BRPI0707336A2

BRPI0707336A2 - uso de microorganismos probióticos para o tratamento e prevenção de obesidade e distúrbios relacionados

Info

Publication number: BRPI0707336A2
Application number: BRPI0707336-4A
Authority: BR
Inventors: Nina Rautonen; Heli Putaala; Arthur Ouwehand; Kirsti Tiihonen; Marta Zdzislawa Czynska; Wouter Herman Noordman
Original assignee: Danisco; Campina Nederland Holding Bv
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-26
Publication date: 2011-05-03
Also published as: RU2008134892A; US20100061967A1; WO2007085970A2; US8257695B2; CN101410128A; JP2009524640A; EP1981516B1; PL1981516T3; DK1981516T3; EP1981516A2; WO2007085970A3; ES2693584T3; MX2008009726A

Abstract

USO DE MICROORGANISMOS PROBIóTICOS PARA O TRATAMENTO E PREVENçãO DE OBESIDADE E DISTúRBIOS RELACIONADOS. Uso de pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo na fabricação de um suporte para administração a um sujeito para modular a sinalização da saciedade, sendo que o suporte é um suporte farmaceuticamente aceitável ou um produto alimentício. De maneira vantajosa, pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo pode ser administrada ao sujeito para o tratamento e/ou prevenção de excesso de peso e/ou de uma doença causada por excesso de peso. Da mesma forma, pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo é administrada ao sujeito para o tratamento e/ou prevenção de obesidade e/ou uma doença causada por obesidade. De preferência, o microorganismo é um microorganismo probiático. De maneira vantajosa o microorganismo pode ser uma bactéria de ácido láctico. Em uma modalidade o microorganismo é uma cepa de Lactobacillus spp. e/ou Bifidobacterium spp. Por exemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophillus, L. curvatus, L. salivarius e/ou B. lactis.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para: "USO DEMICROORGANISMOS PROBIÓTICOS PARA O TRATAMENTO E PREVENÇÃODE OBESIDADE E DISTÚRBIOS RELACIONADOS"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se à saciedade do apetite.

Em uma modalidade a presente invenção refere-se ao usode pelo menos uma cepa de um microorganismo, depreferência, uma bactéria de ácido láctico, de preferência,uma bactéria probiótica, como Lactobacillus spp. (porexemplo L. acidophilus, L. salivarius e/ou L. curvatus)e/ou Bifidobacterium spp. (como B. lactis), para prepararum suporte administrado a humanos ou animais para modular asinalização da saciedade, de preferência, induzindosaciedade.

A presente invenção refere-se adicionalmente ao uso depelo menos uma cepa de um microorganismo, de preferência,uma bactéria de ácido láctico, de preferência, uma bactériaprobiótica, como Lactobacillus spp. (por exemplo, L.acidophilus, L. salivarius e/ou L. curvatus) e/ouBifidobacterium spp. (como B. lactis), no tratamento ouredução ou controle de excesso de peso e/ou no tratamentode doenças causadas por se estar em sobrepeso,particularmente no tratamento de obesidade, e/ou doençasrelacionadas com obesidade.

Fundamentos técnicos

A prática de dieta e perda de peso por razõesestéticas (cosméticas) é praticada por indivíduos em todo omundo. Cientistas, desenvolvedores de drogas edesenvolvedores de alimentos introduziram, ao longo daúltima década, uma variedade de supressores de apetite e/oudrogas para perda de peso e/ou gamas de alimentos"saudáveis" com o fim de auxiliar praticantes de dieta noseu anseio de livrar-se do peso.

A prática de dieta não se restringe a humanos, masinclui outros animais, sendo comuns planos de dietas paraanimais de companhia.

De uma perspectiva evolucionária, animais (incluindohumanos) adaptaram-se para devorar alimento e armazenarenergia em caso de escassez de alimentos. Infelizmente,contudo, embora isto fosse útil em tempos de escassez dealimento, agora, em tempos em que é possível comerconstantemente, isto pode levar a sobrepeso e, em algunscasos, obesidade.

A obesidade tornou-se um importante problema de saúdepública. Condições de saúde causadas ou exacerbadas porobesidade incluem hipertensão, diabetes melito, apnéia dosono, hipoventilação relacionada com obesidade, problemasnas costas e nas juntas, doença cardiovascular, doença não-alcoólica do fígado e doença do refluxo gastroesofágico.

O índice de Massa Corporal, (IMC ou BMI, body massindex) (calculado como peso em quilogramas dividido peloquadrado da altura em metros) é a medição mais comumenteaceita para sobrepeso e/ou obesidade. Um BMI acima de 25 éconsiderado sobrepeso, enquanto que obesidade é definidacomo um BMI de 30 ou mais, sendo que um BMI de 35 ou maisé considerado como comorbidez grave, e um BMI de 4 0 oumais é considerado obesidade mórbida.

A obestatina é um hormônio peptídico que é produzidonas células que revestem o estômago e o intestino delgadode vários mamíferos, incluindo humanos; ela reduzdrasticamente o apetite em camundongos e espera-se que façao mesmo em humanos.

Surpreendentemente, a obestatina é codificada pelomesmo gene que também codifica grelina, um hormôniopeptídico que aumenta o apetite. Ambas, grelina eobestatina são derivadas de um pró-hormônio produzido pelomesmo gene e são divididas por meio de processamento pós-tradução. 0 fim deste mecanismo permanece obscuro, noentanto ele explica verificações anteriores, em que aremoção do gene de grelina de camundongos não reduziusignificativamente seu apetite.

A obestatina tem sido considerada para uso como umadroga contra obesidade, no entanto, ela teria que serfornecida como um spray nasal ou por meio de injeção, àmedida que o peptídio é destruído por sucos gástricos.

Correntemente, há poucos tratamentos para obesidade.Das duas drogas aprovadas para uso nos E.U.A., Xenical™ daRoche (que bloqueia a digestão de gordura) é relativamenteefetivo na promoção da perda de peso, mas apresenta algunsefeitos secundários desagradáveis. A outra droga aprovadapara uso nos E.U.A. é Meridia™ do Abbot Laboratories que,alegadamente, provou não ser particularmente efetiva(Schaffer A. www.slate.com/id/2117332, 26 de abril de2005).

Uma droga experimental correntemente em fase deensaios é Rimonabant™ (um antagonista de receptor decanabinóide) que alegadamente inibe desejos em humanos,reduzindo com isso os apetites de pacientes obesos.

Portanto, há uma necessidade de uma ferramenta efetivapara reduzir peso, prevenir ganho de peso, facilitar perdade peso e/ou tratar obesidade.Entre microorganismos, em particular entre bactérias,alguns exercem uma influência positiva sobre o sistemaimune, em particular as bactérias do ácido láctico ebifidobactérias, e são descritas como cepas ou bactérias"probióticas".

De uma maneira geral, por cepa ou bactéria probióticacompreende-se um microorganismo não-patogênico que, quandoingerido vivo, exerce um efeito benéfico sobre a fisiologiaou a saúde do hospedeiro. Estas cepas probióticasapresentam geralmente a capacidade de sobreviver à passagempela parte superior do trato digestivo. Elas são não-patogênicas, não-tóxicas e exercitam seu efeito benéficosobre a saúde, de um lado via interações ecológicas com aflora residente no trato digestivo, e, de outro lado, viasua capacidade de influenciar o sistema imune de umamaneira positiva através do "GALT" (tecido linfóideassociado com o intestino). Dependendo da definição deprobióticos, estas bactérias, quando dadas em um númerosuficiente, apresentam a capacidade de progredir vivas pelointestino, contudo elas não atravessam a barreiraintestinal, e seus efeitos primários são induzidos,portanto, no lúmen e/ou na parede do trato gastrintestinal.Elas formam então parte da flora residente durante operíodo de administração. Esta colonização (ou colonizaçãotransiente) permite que bactérias probióticas exerçam umefeito benéfico, como a repressão de microorganismospotencialmente patogênicos presentes na flora, e interaçõescom o sistema imune do intestino.

As cepas probióticas mais comumente usadas,particularmente em produtos lácteos, são, principalmente,bactérias e leveduras dos seguintes gêneros: Lactobacillusspp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.,

Bifidobaeterium spp. e Saccharomyees spp.

Entre os efeitos probióticos registrados para estasbactérias pode-se indicar, por exemplo, o melhoramento datolerância à lactose, aumento da função imune, prevençãoou tratamento de infecções gastrintestinais e urogenitais,e redução do risco de câncer.

Aspectos de sumário

Uma verificação seminal da presente invenção é quemicroorganismos, em particular bactérias do ácido lácticoe/ou microorganismos probióticos e/ou bactérias do ácidoláctico probióticas, e/ou um metabólito das mesmas, deacordo com a presente invenção, induzem saciedade, emparticular saciedade pós-prandial, em um sujeito.

Em particular, um achado seminal da presente invençãoé que bactérias do ácido láctico (como Lactobacillusacidophilus, por exemplo, cepa PTA-4797; Lactobacilluscurvatus; Lactobacillus salivarius; e/ou Bifidobacteriumlactis) e/ou um metabólito do mesmo induzem saciedade, emparticular saciedade pós-prandial, em um sujeito.

Aspectos detalhados

Os aspectos detalhados desta invenção são detalhadosabaixo. Em parte, alguns dos aspectos detalhados sãodiscutidos em seções separadas. Isto visa a facilidade dereferência, e de modo algum deve ser consideradolimitante.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o usode pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo para administração a um sujeito paramodular a sinalização da saciedade (por exemplo, nointestino).Em um aspecto, a presente invenção proporciona o usode pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo na fabricação de um suporte paraadministração a um sujeito para modular a sinalização dasaciedade (por exemplo, no intestino).

O termo "modular a sinalização da saciedade" comousado aqui refere-se a variar a amplitude e/ou freqüênciada sinalização neural e/ou endócrina associada com asaciedade.

Em algumas modalidades, "modular a sinalização dasaciedade" refere-se a variar a largura e/ou freqüência demarcadores de saciedade.

O termo "saciedade" como usado aqui significa o estadode estar saciado ou de ter o apetite saturado, i.e.plenitude além do desejo, ou de estar plenamentesatisfeito.

Em um aspecto adicional, a presente invençãoproporciona o uso de pelo menos uma cepa de ummicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo na fabricação deum suporte para administração a um sujeito para induzirsaciedade.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona ouso de pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo na fabricação de um medicamento para otratamento e/ou prevenção de excesso de peso, incluindoobesidade, e/ou uma doença ou distúrbio causado porexcesso de peso, incluindo um distúrbio ou doençarelacionada com obesidade.

Em outro aspecto adicional, a presente invençãoproporciona um método de modular a sinalização da saciedade(por exemplo, no intestino) em um sujeito, sendo quereferido método compreende administrar ao sujeito umaquantidade efetiva de pelo menos uma cepa de ummicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo.

Em um aspecto adicional, a presente invençãoproporciona um método de induzir saciedade em um sujeito,sendo que referido método compreende administrar aosujeito uma quantidade efetiva de pelo menos uma cepa de ummicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo.

Em um aspecto adicional, a presente invençãoproporciona um método de tratar e/ou prevenir excesso depeso, incluindo obesidade, e/ou uma doença ou distúrbiocausado por excesso de peso, incluindo uma doençarelacionada com obesidade em um sujeito, sendo que referidométodo compreende administrar ao sujeito uma quantidadeefetiva de pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo.

Em um aspecto adicional, a presente invençãoproporciona um método cosmético de reduzir excesso de pesoem um sujeito não-obeso, sendo que referido métodocompreende administrar ao sujeito uma quantidade efetivade pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo.

Em outra modalidade, a presente invenção proporcionaum uso cosmético de pelo menos uma cepa de ummicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo na fabricação deum suporte para administração a um sujeito não-obeso parainduzir saciedade.

Em uma modalidade adicional, a presente invençãoproporciona um método para selecionar um microorganismoe/ou um metabólito do mesmo para administração a um sujeitopara induzir saciedade e/ou tratar excesso de peso,incluindo obesidade, sendo que o método compreende asetapas de:

a) colocar um microorganismo e/ou um metabólito domesmo em contato com pelo menos uma célula epitelial,

b) detectar a expressão de um marcador de saciedade(como proteína tirosina quinase (PYY)) em pelo menos umacélula epitelial.

Em uma modalidade adicional, a presente invençãoproporciona um método para selecionar um microorganismoe/ou um metabólito do mesmo para preparar um suporte paraadministração a um sujeito com o objetivo de induzirsaciedade e/ou tratar excesso de peso, incluindoobesidade, sendo que o método compreende as etapas de:

A célula epitelial ou as células epiteliais usadasdurante os estágios a) ou b) provêm, de preferência, dalinha de células Caco-2. Esta é uma linha de células decâncer do colo. Elas também podem ser células isoladas epurificadas de biópsias de itens de operações em humanos.Células Caco-2 são publicamente obteníveis em diversoscatálogos de linhas de células, como da ATCC (American TypeCulture Collection) com um número HTB-37, por exemplo.

Estágio a) é realizado, de preferência, usando-se de 1a 100 células de microorganismos para cada célula epiteliala ser testada com pelo menos uma célula epitelial.O período de contato, durante o estágio a) , podevariar de 0 hora a 24 horas, e, de preferência, é de cercade 3 horas ou pelo menos 3 horas.

De uma maneira geral, o contato com as células deacordo com o estágio a) é realizado em condiçõesconvencionais de temperatura, atmosferas modificadas eesterilidade bem conhecidas por uma pessoa versada na arte,particularmente em condições de cultura de célulasepiteliais in vitro.

O Estágio b) do processo de seleção de acordo com ainvenção é realizado, de preferência, detectando-se aexpressão, e opcionalmente seu nível, do RNA mensageiro domarcador de saciedade (como PYY), por exemplo, por meio dePCR, inter alia por meio de PCR quantitativa ou por meiode imuno-histoquímica ou por meio de ensaio rádio-imunológico. É possível usar outras técnicas bem conhecidaspor uma pessoa versada na arte para a detecção de mRNA esua medição.

Para algumas modalidades, o microorganismo de acordocom a presente invenção pode ser viável.

Para algumas modalidades, o microorganismo de acordocom a presente invenção pode ser morto ou não-viável.

Sem desejar ater-nos à teoria, acreditamos que osmetabólitos, por exemplo, os metabólitos solúveis,associados com, por exemplo, produzidos por, omicroorganismo, podem ser os causadores do efeito vantajosodo microorganismo. Para alguns aspectos, é desnecessárioque as células de microorganismos estejam em contato diretocom as células-alvo.

Para alguns aspectos, acredita-se que um ou maismetabólitos associados com, por exemplo, produzidos por, omicroorganismo podem ser vantajosos para se obter osefeitos benéficos ensinados aqui. Nesses casos, pode serdesnecessário incluir os microorganismos propriamenteditos.

O termo "metabólito do mesmo" como usado aquisignifica um ou mais compostos, quer tenham sido extraídosdo microorganismo de acordo com a presente invenção ouobtidos de um meio de cultura em que um microorganismo deacordo com a presente invenção é ou foi cultivado. Emalguns aspectos o metabólito pode ser um extrato bruto domeio de cultura e/ou microorganismo. De maneira vantajosa,para alguns aspectos, o metabólito pode consistir de um oumais compostos isolados e/ou purificados do meio decultura e/ou o microorganismo.

Em algumas modalidades, de maneira vantajosa, ometabólito pode ser um metabólito solúvel.

Em algumas modalidades o metabólito pode ser ummetabólito solúvel em água.

Em algumas modalidades o metabólito pode ser ummetabólito solúvel em lipxdio.

De maneira vantajosa, o metabólito pode ser ummetabólito que está presente na fase sobrenadante isoladade uma cultura do microorganismo usando-se a metodologiacomo ensinada no documento US 5.578.302 e/ou de acordo comos exemplos ensinados aqui.

Em uma modalidade, o metabólito pode ser obtenível (depreferência, obtido) cultivando-se uma bactéria (depreferência, uma bactéria de ácido láctico, de preferência,uma bactéria probiótica, como Lactobacillus spp. (porexemplo, L. acidophilus, L. salivarius e/ou L. curvatus) ouBifidobacterium spp. (como B. Iactis)) em um meio decultura até que a OD [densidade óptica] da cultura a λ600atinja pelo menos 0,6, de preferência, de 0,6 a 1,5;removendo-se as bactérias por meio de centrifugação e/oufiltração (como, por exemplo, centrifugação a 25° C, 5 min,3000 g e/ou filtração estéril) para resultar em um filtradocompreendendo referido(s) metabólito(s).

