BRPI0709565A2 - ensaio imunoabsorvente ligado a enzima competitiva (c-elisa) para detecção de um anticorpo especìfico de flavivìrus - Google Patents

Abstract

ENSAIO IMONOABSORVENTE LIGADO A ENZIMA COMPETITIVA (C ELISA) PARA A DETECçáO DE UM ANTICORPO ESPECìFICO DE FLAVIVìRUS Um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima competitiva (C-ELISA), usando agentes imunológicos específicos de membro de flavivírus foi desenvolvido para detectar o anticorpo específico aos membros dos flavivírus indicativos de exposição ao flavivírus. O teste é baseado em uma competição para o epitopo de ligação na proteína de envelope do antígeno de flavivírus capturado usando IgA de antiflavivírus na presença de soro positivo de flavivírus. Este teste tem a sensibilidade, especificidade e velocidade comparáveis ao ensaio de neutralização de vírus (VNT) . ELISA é uma técnica versátil, que poderia ter váriasaplicações. Ligeiras modificações deste protocolo poderiam conduzir a um método de detecção baseado em ELISA de infecção secundária ou um que poderia ser usado para estudos soro-epidemiológicos específicos de sorotipo e/ou avaliação de vacinas, O protocolo desenvolvido para C-ELISA foi demonstrado usando o antígeno de usado de dengue e o anticorpo monoclonal específico de dengue. Isto pode ser usado contra outros flavivírus e os resultados para a encefalite japonesa ilustram isto.

Description

ENSAIO IMUNOABSORVENTE LIGADO A ENZIMA COMPETITIVA (C-ELISA) PARA A DETECÇÃO DE UM ANTICORPO ESPECÍFICO DEFLAVIVÍRUS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se especificamente a umatécnica de detecção de exposição de um ser humano e/ou deum animal a um flavivírus ou a um equivalente do mesmo.Mais particularmente, a presente invenção refere-se a umaanálise rápida e fácil de uma amostra biológica colhida deum indivíduo (animal ou ser humano) a fim de determinar seo indivíduo foi exposto previamente a um membro da famíliado flavivírus ou equivalente do mesmo. A presente invençãoainda fornece a sorotipagem da exposição de flavivírusbaseado na análise de soro e fornece kits de diagnósticosmédicos e a soro-avaliação diferencial aos membros de umainfecção de flavivírus ou de um equivalente do mesmo. Ainvenção é particularmente importante para a detecção deinfecção secundária de flavivírus, definindo a sorotipagemde infecção precedente, soro-epidemiologia e avaliação de vacina.

FUNDAMENTO

A família de Flaviviridae contém uma miríade de vírusque causam doenças nos seres humanos e são geralmentetransmitidos por mosquitos e carrapatos. 0 gêneroFlavivírus contém um número de vírus que incluem o vírus dafebre amarela (YF), o vírus de febre da dengue Oeste-Nilo(WN) e o vírus da encefalite japonês (JE) que sãoresponsáveis para suas doenças correspondentes.

A dengue é a infecção de flavivírus artrópode-veiculada difundida e mais comum no mundo e""-mais de 1,2milhões de infecções de dengue ocorrem anualmente enquanto2,5 bilhões de pessoas estão em risco vivendo na áreaendêmica de dengue do mundo (WHO/TDR, abril 2005). Háquatro sorotipos de virus distintos, cada um capaz deproduzir um amplo espectro de sinais e sintomas e umainfecção primária com um dos quatro sorotipos conferemimunidade durável a esse tipo. A possibilidade de infecçãosecundária com sorotipos diferentes ainda permanece.

Embora a dengue seja endêmica na maioria dos paísestropicais e subtropicais, ocorre principalmente nos paísesem desenvolvimento que falta a infra-estrutura de cuidadosmédicos ou as capacidades financeiras para diagnosticarprontamente e eficazmente a dengue. Em Singapura, umadistribuição desigual dos dois vetores resultou natransmissão desigual de dengue dentro de população (Ooi eoutros, 2001). Fazendo-se uma inspeção sorológica,determinou-se que uma mudança na localização onde a denguefoi adquirida poderia ter ocorrido. Essa descoberta podeajudar na modificação de programas de controle de vetorpara direcionar novas áreas de transmissão. Entretanto,somente quatro inspeções soro-epidemiológicas foramcompletadas até agora. 0 custo elevado de testeslaboratoriais ou a falta de reagentes necessários contribuipara que poucas inspeções sejam conduzidas.

Tradicionalmente, a inibição de hemoaglutinação (HAI)foi usada para detectar anticorpos contra a dengue.

Entretanto este método exige antígenos derivados de cérebrocamundongo que não estão prontamente disponíveis devido àsdificuldades no crescimento de tais células. Outro métodousado comumente é fixação de complemento, mas isto exigeanticorpos que tem vida curta. Cada vez mais oslaboratórios estão recorrendo aos kits comerciais de ensaiode imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). Entretanto,nenhum destes testes são específicos para os anticorpos dedengue e tem reação cruzada com outros membros deFlavivírus co-circulantes na mesma região, como aEncefalite Japonesa (JE), Oeste do Nilo, Hepatite C, FebreAmarela, Encefalite Murray Valley, etc.

As sensibilidades do desempenho de seis sistemas de imunoensaio disponíveis comercialmente para a detecção deimunoglobulina M específica de vírus da dengue (IgM) eanticorpos IgG em soro (Goren e outros 2000) têm sidoavaliadas recentemente. As sensibilidades dos ensaiosvírus-específicos de dengue avaliados variaram entre 71 e 100% para IgM e entre 52 e 100% para IgG, com especificaçãode 86 a 96% e 81 a 100% respectivamente. O tempo de testetotal destes testes variou de 7 a 480 minutos. Além disso,todos os testes exigem o suporte de equipamento delaboratório exceto Pan-bio RIT e sua sensibilidade e especificidade para o ensaio de IgG de dengue foram muitobaixas (75% e 52% respectivamente). Entretanto, nenhum dostestes avaliados nestes estudos puderam detectar oanticorpo específico de dengue, mas tiveram reação cruzadacom outros Flavivírus. Conseqüentemente, a detecção de uma infecção secundária precoce é um pouco difícilpresentemente, pois somente a presença IgG específica dedengue durante uma fase aguda (febril) de infecção indica ainfecção secundária de dengue (Schilling e outros, 2004) .

Os estudos soro-epidemiológicos mostraram que ainfecção secundária é um fator de risco principal para afebre de dengue hemorrágica e a síndrome de choque dedengue através do aumento de síndrome dependente deanticorpos (ADE) (Halstead e outros, 1973, Halstead S.B.,1988). Para investigações epidemiológicas e patológicas, éimportante diferenciar entre a infecção de vírus primária esecundária e determinar sorotipos de dengue de infecçõespassadas e presentes.

A técnica de diagnóstico de dengue utilizada maisamplamente é a análise sorológica das amostras suspeitadas.

Entretanto a técnica é um pouco complicada por causa dediversas razões - (i) os pacientes podem ter infecçõesmúltiplas e seqüenciais com os quatro sorotipos de vírus dadengue devido a uma falta de anticorpos de neutralizaçãoprotetores de reações cruzadas; (ii) infecções deflavivírus seqüenciais e múltiplas fazem o diagnósticodiferencial difícil devido à presença de anticorpos pré-existentes e sin antigênico original (muitos clones deCélula B que respondem à primeira infecção de flavivírussão re- estimulados para sintetizar o anticorpo precoce comuma afinidade maior para o primeiro vírus de infecção doque para o vírus de infecção atual em cada infecçãosubseqüente de flavivírus) nas regiões onde dois ou maisFlavivírus estão co-circulando; (iii) Os anticorpos IgG têmaltos níveis de reatividade cruzada aos antígenos deflavivírus homólogos e heterólogos; e (iv) osorodiagnóstico de infecções de vírus da dengue passadas,recentes, e presentes é difícil devido à persistência longade anticorpos IgG 10 meses, como medidos pela ELISA deIgG de captação de E/M específica, ou longa vida, comomedido pelo ELISA de IgG de antígeno de revestimento deindireto de E/M) em muitos pacientes de dengue cominfecções secundárias (Gubler, D.J. 1996 e Innis e outros 1989).

Assim, entre as infecções virais que podem serdiagnosticadas por sorologia, a infecção de vírus da dengueestá entre o mais desafiante. Entretanto, os grandesavanços em analisar os antígenos virais complexos e asrespostas de anticorpo foram feitos recentemente pelodesenvolvimento de vários métodos que procuram as proteínasestruturais e não estruturais (NS) diferentes para estudossorodiagnósticos e soroepidemiológicos de infecção de vírusda dengue.

O teste de inibição de hemoaglutinação (HAI) tem sidousado tradicionalmente para a diferenciação de infecção dedengue primária e secundária. É agora menos popular devidoàs desvantagens inerentes do teste (Innis e outros, 1989 eShu e outros, 20 03). Em contraste, a captação de ELISAs deIgM e IgG tornaram-se os ensaios mais poderosos para adiferenciação de infecção primária e secundária devido àsensibilidade e especificidade elevadas (Innis e outros,1989, 1997). Entretanto, para a sorotipagem de infecção dedengue particularmente para a investigação soro-epidemiológica, nem a captação de ELISA de IgM nem ELISA deIgG é útil devido à anticorpos de neutralização cruzadaentre anticorpos de sorotipos de dengue.

O teste de neutralização de vírus (VNT) é a técnicapadrão de ouro atualmente disponível que pode ser usadapara distinguir entre a dengue e os outros Flavivírus(manual WHO 2002). O VNT é também usado para discriminarentre sorotipos de dengue (sorotipos 1 a 4). Os anticorposde soro criados contra um ou outro vírus podem neutralizartodos os sorotipos de dengue e mesmo outros Flavivírusigualmente, mas neutralizariam o vírus homólogos em umtítulo mais elevado que neutralizariam os vírus heterólogos(Makino e outros, 1994). Infelizmente, anticorposantidengue (IgM) se desenvolveram em uma fase precoce dainfecção aumentando a um nível igual de neutralizaçãocontra todos os sorotipos de dengue; conseqüentemente ainfecção secundária não pode ser determinada nesta fase por VNT (Nawa e outros, 2000) . Por outro lado, VNT tem asseguintes desvantagens:

i. Necessita de laboratório de cultura de célulasofisticado e pessoal treinado;

ii. Duração de teste é mais do que uma semana;

iii. 0 soro de um paciente com uma infecção de denguecom menos de seis meses não pode ser sorotipado devido aosanticorpos de reação cruzada de dengue;

iv. Dificuldade de detectar sorotipos de denguemúltiplos;

v. 10% de soro tem efeito tóxico na cultura de célula;

Innis e outros (1989), a primeira classificaçãoproposta de infecções primária e secundária peladeterminação da razão das unidades de anticorpos IgM devírus da dengue pelas unidades de anticorpos IgG de vírusda dengue. Elas mostraram que os soros de fase aguda depacientes com infecções primárias de vírus da denguetiveram razões de IgM/IgG mais elevadas, visto que ospacientes com infecções secundárias tiveram razões deIgM/IgG mais baixas. Este método fez uma grandecontribuição para a análise do status imune de pacientescom dengue. Muito recentemente, Shu e outros, 2003,modificaram e simplificaram o método acima para diferenciara infecção primária e secundária de vírus da dengue usandoa razão de leituras de IgM/IgG diretamente (> 1,2 indica ainfecção primária ou < 1.2 indica a infecção secundária,respectivamente) sem calcular as unidades de anticorpoatravés do uso de um controle padrão.

Recentemente, Ludoffs e outros, 2002 relataram adiferenciação sorológica de infecções com sorotipos dedengue 1 a 4 usando antígenos recombinantes. Tiras deImmunoblot pontilhadas com os domínios de B de sorotipos devírus da dengue 1 a 4 expressados em Escherichia coli usadopara detectar anticorpos específicos de sorotipo da dengueem amostras emparelhadas de soro de 41 pacientes cominfecções primária e secundária. Embora alguma reatividadecruzada com sorotipos heterólogos foi observada, osresultados mostraram a 93,94% de especificidade, porém asorotipagem não é confiável para a infecção secundáriaatravés deste método.

Os problemas enfrentados para o vírus da dengue sãoencontrados igualmente por outros Flavivírus, comcaracterísticas antigênicas compartilhadas,conseqüentemente dificulta no diagnóstico exato. Há umanecessidade, portanto, para um teste rápido, confiável, esimples que possa distinguir o anticorpo específico deflavivírus em qualquer estágio de infecção a partir doanticorpo para outros Flavivírus, assim como entresorotipos de flavivírus. Os procedimentos de detecçãosorológica têm o papel potencial de agir no diagnósticoclínico para diferenciar infecções de flavivírus de outrasdoenças infecciosas similares ao flavivírus assim como emestudos de soro-vigilância e na avaliação de vacinas. Taistécnicas ajudarão na detecção precoce de infecçãosecundária conduzindo para melhor gerenciamento de caso, afatalidade de caso reduzida e o custo de tratamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto da presente invenção, éfornecido um método para detecção de exposição de umindivíduo a um flavivírus ou equivalente do mesmo, oreferido método compreendendo:

contatar uma amostra biológica do indivíduo com umamistura de componentes capturados de IgA de antiflavivírusflavivírus ou um equivalente;

submeter a amostra biológica e os componentescapturados de IgA de antiflavivírus a um agente competidorimunológico específico de flavivírus;

determinar a presença de um complexo que forma entreum parceiro de ligação específico de flavivírus presente naamostra biológica e um Componente capturado de IgA deantiflavivírus na presença de agente competidor imunológicoespecífico de flavivírus.

A presente invenção resulta de uma necessidade dedesenvolver um ensaio de baixo custo, rápido, e direto paradeterminar a exposição específica prévia ou presente a umflavivírus. A invenção utiliza especificamente um agentecompetidor imunológico específico de flavivírus paracompetir com um parceiro de ligação a partir do corpohospedeiro para o epitopo específico ao flavivírus ou a suapresença de sorotipos na proteína de envelope deflavivírus, que inclui uma mistura de componentescapturados de IgA de antiflavivírus incluindo partículas deflavivirus dentre outros antígenos indicativos de infecçãode flavivirus.

