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BR112021004670A2 - reprogramação celular para reverter o envelhecimento e promover a regeneração de órgãos e tecidos - Google Patents

reprogramação celular para reverter o envelhecimento e promover a regeneração de órgãos e tecidos Download PDF

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BR112021004670A2
BR112021004670A2 BR112021004670-4A BR112021004670A BR112021004670A2 BR 112021004670 A2 BR112021004670 A2 BR 112021004670A2 BR 112021004670 A BR112021004670 A BR 112021004670A BR 112021004670 A2 BR112021004670 A2 BR 112021004670A2
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BR
Brazil
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klf4
nucleic acid
oct4
sox2
Prior art date
Application number
BR112021004670-4A
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Inventor
David A. Sinclair
Yuancheng Lu
Original Assignee
President And Fellows Of Harvard College
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Publication date
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Abstract

São fornecidos aqui ácidos nucleicos modificados (por exemplo, vetores de expressão, incluindo vetores virais, tais como vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores do AAV, vetores virais do herpes e vetores retrovirais) que codificam OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos que sejam úteis, por exemplo, na indução de reprogramação celular, reparo de tecido, regeneração de tecido, regeneração de órgão, reversão do envelhecimento ou qualquer combinação dos mesmos. Também são fornecidos aqui vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, vírus do herpes, retrovírus ou AAVs) compreendendo os ácidos nucleicos modificados (por exemplo, ácidos nucleicos modificados), células modificadas, composições compreendendo os ácidos nucleicos modificados, o vírus recombinante, células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos que são capazes de ativar a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, uma proteína modificada selecionada a partir do grupo que consiste em OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de ativar a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e métodos de tratamento de uma (por exemplo, doença ocular), prevenção de uma doença (por exemplo, doença ocular), regulação (por exemplo, indução ou indução e, em seguida, interrupção), reprogramação celular, regulação do reparo do tecido, regulação da regeneração do tecido ou qualquer combinação dos mesmos).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “REPRO-
GRAMAÇÃO CELULAR PARA REVERTER O ENVELHECIMENTO E PROMOVER A REGENERAÇÃO DE ÓRGÃOS E TECIDOS”. PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 (e) do pedido provisório Norte-americano número 62/738.922, depositado em 28 de setembro de 2018, pedido provisório Norte-americano número 62/792.283, depositado em 14 de janeiro de 2019, pedido provisório Norte-americano número 62/865.877, depositado em 24 de junho de 2019, e pedido provisório Norte-americano número 62/880.488, deposi- tado em 30 de julho de 2019, cada um dos quais é incorporado por re- ferência aqui em sua totalidade.
SUPORTE GOVERNAMENTAL
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob os núme- ros de concessão R01 AG019719 e R01 DK100263 concedidos pelo National Institutes of Health (NIH). O governo tem certos direitos sobre a invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Em muitos animais, incluindo vertebrados, os órgãos vitais têm uma capacidade intrínseca limitada de regeneração e reparo. Le- sões agudas e doenças crônicas podem danificar órgãos e tecidos vi- tais, incluindo coração, pâncreas, cérebro, rins, músculos, pele e tecido neuronal, entre outros. As células somáticas maduras, no entanto, mui- tas vezes não conseguem sobreviver a esses insultos e, mesmo que sobrevivam, são incapazes de se autorrenovar e transdiferenciar para substituir as células danificadas. Além disso, células que são capazes de se autorrenovar podem ser limitadas em quantidade, ter capacidade limitada e são suscetíveis a danos, especialmente com a idade. Em con- traste com as células somáticas de adultos, as células de indivíduos que estão cronologicamente mais próximos da fertilização, como as de em- briões e bebês, exibem juventude celular e têm maior capacidade de resistir a lesões e estresse, para curar, renovar e regenerar órgãos e tecidos. Assim, as composições e métodos direcionados ao rejuvenes- cimento das células, restaurando-as de um estado envelhecido e ma- duro para um estado mais jovem e mais vital, têm sido procurados por muito tempo para tratar certas lesões e doenças, bem como geralmente reverter e prevenir o envelhecimento em organismos inteiros.
[004] Existem dois tipos de informação no corpo: digital e analó- gica. O DNA é uma informação digital e o epigenoma é uma informação analógica. As informações analógicas nunca duram tanto quanto as di- gitais, nem as informações analógicas podem ser copiadas com alta fi- delidade em comparação com as informações digitais. Isso tem conse- quências para o tempo de vida e desenvolvimento dos organismos. O envelhecimento já foi considerado um processo impulsionado por muta- ções no material genético de uma célula. Isso foi amplamente abando- nado como explicação. Acredita-se que uma das principais causas do envelhecimento seja devida às mudanças epigenéticas que fazem com que as células transcrevam os genes errados no momento errado para um funcionamento ideal, um processo que se torna mais disfuncional com o tempo, levando a doenças, incapacidade de cura e, eventual- mente, morte. Os fatores de Yamanaka (OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4) foram anteriormente mostrados para induzir pluripotência in vitro (Taka- hashi et al., Cell. 25 de Agosto de 2006; 126 (4): 663-76) e reverter o relógio de metilação de DNA de envelhecimento (Horvath, Genome Biol. 2013). Nanog e Lin28 podem ajudar a induzir a pluoripotência junto com fatores de Yamanaka. E Tet1, NR5A-2, Sall4, NKX3-1 podem substituir Oct4 (Gao et al., Cell Stem Cell 12, 1-17, 4 de abril de 2013 e Mai et al., Nature Cell Biology 20, 900-908, 2018). A expressão dos quatro fatores de transcrição originais em camundongos transgênicos, no entanto, in- duz teratomas in vivo, juntamente com outras toxicidades agudas, como displasia no epitélio intestinal, que pode matar um animal em poucos dias (Abad et al., Nature. 2013, 17 de outubro; 502 (7471): 340-5). Por- tanto, métodos não tóxicos e eficientes de reprogramação celular são necessários.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[005] Postula-se que o processo de envelhecimento celular é cau- sado pela perda de informações genéticas e epigenéticas. Embora es- tudos anteriores tenham levantado a hipótese de que o envelhecimento é causado principalmente pela perda de informações genéticas (mais comumente na forma de mutações genéticas, como substituições e de- leções no genoma de um organismo), as composições e métodos da presente descrição são informados pelo inesperado descobrir que o en- velhecimento é impulsionado principalmente por uma perda na informa- ção epigenética particular que é estabelecida mais perto da fertilização e diferenciação final de células particulares. Informação epigenética, que comumente assume a forma de modificações covalentes no DNA, como 5-metilcitosina (5mC), hidroximetilcitosina (5hmeC), 5-formilcito- sina (fC) e 5-carboxilcitosina (caC) e metilação de adenina, e para certas proteínas , tal como acetilação de lisina, metilação de lisina e arginina, fosforilação de serina e treonina e ubiquitinação e sumoilação de lisina de proteínas histonas, é algumas vezes referida como a informação "análoga" da célula. A perda dessa informação analógica pode resultar na desregulação de processos celulares vitais, como os processos que mantêm a identidade celular, fazendo com que as células exibam carac- terísticas que são tipicamente associadas ao envelhecimento, como a senescência.
[006] Os métodos, composições e kits da presente descrição reju- venescem as células, prevenindo e revertendo as causas celulares do envelhecimento. Sem estar limitado por uma teoria particular, mais es- pecificamente, os métodos, composições e kits da presente descrição rejuvenescem as células restaurando informações epigenéticas que fo- ram perdidas devido ao processo de envelhecimento, lesão ou doença. As composições de métodos e kits da presente descrição compreendem os fatores de transcrição OCT4, SOX2 e KLF4. OCT4, SOX2 e KLF4 são três dos quatro “Fatores Yamanaka”, sendo o quarto c-Myc. Os Fa- tores Yamanaka têm sido tradicionalmente usados para reprogramar células para um estado pluripotente. Porém, a indução da expressão dos quatro fatores de transcrição em camundongos transgênicos resul- tou na formação de teratomas in vivo, juntamente com outras toxicida- des agudas como displasia no epitélio intestinal, que pode matar o ani- mal em poucos dias. Além disso, o fato de que os quatro fatores de Yamanaka são normalmente usados para reprogramar células para um estado completamente pluripotente, em que a célula perde sua identi- dade celular pré-estabelecida, pode ser perigoso para aplicações in vivo em que a identidade celular das células alvo deve ser mantida por inte- gridade de tecidos e/ou órgãos. Em contraste, em algumas modalida- des, os métodos descritos neste documento permitem a reprogramação incompleta e não resultam em mudanças globais na desmetilação. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento não re- querem desdiferenciação completa das células. Por exemplo, enquanto a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 promoveu a regeneração após lesão em camundongos jovens e velhos e após lesão induzida por vin- cristina em neurônios humanos, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 não induziu uma redução global da metilação do DNA (veja, por exem- plo, FIGs. 45B- 45C).
[007] Em algumas modalidades, os resultados descritos neste do- cumento sugerem que a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 pode per- mitir que as células doentes voltem a um estado mais saudável sem induzir a reprogramação completa. Sem estar limitado por uma teoria particular, os resultados descritos neste documento sugerem que as cé- lulas mantêm um epigenoma de backup que pode ser restaurado usando os métodos descritos neste documento.
[008] Os métodos, composições e kits da presente descrição são em parte informados pela descoberta surpreendente e inesperada de que a indução espacial e temporalmente específica da expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 na ausência da indução da expressão de c-Myc pode rejuvenescer uma célula sem reprogramar a célula para um estado pluripotente. Usando promotores indutíveis, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 pode ser cuidadosamente controlada para diminuir e re- verter as marcas epigenéticas associadas à juventude celular, aumentar as marcas epigenéticas associadas à juventude celular, diminuir a ex- pressão de proteínas relacionadas ao envelhecimento, aumentar a ex- pressão de proteínas associadas com um estado celular jovem, restaura o equilíbrio entre eucromatina e heterocromatina, previne a perda de identidade celular, restaura a identidade celular, revertendo as mudan- ças relacionadas ao envelhecimento na metilação do DNA, rejuvenes- cendo assim a célula sem reprogramar a célula para um estado pluripo- tente.
[009] Assim, em várias modalidades, os métodos da invenção re- juvenescem uma célula, restaurando a identidade celular da célula, re- vertendo os efeitos ou prevenindo uma ou mais vias de desenvolvimento desreguladas. Por exemplo, os métodos: (i) aumentar a abundância de pelo menos um dentre histona H2A, histona H2B, histona H3, histona H4 ou qualquer combinação das mesmas na célula; (ii) aumentar a abundância de pelo menos um de CHAF1a, CHAF1b, HP1α, NuRD ou qualquer combinação dos mesmos na célula; (iii) aumentar pelo menos uma marca de heterocromatina na célula, como por exemplo, H3K9me3, H3K27me3 ou qualquer combina- ção dos mesmos; ou diminuir uma marca de heterocromatina, como H4K20 me3 ou marca de eucromatina H3K4me3; (iv) aumentar/diminuir a metilação do DNA de pelo menos um sítio CpG relacionado à idade na célula em direção ao nível jovem; (v) aumentar a abundância da lâmina B1 na célula; (vi) aumentar a acetilação da histona H3 na lisina 27 (H3K27ac), aumentar a acetilação da histona H3 na lisina 56 (H3K56ac) ou qualquer combinação destas na célula; (vii) diminuir a acetilação da histona H3 na lisina 122 (H3K122Ac) ou da histona H4 na lisina 16 (H4K16ac), ou qualquer com- binação das mesmas na célula; (viii) diminuir a abundância de IL6, Ccl2, Ccl20, Apob, p16, repetições LINE-1, repetições Sat III, elementos Alu, IAP ou qualquer combinação dos mesmos; (ix) restaurar o equilíbrio entre as marcas epigenéticas da eucromatina, como H3K4me3, e as marcas epigenéticas da heterocro- matina, como, por exemplo, H3K9me3 ou H3K27me3; (x) induzir a formação de eucromatina; (xi) restaurar os níveis juvenis de pelo menos uma marca epigenética repressiva de heterocromatina; e/ou (xii) restaurar a expressão de pelo menos um dos genes ci- tados na Tabela 5 para níveis juvenis.
[0010] A presente descrição decorre da descoberta inesperada de que, em algumas modalidades, a expressão precisa de OCT4, SOX2 e KLF4 na ausência de expressão de c-Myc exógeno pode ser usada para promover a reprogramação e regeneração de tecidos in vivo sem toxici- dade aguda. Os vetores de expressão fornecidos neste documento, em certas modalidades, permitem o controle preciso da expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK), incorporação em vírus (por exemplo, vírus adenoassociado (AAV) em um título viral alto (por exemplo, mais de 2 x 1012 partículas por preparação, 1 x 1013 partículas por mL), revertendo o envelhecimento, tratando doenças, incluindo doenças oculares e/ou regeneração de tecidos (por exemplo, regeneração do nervo óptico) in vivo após danos.
[0011] Conforme mostrado na FIG. 14, camundongos com expres- são do transgene induzível de OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) morreram dois dias após a indução da expressão de OSK, devido a displasia cito- lógica e arquitetural generalizada no epitélio intestinal. Uma descoberta semelhante foi relatada em camundongos com transgene de OCT4, SOX2 e KLF4 mais c-Myc (Abad et al., Nature. 17 de Outubro de 2013; 502 (7471): 340-5; Ocampo et al., Cell. 16 de dezembro de 2016; 167: 1719-33). Surpreendentemente, em algumas modalidades, conforme mostrado na FIG.14, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 não causou toxicidade ou câncer in vivo. A expressão contínua (por exemplo, indu- ção por administração de doxiciclina) de OCT4, SOX2 e KLF4 através da liberação de AAV9 (TRE-OSK com UBC-rtTA4) não resultou na for- mação de teratoma in vivo. Nenhum teratoma ou perda de peso corporal foi detectado por três meses quando os vírus AAV9 que codificam esses três fatores de transcrição foram liberados a todo o corpo dos camun- dongos (FIG. 14).
[0012] Por conseguinte, são fornecidos aqui, em certas modalida- des, os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) ca- pazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, agente indutor e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, al- favírus, vacínia vírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) compreen- dendo os mesmos. Os ácidos nucleicos podem codificar OCT4, KLF4 e/ou SOX2. Os ácidos nucleicos podem codificar um fator de transcrição selecionado do grupo que consiste em OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, um nucleico codi- fica dois ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que con- siste em OCT4, KLF4 e SOX2. Em certas modalidades, um ácido nu- cleico codifica OCT4 e SOX2, OCT4 e KLF4. Em certas modalidades, um ácido nucleico codifica SOX2 e KLF4. Em certas modalidades, um nucleico codifica OCT4, KLF4 e SOX2. Em certas modalidades, um ácido nucleico codifica quatro ou mais fatores de transcrição (por exem- plo, OCT4, SOX2, KLF4 e outro fator de transcrição). Em algumas mo- dalidades, a presente descrição fornece ácidos nucleicos que codificam um agente indutor (por exemplo, um agente indutor que é capaz de in- duzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mes- mos). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos codificam uma proteína de fusão Cas9 (ativador CRISPR) e uma sequência de RNA guia direcionada a um promotor ou potencializador no locus endógeno de OCT4, KLF4 e/ou SOX2. Em algumas modalidades, os ácidos nu- cleicos codificam uma proteína de fusão Cas9 (ativador CRISPR) e uma sequência de RNA guia direcionada a um promotor ou potencializador no locus endógeno de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0013] Aspectos da presente descrição também fornecem métodos de regulação da reprogramação celular, promoção da reparação do te- cido, promoção da sobrevivência do tecido, promoção da regeneração do tecido, promoção do crescimento do tecido, regulação da função do tecido, promoção da regeneração do órgão, promoção da sobrevivência do órgão, regulação da função do órgão, tratamento e/ou prevenção do- ença, ou qualquer combinação destes. A regulação pode compreender induzir a reprogramação celular, reverter o envelhecimento, melhorar a função do tecido, melhorar a função do órgão, reparo do tecido, sobre- vivência do tecido, regeneração do tecido, crescimento do tecido, pro- moção da angiogênese, redução da formação de cicatriz, redução do aparecimento de envelhecimento, promoção da regeneração do órgão, promoção da sobrevivência do órgão, alterando o sabor e a qualidade dos produtos agrícolas derivados de animais, o tratamento de uma do- ença, ou qualquer combinação dos mesmos, in vivo ou in vitro.
Os mé- todos podem compreender a administração de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento (por exemplo, DNA e/ou RNA), qualquer uma das proteínas modificadas que codificam KLF4, OCT4, um agente indutor e/ou SOX2, qualquer um dos agentes químicos ati- vadores (por exemplo, induzir a expressão de) OCT4, KLF4, um agente indutor e/ou SOX2, ativação de anticorpos (por exemplo, expressão in- duzida de) OCT4, KLF4, um agente indutor e/ou SOX2 e/ou qualquer um dos vírus recombinantes aqui descritos.
Os métodos podem com- preender a administração de qualquer um dos ácidos nucleicos descri- tos neste documento (por exemplo, DNA e/ou RNA), qualquer uma das proteínas modificadas que codificam KLF4, SOX2, OCT4, ou qualquer combinação dos mesmos, qualquer um dos agentes químicos de ativa- ção (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combina- ção dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus recombinantes aqui des- critos.
Em certas modalidades, os ácidos nucleicos modificados com- preendem DNA e/ou RNA.
O ácido nucleico modificado pode ser um vetor de expressão ou não um vetor de expressão.
Por exemplo, o ácido nucleico modificado pode ser mRNA ou DNA de plasmídeo.
Em certas modalidades, o método compreende ainda a administração de um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente indutor agente e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor.
Por exemplo, o ácido nucleico modificado pode ser mRNA ou DNA de plasmídeo.
[0014] Um aspecto da presente descrição fornece vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo um primeiro ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, um segundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica SOX2, um terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4, sozinho ou em combinação e na ausên- cia de um ácido nucleico exógeno (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) capaz de expressar c-Myc. Em certas modalidades, um vetor (por exemplo, vetor de expressão) compreendendo um primeiro ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, um segundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica SOX2, um terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o primeiro, o segundo e o terceiro ácidos nu- cleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) estão presentes em vetores de expressão separados. Em certas modalidades, dois do pri- meiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nuclei- cos modificados) estão presentes no mesmo vetor de expressão. Em algumas modalidades, todos os três ácidos nucleicos (por exemplo, áci- dos nucleicos modificados) estão presentes no mesmo vetor de expres- são. Em certas modalidades, a sequência que codifica OCT4 é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 2 ou 41. Em certas modali- dades, a sequência que codifica SOX2 é pelo menos 70 % (por exem- plo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 4 ou 43. Em certas modalidades, a sequência que codifica KLF4 é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 6 ou 45. Em certas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é uma proteína humana. Em certas modalidades, OCT4,
SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é uma proteína não humana (por exemplo, mamíferos (por exemplo, primatas (por exemplo, macacos cinomolgo, macacos reso); mamíferos comercialmente rele- vantes, como gado, porcos, cavalos, ovelhas, cabras, gatos e/ou cães) e pássaros (por exemplo, pássaros comercialmente relevantes, como galinhas, patos, gansos e/ou perus). Se dois ou mais de OCT4, SOX2 e KLF4 estiverem em um vetor, eles podem estar em qualquer ordem. As palavras "primeiro", "segundo" e "terceiro" não significam uma ordem dos genes no vetor.
[0015] Um vetor de expressão da presente descrição pode compre- ender ainda um promotor induzível. Um vetor de expressão pode ter apenas um promotor induzível. Em tais casos, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 estão sob o controle do mesmo promotor induzível. Em alguns casos, um vetor de expressão compreende mais de um promotor induzível. O promotor induzível pode compreender um elemento res- ponsivo à tetraciclina (TRE) (por exemplo, um promotor TRE3G, um pro- motor TRE2 ou um promotor à prova de P), promotores responsivos à mifepristona (por exemplo, promotor GAL4-E1b) ou um responsivo à cu- mermicina). Como um exemplo, um promotor TRE (por exemplo, TRE3G) pode compreender uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo menos 70 % (por exem- plo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 7. Como um exemplo, um promotor TRE (por exemplo, TRE2) pode compreender uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 23. Como um exemplo, um TRE (por exemplo, à prova de P) promotor pode compreender uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98
%, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 24. Veja, por exemplo, Pedido Provisório Norte-americano, USSN 62/738.894, intitulado MUTANT RE-
VERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES, que foi arquivado em 28 de setembro de 2018, sob o nú- mero do processo do procurador H0824.70300US00, e o Pedido de Pa- tente Internacional intitulado MUTANT REVERSE TETRACYCLINE
TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION H0824.70300WO00, que foi apresentado no mesmo dia que o pedido instantâneo, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0016] Em certas modalidades, um agente indutor é capaz de indu- zir a expressão do primeiro (por exemplo, OCT4), segundo (por exem- plo, SOX2), terceiro (por exemplo, KLF4) ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados), ou qualquer combinação dos mesmos a partir do promotor induzível na presença de uma tetraciclina (por exem- plo, doxiciclina). Em certas modalidades, o agente indutor é um transa- tivador controlado por tetraciclina reversa (rtTA) (por exemplo, M2-rtTA, rtTA3 ou rtTA4). Em certas modalidades, o rtTA é rtTA3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica para SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o rtTA é rtTA4 e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o rtTA é M2-rtTA e compre- ende uma sequência que é pelo menos 70 % % (por exemplo, pelo me- nos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 15.
[0017] Em certas modalidades, um agente indutor é capaz de indu- zir a expressão da expressão do primeiro ácido nucleico (por exemplo,
ácido nucleico modificado) (por exemplo, OCT4), segundo ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, SOX2), terceiro ácido nucleico (por exemplo, KLF4), ou qualquer combinação destes a partir do promotor induzível na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina). Em certas modalidades, o agente indutor é um transativador controlado por tetraciclina (tTA).
[0018] Em certas modalidades, um vetor de expressão da presente descrição compreende um promotor constitutivo (por exemplo, CP1, CMV, EF1 alfa, SV40, PGK1, Ubc, beta actina humana, CAG, Ac5, po- liedrina, TEF1, GDS, CaM3 5S, Ubi, Promotor H1 e U6). Um promotor constitutivo pode ser operacionalmente ligado a sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codificam OCT4, KLF4, SOX2, um agente indutor ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um vetor de expressão compreende um promo- tor constitutivo. Em algumas modalidades, um vetor de expressão com- preende mais de um promotor constitutivo.
[0019] Em certas modalidades, um vetor de expressão da presente descrição compreende uma sequência terminadora derivada de SV40. Em certas modalidades, a sequência derivada de SV40 é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 8
[0020] Em certas modalidades, um vetor de expressão da presente descrição compreende uma sequência separadora, que pode ser útil na produção de duas sequências de aminoácidos separadas a partir de um transcrito. A sequência separadora pode codificar um peptídeo autocli- vável (por exemplo, peptídeo 2A, incluindo uma sequência de peptídeo 2A que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 9). Em certas modalidades, a sequência separadora é um Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES).
[0021] Em certas modalidades, o vetor de expressão é um vetor vi- ral (por exemplo, um vetor lentiviral, retroviral ou de vírus adenoassoci- ado (AAV)) (por exemplo, FIGS. 2-3). Um vetor AAV da presente des- crição geralmente compreende repetições terminais invertidas (ITRs) flanqueando um transgene de interesse (por exemplo, um ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, SOX2, KLF4, um agente indutor ou uma combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, a distância entre duas repetições terminais inver- tidas é inferior a 5,0 quilobases (kb) (por exemplo, inferior a 4,9 kb, in- ferior a 4,8 kb, inferior a 4,7 kb, inferior a 4,6 kb, inferior a 4,5 kb, inferior a 4,4 kb, inferior a 4,3 kb, inferior a 4,2 kb, inferior a 4,1 kb, inferior a 4 kb, inferior a 3,5 kb, inferior a 3 kb, inferior a 2,5 kb, inferior a 2 kb, inferior a 1,5 kb, inferior a 1 kb ou inferior a 0,5 kb).
[0022] Em certas modalidades, um vetor de expressão (por exem- plo, um vetor de expressão que codifica OCT4, KLF4, SOX2, um agente indutor ou uma combinação dos mesmos) da presente descrição pode compreender ainda um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico, incluindo blasticidina, geneticina, higromicina B, ácido micofenólico, pu- romicina, zeocina, actinomicina D, ampicilina, carbenicilina, canamicina e neomicina) e/ou marcador detectável (por exemplo, GFP, RFP, lucife- rase, CFP, mCherry, DsRed2FP, mKate, biotina, marcador FLAG, mar- cador HA, marcador His, marcador Myc, marcador V5, etc.).