De maneira vantajosa, o(s) metabólito(s) é/sãoobtenível/obteníveis (de preferência, obtido(s)) usando-seum meio de cultura MRS com 1,0 % de açúcar ou sem açúcar.

De maneira vantajosa, o(s) metabólito(s) é/sãoobtenível/obteníveis (de preferência, obtido) cultivando-seas bactérias a 37°C. De maneira vantajosa, o(s)metabólito(os) é/são obtenível/obteníveis (de preferência,obtido(s)) cultivando-se as bactérias anaerobicamente.

Em ensaios in vitro o metabólito em forma do filtradopode ser misturado opcionalmente com células de cultura detecidos em um meio de cultura de tecidos. De preferência, ofiltrado contendo o(s) metabólito(s) é misturado com o meiode cultura de tecidos de tal forma que a mistura de

filtrado/meio de cultura de tecidos compreenda pelo menos10 % vol/vol de filtrado e, no máximo, 90 % vol/vol de meiode cultura de tecidos.

Quando o(s) metabólito(s) é carregado sobre umsuporte, de preferência, a relação da mistura defiltrado/suporte é de 1:10 ou maior.

De maneira vantajosa, o microorganismo de acordo com apresente invenção pode ser co-cultivado com uma ou maiscélulas-alvo, permitindo com isso a transferência defrações solúveis.

De maneira vantajosa, o microorganismo pode não estarem um contato célula-a-célula com a(s) célula(s)-alvo(s).De maneira vantajosa, o microorganismo de acordo com apresente invenção ou o metabólito do mesmo pode encontrar-se em forma de uma suspensão bacteriana, antes ou apóscongelamento, na forma de concentrados, quer em forma seca,liofilizada ou congelada. Qualquer que seja a forma usada,a cepa pode se congelada.

De maneira vantajosa, o microorganismo e/ou metabólitodo mesmo de acordo com a presente invenção pode conteraditivos diferentes. De maneira vantajosa, é possíveladicionar aditivos durante sua secagem e/ou durante sualiofilização.

O microorganismo usado de acordo com a presenteinvenção, (como uma cepa de Lactobacillus spp.; porexemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophilus, L.salivarius e/ou Lactobacillus curvatus e/ou uma cepa deBifidobacterium, por exemplo, B. lactis), pode compreenderde IO6 a IO12 CFU de bactérias/g de suporte, e, maisparticularmente, de IO8 a IO12 CFU de bactérias/g desuporte, de preferência, de IO9 a IO12 CFU/g para a formaliofilizada.

De maneira vantajosa, o microorganismo usado de acordocom a presente invenção, (como uma cepa de Lactobacillusspp.; por exemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophilus,L. salivarius e/ou Lactobacillus curvatus e/ou uma cepa deBifidobacterium, por exemplo, B. lactis), pode seradministrado a uma dosagem de cerca de IO6 a cerca de IO12CFU de microorganismo/dose, de preferência, de cerca de IO8a cerca de IO12 CFU de microorganismo/dose. Com o termo"por dose" compreende-se que esta quantidade demicroorganismo é fornecida a um sujeito, seja por dia, oupor ingestão, de preferência, por dia. Por exemplo, se omicroorganismo deve ser administrado em um suportealimentício (por exemplo, em um iogurte) - então o iogurteconterá, de preferência, de cerca de 10^8 a 10^12 CFU domicroorganismo. Alternativamente, no entanto, estaquantidade de microorganismos pode ser repartida emadministrações múltiplas, sendo que cada uma consiste deuma quantidade menor de carga microbiana — desde que aquantidade global de microorganismos recebida por umsujeito a qualquer tempo específico (por exemplo, a cadaperíodo de 24 horas) seja de cerca de 10^6 a cerca de 10^12CFU de microorganismos, de preferência, de 10^8 a cerca de10^12 CFU de microorganismos.

De acordo com a presente invenção, uma quantidadeefetiva de pelo menos uma cepa de um microorganismo podeser de pelo menos 10^6 CFU de microorganismo/dose, depreferência, de cerca de 10^6 a cerca de 10^12 CFU demicroorganismo/dose, de preferência, cerca de 10^8 a cercade 10^12 CFU de microorganismo/dose.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismousado de acordo com a presente invenção, (como uma cepa deLactobacillus spp.; por exemplo, uma cepa de Lactobacillusacidophilus, L. salivarius e/ou Lactobacillus curvatus e/ouuma cepa de Bifidobacterium, por exemplo, B. Iactis) podeser administrado a uma dosagem de cerca de 10^6 a cerca de10^12 CFU de microorganismo/dia, de preferência, de cerca de10^8 a cerca de 10^12 CFU de microorganismo/dia. Assim, aquantidade efetiva nesta modalidade pode ser de cerca de10^6 a cerca de 10^12 CFU de microorganismo/dia, depreferência, de cerca de IO8 a cerca de 10^12 CFU demicroorganismo/dia.CFU significa Unidades Formadoras de Colônias["Colony-Forming Units"]. Por grama de suporte compreende-se, de preferência, o produto alimentício ou o suportefarmaceuticamente aceitável.

De maneira vantajosa, a presente invenção é umaferramenta efetiva para reduzir ganho de peso e/oufacilitar perda de peso e/ou tratar ou prevenir obesidadee/ou tratar ou aliviar distúrbios ou doenças relacionadascom, ou causadas por obesidade ou por se estar emsobrepeso.

Sem desejar ater-nos à teoria, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo pode mediar perda de peso e/ou resultarem saciedade mediante aumento da sinalização da saciedadeno intestino.

Sem desejar ater-nos à teoria, o microorganismo e/oumetabólito pode mediar perda de peso e/ou resultar emsaciedade via seus efeitos sobre um hormônio do intestinoe/ou sobre um ou mais receptores encontrados no intestino.

Alguns dos reguladores periféricos do apetite,incluindo hormônios do intestino, são discutidos em Stanleyet al Physiol. Review 85: 1131-1158 2005.

Sem desejar ater-nos à teoria, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo pode mediar perda de peso e/ou resultarem saciedade via seu efeito sobre um marcador de saciedade(como o hormônio do intestino, PeptIdio Tirosina Tirosina(PYY), por exemplo).

Saciedade

0 termo "saciedade" como usado aqui significa o estadode estar saciado ou ter o apetite saturado, i.e. plenitudealém do desejo ou de estar plenamente satisfeito.De maneira vantajosa, a presente invenção pode serpara aumentar saciedade.

De preferência, a presente invenção é para induzire/ou aumentar saciedade pós-prandial.

A pessoa versada na arte será capaz de compreender quesaciedade e saciedade pós-prandial pode ser medida dediversas maneiras.

Por exemplo, sem desejar ater-nos à teoria, há umaligação entre o nível de marcador(es) de saciedade (como ohormônio do intestino PYY, quer no sangue ou no intestino)e o nível de saciedade.

Portanto, saciedade e/ou saciedade pós-prandial podeser medida determinando-se o nível de um ou mais marcadoresde saciedade (por exemplo, PYY quer no sangue do sujeitoe/ou no intestino do sujeito) . De maneira vantajosa, asamostras podem ser tomadas em intervalos antes, e emintervalos após o sujeito ter consumido uma refeiçãoespecífica. Por exemplo, níveis incrementados de expressãode PYY e/ou níveis incrementados de PYY podem indicarsaciedade. As relações entre outros marcadores de saciedadee saciedade são conhecidas por aqueles com práticaordinária na arte.

Adicionalmente, ou alternativamente, saciedade e/ousaciedade pós-prandial pode ser medida em estudos animaispor meio de medição da ingestão de comida do animal e/ou dointervalo de tempo entre a alimentação do animal e/ou dopeso do animal. Uma redução da ingestão de comida e/ou dopeso' do animal indica saciedade. Adicionalmente, ou comouma alternativa, um aumento no intervalo de tempo entre asalimentações do animal indica saciedade.Adicionalmente, ou alternativamente, saciedade e/ousaciedade pós-prandial pode ser medida subjetivamente porum sujeito com o uso de um questionário em que sujeitos sãoindagados com as seguintes perguntas: "quão faminto vocêestá?", "quão cheio você está?", "quanto você é capaz decomer?" e "o que você deseja comer?". Sua percepção podeser classificada de 0 (menor) a 10 (maior) em uma escalaanalógica visual de 100 mm (como ensinado em Stock et al J.of Clinicai Endocrinology & Metabolism, publicadoprimeiramente em 18 de janeiro de 2005 comodoi:10.1210/jc.2004.1251). Esta referência é incorporadaaqui por referência. De preferência, o sujeito ésolicitado a preencher o questionário em intervalos antes,e em intervalos após o sujeito ter consumido uma refeiçãoespecífica.

Em algumas modalidades, saciedade pode significar umou mais dos seguintes:

a) saciedade pós-prandial;

b) uma redução da fome pré-refeição;

c) um fortalecimento na saciação da refeição parareduzir o tamanho da refeição; e/ou

d) um aumento do estado de saciedade entre refeições,que pode prevenir aumentos compensatórios nos números derefeições e/ou pode reduzir o "beliscar" entre refeições.

Em algumas modalidades, saciedade pode ser medidacomo um ou mais dos seguintes:

i) uma redução na ingestão de comida pelo sujeito, emcomparação com um sujeito de teste comparativo e/ou emcomparação com o sujeito pré-tratamento;

ii) uma redução no peso corporal do sujeito emcomparação com o sujeito pré-tratamento;iii) uma redução na adiposidade em comparação com umsujeito de teste comparativo e/ou em comparação com osujeito pré-tratamento.

Marcador de saciedade

0 termo "marcador de saciedade" como usado aquirefere-se a um composto(s) e/ou hormônio(s) do intestinoenvolvido na regulação do apetite e/ou da ingestão decomida.

Marcadores de saciedade incluem, embora sem limitação,polipeptídio pancreático (PYY), colecistocinina (CCK),peptídio similar a glucagônio-1 (GLP-I), insulina, leptina,grelina, orexinas, neuropeptídio hipotalâmico orexigênico Y(NPY), ácido acético, amilina, e oxintomodulina.

Em uma modalidade, o marcador de saciedade é, depreferência, um hormônio do intestino.

Em uma modalidade, o marcador de saciedade pode ser umou mais dentre PYY, CCK, GLP-I, insulina, leptina,grelina, orexinas, neuropeptídio hipotalâmico orexigênico Y(NPY), mialina ou oxintomodulina.

De maneira vantajosa, o marcador de saciedade pode serselecionado de qualquer um ou mais dos seguintes: PYY, CCK,GLP-I e insulina.

Sem desejar ater-nos à teoria, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo da presente invenção pode induzirsaciedade através do aumento dos níveis plasmáticos dequalquer um mais dentre: PYY, CCK, GLP-I e insulina. 0aumento é comparado com um controle equivalente a que nãofoi administrado o microorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Em uma modalidade, o microorganismo e/ou metabólito domesmo da presente invenção pode induzir saciedade atravésdo aumento dos níveis de qualquer um ou mais dos seguintesmarcadores de saciedade no intestino: PYY, CCK, GLP-I einsulina. 0 aumento é comparado com um controle a que nãofoi administrado o microorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Sem desejar ater-nos à teoria, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo da presente invenção pode induzirsaciedade mediante aumento do nível de leptina no sangueperiférico e/ou mediante diminuição do nível de leptina nocérebro. 0 aumento é comparado com um controle o qual nãofoi administrado o microorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Em uma modalidade, o microorganismo e/ou metabólito domesmo da presente invenção pode aumentar o nível de PYY. 0aumento é comparado com um controle a que não foiadministrado o microorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Em uma modalidade alternativa ou adicional, omicroorganismo e/ou metabólito do mesmo da presenteinvenção pode aumentar o nível de CCK. O aumento écomparado com um controle que a que não foi administrado omicroorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Em outra modalidade, o microorganismo e/ou metabólitodo mesmo da presente invenção pode induzir saciedade pormeio da diminuição do nível de um ou mais hormônio (s) dointestino no intestino e/ou no plasma, como qualquer um oumais dos seguintes: grelina e orexinas. A diminuição écomparada com um controle a que não foi administrado omicroorganismo e/ou metabólito do mesmo.

Em outra modalidade, o marcador de saciedade pode serácido acético. Nesta modalidade, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo da presente invenção pode induzirsaciedade por meio do aumento do nível de ácido acético nosangue. O aumento é comparado com um controle que a que nãofoi administrado o microorganismo e/ou metabólito do mesmo.Suporte

O suporte empregado durante o uso de acordo com apresente invenção é, de preferência, um suportefarmaceuticamente aceitável ou um produto alimentício.

Informaç ao adicional com relaçao tanto a alimentos comoa farmacêuticos é dada abaixo.

Um suporte farmaceuticamente aceitável pode ser, porexemplo, um suporte em forma de tabletes comprimidos,tabletes, cápsulas, ungüentos, supositórios ou soluções

bebíveis. Outras formas vantajosas são proporcionadasabaixo.

De preferência, o suporte empregado durante o uso deacordo com a invenção é um produto alimentício, como umsuplemento alimentício, uma bebida ou um pó à base deleite. De preferência, ele é um produto lácteo de origemanimal ou vegetal. Como indicado adicionalmente abaixo,aqui o termo "alimento" é usado em seu sentido mais amplo -e abrange comida para humanos e também comida para animais(i.e. uma ração).

O termo "produto lácteo" como usado aqui significaincluindo um meio compreendendo leite de origem animal e/ouvegetal. Como leite de origem animal, como indicado aqui,pode-se mencionar leite de vaca, de ovelha, de cabra ou debúfalo. Como leite de origem vegetal, como indicado aqui,pode-se mencionar qualquer substância fermentável de origemvegetal que pode ser usada de acordo com a invenção, emparticular se originada de grãos de soja, arroz ou cereais.

Ainda mais preferivelmente, o suporte empregado deacordo com a invenção é um leite fermentado ou leitehumanizado.

Sobrepeso/obesidadeO índice de massa corporal (BMI, body mass index)(calculado como peso em quilogramas dividido pelo quadradoda altura em metros) é a medida mais comumente aceita parasobrepeso e/ou obesidade.

Um BMI acima de 25 é considerado sobrepeso.

A obesidade é definida como um BMI de 30 ou mais,sendo que um BMI de 35 ou mais é considerado comorbidezgrave, e um BMI de 4 0 ou mais é considerado obesidademórbida.

O termo "obesidade" como usado aqui inclui obesidade,obesidade comórbida e obesidade mórbida. Portanto, o termo"obesidade" como usado aqui pode ser definido como umsujeito apresentando um BMI acima de 3 0 ou igual a 30.

Em algumas modalidades, de maneira vantajosa, umsujeito obeso pode apresentar um BMI acima de 30, ou iguala 30, vantajosamente 35, vantajosamente 40.

O termo "excesso de peso" como usado aqui significa oexcesso de peso do sujeito. 0 termo "excesso de peso" comousado aqui significa que o sujeito é considerado emsobrepeso. O termo "sobrepeso" como usado aqui significaque o sujeito tem um BMI superior a 25.

Excesso de peso e/ou obesidade pode ser medida usando-se o BMI. Portanto, uma redução no excesso de peso e/ouobesidade pode ser medida usando-se o BMI.

Uma redução no excesso de peso e/ou na obesidadetambém (ou alternativamente) pode ser medida simplesmentemedindo-se o peso do sujeito relativamente a um controlee/ou antes e após administração dos microorganismos e/oumetabólito dos mesmos de acordo com a presente invenção.

Sem desejar ater-nos à teoria, também pode haver umaligação entre marcadores inflamatórios no sangue ou nosoro (como proteína C-reativa e/ou interleucina 6 e/ouTNF-RII, por exemplo) e obesidade. Adicionalmente, tambémpode haver uma correlação entre marcadores inflamatórios nosangue ou no soro e BMI. Assim, em uma modalidade, pode-semedir marcadores inflamatórios no sangue para determinar aobesidade e/ou uma redução na obesidade em um sujeito.Distúrbios/doenças relacionados com, ou causados porexcesso de peso e/ou obesidade .

