BRPI0620223A2

BRPI0620223A2 - mutantes de fsh

Info

Publication number: BRPI0620223A2
Application number: BRPI0620223-3A
Authority: BR
Inventors: Marco Muda; Xuliang Jiang; Sean D Mckenna
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2011-11-01
Also published as: IL192096A; WO2008010840A2; ECSP088646A; MX2008008322A; EA200870108A1; AR058615A1; EP1976872A2; MY145839A; US7740862B2; NZ568475A; CA2630857A1; JP5249044B2; CN101341169B; IL192096A0; UA93893C2; ES2543198T3; JP2009521222A; AU2006346358A2; EP1976872B1; EA013975B1

Abstract

MUTANTES DE FSH. A presente invenção refere-se a mutantes de FSH com glicosilação aumentada e meias-vidas mais longas são descritos. O uso de mutantes de FSH para induzir a foliculogénese em pacientes humanos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTANTES DE FSH".

Antecedentes da Invenção

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à reprodução humana. Mais es- pecificamente, a presente invenção refere-se a terapias de fertilização.

2. Descrição da Técnica Relacionada

a. Gonadotropinas

Hormônio folículo-estimulante (FSH) é um membro da família de gonadotrofinas que desempenham papéis-chave na fertilidade humana. As gonadotrofinas, que também incluem hormônio luteinizante (LH) e gonado- trofina coriônica (CG), são heterodímeros, todos consistindo em uma subu- nidade α comum (92 aminoácidos) e uma subunidade β única (111 aminoá- cidos em FSH). As seqüências de aminoácido das formas maduras das su- bunidades ά e β de FSH são mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

FSH humano foi isolado de glândulas pituitárias e da urina pós menopáusica (EP 322.438) e foi produzido recombinantemente em células mamíferas (US 5.639.640, US 5.156.957, US 4.923.805, US 4.840.896, US 5.767.251, EP 211.894 e EP 521.586). As últimas referências também des- crevem o gene de subunidade β de FSH humano. US 5.405.945 descreve um gene de subunidade α humano modificado compreendendo apenas um íntron.

Liu et al., J Biol Chem 1993, 15; 268 (2): 21613-7, Grossmann et a/., Mol Endocrinol 1996 10 (6): 769-79, Roth e Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove et ai, Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yoo et al., J Biol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42), US 5.508.261 e Chap- pel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 descrevem vários estu- dos de relação entre estrutura-função e identificam resíduos de aminoácido envolvidos na ligação e ativação do receptor e na dimerização de FSH.

b. Uso de Gonadotropinas em Técnicas Reprodutivas Assistidas

As gonadotrofinas desempenham papéis cruciais no ciclo repro- dutivo, e seu uso em terapias exógenas é essencial para técnicas reproduti- vas assistidas (ART), tais como fertilização in vitro (IVF), IVF em combinação com injeção de esperma intracitoplasmática (IVF/ICSI) e transferência de embrião (ET), assim como para indução da ovulação (OI) em pacientes ano- vulatórios que sofrem fertilização in vivo naturalmente ou através de insemi- nação intrauterina (IUI).

US 4.589.402 e US 4.845.077 descrevem FSH humano purifica- do que é livre de LH e o uso deste para fertilização in vitro. A EP 322 438 descreve uma proteína com pelo menos 6200 U/mg de atividade de FSH que é substancialmente livre de atividade LH, e em que a subunidade α de FSH e a subunidade β, respectivamente, podem ser do tipo selvagem ou formas truncadas específicas deste.

Terapia prolongada é necessária para obter um efeito terapêuti- co, tipicamente durante 8 a 10 dias consecutivos e algumas vezes até 21 dias para estimular a foliculogênese em mulheres, e durante até 18 meses em homens hipogonadotróficos para induzir a espermatogênese. HFSH re- combinante é tipicamente administrado como uma injeção diária i.m. ou s.c., com desconforto conseqüente e potencial para reação de sítio de injeção local. A diminuição da freqüência da administração facilitaria a terapia e tor- naria a administração de gonadotrofina mais conveniente, mais tolerável e favorável ao paciente,

c. Glicosilacão de FSH

As gonadotrofinas são glicoproteínas, com cada subunidade tendo cadeias laterais de oligossacarídeo ligadas em asparagina (N-ligado) que são importantes para a atividade e função in vivo. A adição de carboi- drato (glicosilação) aos polipeptídeos é um evento pós traducional que resul- ta na adição de cadeias de açúcar aos aminoácidos específicos asparagina (N-ligado) ou serina/treonina (O-ligado). Ao contrário da seqüência de ami- noácido invariante da porção de proteína de glicoproteínas, as estruturas de carboidrato são variáveis, uma característica referida como microeterogenei- dade. Por exemplo, sítios de N-glicosilação na mesma proteína podem con- ter diferentes estruturas de carboidrato. Além disso, mesmo no mesmo sítio de glicosilação em uma glicoproteína dada, diferentes estruturas de carboi- drato podem ser encontradas. Esta heterogeneidade é uma conseqüência da síntese dirigida não padrão de carboidratos.

A N-glicosilação de proteínas ocorre especificamente no padrão de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, e a uma extensão menor no padrão de con- senso Asn-Xaa-Cys1 onde Xaa pode ser qualquer resíduo de aminoácido. Entretanto, a presença de um tripeptídeo de consenso não é suficiente para garantir que um resíduo de asparagina será glicosilado. Por exemplo, a N- glicosilação da seqüência Asn-Pro-Ser/Thr ocorre em uma taxa 50 vezes mais baixa do que o outros padrões de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr.