[0023] Em algumas modalidades, o vetor de expressão (por exem- plo, vetor viral) que codifica OCT4, KLF4 e SOX2 compreende a se- quência fornecida na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO:
121. Em algumas modalidades, o vetor de expressão que codifica OCT4, KLF4 e SOX2 compreende os elementos representados na FIG. 2, FIG. 3, FIGS. 4A-4AL, FIGS. 5A-5D, ou uma combinação dos mes- mos. Os vetores virais incluem vetores de vírus adenoassociados (AAV), vetores retrovirais, vetores lentivirais e vetores virais de herpes.
[0024] Em outro aspecto, a presente descrição fornece vírus recom- binantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, vírus do her- pes, alfavírus, vírus da vacínia ou vírus adenoassociado (AAV)) com- preendendo qualquer um dos vetores de expressão aqui descritos. Em certas modalidades, um vírus recombinante codifica um fator de trans- crição selecionado de OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, um vírus recombinante codifica dois ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4, KLF4 e SOX2. Em certas modalidades, um vírus recombi- nante codifica OCT4 e SOX2, OCT4 e KLF4, OCT4, KLF4 e SOX2 ou SOX2 e KLF4. Em certas modalidades, um vírus recombinante codifica OCT4, KLF4 e SOX2. Em certas modalidades, quatro ou mais fatores de transcrição codificam quatro ou mais fatores de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 e outro fator de transcrição).
[0025] Em ainda outro aspecto, a presente descrição fornece méto- dos de regulação (por exemplo, indução) da reprogramação celular, re- paro de tecidos, regeneração de tecidos, regeneração de órgãos, rever- são de envelhecimento ou qualquer combinação dos mesmos compre- endendo a administração a uma célula de um primeiro ácido nucleico (por exemplo, nucleico modificado ácido) que codifica OCT4, um se- gundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que co- difica SOX2 e um terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4 na ausência de um ácido nucleico exó- geno (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de expressar c- Myc. Em certas modalidades, o primeiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, o segundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica SOX2 e o terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4 é administrado a um tema. O indivíduo pode ser humano ou não humano. Indivíduos não humanos incluem, por exemplo, mamíferos
(por exemplo, primatas (por exemplo, macacos cinomolgo, macacos reso); mamíferos comercialmente relevantes, como gado, porcos, cava- los, ovelhas, cabras, gatos e/ou cães) e pássaros (por exemplo, pássa- ros comercialmente relevantes, como galinhas, patos, gansos e/ou pe- rus). Em certas modalidades, os três ácidos nucléicos (por exemplo, áci- dos nucléicos modificados) são administrados simultaneamente. Em certas modalidades, os três ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nu- cleicos modificados) são administrados simultaneamente no mesmo ve- tor.
[0026] Em ainda outro aspecto, a presente descrição fornece méto- dos de regulação (por exemplo, indução) da reprogramação celular, re- paro de tecidos, regeneração de tecidos, regeneração de órgãos, rever- são de envelhecimento ou qualquer combinação dos mesmos compre- endendo a administração a uma célula de um primeiro ácido nucleico (por exemplo, nucleico modificado ácido) que codifica OCT4, um se- gundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que co- difica SOX2, um terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o primeiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, o segundo ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica SOX2, o terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4, ou qualquer combinação dos mesmos é administrado a um indivíduo.
[0027] O vetor de expressão compreendendo um ou mais dentre o primeiro, o segundo e o terceiro ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) pode ser qualquer um dos vetores de expressão descritos acima e aqui. Em algumas modalidades, o primeiro ácido nu- cleico, o segundo ácido nucleico, o terceiro ácido nucleico ou qualquer combinação dos mesmos estão presentes em vetores de expressão se-
parados. Em certas modalidades, dois do primeiro ácido nucleico, o se- gundo ácido nucleico, o terceiro ácido nucleico ou qualquer combinação dos mesmos estão presentes no mesmo vetor de expressão. Em certas modalidades, todos os três ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nu- cleicos modificados) estão presentes no mesmo vetor de expressão. Em certas modalidades, pelo menos dois do primeiro, segundo ou terceiro ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor. Em certas modalidades, todos os três do primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor.
[0028] Em algumas modalidades, o vetor de expressão (por exem- plo, vetor de expressão viral, incluindo vetores virais lentivirais, retrovi- rais, adenoassociados) compreende um promotor induzível (por exem- plo, um promotor compreendendo um elemento responsivo à tetraciclina (TRE) incluindo uma sequência TRE3G, uma sequência TRE2, ou uma sequência à prova de P), e o método compreende ainda a administração de um agente indutor (por exemplo, um agente químico, um ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um indutor agente), uma proteína, luz ou temperatura). Em algumas modalidades, um pH é usado para induzir a expressão de um ácido nucleico operaci- onalmente ligado a um promotor. Em certas modalidades, um agente químico capaz de modular a atividade de um agente indutor é a tetraci- clina (por exemplo, doxiciclina). Como um exemplo não limitante, o tran- sativador controlado por tetraciclina (tTA) é um agente indutor cuja ati- vidade é inibida pela tetraciclina. Como um exemplo não limitante, o transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA) é um agente in- dutor cuja atividade é ativada pela tetraciclina. O agente indutor (por exemplo, rtTA ou tTA) pode ser codificado por um quarto ácido nucleico
(por exemplo, ácido nucleico modificado) que é administrado com ácido nucleico. Em certas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um agente químico, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) (por exemplo, um ácido nucleico compreendendo RNA e/ou DNA que codifica um agente indutor), uma proteína, luz, um pH particular, ou temperatura) é introduzido simultaneamente com os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, SOX2 e KLF4. Em certas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um agente químico, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) (por exemplo, um ácido nucleico compreendendo RNA e/ou DNA que codifica um agente indutor), uma proteína, luz, um pH particu- lar, ou temperatura) é introduzido simultaneamente com os ácidos nu- cleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam um ou mais (por exemplo, dois ou mais ou três ou mais) fatores de transcri- ção selecionados de OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos. Um promotor (por exemplo, promotor constitutivo, incluindo CAG e Ubc, ou um promotor induzível) pode ser operacionalmente li- gado ao ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica o agente indutor. Em certas modalidades, o promotor operacio- nalmente ligado ao ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) que codifica o agente indutor é um promotor específico de tecido.
[0029] Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica o agente indutor está presente no mesmo vetor de expressão que pelo menos um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação disso. Em certas modalidades, o ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica o agente indutor está presente em um vetor de expressão separado do ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) SOX2 , e o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica KLF4. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, SOX2 e KLF4 estão pre- sentes em um primeiro vetor de expressão e o quarto ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) está presente em um segundo vetor de expressão.
[0030] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica OCT4, SOX2, KLF4 e/ou um agente indutor não está presente em um vetor viral. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um ou mais (por exemplo, dois ou mais ou três ou mais) fatores de trans- crição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos não estão presentes em um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é liberado sem um ve- tor viral. Em algumas modalidades, a liberação do ácido nucleico que não está em um vetor viral compreende a administração de um ácido nucleico nu, eletroporação, uso de uma nanopartícula e/ou uso de um lipossoma.
[0031] Os vetores de expressão podem ser vetores virais (por exemplo, vetores de lentivírus, vetores de adenovírus, vetores de retro- vírus, vetores de herpes vírus, alfavírus, vírus da vacínia ou vetores AAV). Por exemplo, o primeiro vetor de expressão que codifica OCT4, SOX2 e KLF4 pode compreender a sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) apresentada na SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o vetor de expressão que codifica um agente indutor compreende a sequência fornecido na SEQ ID NO: 17 (por exemplo, FIG. 12), SEQ ID NO: 31 (por exemplo, FIG. 18) ou SEQ ID NO: 32 (por exemplo, FIG. 19).
[0032] Em certas modalidades, o quarto ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) que codifica o agente de indução com- preende ainda uma sequência terminadora derivada de SV-40, incluindo uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 8.
[0033] Em certas modalidades, o agente indutor é capaz de induzir a expressão do promotor induzível na presença de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina). Em certas modalidades, o agente indutor é rtTA (por exemplo, rtTA3, incluindo rtTA3 com uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 11, e rtTA4, incluindo rtTA4 com uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 13). Em certas modalidades, o método compreende ainda a administração de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) à célula, tecido ou indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende a remoção de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) da célula, tecido ou indivíduo.
[0034] Em certas modalidades, o agente indutor é capaz de induzir a expressão do promotor induzível na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina). Em certas modalidades, o agente indutor é um transativador de tetraciclina (tTA). Sem ser limitada por uma teoria par- ticular, a tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) pode se ligar ao tTA e impedir que o tTA se ligue ao seu promotor cognato (por exemplo, um promotor compreendendo um elemento de resposta à tetraciclina (TRE)) e direcionar a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Sem ser limitado por uma teoria particular, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor pode não estar no mesmo vetor que qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, KLF4 e SOX2 para reduzir o tamanho de um vetor viral e melhorar o título viral.
[0035] Em certas modalidades, um ou mais vetores de expressão (por exemplo, AAV compreendendo um vetor de expressão) é adminis- trado a uma célula, tecido ou um indivíduo em necessidade. O indivíduo pode ter uma lesão ou condição, é suspeito de ter uma condição ou lesão, ou está em risco de sofrer uma condição ou lesão. Sem estar limitado por uma teoria particular, a expressão dos fatores de transcri- ção OCT4, SOX2 e KLF4 induz a reprogramação celular. Em algumas modalidades, quando o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mes- mos está operacionalmente ligado a um promotor induzível, a adminis- tração de um agente indutor (por exemplo, um produto químico, uma proteína, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) que codifica um agente indutor) sob as condições apropriadas (por exemplo, na presença ou ausência de tetraciclina). Em certas mo- dalidades, um agente indutor (por exemplo , rtTA) é capaz de se ligar a um promotor e direcionar a expressão de um ácido nucleico operacio- nalmente ligado (por exemplo, ácido nucleico modificado) apenas quando o agente indutor está ligado a tetraciclina. Em certas modalida- des, um agente indutor (por exemplo, tTA) não pode se ligar a um pro- motor e direcionar a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado (por exemplo, ácido nucleico modificado) quando o agente indu- tor é ligado à tetraciclina. A condição pode ser uma doença ocular (por exemplo, uma doença retinal, uma doença da córnea ou qualquer do- ença afetando o olho), câncer, envelhecimento, uma doença relacio- nada à idade, lesão ou uma doença neurodegenerativa. Em certas mo- dalidades, a célula ou tecido é do olho, ouvido, nariz, boca, incluindo goma e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, es- tômago, esôfago, músculo, incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele, incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino.
[0036] Em certas modalidades, o tecido está danificado (por exem- plo, devido a uma lesão, um acidente ou uma lesão iatrogênica) e/ou é um tecido envelhecido. Em certas modalidades, o tecido pode ser con-
siderado saudável, mas abaixo do ideal para desempenho ou sobrevi- vência nas condições atuais ou futuras (por exemplo, na agricultura ou em condições adversas, incluindo terapias tóxicas, exposição ao sol ou viagens para fora da atmosfera terrestre).
[0037] Em certas modalidades, o método compreende ainda a re- gulação de um processo biológico. Em algumas modalidades, os méto- dos descritos neste documento compreendem a regulação de qualquer processo biológico, incluindo reprogramação celular, reparo de tecido, sobrevivência de tecido, regeneração de tecido, crescimento de tecido, função de tecido, regeneração de órgão, sobrevivência de órgão, função de órgão ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalida- des, os métodos compreendem induzir a reprogramação celular, rever- tendo o envelhecimento, melhorando a função do tecido, melhorando a função do órgão, promovendo a reparação do tecido, promovendo a so- brevivência do tecido, promovendo a regeneração do tecido, promo- vendo o crescimento do tecido, promovendo a angiogênese, reduzindo a formação de cicatriz, reduzindo o aparecimento de envelhecimento incluindo alopecia, enfraquecimento do cabelo, cabelo grisalho, flacidez da pele e rugas da pele, promovendo a regeneração de órgãos, promo- vendo a sobrevivência de órgãos, alterando o sabor e a qualidade de produtos agrícolas derivados de animais, tratando uma doença ou qual- quer combinação destes, in vivo ou in vitro. Por exemplo, o método pode induzir a reprogramação celular, sobrevivência celular, regeneração de órgão, regeneração de tecido ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o método compreende induzir e, em seguida, inter- romper a reprogramação celular, sobrevivência celular, regeneração de tecido, regeneração de órgão, envelhecimento ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o método reverte o envelhecimento de uma célula, tecido, órgão ou indivíduo. Em algumas modalidades, o método não induz a formação de teratoma. Em algumas modalidades,
o método não induz a proliferação celular indesejada. Em algumas mo- dalidades, o método não induz o crescimento de células malignas. Em algumas modalidades, o método não induz câncer. Em algumas moda- lidades, o método não induz o crescimento do tumor ou a formação do tumor. Em algumas modalidades, o método não induz glaucoma.
[0038] Em algumas modalidades, um método aqui descrito reverte o relógio epigenético de uma célula, um tecido, um órgão, um indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o re- lógio epigenético é determinado usando um estimador de idade base- ado em metilação de DNA (DNAm). Em algumas modalidades, o mé- todo altera a expressão de um ou mais genes associados ao envelheci- mento. Em algumas modalidades, o método reduz a expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento. Em algumas modalida- des, o método altera a expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento. Em algumas modalidades, um ou mais genes são um ou mais genes sensoriais.
[0039] Em algumas modalidades, o método reduz a expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento. Em algumas moda- lidades, o método reduz a expressão de 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356, Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722,
Gm45516, Gm45532, Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Prickle2, Qsox1, Rapgef4os2, Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1, Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech, Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Slitrk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o mé- todo reduz a expressão de Ace, Kcnk4, Lamc3, Edn1, Syt10, Ngfr, Gprc5c, Cd36, Chrna4, Ednrb, Drd2, ou uma combinação dos mesmos.
[0040] Em algumas modalidades, o método aumenta a expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento. Em algumas mo- dalidades, o método aumenta a expressão de 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik, 4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik, Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248,
Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025, Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648, Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124, Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263, Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706, Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113,
Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o mé- todo aumenta a expressão de Olfr816, Olfr812, Olfr1264, Olfr727, Olfr923, Olfr1090, Olfr328, Olfr1124, Olfr522, Olfr1082, Olfr1206, Olfr1167, Olfr706, Olfr6, Pou3f4, Olfr603, Olfr127, Olfr1263, Olfr1269, Olfr1205, Olfr390, Olfr601, Olfr860, Olfr215, Olfr741, Olfr1469, Olfr355, Olfr481, Olfr456, Olfr1042, Olfr728, Olfr372, Olfr801, Olfr1223, Olfr822, Otogl, Olfr943, Olfr1406, Olfr273, Olfr466, Olfr1043, Olfr427, Olfr890, Rbp4, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0041] Outros aspectos da descrição se referem a métodos de re- programação que compreendem o rejuvenescimento do relógio epige- nético de uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos.
[0042] Outros aspectos da descrição se referem a métodos de re- programação que compreendem alterar a expressão de um ou mais ge- nes associados ao envelhecimento.
[0043] Outros aspectos da descrição se referem a métodos que compreendem a redefinição do perfil transcricional de uma célula velha, um órgão antigo, um tecido antigo e/ou qualquer combinação dos mes- mos in vitro.
[0044] Outros aspectos da descrição se referem a métodos que compreendem a redefinição do perfil transcricional de uma célula velha, um órgão antigo, um tecido antigo, um indivíduo antigo e/ou qualquer combinação destes in vivo.
[0045] Outros aspectos da descrição se referem a métodos de transdiferenciação de células.
[0046] Outro aspecto da presente descrição fornece células modifi- cadas geradas por qualquer um dos métodos descritos neste docu- mento. Os métodos descritos neste documento podem ser úteis na pro-
dução de qualquer célula modificada, incluindo células-tronco pluripo- tentes induzidas. As células modificadas da presente descrição podem ser produzidas ex vivo, e os métodos podem compreender ainda a ge- ração de um tecido modificado ou órgão modificado. Em algumas mo- dalidades, os métodos da presente descrição compreendem a adminis- tração de uma célula modificada, tecido modificado e/ou órgão modifi- cado da presente descrição a um indivíduo em necessidade. Em algu- mas modalidades, o método compreende ainda o tratamento de uma doença.
[0047] Aspectos da presente descrição também fornecem composi- ções compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir OCT4, KLF4, agente indutor e/ou expressão de SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), qualquer uma das proteínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, um agente indutor e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, um agente indutor e/ou SOX2, e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente descrição compreendem ainda um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende ainda um segundo ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão incluindo vetor viral) que codifica um agente indutor (por exemplo, rtTA ou tTA).
[0048] Aspectos da presente descrição também fornecem composi- ções compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir OCT4, KLF4 e/ou SOX2
(por exemplo, vetor de expressão, incluindo um vetor de expressão in- duzível), qualquer um dos proteínas modificadas aqui descritas, qual- quer um dos agentes químicos capazes de ativar (por exemplo, induzir a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos capazes de ativar (por exemplo, induzir a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação. Em algu- mas modalidades, a composição compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indu- tor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente indutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente descrição compreendem ainda um transportador farmaceuti- camente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêu- tica compreende ainda um segundo ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão incluindo vetor viral) que codifica um agente indutor (por exemplo, rtTA ou tTA).
[0049] Aspectos da presente descrição também fornecem composi- ções compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; SOX2; KLF4; e qualquer combinação dos mesmos, qualquer uma das proteínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos e/ou qual- quer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui des- critos, sozinhos ou em combinação.
Em certas modalidades, uma com- posição compreende qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de dois ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; SOX2; KLF4; e qualquer combinação dos mesmos, qualquer uma das proteínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) duas ou mais transcrições selecionadas do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer um dos anticor- pos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) dois ou mais fa- tores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, so- zinhos ou em combinação.
Os dois ou mais fatores de transcrição po- dem compreender OCT4 e SOX2, OCT4 e KLF4, OCT4, KLF4 e SOX2 ou SOX2 e KLF4. Em certas modalidades, uma composição compre- ende qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a ex- pressão de três ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4, SOX2, KLF4 e suas combinações de expressão, qualquer um de as pro- teínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) três ou mais transcri- ções selecionadas do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) três ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação. Em certas modalidades, os três ou mais fatores de transcrição podem compreender OCT4, SOX2 e KLF4. Em algumas mo- dalidades, uma composição farmacêutica compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) que codifica um agente indutor (por exemplo, rtTA ou tTA), qualquer uma das proteínas modificadas que codificam um agente indutor, qualquer um dos agentes químicos capazes de ativar (por exemplo, induzir a expressão de) um agente indutor e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) que codificam um agente indutor. Em algumas modalidades, as composições farmacêuti- cas da presente descrição compreendem ainda um transportador far- maceuticamente aceitável.
[0050] Em ainda outro aspecto, a presente descrição fornece kits que compreendem qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir OCT4, KLF4, agente indutor e/ou expressão de SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), qualquer uma das proteínas modificadas aqui descrito, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, um agente indutor e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, um agente indutor, e/ou SOX2 e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos.
[0051] Em ainda outro aspecto, a presente descrição fornece kits compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), qualquer uma das prote- ínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes químicos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, e/ou qualquer um dos vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente in- dutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor.
[0052] Em ainda outro aspecto, a presente descrição fornece kits que compreendem qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combina- ções dos mesmos, qualquer uma das proteínas modificadas aqui des- critas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, indu- zindo a expressão de) um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combina- ções dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combina- ções dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos. Em certas modalidades, um kit compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) (por exemplo, vetor de expressão) que codifica um agente in-
dutor (por exemplo, rtTA ou tTA), qualquer uma das proteínas modifica- das que codificam um agente indutor, qualquer um dos agentes quími- cos capazes de ativar (por exemplo, induzindo a expressão de) um agente indutor e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) que codifica um agente indutor.
[0053] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados neste documento. Outras características, objetivos e van- tagens da invenção serão evidentes a partir da Descrição Detalhada, Exemplos, Figuras e Reivindicações.
[0054] As referências citadas neste pedido são aqui incorporadas por referência.
DEFINIÇÕES
[0055] As definições de termos específicos são descritas em mais detalhes abaixo. A descrição não se destina a ser limitada de qualquer maneira pela listagem exemplar de substituintes aqui descritos.
[0056] "AAV" ou "vírus adenoassociado" é um vírus sem envelope que é capaz de transportar e liberar ácidos nucleicos (por exemplo, áci- dos nucleicos modificados) (por exemplo, ácidos nucleicos (por exem- plo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos) e pertence ao gênero Dependo- parvovirus. Em alguns casos, um AAV é capaz de distribuir um ácido nucleico que codifica um agente indutor. Em geral, o AAV não se integra ao genoma. As capacidades de direcionamento específico de tecido de AAV são frequentemente determinadas pelo sorotipo de capsídeo de AAV (veja, por exemplo, Tabela 1 abaixo para exemplos de sorotipos de AAV e sua utilidade na distribuição específica de tecido). Os soroti- pos não limitantes de AAV incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e suas variantes. Em certas modalidades, o sorotipo AAV é uma variante de AAV9 (por exemplo,
AAV PHP.b).
[0057] Um "vírus recombinante" é um vírus (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, herpes vírus, alfavírus, vírus da vacínia ou vírus adenoassociado (AAV))) que foi isolado de seu ambiente natural (por exemplo, de uma célula hospedeira, tecido ou um indivíduo) ou é pro- duzido artificialmente.
[0058] O termo "vetor AAV", quando aqui usado, é um ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que compreende repe- tições terminais invertidas (ITRs) de AAV flanqueando um cassete de expressão (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, KLF4 e SOX2, cada um sozinho ou em combinação, ou um cas- sete de expressão que codifica rtTA ou tTA). Um vetor AAV pode com- preender ainda uma sequência promotora.
[0059] Os termos "administrar", "administrar" ou "administração", conforme usados neste documento, referem-se à introdução de qual- quer uma das composições aqui descritas, qualquer um dos ácidos nu- cleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir OCT4, KLF4 e/ou expressão de SOX2 (por exemplo, vetor de expres- são), qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a ex- pressão de um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer uma das proteínas modificadas aqui descritas, qual- quer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos agentes quími- cos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) um ou mais fato- res de transcrição selecionados de OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação com qualquer célula, tecido, órgão e/ou assunto.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente indutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor também é adminis- trado à célula, tecido, órgão e/ou indivíduo.
Qualquer uma das compo- sições aqui descritas, compreendendo qualquer um dos ácidos nuclei- cos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir a expres- são de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), com- preendendo qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nu- cleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; KLF4; SOX2; e quaisquer combinações dos mesmos, qualquer uma das proteínas modificadas aqui descritas, qualquer um dos agentes quími- cos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer uma das proteínas modificadas que codificam OCT4, SOX2, KLF4 ou quaisquer combinações deste, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou qualquer um dos vírus recombinantes
(por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retroví- rus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combina- ção podem ser administrados intravenosamente, intradermicamente, in- tra-arterialmente, intralesionalmente, intratumoralmente, intracraniana- mente, intra-articularmente, intraprostaticalmente, intrapleuralmente, in- tranasalmente, intravitreamente, intravaginalmente, intrarretalmente, to- picamente, intratumoralmente, intramuscularmente, intraperitoneal- mente, subcutaneamente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosalmente, intrapericadialmente, intraumbilicalmente, intraocular- mente, oralmente, topicamente, localmente, sistemicamente, injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada, banhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter, em cremes, em composições lipí- dicas (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer com- binação dos anteriores, como seria conhecido por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), incorporado aqui por referência). Em algumas modalidades, uma composição que compreende um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente in- dutor, e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor tam- bém é administrado à célula, tecido, órgão e/ou indivíduo é administrado usando qualquer método adequado.
[0060] O termo "epigenoma" ou "epigenética" refere-se à modifica- ção e mudanças estruturais dentro de uma célula que controlam a ex- pressão de ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifica- dos) ou informações genômicas em uma célula. Mudanças no epige- noma ocorrem durante e conduzem os processos de desenvolvimento embrionário, progressão da doença e envelhecimento.
