BRPI0613098A2 - mutantes de interferon a2 (ifna2) recombinantes - Google Patents

Abstract

MUTANTES DE INTERFERON <244>2 (IFN<244>2) RECOMBINANTES" A presente invenção fornece mutantes de IFN<244>2 e fragmentos ativos, análogos, derivados, e variantes destes que têm atividade agonista ou antagonista específica melhorada quando comparados com lFN<244>2 tipo silvestre. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo mutantes de IFN<244>2 úteis para o tratamento ou prevenção de câncer, doenças auto-imunes, doenças infecciosas ou distúrbios associados com a expressão aumentada de IFN<244>2.

Description

"MUTANTES DE INTERFERON α2 (IFNa2) RECOMBINANTES"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a mutantes de inter-ferem oí2 recombinantes (IFNa2) , fragmentos, análogos, deri-vados, e variantes deste, tendo atividade antagonista ou a-gonista especifica melhorada comparada com IFNa2 tipo sil-vestre, e às composições farmacêuticas deste, úteis paratratar ou prevenir câncer, doenças auto-imunes, doenças in-fecciosas e distúrbios associados com expressão aumentada deIFNa2 .

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Interferons (IFNs) foram descobertos em 1957 porIsaacs e Lindenmann, e foram nomeados quanto à sua capacida-de de interferir com a proliferação virótica. Os interfe-rons também podem combater infecções bacterianas e parasitá-rias, inibem a divisão de célula, inibem o apoptose espontâ-neo, e promovem ou impedem a diferenciação de células. Combase em sua especificidade receptora, dois tipos de interfe-rons são reconhecidos: Tipo I e Tipo II. Os interferons Ti-po I são uma família de proteínas monoméricas incluindo IFNae IFNq que são produtos de leucócitos, IFNp que é produzidoatravés de fibroblastos, e IFNt que foi descrito somente emespécies unguladas.

O único interferon tipo II conhecido é o IFNy di-mérico que é produzido exclusivamente através de linfócitos.A família de interferon alfa é composta de 13 genes comple-tamente transladados sem intron (excluindo pseudogenes).Cada membro inclui proteínas maduras de 165 ou 166 resíduosde aminoácido, com duas ligações de dissulfeto conservadas:Cysl-Cys98 e Cys29-Cysl38. Um nível elevado de homologia deseqüência (80%) é exibido entre os vários sub-tipos de in-terferon alfa, e cerca de 35% de homologia existe entre es-tes subtipos e o IFNP. Apesar da homologia elevada dos sub-tipos diferentes, suas atividades biológicas, entre eles an-tiproliferativa, antiviral, e imunomodulação, diferem nota-velmente.

A estrutura de vários interferons tipo I foi re-solvida incluindo IFNp de camundongo (UFA, IRMI), IFNp hu-mano (IAUl), IFNa2 humano (1RH2, 1ITF), e IFNx ovino (1B 5L). Estruturalmente, os interferons são os membros da famí-lia de citocina α-helicoidal. Todos os interferons tipo Isinalizam através de um complexo receptor comum composto deIFNARl e IFNAR2. O componente de ligação de ligando princi-pal do receptor de interferon tipo I é IFNAR2, com uma afi-nidade de ligação de -10 nM para IFNa2. A estrutura da par-te extracelular de IFNAR2 consiste em dois domínios tipo i-munoglobulina, com o sítio de ligação de IFNoí2 estando Ioca-lizado no domínio N-terminal e no Ioop de conexão.

IFNARl maduro é uma proteína de 530 aminoácidos,com um segmento de transmembrana composto de 21 resíduos, eum domínio citoplásmico de 100 resíduos. A estrutura daparte extracelular de IFNARl é desconhecida, porém a partirda seqüência alguém pode deduzir que ela é composta de qua-tro domínios imunoglobulina. A ligação de IFNa2 a IFNARl éfraca, com a afinidade medida em uma membrana artificialsendo 1,5-5 μΜ. 0 IFNARl bovino (BoiFNARl) e o IFNARl huma-no (HuIFNARl), são 68% idênticos. Os sub-dominios 2 e 3 deHuIFNARl foram mostrados desempenhar um papel critico na li-gação ao IFNa2. Trocando-se estes sub-dominios com BoIFNARlhomólogo, a afinidade foi aumentada substancialmente. OBoIFNARl solúvel pode ligar interferons humanos com uma afi-nidade de 10 nM, que é 500 vezes maior do que aquela deHuIFNARl. As células de camundongo que expressam IFNAR2 li-gam IFNa2 com uma afinidade de 8 nM, considerando que célu-las que expressam só IFNARl não exibem nenhuma ligação deligando. Em co-expressão de IFNARl e IFNAR2, um aumento dedez vezes na afinidade para IFNoí2 foi observado. Empregandoestudos in vitro em membranas artificiais, foi mostrado quea magnitude do aumento induzido por IFNARl na afinidade deligação do complexo ternário se refere à concentração de su-perficie relativa deste receptor. 0 local do sitio de liga-ção de IFNARl em interferon foi mapeado em IFNp para ser lo-calizado nas hélices B, C, e D e o Ioop DE ao mesmo tempo emque a mutagênese de varredura de Ala de IFNa2 sugeriu que ositio de ligação de IFNARl fosse restrito às hélices B e C.

Vários estudos sugeriram que a formação do comple-xo ternário ocorre em um modo seqüencial, começando comIFNAR2 de ligação de interferon para formar um intermediáriocomplexo, e seguido pelo recrutamento de IFNARl. 0 complexode IFNARl-1FNβ-1FNAR2 foi mostrado ter um 1 :1:1 estequiome-tria. 0 receptor de IFNARl é um componente essencial docomplexo de receptor de interferon, com uma mutação nula deIFNARl, ou a adição de Ab neutralizante contra este receptorque resulta em uma falta completa das respostas antivirais eantiproliferativas a IFNa e IFNp. A associação de IFNARl eIFNAR2, estimula a ativação das cinases intracelulares cons-titutivamente associadas Jakl e Tyk2, levando a uma cascatade fosforilação de tirosina que resulta na dimerização dostransdutores de sinal fosforilados e ativadores de transcri-ção (STATs) , e transporta no núcleo onde eles se ligam àsseqüências de DNA especificas e estimulam a transcrição decentenas de genes responsivos.

As questões restantes têm em vista como os IFNsmuito similares induzem atividades diferenciais no mesmo ti-po de célula. Foi sugerido que as atividades biológicas desub-tipos de IFNa diferentes se correlacionam com suas res-pectivas afinidades de ligação e o tipo de célula empregado.

Os interferons tipo 1 vertebrados são reconhecidospor um único receptor compartilhado, composto de duas prote-ínas de transmembrana (IFNARl e IFNAR2), presentes em suaatividade pelas suas cinases Jak associadas com os fatoresde transcrição Stat como seus alvos principais (Brierley, M.M. & Fish, Ε. N. 2002. Interferon de J Cytokine Res. 22,835-845). Tipicamente reconhecido pelas dobras tipo IgG deseus domínios extracelulares (domínios de hCR), IFNAR2 e IF-NARl são respectivamente considerados como proteínas de li-gação e fatores de transdução acessórios- isto é, as alfas ebetas cadeias de receptores heteroméricos. Uma diferençanas constantes de dissociação de ligando das duas cadeiasestá implícita na definição. Não obstante, ambos contribuemcom a criação de sítios de ligação de afinidade elevada. Acombinação de uma beta cadeia "comum" com cadeias de reco-nhecimento diferentes é uma característica de receptores he-teroméricos que respondem diferencialmente aos ligandos di-ferentes. A capacidade de interagir com alfa-cadeias dife-rentes estabelece conexões de rede potenciais para expressãode receptor diferencial (Kotenko, S. V. & Langer, J. A.2004. Int Immunopharmacol 4, 593-608). Quando, como IFNARl,eles possuem a capacidade de interagir com elementos de viasde sinalização diferentes, eles podem estabelecer conexõespara expressão de gene diferencial (Platanias, L. C. & Fish,Ε. N. 1999. Experimental Hematology 27, 1583-1592).

Os IFNs humanos numeram 12 alfa proteínas não alé-licas distintas, uma beta e uma omega. Como esperado de umafamília com homologia de seqüência marcada, de uma estruturade núcleo 3D compartilhada e de um receptor compartilhado,as atividades dos IFNs Tipo I se sobrepõem. Não obstanteeles podem ser reconhecidos e ainda classificados pelas suasdiferenças de aminoácido e numerosos casos de diferenças re-lativas na atividade foram notados. 0 quadro de emersão éque as diferenças funcionais aparecem somente em contextosfisiológicos específicos. Além de sua ação local ao conce-der proteção antiviral em quase todas células, eles são uni-dos ao desenvolvimento de defesas antivirais de segunda li-nha. Foi notado que uma possível diferença entre os IFNspoderia ser seu potencial ao se ligar firmemente ao IFNARl(Roisman e outros, 2005. JMoI Biol. 353, 271-281).

As atividades diferenciais de IFNs Tipo I foram umobjeto de intensas investigações durante muitos anos. Par-ticularmente foi notado que IFNβ tem um repertório adicionalde atividades sobre IFNa. A análise detalhada das diferen-ças entre este dois IFNs mostrou que IFNP tem uma atividademais elevada geral na ativação de transcrição de genes res-ponsivos de IFN, e é ativo em níveis de IFN reduzidos. Osestudos de ligação sugeriram que a afinidade com respeito aoIFNARl de subunidade acessório é a diferença fundamental en-tre IFNa2 e IFNP (Jaitin, 2006. Mol Cell Biol. 26, 1888-1897).

IFNa2 é conhecido por ter efeitos anti-câncer.Entretanto, este tratamento não é sempre efetivo e às vezesresulta em efeitos colaterais intoleráveis relacionados coma dosagem e duração da terapia. WO 97/12630 descreve o tra-tamento de pacientes de câncer com temozolomida em combina-ção com IFNa2. WO 01/54678 descreve o tratamento de pacien-tes de câncer com temozolomida e interferon pegilado.

A infecção do vírus da hepatite C (HCV) é a infec-ção originada do sangue crônica mais comum nos Estados Uni-dos. Embora várias das novas infecções tenham sido recusa-das, o fardo de infecção crônica é substancial; o Centro pa-ra Controle de Doença estima 3,9 milhões (1,8%) de pessoasinfetadas nos Estados Unidos. A doença do fígado crônica éa décima causa principal de morte entre adultos nos EstadosUnidos, e é responsável por aproximadamente 25.000 mortesanualmente, ou aproximadamente 1% de todas as mortes. Osestudos indicam que 40% de doença do fígado crônica estãorelacionados com HCV, resultando em uma estimativa de 8.000-10.000 mortes a cada ano. A doença do fígado de estágio fi-nal associada ao HCV é a indicação mais freqüente paratransplantação de fígado entre adultos.

A terapia antiviral de hepatite C crônica evoluiurapidamente durante a última década, com melhorias signifi-cantes vistas na eficácia de tratamento. Não obstante, atémesmo com terapia de combinação que usa IFN-α pegilado maisribavirina, 40% a 50% de pacientes falharam a terapia, istoé, são não responsivos ou reincidentes. Estes pacientes a-tualmente não têm nenhuma alternativa terapêutica efetiva.Em particular, os pacientes que tinham fibrose ou cirroseavançada na biópsia do fígado estão em risco significante dedesenvolver complicações de doença do fígado avançada, in-cluindo ascites, icterícia, sangramento varicoso, encefalo-patia, e insuficiência do fígado progressiva, como também umrisco notadamente aumentado de carcinoma hepatocelular.

Esclerose múltipla (MS) é uma doença desmielini-zante crônica, neurológica, autoimune. MS pode causar visãoborrada, perda de visão unilateral (neurite ótica), perda deequilíbrio, coordenação pobre, fala inarticulada, tremores,entorpecimento, fadiga extrema, alterações na função inte-lectual (tal como memória e concentração), fraqueza muscu-lar, parestesias, e cegueira. Muitos indivíduos desenvolveminaptidões progressivas crônicas, porém períodos longos deestabilidade clínica podem interromper os períodos de dete-rioração. Os déficits neurológicos podem ser permanentes ouevanescentes. A patólogia de MS é caracterizada por umaresposta imune anormal direcionada contra o sistema nervosocentral. Em particular, os T-linfócitos são ativados contrao envoltório de mielina do sistema nervoso central que causadesmielinização. No processo de desmielinização, a mielinaé destruída e substituída por cicatrizes de tecido "escleró-tico" endurecido que é conhecido como placa. Estas lesõesaparecem em locais disseminados em todo o cérebro, nervo ó-tico, e espinha dorsal. Os dois tipos de interferon-betaque são aprovados nos Estados Unidos para uso no tratamentode MS são interferon-beta Ia e interferon-beta Ib.

A diabete tipo I, também conhecida como diabeteautoimune ou diabete melito dependente de insulina (IDDM), éuma doença auto-imune caracterizada pela destruição seletivade células pancreáticas através de linfócitos T autorreati-vos (Bach, 1994, Endocr. Rev. 15:516-542). A patologia deIDDM é muito complexa envolvendo uma interação entre um e-vento epigenético (possivelmente uma infecção virótica), ascélulas de ilhota pancreática e o sistema imune em um hóspe-de geneticamente suscetível. Várias citocinas, incluindoIFN-α e IFN-γ, foram envolvidas na patogênese de IDDM em hu-manos e em modelos de animal da doença (Campbell e outros,1991, J. Clin. Invista. 87:739-742). Parece que a expressãolocal de IFN-oí por células ilhotas pancreáticas com respeitoaos estímulos diabetogênicos potenciais tal como vírus podeativar o processo insulítico.

W09304699 descreve um método para tratamento dediabete melito dependente insulina compreendendo administrarum antagonista de IFN-a.

Com base no nível aumentado de expressão de IFN-aem pacientes com lúpus sistêmico eritematoso (SLE), IFN-atambém foi envolvido na patogênese de SLE (Ytterberg e Sch-nitzer, 1982, Arthritis Rheum. 25: 401-406). W002066649descreve anticorpos específicos anti-IFN-α para o tratamentode diabete melito dependente de insulina (IDDM) e lúpus sis-têmico eritematoso (SLE) .

A Publicação do Pedido US No. 20040230040 descrevevariantes de cisteína de α interferon-2. A Publicação doPedido de Patente. US No. 20040002474 descreve homólogos deα interferon que tem atividade antiproliferativa em um en-saio com base em linhagem de célula Daudi humana.

A Patente U.S. No. 4.588.585 descreve IFN-p-lb mu-tado no qual Cysl7 é alterado para Serl7 através de umatransição T a A na primeira base de codon 17, que previne aformação de ligação de dissulfeto incorreta. W02005016371descreve uma composição farmacêutica que compreende um vari-ante de IFN-p-lb humano recombinante melhorado com uma maioratividade específica.

Os tratamentos disponíveis para câncer, doençasinfecciosas, esclerose múltipla, e distúrbios autoimunes as-sociados com expressão aumentada de IFNa2 são caros, efeti-vos somente em uma certa porcentagem de pacientes e efeitoscolaterais adversos não é incomum. Resta uma necessidademédica não atendida de métodos terapêuticos adequados quesejam seguros, de confiança, eficazes, e econômicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos mutantes de IF-Na2 que têm utilidade terapêutica importante. As variantesda invenção têm especificidade melhorada como agonistas ouantagonistas comparado com IFNa2 tipo silvestre.A presente invenção pela primeira vez descreve adescoberta que um mutante de IFNa2 recombinante imita aspropriedades de ligação de IFNβ (SEQ ID NO: 3) e mostra ascaracterísticas fundamentais de atividade de IFNp diferenci-al. Isto inclui atividade antiproliferativa aumentada invitro e in vivo, e infra-regulação específica do receptor deIFNAR2.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente in-venção fornece um polipeptídeo de interferon oc2 recombinante(IFNa2), fragmento ativo, análogo, derivado e variante des-te, onde o referido polipeptídeo compreende uma mutação se-lecionada de pelo menos uma substituição de aminoácido den-tro de resíduos de aminoácido 57-89, e pelo menos uma subs-tituição de aminoácido dos resíduos de aminoácido C terminal159-165, como também combinações destes, onde o referido po-lipeptídeo melhorou a atividade de antagonista ou agonistaespecífica, quando comparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQID NO: 2).

De acordo com algumas modalidades o polipeptídeocompreende pelo menos uma mutação selecionada do grupo queconsiste em H57A (SEQ ID NO: 24), E58A (SEQ ID NO: 25), Q61A(SEQ ID NO: 26), H57Y (SEQ ID NO: 27), E58N (SEQ ID NO: 28),Q61S (SEQ ID NO: 29), e combinações destes, onde o referidopolipeptídeo melhorou a atividade agonista ou antagonistaespecífica, quando comparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQID NO: 2).

De acordo com uma modalidade, a presente invençãofornece um mutante triplo H57A, E58A, Q61A (SEQ ID NO: 5)tendo atividade especifica melhorado quando comparado comIFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

De acordo com outra modalidade, a presente inven-ção fornece um mutante quádruplo N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQID NO: 6) tendo atividade antagonista quando comparado com oIFNa2 tipo silvestre.

De acordo com uma modalidade adicional, a presenteinvenção fornece uma proteína de IFNa2 que compreende umasubstituição do ESLRSKE a KRLKSKE C terminal (SEQ ID NO: 7)tendo atividade específica melhorada quando comparado comIFNoí2 tipo silvestre.

As mutações específicas dos mutantes de IFNa2 dainvenção são cada localizada em uma posição diferente naproteína, e portanto podem ser combinadas para produzir e-feitos adicionais, ou aumentados.

De acordo com uma modalidade, a presente invençãofornece uma variante de IFNoí2 que compreende uma combinaçãodo mutante triplo H57A, E58A, Q61A. e a substituição doESLRSKE a KRLKSKE C terminal (SEQ ID NO: 8), com atividadeespecífica muito elevada.