Conseqüentemente, a presente invenção mostra maiorespecificidade e sensibilidade comparada a outro ELISA decaptura ou indireto de IgG de flavivirus mais usadoatualmente e convencional pelo fornecimento de umaplataforma que pode especificamente identificar o anticorpo(IgG) produzido contra o flavivirus ou relacionadosimunológicos do mesmo em qualquer estágio da infecção.

Preferivelmente, o flavivirus é selecionado de umgrupo que inclui o vírus da febre amarela, o vírus da febreda dengue, o vírus JE, o vírus do Oeste do Nilo, o vírus daHepatite C, o vírus de Murray Valley e a encefalite de St.Louis.

Em um outro aspecto de invenção é fornecido um kit dedetecção de exposição de um indivíduo a um flavivirus ouequivalente do mesmo, o referido kit compreendendo:componentes capturados de IgA de antiflavivírus apartir de flavivirus;

agente competidor imunológico específico deflavivirus; e

pelo menos um agente de detecção para detectar umcomplexo que forma entre um parceiro de ligação presente emuma amostra biológica e um componente capturado de IgA deantiflavivírus na presença do agente competidor imunológicoespecífico de flavivirus.

A presente invenção também fornece componentesindividuais do kit para o uso no método da presenteinvenção que inclui suportes sólidos tais como placas demicrotítulo e membranas de nitrocelulose em que oscomponentes capturados de IgA de antiflavivírus sãoimobilizados.

A presente invenção também fornece um método paraavaliar o risco relativo de um ou mais indivíduos sendoexpostos ao flavivírus ou ao equivalente do mesmo dentro deuma localização definida (por exemplo, área geográfica,moradia, meios de transporte ou centro para o tratamentomédico ou avaliação), compreendendo:

a) obtenção de amostras de uma populaçãorepresentativa dentro de uma localização definida; e

b) avaliando a evidência de exposição de membrosindividuais de uma população de amostra a um flavivírus ouequivalente do mesmo pelo método que compreende as etapas de:

i) contatar uma amostra biológica a partir doindivíduo com um componente derivado do flavivírus ouequivalente do mesmo para formar um complexo entre oscomponentes e um parceiro de ligação indivíduo-derivado do componente contido dentro da amostra biológica;

ii) determinar a presença do complexo, onde apresença do complexo é indicativa de exposição do indivíduoa um flavivírus ou equivalente do mesmo; e

c) avaliar o risco relativo de exposição dentro dalocalização definida.

A análise de risco pode ser conduzida usando osoftware em um formulário lido por computador.Conseqüentemente, a presente invenção ainda relaciona-se aum programa lido por computador e computador apropriadopara analisar a exposição de indivíduos ou grupo deindivíduos ou um risco de exposição de indivíduo ou grupode indivíduos a um flavivírus ou equivalente do mesmo.

FIGURAS

A Figura 1 mostra a otimização de antígeno de lisadode dengue na placa de poliestireno capturada de IgA deantidengue. A Figura 1 (A) mostra uma comparação de MAb-capturado e ELISA capturado de IgA de antidengue. (a)Detecção de vírus da dengue (sorotipo-2) usando o antígenode vírus de sobrenadante de célula. O vírus foi diluído emdiluição de 10 vezes (Log10) iniciando de IO6 pfu/ml a IO2pfu/ml em diluente de vírus, (b) Detecção de vírus dadengue (sorotipo-2) usando antígeno de lisado de célula. Emambos os casos o ELISA capturado de IgA de antidenguemostrou melhor desempenho que o ELISA MAb-capturado.

A Figura 2 mostra a otimização de anticorposmonoclonais contra cada sorotipo de antígenos de lisado dedengue. A determinação da diluição ótima de MAbs. (a).Diluições duplas de série de cada MAb (1:250 a 1:32000)foram reagidas com a diluição de dupla de soro positivo dedengue e dois negativos de dengue (um foi negativo à ELISAde IgG indireto de dengue e o outro foi positivo a ELISA deIgG e febre amarela VNT mas negativo à dengue VNT) em um C-ELISA. Uma diluição de MAb de 1:2000 foi escolhida.

A Figura 3 mostra a otimização soros positivos enegativos de IgG de dengue usando ELISA competitivo (C-ELISA). Determinação de uma diluição ótima de soro para C-ELISA. A diluições duplas em série de soros de controlepositivos e reação cruzada de flavi e negativos foramreagidos com a diluição de MAb pan-den ótima (1:2000) em umC-ELISA. Para minimizar o volume de soro exigido, umadiluição de soro de 1:20 foi escolhida como a diluiçãopreferida que foi realizada somente um pouco melhor.

A Figura 4 mostra a determinação do ponto de corte deC-ELISA usando soros negativos e positivos de dengueconfirmados de VNT. O estabelecimento de um ponto de cortenegativo para o C-ELISA. (a) Todos os soros negativos deIgG de dengue (η = 100); (b) Soros positivos de IgG dedengue detectados por VNT (n = 64). (b) A linha pontilhadarepresenta o ponto de corte de 30% de inibição (média mais3 desvio padrão) para distinguir entre amostras negativas epositivas.

A Figura 5 mostra a avaliação comparativa de trêstécnicas de detecção de IgG específicas de dengue, ELISA debloqueio, ELISA competitivo pré-incubado e simultâneo. Acomparação de B-ELISA com C-ELISA (adição simultânea e pré-incubação de MAb). Cada ponto de dado é a média de quatrovalores; soros positivos (Log2 100 TCID50, 8) e negativosmoderados. A adição simultânea de soro de teste e anticorpomonoclonal mostrou baixo nível de desempenho (1:40positivo) comparado a pré-incubação e ELISAs de bloqueio(1:160).

A Figura 6 mostra os resultados de C-ELISA usando 10amostras de soro triplas (coletadas no dia-1, no dia-4 e nodia-20) dos casos de dengue confirmados. A presença de IgGespecífico de dengue foi detectada das amostras triplas dedengue confirmadas em 10 pacientes (por PCR) no dia 1, nodia 4 e no dia 20. Os níveis de IgG específico antidenguenas segunda e terceira coletas foi aumentadosubstancialmente comparado à primeira coleta.

A Figura 7 mostra resultados de coeficiente decorrelação entre C-ELISA e VNT. A regressão linear deamostras de soro específicas de IgG antidengue mostra umnível elevado de correlação entre C-ELISA e VNT (r=0.91) eindica um nível elevado de especificidade comparado atécnica "padrão de ouro".

A Figura 8 mostra o coeficiente de correlação entre 30e 15 minutos de uma etapa de C-ELISA. A regressão linear dedois ensaios mostra o nível elevado de correlação (r=0,9675).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto da presente invenção, éfornecido um método para a detecção de exposição de umindivíduo a um flavivírus ou equivalente do mesmo, o métodoreferido compreendendo:contatar uma amostra biológica do indivíduo com umamistura de componentes virais de flavivírus capturados deIgA de antiflavivírus de flavivírus ou de um equivalente;submeter a amostra biológica e os componentescapturados de IgA de antiflavivírus a um agente competitivoimunológico específico de flavivírus;determinar a presença de um complexo que forma entreum parceiro de ligação específico de flavivírus presente naamostra biológica e um componente capturado de IgA deantiflavivírus do flavivírus na presença do agentecompetitivo imunológico específico de flavivírus.

A presente invenção resulta de uma necessidade paradesenvolver um ensaio rápido, específico, de baixo custo edireto para determinar a exposição presente ou prévia a umflavivírus. O método usa IgA de antiflavivírus paracapturar antígeno de flavivírus preferivelmente de lisadobruto de célula. O lisado deriva-se de células infectadascom flavivírus compreendendo uma mistura de componentes deflavivírus, preferivelmente componentes imunogênicos. Osindivíduos incluindo animais, tais como mamíferos e emparticular seres humanos são verificados para a presença deparceiros de ligação específicos de flavivírus em umaamostra biológica na presença de um agente competitivoimunológico específico de flavivírus. Os parceiros deligação preferidos são parceiros de ligação derivados deindivíduo tal como, mas não limitado às moléculasimunointerativas.

Preferivelmente, as moléculasimunointerativas são os anticorpos particularmente aimunoglobulina G (IgG) ou fragmentos de imunointerativos.Adicionalmente, a especificidade é melhorada com o uso de um agente imunológico específico de flavivírus como umcompetidor do parceiro de ligação específico de flavivírusna amostra biológica. A identificação de tais parceiros deligação ou agentes competitivos imunológicos específicos deflavivírus é usada então como uma evidência de exposiçãopresente ou prévia do indivíduo ao flavivírus ou umequivalente do mesmo por sua habilidade de formar umcomplexo com o componente capturado de IgA antiflavivírus.Conseqüentemente a invenção utiliza uma combinação decomponentes capturados de IgA de antiflavivírus e de C-ELISA.

Conseqüentemente, a presente invenção mostra maiorsensibilidade e especificidade comparada ao ELISA de IgG deflavivírus mais usado atualmente e convencional pelofornecimento de uma plataforma que pode identificaranticorpos produzidos contra o flavivírus ou osrelacionados imunológicos do mesmo em qualquer estágio dainfecção.

Durante toda a descrição e reivindicações destaespecificação, o uso da palavra "compreende" e variações dapalavra, tais como "compreendendo" e "é compreendido", nãoé pretendido excluir outros aditivos, componentes, inteirosou etapas.

Flavi vírus

0 termo "flavivírus" ou "Flavivírus" como usado aquinas reivindicações e descrição inclui a famíliaFlaviviridae dos Flavivírus incluindo o gênero flavivírusque causa doenças nos seres humanos e é geralmentetransmitido por artrópodes tais como mosquitos ecarrapatos. Os vírus são responsáveis por doenças taiscomo, mas não limitado a, febre amarela, febre de dengue eJE. A espécie de Flavivírus que compõe o gênero demonstroualguma conservação de seqüências no nível de seqüência denucleotídeo e aminoácido. Os vírus incluídos no gênero dosFlavivírus incluem mas não são limitados ao vírus da febreamarela, vírus da dengue Oeste do Nilo e vírus JE. Devidoàs similaridades no nível de nucleotídeo e aminoácido,estes vírus podem mostrar similaridades em antigenicidade,transmissão e doença.

Vírus da dengue

0 termo "vírus da dengue" como usado aqui nasreivindicações e descrição refere-se a todos os sorotiposde dengue (Den-1, Den-2, Den-3 e Den-4) associados com umainfecção de dengue. A presente invenção é aplicável paradetecção da infecção ou exposição de vírus da dengue emquaisquer indivíduos incluindo animais humanos e nãohumanos e animais de laboratório. Os indivíduos humanos,entretanto, são preferidos de acordo com a presenteinvenção. Entretanto, a invenção inclui qualquer indivíduoque pode responder a uma infecção ou imunização pelo vírusda dengue ou um equivalente do mesmo.

Um vírus da dengue é definido como um grupo de vírushumano de RNA consistindo de partículas envelopadas deaproximadamente 40 a 50nm de diâmetro. O genoma viral éaproximadamente 11kb (Stollar e outros, 1966). O virionmaduro consiste em um genoma de RNA de sentido positivofechado por um núcleocapsídeo isométrico. O genoma codificaum único quadro de leitura aberto de aproximadamente 11000nucleotídeos, codificando para as três estruturas (C-Capsídeo, M-Membrana e E-Envelope) e sete proteínas nãoestruturais (NS1, NS2a e NS2b, NS3, NS4a e NS4b, NS5).

O vírus da dengue é transmitido aos seres humanosatravés de mordidas de mosquitos Aedes fêmeas infectados,principalmente o mosquito A. aegypti. Este é um mosquitotropical pequeno, preto e branco, altamente domestiçado queprefere colocar seus ovos em recipientes artificiaisencontrados em torno de casas que podem conter água, talcomo baldes, vasos de flor e outros recipientes de água. Osmosquitos adultos são raramente notados do lado de fora;geralmente descansam em locais internos escuros, sãodiscretos e preferem se alimentar de seres humanos ouanimais durante as horas claras do dia, com a maioria daatividade de mordida ocorrendo ao amanhecer ou no fim datarde (Gubler e outros, 1992; Newton e outros, 1992). Osmosquitos fêmeas são alimentadores nervosos, interrompendoo processo de alimentação no movimento mais leve dohospedeiro, assim retornando ao mesmo ou a um hospedeirodiferente para continuar a se alimentar. Por causa destecomportamento o mosquito freqüentemente se alimenta dediversas pessoas durante uma única refeição de sangue e seinfectado pode transmitir o vírus à múltiplas pessoas(Platt e outros, 1997; Scott e outros, 1997) . Talcomportamento foi usado para explicar a observaçãoepidemiológica que as doenças de dengue ocorremprincipalmente em crianças embora em determinados lugares,como Singapura, isto pode ter mudado devido à adaptação àsmedidas de controle de vetor (Ooi e outros, 2001).

Seguindo a mordida de um mosquito fêmea infectado, ovírus submete-se a um período de incubação intrínseco de 3a 14 dias (média de 4 a 7 dias) após o qual a pessoa podeexperimentar o início agudo de febre acompanhada por outrossinais e sintomas não específicos. Durante este períodovirêmico (que pode estar entre 2 a 7 dias) o vírus circulano sangue de seres humanos infectados. Se um mosquito Aedesnão infectado se alimenta no hospedeiro durante esteperíodo virêmico, este mosquito se tornará contaminado apósum período de incubação extrínsico obrigatório de 10 a 12dias, ele poderia subseqüentemente transmitir o vírus aoutros hospedeiros não infectados. Neste ciclo detransmissão, os seres humanos são os hospedeiros deamplificação principais para o vírus embora estudos mostremque os macacos podem ficar infectados e talvez serir comouma fonte para o vírus (Putnam e outros, 1995; Gubler eoutros, 1976; WHO, Fact sheets, 2002).

A infecção de vírus da dengue causa um espectro dedoença nos seres humanos dependendo do vírus de infecção,condições de idade do hospedeiro e imunológicas. Poderesultar em doença assintomática ou variar de uma doençanão diferenciada de gripe (síndrome viral) à febre dedengue (DF), à febre hemorrágica de dengue (DHF), esíndrome de choque de dengue severa e fatal (DSS)(Nimmannitya, 1993: WHO, 1997).

A Organização Mundial de Saúde estabeleceu padrõespara a classificação da severidade de DHF. Há quatroclasses de severidade das quais a classe III e a classe IVsão consideradas como sendo a síndrome de choque de dengue(DSS).

