BR122024009277A2 - Formas cristalinas de um composto de triazolopirimidina - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a formas cristalinas de um composto de triazolopirimidina, que é útil para tratamento de uma doença ou disfunção mediada por PRC2.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a formas cristalinas de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2- metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina, composições farmacêuticas compreendendo as mesmas e métodos de tratamento usando as formas cristalinas e processos para preparação das formas cristalinas.

ANTECEDENTES

[0002] As proteínas do grupo policomb (PcG) são enzimas modificadoras de cromatina que estão desreguladas em muitos cânceres humanos. O Complexo Repressor de Policomb 2 (PRC2), que inclui SUZ12 (supressor de zeste 12), EED (desenvolvimento de ectoderma embriônico) e a subunidade catalítica, EZH2 (intensificador de homólogo de zeste 2), reprime genes por metilação do núcleo histona H3 lisina 27 (H3K27me3) nas e em torno das regiões promotoras de genes alvo. PRC2 é um componente crítico da maquinaria celular envolvida na regulação epigenética da transcrição de genes e desempenha função crítica no desenvolvimento e diferenciação e regeneração de tecidos. Embora EZH2 seja a subunidade catalítica, PRC2 requer pelo menos EED e SUZ12 para a sua atividade de metiltransferase. EED, SUZ12 e EZH2 estão sobre-expressas em muitos cânceres, incluindo, mas não se limitando a câncer da mama, câncer da próstata, carcinoma hepatocelular e etc. Mutações ativantes de EZH2 foram identificadas em pacientes com DLBCL (linfoma difuso de grandes células B) e FL (linfoma folicular). A inibição da atividade de metiltransferase de PRC2 por compostos competindo com o cofator S- adenosil metionina (SAM) em DLBCL reverte a metilação de H3K27, reativa a expressão de genes alvo e inibe o crescimento/proliferação tumoral. Portanto, PRC2 proporciona um alvo farmacológico para DLBCL e outros cânceres.

[0003] Na preparação de uma composição farmacêutica é procurada uma forma do agente terapêutico que tenha um equilíbrio de propriedades desejadas, tais como, por exemplo, taxa de dissolução, solubilidade, biodisponibilidade e/ou estabilidade no armazenamento. A existência de múltiplas formas sólidas, frequentemente referidas como polimorfos, é bem conhecida para compostos farmacêuticos sólidos, e a estabilidade física e química bem como propriedades de manuseamento de tais compostos dependem frequentemente de qual a forma sólida que é usada. Desse modo, a seleção de uma forma sólida particular da substância de fármaco ativa (p.ex., uma forma de sal, forma hidratada ou solvatada ou forma polimórfica) é frequentemente muito importante na concepção de um processo de produção confiável e reprodutível e no armazenamento, manuseamento e distribuição de uma forma segura e eficaz da substância de fármaco.

[0004] "Impurities: Guideline for Residual Solvents"é um guia sobre quantidades de solventes residuais toleradas em farmacêuticos, que foi produzido pelo Conselho Internacional para Harmonização de Requerimentos Técnicos para Farmacêuticos para Uso Humano (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use - ICH). Este Guia recomenda o uso de solventes menos tóxicos na fabricação de substâncias de fármaco e formas de dosagem, e define limites farmacêuticos para solventes residuais (impurezas voláteis orgânicas) em produtos de fármaco. Este guia divide os solventes em três classes com base no risco: solventes da Classe 1, que são conhecidos por causarem toxicidades inaceitáveis; solventes da Classe 2, que estão associados a toxicidade menos grave; e solventes da Classe 3, que têm baixo potencial tóxico.

[0005] De acordo com o Guia do ICH, quantidades residuais de solventes da Classe 3 de 50 mg por dia ou menos (correspondendo a 5000 ppm ou 0,5%) seriam aceitáveis sem justificação. Os limites de concentração são calculados usando a equação abaixo assumindo uma massa de produto de 10 g administrada diariamente:

[0006] A PDE (exposição diária permitida) é dada em termos de mg/dia e a dose é dada em g/dia. Quantidades mais elevadas de solventes da Classe 3 podem ser também aceitáveis contanto que sejam realistas em relação à capacidade de fabricação e boas práticas de fabricação.

[0007] O pedido de patente de número de série dos US 14/977,273, que é aqui incorporado por referência, divulga certos compostos de triazolopirimidina para tratamento de doenças ou distúrbios mediados por PRC2. Este pedido de patente foi publicado em 23 de junho de 2016 como US 2016-0176882. Um composto divulgado nesse pedido é N-((5- Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (forma livre) e seu sal de cloridrato. A forma livre (referida aqui como Composto A) tem a seguinte estrutura:

[0008] O sal de cloridrato (referido aqui como Composto X) tem a seguinte estrutura:

[0009] A forma livre, Composto A, exibe baixas solubilidades aquosas tanto a nível de pH fisiologicamente relevante de 7,4 como em fluido gástrico simulado (SGF). Foi constatado que as exposições do Composto A foram subproporcionais em doses mais elevadas em estudos farmacocinéticos em roedores, o que pode levar a exposições insuficientes e variáveis em cenários clínicos. Foram levadas a cabo experiências para encontrar um sal apropriado para melhorar a solubilidade aquosa. Foi constatado que somente o sal de cloridrato proporciona a melhoria necessária na solubilidade e demonstra a exposição proporcional à dose em roedor após teste de um número de sais que também incluíram fosfato, fumarato, tartarato, succinato, maleato e mesilato.

[0010] O procedimento descrito em US 14/977,273 para produzir o Composto X usa isopropanol (IPA, um solvente da Classe 3) como o meio. Quantidades variáveis de IPA foram observadas em diferentes lotes do Composto X obtidos pelo procedimento descrito em US 14/977,273 como determinado por 1H RMN (exemplificado pela entrada 1 na tabela 2 abaixo), com a quantidade de IPA em alguns lotes sendo maior do que 0,5% em peso. Foi também muito difícil remover o IPA residual do produto final. Adicionalmente, o Composto X assim obtido mostrou cristalinidades baixas e variáveis, como julgado a partir dos espectros de XRPD. Foram feitos esforços para remover o IPA residual e melhorar a cristalinidade sem muito sucesso. Portanto existe a necessidade de métodos que consigam produzir consistentemente o Composto X na forma desejada, isto é., uma forma que esteja substancialmente isenta de solvente orgânico residual e que mostre cristalinidade melhorada e confiável.

SUMÁRIO

[0011] A presente invenção proporciona formas cristalinas do Composto X (cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina).

[0012] As modalidades destas formas cristalinas incluem aquelas caracterizadas aqui como Formas A, HA e HB bem como combinações ou misturas destas formas cristalinas. Tabela 1

[0013] Os nomes usados aqui para caracterizar uma forma específica, "HA", etc., não devem ser considerados limitantes no que diz respeito a qualquer outra substância possuindo características físicas e químicas similares ou idênticas, mas ao invés deve ser entendido que estas designações são meros identificadores que devem ser interpretados de acordo com a informação de caracterização também apresentada aqui.

[0014] A presente invenção proporciona métodos de preparação de formas cristalinas do Composto X.

[0015] A presente invenção proporciona também composições farmacêuticas compreendendo forma(s) cristalina(s) do Composto X e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode adicionalmente compreender, pelo menos, um agente terapêutico adicional. Têm particular interesse agentes terapêuticos adicionais selecionados de: outros agentes anticancerosos, imunomoduladores, agentes antialérgicos, agentes antináusea (ou antieméticos), analgésicos, agentes citoprotetores e suas combinações.

[0016] A(s) forma(s) cristalina(s) do Composto X da presente invenção pode(m) ser usada(s) no tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2.

[0017] A(s) forma(s) cristalina(s) do Composto X da presente invenção pode(m) ser usada(s) em terapia.

[0018] A(s) forma(s) cristalina(s) do Composto X da presente invenção pode(m) ser usada(s) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2.

[0019] Outras características e vantagens da presente divulgação serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A Figura 1 ilustra um padrão de difração de pó por raios X representativo da Forma A (forma anidra).

[0021] A Figura 2 ilustra termogramas de calorimetria diferencial de varredura (DSC) / análise termogravimétrica (TGA) da Forma A.

[0022] A Figura 3 ilustra uma representação gráfica da sorção de vapor dinâmica (DVS) da Forma A a 25 °C.

[0023] A Figura 4 ilustra um padrão de difração de pó por raios X representativo da Forma HA (forma de mono-hidratado).

[0024] A Figura 5 ilustra termogramas de calorimetria diferencial de varredura (DSC) / análise termogravimétrica (TGA) da Forma HA.

[0025] A Figura 6 ilustra uma representação gráfica da sorção de vapor dinâmica da Forma HA a 25 °C.

[0026] A Figura 7 ilustra uma representação gráfica da sorção de vapor dinâmica da Forma HA a 50 °C.

[0027] A Figura 8 ilustra um padrão de difração de pó por raios X representativo da Forma HB (forma de di-hidratado).

[0028] A Figura 9 ilustra termogramas de calorimetria diferencial de varredura (DSC) / análise termogravimétrica (TGA) da Forma HB.

[0029] A Figura 10 ilustra uma representação gráfica da sorção de vapor dinâmica da Forma HB a 25 °C.

[0030] A Figura 11 ilustra a comparação da Forma A obtida pelo procedimento (A) descrito no Exemplo 3 abaixo vs. obtida pelo procedimento (B) descrito no Exemplo 2 abaixo (também descrito em US 14/977,273).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] As seguintes modalidades enumeradas da invenção são representativas:

[0032] 1. Forma Cristalina A de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina, em que a referida Forma A contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual.

[0033] 2. Forma Cristalina A de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina, em que a referida Forma A contém menos do que 0,2% em peso de solvente orgânico residual.

[0034] 3. Forma Cristalina A de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina, em que a referida Forma A contém menos do que 0,1% em peso de solvente orgânico residual.

[0035] 4. A Forma Cristalina A do Composto X obtida por um processo compreendendo os passos:

[0036] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[0037] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[0038] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[0039] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para se obter a Forma A do Composto X.

[0040] 5. A Forma Cristalina A do Composto X de qualquer uma das modalidades 1 a 3, obtida por um processo compreendendo os passos:

[0041] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[0042] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[0043] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[0044] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para se obter a Forma A do Composto X.

[0045] 6. A Forma Cristalina A do Composto X da modalidade 5, obtida por um processo em que:

[0046] no passo 1), o solvente orgânico miscível em água é selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[0047] no passo 2), aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75 °C;

[0048] no passo 3), acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[0049] no passo 4), diminuição da temperatura da solução resultante para se obter a Forma A do Composto X.

[0050] 7. Uma forma sólida hidratada de cloridrato de N-((5-Fluoro- 2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina.

[0051] 8. A forma sólida hidratada de acordo com a modalidade 7, em que a referida forma hidratada é a Forma de mono-hidratado HA.

[0052] 9. A forma sólida hidratada de acordo com a modalidade 7, em que a referida forma hidratada é a Forma de di-hidratado HB.

[0053] 10. Uma forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina (Forma HA) tendo um padrão de difração de pó por raios X compreendendo os seguintes valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 A): 13,8 ± 0,1,20,8 ± 0,1,26,2 ± 0,1,26,7 ± 0,1 e 28,2 ± 0,1. Em algumas modalidades, a Forma HA tem um ou mais (p.ex., 2, 3, 4 ou 5) valores de 2θ adicionais selecionados daqueles na Lista 2.

[0054] 11. Uma forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina (Forma HB) tendo um padrão de difração de pó por raios X compreendendo os seguintes valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 A): 9,0 ± 0,1, 17,1 ± 0,1, 22,8 ± 0,1, 26,9 ± 0,1 e 35,3 ± 0,1. Em algumas modalidades, a Forma HB tem um ou mais (p.ex., 2, 3, 4 ou 5) valores de 2θ adicionais selecionados daqueles na Lista 3.

[0055] 12. Uma composição farmacêutica, compreendendo um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e a Forma A descrita em qualquer uma das modalidades 1 a 6.

[0056] 13. A composição farmacêutica da modalidade 12 compreendendo adicionalmente, pelo menos, um agente terapêutico adicional.