Condições de saúde (i.e. distúrbios e/ou doenças)causados ou exacerbados por obesidade incluem hipertensão,diabetes melito, por exemplo, diabetes de tipo-2, apnéia dosono, hipoventilação relacionada com obesidade, problemasnas costas e nas juntas, doença cardiovascular, doença não-alcoólica do fígado gordo e doença de refluxogastroesofágico.

Sujeito

O termo "sujeito", como usado aqui, significa umanimal. De preferência, o sujeito é um mamífero, incluindopor exemplo, animais domésticos (incluindo gado, cavalos,porcos, frangos e ovelhas), e humanos. Em alguns aspectosda presente invenção o animal é um animal de companhia(incluindo animais de estimação) , como um cão ou um gato,por exemplo. Em alguns aspectos da presente invenção,vantajosamente o sujeito pode ser um humano.

Medicamento

O termo "medicamento" como usado aqui compreendemedicamentos tanto para uso humano e para uso animal, namedicina humana e veterinária. Adicionalmente, o termo"medicamento" como usado aqui significa qualquer substânciaque proporciona um efeito terapêutico e/ou benéfico. Otermo "medicamento" como usado aqui não se limitanecessariamente a substâncias que precisam de Aprovaçãopara Comercialização, mas pode incluir substâncias quepodem ser usadas em cosméticos, nutracêuticos, alimentos(incluindo rações e bebidas, por exemplo) , culturasprobióticas, e remédios naturais. Adicionalmente, o termo"medicamento" como usado aqui compreende um produtoprojetado para incorporação na ração animal, exemplo, raçãopara animais domésticos e/ou comida para animais decompanhia.

Tratamento

Deve-se considerar que todas as referências feitasaqui a tratamento incluem tratamento curativo, paliativo eprofilático.

Forma substancialmente pura e/ou forma isolada

Para alguns aspectos, o microorganismo e/ou metabólitode acordo com a presente invenção pode encontrar-se em umaforma ou pode encontrar-se em uma forma isolada.

O termo "forma substancialmente pura" é usado paraindicar que o microorganismo e/ou metabólito de acordo coma presente invenção está presente em um nível elevado.Quando o microorganismo e/ou metabólito se encontra em umaforma substancialmente pura, o microorganismo e/oumetabólito é desejavelmente o componente predominantepresente em uma composição. De preferência, ele estápresente em um nível superior a 3 0 %, superior a 5 0 %,superior a 75 %, superior a 90 %, ou mesmo superior a 95 %,sendo que referido nível é determinado numa base de pesoseco/peso seco com relação à composição total emconsideração.

Em níveis muito elevados (p. ex. , em níveis acima de90 %, acima de 95 % ou acima de 99 %) o componente pode serconsiderado como sendo "isolado". Substânciasbiologicamente ativas da presente invenção (incluindopolipeptídios, moléculas de ácido nucleico, carboidratosidentificados/identificáveis via seleção, lipídiosidentificados/identificáveis via seleção, porçõesidentificadas/identificáveis via seleção, etc.) podem serproporcionadas em uma forma que é substancialmente isentade um ou mais contaminantes com os quais a substânciapoderia, de outra forma, estar associada. Assim, porexemplo, elas podem ser substancialmente livres de um oumais polipeptídios e/ou moléculas de ácido nucleicopotencialmente contaminantes.

Elas podem ser proporcionadas em uma forma que ésubstancialmente livre de outros componentes de células(p. ex., de membranas de células, de citoplasma, etc.).Quando uma composição é substancialmente livre de um dadocontaminante, o contaminente se encontrará em um nívelbaixo (p. ex., em um nível inferior a 10 %, inferior a 5 %ou inferior a 1 % na base de peso seco/peso seco indicadaacima) .

Microorganismo

Microorganismos viáveis vantajosos para uso napresente invenção incluem bactérias, bolores e/ouleveduras.

De preferência, os microorganismos viáveis para uso napresente invenção são bactérias viáveis.

0 termo "microorganismo viável" significa ummicroorganismo que é metabolicamente ativo.

0 microorganismo pode ser um microorganismonaturalmente ocorrente ou ele pode ser um microorganismotransformado. O microorganismo também pode ser umacombinação de microorganismos vantajosos.

Em alguns aspectos, o microorganismo de acordo com apresente invenção pode ser um ou mais dos seguintes: umabactéria, um fungo, uma levedura.

De maneira vantajosa, o microorganismo de acordo com apresente invenção pode ser uma bactéria.

De maneira vantajosa, o microorganismo de acordo com apresente invenção pode ser uma bactéria de um ou mais dosgêneros a seguir: Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus,Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium,Propionibacterium, Bifidobacterium e Lactobacillus.

De preferência, em algumas modalidades, omicroorganismo de acordo com a presente invenção é ummicroorganismo probiótico. De maneira vantajosa, omicroorganismo probiótico pode ser uma bactéria ou levedurados gêneros a seguir: Lactobacillus spp., Streptococcusspp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. eSacharomyces spp.

Para algumas modalidades, o microorganismo de acordocom a presente invenção pode ser uma bactéria de ácidoláctico. De maneira vantajosa a bactéria de ácido lácticopode ser uma dos gêneros a seguir: Lactobacillus,Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium,Enterococcus, Brevibacterium, e Vagococcus. Esta lista nãoé exaustiva.

Para algumas modalidades, o microorganismo de acordocom a presente invenção é uma bactéria de ácido lácticoprobiótica. Uma bactéria de ácido láctico probiótica podeser um dos gêneros a seguir: Lactobacillus spp.,Bifidobacterium spp., Streptococcus spp., e Enterococcusspp.

Outros gêneros de bactérias que podem ser usadas deacordo com a presente invenção incluem: Pediococcus,Micrococcus, Staphylococcus, Baeillus, Kocuria,Arthrobacter, Proprionibacterium, Brevibaeterium eCorynebaeterium.

De preferência, o microorganismo a ser usado de acordocom a presente invenção é um microorganismo que égeralmente reconhecido como sendo seguro e que, depreferência, é aprovado pelo GRAS.

Uma pessoa versada na arte perceberá facilmenteespécies específicas e ou cepas de microorganismos dentreos gêneros aqui descritos que são usados nas indústrias dealimentos e/ou agrícola e que geralmente são consideradosvantajosos para consumo humano e/ou animal.

De preferência, o microorganismo usado de acordo com apresente invenção é um que é vantajoso para consumo humanoe/ou animal.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo édo gênero Lactobacillus ou do gênero Bifidobacterium ou éuma mistura dos mesmos. De maneira vantajosa, omicroorganismo pode ser uma cepa das espécies L.acidophilus, L. curvatus, L. rhamnosus, L. casei, L.paracasei, L. salivarius, B. Iactis. B. animalis, B. Iongume/ou B. bifidum. Em uma modalidade, de preferência, omicroorganismo pode ser uma cepa das espécies L.acidophilus, L. curvatus, L. salivarius e/ou B. Iactis.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo édo gênero Lactobacillus.De maneira vantajosa, o microorganismo pode ser umacepa das espécies L. acidophilus, L. curvatus, L.rhamnosus, L. casei, L. paracasei e L. salivarius. Em umamodalidade, de preferência, o microorganismo pode ser umacepa das espécies L. acidophilus, L. curvatus, ou L.salivarius.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo édo gênero, Streptococcus.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo édo gênero Enterococcus.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo édo gênero Bifidobacterium.

De maneira vantajosa, o microorganismo pode ser umacepa das espécies B. Iactis., B animalis, B. Iongum ou B.

bifidum. De preferência, o microorganismo pode ser uma cepadas espécies B. Iactis, como, por exemplo, B. Iactis 420 ouB. Iactis HNO19.

Para algumas modalidades, o microorganismo pode seruma mistura de mais de um microorganismo probiótico (depreferência, mais de uma bactéria probiótica) ; uma misturade mais de uma bactéria de ácido láctico; ou uma mistura deum ou mais microorganismos probióticos (de preferência,bactérias probióticas) e uma ou mais bactérias do ácidoláctico. De preferência, a mistura pode compreender uma oumais manchas de Lactobacillus spp, e/ou Bifidobacteriumspp.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo épelo menos uma cepa de Lactobacillus spp.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo épelo menos uma cepa de Lactobacillus acidophilus.Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo épelo menos uma cepa de Lactobacillus curvatus.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismo épelo menos uma cepa de Lactobacillus salivarius.

O microorganismo, de preferência, um Lactobacillusspp., como L. acidophilus, L. salivarius e L. curvatus porexemplo, para uso de acordo com a presente invenção é, depreferência, uma cepa gram-positiva. De maneira vantajosa,ela pode ser uma cepa catalase-negativa, com um metabolismohomofermentativo dando origem à produção de ácido láctico.

O microorganismo, de preferência, um Lactobacillusspp., como L. acidophilus, L. salivarius e L. curvatus porexemplo, para uso de acordo com a presente invenção tambémpode produzir uma bacteriocina, como, por exemplo,lactacina, ativa contra outros microorganismos.

De preferência, o microorganismo, de preferência, umLactobacillus spp., como L. acidophilus, L. salivarius e L.curvatus, por exemplo, para uso de acordo com a presenteinvenção apresenta uma boa resistência à pepsina, emcondições de pH ácido, uma boa resistência à pancreatinae/ou uma boa tolerância aos sais biliares.

Em uma modalidade, o microorganismo, de preferência,Lactobacillus spp., como L. acidophilus por exemplo, deacordo com a presente invenção pode ser um microorganismo,de preferência, um Lactobacillus spp., como L. acidophilus,por exemplo, que pode ser descrito como "hidrofóbico",i.e. um que apresenta uma forte afinidade por solventesorgânicos hidrofóbicos polares ou não-polares, como, porexemplo, n-decano, clorofórmio, hexadecano ou xileno.

O Lactobacillus acidophilus preferido de acordo com apresente invenção pode ser Lactobacillus acidophilus PTA-4797. Esta cepa de Lactobacillus acidophilus foi registradapela Rhodia Chimie, 26, quai Alphonse Le Gallo7 92 512BOULOGNE-BILLANCOURT Cedex, França, de acordo com o Tratadode Budapeste, na American Type Culture Collection (ATCC),onde é registrada sob o registro n° PTA-4797.

A cepa de Lactobacillus acidophilus para uso de acordocom a presente invenção pode ser em forma de uma misturacom outras bactérias de ácido láctico. As bactérias deácido láctico provavelmente vantajosas de acordo com ainvenção incluem quaisquer bactérias de ácido lácticousualmente empregadas nas indústrias agrícola, alimentíciaou farmacêutica.

De maneira vantajosa, onde o produto é um produtoalimentício, o microorganismo viável e/ou metabólitossolúveis produzidos por referido microorganismo deveriampermanecer efetivos até a data normal de "vender até" ou de"expiração" sendo que durante este período o produtoalimentício é oferecido para comercialização pelodistribuidor. De preferência, o tempo efetivo deveriaestender -se além dessas datas, até o término do período defrescor normal quando a deterioração do alimento se tornaperceptível. As durações desejadas e a vida-de-prateleiranormal variarão de produto alimentício para produtoalimentício, e aqueles com prática ordinária na arteperceberão que os tempos de vida-de-prateleira variarão deacordo com o tipo de produto alimentício, do tamanho doproduto alimentício, das temperaturas de armazenamento,condições de processamento, material de embalagem, eequipamento de embalagem.

Em uma modalidade, de preferência, o microorganismonão é Helicobacter pylori.Ensaio de exposição baseado em células Caco-2

A linha de células de carcinoma colorretal humanoCaco-2 é mantida a 37°C e a 5 % de CO2 em MEM da Dulbecco(Biochrom AG) suplementado com 20 % de soro bovino fetal(FBS7 Gibco), 2 ni de glutamina estável (Biochrom AG) e 1 Xde aminoácidos não-essenciais (Biochrom AG)), 20 Uml"1 depenicilina (Gibco) , 20 μςιηΐ"1 de estreptomicina (Gibco) e0,5 μςπιΐ"1 de anfotericina (Gibco). Quando subcultivadas,as células são lavadas com Ix PBS (Gibco) e destacadas comTryple Select (Gibco).

Para determinar os efeitos de vários microorganismose/ou metabólitos dos mesmos sobre o hormônio do intestino,como PYY, 6,6xl05/cm2 de células Caco-2 são semeadas ediferenciadas em insertos de cultura de células Transwellrevestidos com colágeno (Corning) de acordo com umprotocolo de 5 dias (Yamashita et al. 2001, J. Pharm. Sei.91(3): 669-679). Após semeadura em insertos Transwell, ascélulas Caco-2 são mantidas durante 4 8 h em meio queconsiste de MEM da Dulbecco (Biochrom AG) , 10 % de sorobovino fetal (FBS, Gibco) 2 mM de glutamina estável(Biochrom AG) , e 1 X aminoácidos não-essenciais, porém semqualquer antibiótico. Após 4 8 h o meio é trocado por meioEnterostim (BD Biosciences) suplementado com extensor desoro MITO+ (BD Biosciences) adicionado ao meio de acordocom protocolo proporcionado pelo fabricante. As células sãousadas em experimentos no quarto dia após a semeadura, eminsertos Transwell ou após a resistência elétricatransepitelial ter aumentado a um nível que indicadiferenciação de células. Em todos os experimentos não seusa antibióticos nem soro. Os metabólitos e/ou váriosmicroorganismos são adicionados no lado apical do inserto.Após 24 horas de exposição, o meio é descartado,células no interior dos insertos são lisadas e o RNA éextraído usando-se o kit RNeasy Mini Kit da Qiagen(Alemanha). DNA é digerido usando-se a mesma DNase isentade RNase do fabricante. Realiza-se transcrição reversausando transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen)de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. 0padrão de expressão do hormônio (p. ex., PYY) é determinadopor meio de PCR TaqMan quantitativa em tempo real (i.e. ummétodo de quantificação relativa - ver Holland et al, 1991Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 15 de agosto; 88(16): 7276-80;e Livak e Scmittgen, 2001 Methods dezembro; 25(4):402-8)usando-se os ajustes padrão de um instrumento de detecçãode seqüências ABI Prism 7000 (Applied Biosystems)) ou pormeio de um método de quantificação absoluta, como PCRTaqMan (Applied Biosystems) com analisador genético ABIPrism 7000 usando um conjunto de oligonucleotídeos e umoligonucleotideo padrão que reconhece o hormônio (p. ex.,PYY de homo sapiens) especificamente.

A suspensão microbiana para uso no ensaio acima podeser preparada cultivando-se o microorganismo em um meiovantajoso. A cultura pode ser centrifugada para formar umpellet de células que pode ser suspenso subseqüentemente emum meio vantajoso, p. ex. , DMEM. A suspensão de metabólitopara uso no ensaio acima pode ser preparada cultivando-se omicroorganismo em um meio de cultura vantajoso. A culturapode ser centrifugada e/ou o meio de cultura filtrado(vantajosamente, filtrado de forma estéril) paraproporcionar a suspensão de metabólito.

Microorganismos que causam uma modificação no nível deexpressão de hormônio (p. ex. , um aumento de PYY) emcomparação com um controle não-tratado, podem sermicroorganismos de acordo com a presente invenção e/ou quepodem ser usados de acordo com a presente invenção.

Uma pessoa versada poderia ser capaz de selecionarfacilmente microorganismos probióticos e não-probióticosusando o "ensaio de exposição baseado em células Caco-2"para identificar microorganismos específicos, adicionaisàqueles ensinados especificamente aqui, capazes de produziro efeito anunciado.

Combinação com outros componentes

O microorganismo e/ou metabólito do mesmo para uso napresente invenção pode ser usado em combinação com outroscomponentes. Assim, a presente invenção refere-se também acombinações. O microorganismo e/ou metabólito do mesmo podeser referido aqui como "a composição da presente invenção".

A combinação da presente invenção compreende umacomposição da presente invenção e outro componente que évantajoso para consumo animal ou humano e que é capaz deproporcionar um benefício médico ou fisiológico aoconsumidor.

Outros componentes das combinações da presenteinvenção incluem polidextrose, como Litesse®, e/ou umamaltodextrina e/ou lactitol. Estes outros componentes podemser adicionados opcionalmente à composição para assistir noprocesso de secagem e auxiliar para a sobrevida dosmicroorganismos.

