BRPI0617735B1 - Composições compreendendo vírus isolados, polinucleotídeos, ou polipeptídeos, construções de expressão, vacinas, kits para proteger um canino da infecção do vírus influenza, uso do vírus na preparação de composição farmacêutica bem como método in vitro para detecção de um vírus influenza que é capaz de infectar um animal canídeo - Google Patents

Abstract

VÍRUS DE INFLUENZA CAPAZES DE INFECTAR CANÍDEOS, USOS DOS MESMOS. A invenção em questão refere-se ao isolado do vírus de influenza que é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias no canídeo. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da presente invenção. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para identificar um vírus da invenção e diagnosticar a infecção de um animal com um vírus da invenção.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[001] Este pedido de patente é uma continuação-em-parte do pedido U. S. No 11/409.416, depositado em 21 de abril de 2006; e este pedido reivindica prioridade para os U. S. Nos 60/728.449, depositado em 19 de outubro de 2005; 60/754.881, depositado em 29 de dezembro de 2005; 60/759.162, depositado em 14 de janeiro de 2006; 60/761.451, depositado em 23 de janeiro de 2006; e 60/779.080, depositado em 3 de março de 2006, a descrição de cada um deste é por este meio incorporada por referência aqui em sua totalidade, incluindo qualquer breve sumário, descrições detalhadas da invenção, exemplos, reivindicações, resumo, figuras, tabelas, seqüências de ácido nucléico, seqüências de aminoácido, e desenhos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] "Tosse de canil" ou traqueobronquite infecciosa (ITB) é uma infecção respiratória aguda, contagiosa em cães caracterizada principalmente por tosse (Ford et al, 1998). ITB canina é considerada uma das doenças das vias respiratórias infecciosas mais prevalecentes de cães no mundo, e surtos podem alcançar proporções epidêmicas quando os cães são alojados em ambientes de população de alta densidade tais como canis. A maioria dos surtos é devido ao contato direto de cão-com-cão ou utilização de aerossol de secreções respiratórias (Ford et al, 1998). Os sinais clínicos são causados através de infecção com um ou uma combinação de agentes bacterianos e virais que colonizam o epitélio do trato respiratório superior e inferior. Vírus de parainfluenza canina (CPiV) e bactérias de Bordetella bronchiosseptica são os organismos mais comuns isolados de cães afetados, mas vários outros vírus tais como vírus de sinomose canina (CDV) e adenovírus-1 e - 2 caninas (CAV-1, CAV-2), juntamente com bactérias tais como Streptococcus sp., Pasteurella multicoda e Escherichia coli, podem influenciar o curso e resultado clínicos (Ford et al, 1998). Embora surtos ocorram eficiente e rapidamente em populações de alta densidade com morbidez alta, infecções respiratórias complicadas e morte são incomuns. Embora pneumonia bacteriana secundária de ameaça à vida possa se desenvolver, a maior parte dos casos de ITB é autolimitante e soluciona- se sem qualquer tratamento (Ford et al, 1998).

[003] Em julho de 1992, uma infecção respiratória presumida ser "tosse de canil" tornou-se epidêmica em várias pistas de galgo na Nova Inglaterra, Flórida, West Virginia, Wisconsin, Kansas, Colorado, Oklahoma e Arizona. De acordo com os veterinários, a maioria dos cães afetados teve uma tosse moderada que se solucionou, mas mais que uma dúzia de galgos desenvolveram uma pneumonia hemorrágica aguda seguida por morte rápida (Greyhound Daily News, 1999).

[004] No final de 1998 ao início de 1999, vários surtos de "tosse de canil" ocorreram em canis de galgos de corrida ao longo do país, resultando em fechamento obrigatório das pistas e quarentena de todos os galgos de corrida nos EUA durante várias semanas (Greyhound Daily News, 1999). Em uma pista na Flórida (Palma Beach Kennel Club), tosse foi registrada em quase 40 % da população de cães em um único dia (comunicação pessoal de Dr. William Duggar). Similar ao surto em 1992, a tosse resolveu-se na maioria dos galgos, mas 10 cães na Flórida morreram de uma síndrome de pneumonia hemorrágica não- caracterizada de "tosse de canil" (Putnam, 1999).

[005] Em março-abril de 2003, outro surto de "tosse de canil" ocorreu em pistas de galgo nos EUA oriental. O surto é acreditado ter originado em canis em quatro pistas na Flórida e causou a suspensão de corrida e quarentena dos cães durante quase três semanas. Quase 25 % dos cães na pista em West Palm Beach foram afetados, enquanto quase 50 % dos 1400 cães em Derby Lane em St. Petersburg desenvolveram tosse. Novamente, a maioria dos cães se restabeleceu, mas vários cães morreram da infecção respiratória. O impacto econômico estimado do surto respiratório na pista de Derby Lane sozinho foi 2 milhões de dólares.

[006] Não há nenhum relatório publicado documentando a etiologia ou clinicopatologia dos surtos de "tosse de canil" em canis de galgo de corrida em 1992, 1998-1999, ou 2003. A suposição foi que as infecções tenham sido devido a CPiV e/ou B. bronchiosseptica, as duas causas mais comuns de tosse de canil. Comunicações insubstanciadas tais como sítios de rede atribuíram as pneumonias hemorrágicas fatais relatadas em alguns dos cães com tosse à infecção com Streptococcus equi β-hemolitica subespécie zooepidemicus, e referem-se à síndrome como "choque tóxico estreptocócico canino".

[007] Transmissão do vírus de uma espécie hospedeira para a outra é uma característica crucial da ecologia e epidemiologia de vírus de influenza (Webster, 1998). Dois mecanismos básicos de transmissão interespécies de vírus de influenza são possíveis (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004). Uma é a transferência direta de um vírus essencialmente inalterado de uma espécie para a outra. Exemplos deste mecanismo incluem as recentes infecções humanas com o subtipo de H5N1 do vírus de influenza aviária (Subbarao et al., 1998; Peiris et al., 2004; Guan et al., 2004) e possivelmente o pandêmico de 1918, conhecido como influenza espanhola (Reid et al., 2004). O segundo mecanismo é uma conseqüência da natureza segmentada do genoma de influenza. Co-infecção de um hospedeiro com vírus de espécies diferentes pode resultar em rearranjo dos genes virais segmentados e a geração de um recombinante com a habilidade de infectar outras espécies. Por exemplo, vírus novos gerados por rearranjo de gene entre vírus de influenza aviária e humana resultaram em pandêmico de influenza humana em 1957 e 1968 (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004; Kawaoka et al., 1989).

[008] A maioria das transmissões diretas do vírus de influenza inalterados da espécie hospedeira natural para uma espécie diferente são eventos terminais porque transmissão contínua entre indivíduos da espécie nova não ocorre. Interações múltiplas de vírus-hospedeiro são necessárias para replicação e transmissão horizontal e fornecem uma barreira formidável contra perpetuação de vírus de influenza no hospedeiro novo (Webby et al., 2004). Portanto, estabelecimento de linhagens hospedeiro-específicas novas de vírus de influenza é incomum e tem apenas ocorrido em avícula doméstica, porcos, cavalos, e humanos (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004).

[009] Por causa da natureza séria da infecção do vírus de influenza, continua uma necessidade por métodos para diagnosticar, impedir e tratar infecção por vírus de influenza.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A invenção em questão refere-se ao vírus de influenza isolado que é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias no canídeo. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da presente invenção. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para identificar um vírus da invenção e diagnosticar infecção de um animal com um vírus da invenção.

[0011] Um aspecto da invenção refere-se a vacinas e métodos para proteger caninos de influenza canina, kits compreendendo tais vacinas, e métodos para usar tais vacinas. Esta proteção inclui impedir, reduzir o risco, tardar o princípio, reduzir a expansão, melhorar, suprimir, e/ou erradicar a influenza e/ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) de seus sintomas. É acreditado que as vacinas, kits, e métodos desta invenção sejam em geral adequados para o uso com caninos. Caninos incluem caninos selvagens, de jardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes, e raposas. Caninos também incluem cães, particularmente cães domésticos, tais como, por exemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães de exposição, cães de trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda, cães policiais, cães de corrida, e/ou cães de laboratório.

[0012] Esta invenção é também direcionada, em parte, a um método para proteger um canino de uma infecção do vírus de influenza (isto é, impedir, reduzir o risco, tardar o princípio, suprimir, melhorar, ou erradicar uma infecção do vírus de influenza). O método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7.

[0013] Esta invenção é também direcionada, em parte, a um método para proteger um canino de lesões respiratórias (isto é, impedir, reduzir o risco, tardar o princípio, suprimir, melhorar, ou erradicar lesões respiratórias) causadas por vírus de influenza canina. O método compreende administrar ao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7.

[0014] Esta invenção é também direcionada, em parte, a um método para proteger um canino de ter vírus de influenza canina em secreção nasal ou oral (isto é, impedir, reduzir o risco, tardar o princípio, suprimir, melhorar, ou erradicar o vírus de influenza canina em secreção nasal ou oral) causada por infecção do vírus de influenza canina. O método compreende administrar ao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7.

[0015] Esta invenção é também direcionada, em parte, a uma vacina de influenza canina. Em algumas modalidades, por exemplo, a vacina compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7.

[0016] Esta invenção é também direcionada, em parte, a um kit para proteger um canino de infecção do vírus de influenza. O kit compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7. Além disso, o kit compreende pelo menos um dos seguintes:

[0017] um aparelho para administrar a vacina ao canino,

[0018] um excipiente farmaceuticamente aceitável que auxilia na administração da vacina ao canino,

[0019] um excipiente farmaceuticamente aceitável que intensifica a resposta imune do canino à vacina,

[0020] um alimento a ser consumido pelo canino simultaneamente com a vacina, e/ou

[0021] um medicamento a ser consumido pelo canino simultaneamente com a vacina.

[0022] Outros benefícios da invenção das Requerentes serão evidentes a alguém versado na técnica ao ler este relatório descritivo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] Figuras 1A-1B mostram relações filogenéticas entre os genes de hemaglutinina. Figura 1A mostra uma árvore de genes de HA de isolados representativos caninos, seres humanos, aviários, suínos, e eqüinos, incluindo A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4) como estranho. Figura 1B mostra uma árvore dos genes de HA de vírus de influenza canina com os genes de HA eqüinos contemporâneos e mais velhos, usando A/Duck/Ukraine/63 (H3) como estranho. Árvores filogenéticas foram deduzidas das seqüências de nucleotídeo pelo método de junção de vizinhos e valores de análise de autocarregador > 90% são mostrados. A barra denota o número de alterações de nucleotídeo por comprimento de unidade das ramificações de árvores horizontais.

[0024] Figuras 2A-2B mostram detecção imuno-histoquímica de antígeno de H3 de influenza nos pulmões. Seções do tecido pulmonar foram sondadas com um anticorpo monoclonal de camundongo para hemaglutinina de H3 e ligação foi detectada através de reação de imunoperoxidase (precipitado marrom). Figura 2A mostra epitélio bronquial de um galgo com doença espontânea. Antígeno de H3 viral foi detectado em citoplasma de célula epitelial bronquial e em macrófagos em lumens da via aérea e em espaços alveolares. Figura 2B mostra epitélio bronquial de um cão 5 dias após inoculação com A/canine/Florida/43/2004 (H3N8). Antígeno de H3 viral foi detectado em citoplasma de célula epitelial bronquial. Barra de escala, 66 μm.

[0025] Figura 3 mostra as alterações histológicas características nos brônquios de galgos que morreram de pneumonia hemorrágica associada à infecção do vírus de influenza. Os tecidos são tingidos com H&E. Painel superior: Brônquio normal com células epiteliais ciliadas, células mucosas, e células basais. Painel inferior: Brônquio de um galgo com influenza espontânea. Há necrose e erosão das células epiteliais ciliadas bronquiais. Barra de escala, 100 μm.

[0026] Figuras 4A-4B mostram relações filogenéticas entre os genes de hemaglutinina de H3. Figura 4A mostra uma árvore filogenética dos genes de HA do vírus de influenza canina com os genes de HA eqüinos contemporâneos e mais velhos. Figura 4B mostra uma árvore filogenética da proteína de HA do vírus de influenza canina com o HA eqüino contemporâneo e mais velho. Árvores filogenéticas foram deduzidas de seqüências genéticas ou de aminoácido pelo método de junção de vizinho e valores de análise de autocarregador >80 % são mostrados. A barra denota o número de alterações de aminoácido por comprimento de unidade das ramificações de árvores horizontais.

[0027] Figura 5 mostra proteína de H3 do vírus de influenza em células epiteliais de brônquios e glândulas bronquiais em pulmões de cães que morreram de pneumonia associada à infecção do vírus de influenza. Painéis superiores: Erosão de células epiteliais bronquiais ciliadas nos brônquios. Tecidos foram tingidos com H&E. Painéis inferiores: proteína de H3 do vírus de influenza nas células epiteliais de citoplasma bronquial (esquerda) e glândula bronquial (direito). Tecidos foram tingidos com um anticorpo monoclonal para influenza H3 detectado através de reação de imunoperoxidase (precipitado marrom) e contra-tingimento com hematoxilina.

[0028] Figuras 6A-6D mostram diagramas de amplificação de genes H3 e Matriz (Figura 6A e Figura 6B) obtidos da amplificação de padrões de RNA transcritos serialmente diluídos 10 vezes in vitro. Curvas padrão de genes H3 e Matriz (Figura 6C e Figura 6D) construídas representando em gráfico o log de concentrações de RNA de partida contra o ciclo de limiar (Ct) obtido de cada diluição.

[0029] Figura 7 mostra sensibilidade de Directigen Flu A foi testada com matérias-primas de vírus serialmente diluídas 10 vezes incluindo A/Wyoming/3/ 2003 e A/canine/FL/242/2003. O triângulo roxo indica resultado positivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

[0030] SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PB2 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0031] SEQ ID NO: 2 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 1.

[0032] SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PB1 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0033] SEQ ID NO: 4 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 3.

[0034] SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0035] SEQ ID NO: 6 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 5.

[0036] SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NS que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0037] SEQ ID NO: 8 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 7.

[0038] SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NP que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0039] SEQ ID NO: 10 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 9.

[0040] SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0041] SEQ ID NO: 12 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 11.

[0042] SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de MA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0043] SEQ ID NO: 14 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 13.

[0044] SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de HA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0045] SEQ ID NO: 16 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 15.

[0046] SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PB2 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0047] SEQ ID NO: 18 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 17.

[0048] SEQ ID NO: 19 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PB1 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0049] SEQ ID NO: 20 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 19.

[0050] SEQ ID NO: 21 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0051] SEQ ID NO: 22 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 21.

[0052] SEQ ID NO: 23 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NS que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0053] SEQ ID NO: 24 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 23.

[0054] SEQ ID NO: 25 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NP que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0055] SEQ ID NO: 26 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 25.

[0056] SEQ ID NO: 27 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0057] SEQ ID NO: 28 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 27.

[0058] SEQ ID NO: 29 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de MA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0059] SEQ ID NO: 30 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 29.

[0060] SEQ ID NO: 31 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de HA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0061] SEQ ID NO: 32 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 31.

[0062] SEQ ID NO: 33 é a forma madura da proteína de HA mostrada na SEQ ID NO: 16 em que a seqüência de sinal de aminoácido 16 N-terminal foi removida.

[0063] SEQ ID NO: 34 é a forma madura da proteína de HA mostrada na SEQ ID NO: 32 em que a seqüência de sinal de aminoácido 16 N-terminal foi removida.

[0064] SEQ ID NO: 35 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0065] SEQ ID NO: 36 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0066] SEQ ID NO: 37 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0067] SEQ ID NO: 38 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0068] SEQ ID NO: 39 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0069] SEQ ID NO: 41 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0070] SEQ ID NO: 42 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0071] SEQ ID NO: 43 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0072] SEQ ID NO: 44 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0073] SEQ ID NO: 45 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0074] SEQ ID NO: 46 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[0075] SEQ ID NO: 47 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PB2 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0076] SEQ ID NO: 48 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 47.

[0077] SEQ ID NO: 49 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PB1 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0078] SEQ ID NO: 50 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 49.

[0079] SEQ ID NO: 51 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0080] SEQ ID NO: 52 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 51.

[0081] SEQ ID NO: 53 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NS que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0082] SEQ ID NO: 54 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 53.

[0083] SEQ ID NO: 55 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NP que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0084] SEQ ID NO: 56 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 55.

[0085] SEQ ID NO: 57 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0086] SEQ ID NO: 58 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 57.

[0087] SEQ ID NO: 59 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de MA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0088] SEQ ID NO: 60 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 59.

[0089] SEQ ID NO: 61 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de HA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0090] SEQ ID NO: 62 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 61.

[0091] SEQ ID NO: 63 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PB2 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0092] SEQ ID NO: 64 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 63.

[0093] SEQ ID NO: 65 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PB1 que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0094] SEQ ID NO: 66 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 65.

[0095] SEQ ID NO: 67 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0096] SEQ ID NO: 68 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 67.

[0097] SEQ ID NO: 69 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NS que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[0098] SEQ ID NO: 70 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 69.

[0099] SEQ ID NO: 71 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NP que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[00100] SEQ ID NO: 72 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 71.

[00101] SEQ ID NO: 73 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[00102] SEQ ID NO: 74 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 73.

[00103] SEQ ID NO: 75 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de MA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[00104] SEQ ID NO: 76 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 75.

[00105] SEQ ID NO: 77 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus de influenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de HA que pode ser usada de acordo com a presente invenção.

[00106] SEQ ID NO: 78 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID NO: 77.

[00107] SEQ ID NO: 79 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00108] SEQ ID NO: 80 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00109] SEQ ID NO: 81 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00110] SEQ ID NO: 82 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00111] SEQ ID NO: 83 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00112] SEQ ID NO: 84 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00113] SEQ ID NO: 85 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00114] SEQ ID NO: 86 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00115] SEQ ID NO: 87 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

[00116] SEQ ID NO: 88 é um oligonucleotídeo que pode ser usado de acordo com a presente invenção.

REVELAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00117] Trata-se a invenção em questão do vírus de influenza isolado que é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias. Em uma modalidade, um vírus de influenza da invenção compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo compreende a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante das mesmas. Vírus de influenza da presente invenção pode ter um subtipo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, e H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, ou H16 ou um subtipo de NA de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, OU N9. Em uma modalidade específica, um vírus de influenza da presente invenção é um subtipo H3. Vírus pode ser isolado de cães infectados e cultivado em células ou ovos de acordo com os métodos descritos aqui. Em uma modalidade exemplificada, o vírus de influenza é um vírus de influenza A.

[00118] Trata-se a invenção em questão dos polinucleotídeos que compreendem todo ou parte de um gene ou genes ou um segmento genômico de um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidade, um polinucleotídeo da invenção compreende um gene de hemaglutinina de influenza (HA), gene de neuraminidase (NA), gene de nucleoproteína (NP), gene de proteína de matriz (MA ou M), gene de proteína de polimerase básica (PB), gene de proteína de polimerase acídica (PA), gene de proteína não-estrutural (NS), ou um fragmento funcional ou variante de qualquer um destes genes. Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo da invenção compreende o gene de hemaglutinina (HA), ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Em uma modalidade adicional, o gene de HA codifica uma proteína de hemaglutinina que tem um ou mais dos seguintes: uma serina na posição 83; uma leucina na posição 222; uma treonina na posição 328; e/ou uma treonina na posição 483, versus a seqüência de aminoácido de seqüência eqüina de H3 consenso. Em uma modalidade, o gene de HA codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 16, 32, 62, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o gene de HA compreende uma seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 15, 31, 61, ou 77.

[00119] Em uma modalidade, um polinucleotídeo da invenção codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Desse modo, a invenção em questão refere-se às seqüências de polinucleotídeo que compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77. Em uma modalidade adicional específica, um polinucleotídeo da invenção pode compreender: Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 3; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 5; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 7; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 9; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 11; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 13; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 15; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 19; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 21; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 23; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 25; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 29; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 31; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 47; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 49; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 51; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 53; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 55; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 57; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 59; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 61; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 63; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 65; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 67; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 69; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 71; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 73; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 75; e Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 77. Seqüências de nucleotídeo e de aminoácido de seqüências virais de polinucleotídeo e de polipeptídeo contempladas dentro do escopo da presente invenção foram também depositadas com os acessos de GenBank N DQ124147 a DQ124161 e DQ124190, a revelação destas é incorporada aqui por referência.

[00120] Trata-se a invenção em questão também dos polipeptídeos codificados por polinucleotídeos de um vírus de influenza da presente invenção. Trata-se a invenção em questão também dos fragmentos funcionais e/ou imunogênicos e variantes dos polipeptídeos em questão. Polipeptídeos contemplados incluem proteína de HA, proteína de NA, proteína de NS, nucleoproteína, proteína básica de polimerase, proteína acídica de polimerase, e proteína de matriz de um vírus de influenza da invenção. Em uma modalidade exemplificada, um polipeptídeo da invenção tem uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas.

[00121] Trata-se a invenção em questão também das construtos de expressão de polinucleotídeo que compreendem uma seqüência de polinucleotídeo da presente invenção. Em uma modalidade, um construto de expressão da invenção compreende uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78 compreende a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Desse modo, trata-se a invenção em questão das construtos de expressão que compreendem uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77. Em uma modalidade preferida, um construto de expressão da presente invenção provê sobreexpressão de um polinucleotídeo da invenção operavelmente ligado.

[00122] Construtos de expressão da invenção em geral incluem elementos reguladores que são funcionais na célula hospedeira intencionada na qual o construto de expressão é para ser expressado. Desse modo, uma pessoa de habilidade usual na técnica pode selecionar elementos reguladores para uso, por exemplo, em células hospedeiras humanas, células hospedeiras mamíferas, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras bacterianas, e células hospedeiras de planta. Em uma modalidade, os elementos reguladores são os que são funcionais em células caninas. Elementos reguladores incluem os promotores, seqüências de terminação de transcrição, seqüências de terminação de translação, intensificadores, e elementos de poliadenilação. Como aqui usado, o termo "construto de expressão" refere-se a uma combinação de seqüências de ácido nucléico que provêem transcrição de uma seqüência de ácido nucléico operavelmente ligada. Como aqui usado, o termo "operavelmente ligado" refere-se a uma justaposição dos componentes descritos em que os componentes estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira intencionada. Em geral, componentes operavelmente ligados estão em relação contígua.

[00123] Um construto de expressão da invenção pode compreender uma seqüência de promotor operavelmente ligada a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção. Os promotores podem ser incorporados em um polinucleotídeo usando técnicas padrão conhecidas na técnica. Múltiplas cópias de promotores ou múltiplos promotores podem ser usados em um construto de expressão da invenção. Em uma modalidade preferida, um promotor pode ser posicionado em volta da mesma distância do sítio de começo de transcrição no construto de expressão como é do sítio de começo de transcrição em seu ambiente genético natural. Alguma variação nesta distância é permitida sem diminuição substancial na atividade do promotor. Um sítio de começo de transcrição é tipicamente incluso no construto de expressão.

[00124] Preferivelmente, o promotor associado a um construto de expressão da invenção provê sobreexpressão de um polinucleotídeo da invenção operavelmente ligado.

[00125] Promotores para uso com um construto de expressão da invenção em células eucarióticas podem ser de origem viral ou celular. Promotores virais incluem, mas não são limitados a, promotores de gene de citomegalovírus (CMV), promotores de SV40 precoces ou tardios, ou promotores de gene do vírus de sarcoma Rous (RSV). Promotores de origem celular incluem, mas não são limitados a, promotor de gene de desmina e promotor de gene de actina. Promotores adequados para o uso com um construto de expressão da invenção em células de levedura incluem, mas não são limitados a, promotor de 3-fosfoglicerato cinase, promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, promotor de metalotioneína, promotor de álcool desidrogenase-2, e promotor de hexocinase.

[00126] Se o construto de expressão vier a ser fornecido ou introduzido em uma célula de planta, então promotores virais de planta, tais como, por exemplo, um vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 35S (incluindo o promotor de 35S de CaMV intensificado (vide, por exemplo patente U. S. No 5.106.739 e An, 1997)) ou um promotor de 19S de CaMV pode ser usado. Outros promotores que podem ser usados paro construtos de expressão em plantas incluem, por exemplo, promotor de prolifera, promotor de Ap3, promotores de choque térmico, 1’ ou 2’- promotor de T-DNA de A. tumefaciens, promotor de poligalacturonase, promotor de chalcona A sintase (CHS-A) de petúnia, promotor de PR- 1a de tabaco, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de gene de alcA, promotor de pin2 (Xu et al., 1993), promotor de WipI de milho, promotor de gene de trpA de milho (Patente U. S. No 5.625.136), promotor de gene de CDPK de milho, e promotor de SSU de RUBISCO (Patente U. S. No 5.034.322) podem também ser usados. Promotores raiz-específicos, tais como quaisquer uma das seqüências de promotor descritas na Patente U. S. No 6.455.760 ou patente U. S. No 6.696.623, ou nos pedidos de patente publicados U. S. Nos 20040078841; 20040067506; 20040019934; 20030177536; 20030084486; ou 20040123349, pode ser usado com um construto de expressão da invenção. Promotores constitutivos (tais como o promotor de CaMV, ubiquitina, actina, ou de NOS), os promotores de maneira desenvolvida regulados, e os promotores induzíveis (tais como aqueles promotores que podem ser induzidos por calor, luz, hormônios, ou químicas) são também contemplados para o uso com construtos de expressão de polinucleotídeo da invenção. Promotores tecido-específicos, por exemplo os promotores fruta-específicos, tais como o promotor de E8 de tomate (número de acesso: AF515784; Good et al. (1994)) podem também ser usados. Promotores semente-específicos tais como o promotor de um gene de β-faseolina (por exemplo, de feijão roxo) ou um gene de glicinina (por exemplo, de feijão-soja), e similares, podem também ser usados.

[00127] Para expressão em sistemas procarióticos, um construto de expressão da invenção pode compreender os promotores tais como, por exemplo, promotor de fosfatase alcalina, promotor de triptofano (trp), promotor de lambda PL, promotor de lactamase, promotor de lactose, promotor de phoA, promotor de T3, promotor de T7, ou promotor de tac (de Boer et al., 1983).

[00128] Construtos de expressão da invenção podem opcionalmente conter uma seqüência de terminação de transcrição, uma seqüência de terminação de translação, uma seqüência que codifica um peptídeo sinal, e/ou elementos intensificadores. Regiões de terminação de transcrição podem tipicamente ser obtidas da região não-transladada de 3’ de uma seqüência de gene eucariótico ou viral. Seqüências de terminação de transcrição podem estar posicionadas a jusante de uma seqüência de codificação para prover terminação eficiente. Uma seqüência de peptídeo sinal é uma seqüência de aminoácido curta tipicamente presente no término amino de uma proteína que é responsável pela recolocação de um polipeptídeo maduro operavelmente ligado a uma gama extensiva de destinos celulares pós- translacionais, variando de um compartimento de organela específico a sítios de ação de proteína e o ambiente extracelular. Produtos de gene alvejantes para um destino celular e/ou extracelular intencionado através do uso de uma seqüência de peptídeo sinal operavelmente ligada são contemplados para o uso com os polipeptídeos da invenção. Intensificadores clássicos são elementos de ação cis que aumentam a transcrição de gene e podem também ser incluídos no construto de expressão. Elementos intensificadores clássicos são conhecidos na técnica, e incluem, mas não são limitados a, elemento intensificador de CaMV 35S, elemento intensificador de promotor prematuro de citomegalovírus (CMV), e elemento intensificador de SV40. Elementos intensificadores mediados por íntron que intensificam a expressão de gene são também conhecidos na técnica. Estes elementos devem estar presentes dentro da região transcrita e devem ser dependente da orientação.

