BRPI0619563A2 - nucleosìdeos antivirais - Google Patents

Abstract

NUCLEOSìDEOS ANTIVIRAIS. Compostos que têm a fórmula i em que R1 é como aqui definido são inibidores de NS5b polimerase do vírus da hepatite C. Também são reveladas composições e métodos para inibir a replicação da hepatite, e processos para fazer os compostos de fórmula I.

Description

NUCLEOSÍDEOS ANTIVIRAIS

A presente invenção fornece nucleosídeos acilados que são pró-fármacos de um inibidor da polimerase de RNA viral RNA-dependente do vírus da hepatite C (HCV) . Esses compostos quando administrados por via oral são facilmente absorvidos . do trato GI e eficientemente revertidos ao nucleosídeo parente no sangue. Esses pró-fármacos são inibidores da replicação de RNA viral RNA-dependente e são úteis como inibidores de HCV NS5B polimerase, como inibidores da replicação do HCV, e para o tratamento de infecção de hepatite C em mamíferos.

A invenção relaciona-se a pró-fármacos de nucleosídeo que são inibidores da replicação do HCV. Em particular, a invenção é relacionada com o uso de compostos de nucleosídeo de pirimidina acilados que fornecem melhor absorção de medicamento quando o nucleosídeo é administrado por via oral.

O vírus da Hepatite C (HCV) é um grande problema de saúde e a causa principal de doença hepática crônica por todo o mundo (Boyer, N. e cols. 1 Hepatol. 2000 32:98-112). Pacientes infectados com HCV estão em risco de desenvolver cirrose hepática e subseqüente carcinoma hepatocelular e, portanto, HCV é a principal indicação para transplante de fígado.

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, há mais de 200 milhões de pessoas infectadas por todo o mundo, com pelo menos 3 a 4 milhões de pessoas sendo infectadas a cada ano. Uma vez infectadas, cerca de 20% das pessoas ficam livres do vírus, mas o restante pode portar o HCV pelo resto de suas vidas. Dez a doze por cento das pessoas cronicamente infectadas desenvolverão, em algum momento, cirrose que destrói o fígado ou câncer. A doença viral é transmitida por via parenteral por sangue contaminado e produtos do sangue, agulhas contaminadas ou por via sexual, e verticalmente de mães infectadas ou mães portadoras para sua prole. Os tratamentos atuais para infecção por HCV, que são restritos a imunoterapia com interferon-α recombinante isoladamente ou em combinação com o análogo de nucleosídeo ribavirina, são de benefício clínico limitado uma vez que a resistência se desenvolve rapidamente. Há uma necessidade urgente por melhores agentes terapêuticos que combatam de forma eficaz a infecção crônica por HCV.

0 HCV tem sido classificado como um membro da família viral Flaviviridae que inclui o gênero flavivírus, pestivírus e hapaceivírus que inclui vírus de hepatite C (Rice, c.M., Flaviviridade: The viruses and their replication. In: Fields Virology, Editores: Fields, B. N., Knipe, D.M., e Howley, P.M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, capítulo 30, 931-959, 1996). 0 HCV é um vírus envelopado contendo um genoma de RNA de filamento único senso-positivo de aproximadamente 9,4 kb. 0 genoma viral consiste em uma região 5' não traduzida (UTR), uma longa estrutura de leitura aberta que codifica um precursor de poliproteína de aproximadamente 3011 aminoácidos, e uma UTR 3' curta. A UTR 5' é a parte mais altamente conservada do genoma do HCV e é importante para a iniciação e controle de tradução de poliproteína.

A análise genética de HCV identificou seis genótipos principais que mostram uma divergência >30% em sua seqüência de DNA. Cada genótipo contém uma série de subtipos mais intimamente relacionados que mostra uma divergência de 20-25% em seqüências de nucleotídeo (Simmonds, P. 2004 1 Gen. Virol. 85:3173-88). Mais de 30 subtipos foram distinguidos. Nos EUA, aproximadamente 70% das pessoas infectadas têm uma infecção de tipo Ia e Ib. 0 tipo Ib é o subtipo mais prevalente na Ásia (X. Forns e J. Bukh7 Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh e cols., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63). Infelizmente, as infecções de tipo 1 são mais resistentes à terapia que os genótipos de tipos 2 ou 3 (N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev., 2000 13:223-235).

A organização genética e processamento de poliproteína da porção de proteína não estrutural da ORF de pestivírus e hepacivlrus são muito similares. Esses RNA vírus de filamento positivo possuem uma única estrutura de leitura aberta (ORF) grande que codifica todas as proteínas virais necessárias para a replicação viral. Essas proteínas são expressas como uma poliproteína que é processada junto e após a tradução tanto por proteinases celulares quanto codificadas por vírus para gerar as proteínas virais maduras. As proteínas virais responsáveis pela replicação do RNA do genoma viral estão localizadas aproximadamente no terminal carboxi. Dois terços da ORF são denominados proteínas não estruturais (NS) . Tanto para os pestivírus quanto os hepacivírus, as proteínas não estruturais (NS) maduras, em ordem seqüencial do terminal amino da região codificadora da proteína não estrutural ao terminal carboxi da 0RF, consistem em p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B.

As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus partilham domínios de seqüência que são característicos de funções específicas de proteína. Por exemplo, as proteínas NS3 de vírus em ambos os grupos possuem motivos de seqüência de aminoácidos característicos de serina proteinases e de helicases (Gorbalenya e cols., (1988) Nature 333: 22; Bazan e Fletterick (1989) Virology 171: 637-639; Gorbalenya e cols., (1989) Nucleic Acid Res. 17.3889-3897). De forma similar, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm os motivos característicos de RNA polimerases direcionadas a RNA (Koonin, Ε. V. e Dolja, V. V. (1993) Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28: 375-430).

Os papéis e funções reais das proteínas NS de pestivírus e hepacivírus no ciclo da vida dos vírus são diretamente análogos. Em ambos os casos, a serina proteinase NS3 é responsável por todo o processo proteolítico dos precursores de poliproteína abaixo de sua posicao na ORF (Wiskerchen e Collect (1991) Virology 184 : 341-350; Bartenschlager e cols., (1993) J. Virol. 67:3835- 3844; Eckart e cols., (1993) Biochem. Biophys. Res. Conm. 192: 399-406; Grakoui e cols., (1993) J. Virol. 67:2832- 2843; Grakoui e cols., (1993) Proe. Natl. Aead Sei. USA90: 10583- 10587;Hij ikata e cols., (1993) J. Virol. 67: 4665- 4675; Tome e cols., (1993) J. Virol. 67: 4017-4026). A proteína NS4A, em ambos os casos, age como um cofator com a serina protease NS3 (Bartenschlager e cols., (1994) J. Virol. 68: 5045-5055; Failla e cols., (1994) J. Virol. 68: 3753-3760; Xu e cols., (1997) J. Viral. 71:53 12-5322). A proteína NS3 de ambos os vírus também funciona como uma helicase (Kim e cols., (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 160-166; Jin e Peterson (1995) Arch. Biochem. Biophys., 323: 47-53; Warrener e Collett (1995) J. Virol. 69: 1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm a atividade de RNA polimerases direcionada a RNA previstas (Behrens e cols., (1996) EMBO. 15: 12-22; Lechmann e cols., (1997) J. Virol. 71: 8416- 8428; Yuan e cols., (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 232: 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong e cols., (1998) J. Virol. 72.9365-9369).

Atualmente, há um número limitado de terapias aprovadas que são atualmente disponíveis para o tratamento de infecção por HCV. Abordagens terapêuticas novas e existentes para o tratamento de HCV e inibição da HCV NS5B polimerase foram revistas: R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, outubro: 1999 80-85; G Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; F. Hoffmann e cols., Recent patents on experimental therapy for Hepatitis C Virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11):1707-1723; F. F. Poordad e cols. Developments in Hepatitis C therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(l):9-25; Μ. P. Walker e cols., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8):1269-1280; S.-L. Tan e cols., Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867- 881; R. De Francesco e cols. Approaching a new era for Hepatitis C Virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polimerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q. M. Wang e cols. Hepatitis C Virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25 (9) : 933-8-944; J. A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polimerase for Anti-HCV Chemoterapia Cur. Drug Targ.-Inf. Dis .2003 3:207-219. As revisões citam compostos atualmente em vários estágios do processo de desenvolvimento. Terapia de combinação com dois ou três agentes direcionados aos mesmos alvos ou a alvos diferentes tem se tornado terapia padrão para evitar ou retardar o desenvolvimento de cepas resistentes de um vírus, e os compostos revelados na revisão acima podem ser usados em terapia de combinação com compostos da presente invenção, e essas revisões são aqui incorporadas em sua totalidade por referência.

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Ribavirina (la; ácido amida 1-((2R,3R,4S,5R)-3,4- Dihidroxi-5-hidroximetil-tetrahidro-furan-2-il)-IH- [1,2,4] triazol-3-carboxílico; VIRAZ0LE®) é um análogo de nucleosídeo antiviral sintético, não indutor de interferon, de amplo espectro. Ribavirina tem atividade in vitro contra vários DNA e RNA vírus, incluindo Flaviviridae (Gary L. Davis, Gastroenterology 2000 118:S104-S114). Em monoterapia, ribavirina reduz os níveis séricos de amino transferase ao normal em 4 0% dos pacientes, mas ela não diminui os níveis séricos de HCV-RNA. Ribavirina também exibe toxicidade significativa e é conhecida por induzir anemia. Ribavirina é um inibidor de inosina monofosfato desidrogenase. Ribavirina não é aprovada em monoterapia contra HCVi mas o composto é aprovado em terapia de combinação com interferon a-2a e interferon a-2b. Viramidina Ib é um pró-fármaco convertido a Ia em hepatócitos.

Interferons (IFNs) têm sido disponíveis para o tratamento de hepatite crônica por quase uma década. IFNs são glicoproteínas produzidas por células imunes em resposta a infecção viral. Dois tipos distintos de interferon são reconhecidos: tipo 1 inclui vários interferons alfa e um interferon β, tipo 2 inclui interferon γ. Interferon de tipo 1 é produzido principalmente por células infectadas e protege células vizinhas de nova infecção. IFNs inibem a replicação viral de vários vírus, incluindo HCV, e quando usados como o único tratamento para infecção de hepatite C, IFN suprime HCV-RNA sérico a níveis indetectáveis. Adicionalmente, IFN normaliza os níveis séricos de amino transferase. Infelizmente, os efeitos de IFN são temporários. A cessação da terapia resulta em uma taxa de recaída de 70% e apenas 10-15% exibem uma resposta virológica sustentada com níveis séricos normais de alanina transferase (L.- B. Davis, supra).