[0057] 14. A composição farmacêutica da modalidade 13 onde o referido agente terapêutico adicional é selecionado de outros agentes anticancerosos, imunomoduladores, agentes antialérgicos, agentes antieméticos, analgésicos, agentes citoprotetores e suas combinações.

[0058] 15. A Forma Cristalina A descrita em qualquer uma das modalidades 1 a 6 para uso em terapia.

[0059] 16. Uso da Forma A descrita em qualquer uma das modalidades 1 a 6 na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou disfunção mediada por EED e/ou PRC2.

[0060] 17. O uso da modalidade 16, em que a referida doença ou disfunção é selecionada de linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, outros linfomas, leucemia, mieloma múltiplo, mesotelioma, câncer gástrico, tumor rabdoide maligno, carcinoma hepatocelular, câncer da próstata, carcinoma da mama, cânceres do ducto biliar e vesícula biliar, carcinoma da bexiga, tumores do cérebro incluindo neuroblastoma, schwannoma, glioma, glioblastoma e astrocitoma, câncer cervical, câncer do cólon, melanoma, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer do pulmão, carcinoma nasofaríngeo, câncer dos ovários, câncer pancreático, carcinoma de células renais, câncer retal, cânceres da tiroide, tumores da paratiroide, tumores uterinos e sarcomas de tecidos moles.

[0061] 18. Um processo para preparação da Forma Cristalina A do Composto X compreendendo os passos:

[0062] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[0063] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[0064] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[0065] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para se obter a Forma A do Composto X.

[0066] 19. Um processo para preparação da Forma Cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, compreendendo os passos:

[0067] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[0068] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[0069] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[0070] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[0071] 20. O processo da modalidade 19 em que:

[0072] no passo 1), o solvente orgânico miscível em água é selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[0073] no passo 2), aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75 °C;

[0074] no passo 3), acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[0075] no passo 4), diminuição da temperatura da solução resultante para se obter a Forma A do Composto X.

[0076] Foi postulado que o IPA pode ser aprisionado nos látices cristalinos quando o Composto X é formado em um meio de isopropanol, uma vez que durante a formação inteira do sal, o material permaneceu como uma "pasta" e nunca foi totalmente dissolvido. A Tabela 2 resume os resultados obtidos a partir das experiências levadas a cabo com solventes da Classe 3 selecionados e suas combinações. Foi inesperadamente constatado que EtOH/água e acetona/água (Entradas 11 e 12) permitiram dissolução completa do Composto X e sustentaram também o estado de supersaturação para duração ótima, especialmente em temperatura elevada. Estas combinações proporcionam formas cristalinas do Composto X que estão substancialmente isentas de solventes orgânicos, p.ex., contendo não mais do que 0,3% e tipicamente não mais do que 0,1% de solvente orgânico em peso após secagem normal. Tabela 2

[0077] Com o par de solventes selecionado, as condições de cristalização foram adicionalmente optimizadas, como listado na Tabela 3. Foi constatado que as condições como mostradas nas Entradas 5 e 6 na Tabela 3 produzem o material com conteúdo muito menor do solvente orgânico residual e cristalinidade mais elevada, enquanto foi obtido melhor rendimento com as condições na Entrada 5. As condições da Entrada 5 poderiam ser também reproduzidas em escala de multigramas, como indicado na Entrada 7 da Tabela 3.

Forma A do Composto X (Forma Anidra)

[0078] Em uma modalidade, o Composto X é proporcionado como um material cristalino compreendendo a Forma A. A forma cristalina do Composto X compreende uma forma cristalina referida aqui como "Forma A" do Composto X.

[0079] Em uma modalidade, a Forma A do Composto X é caracterizada por parâmetros de célula unitária aproximadamente iguais aos seguintes:

[0080] Grupo espaçador: P-1

[0081] Moléculas de Composto X/unidade assimétrica: 2

[0082] Volume/Número de moléculas na célula unitária = 946,0(9) Â3

[0083] Densidade (calculada) = 1,449 g/cm3

[0084] em que os parâmetros de célula unitária da Forma A do Composto X são medidos a uma temperatura de cerca de 100 (±2) K (-173 °C).

[0085] Em uma modalidade, a invenção proporciona a Forma A do Composto X que é caracterizada por um padrão de difração de pó por raios X compreendendo os seguintes valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 Â): 12,5 ± 0,1, 13,0 ± 0,1, 25,2 ± 0,1 e 30,8 ± 0,1. Em outra modalidade, adicionalmente aos valores de 2θ especificados, a Forma A exibe um ou mais (p.ex., 2, 3, 4 ou 5) valores de 2θ adicionais selecionados daqueles na Lista 1. Em ainda outra modalidade, a Forma A exibe um padrão de difração de pó por raios X substancialmente igual àquele mostrado na Figura 1. Lista 1: Listagem de picos de XRPD para a Forma A do Composto X (2θ: os picos mais intensos estão sublinhados)

[0086] Em outra modalidade, a Forma A do Composto X exibe uma forte endoterma durante DSC a cerca de 264 ± 1 oC.

[0087] Em outra modalidade, a Forma A do Composto X tem perda gradual de massa através de TGA totalizando cerca de 0,6% de perda por 200 °C.

Forma HA do Composto X (Mono-hidratado)

[0088] Em uma modalidade, o Composto X é proporcionado como um mono-hidratado em uma forma cristalina referida aqui como "Forma HA" do Composto X. A forma HA do Composto X tem uma estequiometria de uma molécula de água para cada molécula do Composto X.

[0089] Em um aspecto, a invenção proporciona a Forma HA do Composto X que é caracterizada por um padrão de difração de pó por raios X compreendendo os seguintes valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 A): 13,8 ± 0,1, 20,8 ± 0,1, 26,2 ± 0,1, 26,7 ± 0,1 e 28,2 ± 0,1. Em outra modalidade, adicionalmente aos valores de 2θ especificados, a Forma HA exibe um ou mais (p.ex., 2, 3, 4 ou 5) valores de 2θ adicionais selecionados daqueles na Lista 2. Em ainda outra modalidade, a Forma HA exibe um padrão de difração de pó por raios X substancialmente igual àquele mostrado na Figura 4. Lista 2: Listagem de picos de XRPD para a Forma HA do Composto X (2θ: os picos mais intensos estão sublinhados)

[0090] Foi constatado que mono-hidratado é facilmente formado em misturas água/solvente com atividade de água acima de 0,5~0,6 e mostra estabilidade aceitável à umidade e temperatura.

[0091] Em outra modalidade, a Forma HA do Composto X exibe uma forte endoterma durante DSC a cerca de 256 ± 1 oC.

[0092] Em outra modalidade, a Forma HA do Composto X tem perda gradual de massa através de TGA totalizando cerca de 4,2% de perda peor 111 °C.

Forma HB do Composto X (Di-hidratado)

[0093] Em uma modalidade, o Composto X é proporcionado como um di-hidratado em uma forma cristalina referido aqui como "Forma HB" do Composto X. A forma HB do Composto X tem uma estequiometria de duas moléculas de água para cada molécula do Composto X.

[0094] Em um aspecto, a invenção proporciona a Forma HB do Composto X que é caracterizada por um padrão de difração de pó por raios X compreendendo os seguintes valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 A): 9,0 ± 0,1, 17,1 ± 0,1, 22,8 ± 0,1, 26,9 ± 0,1 e 35,3 ± 0,1. Em outra modalidade, adicionalmente aos valores de 2θ especificados, a Forma HB exibe um ou mais (p.ex., 2, 3, 4 ou 5) valores de 2θ adicionais selecionados daqueles na Lista 3. Em ainda outra modalidade, a Forma HB exibe um padrão de difração de pó por raios X substancialmente igual àquele mostrado na Figura 8. Lista 3: Listagem de picos de XRPD para a Forma HB do Composto X (2θ: os picos mais intensos estão sublinhados)

[0095] Em outra modalidade, a Forma HB do Composto X exibe uma forte endoterma durante DSC a cerca de 244 ± 1 oC.

[0096] Em outra modalidade, a Forma HB do Composto X tem perda gradual de massa através de TGA totalizando cerca de 8,5% de perda por 122 °C.

[0097] A presença de impurezas de reação e/ou impurezas de processamento pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, cromatografia, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa ou espectroscopia de infravermelhos.

[0098] Em um aspecto da invenção, os polimorfos da invenção têm propriedades cristalinas e são preferencialmente pelo menos 50% cristalinos, mais preferencialmente pelo menos 60% cristalinos, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% cristalinos e o mais preferencialmente pelo menos 80% cristalinos. A cristalinidade pode ser estimada por técnicas de difratometria de raios X convencionais.

[0099] Em algumas modalidades, a forma sólida do Composto X compreende uma ou mais das Formas descritas aqui. Uma forma sólida do Composto X pode incluir duas ou mais destas Formas, isto é., pode ser uma mistura de duas ou mais Formas. Em algumas modalidades, uma amostra da forma sólida consiste majoritariamente em uma Forma única selecionada de Formas A, HA, e HB significando que 50% ou mais do material é de uma Forma sólida. As quantidades relativas de várias Formas em uma mistura podem ser determinadas a partir de dados de XRPD. Como descrito aqui, algumas das Formas podem evoluir ou interconverter sob condições adequadas, tais como Formas A e HA, que pode ocorrer como uma mistura, e podem interconverter dependendo da umidade relativa e temperatura às quais o material é mantido.

[00100] Em um aspecto da invenção, os polimorfos da invenção são a partir de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% cristalinos.

[00101] Na presente especificação, os picos de difração de pó por raios X (expressos em graus 2θ) são medidos usando raios X de cobre com um comprimento de onda de 1,5406 Â (alfal) e 1,5444 Â (alfa2).

[00102] As formas cristalinas da presente invenção podem existir em formas não solvatadas ou solvatadas. O termo "solvato"é usado aqui para descrever um complexo molecular compreendendo o composto da invenção e uma quantidade de um ou mais solventes farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de solventes farmaceuticamente aceitáveis incluem etanol e água. O termo "hidratado"é empregue quando o solvente é água. Dois polimorfos do Composto X como descrito aqui são hidratados.

[00103] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual.

[00104] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,4% em peso de solvente orgânico residual.

[00105] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,3% em peso de solvente orgânico residual.

[00106] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,2% em peso de solvente orgânico residual.

[00107] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,1% em peso de solvente orgânico residual.

[00108] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma HA do Composto X.

[00109] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma HB do Composto X.

[00110] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X em combinação com a Forma HA do Composto X.

[00111] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X em combinação com a Forma HA do Composto X.

[00112] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X em combinação com a Forma HB do Composto X.

[00113] Em outra modalidade, a forma cristalina é a Forma A do Composto X em combinação com a Forma HA do Composto X e Forma HB do Composto X.

[00114] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima.

[00115] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00116] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00117] A composição farmacêutica é útil no tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2.

[00118] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica como definida acima compreendendo ainda agente(s) terapêutico(s) adicional(ais).

[00119] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima, para uso em terapia, sozinha, ou opcionalmente em combinação com outro composto da presente invenção e/ou pelo menos um outro tipo de agente terapêutico.

[00120] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima, para uso em terapia, para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2, sozinha, e/ou pelo menos um outro tipo de agente terapêutico.

[00121] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2, compreendendo administração a um paciente com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima, sozinha, e/ou pelo menos um outro tipo de agente terapêutico.

[00122] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2, compreendendo administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um primeiro e segundo agentes terapêuticos, em que o primeiro agente terapêutico é uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima, e o segundo agente terapêutico é um outro tipo de agente terapêutico.

[00123] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona também o uso de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2, sozinha, ou opcionalmente em combinação com pelo menos um outro tipo de agente terapêutico.

[00124] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma preparação combinada de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) para uso em terapia.

[00125] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma combinação de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) para uso simultâneo ou separado em terapia.

[00126] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma preparação combinada de uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) para uso simultâneo, separado ou sequencial no tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2. A referida forma sólida pode ser administrada como uma composição farmacêutica descrita aqui.

