BRPI0706420A2

BRPI0706420A2 - ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos

Info

Publication number: BRPI0706420A2
Application number: BRPI0706420-9A
Authority: BR
Inventors: John Kunich; Cheng Liu
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2011-03-29
Also published as: PL1977241T3; WO2007082138A2; AU2007204777B2; EP1977241B1; HK1116253A1; DE602007008357D1; JP2009522583A; EP2246700A1; IL192546A; RU2409816C2; US20090155821A1; RU2008131931A; KR20080085080A; MX2008008700A; ES2349885T3; CA2636183A1; PT1977241E; EP1977241A2; IL192546A0; CN101395471A

Abstract

ENSAIO DE CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPOS. A presente invenção descreve métodos para detectar citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Os métodos são sem marcação, e podem ser realizados em tempo real em células aderentes. Os métodos podem incluir, por exemplo, (a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de ensaio; e (b) adicionar células efetuadoras e um anti- corpo que se liga às células-alvo ao meio de ensaio; em que qualquer diminuição na impedância entre os eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa de função de ADCC que foi efetu- ada no meio de ensaio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO DE CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provi-sório dos Estados Unidos N0 de Série 60/756.301, depositado em 04 de ja-neiro de 2006.

CAMPO TÉCNICO

O presente pedido refere-se a métodos de ensaio de citotoxici-dade celular dependente de anticorpos (ADCC) e, em algumas modalidades,refere-se a métodos que permitem que ADCC seja ensaiado em tempo realsem a necessidade de células marcadas.

ANTECEDENTE

ADCC é um componente da resposta imune em que anticorposde IgG ligam-se a antígenos na superfície de células-alvo patogênicas outumorigênicas, as quais identificam-os em relação à destruição por meio decélulas NK efetuadoras. Células efetuadoras transportando o receptor Fcgama (FcyR) reconhecem e ligam a região Fc dos anticorpos ligados à célu-la-alvo. Os anticorpos desse modo conferem especificidade à morte de célu-las-alvo, a qual é mediada por células efetuadoras que formam uma ponteentre os dois tipos celulares e, subseqüentemente liberando grânulos líticos.

Alguns anticorpos terapêuticos obtêm suas atividades biológicaspromovendo ADCC. Por exemplo, Herceptin®, um anticorpo humanizadousado para tratamento de câncer de mama, promove ADCC por meio deligação a antígeno HER-2 na superfície de células cancerosas. Da mesmamaneira, Rituxan®, um anticorpo quimérico usado para tratamento de Iinfo-ma não-Hodgkin, promove ADÇC por meio de ligação a antígenos CD20 nasuperfície de células de linfoma.

Tecnologias para determinar se um anticorpo induz ADCC tipi-camente envolve marcação de células-alvo com um material radioativo, talcomo Cr51, ou um corante fluorescente, tal como Calceína AM. As célulasmarcadas são incubadas com o anticorpo e células efetuadoras tais comocélulas NK ou PBMCs, e morte das células-alvo por meio de ADCC-(Anti-body-Dependent Cellular Cytotoxicity-Citotoxicidade Celular Dependente deAnticorpos) é detectada pela liberação de radioatividade ou fluorescência. Amarcação de células-alvo nesses ensaios exige desprendimento de célulasaderentes para marcação. Após marcação, o ensaio é realizado com as cé-lulas-alvo em suspensão, a qual não é um estado normal de células aderen-tes. Além disso, o grau de morte celular mediado por ADCC geralmente édeterminado em apenas um ponto de tempo, diversas horas após a misturadas células-alvo com células efetuadoras e o anticorpo. Desenvolveu-se umensaio sem marcação, no qual morte celular é determinada medindo Iibera-ção de Iactato desidrogenase (LDH) do citoplasma de células Iisadas no so-brenadante sem células. Contudo, o método LDH não é um ensaio em tem-po real, e não se distingue entre morte de células-alvo e morte de célulasefetuadoras uma vez que ambos os tipos de células liberarão LDH em lise.

Em vista do número de produtos terapêuticos de anticorpos queestão agora no mercado ou em desenvolvimento, há uma necessidade deensaios in vitro permitir que a atividade ADCC de anticorpos seja determina-da. Em particular, há uma necessidade de um ensaio de ADCC em alta es-cala, sem marcação que permite que ADCC seja monitorado em tempo reale que não exige desprendimento de células aderentes.

SUMÁRIO

• O presente pedido proporciona métodos de ensaio de ADCC invitro. Os métodos são sem marcação ou exigem níveis reduzidos de marcação,e desse modo são mais fáceis e seguros para realizar do que ensaios que exi-gem células marcadas. Em algumas modalidades, os métodos também sãorealizados em células aderentes, em vez de células em suspensão. Além disso,os métodos podem ser realizados em tempo real, permitindo que a cinética dereações de ADCC seja seguida de tal modo que a cinética de ADCC de diferen-tes anticorpos possa ser comparada. Os métodos proporcionados neste relató-rio também são mais sensíveis do que ensaios padrões de ADCC, permitindoque diferenças menores na cinética de ADCC de diferentes anticorpos sejamdetectadas. Adicionalmente, em algumas modalidades a simplicidade dos mé-todos proporcionados neste relatório significa que são mais rápidos do que en-saios padrões de ADCC, e também apresentam o potencial de ser otimizadopara seleção em alta escala de atividade de ADCC.

Os métodos proporcionados neste relatório compreendem (a)monitorar a impedância entre eletrodos em um substrato não-condutor quesuporta o crescimento de células-alvo em um meio de ensaio; e (b) adicionarao meio de ensaio células efetuadoras e um anticorpo que se liga às células-alvo. Uma diminuição na impedância entre os eletrodos no substrato apósadição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa de ADCC ter sidoefetuado no meio de ensaio. Um aumento ou nenhuma alteração na impe-dância entre os eletrodos no substrato após adição das células efetuadorase do anticorpo pode ser indicativo de função de ADCC não ter sido efetuadano meio de ensaio.

Em üm aspecto, o presente pedido caracteriza um método deensaiar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), método esteque compreende: (a) monitorar a impedância entre eletrodos em um substra-to não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio deensaio; e (b) adicionar ao meio de ensaio células efetuadoras e um anticorpoque se liga às células-alvo; em que uma diminuição na impedância entre oseletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo éindicativa de função de ADCC que foi efetuada no meio de ensaio, e em queum aumento ou nenhuma alteração na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativo defunção de ADCC não ter sido efetuada no meio de ensaio. O método podeincluir medição da impedância sob intervalos regulares. O método pode in-cluir derivação de um índice Celular (IC) de cada medição de impedância edeterminar se ocorre uma alteração no índice Celular, em que o índice Celu-lar deriva de cada medição de impedância usando a fórmula

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em que f?b(/) e RCéiuia(/) são as resistências do eletrodo dependente de fre-qüência sem células ou com células presentes, respectivamente, e N é onúmero dos pontos de freqüência em que a impedância é medida. O métodopode ser conduzido usando o sistema de RT-CES®. As medições de impe-dância podem ser tomadas a cada 15 minutos.

O método pode adicionalmente plaquear as células-alvo. As cé-lulas-alvo podem ser plaqueadas 18 a 24 horas antes de adição do anticorpoe células efetuadoras. As células-alvo podem estar em uma monocamada nosubstrato. As células-alvo podem ser plaqueadas sob uma densidade deentre 2 K e 100 K por cavidade (por exemplo, entre 15 K e 25 K por cavida-de, ou aproximadamente 20 K por cavidade). A razão de células efetuadoraspara células-alvo (E:T) pode ser 25:1. A E:T pode ser maior que 10:1, maiorque 50:1, ou maior que 100:1.

O anticorpo pode ser adicionado sob uma concentração de entreaproximadamente 1 e aproximadamente 100 μς/ηιΙ, entre aproximadamente1 e aproximadamente 50 μςι/ml, ou entre aproximadamente 2 e aproxima-damente 8 μς/ηιΙ. O método pode incluir adicionar ao meio de ensaio dois oumais anticorpos que se ligam às células-alvo, três ou mais anticorpos que seligam às células-alvo, ou quatro ou mais anticorpos que se ligam às células-alvo. O anticorpo pode-se derivar de um paciente com um distúrbio auto-imune.

As células-alvo podem expressar antígenos apicais. O métodopode incluir uma etapa preliminar de seleção das células-alvo para expres-são de antígeno apical. As células-alvo podem ser células cancerosas oucélulas infectadas viralmente. As células cancerosas podem ser de uma li-nhagem celular. As células cancerosas podem ser células SKBR3 ou células MG63.

As células efetuadoras podem compreender células mononucle-ares sangüíneas periféricas (PBMCs), células exterminadoras (NK), monóci-tos, células citotóxicas T ou neutrófilos. Etapa (b) do método pode compre-ender adicionar à células-alvo sangue total que foi parcialmente enriquecidoem relação às células efetuadoras. Etapa (b) do método pode compreenderadicionar sangue total à células efetuadoras, em que o sangue total compre-ende as células efetuadoras.

Em um outro aspecto, o presente pedido caracteriza um métodode selecionar um anticorpo candidato para a capacidade de induzir ADCCcontra células-alvo, método este que compreende: (a) monitorar a impedân-cia entre os eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o cresci-mento de células-alvo no meio de ensaio; e (b) adicionar células efetuadorase o anticorpo-candidato que se liga às células-alvo ao meio de ensaio; emque uma diminuição na impedância entre os eletrodos no substrato apósadição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa da capacidade doanticorpo candidato efetuar função de ADCC contra as células-alvo, e emque um aumento ou nenhuma alteração na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa daincapacidade do anticorpo candidato efetuar função de ADCC contra as cé-lulas-alvo.

Em um outro aspecto, o presente pedido caracteriza um métodode identificação de um paciente que apresenta uma doença associada a cé-lulas-alvo que é adequado para tratamento com um anticorpo candidato, mé-todo este que compreende: (a) monitorar a impedância entre os eletrodosem um substrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvoassociado à doença; (b) adicionar PBMCs isoladas do paciente e do anticor-po candidato a células-alvo; e (c) determinar se uma alteração na impedân-cia entre os eletrodos no substrato ocorre após adição das PBMCs e do an-ticorpo, em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos é indicati-va da adequabilidade do paciente para tratamento com o anticorpo, e emque um aumento ou nenhuma alteração na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das PBMCs e do anticorpo é indicativa da falta de a-dequabilidade do paciente para tratamento com o anticorpo.

Em ainda um outro aspecto, o presente pedido caracteriza ummétodo de selecionar um composto candidato para a capacidade de modularADCC1 método este que compreende: (a) monitorar a impedância entreos eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento decélulas-alvo no meio de ensaio; (b) adicionar ao meio de ensaio células efe-tuadoras e um anticorpo, na presença e ausência do composto candidato, noqual o anticorpo liga-se a células-alvo; e (c) comparar qualquer alteração naimpedância entre os eletrodos no substrato após adição das células efetua-doras e do anticorpo na presença do composto candidato com qualquer alte-ração na impedância entre os eletrodos no substrato após adição das célu-las efetuadoras e do anticorpo na ausência do composto candidato, em queuma alteração na impedância na presença do composto candidato que émaior que qualquer alteração na impedância na ausência do composto can-didato é indicativa que! o composto candidato apresenta a capacidade demodular ADCC. O composto a ser selecionado pode modular ADCC auto-imune relacionada.

O presente pedido também caracteriza um método conformedescrito neste relatório que é um ensaio em alta escala, em que o substratonão-condutor compreende duas ou mais cavidades de microtitulação, cadacavidade compreendendo pelo menos dois eletrodos, e monitorando a impe-dância entre os eletrodos em cada cavidade.

Em um outro aspecto, o presente pedido caracteriza um ensaiode controle de qualidade de um anticorpo, método este que compreende: (a)monitorar a impedância entre os eletrodos em um substrato não-condutorque suporta o crescimento de células-alvo no meio de ensaio; e (b) adicionarcélulas efetuadoras e o anticorpo ao meio de ensaio, em que o anticorpoliga-se a células-alvo; em uma diminuição na impedância entre os eletrodosno substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativaque o anticorpo é adequado a ser liberado para uso na indução de ADCC, eem que um aumento ou nenhuma alteração na impedância entre os eletro-dos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indi-cativo que o anticorpo não é adequado a ser liberado para uso na induçãode ADCC.