[00129] Seqüências de DNA que direcionam a poliadenilação de mRNA transcrita do construto de expressão podem também ser incluídas no construto de expressão, e incluem, mas não são limitadas a, um sinal de octopina sintase ou de nopalina sintase.

[00130] Construtos de expressão podem também incluir um ou genes marcadores selecionáveis mais dominantes, incluindo, por exemplo, genes que codificam resistência a antibióticos e/ou resistência a herbicidas para selecionar células transformadas. Genes de resistência a antibióticos podem prover resistência a um ou mais dos antibióticos a seguir: higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina, paromomicina, neomicina, e espectinomicina. Resistência à canamicina pode ser fornecida através de neomicina fosfotransferase (NPT II). Genes de resistência a herbicidas podem prover resistência a fosfinotricina acetiltransferase ou glifosato. Outros marcadores usados para triagem de transformação celular incluem, mas não são limitados a, genes que codificam β-glucuronidase (GUS), β- galactosidase, luciferase, nopalina sintase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), proteína de fluorescência verde (GFP), ou GFP intensificada (Yang et al., 1996).

[00131] Trata-se a invenção em questão também dos vetores de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídeo da invenção. Sítios únicos da enzima de restrição podem ser incluídos nas terminações de 5’ e 3’ de um construto de expressão ou polinucleotídeo da invenção para permitir inserção em um vetor de polinucleotídeo. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a qualquer elemento genético, incluindo por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, cromossomos, fago, vírus, e outros que são capazes de replicação quando associados aos elementos de controle apropriados e que podem transferir seqüências de polinucleotídeo entre as células. Vetores contêm uma seqüência de nucleotídeo que permite o vetor replicar em uma célula hospedeira selecionada. Vários vetores estão disponíveis para expressão e/ou clonagem, e incluem, mas não são limitados a, pBR322, série de pUC, série de M13, série de pGEM, e vetores de pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA e Promega, Madison, WI).

[00132] Trata-se a invenção em questão também do oligonucleotídeo e iniciadores, tais como iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR) que podem hibridar com a uma seqüência de codificação ou não-codificação de um polinucleotídeo da presente invenção. Sondas de oligonucleotídeo da invenção podem ser usadas nos métodos para detectar seqüências de ácido nucléico do vírus de influenza. Iniciadores de oligonucleotídeo da invenção podem ser usados nos métodos de PCR e outros métodos que envolvem amplificação de ácido nucléico. Em uma modalidade preferida, uma sonda ou iniciador da invenção pode hibridar com um polinucleotídeo da invenção sob condições rigorosas. Sondas e iniciadores da invenção podem opcionalmente compreender uma marcação detectável ou molécula repórter, tais como moléculas fluorescentes, enzimas, metade radioativa, e outros. Sondas e iniciadores da invenção podem ser de qualquer comprimento adequado para o método ou ensaio em que eles estão sendo empregados. Tipicamente, as sondas e iniciadores da invenção serão 10 a 500 ou mais nucleotídeos em comprimento. As sondas e iniciadores que são 10 a 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90, 91 a 100, ou 101 ou mais nucleotídeos em comprimento são contemplados dentro do escopo da invenção. Em uma modalidade, sondas e iniciadores são de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos em comprimento. As sondas e iniciadores da invenção podem ter identidade de seqüência de nucleotídeo total (100 %) com a seqüência de polinucleotídeo, ou a identidade de seqüência pode ser menor que 100 %. Por exemplo, identidade de seqüência entre uma sonda ou iniciador e uma seqüência pode ser 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % ou qualquer outra identidade de seqüência de porcentagem contanto que a sonda ou iniciador possam hibridar sob condições rigorosas com uma seqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da invenção. Sondas e iniciadores exemplificados da invenção incluem aqueles tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, e SEQ ID NO: 46, ou um fragmento funcional ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 35-46.

[00133] Como aqui usado, os termos "ácido nucléico", "polinucleotídeo", e "oligonucleotídeo" referem-se a um deoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo, ou um polímero de deoxirribonucleotídeo e de ribonucleotídeo misturado na forma uni ou bifilamentar, e a menos que do contrário limitado, abrangeria análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que podem funcionar de uma maneira similar como os nucleotídeos de ocorrência natural. Seqüências de polinucleotídeo incluem a seqüência de filamento de DNA que pode ser transcrita no RNA e o filamento de RNA que pode ser transladado na proteína. A seqüência complementar de qualquer ácido nucléico, polinucleotídeo, ou oligonucleotídeo da presente invenção é também contemplada dentro do escopo da invenção. Seqüências de polinucleotídeo também incluem tanto as seqüências de comprimento total como também as seqüências mais curtas derivadas das seqüências de comprimento total. A invenção em questão também abrange aqueles polinucleotídeos que são complementares em seqüência aos polinucleotídeos revelados aqui. Polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser fornecidos na forma purificada ou isolada.

[00134] Por causa da degeneração do código genético, uma variedade de seqüências de polinucleotídeo diferentes pode codificar um polipeptídeo da presente invenção. Uma tabela mostrando todos possíveis códons trigêmeos (e onde U também representa T) e o aminoácido codificado por cada códon é descrita em Lewin (1985). Além disso, está bem dentro da habilidade de uma pessoa treinada na técnica criar seqüências de polinucleotídeo alternativas que codificam os mesmo, ou essencialmente o mesmo, polipeptídeos da invenção em questão. Estas seqüências de polinucleotídeo variantes degeneradas e alternativas estão dentro do escopo da invenção em questão. Como aqui usado, referências a "essencialmente a mesma" seqüência refere- se às seqüências que codificam substituições, deleções, adições, ou inserções de aminoácido que não alteram materialmente a atividade funcional e/ou imunogênica do polipeptídeo codificado pelos polinucleotídeos da presente invenção.

[00135] Trata-se a invenção em questão também das variantes dos polinucleotídeos da presente invenção codificando os polipeptídeos da invenção. Seqüências variantes incluem aquelas seqüências em que um ou mais nucleotídeos da seqüência foram substituídos, deletados, e/ou inseridos. Os nucleotídeos que podem ser substituídos por nucleotídeos naturais de DNA têm uma metade de base que pode incluir, mas não é limitada a, inosina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, hipoxantina, 1-metilguanina, 5-metilcitosina, e base tritilada. A metade de açúcar do nucleotídeo em uma seqüência pode também ser modificada e inclui, mas não é limitada a, arabinose, xilulose, e hexose. Além disso, a base de adenina, citosina, guanina, timina, e uracila dos nucleotídeos pode ser modificada com grupos acetila, metila, e/ou tio. Seqüências que contêm as substituições, deleções, e/ou inserções de nucleotídeo podem ser preparadas e testadas usando técnicas padrão conhecidas na técnica.

[00136] Substituição de aminoácidos diferentes daqueles especificamente exemplificados ou naturalmente presentes em um polipeptídeo da invenção é também contemplada dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, aminoácidos não-naturais podem ser substituídos pelos aminoácidos de um polipeptídeo, desde que o polipeptídeo tendo os aminoácidos substituídos retenha substancialmente a mesma atividade funcional que o polipeptídeo em que os aminoácidos não foram substituídos. Exemplos de aminoácidos não-naturais incluem, mas não são limitados a, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homosserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-amino butírico, ácido Y-amino butírico, ácido ε-amino hexanóico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cistéico, T-butilglicina, T-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β- alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetistas tais como, - aminoácidos de β-metila, aminoácidos de C-metila, aminoácidos de N- metila, e análogos de aminoácido em geral. Aminoácidos não-naturais também incluem aminoácidos tendo grupos laterais derivatizados. Além disso, quaisquer dos aminoácidos na proteína podem ser da forma D (dextrorrtatório) ou da forma L (levorrotatório). Variantes alélicas de uma seqüência de proteína de um polipeptídeo da presente invenção são também abrangidas dentro do escopo da invenção.

[00137] Aminoácidos podem ser em geral categorizados nas classes a seguir: não-polar, polar descarregado, básico, e acídico. Substituições conservadoras por meio das quais um polipeptídeo da presente invenção que tem um aminoácido de uma classe é substituído com outro aminoácido da mesma classe estão incluídos dentro do escopo da invenção em questão contanto que o polipeptídeo que ainda tem a substituição retenha substancialmente a mesma atividade funcional que o polipeptídeo que não tem a substituição. Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo tendo uma ou mais substituições de aminoácido na seqüência são contemplados dentro do escopo da presente invenção. Tabela 11 abaixo fornece uma listagem de exemplos de aminoácidos que referem-se a cada classe. Abreviações de aminoácido de letra minúscula são definidas na Tabela 12.

[00138] Fragmentos e variantes de polipeptídeos de vírus de influenza da presente invenção podem ser gerados usando métodos padrão conhecidos na técnica e testados quanto à presença de função ou imunogenicidade usando técnicas padrão conhecidas na técnica. Por exemplo, para testar fragmentos e/ou variantes de um polipeptídeo de neuraminidase da invenção, a atividade enzimática pode ser ensaiada. Desse modo, um artesão normalmente versado pode facilmente preparar e testar fragmentos e variantes de um polipeptídeo da invenção e determinar se o fragmento ou variante retém atividade com relação ao polipeptídeo de comprimento total ou um não-variante.

[00139] Polinucleotídeos e polipeptídeos contemplados dentro do escopo da invenção em questão podem também ser definidos em termos de faixas identidade e/ou similaridade mais particulares com aquelas seqüências da invenção especificamente exemplificadas aqui. A identidade de seqüência tipicamente será maior que 60 %, preferivelmente maior que 75 %, mais preferivelmente maior que 80 %, até mesmo mais preferivelmente maior que 90 %, e pode ser maior que 95 %. A identidade e/ou similaridade de uma seqüência pode ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % quando comparada a uma seqüência exemplificada aqui. A menos que do contrário especificado, como aqui usado percentual de identidade e/ou similaridade de seqüência de duas seqüências pode ser determinado usando o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), modificado como em Karlin e Altschul (1993). Um tal algoritmo é incorporado no programa NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990). Pesquisas de BLAST podem ser executadas com o programa de NBLAST, contagem = 100, comprimento de palavra = 12, para obter as seqüências com o percentual de identidade de seqüência desejado. Para obter alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997). Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros predefinidos dos respectivos programas (NBLAST e XBLAST) podem ser usados. Vide sítio de rede de NCBI/NIH.

[00140] A invenção em questão também contempla aquelas moléculas de polinucleotídeo que têm seqüências que são suficientemente homólogas com as seqüências de polinucleotídeo exemplificadas aqui para permitir hibridação com aquela seqüência sob condições rigorosas padrão e métodos padrão (Maniatis et al., 1982). Como aqui usado, condições "rigorosas" para hibridação referem-se às condições em que hibridação é tipicamente realizada durante à noite a 20-25°C abaixo da temperatura de fundição (Tm) do DNA híbrido em 6x SSPE, solução de 5x Denhardt, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A temperatura de fundição, Tm, é descrita pela fórmula a seguir (Beltz et al., 1983): Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41(% G+C) - 0,61 (% formamida)- 600/ comprimento do dúplex nos pares de base.

[00141] Lavagens são tipicamente realizadas como segue: (1) Duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos em 1x SSPE, 0,1 % SDS (lavagem de severidade baixa). (2) Uma vez em Tm -20°C durante 15 minutos em 0,2x SSPE, 0,1 % SDS (lavagem de severidade moderada).

[00142] Trata-se a invenção em questão também das proteínas virais e peptídeos codificados pelos genes de um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidade, a proteína viral é uma proteína de HA madura. Em uma modalidade específica, a proteína de HA madura compreende um ou mais dos seguintes: uma serina na posição 82; uma leucina na posição 221; uma treonina na posição 327; e/ou uma treonina na posição 482. Em uma modalidade exemplificada, a proteína de HA madura tem uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante da SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34. Em outra modalidade, a proteína viral é uma proteína de NA, proteína de NS, proteína de PB, proteína de PA, ou proteína de MA. As proteínas virais e peptídeos da invenção podem ser usados para gerar anticorpos que especificamente ligam à proteína ou peptídeo. Proteínas virais e peptídeos da presente invenção podem também ser usados como imunógenos e em composições de vacina.

[00143] Trata-se a invenção em questão também das composições e métodos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza que é capaz de infectar um animal hospedeiro suscetível e causar doença das vias respiratórias. A invenção pode ser usada para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza de qualquer subtipo em um animal hospedeiro suscetível. Por exemplo, o vírus de influenza pode ser um subtipo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, ou H16, e um subtipo de NA de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, ou N9. Em uma modalidade, o subtipo de HA é H3 ou H5. Em uma modalidade adicional, o subtipo de NA é N7 ou N8. Em uma modalidade específica, uma resposta imune é induzida contra um vírus de influenza de subtipo H3N8. Em uma modalidade, o animal hospedeiro é um canídeo. Caninos incluem caninos selvagens, de jardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes, e raposas. Caninos também incluem cães, particularmente cães domésticos, tais como, por exemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães de exposição, cães de trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda, cães policiais, cães de corrida, e/ou cães de laboratório. Em uma modalidade específica, o animal hospedeiro é um cão domesticado, tal como um galgo. Em uma modalidade, um animal é administrado com uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção suficiente para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da invenção. A resposta imune pode ser uma resposta imune humoral e/ou celular. Em uma modalidade específica, a resposta imune é uma resposta imune protetora que é capaz de impedir ou minimizar infecção viral no animal hospedeiro imunizado durante algum período de tempo subseqüente à imunização. Desse modo, trata-se a invenção em questão também de vacina e métodos que podem proporcionar a um animal vacinado uma resposta imune protetora para um vírus da presente invenção.

[00144] Como descrito aqui, a vacina ou composições imunogênicas da invenção em questão podem compreender vírus inteiro livre de célula, incluindo vírus atenuado ou inativado, ou porções do vírus, incluindo partículas de subvírion (incluindo "vacina fendida" em que um virion é tratado para remover alguns ou todos os lipídios virais), proteínas virais (incluindo proteínas individuais e complexos macromoleculares de proteínas múltiplas), polipeptídeos, e peptídeos, como também linhagens celulares infectadas por vírus, ou uma combinação de qualquer um destes. Vacina ou composições imunogênicas que compreendem linhagens celulares infectadas por vírus podem compreender linhagens celulares múltiplas, cada uma infectada com uma cepa viral diferente.

[00145] Em uma modalidade da invenção, um canino pode ser imunizado com um ou mais vacinas do vírus de influenza inativado (isto é, morto) e/ou atenuado vivo ou vacinas que compreendem um ou uma multiplicidade de antígenos do vírus de influenza de um ou mais isolados virais. Em uma modalidade, o vírus de influenza é um vírus de influenza canina. Em outra modalidade, o vírus de influenza é um vírus de influenza eqüina que codifica ou expressa um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou 97 %, ou 98 %, ou 99 % ou mais identidade de seqüência de aminoácido com um polipeptídeo de vírus de influenza canina. Em uma modalidade, um antígeno de influenza usado em uma vacina da presente invenção tem pelo menos cerca de 96 % identidade de seqüência com um antígeno de HA e/ou antígeno de NA de um vírus de influenza canina.

[00146] Um exemplo de uma vacina inativada é EQUICINE II® que foi comercializada por Intervet Inc. (Millsboro, DE, USA) como uma vacina líquida. EQUICINE II® contém vírus de influenza de A/Pennsylvania/63 inativado ("A/Pa/63") e vírus de influenza de A/eqüino/Kentucky/93 ("A/KY/93") com carbopol (isto é, HAVLOGEN® (Intervet Inc.)). Mais especificamente, uma dose de EQUICINE II® contém: A/Pa/63 inativado a 106.0 EID50, A/KY/93 inativado a 106.7 EID50, 0,25 % em volume de carbopol, e PBS suficiente para criar um volume total de 1 ml.

[00147] Outro exemplo de uma vacina inativada é vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03 ("Ohio 03"). Em algumas modalidades, uma tal vacina contém CARBIGEN® que é um adjuvante com base em polímero emulsificado comercialmente disponível de MVP Laboratories, Inc. (Ralston, NE). Em tais vacinas, uma unidade de dosagem tipicamente compreende pelo menos cerca de 250 unidades de HA do vírus, de cerca de 250 a cerca de 12.500 unidades de HA do vírus, ou de cerca de 1000 a cerca de 6200 unidades de HA do vírus. A concentração recomendada de CARBIGEN® é de cerca de 5 a cerca de 30 % (em massa).

[00148] Um exemplo de uma vacina atenuada viva é influenza de eqüino/ Kentucky/91 ("A/KY/91") modificada viva na forma de uma vacina secada por congelamento que pode ser reconstituída com água. Em algumas modalidades, esta reconstituição é conduzida usando água do tipo vacina suficiente para trazer a dosagem de vacina para um volume total de 1 ml. Aspectos de tais vacinas são debatidos, por exemplo, nas Patentes U. S. Nos 6.436.408; 6.398.774; e 6.177.082, que são incorporadas por referência em sua totalidade nesta patente. Quando reconstituída, uma dose de uma tal vacina pode, por exemplo, conter A/KY/91 a 107,2 TCID50 por ml, 0,015 grama de N-Z AMINE AS® por ml, 0,0025 grama de gelatina por ml, e 0,04 grama de lactose D por ml. N- Z AMINE AS® é uma fonte refinada de aminoácidos e peptídeos produzida por hidrólise enzimática de caseína. N-Z AMINE AS® é comercializada por Bio-Science de Kerry (Norwich, NY, USA).

[00149] Em uma modalidade preferida, a vacina compreende um antígeno de influenza de H3 que tem pelo menos cerca de 93 % de homologia com Florida/43/2004 nas seqüências de codificação de HA, tais como, por exemplo, a cepa de eqüino/New Market/79. Homologia preferida é pelo menos cerca de 96 %, tais como, por exemplo, as cepas de eqüino/Alaska/1/91 e eqüino/Santiago/85. Nos exemplos que seguem, os antígenos de influenza eqüino/Kentucky/91, eqüino- 2/Kentucky/93, eqüino-1/Pennsylvania/63, e eqüino Ohio/03 foram incorporados nas vacinas. Vacinas preferidas também incluem vacinas que compreendem eqüino/Wisconsin/03, eqüino/Kentucky/02, eqüino/Kentucky/93, e eqüino/New Market 2/93. Nos exemplos que seguem, os vírus de H3N8 foram usados. Porém, é acreditado que outros vírus de influenza de H3 possam ser usados de acordo com esta invenção.

[00150] Vacinas atenuadas vivas podem ser preparadas através de meios convencionais. Tais meios em geral incluem, por exemplo, modificar as cepas patogênicas por passagem in vitro, adaptação ao frio, modificação da patogenicidade do organismo através de manipulação genética, preparação de quimeras, inserção de antígenos em vetores virais, seleção de cepas do tipo selvagem não-virulentas, etc.

[00151] Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é derivada por passagem serial do vírus do tipo selvagem através da cultura de células, animais de laboratório, animais não-hospedeiros, ou ovos. A acumulação de mutação genética durante tal(is) passagem(ns) tipicamente leva à perda progressiva de virulência do organismo para o hospedeiro original.

[00152] Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é preparada por co-infecção de células permissíveis com um vírus mutante atenuado e vírus patogênico. O vírus recombinante resultante desejado tem a segurança do vírus atenuado com genes que codificam para antígenos protetores do vírus patogênico.

[00153] Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é preparada por adaptação ao frio. Um vírus adaptado ao frio tem uma vantagem de replicar-se apenas na temperatura encontrada no trato respiratório superior. Um método de geração de um vírus de influenza eqüina adaptado ao frio foi descrito na Patente U. S. No 6.177.082. Um vírus adaptado ao frio resultante desejado confere um ou mais dos fenótipos a seguir: adaptação ao frio, sensibilidade à temperatura, interferência dominante, e/ou atenuação.

[00154] Em algumas modalidades, a cepa do vírus atenuado vivo é preparada através de meios moleculares, tais como mutação, deleção, ou inserção de ponto para converter um vírus patogênico em um vírus não-patogênico ou menos-patogênico comparado ao vírus original, ao mesmo tempo preservando as propriedades protetoras do vírus original.

[00155] Em algumas modalidades, o vírus atenuado vivo é preparado clonando o candidato de genes de antígenos protetores em um genoma de um vírus não-patogênico ou menos-patogênico ou outro organismo.

[00156] Vacinas de vírus inativado (isto é, "morto") podem ser preparadas inativando o vírus usando métodos convencionais. Tipicamente, tais vacinas incluem excipientes que podem intensificar uma resposta imune, como também outros excipientes que são convencionalmente usados nas vacinas. Por exemplo, nos exemplos que seguem, EQUICINE II® compreende HAVLOGEN®. Inativação do vírus pode ser realizada tratando o vírus com químicas de inativação (por exemplo, formalina, propiolactona beta ("BPL"), bromoetilamina ("BEA"), e etilenimina binária ("BEI")) ou através de métodos não- químicos (por exemplo, calor, congelamento/descongelamento, ou sonicação) para incapacitar a capacidade de replicação do vírus.

[00157] Nos exemplos que seguem, eqüino/Ohio/03 foi usado como um vírus de desafio. É conhecido ter cerca de 99 % de homologia com o isolado Florida/43/04, e foi mostrado para induzir sintomas de infecção e soroconversão em cães. Exemplo 18 ilustra a eficácia da vacina de influenza eqüina em cães, mostrando inibição de titulações de hemaglutinação (ou "HI" ou "HAI") em cães vacinados com antígeno de Ohio 03 inativado em uma composição de vacina compreendendo adjuvante de CARBIGEN®. Tabela 29 mostra pré-vacinação, pós- vacinação, e pós-segunda vacinação de titulações, como também pós- desafio. Os resultados indicam titulações de HI em cada pós-vacinação de estágio para os cães vacinados, com pequeno ou nenhum aumento para controles. Tabela 30 ilustra os sinais clínicos, isolamento de vírus e os resultados de histopatologia do mesmo estudo. Embora animais desafiados não mostrassem sinais clínicos, eliminações do vírus, ou histopatologia positiva, as titulações de HI positivas (Tabela 29) indicam titulações de anticorpo significativas em animais imunizados.

[00158] Deveria ser observado que outras vacinas de antígeno de vírus de influenza de H3 são abrangidas por esta invenção também. Aquelas descritas neste relatório descritivo e nos exemplos a seguir são fornecidas para ilustrar a invenção e suas modalidades preferidas, e não limitar o escopo da invenção reivindicada.

[00159] Deve também ser observado que antígenos de influenza diferentes de antígenos de vírus de influenza de H3 podem ser usados de acordo com esta invenção. Tais antígenos incluem, por exemplo, aqueles de eqüino/PA/63 que é um subtipo de eqüino A1 (H7N7). É contemplado que um ou mais de tais antígenos possam ser usados com ou sem um ou mais antígenos de influenza de H3.

[00160] Em geral, a vacina é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para induzir uma resposta protetora no paciente canino contra o vírus alvo. Tipicamente, uma dosagem é "terapeuticamente eficaz" se impedir, reduzir o risco, retardar o princípio, reduzir a expansão, melhorar, suprimir, ou erradicar a influenza ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) de seus sintomas. Sintomas de influenza típicos incluem, por exemplo, febre (para cães, tipicamente; > 39,4°C (> 103,0°F)), tosse, espirro, lesões histopatológicas, secreção ocular, secreção nasal, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, entalo, hemoptise, e/ou estertores audíveis. Outros sintomas freqüentemente mais severos podem incluir, por exemplo, hemorragia nos pulmões, mediastino, ou cavidade pleural; traqueíte; bronquite; bronquiolite; broncopneumonia suportiva; e/ou infiltração do forro epitelial e lumens das vias aéreas dos pulmões com neutrófilos e/ou macrófagos.

[00161] A vacina pode ser administrada como parte de uma terapia de combinação, isto é, uma terapia que inclui, além da própria vacina, administrando um ou mais agentes ativos adicionais, adjuvantes, terapias, etc. Naquela circunstância, deveria ser reconhecido que a quantidade de vacina que constitui uma quantidade "terapeuticamente eficaz" pode ser menor que a quantidade de vacina que constituiria uma quantidade "terapeuticamente eficaz" se a vacina fosse administrada sozinha. Outras terapias podem incluir aquelas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, medicações antivirais, analgésicos, medicações redutoras de febre, expectorantes, medicações de anti- inflamação, anti-histamínicos, antibióticos para tratar infecção bacteriana que resulta da infecção por vírus de influenza, repouso, e/ou administração de fluidos. Em algumas modalidades, a vacina desta invenção é administrada em combinação com uma vacina de bordetella, vacina de adenovírus, e/ou vacina do vírus de parainfluenza.

[00162] Em algumas modalidades, por exemplo, uma dose típica para uma vacina atenuada viva é pelo menos cerca de 103 pfu/canino, e mais tipicamente de cerca de 103 a cerca de 109 pfu/canino. Nesta patente, "pfu" significa "unidades de formação de placa". Em algumas modalidades, uma dose típica para uma vacina atenuada viva é pelo menos cerca de 103 TCID50/canino, e mais tipicamente de cerca de 103 a cerca de 109 TCID50/canino. Em algumas modalidades, uma dose típica para uma vacina atenuada viva é pelo menos cerca de 103 EID50/canino, e mais tipicamente de cerca de 103 a cerca de 109 EID50/canino. Em algumas modalidades, uma dose típica para uma vacina morta é pelo menos cerca de 40 unidades de HA, tipicamente de cerca de 40 a cerca de 10.000 unidades de HA, e mais tipicamente de cerca de 500 a cerca de 6200 unidades de HA. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 6100 a cerca de 6200 unidades de HA.

[00163] Em algumas modalidades preferidas, a vacina compreende uma vacina atenuada viva a uma concentração que é pelo menos cerca de 100,5 pfu/canino maior que o nível de imunogenicidade. Em algumas modalidades preferidas, a vacina compreende uma vacina atenuada viva a uma concentração que é pelo menos cerca de 100,5 TCID50/canino maior que o nível de imunogenicidade. Em algumas modalidades preferidas, a vacina compreende uma vacina atenuada viva a uma concentração que é pelo menos cerca de 100,5 EID50/canino maior que o nível de imunogenicidade.

[00164] O nível de imunogenicidade pode ser determinado experimentalmente através de técnicas de estudo de titulação de dose de desafio em geral conhecidas na técnica. Tais técnicas tipicamente incluem vacinar vários caninos com a vacina em dosagens diferentes, e depois desafiar os caninos com o vírus virulento para determinar a dose de proteção mínima.

[00165] Fatores que afetam o regime de dosagem preferido podem incluir, por exemplo, o tipo (por exemplo, espécies e raça), idade, peso, sexo, dieta, atividade, tamanho pulmonar, e condição do sujeito; a via de administração; a eficácia, segurança, e perfis de duração-de- imunidade da vacina particular usada; se um sistema de liberação é usado; e se a vacina é administrada como parte de um fármaco e/ou combinação de vacina. Desse modo, a dosagem de fato empregada pode variar para animais específicos, e, portanto, pode divergir acima das dosagens típicas expostas. Para determinar tais ajustes de dosagem está em geral dentro da habilidade daqueles na técnica usando meios convencionais. Deve também ser observado que vírus atenuados vivos são em geral autopropagadores; desse modo, a quantidade específica de um tal vírus administrado não é necessariamente crítica.