Classe I: Febre com sintomas constitucionais nãoespecíficos, e a única manifestação hemorrágica é um testede torniquete positivo e ou ferimento fácil.

Classe II: Adicionalmente a manifestação da classe I,sangramento espontâneo na forma da pele ou outrashemorragias.

Classe III: Falha circulatória manifestada por umpulso fraco rápido, redução da pressão de pulso ouhipotensão com a presença de pele fria, viscosa e nãodescansada.

Classe IV: Choque profundo com pressão sangüínea oupulso indetectável (WHO, 1997).

A febre de dengue clássica é mais comum em criançasmais velhas, adolescentes e adultos, e são menos prováveisde serem assintomáticos (Sharp e outros, 1995). A febre éabrupta em seu início com febre alta, dor de cabeça,mialgias e artralgias incapacitantes, vômito de náusea eprurido macular ou maculopapular (Waterman, 1989). A febregeralmente dura por 5 a 7 dias e às vezes pode seguir umcurso bifásico (aparência de "Saddleback") (Nimmannitya,1993) .

A DHF é primeiramente uma doença das crianças maisnovas abaixo de 15 anos, embora também possa ocorrer nosadultos e é principalmente associada com as infecçõessecundárias de dengue (Sumarmo e outros, 1983; WHO) . 0estágio critico de DHF é no momento da diminuição da febre,quando a temperatura se torna normal. Os fatores principaisque determinam a severidade da doença no momento sãoextravasamento de plasma devido à permeabilidade vascularaumentada e a homeostase anormal e outras manifestaçõeshemorrágicas comuns como petéquias, lesões purpúricas, eequimoses. Estes sintomas, mais um teste positivo detorniquete são úteis para o diagnóstico exato de DHF(Gubler DJ., 1998) .

O DSS é o estágio terminal de DHF e é manifestado porchoque hipovolêmico devido ao extravasamento de plasma(WHO, 1997). Há quatro sinais de aviso de DSS: dorabdominal sustentada, vômito persistente, inquietação ouletargia, e uma mudança repentina de febre à hipotermia comtranspiração e prostração. O reconhecimento precoce e otratamento apropriado por equipe hospitalar experientepodem diminuir a taxa de fatalidade de caso de DSS a 0,2%,mas uma vez que o choque acontece a taxa de mortalidadepode ser de mais de 40% (Nimmannitya, 1994; Rigau-Perez JG,e outros, 1998) .

A proteína E, a maior e a única proteína estruturalexposta na superfície do vírus, é a proteína principalenvolvida em reações imunológicas tais como ligação comreceptor, hemoaglutinação e neutralização. A infecção nosseres humanos por um dos sorotipos fornece a imunidadeprolongada a esse sorotipo, mas somente proteção temporáriacontra outros sorotipos.

0 núcleoplasmideo por sua vez é cercado pelo lipidocontendo as proteínas de envelope e de membrana. Além dasproteínas de envelope e capsídeo, o vírus da dengue temsete proteínas não estruturais NSl, NS2a, NS2b, NS3, NS4a,NS4b e NS5.

Vírus de encefalite japonesa

A encefalite japonesa é uma doença que é espalhada aosseres humanos por mosquitos infectados. É uma de um grupode doenças de vírus transmitidas por mosquito que podemafetar o sistema nervoso central e causar complicaçõesseveras e mesmo a morte.

A encefalite japonesa é causada pelo vírus deencefalite japonesa, um arbovírus. Os arbovírus são umgrupo grande de vírus que são espalhados por determinadosanimais invertebrados (artrópodes), mais geralmente porinsetos chupadores de sangue. Como a maioria de arbovírus,a encefalite japonesa é espalhada por mosquitos infectados(Culex spp).

Aqueles infectados desenvolvem sintomas suaves ounenhum sintoma. Naqueles que desenvolvem uma doença maissevera, a encefalite japonesa começa geralmente como umagripe, com febre, calafrios, cansaço, dor de cabeça,náusea, e vômito. A confusão e a agitação também podemocorrer na fase inicial. A doença pode progredir a umainfecção séria do cérebro (encefalite) e pode ser fatal em30% dos casos. Entre os sobreviventes, outros 30% dospacientes mostraram seqüelas neurológicas permanentes.Há outros flavivírus, que causam a encefalite viral eestão dentro do escopo da presente invenção. Eles têm umquadro de doença similar, e incluem:

• Encefalite de St Louis e Murray Valley

· Encefalite de Verão Primavera Russo, transmitida porcarrapatos.

Outros três vírus de encefalite pertencem ao gênero deAlfavírus e são transmitidos também pela mordida demosquito. São a encefalite eqüina Ocidental, Oriental e Venezuelana, ou WEE, EEE e VEE respectivamente. Elasocorrem na América do Norte e do Sul. Há também vacinas queprotegem contra EEE e WEE.

Como a encefalite japonesa estes vírus freqüentementeproduzem somente os sintomas gerais suaves, similares à gripe suave.

0 diagnóstico desta doença tem sido feito previamentedetectando anticorpos no soro e no CSF (líquidocerebroespinhal) pela ELISA de captura de IgM, mas istomostrou menos especificidade e o processo pode levar um longo tempo. Uma vacina está disponível, mas os antiviraissão geralmente ineficazes a menos que administrados dentrode horas da infecção, conseqüentemente o tratamento éprincipalmente de suporte. O vírus de encefalite japonesanão é transmitido entre seres humanos. A infecção com JEV conferencia imunidade prolongada.Equivalentes

O termo "equivalente" como usado aqui e aplicado aoflavivírus é pretendido de incluir as moléculas similaresque podem provocar o mesmo ou a resposta similar que oflavivírus ou uma proteína estrutural ou não estrutural deflavivírus poderiam provocar. Por exemplo, os váriosantígenos expressos pelo flavivírus em vários estágios deinfecção ou várias partículas ou fragmentos de vírus podemcausar os efeitos similares que o vírus inteiro causa. Aresposta pode ser uma resposta imunológica (resposta nãoclínica) ou pode ser uma resposta infecciosa (respostaclínica) ou devido à vacinação.

Exposição

O indivíduo pode ter sido exposto ao flavivírus, masnão precisa mostrar sintomas visuais da infecção. 0 métodopresente detecta a exposição que pode conduzir à infecção(clínica ou subclinica ou não-clínica) ou pode indicar aexposição prévia sem os sintomas manifestados.

A presente invenção é aplicável à detecção deexposição ao flavivírus ou a um equivalente do mesmo. Aexposição pode ser exposição presente ou prévia aoflavivírus ou a um equivalente do mesmo. Preferivelmente, aexposição é suficiente para provocar uma reação imune ouuma resposta no corpo para induzir um parceiro de ligaçãoem resposta ao flavivírus ou ao equivalente do mesmo. Umavez que o indivíduo é exposto, o método da presenteinvenção pode ser aplicado em qualquer estágio de exposiçãocomo descrito acima. Preferivelmente, o método é usado paradetetar a exposição onde não há nenhum sinal e sintoma quesão óbvios de uma infecção de flavivírus. Preferivelmente,o método detecta a exposição do indivíduo em qualquer fasede infecção de flavivírus em uma fase aguda precoce para ainfecção secundária ou estágio de convalescência posteriorde exposição ao flavivírus ou equivalente do mesmo para ainfecção ou a vacinação primária. A exposição pode nemsempre manifestar em uma infecção de flavivírus ou sinaisou sintomas notáveis, mas causará uma resposta para induzirum parceiro de ligação. Preferivelmente, a resposta é umaresposta imunológica.

Resposta imune ou resposta imunológica

Uma "resposta imune" ou "resposta imunológica" écompreendida como sendo uma resposta seletiva montada pelosistema imune de vertebrados em que anticorpos específicosou fragmentos de anticorpos e/ou de células citotóxicas sãoproduzidos contra os patógenos e antígenos invasivos quesão reconhecidos como estranhos no corpo.Parceiro de ligação

Conseqüentemente, o "parceiro de ligação" como usadoaqui é qualquer molécula ou célula que é produzida contra oflavivírus estranho ou equivalente do mesmo.Preferivelmente, é uma molécula imunoreativa. Maispreferivelmente, o parceiro de ligação é um anticorpo ou umfragmento ativo imunologicamente do mesmo, ou uma célulacitotóxica. O parceiro de ligação inclui uma moléculaimunointerativa que possa interagir com um antígeno deflavivírus ou um equivalente e competir com agentesimunológicos específicos de flavivírus, tais comoanticorpos monoclonais específicos de flavivírus.

O parceiro de ligação preferido é uma moléculaimunointerativa, que se refere preferivelmente a qualquermolécula compreendendo uma porção de ligação de antígeno ouum derivado do mesmo. Preferivelmente, a moléculaimunointerativa é um anticorpo contra qualquer porção deproteínas de flavivírus produzidas durante uma respostahumoral no indivíduo de uma infecção ou de uma exposição deflavivírus.

Mais preferivelmente, o parceiro de ligação é umanticorpo produzido no indivíduo a um flavivírus oucomponentes de vírus relacionados. Entretanto, um parceirode ligação do anticorpo alvo pode também ser usado. Umexemplo de um parceiro de ligação é um anticorpo anti-idiotípico ou um anticorpo específico para ediscriminatório de um anticorpo específico de indivíduopara o membro dos flavivírus ou componentes de vírusrelacionados. Nos estágios iniciais convalescentes deinfecção de flavivírus, o anticorpo preferivelmente IgGderivado da infecção de flavivírus precedente é uma dasindicações de infecção secundária ou primária deflavivírus. 0 anticorpo pode ser detectado pela formação deum complexo entre ele e um componente do membro dosflavivírus. A formação deste imunocomplexo com o membro daIgG específica de flavivírus e o antígeno no epitopoespecífico de membro ou específico de flavivírus é indicadopela ausência do anexação de agentes imunológicosespecíficos de membro ou de flavivírus competidores.

Como usado aqui, um "anticorpo anti-idiotípico" é umanticorpo que se liga ao sítio de ligação de antígenoespecífico de outro anticorpo gerado em resposta àexposição a um componente derivado do membro do gêneroflavivírus ou relativo imunológico do mesmo.

Como usado aqui, os termos "anticorpo" ou "anticorpos"incluem o anticorpo inteiro e fragmentos de anticorpo quecontêm porções funcionais do mesmo. 0 termo "anticorpo"inclui qualquer composto monoespecífico ou biespecíficocompreendido de uma porção suficiente da região variável dacadeia leve e/ou região variável da cadeia pesada paraefetuar a ligação ao epitopo ao qual o anticorpo inteirotem especificidade de ligação. Os fragmentos podem incluira região variável de pelo menos um polipeptideo deimunoglobulina de cadeia pesada ou leve, e inclui, mas nãosão limitados a, os fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, efragmentos Fv.

Preferivelmente o parceiro de ligação é um anticorpo.Mais preferivelmente, é uma molécula de IgG de flavivírusou uma porção imunoreativa. Mais preferivelmente oflavivirus é o vírus da dengue ou vírus da JE.

As células Citotóxicas contidas dentro da amostrabiológica podem também sevir como parceiros de ligação. Acélula pode interagir diretamente com o flavivírus ouqualquer componente de um lisado de célula de célulasinfectadas com flavivírus ou um equivalente do mesmo.

Amostra biológica

0 método da presente invenção detecta a exposição aoflavivírus ou equivalente do mesmo através do uso de umaamostra biológica obtida de um indivíduo que sendopotencialmente exposto ao flavivírus. A amostra biológicapode ser qualquer amostra do corpo que pode conter umparceiro de ligação. Tais amostras biológicas podem serselecionadas do grupo que inclui sangue, saliva, líquido dacoluna, células B, Células T, plasma, soro, urina e fluidoamniotic. Preferivelmente, a amostra biológica é soro ouplasma ou saliva. Mais preferivelmente, a amostra biológicaé soro ou saliva.

Também prefere-se que a amostra biológica seja obtidade indivíduos com suspeita de exposição a um flavivírus.Uma amostra biológica pode também ser modificada antes douso, tal como pela diluição, purificação de várias frações,centrifugação e semelhante.

Conseqüentemente, uma amostra biológica pode sereferir a um homogeinizado, lisado ou extrato preparados deum organismo inteiro ou um subconjunto de seus tecidos,células ou partes de componente, ou uma fração ou porção domesmo.

Deve-se notar que uma amostra biológica pode tambémser desprovida de um parceiro de ligação que possainteragir com o flavivírus ou um equivalente do mesmo. Istoocorre quando o indivíduo não foi exposto ao flavivírus oua um equivalente do mesmo. Conseqüentemente a "determinaçãoda presença de um complexo que forma entre um parceiro deligação específico de flavivírus presente na amostrabiológica e um componente capturado de IgA deantiflavivírus" pode dar um resultado zero como um complexoque não pode formar na ausência de parceiros de ligação. 0único complexo que pode formar neste exemplo compreenderiao agente competitivo imunológico específico de flavivírus,tal como um anticorpo monoclonal projetado para competircom os parceiros de ligação na amostra biológica.

Em referência a uma amostra biológica sendo colocadaem contato com um componente de um lisado, preferivelmenteum componente imunogênico de flavivírus ou relativoimunológico do mesmo, deve ser entendido como umareferência a qualquer método para facilitar a interação deuma ou mais moléculas imunointerativas da amostra biológicacom um componente do flavivírus ou do relativo imunológicodo mesmo. A interação deve ser tal que o acoplamento ou aligação ou qualquer outra associação entre a moléculaimunointerativa e um componente imunogênico especifico doflavivirus ou relativo imunológico do mesmo podem ocorrer.A amostra biológica é contatada com uma mistura decomponentes virais capturados de IgA de antiflavivirus deflavivirus ou de equivalente do mesmo.Componente capturado de IgA antiflavivirus

A IgA de antiflavivirus é usada para capturarcomponentes específicos de flavivirus ou de membro.

Preferivelmente o componente é um componente imunológicoque é reativo a um parceiro de ligação específico deflavivirus e um agente competitivo imunológico específicode flavivirus. A IgA de antif lavivirus pode ser obtida porquaisquer métodos disponíveis ao de habilidade técnica parafazer anticorpos a um antígeno. Preferivelmente, a IgA écapturada por IgA antihumana.

