BR122021000924B1

BR122021000924B1 - POLYPEPTIDE, ITS MANUFACTURING METHOD, BACTERIAL, YEAST OR FUNGAL HOST CELL, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, DIAGNOSTIC KIT, AND DIAGNOSTIC METHOD

Info

Publication number: BR122021000924B1
Application number: BR122021000924-4A
Authority: BR
Inventors: Sanjaya Singh; Alisa K. Waterman; Erik Depla; Toon Laeremans; Diane VAN HOORICK; Cedric Jozef Néotère Ververken
Original assignee: Ablynx N.V.
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2023-07-04

Abstract

A presente invenção refere-se a polipeptídeos de ligação de CX3CR1, em particular polipeptídeos que compreendem domínios de imunoglobulina específicos. A invenção também refere-se a ácidos nucléicos codificando semelhantes polipeptídeos; a métodos para preparar semelhantes polipeptídeos; a células hospedeiras expressando ou capazes de expressar semelhantes polipeptídeos; a composições compreendendo semelhantes polipeptídeos; e a utilizações de semelhantes polipeptídeos ou semelhantes composições, em particular para fins profiláticos, terapêuticos e de diagnóstico.The present invention relates to CX3CR1 binding polypeptides, in particular polypeptides comprising specific immunoglobulin domains. The invention also relates to nucleic acids encoding similar polypeptides; to methods for making similar polypeptides; to host cells expressing or capable of expressing similar polypeptides; to compositions comprising similar polypeptides; and to uses of similar polypeptides or similar compositions, in particular for prophylactic, therapeutic and diagnostic purposes.

Description

FIELD OF THE INVENTION

[001] A presente invenção se refere a polipeptídeos de ligação de CX3CR1, em particular polipeptídeos os quais compreendem domínios de imunoglobulina específicos. A invenção também se refere a ácidos nucléicos codificando semelhantes polipeptídeos; a métodos para preparar semelhantes polipeptídeos; a células hospedeiras expressando ou capazes de expressar semelhantes polipeptídeos; a composições compreendendo semelhantes polipeptídeos; e a utilizações de semelhantes polipeptídeos ou semelhantes composições, em particular para fins profiláticos, terapêuticos e de diagnóstico.[001] The present invention relates to CX3CR1 binding polypeptides, in particular polypeptides which comprise specific immunoglobulin domains. The invention also relates to nucleic acids encoding similar polypeptides; to methods for making similar polypeptides; to host cells expressing or capable of expressing similar polypeptides; to compositions comprising similar polypeptides; and to uses of similar polypeptides or similar compositions, in particular for prophylactic, therapeutic and diagnostic purposes.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[002] A CX3CR1 é uma proteína de membrana integral acoplada à proteína G, a qual é um receptor de quimniocina. É expressada pre-dominantemente sobre tipos celulares tais como monócitos, células dendríticas e células T que têm sido associados com a iniciação e a progressão de placas ateroscleróticas. É hiperregulada em monócitos por lipídeos oxidados e media a migração destas células para dentro e sobrevida dentro das placas. Seu único ligante fractalcina (FKN) é expressado sobre a superfície de células endoteliais vasculares e musculares lisas em lesões onde modula a adesão dos leuócitos. A frac- talcina também é liberada na circulação por clivagem proteolítica onde funciona como um agente quimiotático.[002] CX3CR1 is an integral membrane protein coupled to G protein, which is a chemokine receptor. It is expressed predominantly on cell types such as monocytes, dendritic cells and T cells that have been associated with the initiation and progression of atherosclerotic plaques. It is upregulated in monocytes by oxidized lipids and mediates the migration of these cells into and survival within plaques. Its unique ligand fractalkine (FKN) is expressed on the surface of vascular endothelial and smooth muscle cells in lesions where it modulates leukocyte adhesion. Fractalkine is also released into the circulation by proteolytic cleavage where it functions as a chemotactic agent.

[003] Em seres humanos, foi demonstrado que uma variante de CX3CR1 (V249I/T280M) com atividade reduzida está associada com um menor risco de doença cardiovascular (doença cardíaca coronária, doença cerebrovascular ou doença vascular periférica) (McDermott, 2001; Circ Res 89:401), doença das artérias coronárias (evidência an- giográfica de estenose) (McDermott, 2003; J. Clin. Invest. 111:1241), e doença oclusiva da artéria carótida (Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276). CX3CR1 colocalizou com fractalcina a qual apresentou aumentada imunocoloração por anticorpos policlonais dentro de placas ateroscle- róticas (Wong, 2002 Cardiovasc. Path. 11:332). Não foi observada coloração de fractalcina em regiões arteriais não de placas.[003] In humans, a CX3CR1 variant (V249I/T280M) with reduced activity has been shown to be associated with a lower risk of cardiovascular disease (coronary heart disease, cerebrovascular disease, or peripheral vascular disease) (McDermott, 2001; Circ Res 89:401), coronary artery disease (angiographic evidence of stenosis) (McDermott, 2003; J. Clin. Invest. 111:1241), and carotid artery occlusive disease (Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276). CX3CR1 colocalized with fractalkine which showed increased immunostaining by polyclonal antibodies within atherosclerotic plaques (Wong, 2002 Cardiovasc. Path. 11:332). Fractalkine staining was not observed in non-plaque arterial regions.

[004] Vários estudos genéticos independentes em camundongos demonstraram um defeito benéfico da deficiência de CX3CR1 sobre a aterosclerose. Foi vista uma redução na área de lesão no arco aórtico e na aorta torácica bem como uma redução na acumulação de monó- citos/macrófagos nas placas em duas cepas derivadas de modo independente de camundongos CX3CR1-/- apoE-/- alimentados uma dieta de alto teor de gordura (Combadière, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111:333).[004] Several independent genetic studies in mice have demonstrated a beneficial defect of CX3CR1 deficiency on atherosclerosis. A reduction in the area of injury in the aortic arch and thoracic aorta as well as a reduction in monocyte/macrophage accumulation in plaques was seen in two strains independently derived from CX3CR1-/- apoE-/- mice fed a diet of high fat content (Combadière, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111:333).

[005] Isto mostra que CX3CR1 está envolvida em doenças cardi ovasculares e que a modulação de sua atividade pode proporcionar terapias promissoras. Portanto existe a necessidade de moléculas de antagonistas contra CX3CR1 com propriedades farmacológicas benéficas, as quais podem ser usadas como agentes terapêuticos para tratar doenças, em particular doenças cardiovasculares em seres humanos.[005] This shows that CX3CR1 is involved in cardiovascular disease and that modulation of its activity may provide promising therapies. Therefore, there is a need for antagonist molecules against CX3CR1 with beneficial pharmacological properties, which can be used as therapeutic agents to treat diseases, in particular cardiovascular diseases in humans.

[006] Por conseguinte, um objetivo da presente invenção é pro porcionar moléculas de antagonistas anti-CX3CR1, em particular moléculas de antagonistas anti-CX3CR1, as quais têm alta afinidade de ligação para CX3CR1.[006] Therefore, an object of the present invention is to provide anti-CX3CR1 antagonist molecules, in particular anti-CX3CR1 antagonist molecules, which have high binding affinity for CX3CR1.

[007] Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar moléculas de antagonistas anti-CX3CR1, as quais têm alta especifici- dade para CX3CR1.[007] An additional objective of the present invention is to provide anti-CX3CR1 antagonist molecules, which have high specificity for CX3CR1.

[008] Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar antagonistas anti-CX3CR1, as quais têm potente atividade.[008] A further object of the present invention is to provide anti-CX3CR1 antagonists, which have potent activity.

[009] Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar antagonistas anti-CX3CR1, as quais têm uma biodisponibilidade e uma meia-vida favoráveis.[009] A further object of the present invention is to provide anti-CX3CR1 antagonists, which have favorable bioavailability and half-life.

[0010] Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar antagonistas anti-CX3CR1, as quais têm propriedades biofísicas favoráveis.[0010] A further object of the present invention is to provide anti-CX3CR1 antagonists, which have favorable biophysical properties.

[0011] Objetivos adicionais da presente invenção incluem combi nações de qualquer um dos objetivos estipulados acima.[0011] Additional objects of the present invention include combinations of any of the objects stipulated above.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0012] A invenção proporciona polipeptídeos os quais ligam a CX3CR1 humana e são capazes de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana. Em um aspecto, o polipeptídeo é uma imunoglobulina a qual compreende um domínio de ligação antigênica o qual compreende três regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, em que a referida imunoglobulina liga à CX3CR1 humana e é capaz de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo compreende um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1, em que o referido polipeptídeo é capaz de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana.[0012] The invention provides polypeptides which bind to human CX3CR1 and are capable of blocking the binding of human fractalkine to human CX3CR1. In one aspect, the polypeptide is an immunoglobulin which comprises an antigenic binding domain which comprises three complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3, wherein said immunoglobulin binds to human CX3CR1 and is capable of blocking the binding of human fractalkine to human CX3CR1. In a further aspect, the polypeptide comprises one or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains, wherein said polypeptide is capable of blocking human fractalkine binding to human CX3CR1.

[0013] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção é caracterizado por uma ou mais das seguintes propriedades: • Liga com alta afinidade à CX3CR1 humana; • Bloqueia a ligação de fractalcina solúvel à CX3CR1 humana; • Inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina; • Inibe a internalização de receptores de CX3CR1 humana induzida pela fractalcina;[0013] In one aspect, a polypeptide of the present invention is characterized by one or more of the following properties: • Binds with high affinity to human CX3CR1; • Blocks binding of soluble fractalkine to human CX3CR1; • Inhibits fractalkine-induced chemotaxis; • Inhibits fractalkine-induced internalization of human CX3CR1 receptors;

[0014] Tem reação cruzada com CX3CR1 cyno dentro de 10 ve zes da E/IC50 para CX3CR1 humana para ligação e inibição funcional.[0014] It cross-reacts with CX3CR1 cyno within 10 times the E/IC50 for human CX3CR1 for binding and functional inhibition.

[0015] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente in venção compreende um domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 e compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia-vida, por exemplo, uma porção de ligação de albumina, uma molécula de polietileno glicol ou um domínio de Fc. Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1. Em um aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti- CX3CR1 são encadeados de modo covalente por um peptídeo enca- deador. Em um aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imuno- globulina anti-CX3CR1 em um polipeptídeo da presente invenção têm a mesma sequência de aminoácidos. Em outro aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 em um polipep- tídeo da presente invenção têm sequências de aminoácidos diferentes. Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 e compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia- vida, por exemplo, uma porção de ligação de albumina, uma molécula de polietileno glicol ou um domínio de Fc.[0015] In a further aspect, a polypeptide of the present invention comprises a single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain and further comprises a half-life extending moiety, e.g., an albumin-binding moiety, a polyethylene molecule glycol or an Fc domain. In a further aspect, a polypeptide of the present invention comprises two or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains. In one aspect, the two unique variable domains of anti-CX3CR1 immunoglobulin are covalently linked together by a linker peptide. In one aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have the same amino acid sequence. In another aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have different amino acid sequences. In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains and further comprises a half-life extending moiety, e.g., an albumin-binding moiety, a polyethylene glycol molecule, or a DNA domain. Fc.

[0016] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um primeiro domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 ligado de modo covalente a uma porção de ligação de albumina por um primeiro peptídeo encadeador, em que a referida porção de ligação de albumina é adicionalmente ligada de modo covalente a um segundo domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 por um segundo peptídeo encadeador.[0016] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises a first single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an albumin-binding moiety by a first linker peptide, wherein said albumin-binding moiety is further covalently linked to a second unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain by a second linker peptide.

[0017] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 ligado de modo covalente a um domínio de Fc por um peptí- deo encadeador. Em um aspecto, semelhante polipeptídeo compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 ligado de modo covalente a um domínio de Fc por um peptídeo enca- deador é proporcionado como um dímero, por exemplo, através de pontes de dissulfeto.[0017] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises a single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an Fc domain by a linker peptide. In one aspect, a similar polypeptide comprising a single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an Fc domain by a linker peptide is provided as a dimer, for example, via disulfide bridges.

[0018] Os polipeptídeos da presente invenção são usados para a prevenção, o tratamento, a mitigação e/ou o diagnóstico de doenças, distúrbios ou condições associados com CX3CR1, em particular doenças cardiovasculares, tais como aterosclerose.[0018] The polypeptides of the present invention are used for the prevention, treatment, mitigation and/or diagnosis of diseases, disorders or conditions associated with CX3CR1, in particular cardiovascular diseases such as atherosclerosis.

[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona:[0019] In an additional aspect, the present invention provides:

[0020] Modalidade 1: Uma imunoglobulina a qual compreende um domínio de ligação antigênica o qual compreende três regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, em que a referida imunoglobulina liga à CX3CR1 humana e é capaz de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana.[0020] Embodiment 1: An immunoglobulin which comprises an antigenic binding domain which comprises three complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3, wherein said immunoglobulin binds to human CX3CR1 and is capable of blocking the binding of human fractalkine to human CX3CR1.

[0021] Modalidade 2: Um polipeptídeo compreendendo um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1, em que o referido polipeptídeo é capaz de bloquear a ligação de fractalci- na humana à CX3CR1 humana.[0021] Embodiment 2: A polypeptide comprising one or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains, wherein said polypeptide is capable of blocking human fractalkine binding to human CX3CR1.

[0022] Modalidade 3: Um polipeptídeo de acordo com a modalida de 2, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 consiste essencialmente em quatro regiões de framework (FR1, FR2, FR3 e FR4) e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3).[0022] Embodiment 3: A polypeptide according to embodiment 2, wherein said single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain consists essentially of four framework regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) and three complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3).

[0023] Modalidade 4: Um polipeptídeo de acordo com a modalida de 3, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 tem a estrutura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.[0023] Embodiment 4: A polypeptide according to embodiment 3, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain has the structure FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

[0024] Modalidade 5: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 4, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 é um domínio de anticorpo.[0024] Embodiment 5: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 4, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain is an antibody domain.

[0025] Modalidade 6: Um polipeptídeo de acordo com a modalida de 5, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 é um VH, um VL, um VHH, um VH camelizado, ou um VHH que é otimizado para estabilidade, potência, fabricabilidade e/ou similaridade para regiões de framework humanas.[0025] Embodiment 6: A polypeptide according to embodiment 5, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain is a VH, a VL, a VHH, a camelized VH, or a VHH that is optimized for stability , power, manufacturability and/or similarity to human framework regions.

[0026] Modalidade 7: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o referido polipeptídeo tem uma afinidade para CX3CR1 humana a:[0026] Embodiment 7: A polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 6, wherein said polypeptide has an affinity for human CX3CR1 to:

[0027] uma EC50 de menos de ou iqual a 10 nM, menos de ou iqual a 5 nM, menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM, conforme determinado por FACS de ligação celular; ou[0027] an EC50 of less than or equal to 10 nM, less than or equal to 5 nM, less than or equal to 2.5 nM, or less than or equal to 1 nM, as determined by cell binding FACS; or

[0028] uma IC50 de menos de ou iqual a 10 nM, menos de ou iqual a 5 nM, menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM, conforme determinado por FACS de competição.[0028] an IC50 of less than or equal to 10 nM, less than or equal to 5 nM, less than or equal to 2.5 nM, or less than or equal to 1 nM, as determined by competition FACS.

[0029] Modalidade 8: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana a uma IC50 de menos de ou iqual a 300 nM, ou menos de ou iqual a 100 nM, ou menos de ou iqual a 20 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM, ou menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM.[0029] Embodiment 8: A polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 7, wherein said polypeptide blocks binding of human fractalkine to human CX3CR1 at an IC50 of less than or equal to 300 nM, or less than or equal to at 100 nM, or less than or equal to 20 nM, or less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM, or less than or equal to 2.5 nM, or less than or equal to 1 nM.

[0030] Modalidade 9: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o referido polipeptídeo inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina mediada pela CX3CR1 humana a uma IC50 de menos de ou iqual a 500 nM, ou de menos de ou iqual a 100 nM, ou de menos de ou iqual a 75 nM, ou de menos de ou iqual a 50 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM ou menos de ou iqual a 5 nM.[0030] Embodiment 9: A polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 8, wherein said polypeptide inhibits human CX3CR1-mediated fractalkine-induced chemotaxis at an IC50 of less than or equal to 500 nM, or less than or equal to 100 nM, or less than or equal to 75 nM, or less than or equal to 50 nM, or less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM.

[0031] Modalidade 10: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o referido polipeptídeo inibe a in- ternalização de fractalcina mediada pela CX3CR1 humana a uma IC50 de menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM ou ou menos de ou iqual a 1 nM.[0031] Embodiment 10: A polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 9, wherein said polypeptide inhibits human CX3CR1-mediated fractalkine internalization at an IC50 of less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM or less than or equal to 1 nM.

[0032] Modalidade 11: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que a referida CDR3 tem a sequência de aminoácidos de Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4- Xaa5 (SEQ ID NO: 197), em que:[0032] Embodiment 11: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 10, wherein said CDR3 has the amino acid sequence of Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 ( SEQ ID NO: 197), where:

[0033] - Xaa1 é Pro, Ala ou Gly;[0033] - Xaa1 is Pro, Ala or Gly;

[0034] - Xaa2 é Asp ou Asn;[0034] - Xaa2 is Asp or Asn;

[0035] - Xaa3 é Thr ou Ser;[0035] - Xaa3 is Thr or Ser;

[0036] - Xaa4 é Arg, Lys, Ala ou Gly; e[0036] - Xaa4 is Arg, Lys, Ala or Gly; It is

[0037] - Xaa5 é Tyr ou Phe.[0037] - Xaa5 is Tyr or Phe.

[0038] Modalidade 12: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 11, em que:[0038] Embodiment 12: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 11, wherein:

[0039] a)[0039] a)

[0040] - Xaa1 é Pro, Ala ou Gly;[0040] - Xaa1 is Pro, Wing or Gly;

[0041] - Xaa2 é Asp ou Asn;[0041] - Xaa2 is Asp or Asn;

[0042] - Xaa3 é Thr;[0042] - Xaa3 is Thr;

[0043] - Xaa4 é Arg ou Lys; e[0043] - Xaa4 is Arg or Lys; It is

[0044] - Xaa5 é Tyr,[0044] - Xaa5 is Tyr,

[0045] e/ou[0045] and/or

[0046] b) em que a referida CDR3 é selecionada entre qualquer uma de SEQ ID No's: 186 a 190.[0046] b) wherein said CDR3 is selected from any one of SEQ ID No's: 186 to 190.

[0047] Modalidade 13: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 12, em que a referida CDR3 tem a sequência de aminoácidos de Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 186).[0047] Embodiment 13: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 12, wherein said CDR3 has the amino acid sequence of Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr ( SEQ ID NO: 186).

[0048] Modalidade 14: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que:[0048] Embodiment 14: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 10, wherein:

[0049] a referida CDR1:[0049] the aforementioned CDR1:

[0050] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141;[0050] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141;

[0051] tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 80% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141;[0051] has an amino acid sequence that has at least 80% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141;

[0052] tem uma sequência de aminoácidos que tem 2, ou 1 dife rença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, em que[0052] has an amino acid sequence that is 2 or 1 amino acid different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, wherein

[0053] - na posição 2 o S foi modificado para T, ou G;[0053] - in position 2 the S was changed to T, or G;

[0054] - na posição 6 o S foi modificado para R;[0054] - in position 6 the S was changed to R;

[0055] - na posição 7 o N foi modificado para T; e/ou[0055] - in position 7 the N was changed to T; and/or

[0056] - na posição 9 o M foi modificado para K; ou[0056] - in position 9 the M was changed to K; or

[0057] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 141 a 145 e 213;[0057] d) has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 141 to 145 and 213;

[0058] a referida CDR2:[0058] the aforementioned CDR2:

[0059] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164;[0059] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164;

[0060] tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 70% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164;[0060] has an amino acid sequence that has at least 70% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164;

[0061] tem uma sequência de aminoácidos que tem 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, em que[0061] has an amino acid sequence that is 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164, wherein

[0062] - na posição 1 o G foi modificado para A, L, V ou S;[0062] - in position 1 the G was changed to A, L, V or S;

[0063] - na posição 3 o N foi modificado para D, S, Q, G ou T;[0063] - in position 3 the N was changed to D, S, Q, G or T;

[0064] - na posição 4 o S foi modificado para T, K, G ou P;[0064] - in position 4 the S was changed to T, K, G or P;

[0065] - na posição 5 o V foi modificado para A;[0065] - in position 5 the V was changed to A;

[0066] - na posição 6 o G foi modificado para D;[0066] - in position 6 the G was changed to D;

[0067] - na posição 7 o I foi modificado para T, ou V;[0067] - in position 7 the I was changed to T, or V;

[0068] - na posição 8 o T foi modificado para A; e/ou[0068] - in position 8 the T was changed to A; and/or

[0069] - na posição 9 o K foi modificado para R; ou[0069] - in position 9 the K was changed to R; or

[0070] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 162 a 175 e 214 a 221; e[0070] d) has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 162 to 175 and 214 to 221; It is

[0071] a referida CDR3:[0071] the aforementioned CDR3:

[0072] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186;[0072] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 186;

[0073] tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 70% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186;[0073] has an amino acid sequence that has at least 70% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 186;

[0074] tem uma sequência de aminoácidos que tem 3, 2, ou 1 dife rença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, em que[0074] has an amino acid sequence that is 3, 2, or 1 amino acid different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 186, wherein

[0075] - na posição 2 o P foi modificado para A, ou G;[0075] - in position 2 the P was changed to A, or G;

[0076] - na posição 7 o D foi modificado para N; e/ou[0076] - in position 7 the D was changed to N; and/or

[0077] - na posição 9 o R foi modificado para K; ou[0077] - in position 9 the R was changed to K; or

[0078] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 186 a 190.[0078] d) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 186 to 190.

[0079] Modalidade 15: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que[0079] Embodiment 15: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 10, wherein

[0080] a referida CDR1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146;[0080] said CDR1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 146;

[0081] ii) a referida CDR2 tem uma sequência de aminoácidos que a) tem no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176 ou b) tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 176 ou 177; e[0081] ii) said CDR2 has an amino acid sequence that a) has at least 90% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176 or b) has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 176 or 177; It is

[0082] a referida CDR3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191.[0082] said CDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 191.

[0083] Modalidade 16: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que[0083] Embodiment 16: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 10, wherein

[0084] a referida CDR1:[0084] the aforementioned CDR1:

[0085] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 147; ou[0085] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147; or

[0086] tem uma sequência de aminoácidos que tem 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 147, em que[0086] has an amino acid sequence that is 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, wherein

[0087] - na posição 1 o G foi modificado para K, R, ou A;[0087] - in position 1 the G was changed to K, R, or A;

[0088] - na posição 2 o T foi modificado para I, P, S ou L;[0088] - in position 2 the T was changed to I, P, S or L;

[0089] - na posição 3 o I foi modificado para V, ou T;[0089] - in position 3 the I was changed to V, or T;

[0090] - na posição 4 o F foi modificado para L;[0090] - in position 4 the F was changed to L;

[0091] - na posição 5 o S foi modificado para R, ou D;[0091] - in position 5 the S was changed to R, or D;

[0092] - na posição 6 o N foi modificado para S, T, ou D; e/ou[0092] - in position 6 the N was changed to S, T, or D; and/or

[0093] - na posição 7 o N foi modificado para T, ou Y; ou[0093] - in position 7 the N was changed to T, or Y; or

[0094] c) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 147 a 161;[0094] c) has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 147 to 161;

[0095] ii) a referida CDR2:[0095] ii) said CDR2:

[0096] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; ou[0096] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 179; or

[0097] tem uma sequência de aminoácidos que tem 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, em que[0097] has an amino acid sequence that is 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 179, wherein

[0098] - na posição 3 o S foi modificado para T, ou G;[0098] - in position 3 the S was changed to T, or G;

[0099] - na posição 4 o N foi modificado para S, ou I;[0099] - in position 4 the N was changed to S, or I;

[00100] - na posição 5 o S foi modificado para T;[00100] - in position 5 the S was changed to T;

[00101] - na posição 6 o G foi modificado para Y; e/ou[00101] - in position 6 the G was changed to Y; and/or

[00102] - na posição 8 o T foi modificado para A; ou[00102] - in position 8 the T was changed to A; or

[00103] tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 178 a 185; e[00103] has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 178 to 185; It is

[00104] iii) a referida CDR3:[00104] iii) the aforementioned CDR3:

[00105] tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; ou[00105] has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192; or

[00106] tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 80% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; ou[00106] has an amino acid sequence that has at least 80% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192; or

[00107] tem uma sequência de aminoácidos que tem 2, ou 1 dife- rença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192, em que[00107] has an amino acid sequence that is 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192, wherein

[00108] - na posição 2 o A foi modificado para G;[00108] - in position 2 the A was changed to G;

[00109] - na posição 8 o T foi modificado para S;[00109] - in position 8 the T was changed to S;

[00110] - na posição 9 o A foi modificado para G; e/ou[00110] - in position 9 the A was changed to G; and/or

[00111] - na posição 10 o Y foi modificado para F; ou d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 192 a 196.[00111] - in position 10 the Y was changed to F; or d) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 192 to 196.

[00112] Modalidade 17: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que as sequências de aminoácidos das referidas CDR1, CDR2 e CDR3 são estipuladas em:[00112] Embodiment 17: A polypeptide according to embodiment 3, in which the amino acid sequences of said CDR1, CDR2 and CDR3 are stipulated in:

[00113] - SEQ ID No: 141, 162 e 186, respectivamente; ou[00113] - SEQ ID No: 141, 162 and 186, respectively; or

[00114] - SEQ ID No: 141, 163 e 187, respectivamente; ou[00114] - SEQ ID No: 141, 163 and 187, respectively; or

[00115] - SEQ ID No: 141, 164 e 186, respectivamente; ou[00115] - SEQ ID No: 141, 164 and 186, respectively; or

[00116] - SEQ ID No: 141, 166 e 186, respectivamente; ou[00116] - SEQ ID No: 141, 166 and 186, respectively; or

[00117] - SEQ ID No: 141, 167 e 186, respectivamente; ou[00117] - SEQ ID No: 141, 167 and 186, respectively; or

[00118] - SEQ ID No: 141, 167 e 189, respectivamente; ou[00118] - SEQ ID No: 141, 167 and 189, respectively; or

[00119] - SEQ ID No: 141, 168 e 186, respectivamente; ou[00119] - SEQ ID No: 141, 168 and 186, respectively; or

[00120] - SEQ ID No: 141, 168 e 187, respectivamente; ou[00120] - SEQ ID No: 141, 168 and 187, respectively; or

[00121] - SEQ ID No: 141, 169 e 190, respectivamente; ou[00121] - SEQ ID No: 141, 169 and 190, respectively; or

[00122] - SEQ ID No: 141, 170 e 186, respectivamente; ou[00122] - SEQ ID No: 141, 170 and 186, respectively; or

[00123] - SEQ ID No: 141, 171 e 186, respectivamente; ou[00123] - SEQ ID No: 141, 171 and 186, respectively; or

[00124] - SEQ ID No: 141, 174 e 186, respectivamente; ou[00124] - SEQ ID No: 141, 174 and 186, respectively; or

[00125] - SEQ ID No: 141, 175 e 187, respectivamente; ou[00125] - SEQ ID No: 141, 175 and 187, respectively; or

[00126] - SEQ ID No: 142, 165 e 188, respectivamente; ou[00126] - SEQ ID No: 142, 165 and 188, respectively; or

[00127] - SEQ ID No: 142, 173 e 188, respectivamente; ou[00127] - SEQ ID No: 142, 173 and 188, respectively; or

[00128] - SEQ ID No: 143, 164 e 186, respectivamente; ou[00128] - SEQ ID No: 143, 164 and 186, respectively; or

[00129] - SEQ ID No: 144, 172 e 187, respectivamente; ou[00129] - SEQ ID No: 144, 172 and 187, respectively; or

[00130] - SEQ ID No: 145, 172 e 187, respectivamente; ou[00130] - SEQ ID No: 145, 172 and 187, respectively; or

[00131] - SEQ ID No: 141, 214 e 186, respectivamente; ou[00131] - SEQ ID No: 141, 214 and 186, respectively; or

[00132] - SEQ ID No: 141, 215 e 186, respectivamente; ou[00132] - SEQ ID No: 141, 215 and 186, respectively; or

[00133] - SEQ ID No: 141, 216 e 186, respectivamente; ou[00133] - SEQ ID No: 141, 216 and 186, respectively; or

[00134] - SEQ ID No: 141, 217 e 186, respectivamente; ou[00134] - SEQ ID No: 141, 217 and 186, respectively; or

[00135] - SEQ ID No: 141, 218 e 186, respectivamente; ou[00135] - SEQ ID No: 141, 218 and 186, respectively; or

[00136] - SEQ ID No: 141, 219 e 186, respectivamente; ou[00136] - SEQ ID No: 141, 219 and 186, respectively; or

[00137] - SEQ ID No: 141, 220 e 186, respectivamente; ou[00137] - SEQ ID No: 141, 220 and 186, respectively; or

[00138] - SEQ ID No: 213, 221 e 186, respectivamente; ou[00138] - SEQ ID No: 213, 221 and 186, respectively; or

[00139] - SEQ ID No: 213, 214 e 186, respectivamente.[00139] - SEQ ID No: 213, 214 and 186, respectively.

[00140] Modalidade 18: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que as sequências de aminoácidos das referidas CDR1, CDR2 e CDR3 são estipuladas em:[00140] Embodiment 18: A polypeptide according to embodiment 3, in which the amino acid sequences of said CDR1, CDR2 and CDR3 are stipulated in:

[00141] - SEQ ID No: 146, 176 e 191, respectivamente; ou[00141] - SEQ ID No: 146, 176 and 191, respectively; or

[00142] - SEQ ID No: 146, 177 e 191, respectivamente.[00142] - SEQ ID No: 146, 177 and 191, respectively.

[00143] Modalidade 19: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que as sequências de aminoácidos das referidas CDR1, CDR2 e CDR3 são estipuladas em:[00143] Embodiment 19: A polypeptide according to embodiment 3, in which the amino acid sequences of said CDR1, CDR2 and CDR3 are stipulated in:

[00144] - SEQ ID No: 147, 178 e 192, respectivamente; ou[00144] - SEQ ID No: 147, 178 and 192, respectively; or

[00145] - SEQ ID No: 147, 179 e 192, respectivamente; ou[00145] - SEQ ID No: 147, 179 and 192, respectively; or

[00146] - SEQ ID No: 147, 179 e 194, respectivamente; ou[00146] - SEQ ID No: 147, 179 and 194, respectively; or

[00147] - SEQ ID No: 148, 179 e 193, respectivamente; ou[00147] - SEQ ID No: 148, 179 and 193, respectively; or

[00148] - SEQ ID No: 149, 179 e 192, respectivamente; ou[00148] - SEQ ID No: 149, 179 and 192, respectively; or

[00149] - SEQ ID No: 149, 180 e 192, respectivamente; ou[00149] - SEQ ID No: 149, 180 and 192, respectively; or

[00150] - SEQ ID No: 149, 181 e 192, respectivamente; ou[00150] - SEQ ID No: 149, 181 and 192, respectively; or

[00151] - SEQ ID No: 149, 183 e 192, respectivamente; ou[00151] - SEQ ID No: 149, 183 and 192, respectively; or

[00152] - SEQ ID No: 149, 185 e 192, respectivamente; ou[00152] - SEQ ID No: 149, 185 and 192, respectively; or

[00153] - SEQ ID No: 150, 179 e 194, respectivamente; ou[00153] - SEQ ID No: 150, 179 and 194, respectively; or

[00154] - SEQ ID No: 150, 182 e 194, respectivamente; ou[00154] - SEQ ID No: 150, 182 and 194, respectively; or

[00155] - SEQ ID No: 151, 179 e 193, respectivamente; ou[00155] - SEQ ID No: 151, 179 and 193, respectively; or

[00156] - SEQ ID No: 151, 182 e 194, respectivamente; ou[00156] - SEQ ID No: 151, 182 and 194, respectively; or

[00157] - SEQ ID No: 151, 184 e 196, respectivamente; ou[00157] - SEQ ID No: 151, 184 and 196, respectively; or

[00158] - SEQ ID No: 152, 179 e 195, respectivamente; ou[00158] - SEQ ID No: 152, 179 and 195, respectively; or

[00159] - SEQ ID No: 153, 179 e 194, respectivamente; ou[00159] - SEQ ID No: 153, 179 and 194, respectively; or

[00160] - SEQ ID No: 154, 182 e 194, respectivamente; ou[00160] - SEQ ID No: 154, 182 and 194, respectively; or

[00161] - SEQ ID No: 155, 179 e 195, respectivamente; ou[00161] - SEQ ID No: 155, 179 and 195, respectively; or

[00162] - SEQ ID No: 156, 181 e 192, respectivamente; ou[00162] - SEQ ID No: 156, 181 and 192, respectively; or

[00163] - SEQ ID No: 157, 179 e 194, respectivamente; ou[00163] - SEQ ID No: 157, 179 and 194, respectively; or

[00164] - SEQ ID No: 158, 179 e 192, respectivamente; ou[00164] - SEQ ID No: 158, 179 and 192, respectively; or

[00165] - SEQ ID No: 159, 178 e 192, respectivamente; ou[00165] - SEQ ID No: 159, 178 and 192, respectively; or

[00166] - SEQ ID No: 160, 179 e 194, respectivamente; ou[00166] - SEQ ID No: 160, 179 and 194, respectively; or

[00167] - SEQ ID No: 161, 179 e 194, respectivamente.[00167] - SEQ ID No: 161, 179 and 194, respectively.

[00168] Modalidade 20: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que as sequências de aminoácidos das referidas CDR1, CDR2 e CDR3 são estipuladas em: SEQ ID NO's: 141, 164 e 186, respectivamente, ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186, respectivamente.[00168] Embodiment 20: A polypeptide according to embodiment 3, wherein the amino acid sequences of said CDR1, CDR2 and CDR3 are stipulated in: SEQ ID NO's: 141, 164 and 186, respectively, or SEQ ID NO's: 141 , 162 and 186, respectively.

[00169] Modalidade 21: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que as sequências de aminoácidos das referidas CDR1, CDR2 e CDR3 são estipuladas em: SEQ ID NO's: 213, 214 e 186 respectivamente, SEQ ID NO's: 213, 221 e 186 respectivamente, ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186 respectivamente.[00169] Embodiment 21: A polypeptide according to embodiment 3, wherein the amino acid sequences of said CDR1, CDR2 and CDR3 are stipulated in: SEQ ID NO's: 213, 214 and 186 respectively, SEQ ID NO's: 213, 221 and 186 respectively, or SEQ ID NO's: 141, 162 and 186 respectively.

[00170] Modalidade 22: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 10, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em:[00170] Embodiment 22: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 10, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in:

[00171] a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;[00171] the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

[00172] sequências de aminoácidos que têm no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;[00172] amino acid sequences that have at least 90% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3;

[00173] sequências de aminoácidos que têm 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 3; ou[00173] amino acid sequences having 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3; or

[00174] uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1 a 48, 121 a 140 ou 222 a 224.[00174] an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 48, 121 to 140 or 222 to 224.

[00175] Modalidade 23: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 10, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em:[00175] Embodiment 23: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 10, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in:

[00176] a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49;[00176] the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49;

[00177] uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 95% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 49;[00177] an amino acid sequence that has at least 95% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 49;

[00178] uma sequência de aminoácidos que tem 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ou[00178] an amino acid sequence having 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 49; or

[00179] uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 49 a 52.[00179] an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 49 to 52.

[00180] Modalidade 24: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 10, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em:[00180] Embodiment 24: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 10, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in:

[00181] a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67;[00181] the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67;

[00182] uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 67;[00182] an amino acid sequence that has at least 90% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 67;

[00183] uma sequência de aminoácidos que tem 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; ou[00183] an amino acid sequence that is 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 67; or

[00184] uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 53 a 120.[00184] an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 53 to 120.

[00185] Modalidade 25: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 2, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 compreende a sequência estipulada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.[00185] Embodiment 25: A polypeptide according to embodiment 2, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain comprises the sequence stipulated in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

[00186] Modalidade 26: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 2, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 compreende a sequência estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 121 a 140 ou SEQ ID NO: 222 a 224.[00186] Embodiment 26: A polypeptide according to embodiment 2, wherein said single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain comprises the sequence stipulated in any one of SEQ ID NO: 121 to 140 or SEQ ID NO: 222 to 224 .

[00187] Modalidade 27: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades acima, o qual é humanizado e/ou otimizado para estabilidade, potência, fabricabilidade e/ou similaridade para regiões de framework humanas.[00187] Embodiment 27: A polypeptide according to any of the above embodiments, which is humanized and/or optimized for stability, potency, manufacturability and/or similarity to human framework regions.

[00188] Modalidade 28: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 27, o qual é humanizado e/ou tem otimização de sequência em uma ou mais das seguintes posições (de acordo com numeração Ka- bat): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108.[00188] Embodiment 28: A polypeptide according to embodiment 27, which is humanized and/or has sequence optimization in one or more of the following positions (according to Kabat numbering): 1, 11, 14, 16 , 74, 83, 108.

[00189] Modalidade 29: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 28, compreendendo uma ou mais das seguintes mutações: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.[00189] Embodiment 29: A polypeptide according to embodiment 28, comprising one or more of the following mutations: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.

[00190] Modalidade 30: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 29, no qual:[00190] Embodiment 30: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 29, in which:

[00191] FR1 é selecionado entre SEQ ID NO's: 198 a 204;[00191] FR1 is selected from SEQ ID NO's: 198 to 204;

[00192] ii) FR2 é selecionado entre SEQ ID NO's: 205 a 208;[00192] ii) FR2 is selected from SEQ ID NO's: 205 to 208;

[00193] iii) FR3 é selecionado entre SEQ ID NO's: 209 a 210; e/ou[00193] iii) FR3 is selected from SEQ ID NO's: 209 to 210; and/or

[00194] FR4 é selecionado entre SEQ ID NO's: 211 a 212.[00194] FR4 is selected from SEQ ID NO's: 211 to 212.

[00195] Modalidade 31: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 30, o qual é humanizado e/ou tem otimização de sequência em uma ou mais das seguintes posições (de acordo com numeração Kabat): 52, 53.[00195] Embodiment 31: A polypeptide according to any one of embodiments 3 to 30, which is humanized and/or has sequence optimization at one or more of the following positions (according to Kabat numbering): 52, 53.

[00196] Modalidade 32: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 31, compreendendo uma ou mais das seguintes mutações: N52S, S53T.[00196] Embodiment 32: A polypeptide according to embodiment 31, comprising one or more of the following mutations: N52S, S53T.

[00197] Modalidade 33: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 32, no qual CDR2 é selecionada entre SEQ ID NO's: 214 a 221.[00197] Embodiment 33: A polypeptide according to any one of Embodiments 3 to 32, in which CDR2 is selected from SEQ ID NO's: 214 to 221.

[00198] Modalidade 34: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2-33, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 compreende a sequência estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO's: 138 a 140 ou 222 a 224.[00198] Embodiment 34: A polypeptide according to any one of Embodiments 2-33, wherein said anti-CX3CR1 immunoglobulin single variable domain comprises the sequence stipulated in any one of SEQ ID NO's: 138 to 140 or 222 to 224 .

[00199] Modalidade 35: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 22 a 26, em que o referido domínio VHH consiste em qualquer uma das referidas sequências de aminoácidos.[00199] Embodiment 35: A polypeptide according to any one of Embodiments 22 to 26, wherein said VHH domain consists of any one of said amino acid sequences.

[00200] Modalidade 36: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 35, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina bloqueia a ligação de no mínimo um dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina de SEQ ID NO's: 1 a 120, 121 a 140 e 222 a 224 a CX3CR1.[00200] Embodiment 36: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 35, wherein said single immunoglobulin variable domain blocks the binding of at least one of the unique immunoglobulin variable domains of SEQ ID NO's: 1 to 120, 121 to 140 and 222 to 224 to CX3CR1.

[00201] Modalidade 37: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 35, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina é bloqueado de *ligação a CX3CR1 por no mínimo uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO's: 1 a 120, 121 a 140 e 222 a 224.[00201] Embodiment 37: A polypeptide according to any one of embodiments 2 to 35, wherein said single immunoglobulin variable domain is blocked from *binding to CX3CR1 by at least one of the amino acid sequences of SEQ ID NO's: 1 to 120, 121 to 140 and 222 to 224.

[00202] Modalidade 38: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 37, em que o polipeptídeo compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia-vida.[00202] Embodiment 38: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 37, wherein the polypeptide further comprises a half-life extending moiety.

[00203] Modalidade 39: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 38, em que a referida porção de prolongamento da meia-vida é ligada de modo covalente ao referido polipeptídeo e é selecionada entre o grupo consistindo em uma porção de ligação de albumina, tal como um domínio de imunoglobulina anti-albumina, uma porção de ligação de transferrina, tal como um domínio de imunoglobulina anti- transferrina, uma molécula de polietileno glicol, uma molécula de polie- tileno glicol recombinante, albumina sérica humana, um fragmento de albumina sérica humana, um peptídeo de ligação de albumina ou um domínio de Fc.[00203] Embodiment 39: A polypeptide according to embodiment 38, wherein said half-life extension moiety is covalently linked to said polypeptide and is selected from the group consisting of an albumin-binding moiety, such such as an anti-albumin immunoglobulin domain, a transferrin binding moiety, such as an anti-transferrin immunoglobulin domain, a polyethylene glycol molecule, a recombinant polyethylene glycol molecule, human serum albumin, a fragment of serum albumin domain, an albumin-binding peptide or an Fc domain.