[0061] O termo "relógio epigenético" pode se referir a um estimador de idade ou um processo biológico inato. Em algumas modalidades, re- juvenescer ou reverter o relógio epigenético refere-se à redução da idade estimada de uma célula, tecido, órgão ou indivíduo. O relógio epi- genético pode ser parcial ou totalmente revertido ou rejuvenescido por qualquer um dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, um estimador de idade é um estimador de idade epigenética. Por exemplo, um estimador de idade epigenética pode ser conjuntos de dinucleotí- deos CpG que, quando usados em combinação com um algoritmo ma- temático, podem ser usados para estimar a idade de uma fonte de DNA, incluindo células, órgãos ou tecidos. Em algumas modalidades, um es- timador de idade é um estimador de idade baseado em metilação de DNA (DNAm). Em algumas modalidades, um estimador de idade de DNAm é calculado como uma correlação de idade usando o coeficiente de correlação de Pearson r, entre idade baseada na metilação do DNA (DNam) (também conhecida como idade estimada) e idade cronológica. Em algumas modalidades, o estimador de idade baseado em metilação de DNA (DNAm) é um estimador de idade baseado em metilação de DNA de tecido único. Em algumas modalidades, o estimador de idade baseado em metilação de DNA é um estimador de idade baseado em metilação de DNA de vários tecidos. Em algumas modalidades, o esti- mador de idade DNAm é DNAm PhenoAge. Veja, por exemplo, Horvath e Raj, Nat Rev Genet. Junho de 2018; 19 (6): 371-384; Levine et al., Aging (Albany NY). 18 de abril de 2018; 10 (4): 573-591; e os exemplos abaixo.
[0062] "Informação epigenética", quando aqui usado, inclui modifi- cações covalentes ao DNA, como 5-metilcitosina (5mC), hidroximetilci- tosina (5hmeC), 5-formilcitosina (fC) e 5-carboxilcitosina (caC), e para certas proteínas, como a lisina acetilação, metilação de lisina e arginina, fosforilação de serina e treonina e ubiquitinação e sumoilação de prote- ínas histonas e a arquitetura 3D das células, incluindo TADs (domínios topologicamente associados) e compartimentos. As informações epige- néticas às vezes são chamadas de informações "analógicas" da célula.
[0063] "Restaurar a expressão" de pelo menos um gene na Tabela 5 para níveis juvenis destina-se a incluir o aumento da expressão de um gene regulado negativamente ou a diminuição da expressão de um gene regulado positivamente que muda durante o envelhecimento.
[0064] Quando aqui usado, o termo "célula" se destina não apenas a incluir uma célula individual, mas também se refere ao tecido ou órgão específico do qual se origina.
[0065] O termo "senescência celular" refere-se a uma célula que saiu do ciclo celular, exibe marcadores epigenéticos consistentes com senescência ou expressando marcadores celulares de senescência (por exemplo, beta-galactosidase associada à senescência ou citocinas in- flamatórias). A senescência celular pode ser parcial ou completa.
[0066] O termo "expressão gênica" refere-se ao grau em que certos genes ou todos os genes em uma célula ou tecido são transcrições em RNA. Em alguns casos, o RNA é traduzido pela célula em uma proteína. O epigenoma dita os padrões de expressão gênica.
[0067] O termo "reprogramação celular" refere-se ao processo de alteração do epigenoma de uma célula usando fatores de reprograma- ção (por exemplo, reverter ou prevenir alterações epigenéticas em cé- lulas que são causas de disfunção, deterioração, morte celular, senes- cência ou envelhecimento). A reprogramação celular pode ser uma re- programação completa, de modo que uma célula diferenciada (por exemplo, célula somática) seja reprogramada para uma célula-tronco pluripotente. A reprogramação celular pode ser incompleta, de modo que uma célula diferenciada (por exemplo, célula somática) retém sua identidade celular (por exemplo, célula-tronco específica de linhagem). A reprogramação celular pode ser incompleta, por exemplo, uma célula-
tronco não é criada, de modo que uma célula é rejuvenescida ou as- sume atributos mais jovens (por exemplo, maior sobrevivência, redução da inflamação ou capacidade de se dividir). A reprogramação celular pode fornecer funções celulares adicionais ou prevenir o envelheci- mento celular (por exemplo, transdiferenciação ou transição para a se- nescência celular). A reprogramação celular pode induzir mudanças temporárias ou permanentes na expressão gênica. Em algumas moda- lidades, a reprogramação celular incompleta é mostrada pela falta de expressão Nanog. Em algumas modalidades, a reprogramação celular evita que a senescência ocorra.
[0068] O termo "rejuvenescer uma célula", quando aqui usado, pre- tende incluir a prevenção ou reversão das causas celulares do envelhe- cimento sem induzir um estado pluripotente. Uma célula rejuvenescida, quando aqui usada, inclui, por exemplo, uma célula ganglionar retinal que expressa RBPMS e/ou Brn3a.
[0069] Um "estado pluripotente", quando aqui usado, pretende in- cluir um estado em que a célula expressa pelo menos um marcador de célula-tronco, tal como, mas não se limitando a Esrrb, Nanog, Lin28, TRA-1-60/TRA-1-81/TRA -2-54, SSEA1 ou SSEA4. Os métodos de me- dição da expressão de marcadores de células-tronco na célula são co- nhecidos na técnica e incluem os métodos aqui descritos.
[0070] O termo "transdiferenciação" se refere a um processo no qual um tipo de célula é alterado para outro tipo de célula sem entrar em um estado pluripotente. A transdiferenciação também pode ser referida como reprogramação de linhagem ou conversão de linhagem. Veja, por exemplo, Cieślar-Pobuda et al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. Ju- lho de 2017; 1864 (7): 1359-1369, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0071] Os termos “condição”, “doença” e “distúrbio” são usados in-
distintamente. Exemplos não limitantes de condições, doenças e distúr- bios incluem lesões agudas, doenças neurodegenerativas, doenças crô- nicas, doenças proliferativas, doenças cardiovasculares, doenças gené- ticas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças neurológi- cas, doenças hematológicas, condições dolorosas, distúrbios psiquiátri- cos, distúrbios metabólicos, doenças crônicas, cânceres, envelheci- mento, doenças relacionadas à idade e doenças que afetam qualquer tecido em um indivíduo. Por exemplo, as condições relacionadas à idade incluem insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral, doença cardíaca, aterosclerose, doenças neurodegenerativas (por exemplo, do- ença de Parkinson e doença de Alzheimer), declínio cognitivo, perda de memória, diabetes, osteoporose, artrite, perda muscular, perda auditiva (parcial ou total), condições relacionadas aos olhos (por exemplo, visão deficiente ou doença retinal), glaucoma, uma síndrome progeroide (por exemplo, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford) e câncer. Em certas modalidades, a doença é uma doença da retina (por exemplo, degeneração macular). Em algumas modalidades, uma condição relaci- onada à idade é a senescência. Como um exemplo não limitante, a se- nescência das células gliais pode ser uma causa da doença de Alzhei- mer. Veja, por exemplo, Bussian, et al., Nature. 19 de setembro de 2018. Em alguns casos, a condição é lesão do nervo. Em alguns casos, a con- dição é uma lesão no sistema nervoso central (SNC). Em alguns casos, o dano ao nervo é dano ao nervo periférico. Em alguns casos, o dano ao nervo é neurapraxia, axonotmese ou neurotmese.
[0072] Em alguns casos, uma condição aumenta a idade baseada na metilação do DNA de uma célula, um tecido, um órgão e/ou um indi- víduo em relação a um controle. Em alguns casos, uma condição au- menta a idade baseada na metilação do DNA de uma célula, um tecido, um órgão e/ou um indivíduo em pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, em pelo menos 30 %, pelo menos 40
%, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, em pelo menos 400 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 % ou pelo menos 1.000 % em relação a um controle. Em alguns casos, o con- trole é uma célula, um tecido, um órgão e/ou um indivíduo que não tem a condição. Em alguns casos, o controle é a mesma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo antes de ter a condição. Sem estar ligado a uma teoria particular, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser útil na di- minuição da idade baseada na metilação do DNA de uma célula doente, um tecido doente, um órgão doente e/ou um indivíduo que tem, está em risco de, ou é suspeito de ter uma doença. Em alguns casos, a doença aumenta a idade baseada na metilação do DNA da célula, tecido, órgão e/ou indivíduo. Em alguns casos, a doença é uma lesão.
[0073] Em alguns casos, a condição está envelhecendo. Em alguns casos, o envelhecimento é impulsionado pelo ruído epigenético. Veja, por exemplo, Oberdoerffer e Sinclair. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 692-702, doi: 10.1038/nrm2238 (2007); Oberdoerffer et al. Cell 135, 907-918, doi:
10.1016/j.cell.2008.10.025 (2008). Sem serem limitadas por uma teoria particular, as células de mamíferos podem reter uma cópia fiel da infor- mação epigenética do início da vida, análogo ao sistema de "observa- dor" de Shannon na Teoria da Informação, essencialmente uma cópia de backup do sinal original para permitir sua reconstituição em a extre- midade receptora se a informação for perdida ou ruído for introduzido durante a transmissão. Veja, por exemplo, Shannon, The Bell System Technical Journal 27, 379-423 (1948) para uma descrição do sistema de observação.
[0074] Quando aqui usado, uma “doença ocular” ou “doença dos olhos” é uma doença ou condição ocular. Exemplos não limitantes de condições que afetam o olho incluem Ectrópio, Lagoftalmo, Blefaroca- lase, Ptose, Terçol, Xantelasma, Dermatite, Demodex, leishmaniose, lo- íase, oncocercose, ftiríase, (herpes simplex), lepra, molusco contagioso, tuberculose, impetigo, Dacrioadenite, Epífora, exoftalmia, Conjuntivite, Esclerite, Ceratite, Úlcera da córnea/abrasão da córnea, Cegueira da neve/olho do arco, Ceratopatia pontilhada superficial de Thygeson, Ne- ovascularização da córnea, Distrofia de Fuchs, Ceratoconeíte, Cerato- conjuntivite seca, Irite, Íris, Uveíte, Oftalmia simpática, Catarata, crista- lino, Inflamação coriorretiniana, Inflamação coriorretiniana focal, corior- retinite, coroidite, retinite, retinocoroidite, Inflamação coriorretiniana dis- seminada, retinopatia exsudativa, Ciclite posterior, Pars planitis, infla- mação da coriorretiniana, doença de Harada, inflamação coriorretinal, coroide, cicatrizes coriorretinianas, cicatrizes de mácula, pólo posterior (pós-inflamatório) (pós-traumático), retinopatia solar, degeneração co- roidal, atrofia, esclerose, estrias angioides, distrofia coroidal, coroidere- mia, coroidal, areolar, (peripapilar), Atrofia girata, coroide, ornitinemia, Hemorragia coroidal, descolamento coriorretinal, inflamação coriorreti- nal, doenças infecciosas e parasitárias, Coriorretinite, sifilítica, toxo- plasma, tuberculose, coriorretiniana, Descolamento retiniano, retina, co- roide, visão distorcida, Retinosquise, Retinopatia hipertensiva, Retino- patia diabética, Retinopatia, Retinopatia da prematuridade, Degenera- ção macular relacionada à idade, mácula, Degeneração macular, Macu- lopatia em olho de boi, Membrana epirretiniana, Degeneração retinal periférica, Distrofia retiniana hereditária, Retinite pigmentosa, Hemorra- gia retiniana, camadas retinais, Retinopatia serosa central, Descola- mento retinal, distúrbios retinais, Edema macular, mácula, Distúrbio re- tiniano, Retinopatia diabética, Glaucoma, meuropatia óptica, hiperten- são ocular, glaucoma de ângulo aberto, glaucoma de fechamento de ângulo, glaucoma de tensão normal, glaucoma de ângulo aberto, glau- coma de ângulo fechado, Flutuadores, Neuropatia óptica hereditária de
Leber, Drusas do disco óptico, Estrabismo, Oftalmoparesia, músculos oculares, Oftaloplegia externa progressiva, Esotropia, Exotropia, Distúr- bios de refração, acomodação, Hipermetropia, Miopia, Astigmatismo, Anisometropia, Presbiopia, oftalmoplegia, Ambliopia, Amaurose congê- nita de Leber, Scotoma, Anopsia, Daltonismo, Achromatopsia/Maskun, células cônicas, Nictalopia, Cegueira, Cegueira dos rios, Microftal- mia/coloboma, nervo óptico, cérebro, medula espinhal, olho vermelho, pupila de Argyll Robertson, pupilas, ceratomicose, xeroftalmia e aniridia. Em algumas modalidades, a doença ocular é uma lesão ocular aguda ou crônica.
[0075] Em algumas modalidades, a doença ocular é uma córnea ar- ranhada.
[0076] Em algumas modalidades, a doença ocular é glaucoma.
[0077] Em algumas modalidades, uma doença ocular é uma doença da córnea (por exemplo, uma doença que afeta a córnea ou as células da córnea). Em algumas modalidades, uma doença ocular é ceratite por acanthamoeba, ectrópio, ambliopia lagófila, anisocoria, astigmatismo, paralisia de Bell, blefarite, visão embaçada, queimação nos olhos, cata- rata, degeneração macular, degeneração macular relacionada à idade, doença ocular diabética, glaucoma, olho seco, visão deficiente (por exemplo, baixa visão), astigmatismo, blefarite, catarata, calázio, conjun- tivite, retinopatia diabética, olho seco, glaucoma, ceratite, queratônio, degeneração macular, hipertensão ocular, pinquécula, pterígio, retinite pigmentosa ou câncer ocular (por exemplo, retinoblastoma, melanoma do olho, linfoma do olho, meduloepitelioma, câncer de células escamo- sas da conjuntiva). Exemplos de doenças da córnea incluem, mas não estão limitados a, neovascularização da córnea (NV), distrofia da cór- nea, inflamação da córnea, abrasão da córnea e fibrose da córnea. Em algumas modalidades, a doença ocular é Keritaconus. Em algumas mo- dalidades, uma doença ocular é degeneração macular. Exemplos não limitantes adicionais de doenças oculares podem ser encontrados na International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (por exemplo, VII Diseases of the eye and adnexa).
[0078] Uma doença ocular pode afetar qualquer parte do olho e/ou anexos. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio da pálpebra, sistema lacrimal e/ou órbita. Em algumas modalidades, a do- ença ocular é um distúrbio da conjuntiva. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio da esclera, córnea, íris e/ou corpo ciliar. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio da lente. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio da coroide e/ou retina. Em algumas modalidades, a doença ocular é glaucoma. Em al- gumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio do corpo vítreo e/ou globo. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio do nervo óptico e/ou vias visuais. Em algumas modalidades, a doença ocu- lar é um distúrbio dos músculos oculares, movimento binocular, acomo- dação e/ou refração. Em algumas modalidades, a doença ocular é um distúrbio visual e/ou cegueira. Em algumas modalidades, a doença ocu- lar está associada ao envelhecimento, por exemplo, perda de visão as- sociada ao envelhecimento, declínio da acuidade visual associado ao envelhecimento e/ou declínio da função retinal.
[0079] Qualquer método adequado pode ser usado para medir a função ocular. Exemplos não limitantes incluem testes de acuidade vi- sual, eletrorretinogramas de padrão e patologia.
[0080] O termo "doença genética" refere-se a uma doença causada por uma ou mais anormalidades no genoma de um indivíduo, como uma doença que está presente desde o nascimento do indivíduo. As doenças genéticas podem ser hereditárias e podem ser transmitidas pelos genes dos pais. Uma doença genética também pode ser causada por muta- ções ou alterações nos DNAs e/ou RNAs do indivíduo. Nesses casos, a doença genética será hereditária se ocorrer na linha germinativa.
Doen- ças genéticas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, síndrome de Aarskog-Scott, síndrome de Aase, acondroplasia, acrodisostose, ví- cio, adrenoleucodistrofia, albinismo, síndrome ablefaria macrostomia, síndrome de Alagille, alcaptonúria, deficiência de alfa-1 antitripsina, sín- drome de Alport, Doença de Alzheimer, asma, síndrome poliglandular autoimune, síndrome de insensibilidade androgênica, síndrome de An- gelman, ataxia, ataxia telangiectasia, aterosclerose, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), autismo, calvície, doença de Bat- ten, síndrome de Beckwith-Wiedemann, doença de Best, transtorno bi- polar, braquidactilia), câncer de mama, linfoma de Burkitt, leucemia mi- eloide crônica, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Crohn, lábio leporino, síndrome de Cockayne, síndrome de Coffin Lowry, câncer de cólon, hiperplasia adrenal congênita, síndrome de Cornelia de Lange, síndrome de Costello, síndrome de Cowden, displasia craniofrontona- sal, síndrome de Crigler-Najjar, doença de Creutzfeldt-Jakob, fibrose cística, surdez, depressão, diabetes, displasia diastrófica, síndrome de DiGeorge, síndrome de Down, dislexia, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Dubowitz, displasia ectodérmica, síndrome de Ellis-van Creveld, Ehlers-Danlos, epidermólise bolhosa, epilepsia, tremor essen- cial, hipercolesterolemia familiar, febre do Mediterrâneo familiar, Sín- drome X frágil, ataxia de Friedreich, doença de Gaucher, glaucoma, má absorção de glicose galactose, acidúria glutárica, atrofia giratória, sín- drome de Goldberg Shprintzen (síndrome velocardiofacial), síndrome de Gorlin, doença de Hailey-Hailey, hemi-hipertrofia, hemocromatose, he- mofilia, neuropatia motora e sensorial hereditária (HMSN), câncer color- retal hereditário sem polipose (HNPCC), doença de Huntington, imuno- deficiência com hiper-IgM, diabetes de início juvenil, síndrome de Kline- felter, síndrome de Kabuki, doença de Leigh, síndrome do QT longo, câncer de pulmão, melanoma maligno, depressão maníaca, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, aborto espontâneo, doença mucopo- lissacarídica, neoplasia endócrina múltipla, esclerose múltipla, distrofia muscular, esclerose lateral miotrófica, distrofia miotônica, neurofibroma- tose, doença de Niemann-Pick, síndrome de Noonan, obesidade, cân- cer de ovário, câncer de pâncreas, doença de Parkinson, hemoglobinú- ria paroxística noturna, síndrome de Pendred, atrofia muscular pero- neal, fenilcetonúria (PKU), doença renal policística, síndrome de Prader- Willi, cirrose biliar primária, câncer de próstata, síndrome REAR, doença de Refsum, retinite pigmentosa, retinoblastoma, síndrome de Rett, sín- drome de Sanfilippo, esquizofrenia, imunodeficiência combinada grave, anemia falciforme, espinha bífida, atrofia muscular espinhal, atrofia es- pinocerebelar, síndrome de morte súbita adulta, doença de Tangier, do- ença de Tay-Sachs, síndrome de trombocitopenia e ausência do rádio, síndrome de Townes-Brocks, esclerose tuberosa, síndrome de Turner, síndrome de Usher, síndrome de von Hippel-Lindau, síndrome de Waar- denburg, síndrome de Weaver, síndrome de Werner, Síndrome de Wil- liams, doença de Wilson, xeroderma piginentoso, uma síndrome proge- roide (por exemplo, síndrome de Hutchinson-Gilford progeria) e sín- drome de Zellweger.
[0081] Uma “doença proliferativa” refere-se a uma doença que ocorre devido ao crescimento anormal ou extensão pela multiplicação de células (Walker, Cambridge Dictionary of Biology; Cambridge Univer- sity Press: Cambridge, UK, 1990). Uma doença proliferativa pode estar associada a: 1) proliferação patológica de células normalmente quies- centes; 2) a migração patológica de células de sua localização normal (por exemplo, metástases de células neoplásicas); 3) a expressão pa- tológica de enzimas proteolíticas, tais como as metaloproteinases de matriz (por exemplo, colagenases, gelatinases e elastases); ou 4) a an- giogênese patológica como na retinopatia proliferativa e metástase tu-
moral. Doenças proliferativas exemplares incluem cânceres (isto é, "ne- oplasias malignas"), neoplasias benignas, angiogênese, doenças infla- matórias e doenças autoimunes.
[0082] Os termos "neoplasma" e "tumor" são usados aqui indistinta- mente e se referem a uma massa anormal de tecido em que o cresci- mento da massa ultrapassa e não é coordenado com o crescimento de um tecido normal. Uma neoplasia ou tumor pode ser "benigno" ou "ma- ligno", dependendo das seguintes características: grau de diferenciação celular (incluindo morfologia e funcionalidade), taxa de crescimento, in- vasão local e metástase. Uma “neoplasia benigna” geralmente é bem diferenciada, tem um crescimento caracteristicamente mais lento do que uma neoplasia maligna e permanece localizada no local de origem. Além disso, uma neoplasia benigna não tem a capacidade de se infiltrar, invadir ou metastatizar para sítios distantes. Neoplasias benignas exem- plares incluem, mas não estão limitadas a, lipoma, condroma, adeno- mas, acrocórdon, angiomas senis, ceratoses seborreicas, lentigos e hi- perplasias sebáceas. Em alguns casos, certos tumores "benignos" po- dem posteriormente dar origem a neoplasias malignas, que podem re- sultar de alterações genéticas adicionais em uma subpopulação de cé- lulas neoplásicas do tumor, e esses tumores são referidos como "neo- plasias pré-malignas". Um exemplo de neoplasia pré-maligna é um te- ratoma. Em contraste, uma “neoplasia maligna” é geralmente mal dife- renciada (anaplasia) e tem um crescimento caracteristicamente rápido acompanhado por infiltração, invasão e destruição progressiva do tecido circundante. Além disso, uma neoplasia maligna geralmente tem a ca- pacidade de metastatizar para sítios distantes. O termo "metástase", "metastático" ou "metástase" refere-se à disseminação ou migração de células cancerosas de um tumor primário ou original para outro órgão ou tecido e é tipicamente identificável pela presença de um "tumor se-
cundário" ou "secundário massa celular ”do tipo de tecido do tumor pri- mário ou original e não do órgão ou tecido no qual o tumor secundário (metastático) está localizado. Por exemplo, um câncer de próstata que migrou para o osso é chamado de câncer de próstata com metástase e inclui células cancerosas da próstata que crescem no tecido ósseo.