A presente invenção usa especificamente componentescapturados de IgA de antif lavivirus ao contrário de IgG oude IgM que geralmente resultam na perda de sensibilidade doteste. Descobriu-se agora que o uso de IgA para capturarcomponentes de flavivirus pode melhorar a sensibilidade doteste sorológico. A IgA pode capturar componentes deflavivirus que reagem mais especificamente com o parceirode ligação a partir da infecção e exposição recentes.

Quando um indivíduo é exposto ao flavivirus, o sistemaimune do corpo reage para remover inicialmente o vírus.Isto causa uma cadeia de acontecimentos que se manifestageralmente em uma resposta imunológica à pletora deantígenos apresentados pelo flavivirus ou por umequivalente do mesmo. Conseqüentemente o componentefornecido na presente invenção representa qualquer estágiode exposição ao flavivírus e pode ser um antigeno ou porçãodo antigeno que inclui um epitopo específico a todos osflavivírus ou ao sorotipo. Os componentes podem serderivados de qualquer fonte que inclui o próprioflavivírus. Entretanto, prefere-se que o componente sejaderivado de uma célula infectada com o vírus de flavivírus.Isto pode ser derivado de uma cultura de células ou detecido ou amostras biológicas infectadas com o flavivírus.

Mais preferivelmente, os componentes são derivados de umacultura de células infectadas com o flavivírus do qual umlisado de célula é obtido.

Na presente invenção o lisado de célulapreferivelmente compreende uma mistura de imunógenos deflavivírus, que inclui partículas de vírus e as proteínasvirais estruturais e não estruturais. Estes componentesimunogênicos são capturados pela IgA de antiflavivírus.

Preferivelmente os imunógenos de flavivírus são oscomponentes imunogênicos do lisado que são capazes deprovocar uma reação imunológica a um parceiro de ligaçãoespecífico de flavivírus presente na amostra biológica eaos agentes de competição imunológicos específicos deflavivírus. 0 lisado fornece componentes virais,preferivelmente componentes imunogênicos que podem serfornecidos pelo flavivírus em qualquer estágio de seudesenvolvimento.

0 lisado da presente invenção pode ser obtido dequalquer fonte de células que foram infectadas com o membroespecífico dos flavivírus ou equivalente do mesmo.

Preferivelmente, as células são infectadas em uma in vivocultura com flavivírus ou equivalente do mesmo.

Qualquer tipo de célula pode ser infectada.Preferivelmente, o tipo de célula que é capaz de infecção ede cultura de flavivírus. Entretanto, prefere-se que ascélulas capazes de produzir títulos elevados de flavivírussejam infectadas de acordo com os métodos da presenteinvenção, incluindo, mas não limitadas a, linhagem celularcontínua geralmente disponível (por exemplo, células Vero(cepa Vero-PM), células CV-1, células LLC-MK2, C6/36 e AP-- 61), de linhagens celulares primárias, tais como células depulmão de Rhesus fetal (FRhL-2), células BSC-1, e célulasMRC-5, ou fibroblasto diplóide de humanos. Uma combinaçãode tipos de célula é também prevista pela presenteinvenção. As células C6/36 ou AP-61 são infectadas comflavivírus ou equivalente. Mais preferivelmente o tipo decélula é C6/36.

As células podem ser cultivadas para qualquer período,preferivelmente por um período que permita que o flavivírusse estabeleça e. infecte a célula. Mais preferivelmente, ascélulas são cultivadas até que um efeito citopático estejaaparente na cultura de célula que desse modo indica ainfecção ativa do vírus nas células.

Neste momento, as células podem lisadas por qualquermétodo disponível ao técnico hábil. Preferivelmente, o usode um tampão hipotônico que inclui um detergente, tal comoTriton X 100 pode ser usado fornecendo o tampão lisante quenão afeta os imunógenos do flavivírus ou equivalentes domesmo, mas preferivelmente inativa as partículas vivas de vírus.

Deve-se apreciar que o lisado conterá uma mistura decomponentes imunogênicos virais incluindo os antígenos devírus de flavivírus estrutural e não estruturais, assimcomo partículas inteiras de vírus de flavivírus. Para ovírus da dengue estes podem ser selecionados de grupo queinclui DEN 1, 2, 3 ou 4. A presente invenção procuraidentificar uma mistura de antígenos por uma mistura deparceiros de ligação que são gerados na amostra biológicaem resposta à exposição ao flavivírus ou a um equivalente.

Preferivelmente o flavivírus é vírus da dengue ouvírus da JE.

Mais preferivelmente o componente imunogênicoespecífico de dengue ou flavivírus é uma proteínaestrutural ou não estrutural de vírus de flavivírus ou dedengue. Mais preferivelmente, a proteína estrutural éselecionada do grupo que inclui as proteínas de C-Capsídeo,de M-Membrana e de E-Envelope, que podem ser capturada porIgA de antiflavivírus. Mais preferivelmente, as proteínasnão estruturais para a dengue são selecionadas do grupo queinclui NSl, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5.

0 lisado pode ser processado em qualquer maneira.

Preferivelmente, o lisado é clarificado para remover osnúcleos e respiduos celulares e as partículas inteiras deflavivírus. 0 lisado pode separado em alíquotas earmazenado em -70°C a -80°C para uso futuro.

Para o vírus da dengue os métodos precedentes usaram oDEN 1, 2, 3 e 4 de antígenos de dengue específicos(presentes no sobrenadante de células infectadas de vírusda dengue) para detectar os anticorpos indicativos deinfecção de vírus da dengue. Entretanto, a presenteinvenção não usa unicamente estes antígenos, mas umamistura de moléculas/imunógenos de flavivírus (presente nascélulas infectadas flavivírus, que podem conter aspartículas de flavivírus e outros componentes imunológicos,preferivelmente proteínas estruturais e não estruturais)contra quais anticorpos se desenvolvem no curso de umaexposição de flavivírus.

Agente competitivo imunolôgico específico de flavivírus

O agente imunolôgico, preferivelmente um anticorpo ouanticorpo monoclonal é usado para competir com o parceirode ligação presente na amostra biológica. O agenteimunolôgico é também reativo aos componentes específicos deflavivírus. Qualquer agente imunolôgico que é específicopara o flavivírus ou mais pref erivelmente a um epitopo doflavivírus é preferido. Geralmente o agente imunolôgicoserá específico ao epitopo na porção de envelope do vírusde flavivírus. Mais preferivelmente, o agente competitivoimunolôgico específico de flavivírus é específico para umcomponente capturado de IgA de antiflavivírus.

Uma vez que o agente imunolôgico for competir com oagente de ligação específico de flavivírus, também prefere-se que o agente imunolôgico e o agente de ligaçãoespecífico de flavivírus passem a competir por pelo menosum ou o mesmo epitopo. Conseqüentemente prefere-se que oagente imunolôgico seja específico a um epitopo doscomponentes capturados de IgA de antiflavivírus. Umacombinação de Componentes capturados de IgA e um agenteimunolôgico altamente específico melhorará a especificidadedo teste ao membro do gênero flavivírus.

A especificidade no teste pode ser melhorada pelo graude especificidade dos agentes de competição imunológicosespecíficos de flavivírus. Preferivelmente o agentecompetitivo imunológico específico de flavivírus é umanticorpo, tal como um anticorpo policlonal ou um anticorpomonoclonal. Mais preferivelmente é um anticorpo monoclonalespecífico para um epitiope do flavivírus, maisespecificamente a um componente capturado de IgAantiflavivírus.

Sabendo que o antígeno para o qual o anticorpo égerado, o antígeno do componente pode ser identificado.

Quaisquer métodos disponíveis ao técnico hábil podemser usados para fazer um anticorpo ou anticorpo monoclonalao vírus de flavivírus.

Formação de complexo

Os componentes e a amostra biológica são contatados,de modo que possam formar um complexo entre os componentese o parceiro de ligação presentes dentro da amostrabiológica. Preferivelmente, os imunógenos das partículas deflavivírus, incluindo, mas não limitados às proteínasestruturais e não estruturais capturadas por IgA deantiflavivírus que tem um epitopo específico paraflavivírus, formarão complexos com os parceiros de ligaçãoou um agente competitivo imunológico específico deflavivírus. Preferivelmente, os parceiros de ligaçãoespecíficos são anticorpos ou fragmentos do mesmo presentesna amostra biológica. Estes estarão somente presente quandoo indivíduo foi expôsto/imunizado ao flavivírus.

Preferivelmente, o complexo formará entre umanticorpo, preferivelmente uma IgG específico para o membrodo gênero flavivírus ou equivalente do mesmo e umcomponente viral de flavivírus capturado de IgAantiflavivírus.

O parceiro de ligação pode também ser uma célulacitotóxica, tal como uma T célula citotóxica da amostrabiológica que reage aos imunógenos de flavivírus.

Um agente competitivo imunológico específico deflavivírus ou de membro também formará um complexo com ocomponente se o mesmo epitopo permanecer livre nocomponente. Onde o parceiro de ligação e o agenteimunológico são específicos para o mesmo epitopo, umacompetição acontecerá, manifestando-se em uma indicação dapresença do parceiro de ligação e de exposição prévia aoflavivírus.

0 método preferido da presente invenção se baseia nadetecção de agente competitivo imunológico específico deflavivírus ou membro com os parceiros de ligaçãoespecíficos de flavivírus presentes na amostra biológica. 0agente imunológico de competição e parceiro de ligaçãoespecífico de flavivírus ou membro competem para umcomponente do antígeno de flavivírus presente no lisado decélula derivado de uma célula infectada com o flavivírus ouum equivalente do mesmo que foi capturado usando IgA deantiflavivírus. O complexo pode compreender um ou maisparceiros de ligação limitados a um ou mais componentesderivados de flavivírus ou um equivalente do mesmo.

A amostra biológica é deixada em contato com ocomponente derivado de flavivírus ou um equivalente domesmo por um período de tempo suficiente e condições, quepermitem a formação estável de um complexo e inibem aanexação de agente imunológico competitivo, tal como umanticorpo monoclonal específico para o flavivírus ouqualquer o membro particularmente do gênero.

Uma vez que anexado, o agente competitivo imunológicoespecífico de flavivírus pode ser adicionado.Conseqüentemente, prefere-se ter uma etapa de pré-incubaçãoonde o agente de ligação e o componente sejam permitidosformar um complexo antes da adição do agente imunológico.Entretanto, estes componentes podem também ser adicionadossimultaneamente.

A invenção utiliza preferivelmente um flavivírusespecífico ou qualquer anticorpo específico de membroparticular para competir com os parceiros de ligação, taiscomo o antiflavivírus específico ou qualquer membroparticular específico de IgG a partir do corpo hospedeiropara um específico epitopo ao flavivírus ou qualquer membroparticular do gênero ou a seus sorotipos presentes naproteína de envelope de flavivírus derivada de um lisado decélula, que inclua uma mistura de componentes imunogênicosde flavivírus incluindo partículas de flavivírus dentreoutros antígenos indicativos de infecção de flavivírus.

Os métodos e kits da presente invenção procuramdetectar os componentes e parceiros de ligação, que formamcomplexos e são indicativos de uma infecção de flavivírus.Estes componentes e parceiros de ligação são gerados nocurso de uma infecção de flavivírus.

Em ainda outro aspecto, a amostra biológica pode seraplicada a um suporte sólido, tal como, mas sem limitar a,uma membrana de nitrocelulose ou placa de poliestirenorevestida com IgA de antiflavivírus. O suporte sólido podetambém ter o componente capturado por IgA antihumana ederivado do flavivírus ou um equivalente do mesmo aplicadoa ela. O componente derivado de um flavivírus ouequivalente do mesmo é deixado então em contato com aamostra biológica por um período de tempo suficiente e sobcondições, que permitem a formação estável de um complexona presença de agentes imunológicos competidoresespecíficos ao flavivírus ou quaisquer membros do gênero.

Uma vez que o complexo é formado, um sistema de detecção éentão adicionado para facilitar a detecção da ligaçãoespecífica do agente imunológico no complexo.

Determinando a presença de um complexo

Detectar o complexo entre a IgA de antiflavivíruscapturada de componentes virais de flavivírus derivados doflavivírus e um parceiro de ligação específico deflavivírus, tal como uma molécula imunoreativa ou um agenteimunológico específico de flavivírus, pode ser baseado emqualquer método conveniente, que seja conhecido àqueles dehabilidade na técnica.

É conhecido que os procedimentos úteis para detectarcomponentes capturados de IgA de antiflavivírus, parceirosde ligação e agentes imunológicos específicos deflavivírus, tais como os anticorpos monoclonais que formamcomplexos e são indicativos de uma infecção de flavivírusem uma amostra biológica incluem, mas não estão limitadosa, ensaios imunológicos, tais como imunoblotting,imunocitoquímico, imunohistoquímico ou cromatografia deafinidade de anticorpo, análise de Western blot, ouvariações ou combinações destes ou outras técnicas comoconhecida na técnica.

Em uma modalidade preferida, o método de detecçãoemprega um agente de detecção adicional, tal comoanticorpos específicos e anti- anticorpos conjugados comenzima, ou simplesmente utilização de um agente imunogênicoligado diretamente a um grupo reportador, tal como umaenzima. Uma enzima apropriada é peróxido de rábano (HRP)que permite a detecção dos complexos formados comcomponentes competidores. Para especificidade adicionada,os anticorpos monoclonais podem ser empregados.

A presente invenção inclui o uso de um agenteimunológico específico de flavivírus ou de membro deflavivírus que tenha um grupo reportador. 0 uso destemelhora a velocidade que o teste pode ser realizado. Reduzo número de etapas exigidas para identificar a formação decomplexo. Um grupo reportador apropriado é uma enzima, talcomo HRP. Outros grupos reportadores apropriados podem serusados e são familiares àqueles de habilidade na técnica.

O complexo formado por um componente do lisado decélula e o parceiro de ligação pode ser detectado usando umagente de detecção que contenha um grupo reportador e oligue especificamente ao componente/complexo de parceiro deligação. Tal agente de detecção pode compreender, porexemplo, o anticorpo específico de flavivírus ou específicode membro derivado de outra espécie de animais ou de outrosagentes que se ligam especificamente ao parceiro deligação, tal como uma anti-imunoglobulina (isto é,anticorpo), proteína G, proteína A ou uma lecitina.

Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado,em que um agente de detecção capaz de ligar um antígenoderivado do membro de flavivírus, é marcado com um gruporeportador e permitido se ligar ao componente imobilizadodo lisado de célula em combinação com o parceiro de ligaçãoda amostra biológica. A extensão a qual o parceiro deligação da amostra biológica inibe a ligação do flavivírusmarcado ou agente de detecção especifico de membro deflavivírus ao componente imobilizado é indicativo dareatividade do parceiro de ligação da amostra biológica como componente imobilizado.

Em uma modalidade preferida, o reagente de detecção éum anticorpo ou anticorpo secundário ou um fragmentoligador de antígeno do mesmo, capaz de ligar ao parceiro deligação da amostra biológica. Os anticorpos podem serpreparados por qualquer de uma variedade de técnicasconhecidas àquelas de habilidade ordinária na técnica(veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Labortory, 1988). Geralmente, osanticorpos podem ser produzidos pelas técnicas de culturade célula, incluindo a geração de anticorpos monoclonais,ou através de transfecção de genes de anticorpo emhospedeiros de célula bacteriana ou mamífera apropriados, afim de permitir a produção de anticorpos recombinates.

0 anticorpo secundário, que pode ser conjugado a ummarcador, pode ser adicionado ao complexo para facilitar adetecção. Uma faixa de marcadores que fornecem um sinaldetectável pode ser empregada. 0 marcador pode serselecionado de um grupo que inclui cromógeno, uma enzima,um catalizador, um marcador visual fluoróforo e direto. Nocaso de um marcador visual direto, pode-se usar umapartícula metálica coloidal ou não metálica, uma partículade tintura, uma enzima ou um substrato, de um polímeroorgânico, ou de uma partícula de látex. Um grande número deenzimas apropriadas para o uso como marcadores sãodivulgadas na patente dos Estados Unidos no. 4366241,4843000 e 4849338. Os marcadores de enzima apropriados napresente invenção incluem fosfatos alcalinos, peroxidase derábano, preferivelmente peroxidase de rábano. O marcador deenzima pode ser usado sozinho ou em combinação com umasegunda enzima que esteja na solução. Na presente invençãoum anticorpo secundário anexado com peroxidase de rábano,que então reage com seu substrato OPD ou DAB e produz umamudança de cor visualmente detectável, preferivelmentealcança a detecção do complexo que formou com os imunógenose os agentes imunológicos específicos de flavivíruscompetitivo ou de membro de flavivírus, tais como osanticorpos monoclonais específicos para flavivírus ouqualquer membro do gênero.Apresentação dos componentes capturados de IgA deantiflavivírus

Em uma modalidade preferida, os métodos como descritoaqui envolvem o uso de um lisado de célula derivado de umacélula infectada com um flavivírus ou um membro deflavivírus do gênero, ou os componentes capturados de IgAde antiflavivírus (referidos aqui permutavelmente como"components" ou "componentes do lisado de célula"),imobilizado em um suporte sólido, tal como uma membrana depoliestireno ou de nitrocelulose a qual um parceiro deligação presente em uma amostra biológica pode se ligar.

Conseqüentemente em um outro aspecto da presenteinvenção é fornecido um suporte sólido para o uso em ummétodo para detecção de exposição de um indivíduo a umflavivírus ou equivalente do mesmo, o referido métodocompreendendo:contatar uma amostra biológica a partir do indivíduocom uma mistura de componentes capturados de IgA deantiflavivirus de flavivírus ou de um equivalente;

submeter a amostra biológica e os componentescapturados de IgA de antiflavivirus a um agente competitivoimunológico específico de flavivírus

determinar a presença de um complexo que se formaentre um parceiro de ligação específico de membro deflavivírus ou flavivírus presente na amostra biológica e emum componente capturado de IgA de antiflavivirus napresença do agente competitivo imunológico específico deflavivírus;

o referido suporte compreendendo componentescapturados de IgA de antiflavivirus imobilizados nosuporte.

O suporte sólido pode ser qualquer material conhecidoàqueles de habilidade ordinária na técnica ao qual umparceiro ou um componente de ligação do lisado de célulapodem ser anexados. Por exemplo, o suporte sólido pode serum poço de teste em uma placa de microtítulo ou umanitrocelulose ou outra membrana apropriada.

Alternativamente, o suporte pode ser um grânulo ou umdisco, tal como vidro, fibra de vidro, látex ou um materialplástico, tal como poliestireno ou polivinilcloreto. 0suporte pode também ser uma partícula magnética ou umsensor de fibra óptica, tal como aquelas divulgadas, porexemplo, na US-PAT. No.5.359.681.

O parceiro de ligação ou o componente do lisado decélula podem ser imobilizados no suporte sólido usando umavariedade de técnicas conhecidas àqueles de habilidade natécnica, que são descritas amplamente na patente e naliteratura científica. No contexto da presente invenção, otermo "imobilização" refere-se a imuno-absorção ouassociação não-covalente, tal como adsorção, e anexaçãocovalente (que pode ser uma ligação direta entre o antígenoou nucleotídeo e grupos funcionais no suporte, ou pode seruma ligação por um agente de reticulação). A imobilizaçãopela imuno-absorção com anticorpo revestido a um poço emuma placa de microtítulo ou uma absorção simples a umamembrana é preferida. Nesses casos, a adsorção pode serconseguida contatando o parceiro de ligação ou umcomponente do lisado de célula, em um tampão apropriado,com o suporte sólido previamente revestido com o anticorpopara uma quantidade de tempo apropriada. 0 tempo de contatovaria com a temperatura, mas é tipicamente cerca de 1 horae durante a noite.

A Imuno-anexação de um parceiro de ligação, umcomponente capturado de IgA antiflavivírus ou um agenteimunológico específico de flavivírus ou de membro a umasuporte sólido pode também ser conseguido primeiramentereagindo o suporte com um reagente bifuncional que reajacom o anticorpo revestido e um componente imunogênico, talcomo epitopo não específico, de um parceiro de ligação oude um componente. Por exemplo, o parceiro de ligação, de umcomponente capturado de IgA antiflavivírus ou um agenteimunológico específico de flavivírus pode serimunologicamente anexado aos suportes que têm umrevestimento de anticorpo apropriado usando o anti-anticorpo.

Descrição geral do processoO seguinte é uma descrição geral do método meramentepara ilustrar determinadas modalidades preferidas, mas ainvenção não deve ser restringida a esta descrição geralnem ao vírus da dengue. O vírus da dengue é meramente umflavivírus preferido para finalidades de ilustração de umflavivírus para a invenção.

O ensaio pode ser conduzido como um ensaio sanduíchede duas etapas. Este ensaio pode ser realizadoprimeiramente contatando um parceiro de ligação específicode dengue presente em uma amostra biológica que foiimobilizado em um suporte sólido (este pode ser o poço deuma placa de microtítulo), com o componente de um lisado decélula como descrito aqui, de modo que um componente épermitido ligar ao parceiro de ligação imobilizado. Aamostra não ligada é então removida do complexo imobilizadoe um reagente de detecção (preferivelmente um segundoanticorpo capaz de ligar ao parceiro de ligação ou aocomponente, contendo um grupo reportador) é adicionado. Aquantidade de reagente de detecção que permanece ligado aosuporte sólido é determinada então usando um métodoapropriado para o grupo reportador específico.

Mais preferivelmente, uma vez que o parceiro deligação ou um componente do lisado de célula é imobilizadono suporte como descrito acima, os locais de ligaçãorestantes no suporte são tipicamente bloqueados. Qualqueragente de bloqueio apropriado conhecido àqueles dehabilidade ordinária na técnica, tal como a albumina desoro bovino ou leite de pele com Triton X 100 ou Tween 20™(Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.). 0 parceiro de ligaçãoimobilizado ou componente é então incubado com umcomponente de um lisado de célula ou parceiro de ligação,respectivamente, tal que um complexo entre o parceiro deligação e o componente é permitido formar. O componente ouo parceiro de ligação podem também ser diluídos com umtampão de diluente apropriado, tal como salino de tampãofosfato (PBS) com o soro humano negativo de anticorpo dedengue e Triton X 100 ou Tween 20 antes da incubação.Geralmente, um tempo de contato apropriado (isto é, tempode incubação) é um período de tempo preferivelmente de 30minutos que é suficiente para permitir um componente dolisado de célula se ligar ao parceiro de ligaçãoimobilizado, ou vice versa, e então agente imunológicocompetitivo, tal como um anticorpo ao vírus da dengue, maispreferivelmente um anticorpo monoclonal é adicionado àmistura para o ensaio competitivo e é deixado trabalhar poroutros 30 minutos. O agente imunológico competitivo podeter um grupo reportador diretamente ligado a ele.Preferivelmente, o tempo de contato é suficiente paraconseguir um nível de ligação ao epitopo alvo no antígenode dengue anexado que é, pelo menos aproximadamente 95%daquele conseguido em equilíbrio entre o parceiro oucomponente de ligação ligado ou não ligado do lisado decélula. Aqueles de habilidade ordinária na técnicareconhecerão que o tempo necessário para conseguir oequilíbrio pode prontamente ser determinado pelo ensaio donível de ligação que ocorre durante um período de tempo. Emtemperatura ambiente, um tempo de incubação deaproximadamente 30 a 60 minutos é geralmente suficiente.

Os componentes não ligados podem então ser removidoslavando o suporte sólido com um tampão apropriado, tal comoPBS contendo 0,05% Tween 20™ ou Tween 80. Um agente dedetecção que é capaz de ligar ao componente do lisado decélula ou parceiro de ligação, e que contenha um gruporeportador, pode então ser adicionado ao suporte sólido. 0agente de detecção é incubado então com o complexoparceiro-componente de ligação imobilizado para umaquantidade de tempo suficiente para detectar o componenteligado ou parceiro de ligação. Uma quantidade de tempoapropriada pode geralmente ser determinada analisando onível de ligação, isso ocorre durante um período de tempo.

0 agente de detecção não ligado é então removido e agentede detecção ligado é detectado usando o grupo reportador. 0método empregado para detecção do grupo reportador dependeda natureza do grupo reportador.

Alternativamente, um grupo reportador pode ser ligadodiretamente ao agente imunológico. 0 grupo reportador podeentão ser detectado imediatamente. Para grupos radioativos,a contagem de cintilação ou métodos autoradiográficos sãogeralmente apropriados. Os métodos espectroscópicos podemser usados para detectar tinturas, grupos liminescentes,enzimas cromogênicas e grupos fluorescentes. As enzimascromogênicas incluem, mas não são limitadas a, peroxidase efosfatase alcalina. Os grupos fluorescentes incluem, masnão são limitados a, isotiocianato de fluoresceína (FITC),isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), rodamina,Texas Red e ficoeritrina. A biotina pode ser detectadausando avidina, acoplada a um grupo reportador diferente(geralmente um grupo radioativo ou fluorescente ou umaenzima). Os grupos reportadores de enzima podem geralmenteser detectados pela adição de substrato (geralmente por umperíodo de tempo específico), seguido por espectroscopia ououtra análise dos produtos de reação. O substrato pode serselecionada de um grupo de agentes consistindo de 4-cloro-1-naftol (4CN), diaminobenzidina (DAB), carbazola deaminoetila (AEC), 2,21azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), ofenilenodiamina(OPD) e benzidina tetrametila (TMB).

Pode também ser desejável acoplar mais de um gruporeportador a um agente de detecção. Em uma modalidade,grupos reportadores múltiplos são acoplados a uma moléculade agente de detecção. Em uma outra modalidade, mais de umtipo de grupo reportador pode ser acoplado a um agente dedetecção. Não obstante da modalidade particular, os agentesde detecção com mais de um grupo reportador podem serpreparados em uma variedade de maneiras. Por exemplo, maisde um grupo reportador pode ser acoplado diretamente a umagente de detecção, ou ligantes que forneçam múltiploslocais para a anexação podem ser usados.

Em uma modalidade relacionada, o método como descritoaqui pode ser realizado em uma placa de poliestireno oufluxo-livre (flow-through) ou formato de teste de fita,onde o parceiro de ligação de uma amostra biológica ou deum componente é imobilizado pelo anticorpo antidengue ou emuma membrana, tal como nitrocelulose. No teste de fIuxo-livre, por exemplo, um componente é capaz de ligar aoparceiro de ligação imobilizado a medida que a amostrapassa através da membrana. Alternativamente, um parceiro deligação presente em uma amostra biológica é capaz de ligarao componente imobilizado do lisado de célula a medida quea amostra passa através de membrana. Um segundo, agente dedetecção marcado se liga então ao complexo parceiro-componente de ligação enquanto uma solução que contém oagente de detecção flui através da membrana. A detecção doagente de detecção ligado pode então ser realizada comodescrito acima.

No formato de teste de fita, uma extremidade damembrana a qual um componente do lisado de célula é ligadoé imersa em uma solução que contém a amostra biológica. 0parceiro de ligação na amostra biológica migra ao longo damembrana através de uma região que contém um agente dedetecção e até a área do componente imobilizado. Aconcentração de agente de detecção na área do complexoparceiro-componente de ligação imobilizado indica apresença de agente de ligação em uma amostra biológica.

Tipicamente, a concentração do reagente de detecção nesselocal gera um padrão, tal como uma linha, que possa serlida visualmente. A ausência de tal padrão indica umresultado negativo. Geralmente, a quantidade de parceiro deligação imobilizado na membrana ou placa de poliestireno éselecionado para gerar um padrão visualmente discernivelquando a amostra biológica contém um nivel de um agente deligação que seja suficiente para gerar um sinal positivo noensaio sanduíche, no formato discutido acima. Tais testespodem tipicamente ser realizados com uma quantidade muitopequena de amostra biológica.

Em uma versão mais simples do teste de fita ou testede bastão de aferição, os componentes do lisado de célulapodem ser imobilizados em uma membrana, tal como umamembrana de nitrocelulose. As fitas de membrana podem entãoser submetidas às amostras biológicas para formar complexosentre os componentes e um parceiro de ligação presentes naamostra biológica. O complexo é então detectável porquaisquer meios descritos acima usando um agente dedetecção, tal como um anticorpo monoclonal. O teste debastão de aferição pode fornecer uma indicação rápida deexposição precedente sem usar grandes amostras biológicas.