[00204] Modalidade 40: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 38 ou 39, em que a referida porção de prolongamento da meia- vida consiste em um domínio variável único de imunoglobulina anti- albumina.[00204] Embodiment 40: A polypeptide according to embodiment 38 or 39, wherein said half-life prolonging portion consists of a single anti-albumin immunoglobulin variable domain.

[00205] Modalidade 41: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 40, em que o domínio variável único de imunoglobulina é selecionado entre um domínio VHH, um domínio VHH humanizado, um domínio VH camelizado, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio único e/ou "dAb"s.[00205] Embodiment 41: A polypeptide according to embodiment 40, in which the single immunoglobulin variable domain is selected from a VHH domain, a humanized VHH domain, a camelized VH domain, an antibody domain, a single domain antibody and/or "dAb"s.

[00206] Modalidade 42: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 41, em que o domínio variável único de imunoglobulina anti- albumina é selecionado entre SEQ ID NO's: 230 a 232.[00206] Embodiment 42: A polypeptide according to embodiment 41, in which the single anti-albumin immunoglobulin variable domain is selected from SEQ ID NO's: 230 to 232.

[00207] Modalidade 43: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 39, em que o referido polipeptídeo é ligado a uma porção Fc (tal como um Fc humano, por exemplo, conforme estipulado em SEQ ID NO: 252), opcionalmente através de um encadea- dor adequado ou uma região de articulação.[00207] Embodiment 43: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 39, wherein said polypeptide is linked to an Fc portion (such as a human Fc, for example, as stipulated in SEQ ID NO: 252), optionally via a suitable linker or a hinge region.

[00208] Modalidade 44: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 39, em que o referido polipeptídeo é ligado adicionalmente a um ou mais domínios constantes (por exemplo, 2 ou 3 domínios constantes que podem ser usados como parte de/para formar uma porção Fc), a uma porção Fc e/ou a uma ou mais partes de anticorpo, fragmentos ou domínios que conferem uma ou mais funções efetoras ao polipeptídeo da invenção e/ou podem conferir a capacidade para ligar a um ou mais receptores de Fc, opcionalmente através de um encadeador adequado ou uma região de articulação.[00208] Embodiment 44: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 39, wherein said polypeptide is additionally linked to one or more constant domains (for example, 2 or 3 constant domains that can be used as part of/ to form an Fc portion), an Fc portion, and/or one or more antibody parts, fragments or domains that confer one or more effector functions to the polypeptide of the invention and/or may confer the ability to bind to one or more receptors of Fc, optionally via a suitable linker or a hinge region.

[00209] Modalidade 45: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 37, em que o referido polipeptídeo compreende adicionalmente um segundo domínio variável único de imunoglo- bulina, preferencialmente um segundo domínio variável único de imu- noglobulina anti-CX3CR1.[00209] Embodiment 45: A polypeptide according to any one of Embodiments 2 to 37, wherein said polypeptide further comprises a second single immunoglobulin variable domain, preferably a second single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain.

[00210] Modalidade 46: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 45, em que o referido primeiro e o referido segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina são encadeados de modo covalente por um peptídeo encadeador.[00210] Embodiment 46: A polypeptide according to embodiment 45, wherein said first and said second single immunoglobulin variable domains are covalently linked by a linker peptide.

[00211] Modalidade 47: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 45 ou 46, em que os referidos segundos domínios variáveis únicos de imunoglobulina essencialmente consistem em quatro regiões de framework (FR1 a FR4) e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3).[00211] Embodiment 47: A polypeptide according to embodiment 45 or 46, wherein said second single immunoglobulin variable domains essentially consist of four framework regions (FR1 to FR4) and three complementarity determining regions (CDR1 to CDR3) .

[00212] Modalidade 48: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 47, em que o referido primeiro e o referido segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina são domínios de anticorpo.[00212] Embodiment 48: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 47, wherein said first and said second single immunoglobulin variable domains are antibody domains.

[00213] Modalidade 49: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 48, em que os referidos primeiro e segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina são um VH, um VL, um VHH, um VH camelizado, ou um VHH que é otimizado para estabilidade, potência, fabricabilidade e/ou similaridade para regiões de framework humanas.[00213] Embodiment 49: A polypeptide according to any one of embodiments 45 to 48, wherein said first and second single immunoglobulin variable domains are a VH, a VL, a VHH, a camelized VH, or a VHH that is optimized for stability, power, manufacturability, and/or similarity to human framework regions.

[00214] Modalidade 50: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 49, em que as referidas CDR1 a CDR3 do referido domínio variável único de imunoglobulina são estipuladas em qualquer uma das modalidades 11 a 21.[00214] Embodiment 50: A polypeptide according to any one of embodiments 45 to 49, wherein said CDR1 to CDR3 of said single immunoglobulin variable domain are stipulated in any one of embodiments 11 to 21.

[00215] Modalidade 51: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 50, em que o referido primeiro e o referido segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina compreendem a mesma CDR3.[00215] Embodiment 51: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 50, wherein said first and said second single immunoglobulin variable domains comprise the same CDR3.

[00216] Modalidade 52: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 51, em que a referida CDR3 é estipulado em qualquer uma das modalidades 11 a 13.[00216] Embodiment 52: A polypeptide according to embodiment 51, wherein said CDR3 is stipulated in any one of embodiments 11 to 13.

[00217] Modalidade 53: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 53, em que o referido primeiro e o referido segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina compreendem as mesmas CDR1, CDR2 e CDR3.[00217] Embodiment 53: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 53, wherein said first and said second single immunoglobulin variable domains comprise the same CDR1, CDR2 and CDR3.

[00218] Modalidade 54: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 53, em que as referidas CDR1 a CDR3 são estipulados em qualquer uma das modalidades 11 a 21.[00218] Embodiment 54: A polypeptide according to embodiment 53, wherein said CDR1 to CDR3 are stipulated in any one of embodiments 11 to 21.

[00219] Modalidade 55: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 54, em que o referido primeiro e o referido segundo domínios variáveis únicos de imunoglobulina compreendem o mesmo domínio VHH.[00219] Embodiment 55: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 54, wherein said first and said second single immunoglobulin variable domains comprise the same VHH domain.

[00220] Modalidade 56: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 55, em que o referido domínio VHH é estipulado em qualquer uma das modalidades 22 a 37.[00220] Embodiment 56: A polypeptide according to any one of embodiments 45 to 55, wherein said VHH domain is stipulated in any one of embodiments 22 to 37.

[00221] Modalidade 57: Um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio variável único de imunoglobulina o qual compreende a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em SEQ ID NO's: 141, 164 e 186 ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186 e um segundo domínio variável único de imunoglobulina conforme estipulado em qualquer uma das modalidades 2 a 37.[00221] Embodiment 57: A polypeptide comprising a first single immunoglobulin variable domain which comprises the CDR1, the CDR2 and the CDR3 stipulated in SEQ ID NO's: 141, 164 and 186 or SEQ ID NO's: 141, 162 and 186 and a second single immunoglobulin variable domain as stipulated in any of Embodiments 2 to 37.

[00222] Um polipeptídeo semelhante pode em particular ser um po- lipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 56.[00222] A similar polypeptide may in particular be a polypeptide according to any one of embodiments 45 to 56.

[00223] Modalidade 58: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 57, em que o referido primeiro domínio variável único de imuno- globulina compreende a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em SEQ ID NO's: 213, 214 e 186, SEQ ID NO's: 213, 221 e 186 ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00223] Embodiment 58: A polypeptide according to embodiment 57, wherein said first single immunoglobulin variable domain comprises the CDR1, the CDR2 and the CDR3 stipulated in SEQ ID NO's: 213, 214 and 186, SEQ ID NO's: 213, 221 and 186 or SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00224] Modalidade 59: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 57 ou 58, em que o referido domínio variável único de imunoglo- bulina compreende a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em SEQ ID NO's: 141, 164 e 186 ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00224] Embodiment 59: A polypeptide according to embodiment 57 or 58, wherein said single immunoglobulin variable domain comprises the CDR1, the CDR2 and the CDR3 stipulated in SEQ ID NO's: 141, 164 and 186 or SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00225] Modalidade 60: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 57 ou 58, em que o referido domínio variável único de imunoglo- bulina compreende a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em: SEQ ID NO's: 213, 214 e 186, SEQ ID NO's: 213, 221 e 186 ou SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00225] Embodiment 60: A polypeptide according to embodiment 57 or 58, wherein said single immunoglobulin variable domain comprises CDR1, CDR2 and CDR3 stipulated in: SEQ ID NO's: 213, 214 and 186, SEQ ID NO's: 213, 221 and 186 or SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00226] Modalidade 61: Um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio variável único de imunoglobulina, em que o referido primeiro domínio variável único de imunoglobulina é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e um segundo domínio variável único de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 37.[00226] Embodiment 61: A polypeptide comprising a first single immunoglobulin variable domain, wherein said first single immunoglobulin variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a second single immunoglobulin variable domain according to any of Embodiments 2 to 37.

[00227] Um polipeptídeo semelhante pode em particular ser um po- lipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 60.[00227] A similar polypeptide may in particular be a polypeptide according to any one of embodiments 45 to 60.

[00228] Modalidade 62: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 61, em que o referido primeiro domínio variável único de imuno- globulina é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 121 a 140 ou 222 a 224.[00228] Embodiment 62: A polypeptide according to embodiment 61, wherein said first single immunoglobulin variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in any one of SEQ ID NO: 121 to 140 or 222 to 224 .

[00229] Modalidade 63: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que o referido domínio variável único de imunoglo- bulina é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.[00229] Embodiment 63: A polypeptide according to embodiment 61 or 62, wherein said single immunoglobulin variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

[00230] Modalidade 64: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 63, em que o referido domínio variável único de imunoglobulina é um domínio VHH compreendendo a sequência estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 121 a 140 ou 222 a 224.[00230] Embodiment 64: A polypeptide according to embodiment 63, wherein said single immunoglobulin variable domain is a VHH domain comprising the sequence stipulated in any one of SEQ ID NO: 121 to 140 or 222 to 224.

[00231] Modalidade 65: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 64, em que o polipeptídeo compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia-vida.[00231] Embodiment 65: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 64, wherein the polypeptide further comprises a half-life extending moiety.

[00232] Modalidade 66: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 65, em que a referida porção de prolongamento da meia-vida é ligada de modo covalente ao referido polipeptídeo e é selecionada entre o grupo consistindo em uma porção de ligação de albumina, tal como um domínio de imunoglobulina anti-albumina, uma porção de ligação de transferrina, tal como um domínio de imunoglobulina anti- transferrina, uma molécula de polietileno glicol, uma molécula de polie- tileno glicol recombinante, albumina sérica humana, um fragmento de albumina sérica humana, um peptídeo de ligação de albumina ou um domínio de Fc.[00232] Embodiment 66: A polypeptide according to embodiment 65, wherein said half-life extension moiety is covalently linked to said polypeptide and is selected from the group consisting of an albumin-binding moiety, such such as an anti-albumin immunoglobulin domain, a transferrin binding moiety, such as an anti-transferrin immunoglobulin domain, a polyethylene glycol molecule, a recombinant polyethylene glycol molecule, human serum albumin, a fragment of serum albumin domain, an albumin-binding peptide or an Fc domain.

[00233] Modalidade 67: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 66, em que a referida porção de prolongamento da meia-vida consiste em um domínio variável único de imunoglobulina anti- albumina.[00233] Embodiment 67: A polypeptide according to embodiment 66, wherein said half-life prolonging portion consists of a single anti-albumin immunoglobulin variable domain.

[00234] Modalidade 68: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 67, em que o domínio variável único de imunoglobulina é selecionado entre um domínio VHH, um domínio VHH humanizado, um domínio VH camelizado, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio único e/ou "dAb"s.[00234] Embodiment 68: A polypeptide according to embodiment 67, wherein the single immunoglobulin variable domain is selected from a VHH domain, a humanized VHH domain, a camelized VH domain, an antibody domain, a single domain antibody and/or "dAb"s.

[00235] Modalidade 69: Um polipeptídeo de acordo com a modalidade 68, em que o domínio variável único de imunoglobulina anti- albumina é selecionado entre SEQ ID NO's: 230 a 232.[00235] Embodiment 69: A polypeptide according to embodiment 68, in which the single anti-albumin immunoglobulin variable domain is selected from SEQ ID NO's: 230 to 232.

[00236] Modalidade 70: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 64, em que o referido polipeptídeo é ligado a uma porção Fc (tal como um Fc humano, por exemplo, conforme estipulado em SEQ ID NO: 252), opcionalmente através de um encadea- dor adequado ou uma região de articulação.[00236] Embodiment 70: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 64, wherein said polypeptide is linked to an Fc portion (such as a human Fc, for example, as stipulated in SEQ ID NO: 252), optionally via a suitable linker or a hinge region.

[00237] Modalidade 71: Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 45 a 66, em que o referido polipeptídeo é ligado adicionalmente a um ou mais domínios constantes (por exemplo, 2 ou 3 domínios constantes que podem ser usados como parte de/para formar uma porção Fc), a uma porção Fc e/ou a uma ou mais partes de anticorpo, fragmentos ou domínios que conferem uma ou mais funções efetoras ao polipeptídeo da invenção e/ou podem conferir a capacidade para ligar a um ou mais receptores de Fc, opcionalmente através de um encadeador adequado ou uma região de articulação.[00237] Embodiment 71: A polypeptide according to any one of Embodiments 45 to 66, wherein said polypeptide is additionally linked to one or more constant domains (for example, 2 or 3 constant domains that can be used as part of/ to form an Fc portion), an Fc portion, and/or one or more antibody parts, fragments or domains that confer one or more effector functions to the polypeptide of the invention and/or may confer the ability to bind to one or more receptors of Fc, optionally via a suitable linker or a hinge region.

[00238] Modalidade 72: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 225 a 227.[00238] Embodiment 72: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 225 to 227.

[00239] Modalidade 73: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 249 ou 277 a 281.[00239] Embodiment 73: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 249 or 277 to 281.

[00240] Modalidade 74: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 257 a 262.[00240] Embodiment 74: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 257 to 262.

[00241] Modalidade 75: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 253 ou 254.[00241] Embodiment 75: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 253 or 254.

[00242] Modalidade 76: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 263 ou 266.[00242] Embodiment 76: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 263 or 266.

[00243] Modalidade 77: Um polipeptídeo compreendendo a se quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 267 a 276 e 282.[00243] Embodiment 77: A polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 267 to 276 and 282.

[00244] Modalidade 78: Uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma região codificando um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77.[00244] Embodiment 78: A nucleic acid molecule comprising a region encoding a polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77.

[00245] Modalidade 79: Um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico de acordo com a modalidade 78.[00245] Embodiment 79: An expression vector comprising a nucleic acid molecule according to embodiment 78.

[00246] Modalidade 80: Uma célula hospedeira que carrega um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico, a referida molécula de ácido nucléico compreendendo uma região codificando um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, em que a referida célula hospedeira é capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, e em que a referida célula hospedeira é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.[00246] Embodiment 80: A host cell that carries an expression vector comprising a nucleic acid molecule, said nucleic acid molecule comprising a region encoding a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77, wherein said cell host is capable of expressing a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77, and wherein said host cell is a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.

[00247] Modalidade 81: Uma composição farmacêutica compreendendo (i) como o ingrediente ativo, um ou mais polipeptídeos de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, e (ii) um veículo farma- ceuticamente aceitável, e opcionalmente (iii) um diluente, um excipien- te, um adjuvante e/ou um estabilizante.[00247] Embodiment 81: A pharmaceutical composition comprising (i) as the active ingredient, one or more polypeptides according to any one of Embodiments 1 to 77, and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier, and optionally (iii) a diluent, an excipient, an adjuvant and/or a stabilizer.

[00248] Modalidade 82: Um método de fabricar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, compreendendo as etapas de[00248] Embodiment 82: A method of manufacturing a polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77, comprising the steps of

[00249] - cultivar uma célula hospedeira sob condições que permi tem a expressão de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77,[00249] - cultivating a host cell under conditions that allow the expression of a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77,

[00250] em que a referida célula hospedeira que carrega um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico, a referida molécula de ácido nucléico compreendendo uma região codificando um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, e em que a referida célula hospedeira é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica;[00250] wherein said host cell carrying an expression vector comprising a nucleic acid molecule, said nucleic acid molecule comprising a region encoding a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77, and wherein said host cell is a prokaryotic cell or a eukaryotic cell;

[00251] - recuperar o referido polipeptídeo; e[00251] - recovering said polypeptide; It is

[00252] - purificar o referido polipeptídeo.[00252] - Purify said polypeptide.

[00253] Modalidade 83: Um método de usar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77 para o tratamento, a prevenção ou a mitigação de uma doença, um distúrbio ou uma condição, em particular em um ser humano.[00253] Embodiment 83: A method of using a polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77 for the treatment, prevention or mitigation of a disease, disorder or condition, in particular in a human being.

[00254] Modalidade 84: O método da modalidade 83, em que a re- ferida doença, o referido distúrbio ou a referida condição é uma doença, um distúrbio ou uma condição associada com CX3CR1.[00254] Embodiment 84: The method of embodiment 83, wherein said disease, said disorder or said condition is a disease, disorder or condition associated with CX3CR1.

[00255] Modalidade 85: O método da modalidade 83, em que a referida doença, o referido distúrbio ou a referida condição é ateroscle- rose.[00255] Embodiment 85: The method of Embodiment 83, wherein said disease, said disorder or said condition is atherosclerosis.

[00256] Modalidade 86: Uma composição farmacêutica injetável compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, a referida composição sendo adequada para injeção intravenosa ou subcutânea em um ser humano.[00256] Embodiment 86: An injectable pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77, said composition being suitable for intravenous or subcutaneous injection into a human.

[00257] Modalidade 87: Um método para prevenir e/ou tratar uma doença ou um distúrbio que é associado com CX3CR1, em que o referido método compreende administrar a um indivíduo que necessite do mesmo uma quantidade farmaceuticamente ativa de no mínimo um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77.[00257] Embodiment 87: A method for preventing and/or treating a disease or a disorder that is associated with CX3CR1, wherein said method comprises administering to a subject in need thereof a pharmaceutically active amount of at least one polypeptide according with any of the modalities 1 to 77.

[00258] Modalidade 88: Um método da modalidade 85, adicionalmente compreendendo administrar um agente terapêutico adicional selecionado entre o grupo consistindo em uma estatina, um antipla- quetário, um anticoagulante, um antidiabético e um anti-hipertensivo.[00258] Embodiment 88: A method of embodiment 85, further comprising administering an additional therapeutic agent selected from the group consisting of a statin, an antiplatelet, an anticoagulant, an antidiabetic and an antihypertensive.

[00259] Modalidade 89: Um método para inibir a ligação de CX3CR1 à fractalcina em uma célula de mamífero, compreendendo administrar à célula um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, por meio do qual é inibida a sinalização mediada pela fractalcina.[00259] Embodiment 89: A method for inhibiting CX3CR1 binding to fractalkine in a mammalian cell, comprising administering to the cell a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77, whereby fractalkine-mediated signaling is inhibited .

[00260] Modalidade 90: Um método para detectar e/ou quantificar níveis de CX3CR1 em uma amostra biológica contactando a amostra com um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77 e detectando a ligação do polipeptídeo com CX3CR1.[00260] Embodiment 90: A method for detecting and/or quantifying CX3CR1 levels in a biological sample by contacting the sample with a polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77 and detecting binding of the polypeptide with CX3CR1.

[00261] Modalidade 91: Um método para diagnosticar um distúrbio associado com CX3CR1 ou para determinar se um indivíduo tem um risco aumentado de desenvolver um distúrbio associado com CX3CR1, em que o método compreende contatar uma amostra biológica de um indivíduo com um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77 e detectar a ligação do polipeptídeo a CX3CR1 para determinar a expressão ou concentração de CX3CR1.[00261] Embodiment 91: A method for diagnosing a disorder associated with CX3CR1 or for determining whether an individual has an increased risk of developing a disorder associated with CX3CR1, wherein the method comprises contacting a biological sample from an individual with a polypeptide according with any one of embodiments 1 through 77 and detecting binding of the polypeptide to CX3CR1 to determine CX3CR1 expression or concentration.

[00262] Modalidade 92. Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77 para utilização no tratamento, na prevenção ou na mitigação de uma doença, um distúrbio ou uma condição, em um ser humano.[00262] Embodiment 92. A polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77 for use in treating, preventing or mitigating a disease, disorder or condition in a human.

[00263] Modalidade 93. O polipeptídeo para uso de acordo com a modalidade 92, em que a doença, o distúrbio ou a condição é uma doença, um distúrbio ou uma condição associada com CX3CR1.[00263] Embodiment 93. The polypeptide for use according to embodiment 92, wherein the disease, disorder, or condition is a disease, disorder, or condition associated with CX3CR1.

[00264] Modalidade 94. O polipeptídeo para uso de acordo com a modalidade 92, em que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionado entre distúrbios ateroscleróticos cardio- e cerebrovasculares, doença arterial periférica, restenose, nefropatia diabética, glomerulonefri- te, glomerulonefrite crescente humana, nefropatia por IgA, nefropatia membranosa, nefrite lúpica, vasculite incluindo púrpura de Henoch- Schonlein e granulomatose de Wegener, artrite reumatoide, osteoartri- te, rejeição de aloenxerto, esclerose sistêmica, distúrbios neurodege- nerativos e doença desmielinizante, esclerose múltipla (em inglês, MS), mal de Alzheimer, doenças pulmonares tais como doença pul-monar obstrutiva crônica, asma, dor neuropática, dor inflamatória, ou câncer.[00264] Embodiment 94. The polypeptide for use according to embodiment 92, wherein the disease, disorder or condition is selected from atherosclerotic cardio- and cerebrovascular disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, human crescent glomerulonephritis, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, multiple sclerosis (MS), Alzheimer's disease, lung disease such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

[00265] Modalidade 95. O polipeptídeo para uso de acordo com a modalidade 92, em que a doença, o distúrbio ou a condição é ateros- clerose.[00265] Embodiment 95. The polypeptide for use according to embodiment 92, wherein the disease, disorder, or condition is atherosclerosis.

[00266] Modalidade 96. Uso de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77 para a fabricação de um medicamento para o tratamento, a prevenção ou a mitigação de uma doença, um distúrbio ou uma condição, em um ser humano.[00266] Embodiment 96. Use of a polypeptide according to any one of Embodiments 1 to 77 for the manufacture of a medicament for the treatment, prevention or mitigation of a disease, a disorder or a condition, in a human being.

[00267] Modalidade 97. O método de acordo com a modalidade 87, em que a doença ou o distúrbio é selecionado entre distúrbios ateros- cleróticos cardio- e cerebrovasculares, doença arterial periférica, restenose, nefropatia diabética, glomerulonefrite, glomerulonefrite crescente humana, nefropatia por IgA, nefropatia membranosa, nefrite lú- pica, vasculite incluindo púrpura de Henoch-Schonlein e granulomato- se de Wegener, artrite reumatoide, osteoartrite, rejeição de aloenxerto, esclerose sistêmica, distúrbios neurodegenerativos e doença desmieli- nizante, esclerose múltipla (em inglês, MS), mal de Alzheimer, doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, dor neuropática, dor inflamatória, ou câncer.[00267] Embodiment 97. The method according to embodiment 87, wherein the disease or disorder is selected from cardio- and cerebrovascular atherosclerotic disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, human crescentic glomerulonephritis, nephropathy by IgA, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, multiple sclerosis , MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

[00268] Modalidade 98. O método de acordo com a modalidade 87, em que a doença, o distúrbio ou a condição é aterosclerose.[00268] Embodiment 98. The method according to embodiment 87, wherein the disease, disorder or condition is atherosclerosis.

[00269] Modalidade 99. Um kit de diagnóstico ou um método de diagnóstico compreendendo um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 77, ou o uso do mesmo.[00269] Embodiment 99. A diagnostic kit or a diagnostic method comprising a polypeptide according to any one of embodiments 1 to 77, or the use thereof.

[00270] Modalidade 100. Um kit de diagnóstico ou um método de diagnóstico de acordo com a modalidade 99, para o diagnóstico de no mínimo um de distúrbios ateroscleróticos cardio- e cerebrovasculares, doença arterial periférica, restenose, nefropatia diabética, glomerulo- nefrite, glomerulonefrite crescente humana, nefropatia por IgA, nefro- patia membranosa, nefrite lúpica, vasculite incluindo púrpura de He- noch-Schonlein e granulomatose de Wegener, artrite reumatoide, os- teoartrite, rejeição de aloenxerto, esclerose sistêmica, distúrbios neu- rodegenerativos e doença desmielinizante, esclerose múltipla (em inglês, MS), mal de Alzheimer, doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, dor neuropática, dor inflamatória, ou câncer.[00270] Modality 100. A diagnostic kit or a diagnostic method according to modality 99, for the diagnosis of at least one of cardio- and cerebrovascular atherosclerotic disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, human crescent glomerulonephritis, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and disease demyelinating disease, multiple sclerosis (MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Definitions

[00271] Os aspectos e modalidades acima e outros da invenção se tornarão evidentes a partir da descrição que se segue aqui, neste requerimento de patente, na qual:[00271] The above and other aspects and embodiments of the invention will become evident from the description that follows here, in this patent application, in which:

[00272] A menos que indicado ou definido de modo diverso, todos os termos usados têm seu significado usual na técnica, o qual será evidente para a pessoa versada. É feita referência, por exemplo, aos manuais de rotina, tais como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), e Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), bem como aos antecedentes gerais da técnica citados aqui, neste requerimento de patente; Além disso, a menos que indicado de modo diverso, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhes podem ser realizados e foram realizados em uma maneira conhecida per se, conforme será evidente para a pessoa versada. Novamente é feita referência, por exemplo, aos manuais de rotina, aos antecedentes gerais da técnica referidos acima e às referências adicionais citadas nos mesmos;[00272] Unless otherwise indicated or defined, all terms used have their usual meaning in the art which will be apparent to the skilled person. Reference is made, for example, to routine manuals such as Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), as well as general background of the art cited here, in this patent application; Furthermore, unless otherwise indicated, all methods, steps, techniques and manipulations which are not specifically described in detail can be performed and have been performed in a manner known per se, as will be apparent to the person skilled in the art. Again reference is made to, for example, the routine manuals, the general background in the art referred to above and the additional references cited therein;

[00273] b) A menos que indicado de modo diverso, os termos "imu- noglobulina" e "sequência de imunoglobulina" - quer usado aqui, neste requerimento de patente, para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo de 4 cadeias convencional - são usados como termos gerais de modo a incluir tanto o anticorpo de tamanho completo, as cadeias individuais do mesmo, bem como todas as partes, domínios ou fragmentos do mesmo (incluindo mas não limitados a domínios ou fragmentos de ligação antigênica tais como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Além disso, o termo "sequência" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anti- corpo", "sequência de domínio variável (único)", "sequência de VHH" ou "sequência de proteína"), serão entendidos de modo geral como incluindo tanto a sequência de aminoácidos relevante bem como sequências de ácido nucléico ou sequências de nucleotídeos codificando as mesmas, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada;[00273] b) Unless otherwise indicated, the terms "immunoglobulin" and "immunoglobulin sequence" - whether used herein, in this patent application, to refer to a heavy chain antibody or an antibody of 4 conventional chains - are used as general terms to include both the full length antibody, the individual chains thereof, as well as all parts, domains or fragments thereof (including but not limited to antigen binding domains or fragments such as VHH domains or VH/VL domains, respectively). In addition, the term "sequence" as used herein, in this patent application, (e.g., in terms such as "immunoglobulin sequence", "antibody sequence", "variable domain (single) sequence", "variable domain sequence", of VHH" or "protein sequence"), will be understood generally to include both the relevant amino acid sequence as well as nucleic acid sequences or nucleotide sequences encoding the same, unless the context requires a more limited interpretation;

[00274] c) O termo "domínio" (de um polipeptídeo ou uma proteína) conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma estrutura de proteína dobrada a qual tem a capacidade de conservar sua estrutura terciária independentemente do resto da proteína. De modo geral, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais distintas das proteínas, e em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio.[00274] c) The term "domain" (of a polypeptide or a protein) as used herein, in this patent application, refers to a folded protein structure which has the ability to retain its tertiary structure independently of the rest of the protein . In general, domains are responsible for distinct functional properties of proteins, and in many cases they can be added, removed or transferred to other proteins without loss of function of the rest of the protein and/or domain.

[00275] d) O termo "domínio de imunoglobulina" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma região globular de uma cadeia de anticorpo (tal como por exemplo, uma cadeia de um anticorpo de 4 cadeias convencional ou de um anticorpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídeo que essencialmente consiste em uma região globular semelhante. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados pelo fato de que conservam a dobra de imunoglobulina característica de moléculas de anticorpos, a qual consiste em um sanduíche de 2 camadas de cerca de 7 filamentos beta antiparalelos dispostos em duas beta-sheets, opcionalmente estabilizados por uma ligação de dissulfeto conservada.[00275] d) The term "immunoglobulin domain" as used herein in this patent application refers to a globular region of an antibody chain (such as, for example, a chain of a conventional 4-chain antibody or of a heavy chain antibody), or to a polypeptide that essentially consists of a similar globular region. Immunoglobulin domains are characterized by the fact that they retain the characteristic immunoglobulin fold of antibody molecules, which consists of a 2-layer sandwich of about 7 antiparallel beta strands arranged in two beta-sheets, optionally stabilized by a binding of conserved disulfide.

[00276] e) O termo "domínio variável de imunoglobulina" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa um domínio de imunoglobulina essencialmente consistindo em quatro "regiões de framework" as quais são referidas na técnica e nas partes que se seguem como "região de framework 1" ou "FR1"; como "região de fra mework 2" ou"FR2"; como "região de framework 3" ou "FR3"; e como "região de framework 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões de framework são interrompidas por três "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs", as quais são referidas na técnica e nas partes que se seguem como "região determinante de complementaridade 1"ou "CDR1"; como "região determinante de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região determinante de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. Portanto, a estrutura geral ou sequência de um domínio variável de imunoglobulina pode ser indicada como se segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. São o um ou mais domínios variáveis de imunoglobulina que conferem especificidade a um anticorpo para o antígeno carregando o sítio de ligação anti- gênica.[00276] e) The term "immunoglobulin variable domain" as used herein in this patent application means an immunoglobulin domain essentially consisting of four "framework regions" which are referred to in the art and in the parts that follow as " framework region 1" or "FR1"; as "framework region 2" or "FR2"; as "framework region 3" or "FR3"; and as "framework region 4" or "FR4", respectively; the framework regions of which are interrupted by three "complementarity determining regions" or "CDRs", which are referred to in the art and in the parts that follow as "complementarity determining region 1" or "CDR1"; as "complementarity determining region 2" or "CDR2"; and as "complementarity determining region 3" or "CDR3", respectively. Therefore, the general structure or sequence of an immunoglobulin variable domain can be indicated as follows: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. They are the one or more immunoglobulin variable domains that confer specificity to an antibody for the antigen carrying the antigen-binding site.

[00277] f) Os termos "domínio variável único de imunoglobulina" e "domínio variável único" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significam um domínio variável de imunoglobulina o qual é capaz de ligar especificamente a um epítope do antígeno sem parea- mento com um domínio variável de imunoglobulina adicional. Um exemplo de domínios variáveis únicos de imunoglobulina no significado da presente invenção são "anticorpos de domínio", tais como os domínios variáveis únicos de imunoglobulina VH e VL (domínios VH e domínios VL). Outro exemplo de domínios variáveis únicos de imuno- globulina são "domínios VHH" (ou simplesmente "VHHs") de camelí-deos, conforme definido nas partes que se seguem.[00277] f) The terms "single immunoglobulin variable domain" and "single variable domain" as used herein in this patent application mean an immunoglobulin variable domain which is capable of binding specifically to an unpaired antigen epitope. with an additional immunoglobulin variable domain. An example of single immunoglobulin variable domains within the meaning of the present invention are "domain antibodies", such as the VH and VL single immunoglobulin variable domains (VH domains and VL domains). Another example of unique immunoglobulin variable domains are camelid "VHH domains" (or simply "VHHs"), as defined in the parts that follow.

[00278] Em vista da definição acima, o domínio de ligação antigêni- ca de um anticorpo de 4 cadeias convencional ( tal como uma molécula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecida na técnica) ou de um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv tal como um fragmento Fv ligado por dissulfeto ou um fragmento scFv, ou um diabody (todos conhecidos na técnica) derivdo a partir de um semelhante anti- corpo de 4 cadeias convencional, normalmente não seria considerado como um domínio variável único de imunoglobulina, uma vez que, nestes casos, normalmente não ocorreria a ligação ao respectivo epítope de um antígeno por um (único) domínio de imunoglobulina mas por um par de domínios de imunoglobulina (em associação) tais como domínios variáveis de cadeias leve e pesada, isto é, por um par VH-VL de domínios de imunoglobulina, os quais conjuntamente ligam a um epí- tope do respectivo antígeno.[00278] In view of the above definition, the antigenic binding domain of a conventional 4-chain antibody (such as an IgG, IgM, IgA, IgD or IgE molecule; known in the art) or of a Fab fragment, a F(ab')2 fragment, an Fv fragment such as a disulfide-linked Fv fragment or scFv fragment, or a diabody (all known in the art) derived from a similar conventional 4-chain antibody would normally not be considered as a single immunoglobulin variable domain, since in these cases binding to the respective epitope of an antigen would normally not occur by a (single) immunoglobulin domain but by a pair of immunoglobulin domains (in association) such as domains variable light and heavy chains, that is, by a VH-VL pair of immunoglobulin domains, which together bind to an epitope of the respective antigen.

[00279] f1) "Domínios VHH", também conhecidos como VHHs, do mínios VHH, VHH fragmentos de anticorpos, e anticorpos VHH, foram descritos originalmente como o domínio (variável) de imunoglobulina de ligação antigênica de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anticorpos destituídos de cadeias leves"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). O termo "domínio VHH" foi escolhido de modo a distinguir estes domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (os quais são referidos aqui, neste requerimento de patente, como "domínios VH" ou "domínios VH") e dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (os quais são referidos aqui, neste requerimento de patente, como "domínios VL" ou "domínios VL"). Os domínios VHH podem ligar especificamente a um epítope sem um domínio de ligação de antígeno adicional (ao contrário de domínios VH ou VL em um anticorpo de 4 cadeias convencional, em cujo caso o epítope é reconhecido por um domínio VL junto com um domínio VH). Os domínios VHH são unidades pequenas, robustas e eficientes de reconhecimento anti- gênico formadas por um único domínio de imunoglobulina.[00279] f1) "VHH domains", also known as VHHs, VHH domains, VHH antibody fragments, and VHH antibodies, were originally described as the immunoglobulin antigen-binding (variable) domain of "heavy chain antibodies" ( that is, of "antibodies devoid of light chains"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). The term "VHH domain" was chosen in order to distinguish these variable domains from the heavy-chain variable domains that are present in conventional 4-chain antibodies (which are referred to herein as "VH domains" or "VH domains" in this patent application). VH") and the light chain variable domains that are present in conventional 4-chain antibodies (which are referred to herein as "VL domains" or "VL domains"). VHH domains can specifically bind to an epitope without an additional antigen-binding domain (unlike VH or VL domains in a conventional 4-chain antibody, in which case the epitope is recognized by a VL domain along with a VH domain) . VHH domains are small, robust and efficient antigenic recognition units formed by a single immunoglobulin domain.

[00280] No contexto da presente invenção, os termos domínio VHH, VHH, domínio VHH, fragmento de anticorpo VHH, anticorpo VHH, bem como "Nanobody®" e "domínio Nanobody®" ("Nanobody" sendo uma marca registrada da empresa Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) são usados de modo intercambiável e são típicos de domínios variáveis únicos de imunoglobulina (tendo a estrutura: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4 e ligando especificamente a um epítope sem necessitar da presença de um segundo domínio variável de imunoglobulina), e os quais são distinguidos de domínios VH pelos chamados "resíduos de hallmark", conforme definido, por exemplo, na publicação de patente internacional No. WO2009/109635, Fig. 1.[00280] In the context of the present invention, the terms VHH domain, VHH, VHH domain, VHH antibody fragment, VHH antibody, as well as "Nanobody®" and "Nanobody® domain" ("Nanobody" being a registered trademark of the company Ablynx N.V.; Ghent; Belgium) are used interchangeably and are typical of single immunoglobulin variable domains (having the structure: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 and binding specifically to an epitope without requiring the presence of an epitope). second immunoglobulin variable domain), and which are distinguished from VH domains by so-called "hallmark residues", as defined, for example, in International Patent Publication No. WO2009/109635, Fig. 1.

[00281] Os resíduos aminoácido de um domínio VHH são numerados de acordo com a numeração geral para domínios VH proporcionada por Kabat et al. ("Sequência de proteínas de interesse imunológico" ("Sequence of proteins of immunological interest"))"", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação No. 91), conforme aplicado aos domínios VHH de Camelídeos, conforme mostrado por exemplo, na Figura 2 de Riechmann e Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). De acordo com esta numeração,[00281] The amino acid residues of a VHH domain are numbered according to the general numbering for VH domains provided by Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest")"", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), as applied to the VHH domains of Camelids, as shown by for example, in Figure 2 of Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). According to this numbering,

[00282] - FR1 compreende os resíduos aminoácido nas posições 1 a 30,[00282] - FR1 comprises amino acid residues at positions 1 to 30,

[00283] - CDR1 compreende os resíduos aminoácido nas posições 31 a 35,[00283] - CDR1 comprises amino acid residues at positions 31 to 35,

[00284] - FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36 a 49,[00284] - FR2 comprises amino acids at positions 36 to 49,

[00285] - CDR2 compreende os resíduos aminoácido nas posições 50 a 65,[00285] - CDR2 comprises amino acid residues at positions 50 to 65,

[00286] - FR3 compreende os resíduos aminoácido nas posições 66 a 94,[00286] - FR3 comprises amino acid residues at positions 66 to 94,

[00287] - CDR3 compreende os resíduos aminoácido nas posições 95 a 102, e[00287] - CDR3 comprises amino acid residues at positions 95 to 102, and

[00288] - FR4 compreende os resíduos aminoácido nas posições 103 a 113.[00288] - FR4 comprises amino acid residues at positions 103 to 113.

[00289] No entanto, deve ser observado que - conforme é de conhecimento geral na técnica para domínios VH e para domínios VHH - o número total de resíduos aminoácido em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos aminoáci- do indicados pela numeração Kabat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a numeração Kabat podem não estar ocupadas na sequência real, ou a sequência real pode conter mais resíduos aminoá- cido do que o número permitido pela numeração Kabat). Isto significa que, de modo geral, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos aminoácido na sequência real.[00289] However, it should be noted that - as is common knowledge in the art for VH domains and for VHH domains - the total number of amino acid residues in each of the CDRs may vary and may not correspond to the total number of amino acid residues. than indicated by the Kabat numbering (i.e., one or more positions according to the Kabat numbering may not be occupied in the actual sequence, or the actual sequence may contain more amino acid residues than the number allowed by the Kabat numbering). This means that, in general, the numbering according to Kabat may or may not correspond to the actual numbering of amino acid residues in the actual sequence.

[00290] Métodos alternativos para a numeração dos resíduos ami- noácido de domínios VH, cujos métodos também podem ser aplicados em uma maneira análoga para domínios VHH, são conhecidos na técnica. No entanto, nas presentes descrição, reivindicações e figuras, será seguida a numeração de acordo com Kabat e aplicada aos domínios VHH conforme descrito acima, a menos que indicado de modo diverso.[00290] Alternative methods for numbering the amino acid residues of VH domains, which methods can also be applied in an analogous manner to VHH domains, are known in the art. However, in the present description, claims and figures, the numbering according to Kabat will be followed and applied to the VHH domains as described above, unless otherwise indicated.

[00291] O número total de resíduos aminoácido em um domínio VHH geralmente será na faixa de a partir de 110 até 120, frequentemente entre 112 e 115. No entanto, deve ser observado que sequências menores e mais longas também podem ser adequadas para os fins descritos aqui, neste requerimento de patente.[00291] The total number of amino acid residues in a VHH domain will generally be in the range from 110 to 120, often between 112 and 115. However, it should be noted that shorter and longer sequences may also be suitable for the purposes described herein in this patent application.

[00292] Características estruturais e propriedades funcionais adicionais de domínios VHH e polipeptídeos contendo as mesmas podem ser resumidas como se segue:[00292] Additional structural features and functional properties of VHH domains and polypeptides containing the same can be summarized as follows:

[00293] Domínios VHH (os quais tenham sido "projetados" pela natureza para ligarem funcionalmente a um antígeno sem a presença de, e sem qualquer interação com, um domínio variável de cadeia leve) podem funcionar como uma única e relativamente pequena unidade estrutural, como um domínio ou como um polipeptídeo de ligação anti- gênica funcional. Isto distingue os domínios VHH dos domínios VH e VL de anticorpos de 4 cadeias convencionais, os quais por si só de modo geral não são adequados para aplicação prática como proteínas de ligação antigênica única ou domínios variáveis únicos de imunoglo- bulina, mas precisam ser combinados em alguma forma ou outra de modo a proporcionar uma unidade de ligação antigênica funcional (como por exemplo, em fragmentos de anticorpos convencionais tais como fragmentos Fab; em scFv's, os quais consistem em um domínio VH ligado de modo covalente a um domínio VL).[00293] VHH domains (which have been "designed" by nature to functionally bind to an antigen without the presence of, and without any interaction with, a light chain variable domain) can function as a single, relatively small structural unit, as a domain or as a functional antigen-binding polypeptide. This distinguishes the VHH domains from the VH and VL domains of conventional 4-chain antibodies, which by themselves are generally not suitable for practical application as single antigenic binding proteins or single immunoglobulin variable domains, but need to be combined. in some form or other so as to provide a functional antigenic binding moiety (as for example, in conventional antibody fragments such as Fab fragments; in scFv's, which consist of a VH domain covalently linked to a VL domain).