[00166] É contemplado que a vacina pode ser administrada ao paciente canino uma única vez; ou, alternativamente, duas ou mais vezes durante dias, semanas, meses, ou anos. Em algumas modalidades, a vacina é administrada pelo menos duas vezes. Em algumas tais modalidades, por exemplo, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose (por exemplo, o reforço) sendo administrada pelo menos cerca de 2 semanas após a primeira. Em algumas modalidades, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose sendo administrada não maior que 8 semanas após a primeira. A segunda dose é administrada de cerca de 2 semanas a cerca de 4 anos após a primeira dose em algumas modalidades, de cerca de 2 a cerca de 8 semanas após a primeira dose, ou de cerca de 3 a cerca de 4 semanas após a primeira dose. Em algumas modalidades, a segunda dose é administrada cerca de 4 semanas após a primeira dose. Nas modalidades acima, a primeira e dosagens subseqüentes podem variar, tais como, por exemplo, em quantidade e/ou forma. Freqüentemente, porém, as dosagens são iguais para a quantidade e forma. Quando apenas uma dose única for administrada, a quantidade de vacina naquela dose sozinha em geral compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina. Porém, quando mais de uma dose for administrada, as quantidades de vacina naquelas doses podem juntas constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00167] Em algumas modalidades, a vacina é administrada antes do recipiente canino ter sido infectado com influenza. Em tais modalidades, a vacina pode, por exemplo, ser administrada para impedir, reduzir o risco, ou tardar o princípio de influenza ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) sintomas de influenza.

[00168] Em algumas modalidades, a vacina é administrada após o recipiente canino ser infectado com influenza. Em tais modalidades, a vacina pode, por exemplo, melhorar, suprimir, ou erradicar a influenza ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) sintomas de influenza.

[00169] A composição preferida da vacina depende, por exemplo, se a vacina é uma vacina inativada, vacina atenuada viva, ou ambas. Isto também depende do método de administração da vacina. É contemplado que a vacina compreenderá um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, adjuvantes, outros intensificadores de resposta imune, e/ou veículos (coletivamente referidos como "excipientes"). Tais excipientes são em geral selecionados para ser compatíveis com o(s) ingrediente(s) ativo(s) na vacina. Uso de excipientes é em geral conhecido àqueles versados na técnica.

[00170] O termo "farmaceuticamente aceitável" é adjetivamente usado para significar que o substantivo modificado é apropriado para o uso em um produto farmacêutico. Quando for usado, por exemplo, para descrever um excipiente em uma vacina farmacêutica, o excipiente caracteriza como sendo compatível com os outros componentes da composição e não desvantajosamente deletério ao canino recipiente intencionado.

[00171] As vacinas podem ser administradas através de meios convencionais, incluindo, por exemplo, administração mucosa, (tais como intranasal, oral, intratraqueana, e ocular), e administração parenteral. Administração mucosa é freqüentemente em particular vantajosa para vacinas atenuadas vivas. Administração parenteral é freqüentemente particularmente vantajosa para vacinas inativadas.

[00172] Vacinas mucosas podem ser, por exemplo, formas de dosagem líquida, tais como emulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Excipientes adequados para tais vacinas incluem, por exemplo, diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, água, solução salina, dextrose, glicerol, lactose, sucrose, pó de amido, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ésteres de alquila de celulose, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e de cálcio de ácidos fosfóricos e sulfúricos, gelatina, goma acácia, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, e/ou poliálcool vinílico. Excipientes adicionais podem compreender vários agentes intumescentes, emulsificantes, suspensores, condimentos (por exemplo, adocicantes), e/ou aromatizantes.

[00173] Vacinas mucosas orais também podem, por exemplo, ser formadas em comprimidos ou encapsuladas para administração conveniente. Tais cápsulas ou comprimidos podem conter uma formulação de liberação controlada. No caso de cápsulas, comprimidos, e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes tamponantes, tais como citrato de sódio, ou carbonato ou bicarbonato de magnésio ou de cálcio. Comprimidos e pílulas podem ser adicionalmente preparadas com revestimentos entéricos.

[00174] É contemplado que a vacina pode ser administrada por meio de água potável e/ou alimento do paciente canino. É também contemplado que a vacina pode ser administrada na forma de um medicamento ou brinquedo.

[00175] "Administração parenteral" inclui injeções subcutâneas, injeções submucosais, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções intraesternais, injeções transcutâneas, e infusão. Preparações injetáveis (por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis) podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando excipientes adequados, tais como veículos, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e/ou agentes de suspensão. Estes tipicamente incluem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, óleo de milho, óleo de caroço de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, álcool benzílico, álcool benzílico, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, solução de cloreto de sódio isotônica, óleos fixos insípidos (por exemplo, mono- ou diglicerídeos sintéticos), ácidos graxos (por exemplo, ácido oléico), dimetil acetamida, tensoativos (por exemplo, detergentes iônicos e não-iônicos), propileno glicol, e/ou polietileno glicóis. Excipientes adicionais podem incluir quantidades pequenas de outras substâncias auxiliares, tais como agentes tamponantes de pH.

[00176] A vacina pode incluir um ou mais excipientes que intensificam a resposta imune de um paciente canino (que pode incluir uma resposta de anticorpo, resposta celular, ou ambas), assim aumentando a eficácia da vacina. Uso de tais excipientes (ou "adjuvantes") pode ser particularmente benéfico quando usar uma vacina inativada. O(s) adjuvante(s) pode(m) ser uma substância que tem um efeito direto (por exemplo, citocina ou Bacillé Calmette-Guerin ("BCG")) ou indireto (lipossomas) nas células do sistema imune do paciente canino. Exemplos de adjuvantes freqüentemente adequados incluem óleos (por exemplo, óleos minerais), sais metálicos (por exemplo, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio), componentes bacterianos (por exemplo, lipossacarídeos bacterianos, adjuvantes de Freund, e/ou MDP), componentes de planta (por exemplo, Quil A), e/ou uma ou mais substâncias que têm um efeito de veículo (por exemplo, bentonita, partículas de látex, lipossomas, e/ou Quil A, ISCOM). Como observado acima, adjuvantes adicionais incluem, por exemplo, CARBIGEN® e carbopol. Deveria ser reconhecido que esta invenção abrange tanto as vacinas compreendendo um/uns adjuvante(s), como também vacinas que não compreendem nenhum adjuvante.

[00177] É contemplado que a vacina pode ser secada por congelamento (ou do contrário reduzida em volume líquido) para armazenamento, e depois reconstituída em um líquido antes ou na hora da administração. Tal reconstituição pode ser alcançada usando, por exemplo, água do tipo de vacina.

[00178] A presente invenção também compreende kits que são adequados para uso na execução dos métodos descritos acima. O kit compreende uma forma de dosagem compreendendo uma vacina descrita acima. O kit também compreende pelo menos um componente adicional, e, tipicamente, instruções para usar a vacina com o(s) componente(s) adicional(is). O(s) componente(s) adicional(is) pode(m), por exemplo, ser um ou mais componentes adicionais (tais como, por exemplo, um ou mais dos excipientes, alimento, e/ou um medicamento debatidos acima) que possa ser misturado com a vacina antes ou durante a administração. O(s) componente(s) adicional(is) pode(m) alternativamente (ou adicionalmente) compreender um ou mais aparelhos para administrar a vacina ao paciente canino. Um tal aparelho pode ser, por exemplo, uma seringa, inalador, nebulizador, pipeta, fórceps, ou qualquer veículo de liberação medicalmente aceitável. Em algumas modalidades, o aparelho é adequado para administração subcutânea da vacina. Em algumas modalidades, o aparelho é adequado para administração intranasal da vacina.

[00179] Outros excipientes e modos de administração conhecidos nas técnicas farmacêuticas ou biológicas podem também ser usados.

[00180] A vacina ou composições imunogênicas da invenção em questão também abrangem construtos baseadas em vetor viral recombinante que podem compreender, por exemplo, genes que codificam proteína de HA, proteína de NA, nucleoproteína, proteína básica de polimerase, proteína acídica de polimerase, e/ou proteína de matriz de um vírus de influenza da presente invenção. Qualquer vetor viral adequado que possa ser usado para preparar um constructo de vetor/vírus recombinante é contemplado para o uso com a invenção em questão. Por exemplo, vetores virais derivados de adenovírus, avipox, herpesvírus, vacínia, canaripox, entomopox, suinopox, vírus do Nilo Ocidental e similares conhecidos na técnica podem ser usados com as composições e métodos da presente invenção. Vetores de polinucleotídeo recombinante que codificam e expressam componentes podem ser construídos usando técnicas de engenharia genética padrões conhecidas na técnica. Além disso, as várias composições de vacina descritas aqui podem ser usadas separadamente e em combinação entre si. Por exemplo, imunizações primárias de um animal podem usar construtos baseados em vetor recombinante, tendo componentes de cepa simples ou múltiplas, seguido por aumentos secundários com as composições de vacina compreendendo vírus inativado ou linhagens celulares infectadas por vírus inativado. Outros protocolos de imunização com as composições de vacina da invenção são evidentes às pessoas versadas na técnica e são contemplados dentro do escopo da presente invenção.

[00181] Trata-se a invenção em questão também dos vírus rearranjado compreendendo pelo menos um gene ou segmento genômico de um vírus de influenza da presente invenção e o restante dos genes virais ou segmentos genômicos de um vírus de influenza diferente da invenção ou de um vírus de influenza diferente de um vírus da presente invenção. Vírus rearranjado pode ser produzido para rearranjo genético de ácido nucléico de um vírus de influenza de doador da presente invenção com ácido nucléico de um vírus de influenza de recipiente e depois selecionando o vírus rearranjado compreendendo o ácido nucléico do vírus de doador. Métodos para produzir e isolar vírus rearranjado são bem conhecidos na técnica (Fields et al., 1996). Em uma modalidade, um vírus rearranjado da invenção compreende genes ou segmentos genômicos de um vírus de influenza humana, aviária, suína, ou eqüina. Um vírus rearranjado da presente invenção pode incluir qualquer combinação de ácido nucléico do vírus de influenza de doador e recipiente contanto que o vírus rearranjado compreenda pelo menos um gene ou segmento genômico de um vírus de influenza de doador da presente invenção. Em uma modalidade, um vírus de influenza de recipiente pode ser um vírus de influenza eqüina.

[00182] Polipeptídeos naturais, recombinantes ou sintéticos de proteínas virais, e seus fragmentos de peptídeo, podem também ser usados como composições de vacina de acordo com os métodos em questão. Em uma modalidade, uma composição de vacina compreende um polinucleotídeo ou um polipeptídeo de um vírus de influenza canina. Em uma modalidade, uma composição de vacina compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Em uma modalidade específica adicional, um polinucleotídeo da invenção pode compreender: Nucleotídeos 12271 da SEQ ID NO: 3; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 5; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 7; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 9; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 11; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 13; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 15; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 19; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 21; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 23; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 25; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 29; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 31; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 47; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 49; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 51; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 53; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 55; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 57; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 59; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 61; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 63; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 65; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 67; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 69; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 71; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 73; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 75; e Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 77. Em outra modalidade, uma composição de vacina compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade adicional, uma composição de vacina compreende um polinucleotídeo ou um polipeptídeo de um vírus de influenza eqüina em que o polinucleotídeo ou polipeptídeo tem pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou 97 %, ou 98 %, ou 99 % ou mais identidade de seqüência com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de influenza canina. Em uma modalidade, polipeptídeos virais derivados de cepas múltiplas podem ser combinados em uma composição de vacina e podem ser usados para vacinar um animal hospedeiro. Por exemplo, os polipeptídeos com base na proteína de HA viral de pelo menos duas cepas diferentes do vírus de influenza da invenção podem ser combinados na vacina. Os polipeptídeos podem ser homólogos a uma cepa ou podem compreender polipeptídeos "híbridos" ou "quiméricos" cuja seqüência de aminoácido é derivada de unir ou ligar polipeptídeos de pelo menos duas cepas distintas. Procedimentos para preparar polipeptídeos virais são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, polipeptídeos e peptídeos virais podem ser sintetizados usando métodos de síntese de fase sólida (Merrifield, 1963). Polipeptídeos e peptídeos virais podem também ser produzidos usando técnicas de DNA recombinantes em que uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma proteína ou peptídeo viral é expressado em uma célula hospedeira, tais como bactéria, levedura, ou linhagens celulares mamíferas, e a proteína expressa purificada usando técnicas padrão da técnica.

[00183] Composições de vacina da presente invenção também incluem composições de ácido nucléico desprotegidas. Em uma modalidade, um ácido nucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um HA e/ou uma proteína de NA de um vírus de influenza da presente invenção. Métodos para vacinação de ácido nucléico são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes U. S. Nos 6.063.385 e 6.472.375. O ácido nucléico pode ser na forma de um plasmídeo ou um cassete de expressão de gene. Em uma modalidade, o ácido nucléico é fornecido encapsulado em um lipossoma que é administrado a um animal.

[00184] Composições de vacina e imunógenos, tais como polipeptídeos e ácidos nucléicos que podem ser usados de acordo com a presente invenção podem ser fornecidas com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Compostos e composições úteis na invenção em questão podem ser formulados de acordo com os métodos conhecidos para preparar as composições farmaceuticamente úteis. As formulações são descritas em detalhes em várias fontes que são bem conhecidas e facilmente disponíveis àqueles versados na técnica. Por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Science por E. W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19a ed., 1995, descreve formulações que podem ser usadas com relação à invenção em questão. Em geral, as composições da invenção em questão serão formuladas de modo que uma quantidade eficaz de um imunógeno seja combinada com um veículo adequado para facilitar a administração eficaz da composição. As composições usadas nos métodos presentes podem também ser em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem sólidas, semi-sólidas, e líquidas, tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções líquidas ou suspensão, supositórios, soluções injetáveis e infusíveis, e pulverizações. A forma preferida depende do modo intencionado de administração e aplicação terapêutica. As composições também preferivelmente incluem veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis convencionais que são conhecidos àqueles versados na técnica. Exemplos de veículos ou diluentes para o uso com os peptidomiméticos em questão incluem, mas não são limitados a, água, solução salina, óleos incluindo óleo mineral, etanol, sulfóxido de dimetila, gelatina, ciclodextranas, estearato de magnésio, dextrose, celulose, açúcares, carbonato de cálcio, glicerol, alumina, amido, e veículos e diluentes equivalentes, ou misturas de qualquer um destes. Formulações de um imunógeno da invenção podem também compreender agentes de suspensão, protetores, lubrificantes, tampões, conservantes, e estabilizantes. Para prover a administração de tais dosagens para o tratamento terapêutico desejado, as composições farmacêuticas da invenção vantajosamente compreenderão entre cerca de 0,1 % e 45 %, e especialmente, 1 e 15 % em peso do imunógeno ou imunógenos com base no peso da composição total incluindo veículo ou diluente.

[00185] A vacina e composições imunogênicas da invenção em questão podem ser preparadas por procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a vacina ou imunógenos são tipicamente preparados como injetáveis, por exemplo, soluções líquidas ou suspensões. A vacina ou imunógenos são administrados de uma maneira que sejam compatíveis com a formulação de dosagem, e em tal quantidade como será terapeuticamente eficaz e imunogênica no recipiente. As dosagens ótimas e padrões de administração para uma vacina particular ou formulação de imunógenos podem ser determinadas facilmente por uma pessoa versada na técnica.

[00186] Peptídeos e/ou polipeptídeos da presente invenção podem também ser fornecidos na forma de um constructo de peptídeo antigênico múltiplo (MAP). A preparação de construtos de MAP foi descrita em Tam (1988). Construtos de MAP utilizam uma matriz de núcleo de resíduos de lisina sobre os quais múltiplas cópias de um imunógeno são sintetizadas (Posnett et al., 1988). Construtos de MAP múltiplos, cada um contendo os mesmos imunógenos ou diferentes, podem ser preparados e administrados em uma composição de vacina de acordo com os métodos da presente invenção. Em uma modalidade, um constructo de MAP é fornecido e/ou administrado com um ou mais adjuvantes. Polipeptídeos de influenza da invenção podem também ser produzidos e administrados como estruturas de proteína macromolecular compreendendo um ou mais polipeptídeos. Pedido de Patente Publicado U. S. US2005/0009008 descreve métodos para produzir partículas semelhantes a vírus como uma vacina para vírus de influenza.

[00187] De acordo com os métodos da invenção em questão, a vacina e composições imunogênicas aqui descritas são administradas a hospedeiros suscetíveis, tipicamente canídeos, e mais tipicamente cães domesticados, de uma quantidade e maneira eficazes para induzir imunidade protetora contra desafio subseqüente ou infecção do hospedeiro pelo vírus. Em uma modalidade, o animal hospedeiro é um canídeo. Caninos incluem caninos selvagens, de jardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes, e raposas. Caninos também incluem cães, particularmente cães domésticos, tais como, por exemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães de exposição, cães de trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda, cães policiais, cães de corrida, e/ou cães de laboratório. Em uma modalidade específica, o animal hospedeiro é um cão domesticado, tal como um galgo. As vacinas ou imunógenos são tipicamente administrados parenteralmente, através de injeção, por exemplo, ou subcutânea, intraperitoneal ou intramuscularmente. Outros modos adequados de administração incluem administração oral ou nasal. Usualmente, as vacinas ou imunógenos são administrados a um animal pelo menos duas vezes, com um intervalo de uma ou mais semanas entre cada administração. Porém, outros regimes são contemplados para as administrações iniciais e de reforço da vacina ou imunógenos, e podem depender do julgamento do médico e do animal hospedeiro particular sendo tratado.

[00188] Vírus e células infectadas por vírus em uma formulação de vacina podem ser inativados ou atenuados usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, vírus inteiro e células infectadas podem ser inativados ou atenuados mediante exposição a paraformaldeído, formalina, propiolactona beta (BPL), bromoetilamina (BEA), etilenimina binária (BEI), fenol, luz UV, temperatura elevada, congelamento - descongelamento, sonicação (incluindo ultra-sonicação), e similares. A quantidade de vírus inteiro livre de célula em uma dose de vacina pode ser na faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 mg, e mais usualmente é de cerca de 0,2 mg a cerca de 2 mg. A dosagem para formulações de vacina que compreendem linhagens celulares infectadas por vírus usualmente conterá de cerca de 106 a cerca de 108 células por dose, e mais usualmente de cerca de 5 x 106 a cerca de 7,5 x 107 células por dose. A quantidade de proteína ou imunógeno de peptídeo em uma dose para um animal pode variar de cerca de 0,1 μg a 10000 μg, ou cerca de 1 μg a 5000 μg, ou cerca de 10 μg a 1000 μg, ou cerca de 25 μg a 750 μg, ou cerca de 50 μg a 500 μg, ou 100 μg a 250 μg, dependendo do tamanho, idade, etc., do animal recebendo a dose.

[00189] Uma composição imunogênica ou de vacina da invenção, tal como vírus ou células infectadas por vírus ou proteínas ou peptídeos virais, pode ser combinada com um adjuvante, tipicamente só antes da administração. Adjuvantes contemplados para o uso nas formulações de vacina incluem dipeptídeo de muramila de treonila (MDP) (Byars et al., 1987), saponina, Cornebacterium parvum, adjuvante completo de Freund e incompleto de Fruend, alumínio, ou uma mistura de qualquer um destes. Uma variedade de outros adjuvantes adequados para o uso com os métodos e vacinas da invenção em questão, tais como alume, é bem conhecida na técnica e é contemplada para o uso com a invenção em questão.

[00190] Trata-se a invenção em questão também dos anticorpos que especificamente ligam a uma proteína ou um peptídeo da presente invenção. Anticorpos da invenção em questão incluem composições de anticorpos monoclonais e policlonais. Preferivelmente, os anticorpos da invenção em questão são anticorpos monoclonais. Anticorpos inteiros e fragmentos de ligação de antígenos dos mesmos são contemplados na presente invenção. Desse modo, por exemplo, fragmentos de ligação de antígenos adequados incluem fragmentos de anticorpo de Fab2, Fab e Fv. Anticorpos da invenção podem ser marcados com uma metade detectável, tais como uma molécula fluorescente (por exemplo, fluoresceína ou uma enzima).

[00191] Trata-se a invenção em questão também dos métodos e composições para detecção e identificação de um vírus de influenza da invenção e para diagnose de infecção de um animal com um vírus de influenza da presente invenção. Os métodos da invenção incluem detecção da presença de influenza canina, em uma amostra biológica de um animal. A detecção de influenza canina em uma amostra é útil para diagnosticar influenza canina em um animal. Por sua vez, esta informação pode fornecer a habilidade para determinar a prognose de um animal com base nos níveis distintivos de influenza canina presente com o passar do tempo, e pode ajudar na seleção de agentes e tratamentos terapêuticos para o animal, e ajudar no monitoramento da terapia. O método também fornece a habilidade para estabelecer a ausência de influenza canina em um animal testado.

[00192] A habilidade para detectar influenza canina em um animal permite avaliação das epidemias de influenza canina em localizações geográficas diferentes. Esta informação também permite detecção prematura de forma que os animais infectados possam ser isolados, limitar à expansão da doença, e permite intervenção prematura para opções de tratamento. Além disso, tendo esta informação disponível pode prover direção ao pessoal médico para preparar para tratar números grandes de animais doentes, incluindo montagem de materiais médicos, e, se disponíveis, vacinas.

[00193] Em uma modalidade, um método da presente invenção envolve a coletânea de uma amostra biológica de um animal de teste, tal como um canino. A amostra biológica pode ser qualquer material biológico, incluindo, células, tecido, cabelo, sangue total, soro, plasma, aspirado de mamilo, lavagem pulmonar, fluido cérebro-espinhal, saliva, suor e lágrimas.

[00194] A amostra de teste animal pode vir de um animal suspeito de ter vírus de influenza canina, se ou não o animal exibe sintomas da doença. Amostras de controle podem também ser fornecidas ou colhidas de animais conhecidos estarem livres de influenza canina. Controles adicionais podem ser fornecidos, por exemplo, para reduzir resultados falso-positivos e falso-negativos, e verificar quais os reagentes no ensaio são ativamente detectores de vírus de influenza canina A.

[00195] Além de detectar a presença ou ausência de influenza canina em uma amostra biológica, os métodos de detecção usados na invenção podem detectar mutações em vírus de influenza canina, tais como alterações na seqüência de ácido nucléico que podem ser o resultado do ambiente, tratamento de fármaco, manipulações ou mutações genéticas, lesão, alteração na dieta, envelhecimento, ou qualquer/quaisquer outra(s) característica(s) de um animal. Mutações podem também leva influenza canina A se tornar resistente a um fármaco que era antigamente eficaz, ou permitir o vírus infectar e propagar-se em uma espécie diferente de animal, ou ser humano. Por exemplo, vírus de influenza aviária A foi mostrado infectar outros animais e seres humanos.

[00196] Em uma modalidade para detectar um vírus de influenza em um animal, diagnose é facilitada pela coletânea de espécimes de alta qualidade, seu transporte rápido para uma facilidade de testagem, e armazenamento apropriado, antes da testagem em laboratório. O vírus é melhor detectado em espécimes que contêm células infectadas e secreções. Em uma modalidade, espécimes para a detecção direta de antígenos virais e/ou para ácidos nucléicos e/ou isolamento de vírus em culturas de célula são tiradas durante os 3 primeiros dias após o princípio dos sintomas clínicos. Vários tipos de espécimes são adequados para diagnosticar infecções de vírus do trato respiratório superior, incluindo, mas não limitados a, esfregaço nasal, esfregaço nasofaríngeo, aspirado nasofaríngeo, lavagem nasal e esfregaços da garganta. Além de esfregaços, amostras de tecido ou soro podem ser tiradas, e procedimentos invasivos podem também ser executados.

[00197] Em uma modalidade, espécimes respiratórios são colhidos e transportados em 1-5 ml de meios de transporte de vírus. Vários meios que são satisfatórios para o restabelecimento de uma ampla variedade de vírus estão comercialmente disponíveis. Espécimes clínicos são adicionados ao meio de transporte. Esfregaços nasais ou nasofaríngeos podem também ser transportados para o meio de transporte de vírus. Um exemplo de um meio de transporte é 10 gm de caldo de infusão de carne de vitela e 2 gm de fração de albumina bovina V, adicionados à água destilada estéril a 400 m. Antibióticos tais como 0,8 ml de solução de sulfato de gentamicina (50 mg/ml) e 3,2 ml de anfotericina B (250 μg/ml) podem também ser adicionados. O meio é preferivelmente esterilizado através de filtração. Lavagens nasais, tais como solução salina estéril (0,85 % de NaCl), podem também ser usadas para colher os espécimes de vírus respiratórios.

[00198] Em uma modalidade, os soros são colhidos em uma quantidade de 1-5 ml de sangue total de um animal de fase aguda, logo após o princípio dos sintomas clínicos, e preferivelmente não depois que 7 dias. Um espécime de soro de fase convalescente pode também ser colhido, por exemplo em cerca de 14 dias após o princípio dos sintomas. Espécimes de soro podem ser úteis para detectar anticorpos contra vírus respiratórios em um teste de neutralização.

[00199] Em algumas circunstâncias, as amostras podem ser colhidas durante um certo tempo de animais individuais (por exemplo, uma vez ao dia, uma vez por semana, uma vez por mês, bianual ou anualmente). Numerosas amostras podem ser usadas obtendo de um animal individual, durante um certo tempo, para verificar os resultados de detecções mais prematuras, e/ou identificar resposta ou resistência a um tratamento específico, por exemplo, um fármaco terapêutico selecionado.

[00200] Os métodos da presente invenção podem ser usados para detectar a presença de um ou mais agentes patológicos em uma amostra de teste de um animal, e o nível de cada agente patológico. Qualquer método para detectar o agente patológico pode ser usado, incluindo, mas não limitado a, ensaios de anticorpo incluindo ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), testes de anticorpo fluorescente indiretos (IFA), hemaglutinação, e ensaios de inibição de hemaglutinação (HI), e análise de Western blot. Métodos de célula-cultura conhecidos podem também ser usados. Culturas positivas podem ser também identificadas usando imunofluorescência de culturas de célula ou ensaio de HI do meio de cultura de célula (sobrenadante).

[00201] Além disso, os métodos para detectar ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína podem ser usados. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, reação em cadeia de polimerase (PCR), e testes de PCR de transcriptase reversa (RT) e testes de tempo real, e ensaios de proteção de nuclease quantitativos. Há kits de teste comercialmente disponíveis para executar estes ensaios. Por exemplo, QIAGEN (Valença, CA) vende um kit de RT-PCR de uma etapa, e kit de extração de RNA viral.

