BR122013014157A2 - composições de limpeza compreendendo variantes de subtilisina de bacillus, bem como processo de limpeza - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "composições de limpeza compreendendo variantes de subtilisina de bacillus, bem como processo de limpeza". a presente invenção refere-se a variantes de protease engenheiradas. em particular, as variantes de protease compreendem mutações combináveis em selecionadas posições de superfície que afetam a carga e/ou hidrofobicidade da enzima para aperfeiçoar pelo menos uma propriedade desejada da resultante enzima variante em uma aplicação escolhida. composições compreendendo as variantes de protease, e processos usando as mesmas também são providos. 1/1

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO VARIANTES DE SUBTILISINA DE BACILLUS, BEM COMO PROCESSO DE LIMPEZA (51) Int. Cl.: C11D 3/386; C12N 9/54.

(30) Prioridade Unionista: 11/11/2008 US 61/113,545; 19/06/2009 US 61/218,802.

(71) Depositante(es): DANISCO US INC..

(72) Inventor(es): LUIS G. CASCAO-PEREIRA; JAMES T. KELLIS, JR.; DAVID A. ESTELL.

(86) Pedido PCT: PCT US2009063837 de 10/11/2009 (87) Publicação PCT: WO 2010/056653 de 20/05/2010 (85) Data da Fase Nacional: 07/06/2013 (62) Pedido original do dividido: PI0922083-6 - 10/11/2009 (57) Resumo: RESUMO Patente de Invenção: COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO VARIANTES DE SUBTILISINA DE BACILLUS, BEM COMO PROCESSO DE LIMPEZA. A presente invenção refere-se a variantes de protease engenheiradas. Em particular, as variantes de protease compreendem mutações combináveis em selecionadas posições de superfície que afetam a carga e/ou hidrofobicidade da enzima para aperfeiçoar pelo menos uma propriedade desejada da resultante enzima variante em uma aplicação escolhida. Composições compreendendo as variantes de protease, e processos usando as mesmas também são providos. 1/1

10 20 30 40 50

BPN' AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTSSNVKVAVIDSGID SS HPD1KVAGGASM

FHA AQSVPYGVSQIKAPALH3QGYTGSKVKVAV1DSGID SS HPtvLKVAGGASM

GG 36 AQSVPWGISBVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGI*STHPDLNIRGGASF

60 70 80 90 100

BPN' VPSETHPFQDWMSHSTHVAGrVAAUIHSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADG

FNA VPSETHPFQDWHSKGTHVAGrVAAUniSrGVlGVAPSASLYAVKVLGADG

GG36 VPGEPST*ÜPG86fiGtKVAGrXiUÜJÍlS3IGVX(JVARSAELYAVKVI.GASG

101 110 120 130 140 150

SPM' SGQYSWIINGIEWAIAHKMDVINHS LGGPS GSAAXXAAVDKAVASGWW

STSA SGQYSWI IMG IEWAIAMNMDVIMMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGWW

GG36 SGSVSSIAQGI^WAGimGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLW

151 160 170 180 190 200

BPN' AAAGMEeTSGSSSTVGYPGKYPSVlAVGAVDSSHQItASFSSVePELDVMA

FRA AAAGNBGTSGSSSWGYPGKYPSVIAVGAVDSSMQRASFSSVGPEUDVMA

GG36 AASGRSGAGS«»»*ISYPAKYANAMAVGATDQNHMHASFSQYGAGLDIVA

201 210 220 230 240 250

BPN' PGVSIQSTYPGNKYQAYKGTSMAS PHVASAAAL3 LSKHPNWTNTQVRS SL

FRA PGVSIQSTLPGNKYGAUÍGTSMASPHVASAAALlLSKHPNBTNTQVRSSI

GG36 PGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVASAAALVKQKUPSWSIÍVQIRRHL

251 260 270

BPN' ENTTTKLGDSFYYGKGLIRVQAAAQ (3EQ ID MO:1)

FNA ENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID NO:7)

SG36 KNTATSLGSTNiYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO; 4)

1/109

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO VARIANTES DE SUBTILISINA DE BACILLUS, BEM COMO PROCESSO DE LIMPEZA.

Dividido do PI0922083-6, depositado em 10.11.2009.

O presente pedido de patente reivindica prioridade para o pedido de patente provisório US Ser. N^o 61/113 545, depositado em 11 de novembro de 2008 e pedido de patente provisório US Ser. N^o 61/218 802, depositado em 19 de junho de 2009, ambos os quais são aqui incorporados por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a variantes de protease engenheiradas. Em particular, as variantes de protease compreendem mutações combináveis em selecionadas posições de superfície que afetam a carga e/ou hidrofobicidade da enzima para aperfeiçoar pelo menos uma propriedade desejada da resultante enzima variante em uma aplicação escolhida. Composições compreendendo as variantes de protease, e processos para uso das mesmas também são providos.

Antecedentes da Invenção

Serina proteases são um subgrupo de carbonil hidrolases compreendendo uma classe diversa de enzimas tendo uma ampla faixa de especificidades e funções biológicas. Muita pesquisa foi conduzida sobre as subtilisinas, devido grandemente a sua utilidade em aplicações de alimentação e limpeza. Trabalho adicional foi focado sobre as adversas condições ambientais (por exemplo, descrição a agentes oxidantes, agentes quelantes, extremos de temperatura e/ou pH) que podem diminuir a funcionalidade destas enzimas em várias aplicações. Não obstante, permanece uma necessidade na técnica de sistemas de enzimas que sejam capazes de resistir a estas condições adversas e reter ou ter aperfeiçoada atividade sobre aqueles correntemente conhecidos na técnica.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê variantes de protease engenheiradas. Em particular, as variantes de protease compreendem mutações com2/109 bináveis em selecionadas posições de superfície que afetam a carga e/ou hidrofobicidade da enzima para aperfeiçoar pelo menos uma desejada propriedade da resultante enzima variante em uma aplicação escolhida. Composições compreendendo as variantes de protease, e processos para uso das mesmas também são providos.

Em uma modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas através de correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que

3/109 tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de

4/109 substituições selecionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45QS101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45QS101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45ES101E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24ER45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118ET213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118QT213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S101L-Q109LG118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45LS101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24RS101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R- G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109RG118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109RG118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101RQ109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24ER45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118ET213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101QG118Q-T213Q-L217Q, e S24Q-R45Q-S101Q- G118Q-T213Q-L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante protease é a forma madurra de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende a substituição T213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante de protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e uma combinação de substituições selecionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q,

N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45ES101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q,

S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E5/109

N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109LN118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45LS101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,

S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109QN118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45RS101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R,

S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109RN118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45ES101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R,

S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q-L217Q, e S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213QL217E,, onde as posições correspondem às posições de BPN' subtilisina de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a variante protease é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende a substituição K213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ II NO: 1.

Em uma outra modalidade, a invenção provê um ácido nucleico isolado que codifica qualquer uma das variantes de protease descritas acima.

Em uma outra modalidade, a invenção provê um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico isolado que codifica qualquer uma das variantes de protease descritas acima.

Em uma outra modalidade, a invenção provê uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão, que por sua vez compreende um ácido nucleico isolado que codifica qualquer uma das variantes de protease descritas acima.

Em uma outra modalidade, a invenção provê uma composição de limpeza que compreende pelo menos uma variante de protease que é a

6/109 forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 25, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de

B.amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TC PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5. Em algumas modalidades,a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E,

7/109

G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ II NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente de estabilização.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de: S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ II NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5. Em algumas modalidades, a composição é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R,

8/109

K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ II NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente de estabilização.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q,

S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q,

S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109EG118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45QS101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45LS101L-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24LR45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118LT213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R- G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24RS101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24ES101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R,

S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109EG118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45ES101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, e S24Q-R45Q-S101Q- G118Q-T213Q-L217E, onde as posições são numeradas através de correspondência com a sequência de aminoácidos de B. am9/109 yloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de uma Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende a substituição T213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a invenção provê uma composição de limpeza que compreende pelo menos uma variante protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109QN118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109QN118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45ES101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E,

S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45LS101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q,

10/109

S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45RS101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q,

S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109RN118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45ES101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R,

S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, e S24Q-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q-L217E, onde as posições correspondem às posições de BPN' subtilisina de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Ainda em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende a substituição K213Q, onde a dita posição é numerada através de correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas

11/109 de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, pentosanases, malanases, beta - glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213, e 217, onde as posições são numeradas através de correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, pentosanases, malanases, beta - glicanases, arabinosidases,

12/109 hialuronidase, condroitinase, lacase e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' como mostrada em SEQ ID NO: 1., e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, betaglicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente em um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalhos pesados. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade

13/109 proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' como mostrada em SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' como mostrada em SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI

14/109

PI) que é maior ou igual a 0,5, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q,

S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109EG118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45QS101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45LS101L-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24LR45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118LT213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R- G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24RS101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24ES101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R,

S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109EG118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45ES101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, e

15/109

S24Q-R45Q-S101Q- G118Q-T213Q-L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' como mostrada em SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende a substituição T213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lípases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas mo16/109 dalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q,

N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45ES101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q,

S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,

S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109LN118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45LS101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,

S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109QN118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45RS101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R,

S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109RN118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45ES101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R,

S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q-L217Q, e S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' como mostrada em SEQ ID NO: 1, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidase, proteases, metaloproteases,

17/109 celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, betaglicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos uma variante de protease que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende a substituição K213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que ainda compreende uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas. As adicionais enzimas ou derivados de enzimas são selecionados de hemicelulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente. Em algumas modalidades, o detergente é um detergente de pratos. Em outras modalidades, o detergente é um detergente de lavanderia, por exemplo, um detergente de lavanderia seco ou líquido de trabalho pesado. Em modalidades alternativas, a composição de limpeza ainda compreende pelo menos um agente estabilizante.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de

18/109 um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em duas ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina que é a forma madura de uma variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina que tem atividade proteolítica e compreende uma substituição em uma ou mais posições selecionadas de posições 24, 45, 101, 109, 118, 213 e 217, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, e L217E, onde as posições são nu19/109 meradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, e L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende duas ou mais substituições em duas ou mais posições selecionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, e L217E,, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1, e que tem um índice de performance de nível de expressão de proteína relativo (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é maior ou igual a 0,5.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24QR45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118QT213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E20/109

S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q, S24E-R45ES101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q,

S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118QT213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-G118QT213Q, S24L- R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101LQ109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24RR45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101RG118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109RG118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-S101R-Q109RG118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45ES101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R,

S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109EG118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, e S24Q-R45QS101Q- G118Q-T213Q-L217E, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina GG36 que tem atividade proteolítica e compreende a substituição T213Q, onde as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN' mostrada como SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende uma combinação de substituições selecionadas de S24QA45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q,

S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45ES101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q21/109

N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45LS101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118LK213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101QN109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24RA45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118RK213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45R-S101RN109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R, S24EA45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118RK213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R, S24E-A45E-S101EN109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, e S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E, onde as posições correspondem às posições de BPN' subtilisina de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade, a composição de limpeza compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina isolada de Bacillus subtilisina FNA que tem atividade proteolítica e compreende a substituição K213Q, onde a dita posição é numerada por correspondência com a sequência de aminoácidos de B. amyloliquefaciens BPN' mostrada como SEQ ID NO:1.

Em uma outra modalidade, a invenção provê um processo de limpeza que compreende contato de uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com qualquer uma das composições de limpeza descritas, e opcionalmente lavando e/ou rinsando a dita superfície ou artigo.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 provê um alinhamento da forma madura de proteases de origem GG36 (SEQ ID NO: 4) e FNA (SEQ ID NO: 7) com BPN' (SEQ ID NO: 1). A menos que de outro modo especificado, posições de substituição são dadas em relação a BPN'.

A figura 2 provê uma matriz de mudança de carga indicando a mudança de carga para substituições de resíduo de aminoácido em pH 8,6. A partir desta matriz a mudança de carga líquida de uma enzima variante como comparada a uma enzima de origem pode ser facilmente determinada.

22/109

A figura 3 provê uma matriz de mudança de hidropaticidade Kyte-Doolittle indicando a mudança de hidropaticidade para substituições de resíduos de aminoácidos. A partir desta matriz a mudança de hidropaticidade líquida de uma enzima variante como comparada a uma enzima de origem pode ser facilmente determinada.

A figura 4 provê um mapa de pAC-GG36ci.

A figura 5 provê um mapa de pAC-FNAre.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê variantes de protease engenheiradas. Em particular, as variantes de protease compreendem mutações combináveis em selecionadas posições de superfície que afetam a carga e/ou hidrofobicidade da enzima para aperfeiçoar pelo menos uma propriedade desejada da resultante enzima variante em uma aplicação escolhida. Composições compreendendo as variantes de protease, e processos de para uso das mesmas também são providos.

Como aqui indicado, introdução de substituições que afetam a carga e/ou hidrofobicidade de subtilisina resultam em uma enzima que compreende pelo menos uma mutação combinável para prover uma variante de protease tendo um índice de performance para pelo menos uma propriedade de interesse sendo um índice de performance > 0,5 quando comparado àquele da enzima de origem. As mutações combináveis servem para aperfeiçoar o índice de performance para pelo menos uma desejada propriedade de enzima em uma variedade de aplicações. Propriedades de interesse incluem, mas não são limitadas à carga, hidrofobicidade, solubilidade, performance de limpeza, por exemplo, remoção de mancha de tecido e/ou superfícies duras, estabilidade térmica, estabilidade de estocagem, estabilidade detergente, ligação a substrato, inibição de enzima, nível de expressão, taxa de reação, e degradação de substrato. Em algumas modalidades, a propriedade de interesse é uma ou mais propriedades selecionadas de carga, hidrofobicidade, nível de expressão (TCA PI) e performance de limpeza, por exemplo, remoção de mancha (BMI PI). Embora aqui descritas em relação a proteases e manchas de sangue, leite e tinta (BMI), é contemplado que as

23/109 variantes de protease da presente invenção são otimizadas para qualquer interação enzima - substrato em qualquer de uma variedade de meios de reação ditados pela aplicação, por exemplo, aplicações de limpeza.

Previamente, esforços para desenvolvimento de proteínas superiores focalizaram sobre minimização de ligação de enzima a superfícies. Por exemplo, alguns processos envolveram alteração de sequência de subtilisina para obter enzimas variantes com diminuída adsorção a substratos insolúveis (ver, por exemplo, WO 95/07991). Em um outro aspecto, o pI de subtilisina foi alterado de modo a obter-se enzimas variantes com uma carga líquida de zero em um pH definido (ver, por exemplo, WO 91/00345). Entretanto, como determinado durante o desenvolvimento da presente invenção, estas abordagens não são sempre bem-sucedidas. Durante o desenvolvimento da presente invenção, foi determinado que propriedades de superfície de enzimas geralmente têm ótimos que são determinados como uma função de mudança em carga de superfície e/ou hidrofobicidade. Mesmo para enzimas que são normalmente bem ativas, propriedades de superfície podem fazer com que a reação total seja muito mais lenta sob algumas condições e com alguns substratos do que sob outras condições e/ou com outros substratos. Em algumas modalidades a presente invenção provê variantes de protease que compreendem propriedades de superfície modificadas obtidas através de mudança de natureza de um ou mais aminoácidos sobre a superfície de enzima. Quando estas mudanças são feitas em sítios sobre a superfície que não interage com quaisquer outros aminoácidos e não são necessários para função de enzima, as propriedades da proteína são previstas baseado nas propriedades dos aminoácidos substituídos naquelas posições como aqui descrito.

Sítios são facilmente identificados a partir de dados de estrutura; alternativamente, alinhamentos de sequências homólogas, dados de biblioteca de avaliação de sítio e/ou qualquer combinação dos mesmos encontram uso. Matrizes de escore de aminoácidos (por exemplo, figura 1) e/ou escalas de hidrofobicidade (por exemplo, figura 2) encontram uso em orientação de substituição(ões) de aminoácido e identificação daquelas proprie24/109 dades físicas da proteína que correlacionam com as propriedades dos aminoácidos substituídos.

Definições

A menos que de outro modo indicado, a prática da presente invenção envolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecular, microbiologia, e DNA recombinante, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são conhecidas por aqueles versados e são descritas em numerosos textos e trabalhos de referência bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Todas as patentes, pedidos de patentes, artigos e publicações aqui mencionados, ambos, supra e infra, são aqui expressamente incorporados por referência.

A menos aqui de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos têm os mesmos significados como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos encontrem uso na prática da presente invenção, alguns dos processos e materiais preferidos são aqui descritos. Da mesma maneira, os termos definidos imediatamente abaixo são mais inteiramente descritos por referência ao Relatório Descritivo como um todo.

Também, como aqui usado, o singular um, uma, e o inclui a referência plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para direita na orientação 5' para 3'; sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para direita em orientação amino para carbóxi, respectivamente. É para ser entendido que esta invenção não é limitada à particular metodologia, protocolos, e reagentes descritos, à medida que estes podem variar, dependendo do contexto em que eles são usados por aqueles versados na técnica.

É pretendido que toda limitação numérica máxima dada por todo este relatório descritivo inclua toda limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente aqui escritas. Toda

25/109 limitação numérica mínima dada por todo este relatório descritivo incluirá toda limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente aqui escritas. Toda faixa numérica dada por todo este relatório descritivo incluirá toda faixa numérica mais estreita que caia dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente aqui escritas.

Além disso, os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção, os quais podem ser feitos através de referência ao relatório descritivo como um todo. Da mesma maneira, os termos definidos imediatamente abaixo são mais inteiramente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Não obstante, de modo a facilitar entendimento da invenção, um número de termos são definidos abaixo.

Como aqui usado, o termo índice de performance (PI) refere-se à razão da performance de uma enzima variante em relação àquela da enzima de origem ou referência em um dado ensaio. O PI para performance de limpeza é aqui provido como a performance para remoção de manchas de sangue, leite e tinta (BMI), e é provido como um valor BMI PI. O PI para performance de nível de expressão é aqui provido como o nível de proteína produzida como medida por precipitação com ácido tricloro acético (TCA), e é provido como um valor TCA PI.

Como aqui usado, mutações combináveis são aquelas mutações para as quais a variante compreendendo as mutações tem um valor de Índice de Performance (PI) > 0,5 para pelo menos uma propriedade. Mutações combináveis são mutações que podem ser combinadas para liberação de proteínas com apropriados Índices de Performance para uma ou mais propriedades desejadas, e têm mudanças em carga e/ou hidrofobicidade. Posições nas quais ocorrem mutações são classificadas como se segue: posições não-restritivas têm = 20% de mutações neutras para pelo menos uma propriedade; e posições restritivas têm < 20% de mutações neutras para atividade e estabilidade.

O termo isolado ou purificado refere-se a um material que é

26/109 removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele está ocorrendo naturalmente). Por exemplo, o material é dito ser purificado quando ele está presente em uma particular composição em uma concentração maior ou menor do que existe em um organismo ocorrendo naturalmente ou tipo selvagem ou em combinação com componentes normalmente não presentes com expressão a partir de um organismo tipo selvagem ou ocorrendo naturalmente. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo ocorrendo naturalmente presente em um animal vivo não está isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, está isolado. Em algumas modalidades, tais polinucleotídeos são parte de um vetor, e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos são parte de uma composição, e ainda ser em isolados em que tal teor ou composição não é parte de seu ambiente natural. Em modalidades preferidas, um ácido nucleico ou proteína é dito ser purificado, por exemplo, se ele origina essencialmente uma banda em um gel de eletroforese ou ponto.

