BR112021007286A2 - células furtivas terapêuticas nanoprojetadas - Google Patents

Abstract

CÉLULAS FURTIVAS TERAPÊUTICAS NANOPROJETADAS. Trata-se, neste documento, de um método de "reprogramação" de células altamente móveis encontradas em tumores, como esses clones GSC e/ou MDSC altamente móveis, em "mísseis" de células autodestrutivas" (referidas neste documento como células furtivas terapêuticas) que podem procurar e destruir diferentes focos de recorrência no corpo, como no cérebro. As células com motilidade aprimorada podem ser organizadas a partir de populações heterogêneas e, em seguida, serem convertidas como "autodestrutivas" por entrega determinística de um agente anticâncer, como um coquetel de plasmídeo de vírus oncolítico.

Description

“CÉLULAS FURTIVAS TERAPÊUTICAS NANOPROJETADAS” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Nº U.S. 62/747.980, depositado em 19 de outubro de 2018, incorporado a este documento a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0002] A disseminação de células tumorais é o principal fator de mortes relacionadas ao câncer (> 90%) (Gallego-Perez, D. et al. Lab Chip 12: 4.424 a 4.432 (2012); Fidler, I.J. Nat Rev Cancer 3: 453 a 458 (2003); Gupta, GP & Massague, J. Cell 127: 679 a 695 (2006)). O glioblastoma multiforme (GBM), em particular, é uma forma letal de câncer cerebral com uma natureza altamente invasiva (Bellail, A.C., et al. Int J Biochem Cell Biol 36: 1.046 a 1.069 (2004)). Este tumor agressivo exibe padrões de disseminação intracraniana distintos, disseminando-se efetivamente como células únicas ao longo de tratos de substância branca pré-alinhados (Gallego-Perez, D. et al. Lab Chip 12: 4.424 a 4.432 (2012); Bellail, A.C., et al. Int J Biochem Cell Biol 36: 1.046 a 1.069 (2004)). Uma quantidade crescente de evidências sugere que o fenótipo invasivo de GBMs é modulado pela motilidade celular (Giese, A., et al. J Clin Oncol 21: 1.624 a 1.636 (2003)). Além disso, a recorrência parece ser impulsionada principalmente por um subconjunto de células iniciadoras de tumor altamente móveis, conhecidas como células-tronco de glioma (GSCs), que são resistentes a terapias convencionais (Calabrese, C. et al. Cancer Cell 11: 69 a 82 (2007); Ghotra, VP, et al. Int J Radiat Biol 85, 955 a 962 (2009)). Como as GSCs continuam a atrair interesse significativo das comunidades científica e médica, novas ferramentas analíticas e de engenharia são necessárias a fim de melhor compreender e neutralizar os mecanismos por meio dos quais as GSCs se espalham para desenvolver novos focos de crescimento tumoral no cérebro. A pesquisa sobre a motilidade das GSC e a resistência à terapia, entretanto, é limitada em comparação aos esforços contínuos na transformação oncogênica.

Isso se deve, em parte, à falta de ferramentas eficazes para identificar, estudar e manipular subconjuntos específicos de GSCs, ou outras células de interesse a partir do nicho de GBM, para fins de pesquisa, diagnóstico e/ou terapêuticos. A caracterização de tumores ao nível de um único clone por meio de imagens in vivo é extremamente desafiadora (Irimia, D. & Toner, M. Integr Biol (Camb) 1: 506 a 512 (2009); Condeelis, J. & Segall, J.E. Nat Rev Cancer 3: 921 a 930 (2003)). Além disso, as tecnologias atuais para análise ex vivo de explantes de tecido tendem a ser trabalhosas e limitadas (Johnson, J. et al. Tissue Eng Part C Methods 15: 531 a 540 (2009)). Ensaios convencionais in vitro (Boyden, S. J Exp Med 115, 453 a 466 (1962); Albini, A. & Benelli, R. Nat Protoc 2, 504 a 511 (2007); Rao, J.S. Nat Rev Cancer 3, 489 a 501 (2003); Yamada, K.M. & Cukierman, E. Cell 130, 601 a 610 (2007); Liang, C.C., Park, A.Y. & Guan, JL Nat Protoc 2, 329 a 333 (2007)), por outro lado, não são fisiologicamente relevantes e/ou são testes de ponto final que focam apenas no comportamento em massa de populações celulares altamente heterogêneas.

SUMÁRIO

[0003] Há um subconjunto de GSCs e MDSCs que exibe alta disseminação e capacidade de resistência à terapia. Essas descobertas sugerem que GSCs e MDSCs não são populações monolíticas e que subconjuntos clonais específicos exibem fenótipos significativamente mais "agressivos", que podem ser provavelmente responsáveis por conduzir a recaída da doença.

[0004] É divulgado neste documento um método de "reprogramação" de células altamente móveis encontradas em tumores, como esses clones de GSC e/ou MDSC altamente móveis, em "mísseis" de células “autodestrutivas" (referidas neste documento como células furtivas terapêuticas) que podem procurar e destruir novos focos de recorrência no corpo, como o cérebro. As células com motilidade aprimorada podem ser organizadas a partir de populações heterogêneas e, em seguida, se tornar "autodestrutivas" por entrega determinística de um agente anticâncer, como um coquetel de plasmídeo de vírus oncolítico.

[0005] O método divulgado pode envolver a ordenação de células a partir de um sujeito para criar as células furtivas terapêuticas. Em algumas modalidades, as células são autólogas, tais como células sanguíneas ou uma biópsia tumoral a partir do sujeito a ser tratado. No entanto, em alguns casos, as células são alogênicas.

[0006] O método divulgado pode envolver ordenar células a partir de um sujeito para uma subpopulação altamente móvel e, em seguida, reprogramar a subpopulação para entregar agentes anticâncer. Em algumas modalidades, a subpopulação pode ser ordenada em um ensaio de migração usando um gradiente quimioatrativo. Em particular, o gradiente quimioatrativo pode envolver uma quimiocina produzida pelo tumor a ser tratado. Por exemplo, em algumas modalidades, o quimioatrativo compreende Matrigel®. Em algumas modalidades, o quimioatrativo compreende meio condicionado por células tumorais.

[0007] Em algumas modalidades, a subpopulação é ordenada em um ensaio de migração usando uma superfície nanotexturizada e/ou biomimética. Por exemplo, as MDSCs são responsivas e podem ser guiadas ao longo de sinais estruturais pré-alinhados na ausência de estimulação bioquímica. Portanto, em algumas modalidades, a superfície compreende saliências/ranhuras na escala micro ou nano. Por exemplo, a profundidade e a largura das saliências/ranhuras podem ter dimensões de 100 nm a 10 μm, incluindo, 100 nm a 1 μm, 1 μm a 10 μm, 500 nm a 5 μm. As saliências/ranhuras podem ter uma variedade de formas e padrões, incluindo ranhuras retas.

[0008] Em algumas modalidades, a subpopulação é ordenada em um ensaio de migração transwell ou ensaio de invasão celular. Um ensaio de migração transwell mede o número de células que passam por uma membrana porosa, enquanto um ensaio de invasão celular se concentra na migração celular invasiva através de uma matriz extracelular.

[0009] Uma vez que a subpopulação é ordenada e opcionalmente expandida, as células podem então ser reprogramadas para expressar heterologamente um transgene que codifica uma proteína antitumoral, oligonucleotídeo ou combinação dos mesmos.

[0010] A introdução de uma “troca de segurança” eficiente pode, em alguns casos, ser usada para reduzir o risco de doença do enxerto versus hospedeiro grave. Portanto, em algumas modalidades, a subpopulação também é reprogramada com um sistema kill switch. A troca de segurança mais extensivamente estudada até o momento é o produto do gene da timidina quinase derivada de HSV I (HSV-TK). Também foram desenvolvidos sistemas de troca de segurança não imunogênicos que envolvem proteínas de fusão compostas por moléculas pró-apoptóticas humanas (por exemplo, caspase-9) ligadas a proteínas de aglutinação a FK506 humanas modificadas (por exemplo, iCasp9). Essas trocas de segurança podem ser ativadas por injeção de um indutor químico de dimerização (CID), que consiste em um dímero de duas variantes sintéticas de FK506. Outros kill switches indutíveis e autodestrutivos estão em desenvolvimento e podem ser usados nas células furtivas terapêuticas divulgadas.