[00127] Exemplos de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2 incluem, mas não estão limitados a, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, outros linfomas, leucemia, mieloma múltiplo, mesotelioma, câncer gástrico, tumor rabdoide maligno, carcinoma hepatocelular, câncer da próstata, carcinoma da mama, cânceres do ducto biliar e vesícula biliar, carcinoma da bexiga, tumores do cérebro incluindo neuroblastoma, glioma, glioblastoma e astrocitoma, câncer cervical, câncer do cólon, melanoma, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer do pulmão, carcinoma nasofaríngeo, câncer dos ovários, câncer pancreático, carcinoma de células renais, câncer retal, cânceres da tiroide, tumores da paratiroide, tumores uterinos e sarcomas de tecidos moles selecionados de rabdomiossarcoma (RMS), sarcoma de Kaposi, sarcoma sinovial, osteossarcoma e sarcoma de Ewing.

[00128] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2, compreendendo administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um primeiro agente terapêutico opcionalmente com um segundo agente terapêutico, em que o primeiro agente terapêutico é uma forma sólida selecionada de qualquer uma das modalidades descritas acima e o segundo agente terapêutico é um outro tipo de agente terapêutico; em que as doenças ou distúrbios são selecionadas de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, outros linfomas, leucemia, mieloma múltiplo, câncer gástrico, tumor rabdoide maligno e carcinoma hepatocelular.

[00129] Em outra modalidade, agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) usado(s) em composições farmacêuticas combinadas ou métodos combinados ou usos combinados é(são) selecionado(s) de um ou mais, preferencialmente um a três, dos seguintes agentes terapêuticos: outros agentes anticancerosos, imunomoduladores, agentes antialérgicos, agentes antináusea (ou antieméticos), analgésicos, agentes citoprotetores e suas combinações.

[00130] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X, em que a referida Forma A contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,2% por peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% por peso de solvente orgânico residual.

[00131] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X, compreendendo os passos:

[00132] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00133] 2) aquecimento da suspensão resultante até pelo menos cerca de 50 °C;

[00134] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura pelo menos cerca de 50 °C; e

[00135] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00136] Em outra modalidade, a presente invenção um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, compreendendo os passos:

[00137] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00138] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00139] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00140] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00141] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, compreendendo os passos:

[00142] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00143] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75 °C;

[00144] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00145] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00146] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X obtida por um processo compreendendo os passos:

[00147] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00148] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00149] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00150] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00151] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00152] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00153] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00154] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00155] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00156] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00157] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00158] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75°C;

[00159] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00160] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00161] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X obtenível por um processo compreendendo os passos:

[00162] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00163] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00164] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00165] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00166] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00167] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00168] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00169] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00170] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00171] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtenível por um processo compreendendo os passos:

[00172] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00173] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75 °C;

[00174] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00175] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00176] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X, compreendendo os passos:

[00177] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00178] 2) aquecimento da suspensão resultante até pelo menos cerca de 50 °C;

[00179] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida com ácido clorídrico enquanto se mantém a temperatura pelo menos cerca de 50 °C; e

[00180] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00181] Em outra modalidade, a presente invenção um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, compreendendo os passos:

[00182] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00183] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00184] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00185] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00186] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um processo de preparação da Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, compreendendo os passos:

[00187] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00188] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75

[00189] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00190] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00191] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X obtida por um processo compreendendo os passos:

[00192] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00193] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00194] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00195] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00196] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00197] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00198] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00199] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00200] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00201] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00202] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00203] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75

[00204] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00205] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00206] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X obtenível por um processo compreendendo os passos:

[00207] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00208] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00209] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00210] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00211] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtida por um processo compreendendo os passos:

[00212] 1) suspensão de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (Composto A) em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água;

[00213] 2) aquecimento da suspensão resultante até cerca de ou mais do que 50 °C;

[00214] 3) acidificação da suspensão resultante para formar uma solução límpida enquanto se mantém a temperatura a cerca de ou maior do que 50 °C; e

[00215] 4) diminuição da temperatura da solução resultante para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00216] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona a Forma cristalina A do Composto X que contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual, preferencialmente menos do que 0,3% peso de solvente orgânico residual, mais preferencialmente menos do que 0,1% peso de solvente orgânico residual, obtenível por um processo compreendendo os passos:

[00217] 1) suspensão do Composto A em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água selecionado de um grupo consistindo em etanol e acetona;

[00218] 2) aquecimento da suspensão resultante de cerca de 50 a 75

[00219] 3) acidificação da suspensão resultante com ácido clorídrico para formar uma solução límpida por adição de uma solução de HCl a 0,5 N em uma mistura de água e o referido solvente orgânico miscível em água, enquanto se mantém a temperatura de cerca de 50 a 75 °C; e

[00220] 4) diminuição da temperatura da solução para incitar a formação de cristais para se obter a Forma A do Composto X.

[00221] Em modalidades adicionais aos processos acima de preparação da Forma cristalina A do Composto X, a presente invenção proporciona as seguintes razões preferenciais da mistura solvente:

[00222] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 80 a 100% em peso.

[00223] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 85 a 100% em peso.

[00224] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 90 a 100% em peso.

[00225] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 95 a 100% em peso.

[00226] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 85 a 95% em peso.

[00227] Uma razão de mistura solvente de H2O e EtOH em que EtOH é 90 a 95% em peso.

[00228] Em modalidades adicionais aos processos acima de preparação da Forma cristalina A do Composto X, a presente invenção proporciona as seguintes gamas de temperaturas preferenciais para o passo 2:

[00229] Uma gama de temperaturas é 50 a 75 °C.

[00230] Uma gama de temperaturas é 60 a 75 °C.

[00231] Uma gama de temperaturas é 70 a 75 °C.

[00232] Várias modalidades (enumeradas) da invenção são descritas aqui. Será reconhecido que as características especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas para proporcionar modalidades adicionais da presente invenção. É também entendido que cada elemento individual das modalidades é a sua própria modalidade independente.

[00233] Outras características da presente invenção devem se tornar aparentes no decurso das descrições acima de modalidades exemplificativas que são dadas para ilustração da invenção e não se destinam a ser limitantes da mesma.

III. DEFINIÇÕES

[00234] Os termos gerais usados anteriormente e doravante têm preferencialmente dentro do contexto desta invenção os seguintes significados, a não ser que de outro modo indicado, onde os termos mais gerais onde quer que sejam usados podem, independentemente entre si, ser substituídos por definições mais específicas ou permanecerem, definindo assim modalidades mais detalhadas da invenção.

[00235] As características e vantagens da invenção podem ser mais prontamente entendidas pelos peritos na técnica após leitura da seguinte descrição detalhada. É para ser apreciado que certas características da invenção que são, por razões de clareza, descritas acima e abaixo no contexto de modalidades separadas podem ser também combinadas para formar uma única modalidade. Reciprocamente, várias características da invenção que são, por razões de brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade podem ser também combinadas para formar suas subcombinações.

[00236] O termo "um", "uma", "o/a" e termos similares usados no contexto da presente invenção (especialmente no contexto das reivindicações) são para ser interpretados para abrangerem tanto o singular como o plural a não ser que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto.

[00237] Todos os números expressando quantidades de ingredientes, percentagens em peso, temperaturas e assim por diante que são precedidos pela palavra "cerca de"são para ser entendidos como somente aproximações tais como variações ligeiras acima e abaixo do número apresentado possam ser usadas para se alcançar substancialmente os mesmos resultados que o número apresentado. Desse modo, a não ser que indicado o contrário, os parâmetros numéricos precedidos pela palavra "cerca de"são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procuram obter. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser pelo menos interpretado em luz do número de dígitos significativos relatados e por aplicação de técnicas de arredondamento habituais.

[00238] Os nomes usados aqui para caracterizar uma forma específica, p.ex., "HA", etc., são meramente identificadores que são para ser interpretados de acordo com a informação de caracterização apresentada aqui e não são para ser interpretados de modo a excluírem qualquer outra substância possuindo características físicas e químicas similares ou idênticas.

[00239] Todas as medições são sujeitas a erro experimental e estão dentro do espírito da invenção.

[00240] Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um dos e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (p.ex., "tal como"), proporcionados aqui se destina meramente a melhor iluminar a invenção e não coloca uma limitação no escopo da invenção de outro modo reivindicada.

[00241] A frase "farmaceuticamente aceitável"indica que a substância ou composição tem de ser compatível quimicamente e/ou toxicologicamente, com os outros ingredientes compreendendo uma formulação e/ou o mamífero sendo tratado com ela.

[00242] Dependendo das condições de processo, os produtos finais da presente invenção são obtidos em forma livre (neutra) ou de sal. Tanto a forma livre como os sais destes produtos finais estão dentro do escopo da invenção. Se assim desejado, uma forma de um composto pode ser convertida em outra forma. Uma base ou ácido livre pode ser convertido em um sal; um sal pode ser convertido no composto livre ou outro sal; uma mistura de compostos isomêricos da presente invenção pode ser separada nos isômeros individuais.

[00243] Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto original que contém uma fração básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados por reação das formas ácidas ou básicas livres destes compostos com uma quantidade estequiométrica de base ou ácido apropriada em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila são preferenciais. Listas de sais adequados são encontradas em Allen, L.V., Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy,22a Edição, Pharmaceutical Press, Londres, RU (2012), a invenção dos quais é deste modo incorporada por referência.

[00244] Como usado aqui, "polimorfo(s)" se refere(m) a forma(s) cristalina(s) tendo a mesma estrutura/composição química mas diferentes arranjos espaciais das moléculas e/ou íons formando os cristais.

[00245] Como usado aqui, "amorfo" se refere a uma forma sólida de uma molécula, átomo e/ou íons que não é cristalina. Um sólido amorfo não exibe um padrão de difração de raios X definitivo.

[00246] Para propósitos farmacopeicos, "solventes orgânicos residuais"em farmacêuticos são definidos como químicos voláteis orgânicos que são usados ou produzidos na fabricação de substâncias de fármaco ou excipientes ou na preparação de produtos de fármaco. Os solventes orgânicos residuais não são completamente removidos por técnicas de fabricação práticas.

[00247] Como usado aqui, "solvente orgânico miscível em água" se refere a um solvente orgânico que é líquido à temperatura ambiente e é completamente miscível com água, preferencialmente sendo selecionado de etanol e acetona.

[00248] Como usado aqui, um padrão de XRPD "compreendendo" um número de picos selecionados de um grupo especificado de picos se destina a incluir padrões de XRPD tendo picos adicionais que não estão incluídos no grupo especificado de picos.

[00249] "EED" se refere ao produto de proteína do gene desenvolvimento de ectoderma embriônico.

[00250] "PRC2" se refere ao Complexo Repressor de Policomb 2.

[00251] O termo "doença ou disfunção mediada por PRC2" se refere a qualquer doença ou disfunção que é diretamente ou indiretamente regulada por PRC2. Este inclui, mas não está limitado a, qualquer doença ou disfunção que é diretamente ou indiretamente regulada por EED.

[00252] O termo "doenças ou distúrbios mediados por EED e/ou PRC2" se refere a doenças ou distúrbios que são diretamente ou indiretamente reguladas por EED e/ou PRC2.

[00253] Como usado aqui, o termo "paciente" engloba todas as espécies de mamífero.

[00254] Como usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um animal. Tipicamente, o animal é um mamífero. Um "indivíduo" se refere também a qualquer humano ou organismo não humano que poderia potencialmente beneficiar de tratamento com um inibidor de EED. Um indivíduo se refere também a, por exemplo, primatas (p.ex., humanos), vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, coelhos, ratos, camundongos, peixe, pássaros e similares. Em certas modalidades, o indivíduo é um primata. Em ainda outras modalidades, o indivíduo é um humano. Sujeitos exemplificativos incluem seres humanos de qualquer idade com fatores de risco para doença cancerosa.

[00255] Como usado aqui, um indivíduo está "com necessidade de" um tratamento se tal indivíduo beneficiaria biologicamente, medicamente ou em qualidade de vida de tal tratamento (preferencialmente, um humano).

[00256] Como usado aqui, o termo "inibir", "inibição"ou "inibindo" se refere à redução ou supressão de uma dada condição, sintoma ou disfunção ou doença ou uma diminuição significativa na atividade de linha de base de uma atividade ou processo biológico.