O termo isolado, quando usado em referência a uma sequência de DNA, refere-se a uma sequência de DNA que foi removida de seu milieu genético natural e está assim livre de outras sequências codificantes estranhas ou indesejadas, e está em uma forma apropriada para uso dentro de sistemas de produção de proteína engenheirados geneticamente. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas de seu ambiente natural e incluem cDNA e clones genômicos. Moléculas de DNA isoladas da presente invenção são livres de outros genes com os quais elas são comumente associadas, mas podem incluir regiões não-traduzidas 5' e 3' ocorrendo naturalmente tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente para aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985]). O termo uma sequência de DNA isolada é alternativamente referido como uma sequência de DNA clonada.

O termo isolado, quando usado em referência a uma proteína, refere-se a uma proteína que é encontrada em uma condição outra que não

27/109 seu ambiente nativo. Em uma forma preferida, a proteína isolada é substancialmente livre de outras proteínas, particularmente outras proteínas homólogas. Uma proteína isolada é mais que cerca de 10% pura, preferivelmente mais que cerca de 20% pura, e mesmo mais preferivelmente mais que cerca de 30% pura, como determinado por SDS-PAGE. Ainda aspectos da invenção abrangem a proteína em uma forma altamente purificada (isto é, mais que cerca de 40% pura, mais que cerca de 60% pura, mais que cerca de 70% pura, mais que cerca de 80% pura, mais que cerca de 90% pura, mais que cerca de 95% pura, mais que cerca de 97% pura, e mesmo mais que cerca de 99% pura), como determinado por SDS-PAGE. Como aqui usado, uma proteína de origem refere-se à proteína que é modificada, por exemplo, através de introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos, para gerar uma ou mais variantes da proteína de origem. Assim, os termos variante protease e variante de protease são usados em referência a proteases parentes que são similares a variante de protease, particularmente em sua função, mas têm mutações em sua sequência de aminoácidos que as tornam diferentes em sequência da protease de origem em de uma a 20 posições de aminoácidos. As sequências de aminoácidos da região madura de proteases de origem exemplares são mostradas no alinhamento de figura 1. FNA (SEQ ID NO: 7) e GG36 (SEQ ID NO: 4) são as proteases de origem maduras que foram modificadas para conterem uma ou mais substituições combináveis para geração de variantes de protease da invenção. GG36 é uma Bacillus lentus protease tipo selvagem, e FNA é a Bacillus amyloliquefaciens BPN' protease contendo a substituição Y217L.

Como aqui usados, os termos protease e atividade proteolítica referem-se a uma proteína ou peptídeo exibindo a habilidade para hidrolisar peptídeos ou substratos tendo ligações peptídicas. Existem muitos procedimentos bem conhecidos para medição de atividade proteolítica (Kalisz, Microbial Proteinases, In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1981]). Por exemplo, atividade proteolítica pode ser determinada através de ensaios comparativos que analisam a respectiva habilidade de protease para hidrolisar um substrato comercial. Substratos exem28/109 plares úteis na análise de protease ou atividade proteolítica incluem, mas não são limitados a dimetil caseína (Sigma C-9801), colágeno bovino (Sigma C-9879), elastina bovina (Sigma E-1625), e ceratina bovina (ICN Biomedical 902111). Ensaios colorimétricos utilizando estes substratos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 99/34011; e patente US 6 376 450, ambas as quais são aqui incorporadas por referência). O ensaio pNA 9ver, por exemplo, Del Mar et al., Anal. Biochem. , 99:316-320 [1979]) também encontrada uso em determinação de concentração de enzima ativa para frações coletadas durante eluição de gradiente. Este ensaio mede a taxa na qual p-nitro anilina é liberada quando a enzima hidrolisa o substrato sintético solúvel, succinil - alanina - prolina - fenil alanina - p-nitro anilida (sucAAPF-pNA). A taxa de produção de cor amarela a partir da reação de hidrólise é medida em 410 nm em um espectrômetro e é proporcional à concentração de enzima ativa. Em adição, medições de absorbância em 280 nm podem ser usadas para determinar a concentração total de proteína. A razão de enzima ativa/proteína total rende a pureza de enzima.

Como aqui usado, o termo subtilisina refere-se a qualquer membro da família S8 serina protease como descrito em MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucleic Acids Res, 34 Database issue, D270-272, 2006, no site da web merops.sanger.ac.uk/cgibin/merops.cgi?id=s08; action=). A seguinte informação foi derivada de MEROPS - The Peptidase Dta base como de 6 de novembro de 2008 Peptidase family S8 contains the serine endopeptidase subtilisin and its homologues (Biochem J, 290:205-218, 1993). A família S8, também conhecida como a família subtilase, é a segunda maior família de serina peptidases, e pode ser dividida em duas subfamílias, com subtilisina (S08.001) o tipo - exemplo para subfamília S8A e cexina (S08.070) o exemplo - tipo para subfamília S8B. Tripeptidil peptidase II (TPP-II; S08.090) foi anteriormente considerada ser o exemplo - tipo de uma terceira subfamília, mas foi determinada ter sido classificada erradamente. Membros da família S8 têm uma tríade catalítica na ordem Asp, His e Ser na sequência, que é uma ordem diferente daquela de famílias S1, S9 e S10. Em subfamília S8A,

29/109 os resíduos em sítio ativo frequentemente ocorrem em motivos Asp-Thr/SerGly (que é similar ao motivo de sequência em famílias de endopeptidases aspárticas em grupo AA), His-Gly-Thr-His e Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro. Em subfampilia S8B, os resíduos catalíticos frquentemente ocorrem nos mo0tivos Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg e Gly-Thr-Ser-Ala/Ser-Pro., A maioria dos membros da família S8 são endopeptidases, e são ativos em pH suavemente alcalino - neutro. Muitas peptidases na família são termoestáveis. Caseína é frequentemente usada como um substrato proteína e um substrato sintético típico é suc-AAPF. Maioria de membros da família são peptidases não-específicas com uma preferência para clivar após resíduos hidrofóbicos. Entretanto, membros de subfamília S8B, tais como cexina (S08.070) e furina (S08.071), clivam após aminoácidos dibásicos. A maioria dos membros da família S8 são inibidos pelos inibidores serina peptidase genéricos tais como DFP e PMSF. Devido muitos membros da família ligarem-se a cálcio para estabilidade, inibição pode ser vista com EDTA e EGTA, que são frequentemente pensados serem inibidores específicos de metalopeptidases. Inibidores de proteínas incluem domínio terceiro ovomucoide de peru (I01.003), inibidor de subtilisina de Streptomyces (I16.003), e membros da família I13 como eglina C (I13.001) e inibidor de cevada CI-1^a (I13.005), muitos dos quais também inibem quimiotripsina (S01.001). O pró-peptídeo subtilisina é ele próprio inibidor, e o homólogo inibidor de proteinase B de Saccharomyces inibe cerevisina (S08.052). As estruturas terciárias para vários membros de família S8 foram agora determinadas. Uma estrutura de proteína S8 típica consiste em três camadas com uma folha beta de sete - fitas intercalada entre duas camadas de hélices. Subtilisina (S08.001) é a estrutura tipo para grupo SB (SB). A despeito de estrutura diferente, os sítios ativos de subtilisina e quimiotripsina (S01.001) podem ser superpostos, o que sugere que a similaridade é o resultado de evolução convergente antes que divergente.

Como aqui usados, os termos Bacillus e gênero Bacillus incluem todas as espécies dentro de gênero Bacillus, como conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitado a B. subtilis, B. li30/109 cheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganização taxonômica. Assim, é pretendido que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas incluindo, mas não limitado a organismos tais como B. stearothermophilus, que é agora chamado Geobacillus stearothermophilus. A produção de endoesporos resistentes na presença de oxigênio é considerada a característica definidora do gênero Bacillus, embora esta característica também seja aplicada aos recentemente nomeados AlicycloBacillus, AmphiBacillus, AneuriniBacillus, AnoxyBacillus, BreviBacillus, FiloBacillus, GraciliBacillus, HaloBacillus, PaeniBacillus, SaliBacillus, ThermoBacillus, UreiBacillus, e VirgiBacillus.

Os termos proteína e polipeptídeo são aqui usados intercambiavelmente. O código de 3 letras para aminoácidos como definido em conformidade com a IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usada por toda esta descrição. Também é entendido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeo devido à degenerescência do código genético. Uma pró-sequência é uma sequência de aminoácidos entre o peptídeo sinal e a região madura de uma protease. A pró-sequência é clivada durante o processo de maturação que resulta na produção da forma madura ativa da protease.

O termo sequência sinal ou peptídeo sinal refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos que participa na secreção das formas madu7ra ou precursora da proteína. Esta definição de sequência sinal é uma funcional, pensada incluir todas aquelas sequências de aminoácidos codificadas pela porção terminal-N do gene de proteína, que participam na efetuação da secreção de proteína. Elas são frequentemente, mas não universalmente, ligadas à porção terminal-N de uma proteína ou à porção terminal-N de uma proteína precursora. A sequência sinal pode ser endógena ou exógena. A sequência sinal pode ser aquela normalmente associada com a proteína (por exemplo, protease), ou pode ser de um gene codificando uma outra proteína secretada. Uma sequência sinal exógena exem31/109 plar compreende os primeiros sete resíduos de aminoácidos da sequência sinal de B. subtilis subtilisina fundidos ao restante da sequência sinal da subtilisina de B. lentus (ATCC 21536).

O termo sequência sinal híbrida refere-se a sequências sinais nas quais parte de sequência é obtida a partir de expressão de hospedeiro fundido à sequência sinal do gene a ser expresso. Em algumas modalidades, sequências sintéticas são utilizadas.

O termo forma madura de uma proteína ou peptídeo refere-se à forma funcional final da proteína ou peptídeo. Para exemplificar, a forma madura da FNA protease aqui provida inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, enquanto uma forma madura da GG36 protease inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

O termo precursor aqui refere-se à forma de uma proteína ou peptídeo tendo uma pró-sequência ligada operavelmente ao terminus amino ou carbonila da proteína madura. Para exemplificar, SEQ ID NOs: 3 e 6 são sequências dos precursores da GG36 madura (SEQ ID NO: 4) e FNA (SEQ ID NO: 7), respectivamente. O precursor também pode ter uma sequência sinal ligada operavelmente, ao terminus amino da pró-sequência. O precursor também pode ter adicionais polinucleotídeos que estão envolvidos em atividade pós-traducional (por exemplo, polinucleotídeos clivados dos mesmos para deixarem a forma madura de uma proteína ou peptídeo).

Enzima ocorrendo naturalmente e proteína ocorrendo naturalmente referem-se a uma enzima ou proteína tendo a sequência de aminoácidos não-modificada idêntica àquela encontrada na natureza. Enzimas ocorrendo naturalmente incluem enzimas nativas, aquelas enzimas expressas naturalmente ou encontradas no particular micro-organismo.

Os termos derivado de e obtido de referem-se não somente a uma enzima (por exemplo, protease) produzida ou produzível por uma linhagem do organismo em questão, mas também uma enzima codificada por uma sequência de DNA isolada de uma tal linhagem e produzida em um organismo hospedeiro contendo tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo refere-se a uma enzima que é codificada por uma sequência de DNA de

32/109 origem sintética e/ou cDNA e que tem as características de identificação da enzima em questão.

Um derivado dentro do escopo desta definição geralmente retém a característica atividade proteolítica observada na forma tipo selvagem, nativa ou de origem na extensão em que o derivado é útil para propósitos similares como a forma tipo selvagem, nativa ou de origem. Derivados de enzimas funcionais abrangem peptídeos ou fragmentos de peptídeos ocorrendo naturalmente, produzidos sinteticamente ou recombinantemente tendo as características gerais da enzima de origem.

Como aqui usado, através de correspondência a refere-se a um resíduo na posição enumerada em uma proteína ou peptídeo.

Como aqui usado, substituído e substituições referem-se à substituição (ões) de um ou mais resíduos de aminoácidos ou bases de ácidos nucleicos em uma sequência de origem. Em algumas modalidades, a substituição envolve a substituição de um resíduo ou base ocorrendo naturalmente. Em algumas modalidades, dois ou mais aminoácidos são substituídos para gerarem uma variante de protease que compreende uma combinação de substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, combinações de substituições são representadas pela posição de aminoácido na qual a substituição é feita. Por exemplo, uma combinação representada por E6A-E30G significa que ácido glutâmico (E) na posição 6 é substituído com alanina (A) e o ácido glutâmico (E) na posição 30 é substituído com uma glicina. Posições de aminoácidos são dadas por correspondência à posição numerada na região madura da subtilisina BPN' (SEQ ID NO: 1).

A frase substituição em duas ou mais posições aqui refere-se a uma combinação de duas ou mais substituições que são feitas na mesma proteína. Assim, uma substituição em duas ou mais posições refere-se a qualquer uma de uma combinação de 2, 3, 4, 5, e 7 substituições de aminoácidos.

Como aqui usado, os termos cassete de expressão e vetor de expressão referem-se a construtos de ácido nucleico gerados recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de específicos elementos ácidos

33/109 nucleicos que permitem transcrição de um particular ácido nucleico em uma célula-alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossoma, DNA mitocondrial, DNA plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção de cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em modalidades preferidas, vetores de expressão têm a habilidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos em uma célula hospedeira. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos são comercialmente disponíveis. Seleção de apropriados vetores de expressão está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica. O termo cassete de expressão é aqui usado intercambiavelmente com construção DNA, e seus equivalentes gramaticais. Seleção de apropriados vetores de expressão está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica.

Como aqui usado, o termo vetor refere-se a uma construção de polinucleotídeo projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de células. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores lançadores, plasmídeos, cassetes e semelhantes. Em algumas modalidades, a construção de polinucleotídeo compreende uma sequência de DNA codificando a protease (por exemplo, precursor ou protease madura) que está operavelmente ligada a uma apropriada pró-sequência (por exemplo, secretora, etc.) capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro apropriado.

Como aqui usado, o termo plasmídeo refere-se a uma construção de DNA de fita dupla (ds) circular usada como um vetor de clonagem, e que forma um elemento genético auto - replicante extra - cromossômico em alguns eucariotes ou procariotes, ou integra-se no cromossoma hospedeiro.

Como aqui usados, os termos linhagem hospedeira ou célula hospedeira refere-se a um apropriado hospedeiro para um vetor de expressão compreendendo DNA de acordo com a presente invenção.

Como aqui usado, composições de limpeza e formulações de limpeza referem-se a composições que encontram uso na remoção de

34/109 compostos indesejados de itens a serem limpos, tais como tecido, pratos, lentes de contato, outros substratos sólidos, cabelo (xampus), pele (sabões e cremes), dentes (lavagens bucais, pastas de dentes), etc. O termo abrange quaisquer materiais/compostos selecionados para o particular tipo de composição de limpeza desejado e a forma do produto (por exemplo, líquido, gel, grânulo, pulverizado ou composição de espargimento), usado na composição. A específica seleção de materiais de composição de limpeza é facilmente feita através de consideração de superfície, item ou tecido a ser limpo, e a desejada forma da composição para as condições de limpeza durante uso.

Os termos ainda referem-se a qualquer composição que seja apropriada para limpeza, alvejamento, desinfecção, e/ou esterilização de qualquer objeto e/ou superfície. É pretendido que os termos incluam, mas não sejam limitados a, composições detergentes (por exemplo, detergentes de lavanderia sólidos e/ou líquidos e detergentes de tecidos finos; formulações de limpeza de superfície dura, tais como vidro, madeira, cerâmica e bancadas de metal e janelas; limpadores de carpetes; limpadores de forno; refrescadores de tecido; amaciantes de tecidos, e pré-spotters de lavanderia e têxteis, assim como detergentes de pratos).

Realmente, o termo composição de limpeza como aqui usado, inclui a menos que de outro modo indicado, agentes de lavagem de trabalho pesado ou todo propósito em forma granula ou pulverizada, seca, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem para todo propósito em forma líquida, gel ou pasta, especialmente os assim chamados tipos líquidos de trabalho pesado (HDL); detergentes líquidos de tecidos finos; agentes de lavagem manual de pratos ou agentes de lavagem de pratos de trabalho leve, especialmente aqueles tipo alta formação de espuma; agentes de lavagem de pratos em máquina, incluindo os vários tipos de comprimido, granular, líquido e auxiliar de rinsagem para uso doméstico e institucional; agentes desinfetantes e de limpeza líquidos, incluindo tipos de lavagem manual antibacteriana, barras de limpeza, lavagens bucais, limpadores de dentaduras, xampus de carro ou carpete, limpadores de banheiro; xampus de cabelos e

35/109 rinsagens de cabelos; géis de chuveiro e banhos de espuma e limpadores de metais; assim como auxiliares de limpeza como aditivos alvejantes e tipos gruda-mancha ou pré-tratamento.

Como aqui usado, composições de limpeza de tecido incluem composições detergentes de lavanderia em máquinas e manuais incluindo composições aditivas de lavanderia e composições apropriadas para uso no encharcamento e/ou pré-tratamento de tecidos manchados (por exemplo, panos, linhos, e outros materiais têxteis).

Como aqui usado, composições de limpeza não-tecido incluem composições de limpeza de superfície não-têxtil (isto é, tecido), incluindo mas não limitado a composições detergentes de lavagem de pratos, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e composições de limpeza pessoal.

Como aqui usados, os termos composição detergente e formulação detergente são usados em referência a misturas que são pretendidas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em modalidades preferidas, o termo é usado em referência a detergentes usados para limpeza de pratos, talheres, etc. (por exemplo, detergentes de pratos ou detergentes de lavagem de pratos). Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer particular formulação ou composição detergente. Realmente, é pretendido que em adição a detergentes que contêm pelo menos uma protease da presente invenção, o termo abrange detergentes que contêm tensoativos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido reductases, builders, agentes alvejantes, ativadores de alvejantes, agentes azuis, e corantes fluorescentes, inibidores de formação de torta, agentes de mascaramento, ativadores de enzimas, antioxidantes e solubilizadores.

Como aqui usado, composição de lavagem de pratos refere-se a todas as formas de composições para limpeza de utensílios de louça, incluindo talheres incluindo, mas não limitado a formas granulares e líquidas. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer particular tipo ou composição de lavagem de louça. Realmente, a presente invenção encontra uso em limpeza de utensílios de louça (por exemplo, pratos, inclu36/109 indo mas não limitado a, pratos, taças, copos, tigelas, etc.) e talheres (por exemplo, utensílios, incluindo mas não limitado a colheres, facas, garfos, utensílios de serviço, etc.) de qualquer material, incluindo mas não limitado a cerâmicas, plásticos, metais, china, vidro, acrílicos, etc. O termo utensílio de louça é aqui usado em referência a ambos pratos e talheres

Como aqui usado, detergentes de lavagem de louça contendo não-fosfato são detergentes que contêm não mais que 0,5% de fósforo (isto é, fósforo é um elemento em traços).