[0011] Também é divulgada uma composição que compreende uma pluralidade de células furtivas terapêuticas produzidas pelos métodos divulgados. Em modalidades particulares, a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0012] Também é divulgado um método para tratar um tumor em um sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição farmacêutica divulgada. O método divulgado pode ser usado para tratar qualquer tumor sólido. Em modalidades particulares, o tumor é combinado com a fonte de células usada para desenvolver as células furtivas terapêuticas. Por exemplo, MDSCs altamente móveis obtidas a partir de uma biópsia de tumor de mama podem ser reprogramadas para tratar o câncer de mama. Da mesma forma, GSCs/MDSCs altamente móveis obtidas a partir de uma biópsia de glioblastoma multiforme (GBM) podem ser reprogramadas para tratar GBM.

[0013] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são estabelecidos nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras particularidades, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] As Figuras 1A a 1E mostram resultados de uma ordenação/"cromatografia" baseada em migração. A Figura 1A mostra que superfícies nanotexturizadas induzem motilidade guiada. Clones de alta motilidade são atraídos para uma câmara de coleta por quimioatração. A Figura 1B mostra que estudos com GSCs mostram que clones altamente móveis eram resistentes à terapia antimiR363. A Figura 1C mostra que a ordenação baseada na migração de MDSCs descobriu um subconjunto clonal com motilidade superior em comparação com MDSCs em massa. A Figura 1D mostra que a ordenação exibiu um fenótipo diverso com os subtipos granulocítico (P4) e monocítico (P5). Subtipos não classificados que exibem Ly6-C/G baixo (P6) ou alto (P3) também estavam presentes. A Figura 1E mostra que os clones de MDSC com alta motilidade eram P4 ou P3. *p < 0,05.

[0015] A Figura 2 retrata GSCs reprogramadas/domadas e/ou MDSCs sendo injetadas intracranialmente em camundongos portando GBM e a progressão do tumor sendo monitorada.

[0016] A Figura 3 mostra que as MDSCs exibem motilidade significativa (isto é, guiada) em superfícies texturizadas/biomiméticas. MDSCs cultivadas em TCP, por outro lado, exibem motilidade limitada. Estes resultados sugerem que, assim como as células tumorais, as MDSCs podem ser responsivas aos mesmos sinais estruturais que aumentam a disseminação das células tumorais in vivo. *p < 0,05.

[0017] As Figuras 4A e 4B ilustram uma configuração de cromatografia migracional, em que MDSCs são semeadas seletivamente em um lado da plataforma e induzidas a migrar em uma única direção por meio de quimiotaxia. A nanotextura de superfície desencadeia a separação de clones com base na motilidade guiada. A Figura 4C mostra a velocidade para células de movimento rápido vs. lento. As Figuras 4D e 4E contêm análise de citometria de fluxo que mostra que clones de movimento rápido têm um fenótipo distinto em comparação com clones de movimento lento (por exemplo, MDSCs em massa). *p < 0,05.

[0018] As Figuras 5A e 5B mostram ensaios de motilidade de clone único de MDSCs circulantes a partir de pacientes com melanoma. Diferenças na velocidade (Figura 5A) e deslocamento efetivo (Figura 5B) para cada paciente. Os resultados indicam que as MDSCs a partir de certos pacientes exibem velocidades aumentadas. No entanto, quando o deslocamento efetivo é considerado (ou seja, distância geométrica a partir do local inicial ao final), certos lotes de MDSC com baixa velocidade mostraram deslocamento significativo, que pode ser reflexo de uma motilidade mais direcional/persistente (sem quimiotaxia). P1: estágio IIIC, nivolumabe tx + cirurgia; P2: estágio IV, nivolumabe tx; P3: estágio IV V600E/BRAF, radiação tx + pembrolizumabe; P4: estágio IV, nivolumabe tx + ipilumamabe; P5: estágio IV, pembrolizumabe/ipilumamabe/nivolumabe tx; P6: estágio IV V600E/BRAF, tratado com INF-α).

[0019] As Figuras 6A e 6B mostram que superfícies nanotexturizadas podem ser usadas para desmascarar sensibilidades a drogas não observadas no TCP padrão. A Figura 6A mostra que ensaios de motilidade de clone único de MDSCs derivadas de pacientes mostram inibição de um subconjunto clonal específico (velocidade média > 40 μm/h) em resposta a ibrutinibe. A Figura 6B mostra que a motilidade de clone único em TCP não revelou nenhum efeito de ibrutinibe na disseminação de MDSC.

[0020] As Figuras 7A e 7B ilustram um dispositivo para cromatografia migracional com microfluídica integrada para permitir o desprendimento automatizado de clones de interesse. As Figuras 7C e 7D mostram que, uma vez que ocorre a separação baseada na migração, o sistema microfluídico subjacente pode ser usado para fluir sequencialmente água fria em determinados locais, o que facilita o desprendimento seletivo de clones de MDSC de interesse devido à atuação térmica da camada PINIPAM.

[0021] A Figura 8A mostra que a cocultura de MDSCs e MCF10As não cancerígenas levou a uma maior motilidade em um grupo de clones de MCF10A. A Figura 8B mostra que a análise de imunofluorescência indica que as condições de cocultura desencadearam uma diminuição na expressão de marcadores epiteliais, como ECaderina, e um aumento nos marcadores mesenquimais em certos clones (por exemplo, Vimentina). A Figura 8C mostra que a cocultura de MDSCs com células MDAMB-231 já agressivas não levou a grandes mudanças na motilidade na população de MDA-MB-231. ●: monocultura, ■: cocultura 50:50 ▲: cocultura 90:10 (MDSC: células teciduais/câncer de mama).

[0022] A Figura 9 Mostra que a cocultura de MDSCs e células de câncer de mama/tecido levou a um aumento acentuado na velocidade de certos clones de MDSC, especialmente quando cocultivados com MDA-MB-231. Esses resultados sugerem potencialmente que a motilidade de MDSC é regulada positivamente na presença de células metastáticas, que facilitam a codisseminação fora do tumor e a imunoproteção contínua durante o processo de disseminação das células tumorais.

[0023] As Figuras 10A a 10E mostram que as MDSCs são responsivas a sinais estruturais alinhadas e exibem padrões de disseminação guiada. A Figura 10A é um diagrama esquemático do microambiente tumoral que mostra células cancerígenas invasivas e MDSCs infiltrantes que usam sinais estruturais pré-alinhados (por exemplo, ECM remodelado, paredes dos vasos sanguíneos) para escapar e invadir o estroma tumoral, respectivamente. A Figura 10B é uma micrografia SEM (com modelos de MDSC sobrepostos) de uma superfície texturizada biomimética com base em PDMS usada para avaliar a migração de MDSC estruturalmente guiada no nível de clone único. A Figura 10C mostra coloração de Núcleos - Actina que mancham MDSCs cultivadas em superfícies texturizadas vs. de controle/TCP. As MDSCs assumem uma morfologia alinhada/mais migratória nas superfícies texturizadas em comparação com o TCP. As Figuras 10D e 10E mostram rastreios de disseminação de clone único (Figura 10D) e quantificação de MDSCs (Figura 10E) em superfícies texturizadas vs. de controle/TCP que confirmam capacidades de disseminação aprimoradas (ou seja, velocidade média de clone único e distância líquida de rastreio) para MDSCs quando expostas a sinais estruturais pré-alinhados. A distância líquida de rastreio é um reflexo da distância geométrica percorrida por uma célula durante o período de rastreamento. *p < 0,01 e ‡ p < 0,02 (teste t, n = 4).