[0083] O termo "câncer" refere-se a uma classe de doenças carac- terizadas pelo desenvolvimento de células anormais que proliferam de forma incontrolável e têm a capacidade de se infiltrar e destruir os teci- dos normais do corpo. Veja, por exemplo, Stedman’s Medical Dictionary, 25a. ed.; Hensyl ed.; Williams & Wilkins: Philadelphia, 1990. Cânceres exemplares incluem, mas não estão limitados a, neuroma acústico; ade- nocarcinoma; câncer da glândula adrenal; câncer anal; angiossarcoma (por exemplo, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, hemangi- ossarcoma); câncer de apêndice; gamopatia monoclonal benigna; cân- cer biliar (por exemplo, colangiocarcinoma); Câncer de bexiga; câncer da mama (por exemplo, adenocarcinoma da mama, carcinoma papilar da mama, câncer da mama, carcinoma medular da mama); câncer do cérebro (por exemplo, meningioma, glioblastomas, glioma (por exemplo, astrocitoma, oligodendroglioma), meduloblastoma); câncer de brônquio; tumor carcinoide; câncer cervical (por exemplo, adenocarcinoma cervi- cal); coriocarcinoma; cordoma; craniofaringioma; câncer colorretal (por exemplo, câncer de cólon, câncer retal, adenocarcinoma colorretal); câncer do tecido conjuntivo; carcinoma epitelial; ependimoma; endoteli- ossarcoma (por exemplo, sarcoma de Kaposi, sarcoma hemorrágico idi- opático múltiplo); Câncer do endométrio (por exemplo, câncer uterino, sarcoma uterino); câncer de esôfago (por exemplo, adenocarcinoma do esôfago, adenocarcinoma de Barrett); Sarcoma de Ewing; câncer ocular (por exemplo, melanoma intraocular, retinoblastoma); hipereosinofilia familiar; câncer de vesícula biliar; câncer gástrico (por exemplo, adeno- carcinoma do estômago); tumor estromal gastrointestinal (GIST); câncer de células germinativas; câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, car- cinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer oral (por exemplo, carcinoma de células escamosas oral), câncer de garganta (por exemplo, câncer de laringe, câncer de faringe, câncer de nasofa- ringe, câncer de orofaringe)); cânceres hematopoiéticos (por exemplo, leucemia, como leucemia linfocítica aguda (ALL) (por exemplo, LLA de células B, LLA de células T), leucemia mielocítica aguda (LMA) (por exemplo, AML de células B, AML de células T), leucemia mielocítica crônica (CML) (por exemplo, CML de células B, CML de células T) e leucemia linfocítica crônica (CLL) (por exemplo, CLL de células B, CLL de células T)); linfoma, como linfoma de Hodgkin (LH) (por exemplo, LH de células B, LH de células T) e linfoma não-Hodgkin (LNH) (por exem- plo, LNH de células B, como linfoma difuso de grandes células (DLCL) (por exemplo, linfoma difuso de grandes células Linfoma de células B), linfoma folicular, leucemia linfocítica crônica/linfoma linfocítico pequeno (CLL/SLL), linfoma de células de revestimento (MCL), linfomas de célu- las B de zona marginal (por exemplo, linfomas de tecido linfoide associ- ado à mucosa (MALT), linfoma de células B de zona marginal nodal, linfoma de células B de zona marginal esplênica, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico (ou seja, macroglobulinemia de Waldenström), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de células grandes imunoblástico, linfoma B-linfoblástico precursor e linfoma do sistema nervoso central primário (SNC); e LNH de células T, como linfoma/leucemia linfoblástica precursora, linfoma de células T periférico (PTCL) (por exemplo, linfoma cutâneo de células T (CTCL) (por exemplo, micose fungoide, Síndrome de Sezary), linfoma angioimunoblástico de células T, linfoma de células T de exterminado- ras naturais extranodal, linfoma de células T do tipo enteropatia, linfoma de células T do tipo paniculite subcutâneo e linfoma anaplásico de célu-
las grandes); uma mistura de um ou mais leucemia/linfoma como des- crito acima; e mieloma múltiplo (MM)), doença da cadeia pesada (por exemplo, doença da cadeia alfa, doença da cadeia gama, doença da cadeia mu); hemangioblastoma; câncer de hipofaringe; tumores miofi- broblásticos inflamatórios; amiloidose imunocítica; câncer de rim (por exemplo, nefroblastoma a.k.a. tumor de Wilms, carcinoma de células renais); câncer de fígado (por exemplo, câncer hepatocelular (HCC), he- patoma maligno); câncer do pulmão (por exemplo, carcinoma bronco- génico, câncer do pulmão de células pequenas (SCLC), câncer do pul- mão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma do pulmão); leiomiossarcoma (LMS); mastocitose (por exemplo, mastocitose sistê- mica); câncer muscular; síndrome mielodisplásica (MDS); mesotelioma; distúrbio mieloproliferativo (MPD) (por exemplo, policitemia vera (PV), trombocitose essencial (ET), metaplasia mieloide agnogênica (AMM) também conhecida como mielofibrose (MF), mielofibrose idiopática crô- nica, leucemia mielocítica crônica (LMC), leucemia neutrofílica crônica (CNLM) síndrome hipereosinofílica (HES)); neuroblastoma; neurofi- broma (por exemplo, neurofibromatose (NF) tipo 1 ou tipo 2, schwanno- matose); câncer neuroendócrino (por exemplo, tumor neuroendoctrina gastroenteropancreático (GEP-NET), tumor carcinoide); osteossarcoma (por exemplo, câncer ósseo); câncer do ovário (por exemplo, cistadeno- carcinoma, carcinoma embrionário do ovário, adenocarcinoma do ová- rio); adenocarcinoma papilar; câncer pancreático (por exemplo, ande- nocarcinoma pancreático, neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN), tumores de células das ilhotas); câncer de pênis (por exemplo, doença de Paget do pênis e escroto); pinealoma; tumor neuroectodér- mico primitivo (PNT); neoplasia de células plasmáticas; síndromes pa- raneoplásicas; neoplasias intraepiteliais; câncer de próstata (por exem- plo, adenocarcinoma da próstata); câncer retal; rabdomiossarcoma; câncer de glândula salivar; câncer de pele (por exemplo, carcinoma de células escamosas (SCC), ceratoacantoma (KA), melanoma, carcinoma de células basais (BCC)); câncer do intestino delgado (por exemplo, câncer do apêndice); sarcoma de tecidos moles (por exemplo, histioci- toma fibroso maligno (MFH), lipossarcoma, tumor maligno da bainha do nervo periférico (MPNST), condrossarcoma, fibrossarcoma, mixossar- coma); carcinoma de glândula sebácea; câncer do intestino delgado; carcinoma das glândulas sudoríparas; sinovioma; câncer testicular (por exemplo, seminoma, carcinoma embrionário testicular); câncer da ti- roide (por exemplo, carcinoma papilar da tiroide, carcinoma papilar da tiroide (PTC), câncer medular da tiroide); câncer uretral; câncer vaginal; e câncer vulvar (por exemplo, doença de Paget da vulva).
[0084] O termo "doença inflamatória" refere-se a uma doença cau- sada por, resultante de ou resultando em inflamação. O termo "doença inflamatória" também pode se referir a uma reação inflamatória desre- gulada que causa uma resposta exagerada por macrófagos, granulóci- tos e/ou linfócitos T levando a dano anormal do tecido e/ou morte celu- lar. Uma doença inflamatória pode ser aguda ou crônica e pode resultar de infecções ou de causas não infecciosas. As doenças inflamatórias incluem, sem limitação, aterosclerose, arteriosclerose, distúrbios autoi- munes, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, polimialgia reu- mática (PMR), artrite gotosa, artrite degenerativa, tendinite, bursite, pso- ríase, artrose cística, artrose inflamatória, Síndrome de Sjogren, arterite de células gigantes, esclerose sistêmica progressiva (esclerodermia), espondilite anquilosante, polimiosite, dermatomiosite, pênfigo, penfi- goide, diabetes (por exemplo, Tipo I), miastenia grave, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Goodpasture, doença do te- cido conectivo misto, colangite esclerosante, doença inflamatória intes- tinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, anemia perniciosa, dermatoses inflamatórias, pneumonite intersticial usual (PIU), asbestose, silicose,
bronquiectasia, beriliose, talcose, pneumoconiose, sarcoidose, pneu- monia intersticial descamativa, pneumonia intersticial linfoide, pneumo- nia intersticial de células gigantes, pneumonia intersticial celular, alveo- lite alérgica extrínseca, granulomatose de Wegener e formas relaciona- das de angiite (arterite temporal e poliarterite nodosa), dermatoses in- flamatórias, hepatite, reações de hipersensibilidade do tipo retardado (por exemplo, dermatite de hera venenosa), pneumonia, inflamação do trato respiratório, Síndrome de Desconforto Respiratório do Adulto (ARDS), encefalite, reações de hipersensibilidade imediata, asma, febre do feno, alergias, anafilaxia aguda, febre reumática, glomerulonefrite, pielonefrite, celulite, cistite, colecistite crônica, isquemia (lesão isquê- mica), lesão de reperfusão, rejeição de aloenxerto, rejeição do hospe- deiro verso enxerto, apendicite, arterite, blefarite, bronquiolite, bron- quite, cervicite, colangite, corioamnionite, conjuntivite, dacrioadenite, dermatomiosite, endocardite, endometrite, enterite, enterocolite, epicon- dilite, fascite, fibrosite, gastrite, gastroenterite, gengivite, ileíte, irite, la- ringite, mielite, miocardite, nefrite, onfalite, ooforite, orquite, osteíte, otite, pancreatite, parotite, pericardite, faringite, pleurite, flebite, pneu- monite, proctite, prostatite, rinite, salpingite, sinusite, estomatite, sino- vite, testite, tonsilite, uretrite, urocistite, uveíte, vaginite, vasculite, vul- vite, vulvovaginite, angite, bronquite crônica, osteomielite, neurito óp- tica, arterite temporal, mielite transversa, fasceíte necrosante e entero- colite necrosante. Uma doença inflamatória ocular inclui, mas não está limitada a, inflamação pós-cirúrgica. Em algumas modalidades, a do- ença inflamatória é uma inflamação (por exemplo, inflamação que é um efeito colateral do envelhecimento).
[0085] Uma "doença autoimune" refere-se a uma doença decor- rente de uma resposta imune inadequada do corpo de um indivíduo con- tra substâncias e tecidos normalmente presentes no corpo. Em outras palavras, o sistema imunológico confunde alguma parte do corpo como um patógeno e ataca suas próprias células. Isso pode ser restrito a cer- tos órgãos (por exemplo, na tireoidite autoimune) ou envolver um tecido específico em diferentes sítios (por exemplo, doença de Goodpasture que pode afetar a membrana basal tanto no pulmão quanto no rim). O tratamento de doenças autoimunes é tipicamente com imunossupres- são, por exemplo, medicamentos que diminuem a resposta imunológica. Doenças autoimunes exemplares incluem, mas não estão limitadas a, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, vasculite necrosante, linfa- denite, periarterite nodosa, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reuma- toide, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico, eritematose, psorí- ase, colite ulcerativa, esclerose sistêmica, dermatomiosite/polimiosite, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, esclerodermia, pênfigo vulgar, vasculite associada a ANCA (por exemplo, granulomatose de Wegener, poliangeíte microscópica), uveíte, síndrome de Sjogren, doença de Crohn, síndrome de Reiter, espondilite anquilosante, doença de Lyme, síndrome de Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto e cardiomiopatia.
[0086] O termo “doença do fígado” ou “doença hepática” refere-se a danos ou doenças do fígado. Exemplos não limitantes de doença do fígado incluem colestase intra-hepática (por exemplo, síndrome de ala- gille, cirrose do fígado biliar), fígado gorduroso (por exemplo, fígado gor- duroso alcoólico, síndrome de Reye), trombose da veia hepática, dege- neração hepatolenticular (ou seja, doença de Wilson), hepatomegalia, abscesso hepático (por exemplo, abscesso hepático amebiano), cirrose hepática (por exemplo, cirrose hepática alcoólica, biliar e experimental), doenças hepáticas alcoólicas (por exemplo, fígado gorduroso, hepatite, cirrose), doença hepática parasitária (por exemplo, equinococose hepá- tica, fasciolíase, abscesso hepático amebiano), icterícia (por exemplo, icterícia hemolítica, hepatocelular, colestática), colestase, hipertensão portal, aumento do fígado, ascite, hepatite (por exemplo, hepatite alcoó- lica, hepatite animal, hepatite crônica (por exemplo, autoimune, hepatite
B, hepatite C, hepatite D, hepatite crônica induzida por fármacos), he- patite tóxica, hepatite humana viral (por exemplo, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E), hepatite granulomatosa, cirrose biliar secundária, encefalopatia hepática, varizes, cirrose biliar primária, co- langite esclerosante primária, adenoma hepatocelular, hemangiomas, cálculos biliares, insuficiência hepática (por exemplo, encefalopatia he- pática, falência do fígado aguda), angiomiolipoma, metástases hepáti- cas calcificadas, metástases hepáticas císticas, hepatocarcinoma fibro- lamelar, adenoma hepático, hepatoma, cistos hepáticos (por exemplo, cistos simples, doença hepática policística, cistoadenoma hepatobiliar, cisto colédoco), tumores mesenquimatosos (hamartoma mesenquima- toso, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, peliose hepática, li- pomas, pseudotumor inflamatório), tumores epiteliais (por exemplo, hamartoma do ducto biliar, adenoma do ducto biliar), hiperplasia nodular focal, hiperplasia nodular regenerativa, hepatoblastoma, carcinoma he- patocelular, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumores de vasos sanguíneos, angiossarcoma, sarcoma de Karposi, hemangioendoteli- oma, sarcoma embrionário, fibrossarcoma, leiomiossarcoma, rabdomi- ossarcoma, carcinossarcoma, teratoma, carcinoide, carcinoma esca- moso, linfoma primário, peliose hepática, porfiria eritro-hepática, porfiria hepática (por exemplo, porfiria aguda intermitente, porfiria cutânea tar- dia) e síndrome de Zellweger.
[0087] O termo “doença do baço” refere-se a uma doença do baço. Exemplos de doenças do baço incluem, mas não estão limitados a, es- plenomegalia, câncer de baço, asplenia, trauma do baço, púrpura idio- pática, síndrome de Felty, doença de Hodgkin e destruição imunomedi- ada do baço.
[0088] O termo “doença dos pulmões” ou “doença pulmonar” refere- se a uma doença do pulmão. Exemplos de doenças do pulmão incluem,
mas não estão limitados a, bronquiectasia, bronquite, displasia bronco- pulmonar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar ocupacional, enfisema, fibrose cística, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), síndrome respiratória aguda grave (SARS), asma (por exem- plo, asma intermitente, asma persistente leve, asma persistente mode- rada, asma persistente grave), bronquite crônica, doença pulmonar obs- trutiva crônica (DPOC), enfisema, doença pulmonar intersticial, sarcoi- dose, asbestose, aspergiloma, aspergilose, pneumonia (por exemplo, pneumonia lobar, pneumonia multilobar, pneumonia brônquica, pneu- monia intersticial), fibrose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença pul- monar reumatoide, embolia pulmonar e câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma pulmonar de células não pequenas (por exemplo, adenocar- cinoma, carcinoma pulmonar de células escamosas, células grandes carcinoma do pulmão), carcinoma do pulmão de células pequenas).
[0089] Uma “doença hematológica” inclui uma doença que afeta uma célula ou tecido hematopoiético. As doenças hematológicas in- cluem doenças associadas a conteúdo e/ou função hematológica aber- rante. Exemplos de doenças hematológicas incluem doenças resultan- tes de irradiação da medula óssea ou tratamentos de quimioterapia para câncer, doenças como anemia perniciosa, anemia hemorrágica, anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia falciforme, anemia sideroblástica, anemia associada a infecções crônicas, como malária, tripanossomí- ase, HTV, vírus da hepatite ou outros vírus, anemias mieloftísicas cau- sadas por deficiências da medula, insuficiência renal resultante de ane- mia, policitemia, mononucleose infecciosa (EVI), leucemia não linfocí- tica aguda (ANLL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia promielo- cítica aguda (APL), leucemia mielomonocítica aguda (AMMoL), policite- mia vera, linfoma, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica, tumor de Wilm, sarcoma de Ewing, retinoblastoma, hemofilia,
distúrbios associados a um risco aumentado de trombose, herpes, ta- lassemia, distúrbios mediados por anticorpos, como reações transfusio- nais e eritroblastose, trauma mecânico para hemácias, tais como ane- mias hemolíticas microangiopáticas, púrpura trombocitopênica trombó- tica e coagulação intravascular disseminada, infecções por parasitas como Plasmodium, lesões químicas de, por exemplo, envenenamento por chumbo e hiperesplenismo.
[0090] O termo "doença neurológica" refere-se a qualquer doença do sistema nervoso, incluindo doenças e lesões que envolvem o sistema nervoso central (cérebro, tronco cerebral e cerebelo), o sistema nervoso periférico (incluindo nervos cranianos) e o sistema nervoso autônomo (partes dos quais estão localizados no sistema nervoso central e perifé- rico). As doenças neurodegenerativas referem-se a um tipo de doença neurológica marcada pela perda de células nervosas, incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, escle- rose lateral amiotrófica, tauopatias (incluindo demência frontotemporal) e doença de Huntington. Exemplos de doenças neurológicas incluem, mas não estão limitados a, demências vasculares, acidente vascular ce- rebral, dor de cabeça, estupor e coma, demência, convulsão, distúrbios do sono, trauma, infecções, neoplasias, neuro-oftalmologia, distúrbios do movimento, doenças desmielinizantes, distúrbios da medula espi- nhal, e distúrbios de nervos periféricos, músculos e junções neuromus- culares. Dependência e doenças mentais incluem, mas não estão limi- tadas a, transtorno bipolar e esquizofrenia, também estão incluídos na definição de doenças neurológicas. Outros exemplos de doenças neu- rológicas incluem afasia epileptiforme adquirida; encefalomielite disse- minada aguda; adrenoleucodistrofia; agenesia do corpo caloso; agno- sia; Síndrome de Aicardi; Doença de Alexander; Doença de Alpers; he- miplegia alternada; Doença de Alzheimer; esclerose lateral amiotrófica;
anencefalia; Síndrome de Angelman; angiomatose; anoxia; afasia; apra- xia; cistos aracnoides; aracnoidite; Malformação de Arnold-Chiari; mal- formação arteriovenosa; Síndrome de Asperger; ataxia telangiectasia; transtorno de déficit de atenção e hiperatividade; autismo; disfunção au- tonômica; dor nas costas; Doença de Batten; Doença de Behçet; Para- lisia de Bell; blefarospasmo essencial benigno; focal benigno; amiotro- fia; hipertensão intracraniana benigna; Doença de Binswanger; blefaros- pasmo; Síndrome de Bloch Sulzberger; lesão do plexo braquial; abs- cesso cerebral; lesão cerebral; tumores cerebrais (incluindo glioblas- toma multiforme); tumor espinhal; Síndrome de Brown-Sequard; Do- ença de Canavan; síndrome do túnel do carpo (CTS); causalgia; sín- drome da dor central; mielinólise pontina central; distúrbio cefálico; aneurisma cerebral; arteriosclerose cerebral; atrofia cerebral; gigan- tismo cerebral; paralisia cerebral; Doença de Charcot-Marie-Tooth; neu- ropatia induzida por quimioterapia e dor neuropática; Malformação de Chiari; coreia; polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP); dor crônica; síndrome de dor regional crônica; Síndrome de Co- ffin Lowry; coma, incluindo estado vegetativo persistente; diplegia facial congênita; degeneração corticobasal; arterite craniana; craniossinos- tose; Doença de Creutzfeldt-Jakob; distúrbios de trauma cumulativos; Síndrome de Cushing; doença de corpos de inclusão citomegálica (CIBD); infecção por citomegalovírus; síndrome dos olhos dançantes- pés dançantes; Síndrome de Dandy-Walker; Doença de Dawson; Sín- drome de De Morsier; Paralisia de Dejerine-Klumpke; demência; derma- tomiosite; neuropatia diabética; esclerose difusa; disautonomia; disgra- fia; dislexia; distonias; encefalopatia epiléptica infantil precoce; sín- drome da sela vazia; encefalite; encefaloceles; angiomatose encefalo- trigeminal; epilepsia; Paralisia de Erb; tremor essencial; Doença de Fa- bry; Síndrome de Fahr; desmaio; paralisia espástica familiar; convul-
sões febris; Síndrome de Fisher; Ataxia de Friedreich; demência fronto- temporal e outras “tauopatias”; Doença de Gaucher; Síndrome de Gers- tmann; arterite de células gigantes; doença de inclusão de células gi- gantes; leucodistrofia de células globoides; síndrome de Guillain-Barré; Mielopatia associada ao HTLV-1; Doença de Hallervorden-Spatz; lesão da cabeça; dor de cabeça; espasmo hemifacial; paraplegia espástica hereditária; heredopatia atáxica polineuritiforme; herpes zoster ótico; herpes zoster; Síndrome de Hirayama; Demência e neuropatia associa- das ao HIV (veja, também manifestações neurológicas da AIDS); holo- prosencefalia; Doença de Huntington e outras doenças de repetição de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipóxia; encefalomielite imunomediada; miosite de corpos de inclusão; inconti- nência pigmentar; infantil; doença de armazenamento de ácido fitânico; Doença de Refsum infantil; espasmos infantis; miopatia inflamatória; cisto intracraniano; hipertensão intracraniana; Síndrome de Joubert; Síndrome de Kearns-Sayre; Doença de Kennedy; Síndrome de Kins- bourne; Síndrome de Klippel Feil; Doença de Krabbe; Doença de Kugel- berg-Welander; kuru; Doença de Lafora; Síndrome miastênica de Lam- bert-Eaton; Síndrome de Landau-Kleffner; síndrome medular lateral (Wallenberg); dificuldades de aprendizagem; Doença de Leigh; Sín- drome de Lennox-Gastaut; Síndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; Demência dos corpúsculos de Lewy; lissencefalia; síndrome de encar- ceramento; Doença de Lou Gehrig (também conhecida como doença do neurônio motor ou esclerose lateral amiotrófica); doença do disco lom- bar; sequelas neurológicas da doença de Lyme; Doença de Machado- Joseph; macrencefalia; megalencefalia; Síndrome de Melkersson-Ro- senthal; Doença de Menieres; meningite; Doença de Menkes; leucodis- trofia metacromática; microcefalia; enxaqueca; Síndrome de Miller Fis- her; mini-golpes; miopatias mitocondriais; Síndrome de Mobius; amio- trofia monomélica; doença do neurônio motor; doença de moyamoya;
mucopolissacaridoses; demência de múltiplos infartos; neuropatia mo- tora multifocal; esclerose múltipla e outras doenças desmielinizantes; atrofia de múltiplos sistemas com hipotensão postural; distrofia muscu- lar; miastenia grave; esclerose difusa mielinoclástica; encefalopatia mi- oclônica de bebês; mioclonia; miopatia; miotonia congênita; narcolepsia; neurofibromatose; Síndrome maligna neuroléptica; manifestações neu- rológicas da AIDS; sequelas neurológicas do lúpus; neuromiotonia; lipo- fuscinose ceroide neuronal; distúrbios de migração neuronal; Doença de Niemann-Pick; Síndrome de O’Sullivan-McLeod; neuralgia occipital; sequência disrafista espinhal oculta; Síndrome de Ohtahara; atrofia oli- vopontocerebelar; opsoclonia mioclonia; neurito óptica; hipotensão or- tostática; síndrome de uso excessivo; parestesia; Mal de Parkinson; pa- ramiotonia congênita; doenças paraneoplásicas; ataques paroxísticos; Síndrome de Parry Romberg; Doença de Pelizaeus-Merzbacher; parali- sias periódicas; neuropatia periférica; neuropatia dolorosa e dor neuro- pática; Estado vegetativo persistente; Transtornos invasivos do desen- volvimento; reflexo de espirro fótico; doença de armazenamento de ácido fitânico; Doença de Pick; nervo comprimido; tumores hipofisários; polimiosite; porencefalia; Síndrome pós-poliomielite; neuralgia pós-her- pética (NPH); encefalomielite pós-infecciosa; hipotensão postural; Sín- drome de Prader-Willi; esclerose lateral primária; doenças por príons; progressivo; atrofia hemifacial; leucoencefalopatia multifocal progres- siva; poliodistrofia esclerosante progressiva; paralisia supranuclear pro- gressiva; pseudotumor cerebral; Síndrome de Ramsay-Hunt (Tipo I e Tipo II); Encefalite de Rasmussen; síndrome de distrofia simpática re- flexa; Doença de Refsum; distúrbios de movimento repetitivo; lesões por esforço repetitivo; síndrome das pernas inquietas; mielopatia associada a retrovírus; Síndrome de Rett; Síndrome de Reye; Dança de São Vito; Doença de Sandhoff; Doença de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-óptica; síndrome do bebê sacudido; cobreiro; Síndrome de Shy-
Drager; Síndrome de Sjogren; apneia do sono; Síndrome de Soto; es- pasticidade; espinha bífida; lesão da medula espinal; tumores da me- dula espinhal; atrofia muscular espinhal; síndrome da pessoa rígida; aci- dente vascular encefálico; Síndrome de Sturge-Weber; panencefalite esclerosante subaguda; hemorragia subaracnoide; encefalopatia arteri- osclerótica subcortical; coreia de Sydenham; síncope; siringomielia; dis- cinesia tardia; Doença de Tay-Sachs; arterite temporal; síndrome da medula espinhal amarrada; Doença de Thomsen; Síndrome de com- pressão torácica; tique doloroso; Paralisia de Todd; Síndrome de Tou- rette; ataque isquêmico transitório; encefalopatias espongiformes trans- missíveis; mielite transversa; traumatismo crâniano; tremor; neuralgia trigeminal; paraparesia espástica tropical; esclerose tuberosa; demên- cia vascular (demência de múltiplos enfartes); vasculite incluindo arterite temporal; Doença de Von Hippel-Lindau (VHL); Síndrome de Wallen- berg; Doença de Werdnig-Hoffman; Síndrome de West; chicotada; Sín- drome de Williams; Doença de Wilson; e síndrome de Zellweger.
[0091] O termo "doença musculoesquelética" ou "MSD" refere-se a uma lesão e/ou dor nas articulações, ligamentos, músculos, nervos, ten- dões e estruturas de suporte dos membros, pescoço e costas de um indivíduo. Em certas modalidades, uma MSD é uma doença degenera- tiva. Em certas modalidades, uma MSD inclui uma condição inflamató- ria. As partes do corpo de um indivíduo que podem estar associadas a MSDs incluem parte superior e inferior das costas, pescoço, ombros e extremidades (braços, pernas, pés e mãos). Em certas modalidades, uma MSD é uma doença óssea, como acondroplasia, acromegalia, calo ósseo, desmineralização óssea, fratura óssea, doença da medula ós- sea, neoplasia da medula óssea, disceratose congênita, leucemia (por exemplo, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica, leucemia mi- eloide, Leucemia positiva para o cromossoma Filadélfia, leucemia de células plasmáticas, leucemia de células-tronco), mastocitose sistê- mica, síndromes mielodisplásicas, hemoglobinúria paroxística noturna, sarcoma mieloide, doenças mieloproliferativas, mieloma múltiplo, polici- temia vera, síndrome de medula de pâncreas, neoplasia óssea, sar- coma de Ewing, osteocondroma, osteoclastoma, osteossarcoma, bra- quidactilia, síndrome de Camurati- Engelmann, Craniossinostose, disos- tose craniofacial de Crouzon, nanismo, acondroplasia, síndrome de Bloom, síndrome de Cockayne, síndrome de Ellis-van Creveld, sín- drome de Seckel, displasia espondiloepifisária, displasia espondiloepifi- sária congênita, síndrome de Werner, hiperostose, osteófito, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Marfan, Síndrome de McCune-Albright, osteíte, osteoartrite, osteocondrite, osteocondrodis- plasia, doença de Kashin-Beck, discondrosteose de Leri-Weill, osteo- condrose, osteodistrofia, osteogênese imperfeita, osteólise, síndrome de Gorham-Stout, osteomalacia, osteomielite, osteonecrose, osteope- nia, osteopetrose, osteoporose, osteosclerose, displasia otospondilo- megaepifisária, paquidermoperiostose, doença de Paget óssea, Poli- dactilia, síndrome de Meckel, raquitismo, síndrome de Rothmund-Tho- mson, síndrome de Sotos, displasia espondiloepifisária, displasia es- pondiloepifisária congênita, sindactilia, síndrome de Apert, sindactilia do tipo II ou síndrome de Werner.