Exemplos adicionais de outros componentes vantajososincluem um ou mais dentre: espessantes, agentesgelificantes, emulsificantes, ligantes, modificadores decristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais),modificadores de reologia, estabilizantes, antioxidantes,corantes, enzimas, suportes, veículos, excipientes,diluentes, agentes lubrificantes, agentes aromatizantes,matéria corante, agentes de suspensão, desintegrantes,ligantes de granulação etc. Estes outros componentes podemser naturais. Estes outros componentes podem ser preparadospor meio do uso de técnicas químicas e/ou enzimáticas.

Em uma modalidade, o microorganismo e/ou metabólito domesmo pode ser encapsulado.

Em uma modalidade preferida, o microorganismo e/oumetabólito do mesmo para uso na presente invenção pode serusado em combinação com um ou mais lipídios.

Por exemplo, o microorganismo e/ou metabólito do mesmopara uso na presente invenção pode ser usado em combinaçãocom uma ou mais micelas de lipídios. A micela de lipídiopode ser uma micela de lipídio simples ou uma micela delipídio complexa.

A micela de lipídio pode ser um agregado de moléculasorientadas de substâncias anfifáticas.

As micelas de lipídios podem ser um agregado, comdimensões coloidais, de moléculas orientadas desubstâncias anfifáticas que existem em equilíbrio emsolução com as espécies químicas das quais é formada.Geralmente, micelas são carregadas eletricamente. Emsolução aquosa, as moléculas individuais do agregadomicelar são orientadas com seus grupos polares apontando nosentido do meio aquoso e sua porção hidrofóbica dirigidapara o centro da micela.

As micelas de lipídios podem compreender um lipídioe/ou um óleo.

Portanto, em uma modalidade, a presente invençãoproporciona o uso de uma combinação de pelo menos uma cepade um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo e umamicela de lipidio para modular a sinalização da saciedadee/ou para tratar e/ou prevenir excesso de peso (ouobesidade) e/ou uma doença causada por excesso de peso (ouobesidade). Como usado aqui, o termo "espessante ou agentegelificante" refere-se a um produto que previne a separaçãomediante desaceleração ou prevenção do movimento departículas, quer sejam gotículas de líquidos imiscíveis,ar ou sólidos insolúveis. O espessamento ocorre quandomoléculas hidratadas individuais causam um aumento daviscosidade, desacelerando a separação. Gelificação ocorrequando as moléculas hidratadas se ligam formando um sistemareticular tridimensional que aprisiona as partículas, destaforma imobilizando-as.

O termo "estabilizante" como usado aqui é definidocomo um ingrediente ou combinação de ingredientes queimpede um produto (p. ex. , um produto alimentício) demodificar-se ao longo do tempo.

O termo "emulsificante" como usado aqui refere-se a umingrediente (p. ex., um ingrediente de produto alimentício)que impede a separação de emulsões. Emulsões são duassubstâncias imiscíveis, uma presente em forma de gotículas,contida na outra. Emulsões podem ser óleo-em-água, onde agotícula ou fase dispersa é óleo, e a fase contínua é água;ou água-em-óleo, em que a água torna-se a fase dispersa ea fase contínua é óleo. Espumas, que são gás-em-líquido, esuspensões, que são sólido-em-líquido, também podem serestabilizadas com o uso de emulsificantes. Pode ocorreraeração em um sistema de três fases em que o ar éaprisionado por óleo líquido, depois estabilizado porcristais de gordura aglomerados estabilizados com umemulsificador. Emulsificantes possuem um grupo polar comuma afinidade por água (hidrofílico) e um grupo não-polarque é atraído por óleo (IipofIlico). Eles são absorvidosnas interfaces das duas substâncias, proporcionando umapelícula interfacial para estabilizar a emulsão. Aspropriedades hidrofílicas/lipofílicas de emulsificantes sãoafetadas pela estrutura da molécula. Estas propriedades sãoidentificadas pelo valor de balanço hidrofílico/lipofílico(HLB, hydrophilie/lipophilie balance). Valores de HLBbaixos indicam maiores tendências lipofílicas que sãousadas para estabilizar emulsões água-em-óleo. Valores deHLB elevados são atribuídos a emulsificantes hidrofílicos,tipicamente usados em emulsões óleo-em-água. Estes valoressão derivados de sistemas simples. Como alimentosfreqüentemente contêm outros ingredientes que afetam aspropriedades de emulsificação, os valores de HLB podem nemsempre ser um guia confiável para seleção de emulsificante.

Como usado aqui o termo "aglutinante" refere-se a umingrediente (p. ex., um ingrediente alimentício) que seliga ao produto de forma coesa por meio de uma reaçãofísica ou química. Durante a "gelificação", por exemplo, aágua é absorvida, proporcionando um efeito ligante. Noentanto, ligantes podem absorver outros líquidos, comoóleos, conservando-os. dentro do produto. No contexto dapresente invenção, ligantes poderiam ser usados tipicamenteem produtos sólidos ou com baixo teor de umidade, porexemplo, produtos de panificação: passas, doughnuts[espécie de sonho], pão e outros.

O termo "modificador de cristal" como usado aquirefere-se a um ingrediente (p. ex. , um ingredientealimentício) que afeta a cristalização de gordura ou água.A estabilização de cristais de gelo é importante por duasrazões. A primeira está relacionada diretamente com aestabilidade do produto, de um ponto de vista da separação.Quanto mais ciclos de congelamento/descongelamento umproduto encontra, tanto maiores tornam-se os cristais degelo. Estes cristais grandes podem degradar a estrutura doproduto, seja ele naturalmente ocorrente, como no caso deparedes de células, ou que é criado por "elação" . Como aágua não é mais conservada no lugar, o produto podeapresentar sinérese, ou exsudação, após descongelamento. Emsegundo lugar, no caso de um produto que é consumidocongelado, estes cristais maiores resultam numa sensaçãoindesejável arenosa na boca.

"Suportes" ou "veículos" significam materiaisvantajosos para a administração do composto, e incluemqualquer material do tipo referido conhecido na arte, como,por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluentelíquido, solubilizante, ou análogo, que é não-tóxico e quenão interage prejudicialmente com quaisquer componentes dacomposição.

Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveisincluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool,silicone, ceras, geléia de petróleo, óleos vegetais,polietileno glicóis, propileno glicol, liposomas, açúcares,gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco,tensoativos, ácido silícico, parafina viscosa, óleoperfumado, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácido graxo,ésteres de ácido graxo petroethral, hidroximetilcelulose,polivinilpirrolidona, e análogos.

Exemplos de excipientes incluem um ou mais de:celulose microcristalina e outras celuloses, lactose,citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálciodibásico, glicina, amido, lactose e polietileno glicóis comalto peso molecular.

Exemplos de desintegrantes incluem um ou mais dentre:amido (de preferência, amido de milho, de batata outapioca), amido glicolato de sódio, croscarmelose de sódioe determinados silicatos complexos.

Exemplos de ligantes de granulação incluem um ou maisdentre: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose(HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, maltose,gelatina e acácia.

Exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou maisdentre: estearato de magnésio, ácido esteárico, glicerilbehenato e talco.

Exemplos de diluentes incluem um ou mais dentre:água, etanol, propileno glicol e glicerina, e combinaçõesdos mesmos.

Os outros componentes podem ser usadossimultaneamente (p. ex., quando eles se encontram emmistura entre si ou mesmo quando eles são fornecidos porvias diferentes) ou seqüencialmente (p. ex., eles podem serfornecidos por vias diferentes).

De preferência, quando a composição da presenteinvenção, uma vez misturada com quaisquer outroscomponentes, os microorganismos permanecem viáveis.Como usado aqui, o termo "componente vantajoso paraconsumo animal ou humano" significa um composto que éadicionado ou que pode ser adicionado à composição dapresente invenção como um suplemento que pode ser debenefício nutricional, um substituto de fibra, ou queapresenta um efeito geralmente benéfico para o consumidor.Os ingredientes podem ser usados numa ampla variedade deprodutos que requerem gelificação, texturização,estabilização, suspensão, formação de película eestruturação, retenção de suculência, sem adição deviscosidade desnecessária. De preferência, os ingredientesserão capazes de melhorar a vida-de-prateleira e aestabilidade da cultura viável.

Os componentes podem ser prebióticos, como alginato,xantano, pectina, goma de vagem de caroba (LBG, locust beangum), inulina, goma guar, galacto-oligossacarídio (GOS),fruto-oligossacarídeo (FOS), polidextrose (i.e. Litesse®),lactitol, lacto-sacarose, oligossacarídeos de soja,palatinose, isomalto-oligossacarídeos, gluco-oligossacarídeos e xilo-oligossacarídeos.

A quantidade ótima da composição a ser usada nacombinação da presente invenção dependerá do produto a sertratado e/ou do método de contactar o produto com acomposição e/ou do uso desejado para o mesmo. A quantidadede microorganismo viável usado nas composições deveria seruma quantidade suficiente para ser efetiva e parapermanecer suficientemente efetiva para melhorar o aroma,aroma, suavidade, consistência, textura, corpo, sensação naboca, viscosidade, estrutura e/ou propriedadesorganolépticas, nutrição e/ou benefícios à saúde deprodutos alimentícios contendo referida composição. Estaduração para a efetividade deveria estender-se até, pelomenos, o tempo de utilização do produto.

Concentrados

As composições para uso na presente invenção podemencontrar-se em forma de concentrados. Tipicamente, estesconcentrados compreendem uma concentração substancialmenteelevada de um microorganismo viável e/ou de um metabólitodo mesmo. O microorganismo e/ou metabólito do mesmo podeser referido aqui como "a composição da presente invenção"ou "composições".

Pós, grânulos e composições líquidas em forma deconcentrados podem ser diluídos com água ou ressuspensosem água ou outros diluentes vantajosos, por exemplo, ummeio de crescimento apropriado, como leite ou óleosminerais ou vegetais, dando composições prontas para uso.

As combinações da presente invenção em forma deconcentrados podem ser preparadas de acordo com métodosconhecidos na arte.

Em um aspecto da presente invenção o produto écontactado por uma composição em uma forma concentrada. Depreferência, o produto é contactado com uma composiçãosecada por pulverização e/ou ressuspensa.

As composições da presente invenção podem ser secadaspor pulverização ou secadas por congelamento com métodosconhecidos na arte.

Processos típicos para a preparação de partículasusando um processo de secagem por pulverização envolvem ummaterial sólido que é dissolvido em um solvente apropriado(p. ex. , uma cultura de um microorganismo em um meio defermentação). Alternativamente, o material pode sersuspenso ou emulsificado em um não-solvente para formar umasuspensão ou emulsão. Outros ingredientes (como discutidoacima) ou componentes, como agentes anti-microbianos,agentes estabilizantes, corantes e agentes que auxiliam noprocesso de secagem, podem ser usados opcionalmente nesteestágio.A solução é então atomizada para formar uma finanévoa de gotículas. As gotículas entram imediatamente numacâmara de secagem onde elas contactam um gás de secagem. 0solvente é evaporado das gotículas no gás de secagem deforma a solificar as gotículas, transformando-as empartículas. As partículas são então separadas do gás desecagem e recolhidas.

Produtos

É possível usar na presente invenção qualquer produtoque pode beneficiar-se da composição. Estes incluem, emborasem limitação, conservas de frutas e alimentos lácteos eprodutos derivados de alimentos lácteos, produtoscosméticos e farmacêuticos. O microorganismo e/oumetabólito do mesmo pode ser referido aqui como "acomposição da presente invenção" ou "a composição".

A título de exemplo, a composição da presente invençãopode ser usada como um ingrediente para refrigerantes, umsuco de fruta ou uma bebida compreendendo proteína de soro,chás saudáveis, bebidas achocolatadas, bebidas lácteas ebebidas de bactérias de ácido láctico, iogurte e iogurtebebível, queijo, sorvetes cremosos, sorvetes aguados esobremesas, confeitos, tortas de biscoitos e misturas parabolo, lanches rápidos, bebidas e alimentos balanceados,recheios de frutas, glacê, recheio de panificaçãoachocolatado, recheio aromatizado de torta de queijo,recheio de torta com aroma de frutas, cobertura de bolos edoughnuts, cremes de recheio para panifiçados instantâneos,recheios para biscoitos, recheio de panificação de prontoemprego, recheio com calorias reduzidas, bebidasnutricionais para adultos, bebida de suco/soja acidifiçada,bebida achocolatada retortada/asséptica, misturas parabarras, pós para bebidas, soja/leite achocolatado e purofortificado com cálcio, bebida cafeinada fortificada comcálcio.

A composição pode ser usada adicionalmente como umingrediente em produtos alimentícios, como molho de queijoamericano, agente anti-incrustação para queijo ralado epicado, chip dip, requeijão, creme azedo sem gordura paracobertura batida misturada a seco, creme lácteo batido paracongelamento/descongelamento, creme levemente batidoestável para congelamento/descongelamento, queijo cheddarnatural leve e com baixo teor de gordura, iogurte em estilosuíço com baixo teor de gordura, sobremesas aeradascongeladas, sorvete empacotado duro, sorvete empacotadoduro, fácil de rotular, comprovadamente econômico einstigador, sorvete com baixo teor de gordura: soft serve[sorvete cremoso mole], molho para churrasco, molho paraimergir queijo, cobertura de queijo cottage, molho Alfredomisto seco, molho de queijo misto, molho de tomate mistoseco e outros.

Para determinados aspectos, de preferência, a presenteinvenção pode ser usada em conexão com a produção deiogurte, como bebida de iogurte fermentada, iogurte,iogurte bebivel, queijo, creme fermentado, sobremesas àbase de leite, e outros.

De maneira vantajosa, a composição pode ser usadaadicionalmente como um ingrediente em uma ou mais dentreaplicações de queijo, aplicações de carne, ou aplicaçõescompreendendo culturas protetoras.

A presente invenção também proporciona um método depreparar um alimento ou um ingrediente alimentício, sendoque o método compreende misturar a composição de acordo coma presente invenção com outro ingrediente alimentício.

De maneira vantajosa, a presente invenção refere-se aprodutos que foram contactados com a composição da presenteinvenção (e, opcionalmente, com outroscomponentes/ingredientes), sendo que a composição é usadanuma quantidade tal a ser capaz de melhorar a nutrição e/oubenefícios à saúde do produto.

Como usado aqui, o termo "contactado" refere-se àaplicação indireta ou direta da composição da presenteinvenção no produto. Exemplos dos métodos de aplicação quepodem ser usados incluem, embora sem limitação, tratar oproduto em um material compreendendo a composição,aplicação direta por meio de mistura da composição com oproduto, pulverização da composição sobre a superfície doproduto, ou imersão do produto numa preparação dacomposição.

Onde o produto da invenção é um produto alimentício, acomposição da presente invenção é misturada, depreferência, com o produto. Alternativamente, a composiçãopode ser incluída na emulsão ou ingredientes brutos de umproduto alimentício. Em uma alternativa adicional, acomposição pode ser aplicada como um tempero, glacê,mistura corante, e análogos.

Para algumas aplicações, é importante que a composiçãopossa ser aplicada sobre ou na superfície de um produto aser afetado/tratado. Isto permite à composição conferir umaou mais das características favoráveis a seguir: nutriçãoe/ou benefícios à saúde.

As composições da presente invenção podem seraplicadas de forma a interdispersar, revestir e/ouimpregnar um produto com uma quantidade controlada de ummicroorganismo viável.

Alimento

A composição da presente invenção pode ser usada como- ou na preparação de - um alimento. Aqui, o termo"alimento" é usado em um sentido amplo - e abrange alimentopara humanos e alimento para animais (i.e. uma ração). Emum aspecto preferido, o alimento é para consumo humano.

O alimento pode encontrar-se em forma de uma soluçãoou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo deaplicação e/ou do modo de administração.

Quando usado como - ou na preparação de - um alimentocomo alimento funcional - a composição da presenteinvenção pode ser usada em conjunto com um ou mais dentre:um veiculo nutricionalmente aceitável, um diluentenutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmenteaceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, umingrediente nutricionalmente ativo.