[00257] Como usado aqui, o termo "tratar", "tratando" ou "tratamento" de qualquer doença/disfunção se refere ao tratamento da doença/disfunção em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) melhoria da doença/disfunção (isto é., desaceleração ou paragem ou redução do desenvolvimento da doença/disfunção ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos); (b) alívio ou modulação da doença/disfunção (isto é., causando regressão da doença/disfunção, fisicamente (p.ex., estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (p.ex., estabilização de um parâmetro físico) ou ambos); (c) alívio ou melhoria de pelo menos um parâmetro físico incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo indivíduo; e/ou (d) prevenção ou retardamento da ocorrência de início ou desenvolvimento ou progressão da doença ou disfunção em um mamífero, em particular, quando tal mamífero é predisposto à doença ou disfunção mas não foi ainda diagnosticado como a tendo.

[00258] Como usado aqui, "prevenindo" ou "prevenção"abrange o tratamento preventivo (isto é., profilaxia e/ou redução do risco) de um estado de doença subclínico em um mamífero, particularmente em um humano, visado à redução da probabilidade da ocorrência de um estado de doença clínico. Os pacientes são selecionados para terapia preventiva com base em fatores que se sabe que aumentam o risco de sofrerem de um estado de doença clínico em comparação com a população geral. As terapias de "profilaxia" podem ser divididas em (a) prevenção primária e

[00259] (b) prevenção secundária. A prevenção primária é definida como tratamento em um indivíduo que não apresentou ainda um estado de doença clínico, ao passo que prevenção secundária é definida como prevenção de uma segunda ocorrência do mesmo ou similar estado de doença clínico.

[00260] Como usado aqui, "redução do risco" ou "reduzindo risco" abrange terapias que diminuem a incidência do desenvolvimento de um estado de doença clínico. Como tal, terapias de prevenção primária e secundária são exemplos de redução do risco.

[00261] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se destina a incluir uma quantidade de um composto da presente invenção que desencadeará a resposta biológica ou médica de um indivíduo, por exemplo, redução ou inibição de EED e/ou PRC2 ou melhorará sintomas, aliviará condições, desacelerará ou retardará a progressão da doença ou prevenirá uma doença ou disfunção mediada por PRC2. Quando aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultem no efeito preventivo ou terapêutico, quer administradas em combinação, em série ou simultaneamente.

[00262] As abreviaturas, como usadas aqui, são definidas como se segue: "EtOH" para etanol, "1x" para uma vez, "2x" para duas vezes, "3x" para três vezes, "°C" para graus Celsius, "aq" para aquosa, "Col" para coluna, "eq" para equivalente ou equivalentes, "g" para grama ou gramas, "mg" para miligrama ou miligramas, "L" para litro ou litros, "mL" para mililitro ou mililitros, "μL" para microlitro ou microlitros, "N" para normal, "M" para molar, "nM" para nanomolar, "mol" para mole ou moles, "mmol" para milimole ou milimoles, "min" para minuto ou minutos, "h" para hora ou horas, "ta" para temperatura ambiente, "RT" para tempo de retenção, "ON" para durante a noite, "atm" para atmosfera, "psi" para libras por polegada quadrada, "conc." para concentrado, "aq" para aquoso, "sat" ou "sat'd" para saturado, "MW" para peso molecular, "mw" ou "μwave" para micro-onda, "mp" para ponto de fusão, "Wt" para peso, "MS" ou "Espec Massa" para espectrometria de massa, "ESI" para espectroscopia de massa com ionização por eletropulverização, "HR" para elevada resolução, "HRMS" para espectrometria de massa de elevada resolução, "LC-MS" para espectrometria de massa com cromatografia líquida, "HPLC" para cromatografia líquida de elevada pressão, "RP HPLC" para HPLC de fase reversa, "TLC" ou "tlc" para cromatografia em camada fina, "NMR" para espectroscopia de ressonância magnética nuclear, "nOe" para espectroscopia de efeito de Overhauser nuclear, "1H" para próton, "δ" para delta, "s" para singleto, "d" para dubleto, "t" para tripleto, "q" para quarteto, "m" para multipleto, "br" para amplo, "Hz" para hertz, "ee" para "excesso enantiomérico"e "α", "β", "R", "S", "E" e "Z"são designações estereoquímicas familiares a um perito na técnica.

MÉTODOS GERAIS

[00263] Os seguintes métodos foram usados nos Exemplos exemplificativos, exceto onde notado de outro modo.

[00264] As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, cristalização ou recristalização a partir de um solvente adequado, sublimação, crescimento a partir de um fundido, transformação em estado sólido a partir de outra fase, cristalização a partir de um fluido supercrítico e pulverização por jatos. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas a partir de uma mistura solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura solvente, inoculação de cristais de uma mistura solvente supersaturada da molécula e/ou sal, liofilização da mistura solvente e adição de antissolventes (contrassolventes) à mistura solvente. Técnicas de cristalização de elevada produtividade podem ser empregues para preparar formas cristalinas incluindo polimorfos.

[00265] Para técnicas de cristalização que empregam solvente, a escolha de solvente ou solventes está tipicamente dependente de um ou mais fatores, tais como solubilidade do composto, técnica de cristalização e pressão de vapor do solvente. Combinações de solventes podem ser empregues, por exemplo, o composto pode ser solubilizado em um primeiro solvente para originar uma solução, seguido pela adição de um antissolvente para diminuir a solubilidade do composto na solução e para originar a formação de cristais. Um antissolvente é um solvente no qual o composto tem baixa solubilidade.

[00266] Em um método para preparar cristais, um composto é suspenso e/ou agitado em um solvente adequado para originar uma pasta, que pode ser aquecida para promover a dissolução. O termo "pasta", como usado aqui, significa uma solução saturada do composto, que pode também conter uma quantidade adicional do composto para originar uma mistura heterogênea do composto e um solvente a uma dada temperatura.

[00267] Os cristais de inóculo podem ser adicionados a qualquer mistura de cristalização para promover a cristalização. A inoculação pode ser empregue para controlar o crescimento de um polimorfo particular ou para controlar a distribuição dos tamanhos das partículas do produto cristalino. Em geral, inóculos de pequeno tamanho são necessários para controlar eficazmente o crescimento de cristais no lote. O inóculo de pequeno tamanho pode ser gerado por crivagem, moagem ou micronização de cristais grandes ou por microcristalização de soluções. Se deve ter atenção para que a moagem ou micronização de cristais não resulte em qualquer mudança na cristalinidade a partir da forma de cristal desejada (isto é., mudança para amorfo ou para outro polimorfo).

[00268] Uma mistura de cristalização resfriada pode ser filtrada sob vácuo, e os sólidos isolados podem ser lavados com um solvente adequado, tal como solvente de recristalização frio, e secos sob uma purga de nitrogênio para originar a forma cristalina desejada. Os sólidos isolados podem ser analisados por uma técnica espectroscópica ou analítica adequada, tal como ressonância magnética nuclear em estado sólido, calorimetria diferencial de varredura, difração de raios X ou similares, para assegurar formação da forma cristalina preferencial do produto. A forma cristalina resultante é tipicamente produzida em uma quantidade de mais do que cerca de 70% em peso de rendimento isolado, preferencialmente maior do que 90% em peso de rendimento isolado, com base no peso do composto originalmente empregue no procedimento de cristalização. O produto pode ser comoído ou passado através de um crivo de malha para desagregar o produto, se necessário.

[00269] As formas cristalinas podem ser preparadas diretamente a partir do meio de reação do processo final para preparação do Composto X. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por emprego no passo de processo final de um solvente ou uma mistura de solventes a partir do qual o Composto (I) possa ser cristalizado. Alternativamente, as formas cristalinas podem ser obtidas por destilação ou técnicas de adição de solvente. Solventes adequados para este propósito incluem, por exemplo, os solventes não polares acima mencionados solventes polares, incluindo solventes polares próticos tais como álcoois e solventes polares apróticos tais como cetonas.

Difração de Pó por Raios X (XRPD)

[00270] Os dados da difração de pó por raios X (XRPD) foram obtidos usando um D8 Discover da Bruker com ânodo de CuKα. As amostras de pó foram colocadas em uma lâmina de vidro e centradas no feixe de raios X. A distância amostra-detector foi em torno de 30 cm, três grelhas fundidas. A radiação foi CuKα (À = 1,5418 A). Os dados foram coletados para 2<2θ <45° com um tempo de exposição de amostra de pelo menos 270 segundos.

[00271] Os parâmetros atômicos derivados (coordenadas e fatores de temperatura) foram refinados através de mínimos quadrados de matriz total. A função minimizada nas refinações foi ∑w(|Fo| - |Fc|)2. R é definido como ∑ ||F| - |F||/∑ |Fo| enquanto Rw = [∑w( |Fo| - |Fc|)2/∑w |Fo|2]1/2 onde w é a função de ponderação apropriada com base em erros nas intensidades observadas. Os mapas de diferença foram examinados em todas as etapas da refinação. Átomos de hidrogênio foram introduzidos em posições idealizadas com fatores de temperatura isotrópicos, mas nenhum dos parâmetros de hidrogênio foi variado.

Análise Termogravimétrica

[00272] A análise termogravimétrica foi conduzida para cada forma cristalina usando um instrumento de TGA da TA Discovery. Para cada análise, a célula/câmara de amostra de TGA foi purgada com 20 mL/min de gás de nitrogênio de pureza ultraelevada. Uma calibração de pesos foi realizada usando pesos padrão sob purga de nitrogênio. A taxa de aquecimento foi de 10 °C por minuto na gama de temperaturas entre ta e 300 °C. A mudança na percentagem de peso (% em peso) foi representada graficamente versus a temperatura de amostra medida.

Calorimetria Diferencial de Varredura

[00273] A calorimetria diferencial de varredura foi conduzida para cada forma cristalina usando um DSC da TA Discovery. Para cada análise, a célula/câmara de amostra de DSC foi purgada com 50 mL/min de gás de nitrogênio de pureza ultraelevada. O instrumento foi calibrado com índio de pureza elevada. A taxa de aquecimento foi 10 °C por minuto na gama de temperaturas entre 30 e 300 °C. O fluxo de calor, que foi normalizado por peso de amostra, foi representado graficamente versus a temperatura de amostra medida. Os dados foram relatados em unidades de watts/grama ("W/g"). A representação gráfica foi feita com os picos endotérmicos virados para baixo. O pico de fusão endotérmica (ponto de fusão) foi avaliado para temperatura de início extrapolada.

Sorção de Vapor Dinâmica

[00274] A sorção de vapor dinâmica foi realizada em um instrumento DVS Advantage da Surface Measurement Systems. Aproximadamente 10 mg de material foram carregados em um recipiente de amostras. As amostras foram expostas a ciclos de sorção/dessorção em passos de umidade relativa (RH) de 10% ao longo da gama de RH de 50%-90%- 0%-90%-50% a 25 °C e 50 °C. Uma condição de equilíbrio alvo de mudança de massa menor do que 0,002% ao longo de 5 min foi definida, com períodos de equilíbrio mínimos e máximos de 10 e 360 min, respectivamente. O gás carreador foi nitrogênio com uma taxa de fluxo de 100 mL/min. O sistema é calibrado com soluções de sal saturadas. A mudança na percentagem de peso (% em peso) da amostra em cada etapa foi medida e representada graficamente versus a pressão parcial alvo.

RMN Empregue na Caracterização dos Exemplos

[00275] Os espectros de 1H RMN foram obtidos com espectrômetros de transformada de Fourier da Bruker operando nas frequências como se segue: 1H MRN: 400 MHz (Bruker). 13C RMN: 100 MHz (Bruker). Os dados de espectros são relatados no formato: desvio químico (multiplicidade, número de hidrogênios). Os desvios químicos são especificados em ppm em campo baixo de um padrão interno de tetrametilsilano (δ unidades, tetrametilsilano = 0 ppm) e/ou referenciados aos picos de solvente, que nos espectros de 1H RMN aparecem a 2,49 ppm para CD2HSOCD3, 3,30 ppm para CD2HOD, 1,94 para CD3CN e 7,24 ppm para CDCl3 e que nos espectros de 13C RMN aparecem a 39,7 ppm para CD3SOCD3, 49,0 ppm para CD3OD e 77,0 ppm para CDCl3. Todos os espectros de 13C RMN foram decoplados em termos de prótons. As medições foram levadas a cabo à temperatura ambiente ou outro modo especificado. A quantidade de resíduo de solvente foi calculada com base em integrações dos hidrogênios mais representativos nos correspondentes espectros de 1H RMN.

