BR112021005780A2

BR112021005780A2 - novo controle de switch

Info

Publication number: BR112021005780A2
Application number: BR112021005780-3A
Authority: BR
Inventors: Lewis Lee Brayshaw; Nicole Christ; Carlos Martinez Fleites
Original assignee: Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2021-06-29
Also published as: GB201816839D0; US20220323494A1; JP2022512701A; EP3866838A1; CN112867504A; WO2020078925A1; CA3115313A1

Abstract

NOVO CONTROLE DE SWITCH. A presente invenção refere-se a um receptor antigênico quimérico (CAR) adequado para o tratamento de seres humanos que compreende: (i) uma cadeia de sinalização que compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização; (ii) uma cadeia de não sinalização que compreende um domínio de ligação ao alvo e um domínio transmembrana;em que uma das ditas cadeias compreende ainda um domínio de núcleo catalítico (CCD) da integrase de HIV ou um fragmento ou variante funcional do mesmo e a outra cadeia compreende ainda um domínio de ligação de integrase (IBD) de LEDGF/p75 ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "NOVO CONTROLE DE SWITCH".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um receptor antigênico quimérico (Chimeric Antigen Receptor, CAR) que permite controle da atividade de sinalização ao CAR.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Receptores antigênicos quiméricos (CARs) são receptores artificiais de células T que estão na vanguarda das terapias personalizadas modernas (Lee et al. (2012) Clin. Cancer Res., 18 (10): 2780-90). Eles estão sendo desenvolvidos para tratar câncer em pacientes que são resistentes às terapias convencionalmente disponíveis e usam as próprias células imunes do paciente para combater a doença. As células imunes são geneticamente modificadas ex vivo para expressar um CAR específico para um antígeno tumoral e as células subsequentemente transferidas de volta ao paciente. Os CARs residem na superfície das células T e consistem em ecto- e endodomínios que são separados por um domínio transmembrana. O ectodomínio abriga uma região de ligação ao alvo (por exemplo, um fragmento variável com uma única cadeia) que é direcionado a um antígeno expresso exclusivamente nas células doentes. O endodomínio (em geral compreendendo CD3ζ-CD28 ou CD3ζ-41BB) está voltado para o citosol e transmite um sinal de ativação para a célula T após o antígeno ser ligado à região de ligação alvo sobre a superfície da célula.

[0003] Os CARs de primeira geração compreendiam domínios de ligação ao alvo ligados a um domínio de sinalização derivado da região citoplasmática das cadeias gama do receptor CD3zeta ou Fc. Foi mostrado que CARs de primeira geração foram redirecionam com sucesso células T para o alvo selecionado, no entanto, eles falharam em fornecer expansão prolongada e atividade antitumoral de células T in vivo. Portanto, os CARs de segunda e terceira gerações têm se focado em aumentar a sobrevivência de células T modificadas e aumentar a proliferação, incluindo moléculas coestimuladoras, tais como CD28, OX-40 (CD134) e 4-1BB (CD137).

[0004] No entanto, uma preocupação com a segurança desta terapia promissora surgiu por meio da potencial reatividade cruzada com órgãos vitais (tal como o pulmão). Em ensaios clínicos, tanto toxicidades no alvo quanto fora do alvo foram observadas em pacientes tratados com células CAR-T e duas fatalidades foram relatadas com estudos com CAR (Morgan et al. (2010) Mol. Ther., 18 (4): 843-51). Estas toxicidades são difíceis de prever em modelos animais e, em contraste com pequenas moléculas e produtos biológicos, as células CAR-T são medicamentos vivos que têm perfis farmacocinéticos (PK) únicos. Portanto, switchs de segurança estão sendo desenvolvidos para desativar ou reduzir a atividade de morte de células CAR-T e permitir terapias mais controladas e seguras.

[0005] Um tipo de switch de segurança é um switch suicida, onde as células CAR-T são posteriormente projetadas para expressar "genes suicidas" ou "genes de eliminação", o que permite a destruição seletiva de células CAR-T mediante administração de um agente externo. Por exemplo, a incorporação de timidina quinase do vírus do herpes simplex (HSV-TK) significa que a administração do profármaco ganciclovir resulta em morte celular através de incorporação de GCV-trifosfato no DNA em replicação. Outro método é o uso de caspase 9 indutível (iCasp9), uma proteína quimérica que se liga à pequena molécula AP1903, levando à dimerização da caspase 9 e, finalmente, à apoptose da célula CAR-T. No entanto, a principal desvantagem de um switch suicida é que ele é irreversível e a terapia é destruída. Outras desvantagens são que a administração do agente externo pode não atuar rápido o suficiente (elementos switch são frequentemente imunogênicos (por exemplo, HSV-TK)) ou que o switch pode não atingir 100 % de eficácia (seja porque o agente suicida não é homogêneo ou robusto o suficiente).

[0006] Outra estratégia para regular a atividade dos CARs é o controle da montagem (tipo ON) ou desmontagem (tipo OFF) dos endo- e ectodomínios do CAR in vivo. Isto é conseguido ao separar o domínio de sinalização e o domínio de ligação ao alvo do CAR em cadeias de sinalização e não sinalização, então, modular a atividade de sinalização ao adicionar ou remover uma pequena molécula que pode atuar como um indutor ou inibidor para a dimerização das duas cadeias diferentes. As vantagens deste tipo de estratégia de switch são que o switch é reversível e a sinalização pode ser modulada pela alteração da concentração da pequena molécula. No entanto, as propriedades farmacológicas de pequenas moléculas já em uso nem sempre são ideais, sem garantia de que a cinética de desligamento do receptor seja diretamente controlável pela dosagem da pequena molécula. Ser capaz de controlar diretamente a cinética de desligamento do receptor significaria que a atividade do CAR poderia ser ajustada para um nível que trate efetivamente a doença/condição, ao mesmo tempo em que reduz quaisquer efeitos colaterais ao mínimo.

[0007] Um exemplo de um switch de montagem de tipo ON reversível é o complexo rapamicina-FKPB12-mTOR, em que a rapamicina induz à dimerização das cadeias de sinalização e não sinalização do CAR (Wu et al. (2015) Science, 350 (6258): aab4077). No CAR de rapamicina, a ativação é controlada principalmente por meio de variação da concentração de um composto. A desativação do CAR de rapamicina pela retirada da rapamicina, ao contrário, não depende apenas da concentração do composto, mas também é influenciada pela taxa de dissociação do complexo e clearance do composto, os quais são parâmetros difíceis de controlar pela dosagem do composto. Outra desvantagem desta estratégia é que a rapamicina deve ser administrada continuamente durante todo o período de tratamento.

[0008] O documento WO2016/030691 descreve um switch de desmontagem de tipo OFF reversível que usa a interação entre o repressor Tet (TetR) e a proteína que interage com o TetR (TiP) para controlar a ativação do CAR. Este mecanismo funciona de forma oposta ao switch de montagem de tipo ON, uma vez que a adição de uma pequena molécula interrompe a dimerização dos domínios TetR-TiP, deste modo, desativando o CAR ao separar as cadeias constituintes. Isto significa que a molécula desreguladora só precisa ser administrada quando o CAR precisa ser desligado ou sua atividade reduzida. No entanto, o documento WO2016/030691 usa proteína/peptídeos de ligação à tetraciclina derivados de bactérias que são potencialmente imunogênicas em seres humanos.

[0009] Portanto, ainda há uma necessidade na técnica de desenvolver switch de desmontagem de tipo OFF reversíveis para controlar as terapias com células T CAR em seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um receptor antigênico quimérico (CAR) adequado para o tratamento de seres humanos que compreende: (i) uma cadeia de sinalização que compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização; (ii) uma cadeia de não sinalização que compreende um domínio de ligação ao alvo e um domínio transmembrana; em que, uma das ditas cadeias compreende ainda um domínio do núcleo catalítico (Catalytic Core Domain, CCD) da integrase de HIV ou um fragmento ou variante funcional do mesmo, e a outra cadeia compreende ainda um domínio de ligação de integrase (Integrase Binding Domain, IBD) LEDGF/p75 ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[0011] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica a cadeia de sinalização, um polinucleotídeo que codifica a cadeia de não sinalização e um polinucleotídeo que codifica as cadeias de sinalização e não sinalização do CAR, conforme definido no presente documento.

[0012] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo conforme definido no presente documento.

[0013] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora que compreende o CAR conforme definido no presente documento.

[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora, conforme definido no presente documento, para uso em terapia.

[0015] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende as células imunomoduladoras conforme definido no presente documento.

[0016] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de uma doença que compreende administrar a composição farmacêutica conforme definido no presente documento a um ser humano.

[0017] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de produção de uma célula imunomoduladora que expressa o CAR conforme definido no presente documento que compreende: (a) transduzir ou transfectar um polinucleotídeo ou o vetor de expressão, conforme definido no presente documento, na dita célula imunomoduladora; e (b) expressar o dito polinucleotídeo ou o dito vetor de expressão na célula imunomoduladora.

[0018] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora obtida por meio do método conforme definido no presente documento.

[0019] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para controlar a atividade do CAR, conforme definido no presente documento, em um ser humano que compreende administrar ao ser humano sob tratamento com o CAR um agente que inibe a interação LEDGF/p75-integrase de HIV.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0020] FIGURA 1. Organização esquemática do receptor antigênico quimérico de tipo OFF-switch (construções 1 a 5) que incorpora fragmentos de integrase de HIV e proteína LEDGF/p75 humana. Dimerização de componentes como o domínio de integrase de HIV ou dobradiça de CD8α é omitida da representação para maior clareza. scFv é um fragmento de região variável com uma única cadeia anti-BCMA humano, CD8α é a dobradiça e domínio transmembrana de CD8α humana, p75 é um fragmento que compreende o IBD da proteína LEDGF/p75 humana, IN é um fragmento que compreende o CCD da integrase de HIV, 41BB é o domínio intracelular da proteína 4-1BB humana e CD3ζ é o domínio de sinalização à CD3ζ humana. Os componentes são montados com ligantes descritos no Exemplo 1.

[0021] FIGURA 2. Ativação do promotor NFAT em células Jurkat desencadeada pela interação com células apresentadoras de antígeno BCMA ARH-77-10B5 (barras pretas). As células Jurkat foram transfectadas com as Construções 1 a 5 conforme descrito no Exemplo

1. O efeito da adição de BI224436 sobre a ativação de NFAT destas construções é representado pela barra cinza.

[0022] FIGURA 3. Ativação do promotor NFAT em células Jurkat desencadeada pela interação com células apresentadoras de antígeno BCMA ARH-77-10B5 (barras pretas). As células Jurkat foram transfectadas com as Construções 5 a 6, conforme descrito no Exemplo

2. A diferença entre as Construções 5 e 6 é uma mutação pontual no domínio da integrase de HIV descrito no Exemplo 2. O efeito da adição da pequena molécula BI224436 sobre a ativação do NFAT destas construções é representada pela barra cinza.

[0023] FIGURA 4. (A) Organização esquemática das construções de receptor antigênico quimérico de tipo OFF-switch 6 e 7 que incorporam o fragmento de Integrase de HIV com mutação Phe1332Lys e o fragmento de proteína LEDGF/p75 humana. Dimerização de componentes, tais como integrase de HIV ou dobradiça de CD8α, é omitida da representação para maior clareza. scFv é um fragmento de região variável com uma única cadeia anti-BCMA humano, CD8α é a dobradiça e domínio transmembrana de CD8α humana, p75 é um fragmento de proteína LEDGF/p75 humana, IN é um fragmento de integrase de HIV, 41BB é o domínio intracelular da proteína 4-1BB humana e CD3ζ é o domínio de sinalização de CD3ζ humana. Os componentes são montados com ligantes descritos no Exemplo 2 e Exemplo 3. (B) Ativação do promotor NFAT em células Jurkat desencadeada pela interação com células apresentadoras de antígeno BCMA ARH-77-10B5 (barras pretas). As células Jurkat foram transfectadas com as Construções 6 e 7 conforme descrito no Exemplo

1. A diferença entre as Construções 6 e 7 é a troca do fragmento de cadeia LEDGF/p75 pelo elemento scFv e a troca do fragmento de integrase de HIV pelo domínio de CD3ζ. O efeito da adição de BI224436 sobre a ativação do NFAT destas construções é representado pela barra cinza.

[0024] FIGURA 5. Níveis de expressão de CARs de tipo OFF-switch em células Jurkat transduzidas. As células Jurkat transduzidas com as Construções 7 a 12 foram analisadas por meio de citometria de fluxo 20 dias após a transdução para medir a porcentagem de células positivas para expressão de CAR de tipo OFF-switch, indicada pela expressão de scFv anti-BCMA. Para todas as construções, a mesma MOI foi usada para a transdução de células Jurkat.

[0025] FIGURA 6. Efeito da pequena molécula BI224436 sobre o perfil de liberação de citocinas da Construção 9 e da Construção 10 em células T primárias (Exemplo 6).

[0026] FIGURA 7. Efeito da titulação da pequena molécula BI224436 sobre a liberação de TNFα, IFN-γ e IL-2 a partir de células T primárias estimuladas com antígeno. A titulação foi realizada com células T transduzidas com a Construção 13 (Exemplo 6).

[0027] FIGURA 8. Efeito da pequena molécula BI224436 sobre o efeito citotóxico das células T nas células alvo (Exemplo 7).

[0028] FIGURA 9. (A) Níveis de expressão do CAR de tipo OFF- switch e um CAR convencional equivalente em células T transduzidas. As células T primárias transduzidas com as Construções 14 e 10 foram analisadas por meio de citometria de fluxo 12 dias após a transdução para medir a porcentagem de células positivas para expressão de CAR, indicada pela expressão de scFv anti-BCMA. (B) Efeito da pequena molécula BI224436 sobre o efeito citotóxico de células T transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch (Construção 10) e células T transduzidas com um CAR convencional equivalente (Construção 14) (Exemplo 8).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] A presente invenção é um CAR de tipo OFF-switch reversível de ação rápida que pode ser controlado diretamente através de diferentes concentrações de um composto de pequena molécula. No caso de um evento adverso, este sistema permitiria uma rápida inativação ou regulação negativa da sinalização do CAR, seguido pela eliminação das células T CAR por meio da administração de corticosteroides sistêmicos de longo prazo, supressão imune com mAbs específicos para células ou quimioterapia de depleção linfática (por exemplo, ciclofosfamida) se necessário.

[0030] A presente invenção é um CAR que compreende duas proteínas diferentes, as cadeias de sinalização e não sinalização, em que a sinalização ao CAR ocorre apenas se as cadeias de sinalização e não sinalização formarem um complexo. Se o complexo for rompido, a sinalização também será rompida. O risco de efeitos colaterais indesejados é reduzido pelo uso de uma pequena molécula conhecida por interromper a sinalização ao CAR, a qual também é conhecida por ser segura em seres humanos. Além disso, os componentes da proteína usados têm baixo potencial de imunogenicidade e são bem caracterizados com tamanhos moleculares pequenos e N- e C-términos adequados para fusões ideais com os outros componentes do CAR.

DEFINIÇÕES

[0031] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridização e bioquímica). Técnicas padrão são usadas para métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (consulte, de modo geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons, Inc., os quais são incorporados ao presente documento a título de referência na íntegra) e métodos químicos. Todas as patentes e publicações citadas no presente documento são incorporadas a título de referência na íntegra.

[0032] O termo "que compreende(m)" abrange "que inclui(em)" ou "que consiste(m)", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[0033] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, quando de referência a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e assim por diante, se destina a abranger variações de ± 20 % ou ± 10 %, incluindo ± 5 %, ± 1 % e ± 0,1 % do valor especificado.