De acordo com outra modalidade, a presente inven-ção fornece uma variante de IFNa2 que compreende uma combi-nação do mutante quádruplo N65A, L80A, Y85A, Y89A e a subs-tituição do ESLRSKE a KRLKSKE C terminal (SEQ ID NO: 9), comuma afinidade de ligação aumentada a IFNAR2, porém com ati-vidade biológica muito baixa. Esta variante de IFNa2 é ago-ra descrita para atuar como um antagonista de IFN que blo-queia a atividade natural de IFNs através de seus recepto-res.

De acordo com uma outra modalidade, a presente in-venção fornece um mutante triplo H57M, E58D, Q61L (SEQ IDNO: 10) tendo atividade especifica melhorada quando compara-do com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

De acordo com ainda outra modalidade, a presenteinvenção fornece um mutante triplo H57Y, E58N, Q61S (SEQ IDNO: 11) tendo atividade especifica melhorada quando compara-do com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

De acordo com ainda outra modalidade, a presenteinvenção fornece uma variante de IFNa2 que compreende umacombinação do mutante triplo H57M, E58D, Q61L e a substitui-ção do ESLRSKE a KRLKSKE C terminal (SEQ ID NO: 12) tendoatividade especifica melhorada quando comparado com IFNa2tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

De acordo com ainda uma outra modalidade, a pre-sente invenção fornece uma variante de IFNa2 que compreendeuma combinação do mutante triplo H57Y, E58N, Q61S e a subs-tituição do ESLRSKE a KRLKSKE C terminal (SEQ ID NO: 13)tendo atividade especifica melhorada quando comparado comIFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

De acordo com algumas modalidades, a presente in-venção fornece mutantes de IFNa2 PEGilados com atividade es-pecifica aumentada.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãofornece moléculas de DNA que codificam os polipeptideos dainvenção. De acordo com uma modalidade, as moléculas de DNAcompreendem uma seqüência selecionada de SEQ ID NOS: 15-23SEQ ID NOS: 30-35.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção fornece um vetor que compreende uma molécula de DNAda invenção, onde o vetor é capaz de expressar um polipeptí-deo de IFNoí2 mutante em uma célula hospedeira procarióticaou célula hospedeira eucariótica.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente in-venção fornece uma célula hospedeira que compreende um vetorda invenção.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãofornece uma composição farmacêutica que compreende como umingrediente ativo um polipeptideo de interferon a2 recombi-nante (IFNoí2), fragmento ativo, análogo, derivado e variantedeste, onde o referido polipeptideo compreende uma mutaçãoselecionada de pelo menos uma substituição de aminoácido em57-89 resíduos de aminoácido, pelo menos uma substituição deaminoácido dos 159-165 resíduos de aminoácido C terminal,como também combinações destes, onde o referido polipeptideomelhorou a atividade antagonista ou agonista específica,quando comparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2),ainda compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com algumas modalidades, a composiçãofarmacêutica que compreende polipeptideo de interferon a2recombinante (IFNa2), tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-13e SEQ ID NOS: 24-29, fragmentos, análogos, derivado e vari-antes destas.

De acordo com uma modalidade, a referida composi-ção farmacêutica que compreende polipeptideo de interferonα2 recombinante ( IFNoí2 ) tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 5,7, 8, 10, 11, 12 e 13, fragmentos, análogos, derivado e va-riantes destas, onde o referido polipeptideo melhorou a ati-vidade agonista especifica.

De acordo com outra modalidade, a composição far-macêutica que compreende polipeptideo de interferon α2 re-combinante (IFNa2) tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 6 e 9,fragmentos, análogos, derivado e variantes destas, onde oreferido polipeptideo melhorou a atividade antagonista espe-cifica.

De acordo com um outro aspecto, a presente inven-ção fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbioou doença associada com a modulação de IFN compreendendo ad-ministrar a um indivíduo em necessidade disto uma quantidadeterapeuticamente efetiva da composição farmacêutica da in-venção, onde o referido distúrbio ou doença é selecionado dogrupo que consiste em câncer, doença auto-imune e doença in-fecciosa.

De acordo com uma modalidade, a referida doençaauto-imune é esclerose múltipla (MS). De acordo com uma mo-dalidade preferida, a referida MS é selecionada do grupo queconsiste em MS remitente reincidente, MS progressiva secun-dária, MS progressiva primária, e MS reincidente progressiva.

De acordo com algumas modalidades, os mutantes deIFNa2 que têm qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 10, 11,12 e 13 são úteis para tratar ou prevenir MS.

De acordo com uma modalidade, o referido câncer éselecionado do grupo que consiste em leucemia da célula pi-losa, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, leucemia mieloge-nosa crônica, linfoma não Hodgkins e melanoma.

De acordo com outra modalidade, a presente inven-ção fornece um método para inibir o crescimento de célulasde câncer, compreendendo expor as células cancerosas a umaquantidade terapeuticamente efetiva de um mutante de IFNa2que tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 10, 11, 12 e13, fragmentos, análogos, e derivado destas.

De acordo com uma modalidade, a referida doençainfecciosa é infecção de vírus de hepatite.

De acordo com algumas modalidades a referida hepa-tite é selecionada do grupo que consiste em hepatite A, he-patite B e hepatite C.

De acordo com outra modalidade, os mutantes de IF-Nα2 que têm qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 10, 11, 12e 13 são úteis para tratar ou prevenir infecção de virus dehepatite infecciosa.

De acordo com uma modalidade adicional, a presenteinvenção descreve métodos de tratamento ou profilaxia dedistúrbios associados com a expressão aumentada de IFNa2 queinclui porém não está limitada a diabete melito dependentede insulina (IDDM) e lúpus sistêmico eritematoso (SLE) com-preendendo administrar a um indivíduo em necessidade desteum mutante de IFN-a2 que tem SEQ ID NOS: 6, e 9, fragmentos,análogos, e derivado destas.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente in-venção fornece o uso dos mutantes de IFNoí2 da invenção paraa preparação de um medicamento para o tratamento ou preven-ção de distúrbios ou doenças associadas com a modulação deIFN.

Estas e outras modalidades da presente invenção setornarão evidentes junto com as figuras, descrição e reivin-dicações que seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURAS 1A-1C mostram a imobilização do receptorde Interferon tipo I-dominio extracelular (IFNAR1-EC) porcaptura de afinidade e ligação de IFNa2. FIG. IA mostra acurva de ligação para capturar IFNARl com mAbDB2imobilizado, seguiu por reticulação com mAb AA3. FIG. IBmostra a análise de afinidade em estado estável. A ligaçãode IFNa2 E58A (cinza espesso) e E96A (preto fino) em concen-trações diferentes entre 0,25 e 4 μΜ (veja números na figu-ra), ao IFNARl imobilizado na superfície. FIG. IC mostra areação de dissociação de IFNoí2 , ΙΡΝβ e o mutante triploH57A, E58A, Q61 UM (SEQ ID NO: 5) de IFNARl-EC de superfícieimobilizada seguido em tempo real. A taxa de dissociação érelacionada diretamente com a afinidade de ligação, com osdados resumidos nas Tabelas 1 e 3.

FIGURA 2 mostra a análise de mutante de ligação deIFNARl e IFNAR2 ao IFNa2. Os interferons tipo I são alinha-dos relativo ao IFNoí2. Os resíduos que são sublinhados sãoaqueles que o mutante para Ala não mudou se ligando a qual-quer receptor. Os sinais " + " e "-" acima simbolizam se amutação causou um aumento ou diminuição na afinidade de li-gação de IFNa2 na mutação (veja Tabela 1) . 0 número acimasimboliza se a mudança é devido à ligação ao IFNARl (1) ouIFNAR2 (2). Os resíduos C-terminais em IFNa8 estão em ne-grito para marcar as mudanças feitas em SEQ ID 7. Os resí-duos em caixas são aqueles referindo-se a SEQ ID 5-13.

FIGURAS 3A-3B mostram o epítopo funcional para li-gação de IFNARl em IFNa2. FIG. 3 mostra uma plotagem da mu-dança em afinidade de ligação de todas as proteínas mutantesanalisadas por nós para ambos IFNARl e IFNAR2. FIG. 3B mos-tra uma representação de superfície de um modelo do complexode IFNa2 com IFNAR2 como previamente determinado. Os resí-duos que sob mutação alteram a ligação ao IFNARl são deter-minados números. Os resíduos que na mutação aumentam a afi-nidade de ligação em > 2 vezes são sublinhados (57, 58, 61).Este quadro foi composto com PyMoI.

FIGURA 4A-4C mostra a dependência de concentração

da resposta antiviral e antiproliferativa de interferons emcélulas WISH. FIG. 4A mostra um grupo de dados brutos daresposta antiproliferativa sob administração de uma diluiçãoem série de interferon a uma faixa de 250 nM-0,48 pM de IF-Na2 e 125 NM - 0,24 pM e IFNp. FIGURAS 4B e 4C mostram asleituras de densitometria para três experimentos antiprole-ferativos (4B) e antivirais (4C) independentes também inclu-indo o mutante triplo H57A, E58A, Q61A (SEQ ID NO: 5) . Osdados são de exibição de 6 repetições, incluindo o erro pa-drão. A curva foi ajustada por uma equação de resposta dedose, e representa o melhor ajuste para os dados combinados.

FIGURAS 5A-5B mostram as atividades biológicas demutantes de interferon. FIG. 5A mostra a atividade antivi-ral relativa (ao peso) plotada versus a atividade antiproli-ferativa relativa de 21 mutantes únicos de IFNa2, mutantetriplo H57A, E58A, Q61A (SEQ ID NO: 5), mutante quádruploN65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ ID NO: 6), (SEQ ID N0:7), o mu-tante triplo H57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11) e de IFNp.FIG. 5B mostra as atividades antivirais e antiproliferativasrelativas das mesmas proteínas plotadas versus sua afinidadede ligação relativa para IFNARl-EC. Todos os dados são dasTabelas 1-4 . A linha linear representa uma relação teóricaentre a atividade biológica e afinidade. Os pontos acima dalinha são para os mutantes onde a alteração na atividade bi-ológica (antiviral ou antiproliferativa) é mais fraca do quea sua alteração na afinidade, e os pontos abaixo da linhasão o oposto.

FIGURAS 6A-6C mostram o efeito de interferon emexpressão de gene monitorada por experiências de microdispo-sição de oligonucletide manchadas. Quatro diferentes trata-mentos de interferon longos de 16 hora foram testados: 0,3nM (1.000 unidades) IFNa2-peso; 3 nM (10.000 unidades) IF-Na2-peso; 0,3 nM de HEQ (SEQ ID NO: 5) e 0,15 nM de IFNp(1.000 unidades). Cada condição é representada por trata-mento de IFN versus nenhum tratamento nas duplicatas de mi-crodisposição de troca de tintura. Além disso, quatro ré-plicas de experiências de microdisposição que consistem emnenhum tratamento versus nenhum tratamento de outra amostrarepresentam nenhum tratamento de IFN como controle. Fig. 6Amostra os níveis de expressão relativos (a nenhum tratamen-to) dos 395 genes plotados em ordem ascendente de acordo coma alteração de vezes. Fig. 6B mostra os níveis de expressãoplotados relativos ao nível de expressão em adição de 0,15nM de IFNp. A única exceção é para o nível de expressão docontrole não tratado (pontos pretos), que é plotado contraum segundo grupo de controle para avaliar o nível aleatóriode flutuação. Fig. 6C mostra a análise do agrupamento dosgenes induzidos por interferon para os quatro tratamentos.Os perfis de expressão de gene de agrupamento de IFNp e HEQ(SEQ ID NO: 5) juntos, com uma distância muito curta entreeles. 0 perfil de expressão de células tratadas com agrupa-mentos de 3 nM de IFNa2-peso a seguir, ao mesmo tempo em queo perfil de expressão de gene de 0,3 nM de IFNa2-peso estáainda mais distante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece mutantes de IFNa2 efragmentos ativos, análogos, derivado, e variantes destesque têm atividade agonista ou antagonista melhorada quandocomparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) . Os mu-tantes da invenção fornecem utilidade terapêutica melhoradaque pode incluir pelo menos uma vantagem selecionada de es-pecificidade ou seletividade melhorada, duração melhorada deação, estabilidade melhorada e menos efeitos adversos.

A presente invenção fornece composições farmacêu-ticas que compreendem mutantes de IFNa2 úteis para tratar ouprevenir câncer, esclerose múltipla, doenças infecciosas edistúrbios associados com expressão aumentada de IFNoí2 talcomo diabete melito dependente de insulina (IDDM) e de lúpussistêmico eritematoso (SLE).Definições

O termo interferon (IFN) ou interferons (IFNs) serefere à família de proteínas segregadas, que são citocinascom atividades antivirais, anti-protozoárias, imunomodulado-ras, e reguladora do crescimento célula. IFNs foram classi-ficados originalmente por suas fontes: leucócitos IFN-a-1(SEQ ID NO: 1), e IFN-a-2 (SEQ ID NO: 2), fibroblastos IFN-β(SEQ ID NO: 3), e células imunes IFN-γ (SEQ ID NO: 4). Notaparticular é feita de IFNs alfa, beta, e gama. Interferonalfa é o tipo principal de interferon produzido pelos leucó-citos.

Os termos "análogo", "fragmento", "derivado", e"variante", quando se referindo aos polipeptídeos de IFNa2melhorados desta invenção significam análogos, fragmentos,derivado, e variantes de tais polipeptídeos de IFNa2 melho-rados que retêm atividade funcional substancialmente similarou substancialmente a mesma atividade ou função biológicacomo os polipeptídeos de IFNa2 melhorados, como descrito a-qui.

Um "análogo" inclui um polipeptídeo de IFNa2 me-lhorado onde pelo menos um aminoácido é substituído por ou-tro aminoácido para produzir um análogo ativo de um polipep-tídeo da invenção que tem atividade aumentada, estabilidadeou meia-vida mais longa quando comparado com os polipeptí-deos listados aqui.

Um "fragmento" é uma porção de um polipeptídeo deIFN oí2 melhorado da presente invenção que retém atividadefuncional substancialmente similar ou substancialmente amesma atividade ou função biológica como um polipeptideo deIFNa2 melhorado, como mostrado nos ensaios in vitro descri-tos aqui, como descrito também abaixo.

Um "derivado" inclui todas as modificações para umpolipeptideo de IFNoí2 melhorado desta invenção que substan-cialmente preserva as funções descritas aqui e inclui estru-tura adicional e função auxiliar, por exemplo, PolipeptideosPEGilados que têm maior meia-vida.

Uma "variante" inclui polipeptideos que têm umaseqüência de aminoácido que compreende uma combinação do po-lipeptideos de IFNa2 mutantes desta invenção que retêm ati-vidade funcional substancialmente similar ou uma atividadefuncional aumentada quando comparado com os polipeptideos deIFNa2 mutantes originais.

"Atividade funcional substancialmente similar" e"substancialmente a mesma função ou atividade biológica" ca-da significa que o grau de atividade biológica está dentrode cerca de 50% a 100% ou mais, preferivelmente dentro de80% a 100% ou mais, e mais pref erivelmente dentro de cercade 90% a 100% ou mais, daquela atividade biológica demons-trada pelo polipeptideo com o qual está sendo comparadoquando a atividade biológica de cada polipeptideo é determi-nada pelo mesmo procedimento ou ensaio.

"Similaridade" entre dois polipeptideos é determi-nada comparando-se a seqüência de aminoácido de um polipep-tideo com a seqüência de um segundo polipeptideo. Um amino-ácido de um polipeptideo é similar ao aminoácido correspon-dente de um segundo polipeptideo se ele for idêntico ou umasubstituição de aminoácido conservadora. As substituiçõesconservadoras incluem aquelas descritas em Dayhoff, M. O.,ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, NationalBiomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978), eem Argos, P. (1989) EMBO J. 8: 779-785. Por exemplo, amino-ácidos que pertencem a um dos seguintes grupos representamalterações ou substituições conservadoras: Ala: - Pro, GIy,Gim, Asn, Ser, Thr: -Cys, Ser, Tyr, Thr; - Vai, lie, Leu,Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; e -Asp,GIu.

"Atividade especifica" como empregada aqui com re-ferência a um mutante de IFNa2 da presente invenção signifi-ca uma atividade ou função biológica de um IFNa2. As ativi-dades ou funções biológicas de IFNa2 são bem conhecidas natécnica e incluem, porém não estão limitadas à atividade an-tiproliferativa. Tal atividade especifica pode ser detecta-da e medida empregando os métodos descritos aqui ou empre-gando qualquer método conhecido na técnica. A "atividadeespecifica melhorada" como empregado aqui significa que aatividade especifica ou a atividade antagônica da composiçãode IFNa2 da presente invenção é maior do que aquela de umacomposição tipo silvestre de IFNa2 de referência. A ativi-dade especifica de uma composição de IFNa2 da presente in-venção pode ser ensaiada quando comparado com a atividadeespecifica da composição tipo silvestre de referência de IF-Na2, empregando um método para detectar e/ou medir uma ati-vidade especifica de IFNa2, por exemplo, como descrito aquiou como conhecido na técnica."Composição de IFNoí2" se refere a um polipeptideode IFNoí2, fragmento, análogo, derivado, ou variante deste,ou composição (por exemplo, uma composição farmacêutica)compreendendo um polipeptideo de IFNoí2, fragmento, análogo,derivado, ou variante deste.

O termo "proteínas ou polipeptídeos recombinantes"se refere às proteínas ou polipeptídeos produzidos por téc-nicas de DNA recombinantes, isto é, produzidas de células,procarióticas ou eucarióticas, incluindo, por exemplo, mi-crobiana ou mamífera, transformada uma constração de expres-são de DNA recombinante exógena codificando a proteína oupolipeptideo desejado. As proteínas ou polipeptídeos ex-pressos na maioria das culturas bacterianas estarão tipica-mente livres de glican. Proteínas ou polipeptídeos expres-sos em levedura podem ter um padrão de glicosilação diferen-te daquele expresso em células de mamífero.