De preferência, a composição é usada para fermentarleite ou leite fortificado com sacarose ou meio láctico comsacarose e/ou maltose, sendo que o meio resultante contendotodos os componentes da composição - i.e. referidomicroorganismo de acordo com a presente invenção - pode seradicionado como um ingrediente a leite de iogurte emconcentrações vantajosas - como, por exemplo, emconcentrações no produto acabado que oferecem uma dosediária de 10^6-10^10 cfu. O microorganismo de acordo com apresente invenção pode ser usado antes ou após afermentação do iogurte.

Para alguns aspectos, os microorganismos de acordo coma presente invenção são usados como - ou na preparação de -rações animais, como rações para animais domésticos, emparticular rações para galináceos (como frangos) , ou raçãopara animais de estimação.

Ingrediente alimentício

A composição da presente invenção pode ser usada comoum ingrediente alimentício e/ou ingrediente de ração.

Como usado aqui, o termo "ingrediente alimentício" ou"ingrediente para ração" inclui uma formulação que é ou quepode ser adicionada a produtos alimentícios ou alimentosfuncionais como um suplemento nutricional.

O ingrediente alimentício pode encontrar-se em formade uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/oudo modo de aplicação e/ou do modo de administração.

Suplementos alimentícios

A composição da presente invenção pode consistir de -ou pode ser adicionada a - suplementos alimentícios.

Alimentos funcionais

A composição da presente invenção pode consistir de -ou pode ser adicionada a - alimentos funcionais.

Como usado aqui, o termo "alimento funcional"significa alimento que é capaz de proporcionar não só umefeito nutricional, mas também é capaz de fornecer umefeito benéfico adicional ao consumidor.

Assim, alimentos funcionais são alimentos ordináriosque apresentam componentes ou ingredientes (como aquelesdescritos aqui) incorporados nos mesmos que conferem aoalimento um benefício funcional específico - p. ex.benefício clínico ou fisiológico - diferente de um efeitopuramente nutricional.

Embora não haja definição legal de um alimentofuncional, a maioria das partes com um interesse nesta áreaconcorda que eles são alimentos comercializados comoapresentando efeitos de saúde específicos além dos efeitosnutricionais básicos.

Alguns alimentos funcionais são nutracêuticos. Aqui, otermo "nutracêutico" significa um alimento que é capaz deproporcionar não só um efeito nutricional e/ou umasatisfação do paladar, mas também que é capaz de fornecerum efeito terapêutico (ou outro efeito benéfico) aoconsumidor. Nutracêuticos cruzam as linhas divisóriastradicionais entre os alimentos e medicamento.

Pesquisas sugeriram que consumidores conferem a maiorênfase a propagandas de alimentos funcionais relativas adoença cardíaca. A prevenção de câncer é outro aspecto danutrição que interessa muito a consumidores, mas éinteressante observar que esta é a área sobre a qualconsumidores sentem que podem exercer menos controle.Efetivamente, de acordo com a Organização Mundial da Saúde,pelo menos 3 5 % dos casos de câncer estão relacionados coma dieta. Adicionalmente, propagandas relativas àosteoporose, saúde do intestino e efeitos da obesidadetambém são fatores-chave que provavelmente incitam àaquisição de alimentos funcionais e impelem odesenvolvimento do mercado.Probiótico

Para algumas aplicações, acredita-se que osmicroorganismos de ácido láctico viáveis na composição dapresente invenção podem exercer um efeito de culturaprobiótica. Também encontra-se no escopo da presenteinvenção o adicionar à composição da presente invençãoprobióticos e/ou prebióticos adicionais.

Aqui, um prebiótico é:"um ingrediente alimentício não-digerível que afetabeneficamente o hospedeiro mediante estimulação seletiva docrescimento e/ou da atividade de uma, ou de um númerolimitado de bactérias benéficas".

0 termo "cultura probiótica" como usado aqui definemicroorganismos vivos (incluindo, por exemplo, bactérias ouleveduras) que quando, por exemplo, ingeridos ou aplicadoslocalmente em números suficientes, afetam beneficamente oorganismo hospedeiro, i.e. conferindo um ou mais benefíciosde saúde demonstráveis sobre o organismo hospedeiro.Probióticos podem melhorar o balanço microbiano em uma oumais superfícies das mucosas. Por exemplo, a superfície damucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o tratorespiratório ou a pele. O termo "probiótico" como usadoaqui também compreende microorganismos vivos que podemestimular os ramos benéficos do sistema imune e, ao mesmotempo, reduzem as reações inflamatórias em uma superfíciedas mucosas, por exemplo, o intestino.

Embora não haja limites inferior ou superior para aingestão probiótica, sugeriu-se que, pelo menos, de IO6 aIO12, de preferência, pelo menos de IO6 a IO10, depreferência, de IO8 a IO9 cfu, como uma dose diária, sejamefetivos para proporcionar os efeitos benéficos para asaúde em um organismo hospedeiro, como um humano.

Adicionalmente ao efeito probiótico que omicroorganismo de acordo com a presente invenção podeapresentar, também encontra-se no escopo da presenteinvenção proporcionar prebióticos como outros compostos quepodem ser incluídos em uma combinação juntamente com acomposição. O microorganismo de acordo com a presenteinvenção e/ou um metabólito do mesmo pode ser referido aquicomo "a composição". 0 componente prebiótico da combinaçãocompreendendo a composição da presente invenção écaracterizado por fermentação lenta no intestino grosso.

Referidos prebióticos podem exercer um efeito positivosobre a flora intestinal, especificamente no lado esquerdodo colo, uma área do intestino que é particularmentepropensa a distúrbios, em particular câncer do intestino ecolite ulcerativa.

Prebióticos são, tipicamente, carboidrato não-digerível (oligo- ou polissacarideos) ou um álcool deaçúcar que não é degradado ou absorvido no trato digestivosuperior. Prebióticos conhecidos usados em produtoscomerciais e úteis de acordo com a presente invençãoincluem inulina (fruto-oligossacarídeo, ou FOS) etransgalacto- oligossacarídeos (GOS ou TOS) . Outrosprebióticos vantajosos incluem palatinoseoligossacarideo,oligossacarídeo de soja, gentio-oligossacarídeo,xilooligômeros, amido não-degradável, lactosacarose,lactulose, lactitol, maltitol, polidextrose (i.e. Litesse®)ou análogos.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se àcombinação de um microorganismo e/ou metabólito do mesmo deacordo com a presente invenção com um prebiótico.

O prebiótico para uso nesta combinação pode ser um oumais dos seguintes: inulina (f ructo-oligossacarídeo, ouFOS) e transgalacto-oligossacarídeos (GOS ou TOS). Outrosprebióticos vantajosos incluem palatinoseoligossacarideo,oligossacarídeo de soja, gentio-oligossacarídeo,

O xilooligômeros, amido não-degradável, lactossacarose,lactulose, lactitol, maltitol, polidextrose (i.e.Litesse®), ou lactitol.

O prebiótico pode ser administrado simultaneamente com(p. ex., em mistura mútua com, ou fornecido simultaneamentepela mesma via ou por vias diferentes) ou seqüencialmente(p. ex., pela mesma via ou por vias diferentes) aomicroorganismo de acordo com a presente invenção e/ou ummetabólito do mesmo.

A presente invenção considera o uso de ummicroorganismo e/e/ou um metabólito do mesmo em combinaçãocom um prebiótico na fabricação de uma droga para uso naindução de saciedade e/ou no tratamento ou na prevenção deexcesso de peso ou obesidade.

Sinbióticos

A presente invenção também considera o uso de ambos,pré- e probióticos como ingredientes em uma combinaçãojuntamente com a composição da presente invenção que,quando combinados, tornam-se simbióticos. 0 microorganismode acordo com a presente invenção e/ou um metabólito domesmo pode ser referido aqui como "a composição". Afinalidade disto é combinar os efeitos de novas bactériasbenéficas e a estimulação das bactérias benéficas dopróprio corpo. Há um grande potencial no desenvolvimento eno consumo de referidas misturas, porque algumas destaspodem bem mostrar potentes efeitos sinérgicos, nutricionaise/ou de saúde.

Assim, a composição da presente invenção pode serprojetada especificamente de forma a conter componentesdiferentes que podem proporcionar ao consumidor um efeitosimbiótico.

FarmacêuticoA composição da presente invenção pode ser usada como- ou na preparação de - um farmacêutico. Aqui, o termo"farmacêutico" é usado em um sentido amplo - e abrangefarmacêuticos para humanos e também farmacêuticos paraanimais (i.e. aplicações veterinárias). Em um aspectopreferido, o farmacêutico é para uso humano e/ou paracriação animal.

O farmacêutico pode ser para fins terapêuticos — quepodem ser de natureza curativa ou paliativa ou preventiva.O farmacêutico pode ser até mesmo para fins diagnósticos.

Quando usado como — ou na preparação de - umfarmacêutico, a composição da presente invenção pode serusada em conjunto com um ou mais dentre: um veículofarmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamenteaceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, umadjuvante farmaceuticamente aceitável, um ingredientefarmaceuticamente aceitável.

0 farmacêutico pode ser em forma de uma solução oucomo um sólido — dependendo do uso e/ou do modo deaplicação e/ou do modo de administração.

Ingrediente farmacêutico

Os microorganismos da presente invenção podem serusados como ingredientes farmacêuticos. Aqui, a composiçãopode ser o único componente ativo ou pode ser, pelo menos,um de vários (i.e. 2 ou mais) componentes ativos.

0 ingrediente farmacêutico pode ser em forma de umasolução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modode aplicação e/ou do modo de administração.

Formas

0 microorganismo da presente invenção e/ou ummetabólito do mesmo pode ser usado em qualquer formavantajosa - seja quando sozinho ou quando presente em umacombinação com outros componentes ou ingredientes. 0microorganismo da presente invenção e/ou um metabólito domesmo pode ser referido aqui como "a composição". Da mesmaforma, combinações compreendendo a composição da presenteinvenção e outros componentes e/ou ingredientes (i.e.ingredientes — como ingredientes alimentícios, ingredientesalimentícios funcionais ou ingredientes farmacêuticos)podem ser usadas em qualquer forma vantajosa.

O microorganismo da presente invenção pode ser usadoem forma de preparações sólidas ou líquidas ou em formasalternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidasincluem, embora sem limitação, tabletes, cápsulas, produtospara pulverização, grânulos e pós que podem ser umectáveis,secados por pulverização ou secados por congelamento.

Exemplos de preparações líquidas incluem, embora semlimitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas,orgânicas ou aquosas-orgânicas.

Exemplos vantajosos de formas incluem uma ou maisdentre: tabletes, pílulas, cápsulas, óvulos, soluções oususpensões, que podem conter agentes aromatizantes oucorantes, para aplicações de liberação imediata, retardada,modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

A título de exemplo, se a composição da presenteinvenção é usada em uma forma de tablete — como para usocomo um ingrediente funcional — os tabletes também podemconter um ou mais dentre: excipientes, como celulosemicrocristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato decálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina;desintegrantes, como amido (de preferência, amido de milho,de batata ou tapioca), amido glicolato de sódio,croscarmelose de sódio e determinados silicatos complexos;ligantes de granulação, como polivinilpirrolidona,hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose(HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes lubrificantes,como estearato de magnésio, ácido esteárico, glicerilbehenato e talco podem ser incluídos.

Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis parauso na preparação das formas incluem, por exemplo, água,soluções salinas, álcool, silicone, ceras, geléia depetróleo, óleos vegetais, polietileno glicóis, propilenoglicol, liposomas, açúcares, gelatina, lactose, amilose,estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silícico,parafina viscosa, óleo perfumado, monoglicerídeos ediglicerídeos de ácido graxo, ésteres de ácido graxopetroethral, hidroximetil-celulose, polivinilpirrolidona, eanálogos.

Excipientes preferidos para as formas incluem lactose,amido, uma celulose, lactose ou polietileno glicóis comalto peso molecular.

Para elixires e/ou suspensões aquosas, a composição dapresente invenção pode ser combinada com diversos agentesadoçantes ou aromatizantes, matéria corante ou corantes,com agentes emulsif icantes e/ou de suspensão e comdiluentes, como água, propileno glicol e glicerina, ecombinações dos mesmos.

As formas também podem incluir cápsulas de gelatina;cápsulas de fibras, tabletes de fibras etc.; ou aindabebidas de fibras.

Exemplos adicionais de forma compreendem, por exemplo,uma forma de um creme. Para alguns aspectos, omicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo pode serincluído em cremes farmacêuticos e/ou cosméticos, comocremes solares e/ou cremes para aplicação após exposição aosol, por exemplo.

Em um aspecto, a composição de acordo com a presenteinvenção pode ser administrada em um aerossol, por exemplo,como um spray nasal, por exemplo, para administração notrato respiratório.

Exemplos

A presente invenção será descrita agora, apenas atítulo de exemplo, podendo-se referir às figuras a seguir:

A figura 1 mostra o padrão de expressão gênica doPeptídio YY (PYY) em células Caco-2 tratadas com L.acidophilus. Os dados foram normalizados contra aquantidade de RNA. A diferença de dobra foi calculada comoem Livak e Schmittgen, 2001;

A figura 2 mostra o efeito de meio de culturacondicionado com L. acidophilus sobre a expressão de PYYem células Caco-2;

A figura 3 mostra a expressão gênica de PYY apósexposição a diferentes microorganismos apresentandopropriedades probióticas;

A figura 4 mostra o efeito de células bacterianas deL. acidophilus NCFM; micelas de lipídios simples e umacombinação dos mesmos sobre a expressão de PYY em célulasCaco-2 diferenciadas;

A figura 5 mostra os efeitos de metabólitos de L.acidophilus; micelas de lipídios complexas e uma combinaçãodos mesmos sobre a expressão de PYY em células Caco-2diferenciadas; eA figura 6 mostra o efeito de sobrenadante isento decélulas L. acidophilus NCFM e bactérias sobre a expressãode PYY; e

A figura 7 mostra o efeito de Z. curvatus 853 sobre aexpressão de PYY.

Exemplo 1

Para analisar o padrão de expressão gênica dopeptídio YY (TYY) em Caco-2 tratadas com L acidophilus.

Método:

A linha de células Caco-2 de carcinoma colônicohumano foi cultivada sobre insertos de cultura de célulassemiporosos e diferenciados de acordo com um protocolo dediferenciação de 5 dias usando-se meio de diferenciação(DM7 differentiation media) constituído de meio Entero-STIMsuplementado com extensor de meio MITO+ e não contendoantibióticos. A diferenciação foi monitorada usando-semedições de TER e medições de atividade de fosfatasealcalina.

As bactérias Lactobacillus acidophilus (cepa PTA-4797)foram cultivadas sobre meio MRS suplementado com 1 %(peso/vol) de glicose até a OD600 atingir de 0,6 a 0,7. 0tratamento com L. acidophilus foi adicionado no lado apicaldo inserto de cultura de células e incubado durante 24horas. 0 RNA foi isolado das células de acordo com oprotocolo fornecido com o kit RNeasy mini kit (Qiagen), e oc DNA sintetizado usando-se transcriptase reversaSuperscript III (Invitrogen). 0 padrão de expressão gênicafoi monitorado, seja usando o SYBR Green (AppliedBiosystems) com analisador genético ABI Prism 7000 GeneticAnalyzer com iniciadores específicos para peptídio YY dehomo sapiens. 0 iniciador "forward" foi: 5' GGA GGC CTC AGCTTG ACC 3' e o iniciador "reverse": 51 TGC GCA CGA ACA CCATAG 3'. O ciclo de limiar (Ct, threshold cycle) obtido, queé o ciclo de PCR em que a intensidade de f luorescênciacruza o valor de limiar de fundo, foi transformado em valorde expressão relativa usando-se o método de Livak et al.(2001).

Como um controle, células Caco-2 desenvolvidas Demaneira análoga sobre insertos de cultura de tecidos semtratamento com L. acidophilus.

Resultados:

Os resultados da atividade de fosfatase alcalina, etambém as medições de TER, indicam que as células forambem diferenciadas (dados não mostrados).

A análise de expressão gênica mostra a expressão dopeptídio YY (PYY) marcador de saciedade. A expressão dopeptidio YY (PYY) aumentou em 255 % quando comparada comcontrole quando as células CaCo-2 foram tratadas com L.acidophilus (p<0,05, ANOVA) (Figura 1).