Em ainda um outro aspecto, o presente pedido caracteriza umensaio de controle de qualidade de um anticorpo, o qual compreende: (a)monitorar a impedância entre os eletrodos em um substrato não-condutorque suporta o crescimento de células-alvo em um meio de ensaio; (b) adi-cionar células efetuadoras e o anticorpo ao meio de ensaio, em que o anti-corpo liga-se a células-alvo; e (c) comparar qualquer alteração na impedân-cia entre os eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e doanticorpo com qualquer alteração na impedância para uma amostra de con-trole após adição das células efetuadoras e um anticorpo de controle; emque uma diminuição na impedância após adição das células efetuadoras edo anticorpo que é maior que qualquer diminuição na impedância em relaçãoà amostra de controle após adição das células efetuadoras e do anticorpo decontrole é indicativa que o anticorpo é adequado a ser liberado para uso naindução de ADCC, e em que falta de uma diminuição na impedância apósadição das células efetuadoras e do anticorpo que é maior que qualquer di-minuição na impedância em relação à amostra de controle após adição dascélulas efetuadoras e do anticorpo de controle é indicativa que o anticorponão é adequado a ser liberado para uso na indução de ADCC. No ensaio decontrole de qualidade, uma diminuição na impedância após adição das célu-las efetuadoras e do anticorpo que é pelo menos 25% maior que a diminui-ção na impedância em relação à amostra de controle após adição das célu-las efetuadoras e do anticorpo de controle pode ser indicativa de que o anti-corpo é adequado para ser liberado para uso na indução de ADCC.

O presente pedido também caracteriza um método de seleçãode um composto candidato para uso como um terapêutico contra uma doen-ça auto-imune, método este que compreende: (a) monitorar a impedânciaentre os eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimentode células-alvo em um meio de ensaio, em que as células-alvo são célulassadias; (b) adicionar ao meio de ensaio células efetuadoras e um anticorpo,com e sem o composto candidato, em que o anticorpo liga-se a células-alvo,e em que as células efetuadoras são PBMCs de um indivíduo diagnosticadocom a doença auto-imune; e (ç) comparar qualquer alteração na impedânciana presença do composto candidato com qualquer alteração na impedânciana ausência do composto candidato, em que uma diminuição na impedânciana ausência do composto candidato que é maior que qualquer diminuição naimpedância na presença do composto candidato é indicativa que o compostocandidato é adequado como um agente terapêutico contra a doença auto-imune, e que falta de uma diminuição na impedância na ausência do com-posto candidato que é maior que qualquer diminuição na impedância na pre-sença do composto candidato é indicativa que o composto candidato não éadequado como um agente terapêutico contra a doença auto-imune.

Erri um outro aspecto, o presente pedido caracteriza um métodode determinar se um anticorpo candidato é adequado para tratamento de umindivíduo que apresenta uma doença auto-imune, método este que compre-ende: (a) monitorar impedância entre os eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo associado à doença au-to-imune; e (b) adicionar o anticorpo candidato e PBMCs isoladas do indiví-duo à células-alvo; é (c) determinar se uma alteração na impedância entreos eletrodos no substrato ocorre após adição das PBMCs e do anticorpocandidato, em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos é indi-cativa que o anticorpo é adequado para tratar o indivíduo, e em que a faltade uma diminuição na impedância entre os eletrodos é indicativa que o anti-corpo não é adequado para tratamento do indivíduo.

Em ainda um outro aspecto, o presente pedido caracteriza ummétodo para determinar uma concentração ótima de um anticorpo para in-duzir uma resposta de ADCC, método este que compreende: (a) monitorar aimpedância entre os eletrodos em um substrato não-condutor que suporta ocrescimento de duas ou mais amostras de células-alvo em um meio de en-saio; e (b) adicionar células efetuadoras e um anticorpo à duas ou mais a-mostras de células-alvo, em que o anticorpo liga-se a células-alvo, e em queo anticorpo é adicionado sob diferentes concentrações à duas ou mais a-mostras de células-alvo; em que uma diminuição na impedância entre oseletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo éindicativa de função de ADCC que foi efetuada no meio de ensaio, e em quea concentração de anticorpo que resulta na maior diminuição na impedânciaé determinada ser a concentração ótima.

Em um outro aspecto, o presente pedido caracteriza um métodode determinar se um anticorpo liga-se a um antígeno apical em uma célula-alvo, método este que compreende: (a) monitorar a impedância entre os ele-trodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de ensaio; e (b) adicionar células efetuadoras e o anticorpoà células-alvo; em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativaque o anticorpo liga-se a um antígeno apical nas células-alvo.

A não ser que de outra maneira definidos, todos os termos técni-cos e científicos usados neste relatório apresentam o mesmo significadoconforme comumente entendidos por aquele versado no estado da técnicaaos quais esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ouequivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados para práti-ca da invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todasas publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencio-nadas neste relatório são incorporadas como referência em sua totalidade.No caso de conflito, o presente relatório descritivo incluindo, definições, con-trolará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos ape-nas e não pretendem ser limitativos.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são a-presentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras característi-cas, objetivos e vantagens da invenção serão visíveis da descrição e figuras,e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 representa um gráfico traçando (plotting) índice Celularao longo do tempo de células SKBR3 que foram plaqueadas sob diluições 2vezes em série de 40 K, 20 K, 10 K, ou 5 K por cavidade, conforme indicadas.

Figura 2 representa um gráfico traçando índice Celular ao longodo tempo de células SKBR3 plaqueadas que foram tratadas após 20 horascom meio fresco adicional ("células isoladas"), ou com Triton X-100 ("células+ Tritori') para induzir morte celular.

Figura 3 representa um gráfico traçando índice Celular ao longodo tempo de células SKBR3 plaqueadas que foram tratadas após 20 horascom meio fresco ("alvos isolados"), Herceptina ("Alvos + Herceptina"), ouanticorpos de controle de IgG ("Alvos + IgG").Figura 4 representa um gráfico traçando índice Celular ao longodo tempo de células SKBR3 isoladas ("alvos") ou PBMC ("efetuadoras").

Figura 5 representa um gráfico traçando índice Celular ao longodo tempo de células SKBR3 isoladas, PBMC isolada, ou células SKBR3 queforam tratadas com PMBC após 20 horas.

Figura 6 representa um gráfico traçando índice Celular com otempo de células SKBR3 isoladas, células SKBR3 tratadas com PBMC emhoras, ou células SKBR3 tratadas com PBMC e Herceptin® após 20 horas.

Figura 7 representa um gráfico mostrando um curso de tempo deIise de célula-alvo (T) SKBR3 por meio de efetuadoras PBMC (E) em umarazão E:T 50:1 ou 12,5:1, com e sem Herceptin® mAB conforme indicado.

Figura 8A representa um gráfico traçando Iise percentual deter-minada usando um método conforme descrito neste relatório, de células-alvoSKBR3 tratadas com PBMC isolada, células-alvo SKBR3 tratadas comPBMC mais as concentrações de Herceptin® indicadas, ou células-alvo SK-BR3 tratadas com PBMC mais IgG de controle.

Figura 8B representa um gráfico traçando Iise percentual deter-minada usando um ensaio padrão Calceína-AM de células-alvo SKBR3 tra-tadas com PBMC isolada, células-alvo SKBR3 tratadas com PBMC mais asconcentrações de Herceptin® indicadas, ou células-alvo SKBR3 tratadascom PBMC mais IgG de controle.

Figura 9 representa um gráfico traçando índice Celular ao longodo tempo de células SKBR3 e MG63.

Figura 10A representa um gráfico traçando índice Celular de cé-lulas MG63 tratadas em 18-20 horas com PBMC isolada, PBMC com anti-corpo-alvo específico RX1, ou PBMC com anticorpo de IgG de controle.

Figura 10B representa um gráfico traçando índice Celular de cé-lulas SKBR3 tratadas em 18-20 horas com PBMC isolada, PBMC com anti-corpo-alvo específico Herceptin®, ou PMBC com anticorpo IgG de controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O presente pedido proporciona materiais e métodos para detec-tar ADCC medindo impedância entre eletrodos localizados na superfície so-bre a qual as células são plaqueadas. Qualquer dispositivo adequado paramedir impedância pode ser usado. Em algumas modalidades, ADCC podeser detectada usando um dispositivo que apresenta um substrato não-condutor apresentando uma pluralidade de ensaios de eletrodos posicionadonele, os ensaios sendo conectados com um analisador de impedância. Porexemplo, ADCC pode ser medida usando um dispositivo que apresenta en-saios de eletrodos posicionados em um substrato em uma câmara inferior, acâmara inferior sendo separada de uma câmara superior por meio de umamembrana. Tal dispositivo também pode ser usado para detectar migraçãode células da câmara superior para a câmara inferior, em que aderência aosubstrato na câmara inferior é detectada por um aumento na impedânciaentre os eletrodos nos ensaios na câmara inferior. Tais dispositivos são des-critos, por exemplo, no WO 2004/010103 e WO 2004/010102.

Tais dispositivos também podem ser usados para avaliar citoto-xicidade de um composto em células nesse particular. Por exemplo, umcomposto pode ser adicionado a células que são crescidas em um substratocontendo eletrodos, e o efeito do composto sobre impedância entre os ele-trodos pode ser monitorado, em que uma diminuição na impedância entre oseletrodos é indicativa de morte celular. Ver, por exemplo, WO 2005/77104 eWO 2005/047482. Ver, também, Publicação dos Estados Unidos N02005/0112544, a qual descreve métodos que incluem medição de impedân-cia para avaliar citotoxicidade celular induzida por Tamoxifeno.

Nenhuma das referências acima descreve utilizar os dispositivosdescritos aqui para avaliar ADCC. Ao contrário de ensaios de citotoxicidadeconvencionais, os quais simplesmente envolvem a adição de um compostocandidato a uma célula-alvo, ensaios de ADCC envolvem a adição de (a) umanticorpo que se ligará à célula-alvo, e (b) células efetuadoras que se ligarãoao anticorpo. Medições de impedância não seriam esperadas proporcionaruma indicação exata do número de células-alvo em um ensaio de ADCCuma vez que as células-alvo, as células efetuadoras, e o anticorpo seriamesperados aderir-se ao substrato. Desse modo, uma leitura de alta impedân-cia pode ser devido a: i) células-alvo que se aderem ao substrato porque oanticorpo e células efetuadoras não tinham induzido ADCC; ou ii) célulasefetuadoras e anticorpos que se aderem ao substrato após morte de células-alvo por meio de ADCC. Dispositivos tais como aqueles descritos acima,portanto, não seriam esperados ser úteis em um ensaio de ADCC.

Surpreendentemente, contudo, os inventores verificaram quedispositivos tais como aqueles descritos no WO 2005/77104 e WO2005/047482 podem ser usados em ensaios de ADCC. Em particular, osinventores verificaram que células efetuadoras não significativamente ade-rem-se ao substrato contendo eletrodo, e que com números adequados decélulas-alvo, razões de célula efetuadora para célula-alvo (E:T), e concen-trações de anticorpos, alterações na impedância entre os eletrodos no subs-trato podem proporcionar uma indicação exata de números de célula-alvo.

Ao ensaiar ADCC detectando alterações na impedância entre oseletrodos em um substrato no qual as células-alvo são crescidas apresentavárias vantagens significativas sobre ensaios padrões de ADCC. Ao contrá-rio da maior parte de ensaios padrões de ADCC, em algumas modalidades,os métodos proporcionados neste relatório são sem marcação. Em algumasmodalidades, os métodos não envolvem marcação de células com um radio-ativo ou outra marca, tornando os ensaios mais fáceis e mais seguros derealizar do que ensaios que exigem células marcadas. Adicionalmente, con-forme discutido acima, em ensaios padrões de ADCC, células aderentes sãodesprendidas da superfície em que estão crescendo de tal modo que as cé-lulas possam ser marcadas e o ensaio de ADCC seja realizado em suspen-são. Uma vez que os métodos proporcionados neste relatório são sem mar-cação, não há necessidade de desprender as células, desse modo remo-vendo uma fonte potencial de erro devido à perturbação das células aderen-tes. Em vez disso, os ensaios de ADCC são realizados com as células liga-das ao substrato.