[00294] Devido a estas propriedades únicas, o uso de domínios VHH - ou isolados ou como parte de um polipeptídeo maior - oferece uma série de vantagens significativas em relação ao uso de convencionais domínios VH e VL, scFv's ou fragmentos de anticorpos convencionais (tais como fragmentos Fab ou F(ab')2):[00294] Due to these unique properties, the use of VHH domains - either alone or as part of a larger polypeptide - offers a number of significant advantages over the use of conventional VH and VL domains, scFv's or fragments of conventional antibodies (such as Fab or F(ab')2 fragments):

[00295] - somente um único domínio é necessário para ligar um an- tígeno com alta afinidade e com alta seletividade, de modo que não há nenhuma necessidade de ter dois domínios separados presentes, nem de assegurar que estes dois domínios estejam presentes na conformação espacial e na configuração corretas (isto é, através do uso de encadeadores especialmente projetados, conforme com scFv's);[00295] - only a single domain is needed to bind an antigen with high affinity and with high selectivity, so there is no need to have two separate domains present, nor to ensure that these two domains are present in spatial conformation and in the correct configuration (ie, through the use of specially designed chainers, conforming to scFv's);

[00296] - domínios VHH podem ser expressados a partir de um úni co gene e não necessitam de dobra pós-translacional ou modificações;[00296] - VHH domains can be expressed from a single gene and do not require post-translational folding or modifications;

[00297] - domínios VHH podem ser facilmente manipulados para formatos multivalentes e multiespecífcos (conforme adicionalmente discutido aqui, neste requerimento de patente);[00297] - VHH domains can be easily manipulated to multivalent and multispecific formats (as further discussed here, in this patent application);

[00298] - domínios VHH são altamente solúveis e não têm uma ten dência para agregar (conforme com os domínios de ligação antigênica derivados de camundongo descritos por Ward et al., Nature 341: 544- 546 (1989));[00298] - VHH domains are highly soluble and do not have a tendency to aggregate (as per the mouse-derived antigenic binding domains described by Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989));

[00299] - domínios VHH são altamente estáveis ao calor, pH, pro teases e outras condições ou agentes desnaturantes e, portanto, podem ser preparados, armazenados ou transportados sem o uso de equipamentos de refrigeração, transferindo uma economia de custos, de tempo e ambiental;[00299] - VHH domains are highly stable to heat, pH, proteases and other conditions or denaturing agents and therefore can be prepared, stored or transported without the use of refrigeration equipment, transferring savings in costs, time and environmental;

[00300] - domínios VHH são fáceis e relativamente baratos de pre parar, mesmo em uma escala requerida para produção. Por exemplo, domínios VHH e polipeptídeos contendo os mesmos podem ser produzidos usando fermentação microbiana (por exemplo, conforme adicionalmente descrito abaixo) e não requerem o uso de sistemas de expressão de mamíferos, conforme com, por exemplo, fragmentos de anticorpos convencionais;[00300] - VHH domains are easy and relatively inexpensive to prepare, even at the scale required for production. For example, VHH domains and polypeptides containing them can be produced using microbial fermentation (e.g., as further described below) and do not require the use of mammalian expression systems, conforming with, e.g., conventional antibody fragments;

[00301] - domínios VHH são relativamente pequenos (aproximada mente 15 kDa, ou 10 vezes menores do que uma IgG convencional) comparados com anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, e portanto[00301] - VHH domains are relatively small (approximately 15 kDa, or 10 times smaller than a conventional IgG) compared to conventional 4-chain antibodies and antigenic binding fragments thereof, and therefore

[00302] -- apresentam alta(maior) penetração em tecidos e[00302] -- have high (greater) penetration into tissues and

[00303] -- podem ser administrados em maiores doses[00303] -- can be administered in larger doses

[00304] do que os referidos anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos;[00304] than said conventional 4-chain antibodies and antigen-binding fragments thereof;

[00305] - domínios VHH podem apresentar as chamadas proprie dades de ligação de cavidade (entre outros devido a seu loop CDR3 estendido, comparados com convencionais domínios VH) e portanto também podem acessar alvos e epítopes não acessíveis para anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos.[00305] - VHH domains can present so-called cavity binding properties (among others due to their extended CDR3 loop, compared to conventional VH domains) and therefore can also access targets and epitopes not accessible to conventional 4-chain antibodies and fragments their antigenic binding.

[00306] Métodos de obtenção de domínios VHH ligando a um antí- geno ou um epítope específico foram descritos anteriormente, por exemplo, nas publicações de patente internacional Nos. WO2006/040153 e WO2006/122786. Conforme também descrito nas mesmas em detalhes, domínios VHH derivados a partir de camelídeos podem ser "humanizados" substituindo um ou mais resíduos aminoá- cido na sequência de aminoácidos da sequência VHH original por um ou mais dos resíduos aminoácido que ocorrem na posição correspondente ou nas posições correspondentes em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de regiões de framework totalmente humanas, e, em uma modalidade ainda mais específica, podem conter sequências de regiões de framework humanas derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, ou partes das mesmas, opcionalmente combinadas com sequências de JH, tais como JH5.[00306] Methods of obtaining VHH domains binding to an antigen or a specific epitope have been previously described, for example, in International Patent Publications Nos. WO2006/040153 and WO2006/122786. As also described therein in detail, VHH domains derived from camelids can be "humanized" by replacing one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the original VHH sequence with one or more of the amino acid residues that occur at the corresponding position or in the corresponding positions in a VH domain of a conventional 4-chain antibody from a human. A humanized VHH domain may contain one or more fully human framework region sequences, and, in an even more specific embodiment, may contain human framework region sequences derived from DP-29, DP-47, DP-51, or parts thereof, optionally combined with JH sequences, such as JH5.

[00307] f2) "Anticorpos de domínio", também conhecidos como "Dab"s, "Domain Antibodies", e "dAbs" (os termos "Domain Antibodies" e "dAbs" sendo usados como marcas registradas pelo grupo de empresas da GlaxoSmithKline) foram descritos, por exemplo, em Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); e na publicação de patente internacional No. WO2003/002609.[00307] f2) "Domain Antibodies", also known as "Dab"s, "Domain Antibodies", and "dAbs" (the terms "Domain Antibodies" and "dAbs" being used as trademarks by the GlaxoSmithKline group of companies ) have been described, for example, in Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); and in International Patent Publication No. WO2003/002609.

[00308] Anticorpos de domínio essencialmente correspondem aos domínios VH ou VL de mamíferos não camelídeos, em particular anticorpos de 4 cadeias humanas. De modo a ligar um epítope como um único domínio de ligação de antígeno, isto é, sem ser pareado com um domínio VL ou VH, respectivamente, é necessária seleção específica para semelhantes propriedades de ligação antigênica, por exemplo, usando bibliotecas de sequências de domínios VH ou VL únicos humanos.[00308] Domain antibodies essentially correspond to the VH or VL domains of non-camelid mammals, in particular human 4-chain antibodies. In order to bind an epitope as a single antigen-binding domain, i.e. without being paired with a VL or VH domain, respectively, specific selection for similar antigenic-binding properties is required, e.g. using libraries of domain sequences Human single VH or VL.

[00309] Anticorpos de domínio têm, como VHHs, um peso molecu- lar de cerca de 13 a cerca de 16 kDa e, caso derivados de sequências totalmente humanas, não necessitam de humanização para, por exemplo, utilização terapêutica em seres humanos. Como no caso de domínios VHH, são bem expressados também em sistemas de expressão procariótica, proporcionando uma redução significativa no custo de fabricação total.[00309] Domain antibodies have, like VHHs, a molecular weight of about 13 to about 16 kDa and, if derived from fully human sequences, do not require humanization for, for example, therapeutic use in humans. As in the case of VHH domains, they are also well expressed in prokaryotic expression systems, providing a significant reduction in the total manufacturing cost.

[00310] Anticorpos de domínio, bem como domínios VHH, podem ser submetidos a maturação por afinidade por introdução de uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos de uma ou mais CDRs, cujas alterações resultam em uma aprimorada afinidade do domínio variável único de imunoglobulina resultante por seu respectivo antíge- no, em comparação com a molécula parental respectiva. Moléculas de domínios variáveis únicos de imunoglobulina maturados por afinidade da invenção podem ser preparadas por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, ou Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; e Hawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson e RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.[00310] Domain antibodies, as well as VHH domains, can be subjected to affinity maturation by introducing one or more changes to the amino acid sequence of one or more CDRs, which changes result in an improved affinity of the resulting single immunoglobulin variable domain by its respective antigen, in comparison with the respective parent molecule. Affinity-matured single immunoglobulin variable domain molecules of the invention can be prepared by methods known in the art, for example, as described by Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, or Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; and Hawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.

[00311] f3) Além disso, também será evidente para a pessoa versa da que é possível "enxertar" uma ou mais das CDR's mencionadas acima sobre outros "andaimes", inclusive mas não limitados a andaimes humanos ou andaimes não imunoglobulina. Andaimes e técnicas adequados para a enxertação de CDR referida são conhecidos na técnica.[00311] f3) Furthermore, it will also be apparent to the person concerned that it is possible to "graft" one or more of the CDR's mentioned above onto other "scaffolds", including but not limited to human scaffolds or non-immunoglobulin scaffolds. Suitable scaffolds and techniques for said CDR grafting are known in the art.

[00312] g) Os termos "epítope" e "determinante antigênico", os quais podem ser usados de modo intercambiável, se referem à parte de uma macromolécula, tal como um polipeptídeo, que é reconhecida por moléculas de ligação antigênica, tais como anticorpos convencionais ou os polipeptídeos da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação antigênica das referidas moléculas. Epítopes definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina, e portanto representam o alvo de especificidade de uma imunoglobulina.[00312] g) The terms "epitope" and "antigenic determinant", which may be used interchangeably, refer to the part of a macromolecule, such as a polypeptide, that is recognized by antigenic binding molecules, such as antibodies conventional peptides or the polypeptides of the invention, and more particularly by the antigenic binding site of said molecules. Epitopes define the minimal binding site for an immunoglobulin, and therefore represent the specificity target of an immunoglobulin.

[00313] A parte de uma molécula de ligação antigênica (tal como um anticorpo convencional ou um polipeptídeo da invenção) que reconhece o epítope é denominada um parátope.[00313] The part of an antigenic binding molecule (such as a conventional antibody or a polypeptide of the invention) that recognizes the epitope is called a paratope.

[00314] h) O termo molécula de ligação (antigênica) "biparatópico" ou polipeptídeo "biparatópico" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, vai significar um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio variável único de imunoglobulina e um segundo domínio variável único de imunoglobulina conforme definido aqui, neste requerimento de patente, em que estes dois domínios variáveis são capazes de ligação a dois diferentes epitopes de um antígeno, cujos epítopes não são normalmente ligados ao mesmo tempo por uma imunoglobuli- na monoespecífica, tal como por exemplo, um anticorpo convencional ou um domínio variável único de imunoglobulina. Polipeptídeos bipara- tópicos podem ser composdos de domínios variáveis os quais têm especificidades de epítopes diferentes, e não contêm pares de domínios variáveis mutuamente complementares os quais ligam ao mesmo epí- tope. Os dois domínios variáveis portanto não competem um com o outro por ligação ao alvo.[00314] h) The term "biparatopic" (antigenic) binding molecule or "biparatopic" polypeptide as used herein, in this patent application, shall mean a polypeptide comprising a first immunoglobulin single variable domain and a second immunoglobulin single variable domain as defined herein, in this patent application, wherein these two variable domains are capable of binding to two different epitopes of an antigen, which epitopes are not normally bound at the same time by a monospecific immunoglobulin, such as, for example, an antibody conventional or a single immunoglobulin variable domain. Biparatopic polypeptides may be composed of variable domains which have different epitope specificities, and do not contain pairs of mutually complementary variable domains which bind to the same epitope. The two variable domains therefore do not compete with each other for target binding.

[00315] i) Um polipeptídeo ( tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável único de imunoglobulina, um polipeptídeo da invenção, ou geralmente uma molécula de ligação antigênica ou um fragmento da mesma) que pode "ligar a" ou "ligar especificamente a", que "tem afinidade por" e/ou que "tem especificidade por" um determinado epítope, um determinado antígeno ou uma determinada proteína (ou por no mínimo uma parte, um fragmento ou um epítope da mesma) diz-se que é "contra" ou "direcionado contra " o referido epítope, o referido antígeno ou a referida proteína ou é uma molécula de "ligação" com respeito a semelhante epítope, antígeno ou proteína, ou diz-se que é "anti"-epítope, "anti"-antígeno ou "anti"-proteína (por exemplo, anti-CX3CR1).[00315] i) A polypeptide (such as an immunoglobulin, an antibody, a single immunoglobulin variable domain, a polypeptide of the invention, or generally an antigenic binding molecule or fragment thereof) that can "bind to" or "bind specifically for", which "has affinity for" and/or which "has specificity for" a given epitope, a given antigen or a given protein (or at least a part, a fragment or an epitope thereof) it is said that is "against" or "directed against" said epitope, said antigen or said protein or is a "binding" molecule with respect to like epitope, antigen or protein, or is said to be "anti"-epitope, "anti"-antigen or "anti"-protein (eg, anti-CX3CR1).

[00316] k) Geralmente, o termo "especificidade" se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou epítopes aos quais uma molécula de ligação antigênica em particular ou uma proteína de ligação antigêni- ca ( tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável único de imunoglobulina, ou um polipeptídeo da invenção) pode ligar. A especificidade de uma proteína de ligação antigênica pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação antigênica (KD), é uma medida para a força de ligação entre um epítope e um sítio de ligação antigênica sobre a proteína de ligação antigênica: quanto menor o valor da KD, maior a força de ligação entre um epítope e a molécula de ligação antigênica (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), a qual é de 1/KD). Conforme será evidente para a pessoa versada (por exemplo, com base na descrição adicional aqui, neste requerimento de patente), a afinidade pode ser determinada em uma maneira conhecida per se, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da força de ligação entre uma molécula de ligação antigênica (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável único de imunoglobulina, ou um polipeptídeo da invenção) e o antígeno pertinente. A avidez é relacionada tanto com a afinidade entre um epítope e seu sítio de ligação antigênica sobre a molécula de ligação antigênica quanto com o número de sítios de ligação pertinentes presentes sobre a molécula de ligação antigênica.[00316] k) Generally, the term "specificity" refers to the number of different types of antigens or epitopes to which a particular antigenic binding molecule or antigenic binding protein (such as an immunoglobulin, an antibody, a single immunoglobulin variable domain, or a polypeptide of the invention) can bind. The specificity of an antigen binding protein can be determined based on its affinity and/or avidity. Affinity, represented by the equilibrium constant for the dissociation of an antigen with an antigenic binding protein (KD), is a measure of the strength of binding between an epitope and an antigenic binding site on the antigenic binding protein: the smaller the KD value, the greater the binding strength between an epitope and the antigenic binding molecule (alternatively, affinity can also be expressed as the affinity constant (KA), which is 1/KD). As will be evident to the person skilled in the art (for example, based on the further description herein, in this patent application), the affinity can be determined in a manner known per se, depending on the specific antigen of interest. Avidity is a measure of the strength of binding between an antigenic binding molecule (such as an immunoglobulin, an antibody, an immunoglobulin single variable domain, or a polypeptide of the invention) and the pertinent antigen. Avidity is related both to the affinity between an epitope and its antigenic binding site on the antigenic binding molecule and to the number of pertinent binding sites present on the antigenic binding molecule.

[00317] l) Resíduos aminoácido sedrão indicados de acordo com o código de aminoácidos padrão de três letras ou de uma letra, conforme é de conhecimento geral e acordado na técnica. Ao comparar duas sequências de aminoácidos, o termo "diferença de aminoácidos" se refere a inserções, deleções ou substituições do número indicado de resíduos aminoácido em uma posição da sequência de referência, comparada com uma segunda sequência. No caso de uma ou mais substituições, a uma ou mais substituições referidas preferencialmente serão uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras, o que significa que um resíduo aminoácido é substituído com outro resíduo aminoácido de estrutura química similar e o qual tem pouca ou essencialmente nenhuma influência sobre a função, a atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. As substituições de ami- noácidos conservadoras referidas são de conhecimento geral na técnica, por exemplo, na publicação de patente internacional No. WO 98/49185, em que substituições de aminoácidos conservadoras preferencialmente são substituições nas quais um aminoácido dentro dos grupos (i) a (v) que se seguem é substituido por outro resíduo aminoá- cido dentro do mesmo grupo: (i) resíduos pequenos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e GIy; (ii) resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, GIu e GIn; (iii) resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg e Lys; (iv) grandes resíduos alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, VaI e Cys; e (v) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. Substituições de aminoácidos conservadoras particularmente preferenciais são como se segue:[00317] l) Sedron amino acid residues indicated according to the standard three-letter or one-letter amino acid code, as is generally known and agreed in the art. When comparing two amino acid sequences, the term "amino acid difference" refers to insertions, deletions or substitutions of the indicated number of amino acid residues at one position in the reference sequence, compared to a second sequence. In the case of one or more substitutions, the one or more substitutions referred to will preferably be one or more conservative amino acid substitutions, meaning that an amino acid residue is replaced with another amino acid residue of similar chemical structure and which has little or essentially no influence about the function, activity, or other biological properties of the polypeptide. Conservative amino acid substitutions referred to are well known in the art, for example in International Patent Publication No. WO 98/49185, where conservative amino acid substitutions preferably are substitutions in which an amino acid within groups (i) a (v) that follows is replaced by another amino acid residue within the same group: (i) small aliphatic, non-polar or slightly polar residues: Ala, Ser, Thr, Pro and GIy; (ii) polar, negatively charged residues and their amides (uncharged): Asp, Asn, GIu and GIn; (iii) polar, positively charged residues: His, Arg and Lys; (iv) large non-polar aliphatic residues: Met, Leu, Ile, VaI and Cys; and (v) aromatic residues: Phe, Tyr and Trp. Particularly preferred conservative amino acid substitutions are as follows:

[00318] Ala para GIy ou para Ser;[00318] Ala for GIy or Ser;

[00319] Arg para Lys;[00319] Arg for Lys;

[00320] Asn para GIn ou para His;[00320] Asn for GIn or for His;

[00321] Asp para GIu;[00321] Asp for GIu;

[00322] Cys para Ser;[00322] Cys to Ser;

[00323] GIn para Asn;[00323] GIn to Asn;

[00324] GIu para Asp;[00324] GIu to Asp;

[00325] GIy para Ala ou para Pro;[00325] GIy for Wing or for Pro;

[00326] His para Asn ou para GIn;[00326] His for Asn or for GIn;

[00327] Ile para Leu ou para VaI;[00327] Ile to Leu or to Val;

[00328] Leu para Ile ou para VaI;[00328] Read to Ile or to Val;

[00329] Lys para Arg, para GIn ou para GIu;[00329] Lys for Arg, for GIn or for GIu;

[00330] Met para Leu, para Tyr ou para Ile;[00330] Met for Leu, for Tyr or for Ile;

[00331] Phe para Met, para Leu ou para Tyr;[00331] Phe to Met, to Leu or to Tyr;

[00332] Ser para Thr;[00332] Ser to Thr;

[00333] Thr para Ser;[00333] Thr to Ser;

[00334] Trp para Tyr;[00334] Trp to Tyr;

[00335] Tyr para Trp ou para Phe;[00335] Tyr to Trp or to Phe;

[00336] VaI para Ile ou para Leu.[00336] Goes to Ile or Leu.

[00337] m) Uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucléico é considerada como sendo "(em forma) essencialmente isolada" - por exemplo, quando comparada com sua fonte biológica nativa e/ou o meio de reação ou o meio de cultuda a partir do qual tenha sido obtida - quando tenha sido separada a partir de no mínimo um outro componente com o qual é geralmente associada na referida fonte ou no referido meio, tal como outro ácido nucléico, outra proteína/outro polipeptí- deo, outro componente biológico ou macromolécula ou no mínimo um contaminante, uma impureza ou um componente menor. Em particular, uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucléico é considerada "essencialmente isolada" quando foi purificada no mínimo 2 vezes, em particular no mínimo 10 vezes, mais em particular no mínimo 100 vezes, e até 1000 vezes ou mais. Uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucléico que está "em forma essencialmente isolada" é preferenci-almente essencialmente homogênea, conforme determinado usando uma técnica adequada, tal como uma técnica cromatográfica adequa- da, tal como eletroforese por gel de poliacrilamida;[00337] m) A polypeptide or nucleic acid molecule is considered to be "essentially isolated (in form)" - for example, when compared to its native biological source and/or the reaction medium or culture medium from the from which it was obtained - when it has been separated from at least one other component with which it is generally associated in said source or in said medium, such as another nucleic acid, other protein/polypeptide, other biological component or macromolecule or at least one contaminant, impurity or minor component. In particular, a polypeptide or nucleic acid molecule is considered "essentially isolated" when it has been purified at least 2 times, in particular at least 10 times, more in particular at least 100 times, and up to 1000 times or more. A polypeptide or nucleic acid molecule that is "in essentially isolated form" is preferably essentially homogeneous, as determined using a suitable technique, such as a suitable chromatographic technique, such as polyacrylamide gel electrophoresis;

[00338] n) "Identidade de sequências " entre por exemplo, duas sequências de domínios variáveis únicos de imunoglobulina indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos entre estas duas sequências. Pode ser calculada ou determinada conforme descrito no parágrafo f) às páginas 49 e 50 do Requerimento de Patente Internacional de No. WO08/020079. "Similaridade de sequências" indica a percentagem de aminoácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservadoras.[00338] n) "Sequence identity" between e.g. two sequences of unique immunoglobulin variable domains indicates the percentage of amino acids that are identical between these two sequences. It can be calculated or determined as described in paragraph f) on pages 49 and 50 of International Patent Application No. WO08/020079. "Sequence similarity" indicates the percentage of amino acids that are either identical or represent conservative amino acid substitutions.

target specificity

[00339] Os polipeptídeos da invenção têm especificidade para CX3CR1 humana. Deste modo, os polipeptídeos da invenção preferencialmente ligam à CX3CR1 humana (SEQ ID NO: 255). Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção também ligam à CX3CR1 de cynomolgus (SEQ ID NO: 256).[00339] The polypeptides of the invention have specificity for human CX3CR1. Thus, polypeptides of the invention preferentially bind to human CX3CR1 (SEQ ID NO: 255). In one aspect, the polypeptides of the present invention also bind to cynomolgus CX3CR1 (SEQ ID NO: 256).

Polypeptides of the invention

[00340] A invenção proporciona novos agentes farmaceuticamente ativos para a prevenção, o tratamento, a mitigação e/ou o diagnóstico de doenças, distúrbios ou condições associados com CX3CR1, tais como doenças cardiovasculares. Em particular, a invenção proporciona polipeptídeos os quais ligam a CX3CR1 humana e são capazes de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana. Em um aspecto, o polipeptídeo é uma imunoglobulina a qual compreende um domínio de ligação antigênica o qual compreende três regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, em que a referida imunoglobulina liga à CX3CR1 humana e é capaz de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo compreende um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1, em que o referido polipeptídeo é capaz de bloquear a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana.[00340] The invention provides new pharmaceutically active agents for the prevention, treatment, mitigation and/or diagnosis of diseases, disorders or conditions associated with CX3CR1, such as cardiovascular diseases. In particular, the invention provides polypeptides which bind human CX3CR1 and are capable of blocking human fractalkine binding to human CX3CR1. In one aspect, the polypeptide is an immunoglobulin which comprises an antigenic binding domain which comprises three complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3, wherein said immunoglobulin binds to human CX3CR1 and is capable of blocking the binding of human fractalkine to human CX3CR1. In a further aspect, the polypeptide comprises one or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains, wherein said polypeptide is capable of blocking human fractalkine binding to human CX3CR1.

[00341] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção é caracterizado por uma ou mais das seguintes propriedades: • Liga com alta afinidade à CX3CR1 humana, por exemplo, a uma EC50 de menos de ou iqual a 10 nM, menos de ou iqual a 5 nM, menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM, conforme determinado por FACS de ligação celular; • Bloqueia a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana, por exemplo, a uma IC50 de menos de ou iqual a 300 nM, ou menos de ou iqual a 100 nM, ou menos de ou iqual a 20 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM, ou menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM; • Inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina mediada pela CX3CR1 humana, por exemplo, a uma IC50 de menos de ou iqual a 500 nM, ou menos de ou iqual a 100 nM, ou de menos de ou iqual a 75 nM, ou menos de ou iqual a 50 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM ou menos de ou iqual a 5 nM; a eficácia de inibição obtida é de mais de ou igual a 15%, ou de mais de ou igual a 50%, ou de mais de ou igual a 80%, ou de mais de ou igual a 95%; • Inibe a internalização induzida pela fractalcina mediada pela CX3CR1 humana, por exemplo, a uma IC50 de menos de ou iqual a 10 nM ou menos de ou iqual a 5 nM; • Tem reação cruzada com CX3CR1 de cynomolgus, por exemplo, dentro de 10 vezes da E/IC50 para CX3CR1 humana para ligação e inibição funcional.[00341] In one aspect, a polypeptide of the present invention is characterized by one or more of the following properties: • It binds with high affinity to human CX3CR1, for example, at an EC50 of less than or equal to 10 nM, less than or equal to at 5 nM, less than or equal to 2.5 nM or less than or equal to 1 nM, as determined by cell binding FACS; • Blocks binding of human fractalkine to human CX3CR1, for example, at an IC50 of less than or equal to 300 nM, or less than or equal to 100 nM, or less than or equal to 20 nM, or less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM, or less than or equal to 2.5 nM or less than or equal to 1 nM; • Inhibits fractalkine-induced chemotaxis mediated by human CX3CR1, for example, at an IC50 of less than or equal to 500 nM, or less than or equal to 100 nM, or less than or equal to 75 nM, or less than or equal to 50 nM, or less than or equal to 10 nM or less than or equal to 5 nM; the inhibition effectiveness obtained is greater than or equal to 15%, or greater than or equal to 50%, or greater than or equal to 80%, or greater than or equal to 95%; • Inhibits fractalkine-induced internalization mediated by human CX3CR1, eg, at an IC50 of less than or equal to 10 nM or less than or equal to 5 nM; • Cross-reacts with cynomolgus CX3CR1, eg, within 10 fold of the E/IC50 for human CX3CR1 for binding and functional inhibition.

[00341] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia-vida, por exemplo, uma porção de ligação de albumina, uma molécula de polietileno glicol ou um domínio de Fc. Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1. Em um aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti- CX3CR1 são encadeados de modo covalente por um peptídeo enca- deador. Em um aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imuno- globulina anti-CX3CR1 em um polipeptídeo da presente invenção têm a mesma sequência de aminoácidos. Em outro aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 em um polipep- tídeo da presente invenção têm sequências de aminoácidos diferentes. Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 e compreende adicionalmente uma porção de prolongamento da meia- vida, por exemplo, uma porção de ligação de albumina, uma molécula de polietileno glicol ou um domínio de Fc.[00341] In a further aspect, a polypeptide of the present invention further comprises a half-life extending moiety, for example, an albumin-binding moiety, a polyethylene glycol molecule or an Fc domain. In a further aspect, a polypeptide of the present invention comprises two or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains. In one aspect, the two unique variable domains of anti-CX3CR1 immunoglobulin are covalently linked together by a linker peptide. In one aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have the same amino acid sequence. In another aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have different amino acid sequences. In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains and further comprises a half-life extending moiety, e.g., an albumin-binding moiety, a polyethylene glycol molecule, or a DNA domain. Fc.

[00342] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um primeiro domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 ligado de modo covalente a uma porção de ligação de albumina por um primeiro peptídeo encadeador, em que a referida porção de ligação de albumina é adicionalmente ligada de modo covalente a um segundo domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 por um segundo peptídeo encadeador.[00342] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises a first single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an albumin-binding moiety by a first linker peptide, wherein said albumin-binding moiety is further covalently linked to a second unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain by a second linker peptide.

[00343] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um domínio variável único de imunoglobulina anti- CX3CR1 ligado de modo covalente a um domínio de Fc por um peptí- deo encadeador. Em um aspecto, semelhante polipeptídeo compreendendo um domínio variável único de imunoglobulina anti-CX3CR1 ligado de modo covalente a um domínio de Fc por um peptídeo enca- deador é proporcionado como um dímero, por exemplo, através de pontes de dissulfeto.[00343] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises a single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an Fc domain by a linker peptide. In one aspect, a similar polypeptide comprising a single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domain covalently linked to an Fc domain by a linker peptide is provided as a dimer, for example, via disulfide bridges.

[00344] Polipeptídeos de acordo com a presente invenção são obtidos conforme descrito nas partes que se seguem. Em resumo, domínios variáveis únicos da presente invenção foram identificados a partir de uma biblioteca expressando domínios variáveis únicos (VHH) derivados a partir de um lhama imunizado com DNA codificando CX3CR1 humana. A biblioteca de fagos foi varrida (panned) sobre lipopartículas virais de hCX3CR1 e fagos de ligação foram triados para sua capacidade para competir por ligação de receptor com fractalcina com etiqueta de Alexa-fluor (AF-FKN). Domínios variáveis únicos típicos da presente invenção são descritos aqui, neste requerimento de patente, em detalhes adicionais.[00344] Polypeptides according to the present invention are obtained as described in the following parts. In summary, unique variable domains of the present invention were identified from a library expressing unique variable domains (VHH) derived from a llama immunized with DNA encoding human CX3CR1. The phage library was panned over hCX3CR1 viral lipoparticles and binding phage were screened for their ability to compete for receptor binding with Alexa-fluor-tagged fractalkine (AF-FKN). Typical unique variable domains of the present invention are described here, in this patent application, in further detail.

[00345] Em um aspecto, um domínio variável único de imunoglobu- lina da presente invenção consiste essencialmente em quatro regiões de framework (FR1, FR2, FR3 e FR4) e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3). Em particular, o domínio variável único de imunoglobulina tem a estrutura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Em um aspecto, o domínio variável único de imunoglobulina é um domínio de anticorpo.[00345] In one aspect, a single immunoglobulin variable domain of the present invention essentially consists of four framework regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) and three complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3). In particular, the single immunoglobulin variable domain has the structure FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. In one aspect, the single immunoglobulin variable domain is an antibody domain.

[00346] Em um aspecto, a CDR3 de um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção tem a sequência de aminoácidos de Asp-Xaa1-Arg- Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 conforme estipulado em SEQ ID NO: 197, em que:[00346] In one aspect, the CDR3 of a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention has the amino acid sequence of Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4- Xaa5 as stipulated in SEQ ID NO: 197, where:

[00347] - Xaa1 é Pro, Ala ou Gly;[00347] - Xaa1 is Pro, Ala or Gly;

[00348] - Xaa2 é Asp ou Asn;[00348] - Xaa2 is Asp or Asn;

[00349] - Xaa3 é Thr ou Ser;[00349] - Xaa3 is Thr or Ser;

[00350] - Xaa4 é Arg, Lys, Ala ou Gly; e[00350] - Xaa4 is Arg, Lys, Ala or Gly; It is

[00351] - Xaa5 é Tyr ou Phe.[00351] - Xaa5 is Tyr or Phe.

[00352] Em um aspecto, a CDR3 de um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem a sequência de aminoácidos de Asp-Xaa1-Arg- Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 conforme estipulado em SEQ ID NO: 197, em que:[00352] In one aspect, the CDR3 of a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the amino acid sequence of Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4 -Xaa5 as stipulated in SEQ ID NO: 197, where:

[00353] - Xaa1 é Pro, Ala ou Gly;[00353] - Xaa1 is Pro, Ala or Gly;

[00354] - Xaa2 é Asp ou Asn;[00354] - Xaa2 is Asp or Asn;

[00355] - Xaa3 é Thr;[00355] - Xaa3 is Thr;

[00356] - Xaa4 é Arg ou Lys; e[00356] - Xaa4 is Arg or Lys; It is

[00357] - Xaa5 é Tyr.[00357] - Xaa5 is Tyr.

[00358] Em um aspecto, a CDR3 de um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem a sequência de aminoácidos de Asp-Pro-Arg-Arg- Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr conforme estipulado em SEQ ID NO: 186.[00358] In one aspect, the CDR3 of a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the amino acid sequence of Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg -Tyr as stipulated in SEQ ID NO: 186.

[00359] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3:[00359] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3:

[00360] - CDR1:[00360] - CDR1:

[00361] a) tem a sequência de aminoácidos de GSIFSSNAMA (SEQ ID NO: 141); ou[00361] a) has the amino acid sequence of GSIFSSNAMA (SEQ ID NO: 141); or

[00362] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 80% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141; ou[00362] b) has an amino acid sequence that has at least 80% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141; or

[00363] c) tem uma sequência de aminoácidos que tem 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, em que[00363] c) has an amino acid sequence that is 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, wherein

[00364] - na posição 2 o S foi modificado para T, ou G;[00364] - in position 2 the S was changed to T, or G;

[00365] - na posição 6 o S foi modificado para R;[00365] - in position 6 the S was changed to R;

[00366] - na posição 7 o N foi modificado para T; e/ou[00366] - in position 7 the N was changed to T; and/or

[00367] - na posição 9 o M foi modificado para K; ou[00367] - in position 9 the M was changed to K; or

[00368] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 141 a 145 e 213;[00368] d) has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 141 to 145 and 213;

[00369] - CDR2:[00369] - CDR2:

[00370] a) tem a sequência de aminoácidos de GINSVGITK (SEQ ID NO: 164); ou[00370] a) has the amino acid sequence of GINSVGITK (SEQ ID NO: 164); or

[00371] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 70% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164; ou[00371] b) has an amino acid sequence that has at least 70% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164; or

[00372] c) tem uma sequência de aminoácidos que tem 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, em que[00372] c) has an amino acid sequence that is 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164, wherein

[00373] - na posição 1 o G foi modificado para A, L, V ou S;[00373] - in position 1 the G was changed to A, L, V or S;

[00374] - na posição 3 o N foi modificado para D, S, Q, G ou T;[00374] - in position 3 the N was changed to D, S, Q, G or T;

[00375] - na posição 4 o S foi modificado para T, K, G ou P;[00375] - in position 4 the S was changed to T, K, G or P;

[00376] - na posição 5 o V foi modificado para A;[00376] - in position 5 the V was changed to A;

[00377] - na posição 6 o G foi modificado para D;[00377] - in position 6 the G was changed to D;

[00378] - na posição 7 o I foi modificado para T, ou V;[00378] - in position 7 the I was changed to T, or V;

[00379] - na posição 8 o T foi modificado para A; e/ou[00379] - in position 8 the T was changed to A; and/or

[00380] - na posição 9 o K foi modificado para R; ou[00380] - in position 9 K was changed to R; or

[00381] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 162 a 175 e 214 a 221; e[00381] d) has an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 162 to 175 and 214 to 221; It is

[00382] - CDR3:[00382] - CDR3:

[00383] a) tem a sequência de aminoácidos de DPRRGWDTRY (SEQ ID NO: 186); ou[00383] a) has the amino acid sequence of DPRRGWDTRY (SEQ ID NO: 186); or

[00384] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 70% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; ou[00384] b) has an amino acid sequence that has at least 70% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 186; or

[00385] c) tem uma sequência de aminoácidos que tem 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 186, em que[00385] c) has an amino acid sequence that is 3, 2, or 1 amino acid different from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 186, wherein

[00386] - na posição 2 o P foi modificado para A, ou G;[00386] - in position 2 the P was changed to A, or G;

[00387] - na posição 7 o D foi modificado para N; e/ou[00387] - in position 7 the D was changed to N; and/or

[00388] - na posição 9 o R foi modificado para K; ou[00388] - in position 9 the R was changed to K; or

[00389] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 186 a 190.[00389] d) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 186 to 190.

[00390] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3, em que:[00390] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3, wherein:

[00391] - a referida CDR1 tem a sequência de aminoácidos de GRTFSSYAMG (SEQ ID NO: 146);[00391] - said CDR1 has the amino acid sequence of GRTFSSYAMG (SEQ ID NO: 146);

[00392] - a referida CDR2 tem uma sequência de aminoácidos que a) tem no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de GISGSASRKY (SEQ ID NO: 176) ou b) tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176 ou 177; e[00392] - said CDR2 has an amino acid sequence that a) has at least 90% amino acid identity with the amino acid sequence of GISGSASRKY (SEQ ID NO: 176) or b) has the amino acid sequence of SEQ ID NO : 176 or 177; It is

[00393] - a referida CDR3 tem a sequência de aminoácidos de SNSYPKVQFDY (SEQ ID NO: 191).[00393] - said CDR3 has the amino acid sequence of SNSYPKVQFDY (SEQ ID NO: 191).

[00394] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3:[00394] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3:

[00395] - a referida CDR1:[00395] - the aforementioned CDR1:

[00396] a) tem a sequência de aminoácidos de GTIFSNNAMG (SEQ ID NO: 147); ou[00396] a) has the amino acid sequence of GTIFSNNAMG (SEQ ID NO: 147); or

[00397] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 147, em que[00397] b) has an amino acid sequence that is 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, wherein

[00398] - na posição 1 o G foi modificado para K, R, ou A;[00398] - in position 1 the G was changed to K, R, or A;

[00399] - na posição 2 o T foi modificado para I, P, S ou L;[00399] - in position 2 the T was changed to I, P, S or L;

[00400] - na posição 3 o I foi modificado para V, ou T;[00400] - in position 3 the I was changed to V, or T;

[00401] - na posição 4 o F foi modificado para L;[00401] - in position 4 the F was changed to L;

[00402] - na posição 5 o S foi modificado para R, ou D;[00402] - in position 5 the S was changed to R, or D;

[00403] - na posição 6 o N foi modificado para S, T, ou D; e/ou[00403] - in position 6 the N was changed to S, T, or D; and/or

[00404] - na posição 7 o N foi modificado para T, ou Y; ou[00404] - in position 7 the N was changed to T, or Y; or

[00405] c) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 147 a 161;[00405] c) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 147 to 161;

[00406] - a referida CDR2:[00406] - the aforementioned CDR2:

[00407] a) tem a sequência de aminoácidos de SISNSGSTN (SEQ ID NO: 179); ou[00407] a) has the amino acid sequence of SISNSGSTN (SEQ ID NO: 179); or

[00408] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179, em que[00408] b) has an amino acid sequence that is 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 179, wherein

[00409] - na posição 3 o S foi modificado para T, ou G;[00409] - in position 3 the S was changed to T, or G;

[00410] - na posição 4 o N foi modificado para S, ou I;[00410] - in position 4 the N was changed to S, or I;

[00411] - na posição 5 o S foi modificado para T;[00411] - in position 5 the S was changed to T;

[00412] - na posição 6 o G foi modificado para Y; e/ou[00412] - in position 6 the G was changed to Y; and/or

[00413] - na posição 8 o T foi modificado para A; ou[00413] - in position 8 the T was changed to A; or

[00414] c) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 178 a 185; e[00414] c) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 178 to 185; It is

[00415] - a referida CDR3:[00415] - the aforementioned CDR3:

[00416] a) tem a sequência de aminoácidos de DARRGWNTAY (SEQ ID NO: 192); ou[00416] a) has the amino acid sequence of DARRGWNTAY (SEQ ID NO: 192); or

[00417] b) tem uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 80% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; ou[00417] b) has an amino acid sequence that has at least 80% amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192; or

[00418] c) tem uma sequência de aminoácidos que tem 2, ou 1 diferença de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192, em que[00418] c) has an amino acid sequence that is 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192, wherein

[00419] - na posição 2 o A foi modificado para G;[00419] - in position 2 the A was changed to G;

[00420] - na posição 8 o T foi modificado para S;[00420] - in position 8 the T was changed to S;

[00421] - na posição 9 o A foi modificado para G; e/ou[00421] - in position 9 the A was changed to G; and/or

[00422] - na posição 10 o Y foi modificado para F; ou[00422] - in position 10 the Y was changed to F; or

[00423] d) tem uma sequência de aminoácidos selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 192 a 196.[00423] d) has an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO's: 192 to 196.