[0024] As Figuras 11A a 11I mostram que subpopulações de MDSCs exibem disseminação distinta e padrões de expressão genética. As Figuras 11A e 11B são diagramas esquemáticos de um projeto experimental. Aqui, as culturas de MSC-2 foram ordenadas por citometria de fluxo em três subpopulações distintas, que incluem MDSCs granulocíticas (CD11b+Ly6CbaLy6G+) e monocíticas (CD11b+Ly6CalLy6G-), bem como células CD11b+Ly6C+Ly6G+. Cada população foi então submetida a ensaios de motilidade de clone único em PDMS texturizado e análises qRT-PCR de marcadores pró- e anti-inflamatórios. A Figura 11C mostra coloração de Núcleos - Actina que mancham diferentes subtipos de MSC-2 cultivadas em superfícies texturizadas. As MDSCs granulocíticas tinham uma tendência a exibir uma morfologia mais alinhada e propensa à migração em comparação com suas contrapartes. A Figura 11D mostra a quantificação da disseminação de clone único (isto é, velocidades médias e distâncias líquidas de rastreio) para cada subtipo em superfícies texturizadas. *p = 0,006, **p < 0,001, p = 0,001, ‡p = 0,09 (ANOVA de 2 fatores, n = 4). A Figura 11E mostra rastreios de clone único para cada população. A Figura 11F mostra MDSCs ordenadas por fluxo identificadas por fluorescência vs. MDSCs “frescas"/não ordenadas injetadas

(isto é, através da veia da cauda) em camundongos portadores de tumor (isto é, tumor de mama ortotópico desenvolvido a partir de células humanas em camundongos nus). As fotografias à direita retratam a progressão/crescimento do tumor a partir da semana 1 à semana 4. A Figura 11G mostra tumores e outros órgãos alvos imageados para detectar o grau de infiltração de MDSC 24 horas após a injeção. As Figuras 11H e 11I mostram análise de qRT-PCR de genes pró-inflamatórios (Figura 11H) e anti-inflamatórios (Figura 11I) para cada subtipo. *p < 0,001, **p < 0,0001, ‡p = 0,03 (ANOVA de 2 fatores, n = 3 a 4).

[0025] As Figuras 12A a 12G mostram que subpopulações de MDSC simples parecem mostrar plasticidade fenotípica que pode acionar a reposição de todo o espectro fenotípico. A Figura 12A é um diagrama esquemático do projeto experimental. A Figura 12B mostra que os estudos de disseminação de clone único (isto é, velocidades médias e distâncias líquidas de rastreio) não mostraram diferenças significativas entre todas as três populações até dia 7. As Figuras 12C a 12E mostram que as análises de citometria de fluxo indicam que, enquanto no dia 1 após a ordenação, todas as subpopulações permaneceram relativamente puras, no dia 7 todo o espectro de fenótipos foi reposto, independentemente do fenótipo da população de células iniciais. *p < 0,0001, ‡p = 0,01, n° de p = 0,03, p = 0,0001 (ANOVA de 2 fatores/comparações múltiplas de Tukey, n = 3 a 4). As Figuras 12F e 12G mostram análises de qRT-PCR de genes pró-inflamatórios (Figura 12F) e anti- inflamatórios (Figura 12G) no dia 7 após a ordenação. *p = 0,006, **p = 0,01 (ANOVA de 2 fatores/comparações múltiplas de Tukey, n = 3 a 6).

[0026] As Figuras 13A e 13B mostram que as MDSCs circulantes derivadas de pacientes com melanoma mostram diferentes perfis de disseminação ao nível de clone único. As Figuras 13A e 13B mostram que velocidades médias de clone único (Figura 13A) e distâncias líquidas de rastreio (Figura 13B) tinham uma tendência a serem significativamente maiores para certos pacientes em comparação com o restante da população de pacientes, o que poderia ser um reflexo do histórico do paciente.

[0027] As Figuras 14A a 14F mostram que subpopulações distintas de MDSCs derivadas de pacientes mostram diferentes capacidades de disseminação. As Figuras 14A a 14C mostram que MDSCs de pacientes com melanoma foram ordenadas em subpopulações granulocíticas (CD11b+CD15+CD14-) e monocíticas (CD11b+CD15-CD14+) por meio de citometria de fluxo. As Figuras 14D a 14F mostram que semelhante às observações em MDSCs de camundongo, a subpopulação granulocítica de MDSCs derivadas de pacientes também mostra capacidades de disseminação aumentadas (isto é, velocidades médias de clone único e distâncias líquidas de rastreio) em comparação com o subtipo monocítico. *p = 0,0005, **p = 0,002 (Mann-Whitney, n = 3).

[0028] As Figuras 15A e 15B mostram diferenças na expressão genética de marcadores pró-inflamatórios (Figura 15A) e anti- inflamatórios (Figura 15B) em função do tempo para subpopulações ordenadas por citometria de fluxo. *p <0,0001, ‡p = 0,06 (ANOVA de 2 fatores/comparações múltiplas de Sidak, n = 3 a 6).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] Antes de a presente divulgação ser descrita em mais detalhes, deve ser entendido que esta divulgação não está limitada a modalidades particulares descritas e, como tal, pode, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0030] Quando uma gama de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente o contrário, entre o limite superior e inferior dessa gama e qualquer outro valor declarado ou intermediário nessa gama declarada, é abrangido pela divulgação. Os limites superior e inferior dessas gamas menores podem ser incluídos independentemente nas gamas menores e também são abrangidos na divulgação, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na gama declarada. Quando a gama declarada inclui um ou ambos os limites, as gamas que excluem um ou outro, ou ambos daqueles limites incluídos também estão incluídas na divulgação.

[0031] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por alguém versado na técnica a quem esta divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos.

[0032] Todas as publicações e patentes citadas neste relatório descritivo são incorporadas neste documento a título de referência como se cada publicação ou patente individual fosse indicada de maneira específica e individual para ser incorporada a título de referência e são incorporadas neste documento a título de referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas. A citação de qualquer publicação é para sua divulgação antes da data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que a presente divulgação não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude da divulgação anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar ser confirmadas de forma independente.

[0033] Como será evidente para aqueles versados na técnica após a leitura desta divulgação, cada uma das modalidades individuais descritas e ilustradas neste documento tem componentes e recursos distintos que podem ser prontamente separados ou combinados com os recursos de qualquer uma das outras diversas modalidades sem se afastar do escopo ou espírito da presente divulgação. Qualquer método citado pode ser realizado na ordem dos eventos citados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.

[0034] As modalidades da presente divulgação empregarão, a menos que indicado de outra forma, técnicas de química, biologia e semelhantes, que estão dentro da habilidade da técnica.

[0035] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como realizar os métodos e usar as análises divulgadas e reivindicadas neste documento. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números (por exemplo, quantidades, temperatura etc.), mas alguns erros e desvios devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, a temperatura é em °C e a pressão é atmosférica ou quase atmosférica. Temperatura e pressão padrão são definidas como 20 °C e 1 atmosfera.

[0036] Antes de as modalidades da presente divulgação serem descritas em detalhes, deve ser entendido que, a menos que indicado de outra forma, a presente divulgação não está limitada a materiais, reagentes, materiais de reação, processos de fabricação ou semelhantes, pois podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante. Também é possível na presente divulgação que as etapas possam ser executadas em sequência diferente, quando isso for logicamente possível.

[0037] Deve-se notar que, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e “o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0038] "Gene suicida", conforme utilizado neste documento, refere-se a um gene que causa a morte da própria célulapor apoptose. A ativação desses genes pode ser devido a vários processos, mas a principal “troca" celular para induzir a apoptose é a proteína p53. A estimulação ou introdução (por meio de terapia genética) de genes suicidas pode ser usada para tratar o câncer ou outras doenças proliferativas, tornando as células cancerígenas mais vulneráveis, mais sensíveis à quimioterapia. Partes de genes expressos em células cancerígenas são anexadas a outros genes para enzimas não encontradas em mamíferos que podem converter uma substância inofensiva em uma que é tóxica para o tumor. Os genes suicidas que medeiam essa sensibilidade podem codificar enzimas virais ou bacterianas que convertem um fármaco inativo em antimetabólitos tóxicos que inibem a síntese de ácido nucleico.

[0039] Os clones de GSC e/ou MDSC altamente móveis podem ser ordenados a partir de populações heterogêneas por ordenação baseada em migração, como cromatografia de motilidade de clone único suportada por nanochip. O método de ordenação de células com base na migração envolve a identificação de subconjuntos clonais e/ou subpopulações de células que exibem capacidades de disseminação aprimoradas em comparação com o restante da população. Tais células são inerentemente mais propensas a se alojar/infiltrar em tumores primários e/ou desenvolvimentos metastáticos e, como tal, podem servir como veículos de entrega de fármacos/genes mais eficientes. A identificação de subconjuntos clonais altamente disseminativos pode ser alcançada de muitas maneiras diferentes.

[0040] Uma opção é semear misturas de células em uma superfície micro ou nanotexturizada com linhas, o que induzirá a migração direcional guiada por contato das células. Por exemplo, as MDSCs são responsivas e podem ser guiadas ao longo de sinais estruturais pré-alinhadas na ausência de estimulação bioquímica.