Além disso, ao contrário de maior parte de ensaios padrão deADCC, em algumas modalidades os métodos proporcionados neste relatóriopermitem que o número de células seja seguido em tempo real, medindoimpedância sob vários pontos de tempo após adição do anticorpo e célulasefetuadoras. Os métodos proporcionados neste relatório, desse modo permi-tem que a cinética da reação de ADCC seja seguida de tal modo que a ciné-tica de ADCC de diferentes anticorpos possa ser comparada. Em algumasmodalidades, os métodos são mais sensíveis do que ensaios de ADCC pa-drão, permitindo que diferenças menores na cinética de ADCC de diferentesanticorpos sejam detectadas. Além disso, a simplicidade dos métodos pro-porcionados neste relatório significa que eles são muito mais rápidos do queensaios padrões de ADCC, e apresentam o potencial de serem otimizadospara seleção em alta escala de atividade de ADCC.

Os métodos proporcionados neste relatório podem ser conduzi-dos usando um dispositivo descrito no WO 2004/010102, WO 2004/010103,WO 2005/077104 ou WO 2005/047482, ou um dispositivo com base nessesprojetos. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados neste rela-tório podem ser conduzidos usando o sistema RT-CES® produzido por A-CEA Biosciences (San Diego, CA). O sistema RT-CES® de ACEA compre-ende três componentes: um analisador de sensor eletrônico, uma estação dedispositivo, e uma placa de microtitulação de 16 cavidades. O leitor conside-rará que variantes de workshop menores desse sistema estão dentro doâmbito daquele versado no estado da técnica. Por exemplo, o dispositivopode apresentar uma placa de microtitulação de 96 cavidades ou uma placade microtitulação de 256 cavidades, em vez de uma placa de microtitulaçãode 16 cavidades, para permitir que mais ensaios sejam conduzidos simulta-neamente.

Ensaios de microeletrodos com sensor podem ser construídosem lâminas de vidro usando métodos de microfabricação litográficos, e aslâminas contendo eletrodos podem ser montadas com bandejas plásticaspara formar cavidades contendo eletrodos.

A estação do dispositivo pode receber a placa de microtitulação(por exemplo, a placa de microtitulação de 16 cavidades, 256 cavidades oude 96 cavidades) e pode ser capaz de eletronicamente comutar qualqueruma das cavidades com o analisador de sensor para medição de impedân-cia. Na operação, dispositivos com células cultivadas nas cavidades podemser conectados à estação do dispositivo e colocados dentro de uma incuba-dora. Cabos elétricos podem conectar-se à estação do dispositivo ao anali-sador de sensor. Usando o controle de software RT-CES®, o analisador desensor pode automaticamente selecionar cavidades a ser medidas, e podecontinuamente conduzir medições de impedâncias. Os dados de impedânciado analisador podem ser transferidos para um computador, analisados eprocessados pelo software integrado.

A impedância medida entre os eletrodos em uma cavidade indi-vidual tipicamente depende de geometria de eletrodos, concentração iônicana cavidade, e se há células ligadas aos eletrodos. Na ausência de células,impedância de eletrodos é determinada principalmente pelo ambiente iônicona interface de eletrodo/solução e na solução em massa. Na presença decélulas, células ligadas às superfícies do sensor de eletrodos podem alteraro ambiente iônico local na interface de eletrodo/solução, levando a um au-mento na impedância. Quanto mais células há nos eletrodos, maior o au-mento na impedância de célula-eletrodo.

Para quantificar células baseadas na impedância de célula-eletrodo medida, um parâmetro denominado índice Celular (IC) é derivado,de acordo com a fórmula:

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que Rb{f) é a resistência de eletrodo dependente de freqüência (umcomponente de impedância) sem células, RCéiuia(f) é a resistência de eletrododependente de freqüência com células presentes, e N é o número dos pon-tos de freqüência em que a impedância é medida.

Desse modo, índice Celular é uma medida quantitativa das célu-las em uma cavidade contendo eletrodo. Sob as mesmas condições fisioló-gicas, mais células ligadas nos eletrodos levam a um valor maior de RCéiuia(f),levando a um valor maior de índice Celular.

Os métodos proporcionados neste relatório podem incluir medi-ção de impedância em intervalos regulares e derivação de um índice Celulara partir dessas medições de impedância, de acordo com a fórmula fornecidaacima, permitindo desse modo que a reação de ADCC seja seguida. Os in-tervalos em que medições de impedância são tomadas podem depender emcomo estritamente deseja-se seguir a cinética da reação. Por exemplo, inter-valos curtos poderão ser preferíveis se deseja seguir a cinética de ADCC deum anticorpo já conhecido induzir ADCC, visto que intervalos mais longospoderão ser satisfatórios se o objetivo primário de conduzir o ensaio é verifi-car se um dado anticorpo pode induzir ADCC de modo algum. Os métodospodem incluir tomar medições de impedância em pontos de tempo tais co-mo, por exemplo, a cada 30 minutos, a cada 15 minutos, a cada 10 minutos,a cada 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 minutos, a cada minuto, ou mais freqüentemen-te, que a cada minuto.

Os métodos descritos neste relatório podem adicionalmente in-cluir plaquear células-alvo no substrato antes de adição de células efetuado-ras e anticorpo. Por exemplo, células-alvo podem ser plaqueadas no subs-trato e seguidas para crescimento por um período de tempo antes de adiçãode células efetuadoras e anticorpo. Plaqueamento de células-alvo antes deadição de anticorpo e células efetuadoras pode permitir que as células-alvoliguem-se ao substrato e cresçam, resultando em um aumento na impedân-cia que poderá facilitar detecção de uma diminuição na impedância apósadição de células efetuadoras e anticorpo. As células-alvo tipicamente nãodevem ser deixadas crescer excessivamente, contudo, à medida que as cé-lulas-alvo ligadas ao substrato poderão tornar-se inacessíveis ao anticorpodevido às células que se desenvolvem em cima dele. Em tal caso, não seriapossível detectar ADCC. Está bem dentro da capacidade daquele versadono estado da técnica conduzir experimentos para determinar o comprimentode tempo ótimo que células-alvo devem ser plaqueadas antes de adição decélulas efetuadoras e anticorpo. Em algumas modalidades, células-alvo po-dem ser plaqueadas sobre o substrato 10-30 horas antes de adição de célu-las efetuadoras e anticorpo. Por exemplo, células-alvo podem ser plaquea-das sobre o substrato 18-24 horas (por exemplo, 19-21 horas) antes de adi-ção de células efetuadoras e anticorpo.A densidade em que as células-alvo são plaqueadas pode de-pender do tamanho das células e da taxa em que se desenvolvem. O siste-ma de detecção tipicamente apresenta um limite máximo, acima do qual éincapaz de detectar adicionalmente crescimento das células. Células-alvodesse modo podem ser plaqueadas sob uma densidade abaixo desse limitepara permitir que alterações na impedância devido à morte das células se-jam detectadas. Contudo, células-alvo também podem ser plaqueadas sobuma densidade que é alta o suficiente para permitir que as células apresen-tem um efeito na impedância durante o período inicial de crescimento, de talmodo que qualquer diminuição na impedância após adição de células efetu-adoras e anticorpo possa ser detectada. Em algumas modalidades, as célu-las-alvo podem ser plaqueadas sob uma densidade entre 2 K e 100 K emuma cavidade padrão de 19,6 mm2 (por exemplo, uma densidade entre 10 Ke 60 K em uma cavidade padrão de 19,6 mm2, uma densidade entre 15 K e25 K em uma cavidade padrão de 19,6 mm2, ou uma densidade em torno de20 K em uma cavidade padrão de 19,6 mm2).

O comprimento de tempo durante o qual medições de impedân-cia são feitas, isto é, o comprimento do ensaio, pode variar dependendo doperíodo entre plaqueamento das células-alvo e adição de células efetuado-ras e anticorpo. Uma redução na impedância devido a ADCC geralmentepode ser detectada dentro de um par de horas após adição de anticorpo ecélulas efetuadoras. Em alguns casos, contudo, poderá ser desejável conti-nuar monitorando impedância por um período após o início de morte celularpor ADCC, para determinar o grau de morte celular e para verificar se, equando ocorre qualquer recrescimento celular. Os métodos proporcionadosneste relatório, desse modo, poderão incluir tomar medições de impedânciaem relação a, sem limitação, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas, 100horas, 200 horas, ou mais de 200 horas após plaqueamento das células-alvo.

Os métodos proporcionados neste relatório podem empregarqualquer número de células efetuadoras e qualquer número de células-alvo,proporcionados, conforme discutidos acima, que o número de células-alvonão seja tão alto quanto para impedir detecção exata de ADCC. Os métodospodem empregar mais células efetuadoras do que células-alvo. A razão decélulas efetuadoras para células-alvo (E:T) pode ser, por exemplo, maior que10:1, maior que 20:1, maior que 50:1, maior que 100:1 ou em torno de 25:1.

O anticorpo pode ser adicionado às células-alvo sob qualquerconcentração. Por exemplo, o anticorpo pode ser adicionado às células-alvoplaqueadas sob uma concentração de, por exemplo, entre aproximadamente1 e aproximadamente 1.000 μg/ml, entre aproximadamente 1 e aproxima-damente 500 μg/ml, entre aproximadamente 1 e aproximadamente 100μg/ml, entre aproximadamente 1 e aproximadamente 75 μg/ml, entre apro-ximadamente 1 e aproximadamente 50 μg/ml, entre aproximadamente 1 eaproximadamente 25 μg/ml, entre aproximadamente 1 e aproximadamente10 μg/ml, entre aproximadamente 2 e aproximadamente 8 μg/ml, ou entreaproximadamente 4 e aproximadamente 6 μg/ml.

Em algumas modalidades, os métodos descritos neste relatóriopodem ser usados para determinar a concentração ótima de um anticorpoque induz uma resposta de ADCC comparando a resposta de ADCC obtidausando diferentes concentrações de anticorpos. Por exemplo, um métodopode incluir (a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de duas ou mais (por exemplo, du-as, três, quatro, cinco ou mais de cinco) amostras de células-alvo em ummeio de ensaio; e (b) adicionar células efetuadoras e um anticorpo às duasou mais amostras de células-alvo, em que o anticorpo liga-se a células-alvo,e em que o anticorpo é adicionado sob diferentes concentrações às duas oumais amostras de células-alvo; em que uma diminuição na impedância entreos eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticor-po é indicativa de função de ADCC que foi efetuada no meio de ensaio, e emque a concentração de anticorpo que resulta na maior diminuição na impe-dância é determinada ser a concentração ótima.

Células efetuadoras e anticorpo podem ser adicionados ao meiode células-alvo ao mesmo tempo ou separadamente. Por exemplo, célulasefetuadoras podem ser adicionadas ao meio antes de anticorpo, ou anticor-po pode ser adicionado antes de células efetuadoras. Os métodos descritosneste relatório podem empregar qualquer combinação de células-alvo, célu-las efetuadoras e anticorpos, e a seleção de células-alvo, células efetuado-ras e anticorpos usados nos métodos podem depender do propósito do en-saio. Exemplos de células-alvo adequadas, células efetuadoras e anticorpospara uso nos métodos proporcionados neste relatório são discutidos abaixo,como são aplicações possíveis de ensaios que empregam essas células-alvo, células efetuadoras e anticorpos.