Como aqui usado, performance de lavagem ou performance de limpeza de uma variante de protease refere-se à contribuição feita por uma variante de protease para a habilidade de limpeza de uma composição de limpeza quando comparada àquela obtida na ausência da variante de protease.

O termo condições relevantes de lavagem é aqui usado para indicar as condições, particularmente temperatura de lavagem, tempo, mecânicas de lavagem, concentração de espuma, tipo de detergente e dureza de água, realmente usadas em lares em um segmento de mercado de detergente de pratos ou lavanderia.

O termo aperfeiçoada performance de lavagem é usado para indicar que um melhor resultado final é obtido em remoção de mancha sob condições relevantes de lavagem, ou que menos variante de protease, em base em peso, é necessária para obter o mesmo resultado final em relação à correspondente protease de origem tipo selvagem ou de partida.

Como aqui usado, o termo desinfetante refere-se à remoção de contaminantes a partir de superfícies, assim como a inibição ou morte de micróbios sobre as superfícies de itens. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer particular superfície, item, ou contaminante(s) ou micróbios a serem removidos.

Como aqui usado, quantidade eficaz de enzima refere-se à quantidade de enzima necessária para obter a atividade enzimática requerida na específica aplicação (por exemplo, produto de cuidados pessoais, composição de limpeza, etc.). Tais quantidades efetivas são facilmente de37/109 terminadas por aqueles versados na técnica e são baseadas em muitos fatores, tais como a particular variante de enzima usada, a aplicação de limpeza, a específica composição da composição de limpeza, e se uma composição líquida ou seca (por exemplo, granular, barra) é requerida, e semelhantes.

A forma compacta das presentes composições de limpeza é melhor referida através de densidade e, em termos de composição, através da quantidade de sal inorgânico de enchimento. Sais inorgânicos materiais de enchimento são ingredientes convencionais de composições detergentes em forma pulverizada. Em composições detergentes convencionais, os sais de enchimento estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente cerca de 17 a cerca de 35% em peso da composição total. Em contraste, em composições compactas, o sal de enchimento está presente em quantidades não excedendo cerca de 15% da composição total. Em algumas modalidades, o sal de enchimento está presente em quantidades que não excedem cerca de 10%, ou mais preferivelmente, cerca de 5%, em peso da composição. Em algumas modalidades, os sais inorgânicos materiais enchimento são selecionados dos sais de metais alcalinos e alcalinoterrosos de sulfatos e cloretos. Um sal de enchimento preferido é sulfato de sódio.

Como aqui usado, ingrediente adjunto ou material adjunto refere-se a materiais de limpeza que incluem, mas não são limitados a, tensoativos, builders, alvejantes, ativadores de alvejantes, catalisadores alvejantes, outras enzimas, sistemas estabilizadores de enzimas, quelantes, abrilhantadores óticos, polímeros de liberação de sujeira, agentes de transferência de corante, dispersantes, supressores de espuma, corantes, perfumes, corantes, sais de enchimento, hidrótropos, fotoativadores, fluorescentes, condicionadores de tecido, tensoativos hidrolisáveis, preservativos, antioxidantes, agentes antiencolhimento, agentes anticontração, germicidas, fungicidas, pontos de cor, silvercare, agentes antiembaciamento e/ou anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes de solubilização, carreadores, auxiliares de processamento, pigmentos e agentes de controle de pH (ver, por exemplo, patentes US N^os 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 e 5,646,101,, todas as quais são aqui in38/109 corporadas por referência).

Como aqui usado, composição de lavagem de pratos refere-se a todas as formas para composições para limpeza de pratos, incluindo, mas não limitado a formas granulares e líquidas.

Como aqui usado, composição de limpeza de tecido refere-se a todas as formas de composições detergentes para limpeza de tecidos, incluindo, mas não limitado a formas granulares, líquidas e em barras.

Como aqui usado, tecido abrange qualquer material têxtil. Assim, é pretendido que o termo inclua peças de roupa, assim como tecidos, fios, fibras, materiais não-tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil.

Como aqui usado, têxtil refere-se a tecidos tecidos, assim como fibras de comprimento padrão e filamentos apropriados para conversão a, ou uso como, fios, tecido, malha, e tecidos não-tecidos. O termo abrange fios fabricados de fibras naturais, assim como sintéticas (por exemplo, fabricadas).

Como aqui usado, materiais sintéticos é um termo genérico para fibras, intermediários de fios, fio, tecidos, e produtos fabricados de tecidos (por exemplo, peças de roupas e outros artigos).

A maioria das estratégias correntemente utilizadas para aperfeiçoamento de desempenho de proteína em aplicações industriais, de consumidor ou farmacêuticas focalizou sobre substituições de aminoácidos no, ou perto do, sítio ativo da enzima, de modo a aumentar a eficiência catalítica. Entretanto, durante o desenvolvimento da presente invenção, foi determinado que mutações em outros locais sobre a superfície de enzima aumentam dramaticamente o desempenho de enzima além do que é possível através de aperfeiçoamentos em eficiência catalítica. Basicamente, a taxa de reação governando conversão de substratos a produtos mediada por enzimas é somente parcialmente controlada através da taxa da etapa de conversão catalítica química sozinha. Enzimas e substratos interagem como coloides antes de sua associação como um complexo de enzima - substrato ES, assim como durante dissociação do complexo de enzima - produto EP que é

39/109 formado após conversão química. Mesmo se a etapa de reação procede em uma taxa rápida, abordagem de enzima na direção de substrato pode ser extremamente lenta (por exemplo, difusão - limitada), como no caso de coloides de mesmo - sinal experimentando forças eletrostáticas repulsivas. Da mesma maneira, liberação de enzima a partir do complexo enzima - produto EP pode ser extremamente lenta (por exemplo, difusão limitada), como no caso de coloides experimentando forças dispersivas e hidrofóbicas de faixa curta atrativas. Ambas as condições aumentam o tempo de trânsito de enzima de substrato para produto e se torna taxa - limitante de etapa comparado a conversão química. Embora seja possível prever que coloides carregados de modo oposto possam realmente acelerar a formação de complexos ES (por exemplo, acima de limite de difusão), subsequente dissociação do complexo EP pode ser dolorosamente lenta (assumindo que nenhuma carga é criada ou perdida) e a taxa de reação total pode diminuir. Por isso, a assimetria do potencial de interação semelhante a par é explorada de modo a assegurar tempos de trânsito mínimos para ambos complexos ES e EP. Isto é particularmente importante em biotecnologia industrial, uma vez que é desejável converter todo o substrato a produto na menor quantidade de tempo possível sob condições frequentemente limitadas - enzima. Historicamente, engenheiros de proteínas focalizaram sobre específicas interações enzima substrato da etapa de conversão química e falharam em reconhecer a contribuição de ambas as interações não-específicas de faixa curta e longa, surgindo de forças de superfície e coloidais intermoleculares, que governam as etapas de associação e dissociação. Um objetivo da presente invenção é prover variantes de protease tendo propriedades de superfície alteradas obtidas através de alteração de natureza de um ou mais aminoácidos sobre a superfície de enzima que otimizam forças moleculares para o ponto onde a etapa de conversão química torna-se limitante - taxa.

Modificação de propriedades de superfície é obtida através de introdução de substituições de aminoácidos que alteram a carga e/ou hidrofobicidade da enzima usando os processos aqui descritos. Uma vez a etapa de conversão química torne-se limitante de taxa, ainda aperfeiçoamentos na

40/109 performance da enzima variante podem ser obtidos através de mudanças no sítio ativo de enzima. Este objetivo é aplicável se o substrato é um pequeno peptídeo em solução ou um substrato macroscópico insolúvel. Não obstante, conhecimento do mecanismo(s) envolvido não é necessário de modo a obter e usar a presente invenção. Nem é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer particular mecanismo. Em resumo os processos usados para gerar as variantes de protease da presente invenção envolvem (I) ensaio de proteínas sondas disseminando uma faixa de propriedade física; (II) determinação de ótima propriedade física para um dado resultado favorável ; e (III) provimento de proteínas variantes tendo a ótima propriedade física

I. Ensaio de proteínas sondas

Ensaio de proteínas sondas envolve os testes de múltiplas proteínas sondas (isto é, dobras de proteína sonda) espalhando a faixa de uma propriedade física de interesse (isto é, uma propriedade de interesse) em um apropriado ensaio. Proteínas sondas incluem um limitado conjunto de proteínas e/ou suas variantes. Em algumas modalidades exemplares, pelo menos uma serina protease foi testada para um ou mais benefícios. Por exemplo, a mudança em carga líquida da variante em relação à enzima de origem para duas serina proteases, GG36 e FNA foi provida. A mudança de carga líquida para as variantes de GG36 e FNA como aqui descrito estende uma faixa de mudança de carga líquida relativa de -7 para 0 como comparada às respectivas enzimas de origem.

II. Determinação de ótima propriedade física

Determinação de ótima propriedade física, isto é, determinação de ótimo de uma propriedade de interesse, envolve identificação de um ótimo de propriedade física ou sua faixa para um resultado favorável. Em algumas modalidades exemplares, o índice de performance de limpeza, aqui provido como o BMI PI de variantes de protease FNA e GG36 como medido. Em outras modalidades, o presente nível de expressão provido como o TCA PI das variantes de protease FNA e GG36 foi medido. Nas presentes modalidades, quando comparando benefícios obtidos com proteínas tendo a mesma dobra, isto é, serina proteases, um relativo foi empregado (por e41/109 xemplo, diferencial de carga líquida em relação à proteína de origem ou tipo selvagem). Alternativamente, quando comparando benefícios obtidos com proteínas tendo dobras diferentes, por exemplo, serina proteases e metalo proteases, um escala de propriedade física comum é empregada (por exemplo, carga de proteína reportada como potencial zeta). Proteínas sondas abrangendo uma ampla faixa de propriedades físicas são empregadas de modo a aumentar a probabilidade de definição de um ótimo para aquela propriedade física. Uma vez o valor ótimo ou faixa ótima para um benefício de interesse tenha sido estabelecida através de ensaio de proteínas sondas, é possível prever ambas, a direção geral e magnitude de mudança prováveis de serem requeridas para conversão de um ator inferior (por exemplo, estando fora da faixa ótima) em um ator superior (por exemplo, dentro da faixa ótima).

Uso de mais de uma série de proteína sonda é contemplado para permitir a identificação de diferentes ótimas propriedades físicas para um benefício de interesse. Por exemplo, em algumas modalidades, ambas mudanças em carga líquida e hidrofobicidade em relação àquela da enzima de origem das proteases detergentes GG36 e FNA são testadas para performance de limpeza em um ensaio de sangue, leite, tinta. Em alguns exemplos, a mesma propriedade física é contemplada para exibir diferentes ótimos para diferentes benefícios. Por exemplo, existe uma ótima carga de protease para desempenho de limpeza para FNA (BMI PI), que é distinta da carga de protease ótima para nível de expressão (TCA PI).

Em algumas modalidades, propriedades físicas relacionadas a carga são comparadas através de proteínas de origem e variantes em termos de potencial zeta medido, carga líquida, densidade de carga, e/ou contagem de superfície de grupos ionizáveis. Em geral, qualquer processo de determinação de carga de proteína a partir de titulação ou medições eletroforéticas é apropriado para comparação de diferentes dobras de proteína. Comparação de diferentes variantes de proteínas é feita através de cálculo de uma ou mais das quantidades acima baseado na informação de sequência primária, secundária e/ou terciária de proteína quando disponível. Típicas

42/109 ferramentas de bioinformática empregadas para tais propósitos incluem calculadores de ponto isoelétrico usando a equação de Henderson - Hesselbach (por exemplo, European Molecular Biology Laboratory) ou resolvedores eletrostáticos de Poisson - Boltzmann (por exemplo, DelPhi, MOE).

III. Provimento de proteínas variantes tendo a ótima propriedade física

Uma vez um valor ou faixa ótima tenha sido determinada na etapa anterior, uma pluralidade de proteínas candidatas são providas as quais são restritas para a propriedade física de interesse. Apropriados processos provimento de proteínas candidatas incluem, mas não são limitados à produção de variantes de enzimas artificiais através de técnicas recombinantes, assim como a purificação de variantes de enzimas naturais (por exemplo, homólogos) através de cromatografia, a síntese in vitro de variantes de enzima de glicosilação ou fosforilação ou a produção in vitro de conjugados de enzimas. Uma outra maneira de alterar a hidrofobicidade de uma proteína via glicosilação é gerar novos sítios de glicosilação sobre a superfície da enzima. Estas variantes serão glicosiladas in vivo durante expressão.

Em algumas modalidades, propriedades físicas relacionadas com hidrofobicidade são comparadas através de variantes de proteases em termos da contribuição total pelos resíduos substituídos para a mudança líquida em hidrofobicidade da resultante variante em relação àquela da enzima de origem. Em algumas modalidades, a contribuição hidrofóbica total é calculada usando uma ou mais das escalas de hidrofobicidade de aminoácido disponíveis na literatura e conhecidas por aqueles versados na técnica, que levam em conta informação de estrutura primária, secundária e/ou terciária de proteína. Em exemplos quando propriedades físicas relacionadas com hidrofobicidade são comparadas através de diferentes dobras de proteínas em termos de particionamento de proteína medido entre seu ambiente aquoso nativo e uma fase hidrofóbica. Exemplos incluem, mas não são limitados a tensão superficial nas interfaces de ar - água ou heptano - água, assim como ângulo de contato e medições de umedecimento entre fases contendo substrato sólido e aquoso. Em geral, qualquer processo apropriado

43/109 para caracterização de particionamento de uma proteína entre duas fases é apropriado para uso na presente invenção, incluindo determinações óticas (por exemplo, elipsometria, ressonância plasmon de superfície, interferometria, e/ou refletividade), acústicas (por exemplo, microbalança de quartzo cristal), fluorescência, espectroscopia (por exemplo, infravermelho de reflexão total atenuada) ou concentração (por exemplo, atividade de enzima).

Escalas de carga e hidrofobicidade não são independentes uma da outra uma vez que resíduos carregados adicionam caráter hidrofílico. Assim, antes que simplesmente escolhendo uma escala sobre a outra, algumas modalidades da presente invenção empregam múltiplas escalas diferentes (por exemplo, determinadas teórica ou experimentalmente) para identificação de dependências de propriedade física. Referências para 23 das escalas de hidrofobicidade mais comumente usadas incluem: hidrofobicidade (Rao e Argos) calcula parâmetro de hélice enterrada em membrana (Rao e Argos, Biochim. Biophys. Acta 869:197-214 [1986]); hidrofobicidade (Black e Mould) calcula hidrofobicidade de L-alfa aminoácidos fisiológicos (Black and Mould, Anal. Biochem. 193:72-82 [1991]); hidrofobicidade (Bull and Breese) calcula hidrofobicidade (energia livre de transferência para superfície em kcal/mol) (Bull and Breese, Arch. Biochem. Biophys. 161:665-670 [1974]); hidrofobicidade (Chothia) calcula proporção de resíduos 95% enterrados (em 12 proteínas) (Chothia, J. Mol. Biol., 105:1-14 [1976]); hidrofobicidade (Kyte and Doolittle) calcula hidropaticidade (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 [1982]); hidrofobicidade (Eisenberg et al.) calcula escala de hidrofobicidade consenso normalizada (Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142 [1984]); hidrofobicidade (Fauchere and Pliska) calcula escala de hidrofobicidade (pi-r) (Fauchere and Pliska, Eur. J. Med. Chem., 18:369-375 [1983]); hidrofobicidade (Guy) calcula escala de hidrofobicidade baseada em energia livre de transferência (kcal/mol) (Guy, Biophys J., 47:61-70 [1985]); hidrofobicidade (Janin) calcula energia livre de transfer~encia do interior para exterior de uma proteína globular (Janin, Nature 277:491-492 [1979]); hidrofobicidade (Abraham and Leo) calcula hidrofobicidade (delta G1/2cal) (Abraham and Leo, Proteins: Structure, Function and Genetics 2:130-152

44/109 [1987]); hidrofobicidade (Manavalan et al.) calcula hidrofobicidade circundante média (Manavalan et al., Nature 275:673-674 [1978]); hidrofobicidade (Miyazawa et al.) calcula escala de hidrofobicidade (energia de contato derivada de dados 3D) (Miyazawa et al., Macromolecules 18:534552 [1985]); hidrofobicidade (Aboderin) calcula mobilidades de aminoácidos sobre cromatografia de papel (RF) (Aboderin, Int. J. Biochem., 2:537-544 [1971]); hidrofobicidade HPLC (Parker et al.) calcula escala de hidrofilicidade derivada de tempos de retenção de peptídeo de HPLC (Parker et al., Biochem., 25:5425-5431 [1986]); Hphob. HPLC pH3.4 calcula índices de hidrofobicidade em pH 3,4 determinados por HPLC (Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990]); Hphob. HPLC pH 7,5 calcula índices de hidrofilicidade em pH 7,5 determinados por HPLC (Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990]); hidrofobicidade (Rose et al.) (AA) calcula a perda de área fracionada média (f) [área enterrada média/área de estado padrão] (Rose et al., Science 229:834-838 [1985]); e hidrofobicidade (Roseman) calcula escala de hidrofobicidade (pi-r) (Roseman, J. Mol. Biol., 200:513-522 [1988]).

Outras propriedades físicas que são comparadas através de proteases e suas variantes dentro de mesma dobra de proteína ou através de diferentes dobras de proteínas incluem, mas não são limitadas a propriedades físicas relacionadas com solubilidade, e temperaturas de fusão de proteína. Propriedades físicas relacionadas com solubilidade são comparadas através de diferentes dobras de proteínas em termos de ambas, carga e escalas de hidrofobicidade previamente descritas. Em geral, qualquer quantidade termodinâmica ou cinética caracterizando interações proteína - proteína versus proteína - solvente é apropriada para uso com os processos da presente invenção. Por exemplo, segundo coeficiente virial (ver, Wilson, Acta Crystallographica, D50:361-365 [1994], parâmetro chi, pressão osmótica, e coeficientes de atividade ou fugacidade refletindo desvios a partir de comportamento ideal de mistura encontram uso (ver, por exemplo, Reide t al., The Properties of Gases and Liquids, 4^th Ed. McGraw - Hill, [1987]). Propriedades físicas relacionadas com tamanho são comparadas através de

45/109 diferentes dobras de proteínas usando quaisquer meios experimentais apropriados para determinação de dimensões de proteína ou polímero. Tamanho é inferido a partir de peso molecular usando correlações comumente disponíveis entre conformação de proteína ou polímero (espiral, globular, ramificado), seu peso molecular e raio hidrodinâmico ou de giro. Apropriadas técnicas para determinação de tamanho ou peso molecular incluem, mas não são limitadas a dispersão de luz estática e dinâmica, eletroforese de gel, espectrometria de massa e cromatografia. Alternativamente, tamanho é facilmente estimado a partir de conhecimento das estruturas de cristal de proteína determinadas experimentalmente ou modelos de homologia estrutural.