Como usado aqui, "ligação" se refere a uma associaçãonão-covalente ou uma ligação imunológica entre duasmoléculas separadas de modo que um complexo é formado. Ahabilidade de ligar pode ser avaliada pela, por exemplo,determinação de uma constante de ligação para a formação docomplexo. A constante de ligação é o valor obtido quando aconcentração do complexo é dividida pelo produto dasconcentrações componentes. Geralmente, dois compostos sãoditos para se "ligar", no contexto da presente invenção,quando a constante de ligação para a formação de complexoexceda aproximadamente 10^3 L/mol. A constante de ligaçãopode ser determinada usando métodos bem conhecidos natécnica.

Os suportes sólidos contemplados pelo método e kits dapresente invenção incluem qualquer superfície a qual oparceiro de ligação, componentes derivados do flavivírus ouqualquer membro específico do grupo ou equivalente do mesmoou um agente competitivo imunológico específico deflavivírus pudem imobilizar usando imuno-absorção. Osexemplos de superfícies incluem sem serem limitados a,poliestireno ou membranas incluindo membranas denitrocelulose, filtros de membrana depolitetrafluoretilene, filtros de membrana de acetato decelulose e filtros de membrana de nitrato de celulose comcarreadores de papel de filtro. Mais preferivelmente, amembrana é poliestireno e a membrana é membrana denitrocelulose.

Alternativamente, os métodos de diagnóstico dapresente invenção podem adotar um método analíticoautomatizado usando um microchip biológico. Por exemplo, umkit de diagnóstico pode ser estruturado para realizarimunoblotting usando um dispositivo de vidro revestido como componente do lisado de célula. Este kit de diagnósticopode compreender um microchip biológico na superfície daqual o componente do lisado de célula é imobilizado, umtampão apropriado, uma amostra padronizada compreendendo umnível detectável de agente de ligação, e um reagente dedetecção secundário, como descrito aqui.

O método e kits da presente invenção podem detectar aexposição específica de humanos ou animais a um flavivírusou qualquer membro específico da família ou equivalente domesmo, durante a infecção aguda ou em fase convalescente.Como usado aqui, "infecção aguda" se refere ao período detempo quando um vírus infectou um hospedeiro e estáativamente replicante e/ou causando os sintomas associadoscom a infecção como febre, vermelhidão, dor nasarticulações e ou dor abdominal. A "fase convalescente" serefere ao estágio de ciclo de infecção de flavivírus quandoo vírus de flavivírus já não está se multiplicando oupermanece no sangue hospedeiro e desenvolveu parceiros deligação tal como, mas não limitado aos anticorpos. Usando ométodo e o kit da presente invenção, a exposição pode serdetectada a qualquer hora após a geração de um parceiro deligação no paciente infectado ou paciente derivado deinfecção/infecções precedentes.

Kits

Em um outro aspecto da presente invenção é fornecidoum kit para detecção de exposição de um indivíduo a umflavivírus ou qualquer membro da família ou equivalente domesmo, o referido kit compreendendo:

componentes capturados de IgA de antiflavivírus deflavivírus;

agente competitivo imunológico específico deflavivírus; e

pelo menos um agente de detecção para detectar umcomplexo que se forma entre um parceiro de ligação presenteem uma amostra biológica e um componente capturado de IgAde antiflavivírus na presença do agente competitivoimunológico específico de flavivírus.

Opcionalmente, o kit também inclui partes adicionais,tais como tampões de lavagem, recipientes de incubação,tampões de bloqueio e instruções como são necessárias paraconduzir o método.

Conseqüentemente a presente invenção fornece um kitpara detecção de exposição de um indivíduo ao flavivírus ouqualquer membro da família ou um equivalente do mesmo. Okit pode ser qualquer forma conveniente que permiti umparceiro de ligação em uma amostra biológica interagir comum componente viral de flavivírus capturado de IgA deantidengue e ainda competir com um agente competitivoimunológico específico de flavivírus. O resultado é umaindicação, pela presença de flavivírus específico ou deparceiros de ligação específicos de flavivírus na amostrabiológica, de exposição prévia ao flavivírus.Preferivelmente o kit compreende um suporte sólido, talcomo descrito aqui adaptado para receber ou compreendercomponentes capturados de IgA de antiflavivírus def lavivlrus ou um equivalente do mesmo. O kit podecompreender também reagentes, moléculas reportadorascapazes de fornecer sinais detectáveis e opcionalmenteinstruções para o uso. O kit pode ser em forma modular ondeos componentes individuais podem ser separadamentecomprados.

O kit pode ser um kit modular compreendendo um ou maismembros onde pelo menos um membro é um suporte sólidocompreendendo um componente de flavivírus capturado de IgAde antiflavivírus de flavivírus ou equivalente ou lisado decélula compreendendo um componente imunogênico derivado deum flavivírus ou um equivalente do mesmo.

Em uma modalidade alternativa o suporte sólidocompreende um arranjo de parceiros de ligação para um oumais componentes de um ou mais flavivírus ou equivalente domesmo de um ou mais indivíduos.

A presente invenção também fornece componentesindividuais do kit para o uso no método da presenteinvenção. A invenção fornece suportes sólidos incluindocomponentes capturados de IgA de antiflavivírus deflavivírus para o uso na detecção de exposição aoflavivírus. Em uma modalidade, a invenção fornece uma placade 96 poços de poliestireno ou uma membrana denitrocelulose para anexar antígeno viral, para o uso comocomponentes virais de flavivírus capturados de IgA deantif lavivírus imobilizados ou como um ponto de blot ou ouso como uma bastão de aferição, que inclui componentes deflavivírus ou equivalente do mesmo. Preferivelmente, aplaca ou as membranas incluem os componentes selecionadosdo grupo que inclui proteínas estruturais e não estruturaisde flavivirus, partículas de flavivírus e fragmentos domesmo, glicoproteínas, lipídeos e carboidratos derivados doflavivírus ou qualquer mistura do mesmo.

O suporte sólido pode ser também uma placa demicrotítulo, dispositivo de vidro ou microchip biológicoonde os componentes do lisado de célula são imobilizados.Estes suportes sólidos podem ser, então submetidos àamostra biológica para detecção de exposição de flavivírus.Preferivelmente a placa de microtítulo de poliestireno éusada para anexar antígeno de flavivírus por imuno-purificação usando IgA de antiflavivírus do lisado decélula infectado flavivírus.

No caso de uma membrana de nitrocelulose, o segundosuporte pode ser um aparador, que apara o suporte sólidopara melhorar a manipulação do suporte sólido, queimobilizou componentes do flavivírus. Por exemplo, amembrana de nitrocelulose pode ser suportada em um bastãoque permite a membrana de ser mergulhada em uma amostrabiológica tal como o soro. Isto é útil como um componentede um kit já que as pequenas quantidades de amostrabiológica podem ser testadas simultaneamente.

Avaliando o risco relativo de infecção

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção tambémfornece um método de avaliação do risco relativo de um oumais indivíduos sendo expostos ao flavivírus ou qualquermembro da família ou um equivalente do mesmo dentro de umalocalização definida (por exemplo, área geográfica,moradia, meio de transporte ou centro para o tratamentomédico ou avaliação), compreendendo:

a) obter amostras de uma população representativadentro de uma localização definida; e

b) avaliar a exposição de membros individuais de umapopulação de amostra a um flavivírus ou qualquer membro dafamília ou equivalente do mesmo pelo método compreendendoas etapas de -

i) contatar uma amostra biológica de um indivíduo comum componente capturado de IgA de antiflavivírus derivadodo flavivírus ou equivalente do mesmo para formar umcomplexo entre o componente e um parceiro de ligaçãoespecífico de flavivírus presentes na amostra biológica;

ii) determinar a presença do complexo que forma entreum parceiro de ligação específico de flavivírus presente naamostra biológica e um componente capturado de IgA deantiflavivírus na presença de um agente competitivoimunológico específico de flavivírus, onde a presença docomplexo é indicativa de exposição do indivíduo a umflavivírus ou qualquer membro da família ou equivalente domesmo; e

iii) avaliando o risco relativo de exposição dentro dalocalização definida.

A análise de risco pode ser conduzida usando osoftware em uma forma lida por computador.

Conseqüentemente, a presente invenção ainda relaciona-se aum programa lido por computador e computador compreendendoapropriado para analisar a exposição de indivíduos ou grupode indivíduos ou um risco de exposição de indivíduo ougrupo de indivíduos a um flavivírus ou equivalente domesmo.

O método ou a técnica da presente invenção permite oestudo epidemiológico ou a soro-vigilância dasmanifestações de infecção causadas pelo flavivírus ouqualquer membro da família ou equivalente do mesmo. Taisestudos fornecem a informação valiosa, que avança múltiplasfacetas de pesquisa na área de doença de flavivírus. Porexemplo, auxílio de estudos epidemiológicos naidentificação do índice de uma infecção. Tal informaçãopermite a identificação de uma localização definida da quala fonte de vírus responsável para uma manifestação viraloriginou.

Adicionalmente a técnica/método da presente invençãopermite para a identificação ou isolamento rápido dosindivíduos que são infectados com um flavivírus ouequivalente do mesmo sem equipamento de laboratórioprincipal ou mesmo em condições de campo. Tais auxílios deinformação na identificação dos indivíduos, que exigemtratamento médico assim como a definição das posições queexigem posterior investigação ou abordagens de controle dedoenças, tal como a identificação de lugares de criação eseu controle. Adicionalmente, a técnica da presenteinvenção permite a monitoração de um paciente infectadopara determinar a presença de IgG específico deantiflavivírus. A redução do título de IgG ou sua presençaem uma fase inicial de infecção pode ser a indicação deinfecção secundária e assim, ajudar a monitoração das fasessubseqüentes de infecção de flavivírus como a febrehemorrágica de dengue (DHF) ou síndrome de choque de dengue (DSS).Adicionalmente, a técnica da presente invenção fornecemeios para identificação dos indivíduos que são infectadoscom qualquer membro específico do gênero de flavivírus esorotipos envolvidos, permitindo a detecção rápida, riscode infecção adicional, apontando à localização de umaestratégia de controlo de infecção e doenças.

Uma referência aqui a um documento de patente ou outramatéria que é dada como a técnica anterior não deve serlevada como uma admissão que o documento ou a matéria sejamconhecidos ou que a informação que contém fosse parte doconhecimento geral comum como na data de prioridade dequalquer das reivindicações.

Os exemplos dos procedimentos usados na presenteinvenção serão descritos agora mais inteiramente. Deve-secompreender, entretanto, que a seguinte descrição éilustrativa somente e não deve ser tomada de nenhumamaneira como uma limitação na generalidade de invençãodescrita acima.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - C-ELISA para a detecção de dengue IgGespecífica

1. Materiais e métodos

1.1 Preparação de antígenos de lisado virais para C-ELISA: Os antígenos virais de dengue de lisado forampreparados contra todos os quatro sorotipos de vírus dadengue de acordo com o método descrito por Cardosa eoutros, 2002. Momentaneamente, os vírus da dengue (5m.o.i.) foram crescidos nas células C6/3 6 com o meio demanutenção de vírus que contém 2% de soro de vitela fetalfoi incubado de 4 a 5 dias dependendo do desenvolvimento deefeitos citopáticos e de sorotipos do vírus. O meio foidecantado e o frasco com as células infectadas foi lavadoquatro vezes com PBS, tratado com 1 ml de tampão hipotônicocom 1% de trixlOO por uma hora e finalmente centrifugado em14000 RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado,testado contra os anticorpos monoclonais específicos de desorotipo e específico de grupo de dengue por ELISAindireto, e 500μ1 alocados em eppendrofs e armazenados em -70°C até o uso.

1.2 Anticorpos monoclonais: MAbs específicos de denguepan foram obtidos de duas fontes diferentes (Abcam, Oxford,UK e Immunology Consultants Limited, USA) e ambos MAbsforam certificado por CDC, Atlanta, USA. MAbs específicossorotipos de dengue (den-1. den-2. den-3 e den-4) foramobtidos do ICL, USA. As reatividades de todos os MAbscontra quatro sorotipos de isolados de Singapura tambémforam avaliados por ELISA indireto e imunoensaio de dot-blot.

1.3 Soros de teste: Um total de 360 amostras de soroforam usadas neste estudo. Estas amostras foram recebidasde diferentes clínicas e hospitais para o diagnóstico deinfecção de dengue usando PCR ou isolamento de vírus ouensaios sorológicos. A presença de anticorpos reativos dedengue (IgG) na amostra foi inicialmente selecionada usandodois tipos de ELISAs indiretos de IgG de vírus da dengue(Pan-bio, Austrália e IVD Research, Inc, Carlsbad, CA92008, EUA) e o nível de IgG foi então determinado usandodot-blot EIA por diluições em série. Todas as amostrasforam preservadas em -80°C até que fossem testadas por C-ELISA.1.4 ELISA indireto: Três tipos de ELISAs indiretosforam usados neste estudo. Os kits comerciais (Pan-bio,Austrália e IVD Research Inc, Carlsbad, CA 92008, EUA)foram usados para a seleção de anticorpos reativos de IgGde vírus da dengue em amostras de soro e testes foramrealizados de acordo com os procedimentos descritos pelosfabricantes. No ELISA indireto da casa foi usado paraavaliar o MAbs e determinar o antígeno viral, MAb ediluições de soro ótimos para o uso no ensaio competitivo.ELISA indireto foi realizado em placas de poliestirenomaxi-sorb de 96 poços. AS placas de microtítulo de fundochato de 96-poços maxi-sorb (NUNC, Dinamarca) e volumes de100μl de reagentes foi usado durante o ensaio. As placas deELISA foram revestidas com ΙΟΟμΙ por poço de IgA antihumanana diluição 1:500 em tampão de carbonato/bicarbonato(Fluka, Biochemika, Switzerland) em pH 9,6 e incubadas em37°C por 1 hora ou durante a noite em 4°C. As placas foramlavadas uma vez com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05%de Tween 20) e 100μl de IgA antidengue em uma diluiçãoótima predeterminada (1:5000) em PBS foram adicionado àcada poço. As placas foram incubadas por 1 hora em 37°C elavadas novamente, uma vez e 100μl de antígenos de lisadode dengue (Den-I a Den-4) na diluição predeterminada de1:100 em PBS foi adicionado a cada poço e incubado outravez em 37°C por 1 hora. Depois da incubação, as placasforam lavadas quatro vezes e MAbs foi adicionado emdiluições em série de 1:250 a 64.000 no tampão diluente deC-ELISA (PBS com 0,3% de soro humano negativo de anticorposde dengue e 0,1% Triton x100) e incubadas em temperaturaambiente por 30 minutos. Após seis vezes lavando, 100μl deIgG anti-camundongo de cabra conjugada com a peroxidase derábano (HRP) adicionada a cada poço na diluição 1:3000 emtampão diluente e incubada em temperatura ambiente poroutros 30 minutos. As diluições ótimas de IgG anti-camundongo de cabra com 1:3000 de HRPf foram determinadaspor ELISA direto depois que as placas foram revestidas comdiluições em série de MAb. Depois da incubação, as placasforam lavadas seis vezes e 100μ1 de OPD (otro-fenelino-diaimina, Sigma, EUA) foi adicionado a cada poço e incubadoem temperatura ambiente por 5 a 10 minutos. Logodesenvolvimento de cor foi parado após 5 a 10 minutosadicionando 100μl 2M de H2SO4 e a densidade ótima foi lidaem um comprimento de onda de 4 92 nanômetros.