Uma limitação da terapia precoce com IFN foi a rápida depuração da proteína do sangue. A derivatização química de IFN com polietilenoglicol (PEG) resultou em proteínas com propriedades farmacocinéticas substancialmente melhoradas. PEGASYS® é um interferon φα-2a conjugado e um mono-metoxi PEG ramificado de 40 kD e PEG-INTRON® é um conjugado de interferon a-2b e um mono-metoxi PEG de 12 kD (B. A. Luxon e cols., Clin. Therap. 2002 24 (9) :13631383; Α. Kozlowski and J. Μ. Harris, J. Control. Releasel 2001 72:217-224).

Interferon alfa-2a e interferon alfa-2b são atualmente aprovados como monoterapia para o tratamento de HCV.

ROFERON®-A (Roche) é a forma recombinante de interferon alfa-2a. PEGASYS® (Roche) é a forma peguilada (ou seja, modificada por polietileno glicol) de interferon alfa-2a. INTR0N®A (Schering Corporation) é a forma recombinante de Interferon alfa-2b, e PEG-INTRON (Schering Corporation) é a forma peguilada de interferon alfa-2b.

Outras formas de interferon alfa, bem como de interferon β, γ, τ e ω, estão atualmente em desenvolvimento clínico para o tratamento de HCV. Por exemplo, INFERGEN (interferon alfacon-1) por InterMune, OMNIFERON® (interferon natural) por Viragen, ALBUFERON por Human Genome Sciences, REBIF® (interferon β—la) por Ares—Serono, Interferon Omega por BioMedicine, Interferon Alfa Oral por Amarillo Biosciences e interferon γ, interferon τ e interferon γ-Ib por InterMune estão em desenvolvimento.

A terapia de combinação de HCV com ribavirina e interferon-α representa atualmente a terapia ótima. A combinação de ribavirina e PEG-IFN (infra) resulta em uma resposta viral sustentada em 54-56% de pacientes. SVR abrange 80% para HCV de tipo 2 e 3 (Walker, supra) . Infelizmente, a combinação também produz efeitos colaterais que propõem desafios clínicos. Depressão, sintomas semelhantes à gripe e reações cutâneas estão associadas com IFN-α subcutâneo, e anemia hemolítica está associada com tratamento sustentado com ribavirina.

Outros compostos macromoleculares atualmente em desenvolvimento pré-clínico ou clínico para o tratamento de Vírus da infecção de hepatite C incluem: Interleucina-10 por Schering-Plough, IP SOl por Intemeuron, Merimebodib (VX-497) por Vertexi HEPTAZ YME® por RPI, IDN-30 6556 por Idun Pharma., XTL-002 por XTL., HCV/MFS9 por Chiron, CIVACIR® (Globulina Imune de hepatite C) por NABI, ZADAXIN® (timosina a-1) por SciClone, timosina mais interferon peguilado por SciClone, CEPLENE®; uma vacina terapêutica direcionada E2 por Innogenetics, vacina terapêutica por Intercell, vacina terapêutica por Epimmune/Genencor, uma vacina terapêutica por Merix, uma vacina terapêutica, ChronVacC, por Tripep.

Outras abordagens macromoleculares incluem ribozimas direcionadas ao RNA de HCV. As ribozimas são moléculas curtas de ocorrência natural com atividade de endonuclease

Uma abordagem alternativa é o uso de oligonucleotídeos anti-senso que se ligam a RNA e estimulam clivagem mediada por RNaseH.

Inúmeros alvos moleculares potenciais para o desenvolvimento de medicamentos como terápicos anti-HCV foram agora identificados, incluindo, sem limitação, a NS2- NS3 autoprotease, a N3 protease, a N3 helicase e a NS5B polimerase. A RNA polimerase RNA-dependente é absolutamente essencial para a replicação do genoma de RNA de filamento único, senso positivo, e essa enzima tem despertado significativo interesse entre os químicos médicos.

Inibidores nucleosídicos de NS5B polimerase podem agir como um substrato não natural que resulta em terminação de cadeia ou como um inibidor competitivo que compete com ligação de nucleotídeo à polimerase. Para funcionar como um terminador de cadeia, o análogo de nucleosídeo deve ser absorvido pela célula e convertido in vivo a um trifosfato para competir pelo sítio de ligação de nucleotídeo de polimerase. Essa conversão ao trifosfato é comumente mediada por quinases celulares que transmitem necessidades estruturais adicionais em um inibidor potencial de nucleosídeo polimerase. Infelizmente, isso limita a avaliação direta de nucleosídeos como inibidores da replicação do HCV para ensaios baseados em célula capazes de fosforilação in situ.

<formula>formula see original document page 11</formula>

B= adenina, timidina, uracil, citidina, guanina e hipoxant ina

Em WO 01 90121, publicado em 29 de novembro de 2001, J.-P. Sommadossi e P. Lacolla revelam e exemplificam a atividade de polimerase anti-HCV de l'-alquil- e 2'-alquil nucleosídeos de fórmulas e 2 e 3. Em WO 01/92282, publicado em 6 de dezembro de 2001, J.-P. Sommadossi e P. Lacolla revelam e exemplificam o tratamento de Flavivírus e Pestivírus com I1-alquil- e 2'-alquil nucleosídeos de fórmulas 2 e 3. Em WO 03/026675, publicado em 3 de abril de 2003, G. Gosselin revela 41-alquil nucleosídeos para o tratamento de Flavivírus e Pestivírus.

Em W02004003000, publicado em 8 de janeiro de 2 004, 30 J.-P. Sommadossi e cols. revelam 2' e 3' pró-fármacos de 1', 2', 3' e 4'-substituído β-D e β-L nucleosídeos. Em WO 2004/002422, publicado em 8 de janeiro de 2004, 2'-C-metil- 3'-0-valina éster ribofuransil citidina para o tratamento de infecções por Flaviviridae. Idenix relatou experimentos clínicos para um composto relacionado NM283 que se acredita ser o éster de valina do análogo de citidina 2 (B = citosina). Em WO 2004/002999, publicado em 8 de janeiro de 2004, J. -P. Sommadossi e cols. revelam uma série de 21 ou 3' pró-fármacos de 1', 2', 3', ou 4' nucleosídeos ramificados para o tratamento de infecções por flavivírus incluindo infecções por HCV.

Em W02 004/04 6331, publicado em 3 de junho de 2004, J. P. Sommadossi e cols. revelam nucleosídeos 21-ramificados e mutação de Flaviviridae. Em W003/026589, publicado em 3 de abril de 2003, G. Gosselin e cols. revelam métodos de tratamento do Virus da hepatite C com o uso de nucleosideos 41-modificados. Em W02005009418, publicado em 3 de fevereiro de 2005, R. Storer e cols. revelam análogos de purina nucleosídeo para o tratamento de doenças causadas por Flaviviridae incluindo HCV.

Outros pedidos de patente revelam o uso de certos análogos de nucleosídeo para tratar infecção por Vírus da hepatite C. Em WO 01/32153 ,publicado em 10 de maio de 2001, R. Storer revela derivados de nucleosídeos para o tratamento de doenças virais. Em WO 01/60315, publicado em 23 de agosto de 2001, H. Ismaili e cols. revelam métodos de tratamento ou prevenção de infecções por Flavivírus com compostos de nucleosídeo. Em WO 02/18404, publicado em 67 de março de 2002, R. Devos e cols. revelam nucleotídeos 4'- substituídos para o tratamento de vírus HCV. Em WO 01/79246, publicado em 25 de outubro de 2001, K. A. Watanabe revelam compostos de 2' ou 31-hidroximetil nucleosídeo para o tratamento de doenças virais. Em WO 02/32920, publicado em 25 de abril de 2002, e em WO 02/48 165, publicado em 20 de junho de 2002, L. Stuyver e cols. revelam compostos de nucleosídeo para o tratamento de doenças virais.

<formula>formula see original document page 13</formula>

Em WO 03/105770, publicado em 24 de dezembro de 2003, B. Bhat e cols. revelam uma série de derivados nucleosídeos carbocíclicos que são úteis para o tratamento de infecções por HCV. Em WO 2004/007512, publicado em 22 de janeiro de 2003, B. Bhat e cols. revelam compostos de nucleosídeo que inibem a RNA polimerase viral RNA-dependente. Os nucleosídeos revelados nessa publicação são primariamente nucleosídeos 2'-metil-2'-hidroxi substituídos. Em WO 2002/057425, publicado em 25 de julho de 2002, S. S. Carroll e cols. revelam derivados de nucleosídeo que são inibidores de polimerase viral RNA-dependente e métodos de tratamento de infecção por HCV. Em WO 02/057287, publicado em 25 de julho de 2002, S. S. Carroll e cols. revelam derivados relacionados de 2a-metil e 2p-metilribose em que a base é um radical 6 de 7H-pirrol [2,3-d]pirimidina opcionalmente substituído. 0 mesmo pedido revela um exemplo de um 3P-metil nucleosídeo. S.S. Carroll e cols. (J. Biol. Chem. 2003 278(14):11979- 11984) revelam a inibição de HCV polimerase por 2 '-O-metilcitidina (6a). Em WO 2004/009020, publicado em 2 9 de janeiro de 2004, D. B. Olsen e cols. revelam uma série de derivados de tionucleosideo como inibidores de RNA polimerase viral RNA dependente. Publicação PCT No. WO 99/43691 para "Emory

University", intitulada "21 - Fluoronucleosides", revela o uso de certos 21-fluornucleosídeos para tratar HCV. Patente U.S. No. 6.34 8.587 para uEmory University", intitulada "21 - fluoronucleosides", revela uma família de 2'- fluornucleosídeos úteis para o tratamento de hepatite B, HCV, HIV e proliferação celular anormal. Ambas as configurações do substituinte 2'-flúor são reveladas

Eldrup e cols (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (Apr. 27, 2003, Savannah, Ga.)) descreveram a modificados para inibição de HCV.

Bhat e cols. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (Apr. 27, 2003, Savannah, Ga.); ρ A75) descrevem a síntese e propriedades farmacocinéticas de análogos de nucleosídeo como possíveis inibidores de replicação do RNA de HCV. Os autores relatam que nucleosídeos 21-modificados demonstraram potente atividade inibidora em ensaios de replicon com base em célula.