[00202] Em uma modalidade, o método utiliza um anticorpo específico para um vírus ou proteína viral da invenção. Em uma modalidade específica, um anticorpo específico para uma proteína de HA de um vírus da invenção é utilizado. Em outra modalidade, um anticorpo específico para uma proteína de NP de um vírus da invenção é usado. Uma amostra adequada, tal como da região nasal ou nasofaríngea, é obtida de um animal e vírus ou proteína viral é dele isolada(o). Os componentes virais são depois triados para ligação de um anticorpo específico a uma proteína, tal como HA ou NP, de um vírus da invenção. Em outra modalidade, uma amostra de soro (ou outra amostra contendo anticorpo) é obtida de um animal e o soro triado para a presença de anticorpo que liga a uma proteína de um vírus da invenção. Por exemplo, um ensaio de ELISA pode ser executado onde as paredes de placa têm proteína de HA e/ou de NP, ou um fragmento de peptídeo da mesma, ligado à parede. A parede de placa é depois contatada com soro ou anticorpo de um animal de teste. A presença de anticorpo no animal que especificamente liga à proteína de HA e/ou de NP é indicativa que o animal de teste é infectado ou foi infectado com um vírus de influenza da presente invenção.

[00203] Em uma modalidade, a presença de um agente patológico é detectada determinando a presença ou ausência de anticorpos contra o agente, em uma amostra biológica. Pode ocupar algum tempo (por exemplo, meses) após um animal seja infectado antes de pudessem ser detectados anticorpos em um exame de sangue. Uma vez formados, os anticorpos usualmente persistem por muitos anos, até mesmo após tratamento com sucesso da doença. Anticorpos encontrando para influenza canina UM pode não indicar se a infecção era recente, ou algum dia no passado.

[00204] Teste de anticorpo pode também ser feito em fluido(s). Ensaios de anticorpo incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), ensaios de anticorpo fluorescente indiretos (IFA), e análise de Western blot. Preferivelmente, teste de anticorpo é feito usando ensaios múltiplos, por exemplo, ELISA ou IFA seguido por western blot. Os ensaios de anticorpo podem ser feitos em um processo de duas etapas, usando um ensaio de ELISA ou IFA, seguido por um ensaio de western blot. ELISA é considerado um ensaio mais seguro e preciso que IFA, mas IFA pode ser usado se ELISA não estiver disponível. O teste de western blot (que é um teste mais específico) pode também ser feito em todos os animais, particularmente aqueles que foram testados positivos ou positivos incertos (equívocos) em um ensaio de ELISA ou de IFA.

[00205] Outros testes com base em anticorpo que podem ser usados para detecção de vírus de influenza incluem ensaios de inibição de hemaglutinação. Atividade de hemaglutinação pode ser detectada em uma amostra biológica de um animal, usando células sangüíneas vermelhas de galinha ou peru como descrito (Burleson et al., 1992 e Kendal et al., 1982). Em uma modalidade, uma influenza ou uma proteína de HA ou peptídeo da invenção é contatado(a) com uma amostra de teste contendo soro ou anticorpo. Células sangüíneas vermelhas (RBC) de um animal, tal como um pássaro, são depois adicionadas. Se o anticorpo para HA estiver presente, então as RBC não se aglutinarão. Se o anticorpo para HA não estiver presente, as RBC se aglutinarão na presença de HA. Variações e modificações para ensaios de inibição de hemaglutinação padrão são conhecidas na técnica e contempladas dentro do escopo da presente invenção.

[00206] Infecção de um animal pode também ser determinada por isolamento do vírus de uma amostra, tal como um esfregaço nasal ou nasofaríngeo. Isolamento viral pode ser executado usando métodos padrão, incluindo cultura de célula e inoculação de ovo.

[00207] Em uma modalidade adicional, um ensaio com base em ácido nucléico pode ser usado para detecção de um vírus da presente invenção. Em uma modalidade, uma amostra de ácido nucléico é obtida de um animal e o ácido nucléico submetidos à PCR usando iniciadores que gerarão um produto de amplificação se o ácido nucléico contiver uma seqüência específica para um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidade específica, RT-PCR é usado em um ensaio para o vírus em questão. Em uma modalidade exemplificada, RT-PCR de tempo real é usado para ensaiar um vírus de influenza da invenção. Métodos de PCR, RT-PCR e de PCR de tempo real são conhecidos na técnica e foram descritos nas Patentes U. S. Nos 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; 4.965.188; 5.994.056; 6.814.934; e em Saiki et al. (1985); Sambrook et al. (1989); Lee et al. (1993); e Livak et al. (1995). Em uma modalidade, o ensaio de PCR usa oligonucleotídeos específicos para um gene Matriz (MA) e/ou gene HA de influenza. O produto de amplificação pode ser também seqüenciado para determinar se o produto tem uma seqüência de um vírus de influenza da presente invenção. Outros ensaios com base em ácido nucléico podem ser usados para detecção e diagnose de infecção viral por um vírus da invenção e tais ensaios são contemplados dentro do escopo da presente invenção. Em uma modalidade, uma amostra contendo um ácido nucléico é submetida a uma amplificação baseada em PCR usando iniciadores diretos e reversos onde os iniciadores são específicos para um polinucleotídeo viral ou seqüência de gene. Se o ácido nucléico na amostra for RNA, então RT-PCR pode ser executada. Para PCR de tempo real, uma sonda detectável é utilizada com os iniciadores.

[00208] Conjuntos de iniciador específico para o gene de hemaglutinina (HA) de muitos dos vírus de influenza circulantes são conhecidos, e estão sendo desenvolvido continuamente. O genoma de vírus de influenza é RNA unifilamentar, e uma cópia de DNA (cDNA) deve ser feita usando uma polimerase de transcriptase reversa (RT). A amplificação do genoma de RNA, por exemplo, usando RT-PCR, requer um par de iniciadores de oligonucleotídeo, tipicamente projetado em base da seqüência de HA conhecida de subtipos de influenza A e de neuraminidase (NM)-1. Os iniciadores podem ser selecionados de modo que eles especificamente amplificarão o RNA de apenas um subtipo de vírus. DNAs gerados usando iniciadores subtipo-específicos podem ser também analisados por técnicas genéticas moleculares tais como seqüenciação. O teste é preferivelmente operado com um controle positivo, ou produtos são confirmados por seqüenciação e comparação com seqüências conhecidas. A ausência dos produtos de PCR alvos (isto é, um resultado "negativo") pode não descartar a presença do vírus. Resultados podem depois ser disponibilizados dentro de algumas horas de esfregaços clínicos ou culturas de células infectadas. Testes de PCR e RT- PCR para vírus de influenza A são descritos por Fouchier et al., 2000 e Maertzdorf et al., 2004.

[00209] Trata-se a invenção em questão também dos métodos para triar compostos ou fármacos que têm atividade antiviral contra um vírus da presente invenção. Em uma modalidade, células infectadas com um vírus da invenção são contatadas com um composto de teste ou fármaco. A quantidade de vírus ou atividade viral seguindo o contato é depois determinada. Aqueles compostos ou fármacos que exibem atividade antiviral podem ser selecionados para avaliação também.

[00210] Trata-se a invenção em questão também das células isoladas infectadas com um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidade, a célula é uma célula canina, tal como células epiteliais renais caninas.

[00211] Trata-se a invenção em questão também das células transformadas com um polinucleotídeo da presente invenção que codifica um polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeo é fornecida em um construto de expressão da invenção. Mais preferivelmente, o construto de expressão provê sobreexpressão na célula de um polinucleotídeo da invenção operavelmente ligado. Em uma modalidade, a célula é transformada com uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, a célula é transformada com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78 compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Desse modo, trata-se a invenção em questão das células transformadas com uma seqüência de polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.

[00212] A célula transformada pode ser uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de planta, incluindo protoplastos, ou a célula transformada pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana tal como E. coli ou B. subtilis. Células animais incluem células humanas, células mamíferas, células parcialmente caninas, células aviárias, e células de inseto. Células de planta incluem, mas não são limitadas a, células de dicotiledônea, monocotiledônea, e de conífera.

[00213] Trata-se a invenção em questão também das plantas, incluindo plantas transgênicas que expressam e produzem uma proteína viral ou polipeptídeo da presente invenção. Plantas, tecidos de planta, e células de planta transformadas ou criadas para conter um polinucleotídeo da invenção são contemplados pela presente invenção. Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção é sobre-expressado na planta, tecido de planta, ou célula de planta. As plantas podem ser usadas para produzir composições de vacina de influenza da presente invenção e as vacinas podem ser administradas através do consumo da planta (vide, por exemplo, patentes U. S. Nos 5.484.719 e 6.136.320).

[00214] Trata-se a invenção em questão também dos kits para detectar um vírus ou diagnosticar uma infecção por um vírus da presente invenção. Em uma modalidade, um kit compreende um anticorpo da invenção que especificamente liga a um vírus de influenza da presente invenção, ou uma porção antigênica do mesmo. Em outra modalidade, um kit compreende um ou mais polipeptídeos ou peptídeos da presente invenção. Em uma modalidade específica, os polipeptídeos têm uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma modalidade adicional, um kit compreende um ou mais polinucleotídeos ou oligonucleotídeos da presente invenção. Em uma modalidade específica, os polinucleotídeos têm uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante dos mesmos. Um kit pode opcionalmente compreender um ou mais anticorpo de controle, polipeptídeo ou peptídeo de controle, e/ou polinucleotídeo ou oligonucleotídeo de controle. O anticorpo, polipeptídeos, peptídeos, polinucleotídeos, e/ou oligonucleotídeos do kit podem ser fornecidos em um recipiente ou pacote adequado.

[00215] O pedido de patente em questão também refere-se ao uso de cães mestiços como um modelo para infecção e patogênese do vírus de influenza. Em uma modalidade, um cão mestiço é inoculado com um vírus de influenza, tal como um vírus de influenza canina da presente invenção. Opcionalmente, o cão pode ser administrado com agentes terapêuticos subseqüente à inoculação. O cão pode também ser administrado com uma composição para gerar uma resposta imune contra um vírus de influenza antes de inoculação com vírus. Tecido, sangue, soro, e outras amostras biológicas podem ser obtidas antes e/ou após inoculação e examinadas pela presença de vírus e patogênese de tecido usando métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, PCR, RT-PCR, seqüenciação de ácido nucléico, e imuno-histoquímica.

[00216] Cepas de vírus de influenza canina (designados como "A/canine/ Florida/43/2004" e "A/canine/Florida/242/2003") foram depositadas com American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, em 9 de outubro de 2006. Cepas de vírus de influenza canina (designados como "canine/Jax/05" e "canine/Miami/05"), foram depositadas com American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, em 17 de outubro de 2006. As cepas de vírus em questão foram depositadas sob condições que asseguram que acesso às culturas estarão disponíveis durante a pendência deste pedido de patente ao determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks a ser intitulado a este sob 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C. 122. O depósito estará disponível como requerido pelas leis de patentes estrangeiras em países nos quais as contrapartes do pedido de patente em questão, ou sua progênie, forem depositados. Porém, deveria ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em questão em derrogação dos direitos de patente concedidos por ação governamental.

[00217] Também, os depósitos do vírus em questão serão armazenados e ficarão disponíveis ao público de acordo com as providências do Tratado de Budapeste para o Depósito de Microorganismos, isto é, serão armazenados com todo o cuidado necessário para mantê-lo viável e incontaminado durante um período de pelo menos cinco anos após a mais recente solicitação para a provisão de uma amostra do depósito, e em todo caso, durante um período de pelo menos trinta (30) anos após a data de depósito ou para a vida exeqüível de qualquer patente que possa emitir a revelação da cultura. O depositante reconhece o dever de substituir o depósito se o depósito não prover uma amostra quando requerido, devido à condição do depósito. Todas as restrições na disponibilidade para o público do depósito de cultura em questão serão irrevogavelmente removidos na concessão de uma patente que a revela.

[00218] Tabela 57 ilustra as similaridades entre as seqüências de aminoácido codificadas pelos genes de hemaglutinina (ou "HA"), neuraminidase (ou "NA"), e nucleoproteína (NP) do vírus de influenza canina identificados como A/canine/Florida/43/2004 (Ca/Fla/43/04) com isolados de H3N8 eqüino, como também o isolado de canine/Florida/242/2003.

[00219] Qualquer elemento de qualquer modalidade revelada aqui pode ser combinado com qualquer outro elemento ou modalidade revelada aqui e tais combinações são especificamente contempladas dentro do escopo da presente invenção.

[00220] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidas ou citadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, desde que eles não sejam incompatíveis com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 1-6 COLETA DE SANGUE E DE ESFREGAÇO NASAL DE GALGOS.

[00221] Amostras de sangue agudas e convalescentes foram colhidas através de venipunctura jugular de galgos clinicamente doentes ou normais em canis de corrida que experimentam epidemias de doença das vias respiratórias. Amostras convalescentes foram colhidas 4 a 12 semanas após a amostra aguda. Soro foi colhido e armazenado a -80°C. Esfregaços nasais foram colhidos e colocados em meio de transporte de Amies com submissão pendente em carvão (Becton Dickinson Biosciences) para isolamento bacteriano.

AUTÓPSIA DE GALGOS.

[00222] Autópsias completas foram executadas pelo Serviço de Patologia Anatômico na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade da Flórida (UF CVM) em 5 dos 8 galgos que morreram pela epidemia de janeiro 2004 em uma pista da Flórida. Autópsia de outro cão foi executada em uma clínica veterinária privada com submissão dos tecidos a UF CVM para diagnose histopatológica. Tecidos foram fixados em 10 % de formalina tamponada neutra, embebida em parafina, e seções de 5 μm foram tingidas com hematoxilina e eosina para diagnose histopatológica ou processadas para Imuno-histoquímica como descrito abaixo. Tecidos não-fixados foram submetidos à cultura bacteriana e também armazenados a -80°C. TESTE SOROLÓGICOS PARA PATÓGENOS RESPIRATÓRIOS VIRAIS CANINOS.

[00223] Amostras de soro agudas e convalescentes pareadas foram submetidas ao Laboratório de Diagnóstico de Saúde de Animais (AHDL) na Faculdade de Medicina Veterinária da Universitária de Cornell para ensaios de neutralização de soro contra vírus de sinomose canina, adenovírus tipo 2, e vírus de parainfluenza. Titulações de anticorpo foram expressadas como a última diluição de soro que inibiu infecção viral das culturas de célula. Seroconversão, definida como um aumento > que 4 vezes em titulação de anticorpo entre a amostra aguda e convalescente, indicou infecção viral. Nenhuma seroconversão para estes patógenos virais foi detectada.

TESTES MICROBIANOS PARA PATÓGENOS RESPIRATÓRIOS BACTERIANOS CANINOS.

[00224] Esfregaços nasais e tecidos pós-morte pareados foram submetidos ao Serviço de Diagnóstico Clínico de Microbiologia/Parasitologia/ Sorologia na UF CVM para isolamento bacteriano e identificação. As amostras foram cultivadas em meios não- seletivos como também meios seletivos para espécies de Bordetella (Regan-Lowe; Remel) e espécies de Mycoplasma (Remel). Todas as culturas foram retidas durante 21 dias antes de relatar nenhum crescimento. Esfregaços nasais de alguns dos galgos foram também submetidos ao Departamento Diagnóstico de Medicina/Patobiologia na Faculdade de Medicina Veterinária da Universitária do Estado de Kansas para cultura bacteriana. De 70 cães doentes clinicamente testados, Bordetella bronchiosseptica foi isolada da cavidade nasal de 1 cão, enquanto Mycoplasma spp. foi restabelecido da cavidade nasal de 33 cães. Pasteurella multocida foi comumente restabelecido da cavidade nasal de cães com secreções nasais purulentas. Dois dos cães que morreram pela epidemia de janeiro de 2004 tiveram crescimento escasso de Escherichia coli na autópsia dos pulmões, um cão teve crescimento escasso de E. coli e Streptococcus canis, e o outro teve crescimento escasso de Pseudomonas aeruginosa e uma levedura. Nem Bordetella bronchiosseptica nem Mycoplasma foi isolado da traquéia ou pulmões de cães que morreram.

ISOLAMENTO DE VÍRUS DE TECIDOS PÓS-MORTE.

[00225] Tecidos congelados foram descongelados e homogeneizados em 10 volumes de meio de essencial mínimo (MEM) suplementado com 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos. Restos sólidos foram removidos por centrifugação e os sobrenadantes foram inoculados sobre células cultivadas ou em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade. Homogeneizados de tecido de galgos que morreram foram inoculados em culturas de célula diversas que suportaram a replicação de uma faixa vasta de patógenos virais. As culturas de célula incluíram Vero (células epiteliais de rim de macaco verde africano, ATCC No CCL-81), A-72 (fibroblastos de tumores caninos, CRL-1542), HRT-18 (células epiteliais retais humanas, CRL-11663), MDCK (células epiteliais renais caninas, CCL- 34), células epiteliais renais caninas primárias (AHDL, Universidade de Cornell), células epiteliais pulmonares caninas primárias (AHDL), e células testiculares bovinas primárias (AHDL). Células de MDCK e de HRT foram cultivadas em MEM suplementado com 2,5 ug/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma); as linhagens celulares restantes foram cultivadas em MEM suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal e antibióticos. Células foram crescidas em frascos de 25 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. Uma cultura de controle foi inoculada com o MEM suplementado. As culturas foram observadas diariamente quanto às alterações morfológicas e foram colhidas em 5 dias pós-inoculação. Os fluidos e células colhidos foram clarificados através de centrifugação e inoculados sobre células frescas como descrito para a inoculação inicial; duas passagens cegas foram executadas. Atividade de hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi determinada usando células sangüíneas vermelhas de galinha ou peru como descrito (Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982). Para isolamento do vírus em embriões de galinha, 0,1 ml de homogeneizado de tecido foi inoculado no saco alantóico e incubado durante 48 horas a 35°C. Duas passagens cegas na atividade de hemaglutinação nos fluidos alantóicos foram determinadas como descrito (Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982). RT-PCR, SEQÜENCIAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO, E ANÁLISES FILOGENÉTICAS.

[00226] RNA total foi extraído de sobrenadante de cultura de tecido ou fluido alantóico usando o kit de RNeasy (Qiagen, Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total (10 ng) foi transcrito reverso para cDNA usando um kit de RT-PCR de uma etapa (Qiagen, Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCR da região de codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previamente executada como descrito (Klimov et al., 1992a), usando conjuntos de iniciador gene-específico universais. Os amplicons de DNA resultante foram usados como modelos para seqüenciação automatizada em um seqüenciador de DNA automatizado de Applied Biosystems 3100 usando química de terminador de tintura de seqüenciação em ciclo (ABI). As seqüências de nucleotídeo foram analisadas usando GCG Package©, Versão 10.0 (Accelyrs) (Womble, 2000). O Phylogeny Inference Package© Versão 3.5 foi usado para estimar as filogenias e calcular os valores de autocarregador das seqüências de nucleotídeo (Felsenstein, 1989). Árvores filogenéticas foram comparadas às geradas mediante análise de junção de vizinhos com o modelo Tamura-Nei gama implementado no programa de MEGA© (Kumar et al., 2004) e confirmado pelo programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauer Associates).

INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL DOS CÃES.

[00227] Quatro Bigles livres de patógenos específicos de 6 meses de idade [(2 machos e 2 fêmeas (Liberty Research)] foram usados. Exame físico e exames de sangue de linha base incluindo contagem/diferencial de célula sangüínea completo, painel de química de soro, e urinálise determinaram quais animais eram saudáveis. Eles foram alojados juntos em uma instalação de BSL 2-reforçada credenciada pela Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidado de Animal de Laboratório. Temperaturas retais de linha base foram registradas duas vezes diariamente durante 7 dias. Os cães foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg do peso do corpo para efeito) para intubação com tubos endotraqueanos. Cada cão foi inoculado com uma dose total de 106,6 doses infecciosas de cultura de tecido mediana (TCID50) de vírus de A/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) (H3N8) com metade da dose administrada na traquéia distal através do tubo endotraqueano e a outra metade administrada na passagem nasal profunda através de um cateter. Exames físicos e registros de temperatura retal foram executados duas vezes diariamente durante 14 dias pós-inoculação (p.i.). Amostras de sangue (4 ml) foram colhidas através de venipunctura jugular nos dias 0, 3, 5, 7, 10, e 14 p.i. Espécimes nasais e orofaríngeos foram colhidos com esfregaços de poliéster (Fisher Scientific) de cada cão nos dias 0 a 5, 7, 10, e 14 p.i. Os esfregaços foram colocados em meio de transporte viral (Remel) e armazenados a -80°C. Dois cães (1 macho e 1 fêmea) foram eutanizados por inoculação intravenosa de solução de Beuthanasia-D® (1 mL/5 kg do peso do corpo; Schering-Plough Animal Health Corp) no dia 5 p.i. e os 2 cães restantes no dia 14 para autópsia. Tecidos para análise histológica foram processados como descrito. Tecidos para cultura de vírus foram armazenados a -80°C. Este estudo foi aprovado pelo University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee. PROPAGAÇÃO DO VÍRUS DE CÃES EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS.

[00228] Diluições seriais de homogeneizados pulmonares e extratos de esfregaço, preparadas por clarificação dos meios de transporte de esfregaço através de centrifugação, foram fixadas em MEM suplementado com 0,5 % de BSA e antibióticos. Ensaios de placa foram executados como descrito (Burleson et al., 1992) usando monocamadas de células de MDCK em placas de cultura de tecido de 6 cavidades. Monocamadas de células inoculadas foram revestidas com MEM suplementado contendo 0,8 % de agarose e 1,5 ug/mL de TPCK- tripsina. Células foram cultivadas durante 72 horas a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2 antes da fixação e tingimento com violeta cristal. Concentração do vírus foi expressada como unidades de formação de placa (PFU) por grama de tecido ou por esfregaço.

IMUNO-HISTOQUÍMICA.

[00229] Seções de tecido pulmonar de 5 μm desparafinizadas e reidratadas dos galgos e bigles foram montadas em lâminas de BondRite® (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) e subseqüentemente tratadas com proteinase K (DakoCytomation, Carpenteria, CA) seguido por reagente de bloqueio de peroxidase (Kit de Dako® EnVision® Peroxidase, Dako Corp.). As seções foram incubadas com diluições de 1:500 de anticorpos monoclonais para vírus de sinomose canina (VMRD, Inc.), adenovírus canino tipo 2 (VMRD, Inc.), vírus de parainfluenza canina (VMRD, Inc.), ou H3 de influenza A (Chemicon International, Inc.) durante 2 horas em temperatura ambiente. Controles incluíram incubação das mesmas seções com IgG de camundongo (1 mg/ml, Serotec, Inc.), e incubação dos anticorpos monoclonais com seções pulmonares caninas normais. Seguindo tratamento com os anticorpos primários, as seções foram incubadas com imunoperoxidase secundária e reagentes de substrato de peroxidase (Kit de Dako® EnVision® Peroxidase, Dako Corp.) de acordo com as instruções do fabricante. As seções foram contratingidas com hematoxilina, tratadas com Clarificador #2 e Reagente de Anil (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI), desidratadas, e lâminas de cobertura aplicadas com Permount (ProSciTech).

ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HI).

[00230] Amostras de soro foram incubadas com enzima destruidora de receptor (RDE, Denka) (1 parte de soro: 3 partes de RDE) durante 16 horas a 37°C antes da inativação a calor durante 60 minutos a 56°C. Vírus de influenza A/Canine/FL/04 (H3N8) foi crescido em células de MDCK por 36-48 h a 37°C. Os sobrenadantes de cultura de vírus foram colhidos, clarificados através de centrifugação, e armazenados a -80°C. O ensaio de HI foi executado como previamente descrito (Kendal et al., 1982). Brevemente, 4 unidades de hemaglutinação de vírus foram adicionadas em 25 μl a um volume igual de soro serialmente diluído em cavidades de microtitulação e incubados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Um volume igual de 0,5 % v/v de eritrócitos de peru foi adicionado e as titulações de hemaglutinação foram estimadas visualmente após 30 minutos. A titulação de HI de ponto terminal foi definida como a última diluição de soro que completamente inibiu a hemaglutinação. Seroconversão foi definida como o aumento > 4 vezes na titulação de HI entre amostras agudas e convalescentes pareadas. Soropositividade de uma amostra simples foi definida como uma titulação de anticorpo de HI > 1:32.

ENSAIO DE MICRONEUTRALIZAÇÃO (MN).

[00231] Respostas de anticorpo de soro neutralizante para A/Canine/FL/04 (H3N8) foram detectadas por um ensaio de MN como previamente descrito (Rowe et al., 1999) exceto que os soros caninos foram tratados com RDE como descrito acima antes do ensaio. A titulação de ponto terminal foi definida como a diluição mais alta de soro que deu 50 % de neutralização de 100 TCID50 de vírus. Seroconversão foi definida como aumento > 4 vezes em titulação de MN entre as amostras agudas e convalescentes pareadas. Soropositividade de uma amostra simples foi definida como uma titulação de MN > 1:80.

[00232] A seguir são exemplos que ilustram os procedimentos para praticar a invenção. Estes exemplos não deveriam ser interpretados como limitativos. Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que do contrário observado.

EXEMPLO 1

[00233] Em janeiro de 2004, uma epidemia de doença das vias respiratórias ocorreu em 22 galgos de corrida alojados em 2 canis em uma pista de Flórida e a fazenda local forneceu os cães estes canis. Havia cerca de 60 cães em cada instalação do canil e 300 cães na fazenda. A epidemia ocorreu em um período de 6 dias após o qual nenhum caso novo foi identificado. Quatorze dos 22 cães tiveram febres de 39,5 a 41,5°C, uma tosse suave de entalos durante 10 a 14 dias, e restabelecimento eventual. Dos 8 cães restantes, 6 cães aparentemente saudáveis morreram inesperadamente com hemorragia da boca e nariz. Dois outros cães foram eutanizados dentro de 24 horas do princípio da hemorragia da boca e nariz devido à deterioração rápida. Ambos destes cães tiveram febres de 41°C. Quatro das 8 mortes ocorreram nas instalações de canil e 4 ocorreram na fazenda. Cinqüenta por cento das mortes ocorreram no dia 3 da epidemia. Os 22 cães variaram em idade de 17 meses a 4 anos, mas 73 % tinham 17 a 33 meses de idade.

[00234] Duas síndromes clínicas foram evidentes: uma enfermidade mais moderada caracterizada por febre inicial e depois tosse durante 10-14 dias (14 cães) com restabelecimento subseqüente, ou uma morte peraguda associada à hemorragia no trato respiratório (8 cães para uma taxa de mortalidade de 36 %). Autópsias foram executadas em 6 dos 8 casos fatais. Todos os cães tiveram hemorragia extensiva nos pulmões, mediastino, e cavidade pleural. Exame histológico do trato respiratório revelou que além da hemorragia pulmonar, todos os cães tiveram traqueíte, bronquite, bronquiolite, e broncopneumonia supurativa (Figura 3). O forro epitelial e lumens da via aérea nestes tecidos foram infiltrados por neutrófilos e macrófagos. Homogeneizados pulmonares preparados destes cães foram inoculados em uma variedade de linhagens celulares de macaco, humanas, bovinas, e caninas por cultura de vírus. O homogeneizado pulmonar de um cão causou efeitos citopáticos nas células epiteliais de rim canino de Madin-Darby (MDCK) cultivadas na presença de tripsina, e nas células sangüíneas vermelhas de galinha aglutinadas de sobrenadante da cultura de células. Evidência preliminar de um tipo de vírus de influenza A foi provido por um ELISA comercial para detecção da nucleoproteína de vírus de influenza A e B, e por análise de PCR usando iniciadores específicos para o gene Matriz do vírus de influenza A. Além disso, a atividade de hemaglutinação foi inibida por anti-soros de referência para influenza A eqüina subtipo H3, mas não através de anti-soros específicos para influenza A humana subtipos H1-H11 e H13 (Tabela 3). Para caracterizar as propriedades moleculares do vírus, determinaram-se as seqüências de nucleotídeo dos 8 segmentos de RNA do genoma viral. Comparações de seqüência com genes de vírus de influenza conhecidos e análises filogenéticas indicaram que os 8 genes do isolado canino eram muito similares àqueles do vírus de influenza A eqüina contemporânea (H3N8), com o qual eles compartilharam > 96-97 % de identidade de seqüência (Figura 1A, Tabela 4). Em contraste, os genes representativos de isolado de influenza A aviário, suína, e humana tiveram > 94 % de identidade que o isolado canino (Tabela 4). Estes dados identificados o isolado canino A/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) como uma vírus de H3N8 de influenza A estritamente relacionado às linhagens contemporâneas do vírus de influenza eqüina. Considerando que todos os genes do isolado canino eram de origem do vírus de influenza eqüina, concluíram-se que o genoma inteiro de um vírus de influenza eqüina tinha sido transmitido ao cão.