1.5 ELISA competitivo (C-ELISA): C-ELISA depende dobloqueio da ligação de MAb a um epitopo comum de vírus dadengue na presença de soro de positivo de dengue. Acompetição é detectada como uma redução na leitura dedensidade ótima obtida com o MAb sozinho. A quantidade dediminuição no sinal de ELISA seria proporcional ao títulode IgG específico de vírus da dengue no soro. O teste foirealizado de três maneiras, a saber, adição simultânea desoro de teste e de MAb aos poços de captura de antígeno queconduzem a um ELISA competitivo ou adição de MAb após apré-incubação de meia hora com soro de teste ou uma hora depré-incubação com o soro seis vezes lavado seguido pelaadição de MAb que foi chamado de ELISA de bloqueio ou B-ELISA. Todos od três formatos foram testados neste estudo.

Quatro sorotipos de dengue isolados em Singapura foramusados neste estudo. MAbs usados neste estudo foramselecionados usando mais de 100 isolados (Den-1, Den-2,Den-3 e Den-4), isolados durante os últimos quatro anos(2002-2005) e reagidos encontrados igualmente com todos. Adiluição ótima de antígenos de lisado foi determinada portitulação de tabuleiro usando a técnica de captura deantígeno em poços previamente capturados com IgA anti-dengue e a diluição 1:100 de antígeno de lisado foi ótimapara o ensaio.

Placas de microtítulo de fundo chato de 96-poços maxi-sorb foram usadas para capturar antígeno usando o métododescrito acima, lavadas quatro vezes e as placas estavamprontas para se usar para ensaios de C e B-ELISA. Para oensaio 45 μl de tampão de bloqueio (PBS com 0,3% de sorohumano negativo de anticorpos de dengue e 0,1% Triton xlOO)foi adicionado a cada poço e então 5 μΐ de soros de teste ede controle foram adicionados aos poços respectivos e sãousados de acordo com o ensaio: para simultaniedade 50 μΐ deC-ELISA de MAb específico diluído 1:1000 em tampão debloqueio foi adicionado aos poços contendo o soro; para apré-incubação de C-ELISA, MAb específico foi adicionadoapós 30 minutos de soro de incubação em temperaturaambiente e para B-ELISA o soro foi incubado por uma hora emtemperatura ambiente, lavado seis vezes e MAB específicofoi adicionado a cada poço. Após incubação (60 minutos parasimultaneidade e 30 minutos para a pré-incubação de C-ELISAs) as placas foram lavadas 6 vezes, e 100μΙ de umadiluição de 1:3000 de IgG anti-camundongo de cabra HRP-conjugado diluído em tampão de bloqueio foi adicionado acada poço. O resto do ensaio foi feito exatamente comodescrito para o ELISA indireto. No caso de B-ELISA, após aadição de placas de soros de teste foram incubadas no RTpor uma hora lavadas 6 vezes e então adicionado 100 μΐ deMAb a cada poço em diluições 1:1000. As etapas restantesforam similares ao C-ELISA.

1.6 Estabelecimento de MAbs e diluições de soro eformato de teste ótimos: Para o estabelecimento inicial deparâmetros de teste, dois soros positivos neutralizantes devírus-2 de dengue (1:640 e 1:160), dois soros de dengue deconvalescentes (confirmados por PCR) , dois soros positivosneutralizante de febre amarela (1:1280 e 1:80) e dois sorosnegativos de flavivírus (VNT= 1:10) foram usados.Primeiramente, o MAbs foi titulado adicionando as diluiçõesem série (1:250 a 1:64000) em tampão de bloqueio às placasde antígeno capturado e fazendo um ELISA indireto (Fig Ia e2b). Então, duas diluições de MAbs foram arbitrariamenteescolhidas, correspondendo a 100 e 75 a 8 0% do platô OD nacurva de titulação e testadas por C-ELISA e B-ELISA contraas diluições em série de soros (Fig 2a, 2b e 3) . Todas asamostras foram testadas em duplicata. Os controlesincluíram poços sem o soro, mas MAbs (inibição de 0%) epoços sem soro e sem MAbs (inibição de 100%) , oscomponentes faltantes sendo substituídos com o tampão debloqueio.

1.7 Quantificação de resultados de C e de B-ELISA eanálise estatística: A inibição de ligante de MAb aoepitopo específico na proteína de envelope em presença desoro foi expresso como a percentual de inibição (PI) ,calculada do valores de OD médio usando a seguinte fórmula:PI= [100-(amostra teste de OD/MAb médio de OD) χ 100]

A média e desvio padrão de valores de percentual deinibição das amostras de soro negativas e positivas dedengue foi calculado e o limite positivo foi estabelecido.

A especificidade e a sensibilidade relativas de C-ELISAforam estimadas usando o VNT como o teste padrão de ouro.

2. Resultados

2.1 Diluições ótimas de antígeno e de MAbs: Já que umadas exigências de C-ELISA era a possibilidade de usarantígenos de lisado de dengue não purificado e nãoconcentrado, a estratégia adotada era o uso de uma IgA deantidengue de captura que foi previamente capturada por IgAantihumana para a placa de ELISA maxi-sorb. A técnica écapaz de imune-purificar e concentrar o antígeno viral dedengue do lisado de célula e apresentá-lo como o antígenopreso a uma IgG específica dengue (do soro positivo ou MAbsespecífico). Nós observamos que purufucação de antígenocapturado de IgA específico antidengue seguida peladetecção usando MAbs específico de dengue (complexo ousorotipos específicos) pegou mais antígenos que ELISAcapturado de MAbs (Fig-Ia e lb).

2.2 Diluições ótimas de antígeno, MAbs e soro: 0objetivo principal de C-ELISA era diferenciar anticorpoespecífico de dengue de outros membros da famíliaflaviviridae. Conseqüentemente, a especificidade do testefoi medida por sua habilidade de discriminar entre o sorode vírus da dengue fraco-positivo (como definido por VNT) esoro de flavivírus positivo forte (febre amarela) em váriasconcentrações. Nós expressamos a especificidade como adiferença média em valores de PI entre o soro de denguefraco positivo e o soro de febre amarela positivo forte. AFigura-2a apresenta curvas de titulação dos MAbsespecíficos de pan-dengue (pan-dengue MAb- Abcam, UK e Pan-dengue MAb- ICL, USA) e as diluições em que foramadicionalmente testados. A figura 2b expressou osdiferenciais como uma função de diluições de soro. Com baseno resultado na Fig. 2b, adotamos as diluições de saturaçãode 75 a 80% (1:1000) como a diluição ótima dos MAbs natestagem subseqüente. Na concentração de MAbs, a diluiçãoótima de soro era a diluição rendendo o valor máximo. Estadiluição de soro foi de 1:10 (Fig-3). É notável que os doisplatôs de MAbs na mesma diluição com o soro (Fig-2a). Natestagem subseqüente, observamos que deram resultadossemelhantes no teste, e escolhemos usar Pan-dengue MAb,ICL, USA por causa de seu valor mais barato e disponível.

2.3 Formato de teste: ELISA competitivo contra B-ELISAe períodos de incubação: Nós comparamos ELISA competitivo ede bloqueio pelos soros de dengue forte, moderado, fraco enegativo (VNT = 1:640, 1:160, 1:40 e < 1:10). Estacomparação foi estendida avaliando os valores paracombinações diferentes de períodos de soro e de incubaçãode MAbs, com soros com diluição ótima. MAbs ou soro foramadicionados simultaneamente ou MAb adicionado após a pré-incubação com o soro para períodos de incubação totais(soro mais MAb) de 45, 60, 90 e 120 minutos. A Figura-4indica claramente que o formato de competitivo e debloqueio rendeu sensibilidade e especificidade similares.

Adicionalmente, uma pré-incubação de 30 minutos com o soroe incubação adicional de 3 0 minutos após ter adicionado oMAb resultou em especificidade e sensibilidade ótimas doque a adição simultânea de MAb e soro.

2.4 Valor limite negativo: Usando 100 amostras de soronegativas para os anticorpos de dengue (IgG e IgM), usandoELISA de captura de IgM e IgG de dengue indireta (Pan-bio,Austrália e IVD Research Inc, Carlsbad, CA 92008, USA) e 64soros positivos de dengue (VNT> 1:20) e 25 IgG de denguereativo, mas negativo ao vírus da dengue VNT (<1:10), umvalor de limite foram estabelecidos para CeB ELISA (Fig-5) . Para as duas populações combinadas (Fig-5a, 5b) , ovalor limite foi ajustado arbitrariamente na média (9,9)mais 2 de desvio padrão ou inibição (6,6). Quando asamostras de soro reativas cruzadas de flavivírus são consideradas sozinhas (Fig-5, o mesmo ponto de limite édado pela média mais 3 de desvio padrão. Para as amostrasde soro negativas absolutas, a média mais desvios padrãodeu um valor de limite de inibição de 25%.

2.5 Comparação do VNT e C-ELISA: A Figura-6 apresenta títulos de ponto final médios para os dois conjuntos deamostras de soro, como determinado pelo VNT e C-ELISA. Oscoeficientes de correlação totais entre resultados do testeeram (n = 64) . Combinando todas as amostras, aespecificidade e a sensibilidade de C-ELISA relativo ao VNTforam estimadas como mostrado na Tabela 1.

A tabela 1 mostra a comparação de C-ELISA com teste deneutralização de vírus (VNT) para detectar o anticorpoespecífico de dengue (IgG).

Tabela 1: Teste de neutralização de vírus (VNT)

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Sensibilidade = 62/64 = 1x100=96,88%, especificidade =100/100 = 1x100=100%, valor preditivo positivo = 62/62*100=100 e valor preditivo negativo = 100/102*100= 98%.

2.6 C-ELISA e infecção secundária de dengue: Asensibilidade e a especificidade de C-ELISA para a detecçãode infecção secundária de dengue foram comparadas com duastécnicas convencionais; razão de - antidengue IgM e IgG. <_1,2 (infecção secundária) e < 1,2 (infecção primária, Shu eoutros, 2003) e ELISA de captura de IgG anti-dengue, que éequivalente a > 1:2560 unidade de HI (tabela 3).

A tabela 2 mostra a comparação de C-ELISA com técnicasconvencionais (razão de IgM e IgG) de detectar a infecçãosecundária de dengue.

A tabela 3 mostra a comparação de C-ELISA com técnicasconvencionais (ELISA de captura de IgG de dengue) dedetecção de infecção secundária de dengue.

Tabela 2: razão de IgM/IgG de antidengue (< 1:2 e <1:2)

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Sensibilidade = 72/115X100=62,60%, especificidade =31/39X100=79,48%, valor preditivo positivo (PPV)64/72X100= 88,89% e valor preditivo negativo = 31/82X100=37,80%

Tabela 3: ELISA de captura de IgG de antidengue

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Sensibilidade= 54/70X100=77,14%, Especificidade=82/84X100=97,62%, valor preditivo positivo = 54/72X100= 75%e valor preditivo negativo =66/82X100= 80,49%.

2.7. C-ELISA e sorotipagem de dengue: O teste foiusado também para diferenciar os sorotipos de presença devírus da dengue em amostras de soro usando anticorposmonoclonais específicos de sorotipo de dengue; Den-1, Den-2, Den-3 e Den-4. Oitenta e uma amostras de soroespecíficas de dengue previamente detectadas por anticorposmonoclonais de pan-dengue foram analisadas usandoanticorpos monoclonais específicos de sorotipo de dengue.

Três tipos Mabs específico de sorotipo de dengue; dengue-2,dengue-4 e dengue-1 foram usados. Os resultados na tabela 4mostram que 80,25% foram positivos para Den-2, 49,38%dengue-4 e 32,10% ao vírus de dengue-1 respectivamente.vinte por cento dos soros foram positivos a todos os trêssorotipos de dengue (Den-2, Den-4 e Den-1), 38,46% deamostras foram positivos para anticorpos de dengue 2 edengue 4, 10,77% dos soros tiveram anticorpos contra dengue2 e dengue-1 enquanto 12,50% de amostras de soro forampositivas para vírus de dengue-4 e dengue 1. As amostras desoro foram testadas contra o sorotipo 3 de dengue devido àbaixa reatividade de MAb específico de sorotipos.

Tabela 4: Sorotipagem de dengue

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2.8. Quinze minutos e ELISA competitivo em uma etapa:

O teste foi realizado como descrito na seção 2,3 exceto oanticorpo monoclonal competitivo foi conjugado com HRP(ICL, USA) e adicionado simultaneamente com soro de teste.

O período de incubação total foi encurtado de 90 minutos a15 minutos e duas etapas em uma etapa. O resultado dos 15minutos, ensaio de única etapa foi comparado com a pré-incubação de C-ELISA e 3 0 minutos simultâneo em uma etapade C-ELISA e foi encontrado 100% similaridade (Tabela-5).