Olsen e cols. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference 3 0 on Antiviral Research (Apr. 27, 2003, Savannah, Ga.) ρ A76) também descreveram os efeitos dos nucleosídeos 21-modificados sobre a replicação do RNA de HCV. Inibidores de transcriptase reversa de HIV não nucleosídicos alostéricos provaram ser terápicos eficazes isoladamente e em combinação com inibidores de nucleosídeo e com inibidores de protease. Várias classes de inibidores não nucleosídicos de NS5B de HCV foram descritas e estão atualmente em vários estágios de desenvolvimento incluindo: benzimidazol (H. Hashimoto e cols. WO 01/47833, H. Hashimoto e cols. WO 03/000254, P. L. Beaulieu e cols. WO 03/020240 A2; P. L. Beaulieu e cols. US 6.448.281 BI; P. L. Beaulieu e cols. WO 03/007945 Al); indóis, (P. L. Beaulieu e cols. WO 03/0010141 A2); benzotiadiazinas, por exemplo, 7 (D. Dhanak e cols. WO 01/85172 Al; D. Dhanak e cols. WO 03/037262 A2; K. J. Duffy e cols. W003/099801 Al, D.Chai e cols. WO 2004052312, D.Chai e cols. W02004052313, D.Chai e cols. WOO2/098424, J. K. Pratt e cols. WO 2004/041818 Al; J. K. Pratt e cols. WO 2004/087577 Al), tiofenos, por exemplo, 8 (C. K. Chan e cols. WO 02/100851);

<formula>formula see original document page 15</formula>

benzotiofenos (D. C. Young and T. R. Bailey WO 00/18231); β-cetopiruvatos (S. Attamura e cols. US 6,492,423 BI, A. Attamura e cols. WO 00/06529); pirimidinas (C. Gardelli e cols. WO 02/06246 Al); pirimidinadionas (T. R. Bailey and D. C. Young WO 00/13708); triazinas (K.-H. Chung e cols. WO 02/079187 Al); derivados de rodamina (T. R. Bailey e D. C. Young WO 00/10573, J. C. Jean e cols. WO 01/77091 A2); 2,4- dioxopiranos (R. A. Love e cols. EP 256628 A2) ; derivados de fenilalanina (M. Wang e cols. J Biol. Chem. 2003 278 : 2489-2495) .

A NS3 protease surgiu como um alvo principal para descoberta de nova terapia anti-HCV. Em WO 98/224 96, publicado em 28 de maio de 1998, M. R. Attwood e cols. revelaram inibidores de sítio ativo de base em mecanismo da protease (M.R. Attwood e cols., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999 10:259-273; M.R. Attwood e cols., Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents, Patente Alemã Pub. DE 19914474) . Em W098/17679, publicado em 30 de abril de 1998, R. D. Tung e cols. revelaram inibidores de peptídeo de base em mecanismo na NS3 protease.

Em W099/07734, publicado em 18 de fevereiro de 1999, e em WOO0/09543, publicado em 9 de agosto de 1999, M Llinas- Brunet e cols. revelam inibidores de peptídeo da protease. Em WOO0/59929, publicado em 12 de outrubro de 2000, Y. S. Tsantrizos e cols. revelam tripeptídeos macrocíclicos que são potentes inibidores da NS3 protease de HCV. Uma série de patentes relacionadas de Boehringer-Ingleheim revela inibidores de protease relacionados e leva à identificação de derivado de tripeptídeo BILN 2061 (M. Llinas-Brunet e cols. Biorg. Med. Chem. Lett. 2000 10 (20) : 2267-70; J. Med Chem.2004 47 (26) :6584-94; J. Med. Chem. 2004 47(7) :1605- 1608; Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2003 42 ( 12) :1356-60).

Outros inibidores de tripeptídeo identificados por Bristol-Myers Squibb foram revelados, entre outros, em W003/099274, publicado em 4 de dezembro de 2003, em W02 004/032827, publicado em 22 de abril de 2004, em WOO 3/ 05334 9, publicado em 3 de julho de 2003, em W02 005/04 6712, publicado em 26 de maio de 2005 e em W02005/051410, publicado em 9 de junho de 2005. Em W02004/072234, publicado em 26 de agosto de 2004, e em W02004/0937 98, publicado em 4 de novembro de 2004, inibidores de protease de tripeptídeo adicionais foram revelados por Enanta Pharmaceuticals. Em W02005/037214, publicado em 28 de abril de 2005, L. M. Blatt e cols. revelam ainda outros derivados de tripeptídeo que inibem NS3 protease de HCV. Em W02005/030796, publicado em 7 de abril de 2005, S. Venkatraman e cols. revelam inibidores de NS3 serina protease de HCV macrociclicos. Em WO 2005/058821, publicado em 30 de junho de 2005, F. Velazquez e cols. revelam inibidores de NS3/NS4a serina protease de HCV. Em W002/48172, publicado em 20 de junho de 2002, Z. Zhu revela diaril peptideos como inibidores de NS3 protease. Em W002/08187 e em W002/08256, ambos publicados em 31 de janeiro de 2002, A. Saksena e cols. revelam inibidores de peptídeo de NS3 protease de HCV. Em WOO 2/ 08251, publicado em 31 de janeiro de 2002, M. Lim- Wilby e cols. revelam inibidores de peptídeo da NS3 protease. Em US 6.004.933, publicado em 21 de dezembro de 1999, L. W. Spruce e cols. revelam derivados heterocíclicos de peptídeo que inibem a cisteína proteases incluindo endopeptidase de HCV.

Inibidores de NS3 protease não baseados em substrato tal como derivados de 2,4,6-trihidroxi-3-nitro-benzamida (Sudo K. e cols., BBRC1 238:643-647,1997; Sudo K. e cols., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 9:186,1998), incluindo RD3-4 082 e RD3-4078, o primeiro substituído na amida com uma cadeia de 14 carbonos e o último processando um grupo para-fenoxifenil, estão também sendo investigados.

SCH 68631, uma fenan-trenequinona, é um inibidor de protease de HCV (Chu M. e cols., Tetrahedron Letters 37: 7229-7232,1996). Em um outro exemplo pelos mesmos autores, SCH 351633, isolado do fungo Penicillixmi griscofuluum, foi identificado como um inibidor de protease (Chu M. e cols., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952). A potência nanomolar contra a enzima NS3 protease de HCV foi atingida pelo desenho de inibidores seletivos com base a macromolécula eglin c. Eglin c, isolada de sanguessuga, é um inibidor potente de várias serina proteases tais como as proteases Ae B de S. griseus, α-quimiotripsina, quimase e subtilisina. Qasim M. A. e cols., Biochemistry 36:1598- 1607,1997.

Derivados de tiazolidina que mostram inibição relevante em um ensaio de HPLC de fase reversa com uma proteína de fusão NS3/4A e substrato NS5A/5B (Sudo, K. e cols., Antiviral Research 32:9-18, 1996), especialmente o composto RD-1-6250, que possui uma porção cinamoil fundida substituída com uma cadeia longa de alquil, RD4 6205 e RD4 6193. Tiazolidinas e benzanilidas foram identificadas por N. Kakiuchi e cols., em FEBS Letters 421:217-220; e N. Takeshita e cols., Anal. Biochemistry 247:242-246,1997.

Imidazolidinonas como inibidores de serina protease NS 3 de HCV são reveladas em WO 02/08198 para Schering Corporation, publicado em 31 de janeiro de 2002, e em WO 02/48157 para Bristol Myers Squibb, publicado em 20 de junho de 2002. Em W002/48116, publicado em 20 de junho de 2002, P. Glunz e cols. revelam inibidores de pirimidinona de NS3 protease.

Outros alvos enzimáticos para anti-HCV incluem o sítio IRES de HCV (Sítio de Entrada Ribossomal Interno) e HCV helicase. Inibidores de IRES foram relatados por Immusol, Rigel Pharmaceuticals (R803) e por Anadys (ANA 245 e ANA 246). Vertex revelou um inibidor de HCV helicase.

Terapia de combinação que pode suprimir cepas mutantes resistentes tem se tornado abordagem bem estabelecida para quimioterapia anti-viral. Os inibidores de nucleosídeo aqui revelados podem ser combinados com outros inibidores nucleosídicos de polimerase de HCV, inibidores não nucleosídicos de polimerase de HCV, e inibidores de protease de HCV. Como outras classes de medicamentos para HCV, por exemplo, inibidores de entrada viral, inibidores de helicase, inibidores de IRES, ribozimas e oligonucleotídeos anti-senso surgem e são desenvolvidos, eles também serão excelentes candidatos para terapia de combinação. Derivados de interferon já foram combinados de forma bem sucedida com ribavirina e interferons, e interferons quimicamente modificados serão úteis em combinação com os nucleosídeos aqui revelados.

Derivados de nucleosídeo freqüentemente são potentes anti-virais (por exemplo, HIV, HCV, Herpes simples, CMV) e agentes quimioterápicos anti-câncer. Infelizmente, sua utilidade prática é freqüentemente limitada por dois fatores. Primeiramente, propriedades farmacocinéticas pobres freqüentemente limitam a absorção do nucleosídeo do intestino e a concentração intracelular dos derivados de nucleosídeo e, segundo, propriedades físicas subótimas restringem as opções de formulação que podem ser empregadas para melhorar a liberação do ingrediente ativo.

Albert introduziu o termo pró-fármaco para descrever um composto que é desprovido de atividade biológica intrínseca, mas que é capaz de transformação metabólica à substância do medicamento ativo (A. Albert, Selec tive Toxicity, Chapman and Hall, London, 1951). Pró-fármacos foram recentemente revistos (P. Ettmayer e cols., J. Med Chem. 2004 47 (10) :2393-2404; K. Beaumont e cols., Curr. Drug Metab. 2003 4:461-485; H. Bundgaard, Design of Prodrugs: Bioreversible derivatives for various functional groups and chemical entities in Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed) Elsevier Science Publishers, Amersterdam 1985; G. M. Pauletti e cols. Adv. Drug Deliv. Rev. 1997 27:235-256;R. J. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Res. 1995 27; 1-15 e C. R. Wagner e cols., Med. Res. Rev. 2000 20:417-45). Embora a transformação metabólica possa ser catalisada por enzimas específicas, freqüentemente hidrolases, o composto ativo também pode ser regenerado por processos químicos não específicos.