[0041] As células podem ser expostas a um gradiente quimioatrativo, que definirá uma direção específica na qual as células migrarão, e os clones de "movimento rápido" podem ser progressivamente coletados em um reservatório à medida que migram em direção ao quimioatrativo. A execução dessa ordenação na ausência de um quimioatrativo também pode ser usada como uma maneira de identificar subconjuntos clonais que podem ser mais propensos a mostrar motilidade de única direção (isto é, em direção ao reservatório de coleta), mesmo na ausência de um quimioatrativo. Mesmo que essas células não sejam necessariamente os movedores mais rápidos, sua capacidade de exibir motilidade persistente em uma única direção pode se traduzir em capacidade aprimorada de disseminação in vivo (por exemplo, células com alta velocidade de migração, mas com falta de direcionalidade podem não ser necessariamente as mais eficazes “infiltradoras"), o que também torna esses clones desejáveis para a entrega aprimorada de fármacos/genes ao tumor primário e/ou desenvolvimentos metastáticos.

[0042] Outra forma de selecionar células com capacidades de disseminação aprimoradas pode ser por meio de um ensaio de translocação em um sistema transwell (por exemplo, poros de 8 mícrons). Por exemplo, as células podem ser semeadas em uma câmara superior de transwell, e as células com capacidades de disseminação aprimoradas se translocarão gradualmente através dos poros para a câmara inferior, onde podem ser coletadas para modificação posterior (para aplicações de entrega de genes/fármacos).

[0043] Conforme divulgado neste documento, a subpopulação de células divulgada são células supressoras derivadas de mieloide CD11b+Ly6CbaLy6G+. Portanto, em algumas modalidades, as células altamente móveis são obtidas por ordenação de células de GSCs e/ou MDSCs derivadas de tumor usando uma combinação de anticorpos que se aglutinam seletivamente a CD11b, Ly6C e Ly6G.

[0044] Em algumas modalidades, as células são derivadas de células tumorais primárias (por exemplo, isoladas a partir de uma biópsia de rotina). Em algumas modalidades, as células são derivadas de células supressoras derivadas de mieloide (por exemplo, isoladas a partir da circulação). No entanto, os métodos divulgados podem ser aplicados a qualquer outro tipo de célula que é propenso a se infiltrar em tecido cancerígeno (por exemplo, outros monócitos, células T etc.).

[0045] Uma vez que a pré-seleção de clones altamente disseminados está completa, essas células podem ser primeiro expandidas e, em seguida, geneticamente modificadas por meio de várias vias, que incluem entrega viral ou não viral (por exemplo, eletroporação em massa, nanotransfecção de tecido) de transgenes e/ou inserção de transgene acionado por CRISPR/CAS9. O objetivo dessa etapa é induzir a produção de proteínas antitumorais, oligos e/ou outros organismos (por exemplo, glut1, mir146, vírus oncolíticos etc.) por essas células. Uma vez que a modificação genética dessas subpopulações altamente móveis está completa, essas células podem então ser devolvidas ao paciente, tanto sistemicamente (por exemplo, no sangue, sistema linfático), ou localmente (em tumores primários ou metastáticos), com a intenção de erradicar desenvolvimentos cancerígenos. Em algumas modalidades, o transgene codifica o inibidor de tecido da metaloproteinase-3 (TIMP-3).

[0046] Para aplicações de câncer, essas células podem ser modificadas (por meio de transfecção) para expressar moléculas pró- inflamatórias (ccl4, mir146, glut1, por exemplo) para promover a infiltração de células T no tumor, ou componentes antimetástases (por exemplo, timp3) para prevenir a disseminação de câncer.

[0047] Em algumas modalidades, as MDSCs são usadas para entregar medicamentos em outras afecções, como doença de Alzheimer ou diabetes, entregando moléculas anti-inflamatórias ou outras formas de lesão cerebral (por exemplo, acidente vascular cerebral isquêmico), em que as MDSCs habitam naturalmente, de modo que uma vez possam entregar carga terapêutica como agentes pró-angiogênicos e/ou pró-neuronais ou anti- inflamatórios.

[0048] Essas células autólogas podem ser posteriormente modificadas (antes de serem injetadas de volta no paciente) com um sistema de “kill switch” indutível por fármacos (por exemplo, doxiciclina), para erradicar as células terapêuticas quando sua ação não for mais necessária. O sistema kill switch é conhecido na técnica e, portanto, está dentro da competência de um versado na técnica selecionar e empregar um sistema kill switch adequado.

[0049] Várias modalidades da invenção foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CÉLULAS FURTIVAS TERAPÊUTICAS DE

NANOPROJEÇÃO

[0050] As capacidades de disseminação das GSCs, bem como sua capacidade de evitar o sistema imunológico ou as terapias padrão, continuam a ser os principais fatores de letalidade. Ferramentas em nanoescala foram usadas para isolar e estudar um subconjunto específico de GSCs que exibem alta disseminação e capacidade de resistência à terapia (Figura 1).

[0051] Estudos piloto com MDSCs também revelaram um subconjunto clonal com notável capacidade de disseminação, semelhante às GSCs (Figura 1). Essas descobertas sugerem que GSCs e MDSCs não são populações monolíticas e que subconjuntos clonais específicos exibem fenótipos significativamente mais "agressivos", que podem ser provavelmente responsáveis por conduzir a recaída da doença. É divulgado neste Exemplo o desenvolvimento de uma abordagem transformativa, de alto risco/alta recompensa, para minimizar a recorrência de GBM por "reprogramação" de clones de GSC e/ou MDSC altamente móveis em "mísseis" de células “autodestrutivas" que podem buscar e destruir novos focos de recorrência no cérebro. As GSCs e MDSCs com motilidade aprimorada são ordenadas de populações heterogêneas por meio de "cromatografia" de motilidade de clone único suportada por nanochip, conforme ilustrado na Figura 1. Essas células,

então, sofrem uma expansão clonal limitada (2 a 5 passagens) e, subsequentemente, se tornam "autodestrutivas" por entrega determinística baseada em nanocanais (Gallego-Perez, D. et al. Nanomedicine 12: 399 a 409 (2016)) de um coquetel de plasmídeo de vírus oncolítico. Esses vírus podem matar células cancerígenas por meio de diferentes mecanismos em comparação com as terapias convencionais e, como tal, foram propostos como uma alternativa terapêutica potencial para erradicar GSCs (Cripe, TP, et al. Mol Ther 17: 1.677 a 1.682 (2009)).

[0052] Uma série de estudos in vitro é conduzida para determinar a dosagem de plasmídeo ideal e as razões nas quais o subgrupo selecionado de GSCs ou MDSCs se torna "autodestrutivo", mantendo a motilidade superior por períodos prolongados de tempo. Essas populações de GSC/MDSC “domadas", mas altamente móveis, são então injetadas intracranialmente (juntas e separadamente) em camundongos portadores de GBM, com a intenção de disseminá-las de forma eficaz e liberar estrategicamente vírions terapêuticos por todo o cérebro doente (Figura 2).

[0053] Experimentos comparativos de entrega sistêmica de MDSCs reprogramadas/sob efeito de fármaco também são executados em camundongos portadores de GBM, a fim de verificar se essas células são capazes de se hospedar no cérebro doente e impedir a progressão do tumor. Tecnologias avançadas de imagem (por exemplo, IVIS, PET, MRI) são usadas para monitorar o destino de GSCs/MDSCs terapêuticas. Embora as terapias de vírus oncolítico com base em células tenham mostrado resultados promissores em comparação ao tratamento direto com partículas de vírus oncolítico (Power, A.T. & Bell, JC Mol Ther 15: 660 a 665 (2007)), uma limitação importante é que a maioria das células que têm sido estudadas até agora reduziram a capacidade de disseminação, especialmente quando comparadas ao ritmo de disseminação intracraniana de GSCs. GSCs ou MDSCs domadas/reprogramadas, por outro lado, podem ter capacidades inerentemente altas de motilidade intracraniana, além de habilidade furtiva para o sistema imunológico, permitindo-lhes, assim, colonizar, vigiar e tratar o cérebro doente de forma mais eficaz. EXEMPLO 2: DISSEMINAÇÃO GUIADA ESTRUTURALMENTE DE MDSCs DE CAMUNDONGO