[00424] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3:[00424] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3:

[00425] - SEQ ID No: 141, 162 e 186, respectivamente ou[00425] - SEQ ID No: 141, 162 and 186, respectively or

[00426] - SEQ ID No: 141, 163 e 187, respectivamente ; ou[00426] - SEQ ID No: 141, 163 and 187, respectively; or

[00427] - SEQ ID No: 141, 164 e 186, respectivamente ou[00427] - SEQ ID No: 141, 164 and 186, respectively or

[00428] - SEQ ID No: 141, 166 e 186, respectivamente ou[00428] - SEQ ID No: 141, 166 and 186, respectively or

[00429] - SEQ ID No: 141, 167 e 186, respectivamente ou[00429] - SEQ ID No: 141, 167 and 186, respectively or

[00430] - SEQ ID No: 141, 167 e 189, respectivamente ou[00430] - SEQ ID No: 141, 167 and 189, respectively or

[00431] - SEQ ID No: 141, 168 e 186, respectivamente ; ou[00431] - SEQ ID No: 141, 168 and 186, respectively; or

[00432] - SEQ ID No: 141, 168 e 187, respectivamente ou[00432] - SEQ ID No: 141, 168 and 187, respectively or

[00433] - SEQ ID No: 141, 169 e 190, respectivamente ou[00433] - SEQ ID No: 141, 169 and 190, respectively or

[00434] - SEQ ID No: 141, 170 e 186, respectivamente ou[00434] - SEQ ID No: 141, 170 and 186, respectively or

[00435] - SEQ ID No: 141, 171 e 186, respectivamente ou[00435] - SEQ ID No: 141, 171 and 186, respectively or

[00436] - SEQ ID No: 141, 174 e 186, respectivamente ou[00436] - SEQ ID No: 141, 174 and 186, respectively or

[00437] - SEQ ID No: 141, 175 e 187, respectivamente ou[00437] - SEQ ID No: 141, 175 and 187, respectively or

[00438] - SEQ ID No: 142, 165 e 188, respectivamente ou[00438] - SEQ ID No: 142, 165 and 188, respectively or

[00439] - SEQ ID No: 142, 173 e 188, respectivamente ou[00439] - SEQ ID No: 142, 173 and 188, respectively or

[00440] - SEQ ID No: 143, 164 e 186, respectivamente ou[00440] - SEQ ID No: 143, 164 and 186, respectively or

[00441] - SEQ ID No: 144, 172 e 187, respectivamente ou[00441] - SEQ ID No: 144, 172 and 187, respectively or

[00442] - SEQ ID No: 145, 172 e 187, respectivamente ou[00442] - SEQ ID No: 145, 172 and 187, respectively or

[00443] - SEQ ID No: 141, 214 e 186, respectivamente ou[00443] - SEQ ID No: 141, 214 and 186, respectively or

[00444] - SEQ ID No: 141, 215 e 186, respectivamente ou[00444] - SEQ ID No: 141, 215 and 186, respectively or

[00445] - SEQ ID No: 141, 216 e 186, respectivamente ou[00445] - SEQ ID No: 141, 216 and 186, respectively or

[00446] - SEQ ID No: 141, 217 e 186, respectivamente ou[00446] - SEQ ID No: 141, 217 and 186, respectively or

[00447] - SEQ ID No: 141, 218 e 186, respectivamente ; ou[00447] - SEQ ID No: 141, 218 and 186, respectively; or

[00448] - SEQ ID No: 141, 219 e 186, respectivamente ou[00448] - SEQ ID No: 141, 219 and 186, respectively or

[00449] - SEQ ID No: 141, 220 e 186, respectivamente ou[00449] - SEQ ID No: 141, 220 and 186, respectively or

[00450][00450]

[00451] - SEQ ID No: - SEQ ID No: 213, 213, 221 e 186, respectivamente 214 e 186, respectivamente ou[00451] - SEQ ID No: - SEQ ID No: 213, 213, 221 and 186, respectively 214 and 186, respectively or

[00452] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente in- venção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presen- te invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3:[00452] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3:

[00453] - SEQ ID No: 146, 176 e 191, respectivamente; ou[00453] - SEQ ID No: 146, 176 and 191, respectively; or

[00454] - SEQ ID No: 146, 177 e 191, respectivamente.[00454] - SEQ ID No: 146, 177 and 191, respectively.

[00455] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presen- te invenção, tem as seguintes CDR1, CDR2 e CDR3:[00455] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the following CDR1, CDR2 and CDR3:

[00456] - SEQ ID No: 147, 178 e 192, respectivamente ou[00456] - SEQ ID No: 147, 178 and 192, respectively or

[00457] - SEQ ID No: 147, 179 e 192, respectivamente ou[00457] - SEQ ID No: 147, 179 and 192, respectively or

[00458] - SEQ ID No: 147, 179 e 194, respectivamente ou[00458] - SEQ ID No: 147, 179 and 194, respectively or

[00459] - SEQ ID No: 148, 179 e 193, respectivamente ou[00459] - SEQ ID No: 148, 179 and 193, respectively or

[00460] - SEQ ID No: 149, 179 e 192, respectivamente ou[00460] - SEQ ID No: 149, 179 and 192, respectively or

[00461] - SEQ ID No: 149, 180 e 192, respectivamente ou[00461] - SEQ ID No: 149, 180 and 192, respectively or

[00462] - SEQ ID No: 149, 181 e 192, respectivamente ou[00462] - SEQ ID No: 149, 181 and 192, respectively or

[00463] - SEQ ID No: 149, 183 e 192, respectivamente ; ou[00463] - SEQ ID No: 149, 183 and 192, respectively; or

[00464] - SEQ ID No: 149, 185 e 192, respectivamente ou[00464] - SEQ ID No: 149, 185 and 192, respectively or

[00465] - SEQ ID No: 150, 179 e 194, respectivamente ou[00465] - SEQ ID No: 150, 179 and 194, respectively or

[00466] - SEQ ID No: 150, 182 e 194, respectivamente ou[00466] - SEQ ID No: 150, 182 and 194, respectively or

[00467] - SEQ ID No: 151, 179 e 193, respectivamente ou[00467] - SEQ ID No: 151, 179 and 193, respectively or

[00468] - SEQ ID No: 151, 182 e 194, respectivamente ; ou[00468] - SEQ ID No: 151, 182 and 194, respectively; or

[00469] - SEQ ID No: 151, 184 e 196, respectivamente ou[00469] - SEQ ID No: 151, 184 and 196, respectively or

[00470] - SEQ ID No: 152, 179 e 195, respectivamente ou[00470] - SEQ ID No: 152, 179 and 195, respectively or

[00471] - SEQ ID No: 153, 179 e 194, respectivamente ou[00471] - SEQ ID No: 153, 179 and 194, respectively or

[00472] - SEQ ID No: 154, 182 e 194, respectivamente ou[00472] - SEQ ID No: 154, 182 and 194, respectively or

[00473] - SEQ ID No: 155, 179 e 195, respectivamente ou[00473] - SEQ ID No: 155, 179 and 195, respectively or

[00474] - SEQ ID No: 156, 181 e 192, respectivamente ou[00474] - SEQ ID No: 156, 181 and 192, respectively or

[00475] - SEQ ID No: 157, 179 e 194, respectivamente ou[00475] - SEQ ID No: 157, 179 and 194, respectively or

[00476] - SEQ ID No: 158, 179 e 192, respectivamente ou[00476] - SEQ ID No: 158, 179 and 192, respectively or

[00477] - SEQ ID No: 159, 178 e 192, respectivamente ou[00477] - SEQ ID No: 159, 178 and 192, respectively or

[00478][00478]

[00479] - SEQ ID No: - SEQ ID No: 160, 161, 179 e 194, respectivamente 179 e 194, respectivamente ou[00479] - SEQ ID No: - SEQ ID No: 160, 161, 179 and 194, respectively 179 and 194, respectively or

[00480] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente in- venção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em:[00480] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the CDR1, the CDR2 and the CDR3 stipulated in:

[00481] - SEQ ID NO's: 141, 164 e 186; ou[00481] - SEQ ID NO's: 141, 164 and 186; or

[00482] - SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00482] - SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00483] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente in venção, em particular um domínio único de imunoglobulina da presente invenção, tem a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em:[00483] In a further aspect, a polypeptide of the present invention, in particular an immunoglobulin single domain of the present invention, has the CDR1, the CDR2 and the CDR3 stipulated in:

[00484] - SEQ ID NO's: 213, 214 e 186; ou[00484] - SEQ ID NO's: 213, 214 and 186; or

[00485] - SEQ ID NO's: 213, 221 e 186; ou[00485] - SEQ ID NO's: 213, 221 and 186; or

[00486] - SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00486] - SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00487] Polipeptídeos típicos da presente invenção tendo as CDRs descritas acima são mostrados nas Tabelas 1, 2, 3 (polipeptídeos típicos das famílias 101, 9 e 13, respectivamente) e 4 (polipeptídeos típicos de variantes otimizadas da família 101. [00487] Typical polypeptides of the present invention having the CDRs described above are shown in Tables 1, 2, 3 (typical polypeptides of families 101, 9 and 13, respectively) and 4 (typical polypeptides of optimized variants of family 101.

[00488] *As sequências de CDR foram determinadas de acordo com o Antibody Engineering, vol 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Os números de sequências na Tabela (SEQ) se referem às sequências na listagem de sequências do presente requerimento. [00488] *CDR sequences were determined according to Antibody Engineering, vol 2 by Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Sequence numbers in the Table (SEQ) refer to the sequences in the listing sequences of this application.

[00489] *As sequências de CDR foram determinadas de acordo com o Antibody Engineering, vol 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Os números de sequências na Tabela (SEQ) se referem às sequências na listagem de sequências do presente requerimento. [00489] *CDR sequences were determined according to Antibody Engineering, vol 2 by Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Sequence numbers in the Table (SEQ) refer to the sequences in the listing sequences of this application.

[00490] *As sequências de CDR foram determinadas de acordo com o Antibody Engineering, vol 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Os números de sequências na Tabela (SEQ) se referem às sequências na listagem de sequências do presente requerimento. [00490] *CDR sequences were determined according to Antibody Engineering, vol 2 by Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Sequence numbers in the Table (SEQ) refer to the sequences in the listing sequences of this application.

[00491] *As sequências de CDR foram determinadas de acordo com o Antibody Engineering, vol 2 por Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Os números de sequências na Tabela (SEQ) se referem às sequências na listagem de sequências do presente requerimento.[00491] *CDR sequences were determined according to Antibody Engineering, vol 2 by Konetermann & Dübel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Sequence numbers in the Table (SEQ) refer to the sequences in the listing sequences of this application.

[00492] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona polipeptídeos que têm um ou mais domínios VHH.[00492] In a further aspect, the present invention provides polypeptides having one or more VHH domains.

[00493] Em um aspecto, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência estipulada em:[00493] In one aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the sequence stipulated in:

[00494] a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; ou[00494] a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; or

[00495] b) sequências de aminoácidos que têm no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; ou[00495] b) amino acid sequences that have at least 90% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3; or

[00496] c) sequências de aminoácidos que têm 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 3 ou[00496] c) amino acid sequences that have 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 or

[00497] d) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1 a 48, ou SEQ ID NO: 121 a 140, ou SEQ ID NO: 222 a 224.[00497] d) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 48, or SEQ ID NO: 121 to 140, or SEQ ID NO: 222 to 224.

[00498] Em um aspecto adicional, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência estipulada em:[00498] In a further aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the sequence stipulated in:

[00499] a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ou[00499] a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49; or

[00500] b) uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 95% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ou[00500] b) an amino acid sequence that has at least 95% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 49; or

[00501] c) uma sequência de aminoácidos que tem 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ou[00501] c) an amino acid sequence that has 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 49; or

[00502] d) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 49 a 52.[00502] d) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 49 to 52.

[00503] Em um aspecto adicional, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência estipulada em:[00503] In a further aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the sequence stipulated in:

[00504] a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; ou[00504] a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; or

[00505] b) uma sequência de aminoácidos que tem no mínimo 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; ou[00505] b) an amino acid sequence that has at least 90% amino acid identity with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 67; or

[00506] c) uma sequência de aminoácidos que tem 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; ou[00506] c) an amino acid sequence having 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid difference with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 67; or

[00507] d) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 53 a 120.[00507] d) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 53 to 120.

[00508] Em um aspecto adicional, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 121 a 140, ou SEQ ID NO: 222 a 224.[00508] In a further aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the amino acid sequence stipulated in either one of SEQ ID NO: 121 to 140, or SEQ ID NO: 222 to 224.

[00509] Em um aspecto adicional, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 138 a 140.[00509] In a further aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the amino acid sequence stipulated in any one of SEQ ID NO: 138 to 140.

[00510] Em um aspecto adicional, um domínio VHH da presente invenção compreende ou essencialmente consiste na sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 222 a 224.[00510] In a further aspect, a VHH domain of the present invention comprises or essentially consists of the amino acid sequence stipulated in any one of SEQ ID NO: 222 to 224.

[00511] Domínios VHH típicos da presente invenção são mostrados na Tabela 5 e domínios VHH otimizados típicos da presente invenção são mostrados na Tabela 6 abaixo: TABELA 5: DOMÍNIOS VHH[00511] Typical VHH domains of the present invention are shown in Table 5 and optimized VHH domains typical of the present invention are shown in Table 6 below: TABLE 5: VHH DOMAINS

[00512] SEQ ID NO: 1 a 48 são domínios VHH da família 101. SEQ ID NO: 49 a 52 são domínios VHH da família 9. SEQ ID NO: 53 a 120 são domínios VHH da família 13. [00512] SEQ ID NO: 1 to 48 are VHH family 101 domains. SEQ ID NO: 49 to 52 are VHH family 9 domains. SEQ ID NO: 53 to 120 are VHH family 13 domains.

[00513] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imuno- globulina da presente invenção, é humanizado e/ou otimizado para estabilidade, potência, fabricabilidade e/ou similaridade para regiões de framework humanas. Por exemplo, o polipeptídeo é humanizado e/ou tem otimização de sequência em uma ou mais das seguintes posições (de acordo com numeração Kabat): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. Em um aspecto, o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes mutações: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.[00513] In a further aspect, a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, is humanized and/or optimized for stability, potency, manufacturability and/or similarity to regions of framework. For example, the polypeptide is humanized and/or has sequence optimization at one or more of the following positions (in accordance with Kabat numbering): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. In one aspect, the polypeptide comprises one or more of the following mutations: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L.

[00514] Em um aspecto, uma ou mais regiões de framework de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imunoglobulina da presente invenção, são humanizadas e/ou têm otimização de sequência. Em um aspecto, um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imunoglobulina da presente invenção, compreende regiões de framework (FR) por exemplo, conforme estipulado abaixo:[00514] In one aspect, one or more framework regions of a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, are humanized and/or have sequence optimisation. In one aspect, a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, comprises framework regions (FR) for example, as stipulated below:

[00515] i) FR1 é selecionado entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 198 a 204;[00515] i) FR1 is selected from any one of SEQ ID NO's: 198 to 204;

[00516] ii) FR2 é selecionado entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 205 a 208;[00516] ii) FR2 is selected from any of SEQ ID NO's: 205 to 208;

[00517] iii) FR3 é selecionado entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 209 a 210; e/ou[00517] iii) FR3 is selected from any one of SEQ ID NO's: 209 to 210; and/or

[00518] iv) FR4 é selecionado entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 211 a 212.[00518] iv) FR4 is selected from any of SEQ ID NO's: 211 to 212.

[00519] Sequências de regiões de framework (FR) de imunoglobuli- na humana que também podem ser usadas como sequências de regiões de framework para os domínios variáveis únicos de imunoglobuli- na conforme descrito acima são conhecidas na técnica. Além disso são conhecidos na técnica métodos para humanização de regiões de framework de domínios variáveis únicos de imunoglobulina derivada a partir de espécies diferentes de humanos.[00519] Human immunoglobulin framework region (FR) sequences that can also be used as framework region sequences for the unique immunoglobulin variable domains as described above are known in the art. Furthermore, methods for humanizing framework regions of single variable domains of immunoglobulin derived from different human species are known in the art.

[00520] Em um aspecto adicional, uma ou mais regiões de CDR de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imunoglobulina da presente invenção, são humanizadas e/ou têm otimização de sequência. Em um aspecto, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imunoglobulina da presente invenção, é humanizado e/ou tem otimização de sequência em uma ou mais das seguintes posições (de acordo com numeração Kabat): 52, 53.[00520] In a further aspect, one or more CDR regions of a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, are humanized and/or have sequence optimisation. In one aspect, a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, is humanized and/or has sequence optimization at one or more of the following positions (as per Kabat numbering): 52 , 53.

[00521] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imuno- globulina da presente invenção, compreende uma ou mais das seguintes mutações: N52S, S53T.[00521] In a further aspect, a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, comprises one or more of the following mutations: N52S, S53T.

[00522] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, em particular um domínio variável único de imuno- globulina da presente invenção, compreende uma CDR2 selecionada entre qualquer uma de SEQ ID NO's: 214 a 221.[00522] In a further aspect, a polypeptide according to the present invention, in particular a single immunoglobulin variable domain of the present invention, comprises a CDR2 selected from any one of SEQ ID NO's: 214 to 221.

[00523] Sequências típicas humanizadas e/ou otimizadas da presente invenção são mostradas na Tabela 4 e 6 nas partes que se seguem e na Tabela 7 abaixo aqui, neste requerimento de patente. TABELA 7: VARIANTES DE SEQUÊNCIA OTIMIZADA[00523] Typical humanized and/or optimized sequences of the present invention are shown in Table 4 and 6 in the following parts and in Table 7 below here in this patent application. TABLE 7: OPTIMIZED SEQUENCE VARIANTS

[00524] A Tabela 7a mostra a FR1-CDR1-FR2-CRD2 das variantes de sequência otimizada, a Tabela 7b mostra a FR3-CDR3-FR4-CDR4 das referidas variantes. Os números de sequências nas tabelas (SEQ) se referem às sequências na listagem de sequências do presente re-querimento. Tabela 7a: Variantes de sequência otimizada (FR1-CDR1-FR2- CDR2) Tabela 7b: Variantes de sequência otimizada (FR3-CDR3-FR4) [00524] Table 7a shows the FR1-CDR1-FR2-CRD2 of the sequence-optimized variants, Table 7b shows the FR3-CDR3-FR4-CDR4 of said variants. The sequence numbers in the tables (SEQ) refer to the sequences in the sequence listing of the present application. Table 7a: Optimized sequence variants (FR1-CDR1-FR2-CDR2) Table 7b: Optimized sequence variants (FR3-CDR3-FR4)

[00525] Em um aspecto da presente invenção, um polipeptídeo da invenção pode conter adicionalmente modificações tais como resíduos glicosila, cadeias laterais de aminoácidos modificados, e semelhantes.[00525] In one aspect of the present invention, a polypeptide of the invention may additionally contain modifications such as glycosyl residues, modified amino acid side chains, and the like.

[00526] Será evidente para a pessoa versada que para utilizações farmacêuticas em seres humanos, os polipeptídeos da invenção são preferencialmente direcionados contra CX3CR1 humana, ao passo que para fins de veterinária, os polipeptídeos da invenção são preferencialmente direcionados contra a CX3CR1 da espécie a ser tratada.[00526] It will be apparent to the skilled person that for pharmaceutical uses in humans, the polypeptides of the invention are preferably directed against human CX3CR1, whereas for veterinary purposes, the polypeptides of the invention are preferably directed against CX3CR1 of the species to be treated.

[00527] Além disso será evidente para a pessoa versada que quando usados como um agente terapêutico em seres humanos, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina compreendidos nos polipeptí- deos de acordo com a invenção são preferencialmente domínios variáveis únicos de imunoglobulina humanizados.[00527] Furthermore it will be apparent to the skilled person that when used as a therapeutic agent in humans, the single immunoglobulin variable domains comprised in the polypeptides according to the invention are preferably humanized single immunoglobulin variable domains.

[00528] De acordo com a invenção, um domínio variável único de imunoglobulina pode ser um anticorpo de domínio, isto é, anticorpo de VL ou VH, e/ou domínios VHH conforme descrito acima, e/ou qualquer outro tipo de domínio variável único de imunoglobulina, por exemplo, VH camelizado, contanto que estes domínios variáveis únicos de imu- noglobulina sejam domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti- CX3CR1.[00528] According to the invention, a single immunoglobulin variable domain can be an antibody domain, i.e., VL or VH antibody, and/or VHH domains as described above, and/or any other type of single variable domain of immunoglobulin, for example, camelized VH, provided that these single immunoglobulin variable domains are anti-CX3CR1 single immunoglobulin variable domains.

[00529] Em um aspecto da invenção, o domínio variável único de imunoglobulina essencialmente consiste em ou uma sequência de anticorpo de domínio ou uma sequência de domínio VHH conforme descrito acima. Em particular, o domínio variável único de imunoglobulina essencialmente consiste em uma sequência de domínio VHH.[00529] In one aspect of the invention, the single immunoglobulin variable domain essentially consists of either an antibody domain sequence or a VHH domain sequence as described above. In particular, the single immunoglobulin variable domain essentially consists of a VHH domain sequence.

[00530] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois ou mais domínios variáveis únicos de imu- noglobulina anti-CX3CR1. Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1, por exemplo, VHHs anti-CX3CR1. Em um aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti- CX3CR1 em um polipeptídeo da presente invenção têm a mesma sequência de aminoácidos. Em outro aspecto, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 em um polipeptídeo da presente invenção têm sequências de aminoácidos diferentes.[00530] In a further aspect, a polypeptide of the present invention comprises two or more unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains. In a further aspect, a polypeptide of the present invention comprises two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains, e.g., anti-CX3CR1 VHHs. In one aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have the same amino acid sequence. In another aspect, the two unique anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains in a polypeptide of the present invention have different amino acid sequences.

[00531] De acordo com outra modalidade da invenção, os no mínimo dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina presentes em um polipeptídeo da invenção podem ser ligados uns aos outros diretamente (isto é, sem uso de um encadeador) ou através de um enca- deador. O encadeador é preferencialmente um peptídeo encadeador e, de acordo com a invenção, será selecionado de modo a permitir a ligação dos no mínimo dois domínios variáveis únicos de imunoglobu- lina a CX3CR1, quer dentro de uma e da mesma molécula de CX3CR1, ou dentro de duas moléculas diferentes.[00531] According to another embodiment of the invention, the at least two unique immunoglobulin variable domains present in a polypeptide of the invention can be linked to each other directly (that is, without using a linker) or through a linker . The linker is preferably a linker peptide and, according to the invention, will be selected so as to allow the binding of at least two unique immunoglobulin variable domains to CX3CR1, either within one and the same CX3CR1 molecule, or within of two different molecules.

[00532] Encadeadores adequados entre outros vão dependes dos epítopes e, especificamente, da distância entre os epítopes sobre a CX3CR1 à qual os domínios variáveis únicos de imunoglobulina ligam, e serão evidentes para a pessoa versada com base na descrição aqui, neste requerimento de patente, opcionalmente depois de algum grau limitado de experimentação de rotina.[00532] Suitable chains among others will depend on the epitopes, and specifically the distance between the epitopes on CX3CR1 to which the unique immunoglobulin variable domains bind, and will be apparent to the skilled person based on the description herein, in this patent application , optionally after some limited degree of routine experimentation.

[00533] Além disso, quando os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 são anticorpos de domínio ou domínios VHH, também podem ser ligados uns aos outros através de um terceiro anticorpo de domínio ou domínio VHH (no qual os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser ligados diretamente ao terceiro anticorpo de domínio ou domínio VHH ou através de encadeadores adequados). Um terceiro anticorpo de domínio ou domínio VHH semelhante pode ser, por exemplo, um anticorpo de domínio ou um domínio VHH que proporciona uma meia- vida aumentada, conforme adicionalmente descrito aqui, neste requerimento de patente. Por exemplo, o último anticorpo de domínio ou domínio VHH pode ser um anticorpo de domínio ou um domínio VHH que é capaz de ligação a uma proteína do soro (humana) tal como albumina sérica (humana) ou transferrina (humana), conforme adicio-nalmente descrito aqui, neste requerimento de patente.[00533] Furthermore, when the two or more single variable domains of anti-CX3CR1 immunoglobulin are domain antibodies or VHH domains, they may also be linked to each other via a third domain antibody or VHH domain (in which the two or more single immunoglobulin variable domains can be linked directly to the third domain antibody or VHH domain or via suitable linkers). A third domain antibody or VHH-like domain can be, for example, a domain antibody or a VHH domain that provides an increased half-life, as further described herein in this patent application. For example, the last domain antibody or VHH domain can be a domain antibody or a VHH domain that is capable of binding to a serum (human) protein such as serum albumin (human) or transferrin (human), as added. finally described here, in this patent application.

[00534] Alternativamente, os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 podem ser ligados em série (quer diretamente ou através de um encadeador adequado) e o terceiro (único) anticorpo de domínio ou domínio VHH (o qual pode proporcionar meia-vida aumentada, conforme decrito acima) pode ser conectado diretamente ou através de um encadeador a uma destas duas ou mais sequências de imunoglobulina mencionadas acima.[00534] Alternatively, the two or more single variable domains of anti-CX3CR1 immunoglobulin can be linked in series (either directly or via a suitable linker) and the third (single) antibody domain or VHH domain (which may provide half -increased life, as described above) can be connected directly or via a linker to one of these two or more immunoglobulin sequences mentioned above.

[00535] Encadeadores adequados são descritos aqui, neste requerimento de patente, em conexão com específico polipeptídeos da invenção e podem compreender - por exemplo, e sem limitação - uma sequência de aminoácidos, cuja sequência de aminoácidos preferencialmente tem uma extensão de 5 ou mais aminoácidos, 7 ou mais aminoácidos, 9 ou mais aminoácidos, 11 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos ou no mínimo 17 aminoácidos, tal como cerca de 20 a 40 aminoácidos. No entanto, o limite superior não é crucial mas é escolhido por razões de conveniência considerando, por exemplo, a produção biofarmacêutica de semelhantes polipeptídeos.[00535] Suitable linkers are described herein, in this patent application, in connection with specific polypeptides of the invention and may comprise - for example, and without limitation - an amino acid sequence, which amino acid sequence preferably has a length of 5 or more amino acids , 7 or more amino acids, 9 or more amino acids, 11 or more amino acids, 15 or more amino acids, or at least 17 amino acids, such as about 20 to 40 amino acids. However, the upper limit is not crucial but is chosen for reasons of convenience considering, for example, the biopharmaceutical production of similar polypeptides.

[00536] A sequência de encadeador pode ser uma sequência que ocorre naturalmente ou uma sequência que não ocorre naturalmente. Caso usada para fins terapêuticos, o encadeador é preferencialmente não imunogênico no indivíduo ao qual o polipeptídeo da invenção é administrado.[00536] The chainer sequence can be a naturally occurring sequence or a non-naturally occurring sequence. If used for therapeutic purposes, the trigger is preferably non-immunogenic in the subject to which the polypeptide of the invention is administered.

[00537] Um grupo útil de sequências de encadeadores são encade- adores derivados a partir da região de articulação de anticorpos de cadeia pesada conforme descrito nas publicações de patente internacional Nos. WO 96/34103 e WO 94/04678.[00537] A useful group of linker sequences are linkers derived from the hinge region of heavy chain antibodies as described in International Patent Publication Nos. WO 96/34103 and WO 94/04678.

[00538] Outros exemplos são sequências de encadeadores de poli- alanina tais como Ala-Ala-Ala.[00538] Other examples are polyalanine linker sequences such as Ala-Ala-Ala.

[00539] Exemplos preferenciais adicionais de sequências de enca- deadores são encadeadores de Gly/Ser de diferente extensão tais co mo encadeadores de (glyxsery)z, incluindo (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, e (gly3ser2)3.[00539] Additional preferred examples of chainer sequences are Gly/Ser chainers of different length such as (glyxsery)z chainers, including (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, and (gly3ser2)3.

[00540] Se o polipeptídeo da invenção for modificado pela ligação de um polímero, por exemplo, uma porção polietileno glicol (PEG), a sequência de encadeador preferencialmente inclui um resíduo amino- ácido, tal como uma cisteína ou uma lisina, permitindo a referida modificação, por exemplo, PEGuilação, na região do encadeador. EXEMPLOS DE ENCADEADORES SÃO:[00540] If the polypeptide of the invention is modified by the attachment of a polymer, for example, a polyethylene glycol (PEG) moiety, the linker sequence preferably includes an amino acid residue, such as a cysteine or a lysine, allowing said modification, for example, PEGilation, in the chainer region. EXAMPLES OF CHAINERS ARE:

[00541] GGGGS (encadeador de 5 GS, SEQ ID NO: 233)[00541] GGGGS (5 GS chainer, SEQ ID NO: 233)

[00542] SGGSGGS (encadeador de 7GS, SEQ ID NO: 234)[00542] SGGSGGS (7GS chainer, SEQ ID NO: 234)

[00543] GGGGCGGGS (encadeador de 8GS, SEQ ID NO: 235)[00543] GGGGCGGGS (8GS chainer, SEQ ID NO: 235)

[00544] GGGGSGGGS (encadeador de 9GS, SEQ ID NO: 236)[00544] GGGGSGGGS (9GS chainer, SEQ ID NO: 236)

[00545] GGGGSGGGGS (encadeador de 10GS, SEQ ID NO: 237)[00545] GGGGSGGGGS (10GS chainer, SEQ ID NO: 237)

[00546] GGGGSGGGGSGGGGS (encadeador de 15GS, SEQ ID NO: 238)[00546] GGGGSGGGGGSGGGGS (15GS chainer, SEQ ID NO: 238)

[00547] GGGGSGGGGSGGGGGGGS (encadeador de 18GS, SEQ ID NO: 239)[00547] GGGGSGGGGSGGGGGGGS (18GS chainer, SEQ ID NO: 239)

[00548] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (encadeador de 20GS, SEQ ID NO: 240)[00548] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20GS chainer, SEQ ID NO: 240)

[00549] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (encadeador de 25GS, SEQ ID NO: 241)[00549] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (25GS chainer, SEQ ID NO: 241)

[00550] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (enca- deador de 30GS, SEQ ID NO: 242)[00550] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (30GS chainer, SEQ ID NO: 242)

[00551] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (encadeador de 35GS, SEQ ID NO: 243)[00551] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS chainer, SEQ ID NO: 243)

[00552] EPKSCDKTHTCPPCP (encadeador de articulação de G1, SEQ ID NO: 244)[00552] EPKSCDKTHTCPPCP (G1 link chain, SEQ ID NO: 244)

[00553] GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (encadeador de 9GS-articulação de G1, SEQ ID NO: 245)[00553] GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (G1 9GS-joint chainer, SEQ ID NO: 245)

[00554] EPKTPKPQPAAA (região de articulação longa superior de Lhama, SEQ ID NO: 246)[00554] EPKTPKPQPAAA (Llama upper long joint region, SEQ ID NO: 246)

[00555] ELKTPL- GDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSC DTPPPCPRCP (articulação de G3, SEQ ID NO: 247)[00555] ELKTPL- GDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSC DTPPPCPRCP (G3 joint, SEQ ID NO: 247)

[00556] AAA (encadeador de Ala, SEQ ID NO: 248)[00556] AAA (Wing chainer, SEQ ID NO: 248)

[00557] Além do mais, o encadeador também pode ser uma porção poli(etileno glicol), conforme mostrado por exemplo, na publicação de patente internacional No. WO04/081026.[00557] Furthermore, the linker can also be a poly(ethylene glycol) moiety, as shown for example in International Patent Publication No. WO04/081026.

[00558] Exemplos não limitantes de polipeptídeos os quais compreendem ou consistem em dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina anti-CX3CR1 são dados na Tabela 8a. TABELA 8A: POLIPEPTÍDEOS ANTI-CX3CR1 BIVALENTES [00558] Non-limiting examples of polypeptides which comprise or consist of two or more single anti-CX3CR1 immunoglobulin variable domains are given in Table 8a. TABLE 8A: BIVALENT ANTI-CX3CR1 POLYPEPTIDES

[00559] Em outra modalidade, os no mínimo dois domínios variá- veis únicos de imunoglobulina do polipeptídeo da invenção são ligados uns aos outros através de outra porção (opcionalmente através de um ou dois encadeadores), tal como outro polipeptídeo o qual, em uma modalidade preferencial porém não limitante, pode ser um domínio variável único de imunoglobulina adicional conforme já descrito acima. A porção referida pode ou ser essencialmente inativa ou pode ter um efeito biológico tal como aprimoramento das propriedades desejadas do polipeptídeo ou pode conferir uma ou mais propriedades desejadas adicionais ao polipeptídeo. Por exemplo, e sem limitação, a porção pode aumentar a meia-vida da proteína ou do polipeptídeo, e/ou pode reduzir sua imunogenicidade ou aprimorar qualquer outra propriedade desejada.[00559] In another embodiment, the at least two unique immunoglobulin variable domains of the polypeptide of the invention are linked to each other through another moiety (optionally through one or two linkers), such as another polypeptide which, in one preferred but non-limiting embodiment may be an additional single immunoglobulin variable domain as already described above. Said moiety can either be essentially inactive or can have a biological effect such as enhancing the desired properties of the polypeptide or can confer one or more additional desired properties on the polypeptide. For example, and without limitation, the moiety can increase the half-life of the protein or polypeptide, and/or can reduce its immunogenicity or enhance any other desired property.

[00560] Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção inclui, especi- almente quando usado como um agente terapêutico, uma porção a qual prolonga a meia-vida do polipeptídeo da invenção no soro ou em outros fluidos corporais de um paciente. O termo "meia-vida" significa o tempo que leva para a concentração sérica do polipeptídeo (modificado) reduzir por 50%, in vivo, por exemplo, devido à degradação do polipeptídeo e/ou ao clearance e/ou à sequestração por mecanismos naturais.[00560] In one aspect, a polypeptide of the invention includes, especially when used as a therapeutic agent, a portion which prolongs the half-life of the polypeptide of the invention in the serum or other body fluids of a patient. The term "half-life" means the time it takes for the serum concentration of the (modified) polypeptide to decrease by 50%, in vivo, for example, due to degradation of the polypeptide and/or clearance and/or sequestration by natural mechanisms. .

[00561] De acordo com uma modalidade adicional da invenção, os dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina pdoem ser fundidos a uma molécula de albumina sérica, tal como descrito por exemplo, nas publicações de patente internacional Nos. WO01/79271 e No. WO03/59934.[00561] According to a further embodiment of the invention, the two single immunoglobulin variable domains can be fused to a serum albumin molecule, as described for example in International Patent Publications Nos. WO01/79271 and No. WO03/59934.

[00562] Alternativamente, a referida porção de prolongamento da meia-vida pdoe ser ligada de modo covalente ou fundida ao referido polipeptídeo e pode ser, sem limitação, uma porção Fc, uma porção albumina, um fragmento de uma porção albumina, uma porção de ligação de albumina, tal como um domínio variável único de imunoglo- bulina anti-albumina, uma porção de ligação de transferrina, tal como um domínio variável único de imunoglobulina anti-transferrina, uma molécula de polioxialquileno, tal como uma molécula de polietileno gli- col, um peptídeo de ligação de albumina, ou derivados de hidroxietil amido (HES).[00562] Alternatively, said half-life extending moiety may be covalently linked or fused to said polypeptide and may be, without limitation, an Fc moiety, an albumin moiety, a fragment of an albumin moiety, an albumin moiety, an albumin binding, such as a single anti-albumin immunoglobulin variable domain, a transferrin binding moiety, such as a single anti-transferrin immunoglobulin variable domain, a polyoxyalkylene molecule, such as a polyethylene glycol molecule, col, an albumin-binding peptide, or hydroxyethyl starch (HES) derivatives.

[00563] Em outro aspecto, o polipeptídeo da invenção compreende uma porção a qual liga a um antígeno encontrado no sangue, tal como albumina sérica, imunoglobulinas do soro, proteína de ligação de tiro- xina, fibrinogênio ou transferrina, deste modo conferindo uma aumentada meia-vida in vivo ao polipeptídeo resultante da invenção. De acordo com uma modalidade, a porção referida é uma imunoglobulina de ligação de albumina e, em particular, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação de albumina tal como um domínio VHH de ligação de albumina.[00563] In another aspect, the polypeptide of the invention comprises a portion which binds to an antigen found in the blood, such as serum albumin, serum immunoglobulins, thyroxine binding protein, fibrinogen or transferrin, thereby conferring an increased in vivo half-life of the resulting polypeptide of the invention. According to one embodiment, said portion is an albumin-binding immunoglobulin, and in particular, a single albumin-binding immunoglobulin variable domain such as an albumin-binding VHH domain.

[00564] Em outra modalidade, o polipeptídeo da invenção compreende uma porção a qual liga a albumina sérica, em que a porção referida é um peptídeo de ligação de albumina, conforme descrito por exemplo, nas publicações de patente internacional Nos. WO2008/068280 e WO2009/127691.[00564] In another embodiment, the polypeptide of the invention comprises a portion which binds serum albumin, wherein said portion is an albumin-binding peptide, as described for example in International Patent Publications Nos. WO2008/068280 and WO2009/127691.

[00565] Caso pretendido para utilização em seres humanos, o referido domínio variável único de imunoglobulina de ligação de albumina (também denominado domínio variável único de imunoglobulina anti- albumina) preferencialmente ligará à albumina sérica humana e preferencialmente será um domínio VHH de ligação de albumina humanizado.[00565] If intended for use in humans, said albumin-binding immunoglobulin single variable domain (also called anti-albumin-immunoglobulin single variable domain) will preferably bind human serum albumin and preferably be an albumin-binding VHH domain humanized.

[00566] Domínios variáveis únicos de imunoglobulina ligando a albumina sérica humana são conhecidos na técnica e são descritos em detalhes adicionais, por exemplo, na publicação de patente internacional No. WO2006/122786. Um domínio VHH de ligação de albumina especificamente útil consiste em ou contém a sequência de aminoáci- dos conforme estipulado em qualquer uma de SEQ ID NO: 230 a 232: [00566] Single immunoglobulin variable domains binding to human serum albumin are known in the art and are described in further detail, for example, in International Patent Publication No. WO2006/122786. A specifically useful VHH albumin-binding domain consists of or contains the amino acid sequence as stipulated in any one of SEQ ID NO: 230 to 232:

[00567] De acordo com uma modalidade, um polipeptídeo da invenção pode ser ligado a uma ou mais partes de anticorpo, fragmentos ou domínios que conferem uma ou mais funções efetoras ao polipeptídeo da invenção e/ou podem conferir a capacidade para ligar a um ou mais receptores de Fc. Por exemplo, para este fim, e sem ser limitado a isto, as partes de anticorpo podem ser ou podem compreender domínios CH2 e/ou CH3 de um anticorpo, tal como de um anticorpo de cadeia pesada (conforme descrito acima) e mais preferencialmente de um anticorpo de 4 cadeias humano convencional; especificamente, o poli- peptídeo da invenção pode ser ligado a uma região Fc, por exemplo, de IgG humana, de IgE humana ou de outra Ig humana. Por exemplo, a publicação de patente internacional No. WO 94/04678 descreve anticorpos de cadeia pesada compreendendo um domínio VHH Camelídeo ou um derivado humanizado do mesmo, no qual o domínio CH2 e/ou CH3 Camelidae foram substituídos por domínios CH2 e/ou CH3 humanos, de modo a proporcionar uma imunoglobulina que consiste em 2 cadeias pesadas, cada uma compreendendo um domínio VHH - opcionalmente humanizado - e domínios CH2 e CH3 humanos (mas não domínio CH1), cuja imunoglobulina tem a função efetora proporcionada pelos domínios CH2 e CH3, pode funcionar sem a presença de quaisquer cadeias leves, e tem uma meia-vida aumentada em comparação com os domínios VHH correspondentes sem a modificação referida.[00567] According to one embodiment, a polypeptide of the invention can be linked to one or more antibody parts, fragments or domains that confer one or more effector functions to the polypeptide of the invention and/or can confer the ability to bind to one or more more Fc receptors. For example, to this end, and without being limited thereto, antibody parts may be or may comprise CH2 and/or CH3 domains from an antibody, such as from a heavy chain antibody (as described above) and more preferably from a standard human 4-chain antibody; specifically, the polypeptide of the invention can be linked to an Fc region, for example, of human IgG, human IgE or other human Ig. For example, International Patent Publication No. WO 94/04678 describes heavy chain antibodies comprising a Camelidae VHH domain or a humanized derivative thereof, in which the Camelidae CH2 and/or CH3 domain has been replaced by CH2 and/or CH3 domains human, so as to provide an immunoglobulin consisting of 2 heavy chains, each comprising a VHH domain - optionally humanized - and human CH2 and CH3 domains (but not CH1 domain), which immunoglobulin has the effector function provided by the CH2 and CH3 domains , can function without the presence of any light chains, and has an increased half-life compared to corresponding VHH domains without said modification.

[00568] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende dois VHHs anti-CX3CR1 e um VHH capaz de ligação a albumina sérica. Em um aspecto, os VHHs são fundidos usando pep- tídeos encadeadores. Exemplos típicos de semelhantes polipeptí- deos da presente invenção são mostrados nas partes que se seguem.[00568] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises two anti-CX3CR1 VHHs and one VHH capable of binding serum albumin. In one aspect, the VHHs are fused using linker peptides. Typical examples of similar polypeptides of the present invention are shown in the following parts.

[00569] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um primeiro VHH anti-CX3CR1 fundido a um primeiro peptídeo encadeador, o qual é o próprio fundido a um VHH capaz de ligação a albumina sérica, o qual é o próprio fundido a um segundo peptídeo encadeador, o qual é o próprio fundido a um segundo VHH anti-CX3CR1. Em um aspecto, o primeiro ou o segundo peptídeo en- cadeador é um encadeador de 9GS, em um aspecto, o primeiro e o segundo peptídeo encadeador é um encadeador de 9GS. Em um aspecto, o VHH capaz de ligação a albumina sérica é capaz de ligação a albumina sérica humana. Em um aspecto, o VHH capaz de ligação a albumina sérica tem a sequência de aminoácidos estipulada em SEQ ID NO: 231. Em um aspecto, o primeiro e o segundo VHH anti- CX3CR1 têm a mesma sequência de aminoácidos. Em um aspecto, o primeiro ou o segundo VHH anti-CX3CR1 tem a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em:[00569] In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises a first anti-CX3CR1 VHH fused to a first linker peptide, which is itself fused to a VHH capable of binding serum albumin, which is itself fused to a second linker peptide, which is itself fused to a second anti-CX3CR1 VHH. In one aspect, the first or second peptide linker is a 9GS linker, in one aspect, the first and second peptide linker is a 9GS linker. In one aspect, the VHH capable of binding serum albumin is capable of binding human serum albumin. In one aspect, the VHH capable of binding serum albumin has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 231. In one aspect, the first and second anti-CX3CR1 VHH have the same amino acid sequence. In one aspect, the first or second anti-CX3CR1 VHH has the CDR1, CDR2 and CDR3 stipulated in:

[00570] - SEQ ID NO's: 213, 214 e 186; ou[00570] - SEQ ID NO's: 213, 214 and 186; or

[00571] - SEQ ID NO's: 213, 221 e 186; ou[00571] - SEQ ID NO's: 213, 221 and 186; or

[00572] - SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00572] - SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00573] Em um aspecto, o primeiro e o segundo VHH anti-CX3CR1 têm a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em:[00573] In one aspect, the first and second anti-CX3CR1 VHH have the CDR1, CDR2 and CDR3 stipulated in:

[00574] - SEQ ID NO's: 213, 214 e 186; ou[00574] - SEQ ID NO's: 213, 214 and 186; or

[00575] - SEQ ID NO's: 213, 221 e 186; ou[00575] - SEQ ID NO's: 213, 221 and 186; or

[00576] - SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00576] - SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00577] Em um aspecto, o primeiro ou o segundo VHH anti- CX3CR1 tem a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 138 a 140 ou SEQ ID NO: 222 a 224. Em um aspecto, o primeiro e o segundo VHH anti-CX3CR1 têm a mesma sequência de aminoácidos, em que a referida sequência de aminoácidos é a sequência estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 138 a 140 ou SEQ ID NO: 222 a 224.[00577] In one aspect, the first or second anti-CX3CR1 VHH has the amino acid sequence set forth in either SEQ ID NO: 138 to 140 or SEQ ID NO: 222 to 224. In one aspect, the first and second second anti-CX3CR1 VHH have the same amino acid sequence, wherein said amino acid sequence is the sequence stipulated in either SEQ ID NO: 138 to 140 or SEQ ID NO: 222 to 224.

