BR122021005965B1 - Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (adamts) - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece meios de cultura que são úteis para a expressão de proteínas ADAMTS, tal como ADAMTS13. Métodos para a expressão e a purificação de proteínas ADAMTS também são fornecidos. Em algumas modalidades, os meios e os métodos da invenção são úteis para a expressão de proteínas ADAMTS tendo altas atividades específicas. Também são fornecidas ADAMTS, por exemplo, ADAMTS13, composições de proteína com altas atividades específicas que são expressas e purificadas de acordo com os métodos fornecidos neste documento.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/230.477 depositado em 31 de julho de 2009, que é expressamente incorporado neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

DECLARAÇÃO QUANTO AOS DIREITOS ÀS INVENÇÕES REALIZADAS MEDIANTE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL NÃO APLICÁVEL REFERÊNCIA A UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS," UMA TABELA A, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR APRESENTADO EM UM DISCO COMPACTO NÃO APLICÁVEL FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] As proteínas ADAMTS (uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina tipo I) são uma família de metaloproteinases que contêm uma série de domínios conservados, incluindo um domínio catalítico dependente de zinco, um domínio rico em cisteína, um domínio tipo desintegrina, e pelo menos um, e na maioria dos casos, múltiplas repetições de trombospondina tipo I (para revisão, ver Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Estas proteínas, que são evolutivamente relacionadas com as famílias ADAM e MMP de metaloproteinases (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol 2006 Feb;. 7 (1) :25-31), são enzimas segregadas que foram ligadas a um número de doenças e condições incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), distúrbios do tecido conjuntivo, câncer, inflamação (Nicholson et al.) e malária grave por Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Devido a estas associações, as enzimas de ADAMTS têm sido reconhecidas como alvos terapêuticos potenciais para um número de patologias (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). Assim, os métodos de produção de grandes rendimentos de proteínas ADAMTS tendo elevadas atividades específicas, que são livres de contaminantes, tais como vírus, BSE, e patógenos tipo bactérias Mycoplasma, são necessários.

[0003] Para a cultura de células, particularmente células eucarióticas, e mais especificamente células de mamífero, existe uma necessidade constante de usar meios de cultura especiais fornecendo substâncias nutrientes que são necessárias para o crescimento eficiente de células e para a produção de produtos biológicos, especialmente biofármacos, tais como, por exemplo, proteínas recombinantes, anticorpos, vírus, antígenos virais, e partículas tipo vírus. Para a produção eficiente de tais produtos biológicos, é importante alcançar uma densidade de células ótima, bem como um aumento da expressão da proteína em si, a fim de obter o rendimento máximo do produto.

[0004] As formulações de meios de cultura de células foram suplementadas com uma faixa de aditivos incluindo componentes indefinidos tipo soro fetal de vitelo (FCS), proteínas derivadas de vários animais e/ou hidrolisados de proteínas de origem bovina, bem como hidrolisados de proteínas derivados de plantas ou de levedura.

[0005] Em geral, as substâncias derivadas de soro ou soro, tais como, por exemplo, albumina, transferrina ou insulina, podem compreender agentes indesejados que podem contaminar os cultivos de células e os produtos biológicos obtidos da mesma. Além disso, aditivos derivados de soro humano têm de ser testados para todos os vírus conhecidos, incluindo os vírus da hepatite e do HIV, que podem ser transmitidos através de soro. Além disso, o soro bovino e produtos derivados do mesmo correm o risco de contaminação por BSE. Além disso, todos os produtos derivados do soro podem ser contaminados por substâncias desconhecidas. Quando se usa soro ou aditivos de proteínas derivados de fontes humanas ou animais em cultura de células, existem numerosos problemas (por exemplo, a qualidade variável na composição de diferentes lotes e o risco de contaminação com micoplasma, vírus ou BSE), particularmente se as células são usadas na fabricação de medicamentos ou vacinas para administração humana.

[0006] Portanto, muitas tentativas têm sido feitas para fornecer sistemas hospedeiros eficientes e condições de cultura, que não requerem soro ou outros compostos de proteína de animal.

[0007] Tais meios livres de soro foram desenvolvidos com base de extratos de proteínas derivados de plantas ou leveduras. Por exemplo, os hidrolisados de soja são conhecidos por serem úteis para os processos de fermentação e podem intensificar o crescimento de muitos organismos, leveduras e fungos exigentes. O WO 96/26266 descreve que digestos de papaic de farinha de soja são uma fonte de carboidrato e nitrogênio e muitos dos componentes podem ser usados em cultura de tecidos. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) descrevem o crescimento e a produtividade promovendo os efeitos da soja definidos e as frações peptídicas de hidrolisado de trigo.

[0008] O WO 96/15231 descreve um meio isento de soro composto por um meio mínimo sintético essencial e um extrato de levedura para a propagação de células de vertebrados e um processo de produção de vírus. Uma formulação de meio composta por um meio de cultura de células basais compreendendo um peptídeo de arroz e um extrato de levedura e um digesto enzimático do mesmo, e/ou um lipídeo planta para o crescimento de células animais é divulgado em WO 98/15614. Um meio compreendendo hidrolisado de soja purificado para o cultivo de células recombinantes é divulgado em WO 01/23527. O WO 00/03000 divulga um meio que compreende um hidrolisado de soja e um extrato de levedura, mas também requer a presença de formas recombinantes de proteínas animais, tais como fatores de crescimento.

[0009] O EP-A-0 481 791 descreve um meio de cultura bioquimicamente definido para a cultura de células CHO projetadas, que é isento de proteína, lipídeo, e carboidrato isolado a partir de uma fonte animal, compreendendo ainda uma insulina recombinante ou análogo de insulina, peptona de soja e putrescina digeridas em papaína a 1% a 0,025 % p/v. O WO 98/08934 descreve um cultivo de células eucarióticas isento de soro compreendendo peptídeos de soja hidrolisada (1-1000 mg/L), 0,01 a 1 mg/L de putrescina e uma variedade de componentes derivados de animais, incluindo albumina, fetuína, vários hormônios e outras proteínas. Neste contexto, deve-se notar que a putrescina também é conhecida por ser constituída em meios padrões tipo DMEM/Ham’s F12 em uma concentração de 0,08 mg/L.

[0010] A planta e/ou hidrolisados e levedura, no entanto, são misturas indefinidas de oligopeptídeos e outros componentes e contaminantes desconhecidos. Além disso, a qualidade em bateladas disponíveis comercialmente de hidrolisados varia extremamente. Como resultado, existem grandes variações na produção de proteínas recombinantes ou produtos virais (uma variação de até um fator de três) como uma função dos lotes de hidrolisados usados ("variação em batelada a lote"). Este inconveniente afeta a proliferação das células, bem como a expressão da proteína de cada célula. O US 2007/0212770 descreve vários meios de cultura quimicamente definidos livres de proteína e livres de oligopeptídeo de animais, que são úteis para a produção em grande escala de produtos biofarmacêuticos de proteína recombinante.

[0011] Um membro da família de ADAMTS, a ADAMTS13, cliva o fator de von Willebrand (vWF) entre os resíduos de Tyr 1605 e Met 1606, uma função responsável pela degradação de multímeros de vWF grandes in vivo. A perda de atividade de ADAMTS13 tem sido associada a certo número de condições, tais como TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4- 14), inflamação aguda e crônica (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74) e, mais recentemente, malária por Plasmodium falciparum grave (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).

[0012] A púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) é um distúrbio caracterizado por microangiopatia trombótica, trombocitopenia e trombose microvascular que pode causar vários graus de isquemia tecidual e infarto. Clinicamente, os pacientes com TTP são diagnosticados por sintomas tais como trombocitopenia, esquizócitos (fragmentos de eritrócitos) e níveis elevados de lactato desidrogenase (Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake J L. von Willebrand factor, ADAMTS13, e thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41:4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).

[0013] Em 1982, Moake et al. verificaram invulgarmente grandes multímeros de fator de von Willebrand (UL-vWF) no plasma dos pacientes com TTP de reincidência crônicas (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma fator VIII:von Willebrand fator multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435). A ligação entre a UL-FvW e TTP ganhou suporte com as verificações independentes por Furlan et al. e Tsai e Lian que a maioria dos pacientes que sofrem de TTP são deficientes em uma metaloprotease de plasma, agora conhecida como sendo ADAMTS13, que cliva o vWF (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient ativity of von Willebrand fator-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3097-3103; Tsai H M, Sussman, I I, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma J J, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand fator mutants R834W e R834Q: inhibition by doxycycline e by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89:1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand fator-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594).

[0014] A protease ADAMTS13 é uma proteína glicosilada de 190 kDa produzida predominantemente pelo fígado (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand fator-cleaving protease e its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand fator-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276:4105941063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver e secreted into the blood: possibly, the von Willebrand fator-cleaving protease; J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand fator-cleaving protease. Blood. 2001; 98:1654-1661).

[0015] As mutações no gene ADAMTS13 têm mostrado causar TTP (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). A TTP idiopática, muitas vezes causada por autoanticorpos que inibem a atividade de ADAMTS-13, é um distúrbio mais comum que ocorre em adultos e crianças mais velhas e podem recorrer em intervalos regulares em 11% a 36% dos pacientes (Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand fator-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594; Furlan M, Lammle B. Deficiency of von Willebrand fator-cleaving protease in familial e acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514).

[0016] Os autoanticorpos não neutralizantes podem também inibir a atividade de ADAMTS13 pela indução da depuração da circulação (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM e IgG antibodies to von Willebrand fator-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). A atividade de ADAMTS13 do Plasma em adultos saudáveis varia de 50% a 178% (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura e the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). Na maioria dos pacientes com TTP familiar ou adquirida, a atividade de ADAMTS13 do plasma está ausente ou é menos do que 5% da atividade normal. Sem tratamento, a taxa de mortalidade para TTP excede 90%, mas a terapia de plasma reduziu a mortalidade para cerca de 20% (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura e the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433).

[0017] O vWF sintetizado em megacariócitos e células endoteliais é armazenado em plaquetas de α grânulos e corpos de Weibel-Palade, respectivamente, como vWF ultra grande (UL-vWF) (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma fator VIII:von Willebrand fator multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol. 1982; 95:355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand fator e the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66:621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand fator released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69:1531-1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand fator is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand fator. Blood. 1989; 73:2074-2076). Uma vez secretada a partir de células endoteliais, tais multimeros de UL-vWF são clivados por ADAMTS13 em circulação em uma série de multímeros menores em sítios de clivagem específicos no interior da molécula de vWF (Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand fator is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand fator multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest. 1991; 88:774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure of von Willebrand fator reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:7503- 7507).

[0018] ADAMTS13 cliva na ligação Tyr842-Met843 no domínio A2 central da subunidade vWF madura e requer zinco ou cálcio para a atividade (Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site direting the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). vWF existe na forma de "bola-de-fio" e filamentosa visto por microscopia eletrônica (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by eletron microscopy e quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem. 1985; 260:8559-8563). Além disso, a microscopia de força atômica confirma que vWF sai em uma conformação globular em condições estáticas e um estado filamentoso desdobrado após a exposição à tensão de cisalhamento (Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand fator. Blood. 1996; 88:2939-2950). Isso pode ocorrer também in vivo, quando uma extremidade do filamento de vWF é ancorado a uma superfície.

[0019] Os trombos de pacientes com TTP consistem em pouca fibrina e principalmente em vWF e plaquetas, sugerindo a agregação de plaquetas mediada por vWF como uma causa de trombose (Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to fator VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38:469-479). Os doentes com TTP reincidente têm multímeros ultra-grandes no plasma. Os multimeros UL-vWF se acumulam ao longo do tempo, porque a persistência do inibidor (Anti- ADAMTS13 Ab) diminui a atividade de ADAMTS13. Os multimeros UL- vWF são hiperativos e desdobram como resultado da tensão de cisalhamento causando a agregação de plaquetas, resultando em trombose intravascular (Tsai H M. Von Willebrand fator, ADAMTS13, e thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80:639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic e thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1:2038-2040; discussion 2040-2035).

[0020] Acredita-se que a presença de multímeros UL-vWF hiperreativos no plasma, devido à deficiência de ADAMTS13 poderia estar associada com um risco aumentado de trombose arterial associada à doença cardíaca coronária.

[0021] Assim como as proteínas ADAMTS têm sido implicadas em várias doenças e condições, há uma necessidade na técnica de métodos de produção em larga escala de proteínas ADAMTS recombinantes tendo atividades específicas elevadas, que são adequadas para a formulação e a administração farmacêutica. A presente invenção fornece métodos que satisfazem estas e outras necessidades na técnica para a produção e purificação de proteínas ADAMTS.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0022] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de expressão de uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina (ADAMTS). Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento vantajosamente resultam em níveis de expressão aumentados e na produção de proteínas ADAMTS com atividades substancialmente melhoradas. Estas propriedades melhoradas podem ser alcançadas, em um exemplo, pelo suplemento do meio de cultura usado para a expressão de proteínas ADAMTS com níveis aumentados de vários componentes, tais como cálcio, zinco, ou nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13.

[0023] Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos para aumentar a expressão e/ou os níveis de atividade de uma proteína ADAMTS pela cultura de células recombinantes que abrigam um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em meios quimicamente definidos e livres de proteína animal sob condições de cultura de células em batelada, batelada alimentada ou contínua. Em algumas modalidades, estes métodos compreendem o uso de cultivo de células em batelada, batelada alimentada, perfusão, ou quimiostato que pode ser realizado em qualquer suspensão de células ou modos aderentes de células. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13.

[0024] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para reduzir a quantidade de perda de atividade durante a purificação de uma proteína ADAMTS. Em certas modalidades, os métodos compreendem tampões de purificação de suplementação com níveis adicionais de cálcio e/ou de zinco. Em uma modalidade específica, os métodos referem-se à estabilização da atividade de uma proteína ADAMTS durante as etapas de ultrafiltração e/ou diafiltração usadas durante a purificação. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13.

[0025] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a métodos de produção de uma proteína ADAMTS com atividade aumentada paro uso na preparação de uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, estes métodos compreendem o uso de meios de cultura quimicamente definidos e/ou livres de proteína animal sob condições adequadas para expressão aumentada de uma proteína ADAMTS tendo atividades aumentadas. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13.

[0026] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece meios livres de proteína animal, livres de oligopeptídeos e quimicamente definidos que são úteis para a expressão de proteínas ADAMTS tendo elevadas atividades específicas. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] Figura 1. Produtividade volumétrica de Frets-vWF73 de ADAMTS13 recombinante humana expressa em células CHO cultivadas em meio isento de proteína animal sob variações de temperatura e condições de pH. Os resultados dos vários experimentos de cultura de células de são mostrados como representações de (A) plotagem de contorno e (B) plotagem de superfície de produtividade volumétrica normalizada de ADAMTS13 FRETS-VWF73 como uma função da temperatura da cultura e do pH.

[0028] Figura 2, Os níveis de atividade específica (FRETS-VWF73/ antígeno por ELISA) de células CHO que expressam ADAMTS13 recombinante humana cultivadas em meio isento de proteína animal sob diferentes condições de temperatura e pH. Os resultados dos vários experimentos de cultura de células são apresentados como representações de (A) plotagem de contorno e (B) plotagem de superfície de atividade específica como uma função do pH e temperatura da cultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução

[0029] As proteínas ADAMTS (isto é, ADAMTS-1 a ADAMTS-20) são uma família de metaloproteinases de zinco secretadas que partilham uma organização de domínio modular comum (para revisão, ver, Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1;11:544-69). Toda a proteína ADAMTS compartilha uma arquitectura de domínio de núcleo comum, consistindo em um peptídeo de sinal, seguido por um pró-domínio, um domínio catalítico de metaloproteinase dependente de zinco, um domínio tipo desintegrina, uma repetição de trombospondina tipo I, um domínio rico em cisteína, e um domínio espaçador domain (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):31493-7). Além disso, todos exceto ADAMTS-4 contêm pelo menos mais um domínio de repetição de trombospondina tipo I, e muitas da proteína ADAMTS contém um ou mais domínios auxiliares adicionais. Notavelmente, tem sido relatado que todas as proteínas ADAMTS aparentam conter pelo menos um sítio de ligação do cálcio e pelo menos um sítio de ligação de zinco localizado dentro do domínio catalítico de metaloproteinase (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).

[0030] Os papéis biológicos para as proteínas ADAMTS têm sido relatados para diversas doenças e condições, incluindo, Antiangiogenesis, fibrose intersticial renal, remodelação óssea, foliculogênese ovariana, aterosclerose, desenvolvimento urogenital e crescimento/remodelação tumoral (ADAMTS-1); síndrome de Ehler-Danlos tipo 7C e dermatopraxis bovino (ADAMTS-2); artrite, aterosclerose e tendinopatia (ADAMTS-4); artrite e glioblastoma (ADAMTS-5); artrite (ADAMTS-7); Antiangiogenese, malignidade cerebral, artrite e aterosclerose (ADAMTS-8), artrite (ADAMTS-9, -12); púrpura trombocitopênica trombótica (ADAMTS-13); e Antitrombose / acidente vascular cerebral (ADAMTS18) (para revisão, ver, Lin e Liu, Open Access Rheumatology Research e Reviews 2009:1 121-131)

[0031] A ADAMTS13 (A13) recombinante foi expressa antes em células de mamífero, no entanto, a atividade específica varia amplamente dependente das condições de cultura de células. Verificou-se que muitos meios de cultura disponíveis comercialmente não são suficientes para a expressão de A13 com elevadas atividades específicas, expressas como a razão de atividade, medidas por ensaio de FRETS-VWF73, para teor de antígeno, tal como determinado por ELISA. Em um aspecto, os métodos fornecidos neste documento são baseados em várias verificações vantajosas que permitem a expressão da cultura de células de A13 tendo níveis aumentados de atividade total e específica.