Em certas modalidades, uma MSD é uma doença da cartilagem, como neoplasia da cartilagem, osteocondrite, os- teocondrodisplasia, doença de Kashin-Beck ou discondrosteose de Leri- Weill.
Em certas modalidades, uma MSD é hérnia, como a hérnia de disco intervertebral.
Em certas modalidades, uma MSD é uma doença articular, como artralgia, artrite (por exemplo, gota (por exemplo, sín- drome de Kelley-Seegmiller, síndrome de Lesch-Nyhan), doença de Lyme, osteoartrite, artrite psoriática, artrite reativa, febre reumática, ar- trite reumatoide, Síndrome de Felty, sinovite, síndrome de Blau, sín- drome da unha-patela, espondiloartropatia, artrite reativa, síndrome de
Stickler, doença da membrana sinovial, sinovite ou síndrome de Blau. Em certas modalidades, uma MSD é a síndrome de Langer-Giedion. Em certas modalidades, uma MSD é uma doença muscular, como a sín- drome de Barth, encefalomiopatia mitocondrial, síndrome de MELAS, síndrome de MERRF, síndrome de MNGIE, miopatia mitocondrial, sín- drome de Kearns-Sayre, mialgia, fibromialgia, polimialgia reumática, mi- oma, miosite, dermatomiosite, doença neuromuscular, síndrome de Ke- arns-Sayre, distrofia muscular, miastenia, síndrome miastênica congê- nita, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia grave, miotonia, miotonia congênita, atrofia muscular espinhal, tetania, oftalmoplegia ou rabdomiólise. Em certas modalidades, uma MSD é a síndrome de Pro- teus. Em certas modalidades, uma MSD é uma doença reumática, como artrite (por exemplo, gota (por exemplo, síndrome de Kelley-Seegmiller, doença de Lesch-Nyhan Lyme)), osteoartrite, artrite psoriática, artrite re- ativa, febre reumática, artrite reumatoide, síndrome de Felty, sinovite, síndrome de Blau, gota (por exemplo, síndrome de Kelley-Seegmiller, síndrome de Lesch-Nyhan), polimialgia reumática, febre reumática, do- ença cardíaca reumática ou síndrome de Sjogren. Em certas modalida- des, uma MSD é a síndrome de Schwartz-Jampel. Em certas modalida- des, uma MSD é uma doença do esqueleto, como discondrosteose de Leri-Weill, malformações do esqueleto, síndrome de Melnick-Needles, paquidermoperiostose, síndrome de Rieger, doença da coluna espinhal, hérnia de disco intervertebral, escoliose, espinha bífida, espondilite, es- pondilite anquilosante, espondiloartropatia, artrite reativa, displasia es- pondiloepifisária, displasia espondiloepifisária congênita ou espondi- lose. Em algumas modalidades, a doença é uma doença musculoes- quelética.
[0092] Uma "condição dolorosa" inclui, mas não está limitada a, dor neuropática (por exemplo, dor neuropática periférica), dor central, dor de desaferenciação, dor crônica (por exemplo, dor nociceptiva crônica e outras formas de dor crônica, como dor pós-operatória, por exemplo, dor que surge após o quadril, joelho ou outra cirurgia de substituição), dor pré-operatória, estímulo de receptores nociceptivos (dor nocicep- tiva), dor aguda (por exemplo, dor aguda fantasma e transitória), dor não inflamatória, dor inflamatória, dor associada com câncer, dor na ferida, dor em queimadura, dor pós-operatória, dor associada a procedimentos médicos, dor resultante de prurido, síndrome da bexiga dolorosa, dor associada a distúrbio disfórico pré-menstrual e/ou síndrome pré-mens- trual, dor associada à síndrome de fadiga crônica, dor associada a parto prematuro, dor associada a sintomas de abstinência do vício em fárma- cos, dor nas articulações, dor artrítica (por exemplo, dor associada à artrite cristalina, osteoartrite, artrite psoriática, artrite gotosa, artrite rea- tiva, artrite reumatoide ou artrite de Reiter), dor lombossacral, dor mús- culo-esquelética, dor de cabeça, enxaqueca, dor muscular, dor lombar, dor no pescoço, dor de dente, dor dentária/maxilofacial, dor visceral e semelhantes. Uma ou mais das condições dolorosas aqui consideradas podem compreender misturas de vários tipos de dor fornecidos acima e aqui (por exemplo, dor nociceptiva, dor inflamatória, dor neuropática, etc.). Em algumas modalidades, uma dor específica pode dominar. Em outras modalidades, a condição dolorosa compreende dois ou mais ti- pos de dores sem que uma seja dominante. Um clínico experiente pode determinar a dosagem para atingir uma quantidade terapeuticamente eficaz para um determinado indivíduo com base na condição dolorosa.
[0093] O termo "transtorno psiquiátrico" refere-se a uma doença da mente e inclui doenças e transtornos listados no Diagnostic and Statis- tical Manual of Mental Disorders - Quarta Edição (DSM-IV), publicado pela American Psychiatric Association, Washington D. C. (1994). Os transtornos psiquiátricos incluem, mas não estão limitados a, transtor- nos de ansiedade (por exemplo, transtorno de estresse agudo, agorafo-
bia, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno obsessivo-com- pulsivo, transtorno do pânico, transtorno de estresse pós-traumático, transtorno de ansiedade de separação, fobia social e fobia específica), transtornos infantis, (por exemplo, transtorno de déficit de atenção/hipe- ratividade, transtorno de conduta e transtorno desafiador de oposição), transtornos alimentares (por exemplo, anorexia nervosa e bulimia ner- vosa), transtornos do humor (por exemplo, depressão, transtorno bipo- lar, transtorno ciclotímico, transtorno distímico e transtorno depressivo maior), transtornos de personalidade (por exemplo, transtorno de per- sonalidade antissocial, transtorno de personalidade esquiva, transtorno de personalidade limítrofe, transtorno de personalidade dependente, transtorno de personalidade histriônica, transtorno de personalidade narcisista, transtorno de personalidade obsessivo-compulsiva, trans- torno de personalidade paranoide, transtorno de personalidade esqui- zoide e transtorno de personalidade esquizotípica), transtornos psicóti- cos (por exemplo, transtorno psicótico breve, transtorno delirante, trans- torno esquizoafetivo, transtorno esquizofreniforme, esquizofrenia e transtorno psicótico compartilhado), transtornos relacionados a substân- cias (por exemplo, dependência de álcool, dependência de anfetamina, dependência de cannabis, dependência de cocaína, dependência de alucinógeno, dependência de inalantes, dependência de nicotina, de- pendência de opioide, dependência de fenciclidina e dependência de sedativos), transtorno de ajustamento, autismo, delírio, demência, de- mência multi-infarto, transtornos de aprendizagem e memória (por exemplo, amnésia e perda de memória relacionada à idade) e transtorno de Tourette.
[0094] O termo "distúrbio metabólico" refere-se a qualquer distúrbio que envolve uma alteração no metabolismo normal de carboidratos, li- pídeos, proteínas, ácidos nucleicos ou uma combinação dos mesmos. Um distúrbio metabólico está associado a uma deficiência ou excesso em uma via metabólica, resultando em um desequilíbrio no metabolismo de ácidos nucléicos, proteínas, lipídeos e/ou carboidratos. Fatores que afetam o metabolismo incluem, e não estão limitados a, sistema de con- trole endócrino (hormonal) (por exemplo, a via da insulina, os hormônios enteroendócrinos incluindo GLP-1, PYY ou semelhantes), o sistema de controle neural (por exemplo, GLP-1 no cérebro) ou semelhantes. Exemplos de distúrbios metabólicos incluem, mas não estão limitados a, diabetes (por exemplo, diabetes tipo I, diabetes tipo II, diabetes ges- tacional), hiperglicemia, hiperinsulinemia, resistência à insulina e obesi- dade.
[0095] Em algumas modalidades, uma doença é caracterizada por disfunção celular. Por exemplo, uma doença pode ser uma doença mi- tocondrial. Doenças mitocondriais não limitantes incluem ataxia de Frei- drich, doença de alphers, síndrome de barth, defeitos de oxidação beta, deficiência de carnitina, deficiência de CPT I e depleção de DNA mito- condrial. A disfunção celular pode incluir disfunção mitocondrial, disfun- ção de replicação de RNA, disfunção de replicação de DNA, disfunção de translação e/ou disfunção de enovelamento de proteína.
[0096] Em algumas modalidades, a doença ou condição causada por madeira, sangramento, lesões (por exemplo, ossos quebrados, feri- mento por arma de fogo, corte, cicatrizes durante a cirurgia (por exem- plo, cesariana).
[0097] Em algumas modalidades, a doença é uma doença infecci- osa (por exemplo, uma doença causada por um patógeno e/ou vírus). Exemplos não limitantes de doenças infecciosas incluem tuberculose, HIV/AIDS, raiva, peste, cólera, dengue, sarampo, malária, meningite, coqueluche, doença de Lyme, gripe, hepatite C, febre tifoide e poliomi- elite.
[0098] "Causas celulares de envelhecimento", quando aqui usado, incluem perda ou modificação de informações epigenéticas.
[0099] Os termos “c-Myc” ou “Myc” referem-se a uma fosfoproteína nuclear que foi implicada na progressão do ciclo celular. c-Myc é capaz de formar um heterodímero com o fator de transcrição MAX, e o hetero- dímero é capaz de se ligar a uma sequência de consequência da caixa E em ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) para regular a transcrição de genes alvo.
Em certas modalidades, uma se- quência de nucleotídeos que codifica c-Myc compreende uma sequên- cia que é de pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência conforme descrito no banco de dados de NCBI RefSeq sob o número de acesso NM_001354870.1 ou NM_002467.5. Em certas modalidades, uma sequência de aminoácidos que codifica c-Myc compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NP_002458.2 ou NP_001341799.1. Em certas modalidades, os métodos compreen- dem induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combina- ção destes na ausência de expressão de indução de c-Myc ou na au- sência de ativação de c-Myc.
A ausência de expressão de indução de c-Myc pode referir-se à ausência de indução substancial de expressão de c-Myc sobre os níveis endógenos de expressão de c-Myc em uma célula, tecido, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos.
Ausên- cia de indução substancial de expressão de c-Myc em comparação com os níveis endógenos de expressão de c-Myc em uma célula, tecido, in- divíduo ou qualquer combinação dos mesmos, pode referir-se ao au- mento da expressão de c-Myc em inferior a 70 %, inferior a 60 %, inferior a 50 %, inferior a 40 %, inferior a 30 %, inferior a 20 %, inferior a 10 % ou quaisquer valores entre em comparação com os níveis endógenos de expressão de c-Myc na célula, tecido, indivíduo ou qualquer combi- nação dos mesmos.
Ausência de ativação da expressão de c-Myc pode referir-se à ausência de ativação substancial de c-Myc (por exemplo,
atividade) sobre a atividade de c-Myc endógena em uma célula, tecido, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos. Ausência de indução substancial da atividade de c-Myc em comparação com a atividade en- dógena de c-Myc em uma célula, tecido, indivíduo ou qualquer combi- nação dos mesmos, pode referir-se ao aumento da atividade de c-Myc em inferior a 70 %, inferior a 60 %, inferior a 50 %, inferior a 40 %, inferior a 30 %, inferior a 20 %, inferior a 10 % ou quaisquer valores entre em comparação com a atividade endógena de c-Myc na célula, tecido, indi- víduo ou qualquer combinação dos mesmos.
[00100] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeutica- mente eficaz", quando aqui usados, referem-se à quantidade ou con- centração de um composto inventivo, que, quando administrado a um indivíduo, é eficaz para tratar pelo menos parcialmente uma condição da qual o indivíduo está sofrendo.
[00101] Quando aqui usado, uma proteína que é "funcional" ou "ativa" é aquela que retém sua atividade biológica (por exemplo, capaz de atuar como um fator de transcrição ou como um agente indutor). Por outro lado, uma proteína que não é funcional ou é inativa é aquela que não é capaz de realizar uma ou mais de suas funções tipo selvagem.
[00102] O termo "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que expressa uma proteína, incluindo sequências reguladoras precedendo (sequências não codifi- cantes 5') e após (sequências não codificantes 3') a sequência codifi- cante. “Gene nativo” refere-se a um gene encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" ou "construto quimérico" refere-se a qualquer gene ou construto, não um gene nativo, compreendendo sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimé- rico ou construto quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de uma maneira diferente daquela encon- trada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" refere-se a um gene não normalmente encontrado no organismo hos- pedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transfe- rência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um “trans- gene” é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.
[00103] "Homólogo" ou "homólogos" refere-se a sequências (por exemplo, ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) ou sequências de aminoácidos) que compartilham uma certa identidade percentual (por exemplo, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo me- nos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, pelo menos73 %, pelo menos 74 %, pelo menos 75 %, pelo menos 76 %, pelo menos 77 %, pelo menos 78 %, pelo me- nos 79 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo me- nos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade percentual). As sequências homólogas incluem, mas não estão limitadas a sequências parálogas ou ortólogas. As sequências paralógicas surgem da duplica- ção de um gene dentro do genoma de uma espécie, enquanto as se- quências ortólogas divergem após um evento de especiação. Um ho-
mólogo funcional retém uma ou mais atividades biológicas de uma pro- teína tipo selvagem. Em certas modalidades, um homólogo funcional de OCT4, KLF4 ou SOX2 retém pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 % da atividade biológica (por exemplo, atividade do fator de trans- crição) de uma contraparte tipo selvagem.
[00104] "KLF4" também pode ser referido como fator 4 semelhante a Kruppel, EZF ou GKLF e é um fator de transcrição de dedo de zinco. KLF4 foi implicado na regulação da diferenciação e proliferação e é ca- paz de interagir com coativadores, incluindo membros da família de co- ativadores p300-CBP. Um fator de transcrição KLF4, homólogo (por exemplo, homólogo funcional) ou variante do mesmo, quando aqui usado, pode ser derivado de qualquer espécie, incluindo humanos. Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que codifica KLF4 humana compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) descrito no banco de dados NCBI RefSeq sob o número de acesso NM_004235.5 ou NM_001314052.1. Exemplos não limitantes de variantes KLF4 incluem variante 1 do transcrição do fator 4 do tipo Krueppel e variante 2 do transcrição do fator 4 do tipo Krueppel. Em certas modalidades, KLF4 compreende uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 44. A SEQ ID NO: 5 é um exemplo não limitante de uma sequência de nucle- otídeos que codifica KLF4 de mus musculus. A SEQ ID NO: 44 é um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos que codifica
KLF4 humana. Em certas modalidades, KLF4 compreende uma se- quência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NP_001300981. 1 ou NP_004226.3. Em certas modalidades, KLF4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, KLF4 com- preende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 45. SEQ ID NO: 6 é um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos que codifica KLF4 de mus musculus. SEQ ID NO: 45 é um exemplo não limitante de uma sequên- cia de aminoácidos que codifica KLF4 humana.
[00105] "Repetições terminais invertidas" ou "ITRs" são sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que são complementos reversos uma da outra. Em geral, em um vetor AAV, ITRs são encontrados em ambos os lados de um cassete (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos). Em alguns casos, o cassete co- difica um agente indutor. Os ITRs de AAV incluem ITRs de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e suas variantes de AAV.
[00106] Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "molécula de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)", "sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)" e "oligonucleotídeo" referem-se a uma série de bases de nucleotídeos (também chamados de “nucleotídeos”) no DNA e RNA, e significa qualquer cadeia de dois ou mais nucleotídeos. Os termos "ácido nucleico" ou "sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)", "molécula de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)", "fragmento de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)" ou "polinucleotídeo" podem ser usado indistinta- mente com "gene", "mRNA codificado por um gene" e "cDNA".
[00107] Os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifi- cados) podem ser misturas quiméricas ou derivados ou versões modifi- cadas dos mesmos, de fita simples ou de fita dupla. O oligonucleotídeo pode ser modificado na fração de base, fração de açúcar ou cadeia prin- cipal de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, seus parâmetros de hibridização, etc. Uma sequência de nucleotídeos normalmente carrega informações genéticas, incluindo as informações usadas pela maquinaria celular para fazer proteínas e enzimas. Estes termos incluem genômico de fita simples ou dupla e cDNA, RNA, qual- quer polinucleotídeo sintético e geneticamente modificado, e polinucle- otídeos de sentido e antissenso. Isso inclui moléculas de fita simples e dupla, ou seja, híbridos de DNA-DNA, DNA-RNA e RNA-RNA, bem como "ácidos nucleicos de proteínas (por exemplo, ácidos nucleicos modificados)" (PNAs) formados pela conjugação de bases a uma cadeia principal de aminoácido. Isso também inclui ácidos nucleicos (por exem- plo, ácidos nucleicos modificados) contendo carboidratos ou lipídeos. DNAs exemplificativos incluem DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA), DNA de plasmídeo (pDNA), DNA genômico (gDNA), DNA complementar (cDNA), DNA antissenso, DNA de cloroplasto (ctDNA ou cpDNA), DNA de microssatélites, DNA mitocondrial (mtDNA ou mDNA), DNA de cinetoplasto (kDNA), provírus, lisogênio, DNA repe- titivo, DNA satélite e DNA viral. RNAs exemplificativos incluem RNA de fita simples (ssRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA de pequena in- terferência (siRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA mensageiro pre- cursor (pré-mRNA), RNA em formato de grampo de cabelo pequeno ou RNA em formato de grampo de cabelo curto (shRNA ), microRNA
(miRNA), RNA guia (gRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA antis- senso (asRNA), RNA nuclear heterogêneo (hnRNA), RNA codificador, RNA não codificante (ncRNA), RNA não codificador longo (ncRNA ou lncRNA longo), RNA satélite, RNA satélite viral, RNA de partícula de reconhecimento de sinal, RNA citoplasmático pequeno, RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA de interação com Piwi (piRNA), ácido polinossínico, ribozima, flexizima, RNA nucleolar pe- queno (snoRNA), RNA líder emendado, RNA viral e RNA satélite viral.
[00108] Os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifi- cados) aqui descritos podem ser sintetizados por métodos padrão co- nhecidos na técnica, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de DNA automatizado (como aqueles que estão comercialmente disponíveis na Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, os oligonucleo- tídeos fosforotioato podem ser sintetizados pelo método de Stein et al., Nucl. Acids Res., 16, 3209, (1988), oligonucleotídeos de metilfosfonato podem ser preparados pelo uso de suportes de polímero de vidro de poro controlado (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85, 7448-7451, (1988)). Uma série de métodos foi desenvolvida para liberar DNA ou RNA antissenso às células, por exemplo, moléculas antissenso podem ser injetadas diretamente no sítio do tecido, ou moléculas antissenso modificadas, modificadas para atingir as células desejadas (antissenso ligado a peptídeos ou anticorpos que se ligam especificamente recepto- res ou antígenos expressos na superfície da célula alvo) podem ser ad- ministrados sistemicamente. Alternativamente, as moléculas de RNA podem ser geradas por transcrição in vitro e in vivo de sequências de DNA que codificam a molécula de RNA antissenso. Essas sequências de DNA podem ser incorporadas em uma ampla variedade de vetores que incorporam promotores de polimerase de RNA adequados, tais como os promotores de polimerase T7 ou SP6. Alternativamente, as construções de cDNA antissenso que sintetizam RNA antissenso cons- titutiva ou indutivelmente, dependendo do promotor utilizado, podem ser introduzidas de forma estável em linhagens celulares. No entanto, mui- tas vezes é difícil atingir concentrações intracelulares do antissenso su- ficientes para suprimir a translação de mRNAs endógenos. Portanto, uma abordagem preferida utiliza um construto de DNA recombinante na qual o oligonucleotídeo antissenso é colocado sob o controle de um pro- motor forte. A utilização de um tal construto para transfectar células alvo no paciente resultará na transcrição de quantidades suficientes de RNAs de cadeia simples que formarão pares de bases complementares com as transcrições do gene alvo endógeno e, assim, evitará a transla- ção do RNAm do gene alvo. Por exemplo, um vetor pode ser introduzido in vivo de modo que seja absorvido por uma célula e direcione a trans- crição de um RNA antissenso. Esse vetor pode permanecer epissomal ou tornar-se integrado cromossomicamente, desde que possa ser trans- crição para produzir o RNA antissenso desejado. Tais vetores podem ser construídos por métodos de tecnologia de DNA recombinante pa- drão na técnica. Os vetores podem ser plasmídeos, virais ou outros co- nhecidos na técnica, usados para replicação e expressão em células de mamíferos. A expressão da sequência que codifica o RNA antissenso pode ser por qualquer promotor conhecido na técnica para atuar em cé- lulas de mamíferos, de preferência humanas. Esses promotores podem ser indutíveis ou constitutivos. Qualquer tipo de plasmídeo, cosmídeo, cromossoma artificial de levedura ou vetor viral pode ser usado para preparar a construto de DNA recombinante que pode ser introduzida diretamente no sítio do tecido.
[00109] Os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifi- cados) podem ser flanqueados por sequências reguladoras naturais (controle de expressão) ou podem estar associados a sequências hete- rólogas, incluindo promotores, sítios de entrada de ribossoma interno
(IRES) e outras sequências de sítios de ligação de ribossoma, realça- dores, elementos de resposta, supressores, sequências de sinal, se- quências de poliadenilação, íntrons, regiões não codificantes 5' e 3' e semelhantes. Os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos mo- dificados) também podem ser modificados por muitos meios conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de tais modificações incluem meti- lação, "tamponamentos", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo e modificações internucleotídicas, tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforodi- tioatos, etc.). Os polinucleotídeos podem conter uma ou mais frações covalentemente ligadas adicionais, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L- lisina, etc.), intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), que- lantes (por exemplo, metais, metais radioativos, ferro, metais oxidativos, etc.) e alquiladores. Os polinucleotídeos podem ser derivados pela for- mação de um metil ou etil fosfotriéster ou uma ligação alquil fosforami- dato. Além disso, os polinucleotídeos aqui também podem ser modifica- dos com um marcador capaz de fornecer um sinal detectável, direta ou indiretamente. Marcadores exemplares incluem radioisótopos, molécu- las fluorescentes, marcadores de epítopos, isótopos (por exemplo, isó- topos radioativos), biotina e semelhantes.
[00110] Uma "molécula de ácido nucleico recombinante (por exem- plo, ácido nucleico modificado)" ou "ácido nucleico modificado" é uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que sofreu uma manipulação biológica molecular, ou seja, ácido nu- cleico de ocorrência não natural (por exemplo, molécula de ácido nu- cléico modificada) ou molécula de ácido nucléico modificada (por exem- plo, ácido nucléico modificada). Além disso, os termos "molécula de
DNA recombinante" ou "ácido nucleico modificado" referem-se a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que não ocorre naturalmente ou pode ser feita pela combinação artificial de dois segmentos separados de ácido nucleico. (por exemplo, ácido nucleico modificado), ou seja, ligando pedaços de DNA que normal- mente não são contínuos. Por "produzido de forma recombinante" en- tende-se a combinação artificial muitas vezes realizada por meios de síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados), por exemplo, por técnicas de engenharia genética usando enzimas de res- trição, ligases e semelhantes técnicas recombinantes conforme descrito por, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; (1989), ou Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (1989), and DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (ed. D. N. Glover) IREL Press, Oxford, (1985); cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
[00111] Tal manipulação pode ser feita para substituir um códon por um códon redundante que codifica o mesmo ou um aminoácido conser- vador, enquanto tipicamente introduz ou remove um sítio de reconheci- mento de sequência. Alternativamente, pode ser realizado para unir segmentos de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) de funções desejadas para gerar uma única entidade genética compre- endendo uma combinação desejada de funções não encontradas na na- tureza. Os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição são fre- quentemente o alvo de tais manipulações artificiais, mas outros alvos específicos do local, por exemplo, promotores, sítios de replicação de DNA, sequências de regulação, sequências de controle, quadros de lei- tura abertos ou outras características úteis podem ser incorporados por projeto.