Temperaturas de fusão de proteína ^® são tipicamente determinadas através de monitoramento de uma propriedade repórter física através de uma varredura de temperatura. Apropriados processos incluem, mas não são limitados a calorimetria de exploração diferencial, dicroísmo circular, dispersão dinâmica de luz, e espectroscopia de UV - visível.

Aplicações para enzimas serina protease

As mutações combináveis criadas para geração de variantes de protease são contempladas servirem para aperfeiçoar o índice de desempenho, por exemplo, localizar a ótima performance, para pelo menos uma desejada propriedade de enzima em uma variedade de aplicações. A localização do ótimo de desempenho/propriedade é grandemente influenciada por meio utilizado (por exemplo, formulação de detergente, pH, resistência iônica, etc.), assim como a carga líquida e distribuição de carga de resíduos de aminoácidos da enzima de interesse. Assim, uma enzima ótima é contemplada existir para diferentes formulações de variáveis pH, resistência iônica, tipo e razão de tensoativo, reforçadores e quelantes, todos os quais afetam fenômenos eletrostáticos. O uso de combinações de enzimas, onde cada membro da combinação possui um diferente ótimo de carga, é contemplado para a produção de formulações apropriadas para uma ampla faixa de condições (por exemplo, proteases em formulações detergentes vendidas em diferentes geografias ou locais tendo diferenças em dureza de água). O uso de combinações de enzimas, onde cada membro da combinação sobressai

46/109 na limpeza de uma diferente mancha, também é contemplado para a produção de formulações apropriadas para limpeza de uma variedade de manchas. Adicionalmente, o uso de combinações de enzimas, onde cada membro da combinação possui um diferente ótimo de carga, é contemplado em casos onde o próprio substrato enzima sofre mudanças de carga durante reação de enzima.

Embora aqui descritas em relação a proteases e manchas de sangue, leite e tinta, é contemplado que as variantes de protease da presente invenção são otimizadas para qualquer interação de enzima - substrato em qualquer de uma variedade de meios de reação (isto é, condições) ditadas pela aplicação, por exemplo, aplicações de limpeza.

Como aqui descrito em maiores detalhes, as variantes de protease da presente invenção têm importantes características que as tornam muito apropriadas para certas aplicações. Por exemplo, em algumas aplicações preferidas, as variantes de protease da presente invenção têm carga e/ou hidrofobicidade alterada comparadas a algumas proteases correntemente usadas. Assim, estas proteases encontram particular uso em composições de limpeza. Realmente, sob certas condições de lavagem, as presentes proteases exibem comparativa ou aperfeiçoada expressão e/ou atividade de remoção de mancha como comparadas com subtilisina proteases correntemente usadas. Assim, é contemplado que as composições de limpeza e/ou enzima da presente invenção serão providas em uma variedade de composições de limpeza. Assim, as presentes proteases encontram uso em várias composições de limpeza, assim como aplicações de alimentação animal, processamento de couro (por exemplo, limpeza de couro), hidrólise de proteína, e em usos têxteis. As proteases identificadas também encontram uso em aplicações de cuidados pessoais.

Realmente, as variantes de protease da presente invenção encontram uso em um número de aplicações industriais, em particular com as indústrias de limpeza, desinfetante, alimentação animal, e têxtil/couro. Em algumas modalidades, a protease(s) da presente invenção é combinada com detergentes, reforçadores, agentes alvejantes e outros ingredientes conven47/109 cionais para produção de uma variedade de novas composições de limpeza úteis na lavanderia e outras técnicas de limpeza tais como, por exemplo, detergentes de lavanderia (ambos, pulverizado e líquido), préencharcamentos de lavanderia, alvejantes de todos os tecidos, detergentes de lavagem automática de pratos (ambos, líquidos e pulverizados), limpadores domésticos, particularmente aplicações de sabão líquido ou em barra, e certos abridores de drenagem. Em adição, as variantes de protease encontram uso na limpeza de lentes de contato assim com outros itens, através de contato de tais materiais com uma solução aquosa da composição de limpeza. Em adição estas variantes de protease podem ser usadas, por exemplo, em hidrólise de peptídeo, tratamento de despejo, aplicações têxteis, limpeza de dispositivo médico, remoção de biofilme e como enzimas de clivagem fusão em produção de proteína, etc. A composição destes produtos não é crítica para a presente invenção, tanto quanto a protease(s) variante mantenha sua função no cenário usado. Em algumas modalidades, as composições são facilmente preparadas através de combinação de uma quantidade eficaz para limpeza da variante de protease ou uma composição de enzima compreendendo a preparação de enzima variante de protease com os convencionais componentes de tais composições em suas quantidades conhecidas na técnica.

Composições de limpeza

A menos que de outro modo notado, todos os níveis de componentes ou composições aqui providos são feitos em referência ao nível ativo daquele componente ou composição, e são exclusivos de impurezas, por exemplo, solventes residuais ou subprodutos, que podem estar presentes em fontes comercialmente disponíveis. Pesos de componentes enzimas são baseados em proteína ativa total. Todas as porcentagens e razões são calculadas em peso a menos que de outro modo indicado. Todas as porcentagens e razões são calculadas baseadas na composição total a menos que de outro modo indicado. Nas composições detergentes exemplificadas, os níveis de enzima são expressos por enzima pura em peso da composição total e a menos que de outro modo especificado, os ingredientes detergentes

48/109 são expressos em peso das composições totais.

Como aqui indicado, em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem materiais adjuntos incluindo, mas não limitado a, tensoativos, reforçadores, alvejantes, ativadores de alvejantes, catalisadores de alvejantes, outras enzimas, sistemas de estabilização de enzima, quelante, abrilhantadores óticos, polímeros de liberação de sujeira, agentes de transferência de corante, dispersantes, supressores de espuma, corantes, perfumes, corantes, sais de enchimento, hidrótropos, fotoativadores, fluorescentes, condicionadores de tecido, tensoativos hidrolisáveis,. conservantes, antioxidantes, agentes anticontração, agentes antirrugas, germicidas, fungicidas, pontos de cor, silvercare, agentes antiembaciamento e/ou anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes solubilizantes, veículos, auxiliares de processamento, pigmentos, e agentes de controle de pH (ver, por exemplo, patentes U.S. N^os 6 610 642, 6 605 458, 5 705 464, 5 710 115, 5 698 504, 5 695 679, 5 686 014 e 5 646 101, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Modalidades de específicos materiais de composição de limpeza são exemplificadas em detalhes abaixo. Em modalidades nas quais os materiais adjuntos de limpeza não são compatíveis com as variantes de protease da presente invenção nas composições de limpeza, então apropriados processos de manutenção de materiais de limpeza adjuntos e a protease(s) separados (isto é, não em contato um com o outro) até combinação dos dois componentes ser apropriada são usados. Tais processos de separação incluem qualquer processo conhecido na técnica (por exemplo, cápsulas de gel, encapsulação, comprimidos, separação física, etc.).

As composições de limpeza da presente invenção são vantajosamente empregadas, por exemplo, em aplicações de lavanderia, limpeza de superfície dura, aplicações de lavagem de prato, assim como aplicações cosméticas tais como dentaduras, dentes, cabelo e pele. Em adição, devido às vantagens únicas de aumentada eficácia em menores temperaturas de soluções, as enzimas da presente invenção são idealmente apropriadas para aplicações de lavanderia. Além disso, as enzimas da presente invenção

49/109 encontram uso em composições granulares e líquidas.

As variantes de protease da presente invenção também encontram uso para produtos aditivos de limpeza. Em algumas modalidades, aplicações de limpeza de baixa temperatura de solução encontram uso. Em algumas modalidades, a presente invenção provê produtos aditivos de limpeza incluindo pelo menos uma enzima da presente invenção é idealmente apropriada para inclusão em um processo de lavagem quando adicional eficácia de alvejamento é desejada. Tais exemplos incluem, mas não são limitados a aplicações de limpeza em solução de baixa temperatura. Em algumas modalidades, o produto aditivo está em sua forma mais simples, uma ou mais proteases. Em algumas modalidades, o aditivo é embalado em forma de dosagem para adição a um processo de limpeza. El algumas modalidades, o aditivo é embalado em forma de dosagem para adição a um processo de limpeza onde uma fonte de peroxigênio é empregada e aumentada eficácia de alvejamento é desejada. Qualquer forma de dosagem unitária simples apropriada encontra uso com a presente invenção, incluindo, mas não limitado a pílulas, comprimidos, cápsulas de gel, ou outras dosagens unitárias tais como pulverizados ou líquidos pré-medidos. Em algumas modalidades, materiais de enchimento ou carreadores são incluídos para aumentar o volume de tais composições. Apropriados materiais de enchimento ou carreadores incluem, mas não são limitados a, vários sais de sulfato, carbonato e silicato assim como talco, argila e semelhantes. Apropriados materiais de enchimento ou veículos para composições líquidas incluem, mas não são limitados a água ou álcoois primários e secundários de baixo peso molecular incluindo polióis e dióis. Exemplos de tais álcoois incluem, mas não são limitados a, metanol, etanol, propanol e isopropanol. Em algumas modalidades, as composições contêm de cerca de 5% a cerca de 90% de tais materiais. Materiais de enchimento ácidos encontram uso para reduzir o pH. Alternativamente, em algumas modalidades, o aditivo de limpeza inclui ingredientes adjuntos, como mais inteiramente descrito abaixo.

As presentes composições de limpeza e aditivos de limpeza requerem uma quantidade eficaz de pelo menos uma das variantes de protea50/109 se aqui providas, sozinha ou em combinação com outras proteases e/ou adicional enzimas. O nível requerido de enzima é obtido através da adição de uma ou mais variantes de protease da presente invenção. Tipicamente as presentes composições de limpeza compreenderão pelo menos cerca de 0,0001 porcento em peso, de cerca de 0,0001 a cerca de 10, de cerca de 0,001 a cerca de 1, ou mesmo de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 porcento de pelo menos uma das variantes de protease da presente invenção.

As presentes composições de limpeza são tipicamente formuladas de modo que, durante uso em operações de limpeza aquosa a água de lavagem terá um pH de cerca de 5,0 a cerca de 11,5 ou mesmo de cerca de 7,5 a cerca de 10,5. Formulações de produto líquidas são tipicamente formuladas para terem um pH líquido de cerca de 3,0 a cerca de 9,0 ou mesmo de cerca de 3 a cerca de 5. Produtos de lavanderia granulares são tipicamente formulados para terem um pH de cerca de 9 a cerca de 11. Técnicas para controle de pH em níveis de utilização recomendados incluem o uso de tampões, álcalis, ácidos, etc., e são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Apropriadas composições de limpeza de baixo pH tipicamente têm um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5, e são tipicamente livres de tensoativos que hidrolisam em um tal pH de ambiente. Tais tensoativos incluem tensoativos alquil sulfato de sódio que compreendem pelo menos uma metade óxido de etileno ou mesmo de cerca de 1 a cerca de 16 moles de óxido de etileno. Tais composições de limpeza tipicamente compreendem uma quantidade suficiente de um modificador de pH, tal como hidróxido de sódio, mono etanol amina ou ácido clorídrico, para provimento de tal composição de limpeza com um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5. Tais composições tipicamente compreendem pelo menos uma enzima estável em ácido. Em algumas modalidades, as composições são líquidas, enquanto em outras modalidades, elas são sólidas. O pH de tais composições líquidas é tipicamente medido como um pH líquido. O pH de tais composições sólidas é medido como uma solução de 10% de sólidos da dita composição onde o solvente é água destilada. Nestas modalidades, todas as medições de pH

51/109 são tomadas a 20^oC, a menos que de outro modo indicado.

Em algumas modalidades, quando a protease(s) variante é/são empregada em uma composição granular ou líquida, é desejável para a variante de protease estar na forma de uma partícula encapsulada para proteger a variante de protease de outros componentes da composição granular durante estocagem. Em adição, encapsulação é também um meio de controle de disponibilidade da variante de protease durante o processo de limpeza. Em algumas modalidades, encapsulação aperfeiçoa a performance da protease(s) variante e/ou adicionais enzimas. Neste sentido, as variantes de protease da presente invenção são encapsuladas com qualquer material encapsulante conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o material encapsulante tipicamente encapsula pelo menos parte do catalisador para a protease(s) variante da presente invenção. Tipicamente, o material encapsulante é solúvel em água e/ou dispersável em água. Em algumas modalidades, o material encapsulante tem uma temperatura de transição vítrea (Tg) de 0^oC ou maior. Temperatura de transição vítrea é descrita em mais detalhes em WO97/11151. O material de encapsulação é tipicamente selecionado do grupo consistindo em carboidratos, gomas naturais ou sintéticas, quitina, quitosano, celulose e derivados de celulose, silicatos, fosfatos, boratos, álcool polivinílico, polietileno glicol, ceras de parafina, e suas combinações. Quando o material encapsulante é um carboidrato, ele é tipicamente selecionado de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e suas combinações. Em algumas modalidades típicas, o material de encapsulação é um amido (ver, por exemplo, EP 0 922 499; US 4 977 252; 5 354 559 e US 5 935 826). Em algumas modalidades, o material encapsulante é uma microesfera fabricada de plástico tal como termoplásticos, acrilonitrila, metacrilonitrila, poliacrilonitrila, polimetacrilonitrila, e suas misturas; microesferas comercialmente disponíveis que encontram uso incluem, mas não são limitadas àquelas supridas por EXPANCEL^® (Stockviksverken, Sweden), e PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, QCEL®, e SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA).

Como aqui descrito, as variantes de protease da presente inven52/109 ção encontram particular uso na indústria de limpeza, incluindo, mas não limitado a detergentes de lavanderia e pratos. Estas aplicações colocam enzimas sob várias tensões ambientais. As variantes de protease da presente invenção proveem vantagens sobre muitas enzimas usadas atualmente, devido sua estabilidade sob várias condições.

Realmente, existe uma variedade de condições de lavagem incluindo variação de formulações detergentes, volumes de água de lavagem, temperaturas de água de lavagem, e comprimentos de tempo de lavagem, às quais proteases envolvidas em lavagem são expostas. Em adição, as formulações detergentes usadas em diferentes áreas geográficas têm diferentes concentrações de seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, detergentes Europeus tipicamente têm cerca de 4500-5000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem, enquanto detergentes Japoneses têm tipicamente aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente nos Estados Unidos, detergentes tipicamente têm cerca de 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.

Um sistema de baixa concentração de detergente inclui detergentes onde menos que cerca de 800 ppm de componentes detergentes estão presentes na água de lavagem. Detergentes Japoneses são tipicamente considerados sistemas de baixa concentração de detergente quando eles têm aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.

Uma concentração média de detergente inclui detergentes onde cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm de componentes detergentes estão presentes na água de lavagem. Detergentes Norte-Americanos são geralmente considerados serem sistemas de concentração média de detergente quando eles têm aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem. Brasil tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.

Um sistema de alta concentração de detergente inclui detergentes onde mais que cerca de 2000 ppm de componentes detergentes estão

53/109 presentes na água de lavagem. Os detergentes Europeus são geralmente considerados serem sistemas de alta concentração de detergente quando eles têm aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem.

Detergentes Latino-americanos são geralmente detergentes builders de fosfato de alto teor de espuma e a faixa de detergentes usada na América Latina pode cair em ambas, as concentrações média e alta quando elas variam de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes na água de lavagem. Como mencionado acima, Brasil tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.Entretanto, outras geografias de detergente reforçador de fosfato de alto teor de espumas, não limitadas a outros países Latino Americanos, podem ter sistemas de alta concentração de detergente de até cerca de 6000 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavagem.

À luz do anterior, é evidente que concentrações de composições detergentes em típicas soluções de lavagem por todo o mundo varia de menos que cerca de 800 ppm de composição detergente (geografias de baixa concentração de detergente), por exemplo, cerca de 667 ppm no Japão, a entre cerca de 800 ppm a cerca de 2000 ppm (geografias de média concentração de detergente), por exemplo, cerca de 975 ppm nos U.S. e cerca de 1500 ppm no Brasil, para maior que cerca de 2000 ppm (geografias de alta concentração de detergente), por exemplo, cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em geografias de reforçador fosfato de alto teor de espumas.

As concentrações das típicas soluções de lavagem são determinadas empiricamente. Por exemplo, nos U.S., uma máquina de lavagem típica retem um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Da mesma maneira, de modo a obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente dentro de solução de lavagem cerca de 62,79 g de composição detergente têm de ser adicionados aos 64,4 L de solução de lavagem. Esta quantidade é a quantidade típica medida na água de lavagem pelo consumidor usando o copo de medição provido com o detergente.

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Ainda como um exemplo, diferentes geografias usam diferentes temperaturas de lavagem. A temperatura da água de lavagem no Japão é tipicamente menor que aquela usada na Europa. Por exemplo, a temperatura da água de lavagem na América do Norte e Japão está tipicamente entre cerca de 10 e cerca de 30^oC (por exemplo, cerca de 20^oC), enquanto a temperatura de água de lavagem na Europa está tipicamente entre cerca de 30 e cerca de 60^oC (por exemplo, cerca de 40^oC). Entretanto, no interesse de economizar energia, muitos consumidores estão mudando para uso de lavagem com água fria. Em adição, ainda em algumas regiões, água fria é tipicamente usada para lavanderia, assim como aplicações de lavagem de pratos. Em algumas modalidades, a lavagem com água fria da presente invenção utilizada lavagem em temperaturas de cerca de 10^oC a cerca de 40^oC, ou de cerca de 10^oC a cerca de 30^oC, ou de cerca de 15^oC a cerca de 25^oC, assim como todas as outras combinações dentro da faixa de cerca de 10^oC a cerca de 40^oC. Ainda como um exemplo, diferentes geografias tipicamente têm diferentes durezas de água. Dureza de água é usualmente descrita em termos dos grãos por galão de Ca²⁺/Mg²⁺ misturados. Dureza é uma medida da quantidade de cálcio ((Ca²⁺) e magnésio (Mg²⁺) na água. A maior parte das águas nos estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. Água moderadamente dura (60-120 ppm) e dura (121-181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (partes por milhão convertidas para grãos por galão U.S. em ppm# divididas por 17,1 igual a grãos por galão) der minerais de dureza.

Água	Grãos por Galão	Partes por Milhão
Mole	Menos que 1,0	Menos que 17
Levemente dura	1,0 a 3,5	17 a 60
Moderadamente dura	3,5 a 7,0	60 a 120
Dura	7,0 a 10,5	120 a 180
Muito dura	Maior que 10,5	Maior que 180

Dureza de água Europeia é tipicamente maior que cerca de 10,5 (por exemplo, cerca de 10,5 a cerca de 20,0) grãos por galão de Ca²+/Mg²+ misturados (por exemplo, cerca de 15 grãos por galão de Ca²⁺/Mtg²⁺ mistu55/109 rados). Dureza de água Norte-Americana é tipicamente maior que a dureza de água Japonesa, mas menos que dureza de água Europeia. Por exemplo, dureza de água Norte-americana pode estar entre cerca de 3 a cerca de 10 grãos, cerca de 3 a cerca de 8 grãos ou cerca de 6 grãos. Dureza de água Japonesa é tipicamente menor que dureza de água Norte-americana, usualmente menos que cerca de 4, por exemplo, cerca de 3 grãos por galão de Ca²+/Mg²+ misturados.