[0034] O termo "receptores antigênicos quiméricos" ("CARs"), conforme usado no presente documento, refere-se a receptores projetados que compreendem um domínio de ligação ao alvo (o qual geralmente é derivado de um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo), opcionalmente uma região espaçadora, uma região transmembrana e um ou mais domínios efetores intracelulares. Os CARs também foram denominados de receptores de células T quiméricos ou imunorreceptores quiméricos (Chimeric ImmunoReceptors, CIRs). CARs são geneticamente introduzidos em células hematopoiéticas, tais como células T, para redirecionar a especificidade das células para um antígeno desejado na superfície celular.

[0035] Referências a "sinalização ao CAR" referem-se à sinalização através do domínio de sinalização ao CAR que resulta na ativação de células imunomoduladoras (por exemplo, desencadear a morte de células alvo e ativação de células T). No sistema descrito no presente documento, a ligação ao alvo pela cadeia de não sinalização que está colocalizada com a cadeia de sinalização resulta em sinalização ao CAR produtiva através do domínio de sinalização presente na cadeia de sinalização. Se, no entanto, estiver presente um agente que faz com que a cadeia de sinalização e a cadeia de não sinalização sejam deslocalizadas, então, a ligação ao alvo pelo componente receptor resulta em sinalização não produtiva, uma vez que nenhum sinal é ativado através do domínio de sinalização.

[0036] O termo "switch de segurança" ou "switch de controle" refere- se a um mecanismo bioquímico que pode ser ativado sob demanda para controlar um processo biológico que pode causar danos. Os switchs de segurança podem ser usados em moléculas de CAR de modo que possam ser controladas externamente (ou seja, via administração externa à célula) a fim de aumentar a segurança da terapia com o CAR. Por exemplo, as cadeias de sinalização e não sinalização do CAR podem ser divididas em componentes separados. Os componentes contêm domínios de ligação que interagem e mantêm as cadeias de sinalização e não sinalização juntas, a fim de ativar a sinalização quando o antígeno alvo é ligado. A vantagem deste sistema é que a interação entre os domínios de ligação pode ser controlada externamente, por exemplo, através da administração de um agente que rompe ou reúne os domínios de ligação.

[0037] O termo "LEDGF/p75" refere-se à proteína do fator de crescimento derivado do epitélio da íris humana. Há outros sinônimos para esta proteína, incluindo: proteína de interação com PC4 e SFRS1, antígeno KW-7 associado a CLL, proteína de manchas finas densas de 70 kDa (DFS 70) ou coativador transcricional p75/p52. O domínio N- terminal de LEDGF/p75 se liga ao DNA cromossômico, enquanto que seu domínio C-terminal interage com o domínio catalítico central (CCD) da integrase de HIV (UniProt: O75475), unindo o intrassomo de HIV à cromatina da célula hospedeira.

[0038] O termo "região C-terminal de LEDGF/p75" refere-se à sequência de aminoácidos da proteína LEDGF/p75 do resíduo de aminoácido 411 até o C-término da proteína.

[0039] O termo "integrase de HIV" refere-se à integrase (IN) do Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus, HIV), a qual é uma enzima que permite que o material genético retroviral seja integrado ao DNA da célula infectada. Ela é uma proteína de 32 kDa produzida a partir da porção C-terminal do produto do gene pol de HIV (UniProt: P12497) e é um alvo atraente para novos medicamentos anti- HIV. No entanto, deve ser entendido que o domínio de integrase (incluindo qualquer fragmento ou variante do mesmo) usado no CAR, conforme descrito no presente documento, pode se originar de qualquer retrovírus, incluindo qualquer variante ou subtipo de HIV, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2.

[0040] O termo "domínio" refere-se a uma estrutura de proteína dobrada que retém sua estrutura terciária independentemente do restante da proteína. Em geral, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais distintas de proteínas e, em muitos casos, podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou domínio.

[0041] O termo "domínio de ligação ao alvo", conforme usado no presente documento, é definido como um oligo- ou polipeptídeo que é capaz de se ligar a um alvo específico, tal como um antígeno ou ligante. Em particular, o alvo pode ser uma molécula sobre a superfície celular. Por exemplo, o domínio de ligação ao alvo pode ser escolhido para reconhecer um alvo que atua como um marcador sobre a superfície celular em células patogênicas, incluindo células patogênicas humanas, associadas a um estado patológico particular. O domínio de ligação ao alvo pode ser, por exemplo, qualquer tipo de proteína que se liga a um antígeno.

[0042] O termo "região espaçadora", conforme usado no presente documento, refere-se a um oligo- ou polipeptídeo que funciona para ligar o domínio transmembrana ao domínio de ligação ao alvo. Esta região também pode ser denominada como uma "região de dobradiça" ou "região de pedúnculo". O tamanho do espaçador pode ser variado, dependendo da posição do epítopo alvo, a fim de manter uma distância definida (por exemplo, 14 nm) quando da ligação CAR:alvo.

[0043] O termo "domínio transmembrana", conforme usado no presente documento, refere-se à parte da molécula de CAR que atravessa a membrana celular.

[0044] O termo "domínio de sinalização" (também denominado "domínio efetor intracelular"), conforme usado no presente documento, refere-se ao domínio no CAR que é responsável pela sinalização intracelular quando de ligação do domínio de ligação ao alvo. O domínio de sinalização é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune na qual o CAR é expresso. Por exemplo, a função efetora de uma célula T pode ser uma atividade citolítica ou uma atividade auxiliar, incluindo secreção de citocinas.

[0045] O termo "anticorpo" é usado no presente documento no sentido mais amplo para se referir a moléculas que têm um domínio similar à imunoglobulina (por exemplo IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE) e inclui anticorpos monoclonais, recombinantes, policlonais, quiméricos, humanos, humanizados, multiespecíficos, incluindo anticorpos biespecíficos e anticorpos heteroconjugados; um anticorpo com um domínio variável exclusivo (por exemplo, VH, VHH, VL (dAbTM)), fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, Fab, F(ab') 2, Fv, Fv ligado por dissulfeto, Fv com uma única cadeia, diacorpos, TANDABS™, etc. e versões modificadas de qualquer um dos anteriores.

[0046] O termo "domínio variável exclusivo" refere-se a um domínio polipeptídico dobrado que compreende sequências características de domínios variáveis de anticorpo. Portanto, ele inclui domínios variáveis de anticorpos completos, tais como VH, VHH e VL, e domínios variáveis de anticorpos modificados, por exemplo, em que um ou mais loops foram substituídos por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpos ou domínios variáveis de anticorpos que foram truncados ou compreendem extensões N- ou C-terminais, bem como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade de ligação e especificidade do domínio de comprimento total. Um domínio variável exclusivo é capaz de se ligar a um antígeno ou epítopo independentemente de uma região ou domínio variável diferente. Um "anticorpo de domínio" ou "dAbTM" pode ser considerado o mesmo que um "domínio de variável exclusivo". Um domínio variável exclusivo pode ser um domínio variável exclusivo humano, mas também inclui domínios variáveis exclusivos de outras espécies, tais como roedor (por exemplo, conforme descrito no documento WO 00/29004), dAbsTM de VHH de tubarão e camelídeo. As VHH de camelídeo são polipeptídeos com um domínio variável exclusivo de imunoglobulina derivados de espécies de camelídeos, incluindo camelos bactrianos e dromedários, lhamas, vicunhas, alpacas e guanacos, os quais produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves. Tais domínios VHH podem ser humanizados de acordo com métodos padrão disponíveis na técnica, e tais domínios são considerados "domínios variáveis exclusivos". Conforme usado no presente documento , VH inclui domínios VHH de camelídeo.

[0047] "Afinidade" é a intensidade de ligação de uma molécula, por exemplo, a proteína de ligação ao alvo do CAR da invenção, a outra, por exemplo, seu antígeno alvo, em um único sítio de ligação. A afinidade de ligação da proteína de ligação ao alvo por seu alvo pode ser determinada por meio de métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (Enzyme-Linked ImmunoabSorbent Assay, ELISA) ou radioimunoensaio (RadioImmunoAssay, RIA)) ou cinética (por exemplo, análise BIACORETM).

[0048] Identidade de sequência, conforme usado no presente documento, é o grau de parentesco entre duas ou mais sequências de aminoácidos, ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, conforme determinado pela comparação das sequências. A comparação de sequências e a determinação da identidade de sequência podem ser realizadas usando um algoritmo matemático; aqueles versados na técnica estarão cientes dos programas de computador disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a porcentagem de identidade entre elas. Aqueles versados na técnica reconhecerão que algoritmos diferentes podem produzir resultados ligeiramente diferentes.

[0049] Assim, a "porcentagem de identidade" entre uma sequência de ácidos nucleicos de consulta e uma sequência de ácidos nucleicos em questão é o valor de "Identidade", expresso como uma porcentagem, a qual é calculada pelo algoritmo BLASTN quando uma sequência de ácidos nucleicos em questão tem 100 % de cobertura de consulta com uma sequência de ácidos nucleicos de consulta após um alinhamento de pares pelo BLASTN ser realizado. Estes alinhamentos de pares pelo BLASTN entre uma sequência de ácidos nucleicos de consulta e uma sequência de ácidos nucleicos em questão são realizados usando as configurações padrão do algoritmo BLASTN disponíveis no site do National Center for Biotechnology Institute, com o filtro para regiões de baixa complexidade desligado. É importante ressaltar que uma sequência de ácidos nucleicos de consulta pode ser descrita por uma sequência de ácidos nucleicos identificada em uma ou mais reivindicações no presente documento.

[0050] Da mesma forma, a "porcentagem de identidade" entre uma sequência de aminoácidos de consulta e uma sequência de aminoácidos em questão é o valor de "Identidade", expresso como uma porcentagem, a qual é calculada pelo algoritmo BLASTP quando uma sequência de aminoácidos em questão tem 100 % de cobertura de consulta com uma sequência de aminoácidos de consulta após um alinhamento de pares pelo BLASTP ser realizado. Estes alinhamentos de pares pelo BLASTP entre uma sequência de aminoácidos de consulta e uma sequência de aminoácidos em questão são realizados usando as configurações padrão do algoritmo BLASTP disponíveis no site do National Center for Biotechnology Institute, com o filtro para regiões de baixa complexidade desligado. É importante observar que uma sequência de aminoácidos de consulta pode ser descrita por uma sequência de aminoácidos identificada em uma ou mais reivindicações no presente documento.

[0051] A sequência de consulta pode ser 100 % idêntica à sequência em questão ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de aminoácidos ou nucleotídeos comparado com a sequência em questão, de modo que a % de identidade seja menor do que 100 %. Por exemplo, a sequência de consulta é pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à sequência em questão. Tais alterações incluem pelo menos uma eliminação, substituição (incluindo substituição conservativa e não conservativa) ou inserção de aminoácido e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições amino- ou carbóxi-terminais da sequência de consulta ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercalados individualmente entre os aminoácidos ou nucleotídeos na sequência de consulta ou em um ou mais grupos contíguos na sequência de consulta.

[0052] O termo "autólogo", conforme usado no presente documento, refere-se a células do mesmo ser humano. O termo "alogênico", conforme usado no presente documento, refere-se a células da mesma espécie que diferem geneticamente da célula de comparação.

[0053] Os termos "ser humano" e "paciente" são usados no presente documento de forma alternada.

[0054] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição formulada em soluções farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis para administração a uma célula ou indivíduo. As composições da invenção também podem ser administradas em combinação com outros agentes, contanto que os agentes adicionais não afetem adversamente a capacidade da composição de administrar a terapia pretendida.

[0055] O termo "câncer" (algumas vezes também conhecido como "neoplasia") refere-se a uma doença causada por uma divisão descontrolada de células anormais em uma parte do corpo. A divisão descontrolada muitas vezes pode resultar em uma massa, comumente denominada como um "tumor" ou "neoplasma".

[0056] O termo "antígeno associado a tumor" ou "antígeno tumoral", conforme usado no presente documento, refere-se a um antígeno expresso em uma célula tumoral. Este antígeno pode ser expresso de forma exclusiva ou diferencial em uma célula tumoral quando comparado com uma célula normal, isto é, não cancerosa.

[0057] O CAR descrito no presente documento também pode ser usado em métodos de tratamento de um indivíduo que precisa do mesmo. O tratamento pode ser terapêutico, profilático ou preventivo. O tratamento abrange o alívio, redução ou prevenção de pelo menos um aspecto ou sintoma de uma doença e abrange prevenção ou cura das doenças descritas no presente documento.

[0058] O CAR descrito no presente documento pode ser usado em uma quantidade eficaz para tratamento terapêutico, profilático ou preventivo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do CAR descrito no presente documento é uma quantidade eficaz para melhorar ou reduzir um ou mais sintomas, ou prevenir ou curar, a doença.

RECEPTORES ANTIGÊNICOS QUIMÉRICOS

[0059] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um receptor antigênico quimérico (CAR) adequado para o tratamento de seres humanos que compreende: (i) uma cadeia de sinalização que compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização;

(ii) uma cadeia de não sinalização que compreende um domínio de ligação ao alvo e um domínio transmembrana;

[0060] em que uma das ditas cadeias compreende ainda um domínio do núcleo catalítico (CCD) da integrase de HIV ou um fragmento ou variante funcional do mesmo, e a outra cadeia compreende ainda um domínio de ligação de integrase (IBD) de LEDGF/p75 ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[0061] A ligação do domínio de Integrase de HIV ao domínio de LEDGF/p75 causa heterodimerização e colocalização das cadeias de sinalização e não sinalização. Assim, quando o domínio de ligação ao alvo da cadeia de não sinalização se liga ao alvo e o domínio da integrase de HIV e o domínio de LEDGF/p75 são ligados, há sinalização através da cadeia de sinalização.

[0062] O CAR descrito no presente documento usa a interação proteína-proteína de integrase de HIV-LEDGF/p75 em um mecanismo de tipo OFF-switch reversível. Um complexo se forma entre o núcleo catalítico de um homodímero da integrase de HIV e o domínio do feixe de 4 hélices da proteína de ativação de transcrição humana LRDGF/p75 (Cherepanov et al. (2005) PNAS, 102 (48): 17308-13). Esta interação proteína-proteína em particular é o alvo da pesquisa de inibidores alostéricos de integrase de HIV que produziu compostos potentes, bem caracterizados e biodisponíveis (Tsiang et al. (2012) J. Biol. Chem., 287 (25): 21189-203; Cristo & Debyser, (2013) Virology, 435 (1): 102-9). Uma vantagem potencial do CAR descrito no presente documento em relação a outros exemplos publicados, os quais usam proteína/peptídeos de ligação à tetraciclina derivados de bactérias (por exemplo, documento WO 2016/030691), é que o CAR consiste em domínios de proteína já encontrados em seres humanos e podem ter potencialmente um menor potencial de imunogenicidade. Além disso, os componentes do sistema proposto têm um pequeno tamanho (~ 150 resíduos do domínio catalítico (CCD) da integrase de HIV e ~ 80 resíduos do domínio de ligação de integrase (IBD) de LEDGF/p75) com as posições dos resíduos de aminoácidos terminais adequados para conectar para os demais componentes do CAR.

[0063] Além de pequenas moléculas, a interação proteína-proteína também pode ser modulada por peptídeos curtos (Hayouka et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun., 394 (2): 260-265).

[0064] Será entendido que o CAR descrito no presente documento requer que os domínios integrase de HIV e LEDGF/p75 se liguem um ao outro. Em uma modalidade, o CAR compreende um domínio de núcleo catalítico (CCD) de integrase de HIV ou um fragmento funcional ou variante do mesmo e um domínio de ligação à integrase (IBD) de LEDGF/p75 ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Será entendido que outras partes das proteínas integrase de HIV e LEDGF/p75 também podem ser incluídas, por exemplo, resíduos adicionais nos domínios N-terminal ou C-terminal.

[0065] Em uma modalidade, o IBD de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-426 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475). Em uma outra modalidade, o IBD de LEDGF/p75 compreende SEQ ID NO:

1.