EXEMPLO 2

[00235] Para investigar o papel do vírus de Canine/FL/04 nas observações clínicas e patológicas nos galgos, executaram-se tingimento imuno-histoquímico (IHC) em tecidos pulmonares usando um anticorpo monoclonal para H3 de influenza A. Antígeno de H3 viral foi detectado consistentemente no citoplasma de células epiteliais bronquiais e bronquiolares, células epiteliais da glândula bronquial, e macrófagos em lumens da via aérea e espaços alveolares (Figura 2A). Estes dados suportam uma diagnose de infecção pulmonar com vírus de influenza do subtipo H3 em múltiplos cães.

EXEMPLO 3

[00236] Para determinar o envolvimento de um vírus semelhante a Canine/FL/04 na etiologia da epidemia de doença das vias respiratórias, analisaram-se soros agudos e convalescentes pareados de 11 cães doentes e 16 contatos assintomáticos por inibição de hemaglutinação (HI) e microneutralização (MN). Seroconversão, definida como uma elevação de > 4 vezes na titulação de anticorpo para Canine/FL/04 da fase aguda a convalescente, ocorreu em 8 de 11 (73 %) cães doentes em ambos os ensaios (Tabela 1). Seroconversão ocorreu em 6 de 16 (38 %) contatos assintomáticos no ensaio de HI, enquanto 8 de 16 (50 %) soroconvertidos no ensaio de MN (Tabela 1). Os dados de seroconversão demonstraram infecção dos cães com um vírus semelhante a Canine/FL/04 que coincidiu temporalmente com o princípio da doença das vias respiratórias na maioria dos animais.

[00237] As amostras de soro simples foram colhidas 3 meses após a epidemia de uns 46 cães assintomáticos adicionais alojados com os cães doentes. Destes, 43 (93 %) eram soropositivos em ambos os ensaios. Para a população total de 73 cães testados, 93 % eram soropositivos em ambos os ensaios, incluindo 82 % (9/11) dos cães doentes e 95 % (59/62) dos contatos saudáveis. A soroprevalência alta em cães sem história da doença das vias respiratórias indica que a maioria das infecções com vírus de influenza canina é subclínica e sugere expansão eficiente do vírus entre os cães. Não é conhecido se as infecções subclínicas contribuíram para a expansão do vírus.

EXEMPLO 4

[00238] Para melhor entender a capacidade do vírus de Canine/FL/04 para infectar cães, quatro bigles de 6 meses de idade criados para o propósito foram cada um inoculados com 106,6 doses infecciosas de cultura de tecido mediana (TCID50) pelas vias intratraqueana e intranasal. Todos os cães desenvolveram uma febre (> 39°C de temperatura retal) para os 2 primeiros dias pós-inoculação (p.i.), mas nenhum exibiu sintomas respiratórios tais como tosse ou secreção nasal em um período de observação de 14 dias. Eliminação de vírus foi examinada por quantificação de vírus em esfregaços nasais e orofaríngeos. Apenas 2 dos 4 cães propagaram quantidades detectáveis de vírus. Um cão propagou vírus nos dias 1 e 2 p.i. (1,0-2,5 log10 PFU por esfregaço), enquanto que o outro cão propagou vírus durante 4 dias sucessivos após inoculação (1,4-4,5 log10 PFU por esfregaço). Autópsia de 2 cães no dia 5 p.i. revelou traqueíte necrotizante e hiperplástica, bronquite, e bronquiolite similares às encontradas na doença espontânea em galgos, mas não houve nenhuma hemorragia pulmonar ou broncopneumonia. Antígeno de H3 viral foi detectado no citoplasma de células epiteliais dos brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais por IHC (Figura 2B). Vírus infecciosos restabeleceram-se do tecido pulmonar de um dos cães. Autópsia dos 2 cães restantes no dia 14 p.i. mostrou alterações histológicas mínimas nos tecidos respiratórios, nenhum antígeno de H3 viral por IHC, e nenhum restabelecimento do vírus dos homogeneizados pulmonares. Seroconversão nestes 2 últimos cães foi detectada em ensaios de MN pelo dia 7 p.i., com um aumento adicional de 2-3 vezes nas titulações de anticorpo pelo dia 14. Estes resultados estabeleceram a suscetibilidade dos cães à infecção com Canine/FL/04, como comprovado pela resposta febril, presença de antígeno viral e vírus infeccioso no parenquima pulmonar, achados histopatológicos típicos para influenza, e seroconversão. A insuficiência para reproduzir doença severa e morte nos bigles experimentalmente inoculados não é surpreendente uma vez que uma proporção grande dos galgos naturalmente infectados foi assintomática.

EXEMPLO 5

[00239] Para investigar se um vírus semelhante a Canine/FL/04 de influenza circulou entre populações de galgo na Flórida antes da epidemia de janeiro de 2004, soros arquivais de 65 galgos de corrida foram testados para a presença de anticorpos para Canine/FL/04 usando os ensaios de HI e de MN. Não houve nenhum anticorpo detectável em 33 cães amostrados de 1996 a 1999. De 32 cães amostrados entre 2000 e 2003, 9 eram soropositivos em ambos os ensaios - 1 em 2000, 2 em 2002, e 6 em 2003 (Tabela 5). Os cães soropositivos estavam localizados em pistas de Flórida envolvidas em epidemias de doença das vias respiratórias de etiologia desconhecida de 1999 a 2003, sugerindo que um vírus semelhante a Canine/FL/04 pudesse ter sido o agente causativo daquelas epidemias. Para investigar esta outra possibilidade, examinaram-se os tecidos arquivais de galgos que morreram de broncopneumonia hemorrágica em março de 2003. Homogeneizados pulmonares inoculados em células de MDCK e embriões de galinha de um cão renderam vírus de influenza de H3N8, denominado A/Canine/Florida/242/2003 (Canine/FL/03). Análise da seqüência do genoma completo de Canine/FL/03 revelou > 99 % de identidade a Canine/FL/04 (Tabela 4), indicando que vírus semelhante a Canine/FL/04 tinha infectado galgos antes de 2004.

EXEMPLO 6

[00240] De junho a agosto de 2004, as epidemias de doença das vias respiratórias ocorreram em milhares de galgos de corrida em 14 pistas na Flórida, Texas, Alabama, Arkansas, West Virginia, e Kansas.

[00241] Funcionários em algumas destas pistas estimaram que pelo menos 80 % de sua população de cães tiveram doença clínica. A maioria dos cães teve sinais clínicos de febre (> 39°C) e tosse similar aos cães pela epidemia de janeiro de 2004, mas muitos cães também tiveram uma secreção nasal mucopurulenta. Mortes múltiplas foram relatadas mas uma taxa de mortalidade precisa não pôde ser determinada.

[00242] Coletaram-se soros agudos e convalescentes pareados de 94 cães localizados em 4 pistas da Flórida: 56 % destes cães tiveram aumento de > 4 vezes nas titulações de anticorpo para Canine/FL/04, e 100 % eram soropositivos (Tabela 6). Soros convalescentes de 29 cães em West Virginia e Kansas também tiveram anticorpos para Canine/FL/04. Isolou-se vírus de influenza A (H3N8) dos pulmões de um galgo que morreu de broncopneumonia hemorrágica em uma pista no Texas. Análise de seqüência do genoma inteiro deste isolado, denominado A/Canine/Texas/1/2004 (Canine/TX/04), revelou > 99 % de identidade a Canine/FL/04 (Tabela 4). O isolamento de três vírus de influenza estritamente relacionados de casos caninos fatais em um período de 13 meses e de localizações geográficas diferentes, junto com a evidência sorológica substancial de infecção difundida entre galgos de corrida, sugeriu circulação contínua de um vírus semelhante a Canine/FL/04 na população de cães.

[00243] Análise filogenética dos genes de HA de Canine/FL/03, Canine/FL/04, e Canine/TX/04 mostrou que eles constituem um grupo monofilético com suporte autopromotor robusto que foi claramente distinto dos genes de H3 contemporâneos de vírus eqüinos isolados em 2002 e 2003 (Figura 1B). Análise filogenética e comparações de seqüência de nucleotídeo pareadas dos outros 7 segmentos genômicos suportaram a segregação dos genes caninos estritamente relacionados como uma sublinhagem distinta à linhagem de vírus eqüino (dados não mostrados, e Tabela 4). O agrupamento dos genes de influenza canina como um grupo monofilético separado da influenza eqüina é também suportado pela presença de 4 alterações de aminoácido de assinatura no HA (Tabela 2). Junto com os resultados sorológicos de 2003 e 2004, estes dados são consistentes com um evento de transmissão de vírus simples de cavalos para cães com expansão horizontal subseqüente do vírus na população de galgo. Porém, introduções repetidas desta única linhagem de vírus de influenza de uma espécie de reservatório não identificada não pode ser excluída formalmente, improvável como pode ser.

[00244] O HA viral é um determinante crítico da especificidade de espécie hospedeira do vírus de influenza (Suzuki et al., 2000). Para identificar resíduos dentro de HA que pode estar associado à adaptação ao hospedeiro canino, comparou-se a seqüência de aminoácido deduzida de HAs caninos àquelas de vírus eqüinos contemporâneos. Quatro alterações de Diferenças de aminoácido as seqüências de aminoácido de consenso de HA maduras eqüinas e caninas: N83S, W222L, I328T, e N483T (vide Tabela 2). Os vírus caninos têm uma deleção de aminoácido quando comparados às seqüências eqüinas de consenso. Portanto, a posição de aminoácido 7 na seqüência eqüina de HA é a posição 6 na seqüência canina de HA, posição de aminoácido 29 na seqüência eqüina de HA é a posição 28 na seqüência canina de HA, posição de aminoácido 83 na seqüência eqüina de HA é a posição 82 na seqüência canina de HA, etc. Desse modo, os quatro aminoácidos substituídos estão na posição 82, 221, 327, e 482 da seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34. A substituição de serina por asparagina na posição de seqüência de consenso 83 é uma alteração de significação funcional desconhecida uma vez que vários resíduos polares são encontrados nas moléculas de H3 de outras espécies. A isoleucina estritamente conservada na posição de seqüência de consenso 328 próxima do sítio de clivagem do HA de H3 foi substituída por treonina. O papel pivotante da clivagem de HA por proteases hospedeiras em patogênese sugere que esta alteração merece estudo adicional. A substituição de leucina por triptofano na posição de seqüência de consenso 222 é bastante notável porque representa uma alteração não-conservadora adjacente para a cavidade de ligação do ácido siálico que poderia modular a função do receptor (Weis et al., 1988). De forma interessante, leucina na posição 222 não é única para HA de H3 canino uma vez que é tipicamente encontrada nos subtipos de HA H4, H8, H9, e H12 (Nobusawa et al., 1991; Kovacova et al., 2002). A substituição de leucina pode ser mais compatível com especificidade de vírus para hospedeiros mamíferos uma vez que infecções de suínos com subtipo H4 (Karasin et al., 2000) e seres humanos e suínos com vírus de subtipo H9 (Peiris et al., 1999) foram relatadas. A substituição de asparagina com treonina na posição de seqüência de consenso 483 resultou na perda de um sítio de glicosilação na subunidade de HA2 que é conservada em todos os subtipos de HA (Wagner et al., 2002). Embora a importância destas alterações de aminoácido no HA para adaptação de um vírus eqüino para cães permaneça a ser determinada, alterações de aminoácido similares foram observadas previamente em associação com transferência de interespécies (Videiras et al., 1998; Matrosovich et al., 2000). Diferenças de aminoácido entre outras proteínas virais de influenza da invenção e seqüência de consenso eqüina são mostradas na Tabelas 19 a 25.

[00245] A fonte do vírus de influenza eqüina que inicialmente infectou os galgos de corrida permanece especulativa. Canis em pistas de corridas de galgo não ficam localizados próximos de cavalos ou pistas de corridas de cavalos, sugerindo que o contato entre galgos e cavalos propagadores não seja uma explanação suficiente para as múltiplas epidemias em estados diferentes em 2004. Uma fonte potencial de exposição ao vírus eqüino é a alimentação de carne de cavalo para galgos, cuja dieta é suplementada com carne bruta provida pelas casas de empacotamento que confere carcaças, incluindo cavalos que poderiam portar influenza. Precedentes para este modo de infecção incluem relatórios de transmissão interespécies de vírus de influenza aviário de H5N1 para porcos e felídeos de jardim zoológico alimentados com carcaças de galinha infectadas (Webster, 1998; Keawcharoen et al., 2004; Kuiken et al., 2004). Embora esta seja uma via plausível para a introdução inicial de influenza eqüina em cães, não explica as recentes epidemias de influenza múltiplas em milhares de cães em estados diferentes. O estudo de inoculação experimental demonstrou a presença de vírus nas passagens nasais e orofaringe de cães, embora em titulações modestas. Não obstante, estes resultados indicam que propagação é possível, e que a transmissão de cão-para-cão do vírus através de aerossóis de gotícula grandes, fomitas, ou contato mucoso direto poderia representa um papel na epizootiologia da doença.

[00246] A transferência interespécies de um vírus de influenza mamífero inteiro para uma espécie mamífera não relacionada é um evento raro. Estudos anteriores forneceram evidência sorológica ou virológica limitada, mas não ambos, de infecção transiente de cães com vírus de influenza humana A (H3N2) (Nikitin et al., 1972, Kilbourne, et al., 1975; Chang et al., 1976; Houser et al., 1980). Porém, não houve nenhuma evidência de circulação contínua no hospedeiro canino. Embora transferência direta do vírus de influenza suíno de porcos para pessoas esteja bem documentada (Dacso et al., 1984; Kimura et al., 1998; Patriarca et al., 1984; Top et al., 1977), não há nenhuma evidência para adaptação dos vírus suínos em hospedeiros humanos. Neste relatório, forneceram-se evidência virológica, sorológica e molecular para transmissão interespécies de um vírus de influenza A eqüina inteiro (H3N8) para outras espécies mamíferas, o cão. Substituições únicas de aminoácido no vírus canino HA, acopladas com confirmação sorológica de infecção de cães em múltiplos estados nos EUA, sugerem adaptação do vírus ao hospedeiro canino. Uma vez que cães são um animal de companhia primário para seres humanos, estes achados têm implicações com a saúde pública; cães podem prover uma fonte nova para transmissão de vírus de influenza A nova para seres humanos.

a vários cães com sinais clínicos da doença. b Número de cães assintomáticos alojados em contato com cães clinicamente doentes. c Ensaio de inibição de hemaglutinação (HI) usando vírus de A/Canine/ Florida/43/2004. d Ensaio de microneutralização (MN) usando vírus de A/Canine/Florida/43/ 2004. e Porcentagem de cães com pelo menos um aumento de 4 vezes na titulação de anticorpo em soros agudos e convalescentes pareados. f Porcentagem de cães com uma titulação de anticorpo positiva (titulação de HI > 32: titulação de MN > 80) nos soros convalescentes. g Titulação de anticorpo de média geométrica para os soros convalescentes.

* Resíduo de aminoácido (código de letra minúscula) e posição no HA de H3 maduro. O código de aminoácido é: A = alanina, D = ácido aspártico, G = glicina, I = isoleucina, K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina, R = arginina, S = serina, T = treonina, V = valina, W = triptofano. t Denota nenhuma alteração dos HAs de H3 eqüino de consensos.

a Titulação de inibição de hemaglutinação para isolado viral de cão #43. b Anti-soros policlonais que foram produzidos em furões, enquanto que todos os outros anti-soros foram produzidos em ovelhas ou cabras.

a Por cento de identidade de seqüência de nucleotídeo e aminoácido (entre parênteses) de genes de A/Canine/Florida/43/2004 (H3N8) para o gene mais homólogo de vírus do isolado de vírus de influenza das espécies, seguido por seus números de acesso de base de dados de seqüência de Genbank. b Não aplicável: Neuraminidase de N8 nunca foi relatada em vírus humano ou suíno. Petição 870210098781, de 26/10/2021, pág. 92/205

a O ano de coleta da amostra de soro de galgos de corrida na Flórida. b Titulações de anticorpo de ensaio de microneutralização para cães soropositivos, incluindo a faixa para os seis cães de soropositivos de 2003.

a Vários cães clinicamente doentes testados por HI usando A/canine/ Florida/43/2004 (H3N8). b Porcentagem de cães com aumento > 4 vezes na titulação de anticorpo entre soros agudos e convalescentes. c Porcentagem de cães com uma titulação de anticorpo positivo (titulação de HI > 16) nos soros convalescentes. d Titulação de anticorpo de média geométrica para os soros convalescentes.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 7-11 Tecidos Caninos

[00247] Autópsias foram executadas pelo Serviço de Patologia Anatômico na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade da Flórida em 6 cães de raça mista que morreram em abril/maio de 2005 durante uma epidemia de influenza em uma instalação de abrigo no nordeste da Flórida, e em um animal de estimação Yorkshire Terrier que morreu em maio de 2005 durante uma epidemia de influenza em uma clínica veterinária no sudeste da Flórida. Tecidos foram fixados em 10 % de formalina tamponada neutro, embebidos em parafina, e seções de 5 μm foram tingidas com hematoxilina e eosina para diagnose histopatológica. Tecidos não-fixados foram armazenados em análises virológicas pendentes a -80°C.

EXTRAÇÃO DE RNA DE AMOSTRAS DE TECIDO CANINAS

[00248] Tecidos pulmonares congelados de cada um de os 7 cães foram descongelados e homogeneizados em meio de essencial mínimo (MEM) suplementado com 0,5 % albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina) usando moedor de tecido descartável (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). RNA total foi extraído usando um kit comercial (Kit de RNeasy® Mini, QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante e eluído em um volume final de 60 μl de tampão. RNA total foi também extraído de tecido pulmonar colhido de cães sem doença das vias respiratórias.

RT-PCR DE TEMPO REAL

[00249] Uma RT-PCR de tempo real quantitativa de uma etapa foi executada em RNA total extraído das amostras de tecido caninas usando o kit de RT-PCR QuantiTect® Probe contendo ROX como uma tintura de referência passiva (QIAGEN Inc., Valença, CA). Brevemente, 2 conjuntos de iniciador-sonda foram usados para detecção de seqüências de influenza A em cada amostra (TABELA 7). Um conjunto de iniciador-sonda foi seletivo para seqüências de gene de hemaglutinina canina (H3). O outro conjunto de iniciador-sonda alvejou uma região altamente conservada do gene matriz (M) do vírus de influenza do tipo A. Para cada reação de RT-PCR de tempo real, 5 μl de RNA total extraído foram adicionados a uma mistura de reação contendo 12,5 μl de 2X Mistura Mestre de RT-PCR de Sonda de QuantiTech®, 0,25 μl de QuantiTech® RT Mix, iniciadores diretos e reversos (concentração final de 0,4 μM para cada), sonda (concentração final de 0,1 μM) e água livre de RNase em um volume final de 25 μl. Os Reagentes de Controle de RNA Ribossômicos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usados de acordo com as instruções do fabricante para detecção de rRNA de 18S como um controle interno endógeno para a presença de RNA extraído das amostras de tecido caninas.

[00250] RT-PCR quantitativa de tempo real de uma etapa foi executada nas misturas de reação em um Sistema de QPCR Mx3000P® (Stratagene, La Jolla, CA). Condições de ciclismo incluíram uma etapa de transcrição reversa a 50°C durante 30 minutos, uma etapa de desnaturação inicial a 95°C durante 15 minutos para ativar a DNA polimerase de HotStarTaq®, e amplificação durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificação incluiu desnaturação a 94°C durante 15 segundos seguido por anelamento/extensão a 60°C durante 1 minuto. Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de onda de emissão a 518 nm) e de VIC (comprimento de onda de emissão a 554 nm) foram registrados no término de cada ciclo. O ciclo de limiar (Ct) foi determinado ajustando a fluorescência de limiar (dR) em 1000 em cada experimento individual. O programa de software de Mx3000P® versão 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA) foi usado para aquisição e análise dos dados. Amostras foram consideradas positivas para vírus de influenza A quando o ciclo de limiar (Ct) para o gene de H3 ou M foi 3 unidades menor que o Ct para tecidos pulmonares de cães sem doença das vias respiratórias. O controle positivo consistiu em amplificação de RNA extraído de vírus de A/canine/FL/242/03 (H3N8).

ISOLAMENTO DE VÍRUS EM CÉLULAS DE MDCK

[00251] Tecidos pulmonares congelados de cada um dos 7 cães foram descongelados e homogeneizados em 10 volumes do Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 0,5 % (BSA) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina). Restos sólidos foram removidos por centrifugação e os sobrenadantes foram inoculados sobre células de rim canino de Madin-Darby (MDCK) cultivadas em DMEM suplementado com 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina). Células foram crescidas em frascos de 25 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. As culturas foram observadas diariamente para alterações morfológicas e foram colhidas em 5 dias pós-inoculação. As culturas colhidas foram clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes inoculados sobre células de MDCK frescas como descrito para a inoculação inicial; foram executadas duas passagens adicionais para amostras que não mostraram evidência de vírus de influenza através de hemaglutinação ou RT-PCR. Atividade de Hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi determinada usando 0,5 % de células sangüíneas vermelhas de peru como previamente descrito (Burleson, F., et al., 1992; Kendal, P., et al., 1982). RT-PCR foi executada como descrito abaixo.

ISOLAMENTO DE VÍRUS EM OVOS GALINHA EMBRIONADOS

[00252] Homogeneizados foram preparados de tecidos pulmonares congelados como descrito acima para inoculação de células de MDCK. Os homogeneizados (0,2 ml) foram inoculados no saco alantóico de ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade. Após 48 horas de incubação a 35°C, os ovos foram esfriados para 4°C durante a noite antes de colher o fluido alantóico. Atividade de hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi determinada usando 0,5 % de células sangüíneas vermelhas de peru como previamente descrito (Burleson, F., et al., 1992; Kendal, P., et al., 1982). RT-PCR foi executada como descrito abaixo. Foram executadas duas passagens adicionais em ovos embrionados para amostras que não mostraram evidência de vírus de influenza após a inoculação inicial. RT-PCR, SEQÜENCIAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO, E ANÁLISES FILOGENÉTICAS

[00253] RNA viral foi extraído de sobrenadante de MDCK ou fluido alantóico usando o Míni Kit Viral de RNA QIAamp® (QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA viral foi transcrito reverso para cDNA usando o kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCR da região de codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previamente executada como descrito (Klimov, A., et al., 1992b), usando conjuntos de iniciador gene- específico universais (seqüências de iniciador disponível sob solicitação). Os amplicons de DNA resultante foram usados como modelos para seqüenciação automatizada no seqüenciador de DNA automatizado ABI PRISM® 3100 usando química de terminador de tintura de seqüenciação de ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram analisadas as seqüências de nucleotídeo usando Lasergene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madison, WI). O programa de software PHYLIP© versão 3.5 foi usado para estimar as filogenias e calcular os valores de autocarregador das seqüências de nucleotídeo (Felsenstein, J., 1989). Árvores filogenéticas foram comparadas às geradas por análise de junção de vizinhos com o modelo Tamura-Nei implementado no programa de MEGA© (Kumar, S., et al., 2004) e confirmado pelo programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA). ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HI)

[00254] As amostras de soro foram incubadas com enzima destruidoras de receptor (RDE, DENKA SEIKEN Co., Ltd., Tóquio, Japão) (1 parte de soro: 3 partes de RDE) durante 16 horas a 37°C antes da inativação de calor durante 30 minutos a 56°C. Vírus de influenza A/Canine/Jacksonville/05 (H3N8) foi cultivado em células de MDCK por 72 h a 37°C em 5 % de CO2. Os sobrenadantes de cultura de vírus foram colhidos, clarificados através de centrifugação, e armazenados a -80°C. Todos os outros vírus usados no ensaio de HI foram crescidos em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade cujo fluido alantóico foi colhido e armazenado a -80°C. O ensaio de HI foi executado como previamente descrito (Kendal, P., et al., 1982). Brevemente, 4 unidades de hemaglutinação de vírus foram adicionadas em 25 μl a um volume igual de soro serialmente diluído em placas de plástico de 96 cavidades e incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos. Um volume igual de 0,5 % de eritrócitos de peru foi adicionado e as titulações de hemaglutinação foram estimadas visualmente após 30 minutos. O ponto terminal titulação de HI foi definido como a última diluição de soro que completamente inibiu a hemaglutinação.

EXEMPLO 7 - CASOS CLÍNICOS

[00255] Em abril e maio de 2005, uma epidemia de doença das vias respiratórias previamente descrita (Crawford, P. C. et al., 2005) ocorreu em cães alojados em uma instalação de abrigo no nordeste da Flórida. A epidemia envolveu pelo menos 58 cães que variam em idade de 3 meses a 9 anos, e incluiu cães de sangue puro como também raças misturadas. Os sinais clínicos mais comuns foram secreção nasal purulenta e uma tosse durante 7 a 21 dias. Dos 43 cães que tiveram doença clínica por > 7 dias, 41 tinham titulações de anticorpo de HI para canine/FL/04 (H3N8) variando de 32 a > 1024. Pelo menos 10 cães progrediram para pneumonia, dos quais 6 foram eutanizados. Estes 6 cães de raça mista incluíram 3 machos e 3 fêmeas variando em idade de 4 meses a 3 anos. A duração dos sinais clínicos variou de 2 a 10 dias na hora da eutanásia. Sob autópsia, estes cães tiveram congestão pulmonar e edema. Exame histológico do trato respiratório revelou rinite, traqueíte, bronquite, bronquiolite, e broncopneumonia supurativa. Houve necrose de célula epitelial e erosão na traquéia, brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais. Os tecidos respiratórios foram infiltrados por neutrófilos e macrófagos.

[00256] Em maio de 2005, uma epidemia de doença das vias respiratórias ocorreu em 40 cães de estimação em uma clínica veterinária no sudeste da Flórida. Os sinais clínicos mais comuns foram secreção nasal purulenta e uma tosse durante 10 a 30 dias. Dos 40 cães, 17 eram soropositivos para canine/FL/04 (H3N8) com titulações de anticorpo de HI variando de 32 a > 1024. Seroconversão ocorreu em 10 cães para os quais soros agudos e convalescentes pareados estavam disponíveis. Três cães progrediram para pneumonia. Um destes cães, um Yorkshire Terrier macho de 9 anos de idade, morreu 3 dias após o princípio dos sinais clínicos. Este cão teve traqueobronquite, edema pulmonar e congestão, e broncopneumonia severa. Similar aos 6 cães do abrigo, houve necrose de célula epitelial e erosão das vias aéreas e infiltrados neutrófilos nos tecidos.