FSH humano contém quatro sítios de glicosilação N-ligados: dois na subunidade α comum nas posições 52 e 78 e dois na subunidade β nas posições 7 e 24. Carboidratos ligados à subunidade α de FSH são críticos para montagem de dímero, integridade, secreção e transdução de sinal, ao passo que os carboidratos da subunidade β são importantes para montagem de dímero, secreção e liberação do heterodímero da circulação.

Galway et ai, Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100 demonstram que variantes de FSH produzidas em uma linhagem de célula CHO de N- acetilglucosamina transferase-l ou uma linhagem de célula CHO imperfeita no transporte de ácido siálico são tão ativas quanto FSH secretado por célu- las do tipo selvagem ou FSH pituitário purificado in vitro, mas carecidas de atividade in vivo, presumivelmente devido à liberação rápida das variantes inadequadamente glicosiladas no soro. D1Antonio et ai., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7 descrevem várias isoformas de FSH que circulam na corrente sangüínea. As isoformas têm seqüências de aminoácido idênticas, mas diferem em sua extensão da modificação pós traducional. Foi descober- to que o grupo de isoforma menos ácida teve uma liberação in vivo mais rá- pida quando comparado com o grupo de isoforma ácida, possivelmente de- vido a diferenças no teor de ácido siálico entre as isoformas. Além disso, Bishop et aí. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40 concluem que a meia- vida circulatória parece ser o determinante primário da atividade in vivo. Es- tas observações levaram à hipótese que a meia-vida de FSH pode ser au- mentada introduzindo-se sítios de glicosilação adicionais para aumentar o teor de ácido siálico do polipeptídeo. d. Variantes de FSH

Agonistas de FSH com meias-vidas aumentadas foram desen- volvidos fundindo-se o peptídeo carboxiterminal de hCG (CTP) a FSH hu- mano recombinante nativo (rhFSH). A porção de CTP consiste em aminoá- cidos 112-118 a 145 com quatro sítios de glicosilação O-Iigados localizados nas posições 121, 127, 132 e 138. US 5.338.835 e US 5.585.345 descrevem uma subunidade β de FSH modificada estendida no Glu de terminal C com a porção de CTP de hCG. O análogo modificado resultante é estabelecido a ter a atividade biológica de FSH nativo, mas uma meia-vida de circulação prolongada. A US 5.405.945 descreve que a porção terminal carbóxi da su- bunidade β de hCG ou uma variante desta tem efeitos significantes na libe- ração de CG, FSH, e LH.

A US 5.883.073 descreve proteínas de cadeia única compreen- didas de duas subunidades α com atividade agonista ou antagonista para CG, TSH, LH e FSH. A US 5.508.261 descreve polipeptídeos heterodiméri- cos tendo afinidade de ligação para receptores de LH e FSH compreenden- do uma subunidade α hormonal de glicoproteína e um polipeptídeo de subu- nidade β que não ocorre naturalmente, em que o polipeptídeo de subunida- de β é uma cadeia de aminoácidos compreendendo quatro subseqüências unidas, cada uma das quais é selecionada de uma lista de seqüências espe- cíficas. Klein et al. (2003) descreve um análogo de cadeia única de FSH com uma meia-vida aumentada, em que as subunidades α e β são ligadas por um oligopeptídeo contendo dois sítios de glicosilação N-ligados.

O WO 01/58493 descreve 77 mutações que podem ser feitas na subunidade α de FSH e 51 mutações que podem ser feitas na subunidade β de FSH em uma tentativa para melhorar a meia-vida irt vivo de FSH. Além disso, o WO 01/58493 descreve que um ou mais sítios de glicosilação po- dem ser adicionados ao término N de FSH para melhorar sua meia-vida ou inseridos em vários sítios dentro do polipeptídeo de FSH. O WO 01/58493, embora descrevendo que sítios de glicosilação podem ser inseridos no poli- peptídeo de FSH1 ela não forneceu nenhuma orientação como o(s) sítio(s) específico(s) onde um pode inserir um sítio de glicosilação e manter a ativi- dade de FSH. O WO 01/58493 descreve ainda que as subunidades α e β mutantes podem ser usadas individualmente (1 sítio de glicosilação adicio- nal) ou em combinação (2 sítios de glicosilação adicionais). Os 128 mutantes candidatos foram identificados usando-se 50 modelos da estrutura 3D de FSH que foram gerados com base unicamente na estrutura de hCG e um alinhamento de seqüência de FSH e hCG não obstante de apenas 32 % de identidade entre as subunidades β de hCG e FSH. O WO 01/58493 não descreve a produção ou teste de quaisquer subunidades α ou β de FSH on- de um sítio de glicosilação foi introduzido por mutagênese dirigida ao sítio.

O WO 05/020934 descreve GM1, com mutações em ambas as subunidades α è β de FSH1 incluindo uma mutação dupla em β E55N/V57T, isto é, o resíduo E na posição de aminoácido 55 mutado para Neo resíduo V na posição de aminoácido 57 mutado para Τ. A seqüência de aminoácido de β E55N/V57T é mostrada na SEQ ID NO: 3.

Uma necessidade clínica existe para um produto que fornece parte ou todos os efeitos terapeuticamente relevantes de FSH1 e que pode ser administrado em intervalos menos freqüentes quando comparado aos produtos de FSH correntemente disponíveis, e que preferivelmente fornece um nível mais estável de atividade de FSH circulante quando comparado àquele obtenível por tratamento corrente.

A presente invenção é dirigida a tais produtos assim como os meios de fabricar tais produtos.