[0032] Os estudos descritos neste documento demonstram que uma determinada concentração mínima de cálcio no meio de cultura, cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, é necessária para a expressão de A13 ativa. Além disso, verificou-se que, suplementando o meio de cultura com níveis aumentados de zinco, a proteína A13 expressa resultante teve atividades totais e específicas superiores. Por exemplo, em culturas suplementadas com zinco adicional de 2 a 3 vezes a concentração normal, em comparação com concentrações encontradas nos meios padrões definidos quimicamente, tais como meios baseados em DMEM/F12, a atividade específica de A13 foi significativamente aumentada. Além disso, um aumento adicional na atividade específica de A13 pode ser alcançado aumentando a concentração de nicotinamida (vitamina B3) de cerca de 2 mg/L, tal como nos meios baseados em DMEM/F12 padrão, a cerca de 7 mg/L. Pelo cultivo de células de HEK293 ou CHO recombinante em meios suplementados com cálcio, zinco e/ou nicotinamida adicional, as atividades específicas de pelo menos cerca de 500 mU/μg, 1000 mU/μg, a cerca de 2000 mU/μg poderia ser alcançado em culturas de expressão de larga escala de A13 humana recombinante. Estes níveis de atividade específica para proteínas A13 produzidas de forma recombinante não foram relatados anteriormente. Vantajosamente, estes níveis aumentados de atividade A13 foram alcançados em meio quimicamente definido isento de componentes derivados de animais, permitindo a expressão consistente e reprodutível de proteínas ADAMTS em grande escala adequada para a produção de proteínas para a formulação farmacêutica. Além disso, estes meios são ainda livres de proteínas recombinantes, por exemplo, insulina, resultando em produtos que podem ser usados de forma mais segura em formulações farmacêuticas para administração.

[0033] A presente divulgação também fornece métodos que impedem a perda de atividade e atividade específica durante ultra / diafiltração padrão e outra etapas de purificação. Vantajosamente, verificou-se que pela suplementação com tampão usado para a diafiltração com cálcio e de zinco adicional, uma redução significativa na perda de atividade de A13, tal como medida por um ensaio de FRETS-VWF73, poderia ser alcançada.

[0034] Consequentemente, devido à relação de estrutura-função compartilhada entre a família de ADAMTS de metaloproteinases secretadas, os métodos fornecidos pela presente invenção permitem a expressão de todas as proteínas ADAMTS em cultura de células e a recuperação a partir do meio celular.

II. Definições

[0035] Como usado aqui, os termos "vitamina B3", "nicotinamida", "niacinamida", "niacina", e "ácido nicotínico" podem ser usados intercambiavelmente para se referir a qualquer membro da família de vitaminas B3. Assim, qualquer membro desta família pode ser usado para suplementar o meio usado nos métodos da presente invenção.

[0036] Tal como usado neste documento, uma "proteína ADAMTS" refere-se a um polipeptídeo de desintegrina e metaloproteinase com família de motivos trombospondina tipo I de metaloproteinases. Os membros desta família incluem as proteínas humanas ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638), e ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). As proteínas ADAMTS incluem tanto proteínas de comprimento completo quanto polipeptídeos parciais que exibem pelo menos atividade biológica parcial, por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , ou mais da atividade demonstrada pela proteína de comprimento completo, em particular, a atividade de protease demonstrada pela proteína de comprimento completo. Em certos casos, uma proteína ADAMTS será pós- translacionalmente modificada in vivo ou in vitro, por exemplo, por meios enzimáticos ou químicos. Entende-se que as proteínas ADAMTS da presente invenção incluem as isoformas unidas alternativamente, proteínas modificadas conservatimente, proteínas substancialmente idênticas, homólogos, e semelhantes.

[0037] No contexto da presente invenção, uma proteína ADAMTS engloba qualquer membro da família ADAMTS a partir de, por exemplo, um mamífero tal como um primata, humano, macaco, coelho, porco, roedor, camundongo, rato, hamster, gerbil, caninos, felinos, e derivados biologicamente ativos dos mesmos. As proteínas mutantes e variantes de ADAMTS tendo atividade são também abrangidas, tal como são os fragmentos funcionais e proteínas de fusão das proteínas ADAMTS. Além disso, as proteínas ADAMTS da invenção podem ainda compreender tags que facilitam a purificação, a detecção, ou ambos. As proteínas ADAMTS descritas neste docuemnto podem ainda ser modificadas com uma fração terapêutica ou um imageamento adequado da fração in vitro ou in vivo.

[0038] Tal como usado neste documento, uma "proteína ADAMTS13" refere-se a qualquer proteína ou polipeptídeo com atividade de ADAMTS13, particularmente a capacidade para clivar a ligação peptídica entre os resíduos de Tyr-842 e Met-843 de vWF. Em uma modalidade exemplar, uma proteína ADAMTS13 refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é altamente semelhante a de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, pré-pró-proteína) ou aminoácidos 75 a 1427 de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipeptídeo maduro). Em outra modalidade, uma proteína ADAMTS13 refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é altamente semelhante a de NP_620596 (isoforma 2 de ADAMTS13, pré-pró-proteína) ou aminoácidos 75 a 1371 de NP_620594 (isoforma 2 de ADAMTS13, polipeptídeo maduro). Em ainda outra modalidade, as proteínas ADAMTS13 incluem polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos altamente semelhante a de NP_620595 (isoforma 3 de ADAMTS13, pré-pró-proteína) ou aminoácidos 75 a 1340 de NP_620595 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipeptídeo maduro). Como usado neste documento, uma proteína ADAMTS13 inclui variantes naturais com atividade de clivagem de vWF e construtos artificiais com atividade de clivagem de vWF. Tal como usado na presente invenção, ADAMTS13 engloba quaisquer variantes naturais, sequências alternativas, isoformas ou proteínas mutantes que retêm alguma atividade basal. Exemplos de mutações de ADAMTS13 encontradas na população humana incluem, sem limitação, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, muitas das quais foram encontradas associadas com púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). As proteínas ADAMTS13 também incluem polipeptídeos que contêm modificações pós-translacionais. Por exemplo, ADAMTS13 mostrou ser modificada por N-acetilglucosamina (GlcNAc) nos resíduos 614, 667, e 1354, e previu que os resíduos 142, 146, 552, 579, 707, 828, e 1235 podem também ser modificados desta forma.

[0039] As ADAMTS13 recombinantes proteoliticamente ativas podem ser preparadas através de expressão em culturas de células de mamíferos, tal como descrito em Plaimauer et al., (2002, Blood 15;. 100(10):3626-32). e US 2005/0266528, cujas descrições que são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins. Os métodos de cultura recombinante de células que expressam ADAMTS13 são divulgados em Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol 2004 Jan;41 (1):24-33, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins).

[0040] Tal como usado neste documento, "uma unidade de atividade de ADAMTS" é definida como a quantidade de atividade em 1 mL de plasma humano normal agrupado (pooled), independentemente do ensaio a ser usado. Por exemplo, quando a proteína ADAMTS é ADAMTS13. uma unidade de atividade ADAMTS13 FRETS-VWF73 é a quantidade de atividade necessária para clivar a mesma quantidade de substrato FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100) na medida em que é clivada por um mL de plasma humano normal agrupado. Convenientemente, a atividade ADAMTS13 pode ser determinada por ensaios funcionais, tais como ensaios funcionais que empregam peptídeos de fatores de von Willebrand modificados como substrato para ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41). Um método preferido de determinação de atividade de ADAMTS13 humana recombinante está descrito em Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386- 1389). Em uma modalidade, para ser considerada como uma proteína ADAMTS13 como definido acima, um polipeptídeo ou proteína deve ter pelo menos 1% da atividade de clivagem de vWF de ADAMTS13 nativa. Em outras modalidades, uma proteína ADAMTS13 irá conter pelo menos 10% da atividade de ADAMTS13 nativa. Em ainda outras modalidades, uma proteína ADAMTS13 irá conter pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da atividade de ADAMTS13 nativa. A quantidade de uma proteína ADAMTS13 pode também ser determinada pela medição de um antígeno de ADAMTS13, por exemplo, usando o método ELISA descrito em Rieger et al., (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212- 20).

[0041] Tal como usado neste documento, "μg de ADAMTS13" ou "μg de antígeno de ADAMTS13" significa uma quantidade de ADAMTS13 que fornece o mesmo nível de proteína detectável por ensaio de ELISA, tal como 1 mL de plasma humano normal agrupado. Isto é baseado em estimativas publicadas de 1 mg de ADAMTS13 estando presente em 1 mL de plasma humano normal e é, portanto, uma medida aproximada.

[0042] Tal como usado neste documento, o termo "derivado biologicamente ativo", quando usado no contexto de uma proteína ADAMTS, também engloba polipeptídeos obtidos através de tecnologia de DNA recombinante. Isto pode incluir qualquer método conhecido na técnica para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, por exemplo, através de transcrição reversa do RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) a introdução de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, isto é, através de eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo de ditas células transformadas, por exemplo, de um modo contínuo ou em batelada, (iv) expressão de uma proteína ADAMTS, por exemplo, constitutivamente ou mediante indução, e (v) isolamento de dita proteína ADAMTS, por exemplo, a partir do meio de cultura ou pela colheita das células transformadas, de forma a (vi) obter proteína ADAMTS recombinante substancialmente purificada, por exemplo, através de cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, e semelhantes. O termo "derivado biologicamente ativo" inclui também moléculas quiméricas, como, por exemplo uma proteína ADAMTS, ou fragmento funcional da mesma, em combinação com um segundo um polipeptídeo, por exemplo, um domínio Fc de imunoglobulina ou domínio de albumina, a fim de melhorar as propriedades biológicas / farmacológicos tais como, por exemplo, a meia vida da proteína ADAMTS no sistema de circulação de um mamífero, particularmente um humano.

[0043] Tal como usado neste documento, o termo "ultrafiltração" engloba uma variedade de métodos de filtração por membranas em que a pressão hidrostática força um líquido contra uma membrana semipermeável. Os sólidos e solutos suspensos de elevado peso molecular são retidos, enquanto os solutos de baixo peso molecular e água passam através da membrana. Este processo de separação é muitas vezes usado para purificar e concentrar soluções macromoleculares (103-106 Da), especialmente soluções de proteína. Um certo número de membranas de ultrafiltração está disponível, dependendo do tamanho das moléculas que retém. A ultrafiltração é tipicamente caracterizada por um tamanho de poro da membrana entre 2 nm e 0,05 μm e pressões de operação entre 1 e 10 bar e é particularmente útil para a separação de colóides como proteínas a partir de moléculas pequenas tipo açúcares e sais. Em contraste, a nanofiltração é um outro método de filtração conduzido sob pressão normalmente caracterizado por um tamanho de poro de membrana entre 0,5 e 2 nm e pressões de operação entre 5 e 40 bar. A nanofiltração é frequentemente usada para alcançar uma separação entre os açúcares, outras moléculas orgânicas e sais multivalentes, por um lado e os sais monovalentes e água, por outro. Geralmente, a ultrafiltração pode ser realizada em qualquer um dos modos de filtração sem saída (dead-end) ou modo de filtração de fluxo tangencial (TFF).

[0044] Tal como usado neste documento, a "diafiltração" refere-se a um outro método de filtração por membranas, por vezes referido como filtração de fluxo tangencial (TFF), em que o líquido é bombeado tangencialmente ao longo da superfície de uma membrana de ultrafiltração. Tipicamente, o líquido retido é diluído com tampão de diafiltração, depois de passar através da membrana e, subsequentemente, retorna para a membrana em um processo de fluxo contínuo. Geralmente, a diafiltração pode ser realizada em qualquer um dos modos de filtração sem saída ou modo de filtração de fluxo tangencial (TFF). Como tal, um único sistema pode ser usado tanto para as operações de ultrafiltração quanto para as de diafiltração, por exemplo, a primeira concentra a amostra usando ultrafiltração e então realiza troca de tampão por diafiltração.

[0045] Tal como usado neste documento, o termo "poliamina" refere- se a qualquer de um grupo de compostos orgânicos compostos de carbono, nitrogênio e hidrogênio, e contendo dois ou mais grupos amino. Por exemplo, o termo engloba moléculas selecionadas dentre o grupo consistindo em cadaverina, putrescina, agmatina, ornitina, espermina e espermidina.

[0046] Em certas modalidades do meio de cultura quimicamente definido usado para a expressão de uma proteína ADAMTS, a concentração da poliamina está presente em uma concentração que varia de cerca de 0,5 mg/L a cerca de 30 mg/L, ou de cerca de 0,5 mg/L a cerca de 20 mg/L, ou de cerca de 0,5 mg/L a cerca de 10 mg/L, ou de cerca de 1 mg/L a cerca de 10 mg/L, ou de cerca de 2 mg/L a cerca de 10 mg/L, ou de cerca de 2 mg/L a cerca de 8 mg/L, ou de cerca de 2 mg/L a cerca de 5 mg/L no meio. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina, a uma concentração de cerca de 2 mg/L a cerca de 8 mg/L.

[0047] Tal como usado neste documento, o termo "meio quimicamente definido" refere-se a um meio de crescimento sintético em que a identidade e a concentração de todos os componentes são conhecidas. Meios quimicamente definidos não contêm extratos bacterianos, de levedura, animal, ou de plantas, embora eles possam ou não incluir componentes derivados de animais ou de planta individual (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, etc.) Exemplos não limitantes de meios quimicamente definidos comercialmente disponíveis incluem, vários meios EX-CELL® (SAFC Biosciences, Inc.), vários meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mistura de nutriente de Ham (Sigma -Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), e semelhantes. Métodos de preparação de meios de cultura quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, nas patentes US números 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedido de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os efeitos.

[0048] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de oligopeptídeo" refere-se a um meio isento de proteínas que não compreende oligopeptídeos, tais como, por exemplo, oligopeptídeos derivados a partir de um hidrolisado de proteína. Em uma modalidade, o meio não compreende oligopeptídeos tendo vinte ou mais aminoácidos. Em uma modalidade da presente invenção, o meio não compreende oligopeptídeos tendo quinze ou mais aminoácidos. Em outra modalidade da invenção, o meio não compreende oligopeptídeos tendo dez ou mais aminoácidos. Em uma modalidade o meio não compreende oligopeptídeos tendo sete ou mais aminoácidos. Em outra modalidade o meio não compreende oligopeptídeos tendo cinco ou mais aminoácidos. Em ainda outra modalidade o meio não compreende oligopeptídeos tendo três ou mais aminoácidos. De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, o meio não compreende oligopeptídeos tendo dois ou mais aminoácidos. Métodos de preparação de meios de cultura isentos de oligopeptídeos são conhecidos na técnica, por exemplo, nas patenteS US números 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações do Pedidos de Patente US números de 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0049] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de soro" refere-se a um meio de cultura que não é suplementado com um soro de animal. Embora muitas vezes os meios isentos de soro sejam meios quimicamente definidos, os meios isentos de soro podem ser suplementados com animais discretos ou proteínas vegetais ou frações proteicas. Os métodos de preparação de meio de cultura isento soro são conhecidos na técnica, por exemplo, nas patente US números 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedido de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0050] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de proteína animal" refere-se a um meio de cultura que não é suplementado com um soro, proteína, ou fração de proteína de animal. Embora muitas vezes os meios de cultura isentos de proteínas animais sejam meios quimicamente definidoa, os meios de cultura isentos de proteína animal podem conter hidrolisados de plantas ou leveduras. Os métodos de preparação de meio de cultura isentos de proteínas animais são conhecidos na técnica, por exemplo, nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[0051] Um "vetor de expressão" é um construto de ácido nucleico, gerado de forma recombinante ou sintetica, com uma série de elementos de ácidos nucleicos especificados que permite a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico para ser transcrito ligado operativamente a um promotor.

[0052] O termo "heterólogo" quando usado com referência a porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes independentes arranjadas para fazer um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Do mesmo modo, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[0053] Um "promoter" é definido como uma matriz de sequências de controle de ácidos nucleicos que dirige a transcrição de um ácido nucleico. Tal como usado neste documento, um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias próximas do sítio de partida da transcrição, tais como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ser localizados tanto quanto vários milhares de pares de bases a partir do sítio de partida da transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que está ativo na maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que está ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. O termo "operativamente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou uma matriz de sítios de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controle de expressão dirige a transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência de.

[0054] Tal como usado neste documento, o termo "cerca de" denota uma faixa aproximada de mais ou menos 10% a partir de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem "cerca de 20%" engloba uma faixa de 18 a 22%.

III. Expressão de Proteína ADAMTS

[0055] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de expressão de uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina (ADAMTS) possuindo elevada atividade específica. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em meio de cultura suplementado com pelo menos um componente selecionado dentre cálcio, zinco, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade específica, uma proteína ADAMTS é expressa em um meio suplementado com pelo menos dois componentes selecionados a partir de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura é suplementado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura usado para a expressão de uma proteína ADAMTS pode compreender um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido.

[0056] Em um aspecto, os métodos são fornecidos para a produção de uma proteína ADAMTS. Em uma modalidade, os métodos compreendem as etapas de cultura de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura suplementado com pelo menos um de zinco, cálcio e nicotinamida; remoção de uma fração do sobrenadante da cultura; realização de uma etapa de centrifugação ou uma filtração para remover quaisquer células residuais; realização de uma etapa de ultrafiltração para concentrar a proteína ADAMTS; e realização de uma etapa de diafiltração com um tampão compreendendo pelo menos cálcio ou zinco. Em algumas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de 5 mM de cálcio. Em outras modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de 10 μM de zinco. Em uma determinada modalidade da colheita, os sobrenadantes isentos de células ou o tampão de diafiltração contém as combinações de cálcio e de zinco nas concentrações acima mencionadas. Em uma certa modalidade os corte das membranas de ultra e/ou diafiltração podem ser, por exemplo, cerca de 150 kD ou 125 kD ou 100 kD ou 75 kD ou 50 kD ou 30 kD ou 10 kD ou menos do que 10 kD. Em uma certa modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS13 ou um derivado biologicamente ativo da mesma. Em uma modalidade específica, a proteína ADAMTS13 é uma proteína ADAMTS13 humana ou derivado biologicamente ativo da mesma. Em certas modalidades, o meio de cultura usado no método pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido.

