unidades de repetição diferentes do tipo I, tal como um de cada um daqueles listados na SEQ ID N°s 3 a 9.

Uma ou mais unidades de repetição podem ser duplicadas no híbrido, por exemplo, dois monômeros de SEQ ID N0 3 e/ou 4 pode ser incorporado na construção.

a) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de

SEQ ID N0 3.

b) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID N0 4, opcionalmente em combinação com uma unidade como

descrita no parágrafo a) diretamente acima.

c) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID N0 5, opcionalmente em combinação com uma unidade como descrita no parágrafo a) ou b) diretamente acima.

d) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de

SEQ ID N0 6, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades como descrita nos parágrafos a) a c) diretamente acima.

f) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID N0 7, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades

como descrito nos parágrafos a) a d) diretamente acima.

g) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID N0 8, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades como descrito nos parágrafos a) a f) diretamente acima.

h) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID N0 9, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades como descrito nos parágrafos a) a g) diretamente acima.

Os exemplos de unidades de repetição de componente adequado das proteínas CS do tipo II são dados nas SEQ ID N°s IOe 14, tal como 10.

Em um aspecto da invenção é fornecida uma proteína híbrida com 5 ou menos unidades de repetição derivadas do tipo II, tal como um monômero, por exemplo, como mostrado na SEQ ID N0 10.

A proteína híbrida também pode incluir as 12 inserções de aminoácido encontrados no final da região de repetição encontradas em certas cepas asiáticas de P. vivax, por exemplo, como mostrado na SEQ ID N0 11.

Em uma forma de realização, a proteína híbrida compreende 257 aminoácidos derivados de proteína CS de P. vivax.

Em uma forma de realização a proteína de fusão híbrida compreende 494 aminoácidos, por exemplo, 257 dos quais são derivados de proteína CS de P. vivax.

Em um aspecto, a proteína CS compreende proteína de comprimento total.

Em um aspecto, a proteína CS utilizada é uma versão truncada, por exemplo, como mostrado na Figura 12 ou um truncado correspondente em que os aminoácidos de cerca de 1 a cerca de 67 são anulados.

Em uma forma de realização entre 1 e 5 aminoácidos adicionais são inseridos no início da seqüência como um resultado do processo de clonagem, por exemplo, MMAP ou MMAPG inserido. A proteína híbrida e/ou proteína de fusão também podem

incluir antígenos adicionais derivados de P. falciparium e/ou P. vivax, por exemplo, em que o antígeno é selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl e RBP ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização a proteína de fusão híbrida (CSV- S) tem substancialmente a seqüência de aminoácido mostrado na SEQ ID N0 17. Na seqüência, os aminoácidos de 6 a 262 são derivados de CSV e 269 a 494 são derivados de S. Os aminoácidos remanescentes são introduzidos pela construção genética (estes podem, em particular, serem variados, se desejado).

As propriedades da proteína de fusão CSV-S da SEQ ID N0 17

são fornecidas nas Tabelas abaixo:

Análise Proteína total Peso molecular 51794,75 pm Comprimento 494 1 micrograma 19,307 pMoles Coeficiente de Extinção Molar 90780 ± 5% 1 A(280) = 0,57 mg/ml Ponto Isoelétrico 7,33 Carga em pH 7 1,05 Análise da Composição da Proteína Total Aminoácido (s) Contagem % em peso % por freqüência numero Carregado (RKHYCDE) 106 26,35 21,46 Acídico (DE) 38 8,82 7,69 Básico (KR) 39 10,68 7,89 Polar (NCQSTY) 134 28,15 27,13 Hidrofóbico (AILFWV) 167 34,68 33,81 AAla 52 7,14 10,53 CCys 18 3,58 3,64 DAsp 24 5,33 4,86 EGlu 14 3,49 2,83 FPhe 17 4,83 3,44 GGly 64 7,05 12,96 HHis 4 1,06 0,81 IIle 17 3,71 3,44 KLis 20 4,95 4,05 L Leu 42 9,18 8,50 M Met 8 2,03 1,62 N Asn 32 7,05 6,48 PPro 40 7,50 8,10 QGln 21 5,20 4,25 RArg 19 5,73 3,85 S Ser 30 5,04 6,07 TThr 26 5,08 5,26 VVal 25 4,78 5,06 WTrp 14 5,03 2,83 YTir 7 2,21 1,42 B Asx 0 0,00 0,00 ZGlx 0 0,00 0,00 XXxx 0 0,00 0,00 . Ter 1 0,00 0,20 As propriedades da proteína de fusão CSV-S da SEQ ID N0 20 são fornecidas nas tabelas abaixo:

Nishikawa & Ooi 1987

Análise Proteína total Peso molecular 51762,69 pm Comprimento 494 1 micrograma = 19,319 pMoles Coeficiente de Extinção Molar 90780 ± 5% 1 A(280) = 0,57 mg/ml Ponto Isoelétrico 7,33 Carga em pH 7 1,05 Análise da Composição da Proteína Total Aminoácído (s) Contagem % em peso % por freqüência numero Carregado (RKHYCDE) 106 26,37 21,46 Acídico (DE) 38 8,83 7,69 Básico (KR) 39 10,69 7,89 Polar (NCQSTY) 134 28,17 27,13 Hidrofóbico (AILFWV) 168 34,89 34,01 AAla 52 7,14 10,53 CCys 18 3,59 3,64 DAsp 24 5,34 4,86 EGlu 14 3,49 2,83 FPhe 17 4,83 3,44 GGly 64 7,05 12,96 HHis 4 1,06 0,81 IIle 17 3,72 3,44 KLis 20 4,95 4,05 L Leu 42 9,18 8,50 M Met 7 1,77 1,42 N Asn 32 7,05 6,48 PPro 40 7,50 8,10 QGln 21 5,20 4,25 RArg 19 5,73 3,85 S Ser 30 5,05 6,07 TThr 26 5,08 5,26 VVal 26 4,98 5,26 WTrp 14 5,04 2,83 YTir 7 2,21 1,42 B Asx 0 0,00 0,00 ZGlx 0 0,00 0,00 .Ter 0 0,00 0,00 1 0,00 0,20

A proteína de fusão híbrida CSV-S pode ser, por exemplo, preparada utilizando-se o plasmídeo pGFl-S2 (ver a Fig. 4 e os exemplos para detalhes adicionais), que quando a seqüência apropriada correspondente a CSV é inserida no local de clonagem processa a inserção para provar a proteína de fusão C SV-S. A seqüência de nucleotídeo para a proteína de fusão híbrida da SEQ ID N0 17 é dada na SEQ ID N0 16. a porção de CSV desta seqüência foi o códon otimizado para otimizar a expressão na levedura.

Alternativamente a proteína de fusão híbrida CSV-S pode ser, por exemplo, preparada como descrito no Exemplo 2.

Uma seqüência de nucleotídeo alternativa para a proteína de fusão híbrida da invenção é dada na SEQ ID N0 19 e a seqüência de aminoácido para o mesmo é dada na SEQ ID N0 20.

A presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeo, por exemplo, DNA, que codifica as proteínas da presente invenção.

A seqüência de nucleotídeos que codifica as proteínas da presente invenção é, em uma forma de realização flanqueada por elementos de controle transcripcionais, preferivelmente derivado de genes de levedura e incorporados em um vetor de expressão.

Um cassete de expressão para proteínas híbridas pode ser, por exemplo, construído compreendendo as seguintes características:

• Um promotor de seqüência, derivado, por exemplo, do gene TDH3 de S.cerevisiae.

• Uma seqüência codificadora para a proteína de fusão híbrida de CSV-S apropriada.

• Uma seqüência de terminação de transcrição contida dentro da seqüência, derivada, por exemplo, do gene ARG3 de S. cerevisiae.

Um exemplo de um promotor específico é o promotor do gene TDH3 de S. cerevisiae Musti et al.

A invenção também estende-se a vetores utilizados na preparação de uma proteína de fusão híbrida.

Um plasmídeo adequado pode ser utilizado para introduzir a seqüência codificadora na proteína de fusão híbrida em um hospedeiro adequado para a síntese. Um exemplo de um plasmídeo adequado é pRIT 15546 um vetor com base de 2 mícron para carregar o cassete de expressão de CSV-S, ver mapa de plasmídeo do mesmo na Figura 3.

Alternativamente, os plasmídeos são conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica e/ou descritos nos exemplos.

O plasmídeo, no geral, conterá uma marcador construído nele para auxiliar a seleção, por exemplo, um gene codificador para a resistência a antibiótico ou tixotropia de LEU e/ou HIS.

Em um aspecto, o plasmídeo é epissomal, isto é, o gene para as proteínas não é integrado no DNA do hospedeiro.

A invenção também diz respeito a uma célula hospedeira transformada com um vetor de acordo com a invenção. As células hospedeiras também podem ser procarióticas ou eucarióticas mas preferivelmente, são levedura, por exemplo, Saccharomyces (por exemplo, Saceharomyces eerevisiae, tal como DC5 em bancos de dados ATCC (número de acessão 20820), sob a marca RIT DC5 cir(o)). Depositor: Smith Kline-RIT) e leveduras que não Saccharomyees. Estes incluem Schizosaceharomyees (por exemplo, Schizosaceharomyees pombe) Kluyveromyces (por exemplo, Kluyveromyces laetis), Pichia (por exemplo, Piehia pastoris), Hansenula (por exemplo, Hansenula polymorpha), Yarrowia (por exemplo, Yarrowia lipolytiea) e Schwanniomyees (por exemplo, Schwanniomyees oeeidentalis).

Em um aspecto a invenção diz respeito a uma cepa de levedura recombinante Yl834 (e seu uso), que expressa uma proteína de fusão híbrida de CSV-S e/ou partículas imunogênicas destas, ver exemplos para a preparação dos mesmos.

Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma cepa de levedura recombinante Yl 835 (e seu uso), que expressa uma proteína de fusão híbrida de CSV-S e/ou partículas imunogênicas destas, ver exemplos para a preparação dos mesmos. Em um aspecto alternativo a invenção diz respeito a uma cepa de levedura recombinante Y1840 (e seu uso), que expressa uma proteína de fusão híbrida de CSV-S e/ou partículas imunogênicas destas.

Mais especificamente a invenção diz respeito a dita levedura (ou uma outra levedura) que compreende a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de fusão da invenção, o uso das leveduras para a preparação da dita proteína de fusão e processos que envolvem a preparação da dita proteína de fusão.

A seqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta, tal como a porção que codifica a proteína híbrida mas opcionalmente, não a porção que codifica a proteína S) pode ser otimizado por códon para a expressão no hospedeiro relevante, tal como levedura.

Otimizado por códon, neste contexto é pretendido significar que os códons são modificados para torná-los apropriados para a expressão no hospedeiro relevante. Este pode ou não pode ser a seleção de códon mais ótima, por exemplo, uma versão otimizada sub-ótima pode ser selecionada se a expressão da mesma for maior do que aquela de uma versão ótima.

Em células de levedura uma vez expressadas, a proteína de fusão híbrida (que compreende antígeno S), é capaz de montar-se espontaneamente em uma estrutura de lipoproteína/partícula composta de numerosos monômeros das ditas proteínas.