Pró-fármacos Farmaceuticamente aceitáveis referem-se a um composto que é metabolizado, por exemplo, hidrolisado ou oxidado, no hospedeiro para formar o composto da presente invenção. A bioconversão deve evitar a formação de fragmentos com riscos toxicológicos. Exemplos típicos de pró-fármacos incluem compostos que têm grupos de proteção biologicamente instáveis ligados a uma porção funcional do composto ativo. Alquilação, acilação ou outra modificação lipofílica do grupo hidroxi na porção de açúcar têm sido utilizadas no desenho de pró-nucleotídeos. Esses pró- nucleotídeos podem ser hidrolisados ou desalquilados in vivo para gerar o composto ativo.

Fatores que limitam a biodisponibilidade oral freqüentemente são absorção do trato gastrointestinal e excreção de primeira passagem pela parede intestinal e o fígado. A otimização da absorção transcelular através do trato GI requer um D (7,4) maior que zero. A otimização do coeficiente de distribuição, no entanto, não assegura o sucesso. O pró-fármaco pode ter que evitar transportadores de efluxo ativo no enterócito. Metabolismo intracelular no enterócito pode resultar em transporte passivo ou transporte ativo do metabólito por bombas de efluxo de volta ao lúmen do intestino. O pró-fármaco também deve resistir a biotransformações indesejadas no sangue antes de atingir as células alvo ou receptores.

Embora pró-fármacos supostos algumas vezes possam ser desenhados racionalmente com base na funcionalidade química presente na molécula, modificação química de um composto ativo produz uma entidade molecular inteiramente nova que pode exibir propriedades físicas, químicas e biológicas indesejáveis ausentes no composto parente. As necessidades regulatórias para identificação de metabólitos podem apresentar desafios de vias múltiplas que levam a uma pluralidade de metabólitos. Portanto, a identificação de pró-fármacos permanece um exercício desafiador e incerto. Além disso, a avaliação das propriedades farmacocinéticas de potenciais pró-fármacos é um esforço desafiante e dispendioso. Os resultados farmacocinéticos de modelos animais podem ser difíceis de extrapolar a humanos.

0 objetivo da presente invenção é fornecer novos compostos, métodos e composições para o tratamento de um hospedeiro infectado com Vírus da hepatite C.

A presente invenção é direcionada a novos derivados de di-acil de 4-amino-l- ((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxi-5- hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-lH-pirimidin-2- ona (também referido como (2R)2'-desoxi-2-metil-2-flúor- citidina). Compostos da presente invenção possuem uma estrutura de acordo com a fórmula I.

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em que:

R1 é selecionado do grupo que consiste em C2-5 alquil ramificado ou nao ramificado, C2-5 alquenil ramificado ou não ramificado, C2-5 alquinil ramificado ou não ramificado, C2-5 haloalquil inferior, C3-6 cicloalquil, e C2-4 alcoxi; e, hidratos, solvatos e sais de adição ácida destes.

Compostos da presente invenção são úteis para o tratamento de um distúrbio mediado por HCV.

A invenção também compreende métodos de tratamento de HCV com compostos da presente invenção e composições farmacêuticas que contêm os referidos compostos.

Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que R1 é como definido acima.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que Rl é etil, n-propil, iso-propil, n-butil ou iso-butil. Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que Rl é etil ou iso-propil.

Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que Rl é iso-propil e o composto é um sal de cloridrato ou sulfato.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que Rl é iso-propil e o composto é um sal de cloridrato.

Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I em que Rl é etoxi, n-propoxi ou iso-propoxi.

Ainda em uma modalidade adicional da invenção, é fornecido um composto de acordo com a fórmula I para uso em terapia, particularmente para uso na terapia de uma doença mediada pelo vírus HCV.

Ainda em uma outra modalidade da invenção, é fornecido o uso de um composto de acordo com a fórmula I para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença mediada pelo vírus HCV.

Um composto de acordo com a fórmula I pode ser particularmente usado para a preparação de um medicamento para a administração a um paciente em necessidade deste em uma dose terapeuticamente eficaz, preferivelmente em uma dose de 0,1 a 10 g por dia, mais pref erivelmente em uma dose de 0,5 a 7 g por dia, ou ainda mais preferivelmente em uma dose de 1,0 g a 6,0 g por dia.

Um composto de acordo com a fórmula I também pode ser usado para a preparação de um medicamento que também pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador do sistema imune como um interferon, um interferon quimicamente derivado, um interleucina, um fator de necrose tumoral ou um fator estimulante de colônia, e/ou pelo menos um agente antiviral que inibe a replicação de HCV, como inibidor de protease de HCV, um outro inibidor nucleosídico de polimerase de HCV, um inibidor não nucleosidico de polimerase de HCV, um inibidor de helicase de HCV, um inibidor de primase de HCV ou um inibidor de fusão de HCV.

Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo vírus HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido.

Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo vírus HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose de 0,1 a 10 g por dia de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido.

Ainda em uma outra modalidade, a dose é entre 0,5 e 7 g por dia, e em uma modalidade adicional a dose é entre 1,0 e 6,0 g por dia.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo vírus HCV que compreende a co-administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador do sistema imune e/ou pelo menos um agente antiviral que inibe a replicação de HCV. Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador do sistema imune cujo modulador do sistema imune é um interferon, interleucina, fator de necrose tumoral ou fator estimulante de colônia.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador do sistema imune cujo modulador do sistema imune é um interferon ou um interferon quimicamente derivado.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um outro composto antiviral.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença mediada pelo HCV que compreende a administração a um paciente em necessidade deste de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um outro composto antiviral cujo composto é um inibidor de protease de HCV, um outro inibidor nucleosídico de protease de HCV, um inibidor não nucleosídico de protease de HCV, um inibidor de helicase de HCV, um inibidor de primase de HCV, ou um inibidor de fusão de HCV.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com a fórmula I como acima definido misturada com pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um processo para a preparação de um composto de acordo com a fórmula I como acima definido, cujo processo compreende etapas (i)-(v) enumeradas da reivindicação 15 e exemplificadas nos exemplos. 0 processo compreende tratamento I em um meio orgânico aquoso básico que pode ser homogêneo ou bifásico com um agente e acilação como aqui definido na presença de DMAP e base suficiente para manter a solução em um pH de pelo menos cerca de 7,5. 0 presente processo permite a acilação sem concomitante reação da base heterocíclica.

A frase "um" ou "uma" entidade como aqui usada refere- se a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, um composto refere-se a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menos um" podem ser usados de modo intercambiável nesta especificação.

Os termos "opcional" e "opcionalmente" como aqui usados significam que um evento ou circunstância subseqüentemente descrito pode, mas não precisa, ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o evento ou circunstância ocorre e casos em que ela não ocorre. Por exemplo, "ligação opcional" significa que a ligação pode ou não estar presente, e que a descrição inclui ligações únicas, duplas ou triplas.

0 termo "independentemente" é usado nesta especificação para indicar que uma variável é aplicada em qualquer caso sem levar em consideração a presença ou ausência de uma variável que tenha aquela mesma definição ou uma definição diferente no mesmo composto. Portanto, em um composto em que R aparece duas vezes e é definido como "independentemente carbono ou nitrogênio", ambos os R podem ser carbono e o outro nitrogênio.

O termo "alquenil" como aqui usado denota um radical de cadeia hidrocarboneto não substituído que tem de 2 a 10 átomos de carbono tendo uma ou duas ligações duplas olefínicas [preferivelmente uma ligação dupla olefínica]. "C2-10 alquenil" como aqui usado refere-se a um alquenil composto de 2 a 10 carbonos. Exemplos são vinil, 1- propenil, 2-propenil (alil) ou 2-butenil (crotil).

O termo "alquil" como aqui usado denota um resíduo de hidrocarboneto monovalente, de cadeia ramificada ou não ramificada, saturado, que contém 1 a 10 átomos de carbono.

0 termo "alquil inferior" denota um resíduo de hidrocarboneto monovalente, de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 6 átomos de carbono. "C1-10 alquil" como aqui usado refere-se a um alquil composto de 1 a 10 carbonos.

Exemplos de grupos alquil incluem, sem limitação, grupos de alquil inferior, metil, etil, propil, i-propil, n-butil, i-butil, t-butil ou pentil, isopentil, neopentil, hexil, heptil, e octil. O termo (ar)alquil ou (heteroaril)alquil indica que o grupo alquil é opcionalmente substituído por um grupo aril ou a heteroaril respectivamente.

O termo "alquinil" como aqui usado denota um radical de cadeia de hidrocarboneto ramificado ou não ramificado que tem de 2 a 10 átomos de carbono, preferivelmente 2 a 5 átomos de carbono, e que tem uma ligação tripla. "C2-10 alquinil" como aqui usado refere-se a um alquinil composto de 2 a 10 carbonos. Exemplos são etinil, 1-propinil, 2- propinil, 1-butinil, 2-butinil ou 3- butinil.

O termo "cicloalquil" como aqui usado denota um anel carbocíclico saturado contendo 3 a 8 átomos de carbono, ou seja, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil ou ciclooctil. "C3-7 cicloalquil" como aqui usado refere-se a um cicloalquil composto de 3 a 7 carbonos no anel carbocíclico.

O termo "haloalquil" como aqui usado denota um grupo alquil de cadeia ramificada ou não ramificada como acima definido em que 1, 2, 3 ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por um halogênio. "C1-3 haloalquil" como aqui usado refere-se a um haloalquil composto de 1 a 3 carbonos e 1-8 substituintes de halogênio. Exemplos são 1- fluormetil, 1-clorometil, 1-bromometil, 1- iodometil, trifluormetil, triclorometil, tribromometil, triiodometil, 1-fluoretil, 1-cloroetil, 1-bromoetil, 1-iodoetil, 2- fluoretil, 2-cloroetil, 2-bromoetil, 2-iodoetil, 2,2- dicloroetil, 3-bromopropil ou 2,2,2-trifluoretil.

O termo "alcoxi" como aqui usado significa um grupo - 0-alquil, em que alquil é como acima definido. Exemplos são metoxi, etoxi, n-propiloxi, i-propiloxi, n-butiloxi, i- butiloxi, t-butiloxi. "Alcoxi inferior" como aqui usado denota um grupo alcoxi com um grupo "alquil inferior" como previamente definido. "C1-10 alcoxi" refere-se a um -O- alquil em que alquil é C1-10.

O termo derivado de "di-acil" como aqui usado refere- se a um composto de nucleosídeo derivado como aqui descrito em que o 3' e 5'-hidroxi são de um éster -OC(=O)R1 e OC(=0)R2 em que R1 e R2 são como definido na reivindicação 1.