[0066] Em uma modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende os resíduos 1203-1355 da proteína de tipo selvagem (Uniprot P12497). Em uma outra modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende SEQ ID NO: 2.

[0067] Referências a um "fragmento funcional" referem-se a fragmentos das sequências de aminoácidos de tipo selvagem completas que ainda retêm a função de ligação da proteína de tipo selvagem da qual eles são derivados (isto é, ainda permitem que os domínios de ligação interajam). Os fragmentos podem compreender, adequadamente, pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 25, 50, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250 ou 300 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos também podem compreender um truncamento C-terminal ou um truncamento N-terminal de toda a proteína.

[0068] Em uma modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-430 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475). Em uma outra modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende SEQ ID NO: 47.

[0069] Em uma modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-442 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475). Em uma pele Nessa modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende SEQ ID NO: 48.

[0070] Em uma modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-471 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475). Em uma outra modalidade, o fragmento funcional de LEDGF/p75 compreende SEQ ID NO: 49.

[0071] Em uma modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende os resíduos 1203-1355 da proteína de tipo selvagem (Uniprot P12497). Em uma outra modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende SEQ ID NO: 2.

[0072] Em uma modalidade, o fragmento funcional integrase de HIV compreende os resíduos 1203-1355 da proteína de tipo selvagem (Uniprot P12497). Em uma outra modalidade, a integrase de HIV compreende SEQ ID NO: 2.

[0073] Referências a uma "variante funcional" incluem variantes que têm sequências de aminoácidos ou nucleotídeos similares às sequências de tipo selvagem, mas com uma ou mais alterações de aminoácidos ou nucleotídeos que resultam em uma variante que ainda retém a função de ligação da proteína de tipo selvagem da qual elas são derivadas (ou seja, ainda permitem que os domínios de ligação interajam). Isto é, contanto que a variante funcional facilite a colocalização suficiente do receptor e componentes de sinalização intracelular para que sinalização produtiva ocorra quando de ligação do alvo ao domínio de ligação ao alvo.

[0074] Em uma modalidade, a variante funcional da Integrase de HIV compreende 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de tipo selvagem, contanto que a sequência ainda permita a ligação à LEDGF/p75. Igualmente, em uma modalidade, a variante funcional de LEDGF/p75 compreende 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de tipo selvagem, contanto que a sequência ainda permita a ligação à Integrase de HIV.

[0075] Em uma modalidade, a variante funcional de LEDGF/p75 compreende uma ou mais alterações de aminoácidos na região C- terminal de LEDGF/p75, em que os aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas são substituídos por aminoácidos com cadeias laterais hidrofílicas ou neutras. Os aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas são Alanina, Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina e Triptofano.

[0076] Em uma modalidade, a variante funcional de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-430 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475) com mutações Leu428Gln e Val429Arg. Em uma outra modalidade, a variante funcional da Integrase de HIV compreende SEQ ID NO: 50.

[0077] Em uma modalidade, a variante funcional de LEDGF/p75 compreende os resíduos 347-430 da proteína de tipo selvagem (Uniprot O75475) com mutações Leu428Gln e Val429Gln. Em uma outra modalidade, a variante funcional da Integrase do HIV compreende SEQ ID NO: 51.

[0078] Em uma modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende os resíduos 1203-1355 da proteína de tipo selvagem (Uniprot P12497). Em uma outra modalidade, o CCD de integrase de HIV compreende SEQ ID NO: 2.

[0079] A ligação das cadeias de sinalização e não sinalização pode ser rompida pela presença de um agente adequado. Em uma outra modalidade, a invenção compreende ainda um agente que rompe a ligação das cadeias de sinalização e não sinalização. Será entendido que o termo "agente" refere-se a qualquer entidade (por exemplo, uma pequena molécula de fármaco ou peptídeo) que rompe a interação entre os domínios de integrase de HIV e LEDGF/p75. Isto permite que a sinalização ao CAR seja terminada reversivelmente de uma maneira controlável, a fim de evitar potenciais efeitos colaterais tóxicos associados à sinalização contínua ao CAR. O uso de um agente também permite que a potência das células CAR seja controlada farmacologicamente e ajustada para um equilíbrio aceitável entre atingir o efeito terapêutico desejado e evitar toxicidades indesejadas.

[0080] O agente de ruptura pode deslocar as cadeias de sinalização e não sinalização ao se ligar preferencialmente à cadeia de sinalização ou não sinalização e, assim, romper a heterodimerização necessária para sinalização.

[0081] O uso do sistema descrito no presente documento tem a vantagem de que a terapia não é eliminada simplesmente em virtude da administração do agente de ruptura, conforme é o caso com switchs suicidas. O agente de ruptura também pode ser administrado ao paciente antes ou simultaneamente com o CAR, a fim de administrá-lo em seu estado "inativo" (isto é, OFF). Administrar o CAR no estado inativo permite sua distribuição antes de ativação. Uma vez que o CAR é ativado, a dosagem com o agente de ruptura só é necessária em caso de efeitos colaterais graves. Se necessário, as células CAR-T ainda podem ser eliminadas por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como administração de corticosteroides sistêmicos de longo prazo, imunossupressão com mAbs específicos para células ou quimioterapia de depleção linfática (por exemplo, ciclofosfamida).

[0082] O agente de ruptura pode ser capaz de ser distribuído ao citoplasma de uma célula alvo e estar disponível para ligação intracelular. O agente de ruptura pode ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica.

[0083] Agentes conhecidos como "LEDGINs" foram descritos anteriormente, os quais atuam como inibidores potentes da interação LEDGF/p75-Integrase de HIV ao se ligarem à interface do dímero da Integrase de HIV (por exemplo, consulte Tsiang et al. (2012) J. Biol. Chem., 287 (25): 21189-203; Christ & Debyser, (2013) Virology, 435 (1): 102-9) e foram desenvolvidos como agentes antivirais para o tratamento de HIV/AIDS. Eles podem inibir a replicação do HIV com um mecanismo de ação duplo: inibição potente da interação proteína-proteína LEDGF/p75-Integrase de HIV e inibição alostérica da função catalítica. Os esforços intensivos de descoberta de medicamentos nos últimos anos validaram a interação LEDGF/p75-integrase de HIV como um alvo para terapia antiviral e resultou no design e síntese de LEDGINs. Exemplos de agentes que podem ser usados nos CARs descritos no presente documento foram otimizados para uso clínico e são, portanto, adequados para terapia humana. Portanto, em uma modalidade, o agente de ruptura é um LEDGIN.

[0084] Em uma modalidade, o agente de ruptura é um inibidor da interação LEDGF/p75-integrase de HIV. Em outra modalidade, o agente de ruptura é selecionado a partir de um derivado de ácido 2-(quinolin-3- il)acético, um derivado de ácido 2-(piridina-3-il)acético, um derivado de ácido 2-(tieno[2,3-b]piridina-5-il)acético ou um derivado de ácido (S)-2- (terc-butóxi)-2-fenilacético.

[0085] Em uma modalidade, o agente de ruptura é um derivado de quinolina, tal como um derivado de ácido 2-(quinolin-3-il)acético. Em uma outra modalidade, o agente de ruptura é selecionado a partir de: ácido 3-quinolinacético, 4-(2,3-di-hidropirano[4,3,2-de]quinolin-7-il)-α- (1,1-dimetiletoxi)-2-metil-, (αS,4R)-; e ácido 3-quinolinacético, 4-(3,4-di- hidro-2H-1-benzopiran-6-il)-α-(1,1-dimetiletoxi)-2-metil-.

[0086] Em uma modalidade, o agente é selecionado a partir de qualquer um dos agentes descritos em Demeulemeester et al. (2014) Expert Opin. Ther. Pat. 24, 609-632, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência.

[0087] Em uma modalidade, o agente é selecionado a partir de qualquer um dos compostos listados na Tabela 1. Tabela 1: Exemplos de compostos que inibem a interação LEDGF/p75-Integrase de HIV Estrutura Nome Ácido 3-quinolinacético, 4-(2,3- di-hidropirano[4,3,2-de]quinolin- 7-il)-α-(1,1-dimetiletoxi)-2-metil-, (αS,4R)- (BI 224436) Ácido 3-quinolinacético, 4-(3,4- di-hidro-2H-1-benzopiran-6-il)-α- (1,1-dimetiletoxi)-2-metil-

Ácido (S)-2-(terc-butoxi)-2-(4- (3,4-dimetilfenil)-2-metilquinolin- 3-il)acético

Ácido (S)-2-(terc-butoxi)-2-((R)- 4-(8-fluoro-5-metilcroman-6-il)- 2-metilquinolin-3-il)acético

Ácido 2-((6-cloro-2-oxo-4-fenil- 1,2-di-hidroquinolin-3-il)pent-4- enoico

Ácido 2-((6-cloro-2-oxo-4-fenil- 1,2-di-hidroquinolin-3-il)acético

Ácido (S)-2-(terc-butoxi)-2-(4-(4- clorofenil)-2-metilquinolin-3- il)acético

Ácido 2-(6-cloro-2-metil-4- fenilquinolin-3-il)pentanoico

Ácido 2-(6-cloro-2-oxo-4-fenil-1- propil-1,2-di-hidroquinolin-3- il)pentanoico

Ácido 2-(2-metil-4-(p- tolil)tieno[2,3-b]piridin-5- il)pentanoico

Ácido 2-(2,6-dimetil-4- feniltieno[2,3-b]piridin-5- il)pentanoico

(Z)-4-hidroxi-1-metil-3- ((fenilimino)(1H-tetrazol-5- il)metil)quinolin-2(1H)-ona Ácido 2-(terc-butoxi)-2-(2-metil- 4-(p-tolil)tieno[2,3-b]piridin-5- il)acético (Z)-3-(((4-etoxifenil)imino)(1H- tetrazol-5-il)metil)-4-hidroxi- 1metilquinolin-2(1H)-ona

[0088] Em uma modalidade, as cadeias de sinalização e não sinalização podem compreender um peptídeo mimetizador do CCD de integrase de HIV ou IBD de LEDGF/p75, o qual se liga com menor afinidade do que os domínios de tipo selvagem de integrase de HIV ou LEDGF/p75. Isto permite, então, que o domínio natural da integrase de HIV ou LEDGF/p75 seja usado como o agente para romper a ligação de um mimetizador peptídico através de ligação competitiva.

[0089] A ligação do antígeno pela cadeia de não sinalização na ausência do agente de ruptura pode resultar na sinalização através da cadeia de sinalização que é 2, 5, 10, 50, 100, 1000 ou 10000 vezes maior do que a sinalização que ocorre quando o antígeno é ligado pela cadeia de não sinalização na presença do agente de ruptura.

[0090] As cadeias de sinalização e não sinalização podem facilitar a sinalização através do CAR, a qual é proporcional à concentração do agente de ruptura que está presente. Assim, embora o agente de ruptura possa deslocar a ligação entre as cadeias de sinalização e não sinalização, a colocalização das cadeias de sinalização e não sinalização pode não ser completamente reduzida na presença de baixas concentrações do agente de ruptura. Portanto, baixas concentrações do agente de ruptura podem diminuir o nível de sinalização sem inibi-lo completamente. Os níveis de sinalização e a correlação com a concentração do agente de ruptura podem ser determinados usando métodos conhecidos na técnica.

[0091] A sinalização ao CAR pode ser determinada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ensaios que medem a transdução de sinal podem ser usados, tais como ensaios dos níveis de proteínas tirosina quinases (Protein Tyrosine Kinases, PTKs) específicas, ruptura de 4,5-bifosfato de fosfatidil inositol (PIP2), ativação de proteína quinase C (PKC) e elevação da concentração intracelular de íons de cálcio. Leituras funcionais também podem ser usadas, tais como medição da expansão clonal de células T, regulação positiva de marcadores de ativação sobre a superfície celular, diferenciação em células efetoras e indução de citotoxicidade ou secreção de citocinas (por exemplo, IL-2). Por exemplo, o Ensaio de Ativação de Luciferase Bio-GloTM NFAT da Promega é um exemplo de um ensaio comercialmente disponível que pode ser usado.

[0092] A presente invenção descreve, pela primeira vez, o uso de um inibidor da interação LEDGF/p75-Integrase de HIV em um CAR de tipo OFF-switch reversível. Portanto, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido o uso dos agentes de ruptura descritos no presente documento para inibir um CAR, conforme descrito no presente documento.

[0093] Um ligante pode estar presente entre um ou mais dos domínios que compreendem as cadeias de sinalização e não sinalização. Em uma modalidade, o CAR compreende adicionalmente um ligante entre o domínio transmembrana e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e/ou entre o domínio transmembrana e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e/ou entre o domínio de sinalização e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75. Se um domínio coestimulador estiver presente, o CAR pode compreender adicionalmente um ligante entre o domínio coestimulador e um domínio adjacente. Por exemplo, o ligante pode estar entre o domínio transmembrana e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e/ou entre o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e o domínio coestimulador e/ou entre o domínio transmembrana e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e/ou entre o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e o domínio coestimulador e/ou entre o domínio de sinalização e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e/ou entre o domínio de sinalização e o domínio coestimulador.

[0094] De forma ideal, os ligantes conectados à integrase de HIV têm um comprimento suficiente para permitir a dimerização com uma integrase de HIV de um componente vizinho e orientá-lo na direção correta.

[0095] Os ligantes podem ser projetados com sequências de comprimentos adequados que atendem às informações estruturais relatadas em Cherepanov et al. (2005) PNAS, 102 (48): 17308-13, com o código de acesso 2B4J do PDB. Por exemplo, o ligante que conecta um domínio ao domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 pode ter um comprimento suficiente para permitir a rotação do complexo em torno dos dois eixos que conectam os N-términos de duas cópias do domínio LEDGF/p75 e os N-términos de duas cópias do domínio de integrase de HIV. Portanto, em uma modalidade, o ligante tem pelo menos 15 resíduos de aminoácidos de comprimento, tal como 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em uma outra modalidade, o ligante entre o domínio transmembrana e LEDGF/p75 tem pelo menos 20 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o ligante entre o domínio transmembrana e a integrase de HIV tem pelo menos 17 resíduos de aminoácidos de comprimento.

[0096] Os ligantes de acordo com a invenção podem compreender individualmente, ou além de outros ligantes, um ou mais conjuntos de resíduos GS. Em uma modalidade, o ligante compreende (GGGGS)n(DPS)m(GGS)p, em que n = 1-10, m = 0-3 e p = 0-3. Por exemplo, em uma modalidade, o ligante compreende (GGGGS)n(DPS)m(GGS)p, em que n = 4, m = 1 e p = 0. Em uma última modalidade alternativa, o ligante compreende (GGGGS)n(DPS)m(GGS)p, em que n = 4, m = 0 e p = 1.

[0097] Em uma modalidade, o ligante compreende (SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p, em que n = 1-10, p = 0-3 e q = 0-3. Por exemplo, em uma modalidade, o ligante compreende (SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p, em que n = 3, p = 0 e q = 1. Em uma modalidade alternativa, o ligante compreende (SDPS)q(GGGGS)n(GGS)p, em que n = 1, p = 0 e q = 1.

[0098] Em uma modalidade, o ligante compreende pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3-9. Em uma modalidade, o ligante compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-9 ou uma combinação das mesmas.

[0099] Nas sequências ligantes descritas no presente documento, a adição de resíduos SPD no início e/ou final dos domínios de ligação pode ser fornecida a fim de romper as hélices N- e C-terminais do CCD de integrase de HIV e/ou IBD de LEDGF/p75.