Estas partículas também podem ser referidas a uma partícula semelhante a vírus (VLP). As partículas também podem ser descritas como partículas de lipoproteína multiméricas.

Estas partículas podem ser preparadas de diversas maneiras, por exemplo, fundindo-se cada um dos antígenos derivados de plasmódio a um outro parceiro de fusão, (por exemplo, os antígenos de vírus da Hepatite B ou uma proteína estrutural viral) e que expressa o mesmo em um hospedeiro adequado, tal como levedura ou bactéria. Quando a cepa de levedura do recipiente escolhido também carrega em seu genoma uma ou mais cópias integradas de um cassete de expressão S de hepatite B, a cepa resultante sintetiza a proteína híbrida como as proteínas de fusão e também o antígeno S não fundido. Estas podem ser espontaneamente montadas em partículas de lipoproteína que compreendem monômeros de uma proteína de fusão híbrida e monômeros do antígeno S.

Enquanto não deseja-se estar ligado pela teoria, as partículas, por exemplo, quando expressadas em Yl834, são pensadas consistir de unidades/monômeros de uma proteína de fusão híbrida, embora possa ser que a composição de partícula varie de acordo com a levedura específica utilizada.

Desta maneira, em alguns casos, as partículas de lipoproteína também podem conter os monômeros do antígeno S não fundido, por exemplo, como nas partículas que são o resultado da preparação na levedura Y1835.

Desta maneira, em um aspecto, a invenção fornece uma partícula imunogênica que compreende as proteínas de fusão híbridas da invenção.

Desta maneira, em um aspecto, a partícula é uma "assim chamada" partícula simples em que esta consiste essencialmente de unidades da proteína de fusão híbrida. Em um aspecto alternativo da invenção a partícula de lipoproteína imunogênica compreende uma ou mais proteínas de fusão híbridas e uma ou mais unidades de proteína S não fundidas, em uma assim chamada partícula dupla ou mista.

As Figuras 1 e 7 são micrografias eletrônicas de uma partícula de lipoproteína de acordo com este aspecto da invenção, embora preparado em levedura diferente.

As partículas mostradas na micrografia foram purificadas por técnicas clássicas usando-se um gradiente de cloreto de césio e sacarose, em particular usando-se gradientes de cloreto de césio e de sacarose sucessivos, mais especificamente: 1 gradiente de sacarose seguido por 3 gradientes de CsCl sucessivos.

A invenção inclui métodos de purificar as ditas partículas, por exemplo, utilizar um gradiente de cloreto de césio e de sacarose.

Adicionalmente, é hipotetizado que, os tensoativos usados para liberar a proteína das células também pode ajudar na estabilização das partículas de lipoproteína. Em um outro aspecto, a partícula de lipoproteína compreende um tensoativo. O tensoativo pode ser, por exemplo, selecionado de Tween (tal como Tween 20), briji, polietileno glicol. A partícula pode, por exemplo, compreende 1% ou menos, tal como 0,5% ou 0,1% em peso de tensoativo.

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E hipotetizado que as partículas de lipoproteína da invenção ainda podem contribuir para estimular a resposta imune a uma proteína de fusão híbrida in vivo.

A presente invenção também diz respeito a vacinas que compreendem uma quantidade imunoprotetora de uma proteína ou partícula de acordo com a invenção em mistura com um diluente ou carreador adequados.

A invenção também estende-se a uma composição que compreende a proteína híbrida/de fusão ou partícula de acordo com a invenção e um vetor viral que compreende um antígeno de malária, particularmente, um antígeno de malária comum com a dita partícula e opcionalmente um adjuvante.

No contexto deste relatório descritivo, o excipiente refere-se a um componente em uma formulação farmacêutica sem nenhum efeito terapêutico por si próprio. Um diluente ou carreador está dentro da definição de um excipiente.

No aspecto, a composição da invenção compreende uma proteína de fusão e/ou partícula híbrida como descrito neste e um adjuvante. Em uma forma de realização, a construção de vetor viral é como descrita no WO 2004/055187.

Em uma forma de realização, as ditas proteínas de fusão estão em mistura e, desta maneira, disponíveis como uma formulação simples. Em uma forma de realização alternativa, as proteínas de fusão são preparadas como formulações separadas e são administradas separadamente ao paciente.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um tratamento combinado contra P. falciparum e P. vivax, que compreende:

uma proteína de fusão imunogênica que compreende um antígeno derivado de uma proteína CS de P. vivax e

uma proteína de fusão imunogênica que compreende um antígeno derivado de proteína CS de P. falciparum.

Neste aspecto da invenção, o antígeno derivado da proteína CS do componente de P. vivax da fusão pode ser uma proteína CS de ocorrência natural (nativa) tal como tipo I e ou tipo II ou um fragmento do mesmo. Alternativamente, o antígeno pode ser proteína híbrida (quimérica), como descrito acima, tal como o proteína identificada em SEQ ID N0 13 e/ou 15.

Um componente de antígeno de proteína de fusão derivado de P. falciparum pode ser preparado de acordo com o WO 93/10152 por exemplo, como RTS,S (em que "S" representa um monômero não fundido) ou como RTS, ambos os quais são adequados para o uso neste aspecto da invenção.

Em uma forma de realização, o antígeno derivado de P. falciparum compreende pelo menos 4 unidades de repetição da região central de repetição. Mais especificamente, este antígeno compreende uma seqüência que contém pelo menos 160 aminoácidos que são substancialmente homólogos à porção de terminal C da proteína CS. A proteína CS pode ser desprovida dos últimos 12 a 14 aminoácidos do terminal C.

Mais especificamente, a proteína de fusão relevante que compreende uma porção de uma proteína CS de P. falciparum pode corresponder substancialmente aos aminoácidos 207 a 395 de P. falciparum 7G8 fundidos na estrutura por intermédio de um ligador linear ao terminal N do antígeno S. O ligador pode compreender uma porção de preS2 do antígeno S.

Mais especificamente, a proteína de fusão derivada de P. falciparium utilizada é aquela codificada por uma seqüência de nucleotídeo para o cassete de expressão de RTS como fornecido na SEQ ID N0 18.

Os antígenos S adequados, podem compreender um preS2. Um exemplo de um sorotipo Is adw adequado (Nature 280:815-819, 1979).

Em um aspecto, a proteína de fusão híbridas da invenção compreende uma porção derivada de uma proteína S mutante, por exemplo, como descrito no pedido US publicado N0 2006/194196 (também publicado como WO 2004/113369). Este documento descreve um HDB05 rotulado mutante. Em particular, este descreve comparações do mutante e da proteína do tipo selvagem nas Figuras 1 e 6 e os genes para os mutantes nas Figuras 4 e 5. As seqüências de 12 a 22 neste descreve polipeptídeos particulares da proteína S mutante. Cada um dos acima é incorporado neste por referência.

A invenção também diz respeito ao uso da dita combinação para o tratamento, mais particularmente uso como uma vacina para a prevenção de malária e método para tratar um paciente suscetível à infecção por plasmódio que compreende administrar uma quantidade eficaz de cada um dos componentes de maneira simultânea ou seqüencial, desse modo para prevenir ou tratar malária.

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma combinação para o tratamento que compreende: um antígeno híbrido imunogênico que compreende

a. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de um circunsporozóite do tipo I de P. vivax,

b. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de um circunsporozóite do tipo II de P. vivax e

uma proteína de fusão imunogênica que compreende um antígeno derivado da proteína CS de P. falciparum.

Por exemplo, em que o dito antígeno híbrido e a dita proteína de fusão são administradas de maneira concomitante, por exemplo, estes que podem estar em mistura para a administração simultânea ou alternativa podem ser formulados para a administração seqüencial.

Em um outro aspecto, é fornecida uma combinação para o tratamento que compreende: um antígeno híbrido imunogênico que compreende:

a. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de um circunsporozóite do tipo I de P.

vivax,

b. pelo menos uma unidade de repetição derivada da seção de repetição central de uma proteína de circunsporozóite do tipo II de P. vivax e um vetor viral que codifica quanto ao antígeno de malária, tal como o dito antígeno híbrido.

Por exemplo, em que o dito antígeno híbrido no dito vetor viral são administrados concomitantemente, por exemplo, estes que podem ser misturados pela administração simultânea podem ser formulados para a administração seqüencial.

Como usado neste, o termo "concomitantemente" significa que a dita combinação de componentes é administrada dentro do período de não mais que 12 horas, por exemplo, dentro de um período de não mais do que 1 hora, tipicamente, em uma ocasião por exemplo, no curso da mesma visita do profissional de saúde, por exemplo, quando estes são administrados seqüencial ou simultaneamente.

A invenção também inclui uma composição de vacina que compreende os ditos elementos de cada uma destas formas de realização.

A invenção também inclui um kit de vacina que compreende os ditos elementos para tratar malária.

A invenção também estende-se um regime intensificador inicial que compreende os ditos elementos, por exemplo, iniciando com antígeno e/ou partículas de P. falciparium e intensificação com antígeno e/ou partículas de P. vivax e vice versa.

O regime de intensificação inicial pode, por exemplo, compreender os componentes derivados unicamente ou apenas de P. vivax.

Em uma outra forma de realização, a iniciação pode ser realizada com plasmídeo/DNA exposto e a intensificação ocorre com o antígeno de acordo com a invenção e/ou vice versa.

Alternativamente, a iniciação pode ser realizada com um vetor viral apropriado e intensificação com o antígeno de acordo com a invenção ou vice versa.

Os regimes de intensificação iniciais gerais são descritos

abaixo.

Por exemplo:

• a iniciação pode ocorrer com um antígeno (tal como um antígeno com adjuvante) que compreende pelo menos uma unidade de repetição do tipo I a partir da proteína CS de P.vivax e pelo menos uma unidade de repetição do tipo II a partir da proteína CS de P.vivax e a intensificação pode ocorrer com um vetor viral que codifica o antígeno idêntico/correspondente,

• a iniciação pode ocorrer com um antígeno (tal como um antígeno com adjuvante) que compreende pelo menos uma unidade de repetição ou epítopo de P.vivax e pelo menos uma unidade de repetição ou epítopo a partir da proteína CS de P. falciparum e a intensificação pode ocorrer com um proteína viral que codifica o antígeno idêntico/correspondente,

• a iniciação pode ocorrer com um vetor viral que codifica um antígeno que compreende pelo menos uma unidade de repetição do tipo I a partir da proteína CS de P.vivax e pelo menos uma unidade de repetição do tipo II a partir da proteína CS de P.vivax ou que compreende pelo menos uma unidade de repetição ou epítopo de P.vivax e pelo menos uma unidade de repetição ou epítopo da proteína CS de P. falciparum e intensificação com o antígeno com adjuvante idêntico/correspondente na forma de uma proteína e/ou partícula imunogênica.

O antígeno nestes contextos incluem proteína de fusão híbrida e/ou partículas imunogênicas da invenção. Nestes regimes de intensificação iniciais, o antígeno, usualmente, será auxiliado por adjuvante.