O termo "agente de acilação" como aqui usado refere-se a um anidrido, haleto ácido, clorocarbonilalcóxido (por exemplo, etil cloroformato) ou um derivado ativado de um alfa aminoácido N-protegido. 0 termo "anidrido" como aqui usado refere-se a compostos de estrutura geral R1C(O)-O- C(O)R1 em que R1 é como definido na reivindicação 1. O termo "haleto ácido" como aqui usado refere-se a compostos de estrutura geral R1C(O)X em que X é um halogênio. 0 termo "acil imidazol" refere-se a um composto de estrutura geral R1C(O)X em que X é N-imidazolil. O termo "derivado ativado" de um composto como aqui usado refere-se a uma forma reativa transitória do composto original que torna o composto ativo em uma reação química desejada, em que o composto original é apenas moderadamente reativo ou não reativo. A ativação é realizada por formação de um derivado ou um agrupamento químico na molécula com um maior conteúdo de energia livre que aquele do composto original, que torna a forma ativada mais suscetível para reagir com um outro reagente. No contexto da presente invenção a ativação do grupo carboxi pe de importância particular e agentes de ativação correspondentes ou grupos que ativam o grupo carboxi são descritos em maiores detalhes abaixo.

De interesse particular para a presente invenção são anidridos de ácido carboxílico e cloretos de ácido carboxílico.

A frase "mistura heterogênea de solvente aquoso" como aqui usada refere-se a uma mistura de água e um co-solvente orgânico que produz uma mistura de duas fases ou heterogênea.

Essa mistura heterogênea de solvente aquoso pode resultar de um co-solvente com solubilidade aquosa limitada ou a força iônica do componente aquoso pode ser ajustada para limitar a solubilidade do co-solvente na fase aquosa.

O termo "hidróxido de metal alcalino" refere-se a um composto de fórmula MOH em que M é Iitio, sódio, potássio ou césio, "bicarbonato de metal alcalino" refere-se a um grupo MHC03 em que M é sódio ou potássio e "carbonato de metal alcalino" refere-se a um grupo M2C03 em que M é sódio ou potássio. Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que outras bases podem ser usadas para manter o pH em faixa desejada e outras bases estão dentro do escopo da invenção.

As abreviações usadas nesse pedido incluem: acetil (Ac), ácido acético (HOAc), 1-N-hidroxibenzotriazol (HOBt), atmosferas (Atm), cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), metil (Me), terc-butoxicarbonil (Boc), acetonitrila (MeCN), di-terc-butil pirocarbonato ou boc anidrido (BOC2O), cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida (EDCI), benzil (Bn), butil (Bu), metanol (MeOH), benziloxicarbonil (cbz ou Ζ), ponto de fusão (mp), carbonil diimidazol (CDI) , MeSO2-(mesil ou Ms), 1,4- diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), espectro de massa (ms), metil t-butil éter (MTBE), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), N- metilmorfolino (NMM), N-metilpirrolidona (NMP), 1,2- dicloroetano (DCE), Ν,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), dicromato de piridínio (PDC), diclorometano (DCM), propil (Pr) , libras por polegada quadrada (psi), diisopropiletilamina (DIPEA, Base de Hunig), piridina (pyr), temperatura ambiente, rt ou RT, N,N-dimetil acetamida (DMA), terc-butildimetilsilil ou t-BuMe2Si, (TBDMS), 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP), trietilamina (Et3N ou TEA), N,N-dimetilformamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO), ácido trifluoracético (TFA), cromatografia de camada fina (TLC), acetato de etila (EtOAc) , tetrahidrofurano (THF) , éter dietilico (Et20) , trimetilsilil ou Me3Si (TMS) , etil (Et) , monofridrato de ácido p-toluenossulfônico (TsOH ou pTsOH), 4-Me-C6H4SO2- ou tosil (Ts), iso-propil (i-Pr), N-uretano-N-carboxianidrido (UNCA), etanol (EtOH). Nomenclatura convencional incluindo os prefixos normal (η), iso (i-), secundário (sec-), terciário (terc-) e neo têm o significado costumeiro quando usados com uma porção alquil. (J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.).

Exemplos de compostos representativos englobados pela presente invenção e dentro do escopo da invenção são fornecidos na Tabela I. Esses exemplos e preparações que se seguem são fornecidos para permitir que aqueles habilitados na técnica compreendam mais claramente e pratiquem a presente invenção, eles não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção, mas apenas como sendo ilustrativos e representativos dessa.

Em geral, a nomenclatura usada nesse pedido é baseada em AUTONOMTM v.4.0, um sistema computadorizado de Beilstein Institute para a geração de nomenclatura sistemática IUPAC. Se houver uma discrepância entre uma estrutura mostrada e um nome dado àquela estrutura, a estrutura mostrada deve receber mais peso. Além disso, se a estereoquimica de uma estrutura ou uma porção de uma estrutura não for indicada, por exemplo, em linhas com negrito ou tracejadas, a estrutura ou porção da estrutura deve ser interpretada como englobando todos os estereoisômeros dela. O sistema d enumeração para esses sistemas de anel é como se segue:

Compostos e preparação

A atividade inibidora de polimerase de HCV de (2R)-2'- desoxi-21-flúor-21-C-metilcitidina foi revelada (J. L. Clark e cols. J. Med. Chem. 2005 48 (17) : 5504-8; J. Clark Publicação U.S. No. 2005/0009737 e ambas publicações são aqui incorporadas em sua totalidade por referência). Em prática clinica, seria desejável administrar inicialmente altas doses de 1-6 para inibir rapidamente a polimerase de HCV e assim diminuir os níveis virais sob condições que minimizam a oportunidade para que o vírus sofra mutação e para selecionar cepas resistentes. Níveis suficientemente altos podem ser difíceis de serem atingidos com o nucleosídeo parente. Pró-fármacos fornecem uma estratégia para melhorar as propriedades farmacocinéticas e físicas de um composto e assim otimizar a biodisponibilidade. A Publicação U.S. 2005/0009737 sugere abordagens gerais para pró-fármacos de nucleosídeo de 2'-desoxi-2'-flúor-21-metil nucleosídeos. Embora candidatos de pró-fármaco sejam enganosamente simples de idealizar, a identificação de compostos com as propriedades fisicoquímicas e farmacodinâmicas adequadas, transformações in vivo e perfil de segurança é uma tarefa complexa multi-disciplinar que requer experimentação significativa. Obstáculos à identificação de pró-fármacos para liberação oral incluem a manutenção de suficiente solubilidade aquosa, lipofilia e estabilidade química ao mesmo tempo que permite rápida e eficientes liberação da porção ativa após administração. Adicionalmente, metabolismo significativo não esterase e depuração mediada de transportador do pró-fármaco deve ser minimizada (K. Beaumont e cols. Curr. Drug Metab. 2003 4 (6) :461-485) . Também inibição ou indução de enzimas de citocromo P450 podem produzir interações adversas medicamento-medicamento que são indesejáveis. Diésteres de alquil inferior de 1-6 mostrados na Tabela 1 melhoram significativamente a biodisponibilidade de 1-6.

O comportamento farmacocinético de pró-fármacos potenciais foi avaliado em rato e macaco para tentar minimizar variabilidade intra-espécie e polimorfismos genéticos que podem resultar em artefatos intra-espécie. Na extensão em que as transformações enzimáticas são responsáveis por hidrólise das ligações de éster, a afinidade específica para o pró-fármaco pode depender da estrutura específica da esterase e/ou peptidase que pode catalisar a transformação. A atividade da esterase de rato mostrou freqüentemente ser significativamente maior que a do homem ( J. A. Fix e cols. Pharm. Res. 1990 7 (4) : 384-387;

W. Li e cols. Antimicrob. Agents Chemother 1998 42 (3) :647- 653). Um outro parâmetro potencialmente importante foi a bioconversão da base de citidina a uridina por uma desaminase. Embora o trifosfatos de citidina e uridina seja inibidores de polimerase, a fosforilação in vivo de uridina é ineficiente comparada a citidina. Assim, níveis aumentados de uridina são considerados indesejáveis. A ausência de eficácia exibida pelo derivado de uridina no replicon de HCV (J. Clark e cols. J. Med. Chem., supra) foi relatada.

Tabela 1

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1. Cmax é a concentração de pico de 1-7 no sangue.

2. AUC (cyt) é a área. sob a curva, para nucleosídeo de citidina

AUC(urd) é a área sob a curva para nucleosídeo de uridina

3. EC90 em replicon pe 5,40 ± 2,6 μΜ (J. Clark e cols. J. Med. Chem., supra)

De modo surpreendente, foi constatado agora que C2-5 alquil diésteres de 1-6 exibem excelentes propriedades de pró-fármaco. Níveis substancialmente maiores do nucleosídeo fluorinado são observados no sangue em rato e macaco. Além disso, a proporção de citidina para uridina na base fluorinada é maior em ambas espécies quando o nucleosídeo foi administrado como o diéster.

Adicionalmente, diésteres são capazes de formar dois diferentes monoésteres e o nucleosídeo não esterifiçado. A análise farmacocinética nessa situação pode ser complexa se todas as espécies estão presentes no sangue em concentrações significativas. A presença de múltiplos metabólitos no sangue adiciona sobrecargas adicionais para estabelecer que o pró-fármaco é seguro. Surpreendentemente, a hidrólise de ambos ésteres é bastante fácil e o único metabólito significativo observado no sangue além do nucleosideo parente é o 31-monoéster que é convertido rapidamente a 1-6.

Para também avaliar o comportamento potencial em seres humanos, o transporte através de células Caco-2 foi avaliado para os pró-fármacos supostos. As células Caco-2 são comumente usadas para avaliar a absorção/permeabilidade potencial de moléculas (G. Gaviraghi e cols. em Pharmacokinetic optimization in drug research. Biological, Pharmacokinetic and Computational Strategies. B. Testa e cols. eds. Wiley Interscience VCHi Zurich 2001 pp 314). A permeabilidade de Caco-2 é aceitável para C2-s alquil diésteres de 1-6.