[0100] Será entendido que diferentes ligantes podem ser usados entre diferentes domínios no CAR descrito no presente documento. Assim, em uma modalidade, o ligante entre o domínio transmembrana e o primeiro domínio de ligação e/ou o domínio transmembrana e o segundo domínio de ligação compreende SEQ ID NO: 3 ou 4. Em uma outra modalidade, o ligante entre o domínio transmembrana e o primeiro domínio de ligação compreende SEQ ID NO: 3 ou 4. Em ainda outra modalidade, o ligante entre o domínio transmembrana e LEDGF/p75, compreende SEQ ID NO: 3 ou 4. Será entendido que, se domínios coestimuladores forem incluído no CAR, então, as modalidades descritas no presente documento podem se aplicar igualmente, por exemplo, o ligante entre o domínio coestimulador e LEDGF/p75 pode compreender SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0101] Em uma modalidade, o ligante entre o domínio de sinalização e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 5-7. Em outra modalidade, o ligante entre o domínio de sinalização e o domínio de integrase de HIV compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 5-7. Em uma modalidade alternativa, o ligante entre o domínio de sinalização e o domínio LEDGF/p75 compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 5-7.

[0102] Se um domínio coestimulador estiver presente, então, o ligante entre o domínio coestimulador e domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 pode compreender qualquer uma de SEQ ID NOs: 5-7. Se o domínio coestimulador estiver presente após o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75, então, a sequência ligante pode compreender SEQ ID NO: 5 ou 6, em particular SEQ ID NO: 5 para o domínio LEDGF/p75 e/ou SEQ ID NO: 6 para o domínio de integrase de HIV.

Nesta modalidade, se o domínio coestimulador estiver presente entre o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 e o domínio de sinalização, então, o ligante entre o domínio coestimulador e o domínio de sinalização pode compreender SEQ ID NO: 7.

[0103] O domínio de ligação ao alvo se liga a um alvo, em que o alvo é uma molécula específica para tumor, molécula viral ou qualquer outra molécula expressa em uma população de células alvo que é adequada para mediar o reconhecimento e a eliminação por um linfócito. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo compreende um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno ou um ligante. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo é um ligante (por exemplo, um ligante natural do antígeno alvo). Em uma modalidade alternativa, o domínio de ligação ao alvo é um fragmento de ligação a antígeno. Em uma outra modalidade, o fragmento de ligação a antígeno é um fragmento variável com uma única cadeia (scFv) ou um dAbTM. Em ainda outra modalidade, o dito scFv compreende os fragmentos variáveis leve (VL) e pesado (VH) de um anticorpo monoclonal específico para o antígeno alvo unido através de um ligante flexível.

[0104] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo pode se ligar a mais de um alvo, por exemplo, dois alvos diferentes. Tal domínio de ligação ao alvo pode ser derivado de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia. Por exemplo, o Blinatumomabe (também conhecido como AMG 103 ou MT103) é um anticorpo scFv biespecífico para CD19 e CD3 recombinante que consiste em quatro domínios variáveis de imunoglobulina montados em uma única cadeia polipeptídica. Dois dos domínios variáveis formam o sítio de ligação para CD19, a qual é um antígeno na superfície celular expresso na maioria das células B normais e malignas. Os outros dois domínios variáveis formam o sítio de ligação para CD3, a qual faz parte do complexo de células T-receptor de células T. Estes domínios variáveis podem ser arranjados no CAR em tandem, ou seja, dois fragmentos variáveis de anticorpo com uma única cadeia (scFv) unidos a um espaçador e domínios transmembrana e de sinalização. Os quatro domínios variáveis podem ser arranjados em qualquer ordem particular dentro da molécula de CAR (por exemplo, VL (primeiro alvo) -VH (primeiro alvo) - VH (segundo alvo) -VL (segundo alvo) ou VL (segundo alvo) -VH (segundo alvo) - VH (primeiro alvo) -VL (primeiro alvo), etc.).

[0105] O domínio de ligação ao alvo pode se ligar a uma variedade de antígenos na superfície celular, porém, em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo se liga a um antígeno associado a tumor. Em uma outra modalidade, o antígeno associado a tumor é selecionado a partir de: BCMA, antígeno carcinoembrionário (CarcinoEmbryonic Antigen, CEA), antígeno de câncer-125, CA19-9, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD27, CD30, CD33, CD34, CD45, CD52, CD70, CD117, CD138, CD160, receptor do fator de crescimento epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), proteína de ligação a folato, gangliosídeo G2 (GD2 ), HER2, mesotelina, MUC-1, molécula de adesão de células neurais (Neural Cell Adhesion Molecule, NCAM), antígeno de células-tronco prostáticas (Prostate Stem Cell Antigen, PSCA), antígeno na membrana específico para próstata (Prostate- Specific Membrane Antigen, PSMA), fosfatase ácida prostática (Prostatic Acid Phosphatase, PAP), proteína melana-A, sinaptose, seis antígeno epitelial transmembrana prostático I (Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate I, STEAP1), TARP, Trp-p8, tirosinase ou vimentina. Em ainda outra modalidade, o antígeno associado a tumor é BCMA.

[0106] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo tem uma afinidade de ligação de menos de cerca de 500 nanomolar (nM), tal como menos de cerca de 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM ou 0,25 nM. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao alvo tem uma afinidade de ligação de cerca de 10 nM a cerca de 0,25 nM. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação ao alvo tem uma afinidade de ligação de cerca de 1 nM a cerca de 0,5 nM (isto é, cerca de 1000 pM a cerca de 500 pM).

[0107] Em uma modalidade, o CAR compreende adicionalmente um domínio espaçador entre o domínio de ligação ao alvo e o domínio transmembrana. Um espaçador permite que o domínio de ligação ao alvo se oriente em diferentes direções para facilitar a ligação e pode ser usado para melhorar a interação de ligação ao alvo. Em uma modalidade, o espaçador compreende uma sequência derivada de IgG (por exemplo, região Fc de IgG1 ou região de dobradiça de IgG1), CD8 ou CD4.

[0108] O domínio transmembrana em cada uma das cadeias de sinalização e não sinalização atua como uma âncora na membrana para manter a cadeia de sinalização sobre a superfície da célula.

[0109] Em uma modalidade, o domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Em uma modalidade, o domínio transmembrana pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético e pode compreender resíduos predominantemente hidrofóbicos, tais como leucina e valina.

[0110] Por exemplo, o domínio transmembrana pode ser o domínio transmembrana de proteínas CD, tais como CD4, CD8, CD3 ou CD28, uma subunidade do receptor de células T, tais como α, β, γ ou δ, uma subunidade do receptor de IL-2 (cadeia α) ou uma cadeia de subunidade de receptores Fc. Em uma modalidade, o domínio transmembrana compreende o domínio transmembrana de CD4, CD8 ou CD28. Em uma outra modalidade, o domínio transmembrana compreende o domínio transmembrana de CD4 ou CD8 (por exemplo, a cadeia alfa de CD8, conforme descrito em NCBI Reference Sequence: NP_001139345.1, incorporada ao presente documento a título de referência).

[0111] Em uma modalidade, o domínio transmembrana compreende SEQ ID NO: 10.

[0112] Em uma modalidade, a cadeia de sinalização pode compreender adicionalmente uma sequência de dobradiça próximo do domínio transmembrana. Em uma outra modalidade, a sequência de dobradiça compreende SEQ ID NO: 11. Em uma outra modalidade, a dobradiça e o domínio transmembrana compreendem a sequência completa de SEQ ID NO: 12.

[0113] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é composto pela hélice transmembrana de CD8α imediatamente seguida pelo domínio intracelular de comprimento total de 4-1BB que contém um trecho de sequência compatível com a interface da membrana. Se o domínio próximo ao domínio transmembrana não tiver uma sequência compatível com a interface da membrana, então, um ligante pode ser usado.

[0114] Assim, em uma modalidade, há um ligante entre o domínio transmembrana e o domínio imediatamente após o domínio transmembrana no lado intracelular da membrana celular. Em uma outra modalidade, há um ligante entre o domínio transmembrana e o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75; ou, se presente, o domínio transmembrana e o domínio coestimulador. Em ainda outra modalidade, o ligante compreende SEQ ID NO: 13. Este ligante é especialmente vantajoso se o domínio transmembrana for derivado de CD8α, uma vez que é simplesmente a sequência nativa de CD8α que segue imediatamente a hélice transmembrana.

[0115] Exemplos preferidos do domínio de sinalização para uso em um CAR descrito no presente documento podem ser as sequências citoplasmáticas do receptor de células T naturais e correceptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução de sinal quando de ligação ao antígeno, bem como qualquer derivado ou variante destas sequências e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional. Os domínios de sinalização podem ser separados em duas classes: aqueles que iniciam a ativação primária dependente de antígeno e aqueles que atuam de uma maneira independente de antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador. Os domínios efetores de ativação primária podem compreender motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação com base em tirosina imunorreceptoras (Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motifs, ITAMs). ITAMs são motivos de sinalização bem definidos, comumente encontrados na cauda intracitoplasmática de uma variedade de receptores e servem como sítios de ligação para tirosina quinases da classe syk/zap70. Exemplos de ITAMs usados na invenção podem incluir, como exemplos não limitativos, aqueles derivados de CD3zeta, FcRgama, FcRbeta, FcRépsilon, CD3gama, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em uma modalidade, o domínio de sinalização compreende um domínio de sinalização de CD3zeta (também conhecido como CD247). Em outra modalidade, o domínio de sinalização de CD3zeta compreende SEQ ID NO: 14. Esta sequência também é encontrada em Uniprot P20963, resíduos 51-164. Os TCRs naturais contêm uma molécula de sinalização de CD3zeta, portanto, o uso deste domínio efetor é o mais próximo da construção de TCR que ocorre na natureza.

[0116] Em uma modalidade, o domínio de sinalização da cadeia de sinalização compreende um domínio de sinalização de CD3zeta que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, de preferência pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, 90 %, 95 % 98 % ou 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO:

14. Em outra modalidade, o domínio de sinalização ao CAR compreende um domínio de sinalização de CD3zeta que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0117] A cadeia de sinalização ou não sinalização ao CAR pode compreender ainda um peptídeo sinalizador de modo que, quando o componente é expresso em uma célula, a proteína nascente é direcionada para o retículo endoplasmático e, subsequentemente, para a superfície celular onde ela é expressa.

[0118] O núcleo do peptídeo sinalizador pode conter um longo trecho de aminoácidos hidrofóbicos que têm tendência para formar uma única alfa hélice. O peptídeo sinalizador pode começar com um pequeno trecho positivamente carregado de aminoácidos que ajuda a reforçar a topologia adequada do polipeptídeo durante a translocação. No final do peptídeo sinalizador, há tipicamente um trecho de aminoácidos que é reconhecido e clivado pela peptidase sinalizadora. A peptidase sinalizadora pode clivar durante ou após conclusão da translocação para gerar o peptídeo sinalizador livre e uma proteína madura. Os peptídeos sinalizadores livres são, então, digeridos por proteases específicas. O peptídeo sinalizador pode estar no terminal amino da molécula.

[0119] Em uma modalidade, o peptídeo sinalizador é derivado de CD8 (consulte UniProt P01732). Em uma outra modalidade, o peptídeo sinalizador compreende SEQ ID NO: 15 ou uma variante da mesma com 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações de aminoácidos (inserções, eliminações, substituições ou adições), contanto que o peptídeo sinalizador ainda funcione para causar expressão do componente sobre a superfície celular (ou seja, uma variante funcional).

[0120] Conforme descrito no presente documento, a cadeia de sinalização e/ou não sinalização pode conter ainda um sinal secundário ou coestimulador. As células T compreendem adicionalmente moléculas coestimuladoras que se ligam a ligantes coestimuladores cognatos em células apresentadoras de antígeno a fim de aumentar a resposta das células T, por exemplo, aumentar a ativação da proliferação, diferenciação e assim por diante. Portanto, em uma modalidade, as cadeias de sinalização e não sinalização compreendem adicionalmente um domínio coestimulador. Em outra modalidade, o domínio coestimulador compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora selecionada a partir de CD28, CD27, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS (CD278), CD30, CD40, PD-1 (CD279), CD2, CD7, NKG2C (CD94), B7-H3 (CD276) ou qualquer combinação das mesmas. Em ainda outra modalidade, o domínio coestimulador compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora selecionada a partir de CD28, CD27, 4-1BB, OX40, ICOS ou qualquer combinação das mesmas, em particular o domínio intracelular de 4-1BB.

[0121] Em uma modalidade, o domínio coestimulador compreende um domínio de sinalização de 4-1BB que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70 %, de preferência pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de sequência identidade com SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, o domínio coestimulador compreende um domínio de sinalização de 4- 1BB de SEQ ID NO: 16. Esta sequência também é encontrada em Uniprot Q07011, resíduos 214-255.

CONFIGURAÇÕES DO SISTEMA DE RECEPTOR ANTIGÊNICO QUIMÉRICO

[0122] Será entendido por aqueles versados na técnica que várias configurações dos domínios envolvidos nos CARs descritos no presente documento são possíveis, mas que o domínio de ligação ao alvo estará necessariamente no lado extracelular do domínio transmembrana e domínios de sinalização, coestimuladores e de Integrase de HIV ou LEDGF/p75 estarão necessariamente no lado intracelular do domínio transmembrana.

[0123] Em uma modalidade, a cadeia de não sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio de ligação ao alvo; um domínio transmembrana; um domínio coestimulador; e um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 (Configuração A).

[0124] Em uma modalidade alternativa, a cadeia de não sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio de ligação ao alvo; um domínio transmembrana; o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75; e um domínio coestimulador (Configuração B).

[0125] Em outra modalidade, a cadeia de não sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio de ligação ao alvo; um domínio transmembrana e um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 (Configuração C).

[0126] Em uma modalidade, a cadeia de sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio transmembrana; um domínio coestimulador; um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75; e um domínio de sinalização (Configuração I).

[0127] Em uma modalidade alternativa, a cadeia de sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio transmembrana; um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75; um domínio coestimulador; e um domínio de sinalização (Configuração II).

[0128] Em outra modalidade, a cadeia de sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio transmembrana; um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75; e um domínio de sinalização (Configuração III).

[0129] Assim, em uma modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração A, B ou C em combinação com qualquer cadeia de sinalização configurada dentre as Configurações I,

II ou III.

[0130] Será entendido que, em qualquer uma destas configurações, (i) a cadeia de não sinalização compreende um domínio de integrase de HIV e a cadeia de sinalização compreende um domínio LEDGF/p75 ou (ii) a cadeia de não sinalização compreende um domínio de LEDGF/p75 e a cadeia de sinalização compreende um domínio de integrase de HIV.

[0131] Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração A com uma cadeia de sinalização de Configuração I. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração A com uma cadeia de sinalização de Configuração II. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração A com uma cadeia de sinalização de Configuração III.

[0132] Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração B com uma cadeia de sinalização de Configuração I. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração B com uma cadeia de sinalização de Configuração II. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração B com uma cadeia de sinalização de Configuração III.

[0133] Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração C com uma cadeia de sinalização de Configuração I. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração C com uma cadeia de sinalização de Configuração II. Em outra modalidade, o CAR compreende uma cadeia de não sinalização de Configuração C com uma cadeia de sinalização de Configuração III.

[0134] Em uma modalidade, a cadeia de não sinalização pode compreender uma pluralidade de domínios da Integrase de HIV ou LEDGF/p75. Isto permite que a cadeia de não sinalização seja capaz de recrutar mais de uma cadeia de sinalização e, assim, amplificar o sinal em resposta à ligação ao alvo. Os domínios de integrase de HIV ou LEDGF/p75 podem ser, cada um, variantes ou fragmentos com diferentes afinidades de ligação.

[0135] Em uma modalidade, o CAR pode compreender dois ou mais domínios de ligação ao alvo, cada um reconhecendo alvos diferentes, mas que compreendem o mesmo domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75. Tal sistema seria capaz de reconhecer vários antígenos. Em uma outra modalidade desta configuração, o domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 dos componentes do receptor diferem quanto a resíduos que controlam sua afinidade pelo domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75 da cadeia de sinalização. Desta forma, o CAR pode ser ajustado de modo que a sinalização em resposta a um antígeno seja maior ou menor do que a resposta a outro.