[0057] Em uma modalidade, o método compreende ainda uma etapa de purificação selecionada do grupo que consiste em cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade, e cromatografia de interação hidrofóbica.

[0058] Em ainda outra modalidade, a suplementação de zinco pode ser fornecida por adição de um zinco contendo preparação de proteína ou polipeptídeo. Por exemplo, as preparações típicas de insulina contêm zinco em concentrações tais que a suplementação de meio com entre cerca de 1 mg/L e cerca de 10 mg/L de insulina também resulta em suplementação de cerca de 0,03 μM a cerca de 1,5 μM de zinco, tal como calculado a partir da monografia detalhada para Novolin N InnoLet SubQ, insulina humana recombinante, que pode ser encontrado no servidor Medscape. Consequentemente, em uma modalidade, o meio de cultura usado para a expressão de uma proteína ADAMTS pode ser suplementado com uma preparação de insulina contendo zinco.

[0059] O meio basal, que é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3), tal como divulgado neste documento, escolhido para a cultura de linhagem de célula hospedeira não é crítico para a presente invenção e pode ser qualquer um de, ou combinação de, aqueles conhecidos na técnica que são adequados para a cultura de células de mamíferos. Meio tal como Meio de Eagle modificado por Dulbecco, meio F-12 de Ham, Meio Mínimo Essencial de Eagle e meio RPMI-1640 e semelhantes estão comercialmente disponíveis. A adição de fatores de crescimento tais como insulina recombinante é opcional.

[0060] Em uma modalidade, o meio basal usado para o cultivo de uma célula que expressa uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) pode compreender uma mistura de um ou mais meios quimicamente definidos comercialmente disponíveis, por exemplo, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio F-12 de Ham, que foi suplementado com um ou mais componentes diferentes de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Exemplos não limitantes de componentes que podem ser usados para suplementar um meio comercialmente disponível incluem, aminoácidos essenciais (por exemplo, glutamina), surfactantes não iônicos (por exemplo, Synperonic), aminas primárias (por exemplo, etanolamina), poliaminas (por exemplo, putrescina), metais de traços (por exemplo, ferro), e agentes tamponantes (por exemplo, bicarbonato de sódio). Em uma modalidade específica, o meio é um meio de BCS, tal como fornecido na Tabela 1. Em outra modalidade específica, o meio é um meio BACD, por exemplo, meio BACD-A13. Tabela 1. Composição de Meio de BCS de Cultura de Células.

[0061] Historicamente, as células animais têm sido cultivadas em meios contendo soro animal. No entanto, tais meios são incompletamente definidos e carregam o risco de infecção. Aqueles do estado da técnica, portanto, conceberam os meios "isentos de proteína" que são completamente isentos de qualquer proteína ou pelo menos estão isentos de qualquer proteína que não é produzida de forma recombinante. A albumina de soro humano é vulgarmente usada como um suplemento de cultura isento de soro para a produção de proteínas recombinantes. Os meios preferidos incluem os divulgados nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770.

[0062] Opcionalmente, um agente ativo - surfactante não iônico tal como um polipropileno glicol (por exemplo, Pluronic® F-61, Pluronic® F-68, Pluronic® F-71, Pluronic® F-108 ou um Synperonic®) pode ser adicionado ao meio como um agente antiespumante. Este agente é geralmente aplicado para proteger as células contra os efeitos negativos de aeração ("pulverização"). A quantidade de agente ativo - surfactante não iônico pode variar entre 0,05 e 10 g/L, preferencialmente, entre 0,1 e 5 g/L.

[0063] O meio do US 6.936.441 é particularmente bem adequado para o cultivo de células CHO, mas pode ser usado com outras células também. Um meio mais adequado é o meio isento de oligopeptídeo divulgado no Pedido de Patente US 2007/0212770 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare SA). Tabela 2. Concentrações exemplares de zinco, cálcio, e concentração de nicotinamida (vitamina B3) que pode ser usada para suplementar meios de cultura úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS.

*Var. = Variação

[0064] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina (ADAMTS), o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos um de zinco a uma concentração de pelo menos cerca de 2 μM ou cálcio a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 mM. Em uma modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS1. Em uma outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS2. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS3. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS4. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS5. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS6. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS7. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS8. Em uma outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS9. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS10. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS11. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS12. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS13. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS14. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS15. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS16. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS17. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS18. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS19. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS20. Em modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[0065] Em uma modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 2 μM a cerca de 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 5 μM a cerca de 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 0,5 mM de cálcio. Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 0,5 mM e cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 2 μM de zinco e pelo menos cerca de 0,5mM de cálcio.

[0066] Em ainda outras modalidades, verificou-se que a adição de nicotinamida (vitamina B3) intensifica ainda mais a expressão e atividade específica de proteínas ADAMTS na cultura de células. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda pelo menos cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda pelo menos cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).

[0067] Em certas modalidades, o meio de cultura é um meio de cultura isento de proteína animal. Em outra modalidade, o meio de cultura é um meio quimicamente definido. Em certas modalidades, o meio de cultura pode compreender uma ou mais poliaminas. Em uma modalidade particular, a poliamina é a putrescina, por exemplo, a uma concentração de pelo menos 0,5 mg/L. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 8 mg/L putrescina.

[0068] Em certas modalidades, a linhagem de células ou célula usada no cultivo é uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula aviária, ou uma célula de mamífero. Em uma modalidade específica, a linhagem de células é uma linhagem de células humana, uma linhagem de células de hamster, ou uma linhagem de células de murinos. Em uma modalidade mais específica, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO, BHK, ou HEK. Em uma modalidade preferida, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO.

[0069] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína ADAMTS compreende uma sequência de controle operativamente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína ADAMTS. Em uma modalidade, a sequência de controle é um promotor. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor indutível.

[0070] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento compreendem o uso de um sistema de cultivo contínuo de células (isto é, cultivo contínuo de células). Em uma modalidade, o sistema de cultivo contínuo é um sistema de cultivo em quimiostato (isto é, cultivo de células em quimiostato). Em uma outra modalidade, o sistema de cultivo contínuo é um sistema de cultivo em turbidostato (isto é, cultivo de células em turbidostato). Em ainda outra modalidade, o sistema de cultivo contínuo é um sistema de cultivo de perfusão (isto é, cultivo de células com perfusão). Em certas modalidades, o sistema de cultivo contínuo pode ser operado sob um modo de suspensão. Em outras modalidades, o sistema de cultivo contínuo pode ser operado sob um modo aderente. Em certas modalidades, o modo aderente compreende o uso de um microtransportador, por exemplo, um microtransportador poroso.

[0071] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento compreendem o uso de um sistema de cultivo de células em batelada (isto é, cultivo de células em batelada). Em uma modalidade, o sistema de cultivo em batelada é um sistema de cultivo em batelada único (isto é, cultivo de célula em batelada única). Em outra modalidade, o sistema de cultivo em batelada é um sistema de cultivo em batelada alimentada (isto é, cultivo de célula em batelada alimentada). Em ainda outra modalidade, o sistema de cultivo em batelada é um sistema de cultivo em batelada-repetida (isto é, cultivo de células em batelada repetida). Em certas modalidades, o sistema de cultivo em batelada pode ser operado sob um modo de suspensão. Em outras modalidades, o sistema de cultivo em batelada pode ser operado sob um modo aderente. Em certas modalidades, o modo aderente compreende o uso de um microtransportador, por exemplo, um microtransportador poroso.

[0072] Em certas modalidades, a cultura será mantida a uma temperatura entre cerca de 35°C e cerca de 37°C. Em outras modalidades, a cultura será mantida a um pH entre cerca de 6,9 e cerca de 7,3. Em uma modalidade específica, a cultura irá ser mantida a um pH entre cerca de 7,05 e cerca de 7,15.

[0073] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento irão produzir proteínas ADAMTS13 no meio de cultura (isto é, ADAMTS13 expressa) com atividades específicas de, pelo menos, 600U por mg de proteína ADAMTS13. Em outras modalidades, a atividade específica será de pelo menos 800U por mg de proteína ADAMTS13. Em outras modalidades, a atividade específica será de pelo menos 1000U por mg de proteína ADAMTS13. Em outras modalidades, a atividade específica será de pelo menos 1500U por mg de proteína ADAMTS13. Em outras modalidades, a atividade específica será de pelo menos 2000U por mg de proteína ADAMTS13.

[0074] Em outras modalidades, os métodos fornecem culturas que produzem, pelo menos, 400U de atividade de ADAMTS13 por L de cultura por dia (U/ L/D). Em uma modalidade, os métodos fornecem culturas que produzem, pelo menos, 800U de atividade de ADAMTS13 por L de cultura por dia (U/L/D).

A. ADAMTS13

[0075] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS13 tendo atividade específica e/ou total aumentada. Vantajosamente, verificou-se que, pela suplementação de um meio de crescimento com o cálcio, zinco, e/ou nicotinamida (vitamina B3), os polipeptídeos de ADAMTS13 com elevada atividade específica puderam ser expressos de forma recombinante e recuperados a partir de cultura de células.

[0076] Os métodos para a expressão de ADAMTS13 são fornecidos em WO 2009/086309, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins. Esta referência descreve métodos adequados e condições de cultura que podem ser mantidas durante toda a duração da cultura. Como descrito neste documento, os cultivos de células usadas para a expressão de proteínas ADAMTS13 irão geralmente ser mantidas a uma temperatura de ou entre cerca de 34°C e 37°C e um pH de ou entre cerca 6,8 e 7,3.

[0077] As formas de monitoração da temperatura e do pH da cultura são bem conhecidas na técnica e geralmente dependem de sondas que são inseridas no bioreator, ou incluídas em loops através dos quais o meio de cultura é circulado, ou inserido em amostras extraídas do meio de cultura. Sensores de pH em linha (in-line) adequados incluem o sensor Mettler Toledo InPro 3100/125/Pt100 (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). As formas de alteração do parâmetro especificado, a fim de manter o mesmo no nível predefinido são também bem conhecidas. Por exemplo, a manutenção da temperatura constante geralmente envolve o aquecimento ou resfriamento do bioreator ou do meio de alimentação (se for um processo contínuo ou de batelada alimentada); a manutenção do pH constante geralmente envolve a escolha e fornecimento suficiente de um tampão apropriado (tipicamente bicarbonato) e adição de ácido, tal como ácido clorídrico, ou álcali, tal como hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio ou uma mistura dos mesmos, para o meio de alimentação, conforme necessário. É possível que a calibração de uma sonda de pH em linha possa deslocar-se ao longo do tempo, tal como ao longo de períodos de dias ou semanas, durante o qual as células são cultivadas. Nesse caso, pode ser benéfico redefinir a sonda em linha usando medições obtidas a partir de uma sonda calibrada recentemente fora de linha (off-line).

[0078] Em uma modalidade, os métodos compreendem o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em meio de cultura suplementado com pelo menos um componente selecionado dentre cálcio, zinco, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade específica, uma proteína ADAMTS é expressa em um meio suplementado com pelo menos dois componentes selecionados a partir de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura é suplementado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser um meio de cultura isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo ou quimicamente definido.

1. Suplementação com Zinco

[0079] Vantajosamente, verificou-se que a atividade enzimática de ADAMTS13 aumentada e a atividade específica podem ser recuperadas a partir de um cultivo de células crescidas em meio suplementado com zinco. Por exemplo, o Exemplo 1, demonstra que a proteína ADAMTS13 expressa em meio de cultura contendo 1,432 mg/L de ZnSO4 • 7H2O (5 μM de zinco) tem uma atividade específica de 40% a 100% maior do que a proteína ADAMTS13 expressa em meio de cultura contendo apenas 0,432 mg/L de ZnSO4 • 7H2O (1,5 μM de zinco) (comparar, Tabela 10 e Tabela 11). Além disso, este efeito é reprodutível, como mostrado no Exemplo 2 (comparação, a Tabela 13 e Tabela 14); Exemplo 4 (Tabela 16 à Tabela 19), e Exemplo 5 (Tabela 20 e Tabela 21).

[0080] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) tendo uma atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, por exemplo, contendo pelo menos 2 μM de zinco. Do mesmo modo, a presente invenção também fornece métodos para a preparação de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAMTS13) tendo atividade total ou atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, por exemplo, contendo pelo menos 2 μM de zinco.

[0081] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos de ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou cerca dentre 2 μM e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém de ou cerca dentre 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos de ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 DM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco. Faixas de concentração de zinco adequadas são geralmente determinadas por toxicidades de cultura de células que podem ocorrer na presença de concentrações elevadas de zinco, por exemplo, em concentrações maiores que 20 μM, 25 μM, 30 μM, 40 μM,, e semelhantes. Como será entendido pelo versado na técnica, a extensão em que as concentrações de zinco são inibidoras para um sistema de cultivo particular será altamente dependente, entre outros fatores, do tipo de célula usada para expressar uma proteína ADAMTS, dos componentes do meio de cultura usado, e do modo operativo usado para a cultura (por exemplo, batelada vs contínuo; suspensão vs aderente; quimiostato vs perfusão; etc.) Em certos casos, as concentrações mais elevadas de zinco podem ser necessárias onde os componentes do meio de cultura podem sequestrar zinco a partir da solução, por exemplo, nos casos em que o meio de cultura contém albumina. Consequentemente, as faixas de concentração adequadas de zinco são geralmente determinadas pela identidade das células cultivadas, do médio e modo operativo empregado. Uma pessoa versada na técnica será prontamente capaz de determinar os limites superiores adequados para o uso de suplementação de zinco baseado no sistema de cultivo individual empregado.

[0082] Em uma modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM zinco. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal contém de ou cerca dentre 2 μM e 12 μM de zinco. Em uma outra modalidade, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreende de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos de ou cerca de 2 μM, ou pelo menos de ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0083] Em outra modalidade, um método é fornecido para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido contendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido que compreende pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura quimicamente definido contém de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura quimicamente definido contém de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos e ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM ou mais de zinco. Em certas modalidades, o meio quimicamente definido estará isento de polipeptídeos e/ou proteínas derivadas de animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0084] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura que compreende pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético, que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0085] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco, sob condições de cultura contínua ou de batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0086] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C . Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0087] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos cerca 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0088] Em uma modalidade, o meio de cultura usado para a expressão de uma proteína ADAMTS pode ser suplementado com zinco a uma concentração final de pelo menos cerca de 2 μM a pelo menos cerca de 12 μM. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado com zinco a uma concentração final de pelo menos cerca de 2 μM, ou pelo menos cerca de 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, ou níveis mais elevados de zinco. Geralmente, qualquer sal de zinco pode ser usado para suplementar os meios da invenção, exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem, /nSO^7ll2O, /nSO32ll2O, iC..IM) )2/n<2ll2O, ZnBr2, /nBr.-2l I2O, /nCl2, Zn (NO3^6H2O, Zn (HzPO^rHO, (C2H3θ2)2/n-2H2θ, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de zinco é usado para suplementar os meios de cultura da invenção.

2. Suplementação com Cálcio

[0089] Vantajosamente, verificou-se que a atividade enzimática e a atividade específica de ADAMTS13 aumentadas podem ser recuperadas a partir de um crescimento de cultura de células em meio suplementado com cálcio. Meios de cultura de células tradicionais, por exemplo, DMEM/F12, tipicamente continham cerca de 1 mM de cálcio. Iistoricamente, estes níveis elevados de cálcio foram introduzidos no meio para auxiliar os cultivos de células aderentes. Ioje em dia, no entanto, meios comercialmente disponíveis designados para culturas em suspensão contêm níveis de cálcio significativamente inferiores, por exemplo, cerca de 0,1 mM de cálcio. Tais níveis mais baixos de cálcio são invocados para evitar a agregação de células cultivadas por meio de métodos de suspensão. Sabe-se que níveis de cálcio inferiores são suficientes para a propagação de células em suspensão e expressão de proteínas recombinantes, no entanto, os inventores verificaram que estes níveis baixos de cálcio são insuficientes para a expressão das proteínas ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13).

[0090] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) tendo uma atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com cálcio, por exemplo, contendo pelo menos 0,5 mM de cálcio. Do mesmo modo, a presente invenção também fornece métodos para a preparação de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAMTS13) tendo atividade total ou atividade específica aumenta pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com o cálcio, por exemplo, contendo pelo menos 0,5 mM de cálcio.

[0091] Em uma modalidade, um método para expressão de uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

[0092] Em uma modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0093] Em outra modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido que compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura quimicamente definido contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em certas modalidades, o meio quimicamente definido estará isento de polipeptídeos e/ou proteínas derivadas de animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0094] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura que compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM , 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0095] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM , 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio, sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0096] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM , 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0097] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3 . Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM , 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0098] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μ M, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM ou mais zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[0099] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00100] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00101] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM , 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM , 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM , 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende de ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00102] Geralmente, qualquer sal de cálcio pode ser usado para suplementar os meios da presente invenção. Exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem CaCfc, CaCh, CaFPOy2H2O, Ca∑2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3^2H2O, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de cálcio é usado para suplementar os meios de cultura da invenção.

3. Suplementação com Nicotinamida (Vitamina B3)

[00103] Vantajosamente, verificou-se que a atividade enzimática e atividade específica de ADAMTS13 aumentadas podem ser recuperadas a partir de um cultivo de células cultivadas em meio suplementado com nicotinamida (vitamina B3). Por exemplo, o Exemplo 2, demonstra que Proteína ADAMTS13 expressa em meio de cultura contendo 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) tem uma atividade específica 60% maior do que proteína ADAMTS13 expressa em meio de cultura contendo apenas 2 mg/L de nicotinamida (Tabela 13; comparar dias 4 e 7 com o dia 11). Surpreendentemente, este efeito é sinérgico com a suplementação de zinco, na medida em que a expressão de ADAMTS13 em meio contendo 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e 5 μM de zinco resulta em um aumento de 200% a 300% na atividade específica de proteína ADAMTS13 (comparar Tabela 14 dia 11 com a Tabela 13 dias 4 e 7).