Da mesma maneira, em algumas modalidades, a presente invenção provê variantes de protease que mostram surpreendente performance de lavagem em pelo menos um conjunto de condições de lavagem (por exemplo, temperatura de água, dureza de água, e/ou concentração de detergente). Em algumas modalidades, as variantes de protease da presente invenção são comparáveis em desempenho de lavagem a outras subtilisina proteases. Em algumas modalidades, as variantes de protease da presente invenção exibem aperfeiçoada performance de lavagem como comparadas a subtilisina proteases correntemente disponíveis comercialmente. Assim, em algumas modalidades preferidas da presente invenção, as variantes de protease aqui providas exibem aperfeiçoada estabilidade oxidativa, aperfeiçoada estabilidade térmica, aperfeiçoada capacidade de limpeza sob várias condições, e/ou aperfeiçoada estabilidade quelante. Em adição, as variantes de protease da presente invenção encontram uso em composições de limpeza que não incluem detergentes, novamente sozinhas ou em combinação com reforçadores e estabilizantes.

Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza compreendem pelo menos uma variante de protease da presente invenção em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% em peso da composição e o balanço (por exemplo, cerca de 99,999% a cerca de 90,0%) compreendendo materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção compreendem pelo menos uma variante de protease em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de

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0,5% em peso da composição e o balanço da composição de limpeza (por exemplo, cerca de 99,9999% a cerca de 90,0%, cerca de 99,999% a cerca de 98%, cerca de 99,995% a cerca de 99,5% em peso) compreendendo materiais adjuntos de limpeza.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem uma ou mais adicionais enzimas detergentes, que proporcionam performance de limpeza e/ou benefícios de cuidados de tecido e/ou lavagem de pratos. Exemplos de enzimas apropriadas incluem, mas não são limitados a, hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, xilanases, lipases, fosfolipases, estearases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, betaglicanases, arabinosidases, hialuronidases, condroitinases, lacase e amilases ou suas misturas. Em algumas modalidades, é usada uma combinação de enzimas (isto é, um coquetel) compreendendo enzimas convencionais aplicáveis como protease, lipase, cutinase e/ou celulase em conjunção com amilase.

Em adição às variantes de protease aqui providas, qualquer outra protease encontra uso nas composições da presente invenção. Apropriadas proteases incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Em modalidades particularmente preferidas, proteases microbianas são usadas. Em algumas modalidades, mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são incluídos. Em algumas modalidades, a protease é uma serina protease, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease semelhante à tripsina. Exemplos de proteases alcalinas incluem subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus (por exemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg 309, subtilisina 147 e subtilisina 168). Exemplos adicionais incluem aquelas proteases mutantes descritas nas patentes US N^os RE 34 606, 5 955 340, 5 700 676, 6 312 936, e 6 482 628, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Adicionais exemplos de protease incluem, mas não são limitados à tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina), e a Fusarium protease descrita no WO

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89/06270. Em algumas modalidades, enzimas protease comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a MAXATASE®, MAXACAL®, MAXAPEM®, OPTICLEAN®, OPTIMASE^®, PROPERASE^®, PURAFECT^® PROPERASE^®, EXCELLASE^®, PURAFAST^®, e PURAFECT^® OXP (Genencor); ALCALASE^®, SAVINASE^®, PRIMASE®, DURAZYM®, POLARZYME®, OVOZYME®, LIQUANASE®, KANNASE^®, NEUTRASE^®, RELASE^® e ESPERASE^® (Novozymes); e BLAP® (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany. Várias proteases são descritas nos WO95/23221, WO 92/21760, U.S. Pat. Appln. Publ. No. 2008/0090747, e U.S. Pat. N^os 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, e 6,482,628, e várias outras patentes. Em algumas modalidades, metaloproteases encontram uso na presente invenção, incluindo, mas não limitado à metaloprotease neutra descrita no WO 07/044993.

Em adição, qualquer lipase apropriada encontra uso na presente invenção. Apropriadas lipases incluem, mas não são limitadas àquelas de origem bacteriana ou de fungos. Mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são abrangidos pela presente invenção. Exemplos de lipases úteis incluem Humicola lanuginosa lipase (ver, por exemplo, EP 258 068, e EP 305 216), Rhizomucor miehei lipase (ver, por exemplo., EP 238 023), Candida lipase, tal como C. antarctica lipase (por exemplo, a C. antarctica lipase A ou B; ver, por exemplo, EP 214 761), Pseudomonas lipases tais como P. alcaligenes lipase e P. pseudoalcaligenes lipase (ver, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia lipase (ver, por exemplo, EP 331 376), P. stutzeri lipase (ver, por exemplo, GB 1,372,034), P. fluorescens lipase, Bacillus lipase (por exemplo, B. subtilis lipase [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. stearothermophilus lipase [ver, por exemplo, JP 64/744992]; e B. pumilus lipase [ver, por exemplo, WO 91/16422]).

Além disso, um número de lipases clonadas encontra uso em algumas modalidades da presente invenção incluindo, mas não limitado a Penicillium camembertii lipase (ver, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), Geotricum candidum lipase (ver, Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388

58/109 [1989]), e várias Rhizopus lipases tal como R. delemar lipase (ver, Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), uma R. niveus lipase (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) e R. oryzae lipase.

Outros tipos de enzimas lipolíticas tais como cutinases também encontram uso em algumas modalidades da presente invenção, incluindo, mas não limitado à cutinase derivada de Pseudomonas mendocina (ver, WO 88/09367), e a cutinase derivada de Fusarium solani pisi (ver, WO 90/09446).

Adicionais lipases apropriadas incluem lipases comercialmente disponíveis como M1 LIPASE®, LUMA FAST®, e LIPOMAX® (Genencor); LIPOLASE^® e LIPOLASE^® ULTRA (Novozymes); e LIPASE P^® Amano (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan).

Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem lipases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de adicional lipase em peso da composição e o balanço de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem lipases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de lipase em peso da composição.

Em algumas modalidades da presente invenção, qualquer amilase apropriada encontra uso na presente invenção. Em algumas modalidades, qualquer amilase (por exemplo, alfa e/ou beta) apropriada para uso em soluções alcalinas também encontra uso. Amilases apropriadas incluem, mas não são limitadas àquelas de origem bacteriana ou de fungos. Mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são incluídos em algumas modalidades. Amilases que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a alfa - amilases obtidas de B. licheniformis (ver, por exemplo, GB 1 296 839). Amilases comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® , STAINZYME®, STAINZYME PLUS®,

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STAINZYME ULTRA®, NATALASE®, e BAN® (Novozymes), assim como POWERASE®, RAPIDASE® e MAXAMYL® P (Genencor).

Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem amilases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de adicional amilase em peso da composição e o balanço de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem amilases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de amilase em peso da composição.

Ainda em algumas modalidades, qualquer celulase apropriada encontra uso nas composições de limpeza da presente invenção. Apropriadas celulases incluem, mas não são limitadas àquelas de origem bacteriana ou de fungos. Mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são incluídos em algumas modalidades. Celulases apropriadas incluem, mas não são limitadas a celulases de Humicola insolens (ver, por exemplo, patente U.S. 4 435 307). Celulases especialmente apropriadas são as celulases tendo benefícios de cuidados de cor (ver, por exemplo, EP 0 495 257). Celulases comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a CELLUZYME, CAREZYME (Novozymes), e KAC-500(B) (Kao Corporation). Em algumas modalidades, celulases são incorporadas como porções ou fragmentos de celulases variantes ou tipo selvagem maduras, onde uma porção do terminus-N é deletada (ver, por exemplo, patente U.S. 5 874 276). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem celulases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de adicional celulase em peso da composição e o balanço de materiais adjuntos de limpeza em peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem celulases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de celulase

60/109 em peso da composição.

Qualquer mananase apropriada para uso em composições detergentes também encontra uso na presente invenção. Apropriadas mananases incluem, mas não são limitadas àquelas de origem bacteriana ou de fungos. Mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são incluídos em algumas modalidades. Várias mananases são conhecidas as quais encontram uso na presente invenção (ver, por exemplo, patente U.S. 6 566 114, patente U.S. 6 602 842, e patente U.S. 6 440 991, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem mananases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de adicional mananase em peso da composição e o balanço de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem mananases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de mananase em peso da composição.

Em certas modalidades, peroxidases são usadas em combinação com peróxido de hidrogênio ou uma sua fonte (por exemplo, um percarbonato, perborato ou perssulfato) nas composições da presente invenção. Em algumas modalidades alternativas, oxidases são usadas em combinação com oxigênio. Ambos os tipos de enzimas são usadas para alvejamento em solução (isto é, para evitar transferência de um corante têxtil de um tecido colorido para um outro tecido quando os tecidos são lavados juntos em um licor de lavagem, preferivelmente junto com um agente de aperfeiçoamento (ver, por exemplo, WO 94/12621 e WO 95/01426). Apropriadas peroxidases/oxidases incluem, mas não são limitadas àquelas de origem de planta, bacteriana ou de fungos. Mutantes modificados quimicamente ou geneticamente são incluídos em algumas modalidades. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem enzimas peroxidase e/ou oxidase em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de adicional peroxidase e/ou oxidase em peso da composição e o balanço

61/109 de materiais adjuntos de limpeza em peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem enzimas peroxidase e/ou oxidase em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de enzimas peroxidase e/ou oxidase em peso da composição.

Em algumas modalidades, adicionais enzimas encontram uso, incluindo, mas não limitado a peridrolases (ver, por exemplo, WO 05/056782). Em adição, em algumas modalidades particularmente preferidas, misturas das enzimas mencionadas acima são aqui abrangidas, em particular uma ou mais adicionais proteases, amilases, lipases, mananases, e/ou pelo menos uma celulase. Realmente, é contemplado que várias misturas destas enzimas encontrarão uso na presente invenção. É também contemplado que os níveis variáveis da protease(s) variante e uma ou mais adicionais enzimas podem ambos variar independentemente por cerca de 10%, o balanço da composição de limpeza sendo materiais adjuntos de limpeza. A específica seleção de materiais adjuntos de limpeza é facilmente feita através de consideração de superfície, item, de tecido a ser limpo, e a desejada forma da composição para as condições de limpeza durante uso (por exemplo, através de uso de detergente de lavagem).

Exemplos de apropriados materiais adjuntos de limpeza incluem, mas não são limitados a, tensoativos, builders, alvejantes, ativadores de alvejantes, catalisadores de alvejantes, outras enzimas, sistemas de estabilização de enzima, quelantes, abrilhantadores óticos, polímeros de liberação de sujeira, agentes de transferência de corante, agentes de inibição de transferência de corante, materiais catalíticos, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoção de sujeira de argila, , agentes de elasticidade de estrutura, dispersantes, supressores de espuma, corantes, perfumes, corantes, sais de enchimento, hidrótropos, fotoativadores, fluorescentes, condicionadores de tecido, amaciantes de tecido, veículos, hidrótropos, auxiliares de processamento, solventes, pigmentos, tensoativos hidrolisá62/109 veis, preservativos, antioxidantes, agentes anticontração, agentes antirugas, germicidas, fungicidas, pontos de cor, silvercare, antiembaciamento e/ou agentes anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes solubilizantes, veículos, auxiliares de processamento, pigmentos, e agentes de controle de pH (ver, por exemplo, patentes U.S. 6 610 642, 6 605 458, 5 705 464, 5 710 115, 5 698 504, 5 695 679, 5 686 014 e 5 646 101, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Modalidades de específicos materiais de composições de limpeza são exemplificadas em detalhes abaixo. Em modalidades nas quais os materiais adjuntos de limpeza não são compatíveis com as variantes de protease da presente invenção nas composições de limpeza, então apropriados processos de manutenção de materiais adjuntos de limpeza e a protease(s) separados (isto é, não em contato uns com os outros) até combinação dos dois componentes ser apropriada são usados. Tais processos de separação incluem qualquer processo apropriado conhecido na técnica (por exemplo, cápsulas de gel, encapsulação, comprimidos, separação física, etc.).

Em algumas modalidades preferidas, uma quantidade eficaz de uma ou mais variantes de protease aqui providas são incluídas em composições úteis para limpeza de uma variedade de superfícies em necessidade de remoção de mancha de proteína. Tais composições de limpeza incluem composições de limpeza para aplicações tais como limpeza de superfícies duras, tecidos, e pratos. Realmente, em algumas modalidades, a presente invenção provê composições de limpeza de tecido, enquanto em outras modalidades, a presente invenção provê composições de limpeza de nãotecido. Notavelmente, a presente invenção também provê composições de limpeza apropriadas para cuidados pessoais, incluindo cuidados orais (incluindo dentifrícios, pastas de dentes, lavagens bucais, etc., assim como composições de limpeza de dentaduras), composições de limpeza de pele, e cabelos. É pretendido que a presente invenção inclua composições detergentes em qualquer forma (isto é, líquida, granular, barra, semissólida, géis, emulsões, comprimidos, cápsulas, etc.).

Por exemplo, várias composições de limpeza onde as variantes

63/109 de protease da presente invenção encontram uso são descritas em maiores detalhes abaixo. Em algumas modalidades nas quais as composições de limpeza da presente invenção são formuladas como composições apropriadas para uso em processo(s) de lavagem em máquina de lavagem, as composições da presente invenção preferivelmente contêm pelo menos um tensoativo e pelo menos um composto reforçador, assim como um ou mais materiais adjuntos de limpeza preferivelmente selecionados de compostos poliméricos orgânicos, agentes alvejantes, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes sabão - soda, agentes de suspensão de sujeira e anti-redeposição e inibidores de corrosão. Em algumas modalidades, composições de lavanderia também contêm agentes amaciantes (isto é, como adicionais materiais adjuntos de limpeza). As composições da presente invenção também encontram uso em produtos aditivos de detergentes em forma sólida ou líquida. Tais produtos aditivos são pretendidos para suplementar e/ou reforçar o desempenho de convencionais composições detergentes e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza. Em algumas modalidades, a densidade das presentes composições detergentes de lavanderia varia de cerca de 400 a cerca de 1200 g/litro, enquanto em outras modalidades, ela varia de cerca de 500 a cerca de 950 g/litro de composição medidos a 20^oC.

Em modalidades formuladas como composições para uso em processos manuais de lavagem de pratos, as composições da invenção preferivelmente contêm pelo menos um tensoativo e preferivelmente pelo menos um adicional material adjunto de limpeza selecionado de compostos poliméricos orgânicos, agentes de aperfeiçoamento de espumas, íons de metais de grupo II, solventes, hidrótropos e enzimas adicionais.

Em algumas modalidades, várias composições de limpeza tais como aquelas providas na patente U.S. 6 605 458 encontram uso com as variantes de protease da presente invenção. Assim, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma variante de protease da presente invenção são uma composição granular compacta de limpeza de tecido, enquanto em outras modalidades, a composição é uma composi64/109 ção granular de limpeza de tecido útil na lavagem de tecidos coloridos, ainda em modalidades, a composição é uma composição granular de limpeza de tecido que provê amaciamento através de capacidade de lavagem, em adicionais modalidades, a composição é uma composição de limpeza de tecido, líquida, de trabalho pesado. Em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma variante de protease da presente invenção são composições de limpeza de tecido tais como aquelas descritas nas patentes U.S. 6 610 642 e 6 376 450. Em adição, as variantes de protease da presente invenção encontram uso em composições detergentes granulares de lavanderia de particular utilidade sob condições de lavagem Europeias ou Japonesas (ver, por exemplo, patente U.S. 6 610 642).

Em algumas modalidades alternativas, a presente invenção provê composições de limpeza de superfície dura compreendendo pelo menos uma variante de protease aqui provida. Assim, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma variante de protease da presente invenção são uma composição de limpeza de superfície dura tal como aquelas mostradas nas patentes U.S. 6 610 642, 6 676 450.

Ainda em certas modalidades, a presente invenção provê composições de lavagem de pratos compreendendo pelo menos uma variante de protease aqui provida. Assim, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma variante de protease da presente invenção é uma composição de limpeza de superfície dura como aquelas nas patentes U.S. 6 610 642 e 6 376 450. Ainda em algumas modalidades, a presente invenção provê composições de lavagem de pratos compreendendo pelo menos uma variante de protease aqui provida. Ainda em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma variante de protease da presente invenção compreendem composições de cuidados orais tais como aquelas na patente U.S. 6 376 450. As formulações e descrições dos compostos e materiais adjuntos de limpeza contidos nas patentes U.S. 6 376 450, 6 605 458 e 6 610 642 mencionadas anteriormente encontram uso com as variantes de protease aqui providas.

As composições de limpeza da presente invenção são formula65/109 das em qualquer forma apropriada e preparadas através de qualquer processo escolhido pelo formulador, exemplos não-limitantes dos quais são descritos na patente U.S. N^os 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, e 5,486,303, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Quando uma composição de limpeza de baixo pH é desejada, o pH de tal composição é ajustado via a adição de um material tal como mono etanol amina ou um material ácido tal como HCl.

Embora não essencial para os propósitos da presente invenção, a lista não-limitante de adjuntos ilustrados a seguir é apropriada para uso nas presentes composições de limpeza. Em algumas modalidades, estes adjuntos são incorporados por exemplo, para auxiliarem ou aperfeiçoarem desempenho de limpeza, para tratamento de substrato a ser limpo, ou para modificarem as estéticas da composição de limpeza como é o caso com perfumes, corantes ou semelhantes. É entendido que tais adjuntos estão em adição às proteases da presente invenção. A precisa natureza destes componentes adicionais, e níveis de sua incorporação, dependerão da forma física da composição e a natureza da operação de limpeza para a qual ela é pretendida. Apropriados materiais adjuntos incluem, mas não são limitados a, tensoativos, builders, agentes quelantes, agentes de inibição de transferência de corante, auxiliares de deposição, dispersantes, adicionais enzimas, e estabilizadores de enzimas, materiais catalíticos, ativadores de alvejantes, reforçadores de alvejantes, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoção de sujeira de argila/anti-redeposição, abrilhantadores, supressores de espumas, corantes, perfumes, agentes de elasticidade de estrutura, amaciantes de tecido, carreadores, hidrótropos, auxiliares de processamento e/ou pigmentos. Em adição à descrição abaixo, apropriados exemplos de tais outros adjuntos e níveis de uso são encontrados nas patentes U.S. 5 576 282, 6 306 812 e 6 326 348, incorporadas por referência. Os ingredientes adjuntos mencionados anteriormente podem constituir o balanço das composições de limpeza da presente invenção.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza de acor66/109 do com a presente invenção compreendem pelo menos um tensoativo e/ou um sistema tensoativo onde o tensoativo é selecionado de tensoativos nãoiônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos zwitteriônicos, tensoativos não-iônicos semi - polares e suas misturas. Em algumas modalidades de composição de limpeza de baixo pH (por exemplo, composições tendo um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5), a composição tipicamente não contem sulfato etoxilado de alquila, como é acreditado que tal tensoativo pode ser hidrolisado por conteúdos ácidos de tais composições. Em algumas modalidades, o tensoativo está presente em um nível de cerca de 0,1% a cerca de 60%, enquanto em modalidades alternativas o nível é de cerca de 1% a cerca de 50%, enquanto ainda em modalidades o nível é de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da composição de limpeza.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem um ou mais reforçadores de detergente ou sistemas reforçadores. Em algumas modalidades incorporando pelo menos um reforçador, as composições de limpeza compreendem pelo menos cerca de 1%, de cerca de 3% a cerca de 60% ou mesmo de cerca de 5% a cerca de 40% de reforçador em peso da composição de limpeza. Reforçadores incluem, mas não são limitados a, os sais de metais alcalinos, amônio e alcanol amônio de polifosfatos, silicatos de metais alcalinos, carbonatos de metais alcalinos e alcalinoterrosos, alumino silicatos, compostos de policarboxilato, éter hidroxi policarboxilatos, copolímeros de anidrido maleico com etileno ou vinil metil éter, ácido 1,3,5-tri-hidróxi benzeno-2,4,6-tri sulfônico, e ácido carbóxi metilóxi succínico, os vários sais de metais alcalinos, amônio e amônio substituído de ácidos poliacéticos tais como ácido etileno diamino tetra-acético e ácido nitrila triacético, assim como policarboxilatos tais como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxi-dissuccínico, ácido polimaleico, ácido benzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carbóxi metilóxi succínico, e seus sais solúveis. Realmente, é contemplado que qualquer reforçador apropriado encontrará uso em várias modalidades da presente invenção.