Em adição a biotransformação in vivo eficiente um pró- fármaco para administração oral também deve exibir propriedades fisicoquimicas adequadas para formular o medicamento e assegurar a absorção do intestino em um compartimento em que a biotransformação desejada possa ocorrer. Particularmente relevantes são solubilidade em água, coeficiente de divisão e estabilidade em fluidos gástricos e intestinais. Os valores para esses parâmetros são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

<table>table see original document page 37</column></row><table>30

1 = Coeficiente de divisão de octanol/auga calculado

2. Coeficiente de distribuição experimentalmente determinado em pH 7,4

3. Solubilidade em meio aquoso, água, ou tampão pH 6,5 (mg/mL).

4. Estabilidade em fluido gástrico simulado (SGF; pH 1,2)

5. Estabilidade em fluido intestinal simulado (SIF; pH 7,4)

6. Solubilidade em SGF é 13,3 mg/mL

7. não determinado

8. Meio é SIF, solubilidade em SGF é 13,6 mg/mL

9. Meio é SIF, solubilidade em SGF é 0,16 mg/mL

10. Medido em água e tampão de pH 6

11. Degradação insignificante notada pelo período de tempo

12. Determinado em pH 5,5 O coeficiente de divisão óleo-água Po/w (clogP é o Po/w calculado) é uma importante propriedade para medicamentos administrados por via oral. A substância do medicamento deve ter suficiente solubilidade aquosa para se dissolver na formulação e nos fluidos gastrointestinais (GI) para fazer contato com as células endoteliais no estômago e intestino e suficiente solubilidade em lipídeo para atravessar através da membrana de bicamada de lipideo dessas células e finalmente no sangue. A faixa ótima para Iog P de um composto para biodisponibilidade oral é entre 1 e 3 que é exibida por compostos da presente invenção.

A expressão Po/w como aqui usada refere-se ao coeficiente de divisão de octanol/água. a expressão clogP como aqui usada refere-se ao Po/w calculado. Programas de computador que calculam Po/w são facilmente disponíveis para o químico farmacêutico e medicinal. 0 termo coeficiente de distribuição refere-se ao coeficiente de divisão experimentalmente determinado entre octanol e uma solução aquosa tamponada. O coeficiente de divisão e coeficiente de distribuição são geralmente similares, mas o último é uma função do pH da solução aquosa enquanto o Po/w é independente de pH.

A solubilidade em água de um pró-fármaco para administração por via oral deve ser maior que pelo menos cerca de 0,1 mg/mL para formulação ótima e a meia vida em fluido gástrico simulado e fluido intestinal simulado deve ser de 1-2 h e 2-4 h respectivamente para permitir tempo suficiente para atravessar o estômago e ser absorvido no intestino.

Os compostos da presente invenção são convenientemente preparados em uma etapa por acilação de 1-6 em um solvente orgânico aquoso. 0 solvente pode ser uma solução aquosa homogênea ou uma solução de duas fases. 0 pH do solvente orgânico aquoso é mantido acima de 7,5 por adição de base para neutralizar ácido produzido pela acilação. A base pode ser um alcali ou hidróxido de metal alcalino ou uma amina terciária. A reação é realizada na presença de DMAP que é conhecido na técnica por ser um catalisador para acilação. Uma vantagem do presente processo é que o produto desejado pode ser obtido sem acilação da base heterociclica. Nenhum grupo de proteção é necessário o que elimina a necessidade por uma etapa de proteção/desproteção. O processo pe descrito nos exemplos.

Dosagem e administração

Os compostos da presente invenção podem ser formulados em uma ampla variedade de formas de dosagem de administração oral e veículos. A administração oral pode ser na forma de comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina dura e macia, soluções, emulsões, xaropes, ou suspensões. Compostos da presente invenção são eficazes quando administrados por administração de supositório, entre outras vias de administração. A maneira mais conveniente de administração é geralmente oral com o uso de um regime de dosagem diário conveniente que pode ser ajustado de acordo com a severidade da doença e com a resposta do paciente à medicação antiviral.

Um composto ou compostos da presente invenção, bem como seus sais f armaceuticamente úteis, junto com um ou mais excipientes, veículos, ou diluentes convencionais, podem ser colocados na forma de composições farmacêuticas e de dosagem unitária. As composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária podem compreender ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos ativos adicionais e as formas de dosagem unitária podem conter qualquer quantidade eficaz adequada do ingrediente ativo proporcional à faixa de dosagem diária pretendida a ser empregada. As composições farmacêuticas podem ser empregadas como sólidos, como comprimidos ou cápsulas preenchidas, semi-sólidos, pós, formulações de liberação sustentada, ou líquidos como suspensões, emulsões, ou cápsulas preenchidas para uso oral; ou na forma de supositórios para administração retal ou vaginal. Uma preparação típica terá de cerca de 5% a cerca de 95% de composto ou compostos ativos (w/w). 0 termo "preparação" ou "forma de dosagem" deve incluir formulações sólidas e líquidas do composto ativo e uma pessoa habilitada na técnica perceberá que um ingrediente ativo pode existir em diferentes preparações dependendo da dose desejada de parâmetros farmacocinéticos.

O termo "excipiente" como aqui usado refere-se a um composto que é usado para preparar a composição farmacêutica, e é geralmente seguro, não tóxico e nem biologicamente indesejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para uso veterinário bem como uso farmacêutico humano. Os compostos dessa invenção podem ser administrados isoladamente mas serão geralmente administrados em mistura com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmacêuticos adequados selecionados com relação à via pretendida de administração e prática farmacêutica padrão.

Uma forma de "sal farmaceuticamente aceitável" de um ingrediente ativo também pode conferir inicialmente uma propriedade farmacocinética desejável no ingrediente ativo que era ausente na forma não sal, e pode ser positivamente afetada pela farmacodinâmica do ingrediente ativo com relação a sua atividade terapêutica no corpo. A frase "sal farmaceuticamente aceitável" de um composto como aqui usado significa um sal que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto parente. Tais sais incluem: (1) sais de adição ácida, formados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e outros; ou formados com ácidos orgânicos como, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido malônico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido 3-(4-hidroxi benzoil)benzóico, ácido cinâmico, á.cido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etano- dissulfônico, ácido 2-hidroxi etanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 4-clorobenzenossulfônico, ácido 2- naftalenossulfônico, ácido 4-toluenossulfônico, ácido canforsulfônico, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido salicílico, ácido mucônico e outros. Deve ser entendido que todas as referências a sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição de solvente (solvatos) ou formas de cristal (polimorfos) como aqui definido, do mesmo sal de adição ácida.

Preparações em forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem agir como diluentes, agentes flavorizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, ligantes, conservantes, agentes de desintegração de comprimido, ou um material de encapsulação. Em pós, o veículo é geralmente um sólido finamente dividido que é uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, o componente ativo geralmente é misturado com o veículo que tem a capacidade de ligação necessária em proporções adequadas e compactado na forma e tamanho desejado. Veículos adequados incluem, sem limitação, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, Iactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, sódio carboximetilcelulose, um cera de baixa fusão, manteiga de cacau, e outros. Preparações em forma sólida podem conter, em adição ao componente ativo, colorantes, flavorizantes, estabilizantestampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, agentes de solubilização e outros.

Formulações líquidas também são adequadas para administração oral e incluem emulsões, xaropes, elixires e suspensões aquosas. Essas incluem preparações em forma sólida que devem ser convertidas a preparações em forma líquida logo antes do uso. Emulsões podem ser preparadas em soluções, por exemplo, em soluções aquosas de propileno glicol ou podem conter agentes emulsificantes como lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia. Suspensões aquosas podem ser preparadas por dispersão do componente ativo finamente dividido em água com material viscoso, como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, sódio carboximetilcelulose, e ourros agentes de suspensão bem conhecidos.

Os compostos da presente invenção podem ser formulados para administração como supositórios. Uma cera de baixa fusão, como uma mistura de glicerídeos de ácido graxo ou manteiga de cacau é primeiramente derretida e o componente ativo é disperso homogeneamente, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea fundida é então despejada em moldes de tamanho conveniente, deixada para resfriar, e para solidificar.

Os compostos da presente invenção podem ser formulados para administração vaginal. Pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays contendo além do ingrediente ativo tais veículos como são conhecidos na técnica como sendo adequados.

Formulações adequadas junto com veículos farmacêuticos, diluentes e excipientes sao descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edição, Easton, Pennsylvania. Um prosiffional habilitado em formulação pode modificar as formulações dentro dos ensinamentos da especificação para fornecer numerosas formulações para uma via particular de administração sem tornar a composições da presente invenção instável ou comprometer sua atividade terapêutica.

A modificação do presente composto para torná-lo mais solúvel em água ou outro veículo, por exemplo, pode ser facilmente realizada por modificações menores (por exemplo, formulação de sal), que estão dentro da prática comum na técnica. Está também dentro da prática comum na técnica a modificação da via de administração e regime de dosagem de um composto particular para controlar a farmacocinética dos presentes expostos para um efeito benefico maximo nos pacientes.

O termo santidade terapeuticamente eficaz como aqui usado significa uma quantidade necessária para reduzir os sintomas ,a doença em um indivíduo. A dose serã justada as necessidades individuais em cada caso particular. Aquela numerosos fatores como a severidade da doença a ser tratada, a idade, saüde geral . condição do pacente outros medicamentos com os ,uais o paciente esta sendo tratado, a via e forma de administração e as preferencias e experiência do profissional médico envolvido. Para administração oral, uma dosa9em diãria entre cerca 0,1 e cerca de 10 g por dia deve ser adequada em monoterapia e/ou em terapia de combinação. Uma dose diária preferida esta entre cerca de 0,5 and cerca de 7,5 g por dia, mais preferivel 1,5 e cerca de 6,0 g por dia. Geralmente, o tratamento e iniciado com uma "dose de carga" grande inicial para reduzir rapidamente ou elimrnar o virus seguido por uma diminuição da dose a um nivel suficiente para evitar o ressurgimento da infecção. Uma pessoa de habilidade comum no tratamento de doenças aqui descr.tas será capaz, sem experimentação indevida e em com confia no conhecimento pessoal, de experimentar as revelações desse pedido, de determinar a quantidade terapeuticamente eficaz do compostos da presente invenção para uma dada doenca e paciente.

A eficácia terapêutica pode ser determ.nada a partir de testes de função hepática que incluem, mas não sao limitados a, níveis protéicos como proteínas séricas (por exemplo, albumina, fatores de coagulação, fosfatase alcalina, aminotransferases (por exemplo, alanina transaminase, aspartato transaminase) , 51-nucleosidase, γ- glutaminiltranspeptidase etc.), síntese de bilirrubina, colesterol, e síntese de ácidos biliares; uma função metabólica hepática, incluindo, sem limitação, metabolismo de carboidrato, metabolismo de aminoácido e amônia.

Alternativamente, a eficácia terapêutica pode ser monitorada por medição de HCV-RNA. Os resultados desses testes permitirão que a dose seja otimizada.