V. EXEMPLOS

[00276] Os seguintes Exemplos foram preparados, isolados e caracterizados usando os métodos divulgados aqui. Os seguintes exemplos não se destinam a ser limitantes do escopo da invenção. Exemplo 1: Preparação do Composto A (N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina)

[00277] 5-Bromo-4-hidrazinil-2-(metiltio)pirimidina (2): A uma solução de 5-bromo-4-cloro-2-(metiltio)pirimidina (1, 49,0 g, 0,205 mol) em etanol (1000 mL) foi adicionada hidrazina (21,5 g, 0,430 mol). A reação foi agitada à ta durante 4 h. A suspensão resultante foi filtrada, lavada com hexano e seca em vácuo para dar o composto do título (44,1 g, 92%) como um sólido branco.1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,42 (s, 3H), 8,08 (s, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 234,9; 236,9.

[00278] Intermediário3: 5-bromo-4-hidrazinil-2-(metiltio)pirimidina (2) (40,0 g, 0,17 mol) foi dissolvido em 200 mL trietóximetano. A mistura foi aquecida ao refluxo e agitada durante 3 h. A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, o resíduo foi purificado por cromatografia flash (EA: PE = 1:15~1:1) para dar o composto do título (38,3 g, 92%) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 2,82 (s, 3H), 8,03 (s, 1H), 8,87 (s, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 245,0; 247,0. Intermediário A1: 8-bromo-N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-

[00279] 2-Bromo-4-(2,2-dietoxietóxi)-1-fluorobenzeno(A1.1): A uma solução de 3-bromo-4-fluorofenol (500 g, 2,62 mol) e 2-bromo-1,1- dietóxietano (670 g, 3,4 mol) em 2,0 L DMF foi adicionado K2CO3 (1085 g, 7,86 mol) em uma porção. A suspensão foi aquecida a 110 °C e agitada durante a noite sob N2. Após resfriamento até a ta, a reação foi diluída com 10,0 L de H2O e extraída com EtOAc (2,0 L x 3). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura duas vezes, seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado em sílica gel (EtOAc/hexano = 0:100 a 5:100) para dar o composto do título (810 g, 80%) como um óleo amarelo. 1H-RMN (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 1,27 (t, 6 H), 3,65 (q, 2 H), 3,78 (q, 2 H), 3,97 (d, 2 H), 4,82 (t, 1 H), 3,97 (d, 2 H), 6,84 (dd, 1 H), 7,04 (dd, 1 H), 7,13 (d, 1 H).

[00280] 4-Bromo-5-fluorobenzofurano (A1.2a em conjunto com regioisômero A1.2b): A uma solução de PPA (1324 g, 3,93 mol) em tolueno (2,0 L) foi adicionado A1.1 (810 g, 2,62 mol) ao longo de 30 min a 95 °C. A mistura reacional foi agitada a 95 °C durante 2 h. Após resfriamento até a ta, 4,0 L de água gelada foram adicionados lentamente. A mistura foi extraída com PE (2,0 L x 2), a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura duas vezes (2,0 L x 2), seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado em sílica gel (EtOAc/PE = 0:100 a 5:100) para dar uma mistura de A1.2a e A1.2b (A1.2a: A1.2b = 1:0,7, 310 g, rendimento de 55%) como um óleo amarelo.

[00281] 5-Fluorobenzofuran-4-carbonitrila (A1.3): A uma mistura de A1.2a e A1.2b (310 g, 1,44 mol) e Zn(CN)2 (253 g, 2,16 mol) em 1,0 L de DMF foi adicionado Pd(PPh3)4 (162 g, 0,14 mol) sob N2. A mistura reacional foi aquecida a 100 °C e agitada durante 18 h. Após resfriamento até a ta, a mistura foi diluída com 5,0 L de água e extraída com EtOAc (1,0 L x 2). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (1 L), seca sobre Na2SO4 (anidro), filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por coluna flash (fase móvel: EtOAc/PE = 1:70 em 30 min, Tempo de Ret. = 11 min, taxa de fluxo: 120 mL/min) para dar o composto do título (92 g, 40%) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 7,07 (d, 1H), 7,30 (dd, 1H), 7,89 (dd, 1H), 8,10 (dd, 1H).

[00282] ((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)carbamato de terc-butila (A1.4): A uma solução de A1.3 (44,5 g, 276,4 mmol) e Boc2O (90,0 g, 414,6 mmol) em 1,0 L de MeOH foi adicionado Pd/C (5 g, 10% em peso). A mistura reacional foi desgaseificada com H2 e agitada sob H2 durante a noite. A mistura foi filtrada através de celite, lavada com MeOH (300 mL x 2), o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi rescristalizado a partir de PE para dar o composto do título (61,0 g, 93%) como um sólido branco. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,38 (s, 9H), 3,21 (t, 2H), 4,12 (d, 2H), 4,53 (t, 2H), 6,63 (dd, 1H), 6,86 (dd, 1H), 7,25 (s l, 1H). LC-MS: [M- tBu+H]+ = 212,1.

[00283] (5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metanamina (A1.5): Uma solução de A1.4 (18,3 g, 68,5 mmol) em 50 mL de HCI/Dioxano (4 mol/L) foi agitada a ta durante 4 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com um solvente em mistura (MeOH: MeCN = 1:10, 500 mL), depois K2CO3 (18,0 g, 342,5 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida a 60 °C e agitada durante 3 h, resfriada até a ta, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado em sílica gel (MeOH: EtOAc = 0:100 a 1:4) para dar o composto do título (9,2 g, 80%) como um óleo amarelo. 1H-RMN (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 3,27 (t, 2H), 3,77 (s, 2H), 4,56 (t, 2H), 6,59 (dd, 1H), 6,81 (dd, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 168,1.

[00284] Intermediário A1: Uma mistura de A1.5 (1,41 g, 8,2 mmol) e 8-bromo-5-(metiltio)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidina (3) (1,0 g, 4,1 mmol) foi aquecida a 40 °C e agitada durante 16 h. Após resfriamento até a ta, a mistura foi diluída com EtOAc (35 mL). O precipitado foi filtrado e lavado com EtOAc (3 mL x 3), seco em vácuo para dar o composto do título (1,0 g, 67%) como um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, DMSO) δ ppm 3,27 (t, 2H), 4,53 (t, 2H), 4,66 (d, 2H), 6,71 (dd, 1H), 6,95 (t, 1H),7,85 (s, 1H), 8,75 (t, 1H), 9,48 (s, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 363,7; 365,7.

[00285] A uma mistura de A1 (40 mg, 0,110 mmol) em 1,4-dioxano (3 mL), MeCN (0,30 mL) e água (0,30 mL) foram adicionados ácido (2- metilpiridin-3-il)borônico (30,1 mg, 0,220 mmol), carbonato de potássio (45,5 mg, 0,330 mmol) e Pd(PhβP)4 (12,69 mg, 10,98 μmol). A mistura resultante foi agitada sob N2 a 110 °C durante 3 h, resfriada até a ta e evaporada sob vácuo. O resíduo foi purificado em cromatografia flash (DCM: MeOH = 10:1) para originar N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran- 4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina como um sólido branco (20 mg, 46,0%).

[00286] Alternativamente, N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina foi preparada como se segue. A uma suspensão de A1 (25,5 g, 70 mmol), 2-metil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina (30,6 g, 140 mmol) e NaHCO3 (35,3 g, 420 mmol) em uma solução de mistura de 1,4-dioxano (300 mL) e H2O (100 mL) foi adicionado PdCl2(dppf) (5,94 g, 612 mmol). A mistura foi desgaseificada com N2, aquecida a 110 °C durante 1 h. A mistura resultante foi resfriada até a ta e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado sobre cromatografia em coluna (EtOAc: MeOH = 20:1) para dar 14 g do produto desejado. 200 mL de acetona foram adicionados ao produto, e a suspensão resultante foi aquecida a 50 °C durante 2 h. O sólido branco foi coletado por filtração e seco sob vácuo para dar N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran- 4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (13,6 g, 52%) 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,40 (s, 3H), 3,33 (t, 2H), 4,56 (t, 2H), 4,72 (s, 2H), 6,72 (dd, 1H), 6,96 (dd, 1H), 7,31 (dd, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,74 (d, 1H), 8,51 (d, 1H), 8,72 (t, 1H), 9,49 (s, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 376,9.

Exemplo 2: Preparação da Forma A do Composto X (cloridrato de N-((5- Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina) usando isopropanol (IPA) (Entrada 1 na Tabela 2)

[00287] A uma suspensão de N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina (6,0 g, 15,94 mmol) em 100 mL de IPA, uma solução de HCl a 0,5 N em IPA (33,0 mL, 16,50 mmol) foi adicionada gota a gota à ta. A suspensão foi agitada a 50 °C durante 12 h, depois resfriada até a ta e agitada durante 5 h. O sólido resultante foi coletado por filtração e seco a 40 °C sob vácuo durante 2 dias para originar o sal de cloridrato da forma A do composto X como um sólido branco (6,5 g, 98 %) 1H RMN (DMSO-d6) δ ppm 2,65 (s, 3H), 3,35 (t, 2H), 4,57 (t, 2H), 4,74 (d, 2H), 6,73 (dd, 1H), 6,97 (dd, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,85 - 7,94 (m, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,80 (dd, 1H), 9,07 (t, 1H), 9,58 (s, 1H). LC-MS: [M+H]+ = 376,9. A quantidade de resíduo de solvente foi calculada com base em integrações dos hidrogênios mais representativos nos correspondentes espectros de 1H RMN. Especificamente, a integração à δ 1,04 responsável por 6 hidrogênios dos grupos metila de IPA é 0,31, enquanto aquela de 3 hidrogênios do grupo metila em 2-metil-piridina à δ 2,64 foi 3. Portanto, a percentagem por mole de IPA é calculada como se segue: 0,31/ 6 (1 + 0,31/6) = 4,9%; enquanto a percentagem de IPA em peso é calculada como se segue: 60 x (0,31/6) /{(376,38 + 36,46 + 60 x (0,31/6)} = 0,74% {MW (IPA) = 60, MW (composto A) = 376,40 e MW (HCl) = 36,46}.

Exemplo 3: Preparação da Forma A do Composto X (cloridrato de N-((5- Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina) usando EtOH/ H2O (Entrada 7 na Tabela 2)

[00288] A 4,0 g de N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8- (2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina em um frasco de 500 mL foram adicionados 200 mL de EtOH/H2O (95/5, v/v), e a mistura foi agitada por agitação mecânica. A suspensão resultante foi aquecida até 75 °C por banho de óleo e mantida a essa temperatura durante 1 h. À suspensão mantida a 75 °C, 23,38 mL de HCl a 0,5 N em EtOH (1,1 eq) foram adicionados gota a gota. A mistura ficou límpida após a adição de ácido clorídrico. A solução resultante foi agitada a 75°C durante 2 h. A mistura foi depois resfriada até ta em 3 h, e o Composto X resultante como um sólido branco (3,5 g, 79,7%) foi coletado por filtração e seco durante 6 h sob vácuo. A quantidade de resíduo de EtOH foi calculada com base na integração do hidrogênio no espectro de 1H RMN. Especificamente, a integração à δ 1,06 responsável por 3 H do grupo metila de EtOH é 0,01, enquanto aquela de 3 hidrogênios do grupo metila em 2-metil-piridina à δ 2,65 foi 3. Portanto, a percentagem por mole de EtOH foi calculada como se segue: 0,01/ 3 (1 + 0,01/3) = 0,33%; enquanto a percentagem de EtOH em peso é calculada como se segue: 46,07 x (0,01/3) /{(376,38 + 36,46 + x (0,01/3)} = 0,04% {MW (EtOH) = 46,07, MW (composto A) = 376,40 e MW (HCl) = 36,46}.

Exemplo 4: Preparação da Forma HA do Composto X

[00289] 1,0 g da Forma A do Composto X foi adicionado a 10 mL da mistura etanol/água (3:1) para se obter uma suspensão. A suspensão foi agitada a ta durante 3 dias. O sólido resultante foi coletado com filtração a vácuo e seco à ta durante a noite. A Forma HA do Composto X (0,81 g) foi obtida em rendimento de 77%.

Exemplo 5: Preparação da Forma HB do Composto X

[00290] 200 mg da Forma A do Composto X foram dissolvidos em quantidade mínima de misturas acetona/água (1:1) a 60 oC, para se obter uma solução límpida. A solução foi evaporada à ta ao longo de 3 a 5 dias. O sólido resultante foi coletado com filtração a vácuo e seco à ta durante a noite. A Forma HB do Composto X foi obtida.