[00104] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) tendo uma atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com nicotinamida (vitamina B3), por exemplo, contendo pelo menos 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Do mesmo modo, a presente invenção também fornece métodos para a preparação de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAMTS13) tendo o aumento da atividade total ou atividade específica pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com nicotinamida (vitamina B3), por exemplo, contendo pelo menos 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).

[00105] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). As faixas de concentração de nicotinamida (vitamina B6) adequadas são geralmente determinadas por toxicidades de cultura de células que podem ocorrer na presença de concentrações elevadas de nicotinamida (vitamina B3), por exemplo, em concentrações maiores que 15 mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L, 40 mg/L, e semelhantes. Como será entendido pelo versado na técnica, a extensão em que as concentrações de nicotinamida (vitamina B3) são inibidoras para um sistema de cultivo particular serão altamente dependentes, entre outros fatores, do tipo de célula usada para expressar uma proteína ADAMTS, os componentes do meio de cultura usados, e o modo operativo usado para a cultura (por exemplo, batelado vs contínuo; suspensão vs aderente; quimiostato vs perfusão; etc.) Em certos casos, concentrações de nicotinamida (vitamina B3) mais elevadas podem ser necessárias onde os componentes do meio de cultura podem sequestrar nicotinamida (vitamina B3) a partir da solução. Consequentemente, faixas de concentrações de nicotinamida (vitamina B3) adequadas são geralmente determinadas pela identidade das células cultivadas, o modo operativo e médio empregados. Um versado na técnica será prontamente capaz de determinar os limites superiores apropriados para o uso de suplementação com nicotinamida (vitamina B3) baseado no sistema de cultivo individual empregado.

[00106] Em uma modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00107] Em outra modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido contendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura quimicamente definido que compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura quimicamente definido contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio quimicamente definido estará isento de polipeptídeos e/ou proteínas derivadas de animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00108] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura que compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00109] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), sob condições de cultura contínua ou alimentados-lote. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), sob a cultura contínua ou batelada alimentada condições. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3), sob condições de cultura de batelada alimentada e contínua. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00110] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3), em que o cultivo é mantido de ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00111] Em uma outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), em que o pH do cultivo é mantido a ou sobre entre 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3), em que o pH do cultura é mantida a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00112] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μ M, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00113] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00114] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 5μM de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00115] Em uma outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou superior concentrações de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM zinco. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L , 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 concentrações mg/L, ou superiores de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L , 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00116] Em uma outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00117] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00118] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00119] Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

[00120] Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo cálcio, zinco e nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o zinco está presente no meio de cultura a uma concentração de pelo menos ou cerca de 2 μM, 5 μM, entre 2 μM e 12 μM, entre 5 μM e 12 μM, ou pelo menos 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais. Em certas modalidades, o cálcio está presente no meio de cultura a uma concentração de pelo menos ou cerca de 0,5 mM, 1,5 mM, entre 0,5 e 1,5, ou pelo menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais. Em certas modalidades, nicotinamida (vitamina B3) está presente no meio de cultura a uma concentração de pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 7 mg/L, entre 2 mg/L e de 7 mg/L, ou, pelo menos a ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais.

[00121] Tal como expressamente divulgadas neste documento, e fornecidas como Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 a Tabela 6), qualquer combinação de concentrações dos três componentes (isto é, o zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3)) é contemplada paro uso nos métodos da invenção. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimiostática. Em outra modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Tabela 3. Modalidades exemplares de meios de cultura que contêm pelo menos 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

*Var. = Variação Tabela 4. Modalidades exemplares de meios de cultura contendo pelo menos 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

*Var. = Variação Tabela 5. Modalidades exemplares de meios de cultura contendo entre 2 e 7 mg/L nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

*Var. = Variação Tabela 6. Modalidades exemplares de meios de cultura contendo pelo menos 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

*Var. = Variação

B. Vetores e Células Hospedeiras

[00122] As proteínas recombinantes ADAMTS podem ser produzidas por expressão em qualquer sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado. Exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, as células de mamíferos, tais como as células CHO, COS, HEK 293, BHK, SK- HEP, e HepG2; células de insetos, por exemplo, células SF9 células Sf21, células S2, e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, as proteínas ADAMTS podem ser expressas em células bacterianas, células de levedura, células de insetos, células de aves, as células de mamíferos, e semelhantes. Por exemplo, em uma linhagem de células humana, uma linhagem de células de hamster, ou uma linhagem de células de murinos. Em uma modalidade particular, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO, BHK, ou HEK. Em uma modalidade preferida, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO.

[00123] Em uma modalidade, as células podem ser qualquer célula de mamífero que podem ser cultivadas, preferencialmente, em um processo de fabricação (isto é, pelo menos 1 litro), para produzir uma proteína ADAMTS desejada, tal como ADAMTS13. Exemplos incluem a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhote (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR, tais como o subclone DUKX-B11 (CHO, Uriaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de camundongo Sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africanos (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma humano cervical (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75 ); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Preferencialmente, a linhagem de células é uma linhagem de células de roedores, especialmente uma linhagem de células de hamster, tais como CHO ou BHK.

[00124] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) e pode ser selecionada a partir de vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Em certas modalidades, um vetor de plasmídeo é contemplado paro uso na expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13). Em geral, os vetores plasmídicos contendo sequências de replicon e de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor pode transportar um sítio de replicação, bem como a marcação sequências que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. O plasmídeo compreeenderá uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) operável ligada a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor.

[00125] Um método preferido de preparação de clones de células CHO estáveis que expressam uma proteína ADAMTS recombinante é como segue. Uma linhagem de células DUKX-B11 de CHO deficiente em DHFR é transfectada com um vetor de expressão de DHFR para permitir a expressão da proteína recombinante relevante, essencialmente como descrito na Patente dos US número 5.250.421 (Kaufman et al., Genetics Institute, Inc.). A seleção é realizada pelo crescimento em meios isentos de hipoxantina/timidina (HT) e amplificação da região relevante que codifica a expressão da proteína ADAMTS recombinante e gene DHFR é conseguido através da propagação das células em concentrações crescentes de metotrexato. Quando apropriado, as linhagens de células CHO podem ser adaptadas para o crescimento em meio isento de soro e/ou proteínas, essencialmente como descrito no US 6.100.061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft).

[00126] Em outra modalidade preferida, as células HEK293 estáveis são preparadas pela transfecção com um construto contendo um marcador selecionável de higromicina e seleção de transformantes por resistência aos antibióticos.

[00127] A capacidade de certos vírus para infectar as células ou a entrar nas células através de endocitose mediada por receptor e, para integrar no genoma da célula hospedeira e genes virais expressos de forma estável e eficiente os torna candidatos atrativos para a transferência de ácidos nucleicos estranhos em células (por exemplo, células de mamíferos). Assim, em certas modalidades, um vetor viral é usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. O vetor viral irá compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) operável ligada a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor. Alternativamente, o vetor viral pode não conter uma sequência de controle e em vez disso, dependerá de uma sequência de controle dentro da célula hospedeira para dirigir a expressão da proteína ADAMTS. Exemplos não limitantes de vetores de vírus que podem ser usados para distribuir um ácido nucleico incluem vetores adenovirais, vetores de AAV, e vetores retrovirais.

[00128] Em uma modalidade, um vetor de expressão Adenovírus inclui aqueles que contêm contrutos de sequências de adenovirus suficientes para suportar empacotamento do construto e para finalmente expressar um construto de ADAMTS que tenha sido clonado no mesmo. Vetores adenovirais permitem a introdução de sequências de estranhos até 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).

[00129] Em outra modalidade, um vírus adeno-associado (AAV) pode ser usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. Sistemas de AAV foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094- 6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Os detalhes com relação a geração e uso de vetores rAAV são descritos, por exemplo, nas Patentes US 5.139.941 e 4.797.368, cada uma incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00130] Em uma modalidade, um vetor de expressão retroviral pode ser usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. Estes sistemas foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas e Rubinstein, In: Vetors: A survey of molecular cloning vetors e their uses, Rodriguez e Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). Em uma modalidade específica, o vetor retroviral é um vetor lentiviral (ver, por exemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; Pat U.S. Nos. 6.013.516 e 5.994.136)

[00131] Exemplos não limitantes de vetores para a expressão procariótica incluem plasmídeos tais como pRSET, PET, pBAD, etc., em que os promotores usados em vetores de expressão procarióticos incluem lac, trc, trp, recA, AraBAD, etc.. Exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem : (i) para a expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores, tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc., (ii) para a expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores, tais como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., e (iii) para a expressão em células de mamíferos, tais como vetores de pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e vetores derivados formam sistemas virais, tais como o vírus vaccinia, vírus adeno- associado, virus do herpes, retrovírus, etc., usando promotores, tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, e β-actina.

[00132] Em certas modalidades, os métodos de cultivo de células da invenção podem compreender o uso de um microtransportador. A presente invenção fornece, entre outro aspecto, os métodos de expressão da proteína ADAMTS em grande escala. Em algumas modalidades, os cultivos de células das modalidades podem ser realizadas em biorreatores grandes sob condições adequadas para fornecer elevadas áreas de superfície de cultura específica - volume para alcançar expressão da proteína e densidades celulares elevadas. Um meio para fornecer essasbcondições de crescimento é o uso de microtransportadores para cultura de células em biorreatores de tanque agitado. Em outra modalidade, estes requisitos de crescimento são atendidos através do uso de um cultivo de células em suspensão.

C. Métodos de Cultivo

[00133] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção podem compreender o uso de um sistema de cultivo de células operado sob um modo de operação contínuo ou em batelada. Por exemplo, quando os cultivos de células em batelada são usados, eles podem ser operados sob modo de batelada única, batelada alimentada, ou batelada repetida. Da mesma forma, os cultivos de células contínuos podem ser operados sob, por exemplo, modo de perfusão, turbidostato, ou quimiostato. O cultivo contínuo de células ou em batelada pode ser realizado sob quaisquer condições de aderência ou suspensão. Quando operado sob condições de suspensão, as células serão livremente suspensas e misturadas dentro do meio de cultura. Alternativamente, sob condições de aderência, as células serão ligadas a uma fase sólida, por exemplo, um microtransportador, um microtransportador poroso, transportador de disco, cartucho de cerâmica, fibra oca, folha plana, matriz de gel, e semelhantes.

[00134] Um cultivo em batelada é tipicamente um cultivo de células em larga escala em que um inóculo e célula é cultivado até uma densidade máxima em um tanque ou fermentador, e colhido e processado como uma batelada única. Um cultivo em batelada alimentada é tipicamente um cultivo em batelada que é fornecido tanto com nutrientes frescos (por exemplo, substratos limitantes de crescimento) ou aditivos (por exemplo, precursores de produtos). A solução de alimentação é geralmente altamente concentrada para evitar a diluição do bioreator. Em um cultivo em batelada-repetida, as células são colocadas em um meio de cultura e crescidas até uma densidade de células desejada. Para evitar o início de uma fase de declínio e morte celular, o cultivo é então diluído com meio de crescimento completo antes das células atingirem a sua concentração máxima. A quantidade e a frequência de diluição variam amplamente e dependem das características de crescimento da linhagem de células e conveniência do processo de cultura. O processo pode ser repetido quantas vezes forem necessárias e, a menos que as células e o meio sejam descartadas em subcultura, o volume de cultivo irá aumentar gradualmente à medida em que cada diluição é feita. O aumento de volume pode ser manuseado tendo um reator de tamanho suficiente para permitir as diluições no interior do vaso ou dividindo a cultura diluída em vários vasos. A razão deste tipo de cultura é manter as células em um estado em crescimento de forma exponencial. A subcultura de série é caracterizada pelo fato de o volume de cultivo ser sempre crescente gradualmente, pode haver colheitas múltiplas, as células continuam a crescer e o processo pode continuar por tanto quanto desejado. Em certas modalidades, uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) pode ser recuperada após a colheita do sobrenadante de um cultivo em batelada.

[00135] Um cultivo contínuo pode ser um cultivo em suspensão que é continuamente fornecido com nutrientes pelo influxo de meio fresco, em que o volume de cultivo é geralmente mantido constante pela remoção concomitante de meio gasto. Nos métodos de quimiostato e turbidostato, o meio extraído contém células. Assim, as células restantes no vaso de cultivo de células devem crescer para manter um estado estacionário. No método de quimiostato, a taxa de crescimento é tipicamente controlada por controle da taxa de diluição, isto é, a taxa à qual é adicionado um meio fresco. A taxa de crescimento das células na cultura pode ser controlada, por exemplo, a uma taxa de crescimento submáxima, por alteração da taxa de diluição. Em contraste, no método de turbidostato, a taxa de diluição é ajustada para permitir a taxa de crescimento máxima que as células podem alcançar em determinadas condições de funcionamento, como o pH e a temperatura.

[00136] Em um cultivo de perfusão, o meio extraído é empobrecido de células, que são retidas no vaso de cultivo, por exemplo, por filtração ou por métodos centrífugos que levam à reintrodução das células na cultura. No entanto, as membranas tipicamente usadas para de filtração não retêm 100% das células, e assim uma proporção é removida quando o meio é extraído. Não pode ser crucial operar os cultivos de perfusão em taxas de crescimento muito elevadas, na medida em que a maioria das células é retida no vaso de cultivo.

[00137] O sistema de reator de tanque agitado pode ser usado para cultivos de células contínuos ou em batelada operados em modos de suspensão ou aderentes. Geralmente, o sistema do reator de tanque agitado pode ser operado como qualquer reator de tanque agitado convencional com qualquer tipo de agitador, tal como um tipo Rushton, hidrofólio, de lâmina aguda, ou marinho.

[00138] Os métodos da invenção podem compreender o uso de cultivo de células em batelada alimentada ou cultivo contínuo de células, tais como o cultivo de células por perfusão ou quimiostático, para a expressão de uma proteína ADAMTS. Em certas modalidades, verificou-se que os meios de cultura de batelada alimentada suplementados com zinco em concentrações de até pelo menos cerca de 12 μM forneceram a expressão de uma proteína ADAMTS com atividades específicas aumentadas (Tabela 20). Notavelmente, em culturas de batelada alimentada suplementadas com zinco a uma concentração final de 12 μM, as taxas de crescimento específico de células e atividade total não foram afetadas, enquanto que as atividades específicas das proteínas ADAMTS13 expressas continuaram a aumentar. Isto está em contraste com o que foi observado em experimentos que empregam cultivo de células quimiostático. Nestes experimentos, a suplementação do meio de cultura com zinco a uma concentração final de 5 μM resultou em um aumento da atividade específica de ADAMTS13 no sobrenadante (Tabela 21). No entanto, a níveis mais elevados de suplementação, 8,5 μM e 12 μM, as taxas específicas de crescimento de células e rendimentos totais de proteínas ADAMTS13 foram diminuídas, apesar da atividade específica de ADAMTS13 no sobrenadante da cultura ter permanecido elevada.

[00139] Consequentemente, em uma modalidade dos métodos da invenção compreendem o uso de cultura de células em batelada alimentada com um meio compreendendo zinco a uma concentração de pelo menos ou cerca de 2 μM, pelo menos, ou cerca de 5 μM, de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM, ou entre cerca de 2 μM e 5 μM, ou entre cerca de 5 μM e 12 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em algumas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 5 μM a pelo menos cerca de 12 μM. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido.