Sumário

A presente invenção refere-se a moléculas de FSH mutantes, em que a subunidade α de FSH compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3. O FSH pode ser N-glicosilado em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de asparagina do dito FSH mutante. Em uma modalidade N5 da subunidade α mutante da SEQ ID NO: 4 pode ser glicosilado. Em uma outra modalidade N5 da subunidade α mutante da SEQ ID NO: 5 pode ser glicosilado. Em uma modalidade N55 da subunidade β mutante da SEQ ID NO: 3 pode ser glicosilado.

A presente invenção também refere-se a moléculas de DNA iso- ladas que codificam mutantes de subunidade α de FSH selecionados do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5. A presente invenção também re- fere-se a um DNA isolado que codifica uma subunidade β de FSH compre- endendo a seqüência da SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também refere-se a um vetor compreen- dendo o DNA que codifica um mutante de subunidade α de FSH selecionadcT do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5. O vetor pode ser um vetor de expressão.

A presente invenção também refere-se a um vetor compreen- dendo o DNA que codifica um mutante de subunidade β de FSH compreen- dendo a seqüência da SEQ ID NO: 3. O vetor pode ser um vetor de expres- são.

A presente invenção também refere-se a um vetor compreen- dendo um primeiro DNA e um segundo DNA1 em que o primeiro DNA codifi- ca um mutante de subunidade α de FSH selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que o segundo DNA codifica um mutante de subunidade β de FSH compreendendo a seqüência da SEQ ID NO: 3.O ve- tor pode ser um vetor de expressão.

A presente invenção também refere-se a uma célula compreen- dendo um vetor compreendendo o DNA que codifica um mutante de subuni- dade α de FSH selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5. O vetor pode ser um vetor de expressão. A célula pode ser uma célula mamífe- ra, por exemplo, uma célula CHO.

A presente invenção também refere-se a uma célula compreen- dendo um vetor compreendendo o DNA que codifica um mutante de subuni- dade β de FSH compreendendo a seqüência da SEQ ID NO: 3. O vetor pode ser um vetor de expressão. A célula pode ser uma célula mamífera, por e- xemplo, uma célula CHO.

A presente invenção também refere-se a uma célula compreen- dendo um vetor compreendendo um primeiro DNA e um segundo DNA1 em que o primeiro DNA codifica um mutante de subunidade α de FSH selecio- nado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que o segundo DNA codifica um mutante de subunidade β de FSH compreendendo a se- qüência da SEQ ID NO: 3. O vetor pode ser um vetor de expressão. A célula pode ser uma célula mamífera, por exemplo, uma célula CHO.

A presente invenção também refere-se a uma célula compreen- dendo um primeiro e um segundo vetor, em que o primeiro vetor compreen- de o DNA que codifica um mutante de subunidade α de FSH selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e o segundo vetor compreende o DNA que codifica um mutante de subunidade β de FSH compreendendo a seqüência da SEQ ID NO: 3. O(s) vetor(es) pode(m) ser um vetor de expres- são. A célula pode ser uma célula mamífera, por exemplo, uma célula CHO.

A presente invenção também refere-se a um método para pro- duzir um mutante de FSH compreendendo cultivar células mamíferas capa- zes de glicosilar proteínas, em que as ditas células compreendem um primei- ro vetor de expressão compreendendo o DNA que codifica um mutante de subunidade α de FSH selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e um segundo vetor de expressão compreendendo o DNA que codifica um mutante de subunidade β de FSH compreendendo a seqüência da SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade da presente invenção as ditas células compreendem um único vetor compreendendo o DNA que codifica um mu- tante de subunidade α de FSH selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e compreendendo ainda o DNA que codifica um mutante de subunidade β de FSH compreendendo a seqüência da SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também refere-se a uma composição com- preendendo um mutante de FSH e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente, em que a subunidade α de FSH compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que a subu- nidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também refere-se a um método de tratar um mamífero infértil, compreendendo administrar a um mamífero em neces- sidade deste uma quantidade eficaz de um mutante de FSH mutante, em que a subunidade α de FSH compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também refere-se a um método de estimu- lar a foliculogênese em um mamífero, compreendendo administrar a um mamífero em necessidade deste uma quantidade eficaz de um FSH mutan- te, em que a subunidade α de FSH compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3. A presente invenção também refere-se a um método de induzir a hiperestimulação ovariana em um mamífero, com- preendendo administrar a um mamífero em necessidade deste uma quanti- dade eficaz de um FSH mutante, em que a subunidade α de FSH compre- ende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3. Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra um alinhamento dos mutantes de subunidade α GNFT (SEQ ID NO: 4), e GNRT (SEQ ID NO: 5) à subunidade α humana de FSH (SEQ ID NO: 1). Os números de resíduo referem-se à subunidade α humana de FSH (SEQ ID NO: 1) com 1 sendo o primeiro aminoácido do po- lipeptídeo maduro.

A figura 2 mostra uma curva de resposta de dose para as subu- nidades α de FSH mutante comparadas ao FSH do tipo selvagem. Clo- ne 10c-α GNRT/GM1 β. Clone 11c-α GNFT/GM1β.

Descrição Detalhada da Invenção

Embora fosse mostrado que o aumento do teor de carboidrato de FSH pode levar à meia-vida in vivo aumentada, a melhora da meia-vida de FSH é mais complicada do que simplesmente adicionando sítios de glico- silação adicionais. Embora uma seqüência de consenso de glicosilação seja necessária para a adição de carboidrato, ela não é suficiente para garantir que um sítio de adição de carboidrato será utilizado. Outros fatores, tais co- mo a duplicação de proteína local e conformação durante a biossíntese, de- terminam se um oligossacarídeo é ligado em um sítio de seqüência de con- senso dado. Além disso, de modo que a glicosilação adicional leve a um aumento na meia-vida in vivo a seqüência de consenso deve estar em uma posição tal que a glicosilação do sítio não interfere com a ligação do recep- tor, ou comprometer a duplicação, conformação ou estabilidade da glicopro- teína. Até este momento, análogos de FSH com meias-vidas aumentadas foram principalmente limitados a proteínas de fusão em que a porção fundi- da do polipeptídeo incluiu sítios de glicosilação adicionais.