Um "vetor de expressão" como empregado aqui se re-fere a uma molécula de ácido nucléico capaz de réplica e ex-pressando um gene de interesse quando transformou, transfec-cionou ou transduziu em uma cela de anfitrião. Os vetores deexpressão compreendem um ou mais marcadores selecionáveisfenotípicos e uma origem de replicação para garantir a manu-tenção do vetor e para, se desejado, fornecer amplificaçãono hospedeiro. Os marcadores selecionáveis incluem, por e-xemplo, seqüências que concedem marcadores de resistência aantibióticos, que podem ser empregadas para obter transfor-mantes bem sucedidos por seleção, tal como seqüências de re-sistência à ampicilina, tetraciclina e canamicina, ou forne-ce nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos.Os vetores de expressão adequados podem ser plasmídeos deri-vados, por exemplo, de pBR322 ou vários plasmídeos de pUCque estão comercialmente disponíveis. Outros vetores de ex-pressão, podem ser derivados de bacteriófago, fasmídeo, ouvetores de expressão de cosmídio, todos dos quais estão des-critos nas seções 1.12-1.20 de Sambrook e outros, (MolecularCloning: A Laboratory Manual. 3- ed., 2001, Cold Spring Har-bor Laboratory Press). Os plasmídeos isolados e fragmentosde DNA são clivados, talhados, e ligados juntos em uma ordemespecífica para gerar os vetores desejados, como é bem co-nhecido na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e outros,ibid).

O termo proteínas ou polipeptídeos "nativos", "deocorrência natural" ou "tipo silvestre" (peso) se referem àsproteínas ou polipeptídeos recuperados de uma fonte que o-corre in nature. 0 termo "IFN nativo" ou "IFN tipo silves-tre" incluiria IFN nativo ou tipo silvestre e incluiria mo-dificações pós-translacionais de IFN, incluindo, porém nãolimitado a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosfori-lação, lipidação, acilação, e clivagem.

O termo "vetor ou plasmídeo de expressão recombi-nante" é uma construção de plasmídeo ou vetor de DNA repli-cável empregada para ampliar ou expressar DNA que codificaas proteínas ou polipeptídeos da presente invenção. Um ve-tor ou plasmídeo de expressão contém seqüências de controlede DNA e uma seqüência de codificação. As seqüências decontrole de DNA incluem seqüências promotoras, sítios de li-gação de ribossoma, sinais de poliadenilação, seqüências determinação de transcrição, domínios reguladores a montante,e realçadores. Os sistemas de expressão recombinantes comodefinidos aqui, expressará as proteínas ou polipeptídeos dainvenção em indução dos elementos reguladores.

O termo "células hospedeiras transformadas" se re-fere às células que foram transformadas e transfectadas comDNA exógeno. 0 DNA exógeno pode ou não pode ser integrado(isto é, covalentemente ligado) ao DNA cromossômico que pre-para o genoma da célula hospedeira. Em procariotas e leve-dura, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido em um ele-mento epissômico, como um plasmídeo, ou estavelmente inte-grado no DNA cromossômico. Com respeito às células eucarió-ticas, a célula estavelmente transformada é uma què o DNAexógeno tenha se tornado integrado no cromossomo. Esta es-tabilidade é demonstrada pela capacidade dos clones ou li-nhagens de célula eucariótica produzir através de replicaçãouma população de celas filhas contendo o DNA exógeno.

O termo "iniciador" como empregado aqui se referea um oligonucleotídeo, seja de ocorrência natural como emuma digestão de restrição purificada ou produzido sintetica-mente, que seja capaz de atuar como um ponto de iniciação desíntese quando colocado sob condições nas quais a síntese deum produto de extensão do iniciador, que é complementar a umfilamento de ácido nucléico é induzida, isto é, na presençade nucleotídeos e um agente de indução tal como uma DNA po-limerase e a uma temperatura e pH adequados. 0 iniciadorpode ser de filamento único ou filamento duplo e deve sersuficientemente longo para iniciar a síntese do produto deextensão desejado na presença do agente de indução.

"Quantidade terapêutica efetiva" se refere àquelaquantidade de um polipeptídeo de IFNa2 melhorado da invençãoque, quando administrada a um indivíduo em necessidade des-ta, é suficiente para efetuar o tratamento da condição oudistúrbio. Por exemplo, para esclerose múltipla reincidenteremitente (MS), câncer, doenças infecciosas ou distúrbiosassociados com a expressão aumentada de IFNa2, tal como dia-bete melito dependente de insulina (IDDM) e lúpus sistêmicoeritematoso (SLE).

O termo "indivíduo" se refere aos indivíduos huma-nos e indivíduos não humanos.

O termo "câncer" é pretendido incluir todos os ti-pos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, te-cidos metastáticos ou células, tecidos, ou órgãos maligna-mente transformados, independente do tipo histopatológico ouestágio de invasividade. Os exemplos de cânceres incluemporém não estão limitados aos tumores sólidos e leucemias,incluindo: apudoma, coristoma, branquioma, síndrome de car-cinóide maligno, doença de coração carcinóide, carcinoma(por exemplo, Walker, célula basal, basoescamoso, Brown-Pearce, dutal, tumor de Ehrlich,'pulmão de célula não peque-na, célula em grão de aveia, papilar, bronquiolar, broncogê-nico, célula escamosa, e célula de transição), distúrbioshistiocíticos, leucemia (por exemplo, por exemplo, célula B,célula misturada, célula nula, célula T, crônico de célulaT, associado ao HTLV-II, linfocítico agudo, linfocítico crô-nico, célula mastócito, e mielóide), histiocitose maligna,doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, pequeno imunopro-liferativo, plasmacitoma, reticuloendoteliose, melanoma,condroblastoma, condroma, condrossarcoma, fibroma, fibros-sarcoma, tumores de célula gigante, histiocitoma, lipoma,lipossarcoma, mesotelioma, mixoma, mixossarcoma, osteoma,osteossarcoma, sarcoma de Ewing, sinovioma, adenofibroma,adenolinforna, carcinossarcoma, cordoma, craniofaringioma,disgerminoma, hamartoma, mesenquimoma, mesonefroma, miosar-coma, ameloblastoma, cimentoma, odontoma, teratoma, timoma,tumor trofoblástico, adeno-carcinoma, adenoma, colangioma,colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma,tumor de célula da granulosa, ginandroblastoma, hepatoma,hidradenoma, tumor de célula ilhota, tumor de células deLeydig, papiloma, tumor de célula de Sertoli, tumor de célu-la da teca, leiomioma, leiomiosarcoma, mioblastoma, miosar-coma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, ependimoma, ganglioneuro-ma, glioma, meduloblastoma, meningioma, neurilemoma, neuro-blastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paragan-glioma, paraganglioma, não cromafina, angioceratoma, hiper-plasia angiolinfóide com eosinofilia, angioma de esclerose,angiomatose, glomangioma, hemangioendotelioma, hemangioma,hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, linfangioma, linfangio-mioma, linfangiosarcoma, pinealoma, carcinosarcoma, condro-sarcoma, cistosarcoma, filodos, fibrosarcoma, hemangiosarco-ma, leimiosarcoma, leucossarcoma, liposarcoma, Iinfangiosar-coma, miosarcoma, mixosarcoma, carcinoma ovariano, rabdomio-sarcoma, sarcoma (por exemplo, célula de Ewing, experimen-tal, Kaposi, e mastócito), neurofibromatose, e displasiacervical, e outras condições nas quais as células se tornamimortalizadas ou transformadas.

"Tratamento de MS" como empregado aqui abrange otratamento do estado doente em um indivíduo, cujo estado do-ente é caracterizado por sintomas associado com MS, tal comofraqueza, entorpecimento, tremor, perda de visão, dor, para-lisia, perda de equilíbrio, disfunção da bexiga e intestino,e alterações cognitivas (sintomas primários) ; infecções re-petidas do trato urinário, fraqueza de desuso, alinhamentopostural e controle de tronco fraco, desequilíbrio muscular,densidade óssea diminuída, respiração rasa, ineficiente, eferidas (sintomas secundários); e depressão (sintomas terci-ários), e inclui: (i) inibir a condição, isto é, deter seudesenvolvimento; ou (ii) aliviar a condição, isto é, causara regressão da condição.

O termo "infecção de vírus de hepatite" se refereà infecção com um ou mais dos vírus da hepatite A, B, C, D,ou E, com infecção viral de hepatite originada do sanguesendo de interesse particular.

Como empregado aqui, o termo "fibrose hepática",alternadamente empregado aqui com "fibrose do fígado", serefere ao crescimento de tecido de cicatri.z no fígado quepode ocorrer no contexto de uma infecção de hepatite crônica.

O termo "mutantes de IFNa2 pegilados" como empre-gados aqui significa conjugados modificados de polietilenoglicol de mutantes de IFNa2. Os conjugados mutantes de IF-Να2 de poli etileno-glicol preferidos são conjugados rever-síveis que são lentamente convertido para drogas em condi-ções fisiológicas, tal como são preparados de acordo com osmétodos descritos em W02004089280. Outros conjugados de mu-tante de IFNoí2 podem ser preparados acoplando-se um mutantede IFNa2 a um polímero solúvel em água. Uma lista não Iimi-tante de tais polímeros inclui outros homopolímeros de óxidode polialquileno tal como polipropileno glicóis, polióis po-lioxietilenados, copolímeros destes e copolímeros de blocodestes. Como uma alternativa para polímeros com base em ó-xido de polialquileno, os materiais efetivamente não antigê-nicos tal como dextrana, polivinilpirrolidonas, poliacrila-midas, álcoois polivinílicos, polímeros com base em carboi-drato e outros podem ser empregados. Tais conjugados de in-terferon alfa-polímero são descritos na Pat U.S. No.4.766.106 e Pat U.S. No. 4.917.888.

Como definido aqui, uma "microdisposição" se refe-re a uma pluralidade de moléculas de ácido nucléico isoladasou sondas de oligonucleotídeo presas a um suporte onde cadauma das moléculas de ácido nucléico ou sondas de oligonucle-otídeo é presa a um suporte na região pré-selecionada única.O termo "ácido nucléico" é alternável com o termo "polinu-cleotídeo". O termo "polinucleotídeo" se refere a uma ca-deia de nucleotídeos. Preferivelmente, as cadeias têm decerca de 20 a 10.000 nucleotídeos, mais preferivelmente deaproximadamente 150 a 3.500 nucleotídeos. O termo "sonda" serefere a uma seqüência de polinucleotídeo capaz de hibridi-zar com uma transcrição de gene ou complemento deste paraformar um complexo de sonda de polinucleotideo/transcriçãode gene.

O termo "gene" inclui uma região que pode sertranscrita em RNA, como a invenção contempla a detecção deRNA ou equivalentes destes, por exemplo, cDNA e cRNA. Umgene da invenção inclui, porém não está limitado a, genesespecíficos para ou envolvidos em um processo biológico par-ticular e/ou indicativo de um processo biológico, tal comoapoptose, diferenciação, resposta de tensão, envelhecimento,proliferação, etc.; genes do mecanismo celular, por exemplo,ciclo celular, transdução de sinal, metabolismo de compostostóxicos, e outros; genes associados à doença, por exemplo,genes envolvidos em câncer, esclerose múltipla, infecção eoutros. Por exemplo, o gene pode ser um oncogene, cuja ex-pressão dentro de uma célula induz que a célula se torneconvertida de uma célula normal em uma célula de tumor. Ou-tros exemplos de genes incluem, porém não estão limitados a,genes de citocina, genes priônios, moléculas de codificaçãode genes que induzem a angiogênese, moléculas de adesão decodificação de genes, receptores de superfície de célula decodificação de genes, proteínas de codificação de genes queestão envolvidas nos processos de metastatização e/ou inva-sivos, genes de protease como também de moléculas que regu-lam a apoptose e o ciclo de célula.

De acordo com a presente invenção, o nível de umatranscrição de gene pode ser determinado medindo-se o nívelda transcrição de gene, por exemplo, RNA, empregando métodossemiquantitativos tal como hibridização de microdisposiçãoou métodos mais quantitativos tal como qPCR quantitativo.

Como empregado aqui, o termo "regulação da expres-são e/ou atividade" geralmente se refere a qualquer processoque funcione para controlar ou modular a quantidade ou ati-vidade (funcionalidade) de um componente celular. A regula-ção estática mantém expressão e/ou atividade a algum deter-minado nivel. A supra-regulação se refere a um aumento re-lativo na expressão e/ou atividade. Conseqüentemente, a in-fra-regulação se refere a uma diminuição relativa na expres-são e/ou atividade. Infra-regulação é sinônimo com inibiçãode uma determinada atividade do componente celular.

Características dos Polipeptideos de IFNa2 Melho-rados da Invenção

Três mutações únicas (H57A, E58A, Q61A) (SEQ IDNO: 5) foram introduzidas em IFNa2 que especificamente au-menta sua afinidade de ligação com respeito ao receptor deIFNARl em cerca de 30 vezes comparado com a proteína de tiposilvestre (SEQ ID: NO 2) . A afinidade da proteína de IFNa2mutante, quando empregada aqui designada HEQ, é similar à-quela medida para IFNp (Tabela 3) que é muito acima daquelapara qualquer outro subtipo de interferon. A avaliação daatividade biológica de HEQ claramente demonstra que ele ga-nhou características muito similares de IFNp (SEQ ID NO: 3).Desse modo, HEQ promove somente um aumento de 2 vezes em suapotência antiviral, porém um aumento de 25 vezes em sua po-tência antiproliferativa relativo a IFNa2-peso (SEQ ID NO:2) (Tabela 4).

Dois grupos adicionais de mutações foram introdu-zidos nas mesmas posições em IFNa2 como HEQ: H57M, E58D,Q61L, aqui designado MDL (SEQ ID NO: 10), e H57Y, E58N,Q61S, aqui designado YNS (SEQ ID NO: 11). A atividade anti-viral de ambos está em 3 vezes do tipo silvestre (Tabela 4).

Entretanto, sua atividade antiproliferativa é mais elevadado que aquela de HEQ de IFNp. Para MDL, a atividade é 40vezes mais elevada comparada com peso, e é 160 vezes maiselevado nas células WISH e 70 vezes mais elevado para YNS emcélulas MDA231, que é 3-7 vezes do que aquela medida paraIFNp (SEQ ID NO: 3).

O perfil de transcrição de gene de HEQ (SEQ ID NO:5) foi monitorado através de experiências de microdisposiçãode oligonucletide. A ativação do gene de HEQ é muito maiselevada do que aquela de IFNa2 na mesma concentração de pro-teina, similar à ativação de gene registrada para IFNp (SEQID NO: 3). YNS ou HEQ poderiam ser potencialmente drogasmais efetivas no tratamento de doença comparado com IFNa2-wtou IFNP. A vantagem de YNS e HEQ sobreem IFNa2-wt está emsua maior especificidade antiproliferativa o que poderia a-judar na redução dos efeitos colaterais e no tratamento decâncer ou esclerose múltipla. A vantagem de YNS é seu efei-to antiproliferativo mais elevado comparado ao IFNP, partí-cula rmente quando medido em células de câncer de mama huma-nas, MDA2 31.

A presente invenção também fornece um mutante quá-druplo N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ ID NO: 6), quando empre-gado aqui designado NLYY, que tem uma atividade antiprolife-rative 1000 vezes reduzida e uma atividade antiviral 100 ve-zes reduzida comparada à proteína de tipo silvestre, porémainda se ligam ao IFNAR2 em afinidade de tipo silvestre (Ta-bela 2).

A presente invenção fornece uma proteína de IFNa2que compreende uma substituição do ESLRSKE a KRLKSKE C ter-minal (SEQ ID NO: 7), quando empregado aqui designado a8-cauda. 0 mutante a8-cauda foi construído para ter a caudade interferon a8 para otimizar a energia de ligação eletros-tática entre IFNa2 e seu receptor IFNAR2. As medições deligação mostraram que o mutante de a8-cauda têm uma afinida-de de ligação 18 vezes mais elevada para IFNAR2 comparadocom tipo silvestre (Tabela 2). A atividade antiviral do mu-tante de a8-cauda é 3 vezes mais elevada e a atividade anti-proliferativa é 10 vezes mais elevada comparado com tiposilvestres (Tabela 2).

As mutações específicas dos três mutantes de IFNa2da invenção estão cada localizadas em uma posição diferentena proteína, e então podem ser combinadas para produzir e-feitos adicionais, ou aumentados. A presente invenção for-nece variantes compreendendo uma combinação do mutante tri-plo HEQ (SEQ ID NO: 5); MDL (SEQ ID NO: 10) ou YNS (SEQ IDNO: 11), e a substituição do ESLRSKE a KRLKSKE C terminal(SEQ ID NO: 7). Estas variantes (SEQ ID NOS: 8, 12 e 13),podem provar ser mais eficiente no tratamento de câncer, es-pecificamente quando sua atividade antiproliferativa é au-mentada. Além disso, sua potência de ligação mais elevada,pode superar o problema de infra-regulação de receptor emcélula de câncer. Uma vez que HEQ é composto de três muta-ções de ponto únicas para Ala, e o mutante de a8-cauda com-preende uma substituição do C-terminal de IFNa2 com o C-terminal do IFNa8 nativo, a possibilidade de resposta imuno-gênica especifica é pequena.

A presente invenção também fornece uma variantecompreendendo uma combinação do mutante quádruplo N65A,L80A, Y85 UM, Y89A e a substituição do ESLRSKE a KRLKSKE Cterminal (SEQ ID NO: 9), com uma afinidade de ligação aumen-tada para IFNAR2, porém com atividade biológica muito baixa.Esta variante de IFNa2 é uma antagonista de IFN que bloqueiaa atividade natural de IFNs através dos receptores.