[0136] Em uma modalidade, o CAR descrito no presente documento pode compreender uma pluralidade de cadeias de sinalização, cada uma compreendendo um domínio de sinalização e um domínio de integrase de HIV ou LEDGF/p75, em que as cadeias de sinalização compreendem diferentes domínios de sinalização (por exemplo, CD3zeta, CD28, 4-1BB e/ou OX-40). Isto permite a ativação de vários domínios de sinalização diferentes simultaneamente.

[0137] Métodos adequados para alterar os resíduos de aminoácidos dos domínios de integrase de HIV ou LEDGF/p75 de modo que a afinidade de ligação entre os dois domínios seja alterada são conhecidos na técnica. Por exemplo, tais métodos incluem substituição, adição e remoção de aminoácidos usando mutagênese direcionada e aleatória.

[0138] Métodos para determinar a afinidade de ligação entre os domínios de integrase de HIV e LEDGF/p75 também são bem conhecidos na técnica. Estes incluem previsão por bioinformática de interações proteína-proteína, eletroforese de afinidade, ressonância de plasma de superfície, interferometria de biocamada, interferometria de polarização dupla, dispersão estática de luz e dispersão dinâmica de luz.

POLINUCLEOTÍDEOS E VETORES DE EXPRESSÃO

[0139] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica a cadeia de sinalização, um polinucleotídeo que codifica a cadeia de não sinalização ou uma cadeia polinucleotídica que codifica as cadeias de sinalização e não sinalização do CAR descrito no presente documento.

[0140] As sequências polinucleotídicas descritas no presente documento podem ter códons otimizados. A degenerescência encontrada no código genético permite que cada aminoácido seja codificado por entre um e seis códons sinônimos, permitindo que muitas sequências de ácidos nucleicos alternativas codifiquem a mesma proteína (Gustafsson et al. (2004) Trends Biotechnol. 22 (7): 346- 53). A otimização de códons é uma técnica usada para modificar sequências genéticas com a intenção de aumentar a taxa de expressão de um gene em um sistema de expressão heterólogo; tipicamente, os códons de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de interesse são otimizados de modo que o uso de códon se assemelhe mais à tendência de códons da célula hospedeira, embora ainda codifique a mesma sequência de aminoácidos.

[0141] Os ácidos nucleicos descritos no presente documento podem compreender DNA ou RNA. Eles podem ser fita simples ou dupla. Eles também podem ser polinucleotídeos que incluem dentro deles nucleotídeos sintéticos ou modificados. Vários tipos diferentes de modificação são bem conhecidos na técnica, tais como estruturas de metilfosfonato e fosforotioato, ou adição de cadeias de acridina ou polilisina. Tais modificações podem ser usadas para aumentar a atividade in vivo ou a longevidade dos polinucleotídeos da presente invenção.

[0142] A cadeia de sinalização e a cadeia de não sinalização do CAR podem ser expressas por ácidos nucleicos separados ou coexpressas a partir do mesmo ácido nucleico.

[0143] Métodos de expressão simultânea de mais de um gene em células ou organismos usando um único plasmídeo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos incluem: promotores múltiplos fundidos aos quadros de leitura aberta (Open Reading Frames, ORFs) dos genes inserção de sinais de emenda (splicing) entre genes; fusão de genes cujas expressões são controladas por um único promotor; inserção de sítios de clivagem proteolítica entre genes; inserção de sítios de entrada ribossômica internos (Internal Ribosomal Entry Sites, IRESs) entre genes; inserção de sequências peptídicas autocliváveis entre genes.

[0144] Se os componentes são coexpressos, o ácido nucleico pode produzir um polipeptídeo que compreende a cadeia de sinalização e a cadeia de não sinalização unidas através de um sítio de clivagem. O sítio de clivagem pode ser autoclivável de modo que, quando o polipeptídeo é produzido, ele é imediatamente clivado nos componentes cadeia de sinalização e cadeia de não sinalização sem a necessidade de qualquer atividade de clivagem externa. Portanto, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um CAR descrito no presente documento, em que a cadeia de sinalização e a cadeia de não sinalização são coexpressas por meio de um peptídeo de autoclivagem que é clivado entre a cadeia de sinalização e a cadeia de não sinalização quando de tradução.

[0145] Exemplos de peptídeos autocliváveis são conhecidos na técnica, por exemplo, consulte Kim et al. (2011) PLoS ONE 6 (4): e18556.

[0146] Em uma modalidade, o peptídeo autoclivável é um peptídeo autoclivável 2a. Em uma outra modalidade, o peptídeo autoclivável 2a é derivado de teschovírus-1 suíno, vírus Thosea asigna, vírus da rinite A equina (Equine Rhinitis A Virus, ERAV) ou vírus da febre aftosa (Foot- and-Mouth Disease Virus, FMDV), em particular teschovírus-1 suíno. Portanto, o peptídeo autoclivável pode ser selecionado a partir de: P2A (teschovírus suíno-1 2A), T2A (vírus Thosea asigna 2A), E2A (vírus da rinite A equina 2A) e F2A (vírus da febre aftosa 2A). Em ainda outra modalidade, o peptídeo autoclivável 2a compreende SEQ ID NO: 17.

[0147] Em uma modalidade, há um ligante entre a cadeia de sinalização e o peptídeo autoclivável e/ou entre a cadeia de não sinalização e o peptídeo autoclivável. Em outra modalidade, o ligante compreende SEQ ID NO: 8 ou 9.

[0148] Em uma modalidade, os componentes são coexpressos usando um polinucleotídeo que compreende uma sequência de coexpressão. Em uma outra modalidade, a sequência de coexpressão é um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) ou um promotor interno.

[0149] O polinucleotídeo pode estar presente em um cassete de expressão ou vetor de expressão (por exemplo, um plasmídeo para introdução em uma célula hospedeira bacteriana ou um vetor viral, tal como um lentivírus para transfecção de uma célula hospedeira de mamífero). Portanto, de acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo descrito no presente documento.

[0150] O termo "vetor" se refere a um veículo que é capaz de transportar artificialmente material genético estranho para outra célula, onde ele pode ser replicado e/ou expresso. Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo, um vetor viral, um vetor com base em transposon ou um mRNA sintético.

[0151] Em uma modalidade, o vetor de expressão é um vetor retroviral. Em uma outra modalidade, o vetor retroviral é derivado de, ou selecionado a partir de, um lentivírus, alfa-retrovírus, gama-retrovírus ou retrovírus esponjoso, tal como um lentivírus ou gama-retrovírus, em particular um lentivírus. Em uma outra modalidade, a partícula de vetor retroviral é um lentivírus selecionado a partir do grupo que consiste em HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, EIAV e Visna. Os lentivírus são capazes de infectar células que não se dividem (isto é, quiescentes), o que os torna vetores atraentes para terapia genética. Em ainda outra modalidade, a partícula de vetor retroviral é HIV-1 ou é derivada de HIV-1. A estrutura genômica de alguns retrovírus pode ser encontrada na técnica. Por exemplo, detalhes sobre o HIV-1 podem ser encontrados no NCBI Genbank (Nº de Acesso Genômico AF033819). O HIV-1 é um dos retrovírus mais bem compreendidos e, portanto, é frequentemente usado como vetor viral.

CÉLULAS IMUNOMODULADORAS

[0152] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora que compreende o CAR descrito no presente documento. De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora que compreende um polinucleotídeo ou vetor de expressão descrito no presente documento.

[0153] Em uma modalidade, a célula imunomoduladora compreende uma cadeia de sinalização e uma cadeia de não sinalização do CAR descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a célula imunomoduladora compreende uma série de diferentes cadeias de sinalização e uma série de diferentes cadeias de não sinalização. Por exemplo, a célula imunomoduladora pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais cadeias de sinalização diferentes e uma, duas, três, quatro, cinco ou mais cadeias de não sinalização diferentes do CAR descrito no presente documento.

[0154] O termo "célula imunomoduladora" refere-se a uma célula de origem hematopoiética funcionalmente envolvida na modulação (por exemplo, início e/ou execução) da resposta imune inata e/ou adaptativa. A dita célula imunomoduladora de acordo com a presente invenção pode ser derivada de uma célula-tronco. As células-tronco podem ser células-tronco adultas, células-tronco embrionárias não humanas, mais particularmente células-tronco não humanas, células-tronco de sangue do cordão umbilical, células progenitoras, células-tronco da medula óssea, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco totipotentes ou células-tronco hematopoiéticas. A dita célula imunomoduladora também pode ser uma célula dendrítica, uma célula dendrítica assassina, um mastócito, uma célula NK, uma célula B ou uma célula T. A célula T pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em linfócitos T inflamatórios, linfócitos T citotóxicos, linfócitos T reguladores ou linfócitos T auxiliares ou uma combinação dos mesmos. Portanto, em uma modalidade, a célula imunomoduladora é derivada de um linfócito T inflamatório, linfócito T citotóxico, linfócito T regulador ou linfócito T auxiliar. Em outra modalidade, a dita célula pode ser derivada a partir do grupo que consiste em linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+.

[0155] Em uma modalidade, a célula imunomoduladora pode ser uma célula imunomoduladora humana.

[0156] Em uma modalidade, a célula imunomoduladora é alogênica ou autóloga. Será entendido que "autóloga" refere-se a células obtidas do próprio paciente, enquanto que "alogênica" refere-se a células obtidas de um doador. As células autólogas têm a vantagem de serem compatíveis com o paciente e, portanto, evitam quaisquer problemas de compatibilidade imune que levam à doença enxerto contra hospedeiro (Graft-versus-Host Disease, GvHD). A fim de evitar que as células alogênicas sejam rejeitadas pelo paciente, elas precisariam ser derivadas de um doador compatível ou modificadas para assegurar que nenhum antígeno esteja presente sobre a superfície da célula, o que iniciaria uma resposta imune indesejada.

[0157] Antes de expansão e modificação genética das células da invenção, uma fonte de células pode ser obtida de um indivíduo por meio de uma variedade de métodos não limitativos. As células podem ser obtidas a partir de uma série de fontes não limitativas, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodo, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em determinadas modalidades da presente invenção, qualquer número de linhagens de células T disponíveis e conhecidas por versados na técnica pode ser usado. Em outra modalidade, a dita célula pode ser derivada de um doador saudável ou um doador doente, tal como um paciente com diagnóstico de câncer ou infecção. Em outra modalidade, a dita célula faz parte de uma população mista de células que exibem diferentes características fenotípicas.

[0158] As células imunomoduladoras podem ser ativadas e/ou expandidas antes de serem transduzidas com polinucleotídeos ou vetores de expressão que codificam os CARs descritos no presente documento. Por exemplo, as células podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-CD3 para causar ativação.

[0159] Será entendido que as células imunomoduladoras podem expressar os CARs descritos no presente documento de forma transitória ou estável/permanente (dependendo do método de transfecção usado e se o polinucleotídeo que codifica o sistema de receptor antigênico quimérico foi integrado no genoma da célula imunomoduladora ou não).

[0160] Após introdução do CAR, as células imunomoduladoras podem ser purificadas, por exemplo, ao selecionar células que expressam o domínio de ligação ao alvo da cadeia de não sinalização.

USOS

[0161] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida a célula imunomoduladora descrita no presente documento para uso em terapia. Em uma modalidade, a terapia compreende administrar a célula imunomoduladora a um ser humano que precisa de tal terapia.

[0162] Em uma modalidade, a terapia é uma terapia celular adotiva. "Terapia celular adotiva" (ou "imunoterapia adotiva") refere-se à transferência adotiva de linfócitos T humanos que são projetados por meio de transferência gênica para expressar CARs (tais como os CARs da presente invenção) específicos para moléculas na superfície expressas em células alvo. Isto pode ser usado para tratar uma variedade de doenças dependendo do alvo escolhido, por exemplo, antígenos específicos para tumor para tratar câncer. A terapia celular adotiva envolve a remoção de uma parte dos glóbulos brancos do paciente por meio de um processo denominado leucaferese. As células T podem, então, ser expandidas e misturadas com vetores de expressão descritos no presente documento a fim de transferir permanentemente o CAR para as células T. As células T são expandidas novamente e, ao final da expansão, as células T são lavadas, concentradas e, então, congeladas para permitir a testagem, transporte e armazenamento até que o paciente esteja pronto para receber a infusão de células T manipuladas.

[0163] A invenção descrita no presente documento fornece pela primeira vez o uso da interação integrase de HIV-LEDGF/p75 em um CAR. Portanto, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido o uso de um domínio de LEDGF/p75 e um domínio de integrase de HIV, ou fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos, como um switch de segurança em uma terapia com células T de receptor antigênico quimérico (CAR) (por exemplo, como parte de um

CAR indutível).

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0164] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de células imunomoduladoras conforme definido no presente documento.

[0165] Exemplos de ingredientes adicionais para uma composição farmacêutica incluem, sem limitação, quaisquer adjuvantes, carreadores, excipientes, deslizantes, agentes adoçantes, diluentes, conservantes, corantes/colorantes, intensificadores de sabor, tensoativos, agentes umectantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, estabilizantes, agentes isotônicos, solventes, emulsificantes, tampões (tal como solução salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline, PBS)), carboidratos (tais como glicose, manose, sacarose ou dextranas), aminoácidos, antioxidantes ou agentes quelantes (tais como EDTA ou glutationa).

[0166] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. O carreador, excipiente ou diluente deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não deletério para o receptor dos mesmos. De acordo com a presente invenção, qualquer excipiente, carreador, diluente ou aditivo usado deverá ser compatível com o CAR descrito no presente documento. Textos padrão conhecidos na técnica, tal como "Remington’s Pharmaceutical Science", 17ª Edição, 1985, incorporado ao presente documento a título de referência, podem ser consultados para produzir preparações adequadas.

[0167] As composições farmacêuticas podem ser administradas através de injeção ou infusão contínua (exemplos incluem, porém sem limitações, intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intramuscular e intraportal). Em uma modalidade, a composição é adequada para administração intravenosa. Ao administrar uma composição terapêutica da presente invenção (por exemplo, uma composição farmacêutica que contém uma célula imunomoduladora geneticamente modificada conforme descrito no presente documento), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão). As composições farmacêuticas podem ser adequadas para administração tópica (incluindo, porém sem limitações, administração epicutânea, inalada, intranasal ou ocular) ou administração entérica (incluindo, porém sem limitações, administração oral ou retal).

[0168] Métodos para a preparação de tais composições farmacêuticas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Outros excipientes podem ser adicionados à composição conforme apropriado para o modo de administração e a proteína usada em particular.

[0169] Doses e regimes de tratamento eficazes para administrar a composição da presente invenção podem ser dependentes de fatores tais como idade, peso e estado de saúde do paciente e doença a ser tratada. Estes fatores estão ao alcance do médico que faz o atendimento.

[0170] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica conforme definido no presente documento para uso no tratamento ou prevenção de uma doença.

[0171] Em uma modalidade, a doença é selecionada a partir de: um câncer, uma resposta imune patogênica e uma infecção.

[0172] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição farmacêutica, conforme descrito no presente documento, na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.

KITS

[0173] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um kit que compreende um polinucleotídeo ou vetor de expressão conforme descrito no presente documento.

[0174] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um kit que compreende uma célula imunomoduladora ou composição farmacêutica conforme descrito no presente documento.

[0175] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um kit que compreende o CAR conforme descrito no presente documento.

MÉTODOS

[0176] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de manipulação de uma célula imunomoduladora para expressar o CAR descrito no presente documento que compreende: (a) fornecer uma célula imunomoduladora; (b) transduzir ou transfectar o polinucleotídeo ou o vetor de expressão conforme definido no presente documento na dita célula imunomoduladora; e (c) expressar o dito polinucleotídeo ou o dito vetor de expressão na célula imunomoduladora.