[00578] Exemplos não limitantes de polipeptídeos da presente in- venção são os polipeptídeos de qualquer uma de SEQ ID NO: 225 a 227, 249 ou 277 a 281. [00578] Non-limiting examples of polypeptides of the present invention are the polypeptides of any one of SEQ ID NO: 225 to 227, 249 or 277 to 281.

[00579] Em outro aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um VHH anti-CX3CR1 e um domínio de Fc. Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção compreende um VHH anti-CX3CR1 fundido a um peptídeo encadeador, o qual é o próprio fundido a um domínio de Fc. Em um aspecto, o peptídeo encadeador é um encadeador de 15GS. Em um aspecto, o domínio de Fc tem a sequência de aminoácidos estipulada em SEQ ID NO: 250 ou 252. Em um aspecto, o VHH tem a CDR1, a CDR2 e a CDR3 estipuladas em:[00579] In another aspect, a polypeptide of the present invention comprises an anti-CX3CR1 VHH and an Fc domain. In one aspect, a polypeptide of the present invention comprises an anti-CX3CR1 VHH fused to a linker peptide, which is itself fused to an Fc domain. In one aspect, the linker peptide is a 15GS linker. In one aspect, the Fc domain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 250 or 252. In one aspect, the VHH has the CDR1, CDR2 and CDR3 set forth in:

[00580] - SEQ ID NO's: 213, 214 e 186; ou[00580] - SEQ ID NO's: 213, 214 and 186; or

[00581] - SEQ ID NO's: 213, 221 e 186; ou[00581] - SEQ ID NO's: 213, 221 and 186; or

[00582] - SEQ ID NO's: 141, 162 e 186.[00582] - SEQ ID NO's: 141, 162 and 186.

[00583] Em um aspecto, o VHH tem a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NO: 138 a 140 ou SEQ ID NO: 222 a 224. Em um aspecto o polipeptídeo está sob a forma de um díme- ro, por exemplo, em que o dímero é formado por uma ou mais pontes de dissulfeto.[00583] In one aspect, the VHH has the amino acid sequence set forth in either SEQ ID NO: 138 to 140 or SEQ ID NO: 222 to 224. In one aspect the polypeptide is in the form of a dimer, for example, where the dimer is formed by one or more disulfide bridges.

[00584] Exemplos não limitantes de polipeptídeos da presente invenção são os polipeptídeos de SEQ ID NO: 251, 253 ou 254. [00584] Non-limiting examples of polypeptides of the present invention are the polypeptides of SEQ ID NO: 251, 253 or 254.

[00585] Um polipeptídeo da invenção pode ser modificado para melhorar suas propriedades. Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção pode ser modificado para aumentar sua estabilidade depois de armazenamento. Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção pode ser modificado para facilitar sua expressão em um sistema hospedeiro em particular. Por exemplo, o primeiro códon de um polipeptídeo da presente invenção pode ser modificado. Em um aspecto, um polipep- tídeo da presente invenção se inicia com um ácido glutâmico (glu) como seu primeiro aminoácido. Em outro aspecto, um polipeptídeo da presente invenção se inicia com um ácido aspártico (asp) como seu primeiro aminoácido, por exemplo, para reduzir a formação de piroglutamato no N-término durante o armazenamento e portanto aumentar a estabilidade do produto. Em outro aspecto, um polipeptídeo da presente invenção se inicia com uma alanina (ala) ou uma valina (val) como seu primeiro ami- noácido, por exemplo, para facilitar a expressão do polipeptídeo em um sistema de expressão procariótica, tal como Escherichia coli. A modificação referida de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é feita usando técnicas conhecidas na técnica.[00585] A polypeptide of the invention can be modified to improve its properties. In one aspect, a polypeptide of the present invention can be modified to increase its stability after storage. In one aspect, a polypeptide of the present invention can be modified to facilitate its expression in a particular host system. For example, the first codon of a polypeptide of the present invention can be modified. In one aspect, a polypeptide of the present invention starts with a glutamic acid (glu) as its first amino acid. In another aspect, a polypeptide of the present invention starts with an aspartic acid (asp) as its first amino acid, for example, to reduce pyroglutamate formation at the N-terminus during storage and thereby increase product stability. In another aspect, a polypeptide of the present invention starts with an alanine (ala) or a valine (val) as its first amino acid, for example, to facilitate expression of the polypeptide in a prokaryotic expression system, such as Escherichia coli. . Said modification of a polypeptide according to the present invention is done using techniques known in the art.

[00586] Exemplos típicos de polipeptídeos de acordo com a presente invenção com um primeiro códon modificado são estipulados em qualquer uma de SEQ ID NO: 257 a 262 e 263-266 e são mostrados nas Tabelas 11 e 12 abaixo: [00586] Typical examples of polypeptides according to the present invention with a modified first codon are stipulated in any one of SEQ ID NO: 257 to 262 and 263-266 and are shown in Tables 11 and 12 below:

[00587] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente in- venção é caracterizado por uma ou mais das seguintes propriedades: • Liga com alta afinidade à CX3CR1 humana; • Inibe a ligação de fractalcina solúvel à CX3CR1 humana; • Inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina; • Inibe a internalização de receptores de CX3CR1 humana induzida pela fractalcina; • Tem reação cruzada com CX3CR1 cyno dentro de 10 vezes da E/IC50 para CX3CR1 humana para ligação e inibição funcional.[00587] In an additional aspect, a polypeptide of the present invention is characterized by one or more of the following properties: • Binds with high affinity to human CX3CR1; • Inhibits binding of soluble fractalkine to human CX3CR1; • Inhibits fractalkine-induced chemotaxis; • Inhibits fractalkine-induced internalization of human CX3CR1 receptors; • Cross-reacts with cyno CX3CR1 within 10 fold of the E/IC50 for human CX3CR1 for binding and functional inhibition.

[00588] Por conseguinte, em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção tem uma afinidade para CX3CR1 humana a uma IC50 menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM, ou menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM, conforme determinado por FACS de competição.[00588] Accordingly, in one aspect, a polypeptide of the present invention has an affinity for human CX3CR1 at an IC50 less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM, or less than or equal to 2.5 nM or less than or equal to 1 nM as determined by competition FACS.

[00589] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção tem uma afinidade para CX3CR1 humana a uma EC50 de menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM, ou menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM, conforme determinado por FACS de ligação celular.[00589] In a further aspect, a polypeptide of the present invention has an affinity for human CX3CR1 at an EC50 of less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM, or less than or equal to 2.5 nM or less than or equal to 1 nM, as determined by cell binding FACS.

[00590] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção bloqueia a ligação de CX3CR1 humana à fractalcina humana a ou acima de 50%, ou a ou acima de 60%, ou a ou acima de 70%, ou a ou acima de 80%, ou a ou acima de 90%, ou a ou acima de 95% conforme determinado por FACS de competição com fractalcina humana.[00590] In a further aspect, a polypeptide of the present invention blocks binding of human CX3CR1 to human fractalkine at or above 50%, or at or above 60%, or at or above 70%, or at or above 80%, or at or above 90%, or at or above 95% as determined by human fractalkine competition FACS.

[00591] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção bloqueia a ligação de fractalcina humana à CX3CR1 humana a uma IC50 de menos de ou iqual a 300 nM, ou menos de ou iqual a 100 nM, ou menos de ou iqual a 20 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM, menos de ou iqual a 5 nM, menos de ou iqual a 2,5 nM ou menos de ou iqual a 1 nM conforme determinado por FACS de competição com fractalcina humana.[00591] In a further aspect, a polypeptide of the present invention blocks binding of human fractalkine to human CX3CR1 at an IC50 of less than or equal to 300 nM, or less than or equal to 100 nM, or less than or equal to 20 nM, or less than or equal to 10 nM, less than or equal to 5 nM, less than or equal to 2.5 nM, or less than or equal to 1 nM as determined by FACS competition with human fractalkine.

[00592] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina mediada pela CX3CR1 humana a ou acima de 10%, ou a ou acima de 30%, ou a ou acima de 40%, ou a ou acima de 50%, ou a ou acima de 60%, ou a ou acima de 70%, ou a ou acima de 80%, ou a ou acima de 90%.[00592] In a further aspect, a polypeptide of the present invention inhibits fractalkine-induced chemotaxis mediated by human CX3CR1 at or above 10%, or at or above 30%, or at or above 40%, or at or above of 50%, or at or above 60%, or at or above 70%, or at or above 80%, or at or above 90%.

[00593] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção inibe a quimiotaxia induzida pela fractalcina mediada pela CX3CR1 humana a uma IC50 de menos de ou iqual a 500 nM, ou de menos de ou iqual a 100 nM, ou menos de ou iqual a 75 nM, ou menos de ou iqual a 50 nM, ou menos de ou iqual a 10 nM ou menos de ou iqual a 5 nM.[00593] In a further aspect, a polypeptide of the present invention inhibits fractalkine-induced chemotaxis mediated by human CX3CR1 at an IC50 of less than or equal to 500 nM, or less than or equal to 100 nM, or less than or equal to at 75 nM, or less than or equal to 50 nM, or less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM.

[00594] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invenção inibe a internalização de receptor da CX3CR1 humana induzida pela fractalcina a uma IC50 de menos de ou iqual a 10 nM, ou menos de ou iqual a 5 nM ou ou menos de ou iqual a 1 nM.[00594] In a further aspect, a polypeptide of the present invention inhibits fractalkine-induced human CX3CR1 receptor internalization at an IC50 of less than or equal to 10 nM, or less than or equal to 5 nM or or less than or equal to to 1 nM.

[00595] De acordo com ainda outra modalidade, uma modificação de prolongação da meia-vida de um polipeptídeo da invenção (a referida modificação também reduzindo a imunogenicidade do polipeptí- deo) compreende a ligação de um polímero farmacologicamente aceitável adequado, tal como poli(etileno glicol) (PEG) de cadeia reta ou ramificada ou derivados do mesmo (tais como metoxipoli(etileno glicol) ou mPEG). De modo geral, pode ser usada qualquer forma adequada de PEGuilação, tal como a PEGuilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo mas não limitados a anticorpos de domínio e scFv's); é feita referência, por exemplo, a: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese e Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris e Chess, Nat. Rev. Drug. Dis- cov. 2 (2003); publicação de patente internacional No. WO 04/060965; e patente dos Estados Unidos No. US6.875.841.[00595] According to yet another embodiment, a half-life prolonging modification of a polypeptide of the invention (said modification also reducing the immunogenicity of the polypeptide) comprises linking a suitable pharmacologically acceptable polymer, such as poly( straight or branched chain ethylene glycol) (PEG) or derivatives thereof (such as methoxypoly(ethylene glycol) or mPEG). In general, any suitable form of PEGylation can be used, such as the PEGylation used in the art for antibodies and antibody fragments (including but not limited to domain antibodies and scFv's); reference is made, for example, to: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Disc. 2 (2003); International Patent Publication No. WO 04/060965; and US Patent No. US6,875,841.

[00596] Vários reagentes para PEGuilação de polipeptídeos também estão disponíveis comercialmente, por exemplo, na Nektar Therapeutics, EUA, ou na NOF Corporation, Japão, tais como as EA Seri es, SH Series, MA Series, CA Series, e ME Series da Sunbright®, tais como Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, e Sunbright® ME-400MA.[00596] Various reagents for PEGylation of polypeptides are also commercially available, for example, from Nektar Therapeutics, USA, or from NOF Corporation, Japan, such as the EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, and ME Series from Sunbright®, such as Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, and Sunbright® ME-400MA.

[00597] Preferencialmente, é usada PEGuilação sítio-direcionada, em particular através de um resíduo cisteína (vide, por exemplo, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). Por exemplo, para este fim, PEG pode ser ligado a um resíduo cisteína que ocorre naturalmente em um polipeptídeo da invenção, um polipeptídeo da invenção pode ser modificado de modo a introduzir adequadamente um ou mais resíduos cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de aminoá- cidos compreendendo um ou mais resíduos cisteína para ligação de PEG pode ser fundida ao N- e/ou C-término e/ou PEG pode ser ligado a uma região de encadeador que faz ponte entre dois ou mais domínios funcionais de um polipeptídeo da invenção, todas usando técnicas de engenharia de proteína conhecidas per se pela pessoa versada.[00597] Preferably, site-directed PEGylation is used, in particular via a cysteine residue (see, for example, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). For example, to this end, PEG can be linked to a naturally occurring cysteine residue in a polypeptide of the invention, a polypeptide of the invention can be modified so as to suitably introduce one or more cysteine residues for PEG binding, or a sequence of amino acids comprising one or more cysteine residues for PEG binding can be fused to the N- and/or C-terminus and/or PEG can be linked to a linker region that bridges between two or more functional domains of a polypeptide of the invention, all using protein engineering techniques known per se to the skilled person.

[00598] Preferencialmente, para os polipeptídeos da invenção, é usado um PEG com um peso molecular de mais de 5 kDa, tal como mais de 10 kDa e menos de 200 kDa, tal como menos de 100 kDa; por exemplo, na faixa de 20 kDa a 80 kDa.[00598] Preferably, for the polypeptides of the invention, a PEG having a molecular weight of more than 5 kDa, such as more than 10 kDa and less than 200 kDa, such as less than 100 kDa, is used; for example, in the range of 20 kDa to 80 kDa.

[00599] Com respeito à PEGuilação, deve ser observado que, de modo geral, a invenção também engloba qualquer polipeptídeo da invenção que tenha sido PEGuilado em uma ou mais posições de ami- noácido, preferencialmente em um modo tal que a referida PEGuilação ou (1) aumenta a meia-vida in vivo; (2) reduz a imunogenicidade; (3) proporciona uma ou mais propriedades benéficas adicionais conhecidas per se para PEGuilação; (4) não afeta essencialmente a afinidade do polipeptídeo para CX3CR1 (por exemplo, não reduz a referida afinidade por mais de 50%, e mais preferencialmente não por mais de 10%, conforme determinado por um teste adequado, tais como os descritos nos Exemplos abaixo); e/ou (4) não afeta qualquer uma das outras propriedades desejadas dos polipeptídeos da invenção. Grupamentos PEG adequados e métodos para a ligação dos mesmos, quer especificamente ou não especificamente, serão evidentes para a pessoa versada.[00599] With respect to PEGylation, it should be noted that, generally speaking, the invention also encompasses any polypeptide of the invention that has been PEGylated at one or more amino acid positions, preferably in such a way that said PEGylation or ( 1) increases in vivo half-life; (2) reduces immunogenicity; (3) provides one or more additional beneficial properties known per se for PEGylation; (4) does not essentially affect the affinity of the polypeptide for CX3CR1 (e.g., does not reduce said affinity by more than 50%, and more preferably not by more than 10%, as determined by a suitable test, such as those described in the Examples below); and/or (4) does not affect any of the other desired properties of the polypeptides of the invention. Suitable PEG moieties and methods for linking the same, whether specifically or non-specifically, will be apparent to the skilled person.

[00600] De acordo com uma modalidade especificamente preferencial da invenção, um polipeptídeo PEGuilado da invenção inclui uma porção PEG de PEG linear tendo um peso molecular de 40 kDa ou 60 kDa, em que a porção PEG é ligada ao polipeptídeo em uma região de encadeador e, especificamente, em um resíduo Cys, por exemplo, na posição 5 de um peptídeo encadeador de GS8 conforme mostrado em SEQ ID NO: 235.[00600] According to a specifically preferred embodiment of the invention, a PEGylated polypeptide of the invention includes a PEG portion of linear PEG having a molecular weight of 40 kDa or 60 kDa, wherein the PEG portion is linked to the polypeptide in a linker region and specifically at a Cys residue, for example at position 5 of a GS8 linker peptide as shown in SEQ ID NO: 235.

[00601] Exemplos preferenciais de polipeptídeos PEGuilados da invenção são PEGuilados preferencialmente com um dos reagentes PEG conforme mencionado acima, tal como "Sunbright® ME-400MA" conforme mostrado na fórmula química que se segue: [00601] Preferred examples of PEGylated polypeptides of the invention are PEGylated preferably with one of the PEG reagents as mentioned above, such as "Sunbright® ME-400MA" as shown in the following chemical formula:

[00602] o qual tem um peso molecular médio de 40 kDa.[00602] which has an average molecular weight of 40 kDa.

therapeutic uses

[00603] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um poli- peptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo para uso como um medicamento.[00603] In one aspect, the present invention provides a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide for use as a medicament.

[00604] Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo para o tratamento ou a profilaxia de distúrbios ateroscleróticos cardio- e cerebrovasculares, doença arterial periférica, restenose, nefropatia diabética, glomerulo- nefrite, glomerulonefrite crescente humana, nefropatia por IgA, nefro- patia membranosa, nefrite lúpica, vasculite incluindo púrpura de He- noch-Schonlein e granulomatose de Wegener, artrite reumatoide, os- teoartrite, rejeição de aloenxerto, esclerose sistêmica, distúrbios neu- rodegenerativos e doença desmielinizante, esclerose múltipla (em inglês, MS), mal de Alzheimer, doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, dor neuropática, dor inflamatória, ou câncer.[00604] In one aspect, the present invention provides the use of a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide for the treatment or prophylaxis of atherosclerotic cardio- and cerebrovascular disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, human crescent glomerulonephritis, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neural disorders - rodegenerative and demyelinating disease, multiple sclerosis (MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

[00605] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo para o tratamento ou a profilaxia de aterosclerose.[00605] In another aspect, the present invention provides the use of a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide for the treatment or prophylaxis of atherosclerosis.

[00606] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo para o tratamento ou a profilaxia de aterosclerose por prevenção e/ou redução da formação de novas lesões ou placas ateroscleróticas e/ou por prevenção ou diminuição da progressão de lesões e placas existentes.[00606] In another aspect, the present invention provides the use of a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide for the treatment or prophylaxis of atherosclerosis by preventing and/or reducing the formation of new lesions or atherosclerotic plaques and /or by preventing or slowing the progression of existing lesions and plaques.

[00607] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo para o tratamento ou a profilaxia de aterosclerose por modificação da composição das placas de modo a reduzir o risco de ruptura de placas e de eventos atero- trombóticos.[00607] In another aspect, the present invention provides the use of a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide for the treatment or prophylaxis of atherosclerosis by modifying the composition of the plaques in order to reduce the risk of rupture of plaques and atherothrombotic events.

[00608] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, ou redução do risco de, distúrbios ateros- cleróticos cardio- e cerebrovasculares, doença arterial periférica, restenose, nefropatia diabética, glomerulonefrite, glomerulonefrite crescente humana, nefropatia por IgA, nefropatia membranosa, nefrite lú- pica, vasculite incluindo púrpura de Henoch-Schonlein e granulomato- se de Wegener, artrite reumatoide, osteoartrite, rejeição de aloenxerto, esclerose sistêmica, distúrbios neurodegenerativos e doença desmieli- nizante, esclerose múltipla (em inglês, MS), mal de Alzheimer, doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, dor neuropática, dor inflamatória, ou câncer, em uma pessoa sofrendo de ou em risco de, a referida doença ou condição, em que o método compreende administrar à pessoa uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo.[00608] In one aspect, the present invention also provides a method of treating, or reducing the risk of, cardio- and cerebrovascular atherosclerotic disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, human crescent glomerulonephritis, IgA nephropathy , membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, multiple sclerosis (MS ), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer, in a person suffering from, or at risk of, said disease or condition, wherein the method comprises administering to the person a therapeutically effective amount of a polypeptide according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide.

[00609] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, ou redução do risco de aterosclerose em uma pessoa sofrendo de ou em risco de, a referida doença ou condição, em que o método compreende administrar à pessoa uma quantidade terapeuticamente eficaz de polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo.[00609] In one aspect, the present invention also provides a method of treating, or reducing the risk of atherosclerosis in a person suffering from or at risk of, said disease or condition, wherein the method comprises administering to the person a therapeutically effective form of polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide.

[00610] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, ou redução do risco de aterosclerose por prevenção e/ou redução da formação de novas lesões ou placas ate- roscleróticas e/ou por prevenção ou diminuição da progressão de lesões e placas existentes em uma pessoa sofrendo de ou em risco de, a referida doença ou condição, em que o método compreende administrar à pessoa uma quantidade terapeuticamente eficaz de polipeptí- deo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo.[00610] In one aspect, the present invention also provides a method of treating or reducing the risk of atherosclerosis by preventing and/or reducing the formation of new lesions or atherosclerotic plaques and/or by preventing or decreasing the progression of lesions and plaques existing in a person suffering from, or at risk of, said disease or condition, the method comprising administering to the person a therapeutically effective amount of polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide.

[00611] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, ou redução do risco de aterosclerose por modificação da composição das placas de modo a reduzir o risco de ruptura de placas e eventos aterotrombóticos em uma pessoa sofrendo de ou em risco de, a referida doença ou condição, em que o método compreende administrar à pessoa uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um polipeptídeo da presente invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido polipeptídeo.[00611] In one aspect, the present invention also provides a method of treating, or reducing the risk of, atherosclerosis by modifying plaque composition so as to reduce the risk of plaque rupture and atherothrombotic events in a person suffering from or at risk of, said disease or condition, wherein the method comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of a polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition comprising said polypeptide.

[00612] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção é indicado para utilização no tratamento ou na profilaxia de uma doença ou um distúrbio que é associado com CX3CR1.[00612] In one aspect, a polypeptide of the present invention is indicated for use in the treatment or prophylaxis of a disease or a disorder that is associated with CX3CR1.

[00613] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente invenção é indicado para utilização no tratamento ou na profilaxia de doenças ou condições nas quais é desejável a modulação da atividade no receptor de CX3CR1. Em um aspecto, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, ou redução do risco de, doenças ou condições nas quais o antagonismo do receptor de CX3CR1 é benéfico o qual compreende administrar a uma pessoa sofrendo de ou em risco de, a referida doença ou condição, um polipeptídeo da presente invenção.[00613] In one aspect, a polypeptide of the present invention is indicated for use in the treatment or prophylaxis of diseases or conditions in which modulation of activity at the CX3CR1 receptor is desirable. In one aspect, the present invention also provides a method of treating, or reducing the risk of, diseases or conditions in which CX3CR1 receptor antagonism is beneficial which comprises administering to a person suffering from, or at risk of, said disease or condition, a polypeptide of the present invention.

[00614] Espera-se que a profilaxia seja particularmente relevante para o tratamento de pessoas que sofreram de um episódio prévio de, ou são consideradas de modo diverso como estando em risco aumentado de, a doença ou condição em questão. Pessoas em risco de desenvolver uma doença ou condição em particular geralmente incluem aquelas tendo um histórico familiar da doença ou condição, ou aquelas que foram identificadas por teste genético ou triagem como sendo particularmente suscetíveis a desenvolver a doença ou condição.[00614] Prophylaxis is expected to be particularly relevant to the treatment of persons who have suffered from a previous episode of, or are otherwise considered to be at increased risk of, the disease or condition in question. People at risk of developing a particular disease or condition generally include those having a family history of the disease or condition, or those who have been identified by genetic testing or screening as being particularly susceptible to developing the disease or condition.

[00615] No contexto da presente invenção, o termo "prevenção, tratamento e/ou mitigação" não somente compreende prevenção e/ou tratamento e/ou mitigação da doença, mas também compreende geralmente prevenção do início da doença, diminuição ou reversão do progresso da doença, prevenção ou desaceleração do início de um ou mais sintomas associados com a doença, redução e/ou mitigação de um ou mais sintomas associados com a doença, redução da gravidade e/ou da duração da doença e/ou de quaisquer sintomas associados com a mesma e/ou prevenção de um aumento posterior na gravidade da doença e/ou de quaisquer sintomas associados com a mesma, pre-venção, redução ou reversão de qualquer dano fisiológico causado pela doença, e de modo geral qualquer ação farmacológica que é benéfica para o paciente sendo tratado.[00615] In the context of the present invention, the term "prevention, treatment and/or mitigation" not only comprises prevention and/or treatment and/or mitigation of the disease, but also generally comprises prevention of the onset of the disease, slowing down or reversing the progress disease, preventing or slowing the onset of one or more symptoms associated with the disease, reducing and/or alleviating one or more symptoms associated with the disease, reducing the severity and/or duration of the disease and/or any associated symptoms with the same and/or prevention of a further increase in the severity of the disease and/or any symptoms associated with the same, prevention, reduction or reversal of any physiological damage caused by the disease, and in general any pharmacological action that is beneficial to the patient being treated.

[00616] O indivíduo a ser tratado será um mamífero, e mais particularmente um ser humano. Conforme será evidente para a pessoa versada, o indivíduo a ser tratado será em particular uma pessoa sofrendo de, ou em risco de, as doenças, os distúrbios ou as condições mencionados aqui, neste requerimento de patente.[00616] The subject to be treated will be a mammal, and more particularly a human being. As will be apparent to the person skilled in the art, the individual to be treated will in particular be a person suffering from, or at risk of, the diseases, disorders or conditions mentioned herein in this patent application.

[00617] Além disso será evidente para a pessoa versada que os métodos de tratamento de uma doença acima incluem a preparação de um medicamento para o tratamento da referida doença. Além do mais, é evidente que os polipeptídeos da invenção podem ser usados como um ingrediente ativo em um medicamento ou em uma composição farmacêutica pretendidos para o tratamento das doenças acima. Deste modo, a invenção também se refere ao uso de um polipeptídeo da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, o tratamento e/ou a mitigação de qualquer uma das doenças, dos distúrbios ou das condições mencionados acima. A invenção adicionalmente se refere a um polipeptídeo da invenção para utilização terapêutica ou profilática e, especificamente, para a prevenção, o tratamento e/ou a mitigação de qualquer uma das doenças, dos distúrbios ou das condições mencionados acima. A invenção adicionalmente se refere a uma composição farmacêutica para a prevenção, o tratamento e/ou a mitigação das doenças, dos distúrbios ou das condições mencionados acima, em que a referida composição compreende no mínimo um polipeptídeo da invenção.[00617] Furthermore, it will be apparent to the skilled person that the above methods of treating a disease include preparing a medicament for treating said disease. Furthermore, it is evident that the polypeptides of the invention can be used as an active ingredient in a medicament or in a pharmaceutical composition intended for the treatment of the above diseases. Accordingly, the invention also relates to the use of a polypeptide of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention, treatment and/or mitigation of any of the diseases, disorders or conditions mentioned above. The invention further relates to a polypeptide of the invention for therapeutic or prophylactic use, and specifically for the prevention, treatment and/or mitigation of any of the diseases, disorders or conditions mentioned above. The invention additionally relates to a pharmaceutical composition for the prevention, treatment and/or mitigation of the diseases, disorders or conditions mentioned above, said composition comprising at least one polypeptide of the invention.

[00618] Os polipeptídeos da invenção e/ou as composições compreendendo os mesmos podem ser administrados a um paciente que necessite dos mesmos em qualquer maneira adequada, dependendo da formulação farmacêutica específica ou da composição a ser usada. Deste modo, os polipeptídeos da invenção e/ou as composições compreendendo os mesmos podem ser administrados, por exemplo, por via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via transdérmica, por via oral, por via sublingual (por exemplo, sob a forma de um comprimido sublingual, spray ou gota colocada sob a língua e adsorvida através das membranas mucosas para dentro da rede de capilares sob a língua), por via (intra-)nasal (por exemplo, sob a forma de um spray nasal e/ou como um aerosol), topicamente, por meio de um supositório, por inalação, por via intravitreal (esp. para o tratamento de degeneração macular seca (em inglês, dry AMD) ou glaucoma), ou qualquer outra maneira adequada em uma quantidade ou dose eficaz.[00618] The polypeptides of the invention and/or the compositions comprising the same can be administered to a patient in need thereof in any suitable manner, depending on the specific pharmaceutical formulation or composition to be used. Thus, the polypeptides of the invention and/or compositions comprising the same can be administered, for example, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, transdermally, orally, sublingually ( e.g. in the form of a sublingual tablet, spray or drop placed under the tongue and adsorbed through the mucous membranes into the network of capillaries under the tongue), (intra-)nasally (e.g. in the form of a nasal spray and/or as an aerosol), topically, via a suppository, by inhalation, intravitreally (esp. for the treatment of dry macular degeneration (DRY AMD) or glaucoma), or any other way in an effective amount or dose.

[00619] Os polipeptídeos da invenção e/ou as composições compreendendo os mesmos são administrados de acordo com um regime de tratamento que é adequado para prevenção, tratamento e/ou mitigação da doença, do distúrbio ou da condição a ser prevenido, tratado ou mitigado. O médico geralmente será capaz de determinar um regime de tratamento adequado, dependendo de fatores tais como a doença, o distúrbio ou a condição a ser prevenido, tratado ou mitigado, a gravidade da doença, a gravidade dos sintomas da mesma, o polipep- tídeo específico da invenção a ser usado, a via de administração específica e a formulação farmacêutica ou composição a ser usada, a idade, o sexo, o peso, a dieta, a condição geral do paciente, e fatores similares de conhecimento geral do médico. De modo geral, o regime de tratamento compreenderá a administração de um ou mais polipep- tídeos da invenção, ou de uma ou mais composições compreendendo os mesmos, em quantidades ou doses terapeuticamente e/ou profilati- camente eficazes.[00619] The polypeptides of the invention and/or the compositions comprising the same are administered according to a treatment regimen that is suitable for preventing, treating and/or mitigating the disease, disorder or condition to be prevented, treated or mitigated . The physician will generally be able to determine an appropriate treatment regimen depending on factors such as the disease, disorder or condition to be prevented, treated or alleviated, the severity of the disease, the severity of the symptoms of the disease, the polypeptide specific invention to be used, the specific route of administration and the pharmaceutical formulation or composition to be used, the age, sex, weight, diet, general condition of the patient, and similar factors known to the physician. In general, the treatment regimen will comprise administration of one or more polypeptides of the invention, or one or more compositions comprising the same, in therapeutically and/or prophylactically effective amounts or doses.

[00620] De modo geral, para a prevenção, o tratamento e/ou a miti- gação das doenças, dos distúrbios e das condições mencionados aqui, neste requerimento de patente, e dependendo da doença, do distúrbio ou da condição específico a ser tratado, da potência do polipeptídeo específico da invenção a ser usado, da via de administração específica e da formulação farmacêutica ou composição específica usada, os po- lipeptídeos da invenção geralmente serão administrados em uma quantidade entre 0,005 e 20,0 mg por quilograma de peso corporal e dose, preferencialmente entre 0,05 e 10,0 mg/kg/dose, e mais preferencialmente entre 0,5 e 10 mg/kg/dose, ou continuamente (por exemplo, por infusão) ou como doses únicas (tais como por exemplo, doses diária, semanais, ou mensais; cf. abaixo), mas podem variar significativamente, especialmente, dependendo dos parâmetros acima mencionados.[00620] In general, for the prevention, treatment and/or mitigation of the diseases, disorders and conditions mentioned here, in this patent application, and depending on the specific disease, disorder or condition to be treated , the potency of the specific polypeptide of the invention to be used, the specific route of administration and the specific pharmaceutical formulation or composition used, the polypeptides of the invention will generally be administered in an amount between 0.005 and 20.0 mg per kilogram of body weight and dose, preferably between 0.05 and 10.0 mg/kg/dose, and more preferably between 0.5 and 10 mg/kg/dose, either continuously (e.g., by infusion) or as single doses (such as by daily, weekly, or monthly doses; cf. below), but they can vary significantly, especially depending on the above-mentioned parameters.

[00621] Para aplicações profiláticas, as composições contendo os polipeptídeos da invenção também podem ser administradas em dosagens similares ou ligeiramente menores. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico do indivíduo no caso de qualquer complicação.[00621] For prophylactic applications, compositions containing the polypeptides of the invention can also be administered in similar or slightly lower dosages. The dosage can also be adjusted by the individual's physician in case of any complications.

[00622] Dependendo do polipeptídeo da invenção específico e sua farmacocinética específica e outras propriedades, pode ser administrado diariamente, a cada dois, tês, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, mensalmente, e semelhantes. Um regime de administração pode incluir tratamento semanal, de longo termo. Por "longo termo" se indica no mínimo duas semanas e preferencialmente meses, ou anos de duração.[00622] Depending on the specific polypeptide of the invention and its specific pharmacokinetics and other properties, it may be administered daily, every two, third, four, five or six days, weekly, monthly, and the like. An administration regimen may include weekly, long-term treatment. By "long term" is meant a minimum of two weeks and preferably months or years of duration.

[00623] A eficácia dos polipeptídeos da invenção, e de composições compreendendo os mesmos, pode ser testada usando qualque teste in vitro adequado, teste celular, teste in vivo e/ou modelo animal conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença específica envolvida. Testes e modelos animais adequados serão evidentes para a pessoa versada, e por exemplo, incluem os testes e modelos animais usados nos Exemplos abaixo.[00623] The effectiveness of the polypeptides of the invention, and of compositions comprising the same, can be tested using any suitable in vitro test, cellular test, in vivo test and/or animal model known per se, or any combination thereof, depending on the specific disease involved. Suitable animal tests and models will be apparent to the skilled person, and for example include the animal tests and models used in the Examples below.

[00624] Para utilização farmacêutica, os polipeptídeos da invenção podem ser formulados como uma preparação farmacêutica compreendendo (i) no mínimo um polipeptídeo da invenção e (ii) no mínimo um veículo, diluente, excipiente, adjuvante, e/ou estabilizante farmaceuti- camente aceitável, e (iii) opcionalmente um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos adicionais. Por "farmaceutica- mente aceitável" se indica que o respectivo material não apresenta quaisquer efeitos biológicos ou indesejáveis de modo diverso quando administrados a um indivíduo e não interage em uma maneira prejudicial com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica (tais como por exemplo, o ingrediente farmaceuticamente ativo) na qual está contido. Exemplos específicos podem ser encontrados em manuais de rotina, tais como por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990). Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem ser formulados e administrados em qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpos e outras proteínas farma- ceuticamente ativas. Portanto, de acordo com uma modalidade adicional, a invenção se refere a uma composição farmacêutica ou prepara-ção que contém no mínimo um polipeptídeo da invenção e no mínimo um veículo, diluente, excipiente, adjuvante e/ou estabilizante farma- ceuticamente aceitável, e opcionalmente uma ou mais substâncias farmaceuticamente ativas adicionais.[00624] For pharmaceutical use, the polypeptides of the invention can be formulated as a pharmaceutical preparation comprising (i) at least one polypeptide of the invention and (ii) at least one carrier, diluent, excipient, adjuvant, and/or pharmaceutically stabilizer acceptable, and (iii) optionally one or more polypeptides and/or additional pharmaceutically active compounds. By "pharmaceutically acceptable" is meant that the respective material does not exhibit any biological or otherwise undesirable effects when administered to an individual and does not interact in a harmful manner with any of the other components of the pharmaceutical composition (such as, for example, the pharmaceutically active ingredient) in which it is contained. Specific examples can be found in routine manuals, such as, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990). For example, the polypeptides of the invention can be formulated and administered in any manner known per se for conventional antibodies and antibody fragments and other pharmaceutically active proteins. Therefore, according to an additional embodiment, the invention refers to a pharmaceutical composition or preparation that contains at least one polypeptide of the invention and at least one pharmaceutically acceptable vehicle, diluent, excipient, adjuvant and/or stabilizer, and optionally one or more additional pharmaceutically active substances.

[00625] Por meio de exemplos não limitantes, uma formulação semelhante pode estar em uma forma adequada para administração oral, para administração parenteral (tal como por injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratecal, intracavernosa ou intraperitoneal ou por infusão intravenosa), para administração tópica, para adminis- tração sublingual, para administração por inalação, por um emplastro de pele, por um implante, por um supositório, para administração transdérmica, nasal, intravitreal, retal ou vaginal, e semelhantes. As formas de administração adequadas referidas - as quais podem ser sólidas, semi-sólidas ou líquidas, dependendo da maneira de administração - bem como os métodos e veículos para utilização na preparação das mesmas, serão evidentes para a pessoa versada.[00625] By way of non-limiting examples, a similar formulation may be in a form suitable for oral administration, for parenteral administration (such as by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrathecal, intracavernous or intraperitoneal injection or by intravenous infusion), for administration topically, for sublingual administration, for administration by inhalation, by a skin patch, by an implant, by a suppository, by transdermal, nasal, intravitreal, rectal or vaginal administration, and the like. The mentioned suitable administration forms - which may be solid, semi-solid or liquid, depending on the manner of administration - as well as the methods and vehicles for use in preparing the same, will be apparent to the person skilled in the art.

[00626] Preparações farmacêuticas para administração parenteral, tal como injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou infusão intravenosa podem ser, por exemplo, soluções, suspensões, dispersões, emulsões, ou pós estéreis os quais compreendem o ingrediente ativo e os quais são adequados, opcionalmente depois de uma etapa adicional de dissolução ou diluição, para infusão ou injeção. Veículos ou diluentes adequados para as preparações referidas por exemplo incluem, sem limitação, água estéril e tampões e soluções aquosos farmaceuticamente aceitáveis tais como salina tamponada com fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank; óleos de água; glicerol; etanol; glicóis tais como propileno glicol, bem como óleos minerais, óleos animais e óleos vegetais, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, bem como misturs adequadas dos mesmos.[00626] Pharmaceutical preparations for parenteral administration, such as intravenous, intramuscular, subcutaneous injection or intravenous infusion may be, for example, sterile solutions, suspensions, dispersions, emulsions, or powders which comprise the active ingredient and which are suitable after an additional dissolution or dilution step, for infusion or injection. Suitable carriers or diluents for the foregoing preparations for example include, without limitation, sterile water and pharmaceutically acceptable aqueous buffers and solutions such as physiological phosphate buffered saline, Ringer's solutions, dextrose solution, and Hank's solution; water oils; glycerol; ethanol; glycols such as propylene glycol, as well as mineral oils, animal oils and vegetable oils, for example peanut oil, soybean oil, as well as suitable blends thereof.

[00627] Soluções do composto ativo ou seus sais também podem conter um preservante para prevenir o crescimento de microorganismos, tais como agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerossal (ti- omersal), e semelhantes. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, por meio da formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões ou pelo uso de surfatantes. Outros agentes de retardamento da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina, também podem ser adicionados.[00627] Solutions of the active compound or its salts may also contain a preservative to prevent the growth of microorganisms, such as antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal (thiomersal), and the like . In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, buffers or sodium chloride. Proper fluidity can be maintained, for example, by forming liposomes, by maintaining the required particle size in the case of dispersions or by using surfactants. Other agents delaying absorption, for example aluminum monostearate and gelatin, can also be added.

[00628] Em todos os casos, a forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável sob as condições de fabricação e armazenamento. Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguidos por esterilização por filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são as técnicas de secagem a vácuo e de secagem por congelamento (liofilização), as quais produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional presente nas soluções previamente filtradas estéreis.[00628] In all cases, the final dosage form must be sterile, fluid and stable under the conditions of manufacture and storage. Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compound in the required amount in the appropriate solvent with various of the other ingredients enumerated above, as needed, followed by filter sterilization. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze drying (lyophilization) techniques, which produce a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredients present in the solutions. previously filtered sterile.

[00629] Geralmente, serão preferenciais soluções ou suspensões aquosas. De modo geral, formulações adequadas para proteínas terapêuticas tais como os polipeptídeos da invenção são soluções de proteínas tamponadas, tais como soluções incluindo a proteína em uma concentração adequada (tal como de 0,001 a 400 mg/mL, preferencialmente de 0,005 a 200 mg/mL, mais preferencialmente de 0,01 a 200 mg/mL, mais preferencialmente de 1,0 a 100 mg/mL, tal como 1,0 mg/mL (administração i.v.) ou 100 mg/mL (administração s.c.) e um tampão aquoso tal como:[00629] Generally, aqueous solutions or suspensions will be preferred. In general, suitable formulations for therapeutic proteins such as the polypeptides of the invention are buffered protein solutions, such as solutions including the protein in a suitable concentration (such as 0.001 to 400 mg/mL, preferably 0.005 to 200 mg/mL , more preferably 0.01 to 200 mg/ml, most preferably 1.0 to 100 mg/ml, such as 1.0 mg/ml (i.v. administration) or 100 mg/ml (s.c. administration) and an aqueous buffer such as:

[00630] - salina tamponada com fosfato, pH 7,4,[00630] - phosphate buffered saline, pH 7.4,

[00631] - outros tampões de fosfato, pH 6,2 to 8,2,[00631] - other phosphate buffers, pH 6.2 to 8.2,

[00632] - tampões de histidina, pH 5,5 to 7,0,[00632] - histidine buffers, pH 5.5 to 7.0,

[00633] - tampões de succinato, pH 3,2 to 6,6, e[00633] - succinate buffers, pH 3.2 to 6.6, and

[00634] - tampões de citrato, pH 2,1 to 6,2,[00634] - citrate buffers, pH 2.1 to 6.2,

[00635] e, opcionalmente, sais (por exemplo, NaCl) e/ou açúcares ou polialcoóis (tais como trealose, manitol, ou glicerol) para proporcionar a isotonicidade da solução.[00635] and, optionally, salts (eg NaCl) and/or sugars or polyalcohols (such as trehalose, mannitol, or glycerol) to provide isotonicity of the solution.