O tratamento de células Caco-2 com L. acidophilusaumentou a expressão de um marcador de saciedade, peptídioYY. O resultado indica que o consumo de Lactobacillusacidophilus pode aumentar a saciedade pós-prandialmediante sinalização da saciedade no intestino.

Exemplo 2

Experimento in vitro que emula a refeição com glicose.

Experimento com células Caco-2 diferenciadas. Efeito demeio de cultura condicionado com L. acidophilus em célulastratadas com diversas quantidades de glicose.

As células Caco-2 foram cultivadas sobre insertossemiporosos de cultura de células, e diferenciadas deacordo com um protocolo de diferenciação de 5 dias usando-se meio de diferenciação (DM, differentiation media)constituído de meio Entero-STIM suplementado com extensorde soro MITO+ e não contendo antibióticos. A diferenciaçãofoi monitorada usando-se medições de TER e medição deatividade de fosfatase alcalina. No quarto dia doexperimento, o meio foi trocado por um meio não contendoglicose, de ambos os lados do inserto, e as células foramprivadas de glicose durante 24 h.

Os tratamentos das células Caco2 consistiram decélulas de controle, que foram tratadas no lado apical com0,5 mM, e 5 mM de meio contendo glicose, e células deteste, que foram tratadas no lado apical com 0,5 mM e 5 mMde meio contendo glicose, com a adição concomitante detratamento com L. acidophilus. Adicionalmente, incluiu-secélulas Caco-2 de controle sem qualquer adição de meiocontendo glicose no lado apical. Em todos os poçosadicionou-se 5 mM de glicose no lado basal. As célulasforam incubadas durante 24 h a 37°C, 5 % de CO2.

As bactérias de L. acidophilus foram cultivadas emmeio MRS não contendo açúcar até que a OD60O atingisse de0,6 a 0,7. As células foram centrifugadas e o meio decultura foi filtrado de forma estéril e usado nos meios deteste.

0 RNA foi isolado das células Caco2 de acordo com oprotocolo fornecido com o kit RNeasy mini kit (Qiagen), e ocDNA sintetizado usando transcriptase reversa SuperscriptIII (Invitrogen). 0 padrão de expressão gênica de PYY foimonitorado usando-se a química de sonda TaqMan (AppliedBiosystems) com analisador genético ABI Prism 7000 GeneticAnalyzer usando-se um conjunto de oligonucleotídeosreconhecendo especificamente o PYY de homo sapiens.Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador "forward":5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3', iniciador "reverse": 5' TGCGCA CGA ACA CCA TAG 31 , e uma sonda: sonda UniversalProbeLibrary n° 10 (Roche) . 0 ciclo de limiar (Ct,threshold cycle) obtido, que é o ciclo de PCR em que aintensidade fluorescência cruza o valor de limiar de fundo,foi transformado em valor quantitativo absoluto usando-seuma curva padrão de oligonucleotídeos sintéticosquantificados representando a seqüência anti-sentido datranscrição-alvo apresentando relação log-linear invertidaentre o número de cópias e o ciclo de PCR (Nurmi et al. ,2005 Nutrition & Câncer 51 (1) : 83-92) . A seqüência desteoligonucleotídeo padrão é: 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGATAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAG GCG AGG GAA GTCCCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGG CCT CC 3 ' .Resultados

Os resultados da atividade de fosfatase alcalina etambém as medições de TER indicam que as células foram bemdiferenciadas (dados não mostrados).

Os resultados são mostrados na Figura 2.

A adição de meio de cultura de L. acidophilus aumentoua expressão de PYY em 1,3-vez em amostras contendo 0,5 mMde glicose (p<0,05, AN0VA) e 2 vezes em amostras contendo 5mM de glicose (p<0,05) em comparação com o controlerespectivo com quantidade similar de glicose). 0 co-cultivode L. acidophilus em conjunto com células Caco-2 aumentoua expressão de PYY em 1,7 vez em amostras contendo 0,5 mMde glicose, e em 2 vezes em amostras contendo 5 mM deglicose, em comparação com as células de controlerespectivas com valores de glicose similares.

Exemplo 3Experimentos in vitro com outros probióticos.

As células Caco-2 foram cultivadas em insertossemiporosos de cultura de células e diferenciadas deacordo com um protocolo de diferenciação de 5 dias usando-se meio de diferenciação (DM, differentiation media)constituído de meio Entero-STIM suplementado com extensorde soro MITO+ e não contendo antibióticos. A diferenciaçãofoi monitorada usando-se medições de TER e medição deatividade de fosfatase alcalina.

Os tratamentos das células Caco2 consistiram decélulas de controle, que foram tratadas com meio decultura de Caco-2, e células de teste, que foram tratadascom meio de cultura probiótico em meio de cultura de Caco-2. Adicionalmente, incluiu-se células Caco-2 de controlecom adição de meio MRS diluído em meio de cultura de meiode cultura de Caco-2. Células foram incubadas durante 24horas a 37°C, 5 % de CO2.

As bactérias probióticas foram cultivadas em meio MRSsuplementado com 1 % (peso/vol) de glicose até que a OD60Oatingisse de 0,6 a 0,7. As células foram centrifugadas e omeio de cultura foi filtrado de forma estéril e usado nomeio de teste. As cepas probióticas testadas incluíram asseguintes cepas comercializadas: B. Iactis 420 (daDanisco), B. Iactis HN019 (nome comercial Howaru™ Bifido -Danisco A/S) e L. salivarius Ls-33 (da Danisco).

O RNA foi isolado das células Caco2 de acordo com oprotocolo fornecido com o kit RNeasy mini kit (Qiagen), e ocDNA sintetizado usando-se transcriptase reversa SuperscriptIII (Invitrogen) . O padrão de expressão gênica de PYY foimonitorado usando-se a química de sonda TaqMan (AppliedBiosystems) com analisador genético ABI Prism 7000 GeneticAnalyzer usando um conjunto de oligonucleotídeos quereconhece especificamente o PYY de Homo sapiens.

Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador "forward":5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3', iniciador "reverse": 5· TGCGCA CGA ACA CCA TAG 31 , e uma sonda: sonda UniversalProbeLibrary n° 10 (Roche) . 0 ciclo de limiar (Ct) obtido,que é o ciclo de PCR em que a intensidade de fluorescênciacruza o valor de limiar de fundo, foi transformado em valorquantitativo absoluto usando-se uma curva padrão deoligonucleotídeos sintéticos quantificados representando aseqüência anti-sentido da transcrição-alvo mostrandorelação Iog-linear invertida entre o número de cópias e ociclo de PCR (Nurmi et al., 2005 Nutrition & Câncer 51 (1):83-92.). A seqüência deste oligonucleotídeo padrão é: 5'TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGGAGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTCAAG CTG AGG CCT CC 3'.Resultados:

Os resultados são mostrados na Figura 3.

A adição de B. Iactis 420 e B. Lactis HNO 19 aumentoua expressão de PYY em 76 % e 68 %, respectivamente, emcomparação com o controle. 0 tratamento de L. salivarius 33aumentou a expressão de PYY em 67 % em comparação com ocontrole.

Portanto, outras bactérias que não L. acidophiluspodem apresentar o mesmo efeito indutor de saciedade.

Exemplo 4

Medição da sinalização da saciedade no sangue em ratos:

Neste estudo usou-se o rato como um modelo humano,embora existam algumas diferenças fisiológicas.Diferentemente do estômago humano, a parte proximal doestômago de rato é quase livre de suco gástrico, o quepermite que bactérias sobrevivam e fermentem o alimentoali. Isso pode causar diferenças na saciedade entre humanoe rato. Assim, o plasma de rato obtido usando-se oprotocolo abaixo será analisado quanto a sinaisneuroendocrinológicos provenientes do estômago (grelina,Ieptina), intestino (CCK, GLP-1, PYY, orexinas) oumetabólitos na circulação sangüínea (ácido acético,glicose) e suas respostas hormonais (insulina).

0 trato gastrintestinal é rico em células endócrinas eneuronais que sintetizam e secretam peptídiosincrementadores da saciedade, colecistocinina (CCK) epeptídio YY (PYY), na resposta aos estímulos intraluminaisassociados com ingestão de uma refeição. CCK iniberapidamente a ingestão de comida, e a duração de inibição érelativamente breve. Também se sabe que o ácido graxo decadeia curta produzido por micróbios do intestino induzsaciedade induzindo hormônio do intestino PYY. Probióticostambém podem causar diminuição do apetite, estimulandopeptídios grelina e orexina. A concentração plasmática dosmesmos atinge pico antes da refeição e diminui rapidamenteapós a mesma.

Assim, concentra-se a atenção sobre os níveisplasmáticos dos peptídios incrementadores da saciedade, CCKe PYY, e também peptídios estimuladores do apetite, grelinaou orexina, como um indicador de curto prazo do controle daingestão de comida após suplementação de probióticos. Alémdisso, a concentração plasmática de ácido acético seráanalisada para verificar o nível de produtos de fermentaçãono plasma.Ratos Wistar machos (HsdRddHanrWIST) pesando 248 g(desvio padrão de 12,1 g) no inicio dos experimentos foramalojados a 21°C, em um ciclo de luz/escuridão de 12 h, comlivre acesso a água potável. Durante o período deaclimatação (14 dias) o ciclo normal foi invertido, e ratosforam treinados para consumirem toda a sua comida (20g/dia), dentro do período de 5 horas desde o início dociclo de escuridão, às 08:00 horas. A dieta Formulab Diet5008 usada foi uma dieta de alta energia, alto teor deproteína, e contém carboidratos Digeríveis a 49,5 % efibra. Os ratos foram alocados randomicamente em doisgrupos de tratamento de 2 0 animais cada, e um grupo de 5ratos. Este último grupo foi anestesiado às 08:00 antes dereceberem comida, de forma a se proporcionar amostras desangue em jejum. Os grupos remanescentes foram: Bifido 420(IO10), NCFM (IO10), NCFMdO10) + lactitol (2 g) , lactitol (2g) sozinho e grupo de controle. 0 lactitol foi incluídoporque é sabido que aumenta a concentração circulante dePYY pós-prandialmente. Todos os itens de teste foramadministrados por meio de alimentação por tubo em um volumede 2,5 ml de água estéril/animal. O grupo de controlerecebeu água estéril sem qualquer suplemento, nas mesmascondições. Os animais receberam alimento padrão após adosagem. Cada grupo de teste foi dividido em cincosubgrupos e cada subgrupo, por sua vez, foi anestesiadopara coleta de sangue a 1, 5, 10 e 24 h após o início dociclo escuro. Ratos foram anestesiados com dióxido decarbono para coleta de sangue por meio de punção cardíaca.

Concentrações plasmáticas de PYY serão analisadas deacordo com Gee e Johnson (2 005) . Outros hormônios podem seranalisados, incluindo: GLP-I com ensaios rádio-imunológicos(RIAs) de acordo com Deacon et al (2002) Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 282:E873-E879, grelina com RIA, CCK deacordo com Paloheimo & Rehfeld (1995), a orexina de acordocom Heinonen et al (2005) , e ácido acético por meio deHPLC. Todas as amostras de sangue serão coletadas por meiode punção cardíaca em tubos de EDTA. As amostras foramcentrifugadas com 1.600 χ g a 4°C durante 15 minutos. Afração de plasma será removida e transferida para tubosfrescos e armazenada a -70°C até a análise.

Ensaios para monitorar a ingestão de comida em umarefeição:

Usou-se ratos Wistar machos como descrito acima. Usou-se dez ratos em cada grupo (grupos de ratos alimentados comdieta de controle e de teste).

Os ratos têm inicialmente dez dias de aclimataçãoantes do teste, após os quais o teste é iniciado e seestende por dez dias. Os ratos são divididos em cincogrupos, um grupo de controle e quatro grupos de teste. Emtodos os grupos os ratos são alimentados ad libitum comdieta de controle. O grupo de controle recebe soluçãosalina como gavagem uma vez por dia, e os grupos de testerecebem L. acidophilus em quantidade de 10^8 e 10^10 comogavagem uma vez por dia. De preferência, os ratos sãoalimentados durante o ciclo de escuridão.

A ingestão de comida e o ganho de peso são monitoradosapós cada ciclo de escuridão em cada rato.

Investigações preliminares sugerem que a adição demicroorganismos, e particularmente de cepas probióticas, nacomida de ratos diminui a ingestão de comida por partedestes ratos.Ensaio clínico: estudo de sinalização de saciedade pós-prandial em humanos

Foi possível conduzir um estudo-piloto com de 15 a 2 0voluntários (sujeitos humanos). Os sujeitos são seuspróprios controles (dois testes separados com bebida decontrole ou com bebida de teste).

Os sujeitos encontram-se, de preferência, em númeroigual de homens e mulheres saudáveis de média idade (índicede massa corporal BMI de aproximadamente 25).

Os sujeitos são submetidos a um jejum de um dia para ooutro.

Em seguida, eles recebem a bebida de teste(compreendendo uma ou mais das cepas de interesse reveladasna presente descrição), e a bebida de controle (sem ascepas de interesse).

Em seguida, coleta-se amostras de sangue venoso a 0, 2e 5 horas.

Os sujeitos precisam responder a um questionário pararelatar as sensações de fome e de saciedade queexperimentaram após terem ingerido a bebida de teste ou abebida de controle.

Em paralelo, mede-se as concentrações plasmáticas dePYY (Península Laboratories, San Carlos, CA, E.U.A.).

Exemplo 5

Experimento com células Caco-2 diferenciadas. Efeito demeio de cultura condicionado com L. acidophilus em célulastratadas com lipídios.

Este experimento é realizado para emular uma refeiçãocom ácidos graxos:

0 experimento foi realizado com células Caco-2 queforam diferenciadas de acordo com um protocolo de 5 dias(Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y.,Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002) J. Pharm Sci91, 669-79) . As células foram diferenciadas até aresistência elétrica transepitelial (TEER, transepithelialelectrical resistance) ultrapassar 200 ohm χ cm2. Asmicelas de lipídios complexas foram preparadas de acordocom (Chateau, D., Pauquai, T., Delers, F., Rousset, M.,Chambaz, J. & Demignot, S. (2005) J. Cell Physiol 202, 767-776) com ou sem 10 % de metabólitos de L. acidophilus NCFM.As células Caco-2 foram tratadas com as micelas de lipídiosdurante 3 horas após o que mediu-se a expressão de PYY dascélulas.

Materiais & métodos

Células Caco-2 (HTB-37, American Type CultureCollection, ATCC) foram mantidas a 37°C em atmosferaumidificada de 5 % de CO2 em meio de cultura basalconsistindo de Meio Eagle Modificado Dulbecco (DMEM,Invitrogen Carlsbad, CA, E.U.A.) suplementado com 20 % deFBS (Invitrogen), 2 mM de glutamina estável (Invitrogen), 1χ aminoácidos não-essenciais (Invitrogen), 20 U/ml depenicilina (Invitrogen), 20 yg/ml de estreptomicina(Invitrogen), e 0,5 ug/ml de anfotericina (Invitrogen).

As células Caco-2 foram usadas na passagem 2 6 eplaqueadas como 6,6xl05 células/cm2 em insertos de culturade células de 12 poços (BI0C0AT HTS, BD Biosciences, Le

Pont de Claix, França) e diferenciadas de acordo com umprotocolo de 5 dias (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki,Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002)J Pharm Sci 91, 669-79). Em resumo, após o plaqueamento, ascélulas foram incubadas de um dia para o outro a 370C ematmosfera umidificada de CO2 a 5 % em meio de cultura decélulas basais sem antibióticos após o qual o meio foiaspirado e substituído por meio de diferenciação (Entero-STIM, BD Biosciences), suplementado com extensor de soroMITO+ (BD Biosciences) 250 μ1/250 ml de meio. No 4o dia decultura, o meio foi substituído e, no 5o dia, conduziu-seo experimento com micelas de lipídios.