[0177] Em uma modalidade, a célula imunomoduladora é obtida a partir de uma amostra isolada de um paciente (isto é, autóloga). Em uma modalidade alternativa, a célula imunomoduladora é obtida de um doador (isto é, alogênica).

[0178] Como um exemplo não limitativo, o CAR pode ser introduzido como transgenes codificados por um vetor de expressão conforme descrito no presente documento. O vetor de expressão também pode conter um marcador de seleção que permite a identificação e/ou seleção de células que receberam o dito vetor.

[0179] Os polipeptídeos podem ser sintetizados in situ na célula como um resultado da introdução de polinucleotídeos que codificam o dito CAR na célula. Alternativamente, os ditos polipeptídeos podem ser produzidos fora da célula e, então, introduzidos na mesma. Métodos para a introdução de uma construção de polinucleotídeo em células são conhecidos na técnica e incluem, como exemplos não limitativos, métodos de transformação estáveis nos quais a construção polinucleotídica é integrada no genoma da célula ou métodos de transformação transitórios nos quais a construção polinucleotídica não é integrada no genoma da célula e métodos mediados por vírus. Os ditos polinucleotídeos podem ser introduzidos em uma célula, por exemplo, através de vetores virais recombinantes (por exemplo, retrovírus, adenovírus), lipossomas e assim por diante. Por exemplo, métodos de transformação transitória incluem, por exemplo, microinjeção, eletroporação ou bombardeio de partículas. Os polinucleotídeos podem ser incluídos em vectores, mais particularmente plasmídeos ou vírus, com vista a serem expressos em células.

[0180] Os termos "transfecção", "transformação" e "transdução", conforme usado no presente documento, podem ser usados para descrever a inserção do vetor de expressão na célula alvo. A inserção de um vetor é geralmente denominada de transformação de células bacterianas e transfecção de células eucariotas, embora a inserção de um vetor viral também possa ser denominada de transdução. Aqueles versados na técnica também estarão cientes dos diferentes métodos de transfecção não viral comumente usados os quais incluem, porém sem limitações, o uso de métodos físicos (por exemplo, eletroporação, compressão de células, sonoporação, transfecção óptica, fusão de protoplastos, impalefecção, magnetofecção, pistolas gênicas ou bombardeio de partículas), reagentes químicos (por exemplo, fosfato de cálcio, compostos orgânicos altamente ramificados ou polímeros catiônicos) ou lipídios catiônicos (por exemplo, lipofecção). Muitos métodos de transfecção requerem o contato de soluções de DNA de plasmídeo com as células as quais são, então, cultivadas e selecionadas para a expressão de um gene marcador.

[0181] Uma vez que o CAR foi introduzido na célula imunomoduladora, a dita célula pode ser denominada como uma "célula imunomoduladora transformada". Portanto, de acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula imunomoduladora obtida por meio do método descrito no presente documento. Também dentro do escopo da presente invenção está uma linhagem de células obtida a partir de uma célula imunomoduladora transformada de acordo com o método descrito no presente documento.

[0182] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para inibir um CAR em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo um agente que inibe a interação do domínio de LEDGF/p75 ̶ integrase de HIV.

[0183] O nível de sinalização ao CAR pelo sistema descrito no presente documento pode ser ajustado ao alterar a quantidade de agente de ruptura presente ou a quantidade de tempo que o agente de ruptura está presente. Portanto, em uma modalidade, o nível de ativação das células CAR pode ser aumentado ao reduzir a dose do agente de ruptura administrado ao indivíduo ou reduzir a frequência de sua administração. Em uma modalidade alternativa, o nível de ativação das células CAR pode ser reduzido ao aumentar a dose de agente de ruptura ou a frequência de administração ao indivíduo.

[0184] Níveis mais altos de sinalização ao CAR provavelmente estão associados à progressão reduzida da doença, mas aumento das atividades tóxicas, enquanto que níveis mais baixos de sinalização ao CAR provavelmente estão associados ao aumento da progressão da doença, mas redução das atividades tóxicas.

[0185] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de uma doença que compreende administrar a um indivíduo a célula imunomoduladora ou da composição farmacêutica conforme definido no presente documento.

[0186] Em uma modalidade, a doença é câncer. Em uma outra modalidade, o câncer é selecionado a partir de: câncer de sangue, medula óssea, linfa, sistema linfático, bexiga, mama, cólon, colo do útero, esôfago, rim, intestino grosso, pulmão, cavidade oral, ovário, pâncreas, próstata, reto, pele ou estômago. Em ainda outra modalidade, o câncer é um câncer sanguíneo, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia de células B, mieloma múltiplo (MM), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL) e linfoma não-Hodgkin.

[0187] Quando o método descrito no presente documento é usado para tratar câncer, em uma modalidade, o método reduz o número de células tumorais, reduz o tamanho do tumor e/ou erradica o tumor no indivíduo.

[0188] Em uma modalidade, a doença é uma resposta imune patogênica, tal como uma doença autoimune, alergia ou doença enxerto contra hospedeiro. As doenças autoimunes surgem a partir de uma resposta imune anormal do corpo contra substâncias e tecidos normalmente presentes no corpo. Isto pode resultar em dano ou destruição de tecidos ou alteração do crescimento ou função do órgão. Exemplos de doenças autoimunes incluem, porém sem limitações: diabetes mellitus de tipo 1, artrite (incluindo juvenil, psoriática, reativa e artrite reumatoide), psoríase, esclerose múltipla, vasculite, alopecia areata, anemia perniciosa, glomerulonefrite, hepatite autoimune, pancreatite autoimune, colite ulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, síndrome de Sjogren, doença celíaca, doença de Crohn e síndrome de Wegener.

[0189] Em uma modalidade, a doença é uma infecção. Uma infecção pode ser causada por um patógeno, tal como uma bactéria,

vírus, parasita, protozoário ou fungo. Em uma outra modalidade, a infecção é uma infecção viral ou bacteriana.

[0190] Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[0191] O método de tratamento e/ou prevenção pode compreender as seguintes etapas: (a) fornecer (uma) célula(s) imunomoduladora(s); (b) transduzir ou transfectar o polinucleotídeo ou o vetor de expressão conforme definido no presente documento na(s) dita(s) célula(s) imunomoduladora(s); (c) expressar o dito polinucleotídeo ou o dito vetor de expressão na(s) célula(s) imunomoduladora(s); e (d) administrar a(s) célula(s) imunomoduladora(s) a um paciente.

[0192] As células imunomoduladoras ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser administradas a um paciente que já tem a doença a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e/ou desacelerar, reduzir ou bloquear a progressão da doença (ou seja, terapeuticamente). As células imunomoduladoras ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser administradas a um paciente que ainda não contraiu a doença e/ou que não está apresentando quaisquer sintomas da doença para prevenir a causa da doença (isto é, profilaticamente). O paciente pode ter uma predisposição ou ser considerado em risco de desenvolver a doença.

[0193] Em uma modalidade, o método compreende ainda administrar um agente que rompe a interação entre os domínios de LEDGF/p75 e integrase de HIV do CAR descrito no presente documento. O agente pode ser administrado ao paciente antes ou simultaneamente com as células imunomoduladoras/composição farmacêutica (ou seja, antes ou durante a etapa (d) nas etapas do método de tratamento descritas acima), a fim de administrar o CAR em seu estado "inativo" (ou seja, OFF). A quantidade de agente pode, então, ser diminuída para ativar o CAR. A administração do CAR inativo permite uma distribuição uniforme das células imunomoduladoras, evitando o acúmulo local de células ativadas.

[0194] Alternativamente, o agente pode ser administrado ao paciente após administração das células imunomoduladoras/composição farmacêutica (ou seja, após a etapa (d) nas etapas do método de tratamento descritas acima), de modo que o CAR seja administrado em seu estado "ativo" (ou seja, ON).

[0195] O agente pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica. Nesta modalidade, a composição pode compreender adicionalmente carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, conforme descrito no presente documento.

[0196] Conforme descrito no presente documento, a presente invenção fornece um CAR de tipo OFF-switch reversível para ser usado com terapias de células CAR-T. O método pode envolver o monitoramento da atividade tóxica no paciente. Assim, se o nível de atividade tóxica se tornar muito alto, o método pode envolver a administração de um agente que inibe a interação LEDGF/p75 ̶ integrase de HIV para reduzir os efeitos colaterais tóxicos adversos. As atividades tóxicas incluem, por exemplo, toxicidade imune, toxicidade biliar e síndrome do desconforto respiratório.

[0197] Da mesma forma, o método pode envolver o monitoramento da progressão da doença e, em seguida, administrar um agente que inibe a interação LEDGF/p75 ̶ integrase de HIV quando um nível aceitável de progressão da doença é alcançado (por exemplo, melhora). O nível específico de progressão da doença determinado como "aceitável" variará de acordo com as circunstâncias específicas e deve ser avaliado com base nisto.

[0198] Monitorar a progressão da doença significa avaliar os sintomas associados à doença ao longo do tempo para determinar se eles estão reduzindo/melhorando ou aumentando/piorando.

[0199] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um agente adequado para inibir o CAR, conforme definido no presente documento.

[0200] Será entendido que as modalidades descritas no presente documento podem ser aplicadas a todos os aspectos da invenção. Além disso, todas as publicações incluindo, porém sem limitações, patentes e pedidos de patentes, citadas no presente relatório descritivo, são incorporadas a título de referência como se fossem totalmente apresentadas.

SEQUÊNCIAS Estrutura Sequência SEQ ID NO.

SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT CCD de LEDGF/p75 MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN 1

M IBD de Integrase de HIV-1 CSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQ Gag-Polpoliproteína de HIV ETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWA 2 (Uniprot P12497) resíduos 1203- GIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLK 1355 TAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDI Ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPS 3 Ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGS 4 Ligante SDPSGGGGS 5 Ligante SDPSGGGGSGGGGSGGGGS 6 Ligante GGGS 7 Ligante SDPGGGS 8 Ligante GGSG 9 Hélice transmembrana de CD8α TRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 10

FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA Dobradiça de CD8α 11

AGGAVH

FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA Dobradiça de CD8α e hélice AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN 12 transmembrana

HRN Ligante transmembrana de CD8α RRRVCKCPRPVVK 13

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK

RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI Domínio de CD3ζ 14

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP R

Líder de CD8α MALPVTALLLPLALLLHAARP 15

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG Domínio de 4-1BB 16

GCEL Sequência P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGPFE 17 Etiqueta 3x FLAG DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK 18

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHW VRQAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADT

STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGAIYDGYDVLDNWG FV com uma única cadeia anti- QGTLVTV 19

BCMA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQK PGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ

PEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR Etiqueta Myc EQKLISEEDL 20 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 1 e Figura 1) 21 Construção 1 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 1 e Figura 1) 22 Construção 2 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 1 e Figura 1) 23 Construção 3 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 1 e Figura 1) 24 Construção 4 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 1 e Figura 1) 25 Construção 5 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 2 e Figura 4A) 26 Construção 6 Sequência de aminoácidos da (Consulte Exemplo 2 e Figura 4A) 27 Construção 7 Construção 7 com quatro resíduos de aminoácidos C- Sequência de aminoácidos da terminais extras do domínio de LEDGF/p75 (Consulte 28 Construção 8 Exemplo 4) Construção 7 com dezesseis resíduos de aminoácidos C- Sequência de aminoácidos da terminais extras do domínio de LEDGF/p75 (Consulte 29 Construção 9 Exemplo 4) Construção 7 com quarenta e cinco resíduos de Sequência de aminoácidos da aminoácidos C-terminais extras do domínio de LEGF/p75 30 Construção 10 (Consulte Exemplo 4) Sequência de aminoácidos da Construção 8 mutações Leu428Gln e Val429Arg do 31 Construção 11 domínio de LEDGF/p75 (Consulte Exemplo 4) Sequência de aminoácidos da Construção 8 com mutações Leu428Gln e Val429Gln do 32 Construção 12 domínio de LEDGF/p75 (Consulte Exemplo 4) Sequência de aminoácidos da Construção 10 com etiqueta 3xFLAG substituída pela 33 Construção 13 etiqueta Myc (Consulte Exemplo 6) Sequências de DNA das (consulte listagem de sequências) 34-46 Construções 1-13 Fragmento de LEDGF/p75 com

SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT quatro resíduos de aminoácidos C- MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN 47 terminais extras (Uniprot O75475,

MFLV resíduos 347-430

Fragmento de LEDGF/p75 com dezesseis resíduos de SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT aminoácidos C-terminais extras MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN 48 (Uniprot O75475, resíduos 347- MFLVGEGDSVITQVLNK 442) Fragmento de LEDGF/p75 com

SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT quarenta e cinco resíduos de

MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN aminoácidos C-terminais extras 49

MFLVGEGDSVITQVLNKSLAEQRQHEEANKTKDQGKKG (Uniprot O75475, resíduos 347-

PNKKLEKE 471) Mutações Leu428Gln e Val429Arg SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT do domínio de LEGF/p75 (Uniprot MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN 50 O75475, resíduos 347-430) MFQR Mutações Leu428Gln e Val429Gln SMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVT do domínio de LEGF/p75 (Uniprot MQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN 51 O75475, resíduos 347-430) MFQQ Sequência de aminoácidos da Construção 10 em uma única cadeia sem os elementos 52 Construção 14 integrase de HIV e LEDGF (Consulte Exemplo 8) Sequência de DNA da Construção Consulte listagem de sequências 53 14 Exemplos Exemplo 1. Construção de receptores antigênicos quiméricos que incorporam domínios de integrase de HIV e LEDGF/p75 humano que atua como um elemento de controle de tipo switch-OFF.