[00112] "OCT4" também pode ser referido como fator de transcrição de ligação a octâmero 4, OCT3, OCT3/4, POU5F1 ou POU classe 5 homeobox 1 e é um fator de transcrição que tem sido implicado no de- senvolvimento embrionário e na determinação do destino celular.
Se- melhante a outros fatores de transcrição OCT, OCT4 é caracterizado por um domínio de ligação ao DNA bipartido denominado domínio POU.
Um fator de transcrição OCT4, homólogo ou variante do mesmo, quando aqui usado, pode ser derivado de qualquer espécie, incluindo humanos.
Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4 humano é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) descrito no NCBI RefSeq sob o número de acesso NM_002701, NM_203289, NM_001173531, NM_001285986 ou NM_001285987. Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) que codifica um OCT4 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) fornecida como SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 é um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos que codifica OCT4 de mus musculus.
Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que codifica um OCT4 humano compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) fornecida como SEQ ID NO: 40. SEQ ID NO: 40 é um exemplo não limitante de uma sequên- cia de nucleotídeos que codifica OCT4 humano.
Exemplos não limitan- tes de variantes OCT4 aqui abrangidos incluem POU5F1, variante de transcrição 1, POU5F1, variante de transcrição 2, POU5F1, variante de transcrição 3, POU5F1, variante de transcrição 4 e variante de transcri- ção POU5F1 5. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos que codifica OCT4 humano está em pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) descrito no NCBI RefSeq sob o número de acesso NP_001167002.1, NP_001272915.1, NP_001272916.1, NP_002692.2 ou NP_976034.4. Em certas modalidades, um OCT4 compreende uma sequência de ami- noácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 é um exemplo não limitante de uma sequência de amino- ácidos que codifica OCT4 de mus musculus. Em certas modalidades, um OCT4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 41. SEQ ID NO: 41 é um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos que codifica OCT4 humano. Outros fatores de transcrição OCT4 (por exemplo, de outras espécies) são conhecidos e ácidos nucleicos (por exemplo, áci- dos nucleicos modificados) que codificam fatores de transcrição OCT4 podem ser encontrados em bancos de dados disponíveis publicamente, incluindo GenBank.
[00113] O termo "promotor" refere-se a uma região de controle de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) na qual a iniciação e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) são controladas. Um promotor também pode conter sub-regiões nas quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como a poli- merase de RNA e outros fatores de transcrição. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, ativáveis, reprimíveis, específicos do tecido ou qualquer combinação dos mesmos. Um promotor conduz a expres- são ou conduz a transcrição da sequência de ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) que ele regula. Aqui, um promotor é con- siderado "operacionalmente ligado" quando está em uma localização e orientação funcional correta em relação a uma sequência de ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que regula para contro- lar ("conduzir") a iniciação transcricional dessa sequência, expressão dessa sequência ou uma combinação das mesmas.
[00114] Um promotor pode promover a expressão ubíqua ou a ex- pressão específica de tecido de uma sequência de ácido nucleico ope- racionalmente ligada (por exemplo, ácido nucleico modificado) de qual- quer espécie, incluindo humanos. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor eucariótico. Exemplos não limitantes de promotores eu- carióticos incluem TDH3, PGK1, PKC1, TDH2, PYK1, TPI1, AT1, CMV, EF1 alfa, SV40, PGK1 (humano ou camundongo), Ubc, beta actina hu- mana, CAG, TRE, UAS, Ac5, Poliedrina, CaMKIIa, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, e U6, como seria conhecido por al- guém versado na técnica (veja, por exemplo, website Addgene: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region).
[00115] Exemplos não limitantes de promotores ubíquos incluem pro- motores responsivos à tetraciclina (sob as condições relevantes), CMV (por exemplo, SEQ ID NO: 48), EF1 alfa, um promotor SV40, PGK1, Ubc, CAG, promotor do gene da beta actina humana, um promotor RSV (por exemplo, SEQ ID NO: 47), um promotor EFS (por exemplo, SEQ ID NO: 49) e um promotor compreendendo uma sequência de ativação a montante (UAS). Em certas modalidades, o promotor é um promotor de mamífero.
[00116] Exemplos não limitantes de promotores específicos de tecido incluem promotores específicos do cérebro, específicos do fígado, es- pecíficos do músculo, específicos das células nervosas, específicos do pulmão, específicos do coração, específicos do osso, específicos do in- testino, específicos da pele, específicos do cérebro e específicos do olho. Por exemplo, um promotor específico do músculo é um promotor desmina (por exemplo, uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 29). Exemplos não limitantes de promo- tores específicos do olho incluem o promotor GRK1 humano (rodopsina cinase) (por exemplo, SEQ ID NO: 50), promotor CRX (fator de transcri- ção homeobox dos cones-bastonetes) humano (por exemplo, SEQ ID NO: 51) e Promotor NRL humano (realçador do fator de transcrição do zíper de leucina da retina neural a montante do promotor do terminal TK humano).
[00117] Em algumas modalidades, um promotor é específico para células senescentes. Por exemplo, um promotor pode induzir especifi- camente a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em uma célula senescente e não em células não senescentes. Como um exemplo não limitante, o promotor p16 pode ser usado para promover a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em células senescentes.
[00118] Em algumas modalidades, um promotor da presente descri- ção é adequado para uso em vetores AAV. Veja, por exemplo, a Publi- cação do Pedido de Patente Norte-americano nº 2018/0155789, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para este propósito.
[00119] Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem CP1, CMV, EF1 alfa, SV40, PGK1, Ubc, beta actina humana, beta tubu- lina, CAG, Ac5, promotor Rosa26, promotor COL1A1, poliedrina, TEF1, GDS, CaM3 5S, Ubi, H1, U6, promotor de opsina vermelha (promotor vermelho), promotor de rodopsina (promotor rho), promotor de arrestina de cone (promotor de carro), promotor de rodopsina cinase (promotor rk). Um promotor Ubc pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 18. Em alguns casos, o promotor constitutivo é um promotor Rosa26. Em alguns casos, o pro- motor constitutivo é um promotor COL1A1. Um promotor de opsina ver- melha pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 101. Um promotor rho pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO : 102. Um promotor de arrestina de cone pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO:
103. Um promotor da rodopsina cinase pode compreender uma sequên- cia que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica para SEQ ID NO: 104. Um promotor específico de tecido pode ser usado para conduzir a ex- pressão de um ácido nucleico modificado, incluindo, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um rtTA, tTA, OCT4, KLF4, SOX2 ou qual- quer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um promotor específico de tecido é usado para conduzir a expressão de um rtTA ou rTA. Em algumas modalidades, um promotor específico de tecido é usado para conduzir a expressão de OCT4, KLF4 e SOX2. Em algumas modalidades, o promotor específico do tecido é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 101-104. Em alguns mebodiments, o promotor hRK é usado para direcionar a expressão de OCT4, KLF4 e SOX2.
[00120] Um "promotor induzível" é aquele que é caracterizado por iniciar ou realçar a atividade transcricional quando na presença de, in- fluenciado por ou contatado por um agente indutor. Um agente indutor pode ser endógeno ou uma condição normalmente exógena, composto,
agente ou proteína que contata um ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) de modo a ser ativo na indução da atividade transcricional do promotor induzível. Em certas modalidades, um agente indutor é uma proteína sensível à tetraciclina (por exemplo, tTA ou rtTA, reguladores da família TetR).
[00121] Os promotores indutíveis para uso de acordo com a presente descrição incluem qualquer promotor induzível aqui descrito ou conhe- cido por alguém versado na técnica. Exemplos de promotores indutíveis incluem, sem limitação, promotores regulados quimicamente/bioquimi- camente e fisicamente regulados, tais como promotores regulados por álcool, promotores regulados por tetraciclina (por exemplo, promotores responsivos à anidrotetraciclina (aTc) e outros sistemas promotores res- ponsivos à tetraciclina, que incluem um proteína repressora de tetraci- clina (TetR, por exemplo, SEQ ID NO: 26, ou TetRKRAB, por exemplo, SEQ ID NO: 27), uma sequência de operador de tetraciclina (tetO) e uma proteína de fusão de transativador de tetraciclina (tTA) e uma se- quência de operador de tetraciclina (tetO ) e uma proteína de fusão tran- sativadora de tetraciclina reversa (rtTA)), promotores regulados por es- teroides (por exemplo, promotores baseados no receptor de glucocorti- coide de rato, receptor de estrogênio humano, receptores de mariposa ecdisona e promotores da superfamília de receptores de esteroide/reti- noide/tireoide 25), promotores regulados por metais (por exemplo, pro- motores derivados de genes de metalotioneína (proteínas que se ligam e sequestram íons metálicos) de levedura, camundongo e humano), promotores regulados por patogênese (por exemplo, induzidos por ácido salicílico, etileno ou benzotiadiazol (BTH)), promotores induzíveis por temperatura/calor (por exemplo, promotores de choque térmico), promotores regulados por pH e promotores regulados por luz. Um exem- plo não limitante de um sistema induzível que usa um promotor regulado por luz é fornecido em Wang et al., Nat. Methods. 12 de fevereiro de
2012; 9 (3): 266-9.
[00122] Em certas modalidades, um promotor induzível compreende um elemento responsivo à tetraciclina (Tet). Por exemplo, um promotor induzível pode ser um promotor TRE3G (por exemplo, um promotor TRE3G que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 7). Como um exemplo, um promotor TRE (por exemplo, TRE2) pode compreender uma sequência de ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 23. Como um exemplo, um promotor TRE (por exemplo, à prova de P) pode compreender uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 24.
[00123] Exemplos não limitantes adicionais de promotores indutíveis incluem promotores responsivos à mifepristona (por exemplo, promotor GAL4-E1b) e promotores responsivos à cumermicina. Veja, por exem- plo, Zhao et al., Hum Gene Ther. 20 de novembro de 2003; 14 (17): 1619-29.
[00124] Um "transativador de tetraciclina reversa" ("rtTA"), quando aqui usado, é um agente indutor que se liga a um promotor TRE (por exemplo, um TRE3G, um promotor TRE2 ou um promotor à prova de P) na presença de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) e é capaz de dire- cionar a expressão de um transgene que está operacionalmente ligado ao promotor TRE. rtTAs geralmente compreendem uma proteína de li- gação ao DNA repressora de tetraciclina mutante (TetR) e um domínio de transativação (veja, por exemplo, Gossen et al., Science. 23 de Ju- nho de 1995; 268 (5218): 1766-9 e qualquer um dos domínios de tran- sativação listados aqui). O domínio TetR mutante é capaz de se ligar a um promotor TRE quando ligado a tetraciclina. Veja, por exemplo, o Pe- dido Provisório Norte-americano No. 62/738.894, intitulado MUTANT
REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES, que foi apresentado em 28 de setembro de 2018, sob o número de registro do procurador H0824.70300US00, e é aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade.
[00125] “SRY-box 2” ou “SOX2” é um membro da família de fatores de transcrição HMG-box (SOX) relacionados ao SRY. SOX2 tem sido implicado na promoção do desenvolvimento embrionário. Os membros da família de fatores de transcrição SOX (HMG-box relacionado a SRY) são caracterizados por uma sequência de DNA de alta mobilidade do grupo 5 (HMG)-box. Esta HMG box é um domínio de ligação ao DNA que é altamente conservado em todas as espécies eucarióticas. Um fa- tor de transcrição SOX2, homólogo ou variante do mesmo, quando aqui usado, pode ser derivado de qualquer espécie, incluindo humanos. Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que codifica SOX2 compreende uma sequência que é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 100 %) idêntico a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) descrito no NCBI RefSeq sob o número de acesso NM_011443.4. Em certas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um SOX2 humano compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) descrito no NCBI Re- fSeq sob o número de acesso NM_003106.4. Em certas modalidades, SOX2 compreende uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 42. SEQ ID NO: 3 é um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos que codifica SOX2 de mus musculus. SEQ ID NO: 42 é um exemplo não limitante de uma sequên- cia de nucleotídeos que codifica SOX2 humano. Em certas modalida- des, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que co- difica SOX2 humano compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à sequência de aminoácidos descrita no NCBI RefSeq sob o número de acesso NP_003097.1. Em alguns casos, SOX2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 4. Em alguns casos, SOX2 com- preende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 43. SEQ ID NO: 4 é um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos que codifica SOX2 de mus musculus. SEQ ID NO: 43 é um exemplo não limitante de uma sequên- cia de aminoácidos que codifica SOX2 humano.
[00126] Um "vetor multicistrônico" é um vetor que codifica mais de uma sequência de aminoácidos (por exemplo, um vetor que codifica OCT4 e KLF4, OCT4 e SOX2, KLF4 e SOX2, ou OCT4, SOX2 e KL4 (OSK)). Um vetor multicistrônico permite a expressão de múltiplas se- quências de aminoácidos a partir de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado). As sequências de ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codificam cada fator de transcrição (por exemplo, OCT4, KLF4 ou SOX2) podem ser conec- tadas ou separadas de modo que produzam proteínas não conectadas. Por exemplo, sítios de entrada de ribossoma interno (IRES) ou sinais de clivagem de polipeptídeo podem ser colocados entre sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codificam cada fator de transcrição em um vetor. Sinais de clivagem de polipeptí- deo exemplares incluem peptídeos 2A (por exemplo, T2A, P2A, E2A e F2A). Um peptídeo 2A pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 9. Em algumas modalida- des, um vetor de expressão da presente descrição é um vetor de ex- pressão multicistrônico.
[00127] "Revertendo o envelhecimento" ou "revertendo o envelheci- mento", quando aqui usado, refere-se à modificação das características físicas associadas ao envelhecimento. Todos os animais normalmente passam por um período de crescimento e maturação seguido por um período de declínio fisiológico progressivo e irreversível que termina em morte. O período de tempo desde o nascimento até a morte é conhecido como o tempo de vida de um organismo, e cada organismo tem um tempo de vida médio característico. O envelhecimento é uma manifes- tação física das mudanças subjacentes à passagem do tempo, medida pela porcentagem da expectativa de vida média.
[00128] Um "indivíduo" para o qual a administração é considerada inclui, mas não está limitado a, humanos (ou seja, um homem ou mulher de qualquer faixa etária, por exemplo, um indivíduo pediátrico (por exemplo, bebê, criança, adolescente) ou indivíduo adulto (por exemplo, adulto jovem, adulto de meia-idade ou adulto sênior)) e/ou outros ani- mais não humanos, por exemplo, mamíferos (por exemplo, primatas (por exemplo, macacos cinomolgo, macacos reso); mamíferos comerci- almente relevantes, como gado, porcos, cavalos, ovelhas, cabras, gatos e/ou cães) e pássaros (por exemplo, pássaros comercialmente relevan- tes, como galinhas, patos, gansos e/ou perus). Em certas modalidades, o animal é um mamífero. O animal pode ser macho ou fêmea e em qual- quer estágio de desenvolvimento. Um animal não humano pode ser um animal transgênico.
[00129] Um versado na técnica reconheceria que a idade biológica de um indivíduo pediátrico ou adulto pode variar dependendo do tipo de animal.
Como um exemplo não limitante, um camundongo adulto pode ter 1 ano de idade, enquanto um ser humano adulto pode ter mais de 21 anos.
Em algumas modalidades, um indivíduo pediátrico tem menos de 21 anos de idade, menos de 20 anos de idade, menos de 15 anos de idade, menos de 10 anos de idade, menos de 9 anos de idade, me- nos de 8 anos de idade, menos de 7 anos de idade, menos de 6 anos de idade, menos de 5 anos de idade, menos de 4 anos de idade, menos de 3 anos de idade, menos de 2 anos de idade, menos de 1 ano de idade, menos de 10 meses de idade, menos de 9 meses de idade, me- nos de 8 meses de idade, menos de 7 meses de idade, menos de 6 meses de idade, menos de 5 meses de idade, menos de 4 meses de idade, menos de 2 meses de idade, ou menos de 1 mês de idade.
Em algumas modalidades, um indivíduo adulto é pelo menos 3 semanas de idade, 1 mês de idade, pelo menos 2 meses de idade, pelo menos 3 meses de idade, pelo menos 4 meses de idade, pelo menos 5 meses de idade, pelo menos 6 meses de idade, pelo menos 7 meses de idade, pelo menos 8 meses de idade, pelo menos 9 meses de idade, pelo me- nos 10 meses de idade, pelo menos 11 meses de idade, pelo menos 1 ano de idade, pelo menos 2 anos de idade, pelo menos 3 anos de idade, pelo menos 5 anos de idade, pelo menos 10 anos de idade, pelo menos 15 anos de idade, pelo menos 20 anos de idade, pelo menos 25 anos de idade, pelo menos 30 anos de idade, pelo menos 40 anos de idade, pelo menos 50 anos de idade, pelo menos 55 anos de idade, pelo me- nos 60 anos de idade, pelo menos 65 anos de idade, pelo menos 70 anos de idade, pelo menos 75 anos de idade, pelo menos 80 anos de idade, pelo menos 90 anos de idade, ou pelo menos 100 anos de idade.
Em algumas modalidades, um indivíduo adulto de meia-idade tem entre 1 e 6 meses de idade, entre 6 e 12 meses de idade, entre 1 ano e 5 anos de idade, entre 5 anos e 10 anos de idade, entre 10 e 20 anos de idade, entre 20 e 30 anos, entre 30 e 50 anos, entre 50 e 60 anos, entre 40 e 60 anos, entre 40 e 50 anos, ou entre 45 e 65 anos de idade. Em algumas modalidades, um indivíduo adulto sênior tem pelo menos 1 mês de idade, pelo menos 2 meses de idade, pelo menos 3 meses de idade, pelo menos 4 meses de idade, pelo menos 5 meses de idade, pelo menos 6 meses de idade, pelo menos 7 meses de idade, pelo me- nos 8 meses de idade, pelo menos 9 meses de idade, pelo menos 10 meses de idade, pelo menos 11 meses de idade, pelo menos 1 ano de idade, pelo menos 2 anos de idade, pelo menos 3 anos de idade, pelo menos 5 anos de idade, pelo menos 10 anos de idade, pelo menos 15 anos de idade, pelo menos 20 anos de idade, pelo menos 25 anos de idade, pelo menos 30 anos de idade, pelo menos 40 anos de idade, pelo menos 50 anos de idade, pelo menos 55 anos de idade, pelo menos 60 anos de idade, pelo menos 65 anos de idade, pelo menos 70 anos de idade, pelo menos 75 anos de idade, pelo menos 80 anos de idade, pelo menos 90 anos de idade, ou pelo menos 100 anos de idade.
[00130] Um "terminador" ou "sequência terminadora", quando aqui usado, é uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que faz com que a transcrição pare. Um terminador pode ser unidirecional ou bidirecional. É composto por uma sequência de DNA envolvida na terminação específica de uma transcrição de RNA por uma polimerase de RNA. Uma sequência terminadora evita a ativa- ção transcricional de sequências de ácido nucleico a jusante (por exem- plo, ácido nucleico modificado) por promotores a montante. Assim, em certas modalidades, um terminador que termina a produção de uma transcrição de RNA é considerado.
[00131] O tipo de terminador mais comumente usado é um termina- dor dianteiro. Quando colocado a jusante de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é geralmente transcrita, um terminador transcricional direto fará com que a transcrição seja abortada. Em algumas modalidades, os terminadores transcricio- nais bidirecionais podem ser usados, o que geralmente faz com que a transcrição termine tanto na fita direta quanto na reversa. Em algumas modalidades, podem ser usados terminadores de transcrição reversa, que geralmente terminam a transcrição apenas na fita reversa.
[00132] Exemplos não limitantes de sequências terminadoras de ma- míferos incluem terminador de hormônio de crescimento bovino e se- quências de terminação viral, como, por exemplo, o terminador SV40, spy, yejM, secG-leuU, thrLABC, rrnBT1, hisLGDCBHAFI, metZWV, rrnC, xapR, aspA e arcA. Em certas modalidades, a sequência termina- dora é SV40 e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica para SEQ ID NO: 8.
[00133] Um sistema "Tet-Off", quando aqui usado, é um tipo de sis- tema induzível que é capaz de reprimir a expressão de um transgene particular na presença de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina (DOX)). Por outro lado, um sistema Tet-Off é capaz de induzir a expressão de um transgene particular na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxi- ciclina, DOX). Em certas modalidades, um sistema Tet-Off compreende um promotor responsivo à tetraciclina operacionalmente ligado a um transgene (por exemplo, codificando OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos) e um transativador controlado por tetraciclina (tTA). O transgene com o promotor responsivo à tetraciclina (por exem- plo, TRE3G, à prova de P ou TRE2) e o transativador controlado por tetraciclina podem ser codificados no mesmo vetor ou ser codificados em vetores separados. Veja, por exemplo, o Pedido Provisório Norte- americano No. 62/738.894, intitulado MUTANT REVERSE TE- TRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES,
que foi apresentado em 28 de setembro de 2018, sob o número de re- gistro do procurador H0824.70300US00, e é aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade.
[00134] Um sistema "Tet-On", quando aqui usado, é um tipo de sis- tema induzível que é capaz de induzir a expressão de um transgene particular na presença de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina (DOX)). Em certas modalidades, um sistema Tet-On compreende um promotor responsivo à tetraciclina operacionalmente ligado a um transgene (por exemplo, codificando OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos) e um transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA). Por exemplo, o rtTA pode ser rtTA3, rtTA4 ou variantes dos mesmos. Em certas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica rtTA3 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, uma sequência de aminoácidos que codifica rtTA3 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, em pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou pelo menos 100 %) idênticos a (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nu- cleico modificado) que codifica rtTA4 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou pelo menos 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, uma sequência de aminoácidos que codifica rtTA4 compreende uma sequência que é de pelo menos 70 % (por exemplo, em pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou pelo menos 100 %) idênticos a (SEQ ID NO: 13). O cassete de expressão que codifica um promotor responsivo à tetraciclina (por exemplo, um promotor compreendendo um TRE, incluindo TRE3G, à prova de P e TRE2) e um transativador controlado por tetraciclina re- versa pode ser codificado no mesmo vetor ou ser codificado em vetores separados. Veja, por exemplo, o Pedido Provisório Norte-americano No. 62/738.894, intitulado MUTANT REVERSE TETRACYCLINE TRAN- SACTIVATORS FOR EXPRESSION OF GENES, que foi apresentado em 28 de setembro de 2018, sob o número de registro do procurador H0824.70300US00, e é aqui incorporado por referência em sua totali- dade.
[00135] O termo "tecido" refere-se a qualquer tecido biológico de um indivíduo (incluindo um grupo de células, uma parte do corpo ou um ór- gão) ou uma parte do mesmo, incluindo vasos sanguíneos e/ou linfáti- cos, que é o objeto para o qual um composto, partícula e/ou composição da invenção é liberado. Um tecido pode ser um tecido anormal, danifi- cado ou insalubre, que pode precisar ser tratado. Um tecido também pode ser um tecido normal ou saudável que está sob um risco maior do que o normal de se tornar anormal ou insalubre, o que pode precisar ser evitado. Em certas modalidades, o tecido é considerado saudável, mas subótimo para desempenho ou sobrevivência nas condições atuais ou futuras. Por exemplo, na prática agrícola, as condições ambientais, in- cluindo condições climáticas e de cultivo (por exemplo, nutrição) podem se beneficiar de qualquer um dos métodos descritos neste documento. Em certas modalidades, o tecido é o sistema nervoso central. Em certas modalidades, o tecido se refere ao tecido do. Em certas modalidades, a célula ou tecido é do olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós-
tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino. Em certas modalida- des, o tecido está danificado (por exemplo, devido a um defeito congê- nito, uma lesão, um acidente ou uma lesão iatrogênica) e/ou é tecido envelhecido. Em certas modalidades, o tecido é um tecido profundo que pode ser alcançado com uma sonda de fibra óptica.
[00136] O termo "repressor de tetraciclina" ou "TetR" refere-se a uma proteína que é capaz de se ligar a uma sequência Tet-O (por exemplo, uma sequência Tet-O em um TRE, por exemplo, uma sequência Tet-O pode compreender SEQ ID NO: 19) na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) e evita a ligação de rtTA (por exemplo, rtTA3, rtTA4 ou suas variantes) na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxi- ciclina). Os TetRs evitam a expressão do gene de promotores que com- preendem um TRE na ausência de tetraciclina (por exemplo, doxici- clina). Na presença de tetraciclina, os TetRs não podem se ligar aos promotores que compreendem um TRE, e o TetR não pode impedir a transcrição. Exemplos não limitantes de TetRs incluem tetR (por exem- plo, SEQ ID NO: 26), tetRKRAB (por exemplo, SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, um TetR é uma fusão de TetR (por exemplo, TRSID, que pode ser criado fundindo TetR a um domínio de interação mSIN30 (SID) de Mad1). Veja, por exemplo, Zhang et al., J Biol Chem. 30 de novembro de 2001; 276 (48): 45168-74.