Tabela 5: Comparação de tempos de desempenho

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2.9 ELISA competitivo contra o vírus de encefalitejaponesa: C-ELISA baseado em monoclonal foi tambémestabelecido contra os Flavivírus de não-dengue como ovírus da encefalite japonesa (JEV) usando o anticorpomonoclonal específico de vírus (reatividade cruzada comvírus de encefalite St Louis). A placa foi preparada usandoo protocolo descrito na seção 2.3 e o antígeno de JEV foicapturado ao invés do vírus da dengue. Em resumo, oantígeno do lisado de JE (cepa Nayakama) foi usado ecapturado pela IgA de antidengue. O anticorpo anti-JE foiproduzido em coelho e usado para o desenvolvimento doensaio e 83 amostras de soro humanas foram selecionadosusando a técnica. De 83 amostras, 65 amostras forampositivas para IgG de reatividade cruzada de flavivirus eos 28 soros restantes negativos para flavivirus. Osresultados mostraram que 89,23% (58/65) de soro reativo deflavivirus foi positivo pelo JE C-ELISA enquanto 89,29%(25/28) da amostra negativa de flavivirus não reagiu comJE-C-ELISA. Entretanto, a validação da técnica não foifeita usando amostras de soro confirmadas de JE.

3. Discussão

O ELISA competitivo MAb-baseado provou ser um métodorápido, sensível e específico para a' detecção de anticorpode dengue. O teste oferece a vantagem adicional, sobreELISA indireto, de permitir a seleção de soros dos membrosdiferentes de flavivirus. Comparado a VNT, C-ELISA oferecealtos níveis de sensibilidade (100%) e de especificidade(100%) enquanto diminuir o tempo de aplicação de 7 diaspara menos de 2 horas. Adicionalmente, ao contrário do VNT,C-ELISA pode ser menos afetado pela qualidade dos soros(citotoxidade, infecção, hemolizado ou ricos em gordura) ebaixo nível de reatividade cruzada contra outros membros deflavivirus. As contaminações podem afetar o resultado dasorologia em duas maneiras: degradação de anticorpo ealteração de pH a um nível que impeça a ligação deanticorpo. Na prática, a diluição relativamente elevada emque o soro é selecionado (1:20 ou acima) deve anular osegundo fator.

A superioridade de B-ELISA e C-ELISA de soro de pré-incubação por 3 0 minutos sobre a adição simultânea de sorode teste e MAb pode ser devido ao fato que MAb é altamentepurificado e tem uma maior afinidade para o epitopo do queos anticorpos de soro tem. Quando os dois são adicionadossimultaneamente, apenas o anticorpo de soro de altaafinidade competiria em um formato competitivo, soros deprimária resposta inicial, que conteriam principalmente oanticorpo de baixa afinidade, testaram negativo enquanto ossoros de resposta secundária, presumivelmente tendo aafinidade elevada, mostraram um nível de sensibilidadecomparável ao de B-ELISA. Entretanto o uso de anticorpomonoclonal conjugado especifico para o vírus da dengueeliminou a sensibilidade mais baixa da técnica e resultados similares foram obtidos. A técnica modificada não somentemelhorou a sensibilidade do teste, mas também reduziu otempo total de 90 minutos para 15 minutos e duas etapaspara uma etapa. Os 15 minutos, uma etapa de C-ELISA faz umadescoberta tremenda da técnica atual de detecção de IgG de dengue e um único teste pode ser usado para diferenciarentre a infecção primária e secundária de dengue na faseinicial de doença assim como a soro-vigilância específicade dengue que é particularmente importante onde há mais deum flavivírus co-circulante. Atualmente dois tipos de teste de IgG de antidengue são usados para a detecção de infecçãosecundária de dengue e soro-vigilância.

A aproximação de padronização do C-ELISA a um ensaiode micro-neutralização para duas razões: (i) o VNT épresentemente o único teste confirmativo disponível deinfecção de dengue onde mais de um flavivírus está presentee (ii) os anticorpos de neutralização são considerados omelhor previsor de status imune hospedeiro. Os resultadosde C-ELISA concordam muito com os do VNT e havia umcoeficiente de correlação positivo muito elevado (r=0,88)entre dois resultados de análise.A detecção de anticorpo específico de dengue é, nãosomente importante para o estudo epidemiológico, mas tambémpara diagnosticar a infecção secundária através da detecçãode IgG especifica de dengue que o paciente pode levar dainfecção precedente. De acordo com o WHO, somente o soroque tem nível de HAI > 2560 de IgG de antidengue na faseinicial de convalescência de infecção de dengue éconsiderado como a infecção secundária (WHO Manual-1982).

Entretanto, este critério de detecção de infecçãosecundária de dengue pode conduzir o paciente a submeter-sea forma severa de infecção de dengue como a febrehemorrágica de dengue (DHF) por causa do procedimento dedetecção lento e assim não aplicável para gerência depaciente apropriada. Comparamos nossa nova técnica com umteste equivalente da WHO (ELISA de captura de IgG dedengue, tabela 3) e descorimos que o C-ELISA é 77% sensívele 97,62% específico para ELISA captura de IgG de dengue efoi também observado que 18 casos de dengue apesar dapresença de IgG específica de dengue, a captura de IgG nãodetectou, enquanto 16 casos de dengue foram detectados peloELISA de captura de IgG que não eram específicos para IgGde dengue. Conseqüentemente, a presença de IgG dereatividade cruzada de dengue de nível elevado nãosignifica a infecção secundária de dengue, que é um senáriocomum, onde mais de um flavivírus está co-circulando. Poroutro lado, a presença de baixo nível de IgG específica dedengue em uma fase inicial da doença de dengue não descartacasos secundários de dengue. Uma outra técnica descrita porShu e col., 2003 usando razões de IgM e IgG (tabela 2)mostraram que 74,67% de pacientes de dengue tiveram umainfecção secundária, que é consideravelmente elevadocomparado à captura de IgG de dengue e C-ELISA. Sob estacircunstância, descobrimos a que nossa técnica inventiva deC-ELISA é uma ferramenta poderosa para detectar infecçãosecundária pela detecção de IgG específica de dengue (ambosníveis baixos e altos) mesmo dentro de 15 minutos essapresença no soro do paciente durante a doença aguda dedengue.

O protocolo desenvolvido para C-ELISA foi demonstradousando o antígeno de lisado de dengue e o anticorpomonoclonal específico de dengue. Isto pode também ser usadocontra outros Flavivírus e resultados preliminares naencefalite japonesa é um exemplo disto.

Finalmente deve ser compreendido que as várias outrasmodificações e/ou alterações podem ser feitas sem sair doconceito inventivo da presente invenção como esboçado aqui.

REFERÊNCIAS

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Claims (33)

1. Método para a detecção de exposição de um indivíduoa ura flavivírus caracterizado pelo fato de compreender asetapas de:contatar uma amostra biológica do indivíduo com umamistura de componentes capturados de IgA de antiflavivírusde flavivírus;submeter a amostra biológica e os componentescapturados de IgA de antiflavivírus para um anticorpocompetitivo monoclonal específico de flavivírus; edeterminar a presença de um complexo que forma entreum parceiro de ligação específico de IgG flavivíruspresente na amostra biológica e o componente capturado deIgA de antiflavivírus de flavivírus na presença do anticorpo competitivo monoclonal específico de flavivírus.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a amostra biológica e oscomponentes capturados de IgA de antiflavivírus deflavivírus serem pré-incubados para formar um complexoantes de submeter ao corpo competitivo monoclonalespecífico de flavivírus.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a amostra biológica, ocomponente capturado de IgA de antiflavivírus de flavivíruse o anticorpo competitivo monoclonal específico deflavivírus serem contatadas simultaneamente antes dedeterminar a presença de um complexo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o agente competitivo imunológicoespecífico de flavivírus é um anticorpo específico para umepitopo de um componente capturado de IgA de antiflavivírusde flavivírus.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o anticorpo competitivomonoclonal específico de flavivírus ser conjugado a umgrupo reportador.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de os componentes capturados de IgAde antiflavivírus serem capturados de um lisado de célulasinfectadas com flavivírus.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o componente capturado de IgA deantiflavirírus de flavivírus ser selecionado do grupoincluindo proteínas estruturais e não estruturais deflavivírus, partícula de flavivírus e fragmentos do mesmo,glicoproteínas, lipídeos e carboidratos derivados doflavivírus.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de a proteína estrutural serselecionada do grupo incluindo proteínas de envelope,proteínas de membrana Pr, e proteínas de nucleocapsídeo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de o componente capturado de IgA deantiflavivírus ser um anticorpo anti-idiotípico a um sítiode ligação de antígeno de um anticorpo de flavivírus geradoem resposta a exposição a um componente capturado de IgAderivado de um flavivírus ou equivalente do mesmo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o parceiro de ligação ser umanticorpo expresso em um estágio inicial de uma infecção deflavivírus, durante a convalescência ou derivado de uminfecção precedente.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 7,caracterizado pelo fato de o flavivírus ser selecionado deum grupo incluindo vírus da febre amarela, vírus da dengue,e vírus de JE.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o método detectar a exposição aosorotipo de sírus da dengue selecionado do grupo incluindoDEN-1, DEN-2, DEN-3 OU DEN-4.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o agente competitivo imunológicoespecífico de dengue ser um anticorpo específico a umepitopo comum para os sorotipos de vírus da dengue DEN-1,DEN-2, DEN-3 ou DEN-4.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de a proteína não estrutural serselecionado de um grupo incluindo NS-1, NS-2a, NS-2b, NS-3,NS-4a, NS-4b e NS-5.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o anticorpo de parceiro deligação ser um anticorpo de IgG que é específico a umsorotipo de dengue selecionado do grupo incluindo DEN-1,DEN-2, DEN-3 ou DEN-4.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a amostra biológica serselecionada do grupo incluindo sangue, saliva, fluido daespinha, células B, células T, plasma, soro, urina e fluidoaminiótico.

17. Mistura de componentes capturados de IgA deantiflavivírus de flavivírus caracterizada pelo fato de serpara o uso em um método das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 OU 16.

18. Mistura de componentes capturados de IgA deantiflavivírus, de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de ser capturado de um lisado decélulas infectadas com o flavivírus.

19. Mistura, de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de compreender componentesselecionados do grupo incluindo proteínas estruturais e nãoestruturais de flavivírus, partículas de flavivírus efragmentos do mesmo, glicoproteínas, lipídeos ecarboidratos derivados do flavivírus.

20. Mistura, de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de a proteína estrutural serselecionada do grupo incluindo proteínas de envelope,proteínas de membrana Pr, e proteínas de nucleocapsídeo.

21. Mistura, de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de o flavivírus ser selecionado dogrupo incluindo vírus da febre amarela, vírus da dengue, evírus da JE.

22. Mistura, de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de o vírus da dengue serselecionado do grupo incluindo DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN-4.

23. Mistura, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de a proteína não estrutural serselecionada de um grupo incluindo NS-I, NS-2a, NS-2b, NS-3,NS-4a, NS-4b E NS-5.

24. kit para detecção de exposição de um indivíduo aum flavivírus, o referido kit caracterizado pelo fato decompreender:componentes capturados de IgA de antiflavivírus deflavivírus;um anticorpo competitivo monoclonal específico deflavivírus; epelo menos um agente de detecção para detectar umcomplexo que se forma entre um parceiro de ligaçãoespecífico de IgG presente em um amostra biológica e umcomponente capturado de IgA de antiflavivírus na presençado anticorpo competitivo monoclonal específico deflavivírus.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de o componente capturado de IgA deantiflavivírus ou anticorpo competitivo monoclonalespecífico de flavivírus ser imobilizado em um suportesólido.

26. Kit, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de o componente capturado de IgA deantiflavivírus ser selecionado do grupo incluindo incluindoproteínas estruturais e não estruturais de flavivírus,partículas de flavivírus e fragmentos do mesmo,glicoproteínas, lipídeos e carboidratos derivados doflavivírus.

27. Kit, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de a proteína estrutural serselecionada do grupo incluindo proteínas de envelope,proteínas de membrana Pr, e proteínas de nucleocapsídeo.

28. Kit, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de o flavivírus ser selecionado dogrupo incluindo vírus da febre amarela, vírus da dengue, evírus da JE.

29. Kit, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de o anticorpo monoclonalcompetitivo específico de dengue ser um anticorpoespecífico de dengue específico para um epitopo comum aossorotipos de vírus da dengue DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN-4.

30. Kit, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de a proteína não estrutural serselecionada de um grupo incluindo NS-1, NS-2a, NS-2b, NS-3,NS-4a, NS-4b E NS-5.

31. Suporte sólido para o uso em um método para adetecção de exposição de um indivíduo a um flavivírus, oreferido método caracterizado por compreender:contatar uma amostra biológica do indivíduo com umamistura de componentes capturados de IgA de antiflavivírusde flavivírus;submeter a amostra biológica e os componentescapturados de IgA de antif lavivírus a um anticorpocompetitivo monoclonal específico de flavivírus;determinar a presença de um complexo que forma entreum parceiro de ligação específico de IgG flavivíruspresente na amostra biológica e o componente capturado deIgA de antiflavivírus na presença do anticorpo competitivomonoclonal específico de flavivírus;o referido suporte caracterizado pelo fato decompreender componentes capturados de IgA de antiflavivírusimobilizados no suporte.

32. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupoincluindo uma conta, um disco, uma partícula magnética, ouum sensoe de fibra ótica, uma placa de microtítulo, placade vidro, ou microchip biológico ou uma membrana incluindomembranas de nitrocelulose, filtros de membrana depolitetraflúoretileno, filtros de membrana de acetato decelulose e filtros de membrana de nitrato de celulose comcarreadores de papel de filtro.

33. Método de avaliação do risco relativo de um oumais indivíduos sendo expostos a flavivírus dentro de umalocalização definida caracterizado pelo fato decompreender:a) obtenção de amostrar de uma populaçãorepresentativa dentro de uma localização definida; eb) avaliação de exposição de membros individuais deuma amostra de população a um flavivírus pelo método,compreendendo as etapas de:i) contatar a amostra biológica de um indicíduo com umcomponente capturado de IgA de antiflavivírus derivado doflavivírus para formar um complexo entre o componente e umparceiro de ligação específico de flavivírus na amsotrabiológica;ii) determinação da presença do complexo que formaentre um parceiro de ligação específico de flavivíruspresente na amostra biológica e um componente capturado deIgA de antiflavivírus na presença de um agente competitivoimunológico específico de flavivírus, em que a presença docomplexo seja indicativo de exposição do indivíduo a umflaivírus; ec) avaliação de risco relativo de esposição dentro dalocalização definida.