[0201] CARs preparados com elementos LEDGF/p75 e integrase de HIV são capazes de ativar a cascata de sinalização de células T NFAT de uma maneira específica para o antígeno, contanto que tanto a cadeia de sinalização como a cadeia de ligação a antígeno sejam unidas à membrana celular. O sinal de ativação NFAT de células Jurkat transfectadas com o CAR de tipo OFF-switch são modulados pela presença do composto LEDGIN BI224436.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0202] Geração de Construções: As construções abaixo foram clonadas no vetor pG3. A representação esquemática das construções é mostrada na FIGURA 1 e detalhes completos da sequência das construções são fornecidos abaixo. CONSTRUÇÃO 1 (SEQ ID NO: 21):

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVI PAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQG VIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSG GGGSGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGG GSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGS GATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKP TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSL VITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDSRLQRIHAEI KNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNK

FKNM Legenda para a construção 1 Etiqueta 3 x Flag (SEQ ID NO: 18) Ligante (SEQ ID NO: 7) Poliproteína HIV Gag-Pol (Uniprot P12497) resíduos 1203- 1355 (SEQ ID NO: 2) Ligante (SEQ ID NO: 6) 4-1BB, superfamília do receptor de fator de necrose tumoral, membro 9 (Uniprot Q07011) resíduos 214-255 (SEQ ID NO: 16) Ligante (SEQ ID NO: 7) CD3ζ (Uniprot P20963) resíduos 52-164 (SEQ ID NO: 14) Ligante (SEQ ID NO: 9) P2A (SEQ ID NO: 17) CD8 alfa (Uniprot P01732) resíduos 1-21(SEQ ID NO: 15) Fv com uma única cadeia anti-BCMA (SEQ ID NO: 19) CD8 alfa (Uniprot P01732) resíduos 128-223 (SEQ ID NOs: 12 + 13) Ligante (SEQ ID NO: 3) LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-426 (SEQ ID NO: 9) CONSTRUÇÃO 2 (SEQ ID NO: 22):

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGGSSMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDEL ASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKNMSDPSGGGGSKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPF EMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVR QAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR GAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRP VVKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVI PAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQG

VIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDI Legenda conforme para a Construção 1. CONSTRUÇÃO 3 (SEQ ID NO: 23)

FKNMSDPSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL Legenda conforme para a Construção 1. CONSTRUÇÃO 4 (SEQ ID NO: 24)

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGGSSMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDEL ASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKNMSDPSGGGGSKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPF EMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVR QAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR GAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRP VVKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVI PAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQG VIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSG

GGGSGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL Legenda conforme para a Construção 1. CONSTRUÇÃO 5 (SEQ ID NO: 25)

MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGT CGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQ VTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKNMSDPSGGGGSRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGSGATNFSLLKQAGD VEENPGPFEMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTN YWMHWVRQAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCTRGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSDPSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKT VHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLK

TAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDI Transfecção de células Jurkat com construções e ensaio de NFAT-luciferase

[0203] Células NFAT-luc2 Jurkat (Promega) foram cultivadas em meio Jurkat:meio RPMI 1640 (1x) sem L-glutamina com vermelho de fenol (Gibco), Soro Fetal Bovino (FBS) termicamente inativado (Gibco) a 10 % (v/v), Aminoácidos não essenciais em meio essencial mínimo (Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids, MEM NEAA) (ThermoFisher) a 1 % (v/v), Piruvato de sódio (Sigma) a 1 % (v/v), L-

Glutamina (Gibco) a 1 % (v/v). As células ARH-77-10B5 foram cultivadas em meio Jurkat mais 1 mg/mL de G418 (Thermo, 10131035). As células foram incubadas a 37 °C com 5 % de CO2 durante 48 horas. 20 µg de DNA de plasmídeo de cada construção foram misturados com 8x106 células NFAT-luc2 Jurkat e as células foram transfectadas usando o 4D-Nucleofector (Lonza) com o kit Cell Line SE Nucleofector (Lonza) seguindo as instruções do fabricante com o programa CL-120. O composto BI224436 (Chemexpress HY-18595) em uma concentração de estoque de 100 mM em DMSO a 100 % (Sigma, D2650) foi diluído em meio Jurkat para atingir uma concentração de estoque de 100 µM. Usando o estoque a 100 µM de BI224436 em meio Jurkat, as células NFAT-luc2 Jurkat foram incubadas em uma concentração final de composto de 3 µM durante 48 horas a 37 °C com 5 % de CO2. As células NFAT-luc2 Jurkat foram, então, cocultivadas (1x10 5 células por cavidade, proporção de efetor:alvo de 1:1) com células ARH-77-10B5 (células positivas para BCMA) durante 6,5 horas. A luminescência de NFAT-luciferase foi medida usando o Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega G7940) (seguindo as instruções do fabricante) e um EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer).

RESULTADOS

[0204] As Construções 1 a 4 codificam CARs de tipo OFF-switch nos quais o domínio de ligação ao alvo (scFv anti-BCMA) é fundido a um domínio de LEDGF/p75 humano ou a um domínio de integrase de HIV (Figura 1). Nestas construções, a cadeia de sinalização não está ligada à membrana plasmática. As Construções 1 a 4 mostram nenhuma ou baixa ativação de NFAT quando estimuladas com células apresentadoras de antígeno e a adição de BI224436 (uma pequena molécula ligante de integrase de HIV que inibe sua ligação a LEDGF/p75) não reduz o nível de ativação (Figura 2). A Construção 5 codifica para um CAR de tipo OFF-switch no qual a cadeia de sinalização é unida à membrana plasmática por meio da fusão com um domínio transmembrana de CD8α. A Construção 5 ativa o NFAT em células Jurkat quando apresentadas com células que expressam o antígeno (ARH-77-10B5) e a ativação de NFAT é reduzida na presença de BI224436. Exemplo 2. A ativação do receptor antigênico quimérico que contém elementos de tipo OFF-switch é aprimorada pela incorporação de uma mutação de solubilização da integrase de HIV

[0205] A capacidade do CAR de tipo OFF-switch de LEDGF/p75 e integrase de HIV de ativar o promotor NFAT de um modo específico para o antígeno pode ser aprimorada pela introdução de uma mutação da integrase de HIV descrita em Jenkins et al. (1995) PNAS Vol. 92, páginas 6057-6061. Esta mutação é a substituição da fenialanina 185 por lisina (F185K) no domínio da integrase. A mutação corresponde à fenilalanina 1332 na poliproteína Gag-Pol de HIV com entrada Uniprot P12497.

[0206] Geração de Construções: A Construção 5 foi gerada no Exemplo 1. A construção abaixo foi clonada no vetor pG3. Os detalhes completos da sequência da construção são fornecidos abaixo. CONSTRUÇÃO 6 (SEQ ID NO: 26):

TAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDI Legenda conforme para a Construção 1, exceto quanto a: Poliproteína HIV Gag-Pol (Uniprot P12497) resíduos 1203- 1355 com mutação Phe1332Lys Transfecção de células Jurkat com construções e ensaio de NFAT-luciferase

[0207] O método é descrito no Exemplo 1.

RESULTADOS

[0208] A mutação da integrase de HIV de tipo selvagem fenilalanina 1332 (entrada Uniprot P12497) para lisina na Construção 6 resulta em um aumento de três vezes na ativação do promotor NFAT em células Jurkat em relação à Construção 5 (Figura 3). O efeito do composto BI224436 sobre a regulação negativa de NFAT é preservado em ambas as Construções 5 e 6. Exemplo 3. A ativação do receptor antigênico quimérico que contém elementos de tipo OFF-switch é aprimorada ao trocar o domínio de LEDGF/p75 pela cadeia de ligação a antígeno

[0209] A capacidade do CAR de tipo OFF-switch de LEDGF/p75 e integrase de HIV de ativar o promotor NFAT pode ser ainda mais aprimorada ao ter o domínio de LEDGF/p75 fundido com a cadeia de ligação a antígeno e o domínio de integrase de HIV fundido com a cadeia de sinalização.

[0210] Geração de Construções: A Construção 6 foi gerada no Exemplo 2. A construção abaixo foi clonada no vetor pG3. Os detalhes completos da sequência da construção são fornecidos abaixo. CONSTRUÇÃO 7 (SEQ ID NO: 27):

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMSDPGGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLALLLHA ARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWP VKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAE HLKTAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGSRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 6. Transfecção de células Jurkat com construções e ensaio de NFAT- luciferase

[0211] O método é descrito no Exemplo 1.

RESULTADOS

[0212] A ativação de NFAT é mais de 4 vezes maior na Construção 7, onde o domínio de LEDGF/p75 é fundido à cadeia de ligação a antígeno e o domínio da integrase de HIV é fundido à cadeia de sinalização, comparado com a Construção 6, onde o domínio da integrase de HIV é fundido à cadeia de ligação a antígeno e LEDGF/p75 é fundida à cadeia de sinalização (Figura 4). O efeito do composto BI224436 sobre a regulação negativa de NFAT é preservado em ambas as Construções 6 e 7. Exemplo 4. Os níveis de expressão de CAR com elementos de tipo OFF-switch são aprimorados por alterações no domínio de LEDGF/p75 humana

[0213] Os níveis de expressão do CAR de tipo OFF-switch podem ser aprimorados pela mutação do domínio LEDGF/p75. Cinco variantes projetadas de LEDGF/p75 foram geradas: três variantes incluem a adição C-terminal de uma sequência não estruturada (com base na entrada 1Z9E do PDB) de LEDGF/p75 de tipo selvagem para a Construção 7 e as outras duas variantes incluem novas mutações pontuais que aumentam a expressão do CAR de tipo OFF-switch.

[0214] Geração de Construções: A Construção 7 foi gerada no Exemplo 3. As construções abaixo foram clonadas no vetor pG3. Os detalhes completos da sequência das construções são fornecidos abaixo. CONSTRUÇÃO 8 (SEQ ID NO: 28)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMFLVGSDPGGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLAL LLHAARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLA GRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVR DQAEHLKTAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY

NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 7, exceto quanto a: LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-430 (SEQ ID NO: 47) CONSTRUÇÃO 9 (SEQ ID NO: 29)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMFLVGEGDSVITQVLNKSDPGGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEM ALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTC GVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETG QETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESM NKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGS GGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR Legenda conforme para a Construção 7, exceto quanto a: LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-442 (SEQ ID NO: 48) CONSTRUÇÃO 10 (SEQ ID NO: 30)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMFLVGEGDSVITQVLNKSLAEQRQHEEANKTKDQGKKGPNKKLEKESDP GGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDHDGDYKD HDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGSCSPGIWQ LDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFTSTT VKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNKK RKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG

ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 7, exceto quanto a: LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-471 (SEQ ID NO: 49) CONSTRUÇÃO 11(SEQ ID NO: 31):

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMFQRGSDPGGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLA LLLHAARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLA GRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVR DQAEHLKTAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY

NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 7, exceto quanto a: LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-430 com mutações Leu428Gln e Val429Arg (SEQ ID NO: 50) CONSTRUÇÃO 12 (SEQ ID NO: 32): esta construção tem mutação de LEDGF/p75 no resíduo de Leucina 428 para Glutamina e no resíduo de Valina 429 para Glutamina no C-término do domínio de LEGF/p75 da Construção 8.

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDS RLQRIHAEIKNSLKIDNLDVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIME KSTMLYNKFKNMFQQGSDPGGGSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLA LLLHAARPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGSCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLA GRWPVKTVHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVR DQAEHLKTAVQMAVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY

NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 7, exceto quanto a: LEDGF/p75 (Uniprot O75475) resíduos 347-430 com mutações Leu428Gln e Val429Gln (SEQ ID NO: 51)

Produção de Vetor Lentiviral, Transdução de Células Jurkat e Citometria de Fluxo

[0215] Para a produção de vetor lentiviral, 3,0x107 células Lenti-X 293T (Takara Bio) foram semeadas em 20 mL de DMEM (Gibco) e incubadas durante a noite a 37 °C com 5 % de CO2. As células Lenti-X 293T foram transfectadas com uma mistura de 21 µg de vetor de transferência que contém a construção, 3,75 µg de ViraSafe pRSV-Rev, 5,25 µg de ViraSafe pCMV-VSVG, 7,5 µg de ViraSafe pCgp V- (gag- pol), 75 µg de jetPRIME (Polyplus) e 1500 µg de tampão jetPRIME (Polyplus). Após 2 dias, os sobrenadantes foram clarificados e o vírus foi concentrado e purificado por meio de ultracentrifugação em um bloco de sacarose a 20 % usando sacarose ultrapura (ThermoFisher) em tubos de ultracentrifugação Oak Ridge PPCO de 50 ml (ThermoFisher). Os vetores lentivirais foram produzidos para as CONSTRUÇÕES 7, 8, 9, 10, 11 e 12 por meio do método descrito acima.

[0216] As células Jurkat foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 1. Antes da transdução, as células foram divididas em uma densidade de 2x105 células/ml. As células Jurkat foram transduzidas com os vetores lentivirais que codificam as CONSTRUÇÕES 7, 8, 9, 10, 11 e 12. As reações de transdução foram preparadas para atingir uma MOI de 5. As células Jurkat transduzidas foram cultivadas em uma densidade de 2x105 células/ml durante 20 dias. Aos 20 dias após a transdução, as células foram coradas com BCMA-Fc conjugado com AlexaFluor 647 (gerado internamente) para marcar o domínio scFv anti- BCMA nos CARs. As medições foram feitas usando um Cytoflex S (Beckman Coulter) e os dados analisados usando FlowJo (FlowJo).

RESULTADOS

[0217] A extensão da porção C-terminal de LEDGF/p75 (Construções 8, 9 e 10) e a mutação dos resíduos 428 e 429 de LEDGF/p75 (Construções 11 e 12) resultaram em um aumento da porcentagem de células que expressam o CAR de tipo OFF-switch de LEDGF/p75 de HIV (Figura 5). Exemplo 5. Liberação de citocinas por células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV- LEDGF/p75

[0218] As células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF- switch de integrase de HIV-LEDGF/p75 produzem uma resposta funcional na forma de liberação de citocinas quando estimuladas com células apresentadoras de antígeno. A adição de BI224436 modula negativamente a liberação de citocinas.

MATERIAIS E MÉTODOS Transdução de Células T Primárias e Liberação de Citocinas

[0219] Células mononucleares de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) do sangue fresco de dois doadores humanos saudáveis foram isoladas por meio de centrifugação em gradiente de densidade em tubos Accuspin (Sigma) que contêm 15 mL de Histopaque-1077 (Sigma) e seguindo as instruções do fabricante. As células foram ressuspensas a 1x106 células/mL em meio TEXMacs (Miltenyi Biotec) que contém 100 unidades/mL de IL-2 (Sigma) e esferas TransAct (Miltenyi Biotec) e incubadas durante 48 horas a 37 °C com 5 % de CO2.

[0220] As células T dos dois doadores foram transduzidas com os vetores lentivirais que codificam a CONSTRUÇÃO 10 e CONSTRUÇÃO

11. As reações de transdução foram preparadas para atingir uma MOI de 5. As células T foram cultivadas em meio TEXMacs (Miltentyi Biotec) com 100 unidades/mL de IL-2, meio fresco foi adicionado a cada 3 dias. As células ARH-77-10B5 foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 1. O composto BI224436 em uma concentração de estoque de 100 mM em DMSO a 100 % foi diluído em meio Jurkat para atingir uma concentração de estoque de 100 µM. Cada população de células T foi incubada em uma concentração final de BI224436 a 10 µM ou 0 µM (meio apenas) em meio Jurkat durante 1 hora a 37 °C com 5 % de CO2. As células T foram, então, cocultivadas (5x10 4 células por cavidade, proporção de efetor:alvo de 1:1) com células ARH-77-10B5 (células positivas para BCMA) ou meio (sem antígeno) durante 24 horas em meio Jurkat a 37 °C com 5 % de CO2. As células foram sedimentadas (1200 rpm, 5 min) e os sobrenadantes foram coletados. Os sobrenadantes foram analisados quanto aos níveis de citocinas usando o kit Human MSD V-plex Proinflammatory Panel 1 (MSD, K15049D-2) e MSD Sector Imager (MSD).

RESULTADOS

[0221] As células T primárias transduzidas com CARs de tipo OFF- switch (Construções 10 e 11) liberam citocinas TNF-alfa, IL-2 e IFN- gama após estimulação com células positivas para BCMA (ARH-77- 10B5) (Figura 6). Em todos os casos, a liberação de citocinas foi atenuada pela adição do composto BI224435. Exemplo 6. Ajuste do nível de liberação de citocinas por células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV-LEDGF/p75

[0222] A liberação de citocinas de células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV-LEDGF/p75 pode ser ajustada pela concentração de BI224436. Foi usado um CAR de tipo OFF-switch com uma etiqueta Myc na cadeia de sinalização.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0223] Geração de Construções: A construção 13 foi clonada no vetor pG3. Os detalhes completos da sequência da construção são fornecidos abaixo. CONSTRUÇÃO 13 (SEQ ID NO: 33): esta construção é equivalente à Construção 10 com a substituição da etiqueta 3x Flag por uma etiqueta Myc.