As composições de IFNa2 melhoradas da presente in-venção compreendem polipeptideos de mutante de IFNa2, oufragmentos, análogos, derivados, e variantes destes, que têmpelo menos 2 vezes, preferivelmente pelo menos 10 vezes, emais preferivelmente pelo menos 100 vezes, até mesmo maispreferivelmente 1000 vezes, maior atividade especifica doque aquela de uma composição de tipo silvestre de IFNa2 dereferência. Em certas modalidades, as composições de IFNa2da presente invenção têm atividade antagônica com IFNa2 tiposilvestre.

Os antagonistas da invenção

Um antagonista de IFNa é definido ser qualquersubstância que seja capaz de interferir com uma atividadebiológica de IFNa in vivo. Não é necessário que o antago-nista completamente neutralize a atividade de IFNa, porémsomente que faça então a um grau suficiente para mostrar umaatividade terapêutica IDDM ou SLE in vivo. IFNa é conhecidopor possuir uma pluralidade de atividades biológicas. Osantagonistas para uso aqui reduzirão, inibirão ou neutrali-zarão qualquer uma ou mais destas atividades. Ordinariamen-te o antagonista interferirá com pelo menos um (e preferi-velmente toda) a atividade antiviral, antiproliferativa ouimunomoduladora de IFNa.

Os antagonistas geralmente são selecionados de vá-rias categorias: uma forma solúvel de anticorpos de receptorde alfa interferon, receptor anti-alfa interferon que blo-queiam alfa interferon de se ligar ou apropriadamente inte-ragir com seu receptor, anticorpos capazes de se ligar eneutralizar o próprio alfa interferon, e polipeptideos denão interferon que competem com alfa interferon para sítiosde ligação de receptor porém que não eles próprios demons-tram atividade de alfa interferon substancial. Os antago-nistas da presente invenção são mutantes de IFNa que antago-nizam a atividade de IFNa e IFNp.

Mutagênese de IFNa2

Os efeitos da alteração de aminoácidos a posiçõesespecíficas podem ser testados experimentalmente introduzin-do-se as substituições de aminoácido e testando os polipep-tideos de IFNa2 alterados quanto à atividade biológica em-pregando os ensaios descritos aqui. Qualquer técnica paramutagênese conhecida na técnica pode ser empregada, incluin-do porém não limitado, mutagênese química, mutagênese dire-cionada ao sítio in vitro, empregando, por exemplo, o Kit deMutagênese Direcionada ao Sítio QuikChange (Stratagene),etc. As técnicas tal como mutagênese de varredura de alani-na são particularmente adequadas para esta abordagem.

Ácidos Nucléicos

A presente invenção também fornece moléculas deácido nucléico que codificam os polipeptideos de IFNa2 me-lhorados da invenção.

Uma molécula de ácido nucléico pode ser produzidaempregando tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, am-plificação de reação em cadeia de polimerase (PCR), clona-gem) ou síntese química. As seqüências de ácido nucléicoincluem seqüências de ácido nucléico naturais e homólogosdestas, compreendendo, porém não limitado, variantes aléli-cas naturais e seqüências de ácido nucléico modificadas nasquais os nucleotídeos foram inseridos, deletados, substituí-dos, e/ou invertidos de uma tal maneira que tais modifica-ções não interferem substancialmente com a capacidade da mo-lécula de ácido nucléico de codificar os polipeptideos deIFNa2 recombinantes da presente invenção.

Uma seqüência de polinucleotídeo ou oligonucleotí-deo pode ser deduzida do código genético de uma proteína,entretanto, a degeneração do código deve ser levada em con-ta, e as seqüências de ácido nucléico da invenção também in-cluem seqüências, que são degeneradas como um resultado docódigo genético, cujas seqüências podem ser facilmente de-terminadas por aqueles de experiência ordinária na técnica.

Os termos "ácido nucléico" e "polinucleotídeo" co-mo empregados aqui se referem a um oligonucleotídeo, polinu-cleotídeo ou nucleotídeo e fragmentos ou porções destes, eao DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, que pode serde filamento único ou duplo, e representa o filamento desentido ou anti-sentido. 0 termo também deveria ser preten-dido incluir, como equivalentes, análogos de RNA ou DNA fei-tos de anál ogos de nucleotideo, e, quando aplicável a moda —lidade sendo descrita.

O termo "oligonucleotídeo" se refere a uma seqüên-cia de ácido nucléico de pelo menos cerca de 6 nucleotideosa cerca de 60 nucleotideos, preferivelmente cerca de 15 a 30nucleotideos, e mais preferivelmente cerca de 20 a 25 nucle-otideos que podem ser empregados na amplificação de PCR ouum ensaio de hibridização ou uma microdisposição. Como em-pregado aqui, oligonucleotídeo é substancialmente equivalen-te aos termos "amplimers", "iniciadores", "oligômeros", e"sondas", como geralmente definido na técnica.

Como empregado aqui, as condições altamente estri-tas são aquelas, que são tolerantes de até cerca de 5% acerca de 25% de divergência de seqüência, preferivelmenteaté cerca de 5% a cerca de 15%. Sem limitação, os exemplosde condições altamente estritas (-IO0C abaixo do Tm calcula-do do híbrido) usam uma solução de lavagem de 0,1 X de SSC(citrato salino padrão) e 0,5% de SDS no Ti apropriado (tem-peratura de incubação) abaixo do Tm calculado do híbrido. Aúltima severidade das condições é principalmente devido àscondições de lavagem, particularmente se as condições de hi-bridização empregadas são aquelas, que permitem híbridos me-nos estáveis se formar junto com híbridos estáveis. As con-dições de lavagem em severidade mais elevada então removemos híbridos menos estáveis. Uma condição de hibridizaçãocomum que pode ser empregada com as condições de lavagem mo-deradamente severas a altamente severas, descritas acima é ahibridização em uma solução de β X de SSC (ou 6 X de SSPE) ,5 X de reagente Denhardt, 0,5% de SDS, 100 ug/ml de DNA deesperma de salmão desnaturado, fragmentado em um Ti apropri-ado. (Geralmente veja Sambrook e outros, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2- Edição, Cold Sping Harbor Press(1989) para condições de severidade adequadas).

As condições de severidade são uma função da tem-peratura empregada na lavagem e experiência de hibridização,a molaridade dos cátions monovalentes na solução de hibridi-zação e na solução (s) de lavagem e a porcentagem de formami-da na solução de hibridização. Em geral, a sensibilidadepor hibridização com uma sonda é afetada pela quantidade eatividade especifica da sonda, a quantidade do ácido nucléi-co alvo, a detectabilidade do rótulo, a taxa de hibridiza-ção, e a duração da hibridização. A taxa de hibridização émaximizada em um Ti.de cerca de 20°C-25°C abaixo de Tm parahibridos de DNArDNA e cerca de 10°C-15°C abaixo de Tm parahibridos de DNA:RNA. Também é maximizado por uma resistên-cia iônica de cerca de 1,5M de Na+. A taxa é diretamenteproporcional ao comprimento duplex e inversamente proporcio-nal ao grau de desequilíbrio.

A especificidade na hibridização, entretanto, éuma função da diferença na estabilidade entre o híbrido de-sejado e híbridos "antecedentes". A estabilidade híbrida éuma função do comprimento duplex, composição de base, resis-tência iônica, desequilíbrio, e agentes desestabilizantes(se algum). A Tm de um híbrido perfeito pode ser calculadapara híbridos de DNA:DNA empregando a equação de Meinkoth eoutros, (Anal Biochem. 1984; 138 (2):267-84) .

Expressão e Purificação de Polipeptídeos de IFNa2Melhorados

Existem vários modos para expressar e purificarIFNa2 humano recombinante em bactérias, em particular em E.coli, para obter polipeptídeos de IFNa2 tendo atividade ago-nista ou antagonista melhorada. Os métodos conhecidos podemser empregados para expressar os genes clonados em bacté-rias. Para obter expressão de um nível elevado de um geneeucariótico clonado em um sistema procariótico, é preferívelconstruir vetores de expressão que contenham, um promotorforte para transcrição de mRNA direta.

Os exemplos de regiões reguladoras adequadas paraeste propósito são as regiões operadoras e promotoras do ge-ne de beta-glicosidase de E. coli, a via biossintética detriptofano de E. coli, ou o promotor à esquerda do fago A.A inclusão de marcadores de seleção em plasmídeos de DNAtransformados em E. coli é também útil. Os exemplos de taismarcadores incluem os genes de especificação de resistênciaa ampicilina, tetraciclina, ou cloranfenicol. As modifica-ções pós-translacionais, tal como glicosilação, não ocorremno E. Coli do sistema de expressão de célula procariótica.Além disso, as proteínas, com padrões de dissulfeto comple-xos, também podem ser mau duplicadas quando expressas em E.coli. Com o sistema procariótico, a proteína expressa estáou presente no citoplasma da célula em uma forma insolúvel,nos então chamados corpúsculos de inclusão, encontrada nafração solúvel após a célula tem sido lisada, ou está dire-cionada ao periplasma pela adição de seqüências de sinal desecreção apropriadas. Se a proteína expressa está em cor-púsculos de inclusão insolúveis, a reduplicação e solubili-zação subseqüente dos corpúsculos de inclusão são normalmen-te requeridas.

Muitos vetores de expressão procarióticos são co-nhecidos por aqueles versados na técnica e estão comercial-mente disponíveis, tal como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemi-cals, Uppsala, Sweden), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA,USA), e pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI, USA). Os pro-motores geralmente empregados em sistemas de expressão mi-crobiana recombinante incluem o sistema promotor de beta-lactamase (penicilinase) e lactose (Chang, A. C. e outros,1978, Nature 275: 617-624). 0 sistema promotor de triptofa-no (trp) , e o promotor Tac (Sambrook, J. F. e outros, Mole-cular Cl.oning: A LaboratoryManual, cold Spring Harbor Labo-ratory, Cols Spring Harbor, Ν. Y. 1989) . Outro sistema deexpressão bacteriana útil emprega o promotor pL de lambdafago e repressor termoinduzível clts857 (Bernard e outros,1979, Gene 5:59-76).

Atualmente o seguinte protocolo foi empregado: Ogene codificando para IFNa2 foi clonado em um vetor de ex-pressão de dois-cístron com base no plasmídeo pT7T3-18U, aoqual foi adicionado um segundo cístron exatamente a jusantedo códon de partida. O segundo cístron é dos primeiros 9aminoácidos do gene Ipp 5' incluindo seu sítio SD flaqueadopor sítios de restrição Xbal e Ndel. A razão para inserirum segundo cístron foi melhorar a produção de expressão deproteína heteróloga. Além disso, para melhorar o nível deexpressão, o códons para os primeiros 23 aminoácidos foramalterados em: TGT GAT CTG CCG CAG ACT CAC TCT CTG GGT TCTCGT CGT ACT CTG ATG CTG CTG GCT CAG ATG CGT CGT (SEQ ID NO:14). As proteínas são expressas em células BL21, durante anoite em meio rico. IFNa2 é encontrado nos corpúsculos deinclusão, que são dissolvidos em 8 M uréia contendo 5 mMDTT. IFNa.2 foi redüplicado por uma diluição de 20-vezes du-rante a noite. A purificação de proteína é realizada empre-gando metodologias padrões. As produções típicas de proteí-na foram 10 mg/L de cultura de célula. IFNa2 funciona comouma única banda de 18 kdDa em SDS-PAGE.

Análogos, Fragmentos, Derivados, e Variantes dePolipeptídeos de IFNa2 Melhorados

Um análogo, fragmento, derivado, ou variante dospolipeptídeos de IFNa2 melhorados da presente invenção podemser: (i) um no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidossão substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ounão conservado; ou (ii) um no qual um ou mais dos resíduosde aminoácido inclui um grupo substituto; ou (iii) um noqual o polipeptídeo de IFNa2 melhorado é fundido com outrocomposto, tal como um composto aumentar a meia-vida do poli-peptídeo de IFNa2 melhorado (por exemplo, polietileno gli-col) ; ou (iv) um no qual os aminoácidos adicionais são fun-didos ao, polipeptídeo de IFNa2 melhorado, maduro, tal comoum seqüência líder ou secretora ou uma seqüência que é em-pregada para purificação do polipeptideo de IFNa2 melhorado;ou (v) um no qual a seqüência de polipeptideo de IFNa2 me-lhorado é fundida com um polipeptideo maior, isto é, albumi-na humana, um anticorpo ou Fc, para duração aumentada de e-feito. Tais análogos, fragmentos, derivados, e variantessão julgados estar dentro do escopo daqueles versados natécnica dos ensinamentos desta. Uma "substituição de amino-ácido conservadora" é uma na qual o resíduo de aminoácido ésubstituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeialateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido ten-do cadeias laterais similares têm sido definidas na técnica.Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais bá-sicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeiaslaterais ácidas (Por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâ-mico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo,glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alani-na, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, me-tionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (porexemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias lateraisaromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano,histidina). As substituições não conservadoras não seriamfeitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resí-duos de aminoácido residindo dentro de um domínio de proteí-na conservado. Os fragmentos ou porções ativas biologica-mente incluem fragmentos de polipeptideo adequados para usocomo um medicamento, como um reagente de pesquisa, e outros.Os fragmentos incluem peptídeos compreendendo seqüências deaminoácido suficientemente similares a ou derivadas das se-qüências de aminoácido de um polipeptideo de IFNa2 melhoradodesta invenção e exibindo pelo menos uma atividade daquelepolipeptideo, porém que inclua menos aminoácidos do que ospolipeptideos de tamanho natural descritos aqui. Tipicamen-te, porções ativas biologicamente compreendem um domínio oumotif com pelo menos uma atividade do polipeptideo. Taisporções ativas biologicamente podem ser sinteticamente pre-paradas ou através de técnicas recombinantes e podem ser a-valiadas quanto à uma ou mais das atividades funcionais deum polipeptideo desta invenção através dos meios descritosaqui e/ou bem conhecidos na técnica.

Os derivados preferidos da presente invenção in-cluem polipeptideos de IFNa2 melhorados que foram fundidoscom outro composto, tal como um composto para aumentar ameia-vida do polipeptideo e/ou para reduzir a imunogenicida-de potencial do polipeptideo (por exemplo, polietileno gli-col, "PEG"). 0 PEG pode ser empregado para conceder solubi-lidade em água, tamanho, taxa lenta de depuração do rim, eimunogenicidade reduzida à proteína de fusão. Veja por e-xemplo, Patente U.S. No. 6.214.966. No caso de PEGilações,a fusão do polipeptideo de IFNa2 melhorado ao PEG pode serrealizada por qualquer meio conhecido por alguém versado natécnica. Por exemplo, a PEGilação pode ser realizada pri-meiro introduzindo-se uma mutação de cisteína no polipepti-deo de IFNa2 melhorado, seguido por derivação de sítio espe-cífico com PEG-maleimida. 0 resíduo de cisteína pode seradicionado a C-terminação do polipeptideo de IFNa2 melhora-do. Veja, por exemplo, Tsutsumif Y. e outros, (2000) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 97:854 8-8553.

As variantes do polipeptideo de IFNa2 melhoradodesta invenção incluem polipeptideos tendo uma seqüência deaminoácido suficientemente similar à seqüência de aminoácidodos polipeptideos de IFNa2 melhorados originais ou combina-ções destes. As variantes incluem polipeptideos de IFNa2melhorados que diferem em seqüência de aminoácido devido amutagênese. As variantes com atividade melhorada podem seridentificadas avaliando-se as bibliotecas combinatórias demutantes, por exemplo, mutantes pontuais ou truncação, depolipeptideos de IFNa2 melhorados desta invenção.

Em uma modalidade, uma biblioteca matizada de va-riantes é gerada através de mutagênese combinatória ao ní-vel de ácido nucléico e é codificada por uma biblioteca degene matizada. Uma biblioteca matizada de variantes podeser produzida por, por exemplo, ligação enzimática de umamistura de oligonucleotideos sintéticos em seqüências de ge-ne tal que uma série degenerada de seqüências de aminoácidovariantes potenciais seja exprimivel como polipeptideos in-dividuais, ou, alternadamente, como um serie de polipepti-deos de IFNa2 melhorados maiores (por exemplo, para exibiçãode fago) contendo a série de seqüências nela. Há uma varie-dade de métodos que podem ser empregados para produzir bi-bliotecas de variantes potenciais de uma seqüência de oli-gonucleotideo degenerada. A síntese química de uma seqüên-cia de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizadorde DNA automático, e o gene sintético então ligado em um ve-tor de expressão apropriado. 0 uso de uma série degeneradade genes permite a provisão, em uma mistura, de todas as se-qüências codificando a série desejada de seqüências varian-tes potenciais. Os métodos para sintetizar oligonucleotí-deos degenerados são conhecidos na técnica (veja, por exem-plo, Itakura, K. e outros, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323-356).

Várias técnicas são conhecidas na técnica para a-valiar os produtos de gene de bibliotecas combinatórias fei-tas por mutações pontuais ou truncação, e para avaliar asbibliotecas de cDNA quanto aos produtos de gene tendo umapropriedade selecionada. Tais técnicas são adaptáveis paraavaliação rápida das bibliotecas de gene geradas pela muta-gênese combinatória de polipeptideos de IFNa2 melhorados pa-ra atividade especifica. As técnicas mais amplamente empre-gadas, que são tratáveis pela análise de produção elevadapara avaliar bibliotecas de gene maiores tipicamente incluemclonagem da biblioteca de gene em vetores de expressão re-plicáveis, transformação das células apropriadas com a bi-blioteca resultante de vetores e expressão dos genes combi-natórios sob condições nas quais a detecção de uma atividadedesejada facilita o isolamento do vetor codificando o genecujo produto foi detectado. A mutagênese de conjunto recur-siva (REM), uma técnica que realça a freqüência de mutantesfuncionais nas bibliotecas, pode ser empregada em combinaçãocom os ensaios de avaliação para identificar as variantesdesej adas.

Composições Farmacêuticas da InvençãoA invenção também fornece composições farmacêuti-cas que podem ser administradas a um paciente para obter umefeito terapêutico. As composições farmacêuticas desta in-venção podem ser preparadas para administração combinando-seum polipeptideo de IFNa2 melhorado, tendo o grau desejado depureza em uma quantidade farmaceuticamente efetiva, com veí-culos farmaceuticamente aceitáveis.