[00291] Preparação de HCl a 0,5 N em EtOH ou acetona:

[00292] 4,0 mL do HCl concentrado aquoso comercialmente disponível (36,5%, p/p, em água) foram adicionados a 96,0 mL de EtOH ou acetona (opcionalmente a temperatura reduzida), e a solução foi misturada bem para se obter HCl a 0,5 N em EtOH ou acetona. Procedimento para as experiências resumidas na Tabela 2:

[00293] A 10 mg de composto X em um frasco de amostras a 50 °C, o solvente selecionado foi adicionado gota a gota. A adição de solvente foi parada quando uma solução límpida foi alcançada ou quando a quantidade de solvente tiver alcançado 1 mL. A mistura resultante foi agitada continuamente a 50 °C durante 2 h, depois resfriada até à ta e agitada durante a noite. As solubilidades a 50 °C e ta foram determinadas pela homogeneidade da mistura resultante.

Procedimento para as experiências resumidas na Tabela 3:

[00294] As experiências como as Entradas 1 a 6 na Tabela 3 foram levadas a cabo de acordo com o procedimento descrito na formação de sais no Exemplo 3 acima, mas com diferentes parâmetros listados na Tabela 3.

VI. FARMACOLOGIA E UTILIDADE

[00295] Como um componente-chave do complexo de PRC2, EDD não tem atividade enzimática intrínseca. No entanto é crítica para a função apropriada de PRC2. EED se liga diretamente a H3K27me3 e este evento de ligação localiza o complexo de PRC2 no substrato de cromatina e ativa alostericamente a atividade de metiltransferase. O direcionamento do local alostérico dentro da subunidade de EED reguladora de PRC2 pode oferecer um ângulo novo e único a ser vantajoso ao, ou complementar ao, direcionamento direto do mecanismo de competição de SAM de EZH2 ou PRC2. Portanto, o direcionamento de EED representa uma estratégia altamente atrativa para o desenvolvimento de uma nova terapia para o tratamento de muitas formas de cânceres. Em particular existe a necessidade de pequenas moléculas que inibam a atividade de PRC2 através do direcionamento de EED. Foi agora constatado que derivados de triazolopirimidina como presentemente divulgados são úteis para visar EED para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por EED ou PRC2, especialmente cânceres.

[00296] A utilidade do Composto X da presente invenção pode ser demonstrada usando qualquer um dos seguintes procedimentos de teste. O Composto X foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a atividade de PRC2 em um complexo pentamérico de EZH2, SUZ12, EED, Rbap48 e AEBP em ensaios bioquímicos. A capacidade dos compostos da presente invenção de inibirem a atividade celular de PRC2 foi avaliada por análise da metilação de histona H3 lisina 27 em linhas de células humanas. A capacidade do Composto X de inibir cânceres foi derivada a partir da sua capacidade de modular a atividade em linhas de células cancerosas humanas transportando dependência específica à atividade de PRC2 para manter o crescimento canceroso.

Ensaio de ligação de competição de peptídeo EED-H3K27Me3 por AlphaScreen (α-screen)

[00297] Para avaliar a potência dos compostos no ensaio de ligação de competição EED-H3K27Me3, os compostos foram diluídos em série 3 vezes em DMSO para se obter um total de doze concentrações. Depois, os compostos a cada concentração (75 nL de cada) foram transferidos por Mosquito para uma placa ProxiPlate 384 plus da PerkinElmer com 384 poços. 8 μL de soluções contendo proteína EED (1-441)-His a 30 nM e peptídeo biotina-H3K27Me3 (19-33) a 15 nM no tampão (HEPES a 25 mM, pH 8, Tween-20 a 0,02%, BSA a 0,5%) foram adicionados aos poços e depois incubados com composto durante 20 min. A mistura de esférulas de detecção de AlphaScreen foi preparada imediatamente antes do uso por mistura de esférulas aceitadoras de quelato de níquel e esférulas dadoras de estreptavidina em uma razão 1:1 (PerkinElmer, Produto No. 6760619C/M/R) no tampão descrito acima. Depois, 4 μL de mistura de esférulas de detecção foram adicionados à placa e incubados na escuridão à ta durante 1 h. A concentração final de esférulas dadoras e aceitadoras foi 10 μg/mL para cada. As placas foram lidas em EnVision (PerkinElmer) usando o cenário de AlphaScreen adaptado para detecção de sinal ótima com um filtro de 615nm, após excitação de amostras a 680nm. O sinal de emissão a 615 nm foi usado para quantificar a inibição dos compostos. Os sinais de AlphaScreen foram normalizados com base na leitura vinda dos controles positivos (controle de sinal máximo) e negativos (controle de sinal mínimo) para dar a percentagem de atividades restantes. Os dados foram depois ajustados a uma equação de resposta à dose usando o programa Helios (Novartis) para se obterem os valores de IC50. Helios é um software de análise de dados de ensaios interno da Novartis usando os métodos descritos por Normolle, D. P., Statistics in Medicine, 12: 2025-2042 (1993); Formenko, I. et al., Computer Methods and Programs in Biomedicine, 82, 31-37 (2006); Sebaugh, J. L., Pharmaceutical Statistics, 10: 128-134 (2011); Kelly, C. et al., Biometrics, 46 (4): 1071-1085 (1990); e Kahm, M. et al., Journal of Statistical Software, 33 (7): (2010) (grofit: Fitting Biological Growth Curves with R, páginas 1-21, disponível em http://www.jstatsoft.org/).

[00298] Cada composto foi contrarrastreado para se determinar se interferia com as esférulas de AlphaScreen. Os compostos foram diluídos como descrito na seção precedente, e o ensaio foi realizado por adição de 12 μL de peptídeo biotina-miniPEG-His6 a 10 nM no tampão acima e incubação durante 20 min à ta antes da adição das esférulas a 10 μg/mL cada uma. As placas foram depois incubadas durante 1 h à ta na escuridão antes de serem lidas em EnVision.

Ensaio de LC-MS de EED

[00299] Compostos representativos da presente invenção foram diluídos em série e separadamente 3 vezes em DMSO para se obter um total de oito ou doze concentrações. Depois, os compostos de teste a cada concentração (120 nL de cada) foram transferidos por Mosquito para uma placa ProxiPlate 384 plus da PerkinElmer com 384 poços. Soluções (6 μL) de o complexo de PRC2 de tipo selvagem (wtPRC2) a 24 nM e SAM a 2 μM em tampão de reação (Tris a 20 mM, pH 8,0, BSA a 0,1%, Triton a 0,01%, DTT a 0,5 mM) foram adicionadas aos poços que foram depois incubados com o composto de teste durante 20 min. Uma solução de 6 μL de 3 μM do substrato de peptídeo H3K27Me0 (histona H3 [21-44]-biotina) no tampão de reação foi adicionada para iniciar cada reação. Os componentes finais na solução de reação incluem complexo de wtPRC2 a 12 nM, SAM a 1 μM e peptídeo H3K27me0 a 1,5 μM com concentração variável dos compostos. Um controle positivo consistiu na enzima, SAM a 1 μM e substrato a 1,5 μM na ausência do composto de teste e um controle negativo consistiu em SAM a 1 μM e substrato a 1,5 μM somente. Cada reação foi incubada à ta durante 120 min, depois parada por adição de 3 μL por de solução de extinção (TFA a 2,5% com d4-SAH a 320 nM). A mistura reacional foi centrifugada (centrífuga 5810 da Eppendorf, Rotor A-4-62) durante 2 min a 2000 rpm e lida em um espec de massa de quadrupolo triplo API 4000 com Turbulon Spray (Applied Biosystem) acoplado a Prominence UFLC (Shimadzu). Os níveis de produção de SAH foram depois normalizados com base nos valores vindos dos controles positivos e negativos para dar as percentagens de atividades de enzima. Os dados foram depois ajustados a uma equação de resposta à dose usando o programa Helios para se obterem os valores de IC50 do composto de teste.

Ensaio ELISA (metilação de H3K27)

[00300] Compostos representativos da presente invenção foram diluídos em série e separadamente 3 vezes em DMSO para se obter um total de oito ou doze concentrações. Depois, os compostos foram adicionados à célula G401 cultivada em placa com 384 poços à diluição 1:500 para se obter a concentração mais elevada de 20 μM. As células foram adicionalmente cultivadas durante 48 h antes do procedimento de ELISA.

[00301] Extração de histona: As células, na placa com 384 poços, foram lavadas com PBS (10 x tampão PBS (80 g de NaCl (Sigma, S3014), 2 g de KCl (Sigma, 60128), 14,4 g de Na2HPO4 (Sigma, S5136), 2,4 g de KH2PO4 (Sigma, P9791) até 1 L água, pH até 7,4) e lisadas com a adição de tampão de lise (HCl a 0,4 N; 45 μL por poço). A placa foi gentilmente agitada a 4 °C durante 30 min. O lisado de células foi neutralizado com tampão de neutralização (fosfato de sódio dibásico a 0,5 M, pH 12,5, DTT a 1 mM; 36 μL por poço). A placa foi agitada para assegurar que os lisados eram bem misturados antes do protocolo de ELISA.

[00302] Protocolo de ELISA: Os lisados de células foram transferidos para os poços de uma placa com 384 poços e o volume final foi ajustado até 50 μL por poço com PBS. A placa foi selada, centrifugada a 2.000 rpm durante 2 min e incubada a 4 °C durante cerca de 16 h. A placa foi lavada com tampão TBST (1 x TBS (10 x TBS: 24,2 g de Tris (Sigma, T6066), 80 g de NaCl (Sigma, S3014) até 1 L de água e pH ajustado até 7,6 com HCl) com Tween-20 a 0,1%). Tampão de bloqueio (TBST, BSA a 5%; 50 μL por poço) foi adicionado e a placa foi incubada durante 1 h à ta. O tampão de bloqueio foi removido e o anticorpo primário foi adicionado (30 μL por poço). As seguintes diluições foram realizadas com tampão de bloqueio: para o anticorpo anti-H3K27me3 (Cell Signaling Technology, #9733), a diluição foi 1:1000; para o anticorpo anti-H3K27me2 (Cell Signaling Technology, #9288), a diluição foi 1:100; para o anticorpo anti-H3 (Abcam, Cat #24834), a diluição foi 1:1000. O anticorpo primário foi incubado na placa à ta durante 1 h. Os poços foram lavados com TBST e incubados com anticorpo secundário durante 1 h à ta. Para os anticorpos secundários, as seguintes diluições foram levadas a cabo com tampão de bloqueio: anticorpo anticoelho (Jackson ImmunoResearch, #111-035-003), a diluição foi 1:2000; e anticorpo anticamundongo (Cell signaling technology, #7076), a diluição foi 1:1000. Após 1 h de incubação à ta, os poços foram lavados com TBST. O substrato de ECL (Pierce, #34080) foi adicionado a 30 μL por poço e as placas foram centrifugadas a 2.000 rpm durante 2 min. O sinal foi lido usando um Leitor EnVision da PerkinElmer. As leituras da metilação de H3K27 foram normalizadas usando sinal de H3 e depois a percentagem de inibição foi calculada contra as amostras tratadas com DMSO. Os dados foram depois ajustados a uma curva de resposta à dose usando o programa Helios para se obterem os valores de IC50 do composto de teste.

Análise de Transferência de Western

[00303] Os compostos representativos da presente invenção foram analisados quanto à sua capacidade de inibirem seletivamente PRC2. Transferência de Western foi realizada usando técnicas de biologia molecular padrão. A célula foi lisada em tampão de lise SDS (Millipore, Cat #20-163) e a concentração de proteínas foi medida por ensaio de proteínas BCA (Pierce, Cat #PI-23221). Anticorpos para transferências de Western: anti-EZH2 (#3147), anti-H3 (#9715), anti-H3K4me1 (#9723), anti-H3K4me2 (#9725), anti-H3K4me3 (#9727), anti-H3K9me2 (#9753), anti-H3K36me2 (#9758), anti-H3K27me2 (#9755) e anti- H3K27me3 (#9756) foram adquiridos a partir da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Anti-H3K9me1 (#07-395), anti- H3K27me1 (#07-448) e anti-H3K36me1 (#07-548) foram adquiridos a partir da Millipore (Billerica, MA, EUA). Anti-H3K36me3 (ab9050-100) foi adquirido a partir da Abcam (Cambridge, RU). Anti-H3K9me3 (#39161) foi adquirido a partir da Active Motif (Carlsbad, CA, EUA).