Em algumas modalidades, as células-alvo são células aderen-tes. Em algumas modalidades, as células-alvo expressam antígenos apicais.Muitas células são polarizadas e expressam diferentes antígenos em suassuperfícies apicais e basolaterais (Nelson e outros, (2003) Nature 422:766-774). Por exemplo, células epiteliais expressam diferentes antígenos apicaise basolaterais. Quando um ensaio padrão de ADCC é conduzido em sus-pensão, o anticorpo poderá ligar-se tanto a antígeno apical quanto basolate-ral. Nos métodos proporcionados neste relatório, contudo, em que as célulasaderem-se ao substrato, o anticorpo poderá apenas ligar-se a antígenos api-cais. A capacidade de um anticorpo induzir ADCC desse modo demonstraque o anticorpo liga-se a um antígeno apical nas células-alvo. Os métodosproporcionados neste relatório desse modo podem ser usados para determi-nar se um anticorpo particular liga-se a um antígeno apical nas células-alvo.Por exemplo, um método pode incluir: (a) monitorar a impedância entre ele-trodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de ensaio; e (b) adicionar células efetuadoras e o anticorpoàs células-alvo; em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativaque o anticorpo liga-se a um antígeno apical nas células-alvo. Alguns anti-corpos terapêuticos são apenas capazes de acessar antígenos apicais invivo. Por exemplo, alguns anticorpos são apenas capazes de acessar e ligarantígenos apicais expressos na superfície de tumores. A capacidade de umanticorpo induzir ADCC por meio de ligação a antígenos apicais poderá des-se modo ser um indicador da eficácia terapêutica do anticorpo in vivo.Os métodos proporcionados neste relatório podem incluir umaetapa preliminar de seleção de células-alvo para expressão de antígenosapicais. Tal etapa preliminar pode empregar, por exemplo, RT-RCP ouFACS para identificar células-alvo que expressam antígenos apicais que po-derão ser adequados para uso nos métodos proporcionados neste relatório.

Qualquer célula-alvo adequada pode ser usada. Exemplos decélulas que expressam antígenos apicais incluem, sem limitação, célulastumorais e células epiteliais tais como aquelas conhecidas no estado da téc-nica. Por exemplo, glicoproteínas mucina tais como antígeno DF3 e MUC1são expressas ha superfície apical de células epiteliais e são superexpres-sas na superfície apical de tumores epiteliais (Snijdewint e outros (2001) Int.J. Câncer 93:97-106; e Hayes e outros (1990) J. Immunol. 145:962-970).Além disso, uma variedade de células tumorais expressa um receptor desuperfície celular com alta afinidade de ácido fólico em suas superfícies api-cais (Lu e outros, (2002) Câncer Immunol. Immunother. 51:153-162).

As células-alvo podem ser células doentes tais como, por exem-plo, células cancerosas ou células infectadas viralmenté. Essas células-alvopoderão ser linhagens celulares obtidas de bancos de linhagens celulares.Alternativamente, as células podem ser obtidas de um indivíduo que apre-senta uma doença ou um distúrbio. Por exemplo, células-alvo podem serobtidas de uma biópsia de tumor de um paciente com câncer.

Células cancerosas que podem ser usadas como células-alvoincluem, mas sem se limitar as mesmas, células associadas à Doença deHodgkin, Iinfomas de célula B não de Hodgkin, Iinfomas de célula T, Iinfomamaligno, leucemia linfossarcoma, leucemia linfocítica crônica, mieloma múl-tiplo, leucemia mielóide crônica, leucemia mielomonocítica crônica, síndro-mes mielodisplásicas, distúrbios mieloproliferativos, síndrome hipereosinofí-lica, leucemia eosinofílica, mieloma múltiplo, distúrbios Iinfoproliferativos li-gados a X, câncer esofágico, câncer estomacal, câncer de colo, câncer co-lorretal, câncer pancreático e câncer de vesícula biliar, câncer do córtex su-pra-renal, tumor que produz ACTH, câncer de bexiga, câncer do cérebro (porexemplo, neuroblastomas e gliomas), sarcoma de Ewing, câncer de cabeçae pescoço (por exemplo, câncer de boca e câncer de laringe), câncer de rim(por exemplo, carcinoma celular renal), câncer hepático, câncer pulmonar(por exemplo, cânceres de pulmão de células pequenas e não-pequenas),efusão peritonèal maligna, efusão pleural maligna, cânceres de pele (porexemplo, melanoma maligno, progressão de tumor de queratinócitos da pelehumana, carcinoma de células epiteliais, carcinoma de células escamosas,carcinoma de células basais), mesotelioma, sarcoma de Kaposi, câncer ós-seo (por exemplo, osteomas e sarcomas, tais como fibrossarcoma e osteos-sarcoma), cânceres do trato reprodutivo feminino (por exemplo, câncer uteri-no, câncer endometrial, câncer ovariano e câncer cervical), câncer de mama,câncer de próstata, retinoblastoma, câncer testicular e câncer tireoidiano.

Linhagens de células cancerosas que podem ser usadas còmocélulas-alvo podem ser quaisquer linhagens celulares aderentes imortaliza-das obtidas, por exemplo, de um banco celular. Exemplos de linhagens celu-lares aderentes imortalizadas adequadas incluem, mas sem se limitar asmesmas: SKBR3, MG63, CCD-1070Sk, hTERT-HME1 [ME16C], BJ, ATR-FLOX [Mutatect], KEL FIB, HT-1197, LL 97A (AIMy)f NCI-H510A [H510A;NCI-H510], HT-29, SW756, 293, IMR-90 [IMR90], HIAE-55 [parte da ColeçãoWistar Especial], SW1417 [SW-1417], Hs 737.T, NCI-H661 [H661], CCD 841CoN, Hs 792(C).M, Per Sei, NCI-H810 [H810], Panc 05.04, ZR-75-30, T-47D, WISH, HBE135-E6E7, ARPE-19/HPV-16, 10.014 pRSV-T, GH354,MDA-MB-436, T98G [T98-G], Calu-6, BEAS-2B, G-292, clone A141B1, De-troit 539, MNNG/HOS C1 N0 5 [R-1059-D], BT-549, NCI-H1915 [H1915], Hs181.Sk, Hs 839.T, RD, SK-N-MC, 20B8, NCI-H292 [H292], Hs 863.T, Hs181.Tes, Malme-3M, Hs 617 Mg, JAR, Hs 144.We, Hs 742.Sk, Hs 875.T, TE161 .T1 Hs 738 St/lnt, Hs 895.T, RWPE-1, TE 130.T, TE 84.T, HCC1008, Hs894(E).Lu, SK-LMS-1, HFF-1, MRC-5 [MRC5], IRR-MRC-5 [ATCC X-55;ATCC X55; MRC-5 irradiada], WI-38 [Wl 38], HeLa, HEK001, FHs 74 Int,Detroit 548, Detroit 573, SW-13, 293T/17, C211, Amdur II, IMR-32, HeLa[Chang Livei], CHP 3 (M.W), CHP 4, LL 47 (MaDo), HEL 299, Detroit 562,CCD-11Lu, KB, A549 [A-549], MDA-MB-134-VI, HLF-a, TE 354.T, HeLa 229,HeLa S3, COLO 320DM, clone 1-5C-4 [derivado (D) Wong-Kiibourne de con-juntiva de Chang], CCD-13Lu, CCD-8Lu, CCD-19Lu, CCD-16Lu, AV3,Hs888Lu, CCD-25L.U, COLO 320HSR [COLO 320 HSR], DLD-1, COLO 205,COLO 201, HCT-15, SW837 [SW-837], LoVo, SW48 [SW-48], SW1463 [SW1463; SW-1463], SW 1353 [SW 1353; SW-1353], 1205Lu [parte da ColeçãoWistar Especial], HCT-8 [HRT-18], AGS, HCT 116, T84, SNU-C2B, SNU-C2A, NCI-H716 [H716], NCI-H747 [H747], NCI-H498 [H498], LS123, NCI-H1688 [H1688], CFPAC-1, L-132, TE 353.Sk, intestino 407, FL, Detroit 525,Detroit 510, C32, WI-38 VA-13 sublinhagem 2RA [parte da Coleção WistarEspecial], citrulinemia, Cri du Chat, WI-26 VA4 [parte da Coleção Wistar Es-pecial], BeWo, WM35 [parte da Coleção Wistar Especial], MSTO-211H, WRL68, NCI-H295 [H295], MCF 10A, MCF 10F, RWPE2-W99, SV-HUC-1,HCC202, C3A [HepG2/C3A; derivado de Hep G2 (ATCC HB-8065)], MCF-10-2A, 293 c18, F.thy 62891, Lei Cap1 Sal Mat, HCE-2 [50.B1], A2058, RW-PE-2, Am Ric, Lo Ren, Ron Har, H69AR, hFOB 1.19, Mar Vin, SCC-4, BeSal, Hs27, B-3, Lu Vin, Ma San, El Don, SK-N-AS, NCI-H1734 [H-1734;H1734], LNZTA3WT4 [LNZTA3p53WT4; WT4], LNZTA3WT11 [LNZ-TA3p53WT11; WT11], Lo Wen, NCI-H2227 [H2227], COLO 829, HKB-11, CeAr, 90.74, HRT-18G, Be Ar, Em Ar, Win Mee1 Ce Geg, TOV-21G, TOV-112D,OV-90, Ja Bos, Fe Bos, La Bel, Bo Gin, HS-5, Le Ana, Mel Neg, La Bel II,HEP G2/2.2.1, ProPakA.6 [PPA.6; ProPak-A.6], LNCaP clone FGC [LN-CaP.FGC], HCN-1 A, HX [HT1080 xeno], HP [HT1080 poli], 2A, Ne Loc, JaySen, Bi Fin e Ray Hot.

Células infectadas viralmente que podem ser usadas como célu-las-alvo incluem, por exemplo, células infectadas com vírus de Epstein-Barr,HIV, vírus da gripe, vírus da pólio, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B,vírus da hepatite C, vírus da varicela-zóster, vírus da rubéola, vírus do sa-rampo, vírus de herpes simples, vírus da dengue, vírus do papiloma, vírussincicial respiratório, ou vírus da raiva.

As células-alvo usadas nos métodos proporcionados neste rela-tório também podem ser células sadias. ADCC poderá ser envolvido na mor-te de células sadias em pacientes com doenças auto-imunes tais como dis-túrbios auto-imunes tireoidianos, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpuseritematoso sistêmico, anemia hemolítica imune (induzida por penicilina),hepatite auto-imune (AIH), oftalmopatia de Grave, HIV [depleção de CD4],enteropatia auto-imune, doença celíaca, miastenia grave (MG), doença deBeheet, oftalmopatia associada à tireóide, tireoidite auto-imune, miocarditeviral, doença cardíaca auto-imune, doença intestinal inflamatória, colite ulce-rativa, doença de Chagas, vitiligo, doença de Crohn, púrpura trombocitopê-nica idiopática, neutropenia auto-imune, epilepsia da infância, doença deKawasaki, hepatite crônica ativa auto-imune, diabetes melito, esclerose múl-tipla, nefrite da membrana basal anti-glomerular (GBM), doença hepáticacrônica ativa (CALD), glomerulonefrite (de complexos imunes), púrpuratrombocitopênica trombótica (TTP), infertilidadè masculina não-explicada erejeição de transplante. O uso de células sadias como células-alvo nos mé-todos proporcionados neste relatório desse modo podem ser úteis na pes-quisa para como anticorpos e células efetuadoras exterminam células sadiaspor meio de ADCC em doença auto-imune ou rejeição de transplante. Ondeas células-alvo são células sadias, elas podem ser, por exemplo, linhagenscelulares obtidas de bancos celulares ou células obtidas do tecido de umindivíduo que apresenta uma doença auto-imune.

Em alguns casos, uma combinação de mais de um tipo de célu-la-alvo pode ser usada para, por exemplo, mais estritamente reproduzir asituação in vivo em que o anticorpo poderá direcionar órgãos e tecidos quecompreendem diversos tipos celulares. As células-alvo desse modo podemincluir mais de uma linhagem celular ou podem incluir células de mais de umtecido. Em algumas modalidades, as células-alvo incluem dois ou três, oumais tipos celulares.

Os métodos descritos neste relatório podem ser usados paraselecionar qualquer anticorpo em relação à capacidade de induzir uma res-posta de ADCC. O presente pedido desse modo proporciona métodos deselecionar um anticorpo candidato para a capacidade dé induzir ADCC con-tra células-alvo. Os métodos compreendem (a) monitorar a impedância entreos eletrodos em um substrato não-condutor que suporta o crescimento decélulas-alvo em um meio de ensaio; e (b) adicionar ao meio de ensaio célu-las efetuadoras e o anticorpo candidato (por exemplo, um anticorpo que seliga às células-alvo); em que uma diminuição na impedância entre os eletro-dos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo indica acapacidade do anticorpo candidato efetuar ADCC contra as células-alvo.