Em algumas modalidades, os builders formam complexos de íon

67/109 de dureza solúveis em água (por exemplo, builders sequestrantes), tais como citratos e polifosfatos (por exemplo, tri-polifosfato de sódio e hexa-hidrato de tri-polifosfato de sódio, tri-polifosfato de potássio; e tri-polifosfato de sódio e potássio misto, etc.). É contemplado que qualquer builder apropriado encontrará uso na presente invenção, incluindo aqueles conhecidos na técnica (ver, por exemplo, EP 2 100 949).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção contêm pelo menos um agente quelante. Apropriados agentes quelantes incluem, mas não são limitados a agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês e suas misturas. Em modalidades nas quais pelo menos um agente quelante é usado, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 15% ou mesmo de cerca de 3,0 % a cerca de 10% de agente quelante em peso da composição de limpeza objeto.

Ainda em algumas modalidades, as composições de limpeza aqui providas contêm pelo menos um auxiliar de deposição. Apropriados auxiliares de deposição incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol, polipropileno glicol, policarboxilato, polímeros de liberação de sujeira como ácido politereftálico, argilas tais como caolinita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita, e suas misturas.

Como aqui indicado, em algumas modalidades, agentes antiredeposição encontram uso em algumas modalidades da presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, tensoativos não-iônicos encontram uso . Por exemplo, em modalidades automáticas de lavagem de pratos, tensoativos não-iônicos encontram uso para propósitos de modificação de superfície, em particular para formação de folha, para evitar formação de filme e pontos e para aperfeiçoar brilho. Estes tensoativos não-iônicos também encontram uso em prevenção de redeposição de sujeiras. Em modalidades preferidas, o agente anti-redeposição é um tensoativo não-iônico como conhecido na técnica (ver, por exemplo, EP 2 100 949).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção incluem um ou mais agentes de inibição de transferência de

68/109 corante. Apropriados agentes de inibição de transferência de corante polimérico incluem, mas não são limitados a, polímeros polivinil pirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinil pirrolidona e N-vinil imidazol, poli vinil oxazolidonas e poli vinil imidazóis ou suas misturas. Em modalidades nas quais pelo menos um agente de inibição de transferência de corante é usado, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5%, ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso da composição de limpeza.

Em algumas modalidades, silicatos são incluídos nas composições da presente invenção. Em algumas tais modalidades, silicatos de sódio (por exemplo, dissilicato de sódio, meta silicato de sódio, e filo silicatos cristalinos) encontram uso. Em algumas modalidades, silicatos estão presentes em um nível de cerca de 1% a cerca de 20%. Em algumas modalidades preferidas, silicatos estão presentes em um nível de cerca de 5% a cerca de 15% em peso da composição.

Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza da presente invenção também contêm dispersantes. Apropriados materiais orgânicos solúveis em água incluem, mas não são limitados aos ácidos homo- ou copoliméricos ou seus sais, onde o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais que dois átomos de carbono.

Ainda em algumas modalidades, as enzimas usadas nas composições de limpeza são estabilizadas através de qualquer técnica apropriada. Em algumas modalidades, as enzimas aqui empregadas são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons cálcio e/ou magnésio nas composições acabadas que provêm tais íons para as enzimas. Em algumas modalidades, os estabilizadores de enzimas incluem oligossacarídeos, polissacarídeos, e sais de metais divalentes inorgânicos, incluindo metais alcalinos terrosos, tais como sais de cálcio. É contemplado que várias técnicas para estabilização de enzimas encontram uso na presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, as enzimas aqui empregadas

69/109 são estabilizadas através da presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proveem tais íons para as enzimas, assim como outros íons metálicos (por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II), e oxovanádio (IV). Cloretos e sulfatos também encontram uso em algumas modalidades da presente invenção. Exemplos de apropriados oligossacarídeos e polissacartídeos (por exemplo, dextrina) são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 07/145964). Em algumas modalidades, inibidores de protease reversíveis também encontram uso, tais como compostos contendo boro (por exemplo, borato, ácido 4formil fenil borônico) e/ou um aldeído tripeptídeo encontram uso para ainda aperfeiçoar estabilidade, quando desejado.

Em algumas modalidades, alvejantes, ativadores de alvejantes e/ou catalisadores de alvejantes estão presentes nas composições da presente invenção. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem composto(s) alvejante orgânico e/ou inorgânico. Alvejantes inorgânicos incluem, mas não são limitados a sais peridrato (por exemplo, sais perborato, percarbonato, perfosfato, per-sulfato, e per-silicato). Em algumas modalidades, sais peridrato inorgânicos são sais de metais alcalinos. Em algumas modalidades, sais peridrato inorgânicos são incluídos como o sólido cristalino, sem adicional proteção, embora em algumas outras modalidades, o sal seja revestido. Qualquer sal apropriado conhecido na técnica encontra uso na presente invenção (ver, por exemplo, EP 2 100 949).

Em algumas modalidades, ativadores de alvejantes são usados nas composições da presente invenção. Ativadores de alvejantes são tipicamente precursores de perácido orgânico que aperfeiçoam a ação alvejante no curso de limpeza em temperaturas de 60^oC e abaixo. Ativadores de alvejantes apropriados para uso aqui incluem compostos que sob condições de peridrólise, rendem ácidos peróxi carboxílicos tendo preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono, em particular de cerca de 2 a cerca de 4 átomos de carbono, e/ou ácido per-benzoico opcionalmente subs70/109 tituído. Adicionais ativadores de alvejantes são conhecidos na técnica e encontram uso na presente invenção (ver, por exemplo, EP 2 100 949).

Em adição, em algumas modalidades e como ainda aqui descrito, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem pelo menos um catalisador alvejante. Em algumas modalidades, o manganês triaza ciclo nonano e complexos relacionados encontram uso, assim como complexos de cobalto, cobre, manganês e ferro. Adicionais catalisadores de alvejantes encontram uso na presente invenção (ver, por exemplo, US 4 246 612, 5 227 084, 4 810 410, WO 99/06521 e EP 2 100 949).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção contêm um ou mais complexos de metal catalítico. Em algumas modalidades, um catalisador de alvejante contendo metal encontra uso. Em algumas modalidades preferidas, o catalisador de alvejante de metal compreende um sistema catalisador compreendendo um cátion de metal de transição de definida atividade catalítica de alvejante (por exemplo, cátions cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio, ou manganês), um cátion de metal auxiliar tendo pequena ou nenhuma atividade catalítica alvejante (por exemplo, cátions de zinco ou alumínio), e um sequestrado tendo definidas constantes de estabilidade para os cátions de metal auxiliares e catalíticos, particularmente ácido etileno diamino tetra-acético, ácido etileno diamino tetra(metileno fosfônico) e seus sais solúveis em água são usados (ver, por exemplo, patente US 4 430 243). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção são catalisadas por meio de um composto de manganês. Tais compostos e níveis de uso são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patente US 5 576 282). Em adicionais modalidades, catalisadores alvejantes de cobalto encontram uso nas composições de limpeza da presente invenção. Vários catalisadores alvejantes de cobalto são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patentes US 5 597 936 e 5 595 967) e são facilmente preparados através de procedimentos conhecidos.

Em modalidades adicionais, as composições de limpeza da presente invenção incluem um complexo de metal de transição de um ligante

71/109 rígido macropolicíclico (MRL). Como uma questão prática, e não a título de limitação, em algumas modalidades, as composições e processos de limpeza providos pela presente invenção são ajustadas para provimento da ordem de pelo menos uma parte por cem milhões das espécies MRL ativas no meio de lavagem aquoso, e em algumas modalidades preferidas, provimento de cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, mais preferivelmente de cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm, e mais preferivelmente de cerca de de 0,1 ppm a cerca de 5 ppm, para o MRL no licor de lavagem.

Preferidos metais de transição no presente catalisador alvejante de metal de transição incluem, mas não são limitados a manganês, ferro e cromo. Preferidos MRLs também incluem, mas não são limitados a especiais ligantes ultrarrígidos que são ligados com ponte - cruzada (por exemplo, 5,12-dietil-1,5,8,12-tetra-aza biciclo[6.6.2] hexadecano). Apropriados MRLS de metais de transição são facilmente preparados através de procedimentos conhecidos (ver, por exemplo, WO 2000/32601, e patente US 6 225 464).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem agentes de cuidados metálicos. Agentes de cuidados metálicos encontram uso em prevenção e/ou redução de embaciamento, corrosão, e/ou oxidação de metais, incluindo alumínio, aço inoxidável, e metais não-ferrosos (por exemplo, prata e cobre). Apropriados agentes de cuidados metálicos incluemaqueles descritos nos EP 2 100 949, WO 9426860 e WO 94/26859). Em algumas modalidades, o agente de cuidados metálico é um sal de zinco. Ainda em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 5% em peso de um ou mais agentes de cuidados de metal.

Como indicado acima, as composições de limpeza da presente invenção são formuladas em qualquer forma apropriada e preparadas através de qualquer processo escolhido pelo formulador, exemplos nãolimitantes dos quais são descritos nas patentes US 5 879 584, 5 691 297, 5 574 005, 5 569 645, 5 516 448, 5 489 392 e 5 486 303, todos os quais são aqui incorporados por referência. Em algumas modalidades nas quais uma composição de limpeza de baixo pH é desejada, o pH de tal composição é

72/109 ajustado via a adição de um material ácido tal como HCl.

As composições de limpeza aqui mostradas encontram uso em limpeza de um local (por exemplo, uma superfície, louça, ou tecido). Tipicamente, pelo menos uma porção do local está em contato com uma modalidade da presente composição de limpeza, em forma pura ou diluída em um licor de lavagem, e então o local é opcionalmente lavado e/ou rinsado. Para propósitos da presente invenção, lavagem inclui, mas não está limitada a esfregação, e agitação mecânica. Em algumas modalidades, as composições de limpeza são tipicamente empregadas em concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15 000 ppm em solução. Quando o solvente de lavagem é água, a temperatura da água tipicamente varia de cerca de 5^oC a cerca de 90^oC e, quando o local compreende um tecido, a razão de massa de água para tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

Experimental

Os seguintes exemplos são providos de modo a demonstrarem e ainda ilustrarem certas modalidades preferidas e aspectos da presente invenção e não são para serem construídos como limitantes de seu escopo.

Na descrição experimental que se segue, são aplicadas as seguintes abreviações: ^oC (graus Celsius); rpm (rotações por minuto); H₂O (água); HCl (ácido clorídrico); aa e AA (aminoácido); bp (par de bases); kb (par de quilobase); kD (quilodáltons); g (gramas); pg (microgramas); mg (miligramas); ng (nanogramas); pL (microlitros); mL (mililitros); mm (milímetros); nm (nanometros); pm (micrometros); M (molar); pM (micromolar); U (unidades); V (volts); MW (peso molecular); s (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) (hora/horas); MgCl₂ (cloreto de magnésio); NaCl (cloreto de sódio); OD₂₈₀ (^densidade ó^a em ²⁸⁰ nm)^; (densidade ótica em 405 nm); OD600 (densidade ótica em 600 nm); PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida); EtOH (etanol); PBS (solução salina tamponada com fosfato [NaCl 150 mM, tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2]); LAS (lauril sulfonato de sódio); SDFS (dodecil sulfato de sódio); Tris (tris(hidróxi metil) amino metano); TAED (N,N,N',N'-tetra-acetil etileno diamina); BES (poliéster sulfona); MES (monohidrato de ácido (2-morfolino etano sulfônico; f.w. 195,24; Sigma # M-3671);

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CaCl₂ (cloreto de cálcio, anidro; f.w. 110,99; Sigma # C-4901): SRI( (Índice de remoção de mancha), BMI (sangue leite tinta) e BMI PI (índice de performance de tinta leite sangue), TCA (ácido tricloro acético) e TCA PI (índice de performance de ácido tricloro acético).

Em adição materiais foram obtidos de algumas das seguintes instituições: : TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); Corning (Corning International, Corning, NY); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc., Flintshire, UK); EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (PerkinElmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Woburn, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis, MN); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL or Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany);Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning

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Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); Merck (Merck & Co., Rahway, NJ); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); Corning (Corning International, Corning, NY); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Beckman (Beckman-Coulter, Fullerton, CA); SeitzSchenk (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); Malvern Instruments (Malvern Instruments, Inc., Worcestershire, UK), DNA 2.0 (Menlo Park, CA), Molecular Devices (Sunnyvale, CA), Costar (Cambridge, MA).

Exemplo 1

Ensaios

Nos exemplos que se seguem, vários ensaios foram usados como mostrado abaixo para facilidade em leitura. Quaisquer desvios dos protocolos providos abaixo são indicados.

A. Ensaio TCA para Determinação de Teor de Proteína em Placas de Microtitulação de 96 cavidades

Para FNA (por exemplo, protease de origem) e suas variantes, este ensaio foi iniciado usando sobrenadante de cultura filtrado de placas de microtitulação crescidas 3-4 dias a 33^oC com agitação em 230 rpm e aeração umedecida. Uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 cavidades nova (MTP) foi usada para o ensaio. Primeiro, 100 uL/cavidade de HCl 0,25 N foram colocados em cada cavidade. Então, 50 microlitros de caldo de cultura filtrado foram adicionados. A dispersão/absorbância de luz em 405 nm (usar modo de mistura de 5 segundos no leitor de placa) foi então determinada, de modo a prover a leitura de branco. Para o teste, 100 microlitros/cavidade de ácido tricloro acético (TCA) 15% (peso/volume) foram colocados nas placas e incubados entre 5 e 30 minutos em temperatura ambiente. A dispersão/absorbância de luz em 405 nm (usar modo de mistura de 5

75/109 segundos no leitor de placa) foi então determinada.

Para GG36 (por exemplo, protease de origem) e suas variantes, este ensaio foi realizado usando sobrenadante de cultura filtrado de placas de microtitulação crescidas aproximadamente 3 dias a 37^oC com agitação em 300 rpm e aeração umedecida. Neste ensaio 100 microlitros de uma solução),25 M de HCl são adicionados a cada cavidade de uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 cavidades. Subsequentemente, alíquotas de 25 microlitros dos sobrenadantes de cultura filtrados (contendo as proteases) foram adicionadas às cavidades. A dispersão/absorbância de luz em 405 nm (usando oo modo mistura de 5 segundos no leitor de placa) foram então determinadas, de modo a prover a leitura de branco. Após esta medição, 100 microlitros de uma solução de TCA 30% (peso/volume) foram adicionados a cada cavidade e as placas de microtitulação foram incubadas entre 5 e 15 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, a resultante dispersão/absorbância de luz em 405 nm (usando o modo mistura de 5 segundos no leitor de placa) foram determinadas.

O equipamento usado foi um Biomek FX Robot (Beckman Coulter) e um SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices) MTP Reader; Os MTP's foram de Costar (tipo 9017).

Os cálculos foram realizados através de subtração de branco (sem TCA) da leitura teste com TCA para prover uma medida relativa do teor de proteína nas amostras. Se desejado, uma curva padrão pode ser criada através de calibração de leituras de TCA com ensaios AAPF de clones com fatores de conversão conhecidos. Entretanto, os resultados de TCA são lineares com relação à concentração de proteína a partir de 50 a 500 microgramas de proteína por mL (ppm) e assim podem ser diretamente plotados contra performance de enzima para o propósito de escolha de variantes de bom desempenho. O aumento de dispersão de luz/turbidez nas amostras correlaciona com a quantidade total de proteína precipitável no sobrenadante de cultura.

B. Ensaios de performance de limpeza

A performance de remoção de mancha de serina proteases refe76/109 rências e suas variantes sobre microswatches foi determinada sobre uma escala de placa de microtitulação (MTP) em detergente TIDE 2X Cold comercialmente disponível. TIDE 2X Cold termo inativado (fora de detergente de prateleira) no qual falta de atividade protease foi confirmada, foi usado nos ensaios. Termo inativação de fórmulas detergentes comerciais serve para destruir a atividade enzimática de quaisquer componentes proteínas enquanto retendo as propriedades de componentes não-enzimáticos. Assim este processo foi apropriado para preparação de detergentes adquiridos comercialmente para uso em testes de variantes de enzimas da presente invenção. Os reagentes usados foram: tampão HEPES 5 mM, pH 8,0 ou MOPS 5 mM, pH 7, 3:1 Ca:Mg para dureza média de água: (CaCl₂ : MgCl₂.6H₂O); estoque 15000 grãos por galão (gpg) diluído para 6 gpg. Duas amostras de algodão EMPA-116 BMI (sangue/leite/tinta) processados por CFT foram usados por cavidade. Os microamostras foram pré-lavados em água deionizada por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a etapa de pré-lavagem, os amostras foram colocados sobre toalhas de papel para secar. As amostras secadas a ar foram então puncionadas usando um cossinete circular de V sobre uma prensa de expulsão. Finalmente duas microamostras foram colocadas em cada cavidade de uma MTP de 96 cavidades verticalmente para expor a inteira área de superfície (isto é, não plana sobre o fundo da cavidade). A solução detergente de trabalho é mostrada na Tabea 1 - 1.

Tabela1-1 Solução Detergente de Trabalho
Deter- gente	Temp (C)	Detergente g/L	pH	Tampão	gpg	Protease
TIDE® 2X Cold	16	0.98	8	5mM HEPES	6	FNA, GG36

A incubadora foi fixada em 16^oC. Amostras de 10 microlitros da placa de diluição mestre de ~10 ppm de enzima foram adicionadas a placas de amostra de BMI2 com 190 microlitros de soluções detergentes de trabalho listadas acima. O volume foi ajustado para render concentração final de 0,5 ppm para variantes nas placas de ensaio. As placas foram imediatamente transferidas para incubadora/agitadora iEMS *Thermo/Labsystems); e in77/109 cubadas por 30 minutos com 1400 rpm de agitação em dada temperatura. Seguindo incubação, 100 microlitros de sobrenadante foram transferidos em uma nova placa de 96 cavidades (tipo Costar 9017 usada para leitura de placas de reação após incubação)e a absorbância foi medida em Spectra MAX MTP Reader (tipo 340; Molecular Devices) em 405 nm e/ou 600 nm. Cavidades controles, contendo 2 microamostras e detergente sem a adição de amostras de protease também foram incluídas no teste. A medição em 405 nm provê um valor maior e traça remoção de pigmento, enquanto a medição em 600 nm traça turbidez e limpeza. Neste ensaio, as proteases hidrolisam o substrato e liberam pigmento e partículas insolúveis do substrato. Assim a taxa de turbidez é uma medida de atividade de enzima.