1. FSH Mutante

Um mutante de FSH é fornecido que foi modificado para criar sítios de reconhecimento de glicosilação adicionais. A subunidade α do mu- tante de FSH pode ter uma das mutações seguintes, comparada à subuni- dade α do tipo selvagem: uma inserção da seqüência de aminoácido GNFT entre os resíduos de aminoácido 3 e 4 da subunidade α do tipo selvagem ou uma inserção da seqüência de aminoácido GNRT entre os resíduos de ami- noácido 3 e 4 da subunidade α do tipo selvagem. Um FSH mutante pode compreender qualquer uma das subunidades α mutantes acima em combi- nação com a subunidade β mutante, por exemplo, β GM1 contendo a muta- ção seguinte: E55N/V57T. Um ou mais dos sítios de glicosilação adicionais do FSH recombinante podem ser glicosilados. O um ou mais sítios de glico- silação adicionais do FSH mutante podem ser glicosilados in vitro ou in vivo. Como usado aqui, o termo "mutante GNFT" refere-se à um FSH mutante compreendendo uma subunidade α como apresentado na SEQ ID NO: 4 e uma subunidade β como apresentado na SEQ ID NO: 3. Como usado aqui, o termo "mutante GNRT" refere-se à um FSH mutante compreendendo uma subunidade α como apresentado na SEQ ID NO: 5 e uma subunidade β co- mo apresentado na SEQ ID NO: 3

O mutante de FSH pode ser produzido por qualquer método a- dequado conhecido na técnica. Estes métodos incluem a construção de se- qüências de nucleotídeo que codificam os mutantes de FSH respectivos e que expressam a seqüência de aminoácido em um hospedeiro transfectado adequado. O mutante de FSH também pode ser produzido por síntese quí- mica ou por uma combinação de síntese química e tecnologia de DNA re- combinante.

O mutante de FSH pode compreender as subunidades α e β de FSH na forma de duas cadeias de polipeptídeo separadas, onde as duas cadeias dimerizam in vivo de modo a formar um polipeptídeo dimérico, ou ele pode compreender uma construção de cadeia única compreendendo as duas subunidades covalentemente ligadas por uma ligação de peptídeo ou um Iigante de peptídeo. Os resíduos de aminoácido do peptídeo Iigante po- dem exibir propriedades que não interferem significantemente com a ativida- de do mutante de FSH.

O mutante de FSH pode ter uma meia-vida aumentada compa- rado ao FSH do tipo selvagem. O mutante de FSH também pode ter estabili- dade aumentada comparado ao FSH do tipo selvagem. O mutante de FSH podem compreender oligossacarídeos em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sítios de glicosilação N-ligados. Uma população de mutantes de FSH também é for- necida, que pode compreender uma ou mais isoformas mutantes de FSH, em que cada isoforma compreende oligossacarídeos em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sítios de glicosilação N-ligados.

A seqüência de nucleotídeo que codifica as subunidades α ou β do mutante de FSH pode ser construída isolando-se ou sintetizando-se uma seqüência de nucleotídeo que codifica a subunidade de FSH precursora, tal como o hFSH-alfa ou hFSH-beta com as seqüências de aminoácido mostra- das nas SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo depois pode ser mudada de modo a efetuar a substituição ou inserção dos resíduos de aminoácido relevantes. A seqüência de nucleotídeo pode ser modificada por mutagênese dirigida ao sítio. Na alternativa, a seqüência de nucleotídeo pode ser preparada por síntese química, em que os oligonucleo- tídeos são designados com base na seqüência de aminoácido específica do mutante de FSH.

A seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser inserida em um vetor recombinante e operavelmente ligada a uma seqüência de controle necessária para a expressão do polipeptídeo na célula hospedei- ra transfectada desejada. As seqüências de controle podem ser qualquer componente que é necessário ou vantajoso para a expressão de um polipep- tídeo. Exemplos de seqüências de controle adequadas para conduzir a transcrição em células mamíferas incluem os promotores iniciais e tardios de SV40 e adenovírus, por exemplo, o promotor tardio principal 2 de adenoví- rus, o promotor de MT-1 (gene de metalotioneína) e o promotor de gene i- mediato-inicial de citomegalovírus humano (CMV).

Um versado na técnica pode fazer uma seleção entre estes veto- res, seqüências de controle de expressão e hospedeiros sem experimenta- ção indevida. O vetor recombinante pode ser um vetor autonomamente re- plicante, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, por e- xemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado.

O vetor pode ser um vetor de expressão em que a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da invenção é operavelmente ligado a segmentos adicionais necessários para a transcrição da seqüência de nu- cleotídeo. O vetor pode ser derivado de DNA plasmídico ou viral. Vários ve- tores de expressão adequados para a expressão nas células hospedeiras mencionadas aqui estão comercialmente disponíveis ou são descritos na literatura.