1. Cultivo Contínuo

[00140] Vantajosamente, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS, por exemplo, ADAMTS13, com elevada atividade específica de um cultivo contínuo. Estes métodos permitem a expressão e purificação continuada de uma proteína ADAMTS de uma única cultura ao longo de períodos de tempo prolongados. Especificamente, verificou-se que níveis elevados de atividade específica e expressão de proteína ADAMTS13 poderão ser mantidos por pelo menos 53 dias em um biorreator quimiostato de 10L, sob condições previstas pela presente invenção (Exemplo 3, ver, Tabela 15). Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00141] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) com alta especificidade por um período de tempo prolongado. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos ou cerca de 7 dias, ou pelo menos ou cerca de 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos ou cerca de 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos em ou cerca de 2 meses, ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas destas modalidades, o nível de expressão, atividade, ou atividade específica de proteína ADAMTS total é mantido na cultura durante um período prolongado de tempo. Em outras modalidades, a Taxa de crescimento específico, densidade de células, e semelhantes são mantidas na cultura durante um período prolongado de tempo. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado com pelo menos um de cálcio, zinco, ou nicotinamida (vitamina B3), por exemplo, a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9). Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00142] Em uma modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma dos Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 7 dias. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 14 dias. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 21 dias. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 1 mês. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 2 meses. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9), por pelo menos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou mais meses. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00143] Em certas modalidades, os métodos de Expressão de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) podem compreender o uso de cultivo contínuo de células com um meio compreendendo zinco a uma concentração de pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou entre cerca de 2μM e 5 μM de zinco, de ou entre cerca de 3 μM e 5 μM de zinco, ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00144] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura contendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 3 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 5 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 5 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 3 μM de zinco e 5 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 3 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 5 μM de zinco e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00145] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM cálcio por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 1,0 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 1,0 mM e 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00146] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura contendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 5 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2 mg/L e de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 5 mg/L e 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00147] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e cálcio por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00148] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00149] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00150] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00151] Em uma modalidade, o cultivo é mantido a uma densidade de células entre cerca de 0,5x106 e 4x107 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 1,0x107 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/mL por um período de tempo prolongado. Em ainda outras modalidades, a densidade de células podem ser mantidas a uma concentração entre cerca de 2,0x106 e cerca de 4,0x106, ou entre cerca de 1,0x106 e cerca de 2,5x106, ou entre cerca de 1,5x106 e cerca de 3,5x106, ou qualquer outra faixa semelhante, por um período de tempo prolongado. A densidade de células na qual um cultivo de células é mantido para a produção de uma proteína ADAMTS recombinante (por exemplo, ADAMTS13) dependerá das condições de cultura e do meio usado para a expressão da proteína. Um versado na técnica será prontamente capaz de determinar a densidade de células ótima para um cultivo de células produtoras de uma proteína ADAMTS. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00152] Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 500 unidades de atividade de ADAMTS13 por litro de cultura por dia (500 U/L/D), por exemplo, Unidades de atividade de FRETS-VWF73, com uma atividade específica de pelo menos ou cerca de 500 U/mg de A13. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 600 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 700 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 800 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 900 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1000 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1100 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1200 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1300 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1400 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1500 U/L/D. Em ainda outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 2000 U/L/D. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00153] Em outra modalidade, os métodos permitem a expressão prolongada de proteína ADAMTS13 com elevadas atividades específicas, por exemplo, uma atividade específica de pelo menos cerca de 600U/mg de proteína A13, ou pelo menos cerca de 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, ou mais U/mg de proteína A13 por um período prolongado de tempo. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfusão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

2. Cultivo em Batelada

[00154] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAMTS, por exemplo, ADAMTS13, com elevada atividade específica em um cultivo em batelada. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado com pelo menos um de zinco, cálcio, ou nicotinamida (vitamina B3), por exemplo, a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9). Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em batelada única. Em outra modalidade, o método compreende o uso de cultura de células em batelada alimentada. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em batelada repetida. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00155] Em uma modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3), a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 7 dias. Em uma outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 14 dias. Em uma outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 21 dias. Em uma outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 1 mês. Em uma outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 2 meses. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var. 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9), por pelo menos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou mais meses. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00156] Em certas modalidades, os métodos de expressão de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) podem compreender o uso de cultivo de células em batelada repetida ou batelada alimentada com um meio compreendendo zinco a uma concentração de pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou entre cerca de 2 μM e 5 μM de zinco, ou entre cerca de 3 μM e 5 μM de zinco, ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco por pelo menos 7 dias. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00157] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 1,0 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 1,0 mM e 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00158] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura contendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 5 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2 mg/L e de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 5 mg/L e 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00159] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e cálcio, por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00160] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00161] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00162] Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, cálcio, nicotinamida e (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00163] Em uma modalidade, o cultivo é mantido a uma densidade de células entre cerca de 0,5x106 e 4x107 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 1,0x107 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/mL por um período de tempo prolongado. Em ainda outras modalidades, a densidade de células podem ser mantidas a uma concentração entre cerca de 2,0x106 e cerca de 4,0x106, ou entre cerca de 1,0x106 e cerca de 2,5x106, ou entre cerca de 1,5x106 e cerca de 3,5x106, ou qualquer outra faixa semelhante, por um período de tempo prolongado. A densidade de células na qual um cultivo de células é mantido para a produção de uma proteína ADAMTS recombinante (por exemplo, ADAMTS13) dependerá das condições de cultura e do meio usado para a expressão da proteína. Um versado na técnica será prontamente capaz de determinar a densidade de células ótima para um cultivo de células produtoras de uma proteína ADAMTS. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00164] Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 500 unidades de atividade de ADAMTS13 por litro de cultura por dia (500 U/L/D), por exemplo, unidades de atividade de FRETS-VWF73, com uma atividade específica de pelo menos ou cerca de 500 U/mg de A13. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 600 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 700 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 800 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 900 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1000 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1100 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1200 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1300 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1400 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1500 U/L/D. Em ainda outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 2000 U/L/D. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00165] Em outra modalidade, os métodos permitem a expressão prolongada de proteína ADAMTS13 com elevadas atividades específicas, por exemplo, uma atividade específica de pelo menos cerca de 600U/mg de proteína A13, ou pelo menos cerca de 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, ou mais U/mg de proteína A13 por um período prolongado de tempo. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

3. Condições de Cultivo

[00166] Surpreendentemente, também foi verificado que as s de células e as atividades de ADAMTS13 podem ser aumentadas por pequenas variações na temperatura e pH da cultura de células. Como pode ser visto na Figura 2, a atividade específica de ADAMTS13 expressa é grandemente intensificada quando as células que abrigam um nucleotídeo que codifica uma proteína ADAMTS13 são cultivadas a um pH abaixo de cerca de 7,30. A temperatura, embora em menor grau, é também um fator que contribui para a atividade específica de ADAMTS13 nestes estudos. Do mesmo modo, verificou-se que a produtividade volumétrica de A13 (medida por FRETS- VWF73) nos sobrenadantes de culturas crescidas a um pH entre cerca de 6,80 e cerca de 7,3 foi grandemente aumentada em comparação com os níveis de pH acima e abaixo dessa faixa. A produtividade de ADAMTS13 também foi afetada pela temperatura da cultura. A atividade máxima foi verificada em culturas crescidas a uma temperatura entre cerca de 34°C e cerca de 37°C.

[00167] Em outras modalidades, os métodos de expressão de proteína ADAMTS compreendem uma etapa de manter a temperatura do meio de cultura a uma temperatura de cerca de 34°C e cerca de 37°C. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser mantido a uma temperatura de 36,5°C ou menos, 36,0 °C ou menos, 35,5 °C ou menos, ou menos que 35,0 °C. Em uma modalidade específica, a temperatura é mantida a uma temperatura de cerca de 36°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a uma combinação de faixas de temperatura e pH acima mencionadas, por exemplo, 36,5 °C ou menos e um pH de, por exemplo, 7,15 ou menos. Em uma modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma temperatura de 36,0 °C e um pH de 7,10.

[00168] Assim sendo, em algumas modalidades, os métodos de expressão de proteína ADAMTS compreendem uma etapa de manter o pH do meio de cultura a um pH entre cerca de 6,8 e 7,3. Em certas modalidades, o pH pode estar entre cerca de 7,0 e cerca de 7,25 ou entre cerca de 7,05 e cerca de 7,15. Em certas modalidades o pH pode ser mantido a um pH de 7,20 ou menos, 7,15 ou menos, 7,10 ou menos ou 7,05 ou menos. Em uma modalidade específica, o pH do meio de cultura é mantido a um pH de cerca de 7,1,

[00169] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a expressão de uma proteína ADAMTS que compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) a uma temperatura de ou entre cerca de 34°C e cerca de 37°C a um pH de ou entre cerca de 6,8 e 7,3. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35°C e cerca de 37°C e o pH será de ou entre cerca de 6,8 e 7,3. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35,5 °C e cerca de 36,5 °C e o pH será de ou entre cerca de 6,8 e 7,3. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou cerca de 36°C e o pH será de ou entre cerca de 6,8 e 7,3. Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com cálcio. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e cálcio. Em uma modalidade, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura será concentrado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6).

[00170] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para a expressão de uma proteína ADAMTS que compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) a uma temperatura de ou entre cerca de 34°C e cerca de 37°C a um pH de ou entre cerca de 6,9 e 7,25. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35°C e cerca de 37°C e o pH será de ou entre cerca de 6,9 e 7,25. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35,5 °C e cerca de 36,5 °C e o pH será de ou entre cerca de 6,9 e 7,25. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou cerca de 36°C e o pH será de ou entre cerca de 6,9 e 7,25. Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com cálcio. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e cálcio. Em uma modalidade, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura será concentrado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6).

[00171] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para a expressão de uma proteína ADAMTS que compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) a uma temperatura de ou entre cerca de 34°C e cerca de 37°C a um pH de ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35°C e cerca de 37°C e o pH será de ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou entre cerca de 35,5 °C e cerca de 36,5 °C e o pH será de ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou cerca de 36°C e o pH será de ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com cálcio. Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e cálcio. Em uma modalidade, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em outra modalidade, o meio de cultura será suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura será concentrado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6).

[00172] O conceito de crescimento celular em microtransportadores foi primeiro descrito por Wezel (van Wezel AL., Nature 1967 Oct 7;216(5110):64-5) e permite a fixação de células na superfície de pequenas partículas sólidas em suspensão no meio de crescimento. Estes métodos fornecem elevadas razões de superfície para volume e, assim, permitem o uso eficiente de nutrientes. Além disso, para a expressão de proteínas secretadas em linhagens de células eucarióticas, a razão de superfície para volume aumentada permite níveis mais elevados de secreção e, assim, rendimentos de proteína mais elevados no sobrenadante da cultura. Finalmente, estes métodos permitem a fácil ampliação de culturas de expressão eucarióticas.

[00173] As células que expressam uma proteína ADAMTS podem ser ligadas a um microtransportador esférico ou poroso durante o crescimento do cultivo de células. O microtransportador pode ser um microtransportador selecionado dentre o grupo de microtransportadores baseados em dextrano, colágeno, plástico, gelatina e celulose e outros, tal como descrito em Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303). Portanto, de acordo com uma modalidade da invenção as células que expressam uma proteína ADAMTS são cultivadas em microtransportadores esféricos. De acordo com outra modalidade células que expressam uma proteína ADAMTS da invenção são cultivadas em microtransportadores porosos. Também é possível crescer as células para uma biomassa em microtransportadores esféricos e subcultivar as células quando elas tiverem atingido a biomassa do fermentador final e antes da produção da proteína expressa em um microtransportador poroso ou vice-versa. Microtransportador esféricos são aqueles selecionados dentre o grupo de superfície lisa, tais como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, e Cytodex™ 3 (GE Healthcare) e microtransportadores macroporosos, tais como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, e Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

IV. Meios de Cultura

[00174] Em um aspecto, a presente invenção fornece meios de cultura que são úteis para a expressão de proteínas ADAMTS tendo elevadas atividades específicas. Vantajosamente, verificou-se que pela suplementação de um meio de cultura com vários componentes, tais como combinações de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3), que as atividades de enzimas de ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) expressas em células cultivadas no meio são grandemente intensificadas, embora as enzimas sejam expressas em níveis tão elevados, se não mais elevados, que as células cultivadas em meios não suplementados.

[00175] Os métodos de preparação de meios de cultura isentos de proteína animal e quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins. Em uma modalidade, o meio de cultura usado nos métodos descritos neste documento é meio isento de proteína animal ou isento de oligopeptídeo. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser quimicamente definido. Em certas modalidades, meos meios de cultura podem conter pelo menos uma poliamina com uma concentração de cerca de 0,5 mg/L a cerca de 10 mg/L.

[00176] Consequentemente, em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido o qual é suplementado com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em certas modalidades, o meio isento de proteína animal ou isento de oligopeptídeo é preparado tal como ensinado nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins, ambas as quais sendo incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins, e suplementado com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional. Em uma modalidade específica, o meio de cultura quimicamente definido pode ser semelhante ao Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que foi suplementado com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional, a fim de aumentar a atividade específica de uma proteína ADAMTS expressa em uma célula cultivada no meio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura é isento de componente animal. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende proteína, por exemplo, proteína animal a partir de soro, tal como soro fetal de vitelo. Em outra modalidade, a cultura tem proteínas recombinantes exogenamente adicionadas. Em outra modalidade, as proteínas são de um animal isento de patógeno certificado.

[00177] Em certas modalidades, os meios de cultura contém, pelo menos, uma poliamina com uma concentração de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura contém, pelo menos, uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 10 mg/L. Em uma modalidade, o meio de cultura contém, pelo menos, uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em certas modalidades a poliamina é a partir do grupo de ornitina, putrescina, espermina ou espermidina, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida, a poliamina é a putrescina. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L de putrescina.

[00178] Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco.

[00179] Geralmente, qualquer sal de zinco pode ser usado para suplementar os meios da invenção, exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem, ZnSO^HO, ZnSO^HO, (CeHs^zZn^HO, ZnBr2, ZnBr^HO, ZnCh, Zn (NO3)r6H2O, Zn (H2PO4)rHO, (C2H3O2)2Zn« 2H2O, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de zinco é usado para suplementar os meios de cultura da invenção. Em outras modalidades, um peptídeo contendo zinco ou preparação de proteína, por exemplo, insulina, pode ser usada para o suplemento da cultura fornecida neste documento.

[00180] Em outra modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM , 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

[00181] Geralmente, qualquer sal de cálcio pode ser usado para suplementar os meios da presente invenção, exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem CaCh, CaCh, CaFPO3^2H2O, Ca∑2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, iC6ll5OK'a^2ll2O, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de cálcio é usado para suplementar os meios de cultura da invenção.

[00182] Em outra modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3).

[00183] Vantajosamente, verificou-se que pela suplementação de um meio de cultura com zinco e cálcio, a atividade específica da proteína ADAMTS13 expressa no meio de cultura é grandemente aumentada. Consequentemente, em uma modalidade, os meios de cultura fornecidos neste documento para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) pode ser suplementado com zinco e cálcio. Por exemplo, um meio de cultura pode ser suplementado com zinco e cálcio em níveis fornecidos na Tabela 7, isto é, a um nível de acordo com qualquer um de Var. 94 a Var. 113. Tabela 7. Modalidades exemplares de meios de cultura suplementados com zinco e cálcio, que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

*Var. = Variação

[00184] Do mesmo modo, verificou-se que pela suplementação de um meio de cultura com zinco e nicotinamida (vitamina B3), a atividade específica da proteína ADAMTS13 expressa no meio de cultura é sinergicamente aumentada. Por exemplo, este efeito pode ser visto no Exemplo 2 (comparar Tabela 14 dia 11 com a Tabela 13 dias 4 e 7). Consequentemente, em uma modalidade, os meios de cultura fornecidos neste documento para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) podem ser suplementados com zinco e nicotinamida (vitamina B3). Por exemplo, um meio de cultura pode ser suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3) em níveis apresentados na Tabela 8, isto é, a um nível de acordo com qualquer um de Var. 114 a Var. 133. Tabela 8. Modalidades exemplares de meios de cultura suplementados com zinco e nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

Var. = Variação

[00185] Vantajosamente, verificou-se que suplementando um meio de cultura com nicotinamida e cálcio, a atividade específica da protein ADAMTS13 expressa no meio de cultura é grandemente aumentada. Por conseguinte, em uma modalidade, os meios de cultura fornecidos neste documento para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) podem ser suplementados com nicotinamida (vitamina B3) e cálcio. Por exemplo, um meio de cultura pode ser suplementado com nicotinamida (vitamina B3) e cálcio em níveis fornecidos na Tabela 9, isto é, a um nível de acordo com qualquer um de Var. 134 a Var. 149. Tabela 9. Modalidades exemplares de meios de cultura suplementados com nicotinamida (vitamina B3) e cálcio, que são úteis para a expressão de uma proteína ADAMTS13.

Var. = Variação

[00186] Em algumas modalidades, o meio de cultura fornecido pela invenção pode ser fornecido em um líquido ou uma forma seca ou em pó. O meio pode ser pré-aliquotado em uma quantidade adequada para o uso único, ou fornecido em uma maior quantidade que pode ser usada para mais de um cultivo de células. Geralmente, o meio da invenção será fornecido de uma forma estéril. Consequentemente, a presente invenção também fornece kits para a expressão ou produção de uma proteína ADAMTS13, os kits compreendendo um meio de cultura adequado para a expressão de uma proteína ADAMTS tendo elevada atividade específica.

[00187] Em um aspecto, a presente invenção fornece meios de cultura úteis para a expressão da proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) com elevadas atividades específicas. Em uma modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 2 μM a cerca de 12 μM de zinco. Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 5 μM a cerca de 12 μM de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 0,5 mM de cálcio. Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 0,5 mM e cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 2 μM de zinco e pelo menos cerca de 0,5 mM de cálcio.

[00188] Em ainda outras modalidades, verificou-se que a adição de nicotinamida (vitamina B3) intensifica ainda mais a expressão e atividade específica de proteínas ADAMTS na cultura de células. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda pelo menos cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda pelo menos cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).

[00189] Em certas modalidades, o meio de cultura é um meio de cultura isento de proteína animal. Em outra modalidade, o meio de cultura é um meio quimicamente definido. Em certas modalidades, o meio de cultura pode compreender uma ou mais poliaminas. Em uma modalidade particular, a poliamina é a putrescina, por exemplo, com uma concentração de pelo menos 0,5 mg/L. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 8 mg/L de putrescina.

1. Meios de Cultura Isentos de Proteína

[00190] Em certos aspectos, a presente invenção fornece meios de cultura para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que estão isentos de proteína adicionada exogenamente. "Meio de cultura isento de proteína" e termos relacionados refere-se ao meio de cultura que não apresenta proteína que é de uma fonte exógena ou diferente das células na cultura, que naturalmente acolhem proteínas durante o crescimento. Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que é isento de proteínas adicionadas exogenamente (isto é, isento de proteínas) e é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, a meio de cultura isento de proteína contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de pelo menos 2 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios de cultura de proteínas livres são ensinados nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00191] Em uma modalidade, um meio de cultura isento de proteínas que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteínas é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco.

[00192] Em outra modalidade, um meio de cultura isento de proteínasque é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteínas é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

[00193] Em ainda outra modalidade, um meio de cultura isento de proteínas que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), ou de ou entre cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteínas é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L , 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 nicotinamida mg/L, 20 mg/L, ou mais (vitamina B3).

2. Meios de Cultura Isentos de Oligopeptídeos

[00194] Em certos aspectos, a presente invenção fornece meios de cultura para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que são isentas de oligopeptídeos adicionados exogenamente. Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que é isenta de oligopeptídeos adicionados exogenamente (isto é, isenta de polipeptídeo) e é suplementada com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de oligopeptídeo contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios de cultura isentos de oligopeptídeos são ensinados nas Patentes US Números 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00195] Em uma modalidade, um meio de cultura isento de oligopeptídeo que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco, pelo menos, ou cerca de 5 μM de zinco, ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de oligopeptídeo é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco.

[00196] Em outra modalidade, um meio de cultura isento de oligopeptídeo que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de oligopeptídeo é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM , 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais cálcio.

[00197] Em ainda outra modalidade, um meio de cultura isento de oligopeptídeo que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), ou de ou entre cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de oligopeptídeo é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais nicotinamida (vitamina B3).

3. Meios de Cultura Isentos de Soro

[00198] Em certos aspectos, a presente invenção fornece meios de cultura para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que são isentos de soro. Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), o qual é isento de soro adicionado exogenamente (isto é, isento de soro) e é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de soro contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios de cultura isentos de soro são ensinados nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00199] Em uma modalidade, um meio de cultura isento de soro que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 μM zinco pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, no ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de soro é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco.