[00137] Quando aqui usado, um "promotor TRE" é um promotor que compreende um elemento responsivo à tetraciclina (TRE). Quando aqui usado, um TRE compreende pelo menos um (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20) sequên- cias Tet-O. Um exemplo não limitante de uma sequência Tet-O é a se- quência que é pelo menos 70 % (por exemplo, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, um promotor TRE compreende ainda um promotor mí- nimo localizado a jusante de uma sequência tet-O. Um promotor mínimo é um promotor que compreende os elementos mínimos de um promotor (por exemplo, TATA box e local de iniciação da transcrição), mas é ina- tivo na ausência de um realçador a montante (por exemplo, sequências compreendendo Tet-O). Por exemplo, um promotor mínimo pode ser um promotor CMV mínimo que compreende uma sequência de pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 20. Por exemplo, um promotor TRE pode ser um promotor TRE3G (por exemplo, um promotor TRE3G que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, um promotor TRE é um promotor TRE2 compreendendo uma sequência que é de pelo menos 70 % (por exemplo, em pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 23. Em algumas mo- dalidades, um promotor TRE é um promotor à prova de P compreen- dendo uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo me- nos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 24.
[00138] O termo "reparo de tecido", no contexto de tecido danificado, refere-se à restauração da arquitetura do tecido, função após o dano ao tecido ou uma combinação dos mesmos. A reparação do tecido inclui a regeneração do tecido, o crescimento celular, a substituição do tecido e/ou a reconfiguração do tecido existente (reprogramação).
[00139] O termo "regeneração de tecido" refere-se à produção de novo tecido ou células dentro de um tecido que são do mesmo tipo que o tecido de interesse (por exemplo, mesmo tipo que o tecido ou célula danificada). Em algumas modalidades, os métodos fornecidos neste do- cumento promovem a regeneração de órgãos.
[00140] O termo "substituição de tecido" refere-se à produção de um tipo diferente de tecido em comparação com o tecido de interesse (por exemplo, tecido conjuntivo para substituir o tecido danificado).
[00141] Quando aqui usado, os termos “tratamento”, “tratar” e “tra- tando” referem-se a reverter, aliviar, retardar o início ou inibir o pro- gresso de uma doença ou distúrbio, ou um ou mais sintomas dos mes- mos, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, o tratamento pode ser administrado após o desenvolvimento de um ou mais sintomas. Em outras modalidades, o tratamento pode ser adminis- trado na ausência de sintomas. Por exemplo, o tratamento pode ser ad- ministrado a um indivíduo suscetível antes do início dos sintomas ou pode ser tratado com outro agente prejudicial (por exemplo, à luz de uma história de sintomas, à luz de fatores genéticos ou outros fatores de suscetibilidade, uma terapia de doença ou qualquer combinação dos mesmos). O tratamento também pode ser continuado após a resolução dos sintomas, por exemplo, para prevenir ou retardar sua recorrência.
[00142] O termo "variante" se refere a uma sequência que compre- ende uma modificação em relação a uma sequência tipo selvagem. Mo- dificações não limitantes em uma sequência de aminoácidos incluem inserções, deleções e mutações pontuais. Modificações não limitantes em sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) incluem mutações de deslocamento de quadro, inserções de nu- cleotídeos e deleções de nucleotídeos.
[00143] O termo “WPRE” refere-se a um Elemento Regulador Pós- transcricional do Vírus da Hepatite da Marmota (WHP). WPREs criam estruturas terciárias em ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de ex- pressão) e são capazes de aumentar a expressão do transgene (por exemplo, a partir de um vetor viral). Em certas modalidades, uma se- quência WPRE é de pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 21.
[00144] Estes e outros substituintes exemplares são descritos em mais detalhes na Descrição Detalhada, Exemplos e reivindicações. A invenção não se destina a ser limitada de qualquer maneira pela lista exemplar de substituintes acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00145] A FIG. 1 é um esquema com uma representação linear de um vetor de expressão que codifica OCT4, SOX2 e KLF4. TRE3G é mostrado como um promotor induzível exemplar e SV40 é mostrado como uma sequência terminadora exemplar.
[00146] A FIG. 2 é um mapa vetorial de TRE3G-OSK-SV40pA, um vetor AAV que codifica OSK. Características incluindo a localização de sequências que codificam OCT4, SOX2 e KLF4 e sequências de repe- tição terminal invertida (ITRs) são indicadas.
[00147] A FIG. 3 é um mapa de vetor que mostra a localização dos sítios de digestão com enzimas de restrição em TRE3G-OSK-SV40pA.
[00148] As FIGS. 4A-4AL incluem uma série de esquemas mape- ando as características mostradas na FIG. 2 e 3 na sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) de TRE3G-OSK- SV40pA.
[00149] As FIGS. 5A-5D mostram as posições de nucleotídeos e comprimentos das sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) das características mostradas nas FIGS. 4A-4AL.
[00150] As FIGS. 6A-6C incluem dados de western blot mostrando que diferentes sorotipos de AAVs que codificam OSK (TRE3G-OSK- SV40pA, SEQ ID NO: 16) foram usados com sucesso em um sistema induzível por doxiciclina (DOX) para controlar a expressão de OSK em células 293T. A expressão de OCT4, KLF4 e H3 foi detectada com an- ticorpos. H3 refere-se à histona 3 e é um controle de corrida. A FIG. 6A mostra o efeito da doxiciclina na expressão da proteína em células in- fectadas com o vírus AAV9 contendo o vetor TRE3G-OSK-SV40pA e com o vírus AAV9 contendo um vetor que codifica rtTA3 (sistema tetra- ciclina (Tet) -on). A FIG. 6B mostra o efeito de DOX na expressão de proteínas em células infectadas com o vírus AAV2 contendo o vetor TRE3G-OSK-SV40pA e com o vírus AAV2 contendo um vetor que codi- fica tTA (sistema Tet-Off). A FIG. 6C mostra o efeito do tratamento com DOX e remoção de DOX na expressão de proteínas em células infecta- das com o vírus AAV.PHP.b contendo o vetor TRE3G-OSK-SV40pA e com o vírus AAV.PHP.b contendo um vetor que codifica rtTA3 (sistema Tet-On ) A duração do tratamento com DOX (+DOX) ou remoção do DOX (-DOX) em dias é indicada entre parênteses.
[00151] As FIGS. 7A-7F incluem dados que mostram que AAV que codifica OSK induziu reprogramação parcial e promoveu a regeneração dos nervos ópticos após o esmagamento do nervo de uma maneira in- duzível. A FIG. 7A inclui uma série de fotos que mostram que a injeção de vírus TRE-OSK-SV40 AAV e vírus CAG-tTA AAV na retina de ca- mundongo resultou na expressão de KLF4 em células ganglionares da retina de camundongo (RGCs). RBPMS (marcador RGC) e mancha- mento KLF4 de uma seção de tomografia de coerência óptica (OCT) da retina de camundongo é mostrada. A FIG. 7B inclui uma série de fotos mostrando que a injeção de vírus TRE-OSK-SV40 AAV e vírus CAG- tTA AAV resultou na expressão induzível de KLF4 e OCT4 na retina de camundongo. O manchamento OCT4 e KLF4 de uma montagem de re- tina inteira na ausência de tratamento com doxiciclina (duas fotos no topo) e após quatro dias de tratamento com DOX (duas fotos na parte inferior) é mostrada. A FIG. 7C mostra uma linha do tempo experimental para determinar o efeito do vírus TRE-OSK-SV40 AAV sozinho ou em combinação com o vírus CAG-tTA AAV na regeneração do nervo óptico após dano por esmagamento do nervo óptico. CTB significa subunidade β da toxina da cólera e permite imagens de fluorescência de axônios. A FIG. 7D mostra o manchamento de colocalização de OCT4 e KLF4 de uma retina de montagem inteira com vírus AAV TRE-OSK-SV40 inje- tado em combinação com CAG-tTA, RBPMS cora células ganglionares da retina especificamente. A FIG. 7E mostra imagens de fluorescência de axônios marcados com CTB em um nervo óptico após dano por es- magamento na retina de camundongo injetado com vírus TRE-OSK- SV40 AAV sozinho (à esquerda) ou TRE-OSK-SV40 AAV em combina- ção com CAG-tTA AAV (direita). As estrelas representam o sítio da le- são. A FIG. 7F mostra imagens de fluorescência adicionais de nervos ópticos tratados como na FIG. 7E com vírus conforme indicado.
[00152] As FIGS. 8A-8G mostra a administração de vírus que codi- fica OSK melhorou a regeneração do axônio RGC após lesão por es- magamento do nervo. A FIG. 8A mostra o efeito do vírus que codifica tTA em combinação com o vírus que codifica TRE-OSK-SV40 na au- sência de DOX (círculos, n = 9), com o vírus que codifica TRE-OSK- SV40 na presença de dox (triângulos, n = 5 ), ou com vírus que codifica d2EGFP (quadrados, controle, n = 5) na regeneração do axônio RGC. O número estimado de axônios por nervo é mostrado como uma função da distância do sítio da lesão (µm). A FIG. 8B é uma linha do tempo experimental para determinar o efeito da expressão de d2EGFP na re- generação do axônio RGC. A FIG. 8C é uma série de imagens que mos- tram axônios marcados com CTB do experimento delineado na FIG. 8B. A FIG. 8D é uma linha do tempo experimental para determinar o efeito da expressão OSK não induzida na regeneração de axônios. A FIG. 8E é uma série de imagens que mostra axônios marcados com CTB do experimento delineado na Fig. 4D. A FIG. 8F é uma linha do tempo ex- perimental para determinar o efeito da expressão de OSK induzida na regeneração de axônios. A FIG. 8G é uma série de imagens que mostra axônios marcados com CTB do experimento descrito na FIG. 8F. Estre- las indicam o sítio da lesão.
[00153] As FIGS. 9A-9D mostram que RGCs infectados por OSK têm uma taxa de sobrevivência mais alta em comparação com células não infectadas com vírus OSK após esmagamento do nervo. A FIG. 9A mos- tra o manchamento para RBPMS e GFP em RGCs não esmagados in- fectados com AAV GFP (canto superior esquerdo) e em RGCs esmaga- dos (canto superior direito). manchamento para RBPMS e KLF4 em RGCs não esmagados infectados com AAV OSK (parte inferior es- querda) e em RGCs esmagados (parte inferior direita). A FIG. 9B mostra a relação de RBPMS (proteína de ligação de RNA com splicing múltiplo) - células positivo (+) para RGCs não esmagados e esmagados infecta- dos com uma forma desestabilizada de vírus GFP (d2EGFP) ou vírus OSK. RGCs infectados com GFP têm a mesma taxa de sobrevivência que RGCs não infectados, portanto, GFP + RBPMs + % permanece o mesmo após lesão por esmagamento. RGCs infectados com OSK tive- ram o triplo da taxa de sobrevivência em comparação com RGC não infectados, portanto, KLF4 + RBPMS+ % aumentou após lesão por es- magamento. A FIG. 9C mostra RGCs sobreviventes sob condição não esmagada (esquerda) e esmagada (direita), com infecção pelo vírus OSK. A FIG. 9D mostra a sobrevivência de RGCs (RBPMS+) sob con- dição não esmagada e esmagada, quando eles foram infectados com o vírus d2EGFP ou vírus OSK.
[00154] As FIGS. 10A-10B mostram que a regeneração e proteção mediadas por OSK são independentes da ativação de mTOR. A FIG. 10A é uma série de imagens que mostra o manchamento de RBPMS e pS6 de controle e RGCs infectados por OSK que não foram esmagados ou esmagados. A FIG. 10B é um gráfico que quantifica a porcentagem de células pS6 positivas a partir de uma série de imagens como a FIG. 10A.
[00155] As FIGS. 11A-11D mostram que um sistema AAV Tet-On compreendendo um vetor CMV-rtTA (SEQ ID NO: 31) induz uma ex- pressão gênica mais rápida em comparação com um sistema AAV Tet-
Off em células retinais após o esmagamento do nervo. A FIG. 11A mos- tra uma linha do tempo experimental para testar o efeito da remoção de doxiciclina na expressão de GFP em um sistema AAV Tet-Off. As linhas indicam a duração do tratamento DOX. Os tratamentos A-D conforme indicado correspondem às fotografias 1-4 da FIG. 7B, respectivamente. A FIG. 11B é uma série de fotos que mostram os resultados do experi- mento descrito na FIG. 11A. As células GFP-positivas da retina de ca- mundongo que foram infectadas com o vírus que codifica tTA e o vírus que codifica TRE-d2EGFP nos dias indicados de remoção de DOX são mostradas. A FIG. 11C mostra uma linha do tempo experimental para testar o efeito do tratamento com doxiciclina na expressão de GFP em um sistema AAV Tet-On compreendendo um vetor CMV-rtTA (SEQ ID NO: 31). As linhas indicam a duração do tratamento DOX. Os tratamen- tos A-C conforme indicados correspondem às fotografias 1-3 da FIG. 11D, respectivamente. A FIG. 11D é uma série de fotos que mostram os resultados do experimento descrito na FIG. 11C. As células GFP-positi- vas da retina de camundongo que foram infectadas com o vírus que codifica rtTA e o vírus que codifica TRE-d2EGFP nos dias indicados de tratamento com DOX são mostradas.
[00156] A FIG. 12 é um mapa vetorial mostrando características em um vetor de vírus adenoassociado (AAV) que codifica o transativador 4 de tetraciclina reversa (rtTA4). Ubc é um promotor constitutivo que está operacionalmente ligado ao ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica rtTA4. SV40pA é uma sequência terminadora derivada de SV40. A sequência deste vetor é fornecida na SEQ ID NO:
17.
[00157] As FIGS. 13A-13C incluem dados que mostram que um sis- tema Tet-On compreendendo rtTA4 (SEQ ID NO: 13) tem baixa fluidez no fígado de camundongos. A FIG. 13A é uma série de imagens de imu-
nofluorescência que mostram a expressão de KLF4 nos fígados de ca- mundongos que receberam AAVs que abrigam ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) mostrados na FIG. 13B na au- sência de doxiciclina (sem DOX) e na presença de doxiciclina (com DOX). DAPI é um manchamento nuclear que foi usada para visualizar células. A FIG. 13B é um esquema que descreve os dois ácidos nuclei- cos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que foram administra- dos a camundongos em vírus AAV9. A FIG. 13C é um western blot de amostras de fígado de camundongos que receberam os construtos re- presentados na FIG. 13B e foram tratados sem doxiciclina ou com doxi- ciclina. Os níveis de OCT4, KLF4 e SOX2 foram detectados conforme indicado usando anticorpos. Actin é mostrado como um controle de cor- rida.
[00158] A FIG. 14 é um gráfico que compara os pesos corporais de camundongos sob vários tratamentos, conforme indicado. WT indica ca- mundongos tipo selvagem sem expressão de OSK exógena. Todos os mortos indicam que os camundongos transgênicos OSK tratados com doxiciclina estavam todos mortos.
[00159] As FIGS. 15A-15B incluem dados que mostram que a indu- ção da expressão de OCT4, KLF4 e SOX2 reverteu o envelhecimento de fibroblastos de orelha de camundongo, conforme indicado pela ex- pressão de genes de histona e Chaf (fator de montagem de cromatina), mas não induziu a expressão de Nanog. O asterisco (*) indica a expres- são endógena de KLF4 a partir das linhagens de células 293T.
[00160] A FIG. 16 é um western blot que mostra que um vetor AAV compreendendo uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é maior do que 4,7 kb entre os dois ITRs no vetor tem baixo título viral quando incorporado em um AAV e produz AAV não funcional. O vetor TRE2-OSK é fornecido como SEQ ID NO:
33. A expressão de OCT4, KLF4 e H3 foi detectada usando anticorpos.
H3 é mostrado como um controle de corrida. Asterisco (*) indica Klf4 endógeno das linhagens de células 293T.
[00161] A FIG. 17 é um western blot que mostra que a administração de mRNA modificado que codifica OCT4, SOX2 e KLF4 induziu a ex- pressão de KLF4 e OCT4 em células de camundongo. Anticorpos contra KLF4, OCT4, GAPDH e H3 foram usados para detectar as proteínas indicadas.
[00162] A FIG. 18 é um mapa vetorial de pAAV2_CMV_rtTA (VP16) (SEQ ID NO: 31). Este vetor é um exemplo não limitante de um vetor que codifica rtTA.
[00163] A FIG. 19 é um mapa vetorial de pAAV-MCS-tTA2 (ou CAG- tTA) (SEQ ID NO: 32). Este vetor é um exemplo não limitante de um vetor que codifica tTA sob um promotor CAG.
[00164] A FIG. 20 é um mapa vetorial de p-AAV-TetO-OSK-WPRE3- SV50LpA (TRE2-OSK, pAAV-TRE2-OSK-SV40LpA ou TRE2-OSK) (SEQ ID NO: 33). Este vetor é um exemplo não limitante de um vetor AAV compreendendo uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que é maior do que 4,7 kb entre os dois ITRs no vetor.
[00165] A FIG. 21 é uma série de imagens que mostra a reprograma- ção química bem-sucedida de fibroblastos embrionários de camun- dongo.
[00166] A FIG. 22 inclui um esquemático mostrando um exemplo não limitante de um sistema Tet-Off para expressar OCT4, SOX2 e KLF4 na ausência de tetraciclina (painel superior) e um esquemático mostrando um exemplo não limitante de um sistema Tet-ON para expressar OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) na presença de tetraciclina (painel inferior).
[00167] As FIGS. 23A-23C incluem dados que mostram que a admi- nistração do vírus AAV2 que codifica OCT4, SOX2 e KLF4 melhorou a regeneração do axônio e a sobrevivência RGC em camundongos adul- tos e velhos duas semanas após o esmagamento do nervo óptico. A FIG. 23A é uma série de imagens que mostra axônios marcados com CTB de camundongos nas idades indicadas (em meses) e comparando o efeito do vírus AAV2 que codifica TRE-OSK-SV40 com o efeito do vírus AAV2 que codifica GFP. Os experimentos foram conduzidos na ausência de DOX usando o sistema Tet-Off representado na FIG. 22, painel superior. A FIG. 23B quantifica o número de axônios estimados por nervo para camundongos com as idades e tratamentos indicados em função da distância do sítio da lesão (µm). A FIG. 23C é um gráfico que mostra que OSK aumentou a sobrevivência de RGCs após lesão do nervo óptico em camundongos adultos (3 meses de idade) e velhos (12 meses de idade) em comparação com GFP de controle. A sobrevi- vência de RGCs (RBPMS+) é mostrada para camundongos das idades indicadas recebendo vírus que codifica d2EGFP ou OSK.
[00168] As FIGS. 24A-24B incluem dados mostrando que aumentar o tempo de reprogramação de duas semanas para cinco semanas me- lhorou a regeneração em camundongos velhos. A FIG. 24A é uma série de fotos que mostra axônios marcados com CTB de camundongos com 12 meses de idade, cinco semanas após a lesão por esmagamento do nervo óptico. Os camundongos foram administrados com vírus que co- difica GFP ou que codificam TRE-SV40-OSK e vírus que codifica tTA antes da lesão por esmagamento do nervo. A FIG. 24B é um gráfico que quantifica o número de axônios estimados por nervo em função da dis- tância do sítio da lesão (µm) da FIG. 24A.
[00169] As FIGS. 25A-25C incluem dados que mostram que a indu- ção da expressão de OSK usando sistemas Tet-On e Tet-Off, mesmo após lesão por esmagamento do nervo óptico, melhorou a regeneração e a sobrevivência das células RGC em camundongos. A FIG. 25A inclui uma química que mostra a linha de tempo do tratamento para determi- nar o efeito da expressão de OSK antes ou depois do esmagamento do nervo óptico. No sistema Tet-On, a indução da expressão de OSK antes da lesão por esmagamento do nervo óptico (indução pré-lesão) e a in- dução da expressão de OSK após a lesão por esmagamento do nervo óptico (indução pós-lesão) são mostradas (painel superior). O trata- mento com doxiciclina foi usado para induzir a expressão de OSK. No sistema Tet-Off, a supressão da indução de OSK com tratamento com doxiciclina antes do esmagamento do nervo óptico (supressão pré-le- são) e a supressão da indução de OSK com tratamento com doxiciclina após o esmagamento do nervo óptico (supressão pós-lesão) são mos- tradas (painel inferior). As linhas sombreadas na linha do tempo indicam a duração do tratamento com doxiciclina (DOX). A injeção da subuni- dade β da toxina do colera (CTB) para imagiologia de axônios também é mostrada. A FIG. 25B é um gráfico que quantifica o número de axônios estimados por nervo em função da distância do sítio da lesão (µm) para camundongos de quatro semanas (jovens) sem indução de OSK (n = 4), indução de OSK pré-lesão apenas (n = 5), expressão de OSK supri- mida de lesão (n = 5) e indução de OSK após lesão (n = 5). Os protoco- los para indução pré-lesão e pós-lesão usados foram como mostrado na FIG. 25A. A FIG. 25C é um gráfico que quantifica o número de células RBPMS+ de camundongos de quatro semanas de idade (jovens) sem indução de OSK, indução de OSK apenas pré-lesão, OSK suprimida de lesão e indução de OSK pós-lesão.
[00170] As FIGS. 26A-26E incluem dados que mostram que a ex- pressão de OSK a partir de uma única transcrição melhorou a regene- ração do axônio e a sobrevivência das células ganglionares da retina (RGC) duas semanas após a lesão por esmagamento do nervo óptico em comparação com a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 de transcri- ções separadas. A FIG. 26A é um esquema que mostra as combinações de AAV injetadas em cada grupo duas semanas antes da lesão por es- magamento e cassetes de expressão exemplares não limitantes em sis- temas Tet-Off que codificam OCT4, SOX2 e/ou KLF4. A FIG. 26B é um gráfico que mostra que a expressão de OSK a partir de uma única trans- crição melhorou a regeneração do axônio em relação à expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 de transcrições separadas.
O número estimado de axônios por nervo após lesão por esmagamento do nervo óptico em função da distância do sítio da lesão (µm) foi quantificado para camun- dongos que receberam o vírus tTA e um dos seguintes (1) vírus OCT4, (2) vírus SOX2, (3) vírus KLF4, (4) vírus com um vetor que codifica OCT4 e SOX2 sob um promotor (OCT4-SOX2), (5) vírus OCT4, SOX2 e KLF4 separados (Oct4, Sox2, KLF4 ou O, S, K), ou (6) vírus com um vetor que codifica OCT4, KLF4 e SOX2 sob um promotor (Oct4-Sox2- KLF4 ou OSK). Os vários vetores usados estão representados na FIG. 26A.
A FIG. 26C é um gráfico que mostra que a expressão de OSK de uma única transcrição melhorou a sobrevivência de RGC em relação à expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 de transcrições separadas.
A FIG. 26D inclui manchamento de montagem inteira da retina de camundongo mostrando que uma população heterogênea de células com poucas cé- lulas RBPMS+ foi detectada quando vetores virais separados que codi- ficam OCT4, SOX2 e KLF4 em vírus separados foram liberados ao olho dos camundongos.
As setas apontam para sete tipos diferentes de cé- lulas que expressam OCT4, SOX2, KLF4 e/ou RBPMS na imagem su- perior esquerda sob o esquema dos vetores.
A FIG. 26E inclui dados que mostram que uma população de células mais homogênea foi detec- tada quando o vírus que compreende um vetor viral que codifica OSK sob um promotor foi liberado ao olho de camundongos em comparação com a FIG. 26D.
Mais células que expressam OSK que também eram RBPMS+ foram detectadas em comparação com a FIG. 26D.
Na ima- gem superior esquerda sob o esquema do vetor usado, a longa seta branca aponta para células RBPMS+ que expressam OCT4, SOX2 e KLF4 e a seta mais curta indica até mesmo algumas células que não expressaram RBPMS expressado por OSK.
[00171] A FIG. 27 é um gráfico que mostra que as DNA desmetilases de Tet1 e Tet2 desempenham um papel na regeneração induzida por OSK. O número estimado de axônios por nervo após o esmagamento do nervo óptico foi quantificado em camundongos que receberam (1) vírus OSK e um controle em formato de grampo de cabelo curto, (2) vírus OSK e um grampo de cabelo curto contra Tet1, ou (3) vírus OSK e um grampo de cabelo curto contra Tet2.