Cálculo da Atividade de Remoção de Mancha

O valor de absorbância obtido foi corrigido para o valor branco (substrato sem enzima), provendo uma medição de atividade hidrolítica. Para cada amostra (variante) o índice de performance foi calculado. O índice de performance compara a performance da variante (valor real) e a enzima padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os valores teóricos podem ser calculados, usando os parâmetros da equação de Langmuir da enzima padrão.

Índice de Desempenho

O índice de desempenho compara o desempenho da variante de protease (valor real) e a de origem (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os valores teóricos podem ser calculados, usando os parâmetros da curva de ligação (isto é, equação de Langmuir) da protease padrão. Um índice de desempenho (PI) que tem um valor de >0,5 para pelo menos uma propriedade identifica uma variante compreendendo pelo menos uma mutação que pode ser combinada com uma ou mais mutações para gerar proteínas tendo apropriados índices de desempenho para uma ou mais propriedades de interesse outras que não em adição à propriedade de interesse para a qual um valor PI de >0,5 foi medido.

Exemplo 2

Variantes de subtilisina de Bacillus subtilis GG36

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Neste exemplo, são descritos experimentos conduzidos para produção de GG36 (também aqui referido como Bacillus lentus subtilisina) em B. subtilis. Transformação foi realizada como conhecido na técnica (ver, por exemplo, WO 02/14490).

Produção de protease GG36 em Bacillus subtilis

O plasmídeo de expressão pAC-GG36ci foi montado usando o gene aperfeiçoado - códon GG36 fundido no 8^o códon da sequência sinal aprE sob o controle do promotor aprE consenso e o terminador transcricional BPN'. Na sequência provida abaixo (SEQ ID NO: 2), fonte em negrito e itálico indicam promotor aprE consenso, fonte padrão indica a sequência sinal, fonte sublinhada indica a pró-sequência, e fonte em negrito indica DNA que codifica protease madura GG36, e fonte itálico sublinhada indica terminador BPN'. A sequência de DNA codificando a região madura GG36 (SEQ ID NO: 4) é flanqueada por sítios de restrição Kpnl e Xhol para clonagem (ver figura 4).

atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacaga atagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaat tgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaag caaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggca aatgacgaggtagccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgatt cctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctatttcttatattgaa gaggatgcagaagtaactacaatqqcqcaatcqqtaccatqqqqaattaqcaqaqtacaaqccc cagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttcc actcatccaqacttaaatattcqtqqtqqaqctaqctttqtaccaqqqqaaccatccactcaaqat ggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttg qcqtaqcqccaaqcqcaqaactatacqctqttaaaqtattaqqaqcaaqcqqttcaqqctctqtc aqctctattqcccaaqqattqqaatqqqcaqqqaacaatqqcatqcacqttqctaatcttaqttta qqatctccttcqccaaqtqccacacttqaqcaaqctqttaataqcqcqacttctaqaqqcqttcttq ttqtaqcqqcctctqqaaattcaqqtqcaqqctcaatcaqctatccqqcccqttatqcqaacqcta tqqcaqtcqqaqctactqaccaaaacaacaaccqcqccaqcttttcacaqtatqqcqcaqqqct tqacattqtcqcaccaqqtqtaaacqtqcaqaqcacttacccaqqttcaacatatqccaqcttaaa cqqtacatcaatqqctactcctcatqttqcaqqtqcqqctqcacttqttaaacaaaaqaacccatct

79/109 tggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttg tatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaaqcttaactcqaqataaaaaaccq gccttggccccgccggttttttat (SEQ ID NO: 2).

O plasmídeo pAC-GG36ci mostrado na figura 4, foi usado para a expressão de protease GG36 em B. subtilis. Os elementos de plasmídeo são como se segue: pUB110 = fragmento de DNA de plasmídeo pUB110 [McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T., Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUB110: Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103, pBR322 = fragmento de DNA de plasmídeo pBR322 [Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles.

II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], pC194 = fragmento de DNA de plasmídeo pC194 [Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150:815-825].

Características de plasmídeo são como se seguem: Ori para B. subtilis = origem de replicação de pUB110, CAT = gene de resistência para cloranfenicol de pC194 origem pMB1 = origem de replicação de pBR322, bla = beta - lactamase de pBR322, promotor aprE curto = promotor transcricional consenso, peptídeo sinal = peptídeo sinal, pró-peptídeo = pró-região de GG36, peptídeo maduroGG36ci = GG36 madura (substituída pelas regiões codificantes para cada variante expressa neste estudo), terminador BPN' = terminador transcricional de subtilisina BPN'.

A sequência de aminoácidos de proteína precursora de GG36 é provida abaixo (SE$Q ID NO: 3). Nesta sequência, negrito indica a protease GG36 madura (tipo selvagem), que é também provida como: SEQ ID NO:4:

MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAV SEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAI SYIEE DAEVTTM AQSVPWGISRVQAPAAH N RG LTGSGVKVAVLDTGISTH PDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAEL YAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAV NSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQY

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GAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSW

SNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR* (SEQ ID NO: 3)

AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLN IRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVK VLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSAT SRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAG LDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNV QIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR* (SEQ ID NO:4)

Desenho e Geração de biblioteca hidrofóbica/carga combinatorial (CCHL)de subtilisina de Bacillus lentus (=GG36)

A biblioteca de hidrofobicidade/carga combinatorial (CCHL) de subtilisina de Bacillus lentus foi desenhada através de identificação de sete aminoácidos expostos na superfície, bem distribuídos. Estes resíduos são S24, R45, S101, Q109, G118, T213, e L217. O número da posição da substituição é através de correspondência à posição enumerada na subtilisina BPN' (numeração BPN'; figura 1). Uma biblioteca hidrofóbica combinatorial de 33 membros (GH2-GH33) foi criada através de obtenção de combinações de quatro possibilidades em cada sítio: glutamina, tipo selvagem (Q), ácido glutâmico (E), leucina (L) e arginina ^® como mostrado na Tabela 2-1.

O plasmídeo pAC-GG36ci contendo o gene GG36 aperfeiçoado - códon foi enviado para DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) para a geração dda CHL. A linhagem Bacillus subtilis (genótipo: AaprE, AnprE, AspoHE, amyE::xyIRPxyIAcomK-phleo) foi provida como a linhagem hospedeira para a transformação do DNA codificando as subtilisinas variantes GG36. Variantes foram supridas como estoques glicerol em placas de 96 cavidades.

A tabela 2-2 mostra as substituições feitas em GG36 para criar as variantes. A Tabela 2-1 também provê a diferença em carga líquida e hidrofobicidade entre a GG36 variante e o tipo selvagem.

Expressão de variantes de protease

Clones de Bacillus subtilis contendo vetores de expressão de GG36 ou FNA foram replicados com um replicador de 96 cavidades de aço a partir de estoques de glicerol em placas de cultura de 96 cavidades (BD,

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353075) contendo 200 microlitros de meios LB + 25 microlitros de cloranfenicol, crescidos por toda noite a 37^oC, 220 rpm em um cercado umedecido. 200 microlitros da cultura de toda noite foram usados para inocular 2000 microlitros de meios definidos + 25 microgramas/mL de cloranfenicol em tubos de agitação plásticos de 5 mL. Os meios de cultura forram meios semi - definidos enriquecidos sobre tampão MOPs, com ureia como principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono, e suplementados com 1% soytone para robusto crescimento de célula. Tubos de agitação foram inoculados a 37^oC, 220 rpm, por 60 horas. Seguindo 60 horas, sobrenadan10 tes foram centrifugados em mais que 8000 x RCF. Solução foi decantada em tubos cônicos de polipropileno de 15 mL para estocagem. Nenhuma purificação ou concentração foi ainda realizada. Estoques de sobrenadante foram formulados em propileno glicol 40% para estabilidade de longo -termo e estocados a 4^oC.

Tabela 2-1: biblioteca hidrofobicidade/carga combinatorial. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Mudanças de carga/hidrofobicidade foram calculadas em relação a GG36.
Variante #	S24	R45	S101	Q109	G118	T213	L217	Variante	mudança de carga liquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte - Doolitle em relação a GG36
GG36	S24S	R45R	S101S	Q109Q	G118G	T213T	L217L	S24S- R45R- S101S- Q109QG118G- T213T- L217L	0	0
GH-2	S24Q	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24Q- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-1	-10.3
GH-3	S24S	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24S- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-1	-7.6
GH-4	S24S	R45R	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24S- R45R- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	0	-8.6
GH-5	S24S	R45R	S101S	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24S- R45R- S101S- Q109QG118Q- T213Q- L217L	0	-5.9
GH-6	S24S	R45R	S101S	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24S- R45R- S101S- Q109QG118Q- T213Q- L217L	0	-5.9
GH-7	S24S	R45R	S101S	Q109Q	G118G	T213Q	L217L	S24S- R45R- S101S- Q109QG118G- T213Q- L217L	0	-2.8
GH-8	S24E	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24E- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-2	-10.3
GH-9	S24E	R45E	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24E- R45E- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-3	-10.3
GH-10	S24E	R45E	S101E	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-4	-10.3
GH-11	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118Q	T213Q	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118Q- T213Q- L217L	-5	-10.3
GH-12	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118E	T213Q	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118E- T213Q- L217L	-6	-10.3

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Tabela 2-1: biblioteca hidrofobicidade/carga combinatorial. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Mudanças de carga/hidrofobicidade foram calculadas em relação a GG36.
Variante #	S24	R45	S101	Q109	G118	T213	L217	Variante	mudança de carga liquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte - Doolitle em relação a GG36
GH-13	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118E	T213E	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118E- T213E-L217L	-7	-10.3
GH-14	S24L	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24L- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-1	-3
GH-15	S24L	R45L	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24L- R45L- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-1	4.3
GH-16	S24L	R45L	S101L	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24L- R45L- S101L- Q109QG118Q- T213Q- L217L	-1	11.6
GH-17	S24L	R45L	S101L	Q109L	G118Q	T213Q	L217L	S24L- R45L- S101L- Q109LG118Q- T213Q- L217L	-1	18.9
GH-18	S24L	R45L	S101L	Q109L	G118L	T213Q	L217L	S24L- R45L- S101L- Q109LG118L- T213Q- L217L	-1	26.2
GH-19	S24L	R45L	S101L	Q109L	G118L	T213L	L217L	S24L- R45L- S101L- Q109LG118L- T213L- L217L	-1	33.5
GH-20	S24R	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24R- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	0	-11.3
GH-21	S24R	R45R	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24R- R45R- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217L	1	-12.3
GH-22	S24R	R45R	S101R	Q109Q	G118Q	T213Q	L217L	S24R- R45R- S101R- Q109QG118Q- T213Q- L217L	2	-13.3
GH-23	S24R	R45R	S101R	Q109R	G118Q	T213Q	L217L	S24R- R45R- S101R- Q109RG118Q- T213Q- L217L	3	-14.3
GH-24	S24R	R45R	S101R	Q109R	G118R	T213Q	L217L	S24R- R45R- S101R- Q109RG118R- T213Q- L217L	4	-15.3
GH-25	S24R	R45R	S101R	Q109R	G118R	T213R	L217L	S24R- R45R- S101R- Q109RG118R- T213R- L217L	5	-16.3

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Tabela 2-1: biblioteca hidrofobicidade/carga combinatorial. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Mudanças de carga/hidrofobicidade foram calculadas em relação a GG36.
Variante #	S24	R45	S101	Q109	G118	T213	L217	Variante	mudança de carga liquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte - Doolitle em relação a GG36
GH-26	S24E	R45R	S101R	Q109R	G118R	T213R	L217L	S24E- R45R- S101R- Q109RG118R- T213R- L217L	3	-15.3
GH-27	S24E	R45E	S101R	Q109R	G118R	T213R	L217L	S24E- R45E- S101R- Q109RG118R- T213R- L217L	1	-14.3
GH-28	S24E	R45E	S101E	Q109R	G118R	T213R	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109RG118R- T213R- L217L	-1	-13.3
GH-29	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118R	T213R	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118R- T213R- L217L	-3	-12.3
GH-30	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118E	T213R	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118E- T213R- L217L	-5	-11.3
GH-31	S24E	R45E	S101E	Q109E	G118E	T213E	L217L	S24E- R45E- S101E- Q109EG118E- T213E-L217L	-7	-10.3
GH-32	S24Q	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217Q	S24Q- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217Q	-1	-17.6
GH-33	S24Q	R45Q	S101Q	Q109Q	G118Q	T213Q	L217E	S24Q- R45Q- S101Q- Q109QG118Q- T213Q- L217E	-2	-17.6

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Exemplo 3

Variantes de subtilisina FNA de Bacillus subtilis

Produção de FNA protease em B. subtilis

Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para produção de FNA (também aqui referida como Bacillus subtilis subtilisina BPN'-Y217L (+FNA)) em B.subtilis são descritos. Transformação foi realizada como conhecida na técnica (ver, por exemplo, WO 02/14490).

O plasmídeo de expressão pACV-FNA foi montado usando o gene FNA, fundido no 8^o códon da sequência sinal aprE, sob o controle do promotor aprE consenso e terminador transcricional BPN'. Na sequência provida abaixo (SEQ ID NO: 5), fonte em negrito e itálico indica promotor aprE consenso, fonte padrão indica a sequência sinal, fonte sublinhada indica a pró-sequência, fonte negrito indica DNA que codifica protease madura FNA, e fonte em itálico sublinhada indica terminador BPN'. A região madura de FNA contem os sítios de restrição KpnI e XhoI para clonagem (ver figura

5).

gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattca cagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagígagaagcaa aaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgca ggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatga gcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgta gacgcagctagcgctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgctta cgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacqcqcaqtccqtqccatatqqcqtatcacaaattaaa qcccctqctctqcactctcaaqqctacaccqqttcaaatqttaaaqtaqcqqttatcqacaqcqqt atcqattcttctcatccaqatcttaaaqtaqcaqqcqqaqccaqcatqqttccttctqaaacaaatc ctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaat cqqtqtattaqqcqttqcqccaaqcqcatcactttacqctqtaaaaqttctcqqcqccqacqqttc cqqccaatacaqctqqatcattaacqqaatcqaqtqqqcqatcqcaaacaatatqqacqttatta acatqaqcctcqqcqqaccqtccqqttctqctqctttaaaaqcqqcaqttqataaaqccqttqcat ccqqcqtcqtaqtcqttqcqqcaqccqqcaacqaaqqcacttccqqcaqctcaaqcacaqtqq qctaccctqqtaaatacccttctqtcattqcaqtaqqcqctqtcqacaqcaqcaaccaaaqaqca tctttctcaaqcqtaqqacctqaqctcqatqtcatqqcacctqqcqtatctatccaaaqcacqcttc

86/109 ctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgc ggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacac cactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctca gtaaaactcQaaataaaaaaccQQCcttQQCCCCQCCQQttttttat (SEQ ID NO:5).

O plasmídeo pAC-FNAre como mostrado na figura 5, foi usado para a expressão de FNA protease em B. subtilis. Os elementos de plasmídeos são como se segue: pUB110 = fragmento de DNA de plasmídeo pUB110 [McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T., Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUB110: Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103], pBR322 = fragmento de DNA de plasmídeo pBR322 [Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], pC194 = fragmento de DNA de plasmídeo pC194 [Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150:815-825].

Características de plasmídeo são como se seguem: Ori para B. subtilis = origem de replicação de pUB110, CAT = gene de resistência a cloranfenicol de pC194, origem pMB1 = origem de replicação9 de pBR322, bla = beta - lactamase de pBR322, promotor sprE curto = promotor transcricional consenso, peptídeo sinal = peptídeo sinal [especificar], pró-peptídeo = pró-região FNA, peptídeo maduro FNA = FNA madura (substituída pelas regiões codificantes para cada variante expressa neste estudo), terminador BPN' = terminador transcricional de BPN' subtilisina.

A sequência de aminoácidos de proteína precursora FNA é provida abaixo (SEQ ID NO: 6). Nesta sequência, negrito indica a protease FNA madura (tipo selvagem), que é também provida como SEQ ID NO:7.

MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGF KQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPS VAYVEE DHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALH SQGYTGSNVKVAVIDSGIDSS HPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPS ASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKA

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AVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQR ASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILS KHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQ ID NO:6)

AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLK VAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYA VKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKA VASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSS VGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPN WTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQ ID NO:7)

Desenho e geração de bibliotecas hidrofóbicas/cargas combinatoriais de subtilisina BPN'-Y217L (=FNA)

A biblioteca hidrofóbica carga combinatorial de subtilisina BPN'Y217L foi desenhada através de identificação de sete aminoácidos expostos na superfície, bem distribuídos. Estes resíduos são S24, A45, S101, N109, N118, K213 me L217. Uma biblioteca hidrofóbica combinatorial de 32 membros (FH2-FH33) foi criada através de obtenção de combinações de quatro possibilidades em cada sítio; tipo selvagem, glutamina (Q), ácido glutâmico (E), leucina (L) e arginina (R) como mostrado na Tabela 3-1.

O plasmídeo pAC-FNAre contendo o gene FNA foi enviado para DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) para a geração de bibliotecas hidrofóbicas combinatoriais. A linhagem Bacillus subtilis (genótipo: ÁaprE, ÁnprE, ÁspoIIE, amyE::xyIRPxyIAcomK-phleo) foi provida para as transformações do DNA codificando as substituições variantes de FNA. Variantes foram supridas como estoques de glicerol em placas de 96 cavidades.

A Tabela 3-1 mostra as substituições feitas em FNA para criar as variantes. A Tabela 3-1 também provê a diferença em carga líquida e hidrofobicidade entre a FNA variante e o tipo selvagem.