Os polipeptídeos de IFNa2 melhorados e composiçõesfarmacêuticas da presente invenção são úteis para adminis-tração parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular esubcutânea), tópica, oral, inalável, ou local.

Os polipeptídeos melhorados da invenção podem serempregados em composições farmacêuticas, por qualquer métodoadequado de administração, incluindo, porém não limitado àadministração intravenosa, subcutânea, intramuscular, ou in-tratecal. Desse modo, os polipeptídeos descritos acima pre-ferivelmente serão combinados com um veículo farmacêuticoestéril aceitável, tal como cinco por cento de dextrose, so-lução de Ringer lactada, salina normal, água estéril, ouqualquer outra solução de tampão fisiológica comercialmentepreparada designada para infusão intravenosa. Será entendi-do que a seleção da solução de veículo, e a dosagem e admi-nistração da composição, variarão com o objetivo e o ajusteclínico particular, e serão administrados através de proce-dimentos médicos padrões.

De acordo com os métodos da presente invenção, es-tas composições farmacêuticas podem ser administradas emquantidades efetivas para inibir ou melhorar as conseqüên-cias ou sintomas patológicos associados com MS, câncer, IDDMou SLE.

A administração dos polipeptideos de IFNa2 melho-rados da presente invenção pode ser através de injeção in-travenosa de bolo, através de infusão intravenosa constante,ou por uma combinação de ambas as rotinas. Alternativamen-te, ou, além disso, os polipeptideos de IFNa2 melhoradosmisturados com excipientes apropriados podem ser levados emconta na circulação por um sitio intramuscular.

Claramente, os polipeptideos são menos adequadospara administração oral, devido à suscetibilidade a digestãopor ácidos gástricos ou enzimas intestinais, porém em certasmodalidades as formulações especificas podem ser empregadaspara administração oral.

Ao preparar as composições em formas de dosagemliquida oral (por exemplo, suspensões, elixires e solução),os meios farmacêuticos típicos, tal como água, glicóis, ó-leos, álcoois, agente aromatizante, preservativos, agentecorante, e outros, podem ser empregados. Similarmente,quando preparando formas de dosagem sólida oral (por exem-plo, pós, comprimido e cápsulas), veículos tal como amidos,açúcares, diluentes, agente de granulação, lubrificantes,aglutinantes, agentes desintegrantes e outros serão emprega-dos. Devido à sua facilidade de administração, os comprimi-dos e cápsulas representam uma forma de dosagem oral desejá-vel para as composições farmacêuticas da presente invenção.

Os polipeptideos são menos adequados para adminis-tração tópica, porém para formulações específicas de trata-mento local podem ser empregadas.

Para administração tópica, os polipeptideos deIFNa2 melhorados da presente invenção podem ser formuladosempregando suaves umidificações de base, tal como ungüentosou cremes. Os exemplos de bases de ungüento adequadas sãopetrolato, petrolato mais silicones voláteis, lanolina e á-gua em emulsões de óleo.

Para administração por inalação os polipeptideosde IFNa2 para uso de acordo com a presente invenção são con-venientemente liberados na forma de uma apresentação de pul-verizador aerossol de um pacote pressurizado ou um nebuliza-dor com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclo-rodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um ae-rossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determi-nada fornecendo-se uma válvula para liberar uma quantidadedosada. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatinafor uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladascontendo uma mistura de pó do peptideo e uma base de pó ade-quada tal como lactose ou amido.

Os polipeptideos de IFNa2 melhorados e composiçõesfarmacêuticas da presente invenção são particularmente úteispara administração intravenosa. As composições para admi-nistração geralmente compreenderão uma solução do polipeptí-deo de IFNa2 melhorado dissolvido em veiculo farmacêuticoaceitável, preferivelmente em um veiculo aquoso. Uma varie-dade de veículos aquosos pode ser empregada, por exemplo,salina tamponada e outros. Estas soluções são estéreis egeralmente livres de substância indesejável. As composiçõespodem ser esterilizadas através de técnicas convencionais deesterilização bem conhecidas. Uma composição farmacêuticatípica para administração intravenosa pode ser facilmentedeterminada por alguém de experiência ordinária na técnica.As quantidades administradas são claramente específicas deproteínas e dependem de sua potência e perfil farmacocinéti-ca. Os métodos atuais para prepara composições parenteral-mente administráveis serão conhecidos ou evidentes para a-queles versados na técnica e são descritos em mais detalhesem tais publicações como Remington's Pharmaceutical Science,18- ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

As composições contendo os polipeptídeos de IFNa2melhorados da invenção ou um coquetel destes (isto é, comoutras proteínas) podem ser administradas em tratamentos te-rapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições sãoadministradas a um paciente em sofrimento de MS, câncer, edistúrbios associados com expressão de IFNa2 aumentada deIFNa.2 em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menoscontrolar parcialmente o distúrbio. Uma quantidade adequadapara realizar isto é definida como uma "dose terapeuticamen-te efetiva". As quantidades efetivas para este uso depen-derão da severidade da doença e do estado geral da saúde dopaciente.

As administrações únicas ou múltiplas das composi-ções podem ser administradas dependendo da dosagem e fre-qüência quando requerido e tolerado pelo paciente. Em qual-quer caso, a composição deveria fornecer uma quantidade su-ficiente dos polipeptideos de IFNa2 melhorados desta inven-ção para tratar efetivamente o paciente. Geralmente, de-pendendo do modo pretendido de administração, as composiçõesfarmacêuticas aceitáveis conterão cerca de 1% a cerca de 99%em peso de um polipeptideo de IFNa2 melhorado da invenção, e99% a 1% em peso de um veiculo ou excipiente farmacêuticoadequado. Preferivelmente, a composição será cerca de 5% a75% em peso de um polipeptideo de IFNa2 melhorado da inven-ção, com o restante sendo veículos ou excipientes farmacêu-ticos adequados.

Os polipeptideos de IFNa2 melhorados da presenteinvenção, ou as suas composições farmacêuticas aceitáveis,são ádministrados em uma quantidade terapeuticamente efeti-va, que variará dependendo de uma variedade de fatores in-cluindo a atividade específica do polipeptideo de IFNa2 me-lhorado particular empregado; a estabilidade metabólica eduração de ação do polipeptideo de IFNa2 melhorado; a idade,peso corpóreo, saúde geral, sexo, e dieta do paciente; o mo-do e tempo de administração; a taxa de excreção; a combina-ção de droga; a severidade dos estados da doença particular;e o hospedeiro sofrendo a terapia. Geralmente, uma dose di-ária terapeuticamente efetiva é de cerca de Ο,ΐμς a cerca de1000μg/kg. de peso corpóreo por administração de um polipep-tideo de IFNa2 melhorado da invenção, preferivelmente, decerca de 0,5μg a cerca de 100μg/kg de peso corpóreo por ad-ministração. Por exemplo, para administração a uma pessoade 70kg, a taxa de dosagem deve ser de cerca de 10μg a cercade 100μg por administração de um polipeptideo de IFNa2 me-lhorado da invenção dependendo do regime de tratamento. Porexemplo, se o polipeptídeo de IFNa2 melhorado da invenção ouformulação contendo o polipeptídeo é administrado de uma avárias vezes no dia, então seria necessária uma dose menordo que se uma formulação fosse administrada semanalmente, oumensalmente ou menos freqüentemente.

É antecipado que os polipeptídeos de IFNa2 da pre-sente invenção são administrados em doses apropriadas. Asdoses são geralmente ajustadas a ou abaixo da dose máximatolerada (MTD). Os sinais indicativos de toxicidade de iri-terferon são notados ser tal para toxicidade hematológica,anemia, trombocitopenia, leucopenia: tal para toxicidadegastrointestinal, diarréia, dispepsia, disfagia, N/V, dorabdominal; tal para aumento de toxicidade do fígado em bi-lirrubina, fosfatase alcalina e LFTs; tac para rim e bexiga,hematúria microscópica, piúria, azotemia, proteinúria, insu-ficiência renal aguda, síndrome nefrótica, glicosúria, albu-minúria; tal para pulmonar, orthopnea, dispnéia, broncospas-mo, tosse, edema pulmonar, ARDS; tal para síncope de toxici-dade cardíaca, MI, SVT, bradicardia, taquicardia, vertigem,hipotensão, hipertensão. A toxicidade neurológica é confu-sões, tremores, entorpecimento, parestesia, incapacidade deconcentração, sonolência, alucinações, encefalopatia, con-vulsões, coma, retardamento psicomotor, disfunção de memó-ria, boca seca, suor, distúrbio de personalidade, agitação,parestesia, depressão, ansiedade, afasia, infarto retinalcom perda de visão, dor de olho, hemianopsia, alteração desabor, dor de cabeça, síncope, insônia. A toxicidade dérmi-ca de erupção cutânea de pele, urticária, necrose epidérmi-ca, erupção cutânea maculopapular é notado. A toxicidademetabólica se manifesta como hiperglicemia. Além disso, acoagulação é monitorada quanto ao aumento em PT/PTT. Tambéma presença de fiarngite, alopecia, fadiga, mal-estar, anore-xia, perda de peso, febre, frios, mialgia, artralgia, ciano-se são respostas tóxicas potenciais ao interferon.

Indicações Terapêuticas

Esclerose Múltipla (MS)

As duas formas de IFN, IFNpia e IFNpib, são apro-vadas para o tratamento de MS remitente reincidente. IFNP étambém empregado para tratar verrugas genitais. Os polipep-tideos de IFNa2 melhorados desta invenção são úteis nas do-enças, distúrbios, ou condições acima, e são também úteispara o tratamento de outras formas de MS, incluindo MS pro-gressivo secundário, MS progressivo primário, e MS reinci-dente progressivo. Por útil é entendido que os polipeptí-deos de IFNa2 melhorados são úteis para tratamento de doen-ça, por exemplo, ou para prevenir doença, ou para prevenirprogressão da doença para um estado mais grave, ou para me-lhorar ou reduzir um sintoma ou conseqüência de doença, talcomo MS.

Câncer

A despeito dos numerosos avanços em tratamento decâncer, das alterações de estilo de vida bem conhecidas quepodem grandemente reduzir o risco de câncer, e dos sinais deadvertência no inicio que alguns cânceres fornecem, muitospacientes ainda desenvolvem câncer para o qual nenhuma tera-pia convencional está disponível que ofereça qualquer espe-rança razoável de cura ou paliação significante. IFNa2 éconhecido por ter efeitos anticâncer.

Uma pessoa que sofre de câncer avançado pode exi-bir um ou mais dos seguintes sinais ou sintomas: presença detumor canceroso, fadiga, dor, desempenho diminuído, estadode fardo de tumor, e os sintomas bem conhecidos associadoscom cada câncer específico.

Para prática da invenção, os mutantes de IFNa2 sãoadministrados ao paciente exibindo um dos muitos sinais ousintomas acima em quantidades suficiente para eliminar oupelo menos aliviar um ou mais dos sinais ou sintomas.

Infecção de vírus de hepatite (HCV)

As Atuais terapias para tratar infecção de HCV so-frem de certas desvantagens. Os regimes de dosagem envol-vendo injeções diariamente (QD), a cada dois dias (QOD), outrês vezes semanalmente (TIW) de IFN-α durante os períodosde tratamento prolongados sofrem de uma ou mais das seguin-tes desvantagens: (1) os regimes de dosagem são incômodos aopaciente e, em alguns casos, resultam na complacência do pa-ciente reduzida; (2) os regimes de dosagem são freqüentemen-te associados com efeitos adversos, causando desconforto a-dicional ao paciente, e, em alguns casos, resultando na com-placência de paciente reduzida; (3) os regimes de dosagemresultam em "picos" (Cmax) e "depressões" (Cmin) em concen-tração de IFN-α de soro, e, durante os períodos de "depres-são", o vírus pode se reproduzir, e/ou infectar células adi-cionais, e/ou mutar; (4) em muitos casos, a redução de Iogno titulo viral durante a resposta viral precoce é insufici-ente para efetuar uma resposta viral prolongada que resultano final em liberação do vírus. A presente invenção poderiater impacto significante na melhoria do potencial terapêuti-co de tratamento de uma infecção de vírus de hepatite.

Diabete Melito Dependente de Insulina (IDDM)

A etiologia de IDDM é um assunto de grande debate.Parece ser multifatorial, incluindo a predisposição genéticae influências ambientais. Fortes associações foram identi-ficadas entre IDDM e HLAs específicos codificados pela regi-ão complexa de histocompatibilidade principal localizada nobraço curto do cromossomo 6. Os alelos de alto risco prin-cipais são DR3 e DR4. As influências ambientais pensadasser importante incluem vírus, e várias linhas de sustentaçãode evidência neste propósito. Certos vírus associados oudiabetogênicos (caxumbas, sarampo, rubéola, encefalomiocar-dite M, coxsackievírus B, e reovírus) tem sido epidemiologi-camente associados com o desenvolvimento de IDDM ou podemcausar diabete quando inoculados em roedores. Os vírus dia-betogênicos podem diretamente infectar células B in culture.

Além disso, coxsackievírus B4 tem sido isolado do pâncreasde um menino com IDDM recém iniciado que morreu de cetoaci-dose grave, e este vírus produzi diabete em animais experi-mentais junto com antígenos virais nas células B dos animaisinfectados. As células B de pacientes com IDDM segregaramalfa interferon, desse modo os polipeptídeos de IFNa2 anta-gonistas desta invenção podem ter impacto significante namelhora do potencial terapêutico de IDDM.Lúpus Eritematoso (LE)

LE é uma doença auto-imune que causa inflamação edanifica os vários tecidos e partes do corpo, incluindo jun-tas, rins, coração, pulmões, cérebro, vasos sangüíneos, epele. Os sintomas mais comuns de LE incluem articulaçõesinchadas ou doloridas (artrite), febre, fadiga prolongada ouextrema, erupções cutâneas de pele e problemas de rim. Mes-mo que a causa de LE seja ainda desconhecida, acredita-seque LE seja causado por uma combinação de fatores genéticos,ambientais e possivelmente hormonais. LE pode ser caracte-rizado por períodos de doença ou chamas, e períodos de bomestado ou remissão. Conseqüentemente, as metas de tratamen-to efetivo de LE são para prevenir chamas, minimizar dano ecomplicações de órgão, e manter as funções corporais nor-mais. Os medicamentos geralmente prescritos para LE incluemdrogas antiinflamatórias não esteroidais (NSAIDs), acetami-nofeno, corticosteróides, antimaláricos e drogas de imunomo-dulação. Por causa do sucesso limitado de medicações dispo-níveis atualmente e seus efeitos colaterais potencialmentegraves, é importante fornecer um tratamento efetivo alterna-tivo para LE.

A composição da invenção pode ser efetiva em mini-mizar e/ou elimina vários sintomas em pacientes com LE.

Tendo agora geralmente descrito a invenção, a mes-ma será mais facilmente entendida através de referência aosseguintes exemplos, que são fornecidos através de ilustraçãoe não é pretendido serem limitantes da presente invenção.

EXEMPLOSMétodos:

(i) Mutagênese direcionada ao sítio. A mutagênesedirecionada ao sitio foi realizada por amplificação de PCRdo pT72Ca2 de plasmideo de expressão com 18-21 iniciadoresde nucleotideo contendo o códon mutado empregando pwo de po-limerases de alta fidelidade (Boehringer Mannheim) e pfu (S-tratagene) como descrito anteriormente (Piehler, J. & Sc-hreiber, G. 1999, J.. MoI. Biol 294, 223-237). Após a fosfo-rilação e ligação, os plasmideos mutados foram transformadosem células TGl de E. coli. A seqüência completa do gene ex-pressado contendo a mutação foi verificada através de se-quenciamento de DNA.

(H) Expressão e purificação de proteína. IFNa2 eIFNAR2-EC foram expressos em E. coli e purificados por cro-matografia de exclusão de tamanho e permuta de ions comodescrito anteriormente (Piehler, J. & Schreiber, G. 1999, J.MoI. Biol 289, 57-67). As concentrações de proteína foramdeterminadas da absobância a 280nm com ε28ο = 18070cm "1M"1para IFNa2 e ε28ο = 26500cm "1M"1 para IFNAR2-EC. IFNARl-ECfoi expresso em células de inseto Sf9 e foi purificado comodescrito (Arduini, R. M. e outros, 1999, protein Science 8,1867-1877).

A pureza de proteína foi analisada através de SDS-PAGE sob condições de não redução. A concentração de prote-ína IFNa2 ativa foi determinada para todos os mutantes atra-vés de filtração de gel analítico com IFNAR2-EC como descri-to anteriormente (Piehler, J. & Schreiber, G. 1999, J. Mol.Biol. 289, 57-67). Para estudos de ligação de ligando,IFNa2 e IFNp foram rotulados especificamente em sítios em-pregando substância química de maleimida. IFNP foi direta-mente rotulado a seu resíduo de cisteína livre C17 atravésde incubação de um excesso molar de 2-vezes de maleimida 0-regon Green 488 (OG488) (Sondas Moleculares) durante 2 h emHBS. IFNa2 foi rotulado com OG488 após incorporação de umresíduo de cisteína adicional (mutação S136C), que foi mos-trado não para afetar a interação com IFNARl-EC ou IFNAR2-EC(Gavutis e outros, 2005, Biophysical Jounal 88(6):4289-4302).

(iii) Desenvolvimento e reduplicação de mutanteIFNa2-YNS. E. Coli foram desenvolvidos em frasco de 750ml.As bactérias foram centrifugadas, re-suspensas em tampão delise de 30ml e sonicadas em bacteriologia durante 30" duran-te cinco horas. Seguinte a centrifugação a 16.OOOrpm duran-te 30', a pelota (corpúsculos de inclusão) foi re-suspensaem solução de lavagem de triton de ~30ml (0,5% de triton,5OmM de Tris8 e IOOmM de NaCl). Os corpúsculos de inclu-são foram centrifugados em 25.OOOg (14,500rpm em ss34 desorval) e foram lavados durante 4-5 horas. Uma lavagem fi-nal foi realizada para livra-se do triton, empregando 50mMde Tris (8,4) com IOOmM de NaCl. Os corpúsculos de inclusãopurificados foram dissolvidos em 5ml de 6M de Guanidina du-rante cerca de 12hr a 4°C com agitação suave. Seguinte acentrifugação a 25000g durante 20', o sobrenadante foi man-tido e a pelota foi descartada.