[00304] Os compostos da presente invenção inibem especificamente a metilação do substrato de PRC2 H3K27. Isto pode ser demonstrado pela sua capacidade de inibirem H3K27me2 e H3K27me3 em um número de linhas de células cancerosas humanas, exemplos incluem células rabdoides (G401) e células de linfoma (WSU-DLCL2, KARPAS422, SU-DHL4). A seletividade é perfilada contra um número de outras marcas da metilação, por exemplo: H3K4me2; H3K9me2; H3K36me3; e H3K79me3.

Análise da Proliferação Celular

[00305] A célula de linfoma de células B KARPAS422 foi cultivada usando condições de cultura de células padrão em RPMI-1640 (Invitrogen, cat #11875) suplementado com FBS a 15% (Invitrogen, cat #10099-141) em incubador umidificado a 37 °C, CO2 a 5%. Para avaliar o efeito da inibição de PRC2 na proliferação de células, células crescendo exponencialmente foram inoculadas a uma densidade de 1 x 105 células/mL em placa com 12 poços (Corning, cat #CLS3513). Após inoculação de células, um composto da presente invenção foi adicionado aos meios de células (em concentrações variando de 0 a 100 μM, séries de diluições 3x). Os números de células viáveis foram determinados a cada 3-4 dias durante até 14 dias usando Vi-CELL (Beckman Coulter). Nos dias de contagem de células, meios de crescimento frescos e composto foram reabastecidos e as células divididas de volta a uma densidade de 1 x 105 células/mL. O número de células total é expresso como células viáveis ajustadas por divisão por mL. As curvas de resposta à dose e valores de IC50 foram gerados usando Prism.

Análise de Propriedades Farmacocinéticas

[00306] As propriedades farmacocinéticas dos compostos como presentemente divulgados podem ser determinadas por uso do protocolo descrito abaixo.

[00307] Um composto representativo da presente invenção foi dissolvido em PEG300 a 10%, Solutol HS 15 a 10% e Tampão acetato pH 4,65 a 80% para originar uma concentração final de 0,2 mg/mL para administração intravenosa (IV) e oral (PO).

[00308] Para os estudos PK em rato, um total de três ratos Sprague Dawly machos foram, cada um, usados para estudo PK IV e PO em rato, respectivamente. A solução de formulação foi administrada através de um único bólus IV a 1 mg/kg e uma gavagem oral única (PO) a 2 mg/kg, respectivamente. Amostras de sangue (aproximadamente 150 μL) foram coletadas através de cânula jugular em pontos temporais apropriados.

[00309] Para os estudos PK em camundongo, um total de doze camundongos ICR machos foi usado para estudo IV e PO, respectivamente. A solução de formulação foi administrada através de um único bólus IV a 1 mg/kg e uma gavagem oral única (PO) a 2 mg/kg, respectivamente. Amostras de sangue (aproximadamente 150 μL) foram coletadas através de punção retro-orbital (~150 μL/camundongo) após anestesia por isoflurano ou através de punção cardíaca (coleta terminal) em pontos temporais apropriados (n=3).

[00310] As amostras foram coletadas em tubos contendo K3-EDTA e armazenadas em gelo até a centrifugação. As amostras de plasma foram centrifugadas a aproximadamente 8000 rpm durante 6 min a 28°C e o plasma resultante foi separado e armazenado congelado a aproximadamente -80 °C. Após adição do padrão interno, as amostras de plasma foram quantificadas por LC-MS/MS usando a curva de calibração. Os parâmetros PK incluindo curva da área sob concentração (AUC), tempo de residência médio (MRT), eliminação a partir do plasma (Cl), volume de distribuição em estado estável (Vdss), meia-vida de eliminação (t1/2), concentração máxima (Cmáx), tempo de concentração máxima (Tmáx) e biodisponibilidade oral (F %) foram calculados usando as seguintes equações:

[00311] t é tempo e C é concentração de plasma no tempo (t);

[00312] Doseiv é a dose para administração intravenosa; e Doseoral é a dose para administração oral.

[00313]

[00314]

[00315]

[00316]

Protocolo para Ensaio de Solubilidade em Equilíbrio de Elevada Produtividade

[00317] Os compostos da presente invenção foram em primeiro lugar solubilizados a 10 mM em DMSO puro. 20 μL cada um da solução de estoque de DMSO foram depois transferidos para 6 poços em placa com 96 poços. O solvente DMSO foi seco com evaporador de solvente GeneVac a 30 °C, vácuo de 1 mbar durante 1 h. Após a adição de 200 μL de soluções de tampão (pH 6,8, ou FaSSIF), a placa foi selada e agitada a 160 rpm durante 24 h à ta. A placa foi centrifugada a 3750 rpm durante 20 min, 5 μL de sobrenadante são misturados com 495 μL de MeOH/H2O (1:1). Soluções de estoque a 0,01 μM, 0,1 μM, 1 μM, 10 μM foram preparadas por séries de diluição para as curvas de calibração. O sobrenadante foi quantificado por HPLC ou LC/MS usando a curva de calibração. A solubilidade em equilíbrio de Elevada Produtividade foi determinada com base na concentração do sobrenadante.

Estudos de eficácia em modelo de xenoenxerto de camundongo

[00318] Todas as experiências conduzidas foram realizadas em camundongos Nus-nu atímicos fêmeas em uma instalação certificada por AAALAC. Os animais foram mantidos sob condições de SPF em gaiolas de ventilação individuais a temperatura e umidade constantes (isto é., 20-26 ° C; 40-70%) com 5 ou menos animais em cada gaiola. Os animais tiverem acesso livre a comida em grânulos secos esterilizados por irradiação e água potável estéril.

Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use.

[00319] As células linfoma de células B humanas 422 Karpas foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco; 11875-093) suplementado com FBS a 15% (Gibco; 10099-141) e Pen Estrep a 1% (Gibco; 15140-122) a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% no ar. As células foram mantidas em culturas de suspensão a concentrações entre 0,5 - 2 x 106 células/mL. As células foram divididas em 1:3 a cada 2-4 dias. Para se estabelecerem modelos tumorais de xenoenxertos, as células foram coletadas, suspensas em PBS, misturadas com Matrigel (BD Bioscience) a uma razão de volumes de 1:1 a uma concentração de 1x108 células/mL e depois injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos nus balb/c (Vital River) a uma concentração de 5x106 células por animal.

[00320] O composto foi formulado como uma suspensão em celulose de metila (MC) a 0,5% e Tween 80 a 0,5% em tampão pH 6,8 a 50 mM (preparado internamente de acordo com a USP) e administrado oralmente por gavagem em doses específicas.

[00321] O tratamento foi iniciado quando o volume tumoral médio alcançou 100-300 mm3. O crescimento tumoral e pesos corporais foram monitorados em intervalos regulares. Os dois diâmetros maiores, largura (W) e comprimento (L), dos tumores de xenoenxerto foram medidos manualmente com calibradores e o volume tumoral foi estimado usando a fórmula: 0,5 x L x W2.

[00322] Quando aplicáveis, os resultados são apresentados como média ± SEM. A representação gráfica e a análise estatística foram realizadas usando GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software). Os dados de mudança tumoral e no peso corporal foram analisados estatisticamente. Se as variâncias nos dados estivessem normalmente distribuídas (teste de Bartlett para variância igual), os dados seriam analisados usando ANOVA de uma via com teste de Dunnett post hoc para comparação de grupo de tratamento versus controle. O teste de Tukey post hoc foi usado para comparação de intragrupos. De outro modo, foi usado Dunn post hoc com teste com classificação de Kruskal- Wallis.

[00323] Como uma medida da eficácia, o valor da %T/C é calculado no final da experiência de acordo com:

[00324] Onde Δvolumes tumorais representam o volume tumoral médio no dia da avaliação menos o volume tumoral médio no início da experiência.

[00325] N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2- metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina foi testada nos ensaios EED (a) de ligação Alphascreen Qualified, (b) LC-MS Qualified e (c) ELISA Qualified descritos acima e foi constatado que tinha atividade inibidora de EED.

[00326] As atividades antiproliferativas (valores de IC50) em células de linfoma de células B KARPAS422 após 14 dias de tratamento para N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3-c]pirimidin-5-amina é 0,0030 μM.

[00327] Desse modo foi constatado que N-((5-fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo [4,3- c]pirimidin-5-amina inibe EED e é, portanto, útil no tratamento de doenças ou distúrbios associadas a EED e PRC2, que incluem, mas não estão limitadas a, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, outros linfomas, leucemia, mieloma múltiplo, mesotelioma, câncer gástrico, tumor rabdoide maligno, carcinoma hepatocelular, câncer da próstata, carcinoma da mama, cânceres do ducto biliar e vesícula biliar, carcinoma da bexiga, tumores do cérebro incluindo neuroblastoma, glioma, glioblastoma e astrocitoma, câncer cervical, câncer do cólon, melanoma, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer do pulmão, carcinoma nasofaríngeo, câncer dos ovários, câncer pancreático, carcinoma de células renais, câncer retal, cânceres da tiroide, tumores da paratiroide, tumores uterinos e sarcomas de tecidos moles selecionados de rabdomiossarcoma (RMS), sarcoma de Kaposi, sarcoma sinovial, osteossarcoma e sarcoma de Ewing.

V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E COMBINAÇÕES

[00328] Um "carreador (diluente ou excipiente) farmaceuticamente aceitável"se refere a meios geralmente aceites na técnica para a administração de agentes biologicamente ativos a animais, em particular, mamíferos, incluindo solventes, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (p.ex., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento da absorção, sais, conservantes, estabilizantes de fármaco, alglutinantes, agentes tamponantes (p.ex., ácido maleico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio e similares), agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, corantes geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) e similares e suas combinações, como seria conhecido dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Allen, L.V., Jr. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 Volumes), 22a Edição, Pharmaceutical Press (2012). As formulações podem ser preparadas usando procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Por exemplo, a substância de fármaco em volume (isto é., composto da presente invenção ou forma estabilizada do composto (p.ex., complexo com um derivado de ciclodextrina ou outro agente de complexação conhecido)) é dissolvida em um solvente adequado na presença de um ou mais dos excipientes descritos acima.

[00329] O Composto X pode ser administrado para qualquer um dos usos descritos aqui por quaisquer meios adequados, por exemplo, oralmente, tais como comprimidos, cápsulas (cada uma das quais inclui formulações de liberação sustentada ou liberação programada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões (incluindo nanossus- pensões, microssuspensões, dispersões secas por pulverização), xaropes e emulsões; sublingualmente; bucalmente; parenteralmente, tal como por injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intrasternal ou técnicas de infusão (p.ex., como soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas injetáveis estéreis); nasalmente, incluindo administração às membranas nasais, tais como por pulverização por inalação; topicamente, tal como na forma de um creme ou pomada; ou retalmente tal como na forma de supositórios. Podem ser administrados sozinhos, mas geralmente serão administrados com um carreador farmacêutico selecionado com base na rota de administração escolhida e prática farmacêutica padrão.

[00330] O Composto X é tipicamente formulado em formas de dosagem farmacêuticas para proporcionar uma dosagem facilmente controlável do fármaco e para dar ao paciente um produto elegante e facilmente manuseável. O regime de dosagem para os compostos da presente invenção irá, obviamente, variar dependendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e rota de administração; a espécie, idade, sexo, saúde, condição médica e peso do recipiente; a natureza e extensão dos sintomas; o tipo de tratamento simultâneo; a frequência de tratamento; a rota de administração, a função renal e hepática do paciente e o efeito desejado. O Composto X pode ser administrado em uma dose diária única, ou a dosagem diária total pode ser administrada em doses divididas de duas, três ou quatro vezes diariamente.

[00331] Em certos casos pode ser vantajoso administrar o Composto X em combinação com pelo menos um agente farmacêutico (ou terapêutico) adicional, tal como outros agentes anticancerosos, imunomoduladores, agentes antialérgicos, agentes antináusea (ou antieméticos), analgésicos, agentes citoprotetores e suas combinações.