Expressão de variantes de protease

Clones de Bacillus subtilis contendo vetores de expressão de GG36 e FNA foram replicados com um replicador de 96 cavidades de aço a partir de estoques de glicerol em placas de cultura de 96 cavidades (Becton Dickinson, 353075) contendo 200 microlitros de meios LB + 25 migrogramas

88/109 /mL de cloranfenicol, crescidos por toda noite a 37^oC, 220 rpm em um asmbiente fechado umedecido. 200 microlitros da cultura de toda noite foram usados para inocular 2000 microlitros de meios definidos + 25 microgramas /mL de cloranfenicol em tubos de agitação plásticos de 5 mL. Os meios de cultura foram meios semidefinidos enriquecidos baseados em tampão MOPs, com ureia como principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono, e suplementados com soytone 1% para robusto crescimento de células. Tubos de agitação foram incubados a 37^oC, 220 rpm, por 60 horas. Seguindo 60 horas, sobrenadantes girados em uma centrífuga a mais de 8000 x RCF. Solução foi decantada em tubos cônicos de polipropileno de 15 mL para estocagem. Nenhuma purificação ou concentração foi ainda realizada. Estoques sobrenadantes foram formulados para 40% de propileno glicol para estabilidade de longo termo e estocados a

Tabela 3-1: Biblioteca de carga/hidrofobicidade combinatorial FNA. Mutações são listadas de acoirdo com numeração BPN'. Mudanças de car-
	ga/hidrofobicidade foram calculadas	em relação a FNA.
Variante #	S24	A45	S101	N109	N118	K213	L217	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a FNA
FNA	S24S	A45A	S101S	N109N	N118N	K213K	L217L	S24S-A45A-S101S-N109NN118N-K213K-L217L	0	0
FH-2	S24Q	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24Q-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-1	-10.3
FH-3	S24S	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24S-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-1	-7.6
FH-4	S24S	A45A	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24S-A45A-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-1	-2.3
FH-5	S24S	A45A	S101S	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24S-A45A-S101S- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-1	0.4
FH-6	S24S	A45A	S101S	N109N	N118Q	K213Q	L217L	S24S-A45A-S101S-N109NN118Q-K213Q-L217L	-1	0.4
FH-7	S24S	A45A	S101S	N109N	N118N	K213Q	L217L	S24S-A45A-S101S-N109NN118N-K213Q-L217L	-1	0.4
FH-8	S24E	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24E-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-2	-10.3
FH-9	S24E	A45E	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24E-A45E-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-3	-10.3

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Tabela 3-1: Biblioteca de carga/hidrofobicidade combinatorial FNA. Mutações são listadas de acoirdo com numeração BPN'. Mudanças de car-
	ga/hidrofobicidade foram calculadas	em relação a FNA.
Variante #	S24	A45	S101	N109	N118	K213	L217	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a FNA
FH-10	S24E	A45E	S101E	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24E-A45E-S101E- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-4	-10.3
FH-11	S24E	A45E	S101E	N109E	N118Q	K213Q	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118Q-K213Q-L217L	-5	-10.3
FH-12	S24E	A45E	S101E	N109E	N118E	K213Q	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213Q-L217L	-6	-10.3
FH-13	S24E	A45E	S101E	N109E	N118E	K213E	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213E-L217L	-7	-10.3
FH-14	S24L	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24L-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	-1	-3
FH-15	S24L	A45L	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24L-A45L-S101Q-N109QN118Q-K213Q-L217L	-1	4.3
FH-16	S24L	A45L	S101L	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24L-A45L-S101L-N109QN118Q-K213Q-L217L	-1	11.6
FH-17	S24L	A45L	S101L	N109L	N118Q	K213Q	L217L	S24L-A45L-S101L-N109L- N118Q-K213Q-L217L	-1	18.9
FH-18	S24L	A45L	S101L	N109L	N118L	K213Q	L217L	S24L-A45L-S101L-N109L- N118L-K213Q-L217L	-1	26.2
FH-19	S24L	A45L	S101L	N109L	N118L	K213L	L217L	S24L-A45L-S101L-N109L- N118L-K213L-L217L	-1	33.5
FH-20	S24R	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24R-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	0	-11.3

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Tabela 3-1: Biblioteca de carga/hidrofobicidade combinatorial FNA. Mutações são listadas de acoirdo com numeração BPN'. Mudanças de car-
	ga/hidrofobicidade foram calculadas	em relação a FNA.
Variante #	S24	A45	S101	N109	N118	K213	L217	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a FNA
FH-21	S24R	A45R	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24R-A45R-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	1	-12.3
FH-22	S24R	A45R	S101R	N109Q	N118Q	K213Q	L217L	S24R-A45R-S101R- N109Q-N118Q-K213Q- L217L	2	-13.3
FH-23	S24R	A45R	S101R	N109R	N118Q	K213Q	L217L	S24R-A45R-S101R- N109R-N118Q-K213Q- L217L	3	-14.3
FH-24	S24R	A45R	S101R	N109R	N118R	K213Q	L217L	S24R-A45R-S101R- N109R-N118R-K213Q- L217L	4	-15.3
FH-25	S24R	A45R	S101R	N109R	N118R	K213R	L217L	S24R-A45R-S101R- N109R-N118R-K213R- L217L	5	-16.3
FH-26	S24E	A45R	S101R	N109R	N118R	K213R	L217L	S24E-A45R-S101R- N109R-N118R-K213R- L217L	3	-15.3
FH-27	S24E	A45E	S101R	N109R	N118R	K213R	L217L	S24E-A45E-S101R- N109R-N118R-K213R- L217L	1	-14.3
FH-28	S24E	A45E	S101E	N109R	N118R	K213R	L217L	S24E-A45E-S101E-N109RN118R-K213R-L217L	-1	-13.3
FH-29	S24E	A45E	S101E	N109E	N118R	K213R	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118R-K213R-L217L	-3	-12.3
FH-30	S24E	A45E	S101E	N109E	N118E	K213R	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213R-L217L	-5	-11.3

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Tabela 3-1: Biblioteca de carga/hidrofobicidade combinatorial FNA. Mutações são listadas de acoirdo com numeração BPN'. Mudanças de car-
	ga/hidrofobicidade foram calculadas	em relação a FNA.
Variante #	S24	A45	S101	N109	N118	K213	L217	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a FNA
FH-31	S24E	A45E	S101E	N109E	N118E	K213E	L217L	S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213E-L217L	-7	-10.3
FH-32	S24Q	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217Q	S24Q-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217Q	-1	-17.6
FH-33	S24Q	A45Q	S101Q	N109Q	N118Q	K213Q	L217E	S24Q-A45Q-S101Q- N109Q-N118Q-K213Q- L217E	-2	-17.6

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Exemplo 4

Avaliação de remoção de mancha e expressão relativa

Este exemplo descreve os testes de variantes de biblioteca hidrofóbica combinatorial GG36 e FNA em um ensaio de microamostra BMI. 5 Os processos providos no exemplo 1 foram usados. Os resultados mostrados nas Tabelas 4-1 (GG36) e 4-2 (FNA) são índices de performance nos quais a performance da variante é comparada ao respectivo de origem para relativa expressão de proteína (TCA PI) e atividade de remoção de mancha (BMI PI). Aquelas variantes com um índice de performance maior que 0,5 (PI 10 > 0,5) têm performance aperfeiçoada. Índice de performance menor que ou igual a 0,05 foram fixados em 0,05 e são indicados em itálico negrito. ND indica não determinado.

Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GG36	S24S- R45R- S101S- Q109Q- G118G- T213T- L217L	0	0	1,00	1,00
GH-2	S24Q- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	-1	-10,3	1,03	0,06

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-3	S24S- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	-1	-7,6	1,05	0,42
GH-4	S24S- R45R- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	0	-8,6	0,87	0,23
GH-5	S24S- R45R- S101S- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	0	-5,9	1,00	0,05
GH-6	S24S- R45R- S101S- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	0	-5,9	ND	ND

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-7	S24S- R45R- S101S- Q109Q- G118G- T213Q- L217L	0	-2,8	0,79	0,38
GH-8	S24E- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	-2	-10,3	1,01	0,47
GH-9	S24E- R45ES101QQ109QG118QT213Q- L217L	-3	-10.3	0.89	0.26
GH-10	S24E- R45E- S101E- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	-4	-10,3	1,28	0,04

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-11	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118Q- T213Q- L217L	-5	-10,3	1,09	0,78
GH-12	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118E- T213Q- L217L	-6	-10.3	1.10	0.29
GH-13	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118E- T213E- L217L	-7	-10,3	1,06	0,71
GH-14	S24L- R45QS101QQ109QG118QT213Q- L217L	-1	-3	0,96	0,37
GH-15	S24L- R45LS101QQ109QG118QT213Q- L217L	-1	4,3	0,99	0,52

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-16	S24L- R45L- S101L- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	-1	11,6	0,88	0,08
GH-17	S24L- R45L- S101L- Q109L- G118Q- T213Q- L217L	-1	18,9	0,90	0,40
GH-18	S24L- R45L- S101L- Q109L- G118L- T213Q- L217L	-1	26,2	0,96	0,09
GH-19	S24L- R45L- S101L- Q109L- G118L- T213L- L217L	-1	33,5	1,06	0,05
GH-20	S24R- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	0	-11,3	1,05	0,56

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-21	S24R- R45R- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	1	-12,3	0,78	0,21
GH-22	S24R- R45R- S101R- Q109Q- G118Q- T213Q- L217L	2	-13,3	0,74	0,19
GH-23	S24R- R45R- S101R- Q109R- G118Q- T213Q- L217L	3	-14,3	0,75	0,15
GH-24	S24R- R45R- S101R- Q109R- G118R- T213Q- L217L	4	-15,3	0.68	0.07

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-25	S24R- R45R- S101R- Q109R- G118R- T213R- L217L	5	-16,3	1,09	0.05
GH-26	S24E- R45R- S101R- Q109R- G118R- T213R- L217L	3	-15,3	0,90	0,05
GH-27	S24E- R45E- S101R- Q109R- G118R- T213R- L217L	1	-14,3	0,79	0,05
GH-28	S24E- R45E- S101E- Q109R- G118R- T213R- L217L	-1	-13,3	0,87	0,06

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-29	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118R- T213R- L217L	-3	-12,3	0,92	0,31
GH-30	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118E- T213R- L217L	-5	-11.3	0.93	0.47
GH-31	S24E- R45E- S101E- Q109E- G118E- T213E- L217L	-7	-10,3	1,01	0,40
GH-32	S24Q- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217Q	-1	-17,6	1,10	0,07

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Tabela 4-1: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de GG36. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a
	GG36 (de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a GG36	Mudança de hidrofobicidade Kyte Doolitle em relação a GG36	TCA PI	BMI PI
GH-33	S24Q- R45Q- S101Q- Q109Q- G118Q- T213Q- L217E	-2	-17,6	1,11	0,47

Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FNA	S24S-A45A- S101S- N109N- N118N- K213K- L217L	0	0	1,00	1,00
FH-2	S24Q-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	-10,3	1,62	0,93

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-3	S24S-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	-7,6	2,08	1,00
FH-4	S24S-A45A- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	-2,3	1,46	1,01
FH-5	S24S-A45A- S101S- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	0,4	1,29	0,95
FH-6	S24S-A45A- S101S- N109N- N118Q- K213Q- L217L	-1	0,4	1,70	0,05
FH-7	S24S-A45A- S101S- N109N- N118N- K213Q- L217L	-1	0,4	1,95	0,95

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-8	S24E-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-2	-10,3	1,55	0,90
FH-9	S24E-A45E- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-3	-10,3	1,37	0,88
FH-10	S24E-A45E- S101E- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-4	-10,3	1,52	0,68
FH-11	S24E-A45E- S101E- N109E- N118Q- K213Q- L217L	-5	-10,3	2,72	0,81
FH-12	S24E-A45E- S101E- N109E- N118E- K213Q- L217L	-6	-10,3	1,55	0,56

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-13	S24E-A45E- S101E- N109E- N118E- K213E- L217L	-7	-10,3	1,56	0,42
FH-14	S24L-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	-3	1,27	1,02
FH-15	S24L-A45L- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	4.3	1,68	0,98
FH-16	S24L-A45L- S101L- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	-1	11,6	1,47	0,94
FH-17	S24L-A45L- S101L- N109L- N118Q- K213Q- L217L	-1	18,9	1,17	0,89

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-18	S24L-A45L- S101L- N109L- N118L- K213Q- L217L	-1	26,2	1,11	0,23
FH-19	S24L-A45L- S101L- N109L- N118L- K213L- L217L	-1	33,5	1,19	0,20
FH-20	S24R-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	0	-11,3	1,31	1,01
FH-21	S24R-A45R- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	1	-12,3	1,29	0,75
FH-22	S24R-A45R- S101R- N109Q- N118Q- K213Q- L217L	2	-13,3	1,28	0,46

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-23	S24R-A45R- S101R- N109R- N118Q- K213Q- L217L	3	-14,3	1,21	0,33
FH-24	S24R-A45R- S101R- N109R- N118R- K213Q- L217L	4	-15,3	1,11	0,28
FH-25	S24R-A45R- S101R- N109R- N118R- K213R- L217L	5	-16,3	0,98	0,23
FH-26	S24E-A45R- S101R- N109R- N118R- K213R- L217L	3	-15,3	1,22	0,37
FH-27	S24E-A45E- S101R- N109R- N118R- K213R- L217L	1	-14,3	1,23	0,65

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-28	S24E-A45E- S101E- N109R- N118R- K213R- L217L	-1	-13,3	1,55	0,89
FH-29	S24E-A45E- S101E- N109E- N118R- K213R- L217L	-3	-12,3	1,56	0,84
FH-30	S24E-A45E- S101E- N109E- N118E- K213R- L217L	-5	-11,3	1,48	0,82
FH-31	S24E-A45E- S101E- N109E- N118E- K213E- L217L	-7	-10,3	2,89	0,65
FH-32	S24Q-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217Q	-1	-17,6	1,55	1,07

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Tabela 4-2: Expressão relativa e desempenho de remoção de mancha de variantes de biblioteca de hidrofobicidade carga/combinatorial de FNA. Mutações são listadas de acordo com numeração BPN'. Índice de desempenho e mudanças de hidrofobicidade/carga calculadas em relação a FNA
	(de origem)
Variante #	Variante	Mudança de carga líquida em relação a FNA	Mudança de hidrofobidicade Kyte Doolitle em relação a FNA	TCA PI	BMI PI
FH-33	S24Q-A45Q- S101Q- N109Q- N118Q- K213Q- L217E	-2	-17,6	1,68	1,07

Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Aqueles versados na técnica facilmente apreciarão que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetos e obter os fins e vantagens mencionadas, assim como aquelas aqui inerentes. As composições e processos aqui descritos são representativos de modalidades preferidas, são exemplares, e não são pretendidos como limitações sobre o escopo da invenção. É facilmente visível para aqueles versados na técnica que várias substituições e modificações podem ser feitas para a invenção aqui mostrada sem se fugir do escopo e espírito da invenção.

A invenção aqui descrita ilustrativamente pode ser praticada apropriadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não seja especificamente aqui mostrada. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que no uso de tais termos e expressões excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas porções, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção foi especificamente mostrada através de modalidades preferidas e características opcionais, modificação e variação

109/109 dos presentes conceitos aqui mostrados podem ser recorridos por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas estarem dentro do escopo desta invenção como aqui definidas.

A invenção foi amplamente e geralmente aqui descrita. Cada 5 uma das espécies mais estreitas e agrupamentos subgerais caindo dentro de descrição geral também forma parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com a condição ou limitação negativa removendo qualquer matéria objeto do gênero, independente de se ou não material excisado é especificamente aqui recitado.

1/3

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de subtilisina de Bacillus, em que a referida variante de subtilisina é uma forma madura possuindo atividade proteolítica e compreendendo uma substituição em duas ou mais posições, em que a referida subtilisina de Bacillus é GG36, e em que a substituição em duas ou mais posições é selecionada de: S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45QS101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45QS101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45ES101E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24ER45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118ET213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118QT213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S101L-Q109LG118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45LS101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24RS101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R- G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109RG118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109RG118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101RQ109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24ER45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118ET213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101QG118Q-T213Q-L217Q, e S24Q-R45Q-S101Q- G118Q-T213Q-L217E, onde as posições correspondem às posições de BPN' subtilisina de SEQ ID NO: 1.
2. 2. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de subtilisina de Bacillus em que a referida variante de subtilisina é uma forma madura possuindo atividade proteolítica e compreendendo uma substituição em duas ou mais posições, em que a referida subtilisina de Bacillus é FNA, e em que a substituição em duas ou mais posições é selecionada de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109QN118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q,

   2/3

   S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109QN118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45ES101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E,

   S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45LS101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q,

   S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45RS101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q,

   S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109RN118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45ES101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R,

   S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109EN118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, and S24Q-A45Q-S101Q-N109QN118Q-K213Q-L217E, wherein the positions correspond to the positions of BPN' subtilisin of SEQ ID NO:1.
3. 3. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida variante de subtilisina tem um índice de performance de expressão de proteína relativa (TCA PI) e/ou um índice de performance de atividade de remoção de mancha (BMI PI) que é superior ou igual a 0.5.
4. 4. Composição de limpeza de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é um detergente.
5. 5. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito detergente é um detergente de lavanderia seco ou líquido para trabalho pesado.
6. 6. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito detergente é um detergente de louça.
7. 7. Composição de limpeza de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais adicionais enzimas ou derivados de enzimas selecionados de hemice3/3 luloses, celulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, peridrolases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, ceratinases, reductases, oxidases, fenol oxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta5 glicanases, arabinosidases, hialuronidases, condroitinase, lacase, e amilases, ou suas misturas.
8. 8. Composição de limpeza de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um agente estabilizante.
9. 10 9. Composição de limpeza de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 0,0001 porcento em peso de pelo menos uma variante de subtilisina, e opcionalmente pelo menos um ingrediente adjunto apropriado.

   10. Processo de limpeza, caracterizado pelo fato de que com15 preendendo as etapas de:

   a) contato de uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida em qualquer uma das reivindicações 1-9; e

   b) opcionalmente lavagem e/ou rinsagem da dita superfície ou

   20 artigo.

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   BPN'

   FNA

   GG36

   BPN'

   FNA

   GG36

   BPN'

   FNA

   GG36

   BPN'

   FNA

   GG3é

   BPN'

   FNA

   GG36

   BPN'

   FNA

   GG36

   1 10 20 30 40 50

   AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDS GID ΞΞ BPDLKVAGGASM AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASM AQSVPWGISPVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVWTGI * STHPDLNIRGGASF

   51 60 70 BQ 90 100

   VPSETN PFQDNNSHGTHVAGTVAKLNNSIGVLGVAPSASLYAVXVLGADG VPSETN PFQDNNSHGTHVAGTVAALNNS1GVLGVAP SASLYAVKVLGADG VPÇEPST*QD GNÇHGTHVAÇTIAALNNSI GVLGVAPSAELYAVKVLGASG

   101 110 120 130 140 150

   SGQYSWIINGIEWAIANNMDVI NMS LGGPS GSAAIxKAAVDKAVASGWW SGQYSWIINGIENAIANNMDVI ΝΜΞ LGGPS GSAALKAAVDKAVASGWW SGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSBjGVLW

   151 160 170 ISO 190 200

   AAAGNEGT SGSS STVGY PGKYPSVIAVGAVD SSNQBAS FSSVGPELDVMA AAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQBASFSSVGPELDVMA AASGNSGAGS * * * *ISYPARYANAMAVGATDQNNNKASFSQYGAGLDIVA

   201 210 220 230 240 250

   PGVSIQSTYPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSL PGVSIQS TLPGNKYGALNGTSMAS PKVAGÂAÃLILSKHPNWTNTQVRS SL PGVNVQS TYPGSTYASLNGTSMAT PHVAGAAALVKQKNPSWSNVQ1HNHL

   251 260 270

   ENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ {SEQ ID NO:1)

   ENTTTKLGDSFYYGKGL1NVQAAAQ {SEQ ID NO:7)

   KNTATSLGSTNLYGSGLYNAEAATR (SEQ ID NO;4}