O vetor recombinante pode compreender ainda uma seqüência de DNA que permite que o vetor replique na célula hospedeira em questão. Um exemplo de uma tal seqüência, (quando a célula hospedeira é uma célu- la mamífera) é a origem SV40 de replicação. O vetor também pode compre- ender um marcador selecionável, por exemplo, um gene cujo produto com- plementa um defeito na célula hospedeira, tal como a codificação de gene para diidrofolato redutase (DHFR) ou um que confere resistência a um fár- maco, por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina cloranfenicol, neomi- cina, higromicina ou metotrexato. O vetor também pode compreender um gene amplificável, tal como DHFR, tal que as células tendo cópias múltiplas do gene amplificável e seqüências de flanqueamento, incluindo o DNA de FSH mutante, podem ser selecionadas em meios apropriados.

Também fornecido é um DNA que codifica uma subunidade α do mutante de FSH. A seqüência de nucleotídeo que codifica as subunidades alfa e beta do mutante de FSH, se preparada por mutagênese dirigida ao sítio, síntese, PCR ou outros métodos, também pode incluir opcionalmente uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal. O peptí- deo de sinal pode estar presente quando o polipeptídeo deve ser secretado das células em que ele é expressado. Tal peptídeo de sinal, se presente, pode ser um reconhecido pela célula escolhida para a expressão do polipep- tídeo. O peptídeo de sinal pode ser homólogo (por exemplo, ser aquele nor- malmente associado com uma subunidade de hFSH) ou heterólogo (isto é, originando-se de uma outra fonte exceto hFSH) ao polipeptídeo ou pode ser homólogo ou heterólogo à célula hospedeira, isto é, ser um peptídeo de sinal normalmente expressado da célula hospedeira ou um que não é normalmen- te expressado da célula hospedeira.

Qualquer hospedeiro adequado pode ser usado para produzir os polipeptídeos, incluindo bactérias, fungos (incluindo leveduras), planta, inse- to, mamífero, ou outras células animais apropriadas ou linhagens de célula, assim como animais ou plantas transgênicos. Exemplos de adequado célu- las hospedeiras mamíferas incluem linhagens de célula de ovário de hamster Chinês (CHO), (por exemplo, CHO-KL; ATCC CCL-61), linhagens de célula de Macaco-Verde (COS) (por exemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de camundongo (por exemplo, NSIO), linhagens de célula de Rim de Filhote de Hamster (BI-EK) (por exemplo, ATCC CRL- 1632 ou ATCC CCL-10), e células humanas (por exemplo, BEK 293 (ATCC CRL-1573)), assim como células vegetais em cultura de tecido. Linhagens de célula adequadas adicionais são conhecidas na técnica e disponível a partir de depósitos públicos tais como the American Type Culture Collection, USA. Métodos para introduzir DNA exógeno em células hospedeiras mamí- feras incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por liposso- mo e vetores virais.

As células podem ser cultivadas em um meio nutriente adequa- do para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínua, em porção, alimentada em porção, ou de estado sólido) em fer- mentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isola- do. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conheci- dos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publica- das (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, ele pode ser recuperado direta- mente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado, ele pode ser recuperado de lisatos de célula. Um método de produção de rendimento alto dos mutan- tes de FSH da invenção é através do uso de amplificação por diidrofolato redutase (DHFR) em células CHO deficientes de DHFR, pelo uso de níveis sucessivamente crescentes de metotrexato como descrito na Patente US N2 4.889.803.

O polipeptídeo de FSH mutante resultante pode ser recuperado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ele pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limi- tados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por atomização, evapo- ração, ou precipitação. Os polipeptídeos de FSH mutante podem ser purifi- cados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbico, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos ele- troforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade dife- rencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração.

Também fornecida é uma composição farmacêutica compreen- dendo o mutante de FSH. Tal composição farmacêutica pode ser usada para estimular foliculogênese, por exemplo em combinação com indução da ovu- lação ou técnicas reprodutivas assistidas (ART). Porque o mutante de FSH da presente invenção pode ser eficaz em induzir folículos múltiplos a desen- volverem e amadurecerem, ele pode ser particularmente adequado para o uso em ART, em que ele é desejado para coletar oócitos múltiplos.

O mutante de FSH pode ser usado para induzir monofoliculogê- nese para OI, ou paucifoliculogênese (até cerca de três folículos) para IUI, para fertilização in vivo. A monofoliculogênese também pode ser atingida com uma dose reduzida do mutante de FSH, ou dosagem menos freqüente quando comparada com preparações de FSH convencionais. Por exemplo, em Ol uma preparação de FSH da invenção pode ser administrada em 225 a 400 IU a cada três dias, ou doses mais baixas, dependendo da resposta do paciente. A resposta do paciente pode ser seguida por sonografia.

O mutante de FSH da invenção pode ser usado em um regime de hiperestimulação ovariana controlada (COH). Regimes padrão para COH incluem uma fase de infra-regulação em que o hormônio Iuteinizante (LH) endógeno é infra-regulado por administração de um agonista do hormônio de liberação de gonadotrofina (GnRH) seguido por uma fase estimulatória em que o desenvolvimento folicular (foliculogênese) é induzido por adminis- tração diária de hormônio folículo-estimulante (FSH), usualmente em cerca de 150 a 225 lU/dia. Alternativamente a estimulação pode ser iniciada com FSH depois da menstruação espontânea ou induzida, seguido por adminis- tração de um antagonista de GnRH (tipicamente iniciando em torno do dia seis da fase estimulatória). Quando existem pelo menos 3 folículos >16 mm (um de 18 mm), um único bolus de hCG (5 a 10.000 IU) pode ser fornecido para imitar o surto de LH natural e induzir a ovulação. A recuperação de oó- cito pode ser cronometrada por 36 a 38 horas depois da injeção de hCG.