[00200] Em outra modalidade, um meio de cultura isento de soro que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de soro é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

[00201] Em ainda outra modalidade, um meio de cultura isento de soro que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), ou de ou entre cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de soro é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L , 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 nicotinamida mg/L, 20 mg/L, ou mais (vitamina B3).

4. Meios de Cultura Isentos de Proteína Animal

[00202] Em certos aspectos, a presente invenção fornece meios de cultura para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que são isentos de proteína animal. Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que é isenta polipeptídeos ou proteínas animais exogenamente adicionados (isto é, isenta de proteína animal) e é suplementada com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de proteína animal contém uma poliamina. Por exemplo, uma concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Os meios de cultura isentos de proteínas animais são ensinados nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00203] Em uma modalidade, um meio de cultura isento de proteína animal que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco, no ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM zinco. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteína animal é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais zinco.

[00204] Em outra modalidade, um meio de cultura isento de proteína animal que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteína animal é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

[00205] Em ainda outra modalidade, um meio de cultura isento de proteína animal que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), ou de ou entre cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, um meio de cultura isento de proteína animal é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 nicotinamida mg/L, 20 mg/L, ou mais (vitamina B3).

V. Purificação de Proteína ADAMTS

[00206] ADAMTS13 é secretada no plasma in vivo, onde ela funciona para regular a atividade de coagulação por clivagem de multímeros grandes de vWF. A capacidade das células de mamíferos para secretar ADAMTS13 após expressão pode ser explorada durante a produção e purificação de composições de ADAMTS13 em cultura de células. Por exemplo, pela expressão de ADAMTS13 recombinante em culturas de células de mamífero, as composições de ADAMTS13 podem ser prontamente recuperadas diretamente a partir do sobrenadante de cultura, sem a necessidade de colher e lisar as células. Isto permite o uso de técnicas tais como a cultivo contínuo de células (por exemplo, cultura de células quimiostática ou perfusão) para produzir grandes quantidades da proteína sem períodos de recuperação e retardo de cultura múltipla. Em um aspecto da invenção, são fornecidos métodos para a purificação de proteínas ADAMTS tendo elevada atividade específica a partir da cultura de células.

[00207] Consequentemente, em uma modalidade, as proteínas ADAMTS13 são expressas em cultura e recuperadas diretamente a partir do sobrenadante da cultura. Desta maneira, Pas proteínas ADAMTS13 são recuperadas através da remoção de uma fração da cultura e purificação de ADAMTS13 longe dos outros componentes do sobrenadante. Geralmente, isto envolve a separação de quaisquer células que são recuperadas juntamente com o sobrenadante pela filtração ou centrifugação e submetendo o sobrenadante a uma ou mais etapas de purificação de ADAMTS13.

[00208] A Publicação de Pedido de Patente dos US 2005/0266528 e Zheng et al., (2001, Blood, 98:1662-1666), cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins, fornece métodos exemplares para a purificação de ADAMTS13. ADAMTS13 purificada pode ser formulada de acordo com os métodos convencionais e usada terapeuticamente, por exemplo, para tratar TTP.

[00209] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para produzir uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAMTS13). Em uma primeira modalidade, o método compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura isento de proteína animal, (b) remover uma fração do sobrenadante da cultura, (c) realizar uma etapa de filtração ou centrifugação para remover quaisquer células residuais, (d) realizar uma etapa de ultrafiltração para concentrar a proteína ADAMTS, e (e) realizar uma etapa de diafiltração com um tampão compreendendo pelo menos cerca de 0,5 μM de zinco e pelo menos cerca de 0,1 mM de cálcio; preparando assim uma composição de ADAMTS.

[00210] Em certas modalidades, a etapa de cultivo de célula de uma célula compreende o cultivo de células em batelada. Em outras modalidades, a etapa de cultivo de uma célula compreende o cultivo contínuo de células.

[00211] Em certas modalidades, o meio de cultura contém cálcio. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém, pelo menos, 0,5 mM de cálcio. Em outras modalidades, o meio de cultura contém zinco. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém, pelo menos, 2 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura contém nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém, pelo menos, 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o tampão de diafiltração contém pelo menos cerca de 5 μM de zinco e pelo menos cerca de 2 mM de cálcio.

[00212] Em certas modalidades, menos que cerca de 20% da atividade específica de ADAMTS13 é perdida entre o final da etapa (c) e o final da etapa (e). Em outras modalidades, menos que cerca de 10% da atividade específica de ADAMTS13 é perdida entre o final da etapa (c) e o final da etapa (e). Em ainda outras modalidades, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 1000 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 1500 U/mg.

A. Troca de Tampão

[00213] Tipicamente, ao purificar uma proteína secretada a partir de um sobrenadante de cultura, a primeira etapa do processo de purificação envolve a troca do meio de cultura para uma solução tamponada, o que facilita a purificação adicional da proteína de interesse. Existem várias opções para a troca de meio de cultura por um tampão, incluindo, sem limitação, técnicas de diafiltração, diálise, trocas de tampão, filtração em gel, cromatografia, e semelhantes.

[00214] Verificou-se que as composições de proteína ADAMTS13 perderam uma fração significativa da sua atividade específica durante as tais etapas de purificação que requerem a introdução de novos tampões, por exemplo, etapas de diafiltração, diálise, troca de tampão, cromatografia e semelhantes, independentemente da duração do tempo entre a colheita do sobrenadante da cultura e da etapa de purificação. Vantajosamente, no entanto, os presentes inventores verificaram que, incluindo zinco e cálcio no tampão a ser introduzido no sistema, tal como nas etapas de diafiltração, diálise, troca de tampão, filtração em gel, e cromatográficas, as atividades específicas elevadas da composição de ADAMTS13 são mantidas. Como evidência disto, o Exemplo 6 demonstra que a diafiltração de uma composição de ADAMTS13 com um tampão sem cálcio e zinco resulta falta em uma perda média de cerca de 25% da atividade específica da composição, embora a inclusão de cálcio e de zinco quase inteiramente evite esta perda (Tabela 22). Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para reduzir a perda de atividade para composições de proteína ADAMTS após diafiltração, ou métodos semelhantes, por exemplo, diálise, troca de tampão, cromatografia, pela inclusão de zinco e cálcio no sistema tampão.

[00215] Em uma modalidade, é fornecido um método para a purificação de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), o método compreendendo as etapas de (a) cultivar uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura, (b) recuperar uma porção do sobrenadante de meio de cultura contendo uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), e (c) trocar o sobrenadante do meio de cultura por uma solução tamponada contendo zinco e cálcio, preparando assim uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13). Em uma modalidade, o meio de cultura contém cálcio, zinco e, opcionalmente, nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade preferida, a etapa de cultivar uma célula compreende um cultivo contínuo (por exemplo, cultura quimiostática ou perfusão). Em outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma temperatura entre 34°C e 37°C. Em ainda outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a um pH entre 6,9 e 7,2.

[00216] Em uma modalidade específica, a etapa de troca do sobrenadante do meio de cultura com uma solução tamponada compreende o uso de um tampão contendo, pelo menos, ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em uoutra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Geralmente, qualquer combinação das concentrações acima é adequada paro uso nos presentes métodos.

[00217] Em uma modalidade, é fornecido um método para a troca de tampão de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) pela realização da troca de tampão (por exemplo, diafiltração, diálise, filtração em gel, etc.), com um tampão contendo cálcio e zinco. Em uma modalidade específica, o método compreende o uso de um tampão contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 1 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 1 μM de zinco. Em uma modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, o tampão contém entre 0,5 mM e 5 mM de cálcio e entre 0,5 μM e 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Em uma modalidade determinada da colheita, o sobrenadante isento de células ou o tampão de diafiltração contém as combinações de cálcio e zinco nas concentrações acima mencionadas.

[00218] Em outra modalidade, um método é fornecido para a estabilização da atividade enzimática de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) após expressão em cultura de células compreendendo suplementação da célula contendo a colheita, o sobrenadante isento de células ou um tampão de diafiltração usado para concentrar ou para trocar tampão de uma solução de ADAMTS com cálcio e zinco. Em uma modalidade específica, o método compreende o uso de um tampão contendo, pelo menos, ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Em uma modalidade determinada da colheita, o sobrenadante isento de células ou o tampão de diafiltração contém as combinações de cálcio e zinco nas concentrações acima mencionadas.

[00219] Em outras modalidades, os métodos fornecidos neste documento resultam em uma perda de menos que 15% da atividade específica presente durante qualquer etapa individual. Em uma modalidade preferida, os métodos fornecidos neste documento resultam em uma perda de menos que 10% da atividade específica após presente durante qualquer etapa individual. Em uma modalidade particular, menos que 15% da atividade específica presente no sobrenadante da cultura recuperada é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafiltração ou diálise). Em uma modalidade preferida, menos que 10% da atividade específica presente no sobrenadante da cultura recuperado é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafiltração ou de diálise).

B. Cromatografia

[00220] Em certas modalidades, a composição de proteína ADAMTS, (por exemplo, ADAMTS13) é adicionalmente enriquecida por uma ou mais etapas cromatográficas. Em uma modalidade, é fornecido um método para fornecer uma composição de proteína ADAMTS enriquecida (por exemplo, ADAMTS13), o método compreendendo as etapas de (a) cultivar uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura (b) recuperar uma porção do sobrenadante do meio de cultura contendo uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), (c) trocar o sobrenadante do meio de cultura com uma solução tamponada contendo zinco e cálcio, para formar uma primeira composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), e (d) enriquecer ainda mais a proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) com uma etapa de cromatografia, fornecendo assim uma composição de ADAMTS enriquecida (por exemplo, ADAMTS13). Em uma modalidade, o meio de cultura contém cálcio, zinco e, opcionalmente, nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade preferida, a etapa de cultivo de uma célula compreende um cultivo contínuo (por exemplo, cultura quimiostática ou perfusão). Em outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma temperatura entre 34°C e 37°C. Em ainda outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a um pH entre 6,9 e 7,2.

[00221] Em uma modalidade específica, a etapa de troca do sobrenadante do meio de cultura com uma solução tamponada e/ou a etapa cromatográfica compreende o uso de um tampão contendo, pelo menos, ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em uma modalidade preferida, ambas as etapas compreendem o uso de tampões que contêm pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em uma outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Geralmente, qualquer combinação das concentrações acima é adequada paro uso nos presentes métodos.

[00222] Em uma modalidade, é fornecido um método para a manutenção da atividade específica de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) durante uma etapa de cromatografia, suplementando o(s) tampão(ões) usado na etapa de cromatografia, com zinco e cálcio. Em uma modalidade específica, o método compreende o uso de um tampão contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Geralmente, qualquer combinação das concentrações acima é adequada paro uso nos presentes métodos.

[00223] Exemplos não limitantes de técnicas cromatográficas que podem ser usadas para purificar uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAMTS13) incluem cromatografia de troca aniônica (AEC), cromatografia de troca catiônica (CEC), cromatografia de troca hidrofóbica (HIC), cromatografia de hidroxiapatita (HAP), cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de exclusão de tamanho (isto é, filtração em gel), ou outra etapa cromatográfica adequada. As etapas cromatográficas podem ser realizadas em modo de batelada ou de coluna. Em certas modalidades, os tampões usados para realizar qualquer uma destas técnicas cromatográficas irão incluir zinco e cálcio. Em uma modalidade específica, o método compreende o uso de um tampão contendo, pelo menos, ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μM de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 5 μM, 10 μM ou mais de zinco. Geralmente, qualquer combinação das concentrações acima é adequada paro uso nos presentes métodos.

[00224] Qualquer resina de troca aniônica adequada pode ser usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemplos não limitantes de resinas de troca aniônica adequadas para uso incluem, resinas de dietilaminoetil (DEAE), aminoetil quaternário (QAE) e amônio quaternário (Q).

[00225] Qualquer resina de troca catiônica adequada pode ser usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemplos não limitantes de resinas de troca catiônica adequadas para uso incluem resinas de carboximetil (CM), sulfopropilo (SP), metil sulfonato (S).

[00226] Qualquer resina de troca de hidroxiapatita adequada ou outra resina baseada em cálcio pode ser usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemplos não limitantes de resinas adequadas incluem resinas de hidroxiapatita, resinas de fluorapatita, resinas fluorhidroxiapatita, e semelhantes.

[00227] Qualquer resina de cromatografia de interação hidrofóbica adequada pode ser usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemplos não limitantes de resinas adequadas incluem resinas fenílicas, resinas metílicas, resinas butílicas, resinas octílicas, e semelhantes.

[00228] Em certas modalidades, uma proteína ADAMTS13 (por exemplo, ADAMTS13) pode ser adicionalmente enriquecida por cromatografia de imunoafinidade, por exemplo, com resinas conjugadas a um anticorpo, aptâmero, ou outras moléculas de ligação altamente específicas para a proteína ADAMTS13 (por exemplo, ADAMTS13).

[00229] Em uma modalidade, o método para reduzir a perda de atividade de ADAMTS resulta em uma perda líquida de menos que 20% durante qualquer etapa individual incluindo, mas não limitada a, troca de tampão, diafiltração, diálise, filtração em gel, troca iônica cromatografia, cromatografia de afinidade, nanofiltração, ultrafiltração, filtração estéril, e semelhantes. Em outras modalidades, os métodos fornecidos neste documento resultam em uma perda de menos que 15% da atividade específica presente durante qualquer etapa individual. Em uma modalidade preferida, os métodos fornecidos neste documento resultam em uma perda de menos que 10% da atividade específica após presente durante qualquer etapa individual. Em uma modalidade particular, menos que 15% da atividade específica presente no sobrenadante da cultura recuperado é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafiltração ou diálise). Em uma modalidade preferida, menos que 10% da atividade específica presente no sobrenadante da cultura recuperado é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafiltração ou diálise).

C. Inativação e/ou Remoção Viral

[00230] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento para a preparação de uma composição de ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) irão incluir ainda pelo menos uma etapa de inativação ou remoção viral. Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento incluirão pelo menos duas ou pelo menos três, etapas de inativação ou remoção viral. Exemplos não limitantes de etapas de inativação ou remoção viral que podem ser empregados com os métodos fornecidos neste documento incluem tratamento com detergente solvente (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 e Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, as divulgações dos quais sendo expressamente incorporadas neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins), nanofiltração (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230236 e Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, cujas descrições são expressamente incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins). Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece métodos para a preparação de uma composição de ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) compreendendo o tratamento com detergente solvente e de nanofiltração.

[00231] Em uma modalidade, é fornecido um método para fornecer uma composição de proteína ADAMTS viralmente segura (por exemplo, ADAMTS13), o método compreendendo as etapas de (a) cultivar uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura; (b) recuperar uma porção do sobrenadante do meio de cultura contendo uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), (c) trocar o sobrenadante do meio de cultura com uma solução tamponada contendo zinco e cálcio, para formar uma primeira composição de proteína ADAMTS (por exemplo, a, ADAMTS13); (d) opcionalmente, enriquecer ainda a proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) com uma etapa de cromatografia, e (e) realizar pelo menos uma etapa de inativação ou remoção viral, fornecendo assim uma composição de ADAMTS viralmente segura (por exemplo, ADAMTS13). Em uma modalidade, o meio de cultura contém cálcio, zinco e, opcionalmente, nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade preferida, a etapa de cultivo de uma célula compreende um cultivo contínuo (por exemplo, cultivo quimiostático ou perfusão). Em outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma temperatura entre 34°C e 37°C. Em ainda outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a um pH entre 6,9 e 7,2. Em uma modalidade, a etapa de remoção de vírus é nanofiltração.

1. _Tratamento com Solvente Detergente (S/D)

[00232] A fim de inativar vários contaminantes virais que podem estar presentes na cultura de ADAMTS, uma ou mais soluções intermediárias de ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) podem ser submetidas a um tratamento com solvente detergente (S/D). Métodos para o tratamento com detergente de soluções são bem conhecidos na técnica (para revisão ver, Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42, a divulgação do qual sendo expressamente incorporada neste docuemnto por referência na sua totalidade para todos os fins). Geralmente, qualquer tratamento S/D padrão pode ser usado em conjunto com os métodos fornecidos neste documento. Por exemplo, um protocolo exemplar para um tratamento S/D é fornecido abaixo.

[00233] Em uma modalidade, Triton X-100, Tween-20, e tri (n-butil) fosfato (TNBP) são adicionados a uma solução intermediária ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em concentrações finais de ou cerca de 1,0%, 0,3 %, e 0,3%, respectivamente. A mistura é então agitada a uma temperatura de ou entre cerca de 18°C e 25°C por pelo menos cerca de uma hora.

2. Nanofiltração e Ultra/Diafiltração

[00234] A fim de reduzir a carga viral de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) fornecida neste documento, a composição pode ser nanofiltrada usando um dispositivo de nanofiltração adequado. Em certas modalidades, o dispositivo de nanofiltração terá um tamanho de poro médio de ou entre cerca de 15 nm e 200 nm. Exemplos de nanofiltros adequados para esto uso incluem, sem limitação, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP®, Viresolve NFR® (Millipore), Planova® 15N, 20N, 35N, e 75N (Planova). Em uma modalidade específica, o nanofiltro pode ter um tamanho de poro médio de ou entre cerca de 15 e 72 nm, ou de ou entre cerca de 19 e 35 nm, ou de ou cerca de 15 nm, 19 nm, 20 nm, 35 nm, ou 72 nm. Em uma modalidade preferida, o nanofiltro terá um tamanho médio de poro de ou cerca de 19 nm, 20 nm, ou 35 nm, tais como um filtro Asahi PLANOVA® 20N ou PLANOVA® 35N ou um seu equivalente.