Conforme usada neste relatório, "uma diminuição na impedân-cia" refere-se a qualquer redução na impedância entre os eletrodos em umsubstrato que apresenta células-alvo plaqueadas nele. Uma diminuição naimpedância pode ser, por exemplo, uma redução de aproximadamente 1%ou mais, aproximadamente 5% ou mais, aproximadamente 10% ou mais,aproximadamente 15% ou mais, aproximadamente 20% ou mais, aproxima-damente 25% ou mais, aproximadamente 40% ou mais, aproximadamente50% ou mais, aproximadamente 60% ou mais, aproximadamente 75% oumais, aproximadamente 80% ou mais, aproximadamente 90% ou mais, ouaproximadamente 100% na impedância conforme comparada com uma im-pedância anteriormente determinada.

O anticorpo ou anticorpo candidato usado nos métodos propor-cionados neste relatório pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal,um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo huma-no. Anticorpos que podem ser usados nos métodos descritos neste relatóriotambém incluem anticorpos que foram identificados como apresentando po-tencial terapêutico (por exemplo, anticorpos que já tenham sido submetidosa ensaios clínicos).

Conforme usado neste relatório, o termo "anticorpo" refere-se amoléculas intactas, bem como fragmentos destas, tais como Fab, F(ab')2 eFv, que são capazes de ligar-se às células-alvo. Por "ligação a células-alvo"entende-se que um anticorpo é imunoespecífico de um antígeno das células-alvo, por exemplo, um antígeno apical nas células-alvo.

O termo "imunoespecífico" entende-se que o anticorpo apresen-ta afinidade substancialmente maior do antígeno na célula-alvo do que afini-dade de outras proteínas (por exemplo, outras proteínas correlatas).

Por "afinidade substancialmente maior" entende-se que um anti-corpo apresenta uma afinidade mensuravelmente maior de um antígeno emuma célula-alvo quando comparada com afinidade de moléculas de reco-nhecimento de superfície celular contendo domínio imunoglobulina conheci-do. Por exemplo, a afinidade pode ser pelo menos 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes,10 vezes, 100 vezes, 103- vezes, 104-vezes, 105 vezes ou 106-Vezes maiorem relação a um antígeno em uma célula-alvo do que em relação a molécu-las de reconhecimento de superfície celular contendo domínio imunoglobuli-na conhecido.

Os métodos proporcionados neste relatório também podem serusados como ensaios de liberação ou estabilidade para propósitos de con-trole de qualidade (CQ). Por exemplo, métodos conforme descritos nesterelatório podem ser usados para testar lotes dé produção de anticorpos, emque a presença de atividade de ADCC ou o nível de atividade de ADCC éusado para certificar o produto anticorpo como satisfazendo diretrizes decontrole de qualidade (por exemplo, em GMP (Good Manufacturing Practice)ou outros padrões). Em alguns casos, a simples presença de atividade deADCC pode ser usada como uma determinação qualitativa de que um anti-corpo satisfaz diretrizes de controle de qualidade e é adequado para libera-ção. Tais métodos desse modo podem exigir nenhuma interpretação alémde uma determinação que impedância é reduzida na presença do anticorpoque está sendo testado. Em algumas modalidades, certifica-se que uma a-mostra do lote de um anticorpo ADCC pode ser deliberadamente degradadae usada como um controle negativo para comparação com o lote de anticor-po a ser liberado. A curva de leitura de ADCC em tempo real para as duasamostras pode ser comparada, e um corte quantitativo ou qualitativo podeser estabelecido para certificação de controle de qualidade. A resposta exatadependente de concentração e parâmetros do ensaio pode ser determinadopor ensaio e erro.

Similarmente, métodos descritos neste relatório podem ser usa-dos para certificar molécula pequena ou outros inibidores de atividade deADCC para propósitos de CQ e estabilidade, monitorando a diminuição nosinal de ADCC em tempo real na resposta a sua adição a células-alvo.

Exemplos de anticorpos disponíveis que poderão agir via ADCCincluem, sem limitação, anticorpos para tratamento de alergia e asma, taiscomo Daclizumab (Protein Design Labs/Roche) e CAT-354 (Cambridge Anti-body Technology)] anticorpos para tratamento de distúrbios auto-imunes,tais como MDX-H210 (Medarex/Novartis), Campath alentuzumab (ILEX Oh-cology) e Daclizumab (Protein Design Labs/Roche)·, anticorpos para trata-mento de câncer, tais como Campath® (ILEX Oncology), R1550 (huHMFGI,Therex, Antisome/Roche), Herceptin® (Genentech), Omnitarg (Genenteeh),Tastuzumab-DMI-1 (Genenteeh/lmmunogen), MDX-010 (Medarex), Avastin®(Genenteeh), Mab-17-Ι (edrecolomab-IGN101, lgeneon, EDR ou Panorex-GSK), Iabetuzumab, (IMMU 105) (Immunomedies), Tarvacin (Peregrine),Theragyn, Therevex (Pentumomab) (Antisome/Roche), TheraCIM hR3 (YMBiosciences/Oncosciencé), HuMax-EGFr(Genmab), SGN-40 (Seattle Gene-tics), SGN-30 (Seattle Genetics), Rituxan9 (Rituzan® Genente-ch/Biogenldec), HuMax-CD4 (Genmab), MDX-060 (Medarex), Siplizumab(Medlmmune), AME-133 (Applied Molecular Evolution/Lilly), galiximab (Anti-CD80 Mab Biogenldec), HuMax-DC20 (HuMax cd20) (Genmab), LymphoCi-de® (epratuzumab, Immunomedics), peptídeo MDX-010+gp100 (Medarex),MDX-010 +/- quimioterapia (Medarex), MDX-010 + peptídeos de melanoma(Medarex), AHM (Roche/Chugai), OvaRex (AltaRex/Unither Pharmaceuti-cais), J59I (Biovation/Millennium), Rencarex (WX-G250) (Wi-lex/Centocor/Johnson & Johnson), WX-G250+IL-2/IFN (WiIex), TRAIL-RImAb (HGS-ETR1 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sci-ences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2 Cambridge Antibody Technology/HumanGenome Sciences), Vitaxin (MEDI-522 Medlmmune), WX-K931 (Wilex),MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), Erbitux (cetuximab, IMC-C255 Imclone, Bristol-Myers Squibb), MEDI-507 (Medimmune), TRU-015(um derivado de anticorpo, Trubiori), Matuzumab (EMD-72000, EMD Phar-maceuticals/Merck KGaA), Mab ICR62, CHIR-12.12 (Chiron/XOMA), huG1-M195 (NCI) MOR 102 (MorphoSys), Remitogen (1D10, anti-MHC classe II,Protein Design Labs.) e IGN312 (Igeneon)·, anticorpos para tratamento dedoenças cardiovasculares, tal como ABC-48 (AERES); anticorpos para tra-tamento de doenças infecciosas, tal como MDX-010 (Medarex)·, anticorpospara tratamento de doenças inflamatórias, tal como Humira® (CambridgeAntibody Technology/Abbott), Anti-CDI 1a MAb (Biovation), MLN02 (Miilen-nium/Genentech/Roche), Daclizumab (Protein Design Labs.), Embrel (fusãode receptor dé TNFe IgGI) (Amgen/Wyeth), Remicade (Centoco/) e TRU-016 (um derivado de anticorpo, Trubion)·, anticorpos para tratamento de do-enças renais, tal como Humira® (Cambridge Antibody Technology/Abbott) eRituxan® (Genentech/Biogenidec); e outros anticorpos tal como AMG162(Amgeri) para osteoporose, Erbitux - C255, BTI-322, Etanercept e Infliximab.

Onde os métodos proporcionados neste relatório são usadospara investigar respostas de ADCC em doenças auto-imunes, o anticorpopode ser, por exemplo, um auto-anticorpo obtido de um indivíduo que apre-senta uma doença auto-imune. Tais anticorpos podem ser obtidos usando,por exemplo, métodos conhecidos daqueles versados no estado da técnica(por exemplo, purificação por afinidade).

Em alguns casos, poderá ser desejável adicionar mais de umanticorpo ao meio de ensaio a fim de determinar, por exemplo, se os anti-corpos agem sinergicamente ou se interferem uns aos outros em termos dacapacidade de induzir ADCC. Os métodos proporcionados neste relatóriodesse modo podem incluir adicionar dois, três, quatro, cinco ou mais de cin-co anticorpos ao meio de ensaio.

As células efetuadoras usadas nos métodos proporcionadosneste relatório tipicamente são células que expressam um ou mais recepto-res Fcy. Células efetuadoras adequadas incluem, mas sem se limitar asmesmas, células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMÇs), célulasexterminadoras (NK), monócítos, células citotóxicas T e neutrófilos.

Existem diversas famílias de receptores Fcy1 e diferentes célulasefetuadoras expressam diferentes receptores Fe. Por exemplo, neutrófiloscomumente expressam FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e a isoforma lipídicaancorada de FcyRIII (CD16), visto que células exterminadoras (NK) expres-sam apenas a isoforma transmembranosa de FcyRIII. Além disso, existempolimorfismos nos receptores de Fe. Por exemplo, o FcyRI 11 (CD64) em célu-las NK contém um polimorfismo de Phe/Val na posição 158 que mostrou in-fluenciar ligação com IgG. Células efetuadoras usadas nos métodos descri-tos neste relatório podem ser selecionadas com a base do receptor Fc queelas expressam e, em algumas modalidades, a forma polimórfica do receptorFc que expressam. Os métodos descritos neste relatório desse modo podemser usados para determinar se uma combinação particular de um anticorpo euma célula efetuadora que expressam um receptor Fcy conhecido (por e-xemplo, com um polimorfismo particular) é capaz de matar uma célula-alvopor meio de ADCC. Tais estudos poderão ser úteis em pesquisa geral para omecanismo de ligação com IgG por meio de receptores Fe, e poderão permi-tir identificação de resíduos tanto nos receptores Fc quanto na região Fc deIgG que são cruciais para ligação. Por sua vez, tais estudos poderão facilitardesenvolvimento de anticorpos terapêuticos que apresentam seqüências daregião Fc que exibem ligação ótima com receptores Fc em células efetuado-ras, maximizando desse modo ADCC. Tais estudos também poderão serusados para determinar o genótipo ótimo de células efetuadoras em relaçãoa um anticorpo terapêutico existente ser capaz de induzir uma resposta deADCC, de tal modo que um paciente prospectivo possa ser testado em rela-ção à presença de receptores Fc com o genótipo ótimo.

Em algumas modalidades, as células efetuadoras usadas nosmétodos descritos neste relatório são PBMCs. PBMCs são uma mistura demonócitos e linfócitos que podem ser isoladas de sangue total usando, porexemplo, protocolos experimentais padrão descritos no estado da técnica enos Exemplos abaixo. A variedade de células encontradas em PBMCs seriaesperada resultar em confusão nas leituras de impedância devido à aderên-cia não-específica ao substrato. Surpreendentemente, contudo, os invento-res verificaram que uma alteração na impedância ou índice Celular após adi-ção de um anticorpo e PBMCs é uma indicação acurada de ADCC de célu-las-alvo. Sangue total, ou sangue que foi pelo menos parcialmente purificadode tal modo que seja enriquecido, ou parcialmente enriquecido, de célulasefetuadoras (por exemplo, PBMCs), também poderá ser útil nos métodosproporcionados neste relatório.