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWM HWVRQAPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCTRGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLH SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVP VFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWA PLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDPSSMDSRLQRIHAEIKNSLKIDNL DVNRCIEALDELASLQVTMQQAQKHTEMITTLKKIRRFKVSQVIMEKSTMLYNKFKN MFLVGEGDSVITQVLNKSLAEQRQHEEANKTKDQGKKGPNKKLEKESDPGGGSG SGATNFSLLKQAGDVEENPGPFEMALPVTALLLPLALLLHAARPEQKLISEEDLTRG LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ EEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGSCSPGIWQLDC THLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTVHTDNGSNFT STTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVIESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQM AVFIHNKKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDISDPSGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN

ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda conforme para a Construção 10, exceto quanto a: Etiqueta Myc Produção de Vetor Lentiviral e Transdução de Células T Primárias

[0224] O método para a produção de lentivírus é descrito no Exemplo 4 e o método para a transdução de células T primárias é descrito no Exemplo 5. Liberação de Citocinas

[0225] As células ARH-77-10B5 foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 1. O composto BI224436 em uma concentração de estoque de 100 mM em DMSO a 100 % foi diluído em meio Jurkat para atingir uma concentração de estoque de 100 µM. Cada população de células T foi incubada em uma concentração final de BI224436 a 10 µM, 3,3 µM, 1,1 µM, 0,37 µM, 0,12 µM, 0,04 µM, 0,013 µM, 0,004 µM, 0,001 µM ou 0 µM (meio apenas) em meio Jurkat durante 1 hora a 37 °C com 5 % de CO2. As células T foram, então, cocultivadas (5x10 4 células por cavidade, proporção de efetor:alvo de 1:1) com células ARH-77-10B5 (células positivas para BCMA) durante 24 horas em meio Jurkat a 37 °C com 5 % de CO2. As células foram sedimentadas (1200 rpm, 5 min) e os sobrenadantes foram coletados. Os sobrenadantes foram analisados quanto aos níveis de citocinas usando o kit Human MSD V-plex Proinflammatory Panel 1 (MSD, K15049D-2) e MSD Sector Imager (MSD).

RESULTADOS

[0226] A concentração de BI224436 ajusta o nível de liberação de TNF-alfa, IL-2 e IFN-gama a partir de células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch (Construção 13) quando estimuladas com células positivas para BCMA (ARH-77-10B5) (FIGURA 7). A concentração IC50 de BI224436 é 100 nM. Esta concentração é 10 vezes menor do que as concentrações de BI224436 alcançadas no plasma de indivíduos humanos 24 horas após doses orais de 200 mg de BI224436 (ID do ensaio clínico NCT01276990, análise apresentada como relatório de conferência http://www.natap.org/2011 /ICAAC/ICAAC_35.htm). Exemplo 7. Citotoxicidade por células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV-LEDGF/p75

[0227] O CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV-LEDGF/p75 ativa uma resposta citotóxica e a citotoxicidade é atenuada pela presença do composto BI224436.

MATERIAIS E MÉTODOS Transdução de Células T Primárias

[0228] O método é descrito no Exemplo 5. Ensaio de Citotoxicidade xCelligence

[0229] As células ARH-77-10B5 eram conforme descrito no Exemplo 1. O composto BI224436 em uma concentração de estoque de 100 mM em DMSO a 100 % foi diluído em meio Jurkat para atingir uma concentração de estoque de 100 µM. As placas xCelligence E (ACEA,

06472460001) foram revestidas com agente de união anti-CD40 seguindo as instruções do fabricante para o kit de ensaio de eliminação de células B (anti-CD40) (ACEA, 8100004). As placas foram inseridas na estação xCelligence (ACEA) (37 °C, 5 % de CO2) e deixadas equilibrar a 37 °C durante 1 hora antes de fazer a medição de base. Células ARH-77-10B5 ou meio Jurkat foram adicionados às placas (1x104 células por cavidade) e cultivadas durante 20h. Cada população de células T foi incubada em uma concentração final de 10 µM ou 0 µM de BI224436 em meio Jurkat durante 1 hora a 37 °C com 5 % de CO2. As células T foram adicionadas às placas (1x104 células por cavidade, proporção de efetor:alvo de 1:1) e incubadas na estação xCelligence durante 24 horas. A análise dos dados foi realizada usando o software de imunoterapia xCELLigence (ACEA). O índice de células para amostras foi normalizado para o ponto de adição de células T, então, o índice de células normalizadas para células T foi dividido pelo índice de células normalizadas para células alvo apenas para dar a % de células viáveis em um determinado ponto de tempo.

RESULTADOS

[0230] As células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF- switch (Construção 10) induzem a uma resposta citotóxica contra células positivas para BCMA (ARH-77-10B5) (Figura 8). A resposta é reduzida na presença do composto BI224436. Exemplo 8. Efeito de BI224436 sobre a citotoxicidade de células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch de integrase de HIV- LEDGF/p75 ou um CAR convencional equivalente

[0231] A citotoxicidade específica para antígeno do CAR de tipo OFF-switch é comparável com um CAR convencional equivalente e BI22436 atenua apenas a citotoxicidade do CAR de tipo OFF-switch. Componentes essenciais do CAR (scFv anti-BCMA, dobradiça e transmembrana de CD8-alfa, 4-1BB e CD3-zeta) do CAR de tipo OFF-

switch foram usados para gerar um CAR com uma única cadeia convencional equivalente.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0232] Geração de Construções: A Construção 14 foi clonada no vetor pG3. Detalhes completos da sequência da construção são fornecidos abaixo.

[0233] CONSTRUÇÃO 14 (SEQ ID NO: 52): Esta construção é um CAR convencional com uma única cadeia e usa componentes da CONSTRUÇÃO 10. CONSTRUÇÃO 14:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGYTFTNYWMHWVRQ APGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG AIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD

GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Legenda: Superfamília do receptor de fator de necrose tumoral 4-1BB, membro 9 (Uniprot Q07011) resíduos 214-255 CD3ζ (Uniprot P20963) resíduos 52-164 CD8 alfa (Uniprot P01732) resíduos 1-21 Fv com uma única cadeia anti-BCMA CD8 alfa (Uniprot P01732) resíduos 128-223 Sequência de DNA da Construção 14 (SEQ ID NO 53):

ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTCCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCC AGGCCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGGGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCTC CGTGAAAGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGG GTGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCGCCACCTACAGGGGCCA CAGCGACACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACCCTGACCGCCGACACT AGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCTCACTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCACCAGGGGCGCCATCTACGACGGCTACGACGTGCTGGACAACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGGCGGCGGCGGGAGCGGCGGCGGCGGAAG CGGCGGCGGAGGAAGCGGCGGCGGCGGAAGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCA GCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGCGCAAGCCAG GACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGC TGATCTACTACACCTCTAACCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCTCTGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCCGAGGACTTCGCCACC TACTACTGCCAGCAGTACAGGAAGCTCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGG AGATCAAGCGCTTCGTGCCCGTGTTCCTCCCCGCAAAACCCACCACCACTCCCGCCCC CAGACCCCCCACTCCCGCCCCAACAATTGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGA GGCTTGTAGGCCCGCCGCTGGCGGCGCCGTCCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTG CGACATCTATATCTGGGCCCCCCTGGCCGGAACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCT GGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGGAACAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTCCTGTAC ATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGC AGCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAGGAGGGCGGGTGCGAACTGAGAGTGAAATTTAGC AGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTATCAGCAAGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTC AACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGGGGCAGAGATCC CGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAATCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCT GCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGGGAGAGGA GGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGAC

ACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG Produção de Vetor Lentiviral

[0234] O método é descrito no Exemplo 4. Isolamento e Transdução de Células T CD4+ e CD8+

[0235] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) do sangue fresco de um doador humano saudável foram isoladas por meio de centrifugação em gradiente de densidade em tubos Accuspin (Sigma) que contêm 15 mL de Histopaque-1077 (Sigma) e seguindo as instruções do fabricante. Células T CD4+ e CD8+ foram isoladas usando microesferas de CD4 e CD8 (Miltenyi Biotec) e o separador AutoMACS Pro (Miltenyi Biotec). As células foram ressuspensas a 1x10 6 células/mL em meio TEXMacs (Miltenyi Biotec) que contém 100 unidades/mL de IL- 7 (Sigma), 100 unidades/mL de IL-15 (Sigma) e esferas TransAct (Miltenyi Biotec) e incubadas durante 48 horas a 37 °C com 5 % de CO2.

[0236] As células T foram transduzidas com vetores lentivirais que codificam a CONSTRUÇÃO 14 ou CONSTRUÇÃO 10. As células T transduzidas e não transduzidas (UT) foram cultivadas em meio TEXMacs (Miltenyi Biotec) com 100 unidades/mL de IL-7 (Sigma) e IL- 15 (Sigma) e meio fresco adicionados a cada 3 dias. As reações de transdução foram preparadas para atingir níveis de expressão de CAR comparáveis entre a CONSTRUÇÃO 14 e a CONSTRUÇÃO 10. 1x10 5 de cada população de células T foi corado com AlexaFluor 647 BCMA- Fc conjugado (gerado internamente) para marcar o scFv anti-BCMA nos CARs. As medições foram feitas usando um Cytoflex S (Beckman Coulter) e os dados analisados usando FlowJo (FlowJo).

[0237] Células K562 BCMA (positivas para BCMA) foram cultivadas em meio Jurkat mais 0,8 mg/mL G418 (Gibco) e células K562 (negativas para BCMA) foram cultivadas em meio Jurkat. Ambas as linhagens de células foram cultivadas a 37 °C com 5 % de CO2. O composto BI224436 em uma concentração de estoque de 100 mM em DMSO a 100 % (Sigma) foi diluído em meio Jurkat para atingir uma concentração de estoque de 100 μM. As células K562 foram coradas com Cell Trace Far Red (0,5 µM, ThermoFisher) e as células K562 BCMA foram coradas com Cell Trace Violet (2,5 µM, ThermoFisher). As células T foram incubadas em uma concentração final de BI224436 a 10 µM ou 0 µM (meio apenas) em meio Jurkat durante 1 hora a 37 °C com 5 % de CO2. As células T foram, então, cocultivadas (1x10 4 células K562 ou K562 BCMA por cavidade, proporção de efetor:alvo de 1:1 ou 4:1) com células K562 ou K562 BCMA durante 48 horas em BI224436 a 10 µM ou 0 µM em meio Jurkat a 37 °C com 5 % de CO2. Após 48 horas, SytoxAADvanced (1 µM, ThermoFisher), Dnase (2,5 mg/ml, ThermoFisher) e EDTA (10 mM, Invitrogen) foram adicionados às cavidades que continham as células e incubados durante 5 min a 25 °C. 50 µL de cada cavidade foram analisados em um Cytoflex S (Beckman Coulter) e os dados foram analisados usando o FlowJo (FlowJo). A porcentagem de células K562 e K562 BCMA sobreviventes foi calculada ao dividir o número de células K562 e K562 BCMA em cada condição pelo número de células K562 e K562 BCMA encontradas após cocultura com células T UT em BI224436 a 0 µM.

RESULTADOS

[0238] Tanto células T primárias transduzidas com o CAR de tipo OFF-switch (Construção 10) como as células T primárias transduzidas com um CAR convencional equivalente (Construção 14) matam células positivas para BCMA (K562 BCMA), mas não células negativas para BCMA (K562 WT) (Figura 9B). BI224436 não afeta a citotoxicidade do CAR convencional (Construção 14), mas atenua efetivamente a citotoxicidade do CAR de tipo OFF-switch (Construção 10).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor antigênico quimérico (CAR) adequado para o tratamento de seres humanos caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma cadeia de sinalização que compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização; (ii) uma cadeia de não sinalização que compreende um domínio de ligação ao alvo e um domínio transmembrana; em que uma das ditas cadeias compreende ainda um domínio do núcleo catalítico (CCD) da integrase de HIV ou um fragmento ou variante funcional do mesmo e a outra cadeia compreende ainda um domínio de ligação da integrase (IBD) de LEDGF/p75 ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

2. CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia de sinalização compreende ainda um domínio coestimulador.

3. CAR, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia de não sinalização compreende ainda um domínio coestimulador.

4. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia de não sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio de ligação ao alvo; um domínio transmembrana; um domínio coestimulador; e um CCD de integrase de HIV ou IBD de LEDGF/p75 (Configuração A) e a cadeia de sinalização compreende domínios na seguinte ordem: um domínio transmembrana; um domínio coestimulador; um CCD de integrase de HIV ou IBD de LEDGF/p75; e um domínio de sinalização (Configuração I).

5. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia de não sinalização compreende o IBD de LEDGF/p75.

6. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as ditas variantes funcionais de IBD de LEDGF/p75 têm hidrofobicidade reduzida nos resíduos 428 e 429.

7. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito IBD de LEDGF/p75 compreende resíduos de aminoácidos adicionais a partir da sequência da proteína LEDGF/p75 C-terminal ao IBD.

8. CAR, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito IBD de LEDGF/p75 compreende 1-45 resíduos de aminoácidos adicionais a partir da sequência da proteína LEDGF/p75 C-terminal ao IBD.

9. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao alvo compreende um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno ou um ligante.

10. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao alvo se liga a um antígeno associado a tumor.

11. CAR, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado a tumor é selecionado a partir de: BCMA, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno de câncer-125, CA19-9, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD27, CD30, CD33, CD34, CD45, CD52, CD70, CD117, CD138, CD160, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína de ligação ao folato, gangliosídeo G2 (GD2), HER2, mesotelina, MUC-1, molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno de células-tronco prostáticas (PSCA), antígeno na membrana específico para próstata (PSMA), fosfatase ácida prostática (PAP), proteína melana-A, sinaptose, seis antígeno epitelial transmembrana prostático I (STEAP1), TARP, Trp-p8,

tirosinase ou vimentina.

12. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende o domínio transmembrana de CD8 ou CD4.

13. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização compreende um domínio de sinalização de CD3zeta.

14. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o domínio coestimulador é selecionado a partir de 4-1BB, CD28, CD27, OX40, ICOS, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 ou qualquer combinação dos mesmos.

15. Uso de um CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente que rompe a ligação do CCD de integrase de HIV ou uma variante funcional do mesmo com a proteína fator de crescimento derivado do epitélio da íris humana (LEDGF/p75) ou fragmentos funcionais ou variantes da mesma.

16. Uso de um CAR, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado a partir de um derivado de ácido 2-(quinolin-3-il)acético, um derivado de ácido 2- (piridina-3-il)acético, um derivado de ácido 2-(tieno[2,3-b]piridina-5- il)acético ou um derivado de ácido (S)-2-(terc-butóxi)-2-fenilacético.

17. Uso de um CAR, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado a partir de: ácido 3-quinolinacético, 4-(2,3-di-hidropirano[4,3,2- de]quinolin-7-il)-α-(1,1-dimetiletoxi)-2-metil-, (αS,4R)-; e ácido 3-quinolinacético, 4-(3,4-di-hidro-2H-1-benzopiran-6- il)-α-(1,1-dimetiletoxi)-2-metil-.

18. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a cadeia de sinalização e/ou a cadeia de não sinalização do CAR, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

19. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 16.

20. Célula imunomoduladora, caracterizada pelo fato de que compreende o sistema de receptor antigênico quimérico (CAR), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

21. Célula imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é derivada de um linfócito T inflamatório, linfócito T citotóxico, linfócito T regulador ou linfócito T auxiliar.

22. Célula imunomoduladora, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia.

23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células imunomoduladoras, como definida na reivindicação 20 ou 21.

24. Método de tratamento e/ou prevenção de uma doença, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 23, a um indivíduo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente que rompe a interação entre o domínio catalítico do núcleo (CCD) da proteína integrase de HIV ou uma variante funcional da mesma e a proteína fator de crescimento derivado do epitélio da íris humana (LEDGF/p75) ou fragmentos funcionais ou variantes da mesma.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente é administrado ao paciente antes, simultaneamente ou após a composição farmacêutica.

27. Método de produção de uma célula imunomoduladora, como definida na reivindicação 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma célula imunomoduladora; (b) transduzir ou transfectar o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 18, ou o vetor de expressão, como definido na reivindicação 19, na dita célula imunomoduladora; e (c) expressar o dito polinucleotídeo ou o dito vetor de expressão na célula imunomoduladora.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula imunomoduladora é alogênica ou autóloga.

29. Célula imunomoduladora, caracterizada pelo fato de que é obtida por meio do método, como definido na reivindicação 27 ou 28.

30. Método de inibição do CAR, como definida na reivindicação 20, 21 ou 22, em um indivíduo que compreende a célula imunomoduladora, como definido na reivindicação 24, 25 ou 29, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um agente que inibe a interação integrase de HIV-LEDGF/p75.