Nestes aspectos da invenção, as preferências descritas acima para a proteína híbrida derivada de P. vivax também aplicam-se. Desta maneira, em um aspecto, a proteína híbrida tem a seqüência na SEQ ID N0 13.

RTS,S e antígeno (na forma de uma partícula imunogênica) de P. falciparum podem ser preparados como descrito no WO 93/10152.

Em um aspecto a invenção fornece um vetor viral de replicação deficiente que codifica uma proteína híbrida (ou alternativamente uma proteína de fusão híbrida) de acordo com a invenção, os vetores virais adequados podem ser derivados de vetores adeno virais, vetores virais adeno- associados (AAVs), sarampo, lentivírus, alfavírus, baclovírus, vírus do herpes simples e vírus da varíola, tal como varíola bovina, varíola aviária, varíola de pombo, varíola de canário, suipox e varíola de ovelha/varíola caprina. Metodologia de preparar vetores adenovirais que codificam um antígeno de malária é, por exemplo, descrito em WO 2004/055187. A proteína codificada pelo vetor pode ser, por exemplo, modificada para evitar a glicosilação da proteína durante a expressão, por exemplo, certas serinas podem ser substituídas por resíduos de alanina para reduzir a glicosilação. Adenovírus

Os vetores adenovirais da presente invenção compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos (DNA) que codifica um ou mais polipeptídeos imunogênicos.

Os vetores adenovirais de uso na presente invenção podem ser derivados de uma faixa de hospedeiros mamíferos.

A adenovírus (neste referido como "Ad" ou "Adv") tem uma morfologia característica com um capsídeo icosaedral que consiste de três maiores proteínas, héxon (II), base de pentona (III) e uma fibra arredondada (IV), junto com diversas outras proteínas menores, VI, VIII, IX, IIIa e IVa2 (Russell W.C. 2000, Gen Viriol, 81:2573-2604). o genoma do vírus é um DNA filamentoso linear ou duplo como uma proteína terminal ligada covalentemente aos terminais 5', que tem repetições terminais invertidas (ITRs). O DNA do vírus é intimamente associado com a proteína altamente básica VII e um peptídeo pequeno denominado mu. Uma outra proteína, V, é embalada com este Complexo de proteína de DNA e fornece uma ligação estrutural ao capsídeo por intermédio da proteína VI. O vírus também contém uma protease codificadora de vírus, que é necessária para o processo de algumas das proteínas estruturais para produzir vírus infecciosos maduros.

Em 100 sorotipos distintos de adenovírus foi isolado pelo qual infectam várias espécies de mamíferos. 51 que são de origem humana. Deste modo um ou mais dos vetores adenovirais podem ser derivados a partir de um adenovírus humano. Exemplos de tais adenovírus derivados humanos são Adi, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Adl 1, Ad 24, Ad34, Ad35, Ad50/51 particularmente Ad5, Adll e Ad35. Os sorotipos humanos foram classificados em seis subgêneros (A a F) com base em diversos critérios biológicos, químicos, imunológicos e estruturais.

Através dos vetores com base no Ad5 foram usados extensivamente diversos testes de terapia de gene, podem haver limitações no uso de Ad5 e outro grupo C dos vetores adenovirais devido à imunidade pré- existente na população geral devido à infecção natural. Ad5 e outros membros do grupo C tende-se a ser entre os sorotipos mais soroprevalentes. A imunidade para vetores de existência podem desenvolver como um resultado da exposição ao vetor durante o tratamento. Estes tipos de imunidade preexistente ou desenvolvida por vetores soroprevalentes podem limitar a efetividade da terapia de gene ou esforços de vacinação. Sorotipos de adenovírus alternativos, deste modo constituem alvos muito importantes na perseguição dos sistemas de liberação do gene capaz de escapar da resposta imune hospedeira.

Uma tal área de sorotipos alternativos são aqueles derivados de primatas não humanos, especialmente adenovírus de chimpanzé. Ver Patente U.S. 6.083.716 que descreve o genoma de dois adenovírus de chimpanzé.

Será mostrado que os vetores adenovirais de chimpanzé ("Pan" ou " C") induz as respostas imunes fortes para os produtos transgene como eficientemente como os vetores adenovirais humanos (Fitzgerald et al. J. Immunol. 170:1416).

O adenovírus primata não humano pode ser isolado de linfonodos mesentéricos de chimpanzés. Os adenovírus de chimpanzés são suficientemente similares ao subtipo C de adenovírus humano para permitir a replicação do vírus anulado El em células HEK 293. Já os adenovírus de chimpanzés são filogeneticamente distintos a partir dos sorotipos humanos mais comuns (Ad2 e Ad5). O Pan 6 é menos intimamente relacionado com e é sorologicamente distinto de Pans 5, 7 e 9.

Deste modo um ou mais dos vetores adenovirais podem ser derivados de um adenovírus primata não humano por exemplo um adenovírus de chimpanzé tal como um selecionado dos sorotipos Pans, Pan 6, Pan 7 e Pan 9.

Os vetores adenovirais também podem ser derivados de mais do que um sorotipo de adenovírus, e cada um sorotipo pode ser da mesma ou diferente fonte. Por exemplo estes podem ser derivados de mais do que um sorotipo humano e/ou mais do que um sorotipo primata não humano. Os métodos para a construção quimérica dos vetores adenovirais são divulgadas em W02005/001103.

Existem certas restrições de tamanho associado com inserção de DNA heterólogo em adenovírus. O adenovírus humano tem a capacidade de embalar até 105% do comprimento do genoma de tipo selvagem (Bett et al 1993, J Virol 67 (10), 5911-21). O limite inferior para a embalagem para o adenovírus humano foi mostrado ser 75% do comprimento do genoma de tipo selvagem (Parks et al 1995, J Virol 71(4), 3293-8).

Um exemplo de adenovírus útil na presente invenção são os adenovírus que são distintos de sorotipos de ocorrência natural prevalente na população humana tal como Ad2 e Ad5. Este evita a indução de respostas imunes potentes contra o vetor que limita a eficácia de administrações subseqüentes do mesmo sorotipo pela absorção do vetor bloqueador através do anticorpo neutralizante e influenciando a toxicidade.

Deste modo, o adenovírus pode ser um adenovírus que não é um sorotipo de vírus humano de ocorrência natural prevalente. O adenovírus isolado de animais tem capsídeo distinto imunologicamente, os componentes héxon, pentona e fibra mas são filogeneticamente intimamente relatados. Especificamente, o vírus pode ser um adenovírus não humano, tal como um adenovírus símio e em particular um adenovírus de chimpanzé tal como Pan 5, 6, 7 ou 9. Exemplos de tais filamentos são descritos em WO 03/000283 e são disponíveis de American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, e outras fontes. Os filamentos de adenovírus de chimpanzés desejados são Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], e Pan 7 [ATCC VR-593].

O uso de adenovírus de chimpanzé é um conceito a ser vantajoso no uso de sorotipos de adenovírus humanos por causa da falta da imunidade pré-existente, em particular a falta de anticorpos de neutralização cruzada, pelo adenovírus na população alvo. A reação cruzada do adenovírus de chimpanzé com as respostas de anticorpo de neutralização pré-existentes é apenas presente em 2% da população alvo comparada com 35% no caso de certos vetores de adenovírus de candidatos humanos. Os adenovírus de chimpanzé são distintos de subtipos humanos mais comuns Ad2 e Ad5, mas são mais intimamente relatados ao Ad4 humano do sub-grupo E, que não é um subtipo prevalente. O Pan 6 é menos intimamente relacionado com Pan 5, 7 e 9.

O adenovírus da invenção pode ser replicação defeituosa. Isto significa que este tem uma capacidade reduzida para replicar em células não complementares, comparadas ao vírus do tipo selvagem. Este pode ser conduzido aproximadamente pela mutação do vírus por exemplo pela anulação de um gene envolvido na replicação, por exemplo anulação do gene Ela5Elb, E3 ou E4.

Os vetores adenovirais de acordo com a presente invenção podem ser derivados da replicação defeituosa de adenovírus que compreende uma anulação de El funcional. Deste modo os vetores adenovirais de acordo com a invenção podem ser de replicação defeituosa devido à ausência da capacidade para expressar El adenoviral e um Elb, isto é, são funcionalidades anuladas em El e em Elb. O adenovírus recombinante também pode conduzir as anulações funcionais em outros genes [ver WO 03/000283] por exemplo, anulações em genes E3 ou E4. O gene E3 prematuro atrasado por adenovírus pode ser eliminado a partir da seqüência de adenovírus que formam partes do vírus recombinante. A função de E3 não é necessária para a produção da partícula recombinante do adenovírus. Deste modo, este não é necessário para substituir a função deste produto do gene a fim de embalar um adenovírus recombinante útil na invenção. Em uma forma de realização particular o adenovírus recombinante tem funcionalidade anulada dos genes El e E3. A construção de tais vetores é descrito em Roy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004.

O adenovírus recombinante também pode ser construído tendo uma anulação funcional do gene E4, embora este pode ser desejável para reter a função E4 ORF6. Os vetores de adenovírus de acordo com a invenção também podem conter uma anulação no atraso do gene prematuro E2a. As anulações também pode ser feitas em qualquer dos genes tardios Ll diretamente ao L5 do genoma do adenovírus. Similarmente as anulações nos genes intermediários IX e IVa podem ser úteis. Outras anulações podem ser feitas nos outros genes de

adenovírus estrutural ou não estrutural. As anulações acima podem ser usadas individualmente, isto é uma seqüência de adenovírus para o uso na presente invenção pode conter anulações de apenas El. Alternativamente, as anulações dos genes inteiros ou porções destes eficazes para destruir sua atividade biológica que pode ser usada em qualquer combinação. Por exemplo em um vetor exemplar, as seqüências de adenovírus podem ter anulações dos genes Eleo gene E4, ou dos genes El, E2a e E3, ou dos genes El e E3 (tal como as anulações funcionais emElaeElb, e uma anulação de pelo menos parte de E3), ou dos genes El, E2a e E4, com ou sem anulações de E3 e assim por diante. Tais anulações podem ser anulações parciais ou totais destes genes e podem ser usados em combinação com outras mutações, tal como mutações sensíveis a temperatura para atingir um resultado desejado.

Os vetores adenovirais podem ser produzidos em qualquer linha celular adequada em que o vírus é capaz de replicação. Em particular, as linhas celulares de complemento que fornecem os fatores que faltam a partir do vetor viral que resulta nestas características de replicação diminuídas (tal como El e/ou E4) podendo ser usadas. Sem limitação, uma tal linha celular pode ser HeLa [Número de acessão ATCC CCL 2], A549 [Número de acessão ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por exemplo, Detroit 510, CCL 72] e células WI-38 [CCL 75], entre outras. Estas linhas celulares são todas disponíveis de American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209. Outras linhas celulares de origem adequadas podem ser obtidas de outras fontes, tal como células PER.C6©, como representado pelas células depositadas sob ECACC N0. 96022940 na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) no Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, UK) ou células Her 96 (Crucell).

A invenção estende-se ao uso de linhas celulares conhecidas para a preparação de um vetor viral que codifica uma proteína da presente invenção.