[0054] Estudos recentes indicam que as MDSCs são responsivas a, e podem ser guiadas ao longo de sinais estruturais pré-alinhados (Figuras 3 a 4), na ausência de estimulação bioquímica. Em contraste, os ensaios de motilidade de clone único em poliestireno de cultura de tecidos (TCP) revelaram pouca capacidade de disseminação (Figura 3), sugerindo que, assim como as células tumorais, a disseminação/infiltração de MDSC é presumivelmente favorecida pela migração guiada estruturalmente. Estudos de cromatografia migracional suportada por chip revelaram um subconjunto clonal com capacidade de disseminação aprimorada em comparação com o restante da população (Figura 4A a 4C), comparável a células cancerígenas altamente agressivas. As análises de citometria de fluxo de clones de movimento rápido revelaram que essa população era predominantemente Ly6-Galta/Ly6-Cbaixa (granulocítica) e Ly6-Galta/Ly6-Calta (não identificada). O fenótipo de clones de movimento lento foi mais uniformemente distribuído entre monocítico (Ly6-Gbaixo/ Ly6-Calto) e granulocítico, bem como as variantes não identificadas Ly6- Gbaixa/Ly6-Cbaixa e Ly6-Galta/Ly6 -Calta. Portanto, as MDSCs claramente têm subconjuntos clonais especializados com capacidades de disseminação melhoradas, que presumivelmente são mais propensas a colonizar tumores/gânglios para exercer imunossupressão. Esses subconjuntos clonais podem, portanto, representar alvos terapêuticos inovadores na luta contra o câncer. EXEMPLO 3: DISSEMINAÇÃO GUIADA ESTRUTURALMENTE DE MDSCs DE PACIENTES

[0055] O próximo teste foi se as MDSCs derivadas do paciente também exibem migração guiada estruturalmente na ausência de estímulos bioquímicos. MDSCs isoladas do sangue periférico de pacientes com melanoma em diferentes estágios, sob diferentes modalidades de tratamento, foram rastreadas por aproximadamente 24h. As MDSCs de cada paciente exibiram padrões/assinaturas de disseminação exclusivos(as), com alguns pacientes mostrando subconjuntos clonais com mobilidade aprimorada em comparação com a população em massa (Figura 5), que permaneceram agrupados abaixo de 25 μm/h. Digno de nota, alguns pacientes tinham MDSCs em cuja velocidade se agruparam inteiramente abaixo de 25 μm/h, possivelmente indicativo de uma população aparentemente "quiescente", presumivelmente reflexo do tipo de malignidade e/ou a modalidade/estágio da terapia. Embora mais estudos sejam necessários para estabelecer uma correlação clara entre esses fatores e as capacidades/assinaturas de disseminação de clone único de MDSCs, que podem servir como um indicador para seu nível de atividade in vivo e/ou resultado de doença, esses dados sustentam ainda mais a noção que as MDSCs não são monolíticas e que explorar os mecanismos relacionados à motilidade poderia potencialmente abrir caminho para o desenvolvimento não apenas de terapias aprimoradas, mas também de novas ferramentas de diagnóstico/prognóstico. EXEMPLO 4: A MIGRAÇÃO GUIADA

ESTRUTURALMENTE REVELA SUSCETIBILIDADES A FÁRMACOS

[0056] Impedir a migração/infiltração de MDSC no tumor/gânglios pode ser uma estratégia viável para reduzir a carga imunossupressora. Os inibidores da tirosina quinase de Bruton (BTK) têm sido comumente usados no tratamento de cânceres hematológicos. A BTK desempenha um papel em vários processos biológicos, que incluem a migração celular. Enquanto as MDSCs expressam a BTK, os ensaios de motilidade de clone único em TCP na presença de ibrutinibe (inibidor de BTK) não mostraram um efeito significativo na migração (Figura 6). Em contraste, os ensaios de motilidade em superfícies biomiméticas parecem mostrar direcionamento seletivo de um subconjunto altamente móvel de MDSCs (Figura 5). Tais resultados indicam que as mudanças acionadas pela migração (por exemplo,

alinhamento do citoesqueleto) podem modular parcialmente a sensibilidade ao fármaco em MDSCs. EXEMPLO 5: PLATAFORMAS BIOMIMÉTICAS PARA

CROMATOGRAFIA MIGRACIONAL

[0057] A experiência de nanofabricação interna (isto é, litografia baseada em contato/projeção e litografia macia) é aproveitada para fabricar sinais estruturais pré-alinhados (aproximadamente 300 nm de largura) a partir de polidimetilsiloxano (PDMS). As superfícies texturizadas serão, então, funcionalizadas com poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM) termorresponsiva sob plasma de argônio (30 Watts, aproximadamente 133,32237 Pa (1.000 microTorr)). Os substratos revestidos com PINIPAM (aproximadamente 100 μm de espessura) serão então interfaceados com um sistema microfluídico com microcanais agrupados (50 μm de largura, 500 μm de passo, operado independentemente, Figura 7). Esses canais são usados para fluir seletivamente água fria sob o PDMS texturizado e facilitar o desprendimento seletivo da célula por meio da ativação térmica da PINIPAM (isto é, trocar de medianamente hidrofóbico para altamente hidrofílico). Superfícies nanotexturizadas são caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (SEM) e de força atômica (AFM). O revestimento de PNIPAM será verificado por meio de medições de ângulo de contato em diferentes temperaturas, espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). EXEMPLO 6: MOTILIDADE DE MDSC

[0058] As MDSCs são isoladas a partir de tecido recém-adquirido (isto é, sangue periférico, tumor e tecido linfoide) de pacientes com tumor de câncer de mama sob o protocolo OSU-09142 usando procedimentos padrão. Células/tecidos tumorais também serão coletadas(os) usando procedimentos padrão 36. A cromatografia migracional será conduzida nas superfícies biomiméticas (Figuras 4, 7) usando GM-CSF (200 ng/ml) como quimioatrativo. A migração de clone único para MDSCs de origem diferente (isto é, circulante vs. tumoral vs. residente em tecido linfoide) é registrada por meio de microscopia de lapso de tempo em um microscópio confocal equipado com uma câmara de cultura. As imagens serão coletadas a cada 10 minutos durante 24 a 72 horas, e pós-processadas/analisadas usando o plugin do rastreador manual em Fiji. Os clones de MDSC que exibem diferentes graus de motilidade serão isolados “operando” seletivamente os microcanais da plataforma. As células são divididas como motilidade alta vs. média vs. baixa, dependendo da distância percorrida a partir do local de partida (Figura 7). A biomecânica (ou seja, rigidez e contratilidade) desses subconjuntos clonais é então analisada por AFM oscilatório, que é uma técnica desenvolvida por co-I Ghadiali para analisar propriedades viscoelásticas de células únicas, e Microscopia de Força de Tração (TFM), conforme descrito alhures. Além disso, a citometria de fluxo é executada para marcadores monocíticos (CD15+/CD14+) e granulocíticos (CD15+/CD14-) e combinações dos mesmos. Para avaliar a atividade imunossupressora em cada subconjunto clonal, eles são cultivados (em diferentes concentrações) com células T etiquetadas com CFSE e a proliferação de células T é avaliada por citometria de fluxo. O meio RMPI sozinho e o peptídeo SIINFEKL serão usados como controles negativos e positivos, respectivamente. Finalmente, subconjuntos clonais com a atividade supressora mais forte são analisados adicionalmente por sequenciamento de célula única, conforme descrito alhures. EXEMPLO 7: INIBIÇÃO DE BTK

[0059] Uma vez que clones altamente móveis e/ou imunossupressores são identificados a partir de diferentes fontes de MDSCs, a extensão em que os inibidores de BTK (isto é, ibrutinibe) dificultam a disseminação guiada é avaliada. Primeiro, o immunoblotting é usado para avaliar o nível de BTK e BTK fosforilado (p-BTK) em cada subconjunto clonal exposto a 0 a 10 μm de ibrutinibe. Cada subconjunto clonal é então plaqueado nas superfícies nanotexturizadas (aproximadamente 10 3 a 104 células/cm2), e a migração guiada é monitorada por meio de microscopia de lapso de tempo enquanto é exposta a 0 a 10 μm de ibrutinibe. As imagens são processadas/analisadas por meio de Fiji. Experimentos com ACP-196 (inibidor seletivo e irreversível de BTK) e GDC-0853 (inibidor seletivo e reversível de BTK) são realizados para fins de comparação. AFM e TFM são usados novamente para avaliar a rigidez e contratilidade de uma única célula, respectivamente, após a exposição ao ibrutinibe. Os efeitos da inibição de BTK na motilidade e biomecânica de MDSC são avaliados posteriormente em pacientes com câncer de mama que recebem ibrutinibe sob os auspícios de um estudo clínico patrocinado pela OSU CCC que está aberto e em andamento na OSU (OSU- 18015). Após a obtenção do consentimento informado, 30 cm 3 de sangue periférico são extraídos pré-tratamento e em 2 e 4 semanas após o início da terapia. MDSCs são isoladas e a motilidade de clone único e biomecânica (isto é, AFM e TFM) são avaliadas como descrito acima. EXEMPLO 8: MODULAÇÃO RECÍPROCA DE DISSEMINAÇÃO DE CÉLULAS TUMORAIS/MDSCS