[00332] O termo "terapia de combinação"se refere à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma doença, disfunção ou condição terapêutica descrita na presente invenção. Tal administração engloba coadministração destes agentes terapêuticos de um modo substancialmente simultâneo, tal como em uma cápsula única tendo uma razão fixa de ingredientes ativos. Alternativamente, tal administração engloba coadministração em recipientes múltiplos ou separados (p.ex., cápsulas, pós e líquidos) para cada ingrediente ativo. O Composto X e agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados através da mesma rota de administração ou através de rotas de administração diferentes. Pós e/ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Adicionalmente, tal administração engloba também uso de cada tipo de agente terapêutico de um modo sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em diferentes momentos. Em qualquer um dos casos, o regime de tratamento proporcionará efeitos benéficos da combinação de fármacos no tratamento das condições ou distúrbios descritas aqui.

[00333] Agentes quimioterapêuticos gerais considerados para uso em terapias de combinação incluem anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), bussulfano (Myleran®), injeção de bussulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desóxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatina (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® ou Neosar®), citarabina, arabinosídeo de citosina (Cytosar-U®), injeção de lipossomo de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), cloridrato de daunorrubicina (Cerubidine®), injeção de lipossomo de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), cloridrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposídeo (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracil (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesóxicitidina), hidróxiureia (Hydrea®), Idarrubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecano (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalano (Alkeran®), 6- mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), nab-paclitaxel (Abraxane®), foenix (Ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposídeo (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e vinorrelbina (Navelbine®).

[00334] Agentes anticancerosos de interesse particular para combinações com o Composto X podem incluir: inibidores de cinase dependente de ciclina (CDK), inibidores de cinase de ponto de verificação (CHK), inibidores de C-RAF, inibidores de fosfoinositídeo 3- cinase (PI3K), inibidores de BCL-2, inibidores da proteína cinase ativada por mitógeno (MEK), inibidores de topoisomerase II, inibidores de SRC, inibidores de histona deacetilase (HDAC), antibióticos antitumorais, agentes desmetilantes e antiestrógenos.

[00335] Alguns pacientes experienciam reações alérgicas aos compostos da presente invenção e/ou outro(s) agente(s) anticanceroso(s) durante ou após administração; portanto, agentes antialérgicos são frequentemente administrados para minimizar o risco de uma reação alérgica. Agentes antialérgicos adequados incluem corticoesteroides (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), tais como dexametasona (p.ex., Decadron®), beclometasona (p.ex., Beclovent®), hidrocortisona (também conhecida como cortisona, succinato sódico de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona e vendida sob os nomes registrados Ala-Cort®, fosfato de hidrocortisona, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® e Lanacort®), prednisolona (vendida sob os nomes registrados Delta- Cortel®, Orapred®, Pediapred® e Prelone®), prednisona (vendida sob os nomes registrados Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® e Orasone®), metilprednisolona (também conhecida como 6-metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, vendida sob os nomes registrados Duralone®, Medralone®, Medrol®, M- Prednisol® e Solu-Medrol®); anti-histaminas, tais como difenidramina (p.ex., Benadryl®), hidróxizina e cipro-heptadina; e broncodilatadores, tais como os agonistas de receptores beta-adrenêrgicos, albuterol (p.ex., Proventil®) e terbutalina (Brethine®).

[00336] Imunomoduladores de interesse particular para combinações com os compostos da presente invenção incluem um ou mais de: um ativador de uma molécula coestimuladora ou um inibidor de uma molécula do ponto de verificação imunológico (p.ex., um ou mais inibidores de PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 ou CTLA4) ou qualquer sua combinação.

[00337] Em certas modalidades, o imunomodulador é um ativador de uma molécula coestimuladora. Em uma modalidade, o agonista da molécula coestimuladora é escolhido de um agonista (p.ex., um anticorpo agonístico ou seu fragmento de ligação ao antígeno ou uma fusão solúvel) de ligando OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 ou CD83.

[00338] Em certas modalidades, o imunomodulador é um inibidor de uma molécula do ponto de verificação imunológico. Em uma modalidade, o imunomodulador é um inibidor de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta. Em uma modalidade, o inibidor de uma molécula do ponto de verificação imunológica inibe PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 ou CTLA4 ou qualquer sua combinação. O termo "inibição"ou "inibidor" inclui uma redução em um certo parâmetro, p.ex., uma atividade, de uma dada molécula, p.ex., um inibidor do ponto de verificação imunológico. Por exemplo, a inibição de uma atividade, p.ex., uma atividade de PD-1 ou PD-L1, de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou mais está incluída por este termo. Assim, a inibição não necessita de ser 100%.

[00339] Alguns pacientes podem experienciar náusea durante e após administração do composto da presente invenção e/ou outro(s) agente(s) anticanceroso(s); portanto, antieméticos são usados na prevenção da náusea (estômago superior) e vômitos. Anti-eméticos adequados incluem aprepitant (Emend®), ondansetrona (Zofran®), granisetrona HCl (Kytril®), lorazepam (Ativan®), dexametasona (Decadron®), proclorperazina (Compazine®), casopitant (Rezonic® e Zunrisa®) e suas combinações.

[00340] Medicação para aliviar a dor experienciada durante o período de tratamento é frequentemente prescrita para fazer com que o paciente fique mais confortável. Analgésicos sem prescrição comuns, tais como Tylenol®, são frequentemente usados. No entanto, fármacos analgésicos opioides tais como hidrocodona/paracetamol ou hidrocodona/acetaminofeo (p.ex., Vicodin®), morfina (p.ex., Astramorph® ou Avinza®), oxicodona (p.ex., OxyContin® ou Percocet®), cloridrato de oximorfona (Opana®) e fentanil (e.g., Duragesic®) são também úteis para dor moderada ou grave.

[00341] Em um esforço de proteger as células normais da toxicidade do tratamento e de limitar as toxicidades em órgãos, agentes citoprotetores (tais como neuroprotetores, removedores de radicais livres, cardioprotetores, neutralizantes do extravaso de antraciclina, nutrientes e similares) podem ser usados como uma terapia adjunta. Agentes citoprotetores adequados incluem Amifostina (Ethyol®), glutamina, dimesna (Tavocept®), mesna (Mesnex®), dexrazoxano (Zinecard® ou Totect®), xaliprodeno (Xaprila®) e leucovorina (também conhecida como leucovorina cálcica, fator de citrovorum e ácido folínico).

[00342] A estrutura dos compostos ativos identificados por números de código, nomes genéricos ou registrados pode ser retirada da edição atual do compêndio padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, p.ex., Patents International (p.ex., IMS World Publications).

[00343] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo o Composto X em conjunto com um carreador farmaceuticamente aceitável adequado para administração a um indivíduo humano ou animal, sozinhas ou em conjunto com outros agentes anticancerosos.

[00344] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de indivíduos humanos ou animais sofrendo de uma doença proliferativa celular, tal como câncer. A presente invenção proporciona métodos de tratamento de um indivíduo humano ou animal com necessidade de tal tratamento, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção (p.ex., um composto da presente invenção) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, sozinho ou em combinação com outros agentes anticancerosos.

[00345] Em particular, as composições serão formuladas em conjunto com um terapêutico de combinação ou administradas separadamente.

[00346] Em terapia de combinação para tratamento de uma malignidade, o Composto X e outro(s) agente(s) anticanceroso(s) podem ser administrados simultaneamente, concorrentemente ou sequencialmente sem limites de tempo específicos, em que tal administração proporciona níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do indivíduo.

[00347] Em uma modalidade preferencial, o Composto X e o(s) outro(s) agente(s) anticanceroso(s) são geralmente administrados sequencialmente em qualquer ordem por infusão ou oralmente. O regime de dosagem pode variar dependendo da etapa da doença, aptidão física do paciente, perfis de segurança dos fármacos individuais e tolerância dos fármacos individuais, bem como outros critérios bem conhecidos do médico assistente e praticante(s) médico(s) administrando a combinação. O composto da presente invenção e outro(s) agente(s) anticanceroso(s) podem ser administrados no espaço de minutos entre si, horas, dias ou mesmo semanas de intervalo dependendo do ciclo particular sendo usado para tratamento. Adicionalmente, o ciclo poderia incluir administração de um fármaco mais frequentemente do que o outro durante o ciclo de tratamento e em diferentes doses por administração do fármaco.

[00348] Em outro aspecto da presente invenção são proporcionados estojos que incluem o Composto X e um parceiro de combinação como divulgado aqui. Estojos representativos incluem (a) Composto X, (b) pelo menos um parceiro de combinação, p.ex., como indicado acima, por meio do que tal estojo pode compreender uma inserção de pacote ou outra etiqueta incluindo direções para administração.

[00349] O Composto X pode ser também usado com vantagem em combinação com processos terapêuticos conhecidos, por exemplo, a administração de hormônios ou especialmente radiação. O Composto X pode em particular ser usado como um radiossensibilizante, especialmente para o tratamento de tumores que exibem fraca sensibilidade à radioterapia.

[00350] Em outro aspecto da presente invenção são proporcionados estojos que incluem o Composto X e um parceiro de combinação como divulgado aqui. Estojos representativos incluem (a) Composto X, (b) pelo menos um parceiro de combinação, p.ex., como indicado acima, por meio do que tal estojo pode compreender uma inserção de pacote ou outra etiqueta incluindo direções para administração.

[00351] Nas terapias de combinação da invenção, o Composto X e o outro agente terapêutico podem ser fabricados e/ou formulados pelos mesmos ou diferentes fabricantes. Além do mais, o Composto X e o outro terapêutico (ou agente farmacêutico) podem ser colocados em conjunto em uma terapia de combinação: (i) antes da liberação do produto de combinação a médicos (p.ex., no caso de um estojo compreendendo o Composto X e o outro agente terapêutico); (ii) pelos próprios médicos (ou sob a orientação do médico) imediatamente antes da administração; (iii) no próprio paciente, p.ex., durante administração sequencial do Composto X e outro agente terapêutico.

[00352] A composição (ou formulação) farmacêutica para aplicação pode ser empacotada em uma variedade de modos dependendo do método usado para administração do fármaco. Geralmente, um artigo para distribuição inclui um recipiente tendo depositado nele a formulação farmacêutica em uma forma apropriada. Recipientes adequados são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem materiais tais como garrafas (plástico e vidro), saquetas, ampolas, sacos de plástico, cilindros de metal e similares. O recipiente pode também incluir uma montagem inviolável para prevenir acesso indiscreto aos conteúdos do pacote. Adicionalmente, o recipiente tem depositado nele uma etiqueta que descreve os conteúdos do recipiente. A etiqueta pode também incluir avisos apropriados.

Claims (2)

1. Forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[4,3- c]pirimidin-5-amina, caracterizada pelo fato de que a forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2- metilpiridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-c]pirimidin-5-amina é obtida por um processo que compreende as etapas de: 1) suspender N-((5-fluoro-2,3-di-hidrobenzofuran-4- il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-c]pirimidin-5-amina em uma mistura de água e solvente orgânico miscível em água, em que o solvente orgânico miscível em água é etanol ou acetona; 2) aquecer a suspensão resultante de 50 a 75 °C; 3) acidificar a suspensão resultante para formar uma solução límpida com ácido clorídrico enquanto se mantém a temperatura de 50 a 75 °C; e 4) diminuir a temperatura da solução resultante para se obter a forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[4,3- c]pirimidin-5-amina, e sendo que a forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro- 2,3-di-hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)- [1,2,4]triazolo[4,3-c]pirimidin-5-amina apresenta um padrão de difração de pó por raios X compreendendo valores de 2θ (CuKα À = 1,5418 Â) de 12,5±0,1, 13,0±0,1, 14,2±0,1, 18,7 ±0,1, 25,2±0,1, e 30,8±0,1, sendo que a forma cristalina contém menos do que 0,5% em peso de solvente orgânico residual.

2. Forma cristalina de cloridrato de N-((5-Fluoro-2,3-di- hidrobenzofuran-4-il)metil)-8-(2-metilpiridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[4,3- c]pirimidin-5-amina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que na etapa 3) a suspensão é acidificada pela adição de uma solução de 0,5 N HCl em uma mistura de água e o solvente orgânico miscível em água, mantendo a temperatura de 50 a 75° C.