As seqüências de polinucleotídeos que codifica os polipeptídeos imunogênicos podem ser códons otimizados por células mamíferas. Tal otimização do códon é descrito em detalhes em WO 05/025614 por exemplo, no início da página 37.

Em uma forma de realização da presente invenção em que o vetor viral que compreende as construções de polinucleotídeos em que as ditas construções compreendem uma seqüência líder de terminal Ν. A seqüência de sinal, o domínio da transmembrana e domínio citoplásmico são individualmente todos opcionais presentes ou anulados. Em uma forma de realização da presente invenção todas estas regiões estão presentes mas modificadas.

Um promotor para o uso no vetor adenoviral de acordo com a invenção pode ser o promotor do gene HCMV IE, por exemplo em que a região não traduzida 5' do gene HCMV IE que compreende éxon 1 é incluída e íntron A é completamente ou parcialmente excluída como descrito em WO 02/36792.

Quando diversos antígenos são fundidos em uma proteína de fusão, tal proteína seria codificada por um polinucleotídeo sob o controle de um promotor simples.

Em uma forma de realização alternativa da invenção, diversos antígenos podem ser expressados separadamente através de promotores individuais, cada um dos ditos promotores podem ser o mesmo ou diferente. Ainda em uma outra forma de realização da invenção alguns dos antígenos podem formar uma fusão, ligado a um primeiro promotor e outros antígenos podem ser ligados a um segundo promotor, que pode ser o mesmo ou diferente do primeiro promotor.

Deste modo, o vetor adenoviral pode compreender um ou mais cassetes de expressões cada uma que codifica um antígeno sob o controle de um promotor. Alternativamente ou adicionalmente este pode compreender um ou mais cassetes de expressões cada um que codifica mais do que um antígeno sob o controle de um promotor, pelo qual os antígenos são portanto expressados como uma fusão. Cada cassete de expressão pode estar presente em mais do que um local no vetor adenoviral.

O polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos imunogênicos a serem expressados podem ser inseridos em qualquer das regiões anulados por adenovírus, por exemplo na região anula El.

Embora dois ou mais polinucleotídeos que codificam

polipeptídeos imunogênicos podem ser ligados como uma fusão, a proteína resultante pode ser expressada como uma proteína de fusão, ou este pode ser expressada como produtos de proteína separados, ou este pode ser expressado como uma proteína de fusão e então subseqüentemente partido em pequenas sub-unidades.

Imunogênico no contexto desta especificação é pretendido a referir-se pela capacidade de proibir uma resposta imune. Esta resposta pode ser então a proteína administrada em uma formulação apropriada, que pode incluir/necessitar de um adjuvante adequado. Um incentivador que compreende uma dose similar ou menos do que a dose original pode ser requerida para obter a resposta imunogênica requerida (incluindo um incentivador com uma existência diferente isto é incentivador heterólogo).

As formulações de composição e farmacêuticas de acordo com a invenção ainda podem incluir em mistura uma ou mais antígenos adicionais, tal como aqueles derivados de P. falciparium e/ou P. vivax, por exemplo em que o antígeno é selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl e RBP ou fragmento deste.

Outros exemplos, os antígenos derivados de P falciparum inclui, PfEMP-1, Pfs 16 antígenos, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-I e TRAP. Outros antígenos de plasmódio incluem P. falciparum EBA, GLURP, RAP 1, RAP2, Sequestrin, Pf332, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 e seus análogos em outros Plasmodium spp.

Na vacina da invenção, uma solução aquosa de antígeno híbrido pode ser usada diretamente. Alternativamente, a proteína com ou sem liofilização anterior pode ser misturada ou absorvida com adjuvantes, que inclui mas não são limitados a alume, dipeptídeo de muramila, saponinas tal como Quil A.

Os adjuvantes particulares são aqueles selecionados dos grupos de sais metálicos, emulsões em óleo em água, agonista receptores semelhantes a toll, (em particular agonista receptor 2 tipo toll, agonista receptor 3 tipo toll, agonista receptor 4 tipo toll, agonista receptor 7 tipo toll, agonista receptor 8 tipo toll e agonista receptor 9 tipo toll), saponinas ou combinações dos mesmos com o devido que sais metálicos são apenas usados em combinação com um outro adjuvante e não sozinho a não ser que estes são formulados em uma tal maneira que não mais do que cerca de 60% do antígeno é absorvido no sal metálico. Mais especificamente, não mais do que cerca de 50%, por exemplo 40% do antígeno é absorvido no sal metálico, e em uma forma de realização não mais do que cerca de 30% do antígeno é absorvido no sal metálico. O nível de anticorpo absorvido no sal metálico pode ser determinado por habilidades bem conhecidas na técnica. O nível de antígeno livre pode ser aumentado por, por exemplo, a formulação da composição na presença de íons de fosfato, tal como solução salina tamponada por fosfato, ou pelo aumento da razão do antígeno por sal metálico. Em uma forma de realização o adjuvante não inclui um sal metálico como adjuvante sozinho. Em uma forma de realização o adjuvante não inclui um sal metálico.

Em uma forma de realização o adjuvante é um ligando

receptor 4 tipo toll (TLR), por exemplo um agonista tal como um derivado do lipídeo A, em particular lipídeo A de monofosforila ou mais especificamente 3 lipídeo A de monofosforila desacilado (3D - MPL).

3 lipídeo A de monofosforila desacilado é conhecido da Patente U.S. N0 4.912.094 e Pedido de Patente UK N°. 2.220.211 (Ribi) e é disponível de Ribi Immunochem, Montana, USA.

O 3D-MPL é fornecido sob o nome comercial de MPL® por Corixa Corporation e primariamente promove as respostas de células T+CD4 com um fenotipo IGN-g (Thl). Estes podem ser produzidos de acordo com os métodos divulgados em GB 2 220 211 A. Quimicamente esta é uma mistura de 3-lipídeo A de monofosforila desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Geralmente nas composições da presente invenção pequenas partículas 3 D- MPL são usadas. Pequenas partículas 3D-MPL tem um tamanho de partícula tal que esta pode ser estéril-filtrada através de um filtro 0,22 μπι. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional N°. WO 94/21292.

Os derivados sintéticos do lipídeo A são conhecidos e consideram a ser agonistas TLR 4 incluindo, mas não limitando a: OMl74 (2-desóxi-6-0-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-

decanoilamino]-4-o-fosfono-P-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosildiidrogenfosfato), (WO

95/14026).

OM294 DP (3S, 9 R)-3-[(R)-

dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-

hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1,10-bis(di-hidrogenofosfato) (WO 99/64301 e WO 00/0462).

OM197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1 -di-hidrogenofosfato 10-(6- aminoexanoato) (WO 01/46127).

Tipicamente quando 3 D-MPL é usado o antígeno e 3 D-MPL são liberados com alume ou apresentados em emulsão de óleo em água ou emulsões múltiplas em óleo em água. A incorporação de 3D-MPL é vantajosa visto que esta é um estimulador de respostas de células T de efeito. Alternativamente o 3D-MPL pode ser formulado como lipossomas.

Outros ligandos TLR4 que podem ser usados são fosfatos de alquil glucosaminida (AGPs) tal como aqueles divulgados em WO 9850399 ou U.S. 6303347 (processos para preparação de AGPs também são divulgados), ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgados em U.S. 6764840. Alguns AGPs são agonistas TLR4, e alguns são antagonistas TLR4. Ambos são considerados úteis como adjuvantes.

Um outro imunoestimulante para o uso na presente invenção é Quil A e estes derivados. O Quil A é uma preparação de saponina isolada de South American tree Quilaja Saponaria Molina e foi a primeira descrita como tendo uma atividade adjuvante por Dalsgaard et al. in 1974 ("Saponin adjuvantes", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254). Os fragmentos purificados de Quil A foi isolado por HPLC que retém a atividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (EP O 362 278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecido como QA7 e QA21). O QS21 é uma saponina natural derivado a partir do córtex de Quillaja saponaria Molina que induz células T citotóxicas CD8+ (CTLs), as células Thl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante.

As formulações particulares de QS21 foram descritas que ainda compreende um esterol (WO 96/33739). Da razão do QS21: esterol será tipicamente a fim de 1:100 a 1:1 peso a peso.

Geralmente um excesso de esterol é presente, da razão do QS21: esterol sendo pelo menos 1:2 p/p. Tipicamente para a administração humana QS21 e esterol estarão presentes na vacina na faixa de cerca de 1 μg a cerca de 100 μg, tal como cerca de 10 μg a cerca de 50 μg por dose.

Os lipossomas geralmente contém um lipídeo neutro, por exemplo fosfatidilcolina, que é usualmente não cristalina em temperatura ambiente, por exemplo fosfatidilcolina de gema de ovo, fosfatidilcolina de dioleoila ou fosfatidilcolina de dilaurila.

Os lipossomas também podem conter uma carga de lipídeo que aumenta a estabilidade da estrutura QS21 do lipossoma para lipossomas compostos de lipídeos saturados. Nestes casos a quantidade de lipídeos carregados é freqüentemente de 1 a 20% p/p, tal como 5 a 10%. Da razão do esterol por fosfolipídeo é de 1 a 50% (mol/mol), tal como 20 a 25%.

Estas composições podem conter MPL (3-lipídeo A de monofosforila desacilado, também conhecido como 3D-MPL). O 3D-MPL é conhecido de GB 2 220 211 (Ribi) como uma mistura de 3 tipos de de-O- lipídeo A monofosforila acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é fabricado por Ribi Immunochem, Montana.

Geralmente nas composições da invenção pequenas partículas 3D-MPL, que tem um tamanho de partícula tal que esta pode ser estéril- filtrada através de um filtro de 0,22 μπι, é utilizado. Tais preparações são descritas em WO 94/21292.

As saponinas podem ser separadas na forma de micelas, micelas misturadas (geralmente, mas não exclusivamente com sais biliares) ou podem ser na forma de matrizes ISCOM (EP O 109 942 BI), lipossomas ou estruturas coloidais relatadas tal como complexos multiméricos semelhantes ao anel ou semelhantes ao verme ou estruturas lipídicas/em camadas e lamelas quando formuladas com colesterol e lipídeo, ou na forma de uma emulsão de óleo em água (por exemplo como no WO 95/17210). As saponinas podem ser freqüentemente associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO 98/15287).

Usualmente, a saponina é apresentada na forma de um lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores também podem ser usados. Exemplos de oligonucleotídeos para o uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção inclui CpG contendo oligonucleotídeos, geralmente contendo dois ou mais motivos de CpG de dinucleotídeos separados por pelo menos três, mais freqüentemente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo de CpG é um nucleotídeo de citocina seguido por um nucleotídeo de guanina. Os oligonucleotídeos CpG são tipicamente deoxinucleotídeos. Em uma forma de realização o internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato, ou mais preferivelmente uma ligação de fosforotioato, embora fosfodiéster e outros ligações de internucleotídeos estão dentro do escopo da invenção. Também incluídos dentro do escopo da invenção são oligonucleotídeos com linguagens de internucleotídeos misturados. Os métodos para a produção de fosforotioato de oligonucleotídeos ou fosforoditioato são descritos em U.S. 5.666.153, U.S. 5.278.302 e WO 95/26204.