[00235] Subsequente a nanofiltração, o filtrado pode, opcionalmente, ser concentrado por ultrafiltração e/ou a composição do tampão ajustada por diafiltração. Em certas modalidades, a ultrafiltração é transportada em um cassete com uma tela de canal aberto e a membrana de ultrafiltração tem um peso molecular nominal de corte (NMWCO) de menos que ou cerca de 175 kDa ou menos que de ou cerca de 170, 160, 150 , 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menor kDa. Em uma modalidade preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais que 30 kDa. Em outra modalidade preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais que 30 kDa.

3. Tratamento Térmico e Liofilização

[00236] Em ainda outras modalidades, a atividade viral de uma composição de proteína ADAMTS13 liofilizada (por exemplo, ADAMTS13), que pode ter sido previamente submetida a outras etapas de inativação ou remoção viral, tais como nanofiltração, pode ser ainda mais reduzida pelo tratamento térmico da composição liofilizada. Os tratamentos térmicos para a inativação de cargas virais nos fatores de sangue são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver, Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein e Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40).

VI. Composições de ADAMTS

[00237] Vantajosamente, verificou-se que as proteínas ADAMTS, tais como ADAMTS13, expressas em culturas de células suplementadas com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3) tiveram as atividades específicas inesperadamente elevadas. Tal como fornecido neste documento, foram desenvolvidos métodos para a recuperação e expressão contínua de tais proteínas ADAMTS com elevadas atividades específicas. Por exemplo, os métodos de cultura de células contínuas fornecidos neste documento permitem a expressão de mais que 1 mg de ADAMTS13 por litro por dia, com atividades específicas de mais que 1000 U/mg para mais de uma semana ou mais. Do mesmo modo, os métodos para reduzir a perda de atividade tipicamente encontrada durante a purificação de proteína de ADAMTS13 são também fornecidos neste documento.

[00238] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece composições de proteína ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS13) expressas em cultura de células de acordo com os métodos fornecidos neste documento. Por exemplo, as composições de proteínas ADAMTS são fornecidas, em que a proteína é expressa pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em meio de cultura suplementado com pelo menos um componente selecionado dentre cálcio, zinco, e nicotinamida (vitamina B3). Também são fornecidas composições de proteína ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS13) que são purificadas de acordo com um método fornecido neste documento. Por exemplo, as composições de proteínas ADAMTS são fornecidas as quais foram purificadas de acordo com um método compreendendo uma etapa de troca de tampão, em que a troca de tampão inclui zinco e cálcio. Em modalidades preferidas da invenção, a composição de proteína ADAMTS é uma composição de ADAMTS13.

[00239] Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições de proteína ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS13) que são preparadas por um método compreendendo a expressão da proteína ADAMTS em um cultivo de células de acordo com qualquer método fornecido neste documento. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00240] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece composições de proteína ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS13) que são preparadas por um método compreendendo a inclusão de tantode zinco quanto de cálcio, em pelo menos um tampão durante a purificação da proteína ADAMTS a partir de um meio de cultura. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00241] A presente invenção fornece composições de proteína ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS13) preparadas por um método fornecido neste documento. Em uma modalidade, a composição de ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS13) é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em meio de cultura suplementado com pelo menos um componente selecionado dentre cálcio, zinco, e nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade específica, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em meio de cultura suplementado com pelo menos dois componentes selecionados a partir de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outra modalidade, o meio de cultura é suplementado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser um meio de cultura isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00242] Em uma modalidade, uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS13) é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM de zinco. Em outra modalidade, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μM de zinco. Em uma modalidade, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 μM e 12 μM de zinco. Em outra modalidade, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μM e 12 μM de zinco. Em ainda outras modalidades, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μM, ou pelo menos ou cerca de 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, ou mais de zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em outra modalidade, o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua. Em algumas modalidaes específicas, o método é realizado sob condições de cultura em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultivo em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo aderente. Em outra modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo em batelada. Em modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou em batelada alimentada operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou batelada alimentada operada no modo aderente. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00243] Em uma modalidade de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS13), meio de cultura usado para a expressão da proteína ADAMTS pode ser suplementado com zinco a uma concentração final de pelo menos cerca de 2 μM para pelo menos cerca de 12 μM. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado com zinco a uma concentração final de pelo menos cerca de 2 μM, ou pelo menos cerca de 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, ou níveis mais elevados de zinco. Geralmente, qualquer sal de zinco pode ser usado para suplementar os meios da invenção, exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem, ZnSO^HO, ZnSOs^2H2O, (CôH5O7)2Zn3^2H2O, ZnBr2, ZnBr^HO, ZnCl2, Zn (NO3)r6H2O, Zn (H2PO4)rH2O, (C2H3O2)2Zn 2H2O, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de zinco é usado para suplementar os meios de cultura da invenção. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00244] Em outra modalidade, uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS13) é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em ainda outras modalidades, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM , 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma outra modalidade, o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo contínuo. Em algumas modalidaes específicas, o método é realizado sob condições de cultura em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo aderente. Em outra modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo em batelada. Em modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou batelada alimentada operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou batelada alimentada operada no modo de aderente. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00245] Geralmente, qualquer sal de cálcio pode ser usado para suplementar os meios da presente invenção. Exemplos não limitantes de sais aceitáveis incluem CaCfc, CaCh, CaFPOy2H2O, Ca∑2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3^2H2O, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de cálcio é usado para suplementar os meios de cultura da invenção.

[00246] Em outra modalidade, uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS13) é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35°C e 37°C. Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36°C. Em uma outra modalidade, o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo contínuo. Em algumas modalidaes específicas, o método é realizado sob condições de cultura em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em quimiostato, turbidostato, ou perfusão operada no modo aderente. Em outra modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo em batelada. Em modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou batelada alimentada operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições de cultura em batelada única, batelada repetida, ou batelada alimentada operada no modo de aderente. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00247] Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e cálcio. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Var. 113 (Tabela 7). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é um cultivo de perfusão. Em outra modalidade, o cultivo é um cultivo quimiostático. Em outras modalidades, o cultivo é um cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00248] Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco e nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela 8). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é um cultivo de perfusão. Em outra modalidade, o cultivo é um cultivo quimiostático. Em outras modalidades, o cultivo é um cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00249] Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com cálcio e nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentraçõe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é um cultivo de perfusão. Em outra modalidade, o cultivo é um cultivo quimiostático. Em outras modalidades, o cultivo é um cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00250] Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nicotinamida (vitamina B3) serão uma das variações Var. 14 a Var. 93 (Tabela 3 com a Tabela 6). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é um cultivo de perfusão. Em outra modalidade, o cultivo é um cultivo quimiostático. Em outras modalidades, o cultivo é um cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

[00251] Em outra modalidade, as composições de ADAMTS13 são fornecidas com elevadas atividades específicas, por exemplo, uma atividade específica de pelo menos 600 U/mg de proteína A13. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 700 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 800 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 900 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1000 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1100 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1200 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1300 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1400 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1500 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1600 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1700 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1800 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 1900 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2000 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2100 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2200 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2300 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2400 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS13 tem uma atividade específica de pelo menos 2500 U/mg.

VII. Exemplos Exemplo 1

[00252] Os experimentos em batelada alimentada foram realizados usando culturas de bioreatores da linhagem de células HEK293 recombinante 1020/1 013-2 expressando ADAMTS13 humana em meio BACD-A13 quimicamente definido. O efeito de suplementação do meio de cultura com zinco adicional foi investigado.

[00253] As células HEK293 recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram cultivadas por cultivo de células em batelada alimentada em biorreatores de 1,5 L com impulsores de lâmina sob um pH controlado em linha de 7,20 a 37°C com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. A suspensão de células foi transferida para 2 biorreatores idênticos contendo um meio de cultura quimicamente definido com base em DMEM/F12 (BACD-A13; Tabela 12). Os dois cultivos foram crescidos em meios BACD-A13 preparados quer com 0,432 mg/L ZnSO4-7H2O, como em DMEM/F12, ou com um suplemento adicional de 1 mg/L de ZnSO4-7H2O para uma concentração final de 1,432 mg/L. Os dois cultivos em batelada alimentada foram, de outro modo, tratados da mesma forma e, assim, podem ser comparados diretamente um com o outro.

[00254] A atividade de A13 em sobrenadantes de cultura foi medida por ensaio de FRETS-VWF73 após a centrifugação ou filtração dos sobrenadantes para remover células residuais. A quantidade total de A13 foi medida por ELISA, usando um anticorpo específico para A13-(Tabela 10). O sobrenadante da cultura empregando meio BACD-A13 com uma concentração de zinco DMEM/F12 padrão teve uma atividade de A13 de 728 e 826 mU/ml nos dias 3 e 6, respectivamente. As atividades específicas para os cultivos foram 482 mU/μg e 526 mU/μg de A13, respectivamente. Em contraste, os sobrenadantes de culturas com suplemento adicional de Zn, embora tendo rendimentos apenas ligeiramente melhorados de expressão de A13 (7% e 19% maior nos dias 3 e 6, respectivamente), mostraram atividades totais e específicas dramaticamente melhoradas de atividades de A13 (Tabela 11). Como pode ser visto comparando os resultados na Tabela 10 e Tabela 11, a atividade Frets-VWF73 de A13 total foi 118% mais elevada (1589 vs 728) no dia 3 e 61% mais elevada (1381 vs 728) no dia 6 para as culturas crescidas na presença de 1,432 mg/L de ZnSO4-7H2O, em comparação com os cultivos obtidos em 0,432 mg/L de ZnSO4-7H2O. Do mesmo modo, a atividade específica da proteína A13 nos cultivos suplementados foi 104% mais elevada (981 vs 482 mU/μg) no dia 3 e 42% mais elevada (739 vs 526 mU/μg) no dia 6.

[00255] As amostras dos biorreatores foram tomadas e analisadas para A13 por ELISA, a atividade de A13 foi medida por ensaio de FRETS- VWF73. As contagens de células foram determinadas por tecnologia Nucleocounter. As taxas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtividades volumétricas. Tabela 10. Dados de fermentação para batelada alimentada da cultura 1 realizada em um biorreator de 1,5L com meio BACD-A13 sem suplementação de zinco.

Tabela 11. Dados de fermentação para experimento de batelada alimentada realizado em um biorreator de 1,5L com meio BACD-A13 com suplementação de zinco.

Tabela 12. Composição do meio de cultura de células BACD-A13 quimicamente definido.

Exemplo 2

[00256] Os experimentos de atelada alimentada foram realizados usando culturas de bioreatores da linhagem de células CHO recombinante # 938 expressando ADAMTS13 humana em meio BACD-A13 quimicamente definido. O efeito de suplementação do meio de cultura com zinco e/ou vitamina B3 adicional foi investigado.

[00257] As células CHO recombinantes expressando ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio de BCS químicamente definido (meio de BCS). O clone # 938 do Banco de Células de Trabalho de Desenvolvimento # 01 (DWCB # 01) foi descongelado e inóculo celular foi preparado em meio de BCS. As células foram transferidas para dois biorreatores de 1,5 L com impulsores de lâmina e cultivadas sob cultura de células em batelada alimentada em meio BACD-A13 de propriedade com um pH controlado em linha de 7,20 a 37°C, com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. Os dois cultivos foram crescidos em Meios BACD-A13 preparados quer com 0,432 mg/L de ZnSO4-7H2O, como em DMEM/F12, ou com uma suplementação adicional de 1 mg/L de ZnSO4-7H2O para uma concentração final de 1,432 mg/L. Os dois cultivos em batelada alimentada foram, de outro modo, tratados da mesma forma e, assim, podem ser comparados diretamente um com o outro. Os sobrenadantes foram colhidos nos dias 4 e 7 e ensaiados quanto aos níveis de atividade e proteína A13. Após a colheita no dia 7, ambos os cultivos foram suplementados com 5 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) adicional, para uma concentração final de 7,02 mg/L, e cultivados sob condições idênticas por um período adicional de 4 dias. Os sobrenadantes foram novamente colhidos nos dias 11 e os níveis de atividade e proteína A13 foram ensaiados.

[00258] Na primeira cultura, crescimento sem suplementação de zinco, os níveis de atividade de A13 no sobrenadante colhido foram de 642 e 488 mU/ml nos dias 4 e 7, respectivamente (Tabela 13). As atividades específicas para estes sobrenadantes foram 371 e 273 mU/μg nos dias 4 e 7, respectivamente. Como visto anteriormente no exemplo 1, as atividades específicas e totais de A13 no sobrenadante de cultura suplementado com zinco adicional foram significativamente aumentadas (comparar Tabela 13 e Tabela 14 nos dias 4 e 7 da colheita). Como antes, a A13 total produzida em ambas os cultivos foi semelhante, no entanto, A13 a partir do sobrenadante do segundo cultivo, suplementado com zinco adicional, teve 40% e 104% de atividade total maior nos dias 4 e 7, respectivamente, bem como 78 % e 75% de atividade específica maior nos dias 4 e 7 (Tabela 14 vs Tabela 13). Outros parâmetros, incluindo o rendimento de A13 total e a taxa de crescimento celular aparentaram não ser afetados pela suplementação com zinco adicional.

[00259] Após a colheita dos sobrenadantes no dia 7, ambos os cultivos foram ainda suplementados com um adicional de 5 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e cultivados sob condições idênticas por um período adicional de 4 dias. Os sobrenadantes foram colhidos como antes no dia 11. A suplementação com vitamina B3 resultou em um aumento na atividade de FRETS-VWF73 total e a atividade específica de A13 encontrada nos sobrenadantes de ambas os cultivos (Tabela 13 e Tabela 14, dia 11). Notavelmente, estes valores aproximadamente dobraram em ambos os cultivos. No dia 11, o sobrenadante da cultura 2, suplementado com adição de zinco e vitamina B3, demonstrou a atividade total quase 200% maior (2366 vs 791 mU/ml) e atividade específica 174% maior (1189 vs 432 mU/μg) do que demonstrou o sobrenadante colhido a partir de cultura 1.

[00260] A suplementação do meio com nicotinamida individualmente resultou em um aumento de cerca de 60% na atividade total (791 mU/ml vs 488 mU/ml; comparar Tabela 13 nos dias 7 e 11) e atividade específica (432 mU/μg vs 273 mU/μg; comparar Tabela 13 nos dias 7 e 11) de A13, Do mesmo modo, a suplementação do meio com zinco individualmente resultou em aumentos entre cerca de 70% e 80% na atividade total e atividade específica de A13 (comparar Tabela 13 e Tabela 14 nos dias 4 e 7). Surpreendentemente, a suplementação do meio de cultura com nicotinamida e zinco, resultou em um aumento sinérgico entre cerca de 300% a 400% de atividade total (comparar Tabela 14 dia 11 com a Tabela 13 dias 4 e 7) e entre cerca de 200% a 300% de específica atividade (comparar Tabela 14 dia 11 com a Tabela 13 dias 4 e 7) de A13, demonstrando uma interação sinérgica inasperada entre os efeitos de zinco e de nicotinamida. Tabela 13. Dados de fermentação para experimento em batelada CP_07/18_M04: hA13 CHO Klon #985/1 938 DWCB#01.

* BAV-CD-A13; 0,432 mg/L de ZnSO4-7H2O; 2 mg/L de nicotinamida † BAV-CD-A13; 0,432 mg/L de ZnSO4-7H2O; 7 mg/L de nicotinamida Tabela 14. Dados de fermentação para experimento em batelada de CP_07/18_M07: hA13 CHO Klon #985/1 985 DWCB#01.

* BAV-CD-A13; 1,432 mg/L de -7^0; 2 mg/L de nicotinamida † BAV-CD-A13; 1,432 mg/L de ZnSO4-7H2O; 7 mg/L de nicotinamida

Exemplo 3

[00261] Uma cultura de células em quimiostato de linhagem de células CHO recombinante # 640-2 expressando ADAMTS13 humana foi cultivada em meio BACD-A13 quimicamente definido suplementado com zinco adicional e vitamina B3. A cultura de 10L foi mantida durante 53 dias e a produção de atividade e proteína A13 foi monitorada ao longo do tempo.

[00262] As células CHO recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio quimicamente definido de propriedade (meio de BCS). Um frasco de banco de células foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de BCS. As células propagadas a partir do clone de expressão A13 # 640-2 foram transferidas para um biorreator de 10L com impulsores de tipo Rushton e cultivadas em cultivos em batelada repetidas com meio BACD-A13 de propriedade sob um pH controlado de em linha de 7,15-7,20 a 37°C com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. Após 2 bateladas as culturas foram crescidas para o volume de trabalho final de 10L, o bioreator foi mudado para alimentação em meio contínuo no dia 5 e operado por um período adicional de 48 dias em um modo quimiostato.

[00263] As amostras de sobrenadante dos biorreatores foram tomadas semanalmente e analisadas para a produção de proteína A13 por ELISA e atividade de A13 por ensaio de FRETS-VWF73. As contagens de células foram determinadas por tecnologia Nucleocounter. As taxas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtividades volumétricas.

[00264] Sob condições de cultivo contínuo usando meio BACD-A13 quimicamente definido suplementado com zinco e nicotinamida a uma concentração final de 1,432 mg/L de ZnSO4-7H2O e 7,02 mg/L de nicotinamida, os níveis elevados de produção de proteína A13, entre 0,9 e 1,3 mg/L / D, e atividades específicas, entre cerca de 800 e 1100 mU/μg de A13, foram alcançados (Tabela 15). Estes resultados foram consistentes com as atividades específicas e a produção de proteína alcançadas com o clone # 938 CHO tal como no exemplo 2. Notavelmente, as produtividades específicas e volumétricas de célula aumentaram ao longo do tempo na cultura de longo prazo, provavelmente devido ao aumento do crescimento e taxas de diluição ao longo do tempo. A elevada atividade específica de A13 expressa pode ser, pelo menos, mantida a um nível constantemente elevado por pelo menos 7 semanas inteiras que a cultura foi crescida sob condições quimiostática. Na verdade, a atividade específica de A13 produzida na cultura realmente aumentou de cerca de 800 mU/μg de A13 na semana 2 para cerca de 1100 mU/μg de A13 na semana 7. Tabela 15. Dados de fermentação para experimento em cultivo contínuo de CP_07/30_F02: hA13 CHO Klon #987/1 640-2.