EXEMPLO 8 - RT-PCR E TEMPO REAL E ISOLAMENTO VIRAL

[00257] Tecidos pulmonares dos 7 cães foram analisados através de ensaios de RT-PCR quantitativo de tempo real que detectam o gene M do tipo de influenza A e o gene H3 do vírus de influenza A canina de H3N8. Os pulmões de todos os 7 cães eram positivos tanto para gene M de influenza A quanto gene H3 de influenza canina (Tabela 8). Após 3 passagens em células de MDCK, vírus de H3N8 do subtipo influenza A foi isolado dos pulmões de um cão do abrigo que morreu após 3 dias de pneumonia. Este vírus foi nomeado A/canine/Jacksonville/05 (H3N8) (canine/Jax/05). Após 2 passagens em ovos de galinha embrionados, vírus de H3N8 do subtipo influenza A restabeleceu-se dos pulmões do cão de estimação que também morreu após 3 dias de pneumonia. Este vírus foi nomeado A/canine/Miami/05 (H3N8) (canine/Miami/05).

EXEMPLO 9 - ANÁLISES GENÉTICA DOS ISOLADOS DE H3N8 INFLUENZA A CANINA

[00258] Análises de seqüência de canine/Jax/05 e canine/Miami/05 revelaram que seus genes de hemaglutinina (HA) foram 98 % idênticos aos isolados de canine/FL/04, canine/TX/04, e canine/Iowa/05 restabelecidos dos pulmões de galgos de corrida que morreram de pneumonia durante as epidemias de influenza em pistas em 2004 e 2005 (Crawford, P. C. et al., 2005; Yoon K-Y. et al., 2005). Além disso, os genes de HA de canine/Jax/05 e canine/Miami/05 eram 98 % idênticos ao vírus de influenza eqüina contemporâneos isolado após o ano 2000. Comparações filogenéticas dos genes de HA mostraram que os vírus canine/Jax/05 e canine/Miami/05 foram agrupados com os isolados de galgo canine/FL/04, canine/TX/04, e canine/Iowa/05 e isolados eqüinos contemporâneos, formando um grupo distinto dos isolados de vírus eqüino mais velhos no início de 1990 (Figura 4). Além disso, os isolados canine/Jax/05, canine/Miami/05, e canine/Iowa/05 estavam relacionados mais estritamente a canine/Tx/04 que a canine/FL/04 ou canine/FL/03. Os isolados de 2005 formaram um subgrupo que parece se ramificar dos vírus caninos mais prematuros de 2003 e 2004 com diferenças em aproximadamente 10 sítios informativos de parcimônia. Estas diferenças suportam a hipótese que vírus de influenza canina esteja sendo transmitido horizontalmente de cão-para- cão ao invés de ser periodicamente reintroduzido de uma fonte externa. A acumulação de mutações de 2003 a 2005 ilustra o processo contínuo de adaptação que o vírus tem que sofrer após ser transmitido a um hospedeiro novo, como é esperado ter acontecido para os vírus de influenza canina.

EXEMPLO 10 - ANÁLISES DE AMINO ÁCIDO DOS ISOLADOS DE H3N8 DE INFLUENZA A CANINA.

[00259] Haviam substituições de aminoácido conservadas em todos os 6 isolados caninos que os diferenciaram dos vírus de influenza eqüina contemporâneos (Tabela 9). Estas substituições conservadas eram I15M, N83S, W222L, I328T, e N483T. Comparações filogenéticas da proteína de HA madura mostraram que o vírus de canine/Jax/05, canine/Miami/05, e canine/Iowa/05 formaram um subgrupo com o isolado de canine/TX/04 (Figura 4). Havia 3 alterações de aminoácido (L118V, K261N, e G479E) que diferenciaram este subgrupo dos outros vírus caninos (Tabela 9). Havia 2 alterações de aminoácido (F79L e G218E) que diferenciaram os isolados de 2005 de sal// raiz de canine/TX/04. Além disso, os isolados de 2005 dos cães não-galgos, canine/Jax/05 e canine/Miami/05, diferiram dos isolados de galgo canine/Iowa/05 por uma alteração de aminoácido, R492K. Por fim, canine/Jax/05 diferiu de canine/Miami/05 em um aminoácido simples, S107P. Em todos os outros vírus de H3N8 eqüinos e caninos, S é conservado na posição 107 com exceção de A/Eqüino/Jilin/1/89 que tem um T (Guo Y. et al., 1992).

EXEMPLO 11 - ANÁLISES ANTIGÊNICAS DOS ISOLADOS DE H3N8 DE INFLUENZA CANINA

[00260] Testes de inibição de hemaglutinação (HI) foram executados usando um painel de antígeno de vírus de influenza eqüina mais velhos e contemporâneos e os vírus de influenza canina, e o soro colhido em 2005 de cavalos e cães que tinham sido infectados com vírus de influenza (TABELA 10). Soro de furões imunizados contra canine/FL/04 foi também incluso nas análises. As titulações de anticorpo de HI em soro eqüino foram 8-16 vezes mais altas quando testadas com vírus eqüinos contemporâneos comparados aos isolados mais velhos, mas diminuíram em pelo menos 4 vezes quando testados com os vírus caninos. O soro canino foi não-reativo com os vírus eqüinos mais velhos, mas as titulações de anticorpo aumentaram 4 vezes quando testadas com isolados eqüinos e caninos contemporâneos. Isto foi também observado para o soro de furões imunizados contra vírus de influenza canina. Estes padrões de //sero-reatividade demonstraram a similaridade antigênica entre os vírus de influenza caninas e vírus de influenza eqüina contemporâneos e foram consistentes com as análises filogenéticas. As titulações de anticorpo em soros de eqüino, canino, e furão para os isolados de canine/Miami/05 foram similares às para os isolados caninos de 2003 e 2004. Porém, as titulações foram 2-4 vezes mais baixas para os isolados de canine/Jax/05. Isto sugere que canine/Jax/05 é antigenicamente distinto do outro isolado canino que pode ser se referido em parte à alteração do aminoácido simples na posição 107 no HA maduro.

a Letra sublinhada r representa nucleotídeo a ou g e letra sublinhada k representa nucleotídeo g ou t. b Letras maiúsculas representam resíduos de ácido nucléico presos. Petição 870210098781, de 26/10/2021, pág. 103/205

a Titulações de anticorpo foram determinadas em um ensaio de inibição de hemaglutinação executado com diluições seriais de soro eqüino, canino, ou soro de furão e o vírus listado na coluna de antígeno. b Soro de furões imunizados com vírus de canine/FL/04. MATERIAIS E MÉTODOS EXEMPLARES PARA OS EXEMPLOS 1215 Inóculo de Vírus de Influenza Canina.

[00261] O inóculo de vírus foi preparado por inoculação de células epiteliais de rim canino de Madin-Darby (MDCK) com uma matéria- prima de A/canine/FL/43/04 (H3N8) representando passagem 3 do isolado original descrito previamente (Crawford et al., 2005). As células de MDCK inoculadas nos Meios Essenciais Mínimos de Dulbecco (DMEM) suplementados com 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina) foram cultivadas em frascos de 250 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. As culturas foram observadas diariamente para alterações morfológicas e foram colhidas em 5 dias pós-inoculação. As culturas colhidas foram clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes foram armazenados em inoculação pendente de -80°C dos cães. Uma alíquota de sobrenadante foi usada para determinação da titulação de vírus pelo método de Reed e Muench. A titulação foi 107 doses infecciosas de cultura de tecido mediana (TCID50) de A/canine/Florida/43/2004 (canine/FL/04) por ml. INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL.

[00262] Oito cães mestiços com colônias de 4 meses de idade (Marshall BioResources, North Rose, NY) (4 machos e 4 fêmeas) foram usados para o estudo de inoculação experimental aprovado por University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee. Os pesos dos corpos dos cães variaram de 13 a 17 kg. Os cães eram saudáveis com base em exames físicos, exames de sangue de linha base, e registro de temperaturas do corpo durante 2 semanas antes da inoculação. Todos os cães eram livres de exposição anterior ao vírus de influenza canina com base nos testes de sorologia executados nas amostras de soro colhidas depois na hora da chegada na instalação e 2 semanas. Os cães foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg do peso do corpo para efeito) para intubação com tubos endotraqueanos. Seis cães (3 machos e 3 fêmeas) foram cada inoculados com 107 TCID50 de vírus de canine/FL/04 em 5 ml de solução salina estéril administrada na traquéia distal através de um cateter de borracha de diâmetro pequeno inserido no tubo endotraqueano. Dois cães (1 macho e 1 fêmea) foram pseudo-inoculados com um volume igual de solução salina estéril. Os cães de controle pseudo-inoculados foram alojados em um quarto diferente dos cães inoculados com vírus e cuidados por pessoal diferente. Exames físicos e registros de temperatura retal foram executados duas vezes diariamente durante 6 dias pós-inoculação (p.i.). COLETÂNEA DE ESFREGAÇO FARÍNGEO E RETAL.

[00263] Espécimes orofaríngeos foram colhidos duas vezes diariamente de cada cão nos dias 0 a 6 p.i. para monitorar a eliminação do vírus usando chumaços com haste de poliéster (Fisher Scientific Internacional Inc., Pittsburgh, PA). Os esfregaços foram colocados em 1 ml de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA). Os esfregaços retais foram colhidos diariamente de cada cão dos dias 0 a 6. Extratos de esfregaço foram preparados por clarificação dos meios de transporte de esfregaço através de centrifugação. Uma alíquota de extrato de esfregaço foi testada imediatamente para nucleoproteína de vírus de influenza A usando o kit de imunoensaio comercial Directigen® (BD, Franklin Lakes, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. O extrato restante foi armazenado a -80°C pendendo outros ensaios virológicos. AUTÓPSIAS.

[00264] No dia 1 p.i., um cão pseudo-inoculado e um cão inoculado com vírus foram submetidos à eutanásia por inoculação intravenosa de solução de Beuthanasia-D® (1 mL/5 kg de peso do corpo; Schering- Plough Animal Health Corp). Um cão inoculado com vírus foi similarmente submetido à eutanásia cada dia dos dias 2 a 5 p.i. No dia 6 p.i., o cão pseudo-inoculado e o cão inoculado com vírus restantes foram submetidos à eutanásia. Autópsias completas foram executadas por um dos investigadores (WLC). Tecidos foram fixados em 10 % de formalina tamponada neutro, embebidos em parafina, e seções de 5 μm foram tingidas com hematoxilina e eosina para diagnose histopatológica ou processadas para Imuno-histoquímica como descrito abaixo. Tecidos pulmonares não-fixados foram submetidos ao Serviço de Diagnóstico de Microbiologia Clínica/Parasitologia/Sorologia na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade da Flórida para isolamento bacteriano e identificação. As amostras foram cultivadas em meios não-seletivos como também meios seletivos para espécies de Bordetella (Regan-Lowe; Remel, Lenexa, KS) e espécies de Mycoplasma (Remel). Todas as culturas foram mantidas durante 21 dias antes de relatarem nenhum crescimento. Tecidos não-fixados foram também armazenados a -80°C pendendo análises virológicas. IMUNO-HISTOQUÍMICA.

[00265] Seções de tecido da traquéia e pulmão de 5 μm desparafinizados e reidratados foram montadas em lâminas de BondRite® (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) e subseqüentemente tratadas com proteinase K (DAKOCytomation Inc., Carpenteria, CA) seguido por reagente de bloqueio de peroxidase (Kit de Peroxidase DAKO® EnVision®, DAKO Corp., Carpenteria, CA). As seções foram incubadas com uma diluição de 1:500 de anticorpo monoclonal para H3 de influenza A (Chemicon International, Inc., Ternecula, CA) durante 2 horas em temperatura ambiente. Controles incluíram incubação das mesmas seções com IgG de camundongo (1 mg/ml, Serotec, Inc. Raleigh, NC), e incubação do anticorpo monoclonal com seções pulmonares caninas normais. Seguindo tratamento com o anticorpo primário, as seções foram incubadas com reagentes de substrato de imunoperoxidase e de peroxidase secundários (Kit Peroxidase Dako® EnVision®, Dako Corp.) de acordo com as instruções do fabricante. As seções foram contra-tingidas com hematoxilina, tratadas com Clarificador #2 e Reagente de Anil (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI), desidratadas, e lâminas de cobertura aplicadas com Permount (ProSciTech, Queensland, Austrália). EXTRAÇÃO DE RNA DE ESFREGAÇOS E TECIDOS.

[00266] Tecidos pulmonares e traqueanos de cada cão foram descongelados e homogeneizados em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina) usando moedor de tecido descartável (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). RNA total foi extraído dos homogeneizados de tecido como também extratos de esfregaços orofaríngeos e retais usando um kit comercial (RNeasy® Míni Kit, QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante e eluídos em um volume final de 60 μl de tampão. RT-PCR DE TEMPO REAL.

[00267] Uma RT-PCR quantitativa de uma etapa de tempo real foi executada no RNA total usando o kit de RT-PCR de Sonda de QuantiTect® contendo ROX como uma tintura de referência passiva (QIAGEN Inc., Valença, CA) e um conjunto de iniciador-sonda que alvejou uma região altamente conservada do gene matriz (M) de vírus de influenza do tipo A (Payungporn S. et al., 2006a; Payungporn S. et al., 2006b). Para cada RT-PCR de tempo real reação, 5 μl de RNA total extraído foram adicionados a uma mistura de reação contendo 12,5 μl de 2X Mistura Mestre de RT-PCR de Sonda de QuantiTech®, 0,25 μl de Mistura de RT de QuantiTech®, iniciadores diretos e reversos (concentração final de 0,4 μM para cada), sonda (0,1 μM de concentração final) e água livre de RNase em um volume final de 25 μl. Os Reagentes de Controle de TaqMan® GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usados de acordo com as instruções do fabricante para detecção de GAPDH como um controle interno endógeno para a presença de RNA extraído do esfregaço e amostras de tecido e como um controle de normalização.

[00268] RT-PCR quantitativa de uma etapa de tempo real foi executada nas misturas de reação em um Sistema de QPCR de Mx3000P® (Stratagene, La Jolla, CA). Condições de ciclismo incluíram uma etapa de transcrição reversa a 50°C durante 30 minutos, uma etapa de desnaturação inicial a 95°C durante 15 minutos para ativar a DNA polimerase de HotStarTaq®, e amplificação durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificação incluiu desnaturação a 94°C durante 15 segundos seguido por anelamento/extensão a 60°C durante 1 minuto. Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de onda de emissão a 518 nm) e de VIC (comprimento de onda de emissão 554 nm) foram registrados no término de cada ciclo. O ciclo de limiar (Ct) foi determinado ajustando a fluorescência de limiar (Dr) a 1000 em cada experimento individual. O programa de software de Mx3000P® versão 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA) foi usado para aquisição e análise dos dados. O controle positivo consistiu em amplificação de RNA extraído de vírus de A/canine/FL/242/03 (H3N8). Os resultados foram normalizados dividindo o valor de Ct de M pelo valor de Ct de GAPDH correspondente por cada amostra. ISOLAMENTO DE RE DE VÍRUS DOS TECIDOS.

[00269] Tecidos do pulmão e da traquéia congelados de cães inoculados com vírus foram descongelados e homogeneizados em 10 volumes de DMEM suplementados com 0,5 % de BSA e antibióticos. Restos sólidos foram removidos por centrifugação e sobrenadantes foram inoculados sobre células de MDCK cultivadas em DMEM suplementados com 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO) e antibióticos como descrito acima. Células foram cultivadas em frascos de 25 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. As culturas foram observadas diariamente para alterações morfológicas e colhidas em 5 dias pós- inoculação. As culturas colhidas foram clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes inoculados sobre as células de MDCK frescas como descrito para a inoculação inicial; foram executadas duas passagens adicionais para amostras que não mostraram evidência de vírus de influenza através de hemaglutinação ou RT-PCR. Atividade de hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi determinada usando 0,5 % de células sangüíneas vermelhas de peru como previamente descrito (Crawford et al., 2005). RT-PCR foi executada como descrito abaixo. RT-PCR, SEQÜENCIAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO, E ANÁLISES FILOGENÉTICAS.

[00270] RNA viral foi extraído do sobrenadante de MDCK usando o MiniKit Viral de RNA de QIAamp® (QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA viral foi transcrito reverso para o cDNA usando o Kit de RT-PCR de Uma Etapa de QIAGEN® (QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCR da região de codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previamente executada como descrito (Crawford et al., 2005), usando conjuntos de iniciador gene-específico universais (seqüências de iniciador disponível sob solicitação). Os amplicons de DNA resultante foram usados como modelos para seqüenciação automatizada no seqüenciador de DNA automatizado de ABI PRISM® 3100 usando química de terminador de tintura de seqüenciação de ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram analisadas as seqüências de nucleotídeo usando o Lasergene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madison, WI). As seqüências de nucleotídeo para vírus restabelecidos de cães infectados foram comparadas às seqüências do vírus no inóculo para determinar se qualquer alteração ocorreu durante a replicação no trato respiratório.

EXEMPLO 12 - DOENÇA CLÍNICA

[00271] Todos os 6 cães inoculados com vírus desenvolveram uma febre transiente (> 39°C de temperatura retal) para os primeiros 2 dias p.i., mas nenhum exibiu sinais respiratórios tais como tosse ou secreção nasal no período de observação do dia 6. Os cães pseudo-inoculados permaneceram clinicamente saudáveis.

EXEMPLO 13 - PROPAGAÇÃO DO VÍRUS

[00272] Nucleoproteína de influenza A foi detectada no esfregaço orofaríngeo colhido de um dos cães inoculados com vírus a 24 horas p.i. Os esfregaços orofaríngeos colhidos de um cão em 72, 84, e 120 horas p.i., e outro cão em 108, 120, e 132 horas p.i., eram positivos para vírus através de RT-PCR quantitativa de tempo real (Tabela 11). O número absoluto de cópias de gene M de influenza por μl de extrato de esfregaço aumentou com o tempo de 3 para 6 dias p.i. Nenhum vírus foi detectado nos esfregaços retais.

EXEMPLO 14 - AUTÓPSIAS

[00273] Em contraste com a infecção experimental anterior usando Bigles livres de patógenos específicos (Crawford et al., 2005), os cães mestiços inoculados com vírus tiveram pneumonia como comprovado por análises totais e histológicas dos pulmões dos dias 1 a 6 p.i. Além de pneumonia, os cães tiveram rinite, traqueíte, bronquite, e bronquiolite similares às descritas em cães naturalmente infectados (Crawford et al., 2005). Houve necrose epitelial e erosão do forro das vias aéreas e glândulas bronquiais com infiltração de neutrófilos e macrófagos dos tecidos submucosais (Figura 5, painéis superiores). Imuno-histoquímica detectou antígeno de H3 viral nas células epiteliais de brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais (Figura 5, painéis inferiores). Nenhuma superinfecção bacteriana estava presente. Os tecidos respiratórios dos 2 cães pseudo-inoculados estavam normais.

EXEMPLO 15 - REPLICAÇÃO DE VÍRUS EM TRAQUÉIA E PULMÕES

[00274] A traquéia e pulmões eram positivos para vírus através de RT-PCR quantitativa de tempo real em todos os cães de 1 para 6 dias p.i. (Tabela 12). O número absoluto de cópias de gene M de influenza por μl de homogeneizado de traquéia aumentou de 1 a 5 dias p.i., depois diminuiu no dia 6. O número absoluto de cópias de gene M por μl de homogeneizado pulmonar diminuiu de 1 a 6 dias p.i. Em geral, a traquéia continha > um logio mais vírus que o pulmão em cada um dos 6 dias p.i.

a Tempo que foram colhidos os esfregaços orofaríngeos dos cães seguindo inoculação com vírus de A/canine/FL/43/04 (H3N8). b Razões de normalização foram calculadas dividindo o M (Ct) pelo GAPDH (Ct) para cada extrato de esfregaço. c O número absoluto de cópias de gene Matriz por uL de extrato de esfregaço.

a Tempo que foram colhidos os tecidos dos cães seguindo inoculação com vírus de A/canine/FL/43/04 (H3N8). b Razões de normalização foram calculadas dividindo o M (Ct) pelo GAPDH (Ct) para cada homogeneizado de tecido. c O número absoluto de cópias de gene Matriz por uL de homogeneizado de tecido.

MATERIAIS E MÉTODOS EXEMPLARES PARA O EXEMPLO 16 CEPAS DE VÍRUS

[00275] Cepas de vírus de influenza canina como também aquelas de origem aviária, eqüina e humana (listadas na Tabela 15) foram propagadas em ovos embrionados ou células de MDCK e sua infecciosidade foi titulada por diluição de ponto terminal em embriões de galinha, ou ensaio de placa. Quantificação de vírus rápida foi executada através de ensaio de hemaglutinação usando eritrócitos de células sangüíneas vermelhas de peru.

ESPÉCIMES DIAGNÓSTICOS

[00276] Um total dos 60 tecidos de pulmão canino colhidos de casos suspeitos de doença das vias respiratórias virais durante o ano de 2005 foi testado para a presença de vírus de influenza canina.

EXTRAÇÃO DE RNA DE AMOSTRAS DE TECIDO CANINAS

[00277] Blocos de tecido pulmonar pesando entre 20 e 30 mg foram homogeneizados em um moedor de tecido descartável (Kendal). RNA total foi extraído usando um kit comercial (Míni Kit de RNeasy, Qiagen, Valença, CA) e eluído em um volume final de 60 μl, seguindo as recomendações do fabricante.

PROJETO DE INICIADORES E DE SONDAS

[00278] Alinhamentos de seqüência múltiplos dos genes H3 e M de vários subtipos e de espécies diversas foram executados usando o programa CLUSTAL X (Versão 1.8). Iniciadores de matriz (M) e sonda foram selecionados das regiões conservadas das seqüências conhecidas que correspondem aos subtipos diferentes de vírus de influenza A, enquanto o conjunto de iniciadores gene-específicos e de sonda de hemaglutinina de H3 foi selecionado para especificamente emparelhar genes do vírus de influenza A eqüina e canina e desemparelhar os genes aviários e humanos homólogos (Tabela 13). Software de projeto de iniciador (OLIGOS Versão 9.1) e as ferramentas de análise com base em rede fornecidas por EXIQON (http://lnatools.com) foram usados para cálculo de Tm e predição da estrutura secundária como também auto hibridação. Uma região conservada de um gene de rRNA de 18S foi usada como controle interno endógeno para a presença de RNA extraído da amostra de tecido canina. Os Reagentes de Ensaio Pré-desenvolvidos de TaqMan® para rRNA Eucariótico de 18S (VIC/TAMRA) (Applied Biosystems) foram usados para a detecção de tempo real de rRNA de 18S em amostras de tecido.

CONDIÇÃO DE RT-PCR DE TEMPO REAL

[00279] Uma RT-PCR de tempo real de uma etapa foi executada usando kit de Sonda de RT-PCR de Quantitect contendo ROX como uma tintura de referência passiva (Qiagen, Valença, CA). Em cada reação de RT-PCR de tempo real, 5 μl de amostra de RNA foram usados como um modelo para combinar com uma mistura de reação contendo 10 μl de 2X Mistura Máster de RT-PCR de Sonda de QuantiTech, 0,2 μl de Mistura de RT de QuantiTech, iniciadores (0,4 μM conc. final para gene de H3 ou 0,6 μM de conc. final para gene M), sonda (0,1 μM conc. final para gene H3 ou 0,2 μM de conc. final para gene M) e água livre de RNase em um volume final de 20 μl. RT-PCR de tempo real de uma etapa foi executada no Sistema de QPCR de Tempo real de Mx3005P (Stratagene). Condições de ciclismo incluíram uma etapa de transcrição reversa a 50°C durante 30 minutos. Após uma etapa de desnaturação inicial a 95°C durante 15 minutos para ativar a DNA polimerase de HotStarTaq, amplificação foi executada durante 40 ciclos incluindo desnaturação (94°C durante 15 segundos) e anelamento/extensão (60°C durante 30 segundos). Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de onda de emissão a 516 nm para detecção de H3 e de M) e de VIC (comprimento de onda de emissão a 555 nm para detecção de rRNA de 18S) foram obtidos uma vez por ciclo ao término da etapa de extensão. Aquisição de dados e análise do ensaio de tempo real de PCR foram executadas usando o software de Mx3005P versão 2.02 (Stratagene).

ESPECIFICIDADE DE CONJUNTO DE INICIADORES / SONDA DE H3 PARA INFLUENZA CANINA (H3N8) E UNIVERSALIDADE DE CONJUNTO DE INICIADORES / SONDA DE M PARA TIPO DE VÍRUS DE INFLUENZA A

[00280] Para testar a especificidade de cada conjunto de iniciadores/sonda, RNA extraído de vários subtipos conhecidos de vírus de influenza A foram usados como um modelo no ensaio de RT-PCR de tempo real (Tabela 15).

PADRÃO DE RNA PARA DETERMINAÇÃO DO DESEMPENHO DE RT-PCR DE TEMPO REAL

[00281] Os genes de vírus de influenza A canina (A/canine/Florida/242 /2003 (H3N8)) foram usados para gerar oS amplicons de PCR para H3 (nt 1-487) e M (nt 1-276) usando iniciadores ligados com promotor T7 (Tabela 13). Depois oS amplicons de PCR purificado de genes de H3 e M foram usados como modelos para transcrição in vitro usando Sistema de Transcrição de T7 de Ribossonda in vitro (Promega) seguindo as recomendações do fabricante. A concentração dos RNAs transcritos foi calculada medindo absorbância a 260 nm. Os RNAs foram depois serialmente diluídos 10 vezes, variando de 108 a 10 cópias / μl para executar os testes de sensibilidade. Além disso, uma curva padrão foi gerada representando em gráfico o log das concentrações iniciais de RNA modelo (cópias / μl) versus o ciclo de limiar (Ct) obtido de cada diluição para determinar o desempenho geral de RT-PCR de tempo real.