Exemplos de oligonucleotídeos são como seguintes: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456), As seqüências podem conter fosforotioato de linguagens de

internucleotídeos modificados.

Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender uma ou mais seqüências acima em que estes tem anulações que não em seqüência ou adições destes. Os oligonucleotídeos CpG podem ser sintetizados por qualquer

método conhecido na técnica (por exemplo ver EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático.

Exemplos de um agonista TLR 2 inclui peptidoglicano ou lipoproteína. As Imidazoquinolinas, tal como Imiquimod e Resiquimod são conhecidos agonistas TLR7. O RNA filamentado simples também é um conhecido agonista TLR (TLR8 em humanos e TLR7 em camundongos), considerando RNA filamentado duplo e poli IC (ácido poliinosínico- policitidílico - um mimético sintético comercial de RNA viral) são exemplares de agonistas TLR 3. O 3DMPL é um exemplo de um agonista TLR4 enquanto o CpG é um exemplo de um agonista TLR9.

Um imunoestimulante pode alternativamente ou em adição serão incluídos. Em uma forma de realização este imunoestimulante será 3 de lipídeo A de monofosforila acilado (3DMPL). As combinações dos adjuvantes inclui 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 BI), emulsões em óleo em água que compreendem 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), ou 3DMPL formulados com outros carreadores (EP 0 689 454 BI) incluindo lipossomas. Outros sistemas de adjuvante preferidos compreendem uma combinação de 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG como descrito em U.S. 6558670 e U.S. 6544518.

Em um aspecto o adjuvante compreende 3D-MPL.

Em um aspecto o adjuvante compreende QS2I.

Em um aspecto o adjuvante compreende CpG.

Em um aspecto o adjuvante compreende QS21 e 3D-MPL.

Em um aspecto o adjuvante compreende QS21, 3D-MPL e

CpG

Em um aspecto o adjuvante é formulado como uma emulsão de óleo em água. Em um aspecto o adjuvante é formulado como lipossomas.

Em uma forma de realização da presente invenção fornece uma vacina que compreende uma proteína híbrida como neste descrito, tal como CSV-S em combinação com 3D-MPL e um carreador. Tipicamente o carreador será uma emulsão de óleo em água ou alume. Mais especificamente a proteína híbrida é apresentada como uma partícula ou partícula misturada como neste descrito.

A proteína da presente invenção também pode ser encapsulada em micropartículas tal como lipossomas.

A preparação da vacina é geralmente descrita em New Trends e Developments in Vacinas, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. A encapsulação dentro dos lipossomas é descrito, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877.

A quantidade da proteína da presente invenção presente em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem ser significante, efeitos colaterais adversos em vacina típicas. Tal quantidade variará dependo pelo qual o imunogênio específico é utilizado e se ou não a vacina é adjuvante. Geralmente, não é esperado que cada um compreenderá de 1 a 1000 μ§ de proteína, por exemplo 1 a 200 tal como 10 a 100 mais particularmente 10 a 40 μg. Uma ótima quantidade para uma vacina particular pode ser determinada pelo estudos padrão envolvendo por observação de tituladores de anticorpo e outras respostas em pacientes. Seguindo uma vacinação inicial, os pacientes receberão preferivelmente uma ajuda em cerca de 4 semanas, seguido por ajudas repetidas a cada seis meses para tão longo quanto um risco de infecção existente. A resposta imune a uma proteína desta invenção é intensificado pelo uso de adjuvante e ou um imunoestimulante.

A quantidade de 3 D-MPL usada é geralmente pequena, mas dependendo da formulação da vacina pode ser na região de 1 a 1000μg por dose, geralmente 1 a 500 μg por dose, e mais tal como entre 1 a 100 μg por dose (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 μg por dose).

A quantidade de CpG ou os oligonucleotídeos imunoestimuladores nos adjuvantes ou vacinas da presente invenção é geralmente pequena, mas dependendo da formulação da vacina pode ser na região de 1 a 1000 μg por dose, geralmente 1 a 500 μg por dose, e mais tal como entre 1 a 100 μg por dose (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 μg por dose).

A quantidade de saponina para o uso nos adjuvantes da presente invenção pode ser na região de 1 a 1000 μg por dose, geralmente 1 a 500 μg por dose, mais tal como 1 a 250 μg por dose, e mais especificamente entre 1 a 100 μg por dose (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 μg por dose).

Em um aspecto adicional a invenção fornece uma combinação da vacina fornecendo imunoproteção contra malária causada por P. faciparum e/ou PMvax que compreende uma proteína híbrida derivada da proteína CS de P. vivax tal como descrito neste. Em um aspecto aqui é fornecido uma vacina que compreende partículas imunogênicas como descrito neste, e opcionalmente ainda que compreendem partículas imunogênicas de TRS, S em mistura (como descrito em WO 93/10152) e um adjuvante imunoestimulador apropriado.

As formulações da presente invenção podem ser usadas no tratamento para ambos propósitos profiláticos e terapêuticos.

De acordo com a invenção fornece o uso de qualquer aspecto da invenção descrito neste para o tratamento, em particular uma composição da vacina como descrito neste para o uso na medicina.

Um aspecto adicional da presente invenção é para fornecer um processo para a preparação da proteína híbrida da invenção, pelo qual o processo compreende a seqüência de um nucleotídeo que expressa e que codificam a proteína, em um hospedeiro adequado, preferivelmente uma levedura, e recuperação do produto.

A invenção também estende-se aos métodos de preparação da composição farmacêutica tal como vacinas utilizando um ou mais aspectos descritos neste.

Um aspecto adicional da invenção encontra-se em um método de tratamento de um paciente susceptível à infecção por plasmódio pela administração de uma quantidade efetiva de uma vacina como mais acima descrito.

A vacina inclui uma vacina parenteral.

Deste modo a invenção estende-se ao uso dos antígenos tal como proteínas de fusão híbridas e/ou partículas de lipoproteínas da invenção e composições que compreendem o mesmo para o tratamento e particular no uso na fabricação de um medicamento para o tratamento/prevenção da malária, tal como malária causada por P. vivax e/ou P.falciparum.

As proteínas e/ou vetores virais que codificam o mesmo podem não ser administrados no início de regime de ajuda, por exemplo como especificamente descrito em WO 2004/037189.

No contexto desta especificação "que compreende" é a ser interpretado como "incluindo".

Os aspectos da invenção que compreende certos elementos também são pretendidos à estender-se aos ditos aspectos "que consistem" ou "que consistem essencialmente" dos elementos relevantes. EXEMPLOS Exemplo 1

Descrição da Cepa Yl 834

A cepa recombinante de levedura Yl834 expressa a proteína de fusão CSV-S. Esta consiste da cepa hospedeira de Saccharomyces cerevisiae DC5 transformada com o vetor de expressão recombinante pRIT15546.

O DC5 é uma cepa de levedura de laboratório (ATCC N°: 20820) com os seguintes genotipos: leu2-3, leu2-112, his3, canl-11. A mutação leu-2 dupla permite a seleção para a absorção e manutenção do vetor pRIT15546 com os carreadores de cópia do gene LEU-2 funcional. Apenas aquelas células que conduzem um vetor com um gene LEU-2 pode desenvolver quando a leucina está ausente do meio de desenvolvimento.

O vetor pRIT15546 é um vetor de expressão epissomal de levedura (vetor de base 2 μ) que conduz o cassete de expressão CSV-S. A expressão recombinante é conduzida por um promotor derivado do gene TDH3 de levedura (expressão constitutiva). A construção do vetor pRIT 15546 é detalhada abaixo. Construção do vetor pRIT15546.

Um gene sintético CSV, com um uso do códon apropriado para a expressão de levedura foi construído e sub-clonado no vetor pUC57 (Número de Acessão GenBank/EMBL Y14837). O plasmídeo resultante pUC57/CSV e o vetor de expressão de levedura pGfl-S2 foram ambos restritos com a enzima apropriada. O vetor pGfl-S2 foi construído (em GSK) por um procedimento de clonagem de multi-etapa. Este vetor, que já realiza um cassete de expressão S, permite a construção dos genes de fusão do vetor, como a fusão na estrutura do terminal N com o gene S do vírus da Hepatite B. O vetor de expressão final, após a verificação da seqüência, foi denominado pRIT15546 (Fig 3) Transformação da cepa DC5.

A cepa leu- e his-auxotrófica DC5 foi transformada com o plasmídeo recombinante pRIT15546, pelo uso do protocolo padrão de levedura. As células transformadas foram colocadas em placas seletivas de ágar. Um transformante foi selecionado ou recebido pela designação oficial Y1834.

EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE:

Yl 834 é desenvolvida, a 30°C, em YNB (Yeast Nitrogen Base disponível de Kracker Scientific Inc) o meio mínimo suplementado a uma concentração final de 8 μg/ml de histidina por um O.D (620 nm) de cerca de 0,5 (aqui 0,770). Então as células são coletadas e os extratos celulares são preparados. Preparação do Extrato: As células são recolocadas em suspensão em Tampão de

ruptura e mecanicamente rompidas (contas de vidro). O extrato é centrifugado por 5 a 10 minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é escoada em SDS - PAGE 4 a 20%.

Tampão de ruptura: 50 mM de tampão de fosfato Na (PH:7,5) 4mMEDTA

a 0,5% de Tween

+ coquetel inibidor de protease (Completo/ ROCHE)

Concentração celular: 100 ml de cultura (OD: 0,5) em 5 ml de tampão de ruptura = concentração de 10 OD unidade/ml. Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado por 5 a 10 minutos/

5000 rpm

DETECÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são escoados por SDS-PAGE 4 a 20%, as proteínas transferida a membrana de nitrocelulose e submetida ao imunotingimento. Ver Fig. 2 Análise de Western blot:

Reagente = anti-S de anticorpo monoclonal de camundongo (preparados por GSK Biologicals)-(diluição: 1/500) Anticorpos anti-S que são comercialmente disponíveis podem ser substituídos por aqueles utilizados neste método. Alternativamente os anticorpos anti-CSV podem ser utilizados, por exemplo aqueles conhecidos como MR4 disponível de NIH.

Proteína de fusão CSV-S:

MW teoricamente: 51794 Daltons MW evidente: 55 kDa

Exemplo 2:

Descrição da Cepa Yl 840

A cepa Pichia pastoris Y1840 expressa a proteína de fusão CSV-S. A cepa Yl840 contém quatro cópias do gene de fusão CSV-S, integrado no genoma. Para obter uma cepa que expressa a proteína de fusão CSV-S, a cepa Pichiapastoris GSl 15 foi transformada com um fragmento de DNA linear integrado com os carreadores de cassete CSV-S e o gene HIS4 funcional.

O GSl 15 é uma cepa de levedura de laboratório (ATCC N°: 20864) com os seguintes genotipos: his4. A mutação his4 permite a seleção para a absorção do fragmento de DNA linear derivado de pRIT15607 com os carreadores do cassete CSV-S e o gene HIS4 funcional.