[0060] Estudos preliminares indicam que as MDSCs têm subconjuntos clonais especializados com mobilidade melhorada, que presumivelmente são mais propensas a colonizar tumores/tecidos linfoides ou codisseminar junto com células tumorais altamente invasivas para fornecer imunossupressão "protetora" no início da metástase. Estudos piloto em superfícies biomiméticas (Figuras 8 e 9) indicaram que a presença de MDSCs desencadeou motilidade aumentada e transições similares a epiteliais para mesenquimais em um subconjunto clonal de células de tecido da mama não cancerígenas (Figura 8A e 8B), sugerindo que MDSCs podem ter a capacidade de induzir transformações potencialmente cancerígenas em tecido saudável. Em contraste, as MDSCs não parecem induzir mudanças significativas no padrão geral de motilidade de células de câncer de mama altamente agressivas (Figura 8C). Curiosamente, as células tumorais mais agressivas induziram as mudanças mais fortes na motilidade de clone único em MDSCs (Figura 9). As MDSCs passaram de velocidades de clone único que se agrupavam em torno/abaixo de 40 μm/h, para velocidades que poderem atingir, em alguns casos,

aproximadamente 100 μm/h, provavelmente devido ao aumento da secreção de citocinas/quimiocinas de células tumorais agressivas. EXEMPLO 9: ESTUDOS DE MIGRAÇÃO GUIADA NO

NÍVEL DE CLONE ÚNICO REVELAM POSSÍVEIS ALVOS DE INTERESSE TERAPÊUTICO EM POPULAÇÕES DE CÉLULAS SUPRESSORAS DERIVADAS DE MIELOIDES ASSOCIADAS A TUMORES MÉTODOS

[0061] Superfícies de PDMS texturizadas: as superfícies de PDMS microtexturizadas foram fabricadas a partir de mestres de silício padronizados fotolitograficamente por meio de um processo de moldagem de réplica. Um agrupamento paralelo de saliências e ranhuras (2 µm de largura, 2 µm de altura, espaçadas por 2 µm) foi primeiramente padronizado em um mestre de silício por meio de fotolitografia UV padrão usando fotoresistente S1813. Uma mistura de 10:1 de PDMS com agente de cura foi então fundida no mestre e permitiu a eliminação do gás e a cura por várias horas. O PDMS foi então desmoldado do mestre, esterilizado e colocado em placas de múltiplos poços para experimentos de migração de célula única. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi usada para caracterizar a morfologia da superfície.

[0062] Culturas de MDSC: a linhagem de células MDSC de camundongo (MSC-2) foi uma doação gentil de Gregoire Mignot. As células MSC-2 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com HEPES de 25 mM, soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) a 10%, antibiótico- antimicótico a 1% e piruvato de sódio de 1 mM. As MDSCs derivadas de pacientes foram enriquecidas a partir de sangue periférico usando o kit de enriquecimento de células mieloides RosetteSep HLA (Stemcell Technologies) seguido por centrifugação Ficoll-Paque (GE Healthcare). As MDSC foram isoladas por seleção negativa subsequente de células HLA-DRneg usando microesferas antiHLA-DR (Miltenyi Biotec) por 15 minutos a 4 °C e isoladas usando uma coluna MS-MACS. As amostras foram adquiridas com consentimento informado segundo os protocolos aprovados pelo IRB para pesquisa em seres humanos.

[0063] Ensaios de migração de célula única: Aproximadamente 1,5 x 105 células MSC-2 foram semeadas e permitidas a aderir nas superfícies texturizadas de PDMS ou controles de TCP em meios de cultura regulares por várias horas. As células foram imageadas por meio de microscopia de lapso de tempo a cada 10 minutos por mais de 16h usando uma câmara de cultura de células (Okolab) montada em um microscópio invertido. As imagens foram analisadas usando o plugin do rastreador manual em Fiji. Os dados de deslocamento de célula única foram então analisados por meio de MATLAB para determinar as velocidades e distâncias percorridas de rastreio líquidas.

[0064] Análise e ordenação baseada em citometria de fluxo: os seguintes anticorpos foram usados para as células MSC-2: antiCD11b-FITC, antiLy6-C-APC e antiLy6-G-PE, todos adquiridos da Biolegend. Para MDSCs derivadas de pacientes, utilizou-se antiCD33-APC, antiCD11b-AP e antiHLA-DR-PECy7, adquiridos da Beckman Coulter. Os dados foram obtidos usando um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Todas as cores foram avaliadas quanto a seus respectivos controles isotípicos e amostras sem coloração.

[0065] Análises de expressão genética: O RNA total foi extraído usando o reagente TRizol (ThermoFisher). As reações de transcrição reversa foram realizadas usando 500 a 1.000 ng de RNA em uma reação de 20 l com o kit de síntese de cDNA VILO sobrescrito (ThermoFisher). O cDNA foi usado como um modelo para medir os níveis de expressão de genes pró- e anti- inflamatórios por PCR quantitativa em tempo real usando iniciadores predefinidos. As reações PCR em tempo real foram realizadas usando o Sistema PCR em tempo real QuantStudio 3 com química de avanço rápido TaqMan (Thermo Scientific) com as seguintes condições: 95 °C 10 min, 40 ciclos de 95

°C 1 min, 60 °C 1 min e 72 °C 1 min. A expressão genética foi normalizada quanto aos genes de manutenção GAPDH e ATP-6.

[0066] Xenoenxertos de tumor ortotópico: camundongos nus imunodeficientes (Laboratório Jackson), de 6 a 8 semanas de idade, receberam pela primeira vez injeções com 1 milhão de células de câncer de mama humanas (MDA-MB-231) no coxim de gordura mamária para gerar tumores. Após 4 semanas de desenvolvimento do tumor, as subpopulações de MDSC ordenadas foram coradas usando o kit de ligante de célula fluorescente verde PKH67 para etiquetagem de membrana celular geral (Millipore Sigma) seguindo as instruções sugeridas pelo fabricante. Camundongos portadores de tumor receberam então injeções com aproximadamente 2,5 x 105 de MDSCs através da veia da cauda. Os camundongos foram então coletados 1 dia após a injeção, e os tumores, pulmões e baços foram caracterizados com um Sistema de Imagem IVIS (Xenogen Imaging Technologies). Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Ohio (The Ohio State University).

[0067] Análise estatística: Todas as análises estatísticas foram executadas em Sigma Plot 12 ou GraphPad Prism 7. Utilizou- se n = 3 a 6 réplicas por experimento. Informações específicas sobre o número de réplicas, testes estatísticos e níveis de significância podem ser encontradas nas legendas das figuras.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[0068] As MDSCs respondem a sinais topográficos e exibem padrões de disseminação estruturalmente guiados. A disseminação de células guiadas estruturalmente tem sido conhecida por desempenhar um papel no escape de células cancerígenas a partir do tumor primário e no estabelecimento de desenvolvimentos metastáticos em órgãos e tecidos periféricos. Células cancerígenas altamente agressivas tendem a exibir padrões de disseminação distintos, disseminando-se preferencialmente ao longo de microestruturas anatômicas pré-alinhadas dentro dos tecidos, incluindo fibrilas orientadas radialmente a partir da matriz extracelular (ECM), tratos de substância branca, lâmina basal de vasos sanguíneos e espaços subpiais/subperitoneais, entre outros (Figura 10A) (Gallego-Perez D, et al. Lab Chip 2012, 12: 4.424 a