Os métodos proporcionados neste relatório apresentam umaampla variedade de aplicações clínicas. Conforme discutido acima, existempolimorfismos em receptores Fc humanos que apresentam um efeito na ca-pacidade de células efetuadoras ligar-se a um anticorpo, e que desse modopoderá afetar á capacidade das células efetuadoras mediar ADCC. A çapa-cidade de células efetuadoras em um indivíduo ligar um anticorpo terapêuti-co pode apresentar um impacto maior na eficácia clínica do anticorpo. Porexemplo, o anticorpo anti-CD20 IgG Rituxan® usado no tratamento de ma·Iignidades Iinfoproliferativas B pode gerar um melhor resultado clínico empacientes homozigotos do genótipo de FcyRIII 158V do que em pacienteshomozigotos do genótipo de FcyRIIH58F, possivelmente devido ao fato deque células NK transportando FcyRIII158V ligam-se mais eficazmente à re-gião Fc de Rituxan®.

A capacidade de utilizar PBMCs de indivíduos (por exemplo, pa-cientes) como células efetuadoras significa que os métodos proporcionadosneste relatório podem ser usados para determinar, se um anticorpo terapêu-tico particular é adequado para tratamento de um paciente particular queapresenta uma doença ou distúrbio associado a células-alvo. Conseqüente-mente, em algumas modalidades, as células efetuadoras podem ser PBMCsobtidas de um paciente que apresenta uma doença associada a células-alvo,e o anticorpo pode ser um anticorpo candidato terapêutico para tratar o paci-ente. Este documento desse modo proporciona métodos de identificação deum indivíduo como apresentando uma doença associada a células-alvo queé adequado para tratamento com um anticorpo candidato. Os métodos po-dem compreender (a) monitorar impedância entre os eletrodos em um subs-trato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo associadas àdoença; (b) adicionar PBMCs isoladas do paciente e do anticorpo candidatoa células-alvo; e (c) determinar se uma alteração na impedância entre oseletrodos no substrato ocorre após adição das PBMCs e do anticorpo, emque uma diminuição na impedância entre os eletrodos é indicativa de ADCCe desse modo da adequabilidade do paciente para tratamento com o anti-corpo.

Em algumas modalidades, as células-alvo podem ser célulasassociadas a malignidades Iinfoproliferativas B, e o anticorpo candidato podeser Rituxan®. De acordo com tais modalidades, métodos conforme propor-cionados neste relatório podem ser usados para determinar se um pacienteque apresenta uma malignidade Iinfoproliferativa B é adequado para trata-mento com Rituxan®. O método poderá, naturalmente, ser conduzido comPBMCs de um paciente particular em combinação com qualquer um dos ou-tros anticorpos e células-alvo descritos neste relatório para identificar o anti-corpo ótimo para tratamento do paciente. Adicionalmente, quando PBMCssão identificadas como capazes de induzir ADCC em combinação com umanticorpo particular, o genótipo das PBMCs poderá ser determinado e asPBMCs de outros indivíduos poderão ser testadas usando métodos de geno-tipagem padrão para estabelecer se elas são adequadas para tratamentocom esse anticorpo.

Onde PBMCs de um indivíduo são usadas como as células efe-tuadoras, as células-alvo também poderão ser células do indivíduo (por e-xemplo, células cancerosas obtidas de uma biópsia), de tal modo que o mé-todo seja um método personalizado de determinação se um anticorpo candi-dato particular em combinação com as PBMCs do indivíduo é capaz de ma-tar células-alvo no paciente por meio de ADCC. À medida que a maior partedos produtos de anticorpos tornam-se disponíveis, os métodos proporciona-dos neste relatório permitirão seleção do melhor produto de anticorpo paraotimizar resultados clínicos em um paciente particular.

Os métodos proporcionados neste relatório também podem seradaptados para selecionar compostos para a capacidade de aumentar oudiminuir ADCC induzido por diferentes combinações de células efetuadorase anticorpos. Conseqüentemente, esse documento proporciona métodos deselecionar compostos para a capacidade de modular ADCC. Os métodospodem compreender (a) monitorar a impedância entre os eletrodos em umsubstrato não-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em ummeio de ensaio; (b) adicionar o composto, células efetuadoras, e um anticor-po que se liga a células-alvo ao meio de ensaio; e (c) determinar se o com-posto modula ADCC comparando qualquer alteração na impedância entre oseletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpona presença do composto com qualquer alteração na impedância entre oseletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpona ausência dó composto.

Conforme discutido neste relatório, uma diminuição na impedân-cia após adição de células efetuadoras e do anticorpo é indicativa de ADCCter sido efetuado no meio de ensaio. Uma diminuição adicional na impedân-cia observada na presença de um composto que é selecionado poderá seruma indicação que o composto aumenta ADCC. Inversamente, um aumentona impedância na presença do composto poderá ser uma indicação que ocomposto diminui ADCC. Em algumas situações, poderá ser desejável iden-tificar compostos que aumentam ADCC. Por exemplo, os métodos poderãoser usados para identificar compostos que aumentam a resposta de ADCCinduzida por um anticorpo terapêutico e PBMCs contra células cancerosas.

Em outras situações, poderá ser desejável identificar compostos que dimi-nuem ADCC. Por exemplo, os métodos poderão ser usados para identificarcompostos que diminuem a resposta de ADCC induzida por anticorpos ePBMCs de um paciente com uma doença auto-imune contra células-alvosadias. A descoberta que um composto não age como um modulador deADCC também poderá ser útil em algumas situações, uma vez que issomostra que o composto (o qual poderá ele próprio apresentar uma outra fina-lidade terapêutica) não interfere com a capacidade de uma combinação decélula efetuadora-anticorpo particular induzir ADCC.

Tais métodos podem empregar qualquer uma das células-alvo,células efetuadoras e anticorpos descritos neste relatório. Em algumas mo-dalidades, a combinação célula efetuadora-anticorpo empregada pode seruma combinação que já foi identificada como sendo capaz de induzir umaresposta de ADCC contra as células-alvo em questão. O composto que deveser selecionado pode ser adicionado às células-alvo ao mesmo tempo comoas células efetuadoras e o anticorpo. Alternativamente, o composto que deveser selecionado pode ser adicionado às células-alvo antes das células efetu-adoras e do anticorpo, ou após as células efetuadoras e o anticorpo.Compostos que podem ser selecionados para a capacidade demodular ADCC nos métodos proporcionados neste relatório incluem, masnão se restringem aos mesmos, peptídeos, peptóides, proteínas, lipídeos,metais, moléculas pequenas orgânicas, aptâmeros de RNA, antibióticos eoutros produtos farmacêuticos conhecidos, poliaminas, e combinações ouderivados destes. Moléculas pequenas orgânicas tipicamente apresentamum peso molecular de aproximadamente 50 dáltons a aproximadamente2.500 dáltons (por exemplo, de aproximadamente 300 a aproximadamente800 dáltons).

Compostos candidatos podem ser derivados de grandes biblio-tecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, bibliotecas de com-postos sintéticos são comercialmente disponíveis de MayBridge ChemicalCo. (Revillet, Cornwall, RU) ou Aldrich (Milwaukee, Wl). Alternativamente,bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngi-cos, vegetais e animais poderão ser usadas. Adicionalmente, compostoscandidatos poderão ser sinteticamente produzidos usando química combina-tória como compostos individuais ou como misturas.

Em algumas modalidades, o composto que deve ser selecionadopode ser um composto que é já usado no tratamento de uma doença com oqual as células-alvo associam-se, e o anticorpo poderá ser um anticorpo de-senvolvido para o tratamento dessa doença. Por exemplo, onde as células-alvo são células cancerosas, o composto a ser selecionado pode ser um a-gente quimioterapêutico e o anticorpo pode ser um anticorpo terapêutico de-senvolvido para o tratamento de câncer. Métodos conforme proporcionadosneste relatório desse modo podem ser usados para determinar se o agentequimioterapêutico aumenta ou diminui morte das células-alvo pelo anticorpopor meio de ADCC. Similarmente, o composto que deve ser selecionado podeser um que modula ADCC em um paciente com um distúrbio auto-imune. Emtais casos, o anticorpo a ser adicionado pode ser um anticorpo que causa ati-vidade auto-imune via ADCC em um indivíduo com uma doença auto-imune.

Em algumas modalidades, os métodos descritos neste relatóriopodem ser métodos em alta escala que simultaneamente avaliam a capaci-dade de combinações múltiplas de anticorpos, células efetuadoras e células-alvo para produzir uma resposta de ADCC, opcionalmente na presença decompostos que poderão modular a resposta de ADCC. Em tais modalidades,as células-alvo podem ser plaqueadas em um substrato não-condutor con-tendo duas ou mais cavidades, cada cavidade compreendendo pelo menosdois eletrodos, e o método pode incluir monitoração de qualquer alteraçãona impedância entre os eletrodos em cada cavidade individual. O sistemaRT-CES® e software associado descrito neste relatório são adaptados parauso em ensaios em alta escala.

Em algumas modalidades, as células-alvo, anticorpos e célulasefetuadoras adicionados a cada cavidade poderão ser as mesmas ou dife-rentes dependendo do propósito do ensaio. Em algumas modalidades, porexemplo, o método pode ser usado para simultaneamente testar a capaci-dade de anticorpos candidatos terapêuticos múltiplos induzir ÂDCC contrauma variedade de células-alvo na presença de PBMCs de um paciente ouPBMCs de diversos pacientes. Tais métodos em alta escala também podemser usados para simultaneamente testar a capacidade de um único anticorpocandidato induzir ADCC contra a mesma célula-alvo, ou uma variedade dediferentes células-alvo, na presença das mesmas células efetuadoras sobuma variedade de concentrações de anticorpos. Além disso, tais métodos• em alta escala podem ser usados para simultaneamente comparar a cinéticade ADCC de uma variedade de diferentes anticorpos. Ensaios em alta esca-la também podem ser usados para selecionar compostos em relação à ca-pacidade de modular respostas de ADCC, conforme discutidas acima.

Adicionalmente, uso de um método conforme descrito neste rela-tório como parte de um método em alta escala permite que experimentos decontrole sejam conduzidos em paralelo ao método de ensaio de atividade deADCC descrito acima. Por exemplo, um ensaio de controle adequado podeincluir plaqueamento e crescimento de células-alvo e monitoração de impe-dância na ausência de células efetuadoras e anticorpo. Experimentos decontrole adicionais poderão compreender adicionar células efetuadoras iso-ladas ou adicionar anticorpo isolado a células-alvo plaqueadas.A invenção será adicionalmente descrita no seguinte exemplo, oqual não limita o escopo da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLO

1. Introdução

O sistema ACEA Biosciences (San Diego, CA) RT-CES® (RealTime Celi Electronic ββηεοή utiliza uma leitura (readout) eletrônica de impe-dância para não-invasivamente quantificar status celular em tempo real. Cé-lulas são semeadas em placas de microtitulação E-Plate {ACEA Bioscien-ces), as quais são integradas com ensaios de sensor microeletrônico. A inte-ração de células com a superfície de microeletrodos leva à geração de umaresposta de impedância célula-eletrodo, a qual indica o status das célulasem termos de morfologia, qualidade de adesão e número.

Usou-se o sistema de ACEA para desenvolver um ensaio deADCC em tempo real de células aderentes. Foram usadas duas linhagenscelulares: SKBR3 (uma linhagem celular de adenocarcinoma da glândulamamaria); e MG63 (uma linhagem celular osteoblástica). SKBR3 é uma li-nhagem celular aderente que superexpressa o antígeno HER-2. Herceptin®,um anticorpo humanizado contra HER-2, media morte de células SKBR3 pormeio de ADCC na presença de células efetuadoras. MG63 é uma linhagemcelular aderente que superexpressa M-SCF. Chir-RXI, um anticorpo IgGIhumanizado contra M-CSF, media ADCC contra células MG63 na presençade células efetuadoras.

Experimentos foram conduzidos para determinar se o sistema deACEA pode ser usado para monitorar morte em tempo real de células-alvoSKBR3 e MG63 por meio de ADCC mediadas por células efetuadoras PBMCe Herceptin® ou RX-1.

2. Preparação de célula-alvo, anticorpo e PBMCCélulas SKBR3 (ATCC, Manassas, VA\ catálogo N0 HTB-30)foram cultivadas no Meio DME-15.

Anticorpo humanizado Herceptin® (Genentech Corporation,South San Francisco, CA·, nome comercial Trastuzumab) foi reconstituídocom água para produzir uma solução de estoque de 21 mg/ml antes de uso.Herceptin® é estável por 30 dias após reconstituição.