L. acidophilus NCFM (da Danisco Cultures, Paris,França) foi cultivado a 370C anaerobicamente em meio Man,Rogosa e Sharpe (MRS) suplementado com 1,0 % de glicose atéa OD600 atingir de 0,6 a 0,7. A densidade de célulasbacterianas foi determinada com citometria de fluxo(FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, E.U.A.) comodescrito previamente (Apajalahti, J. H., Kettunen, H.,Kettunen, A., Holben, W. E., Nurminen, P. H., Rautonen, N.& Mutanen, M. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68, 4986-4995). Os sobrenadantes isentos de células foram recolhidospor meio de centrifugação (25°C, 5 min, 3000 g) e removeu-se o sobrenadante. 0 sobrenadante isento de células de L.acidophilus NCFM (referido mais â frente como metabólitosde L. acidophilus NCFM) e também o controle de MRS foramdiluídos a 10 % (vol/vol) em meio de diferenciação, epreparou-se micelas de lipídios complexas no meioresultante (ver abaixo).

As micelas de lipídios complexas foram preparadas em24 mM de taurocolato (Sigma, St Louis, MO, E.U.A.) em meiode diferenciação. A composição de micelas complexas usadafoi de: 0,6 mM de ácido oléico - 2 mM de taurocolato - 0,2mM de 2-mono-oleilglicerol - 0,05 mM de colesterol - 0,2 mMde fosfatidilcolina. Preparou-se um mililitro de micelaspor meio de mistura de ácido oléico (6 μΐ de 100 mM deestoque) com outros lipídios (2 μΐ) em um tubo de vidroestéril. Os lipídios foram secados sob gás de nitrogênio àtemperatura ambiente e o resíduo foi dissolvido em 83 μΐ detaurocloato 24 mM em meio de diferenciação, e o volume foitrazido a 1 ml, seja com meio de diferenciação puro, commeio de diferenciação consistindo de 10 % (vol/vol) MRS, oucom meio de diferenciação consistindo de 10 % (vol/vol) demetabólitos de L. acidophilus NCFM.

As micelas de lipídios foram aplicadas no quinto diade diferenciação de Caco-2 no lado apical das células, eforam deixadas reagir com as células durante 3 horas. Comocontroles usou-se 10 % (vol/vol) de MRS e micelas delipídios complexas sem metabólitos de L. acidophilus NCFM.

Eles foram preparados em meio de diferenciação.

Após os tratamentos os meios de cultura de célulasforam aspirados e as células foram lisadas com 150 μΐ deRAl (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) suplementado com 1 %de β-mercaptoetanol (Sigma). O RNA dos lisados de célulasfoi recolhido com o kit de isolamento de RNA Nucleospin 96de acordo com instrução fornecida pelo fabricante(Macherey-Nagel). A síntese de cDNA de primeiro filamentofoi realizada com iniciadores randômicos usando SuperscriptIII de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).0 padrão de expressão de PYY nas amostras foi analisadousando-se o sistema de detecção de seqüências ABI PRISM(Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) usando-seoligonucleotídeos que detectam especificamente PYY de homosapiens.

Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador "forward":5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; iniciador "reverse": 5' TGCGCA CGA ACA CCA TAG 3'; e a sonda: sonda UniversalProbeLibrary n° 10 (Roche). 0 ciclo de limiar (Ct) obtido,que é o ciclo de PCR em que a intensidade de fluorescênciacruza um valor de limiar de fundo, foi transformado emvalor quantitativo absoluto por meio do uso de uma curvapadrão de oligonucleotideos sintéticos quantificadosrepresentando a seqüência anti-sentido da transcrição-alvoapresentando relação Iog-linear invertida entre o número decópias e o ciclo de PCR (Nurmi, J. T., Puolakkainen, P. A.& Rautonen, Ν. E. (2005) Nutr Câncer 51, 83-92). Aseqüência deste oligonucleotídeo padrão é: 5' TGC GCA CGAACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGG TGG AAGGCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAG CTG AGGCCT CC 31.

A análise estatística foi realizada com o teste t deStudent.

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 5.

A expressão do peptídio YY (PYY) marcador de saciedadeaumentou quando células Caco-2 foram tratadas ou commetabólitos de L. acidophilus NCFM sozinhos ou combinadoscom as micelas de lipídios complexas.

No experimento com micelas de lipídios complexas(constituídas de 0,6 mM de ácido oléico, 2 mM de 2-mono-oleilglicerol, 0,2 mM de colesterol e 0,05 mM de L-a-fosfatidilcolina), o meio MRS combinado com a mistura demicela de lipídio complexa não induziu a expressão de PYYquando comparada com o tratamento com micelas de lipídioscomplexas apenas.

Os metabólitos de L. acidophilus NCFM aumentaram aexpressão de PYY em comparação com os controles (p<0,05quando comparado com micelas de lipídios complexas apenas,e p=0,05 quando comparado com MRS a 10 % apenas).Quando as micelas de lipídios complexas foramcombinadas com os metabólitos de L. acidophilus NCFM a 10% isto aumentou adicionalmente a expressão de PYY (p<0,05quando comparado com tratamento com micelas de lipídioscomplexas ou com tratamento com MRS a 10 %).

Exemplo 6

Efeito de células bacterianas de L. acidophilus NCFM sobrecélulas Caco-2 diferenciadas tratadas com lipídios.

0 experimento foi realizado com células Caco-2 queforam diferenciadas de acordo com um protocolo de 5 dias(Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki, Y.,Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci91, 669-79) . As células foram diferenciadas até que aresistência elétrica transepitelial (TEER) ultrapassasse200 ohm χ cm2. As micelas de lipídios complexas forampreparadas de acordo com (Chateau, D., Pauquai, T., Delers,F., Rousset, M., Chambaz, J. & Demignot, S. (2005) J. CellPhysiol 202, 767-776), com ou sem células bacterianas deL. acidophilus NCFM em uma relação de 50 célulasbacterianas para uma célula Caco-2. As células Caco-2 foramtratadas com as micelas de lipídios durante 3 horas após oque a expressão de PYY foi medida das células.

Materiais & métodos

Células Caco-2 (HTB-37, American Type CultureCollection7 ATCC) foram mantidas a 37°C em atmosferaumidificada de CO2 a 5 % em meio de cultura basalconsistindo de Meio Eagle Modificado Dulbecco (DMEM,Invitrogen Carlsbad, CA, E.U.A.) suplementado com 20 % deFBS (Invitrogen), 2 mM de glutamina estável (Invitrogen), 1χ aminoácidos não-essenciais (Invitrogen), 20 U/ml depenicilina (Invitrogen) , 20 yg/ml de estreptomicina(Invitrogen), e 0,5 yg/ml de anfotericina (Invitrogen).

As células Caco-2 foram usadas na passagem 26 eplaqueadas como 6,6xl05 células/cm2 em insertos de culturade células de 12 poços (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, LePont de Claix, França) e diferenciadas de acordo com umprotocolo de 5 dias (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki,Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002)J Pharm Sci 91, 669-79). Em resumo, após o plaqueamento, ascélulas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C ematmosfera umidifiçada de CO2 a 5 %, em meio de cultura decélulas basais, sem antibióticos após o qual o meio foiaspirado e substituído por meio de diferenciação (Entero-STIM, BD Biosciences), suplementado com extensor de soroMITO+ (BD Biosciences) 250 μ1/250 ml de meio. No 4o dia decultura, o meio foi substituído, e no 5o dia realizou-se oexperimento com micelas de lipídios.

L. acidophilus NCFM (from Danisco Cultures, Paris,França) foi cultivado a 37°C anaerobicamente em meio deMan, Rogosa e Sharpe (MRS) suplementado com 1,0 %(peso/volume) de glicose até a OD600 atingir de 0,6 a 0,7. Adensidae de células bacterianas foi determinada comcitometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, SanJose, CA, E.U.A.) como descrito previamente (Apajalahti, J.H., Kettunen, H., Kettunen, A., Holben, W. E., Nurminen, P.H., Rautonen, N. & Mutanen, M. (2002) Appl. Environ.Microbiol. 68, 4986-4995). As células bacterianas foramrecolhidas por meio de centrifugação (25°C, 5 min, 3000 g)e removeu-se o sobrenadante. As células bacterianas de L.acidophilus NCFM foram lavadas uma vez com meio dediferenciação e preparou-se micelas de lipidios simples comas bactérias (ver abaixo).

As micelas de lipidios simples foram preparadas emtaurocolato 24 mM (Sigma, St Louis, MO, E.U.A.) em meio dediferenciação. A composição de micelas simples foi de: 0,6mM de ácido oléico - 2 mM de taurocolato. Preparou-se ummililitro de micelas de ácido oléico (6 μl de 100 mM deestoque) em um tubo de vidro estéril. O ácido oléico foisecado sob gás de nitrogênio à temperatura ambiente e oresíduo foi dissolvido em 83 μΐ de taurocolato 24 mM emmeio de diferenciação e o volume foi trazido a 1 ml commeio de diferenciação puro, com meio de diferenciaçãoconsistindo de 10 % (vol/vol) de MRS, ou com meio dediferenciação consistindo de células bacterianas de L.acidophilus NCFM numa relação de 50 células bacterianaspara uma célula Caco-2.

As micelas de lipidios foram aplicadas no quinto diade diferenciação de Caco-2 no lado apical das células, eforam deixadas reagir com as células durante 3 horas. Comocontroles usou-se 10 % (vol/vol) de meio MRS e micelas delipidios simples sem células bacterianas L. acidophilusNCFM. Elas foram preparadas em meio de diferenciação.

Após os tratamentos, os meios de cultura de célulasforam aspirados e as células foram lisadas com 150 μl deRAl (Macherey-Nagel, Dúren, Alemanha) suplementados com 1 %de β-mercaptoetanol (Sigma) . O RNA dos lisados de célulasfoi recolhido com o kit de isolamento de RNA Nucleospin 96de acordo com instrucional fornecida pelo fabricante(Macherey-Nagel). A síntese de cDNA de primeiro filamentofoi realizada com iniciadores randômicos usando SuperscriptIII de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante(Invitrogen). 0 padrão de expressão de PYY nas amostrasfoi analisado empregando-se o sistema de detecção deseqüências ABI PRISM Sequence Detection System (AppliedBiosystemsi Foster City, CA, E.U.A.) usando-seoligonucleotídeos que detectam especificamente PYY de homosapiens. Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador"forward": 5* GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3·; iniciador"reverse": 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; e a sonda: sondaUniversal ProbeLibrary n° 10 (Roche). O ciclo de limiar(Ct) obtido, que é o ciclo de PCR em que a intensidade defluorescência cruza o valor de limiar de fundo, foitransformado em valor quantitativo absoluto por meio do usode uma curva padrão de oligonucleotídeos sintéticosquantificados representando a seqüência anti-sentido datranscrição-alvo apresentando relação Iog-linear invertidaentre o número de cópias e o ciclo de PCR (Nurmi, J. T.,Puolakkainen, P. A. & Rautonen, Ν. E. (2005) Nutr Câncer51, 83-92).

A seqüência deste oligonucleotídeo padrão é: 51 TGCGCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGG AGGTGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTC AAGCTG AGG CCT CC 31.

A análise estatística foi realizada com teste t deStudent.

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 4.

A expressão do peptídio YY (PYY) marcador de saciedadeaumentou quando células Caco-2 foram tratadas com célulasbacterianas de L. acidophilus NCFM sozinhas ou combinadascom as micelas de lipídios simples.No experimento com micelas de lipídios simplesconstituídas de 0,6 mM de ácido oléico em 2 mM detaurocolato, o meio MRS combinado com a mistura de micelasde lipídios simples não induziu a expressão de PYY quandocomparado com o tratamento com micelas de lipídios apenas.As células bacterianas de L. acidophilus NCFM aumentaram aexpressão de PYY em comparação com os controles (p<0,05quando comparado com micelas de lipídios apenas, e quandocomparado com 10 % de MRS apenas) . Quando as micelas delipídios foram combinadas com as células bacterianas de L.acidophilus NCFM numa relação de 5 0 células bacterianaspara uma célula Caco-2, a expressão de PYY foi induzida demaneira similar, embora a elevada variação tenha causadouma diminuição da significância estatística (p=0,08 quandocomparado com tratamento com micelas de lipídioscomplexas).

Exemplo 7

Efeito de L. acidophilus NCFM sobre a expressão de PYY(série temporal)

Esboço do ensaio

O experimento foi realizado com células Caco-2 queforam diferenciadas de acordo com um protocolo de 5 dias(Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki7 Y.,Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci91, 669-79) . As células foram diferenciadas até que aresistência elétrica transepitelial (TEER) superasse 200ohm χ cm2. As células foram tratadas com célulasbacterianas (50 micróbios: uma célula Caco-2) ou com 0,1 %(vol/vol), 1 % (vol/vol), e 10 % (vol/vol) de sobrenadanteisento de células diluído em meio de cultura de Caco-2. Asamostras para estudos de expressão de PYY foram coletadasme dois momentos diferentes, a 3 h e 24 h, após aadministração das substâncias de teste.

Materiais & métodos

Células Caco-2 (HTB-37, American Type CultureCollection, ATCC) foram mantidas a 370C em atmosferaumidicada de CO2 a 5 % em meio de cultura basal consistindode Meio Eagle Modificado Dulbecco (DMEM, InvitrogenCarlsbad, CA, E.U.A.) suplementado com 20 % de FBS(Invitrogen), 2 mM de glutamina estável (Invitrogen), 1 χde aminoácidos não-essenciais (Invitrogen) , 20 U/ml depenicilina (Invitrogen), 20 pg/ml de estreptomicina(Invitrogen), e 0,5 μg/ml de anfotericina (Invitrogen).

As células Caco-2 foram usadas na passagem 58 eplaqueãdas como 6,6xl05 células/cm2 em insertos de culturade células de 12 poços (BIOCOAT HTS, BD Biosciences, LePont de Claix, França) e diferenciadas de acordo com umprotocolo de 5 dias (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki,Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002)J Pharm Sci 91, 669-79). Em resumo, após o plaqueamento, ascélulas foram incubadas de um dia para o outro a 370C ematmosfera umidifiçada de CO2 a 5 %, em meio de cultura decélulas basal, sem antibióticos, após o que o meio foiaspirado e substituído por meio de diferenciação (Entero-STIM [BD Biosciences] suplementado com extensor de soroMITO+ [BD Biosciences], 250 μ1/250 ml de meio). No 4o diade cultura, o meio foi substituído e, no 5o dia, realizou-se o experimento com bactérias e também com sobrenadanteisento de células.

L. acidophilus NCFM (Danisco Cultures, Paris, França)foi cultivado fresco em condições anaeróbicas a 37°C emmeio de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) suplementado com 1,0 %de glicose (peso/volume) até a OD600 atingir de 1,0 a 1,5. 0sobrenadante isento de células foi recolhido por meio decentrifugação (25°C, 5 min, 3000 g) e removido, e diluído a0,1 % (vol/vol), 1 % (vol/vol) e 10 % (vol/vol) em meio dediferenciação, e filtrado através de unidades de filtraçãocom seringa de 0,2 μπι (Sartorius, Goettingen, Alemanha). Adensidade de células bacterianas foi estimada com base novalor da OD, e elas foram lavadas uma vez com EnteroStim eressuspensas em EnteroStim numa relação de 50 célulasbacterianas para uma célula Caco-2. As substâncias deteste foram aplicadas no lado apical das células Caco-2.

Após os tratamentos os meios de cultura de célulasforam aspirados e as células foram lisadas com 150 μΐ deRAl (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) suplementado com 1 %de B -mercaptoetanol (Sigma). As amostras para análise deexpressão de PYY de amostras de L. acidophilus NCFM foramcoletadas após 3 h e 24 h de incubação. 0 RNA dos lisadosde células foi recolhido com o kit de isolamento de RNANucleospin 96 de acordo com instrucional fornecida pelofabricante (Macherey-Nagel). A sintes de cDNA de primeirofilamento foi realizada com iniciadores randômicos usandoSuperscript III de acordo com as instruções fornecidas pelofabricante (Invitrogen) . 0 padrão de expressão de PYY nasamostras foi analisado empregando o sistema de detecção deseqüências ABI PRISM Sequence Detection System (Applied

Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) usandooligonucleotídeos que detectam especificamente PYY de homosapiens. Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador"forward" : 5' GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; iniciador"reverse": 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; e a sonda: sondaUniversal ProbeLibrary n° 10 (Roche). 0 ciclo de limiar(Ct) obtido, que é o ciclo de PCR em que a intensidade defluorescência cruza um valor de limiar de fundo, foitransformado em valor quantitativo absoluto com o empregode uma curva padrão de oligonucleotídeos sintéticosquantificados representando a seqüência anti-sentido datranscrição-alvo apresentando relação log-linear invertidaentre o número de cópias e o ciclo de PCR (Nurrni, J. T.,Puolakkainen, P. A. & Rautonen, Ν. E. (2 005) Nutr Câncer51, 83-92). A seqüência deste oligonucleotídeo padrão é: 5'TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGGAGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTCAAG CTG AGG CCT CC 3'.