Para reduplicação, o sobrenadante foi diluído 1:20em 0,8M de Arginina pH 9,3, agitado lentamente ao mesmo tem-po em que suavemente em um vórtice, e sacudido a 20°C duran-te 2hrs. Seguinte a centrifugação a 16.OOOrpm durante 20' ediálise contra Tris 7,4, a proteína foi purificada atravésde cromatografia de permuta de íon para produzir: ~5 mg/L deproteína pura.

(iv) Medições da afinidade de ligação. A intera-ção entre IFNARl-EC e IFNa2 recombinante foi monitorado a-través de Espectroscopia de Interferência Reflectométrica(RIfS) sob condições de fluxo total (Schmitt, H. M., e ou-tros, 1997, Biosens. & Bioelectron. 12, 809-816). Este mé-todo detecta a interação biomolecular a interfaces como umaalt eração nas densidades ópticas aparentes de uma camada desílica fina. A ligação á superfície é monitorada como umdesvio no espectro de interferência. 0 desvio A de 1 pmcorresponde a aproximadamente 1 pg/mm2 de proteína na super-fície. Um segundo método aplicado para medições de ligaçãoem tempo real foi através de SPR (ressonância de plásmon desuperfície) empregando o ProteON (Biorad). Todas as medi-ções foram realizadas empregando HBS (20 mM de HEPES pH 7,5,150 mM de NaCl e 0,01% de Triton X100) como um tampão fluen-te. A ligação da sub-unidade do receptor de IFNARl à super-fície de fatia foi feita por dois métodos. Em um, o anti-IFNARl-EC mAb DB2 não neutralizante foi acoplado à superfí-cie (dextrana amino-funcionalizada de AMD 500) por seus gru-pos amino expostos por substância química de acoplamento deamino. 0 IFNARl-EC foi afinidade capturada à superfície se-guida por reticulação com um segundo mAb AA3. Em um segundométodo, a cauda His-alvejada de IFNARl foi diretamente unidaà superfície de NTA da fatia. Uma descrição detalhada dométodo empregado para medir a interação de interferon-IFNAR2-EC é determinada em (Piehler, J. e Schreiber, G.2001, Anal. Biochem. 289, 173-186). Para ligação fraca, adeterminação da constante de dissociação K0 foi obtida daresposta de equilíbrio plotada contra a concentração de pro-teína e adaptada de acordo com a lei de ação de massa. Parainterações de ligação mais estritas, as constantes de taxascinéticas foram determinadas e a afinidade foi calculada darelação de koff/kon=KD bem como diretamente da resposta de e-quilíbrio.

(v) Ensaio de atividade de proteção antiviral.Atividade antiviral de IFNa2 tipo silvestre e mutante foiensaiada como a inibição do efeito citopático de vírus deestomatite vesicular (VSV) em células WISH humanas (Evinger,M. e outros, 1981, Arco. Biochem. Biophys. 210, 319-329). Aatividade relativa de mutantes de IFNa2 foi determinada comoa concentração necessária para 50% de proteção das célulasrelativo à concentração de IFNa2 tipo silvestre necessáriopara 50% de proteção.

(vi) Ensaio antiproliferativo. A atividade anti-proliferativa de IFNa2 nas células de linfoma de Daudi Bur-kitt foi ensaiada como descrito (Piehler, J. e outros, 2000,J. Biol. Chem. 275, 40425-40433). As células foram tratadasdurante 60 h com IFN. 0 número de células vivas foi entãodeterminado empregando um kit de manchamento de célula (Bio-logical Industries Co, Israel) com base na detecção colori-métrica da clivagem do sal do XTT de sal de tetrazólio emformazano. O ensaio antiproliferativo em células WISH foiconduzido adicionando-se interferon em diluições diferentesao meio de desenvolvimento, e monitorando a densidade dascélulas após 72 hr através de manchamento violeta cristal.

(vii) Erros. O erro (σ) em Kd para ligação deIFNa2-IFNAR2 quando medido em RIfS é 20%, e para 30% de afi-nidade relativa (peso/mut) . Para IFNa2-IFNARl, o erro (σ)em Kd é 35% e para 50% de afinidade relativa (peso/mut). Aousar 2σ (95% de confidência) como o nivel de confidência bá-sico, isto pode sugerir que um mínimo de uma alteração deduas vezes pode ser visto como significante. A magnitude doerro (σ) para medições de atividade biológica individuais(quer antiviral ou anti-proliferativo) é 35%. Entretanto,um nível de confidência de 2σ entre duas medições pode suge-rir que diferenças menores do que duas vezes estão dentro doerro experimental.

(viii) Experiências de microdisposição de oligonu-cletídeo Manchadas. As microdisposiçãos de vidro revestidaspor poli-L-lisina-coberto contendo quase 19.000 sondas dife-rentes (série de oligonucleotídeo humano de Compugen) foramadquiridas de CAG (Center for Applied Genomics, New Jersey)1

As microdisposiçãos foram sondadas com uma mistura cosistin-do em cianina (Cy) 3 ou cDNA rotulado por Cy5 representandoo tratamento versus não tratamento (controle) de IFN. Ascélulas WISH foram tratadas com diferentes IFNs durante 16horas e seu RNA extraído (RNeasy Midi kit, Qiagen), 100μg daqual foram submetidos à transcrição reversa (enzima de RT demutação M-MLV Η-pontual, Promega) com nucleotídeo de dUTPmodificado por aminoalila (Ambion) misturado na mistura denucleotideo a uma relação de 4:1 de aa-dUTP para dTTP. OcDNA produzido foi rotulado com a sonda fluorescente Cy3 ouCy5 ativada por NHS (Amersham) , que se liga ao aa-dUTP. Aincorporação foi avaliada (espectrofotômetro de NanoDrop) ecDNAs rotulados foram misturados (tratamento com uma cor econtrole com a outra) em quantidades equivalentes de tinturafluorescente (100 pmoles cada), no final 2X SSC, 0,08% deSDS e 6μ1 de solução de bloqueio (Amersham), em ΙΟΟμΙ de vo-lume alvo, desnaturado a 95°C durante 3 minutos, resfriado eaplicado entre uma capa elevada (LifterSlip, Erie ScientificCompany) e a disposição. A hibridização foi feita a 55°Cdurante 12 horas na escuridão. Depois, a lâmina foi lavadacinco minutos em 2X de SSC, 0,5% de SDS a 55°C; cinco minu-tos em 0,5X de SSC em temperatura ambiente e uns cinco minu-tos finalmente em 0,05X de SSC em temperatura ambiente. En-tão foi secada girando-se 3 minutos a 1000 rpm, e armazenadona escuridão até que cintilografas.

(ix) Análise de dados e imagem de microdisposição.

A varredura das microdisposiçãos hibridizadas foi realizadacom scanner de microdisposição de DNA (Agilent). A detecçãode mancha automática, subtração de fundo e quantificação deintensidade foi feita com o software SpotReader (Niles Sci-entific). A normalização de dados, análise de grupo e fil-tragem foram feitas com o software GeneSpring (SiliconGene-tics). A análise é baseada no tratamento para controlar arelação de cada ponto, e inclui tais manipulações como fil-tração de dados por flags de produção SpotReader, uma indi-cação da qualidade do sinal, relativamente ao fundo (ruído).Cada tratamento (condição) é representado através de duasréplicas de microdisposição de troca de tinturas. Uma listainicial de genes de interferon modulado foi integrada atra-vés de genes além de um limiar de 1,7 em pelo menos duascondições, tolerando somente um flag 'ausente' (λΑ'), que éindicativo de um ponto 'ruidoso' , em todas as condições porgene. Este critério foi selecionado após perceber que a su-pra ou infra-regulação genuína é observada em mais do queexatamente um tratamento de IFN, desse modo selecionado duascondições como um mínimo, um limiar baixo de severidade énecessário para incluir ISGs modificado a níveis relativa-mente baixos.

A lista destes genes foi exportada em uma folha detrabalho de Excel, e conteve o valor da relação de tratamen-to para controle médio, os valores de réplica, p-valores det-teste, que é uma estimativa do erro técnico de microdispo-sição com base na distância entre as réplicas, e os códigosde flag. Os genes foram então analisados a olho nu quanto àsignificação, comparando-se à distância entre cada par deréplicas e entre condições, olhando também em p-valores e aocorrência de 'A' flag. Esta análise tediosa foi necessáriaporque a seleção estatística deixa claramente super/infra-regulado, por causa do ruído relativamente grande produzidopara o baixo número de réplicas por condição. Um valor mé-dio além do limiar de 1,7 tendo uma de suas réplicas abaixodeste limiar, ou com uma distancia inter-réplica maior rela-tiva a média, e com nenhuma outra condição com níveis simi-lares e significantes, não foi considerada uma modulaçãoconfiável, porém ruido técnico, e o gene foi excluído conse-qüentemente da lista. A lista final consistiu em 395 genes,super-regulados ou infra-regulados através de interferons em16 horas de tratamento. A análise de grupo foi feita nestalista importa-lo de volta para GeneSpring.

EXEMPLO 1. Caracterização da interação de IFNa2-IFNAR1-EC empregando um sistema biosensor óptico

A interação de IFNARl-EC para IFNa2 foi investiga-da por detecção de fase sólida de livre de rótulo empregandoRIfS. Esta tecnologia requer a imobilização na superfíciede fatia de um dos compostos de interação. O método de modobem sucedido previamente empregado para IFNAR2-EC foi empre-gado, onde o receptor é imobilizado empregando mAbs que sãoauto-imobilizados à superfície por acoplamento de amino (Pi—ehler, J. e Schreiber, G. 2001, Anal. Biochem. 289, 173-186) . O mAb DB2anti-IFNARl-EC não neutralizante foi acopla-do à superfície AMD 500 de dextrana funcionalizada por aminopor seus grupos amino expostos. O IFNARl-EC foi capturadopor afinidade à superfície de mAb seguido por reticulaçãocom um segundo mAb AA3. O processo como seguido em RIfS detempo real é mostrado na Figura IA. A atividade de ligaçãode IFNARl-EC ligado à superfície de RIfS foi determinada in-jetando-se proteína de IFNa2 a concentrações variando de0,12 a 4μΜ. Devido à baixa afinidade de ligação de IFNa2 aIFNAR1-EC, os dados cinéticos de associação e dissociaçãonão podem ser determinados. Entretanto, a afinidade de li-gação foi determinada de plotagem da resposta de estado es-tável versus a concentração de proteína de acordo com a leide ação de massa. Isto resulta em uma constante de afinida-de de 1,5μΜ para IFNa2 tipo silvestre (Lamken, P. e outros,2004, J MoI Biol 341, 303-318) .

EXEMPLO 2. Mapeamento e Sítio de Ligação de IFNa2para IFNARl

Para localizar o sítio de ligação de IFNARl emIFNa2, uma varredura de Ala da maioria dos resíduos locali-zados nas hélices BeC foi realizada (Figura 2 e 3). Todosjuntos, 21 mutações pontuais únicas foram produzidas, e suasafinidades de ligação para IFNAR2 e IFNARl foram medidas porRIfS ou ProteON. Quando as mutações são localizadas na su-perfície oposta do sítio de ligação de IFNAR2 em IFNa2, asafinidades de ligação das proteínas de mutante diferentespara IFNAR2 foram muitos similares àquelas de IFNa2 tiposilvestre (Tabela 1). Isto é assegurado, uma vez que validaa duplicação apropriada de todas as proteínas mutantes, esuas concentrações ativas. Ao mesmo tempo em que a ligaçãode IFNa2 com IFNAR2-EC fornece um sinal cinético claro, aligação para IFNAR1-EC é muito mais fraca e tem que ser ana-lisada de acordo com o sinal de unidade refrativa (RU) daafinidade de estado estável, variando-se a concentração doligando. Neste caso, o conhecimento das concentrações exa-tas e precisas de todas as proteínas de IFNa2 é essencial.Entretanto, todas as concentrações de proteína mutante foramvalidadas em uma coluna de filtração de gel analítica pelasua capacidade de ligar IFNAR2-EC. Os resultados de todasas medições de ligação são resumidos nas tabelas 1 e 3 e Fi-gura 3Α. Três únicas mutações causam um aumento na ligação(H57A, E58A, Q61A) ao mesmo tempo em que 6 mutações causamuma diminuição na ligação (F64A, N65A, T69A, L80A, Y85A,Y89A). Entretanto, nenhum ponto quente para ligação foi i-dentificado, desse modo, nenhuma das mutações levou a umaalteração de mais do que 5 vezes em afinidade. Para confir-mar os efeitos de mutação única, um mutante triplo contendoas mutações únicas L80A, Y85A, Y89A (designado aqui comoLYY) e um mutante quádruplo N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ IDNO: 6) (designado aqui como NLYY) foram preparados. A liga-ção para estas duas proteínas mutante foi abaixo do limiarda medição.

Tabela 1: Constantes Termodinâmicas e Cinéticospara as Interações de IFNa2 Mutante (hélice de B e C e o Io-op C-D) com IFNAR2-EC e IFNARl-EC_

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EXEMPLO 3. Atividade antiproliferativa e antiviralde mutantes de IFNa2

A atividade antiviral foi ensaiada como a inibiçãodo efeito citopático de vírus de estomatite vesicular (VSV)em células WISH (linhagem de célula epitelial humana de ori-gem amniótica). A atividade anti-proliferativa foi determi-nada tanto em células WISH quanto em células Daudi, como ainibição de 50% de desenvolvimento da célula (como descritonos Métodos). A Figura 4A mostra o resultado de aplicar umadiluição em série de concentrações de IFNa2 e IFNp durante72 hr na intensidade exibida pelas células WISH após man-char, da qual a concentração de interferon promovendo um e-feito de antiproliferativo pode ser deduzida. Os poços fo-ram cintilografados para análise de densitometria, e os re-sultados foram plotados versus a concentração de proteínaaplicada (Figura 4B) . 0 mesmo foi feito para determinar apotência antiviral de interferons em células WISH (Figura4C). O ponto de atividade de 50%, bem como as taxas de al-teração em atividade (declive), foram deduzidos de uma curvade resposta de dose IFN, Eq. 1.

γ = A0 + A/ (1+ (c/c50) 3) [Eq. 1]

onde γ é a transmitância que se refere ao númerode células, A0 é o ofsete, A é a amplitude, c é a concentra-ção, C50 é a concentração determinando 50% de atividade, e sé o declive. As concentrações de IFNa2 e IFNβ médias promo-vendo 50% de proteção antiviral são respectivamente 0,85 e0,43 pM (calculada a média durante 6 experiências). As con-centrações de IFNa2 e IFNp médias promovendo 50% de ativida-de anti-proliferativa são 1360 e 29 pM (calculada a médiadurante 17 e 7 experiências respectivamente). De modo inte-ressante, a concentração de IFNa2 promovendo 50% de ativida-de anti-proliferativa em células Daudi é somente 0,5 pM (Ta-bela 2), o que está acima de 1000-vezes menor do que aquelamedida para as células WISH realçando a importância de usara mesma linha de célula para todas as experiências.

A atividade antiviral e antiproliferativa de todasas proteínas de mutante de interferon foi determinada rela-tivo àquela de IFNa2 tipo silvestre (peso/mut) com os resul-tados sendo resumidos nas Tabelas 2 e 4. Como encontradocom a afinidade de ligação para IFNARl-EC, as atividades an-tivirais e antiproliferativas não alteraram dramaticamentesob mutação. 0 único mutante que causa um aumento signifi-cante na atividade antiviral (> 2-vezes) é E58A. L80A, Y85Ae Y89A causam uma diminuição significante na atividade anti-viral (porém nenhum acima de 6-vezes). Entretanto, os mu-tantes LYY e NLYY combinados reduzem a potência antiviral em30 e 100-vezes, respectivamente. Esta redução aproximada-mente ajusta os efeitos aditivos das únicas mutações (paraLYY, 0,5x0,26x0,20 = 0,029, similar ao resultado obtido parao mutante triplo). O efeito na atividade antiproliferativada mesma série de mutantes é mais significante, com ambosE58A e Q61A causando um aumento significante na atividade,ao mesmo tempo em que N65A, T69A, L80A, Y85A e Y89A causandouma diminuição significante na atividade. Além disso, amagnitude da diminuição em atividade quando medida no ensaiode antiproliferativo empregando células WISH é significante-mente maior do que aquele medido quanto á proteção antivi-ral. Os mutantes múltiplos de LYY e NLYY reduzem a ativida-de em 190 e 1100-vezes, respectivamente. Neste caso, as ú-nicas mutações superestimam o efeito medido para os mutantesmúltiplos em cerca de 30 vezes (para LYY, 0,14x0,035x0,044 =0,00022 versus o valor experimentalmente medido de 0,0057, epara NLYY 0,16x0,14x0,035x0,04 4 = 0,000035 versus o valorexperimentalmente medido de 0,00092). Os resultados antivi-rais e antiproliferativos para todos os mutantes analisadossão plotados na Figura 5A. Para interesse, também foi adi-cionado o valor medido quanto ao ΙΕΝβ. Parece neste gráficoque a resposta antiproliferativa é muito mais sensível aomutante IFNa2 específico comparado à resposta antiviral.

Além disso, esta tendência também ajusta os dados para IFNP,para que a atividade antiviral seja de cerca de 2 vezes maiselevada do que aquele IFNa2 (similar à atividade antiviraldo mutante E58A) ao mesmo tempo em que sua atividade de an-ti-proliferativo é ~50-vezes mais elevada. Ao comparar aatividade biológica com a afinidade de ligação medida paraIFNARl mostra que ambas as atividades geralmente escalam coma afinidade de ligação, porém não acima da escala total (Fi-gura 5B).