Foram preparadas PBMC humanas frescas de sangue humanoobtidas de doadores voluntários sadios. Amostras sangüíneas venosas hu-manas (8,5 ml)'foram coletadas em tubos de citrato de amônio de tampa ama-rela (ACD-A). Os tubos foram invertidos 10-15 vezes, e sangue total foi remo-vido de cada tubo de tampa amarela e transferido para um tubo cônico de 50ml. Sangue foi diluído 1;3 com PBS em FBS {fetal bovine serum) a 2%. Dozeml de Ficoll-Hypaque {Amersham BiosciencestPiscataway, Λ/J; cat. N0 17-1440-02) forám dispensados lentamente debaixo da mistura de sangue/PBS.As amostras foram centrifugadas sob temperatura ambiente, em 2.350 rpmpor 30 minutos antes de remover a camada superior (plasma/PBS) por meiode aspiração. Camadas de células brancas foram coletadas com pipetas esté-reis e combinadas (pooled) em um tubo cônico de 50 ml. Se grumos (clumps)de WBC visíveis permaneceram abaixo da camada de células brancas, tudodo material WBC foi coletado, com cuidado para não remover excesso de Fi-coll-Hypaque. PBS estéril-FBS a 2% foi adicionado para levar o volume a 30ml, e a mistura foi misturada por inversão. As suspensões de PBMC diluídasforam centrifugadas em 250 χ g (1.046 rpm de rotor Beekman GH3.8 ) sobtemperatura ambiente por 17 minutos, e o pelete celular foi coletado. O peletede PBMC foi suspenso em 2,5 ml de Meio R-2 (Meio RPMI-1640 com FBS a2% inativado pelo calor), misturado cuidadosamente, e transferido para umtubo cônico de 15 ml. PBMCforam lavadas uma vez com meio R-2, e o núme-ro de células viáveis foi checado por exclusão de azul de tripano (Invitrogencat. N0 15250-061 ou equivalente).

3. Ensaio de morte por ADCC de células SKBR3 por meio de Herceptin® ePBMC

Antes de conduzir o ensaio de ADCC, diversos experimentosforam conduzidos para avaliar o efeito das células SKBR3 isoladas, com oanticorpo Herceptin®, ou com células efetuadoras PBMC, na leitura (rea-dout) do índice Celular do sistema RT-CES®.

As células SKBR3 foram plaqueadas em 40K, 20K, 10K ou 5 Kpor cavidade e colocadas no leitor de RT-CES®. Meio fresco foi adicionadoapós 20 horas e índices Celulares foram monitorados por 100 horas. Con-forme mostrado na Figura 1, o índice Celular aumentou à medida que ascélulas SKBR3 proliferaram. O índice Celular apresentava um limite máximode detecção de células de 60K A 160K por cavidade.

Em experimentos subseqüentes, as células SKBR3 foram pla-queadas em 40K por cavidade. Após 20 horas, meios frescos foram adicio-nados a um grupo de cavidades e PBS contendo Triton X-100 foi adicionadoa um segundo grupo de cavidades, e a placa foi retornada ao dispositivo.Conforme mostrada na Figura 2, uma queda no índice Celular seguida adi-ção de Triton X-100, indicando morte celular.

Em experimentos adicionais, as células SKBR3 foram plaquea-das em 20K por cavidade, e meios isolados, Herceptirm ou anticorpo decontrole IgG foi adicionado 20 horas mais tarde. O adicional de Herceptin®ou IgG isolada não significativamente alterou o índice Celular comparadocom o índice Celular quando nenhum anticorpo foi adicionado (Figura 3).

O índice Celular de células SKBR3 plaqueadas em 20K por ca-vidade foi em seguida comparado com o índice Celular de PBMC adiciona-das a meios isolados sob uma quantidade final de 5 X 105 células por cavi-dade. Surpreendentemente, PMBC não apresentou um efeito significativo noíndice Celular (Figura 4), indicando que o uso de PBMC como células efetu-adoras em um ensaio de ADCC não interferiria com detecção acurada demorte celular de SKBR3. Quando PBMCs foram adicionadas a cavidadescontendo células SKBR3 plaqueadas em 20K por cavidade, o índice Celularcaiu (Figura 5), indicando que células efetuadoras PBMC isoladas apresen-tam um efeito exterminador NK em células-alvo SKBR3.

Conduziu-se um ensaio em seguida para detectar morte de célu-las SKBR3 por ADCC por meio do anticorpo-alvo Herceptin® na presençade células efetuadoras PBMC. Células-alvo foram plaqueadas em 20K porcavidade 20 horas antes do início do ensaio de ADCC. No início do ensaiode ADCC, a, placa foi removida do sistema ACEA temporariamente paraadição de anticorpo e células efetuadoras.

Células efetuadoras PBMC foram adicionadas às células-alvoSKBR3 sob uma razão de 25:1 efetuadora:alvo, juntamente com o anticorpoHerceptin® sob uma concentração final de 5 μς/ηιΙ. A placa celular foi emseguida retornada ao Sistema ACEA para monitoração contínua de índiceCelular em reláção às 48 horas seguintes. A Figura 6 mostra uma compara-ção do índice Celular de células SKBR3 isoladas, células SKBR3 com PBMCe células SKBR3 com anticorpo Herceptin® e PBMC. Registrou-se umaqueda dramática no índice Celular após adicional de PBMC e Herceptin®,refletindo morte de células SKBR3 por meio de ADCC.

O experimento foi repetido usando células SKBR3 com célulasefetuadoras PBMC em uma razão 50:1 ou 12,5:1 E:T, com ou sem Hercep-tin® sob uma concentração de 5 μg/ml. A Figura 7 mostra um curso de tem-po de morte por ADCC nesses experimentos conforme medido em termosde porcentagem de Iise celular, a qual foi calculada de acordo com a seguin-te equação:

<formula>formula see original document page 37</formula>

Os resultados na Figura 7 demonstram um aumento dramático emIise celular na presença de Herceptin® e PBMC como um resultado de ADCC.4. Comparação de ensaio de ADCC em tempo real com ensaio de ADCC deLiberação de Calceína AM

Foram conduzidos experimentos para comparar a % de Iise de-tectada usando o ensaio de ADCC em tempo real com a % de Iise detectadausando um ensaio de ADCC de liberação de Calceína AM padrão.

O ensaio de Calceína-AM foi conduzido usando o seguinte pro-tocolo. Um frasco de Calceína AM (Sondas Moleculares, Eugene, OR\ catá-logo N0 C-3099) em solução de 1 mg/ml em DMSO seco foi descongelado emisturado moderadamente por meio de pipetagem.

Para marcar as células SKBR3, o meio foi removido e a mono-camada lavada com 10 ml de PBS isolado (nenhum soro fetal bovino (FBS)).A monocamada foi desprendida adicionando 5 ml de EDTA/PBS e incuban-do até 10 minutos a 37°C. Dez ml de R10 fresco (meio RPMI-1640 com 10%de FBS inativado pelo calor, Pen/Strep (final 100 μg/ml) e L-glutamina (final2 mM)) foram adicionados. As células foram colhidas, centrifugadas e conta-das, e 2,5 X 106 células foram transferidas para tubos frescos de 15 ml. Ascélulas foram suspensas em 2,5 ml de R-10 em um tubo cônico de 15 ml, e12,5 μl de Calceína AM (final 5 μΜ) foi adicionado a cada tubo. Os tubos fo-ram incubados por 30 minutos a 37°C em CO2 a 5% umidificado, assegu-rando que a tampa estava solta. As células foram misturadas moderadamen-te a cada 10 minutos para impedir sedimentação. Células marcadas foramlavadas duas vezes com 10 ml de meio R-2 (RPMI-1640 com FBS a 2% ina-tivado pelo calor). As células foram suspensas em meio R-10 para obter 5 X105 células/ml.

As células-alvo SKBR3 foram plaqueadas em 20K por cavidadepara o ensaio de ADCC. No início do ensaio de ADCC, células efetuadorasPBMC foram adicionadas às células-alvo sob uma razão de 25:1, juntamentecom anticorpo de controle IgG ou Herceptin® nas concentrações mostradasna Figura 8. As misturas de células-alvo, células efetuadoras e anticorposforam deixadas incubar-se a 37°C por quatro horas. No fim da incubação, ascélulas foram peletizadas e a liberação de Calceína AM foi medida a partirdo sobrenadante.

A média de controle de meios de fundamento para cada alvo foisubtraída de cada linhagem de células-alvo do indivíduo antes de análise, e aporcentagem mínima para máxima foi calculada usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 38</formula>

O ensaio foi considerado inválido se a porcentagem de liberaçãomínima versus liberação máxima foi maior que 37%. A porcentagem de Iiseespecífica foi calculada a partir da média de pontos tríplices usando a se-guinte equação:

de lise — 100 X média cpm experimental média cpm de liberação espontânea média cpm de liberação máxima média cpm de liberação espontânea

A porcentagem de Iise detectada usando o ensaio de Calceína-AM é mostrada na Figura 8B. A Figura 8A mostra a porcentagem de Iise de-tectada em um ensaio paralelo conduzido usando o sistema RT-CES®. Cé-lulas-alvo SKBR3 foram plaqueadas 18-20 horas antes de adição de célulasefetuadoras PMBC e anticorpos IgG ou Herceptin® nas mesmas razões econcentrações como para o ensaio de Calceína-AM. A porcentagem de Iisedetectada usando o sistema RT-CES foi aproximadamente 2 vezes maiorque a porcentagem de Iise detectada usando marcação com Calceína-AM.Isso poderá ser devido ao fato de que o ensaio de Calceína-AM exige que ascélulas estejam em suspensão, visto que as células são aderentes no ensaiode RT-CES.

5. Ensaio de morte por ADCC de células MG63 por meio de anticorpo mono-clonal RX-1 e PBMC

Células MG63 e SKBR3 foram plaqueadas em 20K células porcavidade, e índices Celulares foram monitorados por 24 horas. Crescimentode células SKBR3 apresentava uma relação linear com o índice Celular, vis-to que crescimento de células MG63 geralmente não apresentava (Figura 9).

Entre aproximadamente 7 horas e aproximadamente 17 horas, contudo,crescimento de células MG63 foi em uma relação aproximadamente linearcom índice Celular, sugerindo que o ensaio de ADCC deve ser realizadodentro desse período de tempo para células MG63.

Conduziu-se um ensaio de ADCC com as células-alvo MG63plaqueadas em 20 K por cavidade. O índice Celular para as células MG63isoladas foi comparado com o índice Celular de células MG63, ao qualPBMC, PBMC e anticorpo de controle IgG, ou PBMC e anticorpo RX1 foiadicionado após 18-20 horas. A razão célula efetuadora PBMC para célula-alvo MG63 em cada experimento foi de 50:1, e o anticorpo foi adicionadosob uma concentração de 5 μg/ml. Conforme mostrado na Figura 10A, o ín-dice Celular caiu após adição de PBMC e RX1 como resultado de ADCC dascélulas MG63. A cinética do ADCC foi, contudo, diferente da cinética obser-vada quando o mesmo experimento foi repetido com células SKBR3 na pre-sença de PBMC, PBMC e IgG, ou PBMC e Herceptin® (Figura 10B). Essesresultados demonstram a utilidade do ensaio de ADCC em tempo real emproporcionar informação detalhada sobre cinética de ADCC.

6. Conclusão

Os ensaios de ADCC descritos neste relatório proporcionam a-perfeiçoamentos sobre métodos correntes de ensaio de ADCC. Ao contráriode ensaios padrão, os ensaios à base de RT-CES® podem ser usados paraseguir morte por ADCC em tempo real, e permitir que a cinética de ADCCseja seguida em detalhes. Os ensaios são mais sensíveis do que outros en-saios de ADCC que são atualmente disponíveis, são mais rápidos, e apre-sentam o potencial de serem otimizados para seleção em alta escala. Alémdisso, os ensaios são sem marcação e não-radioativos, ou exigem níveisreduzidos de marcação, tornando-os mais seguros do que ensaios envol-vendo marcação radioativa, por exemplo. Uma vez que os ensaios podemser conduzidos em células aderentes, sem desprendimento da placa, elespermitem uma avaliação mais acurada de ADCC em células in vivo. Dessemodo, os ensaios de ADCC descritos neste relatório aperfeiçoarão a capaci-dade de ensaiar anticorpos candidatos terapêuticos para atividade de ADCC.