TESTES DE SENSIBILIDADE COMPARATIVOS ENTRE RT-PCR DE TEMPO REAL E KIT DE TESTE DE DIRECTIGEN FLU A

[00282] Vírus de matéria-prima de duas cepas virais incluindo A/Wyoming/ 3/2003 (H3N2) a 106,67 EID50/mL (HA=64) e A/canine/Florida/ 242/2003 (H3N8) a 107,17 EID50/mL (HA=16) foram usados para o ensaio de limiar de detecção. Diluição logarítmica de espécimes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (125 μl) foi usada em um kit de detecção de antígeno de influenza A rápido, Directigen Flu A, (Becton, Dickinson e Company) seguindo as instruções do fabricante. Cada dispositivo de teste de Directigen Flu A tem uma mancha de antígeno de influenza de H1N1 no centro da membrana que desenvolve como um ponto roxo e indica a integridade do teste que é com base em um anticorpo monoclonal para a nucleoproteína (NP). O desenvolvimento de um triângulo roxo que circunda o ponto é indicativo da presença de influenza NP no espécime testado. A intensidade do sinal roxo do triângulo foi registrada como + (esboço de triângulo), ++ (triângulo suavemente colorido), +++ (triângulo roxo-escuro) e ++++ (triângulo roxo-muito-escuro). RNA viral foi extraído 125 μl alíquotas de cada diluição de vírus usando MíniKit Viral de RNA de QIAamp (Qiagen, Valença, CA) e eluindo em um volume final de 50 μl. Um volume de 5 uL dos RNAs virais extraídos foi testado através de RT-PCR de tempo real para teste de sensibilidade comparativo com o kit Directigen Flu A. EXEMPLO 16

[00283] O ensaio de RT-PCR de tempo real para influenza canina conta com informação de três sondas moleculares que alvejam rRNA de 18S de célula hospedeira como também M e H3 do genoma de vírus de influenza A (Tabela 14). Amplificação do gene hospedeiro é um repórter de qualidade de espécime e integridade. Amostras clínicas, de necropsia ou de laboratório contendo o vírus de influenza canina (H3N8) são esperadas dar o sinal de amplificação com as três sondas. Espécimes que conferem o sinal de amplificação com sondas de rRNA de M e 18S mas negativas para H3 seriam indicativos de um vírus de influenza subtipo H3 de origem humana, suína ou aviária ou de subtipos não-H3. Estes casos raros poderiam ser solucionados por RT-PCR usando iniciadores universais de HA para gerar cDNA de amplicon que pode ser analisado através de seqüenciação. Espécimes corretamente colhidos e manipulados desprovidos do vírus de influenza A rendem sinal de amplificação de 18S de rRNA apenas. Situações em que apenas a sonda de rRNA de 18S e as sondas de H3 rendem sinal de amplificação são indicativas de técnica defeituosa, a menos que do contrário provado; ou um falso negativo com sondas de M ou falso positivo para H3 necessitam ser demonstrados. Por fim, espécimes não rendendo sinais de amplificação com as três sondas são indicativos de coletânea de amostra defeituosa, degradação, extração de RNA defeituosa ou a presença de inibidores as polimerases usadas em PCR.

[00284] Para testar a especificidade do conjunto de iniciadores/sonda de H3 para o vírus de influenza A canina (H3N8) e a universalidade do conjunto de iniciadores/sonda de M para tipo de influenza A, vários subtipos de vírus de influenza A foram testados através de RT-PCR de tempo real. Os resultados mostram que conjunto de iniciadores/sonda de H3 rendeu um sinal de amplificação positivo apenas com influenza canina (H3N8). Não foi observado nenhum sinal de amplificação falso positivo significativo ou não-específico em outros subtipos ou cepas humanas de H3. O conjunto de iniciadores/sonda de M rendeu sinal de amplificação positivo com todas as cepas testadas (Tabela 15). Estes resultados indicaram que os iniciadores/sonda de H3 especificamente detectam vírus de influenza A canina (H3N8) enquanto que os iniciadores/sonda de M detectam subtipos múltiplos do tipo de vírus de influenza A.

[00285] O desempenho dos ensaios de RT-PCR de tempo real foi avaliado por diluição de ponto terminal de RNAs transcritos in vitro de M e H3. Como esperado, o ciclo de limiar (Ct) aumentou em correlação direta com a diluição dos padrões de RNA. Os sinais fluorescentes podem ser detectados em diluições ods padrões de RNA de M e H3 tão baixos quanto 103 e 102 c0pias/μL, respectivamente (Figura 6A e 6B). As curvas padrão de genes M e H3 foram construídas representando em gráfico o log de concentrações de RNA de partida versus o ciclo de limiar (Ct) obtido de cada diluição (Figura 6C e 6D). O declive da curva padrão é usado para determinar a eficiência da reação de PCR que é teoricamente exponencial; 100 % de eficiência de amplificação implicaria em dobrar a concentração de amplicon a cada ciclo. As curvas padrão com um declive entre cerca de -3,1 e -3,6 são tipicamente aceitáveis para a maioria das aplicações que requerem quantificação precisa (90-110 % de eficiência de reação). Um valor de Rsq é o ajuste de todos os dados ao diagrama de curva padrão. Se todos os dados perfeitamente ficarem na linha, o Rsq será 1,00. À medida que os dados caem também da linha, Rsq diminui. Um valor de Rsq > 0,985 é aceitável para a maioria dos ensaios. A curva padrão de M revelou um declive de -3,576 (eficiência = 90,4 %) e Rsq = 1,00, enquanto que curva padrão de H3 rendeu um declive de -3,423 (eficiência = 95,9 %) e Rsq = 0,999. Estes valores indicam eficiência de amplificação satisfatória e desempenho geral dos ensaios de RT-PCR de tempo real. Atribuiram- se a eficiência inferior e sensibilidade do conjunto de iniciadores/sonda de M quando comparado ao conjunto de iniciadores/sonda de H3 à degeneração de N vezes das seqüências de iniciador de M requeridas para assegurar cobertura vasta da variabilidade de seqüências de gene M ao longo dos vírus de múltiplos subtipos, hospedeiros e linhagens.

[00286] A sensibilidade de ensaio de RT-PCR de tempo real foi também comparada com o ensaio de detecção de antígeno rápido comercial (Directigen Flu A). Diluições logarítmicas de A/Wyoming/3/2003 (H3N2) e A/canine/ Florida/242/2003(H3N8) foram analisadas com Directigen Flu A e através de RT-PCR de tempo real. Os resultados de Directigen Flu A mostraram que as sensibilidades contra ambas as cepas virais são diluição de aproximadamente 100 vezes dos vírus de matéria-prima usados nestes experimentos (Figura 7). Os sinais (cor roxa) gerados pelas amostras de vírus canino (A/canine/Florida/242/2003: 106.x PFU/ml) foram muito mais fracos que aqueles encontrados em vírus humano (A/Wyoming/3/2003: 107.x PFU/ml), de acordo com a concentração de vírus inferior nestas amostras. Alternativamente, sinal inferior para influenza canina poderia ser atribuído à especificidade molecular dos anticorpos monoclonais versus NP; isto é, conservação ruim dos aminoácidos dentro do epítopo de NP do vírus de influenza A canina.

[00287] RT-PCR de tempo real do gene M renderam valores de Ct acima do limiar com equivalentes de vírus PFU 10 e 30 por reação de A/canine/Florida/242/2003 e A/Wyoming/3/2003, respectivamente (Tabela 16). As diferenças entre o valor de sensibilidade de 2 cepas virais, porque as diferenças nas titulações virais originais. A comparação de detecção de gene H3 entre vírus de influenza canina e humana não foi executada porque os iniciadores/sonda de H3 no ensaio de RT-PCR de tempo real amplifica exclusivamente vírus de influenza A canina. RT- PCR foi 105 vezes mais sensível que o kit de detecção de antígeno rápido.

[00288] Para avaliar o desempenho do teste de RT-PCR em espécimes de necropsia de cães com doença das vias respiratórias aguda, foram testadas sessenta amostras de tecido pulmonar canino submetidas durante o ano de 2005 à presença de vírus de influenza A canina através de RT-PCR de tempo real. Um total de 12 entre 60 amostras (20 %) eram positivas com genes M e H3, enquanto que as 48 amostras restantes renderam resultado negativo para gene M e H3. Tentativas de isolamento de vírus foram conduzidas por inoculação de célula ovo e MDCK, para avaliar a especificidade do ensaio de tempo real; 2 de 12 amostras que eram positivas para RT-PCR de influenza canina renderam vírus de influenza canina (dados não mostrados, manuscrito na preparação). Embora todos os tecidos tenham sido colhidos de cães com uma história de doença severa das vias respiratórias, a maioria das amostras não rendeu nenhum vírus de influenza canina por PCR de tempo real ou isolamento convencional, sugerindo uma incidência alta de outros patógenos respiratórios tais como Bordetell bronchiseptica, sinomose canina ou vírus de parainfluenza. O ensaio de RT-PCR de tempo real de uma etapa aqui provê um método rápido, sensível e custo-eficaz para detecção de vírus de influenza A canina (H3N8). Diagnose de laboratório rápida das infecções por vírus de influenza A canina (H3N8) no estágio prematuro da doença pode prover informação relevante para o paciente clínico e gerenciamento de aparelho.

Nota: Letras maiúsculas = resíduos de LNA (Ácido nucléico preso), r = a ou g, k = g ou t, sublinhado = seqüência de promotor de T7.

* Observe que subtipos de amostras clínicas foram confirmados através de seqüenciação de nucleotídeo.

* Com base em genes disponíveis de isolados virais entre 1963 e 1998.

* Com base em genes disponíveis de isolados virais entre 1963 e 1998.

*Com base em genes disponíveis de isolados virais entre 1963 e 1998

EXEMPLO 17 - DESENVOLVIMENTO MODELO DE DESAFIO DE INFLUENZA CANINA.

[00289] O vírus de influenza canina (influenza canina), que foi isolado de epidemias de influenza na Flórida, foi observado ser um vírus de influenza do tipo H3N8, e estritamente relacionado à cepa de vírus de influenza eqüina, A/eqüino/Ohio/03 (Crawford et al., SCIENCE Vol. 309, setembro de 2005, incorporado por referência em sua totalidade nesta patente). O potencial de uso da cepa de vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03 para induzir doença com base em influenza em cães foi investigado neste estudo.

PROCEDIMENTO:

[00290] Foram obtidos dez bigles 13 semanas de idade de sexo misto de um fornecedor comercial, e alojados em jaulas individuais em uma instalação de BSL-2. Os cães foram atribuídos fortuitamente a dois grupos de 5 cães cada. Como mostrado na Tabela 26, um grupo foi submetido a um desafio intratraqueano, e o outro grupo foi submetido a um desafio oronasal. Os cães foram desafiados em 14 semanas de idade.

[00291] Um vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03 cultivado em cultura de células foi usado como o vírus de desafio. Para desafio intratraqueano, o vírus de desafio foi administrado por meio de um tubo de liberação que consistiu em um tubo traqueano embanhado (Tamanho 4,0/4,5, Sheridan, USA) e tubo de alimentação (tamanho 5Fr, 1,7 mm, 16 polegadas (41 cm) em comprimento, Kendall, USA) em 0,5 a 1,0 ml de volume. Para desafio oronasal, o vírus de desafio (107 a 108 TCID50 por cão) foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (nebulizador ultra-sônico de DeVilbiss Ultra-Neb®99, Sunrise Medical, USA) em um volume de 2 a 3 ml.

[00292] Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza durante dias 14 pós-desafio. Foram colhidas amostras de soro de cada cão no dia zero (antes do desafio), e dias 7 e 14 pós- desafio para determinar a titulação de HI usando um vírus de influenza eqüina de H3N8 com um protocolo padrão (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA). Todos os cães foram humanitariamente eutanizados e os tecidos do pulmão foram colhidos em 10 % de formalina tamponada para avaliação histopatológica.

RESULTADOS:

[00293] Os resultados deste experimento estão resumidos na Tabela 27. Sinais clínicos relacionados à influenza foram observados em alguns cães após-desafio. Estes sinais incluíram febre (>103°F; >39,4°C) e tosse. Dois dos 5 cães (isto é, 40 %) tiveram febres (>103°F; >39,4°C) no Grupo 1, comparado a 1 de 5 (isto é, 20 %) cães no Grupo 2. Um cão do grupo de desafio oronasal teve espirro, e outro teve tosse seguindo o desafio. Uma faixa de titulação de HI de 10 a 80, com uma titulação de média geométrica (GMT) de 20, foi observada para o Grupo 1. Uma faixa de titulação de 40 a 160, com uma GMT de 86, foi observada para o Grupo 2. Um cão de cada grupo teve lesões histopatológicas compatíveis ou patognômicas para influenza.

* Os animais foram desafiados com um isolado de influenza eqüina Ohio 03. ** Temperatura retal ≥39,4°C(≥103°F);

EXEMPLO 18 - EFICÁCIA DE UMA VACINA DE VÍRUS DE INFLUENZA EQÜINA PARA CÃES.

[00294] O isolado viral de influenza canina (influenza canina) de epidemias de influenza na Flórida foi observado ser um vírus de influenza do tipo H3N8, e foi referido estritamente ao vírus de influenza eqüina, A/eqüino/ Ohio/03, com base na similaridade de seqüência. O estudo a seguir foi conduzido para determinar a eficácia de uma vacina de vírus de influenza eqüina inativada experimental.

PROCEDIMENTO:

[00295] Foram obtidos nove bigles de 7 semanas de idade de sexo misto de um fornecedor comercial, e alojados em jaulas individuais em uma instalação de BSL-2. Estes cães foram atribuídos fortuitamente a dois grupos, como resumido na Tabela 28:

[00296] O primeiro grupo consistiu em 5 cães, que foram vacinados com uma vacina de A/eqüino/Ohio/03 de vírus de influenza eqüina inativado, com adjuvante de CARBIGEN®, a 8 e 12 semanas de idade por meio de via subcutâneo (SQ). O A/eqüino/Ohio/03 foi inativado através de etilenimina binária ("BEI") usando um método padrão. Cada dose da vacina continha 5 % em massa de CARBIGEN®, 4096 unidades de HA do vírus inativado, PBS suficiente para trazer o volume total da dose para 1 ml, e NaOH suficiente para ajustar o pH para entre 7,2 e 7,4. Foram colhidas amostras de soro de todos os cães no dia da primeira e da segunda vacinação e dia 7 e 14, pós-primeira e segunda vacinação, e o pré-desafio para determinar a titulação de HI usando um protocolo padrão de vírus de influenza eqüina de H3N8 (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA). Em 3 semanas pós-segunda vacinação, os 5 cães vacinados e o segundo grupo (isto é, o grupo de controle) consistindo em 4 cães com idade equiparada foram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza eqüina crescido em cultura de células A/eqüino/Ohio/03 (107,0 a 108,0 TCID50 por cão) em um volume por dose de 1-2 ml. O vírus de desafio foi administrado aos cães como uma névoa usando um nebulizador (nebulizador ultra-sônico de DeVilbiss Ultra- Neb®99, Sunrise Medical, USA). Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. Cinco cães (3 vacinados e 2 controles) 7 dias pós-desafio e 4 cães (2 controles e 2 vacinados) 14 dias pós-desafio foram humanitariamente eutanizados para coleta dos tecidos pulmonares em 10 % de formalina tamponada para avaliação histopatológica.

RESULTADOS:

[00297] Os resultados deste experimento estão resumidos nas Tabelas 29 e 30. Todos os cães vacinados soroconverteram-se seguindo a vacinação. Uma faixa de titulação de HI de 40 a 640, com o GMT de 129, foi observada durante o período de pós-vacinação com vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03, e uma titulação de HI de 160 a 320, com uma titulação de média geométrica de 211, foi observada com isolado de influenza canina, A/canine/Florida/242/03. Dois de 6 vacinados tiveram uma febre de >39,4°C (>103°F) por um dia e nenhum outro sinal clínico foi observado em quaisquer dos cães seguindo desafio.

CONCLUSÃO:

[00298] Todos os cães vacinados responderam à vacina de influenza eqüina inativada, com adjuvante de CARBIGEN®. A titulação de HI resulta com um vírus de isolado de influenza canina sugerindo que a vacina de influenza eqüina inativada induziu um nível detectável de anticorpo reativo transversal para o vírus de influenza canina. Embora o vírus de desafio usado aqui não induza nenhuma doença clínica notável em cães bigles, com base na titulação de HI com um vírus de isolado de influenza canina, foi concluído que vacina eqüina inativada poderia ser usada em cães para induzir anticorpos reativos cruzados, que poderiam proteger cães potencialmente contra doença de "influenza canina" causada pelo vírus de influenza canina do tipo H3N8.

* Os animais foram desafiados com um isolado de influenza eqüina Ohio 03 ** Vacina de Ohio 03 de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de CARBIGEN® foi usada para vacinação *** Eutanizado 7 dias pós-desafio

* Os animais foram desafiados com um isolado de influenza eqüina Ohio 03 ** Vacina de Ohio 03 de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de CARBIGEN® foi usada para vacinação 129/185 Petição 870210098781, de 26/10/2021, pág. 136/205

EXEMPLO 19 - EFICÁCIA DE UMA VACINA DE VÍRUS DE INFLUENZA EQÜINA PARA CÃES.

[00299] O vírus de influenza canina isolado de epidemias de influenza na Flórida foi caracterizado estar estritamente relacionado a vários isolados de vírus de influenza eqüina do tipo H3N8. Pela análise de similaridade de seqüência de DNA e de aminoácido foi demonstrado que o vírus de influenza canina é bem parecido a um vírus de influenza eqüina, A/eqüino/Ohio/03. O estudo a seguir foi conduzido em cães para determinar a eficácia de vacinas de influenza eqüina comercialmente disponíveis em cães.

PROCEDIMENTO:

[00300] Cerca de 20 cães mestiços de 16 meses de idade e 20 bigles de sexo misto foram usados no estudo. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 6 grupos (Tabela 31) de 6-7 cães cada. Cães nos grupos 1 e 4 foram vacinados com uma vacina de influenza eqüina inativado comercialmente disponível com adjuvante (EQUICINE II®, Intervet Inc., Millsboro, DE) a 16 e 17 meses de idade por meio de via subcutânea (SQ). Os cães nos grupos 2 e 5 que foram vacinados com uma vacina de influenza eqüino/Kentucky/91 vivo modificado em um 1 ml de volume por meio de via intranasal (uma só narina). Amostras de sangue foram colhidas no dia da vacinação, dia 7 e 14 pós- primeira vacinação (grupos 1, 2, 4, e 5) e pós- segunda vacinação (grupos 1 e 4) para determinar a titulação de HI usando um vírus de influenza eqüina de H3N8 e um vírus de influenza canina usando por um protocolo padrão (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA).

[00301] Vacinados (em 72 dias pós-vacinação final) e os controles foram desafiados oronasalmente com uma cepa de vírus de influenza eqüina cultivada em cultura de células A/eqüino/Ohio/03 (10x7,0 a 10x8,0 TCID50 por cão) em um volume de 1-2 ml. O vírus de desafio foi administrado aos cães como névoa usando um nebulizador (nebulizador ultra-sônico de DeVilbiss Ultra-Neb®99, Sunrise Medical, USA). Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 12 dias pós-desafio. Os esfregaços nasais e orofaríngeos foram colhidos no meio de MEM de Earl com antibióticos (neomicina e polimixina B) diariamente do dia -1 ao dia 12 pós-desafio para isolamento de vírus. A presença de vírus nos esfregaços indica que o animal está excretando o vírus em secreções nasais/orais. Todos os cães foram humanitariamente eutanizados no dia 12 pós-desafio e os tecidos pulmonares foram colhidos em 10 % de formalina tamponada para avaliação histopatológica.

* Não aplicável ** EQUICINE II® é comercializado por Intervet Inc. como uma vacina líquida. EQUICINE II® contém vírus de influenza A/Pennsylvania/63 inativado (ou "A/Pa/63") e vírus de influenza A/eqüino/Kentucky/93 (ou "A/KY/93") com carbopol (isto é, HAVLOGEN® (Intervet Inc.)). Mais especificamente, uma dose de EQUICINE II® contém: A/Pa/63 inativado a 106,0 EID50, A/KY/93 inativado a 106,7 EID50, 0,25 % em volume de carbopol, e PBS suficiente para criar um volume total de 1 ml. *** A/KY/91 é uma vacina secada por congelamento que foi reconstituída com água. Tal reconstituição foi conduzida usando água do tipo para vacina suficiente para trazer a dosagem de vacina para um volume total de 1 ml. A vacina continha vírus de influenza eqüino/Kentucky/91 (ou "A/KY/91"), e é debatida, por exemplo, nas patentes U. S. Nos. 6.436.408; 6.398.774; e 6.177.082, que são incorporadas por referência em sua totalidade nesta patente. Quando reconstituída, uma dose da vacina continha A/KY/91 a 107,2 TCID50 por ml, 0,015 grama de N-Z AMINE AS® por ml, 0,0025 de grama gelatina por ml, e 0,04 grama de lactose de D por ml. N-Z AMINE AS® é uma fonte refinada de aminoácidos e peptídeos produzida por hidrólise enzimática de caseína. N-Z AMINE AS® é comercializada por Kerry BioScience (Norwich, NY, USA).

RESULTADOS:

[00302] Todos cães vacinados soroconverteram-se seguindo a vacinação e as titulações de HI variaram de 10 a 80 para cães do grupo de vacina de EQUICINE II® comparadas a 10 a 40 para os cães do grupo de vacina de A/KY/91 usando um vírus de influenza eqüina (tipo H3N8).

[00303] As amostras colhidas em 2 semanas pós-vacinação (pós- segunda vacinação para vacina de EQUICINE II®) foram analisadas para determinação da titulação de HI com uma influenza canina como também com um vírus de influenza eqüina (tipo de H3N8). Os resultados de HI são mostrados na Tabela 32. Os sinais clínicos incluem febre (>103°F; >39,4°C), tosse ocasional, e secreção nasal moderada observados seguindo o desafio.

* Não aplicável

[00304] Entre os bigles, 2 de 6 cães no grupo de vacina de EQUICINE II ® (Grupo 1), 1 dos 7 cães no grupo vacina de A/KY/91 (Grupo 2) e 2 de 6 cães no grupo de controle (Grupo 3) tiveram febre. Um de 6 cães no Grupo 3 (controle) era positivo para vírus no sobrenadante de cultura de célula de material de esfregaço nasal através de ensaio de hemaglutinação com 0,25 % de células sangüíneas vermelhas de galinha (CRBC). Um de 6 cães no grupo de controle (Grupo 3) e 1 de 7 cães no grupo de vacina de A/KY/91 (Grupo 2) tiveram secreção nasal moderada durante o período de observação de pós- desafio. Não houve nenhuma diferença significativa estatística (P > 0,05) entre os grupos de controle e de vacina para cães da raça bigles.

[00305] Entre os cães mestiços, 5 de 7 cães no grupo de vacina de EQUICINE II® (Grupo 4), 1 de 7 cães no grupo de vacina de A/KY/91 (Grupo 5) e 5 de 6 cães no grupo de controle (Grupo 6) tiveram febre. Um cão de cada um do Grupo 4 e 6 teve uma secreção nasal moderada, e um cão do Grupo 5 teve uma tosse ocasional. Dois de 7 cães no grupo de vacina de EQUICINE II® (Grupo 4) e 3 de 6 cães no grupo de controle (Grupo 6) eram positivos para vírus de influenza no esfregaço nasal através de ensaio de HA. Nenhum dos cães do grupo de A/KY/91 (Grupo 5) era positivo para vírus de influenza nos materiais de esfregaço nasal.

CONCLUSÃO:

[00306] Mediante sorologia, foi demonstrado que vacinação de cães com vacinas de influenza eqüina comercialmente disponíveis estimulou uma resposta de anticorpo de influenza nível moderado. Pode haver alguma diferença de raça no desenvolvimento de sinais clínicos relacionados à influenza em cães seguindo um desafio com vírus de influenza do tipo H3N8. A vacina de influenza eqüina atenuada viva (A/KY/91) forneceu uma proteção significativa (P < 0,05) de desenvolvimento da doença clínica em temperatura retal em cães mestiços. Também, a vacina viral atenuada viva impediu a propagação do vírus de influenza nas secreções nasais.

EXEMPLO 20 - DESENVOLVIMENTO DE MODELO DE DESAFIO DE INFLUENZA CANINA

[00307] Em vista dos relatórios que induzir doença em caninos para propósitos de estudo não tiveram sucesso, o potencial para usar um vírus de influenza canina, H3N8, para desenvolver um modelo de desafio de influenza canina em cães foi investigado no estudo a seguir. PROCEDIMENTO:

[00308] Dez cães mestiços de sexo misto foram obtidos de um fornecedor comercial, e alojados em jaulas em uma instalação de BSL- 2. Os cães foram atribuídos fortuitamente a dois grupos de 5 cães cada. Como mostrado na Tabela 33, um grupo foi submetido a um desafio intratraqueano/intranasal, e o outro grupo foi submetido.

[00309] Os cães foram desafiados em aproximadamente 12 semanas de idade. Vírus de influenza canina cultivado em ovo de galinha embrionado (A/canine/Florida/242/03) foi usado como vírus de desafio. Cada cão recebeu um total de cerca de 107,2 TCID50 de vírus em ou 2 ml (para via oronasal) ou 4 ml (via intratraqueana/intranasal) de volume.

[00310] Para desafio intratraqueano/intranasal, 3 ml do vírus de desafio foram administrados primeiro na traquéia, seguido por 5 ml de PBS usando um tubo de liberação que consistiu em um tubo traqueano embanhado (Tamanho 4,5/5,0, Sheridan, USA) e tubo de alimentação (tamanho 5Fr, 1,7 mm; 41 cm (16 polegadas) em comprimento, Kendall, USA), e 1 ml de vírus de desafio, seguido por 3 ml de ar atmosférico foram administrados nas narinas usando uma seringa.

[00311] Para desafio oronasal, o vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®, DVM Pharmaceuticals, Inc., Miami, FL) em cerca de 2 ml de volume. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. Os cães foram eutanizados no dia 14 pós-desafio, e amostras de tecido (pulmão e traquéia) foram colhidas em 10 % de formalina tamponada para exame histopatológico

RESULTADOS:

[00312] Todos cães nos grupos 1 e 2 desenvolveram sinais clínicos de influenza canina dentro de 24 a 48 horas. Cada cão teve 2 ou mais dos sinais clínicos a seguir: febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, entalo, Hemoptise, e estertores audíveis. Tecidos pulmonares de 5 de 5 cães do grupo 1 e 4 de 5 cães do grupo 2 tiveram lesões histopatológicas que incluíram um ou mais dos seguintes: broncopneumonia supurativa difusa, bronquite/bronquiolite com tampões de exsudato neutrofílico nos lumens e agregação de células mononucleares marcadas no tecido mucosa e peribronquiolar, exsudato misturado dentro dos alvéolos com números grandes de macrófagos espumosos, plasma linfocelular e celular como também infiltração de célula granulocítica, e espessamento de septos alveolares com proliferação de pneumócitos do tipo II compatível ou patognômica para uma infecção do vírus de influenza. As amostras de tecido de traquéia eram normais.

CONCLUSÃO:

[00313] Um isolado de influenza canina de H3N8 tal como o usado neste estudo pode ser usado para induzir doença de influenza canina em cães usando um dos métodos descritos neste estudo ou um método similar.

EXEMPLO 21 - DESAFIO DE MODELO DE DESENVOLVIMENTO DE INFLUENZA CANINA

[00314] O potencial para usar um vírus de influenza canina, H3N8, para desenvolver um modelo de desafio de influenza canina em cães foi também investigado no estudo a seguir. PROCEDIMENTO:

[00315] Quinze cães mestiços de 17 - 18 semanas de idade e cinco bigles de 15 semanas de idade foram obtidos de fornecedores comerciais, e foram alojados em jaulas em uma instalação de BSL-2. Os cães mestiços foram atribuídos fortuitamente a 3 grupos (Grupos 1 a 3) de 5 cães cada. Todos os bigles foram atribuídos a um grupo (Grupo 4) como mostrado na Tabela 34:

[00316] Os cães foram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento, A/Canine/Florida/242/2003 (isolado de pulmão de um cão galgo com doença de influenza canina (fornecido por Dr. Cynda Crawford na Universidade de Flórida)). O vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) em cerca de 2 ml de volume. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio.