4.432; Bellail AC, et al. Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 1.046 a 1.069; Johnson J, et al., Tissue Eng Part C Methods 2009, 15: 531 a 540). Ferramentas em micro e nanoescala têm sido usadas para desenvolver sistemas que podem ser utilizados para sondar a motilidade de células cancerígenas sob essas condições fisiologicamente relevantes (Gallego-Perez D, et al. Lab Chip 2012, 12: 4.424 a

4.432; Bellail AC, et al. Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 1.046 a 1.069; Johnson J, et al. Tissue Eng Part C Methods 2009, 15: 531 a 540; Irimia D, et al. Integr Biol (Camb) 2009, 1: 506 a 512 ; Doyle AD, et al. J Cell Biol 2009, 184: 481 a 490; Petrie RJ, et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2009, 10: 538 a 549). Embora sinais topográficos ou de confinamento celular tenham sido usados para imitar a motilidade rápida e altamente direcional em uma ampla variedade de células cancerígenas (Gallego-Perez D, et al. Lab Chip 2012, 12: 4.424 a 4.432; Johnson J, et al. Tissue Eng Part C Methods 2009, 15: 531 a 540; Irimia D, et al. Integr Biol (Camb) 2009, 1: 506 a 512; Sidani M, et al. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2006, 11: 151 a 163; Provenzano PP, et al. BMC Med 2006, 4:38; Wong IY, et al. Nat Mater 2014, 13: 1.063 a 1.071), nenhum estudo examinou a influência de tais sinais nas capacidades de disseminação/infiltração de MDSCs associadas a tumor. O próximo teste foi se as MDSCs respondem a sinais topográficos exibindo padrões de disseminação estruturalmente guiados semelhantes a células cancerígenas invasivas. A linhagem celular MDSC murina, MSC-2, foi usada como modelo (Stiff A, et al. Cancer Res 2016, 76: 2.125 a 2.136; Trikha P, et al. Oncoimmunology 2016, 5: e1214787). Essas células foram plaqueadas em superfícies de polidimetilsiloxano (PDMS) microtexturizadas (Figura 10B), que foram fabricadas por meio de moldagem a partir de réplica de mestres de silício fabricados fotolitograficamente e foram projetadas como um agrupamento de saliências e ranhuras paralelas com dimensões que foram previamente testadas nos estudos de disseminação de células cancerígenas (aproximadamente 2 µm x 2 µm com espaçamento de 2 µm) (Gallego-Perez D, et al.

Nano Lett 2016, 16: 5.326 a 5.332; Gallego-Perez D, et al.

Lab Chip 2012, 12: 4.424 a 4.432; Kim SH, et al.

Cancer Cell 2016, 29: 201 a 213; Gu SQ, et al.

Nucleic Acids Res 2016, 44: 5.811 a 5.819). A motilidade da MDSC foi monitorada ao nível do clone único em tempo real por meio de microscopia de lapso de tempo.

As células plaqueadas em uma superfície de cultura de células padrão (isto é, poliestireno de cultura de tecidos ou TCP) foram usadas para fins de comparação.

Os resultados indicam que as MDSCs mostram motilidade limitada no nível do clone único em TCP (Figura 10C a 10E), com a maioria das células exibindo uma morfologia arredondada (Figura 10C). As superfícies texturizadas, por outro lado, induziram claramente rearranjos citoesqueléticos e morfológicos (isto é, alinhamento) em algumas das MDSCs (Figura 10C), que eram propícias ao aumento da motilidade (Figura 10D, 10E). As velocidades médias de clone único atingiram um máximo de aproximadamente 40 m h-1 em superfícies texturizadas em comparação com aproximadamente 20 m h-1 em TCP.

As distâncias líquidas de rastreio, que são uma medida do deslocamento efetivo de um clone único, atingiram um máximo de aproximadamente 400 m por um período de 16 horas em superfícies texturizadas em comparação com < 100 m em TCP.

Notavelmente, MDSCs migrando em superfícies texturizadas exibiram variabilidade interclonal significativa no potencial de disseminação, com células que abrangem todo o espectro de baixa à alta motilidade.

Em contraste, as MDSCs que migram no TCP mostraram uma variabilidade interclonal marcadamente menor.

Estudos com MDSCs circulantes derivadas de pacientes com câncer (Figura 13) confirmaram ainda a existência de populações de MDSC altamente móveis exibindo variabilidade interclonal marcada, com alguns clones mostrando velocidades de migração médias guiadas de até aproximadamente 200 m h-1, e deslocamentos líquidos totais que se aproximaram de 1 mm ao longo de um período de 16 horas.

No entanto, certas populações de MDSCs circulantes derivadas de pacientes exibiram motilidade geral limitada, o que poderia potencialmente ser um reflexo direto da malignidade subjacente (por exemplo, tipo, estágio, mutações) e/ou modalidades de tratamento simultâneas (Tabelas 1 a 3).

[0069] As subpopulações de MDSC exibem diferentes capacidades de disseminação.

Com base na variabilidade interclonal clara na motilidade, procedemos para estratificar e sondar ainda mais a população de MDSC por meio de ordenação baseada em citometria de fluxo em subpopulações granulocíticas (CD11b+Ly6CbaLy6G+) e monocíticas (CD11b+Ly6CalLy6G-) (Figura 11A a 11C) com base na nomenclatura de MDSC padrão (Bronte V, et al.

Nat Commun 2016, 7: 12150). Uma subpopulação de células CD11b+Ly6C+Ly6G+ também foi identificada a partir dos dados de citometria de fluxo e incluída em nossas análises.

Subpopulações com ordenação por fluxo foram então submetidas a estudos de motilidade estruturalmente guiada em superfícies texturizadas, conforme descrito acima, além de análises de qRT-PCR de marcadores pró- e anti-inflamatórios.

Estudos de disseminação de clone único indicam que, quando sondadas isoladamente, as MDSCs granulocíticas têm capacidades de disseminação superiores em comparação com as MDSCs monocíticas e a subpopulação de CD11b+Ly6C+Ly6G+ (Figura 11D), com clones únicos atingindo em alguns casos velocidades médias e deslocamentos líquidos de > 100 m h-1 e aproximadamente 1,5 mm ao longo de um período de 16 horas.

E embora alguns clones dentro das subpopulações monocíticas MDSC e CD11b + Ly6C+Ly6G+ mostraram velocidades de migração médias relativamente altas, aproximadamente 50 m h-1, os deslocamentos líquidos foram consideravelmente limitados, sugerindo que essas células tendem a mostrar uma gama muito curta e/ou padrões de motilidade desorganizados em comparação com MDSCs granulocíticas (Figura 11E). Essas observações foram confirmadas por meio de estudos in vivo (Figura 11F, 11G), em que camundongos com tumor receberam sistemicamente injeções com suspensões etiquetadas com fluorescência de MDSCs ordenadas vs. “frescas”/não ordenadas, e IVIS foi usado para documentar o acúmulo de MDSC dentro do nicho do tumor vs. órgãos/tecidos periféricos.

Os camundongos que receberam injeções com MDSCs granulocíticas mostraram acúmulo de sinal de fluorescência mais acentuado dentro do tumor (Figura 11G). Estudos paralelos de motilidade de clone único com MDSCs circulantes derivadas de pacientes com câncer (Figura 14) também sugerem que a subpopulação granulocítica (CD11b+CD15+CD14-) exibe motilidade aumentada em comparação com a monocítica (CD11b+CD15-CD14+). A análise da expressão genética das células MSC-2 de marcadores pró-inflamatórios não indica diferenças estatisticamente significativas na expressão de TNF-, iNOS e IL-27 entre a população de MDSC "fresca" (isto é, não ordenada) e as subpopulações granulocíticas, monocíticas e CD11b+Ly6C+Ly6G+ purificadas. No entanto, a IL-6 foi significativamente superexpressa na população fresca vs. as subpopulações ordenadas por fluxo. As análises de expressão genética de marcadores anti-inflamatórios, por outro lado, sugerem que a subpopulação granulocítica ordenada por fluxo tem uma tendência a superexpressar arginase e IL-10 em comparação com as subpopulações de MDSC monocítica fresca e ordenada por fluxo e CD11b+Ly6C+Ly6G+. Em conjunto, esses resultados sugerem que a subpopulação de MDSC granulocítica parece não apenas ser mais propensa a disseminar e colonizar tecido cancerígeno, mas também a superexpressar marcadores anti-inflamatórios/supressores em comparação com a MDSC monocítica e as subpopulações de CD11b+Ly6C+Ly6G+.