O mutante de FSH também pode ser usado para Ol e IUI. Por exemplo, a estimulação de FSH pode ser iniciada depois da menstruação espontânea ou induzida, em uma dose diária de 75 a 150 IU. Quando 1 ou 3 folículos atingiram um diâmetro de pelo menos 16 mm, um único bolus de hCG pode ser administrado para induzir a ovulação. A inseminação pode ser realizada in vivo, por intercurso regular ou IUI.

Porque o mutante de FSH pode ter uma meia-vida aumentada

com respeito a preparações de FSH do tipo selvagem, regimes tais como aquele descrito acima podem utilizar doses IU mais baixas de FSH, e/ou po- dem ser modificados diminuindo-se o período de estimulação de FSH, en- quanto obtendo a mesma resposta ou melhor, em termos de número e viabi- lidade de folículos. Por exemplo, a foliculogênese adequada pode ser obtida com doses diárias em ou de cerca de 50 a 150, 50 a 100 ou 50 a 75 IU de FSH. A dosagem de FSH pode estar em uma base diária ou semidiária. O período de dosagem pode ser menor do que ou cerca de 14, 12, 11 ou 10 dias. Para OI, a preparação do mutante de FSH pode ser administrada em doses de 25 a 150 ou 50 a 125 IU de FSH/dia. Para o tratamento de infertili- dade masculina, uma preparação de mutante de FSH pode ser administrada em 3 X 150 a 300 lU/semana até que a espermatogênese atinja níveis ade- quados para a inseminação, através de intercurso regular ou técnicas de ART.

Por causa da meia-vida mais longa do FSH mutante, ele pode ser administrado como uma preparação de ação longa, que pode ser admi- nistrada menos freqüentemente do que a cada dois dias. FSH convencional pode ser administrado em ou cerca de 300 IU de dois em dois dias, enquan- to obtendo resultados similares à administração a cada dia em ou cerca de 150 IU. O FSH mutante pode ser administrado a cada 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, enquanto obtendo resultados similares ou melhores do que a administração diária de FSH convencional.

O mutante de FSH pode ser usado para a fabricação de um me- dicamento para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições. Em um outro aspecto, o polipeptídeo ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção são usados em um método de tratar um mamífero, em particular um ser humano, compreendendo administrar ao mamífero em necessidade deste tal polipeptídeo ou composição farmacêutica.

Estará evidente àqueles versados na técnica que uma quantida- de eficaz de um polipeptídeo, preparação ou composição depende, interalia, da doença, da dose, do programa de administração, se o polipeptídeo ou preparação ou composição são administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia-vida sérica das composições, e da saúde geral do paciente. Tipicamente, uma dose eficaz da preparação ou composição é suficiente para garantir um efeito terapêutico.

O mutante de FSH pode ser administrado em uma composição incluindo um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes. "Farmaceuticamente aceitável" significa um veículo ou excipiente que não causa nenhum efeito adverso em pacientes aos quais ele é administrado. Tais veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem- conhecidos na técnica, e o polipeptídeo pode ser formulado em composições farmacêuticas por métodos bem-conhecidos (ver por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18â edição, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e Hand- book of Pharmaceutical Excipients, 3â edição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser u- sados em composições compreendendo o polipeptídeo incluem, por exem- plo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonifica- dores, tensoativos não tônicos ou detergentes "agentes umectantes"), antio- xidantes, agentes de volume ou enchedores, agentes quelantes e cossolven- tes.

A composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH pode ser formulada em uma variedade de formas, incluindo líquidos, por e- xemplo, soluções ou suspensões prontas para o uso, géis, liofilizada, ou qualquer outra forma adequada, por exemplo, pó ou cristais adequados para preparar uma solução. A forma da composição pode depender da indicação particular que é tratada e estará evidente a um versado na técnica.

A composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH pode ser administrada intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradér- mica, subcutânea, sublingual, bucãl, intranasal, transdermicamente, por ina- lação, ou em qualquer outra maneira aceitável, por exemplo, usando a tec- nologia PowderJect ou ProLease ou um sistema de injeção por caneta. O modo de administração pode ser dependente da indicação particular que é tratada e estará evidente a um versado na técnica. A composição pode ser administrada subcutaneamente, que pode permitir que o paciente conduza a auto-administração.

As composições farmacêuticas podem ser administradas em combinação com outros agentes terapêuticos. Estes agentes podem ser in- corporados como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente dos polipeptídeos, concorrentemente ou de acordo com qualquer outro programa de tratamento aceitável. Além disso, o polipeptídeo, preparação ou composição farmacêutica podem ser usados como um adjunto a outras terapias.

A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos exemplos não limitantes seguintes.

Exemplo 1

Mutantes de FSH

A estrutura de cristal 3D de FSH humano foi usada para identifi- car regiões na molécula de FSH onde um sítio de glicosilação candidato po- de ser inserido. Duas moléculas de FSH (quatro subunidades) estão presen- tes em cada unidade assimétrica da estrutura de cristal. As duas moléculas de FSH foram sobrepostas e comparadas, com cada resíduo sendo visual- mente inspecionado para identificar sítios potenciais onde um sítio de N- glicosilação pode ser inserido que não interromperia a própria duplicação do polipeptídeo de FSH ou reduziria a atividade de FSH. A estrutura de FSH cristalográfica foi combinada com o conhecimento da interação de receptor FSH/FSHR para ajudar ainda na seleção de sítios de N-glicosilação potenci- ais. Os critérios de projeto principais foram interrupção mínima da estrutura 3D, interrupção mínima da ligação prognosticada e sítios de ativação, e es- trutura 3D prognosticável compatível com a glicosilação. Com base nos crité- rios acima, os dois mutantes de inserção seguintes da subunidade α de FSH foram preparados:

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Exemplo 2

Análise Morfológica de Mutantes de FSH

Alíquotas de sobrenadantes de cultura concentrados a partir da expressão transitória de mutantes de subunidade α de FSH 1 a 2 foram ana- lisadas por SDS-PAGE sob condições de não redução que permite a resolu- ção de heterodímeros de FSH intactos a partir de subunidades α e β livres. Comparando-se os pesos moleculares aparentes de cada heterodímero mu- tante àquele de FSH do tipo selvagem, uma pessoa é capaz de determinar se o FSH mutante é hiperglicosilado em relação a FSH do tipo selvagem. Brevemente, depois da eletroforese, proteínas foram eletroforeticamente transferidas a PVDF e visualizadas usando anticorpo Serono 9 a 14 dirigido contra a subunidade α de FSH. Como um controle, FSH do tipo selvagem humano, GM1 mutante, FSH-CTP e Gonal F também foram analisados. A Tabela 1 mostra o peso molecular aparente do heterodímero formado pelos mutantes de subunidade α e subunidade β do tipo selvagem quando calcu- lado com base em padrões de peso molecular.

Tabela 1

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Como mostrado na Tabela I, cada um dos dois mutantes de FSH expressados, isto é, inserções de GNFT e GNRT, mostrou glicosilação au- mentada como evidenciado por um deslocamento da distribuição do peso molecular aparente do heterodímero comparado ao FSH do tipo selvagem humano.

Exemplo 3

Função In Vitro de Mutantes de FSH

De modo a determinar a atividade dos mutantes de FSH1 cada mutante foi testado quanto à capacidade para estimular a produção de cAMP em uma linhagem de células CHO que expressa recombinantementè o receptor de FSH humano. Células CHO-FSHR foram mantidas em meio de crescimento de FSHR [MEM a(-) (Gibco, catN°12561-056) + 10 % de FBS dialisada (Gibco, catN°26300-020) + 600 pg/ml de Geneticin (Gibco, catN°10131-035) + 0,02 μΜ de MTX]. Células CHO-FSHR foram semeadas em 2 χ104 células/cavidade em 100 μl/cavidade (2 χ 10^6 células/10 ml = 1 placa) e incubadas a 37° C durante 24 horas antes do ensaio. As células foram usadas para o ensaio se pelo menos 70 % confluente.

Uma diluição 1:3 serial de 12 pontos foi feita iniciando em 67,5 nM para todas as amostras e padrão interno (Gonal F foi usado como um padrão interno). Todas as diluições foram feitas em meio de ensaio [DMEM/F12 (livre de fenol, Gibco, cat N°11039-021) + 1 mg/ml de BSA (Sigma, A-6003) + 0,1 mM de IBMX (inibidor de 3-isobutil-1-metilxantona fosfodiesterase, Sigma, CatN°I-7018)]. O meio de crescimento foi removido da placa de ensaio, 25 μl de meio de ensaio (fornecido com MA6000 cAMP MSD kit- Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) adicionado, as placas recuperadas e incubadas a 37° C durante 15 minutos. Cavidades depois fo- ram dosadas com 25 μl/cavidade da amostra de teste, misturados, as placas recuperadas e incubadas durante 1 hora a 37° C. Depois da 1 hora de incu- bação, a amostra e o meio foram removidos das cavidades. 25 μl de tampão de Iise padrão (fornecido com MA 6000 Meso Scale Discovery kit) depois foram adicionados a cada cavidade, as placas cobertas com selador de pla- ca (Packard, catNs6005185) e agitadas durante 5 minutos. Depois da incu- bação de Iise de 5 minutos, 25 μl de material de célula Iisada foram transfe- ridos à placa cAMP Meso Scale Discovery (fornecida com o kit MA6000 MSD) e incubados com mistura suave na temperatura ambiente durante 30 minutos. 25 μΙ de conjugado cAMP-AP foram adicionados a cada cavidade e misturados. 25 μΙ de anticorpo anti-cAMP depois foram adicionados a cada cavidade, as placas cobertas com selador de placa e agitadas durante 30 minutos na temperatura ambiente. As placas depois foram lavadas seis ve- zes com 350 μ l/cavidade de tampão de lavagem em um lavador de placa automático. 100 μΙ de realçador de substrato Sapphire Il RTU (pronto para o uso) depois foram adicionados a cada cavidade, as placas cobertas com selador de placa e incubadas 30 minutos no escuro a 25° C. As placas de- pois foram lidas em um segundo por cavidade com níveis baixos de cAMP mostrando um sinal alto e níveis altos de cAMP mostrando um sinal baixo. A curva de resposta de doses dos mutantes de FSH é mostrada na figura 2. Valores de EC50 foram calculados e mostrados na Tabela 2.

Como mostrado na figura 2 e Tabela 2, cada um dos mutantes de FSH tem atividade in vitro comparável àquele de FSH do tipo selvagem. Tabela 2

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Exemplo 4

Meia-vida in vivo de mutantes de FSH Duas porções diferentes de mutante GNFT e mutante GNRT, foram analisadas em estudos farmacocinéticos (PK) separados. Os dois es- tudos foram do mesmo projeto: 33 ratos SD fêmeas imaturos de 21 dias de idade (aprox. 40 g de peso corporal; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram aleatoriamente divididos em 5 grupos de tratamento (n = 6) e 1 grupo de base (n = 3). A escolha de ratos fêmeas imaturos foi fundamentada no uso desta idade e sexo quanto às avaliações biológicas in vivo de ativi- dade de FSH. Os animais nos grupos de tratamento receberam injeções subcutâneas (s.c.) de 4 ug de GM1 (controle), mutante GNFT, mutante GN- RT ou 8 ug de Gonal-F rhFSH (controle). O sangue foi coletado do seio re- tro-orbital a 0 h do grupo de base e em 1, 2, 4, 6, 10, 24, 48 e 72 h dos ani- mais no grupos de tratamento (n = 3/ponto no tempo; ratos foram alternados de modo a não serem sangrados em 2 pontos de amostragem subseqüen- tes). Aproximadamente 0,1 ml de sangue foi coletado de cada rato em cada sangria, e plasma foi colhido e armazenado a -80° C até que analisado por ELISA. O ensaio usado para medir proteínas FSH no soro de ambos os es- tudos foi o DSL FSH Coated Well ELISA (Diagnostics Systems Laboratories, Webster, TX). Cada uma das amostras de soro foi analisada em triplicata.