O vetor pRIT 15607 é um vetor de expressão integrado de Pichia pastoris que conduz o cassete de expressão CSV-S. A expressão recombinante é conduzida pelo metanol forte, firme, regulado que induz ao promotor AOXl. A construção do vetor pRIT15607 é detalhada abaixo. Construção do vetor pRIT15607.

O gene de fusão CSV-S, presente no pRIT15546, foi amplificado por PCR e clonado no vetor intermediário fácil pGEM-T (Promega, cat N°: # Al360). Após a verificação da seqüência o plasmídeo recombinante foi digerido com as enzimas de restrição apropriadas e clonadas no vetor integrado pHIL-D2 Pichia pastoris. O vetor de expressão final, após a verificação da seqüência, foi denominado pRIT15607 (Fig 5). A proteína de fusão CSV-S codificada pelo plasmídeo pRIT15607 é quase idêntica à seqüência detalhada na SEQ ID N0 17, exceto que a metionina 2 é substituída por uma valina ( ver SEQ. ID N0 19 e SEQ. ID N0 20). A digestão de pRIT 15607 com endonuclease NotI libera um fragmento linear 6816 bp que pode ser integrado no genoma da levedura pela recombinação homóloga no local AOXl residente. Transformação da cepa GS 115.

A cepa hospedeira GS 115 foi transformada com o plasmídeo recombinante pRIT 15607. Antes da transformação o vetor integrado foi restrito com NotI a fim de liberar um fragmento de DNA linear que realiza o cassete de expressão e o marcador selecionável HIS4. A restrição NotI favorecerá a integração no local AOX1. As células transformadas foram colocadas em placas seletivas de ágar. Os clones integrantes de multi-cópias foram selecionados pela análise de dot blot quantitativa. Entre os clones selecionados como tendo um alto número de cópias de cassetes de expressão CSVS integrados, um destes mostram que o alto nível de expressão para a proteína recombinante CSV-S foi selecionada e dada pela designação oficial Yl 840. Este clone realizou quatro cópias do gene de fusão CSV-S. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE:

Yl 840 é desenvolvida, a 30°C, em YNB (Yeast Nitrogen Base disponível de Kracker Scientific Inc) o meio mínimo suplementado com 1% de glicerol como uma fonte de carbono a um O.D. (620 nm) de cerca de 0,5 (0,709 neste caso). Então as células são coletadas recolocadas em suspensão no mesmo volume do meio YNB suplementado com 1% de metanol como uma fonte de carbono (como induzidor) e incubado a 30°C por cerca de 16 horas.

PREPARAÇÃO DO EXTRATO:

O metanol que induz as células são centrifugados, os grânulos das células recolocadas em suspensão em tampão de ruptura e mecanicamente rompidas (gotas de vidro de vidro ou French press). O extrato é centrifugado por 5 a 10 minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é escoada em SDS - PAGE 12,5%.

Tampão de ruptura: 60mM de Na2HP04

40mM de NaH2PO4 ImM de MgSO4 IOMm de KCl

2 Mn de PMSF

a 0,5% de Tween Concentração celular: 100 ml de cultura (OD: 0,5) em 2,5 ml de tampão de

ruptura = concentração de 20 OD unidade/ml. Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado de 5 a 10 minutos/5000 rpm

DETECÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são escoados por SDS-PAGE a 12,5%, as proteínas transferidas, a membrana de nitrocelulose é submetida ao imunotingimento. Ver Figura 6. Análise de Western blot:

Reagente = anti-S de anticorpo monoclonal de camundongo (preparado por GSK Biologicals)- (diluição: 1/250) anticorpos anti-S que são comercialmente disponíveis podem ser substituídos por aqueles utilizados neste método. Alternativamente anticorpos anti-CSV podem ser utilizados, por exemplo aqueles conhecidos como MR4 disponível de NIH.

Proteína de fusão CSV-S: MW teoricamente: 51762 Daltons

MW evidente: 55 kDa

Exemplo 3:

Descrição da Cepa Yl 835

A cepa recombinante de levedura Yl 835 simultaneamente expressa a proteína de fusão CSV-S e o antígeno S. Para obter uma cepa que co-expressa CSV-S e proteínas S, a cepa Saccharomyces eerevisiae Y1295, que já realiza cinco cópias integradas de cassetes de expressões S, foi transformada com o vetor de expressão recombinante integrado pRIT15582.

A cepa Y1295 foi construída a GSK por um procedimento de transformação de multi-etapas. A construção da cepa do vetor Y1295 é descrito em WO 93/10152. A cepa Yl295 tem os seguintes fenótipos: leu2-3, leu2-112, gall. A mutação leu-2 permite a seleção para a absorção de fragmento de DNA linear derivado de pRIT15582 com os carreadores de cassete CSV-S e do gene LEU2 funcional.

O vetor pRIT15582 é um vetor de expressão integrado de levedura (vetor com base Ty) que conduz o cassete de expressão CSV-S. A expressão recombinante é conduzida por um promotor derivado do gene TDH3 de levedura (expressão constitutiva). A construção do vetor pRIT15582 é detalhada abaixo. Construção do vetor integrado pRIT15582.

O material de partida usado para construir o vetor pRIT15582 foi o plasmídeo de expressão pRIT15546 (Fig 3). A construção do vetor deste plasmídeo é descrito no exemplo 1. A digestão de pRIT 15546 com endonuclease HindIII libera um fragmento de DNA longo de 3706 bp correspondente ao cassete de expressão CSV-S completo (pTDH3 + CSV-S + tARG3). Este fragmento de DNA HindIII (após o enchimento com polimerase de DNA T4) foi inserido no vetor integrado com base Ty pRIT13144 no único local de clonagem SalI (SalI restrito/T4 tratado).0 plasmídeo resultante pRIT15582 contém, em adição ao cassete de expressão, o gene de levedura LEU2 como marcador seletivo (Fig 8). A digestão de pRIT15582 com endonuclease XhoI libera um fragmento linear 8500 bp mostrado na figura 4 que pode ser integrado no genoma de levedura pela recombinação homóloga dos finais livres com elementos Ty residentes. Transformação da cepa Y1295.

Para obter uma cepa que expressa ambas as proteínas S e CSV-S, a cepa Y1295 foi transformada com o fragmento linear 8500bp linear XhoI (Fig 9) com seleção para as colônias Leu+. Diversos integrantes contendo séries de ambos os cassetes de expressões presentes no genoma em várias razões foram obtidas. Uma realização de transformação de quatro cópias de cassetes CSV-S foi selecionada e dada pela designação oficial Yl 835. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE:

Yl835 é desenvolvida, a 30°C, em YNB (Yeast Nitrogen Base disponível de Kracker Scientific Inc) o meio mínimo a um O.D (620 nm) de cerca de 0,5 (0,8). Então as células são coletadas e os extratos celulares são preparados.

ANÁLISE DOS PRODUTOS DE EXPRESSÃO POR IMMUNOBLOTTING.

PREPARAÇÃO DO EXTRATO:

As células são recolocadas em suspensão no tampão de ruptura e mecanicamente rompidas (contas de vidro). O extrato é centrifugado por 5 a 10 minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é escoada em SDS - PAGE a 12,5%. Tampão de ruptura: 50mM de tampão de fosfato Na (PH:7,5)

4mMEDTA a 0,5% de Tween

+ coquetel inibidor de protease (completo/ROCHE) Concentração celular: 100 ml de cultura (OD:0,5) em 2,5 ml de tampão de

ruptura = concentração de 20 OD unidade/ml. Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado de 5 a 10 minutos/

5000 rpm

DETECÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são escoados por SDS-PAGE a 12,5%, as proteínas transferidas a membrana de nitrocelulose e submetida ao imunotingimento.

Análise de Western blot (Fig 10): Reagentes: 1/anti-S de anticorpo monoclonal de camundongo (preparados por GSK Biologicals)- (diluição: 1/250)

2/anti-CSV de anticorpo policlonal de coelho (cordialmente fornecido por WRAIR)- diluição 1/20.000.

Os anticorpos anti-S bem como os anticorpos anti- P.vivax/CSP que são comercialmente disponíveis podem ser substituídos por aqueles utilizados neste método. Referências

(1) Harford Ν, Cabezon Τ, Colau Β, et al., "Construction and

Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen", Postgrad Med J 63, Supp. 2: 65-70, 1987. (2) Jaeobs E, Rutgers T, Voet P, et al., "Simultaneous Synthesis and

Assembly of Various Hepatitis B Surfaee Proteins in Saccharomyces cerevisiae", Gene 80: 279-291, 1989.

(3) Vieira J and Messing J, "The pUC plasmids, an M13mp7- Derived System for Insertion Mutagenesis and Seqüencing with Synthetie

Universal Primers", *_Gene 19: 259-268, 1982.

(4) Hinnen A, Hieks JB, and Fink GR, "Transformation of Yeast", Proc Natl Aead Sei USA 75: 1929-1933,1980.

(5) Broaeh JR, Strathern JN, and Hieks JB, "Transformation in Yeast Development of a Hybrid Cloning Veetor and Isolation of the CAN 1 Gene",

Gene 8: 121-133, 1979.

(6) Zhang H, et al., "Double Stranded SDNA Seqüencing as a Choice for DNA Seqüencing", Nucleic Acids Research 16: 1220, 1988.

(7) Dame JB, Williams JL. Mc Cutchan TF, et al., "Structure of the Gene Enconding the Immunodominant Surface Antigen on the Sporozóites of

the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum", Science 225: 593-599, 1984.

(8) Valenzuela P, Gray P, Quiroga M, et al., "Nucleotide Seqüences of the Gene Coding for the Major Protein do vírus da Hepatite B Surface Antigen", Nature 280: 815-819, 1979.

(9) In SS, Kee-Hoyung L, Young RK, et al., " comparison of

Immunological

Responses to Various Types of Circunsporozóite Proteins of Plasmodium vivax in Malaria Patients of Korea", Microbiol. Immunol. 48(2): 119-123, 2004;Microbiol. Immunol. 2004; 48(2): 119-123.