Tabela 2: Atividade Biológica de mutantes de IFNa2

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EXEMPLO 4. Estabilidade do complexo ternário é re-alçada por HEQ comparado com IFNa2

Uma vez que três mutações para Ala foram constata-das aumentar a ligação em 2 a 4 vezes, estas três mutaçõesde IFNa2 (H57A, E58A, Q61A) foram combinadas em uma únicaproteína mutante de IFNa2, como empregado aqui, HEQ designa-da (SEQ ID NO: 5).

A ligação de IFNs ao domínio extracelular de re-ceptor do tipo I de Interferon (IFNAR1-EC), e para o comple-xo ternário incluindo IFNARl-EC e IFNAR2-EC foi estudado a-través de espectroscopia de fluorescência de reflexão inter-no total (TIRFS). IFNAR2-EC e IFNARl-EC foram presos atra-vés de sés rótulos de histidina C-terminal sobre as bicama-das de lipideo de suporte sólido. Os cinéticos de dissocia-ção de IFNa2-peso, HEQ, e IFNP de IFNARl-EC como monitoradopor TIRFS são comparados na Figura IC'. Um aumento de 20 ve-zes em tempo de vida do complexo foi observado para HEQ com-parado a IFNa2, e cinéticos de dissociação similares comopara IFNp (Tabela 3). Em contraste, constantes de associa-ção de taxa muito similares foram obtidas para todas as trêsespécies. A partir destes dados, uma constante de dissocia-ção de equilíbrio K0 = 83 nM foi determinada para o complexode HEQ/IFNARl-EC, K0 = 33 nM foi determinada para o complexode YNS/IFNARl-EC, Kd = Ι,βμΜ para complexo de IFNa2-peso/IFNARl-EC e K0 = 66 nM para complexo de IFNp/IFNARl-EC.

A afinidade de ligação de HEQ para IFNAR2-EC é similar àque-la medida para IFNa2-peso (5 nM) , que é cerca de 10 vezesmais fraca que aquela de IFNp (Tabela 3) . Desse modo, so-mente a afinidade de HEQ com relação ao IFNARl é similar aIFNP, porém não com relação ao IFNARl.

IFN induz a atividade biológica pela formação docomplexo ternário (IFNARl-IFN-IFNAR2) em uma estoiquiometriade 1:1:1. Por causa da ligação cooperativa as duas sub-unidades receptoras ligadas à superfície, a afinidade de li-gação ligando aparente é mais elevada do que a ligação aoIFNAR2 sozinho, e depende das concentrações de superfície dereceptor relativas e absolutas (Lamken, P e outros, 2004,JMoI Biol 341, 303-318) . A estabilidade aumentada do com-plexo ternário por afinidade aumentada com relação ao IFNARlpode ser sondada pelos cinéticos de dissociação de ligando.Entretanto, a dissociação de IFNa2 (SEQ ID NO: 2), HEQ (SEQID NO: 5), YNS (SEQ ID NO: 11), a8-cauda (SEQ ID NO: 7) eIFNp (SEQ ID NO: 3) foram comparadas com as concentraçõesdiferentes de IFNARl-EC e IFNAR2-EC a relação de estoiquio-metra. Para IFNp, as medições foram feitas empregando o mu-tante I47A em IFNAR2, que liga IFNp a uma afinidade de 5 nM,similar àquela de IFNa2 com relação ao peso-IFNAR2 (Tabela3). Isto chega a comparar somente o efeito de concentraçãode superfície IFNARl em dissociação de ligando. Ao mesmotempo em que para IFNa2, os cinéticos de dissociação dependefortemente da concentração de superfície de receptor, ascurvas de dissociação sobrepostas foram observadas para IFNpe HEQ. Isto demonstra claramente a estabilidade mais eleva-da do complexo ternário formado com IFNp e HEQ. Ainda naconcentração de receptor superior (que é muito acima da con-centração de receptor celular em 1000 receptores por célu-la) , foi observada a dissociação mais rápida de IFNa2 tiposilvestre do que para IFNp e HEQ nas concentrações de recep-tor mais baixas. Entretanto, se as concentrações de recep-tor de superfície são aumentadas também, eventualmenteIFNa2-peso dissocia em taxas comparáveis a IFNp ou HEQ. Aestabilidade do complexo ternário é uma função combinada deconcentrações de receptor de superfície e das afinidades deligação com relação aos receptores individuais. Assumindoque a estabilidade do complexo ternário está relacionada coma atividade biológica, não é surpreendente que ativação di-ferencial de IFNs de ligação mais estrita possa ser seqües-trada em células com números elevados de receptor, ou natu-ral (como em células Daudi) ou devido a transfecção. Istotambém realça o perigo de transfectar células com receptoresde superfície de célula em níveis não nativos, um assuntonormalmente ignorado.

Tabela 3: Constantes e afinidades de taxa da inte-ração de IFNa2tipo silvestre, IFNp e mutantes de IFNa2 comIFNARl-EC e IFNAR2-EC

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asítio de mutante S136C especificamente rotuladocom maleimida Oregon Green 488

bSitio especificamente rotulado com maleimida Ore-gon Green 488 em resíduo C17 livre

cinteração com IFNAR2-EC I47A

EXEMPLO 5. Atividade antiviral e anti-proliferativa de mutantes IFNa2: HEQ, MDL, a8-cauda e YNS

Foi notado que a potência antiviral de IFNp em cé-lulas WISH é somente 2 vezes mais elevada comparada comIFNa2, ao mesmo tempo em que sua atividade anti-proliferativa é cerca de 50 vezes mais elevada. As Figuras4B-4C mostram as atividades antivirais e anti-proliferativasde IFNa2-peso, HEQ (SEQ ID NO: 5) e IFNp, quando medidas emcélulas WISH. Neste ensaio, o perfil de atividade de HEQ écomparável com aquele de ΙΕΝβ. A despeito do grande aumentoem afinidade de ligação de HEQ com relação ao IFNAR1, suapotência antiviral é somente 2 vezes mais elevada do que a-quela de I FNa2 tipo silvestre. Sua atividade de anti-prolif erativa é aumentada em -25 vezes comparada com um au-mento de 42 vezes na atividade anti-proliferativa de IFNp(Tabela 4). A mesma tendência é também verdade para MDL(SEQ ID NO: 10) e YNS (SEQ ID NO: 11) . Ao mesmo tempo emque sua atividade antiviral é aproximadamente aquela deIFNa2, sua atividade antiviral é muito mais elevada. MDLapresenta o mesmo nivel de atividade como IFNp, ao mesmotempo em que YNS apresenta um nivel ainda mais elevado deatividade anti-proliferativa. As atividades anti-proliferativas aumentadas estão em linha com as afinidadesaumentadas deste dois IFNs com respeito ao IFNARl. Comopreviamente notado, IFNp parece controlar o desenvolvimentomais rápido comparado a IFNa2. Como um resultado, a célulatotal após aplicação de concentrações de IFN elevadas é me-nor para IFNp. Este fenômeno não pode ser compensado empre-gando-se sua concentração mais elevada de IFNa2, porém é umadiferença qualitativa (Figura 4B). Neste aspecto, HEQ e YNSse comportam como IFNa2-peso, e não como IFNp. O declive dacurva de titulação de HEQ (que se refere à concentração deinicio dependente) está entre aquele de peso-IFNa2 e IFNp.

Tabela 4: Atividades biológicas relativas de IFNa2tipo silvestre, mutantes e IFNp

<table>table see original document page 76</column></row><table>

EXEMPLO 6. Monitoramento da ativação de gene em-pregando tecnologia de fatia de gene

As fatias gene se tornaram uma tecnologia padrãopara obter informação completa sobre ativação de gene dife-rencial. Realmente, vários estudos foram conduzidos parainvestigar o perfil de expressão de gene na indução de IFN(de Veer, M. J. e outros, 2001, J Leukoc Biol. 69, 912-920).0 efeito de IFNs em expressão de gene foi monitorado atravésde experiências de microdisposição de oligonucletideo man-chado. As células WISH foram tratadas durante 16 horas com0,3 nM de IFNa2; 3 nM (10.000 unidades) de IFNa2; 0,3 NM deHEQ e 0,15 NM de IFNP (1, 000 unidades). As concentraçõesforam selecionadas para produzir >90% de uma resposta anti-proliferativa(3 nM de IFNa2-peso, HEQ e IFNP) ou sob 10% deresposta anti-proliferativa (0,3 nM de IFNa2-peso) em célu-las WISH. Em cada condição a experiência de tratamento deIFN versus nenhum tratamento foi realizada em duplicatas demicrodisposição de troca de tintura. Além disso, quatro ré-plicas de experiências de microdisposição consistindo em ne-nhum tratamento versus nenhum tratamento foram empregadascomo controle adicional. A relação normalizada entre as du-as cores é tomada como o nivel de indução. Os critérios se-lecionados para definir a lista de genes regulados por IFNsão descritos na seção de Métodos.

Os resultados do gene de fatia podem ser analisa-dos em uma base por gene, ou olhando para tendências geraisde indução de gene. A Figura 6 chega a determinar uma ava-liação das tendências registradas para a alteração em níveisde expressão de 395 genes IFN regulados, 16 horas após otratamento com ΙΡΝβ (0,15 NM), HEQ e IFNa2-peso (0,3 nM e 3nM, respectivamente) . Na Figura 6A os níveis de expressãorelativos (para nenhum tratamento) dos 395 genes foram plo-tados em ordem ascendente de acordo com a alteração de ve-zes. Os pontos pretos são da fatia de controle, que conteveuma mistura de amostras não tratadas somente em ambos os ca-nais de cor. Isto fornece uma estimativa da flutuação alea-tória esperada. As alterações mínimas e máximas no nível deexpresso registrado para a fatia de controle foram 0,65-1,6vezes, com a relação entre o dois de canais sendo somente0,75-1,4 vezes para o topo 95% dos genes. O baixo nível deflutuação aleatória em expressão de gene fornece um nívelelevado de confidência na qualidade dos dados. Em geral, osníveis de expressão de gene são similares para IFN β (0,15NM) e HEQ (0,3 NM) (Figura 6A), ao mesmo tempo em que um ní-vel muito mais baixo de indução foi registrado para IFNa2-peso (0,3 NM) . A indução de gene em adição de 3 nM deIFNa2-peso está entre os níveis registrados para IFNa2-peso(0,3 NM) e IFNp (0,15 NM) ou HEQ (0,3 NM). Um modo alterna-tivo de analisar os níveis de expressão diferenciais é plo-tar a relação de alteração em ativação de gene entre os tra-tamentos diferentes (Figura 6B). Quando IFNP induziu a mai-or alteração, todos os outros valores foram calculados rela-tivos a indução de IFNp. O controle é o mesmo como na Figu-ra 6A. Novamente, IFNp e HEQ parecem induzir o mesmo nívelde alteração para todos os genes (a linha verde segue a li-nha preta que é o controle) . Isto não significa um não umúnico gene se comporta significantemente diferente sob indu-ção com IFNP versus HEQ. Este resultado notável mostra deque modo similares ambos estes IFNs são. A expressão dife-rencial maior é encontrada entre IFNP e IFNa2-peso (0,3 nM).Novamente, os resultados para IFNa2-peso (3 nM) estão entreaqueles registrados para IFNa2-peso (0,3 nM) e HEQ.

A análise de grupo dos genes induzidos de IFN paraos quatro tratamentos foi feita para determinar a verifica-ção independente dos resultados apresentados graficamentenas Figs. 6A e 6B. Figo. 6C mostra que os perfis de expres-são de gene de grupo de IFNp e HEQ junto, com uma distânciamuito curta entre eles. O perfil de expressão de célulastratadas com 3 NM IFNa2-peso se agrupa em seguida, ao mesmotempo em que o perfil de expressão de gene de 0,3 NM deIFNa2-peso está ainda mais distante. A definição de perfilde expressão de gene está de acordo excelente com a ativida-de biológica diferencial observada entre INFp e IFNa2, e no-vamente demonstra que HEQ é um IFNa2 com todas as caracte-risticas de IFNp.

As fatias de gene fornecem conhecimento detalhadodos níveis de expressão dos genes individuais que compreen-dem o genoma. Um dos aspectos mais interessantes de analisaro perfil de expressão de gene de IFNp contra IFNa2-peso éinvestigar ativação diferencial, e a relação entre ativaçãodiferencial e concentração de IFN (Der, S. D., e outros,1998, Proc Natl Acad U.S.A 95, 15623-15628). Fora dos 395genes induzidos, 59 genes supra-regulados e 9 genes infra-regulados foram selecionados de acordo com o seu nível dife-rencial de ativação entre os tratamentos diferentes (Jaitine outros, 2006, Mol Cell Biol 26 (5):18 88-1897, Tabela 3).

0 efeito em expressão de IFNp e HEQ (SEQ ID NO: 5)na maioria dos genes muito mais forte do que o efeito indu-zido por IFNa2 a concentrações de atividade anti-viral equi-valentes, isto é, 0,15 e 0,3 nM, respectivamente, que incluimuitos genes não influenciados por IFNa2 à 0,3 nM de concen-tração.

EXEMPLO 7. Modelo prevenção tumor MDA231

Para estabelecer os tumores sub-cutâneos (s.c.),as células MDA231 eram crescidas in vitro para 70% de con-fluência, tripsinizadas e suspensas em PBS a uma concentra-ção de IO8 células/ml, e IO7 células foram injetadas s.c. noflanço de um camundongo nu. Os camundongos foram então ale-atorizados e separados em 3 grupos de tratamento de 6 ani-mais por grupo. 0 regime de tratamento começou no Dia 1 econtinuou até a Dia 34. Os camundongos foram injetados s.c.com PBS ou um tratamento especifico duas vezes por semanadurante 34 dias. Depois de 34 dias de tratamentos os animaisforam sacrificados, os tumores foram excisados e o tamanhode tumor foi determinado. Os resultados são resumidos naTabela 5. Os resultados demonstram claramente que de acordocom as experiências de cultura de tecido, YNS é muito efeti-vo suprimindo o crescimento de células MDA231 de câncer demama in vivo. Seguinte os 34 dias de tratamento com YNS to-dos os camundongos tratados com YNS foram limpos de caroços,ao mesmo tempo em que cinco entre seis dos camundongos tra-tados com IFNct2 e todos os seis dos camundongos tratados comPBS tiveram caroços de tamanho variado.

Tabela 5: Os resultados de modelo de prevenção detumor MDA231

<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>

Os camundongos foram injetados com células de MDA231 no dia ze-ro, seguido por injeções de 20 μς/θ3ΐτοχ1οηςο dos tratamentos di-ferentes nos tempos indicados. Seis camundongos foram tratadospara cada condição experimental. O crescimento de tumores foiestimado por de olho durante quase todos os 34 dias. No últimodia (34) os camundongos foram sacrificados, e o tumor foi extra-ído e foi medido. L, M, SeN representam tamanho de tumor (emparêntese é o diâmetro medido no dia 34), L- grande (>5 mm), M-médio (2,5-5 mm), S-pequeno (< 2,5 mm), N-nenhum.

EXEMPLO 8. Encefalomielite Autoimune Experimental(EAE)

A encefalomielite Autoimune Experimental (EAE),também conhecida como Encefalomielite Alérgica Experimental,é um modelo de animal de esclerose múltipla (MS). Vários mo-delos de EAE são conhecidos na técnica, dependendo do métodode indução, do filamento do animal e do antígeno empregadopara induzir a doença. EAE é uma doença aguda ou de recaídacrônica, adquirida, inflamatória e auto-imune desmielinante.

As formas diferentes de EAE se assemelham muito initimamenteàs várias formas e estágios de MS.

No estudo presente, EAE é induzido por injeção deProteína Básica de Mielina (MBP), um método conhecido paramodelar a fase aguda de SRA. Neste modelo o começo da doen-de 10 dias após a indução. Os progressos da doença e aclassificação clínica aumentam e maximizam por volta do dia15 e a recuperação espontânea é observada por volta do 23após a indução da doença.

Os camundongos Lewis fêmeas (peso corpóreo médio130-180 g, Harlan, Israel) são injetados s.c. nas patas tra-seiras com 25 ug de proteína básica de mielina de porco deguiné purificada (MBP, Sigma) emulsificada em 0,1 ml do Ad-juvante de Freund Completo (Difco). Os animais são mantidosem um regime de claridade de 12-horas/escuridão de 12 horas,a uma temperatura constante de 22°C, com comida e água adlibit um. A partir do dia 8 seguinte à indução, os animaissão acompanhados em uma base diária. Os resultados são re-gistrados como classificação clínica; classificação de 0 in-dica um animal normal sem sinais clínicos, 0,5 indica umaperda de tonicidade na parte de distai da cauda, 1 indicaparalisia da cauda inteira, 1,5 indica fraqueza em uma pernatraseira, 2 indica fraqueza em ambas as pernas traseiras,2,5 indica em uma perna dianteira, 3 indica paralisia de to-das as quatro pernas, 4 indica paralisia de corpo completa eestado moribundo e 5 indica morte. A classificação clínicados animais é registrada durante -15 dias seguinte o começoda doença até o fim do estudo, 25 dias seguinte a indução ea área sob a curva (AUC) é calculada durante este período detempo.

Os animais que exibem sintoma da doença, que pode-riam ser clinicamente classificados entre 0,5 e 1 são trata--dos com composições de HEQ (SEQ ID NO: 5), YNS (SEQ ID NO:11) ou controle de veículo durante três dias consecutivos apartir do começo da doença no dia 9-11 seguinte a induçãoda doença). Várias rotinas de administração são avaliadas,por exemplo, intravenosamente (em veiculo) ou oralmente a-través de gavagem (em veiculo) em dose de volume de 5 ml/kg.No último dia de estudo (aproximadamente dia 25) os animaissão eutanizados com 100 mg/kg de pentobarbitona de sódioi.ρ.