A meia-vida do mutante GNFT e mutante GNRT é de aproxima- damente 17 horas ao passo que aquela dos controles GM1 e Gonal-F é de aproximadamente 12 h e 8 h, respectivamente. Isto indica que o mutante GNFT e mutantes GNRT têm uma meia-vida mais longa do que FSH do tipo selvagem. Exemplo 5

Atividade Biológica In Vivo

O modelo in vivo usado para avaliar a atividade biológica dos mutantes GNRT e GNFT é o ensaio de ganho de peso ovariano de rato. O tratamento de ratos fêmeas imaturos de 21 dias de idade com FSH ou molé- culas com atividade semelhante a FSH, por exemplo, mutantes GNRT e GNFT, provoca o crescimento de folículos ovarianos e produção de oócitos. Este crescimento é facilmente detectado por medição do peso ovariano no final do período de tratamento. No modelo, a substância a ser testada é for- necida por injeção durante três dias e os ovários são coletados e pesados depois da última dose. Este ensaio foi usado durante várias décadas como a base para avaliar a potência de FSH para produtos clínicos quanto a propó- sitos de rótulo. Ele mede a ação fisiológica relevante de FSH e tem uma cor- relação clara ao desempenho de produtos na clínica.

A atividade in vivo dos mutantes GNRT e GNFT foi comparada àquela de FSH do tipo selvagem. Todas as doses foram definidas com base em equivalência prognosticada de FSH, tomando em consideração a potên- cia in vitro e a meia-vida em ratos. Os mutantes GNRT e GNFT foram des- cobertos possuir atividade de FSH potente com uma magnitude similar àque- la de FSH do tipo selvagem. Seqüência de Listagem <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <120> MUTANTES DE FSH <130> 1115 WO <160> 5

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 92

<212> PRT

<213> Homs sapiens

<400> 1

Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15

Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys

20 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu

35 40 45

Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser

50 55 60

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 15 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phie Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110

<210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> subunidade beta do mutante E55N/V57T <400> 3

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys

20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110

<210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> inserção da subunidade alfa do mutante GNFT <400> 4

Ala Pro Asp Gly Asn Phe Thr Val Gln Asp Cys Pro Glü Cys Thr Leu 1 5 10 15

Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val 65 70 75 80

Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 95

<210> 5 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> inserção da subunidade alfa do mutante GNRT <400> 5

Ala Pro Asp Gly Asn Arg Thr Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu 1 5 10 15

Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys 50 55 60

Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val 65 70 75 80

Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 95

Claims

1. Ácido nucléico que codifica uma subunidade α mutante de FSH em que a subunidade α compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4 a 5.

2. Vetor compreendendo o ácido nucléico como definido na rei- vindicação 1.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, em que o vetor é um vetor de expressão.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 2, em que o vetor com- preende ainda um ácido nucléico que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 3.

5. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definido na reivindicação 2.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, em que a célula é uma célula mamífera.

7. FSH mutante, em que a subunidade β compreende a seqüên- cia da ID NO: 3, e em que a subunidade α compreende uma seqüência codi- ficada pelo ácido nucléico como definido na reivindicação 1.

8. FSH mutante de acordo com a reivindicação 7, em que qual- quer um de 0 a 6 resíduos de asparagina são glicosilados.

9. FSH mutante de acordo com a reivindicação 7, em que a su- bunidade α compreende a seqüência ID NO: 4 e em que N5 é glicosilado.

10. FSH mutante de acordo com a reivindicação 7, em que a subunidade α compreende a seqüência da SEQ ID NO: 5 e em que N5 é glicosilado.

11. Método de produzir um mutante de FSH compreendendo: (a) fornecer uma célula compreendendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 1, e um segundo ácido nucléico que codifica a SEQ ID NO: 3; (b) cultivar a célula sob condições que permitem a expressão dos primeiro e segundo ácidos nucléicos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célula é capaz de glicosilar proteína.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célula compreende um único vetor que compreende o ácido nucléico como definido na reivindicação 1, e um ácido nucléico que codifica a SEQ ID NO: 3.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célula compreende um vetor compreendendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 1, e compreendendo ainda um segundo vetor compreendendo um ácido nucléico que codifica a SEQ ID NO: 3.

15. Composição farmacêutica compreendendo o FSH mutante como definido na reivindicação 7, e opcionalmente um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

16. Método de tratar um mamífero infértil, compreendendo admi- nistrar a um mamífero em necessidade deste a composição farmacêutica como definida na reivindicação 15.

17. Método de estimular a foliculogênese em um mamífero, compreendendo administrar a um mamífero em necessidade deste a com- posição farmacêutica como definida na reivindicação 15.

18. Método de induzir a hiperestimulação ovariana em um mamí- fero, compreendendo administrar a um mamífero em necessidade deste a composição farmacêutica como definida na reivindicação 15.