[00636] Soluções de proteínas tamponadas preferenciais são soluções incluindo cerca de 0,05 mg/mL do polipeptídeo da invenção dissolvido em 25 mM de tampão de fosfato, pH 6,5, ajustadas para isoto- nicidade adicionando 220 mM de trealose. Além disso, outros agentes tais como um detergente, por exemplo, 0,02% de Tween-20 ou Tween- 80, podem ser incluídos em semelhantes soluções. Formulações para aplicação subcutânea podem incluir concentrações significativamente maiores do polipeptídeo da invenção, tal como até 100 mg/mL ou mesmo acima de 100 mg/mL. No entanto, será evidente para a pessoa versada na técnica que os ingredientes e as quantidades dos mesmos conforme proporcionado acima somente representam uma opção preferencial. Alternativas e variações da mesma serão imediatamente evidentes para a pessoa versada, ou podem ser facilmente concebidas iniciando a partir da descrição acima.[00636] Preferred buffered protein solutions are solutions including about 0.05 mg/mL of the polypeptide of the invention dissolved in 25 mM phosphate buffer, pH 6.5, adjusted to isotonicity by adding 220 mM trehalose. In addition, other agents such as a detergent, for example 0.02% Tween-20 or Tween-80, can be included in similar solutions. Formulations for subcutaneous application can include significantly higher concentrations of the polypeptide of the invention, such as up to 100 mg/ml or even above 100 mg/ml. However, it will be apparent to the person skilled in the art that the ingredients and amounts thereof as provided above only represent a preferred option. Alternatives and variations thereof will be immediately apparent to the skilled person, or can easily be devised starting from the above description.

[00637] Os polipeptídeos da invenção também podem ser administrados usando formulações de depósito, de liberação lenta ou de liberação gradual adequadas, por exemplo, adequadas para injeção, usando dispositivos de liberação controlada para implantação sob a pele, e/ou usando uma bomba de dosagem ou outros dispositivos conhecidos per se para a administração de substâncias ou princípios farmaceuticamente ativos. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem ser formulados sob a forma de um gel, de um creme, de um spray, de uma gota, de um emplastro ou de um filme o qual, caso colocado sobre a pele, passa através da pele.[00637] The polypeptides of the invention may also be administered using suitable depot, slow-release or gradual-release formulations, for example, suitable for injection, using controlled-release devices for implantation under the skin, and/or using a pump dosing or other devices known per se for the administration of pharmaceutically active substances or principles. Furthermore, the polypeptides of the invention can be formulated in the form of a gel, cream, spray, drop, plaster or film which, if placed on the skin, passes through the skin.

[00638] Além disso, comparados com anticorpos convencionais ou fragmentos de anticorpos, uma importante vantagem do uso dos poli- peptídeos da invenção é que também podem ser facilmente administrados através de vias diferentes da administração parenteral e podem ser facilmente formulados para semelhante administração. Por exemplo, conforme descrito no requerimento de patente internacional No. WO2004/041867, semelhantes polipeptídeos podem ser formulados para administração oral, intranasal, intrapulmonar e transdérmica.[00638] Furthermore, compared with conventional antibodies or antibody fragments, an important advantage of using the polypeptides of the invention is that they can also be easily administered via routes other than parenteral administration and can be easily formulated for such administration. For example, as described in International Patent Application No. WO2004/041867, similar polypeptides can be formulated for oral, intranasal, intrapulmonary and transdermal administration.

[00639] De acordo com outra modalidade da invenção é proporcionada uma combinação farmacêutica compreendendo no mínimo um polipeptídeo da invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e no mínimo um outro agente terapêutico selecionado entre o grupo consistindo em estatinas, antiplaquetários, anticoagulantes, antidiabéticos e anti-hipertensivos.[00639] According to another embodiment of the invention, a pharmaceutical combination is provided comprising at least one polypeptide of the invention as described herein, in this patent application, and at least one other therapeutic agent selected from the group consisting of statins, antiplatelet agents, anticoagulants, antidiabetics and antihypertensives.

[00640] A combinação farmacêutica referida opcionalmente e adicionalmente pode compreender um diluente, um excipiente, um adjuvante e/ou um estabilizante.[00640] The pharmaceutical combination mentioned optionally and additionally may comprise a diluent, an excipient, an adjuvant and/or a stabilizer.

[00641] Quando duas ou mais substâncias ou princípios devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, podem ser administrados através da mesma via de administração ou através de diferentes vias de administração, essencialmente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, essencialmente simultaneamente, consecutivamente, ou de acordo com um regime alternado). Quando as substâncias ou princípios devem ser administrados simultaneamente atravéds da mesma via de administração, podem ser administrados como diferentes formulações ou composições farmacêuticas ou como parte de uma formulação ou composição farmacêutica combinada. Além disso, quando duas ou mais substâncias ou princípios ativos devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, cada uma das substâncias ou dos princípios pode ser administrado na mesma quantidade e de acordo com o mesmo regime conforme usado quando o composto ou princípio é usado por si só, e a utilização combinada referida pode levar ou não a um efeito sinérgico. No entanto, quando a utilização combinada das duas ou mais substâncias ou princípios ativos leva a um efeito sinérgico, também pode ser possível reduzir a quantidade de uma, mais ou todas as substân- cias ou princípios a serem administrados, enquanto ainda obtendo a ação terapêutica desejada. Isto pode ser útil, por exemplo, para evitar, limitar ou reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados que estão associados com o uso de uma ou mais das substâncias ou princípios quando são usados em suas quantidades usuais, enquanto ainda obtendo o efeito farmacêutico ou terapêutico desejado.[00641] When two or more substances or principles are to be used as part of a combined treatment regimen, they may be administered via the same route of administration or via different routes of administration, essentially at the same time or at different times (e.g. , essentially simultaneously, consecutively, or according to an alternating regimen). When the substances or principles must be administered simultaneously through the same route of administration, they can be administered as different formulations or pharmaceutical compositions or as part of a combined formulation or pharmaceutical composition. Furthermore, when two or more substances or active principles are to be used as part of a combined treatment regimen, each of the substances or principles may be administered in the same amount and according to the same regimen as used when the compound or principle is used. is used alone, and said combined use may or may not lead to a synergistic effect. However, when the combined use of two or more substances or active principles leads to a synergistic effect, it may also be possible to reduce the amount of one, more or all of the substances or principles to be administered, while still obtaining the therapeutic action. desired. This can be useful, for example, to avoid, limit or reduce any unwanted side effects that are associated with the use of one or more of the substances or principles when they are used in their usual amounts, whilst still achieving the desired pharmaceutical or therapeutic effect.

[00642] Ainda, uma modalidade adicional da invenção é um método para tratar as doenças e os distúrbios conforme estipulado acima, compreendendo administrar a um indivíduo, simultaneamente, separa-damente ou sequencialmente, uma quantidade eficaz de no mínimo um polipeptídeo da invenção e no mínimo um agente selecionado entre o grupo consistindo em uma estatina, um antiplaquetário, um anti- coagulante, um antidiabético e um anti-hipertensivo.[00642] Yet, an additional embodiment of the invention is a method of treating the diseases and disorders as set forth above, comprising administering to a subject, simultaneously, separately or sequentially, an effective amount of at least one polypeptide of the invention and at the at least one agent selected from the group consisting of a statin, an antiplatelet, an anticoagulant, an antidiabetic, and an antihypertensive.

[00643] De acordo com um aspecto adicional da invenção, o poli- peptídeo da invenção é preparado para ser administrado em combinação com outros fármacos usados para o tratamento das doenças e dos distúrbios estipulados acima, os outros fármacos referidos sendo selecionados entre o grupo consistindo em uma estatina, um antiplaquetá- rio, um anticoagulante, um antidiabético e um anti-hipertensivo.[00643] According to a further aspect of the invention, the polypeptide of the invention is prepared to be administered in combination with other drugs used for the treatment of the diseases and disorders stipulated above, the said other drugs being selected from the group consisting into a statin, an antiplatelet, an anticoagulant, an antidiabetic and an antihypertensive.

[00644] e acordo com ainda outro aspecto da invenção, fármacos usados para o tratamento das doenças e dos distúrbios estipulados acima, os fármacos referidos sendo selecionados entre o grupo consistindo em uma estatina, um antiplaquetário, um anticoagulante, um antidiabético e um anti-hipertensivo são preparados para serem administrados em combinação com o polipeptídeo da invenção.[00644] and according to yet another aspect of the invention, drugs used for the treatment of the diseases and disorders stipulated above, said drugs being selected from the group consisting of a statin, an antiplatelet, an anticoagulant, an antidiabetic and an anti- hypertensive are prepared to be administered in combination with the polypeptide of the invention.

[00645] De acordo com um aspecto adicional da invenção, o poli- peptídeo da invenção é usado em combinação com um dispositivo útil para a administração do polipeptídeo, tal como uma seringa, caneta injetora, ou dispositivo diverso.[00645] According to a further aspect of the invention, the polypeptide of the invention is used in combination with a device useful for administering the polypeptide, such as a syringe, injector pen, or miscellaneous device.

[00646] De acordo com ainda outra modalidade da invenção, é pro- porcionado um método de diagnosticar uma doença, um distúrbio ou uma condição mediada pela disfunção de CX3CR1 compreendendo as etapas de:[00646] According to yet another embodiment of the invention, there is provided a method of diagnosing a disease, disorder or condition mediated by dysfunction of CX3CR1 comprising the steps of:

[00647] a) obter uma amostra de um indivíduo, e[00647] a) obtain a sample from an individual, and

[00648] b) contatar, in vitro, a amostra com um polipeptídeo da in venção conforme definido acima, e[00648] b) contacting, in vitro, the sample with a polypeptide of the invention as defined above, and

[00649] c) detectar a ligação do referido polipeptídeo com a referida amostra, e[00649] c) detecting the binding of said polypeptide with said sample, and

[00650] d) comparar a ligação detectada na etapa (c) com um padrão, em que uma diferença na ligação relativa à referida amostra é diagnóstico de uma doença, um distúrbio ou uma condição caracterizada por disfunção de CX3CR1.[00650] d) comparing the binding detected in step (c) with a standard, wherein a difference in binding relative to said sample is diagnostic of a disease, disorder, or condition characterized by dysfunction of CX3CR1.

[00651] De acordo com outra modalidade da invenção, é proporcionado um método de diagnosticar uma doença, um distúrbio ou uma condição mediada pela disfunção de CX3CR1 compreendendo as etapas de:[00651] According to another embodiment of the invention, there is provided a method of diagnosing a disease, disorder or condition mediated by dysfunction of CX3CR1 comprising the steps of:

[00652] a) obter uma amostra de um indivíduo, e[00652] a) obtain a sample from an individual, and

[00653] b) contatar a amostra com um polipeptídeo da invenção conforme definido acima;[00653] b) contacting the sample with a polypeptide of the invention as defined above;

[00654] c) determinar a quantidade de CX3CR1 na amostra; e[00654] c) determine the amount of CX3CR1 in the sample; It is

[00655] d) comparar a quantidade determinada na etapa (c) com um padrão, em que uma diferença na quantidade relativa à referida amostra é diagnóstico de uma doença, um distúrbio ou uma condição caracterizada por disfunção de CX3CR1.[00655] d) comparing the amount determined in step (c) with a standard, wherein a difference in the amount relative to said sample is diagnostic of a disease, a disorder or a condition characterized by dysfunction of CX3CR1.

[00656] Os métodos de diagnóstico acima também podem ser usados para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico de um indivíduo.[00656] The above diagnostic methods can also be used to monitor the effectiveness of an individual's therapeutic treatment.

[00657] De acordo com outra modalidade da invenção, é proporcionado um kit para diagnosticar uma doença, um distúrbio ou uma condição mediada pela disfunção de CX3CR1, para utilização em um mé- todo conforme definido acima, o kit referido compreendendo no mínimo um polipeptídeo da invenção e, opcionalmente, um ou mais meios, meios de detecção e/ou agentes de imagiologia in vitro ou in vivo, e, adicionalmente e opcionalmente, instruções de utilização. Agentes de imagiologia in vivo adequados incluem 99mTc, 111Índio, 123Iodo, e, para estudo por imagens de ressonância magnética, compostos para- magnéticos.[00657] According to another embodiment of the invention, a kit is provided for diagnosing a disease, a disorder or a condition mediated by dysfunction of CX3CR1, for use in a method as defined above, said kit comprising at least one polypeptide of the invention and, optionally, one or more means, detection means and/or in vitro or in vivo imaging agents, and, additionally and optionally, instructions for use. Suitable in vivo imaging agents include 99mTc, 111Indium, 123Iodine, and, for study by magnetic resonance imaging, paramagnetic compounds.

[00658] A invenção adicionalmente proporciona um kit compreendendo no mínimo um polipeptídeo da invenção e, adicionalmente, um ou mais componentes diversos selecionados entre o grupo consistindo em outros fármacos usados para o tratamento das doenças e dos distúrbios conforme descrito acima, e dispositivos conforme descrito acima.[00658] The invention additionally provides a kit comprising at least one polypeptide of the invention and, additionally, one or more miscellaneous components selected from the group consisting of other drugs used for the treatment of diseases and disorders as described above, and devices as described above.

[00659] A invenção adicionalmente proporciona métodos de fabricar um polipeptídeo da invenção, os métodos referidos geralmente compreendendo as etapas de:[00659] The invention additionally provides methods of manufacturing a polypeptide of the invention, said methods generally comprising the steps of:

[00660] - cultivar células hospedeiras compreendendo um ácido nu- cléico capaz de codificando um polipeptídeo da invenção (nas partes que se seguem: "ácido nucléico da invenção") sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo da invenção; e,[00660] - cultivating host cells comprising a nucleic acid capable of encoding a polypeptide of the invention (in the following parts: "nucleic acid of the invention") under conditions that allow expression of the polypeptide of the invention; It is,

[00661] - recuperar ou isolar o polipeptídeo expressado pelas célu las hospedeiras a partir da cultura; e[00661] - recovering or isolating the polypeptide expressed by the host cells from the culture; It is

[00662] - opcionalmente adicionalmente purificar e/ou modificar e/ou formular o polipeptídeo da invenção.[00662] - optionally further purifying and/or modifying and/or formulating the polypeptide of the invention.

[00663] Um ácido nucléico da invenção pode ser DNA genômico, cDNA ou DNA sintético (tal como DNA com um uso de códon que tenha sido especificamente adaptado para expressão na célula hospedeira pretendida ou no organismo hospedeiro pretendido). De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucléico da invenção está em forma essencialmente isolada, conforme definido acima.[00663] A nucleic acid of the invention may be genomic DNA, cDNA or synthetic DNA (such as DNA with a codon usage that has been specifically adapted for expression in the intended host cell or the intended host organism). According to an embodiment of the invention, the nucleic acid of the invention is in essentially isolated form, as defined above.

[00664] O ácido nucléico da invenção também pode estar sob a forma de, estar presente em e/ou ser parte de um vetor, tal como por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo ou um YAC, o qual novamente pode estar em forma essencialmente isolada. O vetor pode ser especialmente um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode proporcionar expressão do polipeptídeo in vitro e/ou in vivo (por exemplo, em uma célula hospedeira adequada, em um organismo hospedeiro adequado e/ou em um sistema de expressão adequado). O vetor de expressão referido geralmente compreende no mínimo um ácido nucléico da invenção que é ligado operavelmente a um ou mais elementos reguladores adequados, tais como um ou mais promotores, um ou mais reforçadores, um ou mais terminadores, e semelhantes. Exemplos específicos de semelhantes elementos reguladores e outros elementos, tais como um ou mais fatores de integração, um ou mais marcadores de seleção, uma ou mais sequências de sinal ou líder, um ou mais genes reporter, e semelhantes, úteis ou necessários para expressar os polipeptídeos da invenção, são descritos, por exemplo, às pp. 131 a 133 da publicação de patente internacional No. WO2006/040153.[00664] The nucleic acid of the invention can also be in the form of, be present in and/or be part of a vector, such as for example a plasmid, a cosmid or a YAC, which again can be in essentially isolated. The vector can especially be an expression vector, i.e., a vector that can provide for expression of the polypeptide in vitro and/or in vivo (e.g., in a suitable host cell, in a suitable host organism, and/or in a delivery system). suitable expression). Said expression vector generally comprises at least one nucleic acid of the invention that is operably linked to one or more suitable regulatory elements, such as one or more promoters, one or more enhancers, one or more terminators, and the like. Specific examples of similar regulatory elements and other elements, such as one or more integrating factors, one or more selection markers, one or more signal or leader sequences, one or more reporter genes, and the like, useful or necessary for expressing the polypeptides of the invention are described, for example, at pp. 131 to 133 of International Patent Publication No. WO2006/040153.

[00665] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser preparados ou obtidos em uma maneira conhecida per se (por exemplo, por síntese de DNA automatizada e/ou por tecnologia de DNA recombinante), com base na informação sobre as sequências de aminoácidos para os poli- peptídeos da invenção proporcionada aqui, neste requerimento de patente, e/ou podem ser isolados a partir de uma fonte natural adequada.[00665] The nucleic acids of the invention can be prepared or obtained in a manner known per se (for example, by automated DNA synthesis and/or by recombinant DNA technology), based on the information on the amino acid sequences for the poly - peptides of the invention provided herein, in this patent application, and/or can be isolated from a suitable natural source.

[00666] De acordo com outra modalidade, a invenção se refere a um hospedeiro ou uma célula hospedeira que expressa ou é capaz de expressar um polipeptídeo da invenção; e/ou que contém um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção. De acordo com uma modalidade particularmente preferencial, as células hospedeiras referidas são células bacterianas, células de levedura, células fúngicas ou células de mamífero.[00666] According to another embodiment, the invention relates to a host or a host cell that expresses or is capable of expressing a polypeptide of the invention; and/or which contains a nucleic acid encoding a polypeptide of the invention. According to a particularly preferred embodiment, said host cells are bacterial cells, yeast cells, fungal cells or mammalian cells.

[00667] Células bacterianas adequadas incluem células de cepas bacterianas gram-negativas tais como cepas de Escherichia coli, Proteus, e Pseudomonas, e cepas bacterianas gram-positivas tais como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, e Lactococcus. Células fúngicas adequadas incluem células de espécies de Trichoderma, Neurospora, e Aspergillus. Células de levedura adequadas incluem células de espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccha- romyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia metha- nolica), e Hansenula.[00667] Suitable bacterial cells include cells from gram-negative bacterial strains such as Escherichia coli, Proteus, and Pseudomonas strains, and gram-positive bacterial strains such as Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, and Lactococcus strains. Suitable fungal cells include cells from Trichoderma, Neurospora, and Aspergillus species. Suitable yeast cells include cells from Saccharomyces species (for example, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (for example, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (for example, Pichia pastoris and Pichia methanolica), and Hansenula.

[00668] Células de mamífero adequadas incluem por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, células NS0, células HEK, e semelhantes. No entanto, também podem ser usadas células de anfíbios, células de insetos, células de plantas, e quaisquer outras células usadas na técnica para a expressão de proteínas heterólogas.[00668] Suitable mammalian cells include, for example, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, NS0 cells, HEK cells, and the like. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cells used in the art for expression of heterologous proteins can also be used.

[00669] Para produção em escala industrial, hospedeiros heterólo- gos preferenciais para a produção (industrial) de polipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina e terapêuticos de proteína contendo os mesmos incluemcepas de E. coli, Pichia pastoris, e S. cerevi- siae que são adequadas para expressão, produção e fermentação em larga escala, e em particular para expressão (bio-)farmacêutica, produção e fermentação em larga escala.[00669] For industrial scale production, preferred heterologous hosts for (industrial) production of immunoglobulin single variable domain polypeptides and protein therapeutics containing the same include strains of E. coli, Pichia pastoris, and S. cerevisiae which are suitable for large-scale expression, production and fermentation, and in particular for (bio-)pharmaceutical expression, large-scale production and fermentation.

[00670] A escolha do sistema de expressão específico vai depender em parte da necessidade de altumas modificações pós-translacionais, mais especificamente glicosilação. A produção de um polipeptídeo da invenção para o qual glicosilação é desejada ou requerida vai necessitar do uso de hospedeiros de expressão mamíferos que têm a capacidade de glicosilar a proteína expressada. A este respeito, será evidente para a pessoa versada que o padrão de glicosilação obtido (isto é, o tipo, número e posição de resíduos anexados) vai depender da célula ou linhagem celular que é usada para a expressão.[00670] The choice of the specific expression system will depend in part on the need for high post-translational modifications, more specifically glycosylation. Production of a polypeptide of the invention for which glycosylation is desired or required will necessitate the use of mammalian expression hosts that have the capacity to glycosylate the expressed protein. In this regard, it will be apparent to the skilled person that the glycosylation pattern obtained (i.e. the type, number and position of appended residues) will depend on the cell or cell line that is used for expression.

[00671] Polipeptídeos da invenção produzidos em uma célula conforme estipulado acima podem ser produzidos quer intracelullarmente (por exemplo, no citosol, no periplasma ou em corpos de inclusão) e em seguida isolados das células hospedeiras e opcionalmente adicionalmente purificados; ou podem ser produzidos extracelularmente (se- cretados no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas) e em seguida isolados do meio de cultura e opcionalmente adicionalmente purificados.[00671] Polypeptides of the invention produced in a cell as stipulated above can be produced either intracellularly (for example, in the cytosol, in the periplasm or in inclusion bodies) and then isolated from host cells and optionally further purified; or they can be produced extracellularly (secreted into the medium in which the host cells are grown) and then isolated from the culture medium and optionally further purified.

[00672] Métodos e reagentes adicionais usados para a produção recombinante de polipeptídeos, tais como vetores de expressão adequados, métodos de transformação ou transfecção, marcadores de seleção, métodos de indução de expressão de proteínas, condições de cultura, e semelhantes, são conhecidos na técnica. De modo similar, técnicas de isolamento e purificação de proteínas úteis em um método de fabricação de um polipeptídeo da invenção são de conhecimento geral para a pessoa versada.[00672] Additional methods and reagents used for the recombinant production of polypeptides, such as suitable expression vectors, transformation or transfection methods, selection markers, methods of inducing protein expression, culture conditions, and the like, are known in the technique. Similarly, protein isolation and purification techniques useful in a method of manufacturing a polypeptide of the invention are well known to the skilled person.

[00673] A produção dos polipeptídeos da invenção através de fermentação em organismos hospedeiros recombinantes convenientes tais como E. coli e levedura é rentável, em comparação com anticorpos convencionais os quais também requerem caras instalações de cultura de células de mamífero. Além disso, os níveis de expressão obteníveis são elevados e as produções dos polipeptídeos da invenção são na faixa de 1 a 10 g/l (E. coli) e até 10 g/l (levedura) e mais. EXEMPLOS[00673] Production of the polypeptides of the invention by fermentation in convenient recombinant host organisms such as E. coli and yeast is cost-effective compared to conventional antibodies which also require expensive mammalian cell culture facilities. Furthermore, the obtainable expression levels are high and the yields of the polypeptides of the invention are in the range of 1 to 10 g/l (E. coli) and up to 10 g/l (yeast) and more. EXAMPLES

[00674] Produção de linhagens celulares CHO, Baf/3, Caki e HEK293 superexpressando CX3CR1 humana ou CX3CR1 de cynomo- lgus[00674] Production of CHO, Baf/3, Caki and HEK293 cell lines overexpressing human CX3CR1 or cynomolgus CX3CR1

[00675] Células CHO e Baf/3 superexpressando CX3CR1 humana ou de cynomolgus foram geradas usando técnicas conhecidas na téc- nica. Células expressando CCR2 ou CCR5 humanas também foram geradas usando técnicas conhecidas na técnica.[00675] CHO and Baf/3 cells overexpressing human or cynomolgus CX3CR1 were generated using techniques known in the art. Cells expressing human CCR2 or CCR5 were also generated using techniques known in the art.

[00676] O cDNA foi clonado em pCDNA3.1(+)-neo para CX3CR1 humana ao passo que pcDNA-DEST40-neo foi usado para CX3CR1 de camundongo.[00676] The cDNA was cloned into pCDNA3.1(+)-neo for human CX3CR1 whereas pcDNA-DEST40-neo was used for mouse CX3CR1.

[00677] As sequências de aminoácidos de CX3CR1 humana e CX3CR1 de cynomolgus estão representadas em SEQ ID NO: 255 e 256, respectivamente.[00677] The amino acid sequences of human CX3CR1 and cynomolgus CX3CR1 are depicted in SEQ ID NO: 255 and 256, respectively.

[00678] De modo a estabelecer células de rim de camelo (Caki, Camel Kidney) superexpressando CX3CR1 humana ou CX3CR1 de camundongo, células Caki parentais foram eletroporadas com pCD- NA3.1(+)-neo-hCX3CR1 ou pcDNA-DEST40-neo-mCX3CR1, respectivamente. Para todas as condições, os transfectantes foram selecionados adicionando 1 mg/mL de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).[00678] In order to establish camel kidney cells (Caki, Camel Kidney) overexpressing human CX3CR1 or mouse CX3CR1, parental Caki cells were electroporated with pCD-NA3.1(+)-neo-hCX3CR1 or pcDNA-DEST40-neo -mCX3CR1, respectively. For all conditions, transfectants were selected by adding 1 mg/mL of geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

[00679] Células de rim embrionário humano (HEK293, Human Em- byonic Kidney) superexpressando CX3CR1 humana ou CX3CR1 de cynomolgus foram geradas por transfecção mediada por lipídeos com Fugene (Roche) de plasmídeos pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1 ou cyCX3CR1, respectivamente, na linhagem celular parental HEK293. Estas células foram usadas como transfectantes transitórios e deste modo não foram postas sob seleção. Em resumo, 2*10E6 células foram semeadas por T75 e incubadas de um dia para o outro antes de transfecção. Depois de remoção do meio de cultura, as células foram transfectadas com os plasmídeos respectivos (9 μg) e Fugene (27 μl) de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas depois da trans- fecção, as células foram colhidas e congeladas para uso posterior.[00679] Human embryonic kidney (HEK293, Human Embyonic Kidney) cells overexpressing human CX3CR1 or cynomolgus CX3CR1 were generated by lipid-mediated transfection with Fugene (Roche) of plasmids pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1 or cyCX3CR1 , respectively, in the parental cell line HEK293. These cells were used as transient transfectants and thus were not put under selection. Briefly, 2*10E6 cells were seeded by T75 and incubated overnight prior to transfection. After removal from the culture medium, the cells were transfected with the respective plasmids (9 μg) and Fugene (27 μl) according to the manufacturer's instructions. 48 hours after transfection, cells were harvested and frozen for later use.

EXAMPLE 1: IMMUNIZATION WITH CX3CR1 INDUCES A HUMORAL IMMUNE REACTION IN LLAMA 1.1. Immunizations

[00680] Depois de aprovação pelo Commitê de Ética (University Antwerp, Bélgica, UA2008A1, 2008/096, 2007/068), 9 lhamas (designados No. 368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 e 314) foram imunizados.[00680] After approval by the Ethics Committee (University Antwerp, Belgium, UA2008A1, 2008/096, 2007/068), 9 llamas (designated No. 368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 and 314 ) were immunized.

[00681] Seis lhamas (312, 313, 314, 381, 382 e 384) foram imunizados com 4 injeções intramusculares (2 mg/dose em intervalos semanais ou bisemanais) de vetor de plasmídeo pVAX1-huCX3CR1 (In- vitrogen, Carlsbad, CA, EUA ). Três lhamas (381, 382 e 384) em seguida receberam 4 injeções subcutâneas de CX3CR1 humana supe- rexpressando células Caki as quais foram estabelecidas conforme descrito acima. As células foram ressuspendidas em D-PBS e mantidas sobre gelo antes da injeção.[00681] Six llamas (312, 313, 314, 381, 382, and 384) were immunized with 4 intramuscular injections (2 mg/dose at weekly or biweekly intervals) of plasmid vector pVAX1-huCX3CR1 (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA ). Three llamas (381, 382 and 384) then received 4 subcutaneous injections of human CX3CR1 overexpressing Caki cells which were established as described above. Cells were resuspended in D-PBS and kept on ice before injection.

[00682] Três lhamas adicionais (designados No. 368, 369 e 370) foram imunizados de acordo com protocolos de rotina com 4 subcutâneas injeções de CX3CR1 humana superexpressando células Caki as quais foram estabelecidas conforme descrito acima. As células foram ressus- pendidas em D-PBS e mantidas sobre gelo antes da injeção. Em seguida, a estes lhamas foram administradas duas injeções com fragmento recombinante CX3CR1 NT/EC3 acoplado a BSA (TABELA 13). Os pep- tídeos foram ordenados no NeoMPS (PolyPeptide Group, Strasbourg, França) e acoplados a BSA de acordo com protocolos de rotina. TABELA 13SEQUÊNCIA DE FRAGMENTOS DE PEPTÍDEO USADOS PARA REFORÇO DE IMUNIZAÇÃO [00682] Three additional llamas (designated No. 368, 369 and 370) were immunized according to routine protocols with 4 subcutaneous injections of human CX3CR1 overexpressing Caki cells which were established as described above. Cells were resuspended in D-PBS and kept on ice before injection. Then, these llamas were given two injections with recombinant CX3CR1 NT/EC3 fragment coupled to BSA (TABLE 13). Peptides were ordered in NeoMPS (PolyPeptide Group, Strasbourg, France) and coupled to BSA according to routine protocols. TABLE 13 SEQUENCE OF PEPTIDE FRAGMENTS USED FOR IMMUNIZATION BOOST

[00683] A primeira injeção foi formulada em Adjuvante de Freund Completo (Difco, Detroit, MI, EUA), ao passo que a injeção subse- quente foi formulada em Adjuvante de Freund Incompleto (Difco, Detroit, MI, eUA). 1.2. Avaliação de reações imunes induzidas em lhama[00683] The first injection was formulated in Complete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA), while the subsequent injection was formulated in Incomplete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA). 1.2. Evaluation of llama-induced immune reactions

[00684] De modo a avaliar a indução de reações imunes nos animais contra CX3CR1 humana por ELISA ou FACS, foram colhidos soros dos lhamas 312, 313 e 314 no dia 0 (pré-imune), e diferentes pontos do tempo no esquema de imunização (tempo de coleta de linfócitos do sangue periférico [PBL]).[00684] In order to evaluate the induction of immune reactions in animals against human CX3CR1 by ELISA or FACS, sera were collected from llamas 312, 313 and 314 on day 0 (pre-immune), and different time points in the immunization schedule (peripheral blood lymphocyte [PBL] collection time).

[00685] Em resumo, Neutravidina (2 μg/mL) foi imobilizada de um dia para o outro a 4°C em uma placa Maxisorb de 96 cavidades (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). As cavidades foram bloqueadas com uma solução de caseína (1%) em PBS. Em seguida fragmento NT recombi- nante biotinilado (Polypeptide, Strasbourg, França) ou fragmentos EC3 biotinilados de CX3CR1 (Polypeptide, Strasbourg, França) foram capturados a 2 μg/mL. Depois da adição de diluições séricas, imunoglobu- linas ligadas especificamente foram detectadas usando uma imuno- globulina anti-lhama de cabra conjugada a peroxidase de raiz forte (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EUA) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB One (3,3',5,5'- tetramentilbenzidina) (Promega, Mannheim, Alemanha), mostrando que uma significativa reação imune dependente de anticorpos contra CX3CR1 foi induzida depois das imunizações com os peptídeos.[00685] In summary, Neutravidin (2 μg/mL) was immobilized overnight at 4°C in a 96-well Maxisorb plate (Nunc, Wiesbaden, Germany). The wells were blocked with a solution of casein (1%) in PBS. Then biotinylated recombinant NT fragment (Polypeptide, Strasbourg, France) or biotinylated EC3 fragments of CX3CR1 (Polypeptide, Strasbourg, France) were captured at 2 μg/mL. After the addition of serum dilutions, specifically bound immunoglobulins were detected using horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-llama immunoglobulin (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) and a subsequent enzymatic reaction in the presence of TMB One substrate (3,3',5,5'-tetramentylbenzidine) (Promega, Mannheim, Germany), showing that a significant antibody-dependent immune reaction against CX3CR1 was induced after immunizations with the peptides.

[00686] Adicionalmente, os títulos séricos de animais imunizados com células foram confirmados por análise FACS sobre CX3CR1 humana crescendo ativamente superexpressando células CHO. As respostas de títulos séricos de CX3CR1 para os lhamas 368, 369 e 370 foram determinadas com soro amostrado depois de 4 imunizações celulares (dia 49), 4 imunizações celulares e 1 reforço de peptídeo (dia 77) e 4 imunizações celulares e 2 reforços de peptídeo (dia 81). As células foram colhidas e lavadas antes de incubação com as diluições séricas. Foi realizada detecção com IgG anti-lhama de cabra (Bethyl, Montgomery, TX, EUA) seguida por anti-cabra de burro acoplada com PE (Jackson Laboratories, Suffolk, Reino Unido) e leitura por análise em FACSArray (BD Biosciences). Um sumário das respostas séricas obtidas conforme determinado ou por ELISA ou por FACS é mostrado na TABELA 14 e na TABELA 15. TABELA 14 ANÁLISE DOS TÍTULOS SÉRICOS PARA OS ANIMAIS IMUNIZADOS COM CÉLULAS/PEPTÍDEOS TABELA 15ANÁLISE DOS TÍTULOS SÉRICOS PARA OS ANIMAIS IMUNIZADOS COM DNA/CÉLULAS [00686] Additionally, serum titers of animals immunized with cells were confirmed by FACS analysis on actively growing human CX3CR1 overexpressing CHO cells. CX3CR1 serum titre responses for llamas 368, 369, and 370 were determined with serum sampled after 4 cell immunizations (day 49), 4 cell immunizations and 1 peptide boost (day 77), and 4 cell immunizations and 2 peptide boosts. peptide (day 81). Cells were harvested and washed before incubation with serum dilutions. Detection was performed with goat anti-llama IgG (Bethyl, Montgomery, TX, USA) followed by PE-coupled donkey anti-goat (Jackson Laboratories, Suffolk, UK) and reading by FACSArray analysis (BD Biosciences). A summary of serum responses obtained as determined by either ELISA or FACS is shown in TABLE 14 and TABLE 15. TABLE 14 ANALYSIS OF SERUM TITERS FOR ANIMALS IMMUNIZED WITH CELLS/PEPTIDES TABLE 15 ANALYSIS OF SERUM TITERS FOR ANIMALS IMMUNIZED WITH DNA/CELLS

[00687] Para os lhamas imunizados com DNA somente (312, 313 e 314) não foi determinado nenhum título sérico.[00687] For llamas immunized with DNA only (312, 313 and 314) no serum titers were determined.

EXAMPLE 2: CLONING OF THE HEAVY CHAIN ANTIBODY FRAGMENT REPERTORIES ONLY AND PHAGE PREPARATION

[00688] Depois da injeção de imunogênio final de cada subgrupo, tecidos imunes como a fonte de células B que produzem os anticorpos de cadeia pesada foram coletados dos lhamas imunizados. Para os lhama 312, 313 e 314, duas amostras de sangue de 150 mL, coletadas 4 e 8 dias depois da última injeção de antígeno foram coletadas por animal. Para os lhamas 368, 369 e 370 foram coletadas quatro amostras de sangue de 150 mL, 5 e 7 dias depois da última imunização celular e adicionalmente 4 e 8 dias depois da última imunização com peptídeo. Próximo a estas, foram colhidas duas biópsias de linfonodo, 12 dias depois da última imunização celular e 12 dias depois da última imunização com peptídeo. Para os lhamas 381, 382 e 384 foram coletadas cinco amostras de sangue de 150 mL, 8 dias depois da última imunização com DNA e adicionalmente 4 dias depois do primeiro re-forço celular, 8 e 11 dias depois do segundo reforço celular e 8 dias depois da última imunização celular. Próximo a estas, foi colhida uma biópsia de linfonodo, 8 dias depois da segunda imunização celular.[00688] After the final immunogen injection of each subgroup, immune tissues as the source of B cells that produce the heavy chain antibodies were collected from the immunized llamas. For llama 312, 313 and 314, two 150 mL blood samples collected 4 and 8 days after the last antigen injection were collected per animal. For llamas 368, 369 and 370 four 150 ml blood samples were collected 5 and 7 days after the last cellular immunization and additionally 4 and 8 days after the last peptide immunization. Next to these, two lymph node biopsies were taken, 12 days after the last cellular immunization and 12 days after the last peptide immunization. For llamas 381, 382 and 384 five blood samples of 150 mL were collected, 8 days after the last DNA immunization and additionally 4 days after the first cell boost, 8 and 11 days after the second cell boost and 8 days after the last cellular immunization. Next to these, a lymph node biopsy was taken 8 days after the second cellular immunization.

[00689] A partir das amostras de sangue, linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram preparados usando Ficoll-Hypaque de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). A partir dos PBLs e da biópsia de linfonodos (LN), foi extraído RNA total, o qual foi usado como material de partida para RT-PCR de modo a amplificar os segmentos de DNA codificando VHH.[00689] From the blood samples, peripheral blood lymphocytes (PBLs) were prepared using Ficoll-Hypaque according to the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). From PBLs and lymph node (LN) biopsy, total RNA was extracted, which was used as starting material for RT-PCR in order to amplify the DNA segments encoding VHH.

[00690] Para cada lhama imunizado, foram construídas bibliotecas agrupando o RNA total isolado a partir das amostras originárias de um determinado subgrupo do esquema de imunização, isto é, depois de um tipo de antígeno de imunização, e para alguns lhamas amostras dos diferentes animais foram reunidas em uma biblioteca (TABELA 16). TABELA 16AGRUPAMENTO DAS DIFERENTES AMOSTRAS PARA CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS [00690] For each immunized llama, libraries were built by grouping the total RNA isolated from samples originating from a certain subgroup of the immunization scheme, that is, after a type of immunization antigen, and for some llamas samples from different animals were gathered in a library (TABLE 16). TABLE 16 GROUPING OF DIFFERENT SAMPLES FOR LIBRARY CONSTRUCTION

[00691] Em resumo, o repertório de VHH amplificado por PCR foi clonado através de sítios de restrição específicos em um vetor designado para facilitar o display de fago da biblioteca de VHH. O vetor foi derivado de pUC119 e contém o promotor LacZ, uma sequência codi- ficante de proteína M13 fago gIII, um gene de resistência para ampici- lina ou carbenicilina, um sítio de clonagem múltipla e uma sequência líder híbrida gIII-pelB (pAX050). In frame com a sequência codificante de VHH, o vetor codifica uma etiqueta c-myc C-terminal e uma etiqueta His6. Os fagos foram preparados de acordo com protocolos de rotina e armazenados depois de esterilização por filtro a 4°C ou a -80°C em 20% de glicerol para utilização posterior.[00691] In summary, the PCR-amplified VHH repertoire was cloned through specific restriction sites into a vector designed to facilitate phage display of the VHH library. The vector was derived from pUC119 and contains the LacZ promoter, an M13 phage gIII protein coding sequence, an ampicillin or carbenicillin resistance gene, a multiple cloning site, and a gIII-pelB hybrid leader sequence (pAX050) . In frame with the VHH coding sequence, the vector encodes a C-terminal c-myc tag and a His6 tag. Phages were prepared according to routine protocols and stored after filter sterilization at 4°C or -80°C in 20% glycerol for later use.

EXAMPLE 3: SELECTION OF SPECIFIC VHHS FOR CX3CR1 VIA PHAGE DISPLAY

[00692] Repertórios de VHH obtidos a partir de todos os lhamas e clonados como biblioteca de fagos foram usados em diferentes estratégias de seleção, aplicando uma multiplicidade de condições de seleção. Variáveis incluem i) a forma de apresentação da proteína CX3CR1 (sobre diferentes fundos celulares ou sobre liposso- mas/VLPs), ii) o método de apresentação de antígeno (Em solução ao usar células ou revestido sobre placas ao usar VLPs), iii) a concentração de antígeno iv) o ortólogo usado (humano ou cynomolgus) v) o número de rodadas de seleção e vi) métodos de elutriação diferentes (inespecíficos através de tripsina ou específicos através do ligante Fractalcina). Todas as seleções de fase sólida revestida foram feitas em placas Maxisorp de 96 cavidades (Nunc, Wiesbaden, Alemanha).[00692] VHH repertoires obtained from all llamas and cloned as a phage library were used in different selection strategies, applying a multitude of selection conditions. Variables include i) the form of presentation of the CX3CR1 protein (on different cellular backgrounds or on liposomes/VLPs), ii) the method of antigen presentation (in solution when using cells or coated on plates when using VLPs), iii) the antigen concentration iv) the ortholog used (human or cynomolgus) v) the number of selection rounds and vi) different elutriation methods (non-specific through trypsin or specific through Fractalcine ligand). All coated solid phase selections were made in 96-well Maxisorp plates (Nunc, Wiesbaden, Germany).