(10) Rathore D, Sacci JB, de Ia Vega Ρ, et al., « Binding and Invasion of Liver Cells by Plasmodium falciparum Sporozóites", J. Biol. Chem. 277(9): 7092-7098, 2002. Rathore et al, 2002, J. Biol. Chem. 277, 7092-8. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID HO: 1

REGIÃO 1

KLKQP

SEQ ID NO: 2 REGIÃO Π MAIS

CSVTCG

SEQ ID HOt 3 Repetição de VK210

GDRAAGQfA

SBQ ID NO: 4 Repetição de VK210 GDRADGQPA

SEQ ID NO: 5 Repetição de VK210

GDRADGQAA

SEQ ID NO: 6 Repetição de VK210

GNGAGGQPA SSQ ID NOi 7

Repetição de VK210

GDGAAGQPA SEQ ID NO: 8

Repetição de VK210

GDRAA GOAA

SEQ ID NO: 9

Repetição de VKIlO

GNGAGGOAA SEQ XD NO: 10

Repetição de VK210 principal

ANGAGNQPG SEQ ID NO: 11

Inserto de 12 ajninoác ido s

GGNAAKKKABDA SEQ ID NO: 12

Seqüência de micleotídeo IV-CS

Acacat t gcggac ataat g t aga 111 at c t aaagc t a t aaa 111 aaa t gg t g t aaac ttcaataacgtagacgctagtteactcggggctgcg cacgtaggtcagcctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaa gaaggtgatgctaaaaagaaaaaggacg

gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatc gcgcggatggtcaagcggcgggtaatggg

gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcg gctggtcagccagcgggggatggtgc

ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagceagcgggggatcgcgcgga tggtcaaccagccggtgatcgcgcggct

ggecaagcggccggtaatggggcggggggtcaageggccgcgaacggagcggggaac cagccaggcggcggtaacgctgcga

a t aaaaaagcggaaga t gcggg t gg taa cgcgggc gg taat gc gggc ggc caagg t c agaacaacgaaggggctaatgcaccaaa

cgaaaaa t c t g t caaagaat at c t c gataaag t c cg çg c t acag t agggacagaa t g gacgccatgc t c tgt aacatgt ggtg t cggggt

acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaa tgatctcgaaacggatgtctgcaca

SEQ ID HO: 13

Seqüência, de aminoácidos da proteína Pv-CS

THCGHNVDLSKAIKLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN

PDDÊEGDAKKKKDÜKKAÊPKSPRHNKLKgreDRADGQAAÜNGAGtí

QPAGDRAAGCPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG

QPAGDRAAGQAAGKGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG

KAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYIJDKVRATVGTEWTP CSVT

CGVGVHVRRRVNAANKKPEDLTLtroLSTDVCT

SSQ ID SO: 14

Repetição tipo 2 menor

ANGAGDQPG

SBQ ID NO 15] Gene híbrido CSV

ACCCATTGTCGTCACAATXSTCGATTIXn^TAAGGCCATTAACT 6 O

AACJ^CGTCeATOCTTCTTCTTTAMTtSCCGCTCATGTTGGTCJUiTCTí^TTCJiaSAGâT 12 0

AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGM^^ 130

AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC 240

gacccacaaccacctcctaatcgtcctcgaoct £aaccacctcctcacacacctc CCCCT 300

cagcctgctggtgatagagctgctggacaacctgctggagacggtgccgccggtcaacct 360

gctggtgatagagcagacggacaaccagctggtgaccctgctgacggacagccagccggc 420

GATAOGOCTSCAGeTCA/taCCGCTaGTAACOeiKJCCGaTQa^CAAaC-rSCTQCTAACGGT 4 80

GCTGGTAACGAACCAGGTGGTSSTAAOGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCrOG^G? 54 0

aatgctggj^taatc-caggtggtcagggtcaaaacaacgaaggtgctaacgctccaaac 600

GIUUU^TCICTrtóGGAATACTTAGATMGGCTAGAGCTACf GTCGGTACTGAAIGGACT 660

CCATGTTCTGTTACrrG-TGGTGTCGGTlXJTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC 720

AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACXiACTTGGAAACTGACGTTTGTACT 771

SEQ ID No 16] Fusão de CSV-S j Seqüência de nucleotídeos

ATGATGGcTcccGGGAcccATTc-TGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCArTA^-CTTG 6 0 AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCITCTTC^ 120

TCttrcTTCAAGAGGTAGAGGlTTA^ 18 0

AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAG AftAACAAGTTGAAAC^ 24 0

CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTOSTAATGGTGCTGGAGCTCAACCAGCTGGT 3 0 Q

GACAGAÍK^TGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAiGCTGCTGGACAACCTGCrrGGAGACGGT 360

GCCGCCGCTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGAC^CCAGC^ 42 0

GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGOTAACGGTGCCGGTGGTCAA 480

GCTGCTGCTAACGGTGCT<^TAACCAACCAGGTGGT3GTAACGCT3CCAACAAGAAAGCT 54 0

GAAGACGCríXTGGTAATGCTGGAGGTAATCCAGGTGGTCAGG^ 600

G CTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGrTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCT ACTGTC 660

GGTAC TG AATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA 720

GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACrTGGAAACTGACGTT 780

TGT ACTCCCi^ GC CTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG 840

CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCITGTTGACAAGAATCCT(^CAATACCGCAGAGTCTA 900

GACTCG TQGTGGACTTCTCTCAftTTITCTAG<3GGGATCACCCGTGTOTCTTGGCCAAAAT 960

TCGCAGT<XCaUlCCrCCAATCACTCACCAACCTCCTQTCCTCCAAT^ 1020

CTCl^ATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTC^ 1080

TTCTTATrGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA 114 0

TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCRAAACCTOCACGACTCCTCCTCAAGGCAACTCT 12 0 0

ATSTTTÜCCTCATGTTGCTGTACA2WÍCCTACGGATGGARATTGCACCTGTATTCCCATC 1260

CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG 1320

CTCAGTTTACrAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT 1360

TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT 14 4 0

ATACCGCTGTTACCAAITTTCTTTTSTCTCTGGGTATACATTTAA 1485

SSQ XO Ko 17 Seqüência de amino ácidos

hmapgth cghnvdls kaiklngwfnk1Vrdas slgaahvgqsasrgrglgenpddeegda3í e 0

kxkxigkkaepknprenklkqpgdeuumqaagn^ 12 0

aagqpagdradgqpagdradgopagdraagqa^^ 18 0

exjaggnaggnaggqgqnneganft£n^^ 240

vnaamkk PEOLTIJfDLETDVC^PVTO^I tsgflg pllvlqagpflltk 1 ltl PQSL 300

dswwts lnfmigs pvclgonsqs ptsnhsptscppicpgyrwmclrrfiiflpxlllcli 360

fll%^ldy<X>!lpvcplipgsttttnxjpcktctt?AMNSMFPSCCCTKPTIJGNCTCl?I 420

psswaf axylkewasvrfswlsllvpfvqvífvgls ptvwlsaiwwkwywg ps lysivspf 480

ipllpiffclwvyi 4 94

SEQ XD »0. 18

Seqüência de nucleotídeos do cassete de expressão RTS e produto de tradução previsto da proteína híbrida de RTS-HBsAg. O produto de tradução iniciado do códon é mestrado abaixo da seqüência de DNA.

aagcttaccagttctcacacggaac^cactaatggacacaaattcgaaatactttgacc ctattttcgaggaccttgtcacct^agcccaagagagccaagat^aaattttcctatg

acttgatgcaaattcccaaagctaataacaiocaagacacgtacggtcaagaagacatat ttgacctcttaactggttcagacgcgactgcctcatcagtaajsacccgt^aaaagaac^ tacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaagaagttta atgacgcggaggcct^ggcaaaaagattccttgattacgtaagg^gttagaatcatt^ gaataaaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaaga

atacgtaaataattaatrgtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaattagccttt TAATTCTX3CTGTAACCCGTACATGCCCAAAATA)mgggcgggttacacagaatatataac ATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATCCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCTCGC TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCÃGÍ^CCAAAA

aaccatcagttcataggtccattc7cttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacm

gcaaaaaacgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctg<íagtaaatgatgacac AAGOCAATTGACCC^CGCATGTATCTATCTCATrrTCTTACACCTTCTATrACCTTCTGC TCXCTCTGAT3rTMAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAAC CAGTTCCCTGAAATTATTCC CCTACTTGACT AAtAASTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGT AAATCTGTAAATCrAT

AGAACTTAGTTTO^TAAACACA»^ MetMetAlaProAspProAsnA

CAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCAAACCCC^

LaAsnProAs jsAlaAsnProAsnAlaAsnProAs IiAlaAsnProAsnAl aAsnProAsnA

CAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG I^aAsnProAsrAlaAsnProAsriAlaAsnProAsnAlaAsnProAfinAlaAariPrDAenA

CAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG

LaAsnProAsnAlaAsnPr oAsnAl aAsnProAsnAlaAsnP roAsnAiaAsr.ProAsna

CAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCÇLAACCCCAATGC^

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAl aAsnProAsnAl aAsnProAsnLysAsnAsnGlnG

GTAATGGAí^iAGGTCACAATATCCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTA LyAsnGlyGlnG IyHi sA^r^tProAsnAípProAínAspProAanArgAsnValAspGliLAsnAlaA

ATGCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAAC

SnAlaAsnAsnAi a Va lLysAsnAsnAsnAÊnGluGluProSerAspl.ysHi s 11 eG IuG AATATTTAAAGAAAATAAAAAATTCTATTTCAACTGJ^TGGTCCCCATGTAGTGTAACTT LnTyrLeuLysLyslleLysAsnSerlleSerThrGluTrpSerProCysSerValThrC

GTGGAAATGGTATTCAAGTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCTAATAAACCTAAAGACGAAT YsGlyAsnGly 11 eGlnValArgl 1*Ly« ProGlySe rAl aAarlLy s ProLysAspGluL

TAGATTATGAAAATGATATTCAAAAAAAAATrrGTAAAATGGAAAAGTGCTCGAGTGTGT euAspTyrGl uAsaAspI 1 eGluLysLys X1 eCysLysMetGluLysCysSexS erVal P

TTAA"rGTCGTAAATAGTC<^CCTGTGACGAACATG3AGAACATCACATCAGOATTCCTAG HeAsnValValAsnSerArgProValThrAfinKetGluAsnlleThrSerGlyPheLeuG

GACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTITCTTGTTCACAAGAATCCTCACAATACCGC Ly PtoLeuLeuVa ILeuGlnAlaGly PhiPhtLeuLeuThr ArgI IeLeuThr IleProG

AGAGTCTAGACTCGTCGTGaACTrCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTaTGTCTTG LnSerLettABpSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlySerPraValCysLeuG

GCCAAAATTCGC^.GTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTC LyGlnAsnSerGlíLSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProlleCysP CTGGTTATCGCTGGATGTGTCTCCGCGTTITATCATATTCCTC^

Rog IyTyrAr gTrpMe t CysLeuArgArgpfae 11 el Ie PfaeLeuPhei IeLeuLeuLeuC

GCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCrGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTG TCCT CTAA YsLeu Ile PheLeuLeuVal LeuLeuAspTyrG InGlyMetLeuProValCysProLeuI

TTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAG LeppoalySerThrThrTh rAsnThrG lyProCyeLysThrCysThrThrProAlaGlnG

GCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTAC^AAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTA LyABr^er>5etPheProSerCysCycCysThrLysProThrAspGlyAsnC^sThrCysI

TTCCCATCCCATÇGTCCTGGGCTTrCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTOVGTCCGTT LeProIleProSerSerTrpAlaPheAlaLyfiTry LeuTrpQluTrpAlaserValArf P

TCTCTTGGCTCAGrrTACTAGTGCCArrTGtTCAGTG^

HeSerTrpLeuSerLeuLeuVal ProPheValGlnTrp PheVa IGlyLeuSer ProThrV

tttggctttcagctatatggatgatgtggtattgsgggccaagtctc

AlTrpLeuSer Ala Ϊ IeTrpMetMetT rpTyrTrpGlyProserLeuTyrserl IeVa IS

gtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctctgggtatacatttaacgaattc ErProPneI lePr-oLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpValTyrl IeBnd