Em modalidades da invenção, o composto ativo ou um sal pode ser administrado em combinação com um outro agente antiviral como ribavirina, um outro inibidor nucleosídico de polimerase de HCV, um inibidor não nucleosídico de polimerase de HCV, um inibidor de protease de HCV, um inibidor de helicase de HCV ou um inibidor de fusão de HCV. Quando o composto ativo ou seu derivado ou sal são administrados em combinação com um outro agente antiviral a atividade pode ser aumentada no composto parente. Quando tratamento é terapia de combinação, tal administração pode ser concomitante ou seqüencial com relação àquela dos derivados de nucleosídeo. "Administração concomitante" como aqui usado inclui a administração dos agentes ao mesmo tempo ou em tempos diferentes. A administração de dois ou mais agentes ao mesmo tempo pode ser realizada por uma única formulação que contém dois ou mais ingredientes ativos ou por administração substancialmente simultânea de duas ou mais formas de dosagem com um único agente ativo.

Deve-se compreender que referências nessa a tratamento, estende-se como a profilaxia bem como ao tratamento de condições existentes. Além disso, o termo "tratamento" de uma infecção por HCV, como aqui usado, também inclui tratamento ou profilaxia de uma doença ou uma condição associada com ou mediada por infecção por HCV, ou os sintomas clínicos dessa.

Exemplo 1

Ácido propiônico (2R,3R,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxo-2H- pirimidin-l-il)-4-flúor-4-metil-3-propioniloxi-tetrahidro- furan-2-ilmetil éster (1-3)

<formula>formula see original document page 46</formula>

A uma suspensão de 1-6 (30 g, 0,116 mol) , DMAP (1,4 g, 11,57 mmol) em THF ( 300 mL) e água (150 mL) foi adicionado TEA (35,1 g, 0,347 mol) para obter uma solução transparente (pH cerca de 11) . A mistura de reação foi resfriada a 5-10° C e anidrido propiônico (30,1 g, 0,231 mol) foi adicionado em gotas à reação bifásica agitada. 0 pH foi monitorado e mantido a cerca de 11-12 por adição simultânea de solução de KOH. 0 progresso da reação foi monitorado por análise de HPLC e depois de o cloreto de propionila ter sido adicionado havia cerca de 52% do diéster, 30% monoésteres e 15% de material de iniciação. Anidrido propiônico adicional (45,2 g, 0,347 mol) foi adicionado em gotas sob as condições acima descritas. A mistura de reação foi deixada em repouso de um dia para o outro sem agitação. A HPLC da fase orgânica indicou cerca de 96% de diéster e cerca de 2% de monoéster. As fases foram separadas e a fase aquosa extraída duas vezes com THF (100 mL) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura. A fase orgânica é filtrada, evaporada e o resíduo dissolvido em água (cerca de 500 mL) e então diluída com IPA (cerca de 10 0 mL) . A mistura resultante é lentamente resfriada até a temperatura ambiente com agitação. 0 precipitado resultante foi filtrado, lavado com água e heptano, seco a cerca de 600C sob vácuo por cerca de 60 horas para gerar 3,45 g (80,3%) de 1-3 que foi 98,75% puro por HPLC. Exemplo 2

Ácido isobutírico (2R,3R,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxo-2H- pirimidin-l-il)-4-flúor-3-isobutiriloxi-4-metil-tetrahidro- furan-2-ilmetil éster (1-2)

A uma suspensão gelada de 1-6 (970 g, 3,74 mol) e DMAP (50 g, 0,412 mol) em THF (10 L) foi adicionado TEA (2,3 kg, 16,5 mol) e água (7 L) que produziram uma solução transparente. Cloreto de isobutirila (3 equivalentes) foi adicionado lentamente à mistura agitada mantendo a temperatura a cerca de 0o C. Mais 1,2 então 0,7 equivalente de cloreto de isobutirila foi adicionado até HPLC indicar que a reação prosseguiu até a finalização (um total de cerca de 1,95 kg). A mistura de reação foi acidifiçada com HCl a um pH de cerca de 6,4 e a fase orgânica foi lavada com EtOAc (2 χ 10 L) . Os extratos combinados foram lavados com água (1 χ 15 L) . A fase orgânica é filtrada e concentrada in vácuo. O resíduo foi dissolvido em IPA (cerca de 20 kg) e heptano (14,2 kg) foi adicionado. A solução foi aquecida a cerca de 74-75° C para produzir uma solução transparente, então cerca de 5 L foram removidos por destilação. A solução resultante foi resfriada lentamente até a temperatura ambiente. Um precipitado formou-se a cerca de 42-43°C. o resfriamento foi continuado lentamente a 5°C então agitação de um dia para o outro. 0 sólido resultante foi filtrado e o filtrado foi lavado com mistura de IPA/heptano (1:8) (13,4 kg), seco sob vácuo a cerca de 60- 70°C para gerar 1,295 kg (86,65%) de 1-2 que era 99,4 5% puro por HPLC.

Exemplo 3

Ácido carbônico (2R,3R,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxo-2H- pirimidin-1-il)-4 - flúor-2 -isobutoxicarboniloximetil-4 - metil-tetrahidro-furan-3-il éster isobutil éster (1-4)

<formula>formula see original document page 48</formula>

Uma suspensão de 1-6 (700 mg), DMAP (33 mg) em THF (7 mL) foi diluída com salmoura (7 mL) . NaOH diluído foi adicionado até o pH ser de cerca de 11. A mistura de reação foi resfriada em um banho de gelo e cloroformato de isobutila (1,11 g) é adicionado em gotas à mistura de reação bifásica agitada mantendo o pH a cerca de 11 por adição de NaOH como necessário. A análise de HPLC indicou a que a maior parte do dicarbonato estava contaminada com cerca de 15% de monocarbonatos. Mais 1 eq. de cloroformato de isobutila foi adicionado em gotas à solução gelada. A HPLC indicou conversão quase completa. A mistura resultante foi deixada em repouso de um dia para o outro em temperatura ambiente. EtOAc (cerca de 50 mL) foi adicionado e o pH da fase aquosa é ajustado a cerca de 7,5 com HCl. As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (3x) e evaporada até secar para gerar um sólido incolor (cerca de 1,22 g). 0 sólido é dissolvido em acetona quente resultando em uma solução transparente que foi lentamente resfriada até RT que produziu uma massa de sólido. 0 sólido foi diluído com IPA (cerca de 20 mL) que produziu um caldo que foi filtrado então lavado seqüencialmente com IPA e heptano então seco para gerar 0,85 g (68,5%) de 1-4 que era 97,5% puro por HPLC.

Exemplo 4

Ácido carbônico (2R,3R,4R,5R)-5-(4-amino-2-oxo-2H- pirimidin-l-il)-4-flúor-4-metil2-propoxicarboniloximetil- tetrahidro-furan-3-il éster propil éster; sal de cloridrato (1-5)

A uma suspensão de 1-6 (700 mg, 2,70 mmol), DMAP (33 mg, 0,27 mmol) em THF (7 mL) e salmoura diluída (7 mL) foi adicionado KOH diluído para ajustar o pH a cerca de 11. A reação foi resfriada a cerca de 5°C e n-propil cloroformato (1,0 g) foi adicionado em gotas à mistura de reação bifásica agitada. A análise de HPLC indicou a formação do produto desejado junto com cerca de 20% de monocarbonatos. Duas quantidades adicionais de cloroformato de propila foram adicionadas (2x1 equivalente) à solução fria até que a análise de HPLC indicou que a reação prosseguiu até o fim. A mistura de reação foi diluída com EtOAc (30 mL) e o pH da fase aquosa é ajustado a cerca de 6,5 com HCl. As fases foram separadas e a fase orgânica é lavada com água (3x) e evaporada até secar para obter um sólido incolor (a cerca de 1,1 g) . Uma solução quente de IPA foi acidificada com 4N HCl (a cerca de 1 mL) e evaporada até secar. 0 sólido resultante foi redissolvido em EtOH quente (a cerca de 115 mL) e agitada de um dia para o outro em RT. É formada uma massa sólida que foi filtrada e o resíduo lavado com MeOH/heptano (1:1). 0 sólido restante foi seco in vácuo a cerca de 60°C para gerar 0,325 g (25,8%) de 1-5 que era 97,5% puro por ensaio de HPLC.

Exemplo 5

Determinação de parâmetros farmacocinéticos em ratos Ratos machos intactos XGS Wistar Han

Crl:WI(GLx/BRl/Han)IGS BR (Hanover-Wistar) pesando 200-250 g foram usados. Grupos de três ratos foram usados para cada nível de dose de um composto experimental. Os animais tiveram acesso normal a ração e água por todo o experimento. A substância de teste foi formulada como uma suspensão aquosa contendo Captex355EP, Capmul MCM, EtOH, e propileno glicol (30:20:20:30) em uma dose equivalente a 10 mg/kg de 1-6 e foi administrada por via oral por alimentação forçada. Uma amostra de sangue (0,3 mL) foi coletada dos ratos tratados a 0,25, 0,5, 1, 3, 5, e8ha partir de uma cânula jugular e a 24 h por punção cardíaca. Oxalato de potássio/NaF foram adicionados às amostras que foram estocadas em gelo durante o procedimento da amostra.

As amostras foram centrifugadas em uma centrífuga refrigerada a -4o C tão logo quanto possível e as amostras de plasma foram estocadas em um congelador a -800C até a análise. Alíquotas de plasma (0,05 mL) foram misturadas com 0,1 mL de acetonitrila. Padrão interno (0,05 mL em água) e 0,02 mL solvente foram adicionados. Um conjunto de padrões de calibragem foi preparado por mistura de alíquotas de 0,05-mL de plasma de ratos não tratados com 0,1 mL acetonitrila, alíquotas de 0,02-mL de solução padrão em metanol:água (1:1) e alíquotas de 0,05-mL do padrão interno em água. Cada amostra de plasma e padrão de calibragem foi turbilhonada completamente e então centrifugada a 3.000 rpm por 5 minutos para precipitar a proteína. Sobrenadante (100 μL cada) da centrifugação foi transferido a uma placa de 96 cavidades contendo 200 μL de fase móvel aquosa para análise de LC/MS/MS.