RESULTADOS:

[00317] Oitenta por cento (4 de 5) dos cães nos Grupos 1 e 4, 100 % dos cães nos Grupos 2 e 3, desenvolveram sinais clínicos de influenza canina dentro de 48 horas. Cada cão teve um ou mais dos sinais clínicos a seguir: febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, entalo, e estertores. Os sinais clínicos observados nos bigles foram em geral mais moderados e de curso curto comparados aos cães mestiços. CONCLUSÃO:

[00318] Um isolado de influenza canina de H3N8 tal como o usado neste estudo pode ser usado por induzir doença semelhante à influenza canina ou tosse canil em cães usando o método descrito neste estudo ou um método similar com uma faixa de dose de desafio de 104,8 a 106,8 TCID50. Houve algumas diferenças nos sinais clínicos observados em cães mestiços e bigles. Em geral, bigles tendem a ter sinais clínicos relacionados à influenza mais moderados comparados aos cães mestiços.

EXEMPLO 22 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CANINA.

[00319] O estudo a seguir foi conduzido para avaliar a eficácia de uma vacina de influenza eqüina de H3N8 em cães contra vírus de influenza canina. PROCEDIMENTO:

[00320] Dezessete cães mestiços de 14 semanas de idade e dez bigles de 8 semanas de idade foram obtidos de fornecedores comerciais. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 5 grupos como mostrado na Tabela 35, e alojados em uma instalação de pesquisa.

[00321] A vacina usada neste estudo era uma vacina de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02). Para preparar esta vacina, o vírus foi inativado através de etilenimina binária (BEI) usando um método padrão. Cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % de timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml.

[00322] Os cães nos Grupos 1 e 4 foram vacinados com 2 doses da vacina. A segunda dose (isto é, o reforço) foi administrada 4 semanas após a primeira. Os cães no Grupo 2 foram vacinados com 1 dose em 18 semanas de idade. Amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titulação de HI usando um protocolo padrão (por exemplo, SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA) com um isolado de influenza canina de H3N8 nos dias zero (antes da vacinação), 7, e 14 pós primeira e segunda vacinações. Cerca de 5 dias antes do desafio, os cães foram movidos para uma instalação de BSL-2 e alojados em jaulas individuais.

[00323] Todos os vacinados e cães de controle com idade equiparada foram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento (107,7 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação dos Grupos 1 a 4 e primeira vacinação do Grupo 2. O vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) a 2 ml por cão. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 17 dias pós-desafio. Esfregaços nasais e orofaríngeos foram colhidos em tubos contendo 2 ml de meio de transporte de vírus para isolamento de vírus do dia -1 (isto é, um dia antes do desafio) ao dia 17 pós-desafio. Todos os cães foram eutanizados no dia 17 pós-desafio e amostras pulmonares e traqueanas foram colhidas em 10 % de formalina tamponada para histopatologia. Foram colhidas amostras de sangue nos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação da titulação de HI. As tarefas de contagem de sinal clínico usadas para a observação pós- desafio estão mostradas na Tabela 36. RESULTADOS:

[00324] Todos os cães nos grupos de vacinação de 2 doses (Grupo 1 e 4) desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de HI ao vírus de isolado de influenza canina (Tabela 37). Seguindo o desafio, cerca de um aumento de 4 vezes na titulação no dia 14 pós-desafio em todos os grupos indiretamente indicou que todos os cães foram expostos ao vírus de desafio. Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais a seguir de influenza canina: febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, e dispnéia. Vacinados tiveram sinais clínicos menos severos, comparados aos controles com idade equiparada (Tabela 38). Houve uma redução significativa nos sinais clínicos devido à vacinação de 2 doses em ambos os cães de 8 semanas de idade (P = 0,040) e 14 semanas de idade (P = 0,003) (Grupos 4 e 1 respectivamente). Neste experimento, a vacinação de uma dose não forneceu uma redução significativa (P = 0,294) nos sinais clínicos (Grupo 2).

[00325] Resultados de isolamento de vírus estão mostrados na Tabela 39. Entre os cães de 14 semanas de idade, o vírus de influenza canina foi isolado das amostras de esfregaço colhidas de 2 de 7 cães (29 %) do grupo de vacina de 2 doses (Grupo 1), 3 de 5 cães (60 %) do grupo de vacina de 1 dose (Grupo 2), e 5 de 5 cães (100 %) do grupo de controle (Grupo 3). Entre os cães 8 semanas de idade, o vírus foi isolado de 1 de 5 cães (20 %) do grupo de vacina de 2 doses (Grupo 4), e 4 de 5 cães (80 %) do grupo de controle (Grupo 5). Houve uma redução significativa (P = 0,003) no número de cães positivos para vírus de influenza canina em amostras de esfregaço devido à vacinação de 2 doses (Grupos 1 e 4) comparado aos controles não-vacinados (Grupos 3 e 5). Embora houvesse uma redução no número de cães (60 % vs. 100 %) positivos para vírus de influenza canina em amostras de esfregaço entre o grupo de vacina de 1 dose (Grupo 2) e o grupo de controle (Grupo 3), a diferença não era estatisticamente significativa (P = 0,222).

[00326] Avaliação histopatológica de amostras de tecido pulmonar e traqueano para lesões foi conduzida para identificar lesões compatíveis ou patognômicas para doença de influenza canina. Esta inclui, por exemplo, determinação se um ou mais dos seguintes existem: áreas com broncopneumonia supurativa; peribronquite/peribronquiolite com agregação de células mononucleares (linfócitos, células plasmáticas); presença de tampões de restos celulares granulocíticos nos lúmens; hiperplasia do epitélio respiratório; exsudato misturado nos alvéolos com quantidade grande de células granulocíticas e restos celulares; agregados (espumosos) de macrófagos, células plasmáticas, e linfócitos; e espessamento dos septos alveolares com proliferação de pneumócitos do tipo II.

[00327] Tabela 40 fornece um sumário da extensão das lesões neste experimento para os cães. Entre os cães de 14 semanas de idade, as lesões pulmonares eram menos extensivas e menos severas em 5 de 7 cães no grupo de vacinação de 2 doses (Grupo 2), e 4 de 5 cães no grupo de vacinação de 1 dose (Grupo 1). Todos cães de controle (Grupo 3) tiveram lesões severas e extensivas sugestivas de nenhuma proteção. Não houve nenhuma diferença nas lesões traqueanas devido à vacinação de 1 ou 2 doses entre os cães de 14 semanas de idade. Entre os cães 8 semanas de idade, não houve nenhuma diferença nas lesões pulmonares entre os cães com vacina de 2 doses e de controle. Nenhum dos cães teve qualquer lesão traqueana.

CONCLUSÃO:

[00328] Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas de anticorpo de HI reativas cruzadas de vírus de influenza canina em cães vacinados, (2) uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a severidade da doença do vírus de influenza canina em cães, e (3) uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a excreção de vírus em secreções nasais e/ou orais.

* Primeira vacinação - Grupos 1 e 4 ** Segunda vacinação - Grupos 1 e 4; Primeira vacinação - Grupo 2 *** Dia do desafio

* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 8.2 (os grupos de vacina foram comparados usando o teste de soma de classificação de Wilcoxon)

"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza "+/-" Lesão moderada (inconclusa) "-" Normal

EXEMPLO 23 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CANINA

[00329] O estudo a seguir foi conduzido para determinar a eficácia de uma vacina de influenza eqüina multivalente de H3N8 contra vírus de influenza canina em cães. PROCEDIMENTO:

[00330] Dezessete bigles de 15 semanas de idade foram obtidos de um fornecedor comercial. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 3 grupos como mostrado na Tabela 41, e alojados em uma instalação de pesquisa.

[00331] A vacina usada neste estudo foi uma vacina de influenza eqüina inativada com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02, A/eqüino/KY/ 93, e A/eqüino/NM/2/93). Para preparar esta vacina, os vírus foram inativados através de etilenimina binária (BEI) usando um método padrão. Cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 2048 unidades de HA de cada um do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml.

[00332] Os cães no Grupo 1 foram vacinados com 2 doses da vacina. A segunda dose (isto é, reforço) foi administrada 4 semanas após a primeira dose. Os cães no Grupo 2 foram vacinados com 1 dose de vacina em 19 semanas de idade. Amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titulação de HI usando um protocolo padrão com um isolado de influenza canina de H3N8 nos dias zero (antes da vacinação), 7, e 14 pós-primeira e pós-segunda vacinações. Sete dias antes do desafio, os cães foram removidos para uma instalação de BSL-2 e alojados em jaulas individuais.

[00333] Todos cães de controle vacinados e de idade equiparada foram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento (107,3 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação do Grupo 1 e pós-primeira vacinação do Grupo 2. O vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) a 2 ml por cão. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza durante 14 dias pós-desafio. Todos os cães foram eutanizados no dia 14 pós-desafio, e amostras de pulmão e traquéia foram colhidas em 10 % de formalina tamponada para histopatologia. As amostras de sangue foram colhidas nos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação da titulação de HI. As tarefas de contagem de sinal clínico usadas para a observação pós- desafio estão mostradas na Tabela 42.

RESULTADOS:

[00334] Todos cães vacinados desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de HI ao isolado de vírus de influenza canina (Tabela 43). Seguindo o desafio, cerca de um aumento de 4 vezes na titulação de HI no dia 14 pós-desafio comparado indiretamente à titulação de HI pré-desafio em todos os grupos indica que todos os cães foram expostos ao vírus de desafio. Todos os cães exibiram sinais doença de influenza canina com cada cão demonstrando um ou mais dos sinais clínicos a seguir: febre >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, e dispnéia. Vacinados tiveram sinais clínicos menos severos, comparados aos controles com idade equiparada (Tabela 44). Houve uma redução significativa (P = 0,028) nos sinais clínicos devido à vacinação de 2 doses em cães (Grupo 1). Uma vacinação de dose não forneceu uma redução significativa (P = 0,068) nos sinais clínicos (Grupo 2).

[00335] Como no Exemplo 22, avaliação histopatológica de amostras de tecido pulmonar e traqueano para lesões foi conduzida para identificar as lesões compatíveis ou patognômicas para doença de influenza canina. Tabela 45 fornece um sumário da extensão das lesões neste experimento para os cães. Entre cães de 15 semanas de idade, a vacinação de cães com 1 dose ou 2 doses impediu as lesões pulmonares em todos os cães. Quatro de 5 cães de controle (80 %) tiveram broncopneumonia supurativa severa consistente com uma doença de influenza. Um dos 7 cães do grupo de vacina de 2 doses (Grupo 1) e 1 de 5 cães do grupo de controle (Grupo 3) tiveram lesões de traquéia moderadas sugestivas de traqueíte que poderiam ser atribuídas à doença de influenza.

CONCLUSÃO:

[00336] Os resultados deste estudo demonstram que 1) Vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas reativas cruzadas do anticorpo de vírus de influenza canina HI em cães vacinados, e 2) Uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a severidade da doença do vírus de influenza canina em cães.

* Primeira vacinação - Grupo 1 / ** Segunda vacinação - Grupo 1; Primeira vacinação - Grupo 2 / *** Dia de desafio

* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 8.2 (os grupos de vacina foram comparados usando o teste de soma de classificação de Wilcoxon)

"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza "+/-" Lesões moderadas (inconclusas) "-" Normal

EXEMPLO 24 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CANINA

[00337] O estudo a seguir foi conduzido para determinar: (1) a eficácia das vacinas de influenza eqüina de H3N8 monovalente versus multivalente contra vírus de influenza canina em cães, e (2) o efeito da via de administração na eficácia da vacina.

PROCEDIMENTO:

[00338] Trinta cães mestiços de 10 semanas de idade foram obtidos de um fornecedor comercial. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 6 grupos como mostrado na Tabela 46, e alojados em uma instalação de pesquisa.

[00339] Três tipos de vacinas (VAX-1, VAX-2, e VAX-3) foram usados. O VAX-1 era uma vacina monovalente de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02), e cada dose continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % de timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml. O VAX-2 era uma vacina monovalente de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02), e cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 4096 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml. O VAX-3 era uma vacina multivalente de influenza eqüina inativada com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02, A/eqüino/KY/93, e A/eqüino/NM/2/93), e continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 2048 unidades de HA de vírus inativado por cepa, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml. Todos os vírus de influenza usados para a formulação de vacina foram inativados através de etilenimina binária (BEI) usando um método padrão.

[00340] As vacinas e vias de administração para cada grupo são descritas na Tabela 46. Todos cães nos grupos vacinados foram vacinados por meio da via intranasal (IN) ou via subcutânea (SQ), e cada cão recebeu 2 doses. A segunda dose (isto é, reforço) foi administrada 4 semanas após a primeira dose. As amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titulação de HI usando um protocolo padrão com um isolado de influenza canina de H3N8 nos dias zero (antes da vacinação), 7, e 14 pós-primeira e pós-segunda vacinações. Sete dias antes do desafio, os cães foram movidos da uma instalação de BSL-2 e alojados em jaulas individuais.

[00341] Todos os cães vacinados e de controle de idade equiparada foram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento (107,4 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação. O vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) em um volume de 2 ml por dia. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. As amostras de sangue foram colhidas nos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação de titulação de HI. Todos os cães foram eutanizados no dia 14 pós- desafio, e amostras do pulmão e da traquéia foram colhidas em 10 % de formalina tamponada para histopatologia. As tarefas de contagem de sinal clínico usadas para a observação pós-desafio estão mostradas na Tabela 47.

RESULTADOS:

[00342] Todos os cães vacinados por meio da via de SQ desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de HI para o isolado de vírus de influenza canina, independente do tipo de vacina (Tabela 48). Nenhum dos cães dos grupos de vacinação IN (isto é, Grupos 1, 3, e 5) desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de HI para o vírus de isolado de influenza canina, independente do tipo de vacina, durante o período de pós vacinação. Porém, houve um aumento de 4 vezes na titulação 14 pós-desafio em todos os cães indiretamente, indicando que todos os cães foram expostos ao vírus de desafio (Tabela 47).

[00343] Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais clínicos a seguir de influenza canina: febre >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, e dispnéia. Vacinados tiveram sinais clínicos menos severos, comparados aos controles com idade equiparada (Tabela 49). Houve uma redução significativa nos sinais clínicos em cães vacinados com VAX-3 por meio da via de SQ (Grupo 4). Neste experimento, administração de IN ou VAX-1, VAX-2, ou VAX-3 não forneceu uma redução significativa nos sinais clínicos de vírus de influenza canina.

[00344] Como nos Exemplos 22 e 23, avaliação histopatológica das amostras de tecido pulmonar e traqueana para lesões foi conduzida para identificar lesões compatíveis ou patognômica para doença de influenza canina. Tabela 50 fornece um sumário da extensão das lesões neste experimento para os cães. Cinco dos 5 cães de controle (Grupo 6) tiveram consistência de lesões pulmonar com uma infecção de influenza. Dois dos 5 cães vacinados com VAX-2 por meio da via SC (Grupo 2) e 3 dos 5 cães vacinados com VAX-3 por meio da via de SC (Grupo 4) estavam livres de qualquer lesão pulmonar relacionada à influenza. Todos os cães que receberam a vacina por meio da via intranasal, independente do tipo de vacina, tiveram lesões pulmonares severas consistentes com uma infecção de influenza. As lesões de traquéia observadas neste estudo eram muito moderadas.

CONCLUSÃO:

[00345] Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas reativo cruzadas de anticorpo de HI do vírus de influenza canina em cães vacinados por meio da via SQ, (2) administração intranasal de vacina monovalente (VAX-1 e VAX-2) ou multivalente (VAX-3) não foi eficaz em cães, e (3) administração subcutânea de vacina multivalente (VAX- 3) forneceu uma redução significativa (P = 0,016) na severidade da doença de vírus de influenza canina em cães.

* Primeira vacinação ** Segunda vacinação *** Dia do desafio

* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 8.2 (os grupos de vacina foram comparados usando o teste de soma de classificação de Wilcoxon)

"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza "+/-" Lesão moderada (inconclusa) "-" Normal

EXEMPLO 25 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CANINA

[00346] Doença de influenza canina é causada por um vírus de influenza de H3N8 (CIV). CIV é muito estritamente relacionado ao vírus de H3N8 eqüino (Crawford et al., 2005) e infeta todos os cães expostos. Cerca de 80 % dos cães expostos desenvolvem sinais clínicos. No estudo a seguir a eficácia de uma vacina de vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 e uma vacina de vírus de influenza canina foi determinada.

PROCEDIMENTO:

[00347] Trinta e cinco bigles e cinco cães mestiços foram usados neste estudo. Bigles foram atribuídos fortuitamente a três grupos (Tabela 51). Todos os cães mestiços foram atribuídos ao grupo de controle (Grupo 3). Todos os cães foram alimentados com uma dieta de crescimento padrão e água estava disponível à vontade.

[00348] Os cães nos Grupos 1 e 2 foram vacinados com VAX-1 ou VAX-2 (Tabela 51). VAX-1 era uma vacina de vírus de influenza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02). Para preparação da vacina, o vírus de vacina foi inativado através de etilenimina binária (BEI) usando um método padrão. Cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para 1 ml e NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2.

[00349] VAX-2 era uma vacina de antígeno de influenza canina inativada, com adjuvante de CARBIGEN®, (A/canine/Fl/43/2004). O A/canine/Fl/ 43/2004 foi inativado através de etilenimina binária ("BEI") usando um método padrão. Cada dose da vacina continha 5 % em massa de CARBIGEN®, aproximadamente 1280 unidades de HA do vírus inativado, PBS suficiente para trazer o volume total da dose para 1 ml, e NaOH suficiente para ajustar o pH para entre 7,2 e 7,4. As amostras de soro de todos os cães foram colhidas no dia das primeira e segunda vacinações, dias 7 e 14 pós-primeira e pós-segunda vacinações, e no pré-desafio para determinar as titulações de HI usando um protocolo padrão de vírus de influenza eqüina de H3N8 (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA). Sete dias antes do desafio, os cães foram movidos para uma instalação de ABSL-2 e alojados em jaulas individuais.

[00350] Todos cães vacinados e de controle de idade equiparada foram desafiados oronasalmente com vírus de influenza canina virulento (107,2 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação. O vírus de desafio foi administrado como uma névoa (2 ml/cão) usando um nebulizador (Nebulair®). Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. Esfregaços nasais e orofaríngeos foram colhidos diariamente em tubos contendo 2 ml de meio de transporte de vírus para isolamento do vírus do dia -1 (isto é, um dia antes de desafio) ao dia 14 pós-desafio. Amostras de sangue foram colhidas nos dias 7 e 14 pós- desafio para determinação de titulação de HI. As tarefas de contagem de sinal clínico usadas para observação de pós-desafio são mostradas na Tabela 52.

RESULTADOS:

[00351] Todos cães vacinados (Grupos 1 e 2) desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de HI ao vírus de isolado de influenza canina (Tabela 53). Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais a seguir de influenza canina: febre >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, e anorexia. Vacinados tinham sinais clínicos menos severos, comparados aos controles com idade equiparada (Tabela 54). Houve uma redução significativa (P < 0,001) nos sinais clínicos em cães vacinados com VAX-1 (Grupo 1) ou VAX-2 (Grupo 2).

[00352] Os resultados do isolamento de vírus estão mostrados nas Tabelas 55 e 56. Seguindo um desafio de vírus de influenza canina virulento, o vírus de influenza canina foi isolado de 5 de 15 (33 %) cães do Grupo 1 (VAX-1), 0 de 5 (0 %) cães do Grupo 2 (VAX-2) e 17 de 20 (85 %) de controles (Grupo 3). Tanto a vacina de influenza eqüina inativada (VAX-1) como a vacina de vírus de influenza canina (VAX-2) demonstraram uma redução significativa (P = 0,004) na eliminação do vírus em secreções nasais ou orais ou ambas (Tabela 55) comparados aos controles.

CONCLUSÃO:

[00353] Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vacinas de vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 e de vírus de influenza canina podem induzir respostas reativas de anticorpo de HI de vírus de influenza canina em cães vacinados, (2) uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 ou de vírus de influenza canina pode reduzir a severidade da doença do vírus de influenza canina em cães, e (3) uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 ou de vírus de influenza canina pode reduzir a excreção de vírus em secreções nasais e/ou orais.

* Primeira vacinação ** Segunda vacinação *** Dia do desafio

* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 9.1 (os grupos de vacina foram comparados usando o procedimento de GLM)

* Analisado usando um procedimento de FREQ de SAS® (Versão 9.1) e valor P associado ao teste exato de Fisher

N - Nenhum vírus isolado de esfregaços orais ou nasais P - Vírus isolado de esfregaços nasais ou orais ou nasais e orais.

[00354] As palavras "compreendem", "compreende", e "compreendendo" nesta patente (incluindo as reivindicações) são para ser interpretadas inclusivamente ao invés de exclusivamente. Esta interpretação é intencionada ser igual à interpretação que estas palavras são dadas sob lei de patentes dos Estados Unidos.

[00355] A descrição detalhada acima das modalidades preferidas é intencionada apenas para familiarizar outros versados na técnica com a invenção, seus princípios, e sua aplicação prática de forma que outros versados na técnica possam adaptar e aplicar a invenção em suas numerosas formas, como elas podem ser melhores adaptadas aos requerimentos de um uso particular. Portanto, esta invenção não é limitada às modalidades acima, e pode ser variadamente modificada.

[00356] Deveria ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou alterações na luz da mesma serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e serão incluídas dentro do espírito e esfera deste pedido de patente.

REFERÊNCIAS

[00357] Patente U. S. No 5.106.739

[00358] Patente U. S. No 5.034.322

[00359] Patente U. S. No 6.455.760

[00360] Patente U. S. No 6.696.623

[00361] Patente U. S. No 4.683.202

[00362] Patente U. S. No 4.683.195

[00363] Patente U. S. No 4.800.159

[00364] Patente U. S. No 4.965.188

[00365] Patente U. S. No 5.994.056

[00366] Patente U. S. No 6.814.934

[00367] Patente U. S. No 6.436.408

[00368] Patente U. S. No 6.398.774

[00369] Patente U. S. No 6.177.082

[00370] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20040078841

[00371] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20040067506

[00372] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20040019934

[00373] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20030177536

[00374] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20030084486

[00375] Pedido de Patente Publicado U. S. No 20040123349 Greyhound Daily News, 1/28/99. National Greyhound Association (NGA), Abilene, Kansas. http://www.NGAgreyhounds.com. Comunicação pessoal, Dr. William Duggar, veterinário no Palm Beach Kennel Club, West Palm Beach, Flórida. Altschul, S. F. et al. (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215:402-410. Altschul, S. F. et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs" Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. An, G. (1987) "Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis" Methods Enzymol. 153:292-305. Beltz, G. A., Jacobs, K. A., Eickbush, T. H., Cherbas, P. T., Kafatos, F. C. (1983) "Isolation of multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods" Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman e K. Moldave [eds.] Academic Press, Nova Iorque 100:266-285. Burleson, F. et al. (1992) Virology: A Laboratory Manual (Academic Press). Byars, N. 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Claims (37)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus influenza isolado que é capaz de infectar um animal canídeo e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o referido vírus influenza compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, e/ou o referido vírus influenza compreende um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; e em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado tem um sorotipo HA de H3.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado tem o sorotipo H3N8.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado compreende um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado é o isolado viral designado como canine/ Jacksonville/2005.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado é inativado ou atenuado.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza isolado é fornecido em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus rearranjado e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em o referido vírus rearranjado compreende pelo menos um polinucleotídeo de um vírus influenza que compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, e/ou o referido vírus influenza compreende um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus da influenza canina isolado que é capaz de infectar um animal canídeo e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o vírus da influenza canina isolado compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina (HA) em que o dito polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácido, ou o dito polinucleotídeo codifica a sequência madura da SEQ ID NO: 77, em que a sequência de sinal de 16 aminoácidos N-terminal da sequência completa da proteína HA foi removida da SEQ ID NO: 78; em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido vírus influenza compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e tem uma sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácido.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo HA do referido isolado viral compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, ou a sua forma madura em que os 16 aminoácidos N-terminais foram removidos.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido vírus influenza compreende um polinucleotídeo com a sequência nucleotídica mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido vírus influenza é inativado ou atenuado.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo isolado e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o referido polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo a sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracte-rizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo isolado compreende a sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo isolado e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o referido polinucleotídeo isolado compreende todo ou parte de um segmento genômico ou gene de um vírus influenza, como definido na reivindicação 9, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HA, como definido na reivindicação 9 ou reivindicação 11; em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, e em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo de HA isolado e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, em que o referido polipeptídeo de HA isolado é codificado por um polinucleotídeo como definido na reivindicação 16; em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

19. Construção de expressão de polinucleotídeo, caracteri-zada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo a sequência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos; operacionalmente ligado às sequências promotora e terminadora da transcrição heretólogas.

20. Construçãoo de expressão de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor viral recombinante.

21. Construção de expressão de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o referido vetor viral compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína hemaglutinina (HA) em que o dito polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 77, ou uma sequência de nucleotídeo degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos ou o dito polinucleotídeo codifica a forma madura da SEQ ID NO: 77, em que os 16 aminoácidos do N-terminal da proteína HÁ são removidos da SEQ ID NO: 78, em que a referida proteína HA madura compreende uma serina na posição 82, uma leucina na posição 221, uma treonina na posição 327 e uma treonina na posição 482 da sequência de aminoácidos.

22. Construção de expressão de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 77 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

23. Construção de expressão de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o referido vetor viral é de adenovírus, avipox, herpesvírus, vírus vaccinia, canarypox, entomopox, swinepox ou vírus do Nilo Ocidental.

24. Construção de expressão de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o referido vetor viral é de adenovírus, avipox, herpesvírus, vírus vaccinia, canarypox, entomopox, swinepox ou vírus do Nilo Ocidental.

25. Construção de expressão de polinucleotídeo, caracteri-zado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 16; provido com um veículo ou adjuvante farmaceu- ticamente aceitável, em que o referido veículo ou adjuvante é um componente artificial.

26. Vacina contra influenza canina, caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno do vírus influenza canina como definido na reivindicação 1 ou um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

27. Vacina de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus inativado.

28. Vacina de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus atenuado.

29. Vacina contra inluenza canina, caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um vírus da influenza, como definido na reivindicação 9, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

30. Vacina, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus inativado.

31. Vacina, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus vivo atenuado.

32. Kit para proteger um canino de uma infecção do vírus influenza H3, caracterizado pelo fato de que compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina que compreende pelo menos um vírus influenza canina como definido na reivindicação 1 ou um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, e pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em: um aparelho para administrar a vacina ao canino, um excipiente farmaceuticamente aceitável que auxilia na administração da vacina ao canino, um excipiente farmaceuticamente aceitável que intensifica a resposta imune do canino à vacina, um alimento a ser consumido pelo canino simultaneamente com a vacina, e um medicamento para ser consumido pelo canino simulta-neamente com a vacina.

33. Kit de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende duas doses da vacina, e as duas doses juntas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina.

34. Kit de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende um aparelho para administrar subcutaneamente a vacina ao canino.

35. Kit de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende um aparelho para administrar por via intranasal a vacina ao canino.

36. Uso de um vírus influenza como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica, vacina e/ou kit para detecção de um vírus influenza que é capaz de infectar um animal canídeo, para induzir uma resposta imune em um animal contra um vírus influenza capaz de infectar um animal canídeo.

37. Método in vitro para detecção de um vírus influenza que é capaz de infectar um animal canídeo, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma amostra biológica de um animal e triar a referida amostra para a presença de um anticorpo ou um ligante que se liga a uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo de um vírus influenza como definido na reivindicação 1.