Os resultados são expressos como média + SEM e asdiferenças entre os grupos de tratamento foram analisadaspor análise de variância (ANOVA) , seguida pelo teste posthoc de Tukey. Um valor de ρ <0,05 é considerado ser esta-tisticamente significante e é indicado na figura por um as-terisco em cima do grupo de tratamento relevante.

A validez do modelo é estabelecida empregando rae-tilprednisolona como controle positivo. Quando o esteróideé administrado diariamente durante 5 dias consecutivos i.v.a 30 mg/kg a partir do dia de indução de doença através deinjeção de MBP, uma redução de 34% foi informada em AUC.

EXEMPLO 9. Um modelo animal de lúpus eritematososistêmico (SLE)

Os camundongos híbridos femininos (NZB X NZW)Fi(referidos a seguir como camundongos "NZB/W") espontaneamen-te desenvolveram uma doença tipo lúpus caracterizada pelapresença de auto-anticorpos de soro para DNA de filamentoduplo (dsDNA). Estes camundongos, que eventualmente sofremde falha dos rins total são freqüentemente empregados comoum modelo para experimentação voltada ao melhor entendimentoe tratamento de lúpus em humanos. Com o passar do tempo,esta condiç ão em camundongos NZB/W progride para mau funcio—namento do rim como manifestado pelo aparecimento de protei-núria.

Os camundongos NZB/W femininos de 32 semanas deidade são empregados em uma experiência para determinar seNLYY (SEQ ID NO: 6) poderia retardar o desenvolvimento dadoença tipo lúpus. Os camundongos são divididos em doisgrupos, e cada grupo é tratado a cada dois dias com ou NLYY(grupo de 10 camundongos) ou IgG de rato como um controle(grupo de 10 camundongos), administrado através de injeçãointraperitoneal. Os tratamentos são continuados durantecinco semanas, e os camundongos são avaliados semanalmentequanto à presença de proteinúria.

A descrição precedente das modalidades especificasrevelará desse modo completamente a natureza geral da inven-ção que outros podem, aplicando-se o conhecimento atual, fa-cilmente modificar e/ou adaptar aos vários pedidos tais mo-dalidades especificas sem experimentação imprópria e sem a-fastar-se do conceito genérico, e, portanto, tais adaptaçõese modificações devem, e é pretendido serem compreendidasdentro do significado e faixa de equivalentes das modalida-des descritas. Embora a invenção tenha sido descrita aquijunto com as modalidades especificas, é evidente que muitasalternativas, modificações e variações serão evidentes paraaqueles versados na técnica. Conseqüentemente, é pretendidoabranger todas tais alternativas, modificações e variaçõesque se incluem no espirito e escopo amplo das reivindicaçõesanexas.

Deveria ser entendido que a descrição detalhada eexemplos específicos, ao mesmo tempo em que indicando moda-lidades preferidas da invenção, são determinados através deilustração somente, uma vez que várias alterações e modifi-cações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarãoevidentes àqueles versados na técnica desta descrição deta-lhada.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Yeda Research and Development Co. Ltd.schreiber, GideonRoi sman, LaiIa C.Jaiti η, DiegoKalie, Eyal

<120> "MUTANTES DE INTERFERON a2 (IFNa2) RECOMBINANTES"<130> YEDA 058 PCT

<160> 35

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> IFNal

<400> 1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Pro Pro Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60

Phe Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Thr Trp Glu Gln ser65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95

Glu Ala Cys Val lie Gln Glu Val Gly vai Glu Glu Thr Pro Leu Met100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Πe Thr115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu165

<210> 2<211> 165<212> PRT<213> IFNa2

<400> 2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr ser Pro Cys Ala Trp Glu Val vai Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu ser145 150 155 160

Leu Arg ser Lys Glu165

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> IFNb

<400> 3

Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg ser ser Asn Phe Gln cys15 10 15

Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys20 25 30

Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln35 ' 40 45Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn50 55 60

Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu65 70 75 80

Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His85 90 95

Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arq100 105 110

Gly Lys Leu Met ser ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arq Ile115 120 125

Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His cys Ala Trp Thr Ile130 135 140

;

Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arq Leu Thr145 150 155 160

Gly Tyr Leu Arg Asn165

<210> 4<211> 165<212> PRT<213> IFNg

<400> 4

Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile vai Leu15 10 15

Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30

Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45

Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Glu Glu ser Asp Arg50 55 60

Lys lie Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys65 70 75 80

Asn Phe Lys Asp Asp Gln ser Ile Gln Lys ser Val Glu Thr Ile Lys85 90 95

Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp100 105 110Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn vai Gln115 120 125

Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro130 135 140

Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly145 150 155 160

Arg Arg Ala ser Gln165

<210> 5<211> 165<212> PRT<213> HEQ

<400> 5

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Ala Ala Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly VaT Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arq Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg ser Lys Glu165

<210> 6<211> 165<212> PRT<213> NLYY

<400> 6

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asd20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr He Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 7<211> 165<212> PRT<213> a8-tai1

<400> 7

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr He Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn asd Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val xle Gln Gly Val Gly vai Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg!45 150 155 160

Leu Lys Ser Lys Glu165

<210> 8

<211> 165

<212> PRT

<213> heq + a8-tail

<400> 8

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Ala Ala Met Ile Ala Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys vai Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Lys Arq145 150 155 160

Leu Lys ser Lys Glu165

<210> 9<211> 165<212> PRT

<213> NLYV+ a8-tail<400> 9

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe ser cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg145 150 155 160

Leu Lys ser Lys Glu165

<210> 10<211> 165<212> PRT<213> MDL

<400> 10

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 · 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Met Asp Met Ile Leu Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

ATa Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val VaT Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 11<211> 165<212> PRT<213> YNS

<400> 11

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile ser Leu Phe ser cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr lie Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile ser Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys vai Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe Ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 12

<211> 165

<212> PRT

<213> MDL+ a8-tail

<400> 12

Cvs Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arq His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro vai Leu Met Asp Met Ile Leu Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly vai Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg145 150 155 160

Leu Lys ser Lys Glu165

<210> 13

<211> 165

<212> PRT

<213> YNS + a8-tail

<400> 13

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala cys vai Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu vai Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg145 150 155 160

Leu Lys ser Lys Glu165

<210> 14<211> 69<212> DNA<213> DNA

<400> 14 tgtgatctgc cgcagactca ctctctgggt tctcgtcgta ctctgatgct gctggctcag 60atgcgtcgt 69<210> 15 <211> 501 <212> DNA <213> HEQ <400> 15 atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct cgctgcgatg 180atcgcgcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaà cttgcaagaa 480agtttaagaa gtaaggaatg a 501<210> 16 <211> 501 <212> DNA <213> NLYY <400> 16 atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga tcttcgctct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240gccctagaca aattcgccac tgaactcgcc cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480agtttaagaa gtaaggaatg a 501<210> 17 <211> 501 <212> DNA <213> a8-tai1 <400> 17 atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgccaggaggagt ttggcaacca gttccaaaagatccagcaga tcttcaatct cttcagcacactcctagaca aattctacac tgaactctacatacaggggg tgggggtgac agagactcccaggaaatact tccaaagaat cactctctattgggaggttg tcagagcaga aatcatgagaaggttaaaaa gtaaggaatg a

<210> 18

<211> 501

<212> DNA

<213> HEQ + a8-tail

, <400> 18

- atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctgcagatgcgtc gtatctctct tttctcctgccaggaggagt ttggcaacca gttccaaaagatcgcgcaga tcttcaatct cttcagcacactcctagaca aattctacac tgaactctacatacaggggg tgggggtgac agagactcccaggaaatact tccaaagaat cactctctattgggaggttg tcagagcaga aatcatgagaaggttaaaaa gtaaggaatg a

<210> 19

<211> 501

<212> DNA

<213> NLVY + a8-tail

' <400> 19

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag

atccagcaga tcttcgctct cttcagcaca

gccctagaca aattcgccac tgáactcgcc

atacaggggg tgggggtgac agagactccc

aggaaatact tccaaagaat cactctctat

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga

aggttaaaaa gtaaggaatg a

ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa 480

501

ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

gctgaaacca tccctgtcct cgctgcgatg 180

aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa 480

501

ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa 480

501

<210> 20<211> 501<212> DNA<213> MDL

<400> 20

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct catggatatg 180

atcctacaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 21

<211> 501

<212> DNA

<213> YNS

<400> 21

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ctataacatg 180

atctctcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 22

<211> 501

<212> DNA

<213> MDL+ a8-tail

<400> 22

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag. gctgaaacca tccctgtcct catggatatg 180

atcctacaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa 480aggttaaaaa gtaaggaatg a 501

<210> 23

<211> 501

<212> DNA

<213> YNS + a8-tail

<400> 23

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ctataacatg 180

atctctcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaaaaa 480

aggttaaaaa gtaaggaatg a 501

<210> 24

<211> 165

<212> PRT

<213> H57A

<400> 24

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Xle Pro Val Leu Ala Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly vai Gly vai Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 25<211> 165<212> PRT<213> E58A

<400> 25

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Ala Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly vai Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala vai Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu ser145 150 155 160

Leu Arg ser Lys Glu165

<210> 26<211> 165<212> PRT<213> Q61A<400> 26

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys lie ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 BO

Arg His Asp Phe GTy Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Ala Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val vai Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 27

<211> 165

<212> PRT

<213> H57Y

<400> 27

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile ser Leu Phe Ser cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys vai Ile Gln Gly vai Gly vai Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu vai Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 28

<211> 165

<212> PRT

<213> E58N

<400> 28

cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu Met15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Ara His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe GlnM 35 40 ' 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro vai Leu His Asn Met Ile Gln Gln lie Phe50 55 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu165

<210> 29

<211> 165

<212> PRT

<213> Q61S

<400> 29

cys Asp Leu Pro Gln Thr His ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Ser Gln Ile Phe50 55 60

Asn Leu Phe ser Thr Lys Asp Ser ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95

Ala cys vai Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110

Glu Asp ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie Thr Leu115 120 125

Tvr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg" Ser Phe ser Leu ser Thr Asn Leu Gln Glu ser145 150 155 160

Leu Arg ser Lys Glu165

<210> 30<211> 501<212> DNA<213> Η57Α

<400> 30

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct cgctgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 31*<211> 501<212> DNA<213> Ε58Α

<400> 31 ^it4.

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgcgatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 32<211> 501<212> DNA<213> Q61A

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180atcgcgcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagaccctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtgatacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa

240300

480agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 33

<211> 501

<212> DNA

<213> H57Y

<400> 33

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ctatgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 34

<211> 501

<212> DNA

<213> E58N

<400> 34

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccataacatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

<210> 35<211> 501<212> DNA<213> Q61S

<400> 35 ™

atgtgtgatc tgccgcagac tcactctctg ggttctcgtc gtactctgat gctgctggct 60

cagatgcgtc gtatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc 120

caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct' ccatgagatg 180

atctctcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agtttaagaa gtaaggaatg a 501

Claims (31)

1. Polipeptideo de interferon a2 (IFNoí2) recombi-nante, fragmento ativo, análogo, derivado e variante deste,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende uma mutação selecionada de pelo menos uma substitui-ção de aminoácido em resíduos 57-89 de aminoácido, pelo me-nos uma substituição de aminoácido do resíduo 159-165 de a-minoácido C terminal, e combinações destes, onde o referidopolipeptideo tem atividade agonista ou antagonista específi-ca melhorada, quando comparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQID NO: 2).

2. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende pelo menos uma mutação selecionada do grupo consis-tindo em H57A (SEQ ID NO:24), E58A (SEQ ID NO: 25), Q61A(SEQ ID NO: 26), H57Y (SEQ ID NO: 27), E58N (SEQ ID NO: 28),Q61S (SEQ ID NO: 29), e combinações destes, onde o referidopolipeptideo tem atividade de agonista ou antagonista espe-cífica melhorada, quando comparada com IFNa2 tipo silvestre(SEQ ID NO: 2).

3. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende um mutante triplo H57A, E58A, Q61A (SEQ ID NO: 5)tendo atividade específica melhorada, quando comparado comIFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

4. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende um mutante quádruplo N65A, L80A, Y85A, Y89A (SEQ IDNO: 6) tendo atividade antagonista, quando comparado com IF-Na2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo com-preende uma substituição do ESLRSKE C terminal para KRLKSKE(SEQ ID NO: 7) tendo atividade específica melhorada, quandocomparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) .

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo com-preende uma combinação do mutante triplo H57A, E58A, Q61A ea substituição do C terminal de ESLRSKÉ por KRLKSKE (SEQ IDNO: 8) tendo atividade específica melhorada, quando compara-do com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo com-preende uma combinação do mutante quádruplo N65A, L80A,Y85A, Y89A e a substituição do C terminal de ESLRSKE porKRLKSKE (SEQ ID NO: 9) tendo atividade antagonista, quandocomparado com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo com-preende um mutante triplo H57M, E58D, Q61L (SEQ ID NO: 10)tendo atividade específica melhorada, quando comparado comIFNoí2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo com-preende um mutante triplo H57Y, E58N, Q61S (SEQ ID NO: 11)tendo atividade específica melhorada, quando comparado comIFN0(2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

10. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende uma combinação do mutante triplo H57M, E58D, Q61L ea substituição do C terminal de ESLRSKE por KRLKSKE (SEQ IDNO: 12) tendo atividade especifica melhorada, quando compa-rado com IFNa2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2).

11. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo com-preende uma combinação do mutante triplo H57Y, E58N, Q61S ea substituição do C terminal de ESLRSKE por KRLKSKE (SEQ IDNO: 13) tendo atividade especifica melhorada, quando compa-rado com IFNoí2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) .

12. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptideo é a-dicionalmente conjugado a PEG.

13. Molécula de DNA codificando um polipeptideo,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma mutação sele-cionada de pelo menos uma substituição de aminoácido em re-siduos 57-89 de aminoácidos, pelo menos uma substituição deaminoácido dos resíduos 159-165 de aminoácido C terminal, ecombinações destes, onde o polipeptideo tem atividade ago-nista ou antagonista específica melhorada, quando comparadocom IFNoí2 tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) .

14. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação-13, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de DNA compre-ende uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQID NOS: 15-23 e SEQ ID NOS: 30-35.

15. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende a molécula de DNA de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 13-14, operavelmente ligado a um ou mais elemen-tos de controle de transcrição.

16. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato deque compreende o vetor de acordo com a reivindicação 15.

17. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreende como um ingrediente ativo um polypep-tide de interferon a2 (IFNa2) recombinante, fragmento ativo,análogo, derivado e variante deste, o referido polipeptideocompreende uma mutação selecionada de pelo menos uma substi-tuição de aminoácido em resíduos 57-89 de aminoácido, e pe-lo menos uma substituição de aminoácido dos resíduos 159-165de aminoácido C terminal, e combinações destes, onde o refe-rido polipeptideo tem atividade agonista ou antagonista es-pecífica melhorada, quando comparado com IFNa2 tipo silves-tre (SEQ ID NO: 2), adicionalmente compreendendo um veículofarmaceuticamente aceitável.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende po-lipeptideo de interferon oí2 ( IFNoí2 ) recombinante, tendoquaisquer das SEQ ID NOS: 5-13 e SEQ ID NOS: 24-29, fragmen-tos, análogos, derivados e variantes destes.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende po-lipeptideo de interferon a2 (IFN a2)recombinante, tendoqualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 10, 11, 12 e 13, frag-mentos, análogos, derivados e variantes destes, onde o refe-rido polipeptídeo tem atividade agonista especifica melhorada.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende po-lipeptideo de interferon a2 (IFN oí2) recombinante tendoqualquer uma das SEQ ID NOS: 6 e 9, fragmentos, análogos,derivados e variantes destes, onde o referido polipeptídeotem atividade antagonista específica melhorada.

21. Método para tratar ou prevenir um distúrbio oudoença associado com a modulação de interferon (IFN),CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a umindivíduo em necessidade deste uma quantidade terapeutica-mente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 19, onde o referido distúrbio ou doença é se-lecionado do grupo consistindo em câncer, doença autoimune edoença infecciosa.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido câncer é selecio-nado do grupo consistindo em leucemia de célula pilosa, sar-coma de Kaposi, mieloma múltiplo, leucemia mielóide crônica,Iinfoma de não Hodgkins e melanoma.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença auto-imuneé esclerose múltipla (MS).

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que a referida MS é selecionadado grupo consistindo em MS remitente reincidente, MS pro-gressiva - secundária, MS progressiva primária, e MS reinei-dente progressiva.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença infecciosaé infecção do virus da hepatite.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido virus da hepatiteé selecionado do grupo consistindo em hepatite A, hepatite Be hepatite C.

27. Método, para tratar ou prevenir distúrbios as-sociados com a expressão aumentada de IFNa2, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende administrar a um indivíduo emnecessidade deste, uma quantidade efetiva de composição far-macêutica, de acordo com a reivindicação 20.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido distúrbio é diabe-tes mellitus dependente de insulina (IDDM).

29. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido distúrbio é lúpuseritematoso sistêmico (SLE).

30. Uso de um polipeptídeo de interferon a2 -(IFNa2) recombinante, fragmento ativo, análogo, derivado e vari-ante deste, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido poli-peptídeo compreende uma mutação selecionada de pelo menosuma substituição de aminoácido em resíduos 57-89 de aminoá-cido, pelo menos uma substituição de aminoácido dos resíduos 159-165 de aminoácido C terminal, e combinações destes, ondeo referido polipeptídeo tem atividade agonista ou antagonis-ta específica melhorada, quando comparado com IFNa2 tiposilvestre (SEQ ID NO: 2) para a preparação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de distúrbios ou doenças as-sociados com a modulação de IFN.

31. Uso de um mutante de interferon a2 (IFNa2), deacordo com qualquer uma das reivindicações 2-12,CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medica-mento para o tratamento ou prevenção de distúrbios ou doen-ças associados com a modulação de IFN.