Análise ds amostra:

Pró-fármacos foram analisados com o uso de cromatografia líquida de alta performance com espectrometria de massa tandem (HPLC/MS/MS). Uma coluna Thermo Aquasil C18 4,6 χ 50 mm (5 μΜ) foi usada para separação. Ionização de eletrospray (ESI) foi usada para o processo de ionização. A fase móvel A continha 5 mM de acetato de amônio em água com 0,1% ácido fórmico e a fase móvel B continha MeOH com 0,1% ácido fórmico. A eluição foi realizada com o seguinte gradiente com uma taxa de fluxo de 1 ml/min.:

<table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table>

Exemplo 6

Determinação de parâmetros farmacocinéticos em macaco

Três macacos machos Cynomolgus pesando 8-10 kg foram usado. Os animais tiveram acesso normal a ração e água por todo o experimento. Os pesos dos animais no momento da administração do medicamento e reações indesejadas dos animais foram registrados. A substância de teste foi formulada como uma suspensão aquosa contendo hipromelose (2910, 50 cps), USP, polissorbato 80, NF, álcool benzílico, NF (5,0, 4,0 e 9,0 mg/mL) e água estéril (quantidade suficiente para gerar 1,0 mL) em uma dose equivalente a to 10 mg/kg de 1-6 e 0,5 mL/kg foi administrados por via oral por alimentação forçada. Uma amostra de sangue (0,5 — 1,0 mL) foi coletada a 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 8 e 24 horas. Manuseio e análise da amostra foi realizado como descrito no experimento com rato. Uma amostra de urina de 5 mL foi retirada de cada macaco antes to da dosagem a 0-8 h.

As amostras de urina foram estocadas a -80° C e analisadas por LC/MS/MS. Curvas padrão foram preparadas em plasma vazio de macaco contendo NaF e oxalato de potássio.

Exemplo 7

Protocolo de Caco

Materiais:

Pós de tampão de Krebs-Henseleit, hihidrato de cloreto de cálcio, e bicarbonato de sódio foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). Células Caco-2 (Passagem -100) foram obtidas de Roche Basel. DMEM/meio superior, ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES), e soro bovino foram obtidos de JRH Bioscience (Lenexa, KS) . MEM aminoácidos não essenciais, L-glutamina, penicilina, e estreptomicina foram obtidos de GIBCO Labs, Life Tech. LLC (Grand Island, NY). Inserções de cultura de células Snapwell (6,5 mm de diâmetro, 1,12 cm2, 0,4 μπι de tamanho de poro) foram obtido de Costar (Cambridge, MA).

Culturas de células:

Células cresceram em frascos de 75-cm2 e mantidas a 370C em uma atmosfera de 5% CO2 e 95% ar. 0 meio de cultura consistiu em DMEM/meio superior suplementado com 5% de soro bovino, 25 mM HEPES, 1% MEM aminoácidos não essenciais, 1% L-glutamina, 100 U/mL penicilina, e 100 μg/mL estreptomicina. Culturas foram passadas a cada semana em uma proporção de divisão de 1-3. Para os estudos de permeabilidade, as células Caco-2 em número de passagem 110-120 foram plaqueadas em uma densidade de 400.000 células/cm2 em filtros de policarbonato Transwell em inserções Snapwell e deixadas em cultura por 7 dias antes do uso.

Tampão de Krebs-Henseleit:

Tampão de bicarbonato de Krebs-Henseleit contendo 10 mM glicose e 2,5 mM CaCl2 ajustado a pH 6,5 e 7,4 foram preparados por instruções da embalagem. Sais em pó foram quantitativamente dissolvidos em cerca de 90% de volume necessário com água Millipore. Dihidrato de cloreto de cálcio e bicarbonato de sódio foram adicionados antes do ajuste do pH com IN HCl ou IN NaOH. Água Millipore adicional foi adicionada para trazer a solução a um volume final. A solução foi esterilizada por filtração com o uso de membrana com uma porosidade de 0,22 mícrons e estocada no refrigerador (-20°C) até o uso.

Preparação de células:

Células diferenciadas foram obtidas de "Cell Culture Core Facility" e deixadas para equilibrar a 37°C em uma atmosfera de 5% CO2 e 95% ar. Inserções de Snapwells, contendo monocamadas de caco-2 foram enxaguadas em tampão Krebs-Henseleit equilibrado a 37°C pH 7,4. Método:

A inserção de célula foi utilizada como a câmara de difusão. 0 pH do tampão de Krebs-Henseleit nas câmaras apical e basolateral foi de 6,5 e 7,4, respectivamente, e a concentração inicial de substrato no lado apical foi 100 μΜ. As células com composto testado na câmara apical foram pré-incubadas por aproximadamente 3 0 minutos a 370C sob uma atmosfera de 5% CO2 e 95% ar. Os experimentos foram iniciados quando as inserções de célula com 100 μΜ compostos em tampão de Krebs-Henseleit em pH 6,5 foram transferidas para uma nova placa com tampão pré-equilibrado em câmara basolateral. As amostras do lado doador a 0 minuto, e lados doador e receptor a 3 0 minutos foram coletadas para análise. Controle pós-experimento:

Amarelo Lucifer foi usado para avaliar a performance do sistema de difusão. Após a última amostragem para os compostos de teste, amarelo Lucifer foi adicionado à câmara apical para gerar uma concentração inicial de 100 μΜ. Depois de 60 minutos de incubação, 250 μL foram removidos da câmara basal e analisados.

Cálculo de coeficiente de permeabilidade (Papp): O Papp foi calculado com o uso da seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 55</formula>

Quando V é o volume (cm3) da solução do receptor, A pe a área de superfície (cm2) da inserção Snapwell, Co é a concentração inicial (nM), e dC/dt é a mudança na concentração na câmara receptora pelo tempo, ou seja, a inclinação (nM/min) da concentração na câmara receptora vs. tempo. As concentrações em cada ponto de tempo da amostra foram corrigidas para responder pelas alíquotas removidas ou transferidas de inserções de doador para novas placas dependendo do experimento. Exeip.plo 8

Composições farmacêuticas dos atuais compostos para administração por meio de várias vias foram preparadas como descrito no Exemplo 8.

Composição para formulação granular úmida para administração oral (A):

<table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table>

Os ingredientes são misturados, granulados e colocados em cápsulas de gelatina dura contendo cerca de 5 00 mg de composto ativo

Composição para Administração oral (B):

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Os ingredientes são combinados e granulados com o uso de um solvente como água. A formulação é então seca e formada em comprimidos contendo cerca de 500 mg de composto ativo com uma máquina de formação de comprimido adequada.

Composição para Administração oral (C)

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Os ingredientes são misturados para formar uma suspensão para administração oral. Formulação de supositório(D):

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Os ingredientes são fundidos e misturados em um banho de vapor, e despejados em moldes contendo 2,5 g de peso total.

As características reveladas na descrição anterior, ou nas reivindicações a seguir, expressas em suas formas específicas ou em termos de um meio para realizar a função revelada, ou um método ou processo para alcançar o resultado revelado, como adequado, podem, separadamente, ou em qualquer combinação de tais características, ser utilizadas para realizaçao da invenção em diversas formas dessa.

A invenção anterior foi descrita em algum detalhe por via de ilustração e exemplo, para objetivos de clareza e de compreensão. Estará óbvio para pessoa habilitada na técnica que mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em apêndice. Portanto, deve-se entender que a descrição acima deve ser ilustrativa e não restritiva. 0 escopo da invenção deve, portanto, ser determinado não com referência à descrição acima, mas deve, ao contrário, ser determinado com referência às reivindicações em apêndice a seguir, junto com o escopo total de equivalentes ao qual tais reivindicações são designadas.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citados nesse pedido são aqui incorporados em sua totalidade por referência para todos os objetivos na mesma extensão como se cada patente, pedido de patente ou publicação individual fossem individualmente indicados.

Claims (17)

1. Composto de formula I <formula>formula see original document page 59</formula> caracterizado pelo fato de que: R1 é selecionado do grupo que consiste em C2-5 alquil ramificado ou não ramificado, C2-5 alquenil ramificado ou não ramificado, C2-5 alquinil ramificado ou não ramificado, C2-5 haloalquil inferior, C3-6 cicloalquil, e C2-4 alcoxi; e, hidratos, solvatos e sais de adição ácida desses.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é etil, n-propil, iso- DrODil n-buti 011 nri-hnt-

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R1 é etil ou iso-propil.

4. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R1 é iso-propil e o composto é o sal de cloridrato ou sulfato.

5. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R1 é iso-propil e o composto é o sal de cloridrato.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é etoxi, n-propiloxi ou isopropiloxi.

7. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado para uso em terapia.

8. Composto de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado para uso na terapia de uma doença mediada pelo Virus da hepatite C (HCV).

9. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com as reivindicações 1 a 6 misturada com pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Uso de um composto de acordo com reivindicações 1 a 6, caracterizado para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença mediada pelo Vírus da hepatite C (HCV).

11. Uso de acordo com reivindicação 10, caracterizado pelo de que o medicamento é administrado a um paciente em necessidade desse em uma dose terapeuticamente eficaz.

12. Uso de acordo com reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo de que o medicamento é administrado a um paciente em necessidade desse em uma dose entre 0,1 e 10 g por dia.

13. Uso de acordo com reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo de que o medicamento é administrado também com pelo menos um modulador do sistema imune e/ou pelo menos um agente antiviral que inibe a replicação de HCV.

14. Método caracterizado para o tratamento de uma doença mediada pelo vírus da hepatite C (HCV) que compreende a administração a um paciente em necessidade desse de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com as reivindicações 1 a 6.

15. Método da reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dose entre 0,1 e 10 g por dia é administrada ao paciente.

16. Método das reivindicações 14 ou 15, caracterizado por também compreender a administração de pelo menos um modulador do sistema imune e/ou pelo menos um agente antiviral que inibe a replicação de HCV.

17. Processo caracterizado para a O-acilação seletiva de um nucleosxdeo I para gerar um O-acil nucleosídeo II sob condições de reação básicas <formula>formula see original document page 61</formula> em que R1 é selecionado do grupo que consiste em C2-5 alquil ramificado ou nao ramificado, C2-5 alquenil ramificado ou não ramificado, C2-5 alquinil ramificado ou não ramificado, C2-5 haloalquil inferior, C3-6 cicloalquil, e C2-4 alcoxi cujo processo compreende as etapas de : (i) dissolução de II e DMAP em uma mistura de solvente heterogênea aquosa e adição de base aquosa para ajustar o pH de cerca de 7,5 a cerca de 12; (ii) opcionalmente adição de NaCl aquoso saturado suficiente para produzir uma mistura de reação bifásica; (iii) adição de um agente de acilação e base adicional suficiente para manter o pH de cerca de 7,5 a cerca de 12; (iv) monitoração da reação e descontinuação da adição do referido agente de acilação e da referida base quando a conversão atingir um nível satisfatório; (ν) opcionalmente, contato de O-acil nucleosídeo um ácido farmaceuticamente aceitável para formar um sal adição ácida do O-acil nucleosídeo.