CAAGCTGAAACAATrCAAAGGTTTrCAAATO^TCAAG AACTTC^

AAACTACAAAT3TATGCA.TTGTCTGCCAAGACATCAAGAAGAAGTTAGTGATGATGTCTT rTAlGGAGAGCATTCCATAGTCTTTGAAGAAacAGAAAACAGATTATATGCAGCTATGTC TGCCATTGATATrTTTGTTAATAATAAAOTTAATTTCAA3GACTTGAAATAATCCTTC^ TCGTGTTCTTAATAACrAATATATAAATACAGATATAGATGCATGAATAATGATATACAT TCyVTTATTTTGCAATGTCAATTAAAAAAAW

AGCAAATAAAGCACTIXKTTAAACGAAATTAACGTTTTTAAGACAGCCAGACCGCGGTCT AAAAATTTAAATATACACTGCCAACAAAITCCTTCGAGTTGTCCAATTTCACCACT7TTA TATTTTCATCAACTTCAGCAGATTC^ACCTTCTCACATAGAACATTGGAATAAACAGCCT

taacaccactttcaagtttgcacagcgtaatatgaggaattttgttttgacaacacaacc

CTTTAATTTTCTCATTGTTTTCATCAATTATGCATCCATCTTTATCTTTAG^CJtó

ctacaatagcaatj^tlttttcatcccaac^tagtttttcísagccraaaattcagtttgt cggtcgttttacctgcgtattttggttattaccagagccttgtg catttt ctatgcggt tgttattgtactccgttatctggtcagtgtatctgttacaatatgartccacaacttttt tgcctctttttcacgg-3acgacatgacatgacctaatgttatat3aagttccttctgaac ttttc cactagctagtaaatgcttgaatttctcagtcagctctgcatcgctagcaataca

cctcttgaccaatcaataatttcatcgtagttttctatttagctgagatatatgtaggt

ttaattaacttascgttttttgttgattattgttgcctttaccaactatttttctcacag taggtttgtaatctaagctccttctgaaogctgtctcaattt»tcatctttcgg<^ CTGGTACCAAAATTGGATAAGCTT

SEQ-ID.No 19:

Gene de fusão de CSV-S (cionado no vetor de expressão de Fichia pastoril integrante de pHIL-D2 Seqüência de nucleotídeos

ATGGTTGCTCCCGGGACCCATTGTGQTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG 6 β

AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGC^TCTTCTTTAOGTGCCOCTCATGTTOSTO^ 120

TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAC^^ 180

AAGAAfiAA<K3ATOGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAG 240

CCAGGTGACAGAGCCG ACGGACAftGCAGCT GGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT 300

GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT 360

GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC 420

GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACG3TGCCGGTGGTCAA 480

GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTXKTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT 540

GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAAC^ 600

GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGriAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC 660

GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA 720

GTTAACGCCGCTAACA^GAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT 780

TffTACTCCCGGOCCTGTOACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG 840

CTCGTGTrACAGGCGGGGTrriTCTrGrrC^CAAGAATCCTCACAArACCGCAGAGTCTA 900

GACTOnXSGT^ACTTCTCTCAATTTrCTAGGG^ 960

TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACC^CCTCCTGTCCTCCAArTKÍTCCTGGTTAT 1020

CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC 10 8 o

TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA 1140

TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCrGCTCAAGGCAACTCT 1200

ATGTXTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTCCACCTCTATTCCCATC 1260

CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATG<Xyu3TG<^ 1320

C~CAGTTTACTAGTGCCA?TTGTTCAG1Ü3TTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTX5GCTT 1380

TCAGCTATATGGATGATGtGGTArTGGGGGCCAAGTCTGrACAGCATCGTGAGTCCCTrr 1440

ATACCGCTGTTACCAATTrrcrrT?GTCTC7GGG?AT^ATTTAA 1485

SEQ.ID.No 20:

Proteína de fusão CSV-S expressada em Pichia pastoris. Seqüência de aminoácidos

NVÃP^ δ o

KKKDGKKAEPKKPHENK1KJ3 PGD RAIXjQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDPAAGQ PAGDG 120

AACSQPAGSRADGOPAGDRAD^PAGDRWGQAAG^AGGQAAAKGAGNO WiMNAANKIC^ ISO

EDAGGKAGGNAGGOGQSNEGAKAPNEKSVK^YLDKVRATVGTEWTPCS^CGVGTOTOaR 240

VNAAKKJtJ>EDLTUTOLE7DVCTfroOT^mENITSG?l,GPLLVLQAGFFLLTRILTI PQSL 300

□SNHTSLNFLGGSPVCLGONSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRyi IFLFILLLCLI 360

FL^ZLLDYOG^PVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAOoKSMFPSCCCTKPTCGNCrCIPI 420

PSSWAFAKyLWEWA5Vl^PSIβ,SliVΪ>FVQ^WGLSPTVW^^AIW^^^GPSLYSIVS PP 480

IPLLPIFFCLWVYI 494

Claims

1. Proteína de fusão híbrida imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: a. pelo menos uma unidade de repetição derivada da região de repetição de uma proteína de um circunsporozóite do tipo I de P. vivax, b. pelo menos uma unidade de repetição derivada da região de repetição de uma proteína de um circunsporozóite do tipo II de P. vivax, e c. antígeno de superfície S derivado de vírus da Hepatite B ou um fragmento do mesmo.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína ainda compreende um fragmento de terminal N da proteína CS de P. vivax.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento de terminal N compreende o fragmento conhecido como a Região (I) tal como mostrado na SEQ ID N0 1.

4. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a proteína ainda compreende um fragmento de terminal C da proteína CS de P. vivax.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o fragmento de terminal C compreende a seção conhecida como a Região (II) tal como o motivo mostrado na SEQ ID N0 2.

6. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a unidade de repetição do tipo I é derivado de uma ou mais das seguintes cepas de P. vivax: Latina, América (isto é, Sal 1, Belém), coreana, China, Tailândia, Indonésia, índia e Vietnã.

7. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a unidade de repetição do tipo I é selecionada de um ou mais monômeros mostrados na SEQ. ID N0 3 a 9.

8. Proteína de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 9 unidades de repetição do tipo I.

9. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que o monômero do tipo II é selecionado de um ou 5 mais monômeros mostrados na SEQ. ID N0 10 ou 14.

10. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que compreende 1 repetição do tipo II.

11. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que ainda compreende a inserção de 12 aminoácidos localizados no final da região de repetição encontradas em certas cepas Asiáticas de P. vivax.

12. Proteína de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos são aqueles mostrados na SEQ. ID N0 11.

13. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que o antígeno S da hepatite B é derivado de um sorotipo adw.

14. Proteína de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais outros antígenos derivados de P. falciparium e/ou P. vivax.

15. Proteína de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antígeno é selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl e RBP.

16. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de proteína de circunsporozóite híbrida como mostrado na SEQ ID N0 13.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende proteína de fusão híbrida como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 e um adjuvante.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: • sais metálicos, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, • emulsões óleo em água, • agonista de receptor tipo toll, (tal como agonista de receptor 2 tipo toll, agonista de receptor 3 tipo toll, agonista de receptor 4 tipo toll, agonista de receptor 7 tipo toll, agonista de receptor 8 tipo toll e agonista de receptor 9 tipo toll), • saponinas, por exemplo, Quil A e seus derivados, tais como QS7 e/ou QS21, • Oligonucleotídeos contendo CpG, • 3D-MPL, • (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-o-fosfono-P-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosil-di-hidrogenofosfato), • DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4- oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1,10- bis(di-hidrogenofosfato) e • MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10- diol, 1 -di-hidrogenofosfato 10-(6-aminoexanoato), ou combinações dos mesmos.

19. Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: • uma saponina associada com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio • 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG, por exemplo, como um óleo na formulação aquosa, • saponina na forma de uma lipossoma, por exemplo, ainda compreende um esterol tal como QS21 e esterol e • ISCOM.

20. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 17 a 19, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais outros antígenos derivados de P. falciparium e/ou P. vivax em mistura.

21. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 17 a 20, caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma tensoativo.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado de Tween (tal como Tween 20), briji, polietileno glicol.

23. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição é uma vacina, tal como uma vacina parenteral.

24. Partícula de lipoproteína multimérica que, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína híbrida como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16.

25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula como definida na reivindicação 24 e pelo menos um excipiente/carreador.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: • sais metálicos, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, • emulsões óleo em água, • agonista de receptor tipo toll, (tal como agonista de receptor 2 tipo toll, agonista de receptor 3 tipo toll, agonista de receptor 4 tipo toll, agonista de receptor 7 tipo toll, agonista de receptor 8 tipo toll and agonista de receptor 9 tipo toll), • saponinas, por exemplo, Quil A e seus derivados, tais como QS7 e/ou QS21, · Oligonucleotídeos contendo CpG, • 3D -MPL, • (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-ofosfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosildi-hidrogenofosfato), · DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4- oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1,10- bis(di-hidrogenofosfato) e • MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10- diol,l-di-hidrogenofosfato 10-(ó-aminoexanoato), ou combinações dos mesmos.

28. Composição de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: · uma saponina associada com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio • 3D - MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG, por exemplo, como um óleo na formulação aquosa, • saponina na forma de uma lipossoma, por exemplo, ainda compreende um esterol tal como QS21 e esterol e • ISCOM.

29. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 25 a 28, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais outros antígenos derivados de P. falciparium e/ou P. vivax em mistura.

30. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 25 a 29, caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma tensoativo.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado de Tween (tal como Tween 20), briji, polietileno glicol.

32. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações de 25 a 31, caracterizada pelo fato de que a composição é uma vacina, tal como uma vacina parenteral.

33. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 23 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 32, caracterizada pelo fato de que é para o uso no tratamento.

34. Uso de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 ou uma partícula como definida na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de malária.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a malária é causada por P. vivax.

36. Método para tratar um paciente suscetível à infecção por plasmódio, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 17 a 23 ou 23 a 32, particularmente como uma vacina, desse modo para tratar ou evitar malária.

37. Seqüência de nucleotídeo, caracterizada pelo fato de que codifica a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16.

38. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de nucleotídeo como definida na reivindicação 37.

39. Processo para a produção de proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de compreender expressar a seqüência de nucleotídeo que codifica a dita proteína em um hospedeiro adequado e que recupera o produto.

40. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é uma levedura.

41. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo que compreende: Saccharomyces, Schizosaecharomyeees, Kluveromyees, Pichia (por exemplo, Piehia pastoria), Hansenula, (por exemplo, Hansenula polymorpha), Yarowia, Schwaniomyees, Schizosaceharomyees, Zygoaeeharomyees, tal como Saccharomyees eerevisiae, S. earlsberoensis, K Laetis, Yl834 e DC5.

42. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o produto é recuperado pela Iise das células hospedeiras pelo tratamento com uma composição adequada que compreende um tensoativo.

43. Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é selecionado do grupo que compreende: Tween (tal como Tween 20), briji, polietileno e glicol.