[0070] As subpopulações de MDSC mostram plasticidade fenotípica que aciona a homeostase populacional sob condições de cultivo prolongadas. Após purificação baseada em fluxo das células MSC-2 em subpopulações distintas de MDSCs granulocíticas e monocíticas, bem como células CD11b+Ly6C+Ly6G+, as células foram mantidas em cultura por 1 a 7 dias. A plasticidade fenotípica foi avaliada por meio de citometria de fluxo nos dias 1 e 7. Ensaios de motilidade de clone único e análises de expressão genética foram executados no dia 7 (Figura 12A). Surpreendentemente, e em contraste com o que encontramos imediatamente após a ordenação baseada em fluxo; nenhuma diferença significativa foi detectada nas características de disseminação em todas as três populações no dia 7 (Figura 12B). As velocidades médias de clone único permaneceram em aproximadamente 50 m h-1 para todas as populações, enquanto a distância geral líquida de rastreio ficou abaixo de aproximadamente 200 m.

As análises de citometria de fluxo indicaram que 1 dia após a ordenação, as populações purificadas ainda compreendiam a maioria (aproximadamente 80%) da cultura, no entanto, pelo dia 7 toda a hierarquia das populações foi restabelecida (Figura 12C a 12E), possivelmente sugerindo um papel para a plasticidade celular na manutenção da homeostase/heterogeneidade populacional em populações de MDSC.

Culturas de células derivadas da subpopulação granulocítica purificada (Figura 12C), por exemplo, deram origem a MDSCs monocíticas e células CD11b +Ly6C+Ly6G+, com a subpopulação monocítica mostrando o aumento mais acentuado do dia 1 ao 7 (alteração de aproximadamente 7 vezes), e a população CD11b+Ly6C+Ly6G+ mostrando um aumento de aproximadamente 3 vezes pelo dia 7. As culturas derivadas de MDSCs monocíticas purificadas, por outro lado, eram mais propensas a dar origem à população CD11b +Ly6C+Ly6G+ pelo dia 7 (aumento de aproximadamente 2,5 vezes) em comparação com a população granulocítica.

Finalmente, as culturas derivadas da população CD11b+Ly6C+Ly6G+ purificadas eram mais propensas a dar origem a MDSCs granulocíticas pelo dia 7 (um aumento de aproximadamente 3 vezes) em comparação com as MDSCs monocíticas, que não mostram um aumento significativo entre os dias 1 e 7. Os perfis de expressão genética de marcadores pró- (Figura 12F) e anti-inflamatórios (Figura 12G) no dia 7 mostraram diferenças mais sutis entre as populações, com diminuição e aumento da expressão de iNOS e IL-6, respectivamente, na população de MDSC “fresca" em relação às subpopulações ordenadas/purificadas.

No entanto, ao comparar os perfis de expressão entre o dia 0 (isto é, dia de ordenação/purificação) e dia 7, uma diferença mais acentuada foi notada, com um aumento geral na expressão de iNOS pró-inflamatório para todas as três populações, e uma significativa diminuição na arginase1 e Il-10 para a subpopulação granulocítica apenas (Figura 15).

[0071] Tecnologias em micro e nanoescala têm sido usadas extensivamente para sondar e/ou modular vários aspectos da biologia celular para aplicações médicas (Gallego-Perez D, et al. Nano Lett 2016, 16:

5.326 a 5.332; Gallego-Perez D, et al. Lab Chip 2012, 12: 4.424 a 4.432; Kim SH, et al. Cancer Cell 2016, 29: 201 a 213; Gu SQ, et al. Nucleic Acids Res 2016, 44: 5.811 a 5.819; Minata M, et al. Cell reports 2019, 26: 1.893 a 1.905; Shukla VC, et al. Trends in biotechnology 2018, 36: 549 a 561; Benavente-Babace A, et al. Biosens Bioelectron 2014, 61: 298 a 305; Fei Z, et al. Analytical chemistry 2013, 85: 1.401 a 1.407; Chang L, et al. Small 2016, 12: 5.971 a 5.980; Chang L, et al. Lab Chip 2015, 15: 3.147 a 3.153; Gallego-Perez D, et al. Biomed Microdevices 2012, 14: 779 a 789; Gallego-Perez D, et al. Nanomedicine 2016, 12: 399 a 409; Gallego-Perez D, et al. Nature nanotechnology 2017, 12: 974; Wu Y, et al. Small 2013, 9: 2.358 a 2.367; Zhao X, et al. Advanced Science 2015, 2; Zhao X, et al. Anal Chem 2015, 87: 3.208 a 3.215). Ferramentas de engenharia em microescala foram usadas para demonstrar que as MDSCs associadas a tumores exibem padrões de migração estruturalmente guiados, semelhantes às células cancerígenas invasivas. As análises de motilidade de clone único revelaram heterogeneidades claras dentro e entre (isto é, para MDSCs derivadas de pacientes) populações de MDSC, confirmando a presença de subconjuntos clonais com capacidades de disseminação aprimoradas em MDSCs murinas e derivadas de pacientes. Estudos de motilidade de acompanhamento juntamente com ordenação baseada em citometria de fluxo, análises de expressão genética e experimentos de xenoenxerto de tumor ortotópico em camundongos nus sugerem que a subpopulação granulocítica é mais propensa a exibir disseminação aumentada e capacidade de infiltração tumoral, bem como atividade anti-inflamatória aprimorada, o que pode tornar essa população um alvo terapêutico atraente no câncer. Estudos subsequentes, no entanto, destacam a natureza extremamente dinâmica e plástica de tais subconjuntos clonais, com subpopulações de MDSC purificadas alcançando rapidamente a homeostase populacional, dando origem a todo o espectro de fenótipos de MDSC. Embora tenha havido relatórios conflitantes sobre o fenótipo dominante de MDSCs residentes no tumor (isto é, granulocítica vs. monocítica) (Kumar V, et al. Trends in immunology 2016, 37: 208 a 220; Hossain F, et al. Cancer immunology research 2015, 3: 1.236 a 1.247; Haverkamp JM, et al. European journal of immunology 2011, 41: 749 a 759; Mairhofer DG, et al. Journal of Investigative Dermatology 2015, 135: 2.785 a 2.793; Bozkus CC, et al. The Journal of Immunology 2015, 195: 5.237 a 5.250), nossos resultados de disseminação de clone único e plasticidade fenotípica apontam para um mecanismo potencial pelo qual MDSCs granulocíticas estão presumivelmente mais bem equipadas para infiltrar o nicho do tumor, onde poderiam então permanecer como granulocíticas e/ou dar origem a MDSCs monocíticas dependendo de vários fatores, incluindo o tipo de tumor. Curiosamente, estudos de disseminação de clone único com MDSCs circulantes derivadas de pacientes com câncer sugerem que a motilidade da MDSC pode ser potencialmente afetada pelo histórico do paciente (por exemplo, tipo/estágio do câncer, modalidades de tratamento etc.) e, como tal, estudos adicionais são necessários para determinar se os padrões de disseminação de MDSCs circulantes, ex vivo, podem ser usados para monitorar a progressão da doença e/ou tratamento.

[0072] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados comumente entendidos por alguém versado na técnica a quem a invenção divulgada pertence. As publicações citadas neste documento e os materiais para os quais são citadas são especificamente incorporados a título de referência.

[0073] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas neste documento.

Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma célula furtiva terapêutica, caracterizado pelo fato de que compreende (a) ordenar células tumorais a partir de um sujeito para uma subpopulação altamente móvel; e (b) reprogramar a subpopulação para entregar agentes anticâncer.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é ordenada em um ensaio de migração que usa um gradiente quimioatrativo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é ordenada em um ensaio de migração que usa uma superfície nanotexturada e/ou biomimética.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é ordenada em um ensaio de migração transwell ou ensaio de câmara de Boyden.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é reprogramada para expressar heterologamente um transgene que codifica uma proteína antitumoral, oligonucleotídeo ou uma combinação dos mesmos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica o inibidor de tecido da metaloproteinase-3 (TIMP-3).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é reprogramada com um sistema kill switch.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é uma célula supressora derivada de mieloide CD11b+Ly6CloLy6G+.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a subpopulação é ordenada por citometria de fluxo.

10. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células furtivas terapêuticas produzidas pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Método para tratar um tumor em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição, de acordo com a reivindicação 11.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tumor é câncer de mama.