Além disso, os ensaios de ADCC proporcionados neste relatóriopoderão ser usados para identificar populações de pacientes adequadospara tratamento com um anticorpo particular. Conforme discutidos acima, osensaios podem ser conduzidos usando PBMCs como células efetuadoras.Existem polimorfismos nos receptores Fc em células efetuadoras PBMC quepodem afetar a capacidade das células efetuadoras ligar-se a anticorpo-alvoespecífico, e desse modo mediar ADCC. Os ensaios de ADCC proporciona-dos neste relatório são ensaios rápidos e fáceis que podem ser usados paradeterminar se a PBMC de um paciente particular, em combinação com umanticorpo terapêutico, são capazes de mediar ADCC de células-alvo.

No resumo, os métodos de ensaio de ADCC proporcionadosneste relatório apresentam o potencial de alterar o meio que ADCC é medi-do, tanto na indústria de desenvolvimento de fármaco, quanto na pesquisabásica de estudar resposta imune mediada por anticorpos.

OUTRAS MODALIDADES

Deve-se entender que embora a invenção tenha sido descritaem conjunto com a descrição detalhada desta, a descrição precedente pre-tende ilustrar e não limitar o escopo da invenção, a qual é definida pelo es-copo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificaçõesestão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims

1. Método de ensaio de citotoxicidade celular dependente deanticorpos (ADCC), o qual compreende:(a)' monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de en-saio; e(b) adicionar ao meio de ensaio células efetuadoras e um anti-corpo que se liga às células-alvo;em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa defunção de ADCC que foi efetuada no meio de ensaio, e em que um aumentoou nenhuma alteração na impedância entre os eletrodos no substrato apósadição de células efetuadoras e do anticorpo é indicativo de função deADCC não ter sido efetuada no meio de ensaio.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, o qual compreendemedição da impedância em intervalos regulares.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, o qual compreendederivação de um índice Celular (IC) a partir de cada medição de impedânciae determinar se ocorre uma alteração no índice Celular, em que o índice Ce-Iular é derivado de cada medição de impedância usando a fórmula <formula>formula see original document page 41</formula> em que /?*,(/) e RCéiuia(0 são as resistências do eletrodo dependente de fre-qüência sem células ou com células presentes, respectivamente, e N é oriúmero dos pontos de freqüência em que a impedância é medida.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, o qual é conduzido usando o sistema RT-CES®.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, no qual medições de impedância são tomadas a cada 15 minutos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, o qual adicionalmente compreende plaqueamento das células-alvo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual as células-alvo são plaqueadas 18 a 24 horas antes de adição do anticorpo e célulasefetuadoras.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no qual as células-alvo estão em uma monocamada sobre o substrato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no qual as células-alvo são plaqueadas sob uma densidade de entre 2 K e 100 K por cavidade.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no qual as células-alvo são plaqueadas sob uma densidade de entre 15 Ke 25 K por cavidade.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no qual as células-alvo são plaqueadas sob uma densidade de aproxima-damente 20 K por cavidade.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no qual a razão de células efetuadoras para células-alvo (E:T) é 25:1.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no qual a E:T é maior que 10:1.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no qual a E:Té maior que 50:1.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no qual a E:T é maior que 100:1.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o anticorpo é adicionado sob uma concentração de entre apro-ximadamente 1 e aproximadamente 100 μς/ιτιΙ.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o anticorpo é adicionado sob uma concentração de entre apro-ximadamente 1 e aproximadamente 50 ng/ml.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o anticorpo é adicionado sob uma concentração de entre apro-ximadamente 2 e aproximadamente 8 μς/ ml.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a- 18, o qual compreende adicionar ao meio de ensaio dois ou mais anticorposque se ligam às células-alvo.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, o qual compreende adicionar ao meio de ensaio três ou mais anticorposque se ligam às células-alvo.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, o qual compreende adicionar ao meio de ensaio quatro ou mais anticor-pos que se ligam às células-alvo.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, no qual as células-alvo expressam antígenos apicais.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, o qual compre-ende uma etapa preliminar de seleção das células-alvo para expressão deantígeno apical.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, no qual as células-alvo são células cancerosas ou células infectadas vi-ralmente.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, no qual as célu-las-alvo são células cancerosas.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, no qual as célu-las cancerosas são de uma linhagem celular.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, no qual as célu-las cancerosas são células SKBR3 ou MG63.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, no qual as células efetuadoras compreendem células mononuclearessangüíneas periféricas (PBMCs), células exterminadoras (NK), monócitos,células citotóxicas T ou neutrófilos.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, no qual as célu-las efetuadoras são PBMCs.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, no qual a etapa (b) compreende adicionar às células-alvo sangue totalque foi parcialmente enriquecido em relação às células efetuadoras.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-27, no qual a etapa (b) compreende adicionar sangue total às células efetu-adoras, e no qual o sangue total compreende as células efetuadoras.

32. Método de seleção de um anticorpo candidato para a capa-cidade de induzir ADCC contra células-alvo, método este que compreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo no meio de ensaio;e(b) adicionar células efetuadoras e o anticorpo-candidáto que seliga às células-alvo ao meio de ensaio;no qual uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa dacapacidade do anticorpo-candidato efetuar função de ADCC contra as célu-las-alvo, e no qual um aumento ou nenhuma alteração na impedância entreos eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticor-po é indicativo da incapacidade do anticorpo-candidato efetuar função deADCC contra as células-alvo.

33. Método de identificação de um paciente que apresenta umadoença associada a células-alvo que é adequado para tratamento com umanticorpo-candidato, método este que compreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo associado à doença;(b) adicionar PBMCs isoladas do paciente e o anticorpo-candidato às células-alvo; e(c) determinar se ocorre uma alteração na impedância entre oseletrodos no substrato após adição das PBMCs e do anticorpo, em que umadiminuição na impedância entre os eletrodos é indicativa da adequabilidadedo paciente em relação a tratamento com o anticorpo, e em que um aumentoou nenhuma alteração na impedância entre os eletrodos no substrato apósadição das PBMCs e do anticorpo é indicativo da falta de adequabilidade dopaciente a tratamento com o anticorpo.

34. Método de seleção de um composto candidato para a capa-cidade de modular ADCC, método este que compreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo no meio de ensaio.(b) adicionar ao meio de ensaio células efetuadoras e um anti-corpo, na presença e ausência do composto candidato, no qual o anticorpoliga-se às células-alvo; e(c) comparar qualquer alteração na impedância entre os eletro-dos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo na pre-sença do composto candidato com qualquer alteração na impedância entreos eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticor-po na ausência do composto candidato, em que uma alteração na impedân-cia na presença do composto candidato que é maior que qualquer alteraçãona impedância na ausência do composto candidato é indicativa que o com-posto candidato apresenta a capacidade de modular ADCC.

35. Método de seleção, de acordo com a reivindicação 34, noqual o composto a ser selecionado modula ADCC auto-imune relacionada.

36. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, oqual é um ensaio em larga escala, e em que o substrato não-condutor com-preende duas ou mais cavidades de microtitulação, cada cavidade compre-endendo pelo menos dois eletrodos, e que monitora a impedância entre oseletrodos em cada cavidade.

37. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o anticor-po deriva de um paciente com um distúrbio auto-imune.

38. Ensaio de controle de qualidade de um anticorpo, o qualcompreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de en-saio; e(b) adicionar células efetuadoras e o anticorpo ao meio de en-saio, no qual o anticorpo liga-se às células-alvo;em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativaque o anticorpo é adequado para ser liberado para uso na indução deADCC, e em que um aumento ou nenhuma alteração na impedância entreos eletrodos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticor-po é indicativo que o anticorpo não é adequado a ser liberado para uso naindução de ADCC.

39. Ensaio de controle de qualidade para um anticorpo, o qualcompreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de en-saio;(b) adicionar células efetuadoras e o anticorpo ao meio de en-saio, no qual o anticorpo liga-se às células-alvo; e(c) comparar qualquer alteração na impedância entre os eletro-dos no substrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo comqualquer alteração na impedância para uma amostra de controle após adi-ção das células efetuadoras e um anticorpo de controle;em que uma diminuição na impedância após adição das célulasefetuadoras e do anticorpo que é maior que qualquer diminuição na impe-dância para a amostra de controle após adição das células efetuadoras e doanticorpo de controle é indicativa que o anticorpo é adequado para ser Iibe-rado para uso na indução de ADCC, e em que falta de uma diminuição naimpedância após adição das células efetuadoras e do anticorpo que é maiorque qualquer diminuição na impedância para a amostra de controle apósadição das células efetuadoras e do anticorpo de controle é indicativa que oanticorpo não é adequado a ser liberado para uso na indução de ADCC.

40. Ensaio de controle de qualidade, de acordo com a reivindi-cação 39, no qual uma diminuição na impedância após adição das célulasefetuadoras e do anticorpo que é pelo menos 25% maior que a diminuiçãona impedância para a amostra de controle após adição das células efetuado-ras e do anticorpo de controle é indicativa que o anticorpo é adequado a serliberado para uso na indução de ADCC.

41. Método de seleção de um composto candidato para uso co-mo um terapêutico contra uma doença auto-imune, método este que com-preende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de en-saio, em que ais células-alvo são células sadias;(b) adicionar ao meio de ensaio células efetuadoras e um anti-corpo, com e sem o composto candidato, no qual o anticorpo liga-se às célu-las-alvo; e em que as células efetuadoras são PBMCs de um indivíduo diag-nosticado com a doença auto-imune; e(c) comparar qualquer alteração na impedância na presença docomposto candidato com qualquer alteração na impedância na ausência docomposto candidato, em que uma diminuição na impedância na ausência docomposto candidato que é maior que qualquer diminuição na impedância napresença do composto candidato é indicativa que o composto candidato éadequado como um agente terapêutico contra a doença auto-imune, e emque falta de uma diminuição na impedância na ausência do composto candi-dato que é maior que qualquer diminuição na impedância na presença docomposto candidato é indicativa que o composto candidato não é adequadocomo um agente terapêutico contra a doença auto-imune.

42. Método de determinação se um anticorpo-candidato é ade-quado para tratamento de um indivíduo que apresenta uma doença auto-imune, método este que compreende:(a) monitorar impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo associado à doençaauto-imune; e(b) adicionar o anticorpo candidato e PBMCs isoladas do indiví-duo às células-alvo; e(c) determinar se uma alteração na impedância entre os eletro-dos no substrato ocorre após adição das PBMCs e do anticorpo candidato,em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos é indicativa que oanticorpo é adequado para tratamento do indivíduo, e em que a falta de umadiminuição na impedância entre os eletrodos é indicativa que o anticorpo nãoé adequado para tratamento do indivíduo.

43. Método para determinação de uma concentração ótima deum anticorpo para induzir uma resposta de ADCC, método este que com-preende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de duas ou mais amostras de célu-las-alvo em um meio de ensaio; e(b) adicionar células efetuadoras e um anticorpo as duas oumais amostras de células-alvo, no qual o anticorpo liga-se às células-alvo; eem que o anticorpo é adicionado sob diferentes concentrações a duas oumais amostras de células-alvo;em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativa defunção de ADCC que foi efetuada no meio de ensaio, e em que a concentra-ção de anticorpo que resulta na diminuição maior na impedância é determi-nada ser a concentração ótima.

44. Método de determinação se um anticorpo liga-se a um antí-geno apical em uma célula-alvo, método este que compreende:(a) monitorar a impedância entre os eletrodos em um substratonão-condutor que suporta o crescimento de células-alvo em um meio de en-saio; e(b) adicionar células efetuadoras e o anticorpo às células-alvo;em que uma diminuição na impedância entre os eletrodos nosubstrato após adição das células efetuadoras e do anticorpo é indicativaque o anticorpo liga-se a um antígeno apical nas células-alvo.