Exemplo 4

[00265] Experimentos cultivo de células em batelada alimentada e quimiostato foram realizados usando culturas de bioreatores da linhagem de células CHO recombinantes # 640-2 que expressam ADAMTS13 humana em meio BACD-A13 quimicamente definido. O efeito de suplementação do meio de cultura com diferentes níveis de zinco foi investigado.

[00266] As células CHO recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio de BCS quimicamente definido de peropriedade em modo de batelada alimentada. Resumidamente, DWCB # 05 foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de BCS. As células foram transferidas para um biorreator 1,5 l com impulsores de lâmina e meio BACD-A13 de propriedade suplementado com nicotinamida a uma concentração final de 7 mg/L, mas sem suplementação de zinco sob um pH controlado em linha de 7,20 a 37°C, com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. A suspensão de células em batelada foi então dividida em três biorreatores idênticos contendo meio BACD-A13 suplementado com nicotinamida a uma concentração final de 7 mg/L com diferentes suplementações de Zn (0 mg/L; 0,5 mg/L e 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O para uma concentração final de 0,432 mg/L; 0,932 mg/L, e 1,432 mg/L de ZnSO4-7H2O).

[00267] Os meios BACD-A13 incluíram 0,432 mg/L de ZnSO4-7H2O com ou sem suplementação adicional de zinco. Caso contrário, os cultivos e os meios foram os mesmos e, assim, puderam ser comparados diretamente um com outro. Os cultivos foram crescidos em modo de batelada alimentada por cerca de uma semana, e o sobrenadante foi ensaiado para a produção de proteína A13 e atividade de FRETS-VWF73. Todos os três biorreatores foram então mudados para o modo de cultura em quimiostato e operados durante cerca de 2 semanas sob condições de cultivo contínuo usando os meios com diferentes suplementações de zinco, como descrito acima.

[00268] Sob condições de cultura de batelada alimentada, consistente com os resultados observados nos exemplos 1 e 2, a suplementação do meio com 0,5 mg/L ou 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O aumentou significativamente a atividade específica da proteína A13 no sobrenadante (785 mU/μg, e 876 mU/μg, respectivamente), em comparação com meio não suplementado com zinco adicional (437 mU/μg) (Tabela 16). Como antes, outros parâmetros, incluindo a produção de proteína A13 total e crescimento celular específico, não foram afetados pela suplementação com zinco adicional. Tabela 16. Dados de Fermentação para experimentos de batelada alimentada de expressão de A13 humana em meio com ou sem suplementação de zinco adicional.

[00269] Depois de mudar os biorreatores para o modo de quimiostato, os cultivos foram crescidos sob condições de cultivo contínuo durante cerca de uma semana (semana 2) usando os meios com diferentes suplementações de zinco, como descrito acima. As amostras do sobrenadante dos biorreatores foram tomadas semanalmente e analisadas para a produção de proteína A13 por ELISA e atividade de A13 por ensaio de FRETS-VWF73. Similar aos resultados observados para os cultivos crescidos sob modo de batelada alimentada, a suplementação do meio de crescimento usado para o crescimento de cultivo contínuo com zinco adicional resultou na melhoria substancial de atividades específicas de A13 (697 mU/μg, e 729 mU/μg por 0,5 mg/L e 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O de suplementação, respectivamente) após uma semana, em comparação com nenhuma suplementação (553 mU/μg) (Tabela 17, Tabela 18 e Tabela 19).

[00270] Previamente, foi observado que a atividade específica de A13 expressa em cultivo contínuo de células realmente melhorou durante um período prolongado de tempo (ver, exemplo 3). Para investigar se este resultado poderia ser ou não repetido, os cultivos crescidos em meio suplementado com zinco adicional foram continuados por mais uma semana. Como se vê na Tabela 18 e Tabela 19, a atividade específica de A13 nos sobrenadantes de ambos os cultivos novamente aumentou ao longo do tempo. A atividade específica de A13 encontrada no sobrenadante do meio suplementado com 0,5 mg/L de ZnSO4-7H2O aumentou de 697 mU/mg na semana 2 para 759 mU/mg na semana 3 (Tabela 18). Do mesmo modo, a atividade específica de A13 encontrada no sobrenadante do meio suplementado com 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O aumentou de 729 mU/mg na semana 2 para 812 mU/mg na semana 3 (Tabela 19). Como antes, o crescimento da célula específica não foi afetado pela suplementação com zinco adicional. Notavelmente, no entanto, a produção de proteína A13 aparentou aumentar em ambos os cultivos suplementados com zinco adicional, tal como comparado com a produção em culturas não suplementadas com zinco. Tabela 17. Dados de Fermentação para experimentos de cultivo de células sem suplementação adicional de zinco.

Tabela 18. Dados de Fermentação para experimentos de cultivo de células com 0,5 mg/L de suplementação adicional de zinco.

Tabela 19. Dados de Fermentação para experimentos de cultivo de células com 1,0 mg/L suplementação adicional de zinco.

Exemplo 5

[00271] Experimentos de cultivo de células em batelada alimentada e quimiostato foram realizados usando culturas de bioreatores de linhagem de células CHO recombinantes # F6 expressando ADAMTS13 humana em meio BACD-A13 quimicamente definido. O efeito de suplementação do meio de cultura com níveis mais elevados de zinco foi investigado.

[00272] As células CHO recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio quimicamente definido de propriedade, meio de BCS, em modo de batelada alimentada. As populações adaptadas foram subclonadas e um clone # F6 foi derivado das mesmas.

[00273] Resumidamente, DWCB # 19 foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de BCS. As células foram transferidas para três biorreatores de 1,5L com impulsores de lâmina e em meio BACD-A13 de propriedade suplementado com 1,0 mg/L, 2,0 mg/L, e 3,0 mg/L de ZnSO4-7H2O para concentrações finais de 1,432 mg/L, 2,432 mg/L, e 3,432 mg/L de ZnSO4-7H2O, respectivamente. Os cultivos foram cultivados sob um pH controlado em linha de 7,15 a 36°C, com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar.

[00274] Os cultivos foram crescidos em modo de batelada repetida (3 bateladas) por cerca de uma semana e o sobrenadante foi ensaiado para a produção de proteína A13 e atividade de FRETS-VWF73. Todos os três biorreatores foram então mudados para o modo de cultura de quimiostato e operados durante 10 dias sob condições de cultivo contínuo usando diferentes meios com suplementações de zinco, como descrito acima.

[00275] Em condições de cultura em batelada alimentada, a suplementação dos meios de cultura com quantidades crescentes de zinco aumentou ainda mais a atividade específica de A13 secretada no sobrenadante de cultura. Consistente com os resultados anteriores relatados acima, a suplementação do meio com um adicional de 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O resultou em uma elevada atividade específica de 806 mU/μg. Aumentos adicionais na concentração de zinco, isto é, a suplementação com 2,0 mg/L e 3,0 mg/L, resultou em níveis ainda mais elevados de atividade específica de A13 (880 mU/μg, e 889 mU/μg, respectivamente) (Tabela 20). Como antes, outros parâmetros, incluindo a produção de proteína A13 total e crescimento específico de células, não foram afetados pela suplementação com zinco adicional. Tabela 20. Dados de Fermentação para experimentos em batelada with suplementação adicional de zinco (media de dados de 3 bateladas).

[00276] Depois de mudar os biorreatores para o modo de quimiostato, os cultivos foram crescidos sob condições de cultivo contínuo, durante 10 dias, usando os meios com diferentes suplementações de zinco, como descrito acima. As amostras do sobrenadante dos biorreatores foram analisadas para a produção de proteína A13 por ELISA e atividade de A13 por ensaio de FRETS-VWF73. Ao contrário dos resultados observados para os cultivos crescidos sob modo de batelada alimentada, a suplementação do meio de crescimento usado para o crescimento de cultivo contínuo com níveis mais elevados de zinco resultou em uma diminuição da taxa de crescimento específico e viabilidade celular total. A cultura de quimiostato cultivada em meio suplementado com um adicional de 1,0 mg/L de ZnSO4-7H2O continuou a exibir a viabilidade celular elevada (88,6%) e uma Taxa de crescimento específico (0,256 por dia) (Tabela 21) consistente com os resultados anteriores descritos acima.

[00277] Em contraste, os cultivos crescidos em meios suplementados com níveis mais elevados de ZnSO4-7H2O, 2,0 mg/L e 3,0 mg/L, exibiram reduções significativas nos níveis de viabilidade celular (72,1% e 80,4%, respectivamente) e taxas específicas de crescimento (0,091 e 0,134 por dia, respectivamente). Notavelmente, no entanto, a atividade específica de A13 nos dois sobrenadantes de cultura permaneceu elevada (863 mU/μg, e 771 mU/μg, respectivamente) (Tabela 21). Tabela 21. Dados de fermentação para experimentos de cultivo de células em quimiostato com suplementação adicional de zinco

Exemplo 6

[00278] A proteína humana A13 foi expressa na linhagem de células CHO recombinante # 640-2, em um meio BACD-A13 quimicamente definido suplementado com zinco adicional e nicotinamida em biorreatores de 50 L. Após a colheita dos sobrenadantes dos cultivos, a comparação das etapas de ultra / diafiltração (50kD) usando tampões com e sem zinco e cálcio foi realizada.

[00279] As células CHO recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio quimicamente definido de propriedade, meio de BCS. Resumidamente, um DWCB foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de BCS. As células foram transferidas via um biorreator de 10L para um biorreator de 50L com impulsores do tipo Rushton e cultivadas em modo de quimiostato em meio BACD-A13 de propriedade sob um pH controlado de em linha de 7,15-7,20 a 37°C, com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar.

[00280] Os sobrenadantes dos biorreatores foram filtrados e as colheitas isentas de células foram ultrafiltradas usando uma membrana PES de 50 kD (fator de concentração de aproximadamente 1:10) e então diafiltradas com 5 volumes de um tampão contendo 50 mM de NaCl e 20 mM de TRIS em pH 7,7. O tampão de diafiltração com ou sem 2 mM de Ca e 5 μM de Zn foi comparado para determinar o efeito sobre a perda de ativida entre a diafiltração e a purificação cromatográfica.

[00281] As atividades específicas, registradas como mU de FRETS- VWF73 por μg de A13 detectado por ELISA, foram determinadas imediatamente após a diafiltração e logo antes de carregar a amostra para purificação adicional. As amostras foram armazenadas entre cerca de 2 e 8 °C durante um tempo máximo de 3 dias (cerca de menos que 80 horas). Quando as amostras foram armazenadas por longos períodos de tempo, foram mantidas a menos que -15 °C entre o final da diafiltração e o início da cromatografia. As amostras foram medidas e comparadas imediatamente após diafiltração e logo antes de carregar a coluna cromatográfica.

[00282] Apesar do tempo de manutenção relativamente curto entre as etapas de ultra / diafiltração e as etapas de purificação adicionais, uma perda significativa de atividade específica de A13 (23,3%) ocorreu quando o tampão de diafiltração não apresentou zinco e cálcio. Em contraste, quando o tampão de diafiltração contendo 2mM de Ca e 5 μM de Zn foi usado, a perda de atividade específica de A13 (7,3%) foi grandemente reduzida (Tabela 22). Tabela 22. Resultados de experimentos de diafiltração usando tampão de diafiltração com e sem cálcio e zinco

Exemplo 7

[00283] Os métodos de cultivo de células contínuo em quimiostato e perfusão foram comparados para determinar a produção relativa e as específicas de A13 expressas em várias linhagens de celulares CHO recombinantes.

[00284] Resumidamente, diferentes clones de células CHO recombinantes expressando A13 recombinante humana foram adaptados a um meio quimicamente definido de propriedade (BCS), que foi usado para a preparação de inóculos. As células foram ainda cultivadas em culturas de bioreatores em meio BACD-A13 de propriedade suplementado com zinco e nicotinamida em concentrações finais de 1,432 mg/L de ZnSO4-7H2O e 7,02 mg/L de nicotinamida. Os inóculos a partir de cada clone de células foram então transferidos para dois biorreatores, dos quais um foi cultivado sob condições quimiostática (CST) e a outro sob perfusão, como indicado na Tabela 23. As células foram cultivadas a uma densidade entre cerca de 2x106 e 4x106 células/mL em microtransportadores Cytopore ™ II (GE Biosciences).

[00285] Os cultivos foram crescidos sob condições de cultivo contínuo durante 3 a 4 semanas e as amostras do sobrenadante a partir dos biorreatores foram analisadas periodicamente para a produção de proteína A13 por ELISA e atividade de A13 por ensaio de FRETS-VWF73. Valores indicados na Tabela 23 representam médias para o período da semana 3 a 4. Consistente com os resultados obtidos nos exemplos 1 a 6 acima, os cultivos crescidos sob quimiostática produziram cerca de 1 mg/L/d a cerca de 2 mg / L/d de proteína de A13 tendo elevadas atividades específicas de cerca de 700 mU/μg a cerca de 1000 mU/μg (Tabela 23). Surpreendentemente, os cultivos crescidos sob condições de cultivo de perfusão consistentemente demonstraram níveis de atividade e produção de proteína A13 mais elevados no sobrenadante de cultura do que os clones idênticos crescidos em condições quimiostáticas. As atividades específicas para A13 produzida nos cultivos de perfusão foram muito elevadas, com três dos quatro clones demonstrando pelo menos cerca de 1000 mU/μg. Tabela 23. Resultados de experimentos comparando cultivo de células em quimiostato e por perfusão.

Exemplo 8

[00286] A fim de determinar o efeito da temperatura e do pH sobre a produção de proteína ADAMTS13 recombinante humana crescida em cultura de células eucarióticas usando um meio de cultura isento de proteína animal quimicamente definido, os cultivos foram crescidos a temperaturas entre 35,0 °C e 38,0 °C, a pH entre 7,05 e 7,30.

[00287] Resumidamente, as células CHO recombinantes que expressam A13 humana foram transferidas para biorreatores de 1,5 l com impulsores de lâmina, em meio de BACD-A13 de propriedade. Os cultivos foram crescidos sob pH controlado em linha é entre 7,05 e 7,30 a temperaturas variando entre 35,0 °C a 38,0 °C, com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. Os experimentos foram designados e executados usando a abordagem de superfície de resposta. A análise estatística foi feita usando o pacote de software estatístico Minitab® 15.1.0.0.

[00288] As amostras dos biorreatores foram tomadas e analisadas para A13 por ELISA, a atividade A13 foi medida por ensaio de FRETS-VWF73. As contagens de células foram determinadas por tecnologia Nucleocounter. As taxas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtividades volumétricas.

[00289] Como pode ser visto nas figuras 1 e 2, ambas as temperatura e pH tiveram um efeito substancial sobre a produtividade volumétrica de A13 (medida por FRETS-VWF73, Fig. 1), e atividade específica (atividade de - VWF73 / antígeno por ELISA, Fig. 2). Especificamente, a produtividade volumétrica de FRETS máxima foi alcançada em culturas crescidas em uma faixa menor de pH entre cerca de 7,05 e 7,2, especialmente cerca de 7,10 e temperaturas entre cerca de 35,0 °C e 37,0 °C, especialmente, cerca de 36°C. Especificamente, a atividade específica máxima (FRETS-VWF73 para antígeno por ELISA) foi alcançada em culturas crescidas em uma faixa de pH menor entre cerca de 7,05 e 7,2, especialmente, abaixo de 7,10 e temperaturas entre cerca de 35,0°C e 37,0°C, especialmente abaixo de 36°C. Especificamente, as condições ótimas para a produção de A13 foram alcançadas com uma combinação de uma temperatura de cerca de 36°C e um pH de cerca de 7,10 em termos de qualidade do produto e rendimento ótimo. [00290] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças a luz dos mesmos serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance do presente pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados neste documento são incorporados neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

Claims (25)

1. Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (ADAMTS), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína ADAMTS em um meio de cultura isento de proteína animal; (b) remover uma fração do sobrenadante da cultura; (c) realizar uma etapa de filtração ou centrifugação para remover quaisquer células residuais; (d) realizar uma etapa de ultrafiltração para concentrar a proteína ADAMTS; e (e) realizar uma etapa de diafiltração com um tampão compreendendo de 0,5 μM a 5 μM de zinco e de 0,1 mM a 5 mM de cálcio; dessa forma preparando uma composição de ADAMTS.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão contém de 1 mM a 5 mM de cálcio e de 1 μ M a 5 μ M de zinco.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tampão contém de 2 mM a 5 mM de cálcio.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre 3 μ M e 12 μM de zinco.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre 5 μM e 12 μM de zinco.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda de 2 mg/L a 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre 2 mg/L e 8 mg/L de poliamina.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a poliamina é putrescina.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo em uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula aviária e uma célula de mamífero.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma linhagem de célula selecionada do grupo consistindo em uma linhagem de célula humana, uma linhagem de célula de hamster e uma linhagem de célula murina.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula é selecionada do grupo consistindo em uma linhagem de célula CHO, uma linhagem de célula BHK e uma linhagem de célula HEK.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivo de célula em batelada.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o cultivo de célula em batelada é cultivo de célula em batelada repetida ou cultivo de célula em batelada alimentada.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivo de célula contínuo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que cultivo de célula contínuo compreende cultivo de célula em suspensão contínua ou cultivo de célula aderente contínuo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado em modo quimiostato ou em modo perfusão.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que um microtransportador é usado para cultivar a célula.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o microtransportador é um microtransportador poroso.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida de 7 dias a dois meses.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida a uma temperatura entre 35°C e 37°C.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida a um pH entre 6,9 e 7,3, ou a um pH entre 7,05 e 7,15.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a atividade específica da proteína ADAMTS13 no meio de cultura é de 600U por mg de proteína ADAMTS13 a 800U por mg de proteína ADAMTS13.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a cultura rende de 400U de atividade de ADAMTS13 por L de cultura por dia (U/L/D) a 800U de atividade de ADAMTS13 por L de cultura por dia.

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