[00693] As seleções foram realizadas como se segue: preparações de antígeno CX3CR1 para formatos de seleção de fase sólida e de solução foram apresentadas conforme descrito acima em múltiplas concentrações. Depois de 2 horas de incubação com as bibliotecas de fagos seguidas por extensiva lavagem, os fatos ligados foram elutria- dos com tripsina (1 mg/mL) por 15 minutos. Quando tripsina foi usada para elutriação de fago, a atividade de protease foi imediatamente neutralizada aplicando 0,8 mM de inibidor de protease ABSF. Como controle, seleções sem antígeno foram realizadas em paralelo.[00693] Selections were performed as follows: CX3CR1 antigen preparations for solid and solution phase selection formats were presented as described above in multiple concentrations. After 2 hours of incubation with the phage libraries followed by extensive washing, the bound facts were eluted with trypsin (1 mg/ml) for 15 minutes. When trypsin was used for phage elutriation, protease activity was immediately neutralized by applying 0.8 mM ABSF protease inhibitor. As a control, selections without antigen were performed in parallel.

[00694] As produções de fagos foram usadas para infectar E. coli as quais foram em seguida por sua vez usadas para preparar fago para a próxima rodada de seleção (resgate de fago). Depois da segunda rodada de seleção, as produções de fagos foram usadas para infectar E. coli as quais foram em seguida laminadas sobre placas de agar (LB+carb+glicose2%) para análise de clones de VHH individuais. De modo a triar uma produção de seleção para ligantes específicos, colô- nias únicas foram selecionadsa entre as placas de agar e cultivadas em 1 mL de placas de 96 cavidades profundas. A expressão de VHH controlada por LacZ foi induzida adicionando IPTG (1 mM final) na ausência de glicose. Extratos periplasmáticos (em um volume de ~ 80 uL) foram preparados de acordo com protocolos de rotina.[00694] The phage yields were used to infect E. coli which were then in turn used to prepare phage for the next round of selection (phage rescue). After the second round of selection, the phage yields were used to infect E. coli which were then plated onto agar plates (LB+carb+glucose2%) for analysis of individual VHH clones. In order to screen a selection yield for specific ligands, single colonies were selected from among the agar plates and grown in 1 ml deep 96-well plates. LacZ-controlled VHH expression was induced by adding IPTG (1 mM final) in the absence of glucose. Periplasmic extracts (in a volume of ~80 uL) were prepared according to routine protocols.

EXAMPLE 4: SCREENING OF PERIPLASMIC EXTRACTS IN CX3CR1-FRACTALKIN COMPETITION FACS TEST

[00695] Extratos periplasmáticos foram triados em um teste de competição FACS CX3CR1 humana/Fractalcina humana de modo a avaliar a capacidade de bloqueio dos VHHs expressados. CX3CR1 humana estava presente sobre células CHO superexpressando CX3CR1. Foi usada tanto uma configuração usando células colhidas a partir de uma cultura crescendo ativamente quanto uma configuração usando células congeladas. Como um reagente de detecção foi usada fractalcina etiquetada (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) etiquetada com alexa647 (A647-Fractalcina) em um grau de marcação de 1. De modo a configurar o teste, primeiro foi realizada uma série de titu-lações da fractalcina etiquetada sobre as células CHO-huCX3CR1 de modo a determinar o valor da EC50 para ligação. Inicialmente foi realizada triagem em uma maior concentração de fractalcina (3 nM) de modo a aumentar a robustez do teste. De modo a aumentar a sensibilidade da triagem a um máximo, a concentração a EC30 (1 nM) foi escolhido para triagem subsequente. Em resumo, 50 μl de extrato peri- plasmático foi adicionado a 6 nM de fractalcina etiquetada (50 μl) e 200 000 células CHO-huCX3CR1. Depois de uma hora de incubação a 4 C, as células foram lavadas três vezes antes de ser realizada a leitura em um FACS Array (Becton Dickinson). Primeiro uma barreira (gate) foi definida sobre as células intactas conforme determinado a partir do perfil de difusão. Em seguida, as células mortas foram excluídas (gated out) por seu perfil de fluorescência a partir da cepa PI (Sigma, St Louis, EU). O perfil de fluorescência da etiqueta alexa647 foi determinado para cada amostra e foi usado para cálculo da capacidade de bloqueio. Como controles, as condições foram tomadas junto onde não havia nenhum VHH presente no peri extrato ou um VHH irrelevante conhecido e amostras foram incluídos onde o excesso de fractalcina a frio foi incluído. Para cada amostra a percentagem de bloqueio foi determinada usando as amostras de controle para determinar a janela de teste.[00695] Periplasmic extracts were screened in a human FACS CX3CR1/human Fractalcine competition test in order to assess the ability to block the expressed VHHs. Human CX3CR1 was present on CHO cells overexpressing CX3CR1. Both a setup using cells harvested from an actively growing culture and a setup using frozen cells were used. As a detection reagent labeled fractalcine (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) labeled with alexa647 (A647-Fractalkine) at a labeling grade of 1 was used. In order to set up the test, a series of titers was first performed. fractalkine-labeled interactions on CHO-huCX3CR1 cells in order to determine the EC50 value for binding. Initially, screening was performed at a higher concentration of fractalcine (3 nM) in order to increase the robustness of the test. In order to increase the screening sensitivity to a maximum, the concentration at EC30 (1 nM) was chosen for subsequent screening. Briefly, 50 μl of periplasmic extract was added to 6 nM labeled fractalkine (50 μl) and 200,000 CHO-huCX3CR1 cells. After one hour of incubation at 4°C, the cells were washed three times before being read on a FACS Array (Becton Dickinson). First a barrier (gate) was set over the intact cells as determined from the diffusion profile. Then, dead cells were excluded (gated out) by their fluorescence profile from the PI strain (Sigma, St Louis, EU). The alexa647 tag fluorescence profile was determined for each sample and was used for blocking capacity calculation. As controls, conditions were taken together where there was no VHH present in the peri-extract or a known irrelevant VHH and samples were included where excess cold fractalcine was included. For each sample the percent blockage was determined using the control samples to determine the test window.

[00696] A partir desta triagem, VHHs foram selecionados e análise de sequências revelou 120 VHHs únicos pertencentes a 3 diferentes linhagens de células B. O número total de variantes encontradas para cada linhagem de células B é representado na TABELA 17. TABELA 17PARÂMETROS DE SELEÇÃO USADOS PARA A IDEN-TIFICAÇÃO DAS LINHAGENS DE CÉLULAS B DE VHH ESPECÍFICOS DE CX3CR1 HUMANA [00696] From this screening, VHHs were selected and sequence analysis revealed 120 unique VHHs belonging to 3 different B cell lineages. The total number of variants found for each B cell lineage is represented in TABLE 17. TABLE 17SELECTION PARAMETERS USED FOR THE IDENTIFICATION OF HUMAN CX3CR1-SPECIFIC VHH B CELL LINEAGES

[00697] Uma visão geral do procedimento de seleção e da performance durante triagem inicial é dada para todos os VHHs na Tabela 18. TABELA 18CONDIÇÕES DE SELEÇÃO E RESULTADO DA TRIAGEM PRIMÁRIA PARA O VHH ESPECÍFICO PARA HUCX3CR1 [00697] An overview of the selection procedure and performance during initial screening is given for all VHHs in Table 18. TABLE 18SELECTION CONDITIONS AND PRIMARY SCREENING RESULTS FOR THE SPECIFIC VHH FOR HUCX3CR1

[00698] As sequências de aminoácidos de todos os VHHs únicos obtidos são mostradas na Listagem de Sequências e acima (foram indicadas CDRs e regiões de framework).[00698] The amino acid sequences of all the unique VHHs obtained are shown in the Sequence Listing and above (CDRs and framework regions have been indicated).

EXAMPLE 5: CHARACTERIZATION OF PURIFIED VHHS

[00699] VHHs anti-CX3CR1 inibidores selecionados a partir da triagem descrita no Exemplo 4 foram adicionalmente purificados e caracterizados. VHHs selecionados foram expressados em E. coli TG1 como proteínas com etiqueta c-myc, His6. Foi induzida expressão por adição de 1 mM de IPTG e deixada para continuar por 4 horas a 37°C. Depois de cxentrifugar as culturas celulares, foram preparados extratos periplasmáticos por congelamento-descongelamento dos péletes. Estes extratos foram usados como material de partida e VHHs foram purificados através de IMAC e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) resultando em 95% de pureza conforme avaliado através de SDS-PAGE. Inibição por VHHs anti-CX3CR1 de ligação de Fractalcina humana à CX3CR1 humana expressada sobre células BA/F3[00699] Inhibitory anti-CX3CR1 VHHs selected from the screening described in Example 4 were further purified and characterized. Selected VHHs were expressed in E. coli TG1 as c-myc-tag proteins, His6. Expression was induced by addition of 1 mM IPTG and allowed to continue for 4 hours at 37°C. After centrifuging the cell cultures, periplasmic extracts were prepared by freeze-thawing the pellets. These extracts were used as starting material and VHHs were purified by IMAC and size exclusion chromatography (SEC) resulting in 95% purity as judged by SDS-PAGE. Inhibition by anti-CX3CR1 VHHs of human Fractalkin binding to human CX3CR1 expressed on BA/F3 cells

[00700] A capacidade de bloqueio para o ligante fractalcina dos VHHs foi avaliada em um FACS de competição de CX3CR1 humana conforme resumido no Exemplo 4. Foram usadas ou células CHO- huCX3CR1, células BA/F3-huCX3CR1 ou células HEK293T transfec- tadas transitoriamente. A quantidade de ligante marcado usado nas diferentes configurações de competição também foi variada. Os valores da IC50 para VHHs bloqueando a interação de fractalcina humana com CX3CR1 humana são representados na TABELA 19. TABELA 19POTÊNCIA E EFICÁCIA DO VHH EM UM FACS DE COMPETIÇÃO DE LIGANTE Inibição por VHHs anti-CX3CR1 de quimiotaxia, induzida por Frac- talcina humana, de células BA/F3 superexpressando CX3CR1 humana[00700] The blocking capacity for the fractalkine ligand of the VHHs was evaluated in a human CX3CR1 competition FACS as summarized in Example 4. Either CHO-huCX3CR1 cells, BA/F3-huCX3CR1 cells or transiently transfected HEK293T cells were used . The amount of labeled binder used in the different competition settings was also varied. IC50 values for VHHs blocking the interaction of human fractalkine with human CX3CR1 are depicted in TABLE 19. TABLE 19VHH POTENCY AND EFFECTIVENESS IN A BINDERS COMPETITION FACS Inhibition by anti-CX3CR1 VHHs of human Fractalkine-induced chemotaxis of BA/F3 cells overexpressing human CX3CR1

[00701] De modo a avaliar a inibição de quimiotaxia induzida por Fractalcina, um teste de quimiotaxia foi configurado usando a câmara descartável ChemoTx com tamanho de poro de 5 μm (Neuroprobe, Gaithersburg, EU). As células foram colhidas a partir de uma cultura crescendo ativamente e foram lavadas antes do uso em meio de teste, RPMI (Gibco, Carlsbad, EU) suplementado com 0,1% de BSA. A câmara de fundo foi preenchida com 320 pM de Fractalcina humana em um volume total de 300 μl. Depois de aplicação da membrana, 0.13E6 células foram depositadas na parte superior da membrana em um volume total de 70 μl. Quimiotaxia foi permitida por 3 horas a 37°C em uma câmara umidificada com CO2. Depois deste período de incubação, a membrana foi removida e as células na câmara de fundo foram ressuspendidas. A quantidade de ATP presente nas cavidades foi de- terminada usando o kit CellTiter-Glo (Promega, Madison WI, EU). Foi realizada leitura em um Envision (Perkin Elmer, Massachusetts, EU) com as configurações de rotina para leitura da luminescência. Séries de titulações foram realizadas em triplicata e cada placa continha amostras de controle também em triplicata. Como controle, foi incluída uma amostra sem VHH bem como uma amostra onde não foi adicionada nenhuma Fractalcina humana à câmara de fundo. Um sumário dos resultados é mostrado na TABELA 20. TABELA 20 POTÊNCIA E EFICÁCIA DO VHH EM BLOQUEIO DA QUIMIOTAXIA INDUZIDA PELA FRACTALCINA Avaliação da reatividade cruzada dos VHHs anti-CX3CR1 contra CX3CR1 de cynomolgus[00701] In order to evaluate the inhibition of Fractalkine-induced chemotaxis, a chemotaxis test was set up using the disposable ChemoTx chamber with pore size of 5 μm (Neuroprobe, Gaithersburg, EU). Cells were harvested from an actively growing culture and were washed prior to use in test medium, RPMI (Gibco, Carlsbad, US) supplemented with 0.1% BSA. The bottom chamber was filled with 320 pM human Fractalcine in a total volume of 300 μl. After membrane application, 0.13E6 cells were deposited on top of the membrane in a total volume of 70 µl. Chemotaxis was allowed for 3 hours at 37°C in a CO2 humidified chamber. After this incubation period, the membrane was removed and the cells in the bottom chamber were resuspended. The amount of ATP present in the wells was determined using the CellTiter-Glo kit (Promega, Madison WI, EU). Reading was performed on an Envision (Perkin Elmer, Massachusetts, US) with routine settings for luminescence reading. Series of titrations were performed in triplicate and each plate contained control samples also in triplicate. As a control, a sample without VHH was included as well as a sample where no human Fractalcin was added to the bottom chamber. A summary of the results is shown in TABLE 20. TABLE 20 POTENCY AND EFFECTIVENESS OF VHH IN BLOCKING FRACTALKIN-INDUCED CHEMOTAXIS Evaluation of cross-reactivity of anti-CX3CR1 VHHs against cynomolgus CX3CR1

[00702] Inicialmente, uma configuração de ligação à base de FACS foi usada para avaliar a reatividade cruzada com cynomolgus. Para isto, os VHHs foram incubados com as células respectivas por 30 minutos a 4°C seguido por três etapas de lavagem e subsequentemente incubados com os reagentes de detecção. Como detecção, foi usado um anticorpo anti-cmyc de camundongo (Serotec, MCA2200) seguido por um anticorpo anti-camundongo de cabra acoplado a PE (Jackson 115-116-071), cadaincubação por 30 minutos a 4°C, seguida por três etapas de lavagem. Os resultados do teste são mostrados na TABELA 21. TABELA 21 VALOR DA EC50 PARA LIGAÇÃO DO VHH RESPECTIVO SOBRE CX3CR1 HUMANA OU SOBRE CX3CR1 DE CYNO- MOLGUS [00702] Initially, a FACS-based binding setup was used to assess cross-reactivity with cynomolgus. For this, the VHHs were incubated with the respective cells for 30 minutes at 4°C followed by three washing steps and subsequently incubated with the detection reagents. As detection, a mouse anti-cmyc antibody (Serotec, MCA2200) was used followed by a PE-coupled goat anti-mouse antibody (Jackson 115-116-071), each incubation for 30 minutes at 4°C, followed by three washing steps. The test results are shown in TABLE 21. TABLE 21 EC50 VALUE FOR RESPECTIVE VHH BINDING ON HUMAN CX3CR1 OR CYNOMOLGUS CX3CR1

[00703] Para VHHs identificados posteriormente, um FACS de competição de Fractalcina humana foi configurado usando CX3CR1 humana ou de cynomolgus expressada em células HEK293T. Tanto o receptor humano quanto o receptor de cynomolgus foram transfecta- dos de modo transitório em células HEK293T e as transfecções foram combinadas pela ligação do ligante etiquetado, fractalcina humana. A competição foi avaliada usando a concentração EC30 de fractalcina e deste modo os valores da IC50 obtidos são uma boa estimativa do valor Ki, uma medida para afinidade (TABELA 22). O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 4. A proporção dos valores da IC50 em CX3CR1 de macaco cynomolgus e humana foi usada para avaliar potenciais diferenças na afinidade por CX3CR1 em ambas as espécies. TABELA 22 EFICÁCIA E POTÊNCIA DE VHHS EM FACS DE COM-PETIÇÃO DE LIGANTE PARA CX3CR1 HUMANA E DE CYNOMOL- GUS Ligações dos VHHs anti-CX3CR1 humana a CCR2 humana, CCR5 humana ou CX3CR1 de camundongo[00703] For subsequently identified VHHs, a human Fractalkine competition FACS was set up using human or cynomolgus CX3CR1 expressed in HEK293T cells. Both the human receptor and the cynomolgus receptor were transiently transfected into HEK293T cells and the transfections were combined by binding the labeled ligand, human fractalkine. Competition was evaluated using the EC30 concentration of fractalkine and thus the IC50 values obtained are a good estimate of the Ki value, a measure for affinity (TABLE 22). The experiment was performed as described in Example 4. The ratio of IC50 values in cynomolgus monkey and human CX3CR1 was used to assess potential differences in affinity for CX3CR1 in both species. TABLE 22 EFFECTIVENESS AND POTENCY OF VHHS IN COMPETITION FACS OF LIGAND FOR HUMAN AND CYNOMOLGUS CX3CR1 Bindings of anti-human CX3CR1 VHHs to human CCR2, human CCR5, or mouse CX3CR1

[00704] A especificidade para o receptor de huCX3CR1 foi avaliada realizando um experimento de ligação FACS sobre células parentais CHO-K1 ou células CHO expressando huCCR2, huCCR5 ou msCX3CR1. Os VHHs foram incubados com as respectivas linhagens celulares por 30 minutos a 4°C seguido por três etapas de lavagem e em seguida foram incubados com os reagentes de detecção. Como detecção, foi usado um anticorpo anti-cmyc de camundongo (Serotec, MCA2200) seguido por um anticorpo anti-camundongo de cabra acoplado a PE (Jackson 115-116-071), cada incubação por 30 minutos a 4°C, seguida por três etapas de lavagem. Para cada linhagem celular foi incluído um controle de qualidade com anticorpo receptor- específico. Além disso, a maior concentração de cada VHH também foi incubada com células CHO expressando huCX3CR1 como um controle positivo. Não pode ser observada ligação a msCX3CR1, huCCR2 ou huCCR5. Determinação do epítope bin[00704] Receptor specificity of huCX3CR1 was evaluated by performing a FACS binding experiment on parental CHO-K1 cells or CHO cells expressing huCCR2, huCCR5 or msCX3CR1. The VHHs were incubated with the respective cell lines for 30 minutes at 4°C followed by three washing steps and then incubated with the detection reagents. As detection, a mouse anti-cmyc antibody (Serotec, MCA2200) was used followed by a PE-coupled goat anti-mouse antibody (Jackson 115-116-071), each incubation for 30 minutes at 4°C, followed by three washing steps. For each cell line, a quality control with receptor-specific antibody was included. Furthermore, the highest concentration of each VHH was also incubated with CHO cells expressing huCX3CR1 as a positive control. No binding to msCX3CR1, huCCR2 or huCCR5 could be observed. Bin epitope determination

[00705] Um experimento de ligação competitiva foi configurado de modo a determinar se os VHHs ligam epítopes em sobreposição sobre CX3CR1. Para isto, foi usado o VHH 66B02 marcado com alexa647 em um FACS de competição sobre as células BA/F3 expressando huCX3CR1. VHHs típicos das três famílias funcionais foram usados como competidores para a ligação do 66B02 marcado. Os valores IC50 obtidos são mostrados na TABELA 23. TABELA 23 BINNING DE EPÍTOPE À BASE DE FACS DE COMPETIÇÃO [00705] A competitive binding experiment was set up in order to determine whether VHHs bind overlapping epitopes on CX3CR1. For this, VHH 66B02 tagged with alexa647 was used in a competition FACS on BA/F3 cells expressing huCX3CR1. Typical VHHs from the three functional families were used as competitors for labeled 66B02 binding. The IC50 values obtained are shown in TABLE 23. TABLE 23 EPITOP BINNING BASED ON COMPETITION FACS

[00706] Como uma inibição completa de ligação de 66B02 pode ser obtida por todos os VHHs típicos das diferentes famílias de bloqueio de ligante, pode ser concluído que todas as famílias funcionais ligam em proximidade suficientemente estreita umas das outras de tal modo que competem com a ligação de 66B02.[00706] As a complete inhibition of 66B02 binding can be obtained by all typical VHHs of the different ligand blocking families, it can be concluded that all functional families bind in close enough proximity to each other such that they compete with the binding of 66B02.

EXAMPLE 6: VHHS FORMATTING FOR BIVALENCE Construction of bivalents

[00707] De modo a aumentar a potência e/ou a eficácia de uma seleção dos VHHs obtidos, moléculas bivalentes foram construídas por engenharia genética. Dois VHHs foram geneticamente ligados junto com um encadeador de 35GS entre os dois blocos de construção e subsequentemente expressados em E.coli conforme descrito acima para os VHHs monovalentes. Diferentes constructos bivalentes foram produzidos conforme listado na TABELA 24. TABELA 24 FORMATOS BIVALENTES TÍPICOS Inibição por VHHs anti-CX3CR1 da ligação de Fractalcina humana a CX3CR1 humana expressada sobre as células BA/F3[00707] In order to increase the potency and/or effectiveness of a selection of the obtained VHHs, bivalent molecules were constructed by genetic engineering. Two VHHs were genetically linked together with a 35GS linker between the two building blocks and subsequently expressed in E.coli as described above for the monovalent VHHs. Different bivalent constructs were produced as listed in TABLE 24. TABLE 24 TYPICAL BIVALENT FORMATS Inhibition by anti-CX3CR1 VHHs of human Fractalkin binding to human CX3CR1 expressed on BA/F3 cells

[00708] A inibição da oligação de ligante a CX3CR1 humana foi investigada para os diferentes formatos conforme descrito no Exemplo 4. Para esta caracterização foi usada a linhagem celular BA/F3- huCX3CR1 apresentando expressão estável do receptor de CX3CR1 humana. O ligante fractalcina marcado com alexa647 foi usado em sua concentração EC30 e deste modo os valores IC50 obtidos são reflexo dos valores Ki. Uma visão geral dos dados obtidos é mostrada na tabela 25. TABELA 25 POTÊNCIA DE FORMATOS BIVALENTES EM COMPETIÇÃO DE LIGANTE Inibição por VHHs anti-CX3CR1 da quimiotaxia, induzida por Frac- talcina humana, de células BA/F3 superexpressando CX3CR1 humana[00708] Inhibition of ligand binding to human CX3CR1 was investigated for the different formats as described in Example 4. For this characterization, the BA/F3-huCX3CR1 cell line showing stable expression of the human CX3CR1 receptor was used. The alexa647-labeled fractalkine linker was used at its EC30 concentration and thus the IC50 values obtained are reflective of the Ki values. An overview of the data obtained is shown in table 25. TABLE 25 POWER OF BIVALENT FORMATS IN BINDER COMPETITION Inhibition by anti-CX3CR1 VHHs of human Fractalkine-induced chemotaxis of BA/F3 cells overexpressing human CX3CR1

[00709] Similar ao que foi descrito para os VHHs monovalentes an- ti-CX3CR1, a inibição de quimiotaxia induzida pela fractalcina sobre as células BA/F3-huCX3CR1 foi avaliada para os constructos bivalentes. Foi usada uma configuração de teste idêntica conforme descrito acima e os resultados obtidos estão resumidos na tabela 26. TABELA 26 INIBIÇÃO DE QUIMIOTAXIA INDUZIDA PELA FRAC- TALCINA POR CONSTRUCTOS DE VHH BIVALENTES Avaliação da reatividade cruzada dos VHHs anti-CX3CR1 contra CX3CR1 de cynomolgus[00709] Similar to what was described for the monovalent anti-CX3CR1 VHHs, the inhibition of chemotaxis induced by fractalkine on BA/F3-huCX3CR1 cells was evaluated for the bivalent constructs. An identical test setup as described above was used and the results obtained are summarized in Table 26. TABLE 26 INHIBITION OF FRAC-TALCIN-INDUCED CHEMOTAXIS BY BIVALENT VHH CONSTRUCTS Evaluation of cross-reactivity of anti-CX3CR1 VHHs against cynomolgus CX3CR1

[00710] Também para os constructos bivalentes a reatividade cruzada para CX3CR1 de cynomolgus foi avaliada e comparada com a reatividade humana. Conforme descrito anteriormente, ou uma confi-guração de ligação (Tabela 27) ou uma configuração de competição de ligante (TABELA 28) foram aplicadas usando células HEK293T transfectadas de modo transitório. Lotes de células transfectadas de modo transitório foram combinados por seu nível de expressão de receptor. TABELA 27 LIGAÇÃO DE CONSTRUCTOS BIVALENTES A CX3CR1 HUMANA OU DE CYNOMOLGUS TABELA 28 COMPETIÇÃO DE LIGANTE DE CONSTRUCTOS BI VALENTES SOBRE CX3CR1 HUMANA OU DE CYNOMOLGUS [00710] Also for the bivalent constructs the cross-reactivity for CX3CR1 from cynomolgus was evaluated and compared with the human reactivity. As described earlier, either a binding configuration (Table 27) or a ligand competition configuration (TABLE 28) were applied using transiently transfected HEK293T cells. Pools of transiently transfected cells were matched by their level of receptor expression. TABLE 27 BINDING OF BIVALENT CONSTRUCTS TO HUMAN OR CYNOMOLGUS CX3CR1 TABLE 28 BIVALENT CONSTRUCTS BINDER COMPETITION OVER HUMAN OR CYNOMOLGUS CX3CR1

EXAMPLE 7: EXPLORING THE LENGTH OF THE LINEAGER AND EXTENDING THE HALF LIFE Evaluation of the chain length and positioning of the VHH alb11

[00711] Como o comprimento do encadeador usado em um formato bivalente pode impactar drasticamente sobre a potência obtida, foram avaliados diferentes comprimentos de encadeador.[00711] As the length of the chain used in a bivalent format can drastically impact the power obtained, different chain lengths were evaluated.

[00712] Além disso, Alb11, um Nanobody ligando a albumina sérica humana foi incluído de modo a aumentar a meia-vida in vivo das moléculas formatadas (publicação de patente internacional No. WO 06/122787). Foram produzidos diferentes formatos incluindo variações sobre os comprimentos do encadeador usado, mas também o posicionamento dos diferentes VHHs da composição. Um sumário dos formatos explorados é mostrado na TABELA 29. TABELA 29 EXPLORAÇÃO DA EXTENSÃO DA MEIA-VIDA E DO COMPRIMENTO DO ENCADEADOR [00712] Furthermore, Alb11, a Nanobody binding to human serum albumin was included in order to increase the in vivo half-life of the formatted molecules (International Patent Publication No. WO 06/122787). Different formats were produced including variations on the lengths of the string used, but also the positioning of the different VHHs in the composition. A summary of the formats explored is shown in TABLE 29. TABLE 29 EXPLORATION OF HALF-LIFE AND LENGTH EXPLORATION OF CHAINER LENGTH

[00713] Sequências codificantes para o VHH formatado foram clo- nadas em um plasmídeo construído internamente (in-house) permitindo expressão em Pichia pastoris e secreção no meio de cultura. O vetor de expressão foi derivado de pPICZa (Invitrogen) e continha o promotor AOX1 para expressão induzida por methanol, fortemente regulada, um gene de restência para Zeocin™, um sítio de multiclonatem e o sinal de secreção do fator α. Depois de transformação, culturas de expressão foram cultivadas e a expressão de VHH foi induzida por adição de metanol e deixada para continuar por 48 horas a 30°C.[00713] Coding sequences for the formatted VHH were cloned into a plasmid constructed internally (in-house) allowing expression in Pichia pastoris and secretion in the culture medium. The expression vector was derived from pPICZa (Invitrogen) and contained the AOX1 promoter for tightly regulated methanol-induced expression, a Zeocin™ resistance gene, a multiclonatem site, and the α-factor secretion signal. After transformation, expression cultures were grown and VHH expression was induced by addition of methanol and allowed to continue for 48 hours at 30°C.

[00714] A potência destes diferentes formatos foi avaliada usando o teste de competição de ligante conforme descrito acima. Vendo que a concentração de ligante usada é abaixo do valor da EC50, os valores da IC50 obtidos são equivalentes aos valores Ki. O Ki obtido para os diferentes formatos está resumido na Tabela 30. TABELA 30 POTÊNCIA DE FORMATOS DE MEIA-VIDA ESTENDIDA EM COMPETIÇÃO DE LIGANTE Impacto da albumina sérica humana sobre a potência[00714] The potency of these different formats was assessed using the ligand competition test as described above. Seeing that the binder concentration used is below the EC50 value, the IC50 values obtained are equivalent to the Ki values. The Ki obtained for the different formats is summarized in Table 30. TABLE 30 POTENCY OF EXTENDED HALF-LIFE FORMATS IN LINDOR COMPETITION Impact of human serum albumin on potency

[00715] A ligação de albumina sérica humana (HSA) ao alb11 VHH pode impactar sobre a potência do formato e portanto a competição de ligante foi repetida na presença de HSA. Em resumo, de modo a permitir a ligação de HSA ao alb11 VHH, os constructos sob avaliação e fractalcina foram pré-incubados com HSA por 30 minutos antes de adição às células. Além disso as células foram ressuspendidas em tampão FACS suplementado com HSA. A concentração final de HSA usada foi um excesso de 50 vezes acima da maior concentração de VHH usada. Em seguida, a competição foi permitida por 2 horas e o processamento posterior foi conforme descrito no Exemplo 4. [00715] Binding of human serum albumin (HSA) to alb11 VHH can impact on formate potency and therefore ligand competition was repeated in the presence of HSA. In summary, in order to allow binding of HSA to alb11 VHH, the constructs under evaluation and fractalkine were pre-incubated with HSA for 30 minutes prior to addition to the cells. In addition cells were resuspended in FACS buffer supplemented with HSA. The final concentration of HSA used was a 50-fold excess over the highest concentration of VHH used. Then competition was allowed for 2 hours and further processing was as described in Example 4.

[00716] A potencial interferência da HSA também foi avaliada em uma configuração de quimiotaxia adaptada, incluindo HSA nos diferentes compartimentos do teste. A concentração de HSA usada foi novamente um excesso de 50 vezes em relação à maior concentração de constructo usada e os constructos foram carregados com HSA por 30 minutos antes do início do teste. O tampão de teste também foi suplementado com HSA de tal modo que HSA está presente durante toda a extensão do experimento. Conforme descrito acima, foi usada a câmara descartável ChemoTx com tamanho de poro de 5 μm (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, EUA). As células foram colhidas a partir de uma cultura crescendo ativamente e foram lavadas antes do uso em meio de teste, RPMI (Gibco, Carlsbad, EU) suplementado com 0,1% de BSA e 62,5 μM de HSA (Sigma, A8763). A câmara de fundo foi preenchida com 320 pM de Fractalcina humana em um volume total de 300 μl. Depois de aplicação da membrana, 0.13E6 células foram depositadas na parte de cima da membrana em um volume total de 70 μl. Foi permitida quimiotaxia por 3 horas a 37 C em uma câmara umidificada com CO2. Depois deste período de incubação, a membrana foi removida e as células na câmara do fundo foram ressuspendidas. A quantidade de ATP presente na cavidade foi determinada usando o kit Cell- Titer-Glo (Promega, Madison WI, EUA). Foi realizada leitura em um Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) com as configurações de fábrica de rotina para leitura da luminescência. Foram realizadas séries de titulações em triplicata e cada placa continha amostras de controle também em triplicata. Como controle, foi incluída uma amostra sem VHH bem como uma amostra onde não foi adicionada nenhuma Fractalcina humana à câmara de fundo. Os valores IC50 obtidos estão listados na TABELA 31. TABELA 31 QUIMIOTAXIA INDUZIDA POR FRACTALCINA NA PRESENÇA DE HSA Inibição da internalização de Fractalcina pelos polipeptídeos formatados bivalentes de meia-vida estendida[00716] The potential interference of HSA was also evaluated in an adapted chemotaxis setup by including HSA in the different test compartments. The HSA concentration used was again a 50-fold excess over the highest construct concentration used and the constructs were loaded with HSA for 30 minutes before the start of the test. The test buffer was also supplemented with HSA such that HSA is present throughout the entire length of the experiment. As described above, the disposable ChemoTx chamber with a pore size of 5 µm (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, USA) was used. Cells were harvested from an actively growing culture and were washed prior to use in test medium, RPMI (Gibco, Carlsbad, EU) supplemented with 0.1% BSA and 62.5 µM HSA (Sigma, A8763) . The bottom chamber was filled with 320 pM human Fractalcine in a total volume of 300 μl. After membrane application, 0.13E6 cells were deposited on top of the membrane in a total volume of 70 µl. Chemotaxis was allowed for 3 hours at 37°C in a CO2 humidified chamber. After this incubation period, the membrane was removed and the cells in the bottom chamber were resuspended. The amount of ATP present in the well was determined using the Cell-Titer-Glo kit (Promega, Madison WI, USA). Reading was performed on an Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) with routine factory settings for luminescence reading. Series of titrations were performed in triplicate and each plate contained control samples also in triplicate. As a control, a sample without VHH was included as well as a sample where no human Fractalcin was added to the bottom chamber. The IC50 values obtained are listed in TABLE 31. TABLE 31 FRACTALKIN-INDUCED CHEMOTAXIS IN THE PRESENCE OF HSA Inhibition of Fractalkine internalization by extended half-life bivalent formatted polypeptides

[00717] Testes funcionais adicionais foram realizados para demons- traar a atividade de antagonista dos polipeptídeos bivalentes de meia- vida estendida. Os polipeptídeos foram avaliados para sua capacidade para inibir a internalização de A647-Fractalcina em células CHO huCX3CR1. Em resumo, 1E4 células/cavidade foram laminadas em placas de 96 cavidades de fundo preto escuro transparente (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) e cultivadas de um dia para o outro. As células foram lavadas uma vez e em seguida equilibradas em tampão de teste (HBSS com cálcio e magnésio (Gibco) suplementado com 10 mM de HEPES e 0,1% de BSA). Os constructos de polipeptídeos formatados foram adicionados e as placas foram incubadas por 15 minutos a 37 C. A647-Fractalcina foi em seguida adicionada em uma concentração final de 8 nM e as células foram incubadas por 60 minutos a 37 C. O meio foi removido e as células foram fixadas por 10 minutos com 3,7% de solução de formaldeído (Polysciences, Warrington, PA, EUA). As células foram enxaguadas uma vez com PBS e os núcleos foram marcados com corante da Hoechst (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). De modo a quantificar a Fractalcina etiquetada internalizada, as células foram estudadas por imagem usando o sistema de bioimage- amento BD Pathway. Foi realizada segmentação de imagens identificando o núcleo celular marcado e desenhando um anel de 3 píxes em torno daquela máscara. A intensidade média de A647 foi medida no anel citoplasmático. Os polipeptídeos formatados inibiram potentemente a internalização de Fractalcina conforme resumido na Tabela 32: TABELA 32 INIBIÇÃO DA INTERNALIZAÇÃO DE A647- FRACTALCINA Um polipeptídeo de meia-vida estendida bivalente formatado anti- CX3CR1 é destituído de atividade de agonista[00717] Additional functional tests were performed to demonstrate the antagonist activity of bivalent polypeptides with extended half-life. The polypeptides were evaluated for their ability to inhibit the internalization of A647-Fractalkine in CHO huCX3CR1 cells. Briefly, 1E4 cells/well were plated onto 96-well dark black bottom clear plates (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) and grown overnight. Cells were washed once and then equilibrated in assay buffer (Calcium Magnesium HBSS (Gibco) supplemented with 10 mM HEPES and 0.1% BSA). The formatted polypeptide constructs were added and the plates were incubated for 15 minutes at 37°C. A647-Fractalcine was then added to a final concentration of 8 nM and the cells were incubated for 60 minutes at 37°C. The medium was removed and cells were fixed for 10 minutes with 3.7% formaldehyde solution (Polysciences, Warrington, PA, USA). Cells were rinsed once with PBS and nuclei were stained with Hoechst dye (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). In order to quantify internalized labeled Fractalkine, cells were imaged using the BD Pathway bioimaging system. Image segmentation was performed by identifying the marked cell nucleus and drawing a 3-pixel ring around that mask. The average intensity of A647 was measured in the cytoplasmic ring. The formatted polypeptides potently inhibited Fractalkine internalization as summarized in Table 32: TABLE 32 INHIBITION OF A647-FRACTALKIN INTERNALIZATION An anti-CX3CR1 formatted bivalent extended half-life polypeptide is devoid of agonist activity

[00718] De modo a confirmar que um polipeptídeo de meia-vida estendida bivalente anti-CX3CR1 não tinha atividade de agonista, CX3CR1BII036 foi avaliado para indução de influxo de cálcio nas células CHO huCX3CR1. Fractalcina mediou aumentos nos níveis de cálcio citosólico nestas células em uma maneira dependente de CX3CR1 e CX3CR1BII036 inibiu esta resposta.[00718] In order to confirm that a bivalent anti-CX3CR1 extended half-life polypeptide had no agonist activity, CX3CR1BII036 was evaluated for induction of calcium influx into huCX3CR1 CHO cells. Fractalkine mediated increases in cytosolic calcium levels in these cells in a CX3CR1-dependent manner, and CX3CR1BII036 inhibited this response.

[00719] As células CHO huCX3CR1 foram laminadas a 5E4 células/ cavidade em placas de 96 cavidades de fundo preto transparente (BD) e foram cultivadas de um dia para o outro. As células foram incubadas com corante Calcium-4 /2 mM de probenicid (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) em HBSS suplementado com 20 mM de HEPES por 60 minutos a 37oC. Para demonstrar o antagonismo dos polipeptí- deos, CX3CR1BII036 foi pré-incubado com as células por 15 minutos da adição de Fractalcina em seu valor de EC80. A mobilização de cálcio foi monitorada em um sistema FLIPR Tetra (Molecular Devices) de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar o agonismo, não houve nenhuma pré-incubação com o polipeptídeo e ao invés, CX3CR1BII036 foi usado ao invés da estimulação com Fractalcina. Enquanto CX3CR1BII036 inibiu o influxo de cálcio mediado pela Frac- talcina com uma IC50 de 1,3 nM, não foram observados aumentos nos níveis de cálcio citosólico quando o polipeptídeo isolado foi adicionado em concentrações até 1 μM.[00719] CHO huCX3CR1 cells were plated at 5E4 cells/well in clear black bottom (BD) 96-well plates and grown overnight. Cells were incubated with Calcium-4 dye /2 mM probenicid (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) in HBSS supplemented with 20 mM HEPES for 60 minutes at 37oC. To demonstrate the antagonism of the polypeptides, CX3CR1BII036 was pre-incubated with the cells for 15 minutes of addition of Fractalkine at its EC80 value. Calcium mobilization was monitored on a FLIPR Tetra system (Molecular Devices) according to the manufacturer's instructions. To determine agonism, there was no pre-incubation with the polypeptide and instead, CX3CR1BII036 was used instead of Fractalkine stimulation. While CX3CR1BII036 inhibited Fractalkine-mediated calcium influx with an IC50 of 1.3 nM, no increases in cytosolic calcium levels were observed when the isolated polypeptide was added at concentrations up to 1 µM.

EXAMPLE 8: EXPLORING HALF-LIFE EXTENSION FORMATS USING MOUSE FC

[00720] De modo a investigar modalidades de extensão da meia- vida alternativas, o domínio VHH 66B02 foi produzido como uma proteína de fusão com um domínio de Fc de IgG2 de camundongo (66B02- mFc). Uma mutação de ácido aspártico para alanina (D265A) foi incorporada no domínio CH2 para anular a potencial função efetora mediada por Fc neste constructo (Baudino, J. Immunol., 181, 6664-6669 (2008)). 66B02-mFc foi expressado em células HEK293T ou células NS0 e purificado por cromatografia por afinidade de Proteína A seguida por cromatografia de permuta iônica. Esta molécula foi testada para atividade utilizando os formatos de teste descritos no Exemplo 7. Os resultados são resumidos na Tabela 33: TABELA 33 ATIVIDADE DE 66B02-MFC [00720] In order to investigate alternative half-life extension modalities, the 66B02 VHH domain was produced as a fusion protein with a mouse IgG2 Fc domain (66B02-mFc). An aspartic acid to alanine mutation (D265A) was incorporated into the CH2 domain to abrogate potential Fc-mediated effector function in this construct ( Baudino, J. Immunol., 181, 6664-6669 (2008 )). 66B02-mFc was expressed in HEK293T cells or NS0 cells and purified by Protein A affinity chromatography followed by ion exchange chromatography. This molecule was tested for activity using the test formats described in Example 7. The results are summarized in Table 33: TABLE 33 66B02-MFC ACTIVITY

[00721] Apesar de 66B02-mFc ter inibido potentemente a ativação de CX3CR1 mediada pela Fractalcina, não apresentou atividade de agonista. Não foi observado nenhum aumento nos níveis de cálcio ci- tosólico com tratamento com até 1 μM desta molécula.[00721] Although 66B02-mFc potently inhibited Fractalkine-mediated activation of CX3CR1, it did not show agonist activity. No increase in cytosolic calcium levels was observed with treatment with up to 1 μM of this molecule.