A análise estatística foi realizada com ANOVA.

Resultados

A figura 6 mostra o efeito de sobrenadante isento de

células de L. acidophilus NCFM e bactérias sobre aexpressão de PYY. Usou-se três diluições diferentes desobrenadante isento de células 0,1 (vol/vol), 1 % de(vol/vol) , e 10 % (vol/vol) . As amostras para estudo deexpressão de PYY foram coletadas 3 e 24 horas após aaplicação da substância de teste. * p<0,05 em comparaçãocom o controle de Enterostim (meio) ; LA NCFM bact =bactéria L. acidophilus NCFM

Células bacterianas de L. acidophilus NCFM aumentarama expressão de PYY em ambos os momentos, 3 h e 24 h após aaplicação das bactérias.

O sobrenadante isento de células aumentou a expressãode PYY como diluição a 10 % após 3 h de incubação.

A dose e também o tempo do tratamento afetam aexpressão de PYY. As células bacterianas, particularmentecélulas bacterianas viáveis, podem exercer um efeito maissustentável sobre a expressão de PYY do que osmetabólitos.

Exemplo 8

Efeito de células bacterianas de L. curvatus 853 sobre aexpressão de PYY

O experimento foi realizado com células Caco-2 queforam diferenciadas de acordo com um protocolo de 5 dias(Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki, Y., Taki7 Y.,Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002) J Pharm Sci91, 669-79) . As células foram diferenciadas até que aresistência elétrica transepitelial (TEER) superasse 200ohm χ cm2. As células foram tratadas com célulasbacterianas de L. curvatus 853 (50 micróbios: uma célulaCaco-2. As amostras para análise de expressão gênica foramcoletadas após 4 horas de tratamento.

Materiais & métodos

Células Caco-2 (HTB-37, American Type CultureCollection, ATCC) foram mantidas a 37°C em atmosferaumidificada de CO2 a 5 % em meio de cultura basalconsistindo de Meio Eagle Modificado Dulbecco (DMEM,Invitrogen Carlsbad, CA, E.U.A.) suplementado com 20 % deFBS (Invitrogen), 2 mM de glutamina estável (Invitrogen), 1χ de aminoácidos não-essenciais (Invitrogen) , 20 U/ml depenicilina (Invitrogen) , 20 μς/ιηΐ de estreptomicina(Invitrogen), e 0,5 ug/ml de anfotericina (Invitrogen).

As células Caco-2 foram usadas na passagem 58 eplaqueadas como 6,6xl05 células/cm2 em insertos de culturade células de 12 poços (BI0C0AT HTS, BD Biosciences, LePont de Claix, França) e diferenciadas de acordo com umprotocolo de 5 dias (Yamashita, S., Konishi, K., Yamazaki,Y., Taki, Y., Sakane, T., Sezaki, H. & Furuyama, Y. (2002)J Pharm Sci 91, 669-79). Em resumo, após o plaqueamento, ascélulas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C ematmosfera umidifiçada de CO2 a 5 %, em meio de cultura decélulas basal, sem antibióticos, após o que o meio foiaspirado e substituído por meio de diferenciação (Entero-STIM [BD Biosciences] suplementado com extensor de meioMITO+ [BD Biosciences]. 250 μ1/250 ml de meio). No 4o diade cultura, o meio foi substituído e, no 5o dia, realizou-se o experimento com células bacterianas.

L. curvatus 853 foi cultivada fresca em condiçõesanaeróbicas a 3 7 0C em meio Man, Rogosa e Sharpe (MRS)suplementado com 1,0 % de glicose até a OD600 atingir de 1,0a 1,5. 0 sobrenadante isento de células foi coletado pormeio de centrifugação (25°C, 5 min, 3000 g) e removido. Adensidade de células bacterianas foi estimada com base novalor de OD, e elas foram lavadas uma vez com EnteroStim,diluídas e aplicadas no lado apical das células Caco-2.

Após o tratamento de 4 horas, os meios de cultura decélulas foram aspirados e as células foram lisadas com 150μΐ de RAl (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) suplementadocom 1 % de β-mercaptoetanol (Sigma). 0 RNA dos lisados decélulas foi coletado com o kit de isolamento de RNANucleospin 96 de acordo com instrucional fornecida pelofabricante (Macherey-Nagel). A síntese de cDNA de primeirofilamento foi realizada com iniciadores randômicos usandoSuperscript III de acordo com as instruções fornecidas pelofabricante (Invitrogen). 0 padrão de expressão de PYY nasamostras foi analisado empregando o sistema de detecção deseqüências ABI PRISM Sequence Detection System (AppliedBiosystems, Foster City, CA, E.U.A.) usandooligonucleotídeos que detectam especificamente PYY de homosapiens. Os oligonucleotídeos incluíram: iniciador"forward" : 5* GGA GGC CTC AGC TTG ACC 3'; iniciador"reverse": 5' TGC GCA CGA ACA CCA TAG 3'; e a sonda: sondaUniversal ProbeLibrary n° 10 (Roche). 0 ciclo de limiar(Ct) obtido, que é o ciclo de PCR em que a intensidade defluorescência cruza o valor de limiar de fundo, foitransformado em valor quantitativo absoluto com o uso deuma curva padrão de oligonucleotídeos sintéticosquantificados representando a seqüência anti-sentido datranscrição-alvo apresentando relação log-linear invertidaentre o número de cópias e o ciclo de PCR (Nurmi, J. T.,Puolakkainen, P. A. & Rautonen, Ν. E. (2005) Nutr Câncer51, 83-92). A seqüência deste oligonucleotídeo padrão é: 51TGC GCA CGA ACA CCA TAG CGA TAG CTT GTG AAG CAG ACG AGC AGGAGG TGG AAG GCG AGG GAA GTC CCA AGG GCT GCA CTG CCG CAG GTCAAG CTG AGG CCT CC 3'.

A análise estatística foi realizada com ANOVA.Resultados

A figura 7 mostra o efeito de L. curvatus 853 sobre aexpressão de PYY. As amostras para estudo da expressão dePYY foram coletadas 4 horas após a aplicação da substânciade teste. * p<0,05 em comparação com controle constituídode meio apenas.

Células bacterianas de L. curvatus 853 aumentaram aexpressão de PYY após 4 horas de incubação.

Todas as publicações mencionadas na descrição acimasão incorporadas aqui por referência. Diversasmodificações e variações dos métodos e sistema descritos dapresente invenção tornar-se-ão aparentes para aqueles comprática na arte sem se afastarem do escopo e espírito dapresente invenção. Embora a presente invenção tenha sidodescrita em conexão com modalidades específicas preferidas,deve-se compreender que a invenção como reivindicada nãodeve limitar-se indevidamente a referidas modalidadesespecíficas. Efetivamente, diversas modificações dos modosdescritos para a realização da invenção, que são óbviaspara aqueles versados nos campos da bioquímica ebiotecnologia ou campos relacionados, devem sercompreendidas pelo escopo das reivindicações a seguir.

Referências

Livak KJ, e Schmittgen TD (2001) "Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2(-Delta Delta C(T)) Method" [Análise de dados deexpressão gênica relativos usando PCR quantitativa emtempo real e o método 2(-Delta Delta C(T))]. Methods,25(4): 402- 8.

Yamashita S, Konishi K, Yamazaki Y, Taki Y, Sakane T,Sezani H, Furuyama Y (2002) "New and better protocols for ashort-term Caco-2 cell culture system" [Protocolos novos emelhores para um sistema de cultura de células Caco-2 decurto prazo]. J Pharm Sci 91(3): 669-679.<table>table see original document page 79</column></row><table>

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONALDO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA EFEITOS DE PROCEDIMENTOEM MATÉRIA DE PATENTES

Formulário internacional

RECIBO NO CASO DE UM DEPOSITO ORIGINAL EXPEDIDO DE ACORDOCOM A REGRA 7.3 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE DE ACORDO COM AREGRA 10.

para: (nome e endereço do depositante ou advogado)

Rhodia Inc.

Advogado: Gregory Leyer

2802 Walton Commons West

Madison, WI 53718

Depositado em favor de: Rhodia Chimie, França

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Os depósitos foram acompanhados de: uma descriçãocientífica, uma descrição taxonômica proposta indicadaacima. Os depósitos foram recebidos em 15 de novembro de2002 por esta Autoridade Depositária Internacional e foramaceitos.

A SEU PEDIDO: Nós lhe informaremos sobrerequisições para as cepas durante 30 anos.

As cepas serão disponibilizadas se um departamento depatentes signatário do Tratado de Budapeste certificar odireito de alguém receber, ou se uma Patente dos E.U.A. forexpedida citando as cepas, e se a ATCC for instruída peloDepartamento de Marcas e Patentes dos Estados Unidos, oupelo depositante, a liberar referidas cepas.

Se as culturas morrerem ou forem destruídas durante otermo efetivo do depósito, deverá ser sua responsabilidadesubstituí-las por culturas vivas dos mesmos.

As cepas serão preservadas durante um período de pelomenos 30 anos desde a data de depósito, ou por cinco anosdepois do último pedido de amostra, o que for maior. OsEstados Unidos e muitos outros países são signatários doTratado de Budapeste.

A viabilidade das culturas citadas acima foi testadaem 25 de novembro de 2002. Naquela data as culturas eramviáveis.

Autoridade Depositária Internacional: American TypeCulture Collection, Manassas, VA 20110-2209 E.U.A..Assinatura da pessoa com autoridade para representar aATCC:

[assinatura]

Marie Harris; Especialista de Patentes; Depositária dePatentes ATCC

Data: 3 de janeiro de 2003

cc: Laure Berruet

Claims

1. Uso de pelo menos uma cepa de um microorganismoe/ou um metabólito do mesmo caracterizado pelo fato de queé na fabricação de um suporte para administração a umsujeito para modular a sinalização da saciedade.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1 caracterizadopelo fato de que o microorganismo e/ou um metabólito domesmo modula um ou mais marcadores de saciedade.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2 caracterizadopelo fato de que a modulação ocorre pós-prandialmente.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoe/ou um metabólito do mesmo modula um ou mais dosmarcadores de saciedade selecionados do grupo que consistede: PYY, CCK, Grelina, Leptina, GLP-1, orexinas,neuropeptídio hipotalâmico orexigênico Y, ácido acético,mialina e oxintomodulina.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4 caracterizadopelo fato de que o nível de um ou mais dos seguintesmarcadores de saciedade é aumentado no plasma e/ou nointestino: PYY, CCK, GLP-I, leptina (no sangue periférico),insulina e ácido acético.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 caracterizadopelo fato de que o nível de um ou mais dos seguintesmarcadores de saciedade é diminuído: grelina, orexinas eleptina (no cérebro).

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o suporte é umsuporte farmaceuticamente aceitável ou um produtoalimentício.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o uso é um usocosmético e o suporte é administrado a um sujeito não-obeso.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o suporte é ummedicamento.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que a pelo menos umacepa de um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo éadministrada ao sujeito para o tratamento e/ou prevenção deexcesso de peso e/ou de uma doença causada por excesso depeso.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que a pelo menos umacepa de um microorganismo e/ou um metabólito do mesmo éadministrada ao sujeito para o tratamento e/ou prevenção deobesidade e/ou de uma doença causada por obesidade.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoé um microorganismo probiótico.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoé uma bactéria de ácido láctico.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoé uma bactéria de ácido láctico probiótica.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoé uma cepa de Lactobacillus spp.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoé uma cepa de Lactobacillus acidophilus.

17. Uso de acordo com a reivindicação 10 caracterizadopelo fato de que o microorganismo é a cepa PTA-4797 deLactobacillus acidophilus.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoe/ou um metabólito do mesmo é usado em combinação com um oumais lipídios e/ou uma ou mais micelas de lipidios.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que o microorganismoe/ou metabólito do mesmo é usado em combinação com umprebiótico.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que o prebiótico é um ou mais dos seguintes:inulina, um transgalacto-oligossacarídeo, palantinose-oligossacarideo, oligossacarideo de soja, gentio-oligossacarideo, oxilo-oligômeros, amido não-degradável,lactossacarose, lactulose, lactitol, maltitol, oupolidextrose.

21. Uso de pelo menos uma cepa de um microorganismoe/ou um metabólito do mesmo caracterizado pelo fato de queé na fabricação de um suporte para administração a umsujeito para induzir saciedade.

22. Método de modular sinalização da saciedade em umsujeito caracterizado pelo fato de que referido métodocompreende administrar ao sujeito uma quantidade efetivade pelo menos uma cepa de um microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo.

23. Método de acordo com a reivindicação 22caracterizado pelo fato de que o microorganismo e/ou ummetabólito do mesmo modula um ou mais marcadores desaciedade.

24. Método de acordo com a reivindicação 22 oureivindicação 22 caracterizado pelo fato de que a modulaçãoocorre pós-prandialmente.

25. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 24 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo e/ou um metabólito do mesmo modula um oumais dos marcadores de saciedade selecionados do grupo queconsiste de: PYY, CCK, Grelina, Leptina, GLP-1, orexinas,neuropeptídio hipotalâmico orexigênico Y, ácido acético,mialina e oxintomodulina.

26. Método de acordo com a reivindicação 25caracterizado pelo fato de que o nível de um ou mais dosseguintes marcadores de saciedade é aumentado no plasmae/ou intestino: PYY, CCK, GLP-1, leptina (no sangueperiférico), insulina e ácido acético.

27. Método de acordo com a reivindicação 25caracterizado pelo fato de que o nível de um ou mais dosseguintes marcadores de saciedade é diminuído: grelina,orexinas e leptina (no cérebro).

28. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 27 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo é incorporado em um suporte.

29. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 28 caracterizado pelo fato de que osuporte é um suporte farmaceuticamente aceitável ou umproduto alimentício.

30. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 29 caracterizado pelo fato de que ométodo é um método cosmético de reduzir excesso de peso emum sujeito não-obeso.

31. Método de acordo com a reivindicação 29 oureivindicação 30 caracterizado pelo fato de que o suporte éum medicamento.

32. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 31 caracterizado pelo fato de que ométodo é um método de tratar e/ou prevenir excesso de pesoe/ou uma doença causada por excesso de peso.

33. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 32 caracterizado pelo fato de que ométodo é um método de tratar e/ou prevenir obesidade e/ouuma doença causada por obesidade.

34. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 33 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo é um microorganismo probiótico.

35. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 34 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo é uma bactéria de ácido láctico.

36. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 35 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo é uma bactéria de ácido láctico probiótica.

37. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 36 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo é uma cepa de Lactobacillus acidophilus.

38. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 22 a 37 caracterizado pelo fato de que omicroorganismo e/ou metabólito do mesmo é administrado emcombinação com um prebiótico.

39. Método de acordo com a reivindicação 38caracterizado pelo fato de que o prebiótico é um ou maisdos seguintes: inulina, um transgalacto-oligossacarídeo,palantinose-oligossacarídeo, oligossacarídeo de soja,gentio-oligossacarideo, oxilo-oligômeros, amido não-degradável, lactossacarose, lactulose, lactitol, maltitol,ou polidextrose.

40. Um método para selecionar um microorganismo e/ouum metabólito do mesmo para preparar um suporte paraadministração a um sujeito para induzir saciedade e/outratar excesso de peso, incluindo obesidade, caracterizadopelo fato de que o método compreende as etapas de:-1) colocar um microorganismo e/ou um metabólito domesmo em contato com pelo menos uma célula epitelial,-2) detectar a expressão de um marcador de saciedade empelo menos uma célula epitelial.

41. Método caracterizado pelo fato de que é comodescrito geralmente acima com referência ã descrição edesenhos.

42. Uso caracterizado pelo fato de que é como descritogeralmente acima com referência à descrição e desenhos.