EXAMPLE 9: INHIBITION OF PLAQUE PROGRESSION IN AN EXTENDED HALF-LIFE DIVALENT POLYPEPTIDE MOUSE MODEL OF ATHEROSCLEROSIS Production of human CX3CR1 knock-in in Apo E -/- mice

[00722] Dada a falta de reatividade cruzada dos VHHs identificados para CX3CR1 de camundongo (Exemplo 5), foi gerada uma linhagem de camundongo de knock-in de CX3CR1 humana (hu CX3CR1 KI) na TaconicArtemis (Koeln, Alemanha) para permitir experimentos destas moléculas em modelos de doença em camundongo. Foi empregada uma estratégia que permitiu a expressão do receptor de quimniocina humana sob o controle do promotor de camundongo correspondente enquanto ocorrendo a disrupção da expressão da proteína de camundongo endógena. Em resumo, foi construído um vetor de direcionamento onde a região codificante de CX3CR1 de camundongo no éxon 2 foi substituída com o frame de leitura aberta de CX3CR1 humana completo e flanqueada por marcadores de seleção e sítios loxP. O vetor de direcionamento foi introduzido em células ES de camundongo e clones que tinham sifo submetidos com sucesso a recombinação homóloga foram usados para gerar camundongos quiméricos. Estes camundongos foram reproduzidos para camundongos altamente eficientes Flp-deleter de modo a obter a remoção do marcador de seleção e transmissão para a linhagem germinativa. Os camundongos hu CX3CR1 KI resultante em um pano de fundo C57BL/6 foram em seguida cruzados com camundongos Apo E -/- (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA) de modo a gerar camundongos hu CX3CR1 KI Apo E-/-. O modelo de camundongos Apo E-/- proporciona um método robusto para induzir estensiva formação de placas ateroscleróticas que é a grosso modo similar à doença humana com respeito à localização sítio-específica da formação de placas, à composição histológi- ca, e aos fatores de risco conhecidos (colesterol, inflamação, hipertensão, etc). Avaliação dos polipeptídeos anti-CX3CR1 bivalentes de meia-vida estendida no modelo de aterosclerose em camundongo Apo E-/[00722] Given the lack of cross-reactivity of the identified VHHs to mouse CX3CR1 (Example 5), a human CX3CR1 knock-in mouse strain (hu CX3CR1 KI) was generated at TaconicArtemis (Koeln, Germany) to allow experiments on these molecules in mouse disease models. A strategy was employed that allowed expression of the human chemokine receptor under the control of the corresponding mouse promoter while disrupting expression of the endogenous mouse protein. In summary, a targeting vector was constructed where the mouse CX3CR1 coding region in exon 2 was replaced with the complete human CX3CR1 open reading frame and flanked by selection markers and loxP sites. The targeting vector was introduced into mouse ES cells and clones that had successfully undergone homologous recombination were used to generate chimeric mice. These mice were bred to highly efficient Flp-deleter mice in order to obtain selection marker removal and germline transmission. The resulting CX3CR1 KI hu mice in a C57BL/6 background were then crossed with Apo E -/- mice (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) to generate CX3CR1 KI Apo E -/- hu mice . The Apo E -/- mouse model provides a robust method for inducing extensive atherosclerotic plaque formation that is broadly similar to human disease with respect to the site-specific location of plaque formation, the histological composition, and the factors involved. known risk factors (cholesterol, inflammation, hypertension, etc). Evaluation of bivalent anti-CX3CR1 polypeptides with extended half-life in the mouse model of atherosclerosis Apo E-/

[00723] Camundongos fêmeas hu CX3CR1KI ApoE -/- foram alimentados com uma dieta de alto teor de gordura/alto teor de colesterol contendo 1,5% de colesterol por 16 semanas iniciando em quatro semanas de idade. Depois de 10 semanas, os animais were administrados por injeção i.p. veículo (20 mM de Citrato de Na pH 6,0, 115 mM de NaCl), 10 mg/kg 66B02-mFc uma vez ou duas vezes por semana ou 30 mg/kg de CX3CR1BII036 duas vezes por semana por 6 semanas. Os animais foram anestesiados por anestesia com gás e perfundidos com salina a 0,9%. A aorta descendente para a bifurcação ilíaca foi cuidadosamente removida e fixada em formalina. Em seguida foi aberta longitudinalmente, e corada com Sudan IV por 15 minutos, seguido por metanol a 70% por 2 minutos. Os vasos foram lavados sob água corrente e cobertos com PBS. Os tecidos foram fotografados com uma câmera digital usando o software SPOT Advanced (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, EUA). A percentagem de coloração de lipídeos foi determinada com software de análise de imagens (Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, EUA) e expressa como uma percentagem de coloração positiva do vaso. Os resultados deste estudo estão resumidos na Tabela 34: TABELA 34 QUANTIFICAÇÃO DO TAMANHO DE PLACA NA AORTA DESCENDENTE EM CAMUNDONGOS FÊMEAS HU CX3CR1 KI APO E -/- [00723] Female hu CX3CR1KI ApoE -/- mice were fed a high-fat/high-cholesterol diet containing 1.5% cholesterol for 16 weeks starting at four weeks of age. After 10 weeks, the animals were administered by injection ip vehicle (20 mM Na Citrate pH 6.0, 115 mM NaCl), 10 mg/kg 66B02-mFc once or twice a week or 30 mg/kg of CX3CR1BII036 twice a week for 6 weeks. Animals were anesthetized by gas anesthesia and perfused with 0.9% saline. The descending aorta to the iliac bifurcation was carefully removed and fixed in formalin. It was then opened longitudinally, and stained with Sudan IV for 15 minutes, followed by 70% methanol for 2 minutes. The pots were washed under running water and covered with PBS. Tissues were photographed with a digital camera using SPOT Advanced software (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI, USA). The percentage of lipid staining was determined with image analysis software (Image-Pro Plus, MediaCybernetics, Rockville, MD, USA) and expressed as a percentage of positive vessel staining. The results of this study are summarized in Table 34: TABLE 34 QUANTIFICATION OF PLAQUE SIZE IN DESCENDING AORTA IN FEMALE HU CX3CR1 KI APO E -/- MICE

[00724] Tanto 66B02-mFc quanto CX3CR1BII036 inibiram significa- tivamene a progressão de placas quando dosados duas vezes por semana. Isto se correlacionou com a cobertura uma vez que os níveis plasmáticos destas moléculas podem ser confirmados para serem mantidos do início ao fim do estudo. Para dosagem de uma vez por semana de 66B02-mFc, não foram mantidos níveis plasmáticos detec- táveis e isto se correlacionou com a falta de eficácia significativa observada depois de 6 semanas de tratamento. Nenhuma molécula afetou significativamente os níveis plasmáticos de colesterol ou triglicerí- deos.[00724] Both 66B02-mFc and CX3CR1BII036 significantly inhibited plaque progression when dosed twice weekly. This correlated with coverage as plasma levels of these molecules could be confirmed to be maintained throughout the study. For once-weekly dosing of 66B02-mFc, detectable plasma levels were not maintained and this correlated with the lack of significant efficacy observed after 6 weeks of treatment. No molecule significantly affected plasma levels of cholesterol or triglycerides.

EXAMPLE 10: PARENTAL VHH SEQUENCE OPTIMIZATION

[00725] Em geral, durante otimização de sequência de VHH, sequências de VHH selvagem parental são mutadas para produzir sequências de VHH que são mais idênticas a sequências de consenso da linhagem germinativa VH3-JH humana. Aminoácidos específicos nas regiões de framework que diferem entre o VHH e o consenso da linhagem germinativa VH3-JH humana são alterados para o equivalente humano de tal modo que a estrutura, a atividade e a estabilidade da proteína são mantidas intactas. Para investigar isto, todas as variantes de otimização de sequência foram comparadas com o VHH parental em três testes diferentes: (i) determinação da temperatura de fusão (Tm) em um teste de mudança térmica (TSA, Thermal Shift Assay), (ii) análise da potência in vitro em FACS de competição de fractalcina, e para alguns constructos (iii) análise da potência in vitro no teste de quimiotaxia induzida pela fractalcina. Mutação de resíduos de framework[00725] In general, during VHH sequence optimization, parental wild-type VHH sequences are mutated to produce VHH sequences that are more identical to human VH3-JH germline consensus sequences. Specific amino acids in the framework regions that differ between the VHH and the human VH3-JH germline consensus are changed to the human equivalent such that the structure, activity, and stability of the protein are kept intact. To investigate this, all sequence optimization variants were compared to the parental VHH in three different tests: (i) determination of the melting temperature (Tm) in a Thermal Shift Assay (TSA), (ii) in vitro potency analysis in fractalkine competition FACS, and for some constructs (iii) in vitro potency analysis in the fractalkine-induced chemotaxis test. Mutation of framework residues

[00726] Para otimização de sequência, foram investigadas as seguintes mutações: E1D, S11L, A14P, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R e Q108L. Os mutantes individuais que foram gerados na sequência parental de CX3CR1BII66B02 estão representados na Tabela 35: TABELA 35 MUTAÇÕES INVESTIGADAS DURANTE OTIMIZAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE 66B02 [00726] For sequence optimization, the following mutations were investigated: E1D, S11L, A14P, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R and Q108L. The individual mutants that were generated in the parental sequence of CX3CR1BII66B02 are represented in Table 35: TABLE 35 MUTATIONS INVESTIGATED DURING SEQUENCE OPTIMIZATION OF 66B02

[00727] Todos os constructos foram clonados em um vetor de expressão em E. coli, e expressados em E. coli como proteínas com etiqueta myc/His em um volume de cultura de 0,25 L a 0,5 L de meio TB. Foi induzida expressão por adição de 1 mM de IPTG e deixada para continuar por 4 horas a 37°C e 250 rpm. As células foram peletizadas, e extratos periplasmáticos foram preparados por congelamento- descongelamento e ressuspensão em dPBS. Estes extratos foram usados como material de partida para cromatografia por afinidade com metal imobilizado (IMAC) usando colunas brutas Histrap FF (GE healthcare). Nanobodies foram elutriados da coluna com 250 mM de imi- dazol e em seguida dessalgados para dPBS. A pureza e a integridade dos Nanobodies foi verificada por SDS-PAGE redutor.[00727] All constructs were cloned into an E. coli expression vector, and expressed in E. coli as myc/His-tagged proteins in a culture volume of 0.25 L to 0.5 L of TB medium. Expression was induced by addition of 1 mM IPTG and allowed to continue for 4 hours at 37°C and 250 rpm. Cells were pelleted, and periplasmic extracts were prepared by freeze-thaw and resuspension in dPBS. These extracts were used as starting material for immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using Histrap FF raw columns (GE healthcare). Nanobodies were eluted from the column with 250 mM imidazole and then desalted into dPBS. The purity and integrity of the Nanobodies was verified by reducing SDS-PAGE.

[00728] Conforme resumido na Tabela 36, as mutações A14P, A74S, K83R e Q108L não tiveram nenhum efeito claro sobre a potência conforme determinado a partir do FACS de competição. De modo similar, as mutações adicionais E1D, S11L e E16G não afetaram a potência. Por outro lado, a introdução de ou R44Q ou D46E resultou em uma queda significatica na potência que foi ainda mais pronunciada no caso de ambas as mutações terem sido introduzidas. TABELA 36 POTÊNCIA DE CONSTRUCTOS DE OTIMIZAÇÃO DE SEQUÊNCIA DETERMINADOS POR FACS DE COMPETIÇÃO DE LIGANTE [00728] As summarized in Table 36, the mutations A14P, A74S, K83R and Q108L had no clear effect on potency as determined from the competition FACS. Similarly, the additional E1D, S11L and E16G mutations did not affect potency. On the other hand, introduction of either R44Q or D46E resulted in a significant drop in potency that was even more pronounced if both mutations were introduced. TABLE 36 POWER OF SEQUENCE OPTIMIZATION CONSTRUCTS DETERMINED BY BINDER COMPETITION FACS

[00729] Além disso, foi avaliada a temperatura de fusão, preditiva para a estabilidade do VHH. A maioria das mutações individuais teve efeito limitado ou nenhum efeito com a exceção da mutação D46E, a qual aumentou a temperatura de fusão por aproximadamente 6°C. A introdução das mutações combinadas também aumentou a estabilidade térmica, cfr 057 e 060.[00729] In addition, the melting temperature, predictive for the stability of the VHH, was evaluated. Most of the individual mutations had limited or no effect with the exception of the D46E mutation, which increased the melting temperature by approximately 6°C. The introduction of the combined mutations also increased thermal stability, cfr 057 and 060.

[00730] Devido aos importantes efeitos sobre a potência no FACS de competição de ligante, as mutações R44Q e D46E não foram inclu- ídas na sequência final. Mutação de resíduos CDR[00730] Due to the important effects on potency in the FACS of ligand competition, the mutations R44Q and D46E were not included in the final sequence. CDR residue mutation

[00731] Com base na análise in silico da sequência parental, um sítio de glicosilação foi previsto na posição 52. Portanto foram construídas duas bibliotecas; uma para a posição 52 e uma para a posição 53, a qual foi projetada para incluir todos os aminoácidos possíveis na respectiva posição. As bibliotecas foram triadas como extratos peri- plasmáticos em um FACS de competição de ligante. Primeiro, uma série de diluições foi feita de material periplasmático da sequência parental e três diluições foram selecionadas para triagem posterior. Um primeiro ponto de diluição (duas vezes) foi escolhido para proporcionar bloqueio total da interação do ligante ao passo que os outros dois pontos de diluição (128 e 512 vezes) vão resultar em 70% e 40% de bloqueio respectivamente. Depois da produção dos extratos periplasmáti- cos da biblioteca, todas as amostras foram divididas em duas e uma delas foi submetida a um tratamento com calor. Tanto as amostras não tratadas quanto as tratadas com calor foram em seguida analisadas no FACS de competição de ligante nos três pontos de diluição. O impacto da mutação pode ser estimada comparando o bloqueio obtido com o bloqueio da sequência parental. A análise das amostras tratadas com calor proporciona uma medida para um potencial impacto sobre a estabilidade da mutação.[00731] Based on the in silico analysis of the parental sequence, a glycosylation site was predicted at position 52. Therefore, two libraries were constructed; one for position 52 and one for position 53, which was designed to include all possible amino acids at the respective position. Libraries were screened as periplasmic extracts in a ligand competition FACS. First, a dilution series was made of periplasmic material from the parental sequence and three dilutions were selected for further screening. A first dilution point (two-fold) was chosen to provide complete blockage of the ligand interaction whereas the other two dilution points (128 and 512-fold) will result in 70% and 40% blockade respectively. After producing the periplasmic extracts from the library, all samples were divided into two and one of them was subjected to a heat treatment. Both untreated and heat-treated samples were then analyzed in the binder competition FACS at the three dilution points. The impact of the mutation can be estimated by comparing the obtained block with the parental sequence block. Analysis of heat-treated samples provides a measure for a potential impact on mutation stability.

[00732] Com base nos resultados de triagem inicial, sete mutações foram selecionadas para caracterização posterior. A potência obtida no FACS de competição de ligante é mostrada na Tabela 37. TABELA 37 REMOÇÃO DE SÍTIO DE GLICOSILAÇÃO NA POSIÇÃO 52 [00732] Based on the initial screening results, seven mutations were selected for further characterization. The potency obtained in the ligand competition FACS is shown in Table 37. TABLE 37 GLYCOSYLATION SITE REMOVAL AT POSITION 52

[00733] A partir desta análise, alinhamento de sequência com a sequência de referência humana e com base em um programa de previsão de reconhecimento de epítope de células T in silico, foi decidido incluir as mutações N52S e S53T na sequência.[00733] From this analysis, sequence alignment with the human reference sequence and based on an in silico T cell epitope recognition prediction program, it was decided to include the N52S and S53T mutations in the sequence.

[00734] Por questões de estabilidade, foi produzida uma biblioteca adicional para a posição 32. A triagem de competição de ligante foi configurada em um modo similar conforme descrito acima. Novamente três diluições dos extratos periplasmáticos foram triadas e a% de bloqueio obtida foi comparada com% de bloqueio obtida para a sequência parental. Depois de análise dos vários mutantes, a substituição de N32T foi escolhida e incluída na variante de sequência final otimizada. EXEMPLO 11: ANÁLISE DAS VARIANTES OTIMIZADAS[00734] For stability concerns, an additional library was produced for position 32. The ligand competition screen was set up in a similar fashion as described above. Again, three dilutions of the periplasmic extracts were screened and the % blocking obtained was compared with the % blocking obtained for the parental sequence. After analysis of the various mutants, the N32T replacement was chosen and included in the final optimized sequence variant. EXAMPLE 11: ANALYSIS OF OPTIMIZED VARIANTS

[00735] Em uma rodada de caracterização final foram caracterizados os constructos listados na TABELA 38. TABELA 38 VARIANTES DE SEQUÊNCIA OTIMIZADA DO VHH 66B02 LIDER [00735] In a final characterization round, the constructs listed in TABLE 38 were characterized. TABLE 38 OPTIMIZED SEQUENCE VARIANTS OF VHH 66B02 LIDER

[00736] Foi realizado um experimento de FACS de competição conforme descrito acima bem como uma determinação da temperatura de fusão. Os valores obtidos são representados na Tabela 39. TABELA 39 FACS DE COMPETIÇÃO E TEMPERATURA DE FUSÃO (TM) DA VARIANTES DE SEQUÊNCIA OTIMIZADA [00736] A competition FACS experiment was performed as described above as well as a melting temperature determination. The values obtained are represented in Table 39. TABLE 39 COMPETITION FACS AND MELTING TEMPERATURE (TM) OF OPTIMIZED SEQUENCE VARIANTS

[00737] Estes constructos também foram caracterizados em quimio- taxia induzida pela fractalcina conforme descrito acima (Tabela 40). TABELA 40 QUIMIOTAXIA INDUZIDA POR LIGANTE COM VARIANTES DE SEQUÊNCIA OTIMIZADA [00737] These constructs were also characterized in fractalkine-induced chemotaxis as described above (Table 40). TABLE 40 LIGAND-INDUCED CHEMOTAXIS WITH OPTIMIZED SEQUENCE VARIANTS

[00738] Constructos selecionados foram avaliados para inibição da internalização induzida A647-Fractalcina em células CHO huCX3CR1. Os resultados são resumidos na Tabela 41: TABELA 41 INTERNALIZAÇÃO INDUZIDA POR LIGANTE COM VARIANTES DE SEQUÊNCIA OTIMIZADA Um polipeptídeo de sequência otimizada anti-CX3CR1 de meia- vida estendida é destituído de atividade agonista[00738] Selected constructs were evaluated for inhibition of A647-Fractalkine induced internalization in CHO huCX3CR1 cells. The results are summarized in Table 41: TABLE 41 LIGAND INDUCED INTERNALIZATION WITH OPTIMIZED SEQUENCE VARIANTS An extended half-life anti-CX3CR1 sequence-optimized polypeptide is devoid of agonist activity

[00739] De modo a confirmar que o polipeptídeo de sequência otimizada anti-CX3CR1 de meia-vida estendida não tem atividade ago- nista, CX3CR1BII00313 foi avaliado para indução do influxo de cálcio nas células CHO huCX3CR1. Enquanto a pré-incubação com CX3CR1BII00313 inibiu o influxo de cálcio mediado pela Fractalcina com uma IC50 de 1,3 nM, não foi obsevado nenhum aumento nos níveis de cálcio citosólicos quando o polipeptídeo isolado foi adicionado em concentrações até 1 μM.[00739] In order to confirm that the sequence-optimized anti-CX3CR1 polypeptide with extended half-life does not have agonist activity, CX3CR1BII00313 was evaluated for induction of calcium influx in huCX3CR1 CHO cells. While preincubation with CX3CR1BII00313 inhibited Fractalkine-mediated calcium influx with an IC50 of 1.3 nM, no increase in cytosolic calcium levels was observed when isolated polypeptide was added at concentrations up to 1 µM.

EXAMPLE 12: EXPLORING HALF-LIFE EXTENSION FORMATS USING HUMAN FC

[00740] De modo a investigar modalidades de extensão da meia- vida adicionais, os domínios VHH de sequência otimizada CX3CR1BII00306 e CX3CR1BII00307 foram produzidos como proteínas de fusão com um domínio de Fc de IgG1 humana (306D-hFc e 307D-hFc). Duas mutações foram incorporadas no domínio CH2 para anular potencial função efetora mediada por Fc neste constructo. 306D-hFc e 307D-hFc foram expressados em células HEK293T ou células NS0 e purificados por cromatografia por afinidade por Proteína A seguida por cromatografia de permuta iônica. Estas moléculas foram testadas para atividade funcional utilizando os formatos de teste descritos no Exemplo 7. Os resultados estão resumidos na Tabela 42: TABELA 42 ATIVIDADE DE PROTEÍNAS DE FUSÃO HFC [00740] In order to investigate additional half-life extension modalities, the sequence-optimized VHH domains CX3CR1BII00306 and CX3CR1BII00307 were produced as fusion proteins with a human IgG1 Fc domain (306D-hFc and 307D-hFc). Two mutations were incorporated into the CH2 domain to abrogate potential Fc-mediated effector function in this construct. 306D-hFc and 307D-hFc were expressed in HEK293T cells or NS0 cells and purified by Protein A affinity chromatography followed by ion exchange chromatography. These molecules were tested for functional activity using the test formats described in Example 7. The results are summarized in Table 42: TABLE 42 HFC FUSION PROTEIN ACTIVITY

[00741] Apesar destas moléculas terem inibido potentemente a ativação de CX3CR1 mediada pela Fractalcina, não apresentaram atividade agonista. Não foram observados aumentos nos níveis de cálcio citosólico com tratamento com até 1 μM destes Nanobodies isolados.[00741] Although these molecules potently inhibited Fractalkine-mediated activation of CX3CR1, they did not exhibit agonist activity. No increases in cytosolic calcium levels were observed with treatment with up to 1 μM of these isolated Nanobodies.

EXAMPLE 13: INHIBITION OF PLAQUE PROGRESSION IN A MOUSE MODEL OF ATHEROSCLEROSIS BY A SEQUENCE-OPTIMIZED ANTI-CX3CR1 NANOBODY

[00742] Camundongos fêmeas hu CX3CR1KI ApoE -/- foram alimentados com uma dieta de alto teor de gordura/alto teor de colesterol contendo 1,5% de colesterol por 16 semanas iniciando em quatro semanas de idade. Depois de 10 semanas, os animais foram administrados por injeção i.p. veículo (20 mM de Citrato de Na pH 6,0, 115 mM de NaCl), 30 mg/kg de CX3CR1BII00313 uma vez ou duas vezes por semana ou 30 mg/kg de CX3CR1BII036 duas vezes por semana por 6 semanas. Os animais foram sacrificados e a percentagem da área de placas na aorta descendente foi quantificada conforme descrito acima. Os resultados deste estudo estão resumidos na Tabela 43: TABELA 43 QUANTIFICAÇÃO DO TAMANHO DE PLACAS NA AORTA DESCENDENTE EM CAMUNDONGOS FÊMEAS HU CX3CR1 KI APO E -/- [00742] Female hu CX3CR1KI ApoE -/- mice were fed a high-fat/high-cholesterol diet containing 1.5% cholesterol for 16 weeks starting at four weeks of age. After 10 weeks, the animals were administered by injection ip vehicle (20 mM Na Citrate pH 6.0, 115 mM NaCl), 30 mg/kg of CX3CR1BII00313 once or twice a week or 30 mg/kg of CX3CR1BII036 twice a week for 6 weeks. The animals were sacrificed and the percentage of plaque area in the descending aorta was quantified as described above. The results of this study are summarized in Table 43: TABLE 43 QUANTIFICATION OF PLAQUE SIZE IN DESCENDING AORTA IN FEMALE HU CX3CR1 KI APO E -/- MICE

[00743] Tanto CX3CR1BII00313 quanto CX3CR1BII036 inibiram significativamente a progressão de placas quando dosados duas vezes por semana. Isto se correlacionou com a cobertura uma vez que os níveis plasmáricos destas moléculas pode ser confirmado como sendo mantido do início ao fim do estudo. Para dosagem uma vez por semana de CX3CR1BII00313, não foram mantidos níveis plasmáricos detectáveis e isto se correlacionou com a falta de eficácia significativa observada depois de 6 semanas de tratamento. Nenhuma molécula afetou significativamente os níveis plasmáticos de colesterol ou trigli- cerídeos.[00743] Both CX3CR1BII00313 and CX3CR1BII036 significantly inhibited plaque progression when dosed twice weekly. This correlated with coverage as plasma levels of these molecules could be confirmed to be maintained throughout the study. For once-weekly dosing of CX3CR1BII00313, no detectable plasma levels were maintained and this correlated with the lack of significant efficacy observed after 6 weeks of treatment. No molecule significantly affected plasma levels of cholesterol or triglycerides.

EXAMPLE 14: ATTACHMENT OF NANOBODY TO CD14+ PRI- HUMAN AND CYNOMOLGUS MONKEY MARIA IN WHOLE BLOOD Competition FACS with formatted sequence-optimized anti-CX3CR1 Nanobody

[00744] De modo a confirmar a ligação do Nanobody anti-CX3CR1 de sequência otimizada formatado a células primárias humanas, foi demonstrado que CX3CR1BII00313 compete pela ligação de CX3CR1BII018 marcado com A647 (A647-018) a células CD14+ em um teste FACS de competição no sangue total. Em resumo, um anticorpo CD14 anti-humano de camundongo conjugado com eFluor 450 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) foi diluído a 1:10 em sangue total tratado com EDTA de um doador humano saudável. 40 μl/ cavidade foi adicionado a placa de fundo redondo de poliestireno de 96 cavidades seguido por 10 μl/ cavidade de CX3CR1BII00313 diluído em Stain Buffer com BSA (BD Pharmingen) em uma concentração final variando de 100 nM a 0,002 pM e as amostras foram incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente. 10 μl/ cavidade de A647-018 em Stain Buffer foi em seguida adicionado para produzir uma concentração final de 1 nM (a EC80 da ligação de A647-018) e as amostras foram incubadas por um adicional de 20 minutos em temperatura ambiente. 220 μl/ cavidade de solução 1-Step Fix/Lyse (eBioscience) foi em seguida adicionado. Depoisa de uma incubação em temperatura ambiente por 10 minutos, as células foram peletizadas, lavadas duas vezes em Stain buffer e ressuspendidas neste tampão. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo BD LSR II. A intensidade de fluorescência média para AlexaFluor 647 foi quantificada para gate a população de células CD14 positivas. CX3CR1BII00313 inibiu potentemente a ligação de A647-018 a células CD14 positivas no sangue humano com uma IC50 de 0,35 nM (n=8).[00744] In order to confirm the binding of the formatted sequence-optimized anti-CX3CR1 Nanobody to primary human cells, CX3CR1BII00313 was shown to compete for the binding of A647-labeled CX3CR1BII018 (A647-018) to CD14+ cells in a competition FACS test at the whole blood. Briefly, an eFluor 450-conjugated mouse anti-human CD14 antibody (eBioscience, San Diego, CA, USA) was diluted 1:10 in EDTA-treated whole blood from a healthy human donor. 40 µl/well was added to a 96-well polystyrene round bottom plate followed by 10 µl/well of CX3CR1BII00313 diluted in BSA Stain Buffer (BD Pharmingen) at a final concentration ranging from 100 nM to 0.002 pM and the samples were incubated for 20 minutes at room temperature. 10 µl/well of A647-018 in Stain Buffer was then added to yield a final concentration of 1 nM (the EC80 of A647-018 binding) and the samples were incubated for an additional 20 minutes at room temperature. 220 µl/well of 1-Step Fix/Lyse solution (eBioscience) was then added. After an incubation at room temperature for 10 minutes, the cells were pelleted, washed twice in Stain buffer and resuspended in this buffer. Samples were analyzed on a BD LSR II flow cytometer. The mean fluorescence intensity for AlexaFluor 647 was quantified to gate the CD14 positive cell population. CX3CR1BII00313 potently inhibited binding of A647-018 to CD14 positive cells in human blood with an IC50 of 0.35 nM (n=8).

[00745] De modo a confirmar a ligação do Nanobody anti-CX3CR1 de sequência otimizada formatado para células primárias de macaco cynomolgus, foi demonstrado que CX3CR1BII00313 compete pela ligação de CX3CR1BII018 marcado com A647 (A647-018) a células CD14+ em um teste FACS de competição no sangue total de macaco cynomolgus. O método usado foi análogo ao método resumido acima com a exceção de que a concentração final de A647-018 foi de 3 nM (a EC80 da ligação de A647-018) e tampão de lise ACK (Life Technologies) foi usado ao invés da solução 1-Step Fix/Lyse. As células foram ressuspendidas em Stain buffer suplementado com 1% de formaldeído antes da análise. CX3CR1BII00313 inibiu potentemente a ligação de A647-018 a células CD14 positivas no sangu de macaco cynomolgus com uma IC50 de 0,43 nM (n=4).[00745] In order to confirm the binding of sequence-optimized anti-CX3CR1 Nanobody formatted to primary cynomolgus monkey cells, CX3CR1BII00313 was shown to compete for the binding of A647-labeled CX3CR1BII018 (A647-018) to CD14+ cells in a FACS assay of competition in cynomolgus monkey whole blood. The method used was analogous to the method summarized above with the exception that the final concentration of A647-018 was 3 nM (the EC80 of A647-018 binding) and ACK lysis buffer (Life Technologies) was used instead of the solution 1-Step Fix/Lyse. Cells were resuspended in Stain buffer supplemented with 1% formaldehyde before analysis. CX3CR1BII00313 potently inhibited binding of A647-018 to CD14 positive cells in cynomolgus monkey blood with an IC50 of 0.43 nM (n=4).

EXAMPLE 15: PHARMACOKINETICS (PK) IN CYNOMOLGUS MONKEYS

[00746] Um estudo farmacocinético foi conduzido em macacos cynomolgus machos naive (Macaca fascicularis) de 2 a 5 anos de idade com uma faixa de peso corporal entre 2,4 a 3,5 kg. Os macados foram divididos em quatro grupos de tratamento. O Grupo 1 (n=3) recebeu 0,2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; Grupo 2 (n=3) recebeu 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v.; Grupo 3 (n=3) recebeu 2 mg/kg de CX3CR1BII00313 s.c. e Grupo 4 (n=3) recebeu 5 mg/kg de CX3CR1BII00313 i.v. CX3CR1BII00313 foi administrado como uma solução a 2 mg/mL em tampão de citrato (20 mM de citrato de só- dio/115 mM de cloreto de sódio, pH 6,0). Amostras de sangue foram coletadas durante 6 semanas a partir de uma veia periférica para tubos de separador de soro para análise farmacocinética.[00746] A pharmacokinetic study was conducted in naïve male cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) aged 2 to 5 years with a body weight range between 2.4 to 3.5 kg. The monkeys were divided into four treatment groups. Group 1 (n=3) received 0.2 mg/kg CX3CR1BII00313 i.v.; Group 2 (n=3) received 2 mg/kg of CX3CR1BII00313 i.v.; Group 3 (n=3) received 2 mg/kg CX3CR1BII00313 s.c. and Group 4 (n=3) received 5 mg/kg CX3CR1BII00313 i.v. CX3CR1BII00313 was administered as a 2 mg/ml solution in citrate buffer (20 mM sodium citrate/115 mM sodium chloride, pH 6.0). Blood samples were collected over 6 weeks from a peripheral vein into serum separator tubes for pharmacokinetic analysis.

[00747] As amostras de soro foram analisadas usando um formato MSD (Meso Scale Discovery). Em resumo, um anticorpo antiNanobody biotinilado foi ligado a uma plac a de estreptavidina padrão MSD (Meso Scale Discovery, Rockville, MD, EUA). As placas foram lavadas com 0,05% de Tween 20 em salina tamponada com fosfato e bloqueadas com 5% em peso/volume de SeraCare BSA (SeraCare Life Sciences, Milford, MA, EUA) antes de incubação com as amostras de soro. CX3CR1BII00313 foi detectado utilizando um Nanobody antiNanobody sulfo-marcado e as placas foram analisadas em um Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Concentrações variáveis de CX3CR1BII0313 de 5000 a 0,5 ng/mL em 5% de soro de macaco foram usadas como padrões. O envolvimento-alvo foi avaliado monitorando os níveis de CX3CR1 livre sobre monócitos CD14+ gated. Este teste foi análogo ao teste FACS de competição resumido no Exemplo 14 com a exceção de que não foi acrescentado nenhum CX3CR1BII00313 adicional. As amostras de soro também foram monitoradas para a presença de anticorpos anti-humanos de primata (PAHA) uma vez que podem impactar a avaliação da farmacocinética e de CX3CR1 livre.[00747] Serum samples were analyzed using an MSD (Meso Scale Discovery) format. Briefly, a biotinylated anti-Nanobody antibody was bound to a standard MSD streptavidin plate (Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA). Plates were washed with 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline and blocked with 5% wt/vol SeraCare BSA (SeraCare Life Sciences, Milford, MA, USA) prior to incubation with the serum samples. CX3CR1BII00313 was detected using a sulfo-labeled antiNanobody Nanobody and the plates were analyzed on a Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Varying concentrations of CX3CR1BII0313 from 5000 to 0.5 ng/ml in 5% monkey serum were used as standards. Target involvement was assessed by monitoring free CX3CR1 levels on gated CD14+ monocytes. This test was analogous to the competition FACS test summarized in Example 14 with the exception that no additional CX3CR1BII00313 was added. Serum samples were also monitored for the presence of primate anti-human antibodies (PAHA) as these may impact the assessment of pharmacokinetics and free CX3CR1.

[00748] ForteBio RED96 foi usado para detecção de PAHA. Em resumo, CX3CR1BII0313 biotinilado foi capturado sobre sensores de estreptavidina. Soro de macaco naive agrupado foi em seguida usado como um controle negativo para calcular o valor de corte (definido como duas vezes acima do sinal de ligação média de soros naive). Todas as amostras de soro foram diluídas 20 vezes em tamção e a resposta de PAHA foi determinada como sendo positiva se o sinal de ligação foi maior do que o valor de corte.[00748] ForteBio RED96 was used for PAHA detection. In summary, biotinylated CX3CR1BII0313 was captured on streptavidin sensors. Pooled naive monkey serum was then used as a negative control to calculate the cut-off value (defined as twice the average binding signal of naive sera). All serum samples were diluted 20-fold in buffer and the PAHA response was determined to be positive if the binding signal was greater than the cut-off value.

[00749] Dados para pontos do tempo depois da detecção de PAHA foram excluídos da análise farmacocinética/farmacodinâmica. Os dados farmacocinéticos estão resumidos na Tabela 44 abaixo. TABELA 44 PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE CX3CR1BII00313 [00749] Data for time points after PAHA detection were excluded from PK/PD analysis. Pharmacokinetic data are summarized in Table 44 below. TABLE 44 PHARMACOKINETIC PARAMETERS OF CX3CR1BII00313

[00750] **dados insuficientes para caracterização da fase terminal[00750] **Insufficient data to characterize the terminal phase

[00751] O clearance e a meia-vida a 2,0 mg/kg i.v. foram de 9,4 mL/d/kg e de 9,6 dias, respectivamente. A 0,2 mg/kg i.v., o clearance foi substancialmente maior (113 mL/d/kg) consistente com far- macocinética de disposição mediada por alvo (TMD) saturável. A AUC(0-14d) dose-ajustada foi comparável entre as doses de 2 e de 5 mg/kg i.v. sugerindo saturação da TMD na dose de 2 mg/kg. A exposição em 2 semanas depois da administração de Nanobody ou i.v. ou s.c. foi > 70 nM e a biodisponibilidade depois de administração s.c. foi de 54%. Receptor livre ratreado com exposição com mais de 90% de cobertura média mantida em exposições > 10 nM.[00751] The clearance and half-life at 2.0 mg/kg i.v. were 9.4 mL/d/kg and 9.6 days, respectively. At 0.2 mg/kg i.v., clearance was substantially higher (113 mL/d/kg) consistent with saturable target-mediated disposition (TMD) pharmacokinetics. The dose-adjusted AUC(0-14d) was comparable between the 2 and 5 mg/kg i.v. doses suggesting TMD saturation at the 2 mg/kg dose. Exposure at 2 weeks after Nanobody administration either i.v. or s.c. was >70 nM and bioavailability after s.c. administration was 54%. Receptor-free traced exposure with greater than 90% average coverage maintained at exposures > 10 nM.

Claims

1. Polypeptide, characterized in that it comprises a unique variable domain of anti-CX3CR1 immunoglobulin (anti-CX3 chemokine receptor 1), said polypeptide capable of blocking the binding of human fractalkine to human CX3CR1, wherein said polypeptide comprises a CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences defined in: - SEQ ID No: 147, 178 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 147, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 148, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 149, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 149, 180 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 149, 181 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 149, 183 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 149, 185 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 150, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 150, 182 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 151, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 151, 182 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 151, 184 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 152, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 153, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 154, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 155, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 156, 181 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 157, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 158, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 159, 178 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 160, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 161, 179 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 213, 221 and 197, respectively; or - SEQ ID No: 213, 214 and 197, respectively.

2. Polypeptide, according to claim 1, characterized by the fact that the unique variable domain of the anti-CX3CR1 immunoglobulin essentially consists of four structural regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) and three complementary determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3).

3. Polypeptide according to claim 1 or 2, characterized in that the unique variable domain of the anti-CX3CR1 immunoglobulin is a VH, VL, VHH, camelized VH or VHH that is optimized for stability, potency, manufacturability and/or similarity to human framework regions.

4. Polypeptide according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said polypeptide comprises a CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences defined in: - SEQ ID No: 147, 178 and 192, respectively ; or - SEQ ID No: 147, 179 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 147, 179 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 148, 179 and 193, respectively; or - SEQ ID No: 149, 179 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 149, 180 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 149, 181 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 149, 183 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 149, 185 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 150, 179 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 150, 182 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 151, 179 and 193, respectively; or - SEQ ID No: 151, 182 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 151, 184 and 196, respectively; or - SEQ ID No: 152, 179 and 195, respectively; or - SEQ ID No: 153, 179 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 154, 182 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 155, 179 and 195, respectively; or - SEQ ID No: 156, 181 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 157, 179 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 158, 179 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 159, 178 and 192, respectively; or - SEQ ID No: 160, 179 and 194, respectively; or - SEQ ID No: 161, 179 and 194, respectively.

5. Polypeptide according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said single variable domain of anti-CX3CR1 immunoglobulin is a VHH domain comprising the defined sequence: a) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; or b) an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 53-120.

6. Polypeptide, according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the polypeptide further comprises a half-life extension moiety.

7. Polypeptide according to claim 6, characterized in that said half-life extension moiety is covalently linked to said polypeptide and is selected from the group consisting of an albumin-binding moiety, such as a anti-albumin immunoglobulin domain, a transferrin binding moiety such as an anti-transferrin immunoglobulin domain, a polyethylene glycol molecule, a recombinant polyethylene glycol molecule, human serum albumin, a fragment of human serum albumin, a peptide binding of albumin or an Fc domain.

8. Polypeptide according to claim 6 or 7, characterized in that said portion of half-life extension consists of a single variable domain of anti-albumin immunoglobulin.

9. Polypeptide according to claim 8, characterized in that the unique variable domain of anti-albumin immunoglobulin comprises a sequence selected from any one of SEQ ID NO's: 230 to 232.

10. Polypeptide according to claim 9, characterized in that the single immunoglobulin variable domain is selected from a VHH domain, a humanized VHH domain, a camelized VH domain, an antibody domain, a single domain antibody and /or "dAb"s.

11. Bacterial, yeast or fungal host cell, characterized in that it comprises a nucleic acid molecule encoding a polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 10, wherein said host cell is capable of expressing said polypeptide .

12. Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises (i) a polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 10, and (ii) a pharmaceutically acceptable vehicle, and optionally (iii) a diluent, an excipient, an adjuvant and/or a stabilizer.

13. Pharmaceutical composition according to claim 12, characterized in that said pharmaceutical composition is suitable for intravenous or subcutaneous injection into a human being.

14. Method of manufacturing a polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 10, characterized in that it comprises the steps of - cultivating a host cell under conditions that allow the expression of a polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 10, wherein said host cell is carrying an expression vector comprising a nucleic acid molecule, said nucleic acid molecule comprising a region encoding a polypeptide as defined in any one of claims 1 to 10 , and wherein said host cell is a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.

15. Method according to claim 14, characterized in that it additionally comprises the steps of - recovering said polypeptide; and - purifying said polypeptide.

16. Polypeptide, according to any one of claims 1 to 10, characterized in that it is for use in the treatment, prevention or mitigation of a disease, disorder or condition in a human being.

17. Polypeptide according to claim 16, characterized in that the disease, disorder or condition is a disease, disorder or condition associated with CX3CR1.

18. Polypeptide, according to claim 17, characterized by the fact that the disease, disorder or condition is selected from cardio- and cerebrovascular atherosclerotic disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis , human crescent glomerulonephritis, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, sclerosis multiplex (MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

19. Polypeptide for use according to claim 17, characterized in that the disease, disorder or condition is atherosclerosis.

20. Diagnostic kit, characterized in that it comprises a polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 10, and one or more means, detection means and/or imaging agents, and optionally, instructions for use; wherein said kit is suitable for diagnosing a disease, disorder or condition characterized by CX3CR1 dysfunction.

21. Diagnostic kit or diagnostic method, according to claim 20, characterized in that it is for the diagnosis of at least one of atherosclerotic cardio- and cerebrovascular disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis , human crescentic glomerulonephritis, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, multiple sclerosis ( in English, MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.

22. Diagnostic method, characterized in that it comprises, from a sample of an individual, the steps of: a) contacting the sample with a polypeptide as defined in any one of claims 1 to 10; b) determine the amount of CX3CR1 in the sample; and c) comparing the amount determined in step (b) with a standard, where a difference in amount from said sample is diagnostic of a disease, disorder, or condition characterized by dysfunction of CX3CR1.

23. Diagnostic method, according to claim 22, characterized in that it is for the diagnosis of at least one of atherosclerotic cardio- and cerebrovascular disorders, peripheral arterial disease, restenosis, diabetic nephropathy, glomerulonephritis, glomerulonephritis human crescent, IgA nephropathy, membranous nephropathy, lupus nephritis, vasculitis including Henoch-Schonlein purpura and Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allograft rejection, systemic sclerosis, neurodegenerative disorders and demyelinating disease, multiple sclerosis ( in English, MS), Alzheimer's disease, lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, neuropathic pain, inflammatory pain, or cancer.