[00172] A FIG. 28 inclui dados mostrando que a expressão de OSK usando um sistema Tet-Off reverteu a perda de acuidade visual relacio- nada à idade em camundongos velhos um mês após a injeção de vírus AAV que codifica TRE-OSK e vírus AAV que codifica tTA. A FIG. 28 é um gráfico que mostra que a injeção intravitrea de camundongos com vírus que codifica tTA e vírus que codifica TRE-OSK na ausência de doxiciclina (condição de indução de OSK) reverteu a diminuição relaci- onada à idade no limiar de frequência espacial (ciclos/grau, teste de acuidade visual) observado em camundongos velhos (camundongos com 12 meses (12m) e camundongos com 18 meses (18m)). Foi utili- zado um teste de acuidade visual baseado na resposta optomotora (OMR). Como controles, os camundongos da mesma idade receberam o vírus que codifica o vírus que codifica rtTA e o vírus TRE-OSK na ausência de doxiciclina (controle não induzido). Camundongos adultos (3 meses de idade (3m)) também foram usados como controle.
[00173] A FIG. 29 inclui dados que mostram que a expressão de OSK reverteu o declínio relacionado à idade na função das células ganglio- nares da retina (RGC) em camundongos velhos. A FIG. 29 é um gráfico que mostra a medição de ondas elétricas geradas a partir de RGCs de camundongos adultos (3 meses de idade (3m)) e com idade (12 meses
(12m) e 18 meses de idade (18m)). Foi utilizado um eletrorretinograma padrão (padrão ERG). Os camundongos foram injetados com vírus rtTA e vírus TRE-OSK sem doxiciclina (controle não induzido (ctl)) ou com vírus tTA e vírus TRE-OSK (induzido, OSK) sem doxiciclina. Os resulta- dos foram obtidos um mês após a injeção do vírus.
[00174] As FIGS. 30A-30E incluem dados que mostram que a ex- pressão de OSK melhorou os declínios induzidos por glaucoma na acui- dade visual e função RGC em camundongos de um mês de idade. A FIG. 30A é um gráfico que mostra que glaucoma induzido por microcon- tas de poliestireno, conforme medido por um aumento na pressão intra- ocular (IOP) em comparação com o tratamento com solução salina em camundongos C57BL/6J adultos. As medições de IOP são mostradas nas primeiras quatro semanas após a injeção de microcontas. As FIGS. 30B-30C mostram que 4 semanas após a injeção de microcontas na câmara anterior do olho, houve perda significativa de densidade de axô- nio e densidade de RGC. Os AAVs foram injetados por via intravítrea 3 semanas após as micropérolas e ocorreram outra semana antes de a expressão de OSK ser observada. A FIG. 30B inclui um gráfico que quantifica a densidade de axônio (painel esquerdo) usando mancha- mento de p-fenilenodiamina (PPD) (mostrado, por exemplo, à direita). A FIG. 30C inclui um gráfico que quantifica a densidade celular RGC (pai- nel esquerdo) usando manchamento Brn3a (mostrado, por exemplo, à direita). A FIG. 30D é um gráfico que mostra a melhora da acuidade visual pelo tratamento AAV OSK em camundongos induzidos por glau- coma. Os camundongos foram injetados por via intravítrea com micro- contas para induzir glaucoma ou solução salina sem microcontas (sem controle de glaucoma; solução salina). Três semanas após a injeção de microcontas, os camundongos são então tratados com (1) vírus que co- difica rtTA e vírus TRE-OSK na ausência de doxiciclina (contas (OSK AAV OFF)); (2) vírus que codifica tTA e vírus que codifica TRE-OSK na ausência de doxiciclina (grânulos (OSK AAV ON)). Os resultados 3 se- manas após a injeção de solução salina ou microcontas (injeção pré- AAV) e 4 semanas após a injeção de AAV (7 semanas após a injeção de microcontas) são mostrados. A FIG. 30E é um gráfico que mostra os resultados da função RGC por padrão de camundongos com eletrorre- tinogramina tratados como na FIG. 30B.
[00175] As FIGS. 31A-31C incluem dados que mostram que a ex- pressão de OSK promoveu sobrevivência neuronal e regeneração de axônio de células neuronais SH-SY5Y humanas após dano induzido por vincristina (VCS). A FIG. 31A inclui uma série de imagens que mostram o efeito de induzir a expressão de OSK (OSK On) em comparação com a ausência de indução de expressão de OSK (OSK Off) na estrutura dos neurônios. As imagens foram tiradas no dia 3 e no dia 9 após 24 horas de tratamento com VCS. Os contornos da área das células neuronais são mostrados no Dia 9. A FIG. 31B é um gráfico que quantifica a área de célula de neurônio (µm2) nos dias indicados após 24 horas de trata- mento com VCS para células em que a expressão de OSK foi induzida (OSK On) e para células nas quais a expressão de OSK não foi induzida (OSK Off). A FIG. 31C é um gráfico que quantifica a área de célula de neurônio (µm2) nos dias indicados após 48 horas de tratamento com VCS para células em que a expressão de OSK foi induzida (OSK On) e para células nas quais a expressão de OSK não foi induzida (OSK Off).
[00176] As FIGs. 32A-32G mostram que a reprogramação parcial com OSK policistrônico distribuído por AAV não é tóxica e induz a rege- neração do axônio do SNC. A FIG. 32A é um esquema dos vetores AAV Tet-On e Tet-Off usados no estudo para controlar a expressão de OSK. A FIG. 32B mostra o peso corporal de camundongos WT, camundongos transgênicos OSK e camundongos expressando OSK mediados por AAV (cópias do gene 1.0x1012) com ou sem indução de doxiciclina nas primeiras 4 semanas (n = 5,3,6,4,6,3, respectivamente). A FIG. 32C é um esquema que mostra a injeção intravítrea de AAV para direcionar as células ganglionares da retina. Imunofluorescência do visor totalmente montado e seção transversal da retina, mostrando a taxa de infecção e a camada de retina direcionada. As barras de escala representam 1 mm e 100 µm, respectivamente. A FIG. 32D mostra um esboço experimental do estudo de esmagamento do nervo óptico usando o sistema Tet-Off. A FIG. 32E mostra a quantificação das fibras em regeneração por para d2EGFP, Oct4, Sox2, Klf4, OS, O+S+K ou AAV OSK em diferentes dis- tâncias distais ao sítio da lesão. Barras de erro indicam s.e.m. (n = 4-7). ****, P < 0,0001, ANOVA com pós-testes de Bonferroni. A FIG. 32F mos- tra a sobrevivência de células RBPMS-positivas na camada RGC trans- duzida com diferentes vetores AAV no dia 14 após a lesão por esmaga- mento (n = 4-8). ***, P < 0,001, ****, P < 0,0001, ANOVA unilateral com pós-testes de Bonferroni, em relação ao d2EGFP. A FIG. 32G mostra imagens representativas de seções de nervo óptico mostrando axônios marcados com CTB em camundongos tipo selvagem com injeção intra- vítrea de AAV2-tTA e TRE-OSK na presença e ausência de DOX em 2 semanas após a lesão do nervo óptico. O sítio de esmagamento é indi- cado por asteriscos. As barras de escala representam 200 µm.
[00177] As FIGs. 33A-33K mostram que a expressão de OSK pro- move a regeneração de axônios e a sobrevivência neuronal por meio de um mecanismo dependente de Tet. A FIG. 33A mostra estratégias ex- perimentais para indução pré e pós-lesão da expressão de OSK. A FIG. 33B mostra a sobrevivência de RGC em retinas com expressão de OSK pré e pós-lesão. A FIG. 33C mostra a quantificação de fibras em rege- neração de modelos de expressão OSK pré e pós-lesão. A FIG. 33D mostra imagens representativas de nervos ópticos mostrando axônios em regeneração 4 semanas após a lesão, com ou sem expressão de OSK pós-lesão. O sítio de esmagamento é indicado com asteriscos. As barras de escala representam 200 µm. FIGs. 33E-33F mostram a quan- tificação de fibras em regeneração e sobrevivência de RGC em retinas co-transduzidas com vetores AAV2 que codificam vetores OSK, tTA e shRNA policistrônicos com uma sequência embaralhada (Scr), Tet1 ou sequências Tet2 para nocaute de dioxigenases/desmetilases de DNA de Tet. A FIG. 33G mostra contornos experimentais para examinar a regeneração de axônios em neurônios humanos após danos à vincris- tina (VCS). A FIG. 33H mostra que OSK rejuvenesce os neurônios hu- manos de acordo com o relógio da pele e do sangue. No painel superior da FIG. 33H, o valor P é calculado pelo modelo de regressão linear para ver se DNAmAge diminui com o tempo. No painel inferior da FIG. 33H, é mostrada a idade de metilação do DNA de neurônios humanos com expressão de OSK pré (Dia -) ou após o dano de VCS (Dia 1 e 9), esti- mada por relógios de pele e células sanguíneas. A FIG. 33I mostra a área de neurito em cada grupo de tratamento AAV. * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,0001, ANOVA unilateral com teste de comparação múl- tipla de Tukey. A FIG. 33J mostra imagens representativas de neurônios humanos e da área de neurito após 9 dias de recuperação do dano VCS. A FIG. 33K mostra idade de metilação de rDNA de RGCs de 1 mês de idade isolados de retina intacta com axônio infectada com ou sem GFP, ou de retinas com lesão de axônio infectadas com GFP-AAV ou OSK- AAV 4 dias após o esmagamento do nervo.
[00178] As FIGs. 34A-34H mostram a reversão do glaucoma pelo tratamento AAV OSK. A FIG. 34A é um esquema que mostra o esboço experimental. A FIG. 34B mostra a pressão intraocular medida sema- nalmente por tonometria de rebote durante as primeiras 4 semanas após a injeção de microcontas. A FIG. 34C mostra micrografias repre- sentativas de seções transversais de nervo óptico manchadas com PPD em 4 semanas após a injeção de AAV2 ou PBS. Barras de escala, 50 µm. OSK Off (rtTA+TRE-OSK); OSK On (tTA+TRE-OSK). A FIG. 34D mostra uma quantificação de axônios saudáveis do nervo óptico 4 se- manas após a injeção de PBS ou AAV. A FIG. 34E é um esquema de ensaio de estimulação visual de alto contraste para medir a resposta optomotora. Um movimento reflexivo da cabeça em resposta à rotação de um padrão de listras em movimento que aumenta na frequência es- pacial foi usado para avaliar a visão. A FIG. 34F mostra a resposta de limiar de frequência espacial de cada camundongo medido antes do tra- tamento e 4 semanas após a injeção intravítrea de vetores AAV.FIG. 34G mostra formas de onda pERG representativas registradas do mesmo olho na linha de base antes do tratamento e quatro semanas depois do tratamento com OSK-OFF AAV (gráfico superior) ou OSK-ON AAV (gráfico inferior). A FIG. 34H mostra as amplitudes médias de pERG de registros medidos de cada camundongo na linha de base an- tes do tratamento e 4 semanas após a injeção intravítrea de AAVs. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001, **** P < 0,0001 ANOVA de dois fatores com pós-testes de Turquia entre os grupos foi usado para o efeito geral de tempo e tratamento. Um teste t pareado foi usado para comparar antes e depois dos tratamentos.
[00179] As FIGs. 35A-35I mostram que AAV OSK induz a regenera- ção de axônios e restaura a função visual em camundongos velhos. A FIG. 35A mostra um esboço experimental para testar os efeitos do tra- tamento de AAV OSK em camundongos velhos na regeneração de axô- nios após esmagamento do nervo óptico e restauração da perda de vi- são associada ao envelhecimento fisiológico. A FIG. 35B mostra a re- generação de Axon em camundongos de 12 meses de idade com trata- mento AAV OSK ou AAV de controle (d2EGFP) após 2 ou 5 semanas após o esmagamento do nervo óptico. FIG. 35C Imagens confocais re- presentativas de seções longitudinais através do nervo óptico mos- trando axônios marcados com CTB após 5 semanas de tratamento com
OSK. A barra de escala representa 200 µm. FIG. 35D O limiar de fre- quência espacial em camundongos jovens (4 meses) e camundongos velhos (12 meses) tratados com AAVs OSK-Off ou OSK-On. As FIGs. 35E-35F mostram limiar de frequência espacial e amplitudes de pERG em camundongos velhos (12 meses) tratados com: (i) OSK-Off, (ii) OSK-On, ou (iii) OSK-On mais: nocaute mediada por sh-Scr, sh-Tet1 ou sh-Tet2 de DNA desmetilases. OSK-Off, (rtTA+TRE-OSK); OSK-On, (tTA + OSK). A FIG. 35G é um mapa de calor hierárquico agrupado que mostra a expressão de RNA-Seq de 464 genes diferencialmente expres- sos em células RGCs purificadas de camundongos jovens intactos (5 meses) ou camundongos velhos intactos (12 meses), ou camundongos velhos tratados com AAV de controle (TRE-OSK) ou OSK-On AAV. A FIG. 35H é um gráfico ascendente de alterações induzidas por OSK nos níveis de RNA versus alterações associadas à idade nos níveis de mRNA. Os pontos representam genes expressos diferencialmente em RGCs. A FIG. 35I mostra idade de metilação de rDNA de RGCs FACS de 12 meses de idade isolados de retinas infectadas por 4 semanas com AAV -OSK ou +OSK juntamente com DNAs em formato de grampo de cabelo curto com uma sequência embaralhada (sh-Scr) ou direcionados a Tet1 ou Tet2 (sh -Tet1/sh-Tet2). Critérios de exclusão de gene para a FIG. 35G e FIG. 35H: genes com baixa expressão geral (log2 (CPM) <2), genes que não mudaram significativamente com a idade (log2 ab- soluto mudança <1) ou genes alterados pelo vírus (expressos diferenci- almente entre velhos intactos e velhos tratados com TRE -OSK AAV). * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001, **** P < 0,0001. ANOVA de duas vias na FIG. 35D; ANOVA unilateral nas As FIGs. 35B, 35E e 35F.
[00180] As FIGs. 36A-36H mostram uma exploração dos efeitos do OSK (sem Myc) no envelhecimento e na segurança do AAV OSK. A FIG. 36A é um esquema de um esboço experimental do efeito de reprogra- mação de teste em fibroblastos de camundongos transgênicos jovens e velhos. A FIG. 36B mostra que a expressão de OSKM resgata mudan- ças transcricionais associadas à idade sem induzir pluripotência. Por exemplo, a expressão Nanog não é induzida. A FIG. 36C mostra que a expressão de OSK resgata mudanças transcricionais associadas à idade sem induzir pluripotência. Por exemplo, a expressão Nanog não é induzida. A FIG. 36D mostra a expressão de AAV OSK9 no fígado em comparação com camundongos transgênicos. A FIG. 36E mostra o peso corporal de camundongos WT e camundongos que expressam OSK mediados por AAV (1,0x10 ^ 12 cópias do gene no total) com ou sem doxiciclina nos 9 meses seguintes após as primeiras 4 semanas (n = 5,3,6,4, respectivamente) A FIG. 36F mostra os vetores AAV-UBC- rtTA e AAV-TRE-Luc usados para medir a distribuição nos tecidos. A FIG. 36G mostra imagens de luciferase de camundongos WT 2 meses após as injeções retro-orbitais de AAV9-UBC-rtTA e AAV9-TRE-Luc (1,0x10 ^ 12 cópias do gene no total). A doxiciclina foi liberado em água potável (1 mg/mL) por 7 dias para o camundongo mostrado à direita. A FIG. 36H mostra imagens de luciferase do olho (Ey), cérebro (Br), glân- dula pituitária (Pi), coração (He), timo (Th), pulmão (Lu), fígado (Li), rim (Ki), baço (Sp), pâncreas (Pa), testículo (Te), adiposo (Ad), músculo (Mu), medula espinhal (SC), estômago (St), intestino delgado (In) e ceco (Ce) 2 meses após a injeção retro-orbital de AAV9-UBC-rtTA e AAV9- TRE-Luc seguido de tratamento com doxiciclina por 7 dias. O sinal da luciferase está principalmente no fígado. A imagem dos mesmos tecidos com um tempo de exposição mais longo (FIG. 36H, painel inferior) re- velou níveis mais baixos de sinal de luciferase no pâncreas (o fígado foi removido).
[00181] As FIGs. 37A-37D mostram a caracterização de um sistema AAV policistrônico induzível. A FIG. 37A mostra uma análise de imuno- fluorescência da retina montada integralmente transduzida com um ve- tor AAV policistrônico que expressa OCT4, SOX2 e KLF4 na mesma célula. As setas apontam para células triplo positivas. A FIG. 37B mostra uma análise de imunofluorescência da retina montada integralmente transduzida com AAVs que codificam separadamente OCT4, SOX2 e KLF4. As setas pontilhadas apontam para células duplamente positivas. Setas sólidas apontam para células positivas simples, exceto a seta no canto inferior direito de cada imagem, que aponta para células positivas triplas. As FIGs. 37C-37D são imagens que mostram a exibição de re- tina totalmente montada de imunofluorescência RBPMS e Klf4. A FIG. 37C mostra que a expressão do sistema AAV2 Tet-Off pode ser desli- gada pela água potável Dox (2mg/mL 3 dias). A FIG. 37D mostra que a expressão do sistema AAV2 Tet-On pode ser ativada pela água potável Dox (2 mg/mL 2 dias). Barras de escala representam 1 mm.
[00182] As FIGs. 38A-38C mostram que OSK induz a regeneração de axônio de longo prazo após lesão sem proliferação de RGC. A FIG. 38A mostra o manchamento de montagem inteira da retina mostrando RGCs infectados com OSK sem marcador de proliferação Ki67 (es- querda), enquanto as células 293T em proliferação têm sinal Ki67 (di- reita). As barras de escala representam 100 µm. A FIG. 38B mostra ima- gens de todo o nervo de nervos ópticos mostrando axônios em regene- ração de controle (sem AAV) ou tratamento de AAV OSK em 3 meses após a lesão. As barras de escala representam 200 µm. A FIG. 38C mostra imagem de todo o nervo mostrando axônios regenerativos mar- cados com CTB em 16 semanas pós-lesão (wpc) em camundongos tipo selvagem dentro da injeção intravítrea de AAV2-tTA e TRE-OSK. Barras de escala representam 200 μm.
[00183] As FIGs. 39A-39D mostram que o sistema Tet-On tem uma taxa de ativação melhor e as RGCs transduzidos por OSK têm uma taxa de sobrevivência mais alta. A FIG. 39A mostra imagens representativas que mostram a expressão de d2EGFP na retina do sistema Tet-Off AAV com tratamento Dox diferente. Quando pré-tratado com DOX para su- primir a expressão (em DOX), a expressão de GFP só apareceu espar- samente após a retirada de DOX por 8 dias, muito mais fraca em com- paração com o pico de expressão (Nunca DOX). A FIG. 39B são ima- gens representativas que mostram o d2EGFP na retina do sistema Tet- On AAV. Nenhuma expressão de GFP foi observada na ausência de DOX, e a expressão de GFP atingiu o pico em 2 dias após a indução de Dox e não ficou mais forte com 5 dias de indução de DOX. A FIG. 39C mostra imagem de imunofluorescência representativa de RGCs GFP- positivos ou KLF4-positivos em amostras intactas e esmagadas. A FIG. 39D mostra a quantificação de células GFP- ou KLF4- positivas indi- cando maior taxa de sobrevivência de RGCs expressando OSK após esmagamento. Barras de escala representam 200 µm na FIG. 39A, FIG. 39B e FIG. 39C.
[00184] As FIGs. 40A-40F mostram a identificação do mecanismo epigenético subjacente ao efeito OSK. A FIG. 40A Imagens representa- tivas de montagens retinais inteiras transduzidas com d2EGFP ou OSK que codificam AAV2 na presença ou ausência de lesão por esmaga- mento. As montagens retinais inteiras foram imunocoradas para o mar- cador RGC RBPMS e o marcador de ativação mTOR pS6. A FIG. 40B mostra a quantificação de RGC % positivo em pS6 em amostras intactas e trituradas. A A FIG. 40C mostra a quantificação da taxa de transdução de shRNA-YFP AAV nos RGCs expressos por OSK. A FIG. 40D mostra imagens representativas de montagens retinais inteiras transduzidas com AAV2 que codifica OSK na combinação com sh-Scr, sh-Tet1 ou sh- Tet2 YFP AAV. As montagens retinais inteiras foram imunocoradas para Klf4. Barras de escala representam 100 µm na FIG. 40A e FIG. 40D. A FIG. 40E mostra o nível de mRNA de Tet1 versus GAPDH com trata- mento com sh-Scr ou sh-Tet1 em RGCs de camundongo na presença de expressão de OSK. A FIG. 40F mostra o nível de mRNA de Tet2 versus GAPDH com sh-Scr ou sh-Tet2 AAV em RGCs de camundongo na presença de expressão de OSK.
[00185] As FIGs. 41A-41K mostram que OSK induz de forma robusta a regeneração de axônios de neurônios humanos independente da via de mTOR. A FIG. 41A mostra imunofluorescência de neurônios huma- nos diferenciados com transdução de vetores AAV-DJ que codificam TRE-OSK e tTA (OSK On) ou TRE-OSK sozinho (OSK Off). A FIG. 41B mostra o nível de mRNA de Oct4, Sox2 e Klf4 de neurônios humanos transduzidos com vetores AAV-DJ como na FIG. 41A. A FIG. 41C mos- tra o perfil FACS das fases G1, S e G2 em células indiferenciadas e células diferenciadas com OSK On ou Off. A FIG. 41D mostra a quanti- ficação da população de células que estão em fase S de proliferação. A FIG. 41E mostra imagens representativas e a área de neurita de neurô- nios humanos após dano de vincristina com ou sem expressão de OSK. A FIG. 41F mostra a quantificação da área de neurita em diferentes pon- tos de tempo após o dano da vincristina. A FIG. 41G mostra o nível de mRNA de Tet2 com tratamento de AAV sh-Scr e sh-Tet2 em neurônios humanos. A FIG. 41H mostra o nível de fosforilação de S6 em neurônios humanos com tratamento com Rapamicina (10 nM) por 5 dias. A FIG. 41I mostra o efeito da inibição de mTOR na regeneração de axônios de neurônios diferenciados com OSK Off ou OSK On. A FIG. 41J mostra a idade de metilação do DNA de neurônios humanos antes do dano da vincristina (VCS) (Dia -) ou 1 e 9 dias após o dano na ausência de ex- pressão de OSK, estimado usando uma pele ou um relógio de células sanguíneas. A FIG. 41K mostra o nível de mRNA de Oct4 de camun- dongo com sh-Scr ou sh-Tet2 AAV em neurônios humanos na ausência ou presença de expressão de OSK.
[00186] As FIGs. 42A-42C mostram o efeito de OSK em um modelo de camundongo induzido por Microconta. A FIG. 42A mostra a quantifi- cação de RGCs e imagens microscópicas confocais representativas de montagens planas da retina manchadas com anti-Brn3a, um marcador específico de RGC e DAPI, um manchamento nuclear, 4 semanas após a injeção de microcontas ou pós-injeção de solução salina. A barra de escala representa 75 mm. A FIG. 42B mostra a quantificação de axônios saudáveis do nervo óptico e fotomicrografias representativas de cortes transversais do nervo óptico manchados com PPD, 4 semanas após a injeção de microcontas ou pós-solução salina. As barras de escala re- presentam 10 µm. A FIG. 42C mostra a quantificação de RGCs e ima- gens microscópicas confocais representativas 4 semanas após a inje- ção de AAV e 8 semanas após a injeção de microcontas ou pós-injeção de solução salina.
[00187] As FIGs. 43A-43G mostram o efeito de OSK em camundon- gos velhos. A FIG. 43A mostra o efeito da expressão de OSK na sobre- vivência de RGC em camundongos jovens, adultos e velhos após es- magamento do nervo óptico. A FIG. 43B mostra a regeneração de axô- nio promovida pela expressão de OSK em comparação com os contro- les d2EGFP em camundongos jovens (1 mês de idade), adultos (3 me- ses de idade) e velhos (12 meses de idade) em 2 semanas após a lesão. A FIG. 43C mostra uma comparação de medições de pERG em diferen- tes idades um mês após o tratamento com OSK Off ou OSK On. OSK Off, rtTA+TRE=AAV OSK; OSK On, tTA + AAV OSK. A FIG. 43D mostra a comparação da densidade de células RGC em camundongos de 4m e 12m de idade em um mês após o tratamento com OSK Off ou OSK On. A FIG. 43E mostra uma comparação da densidade do axônio em camundongos de 4m e 12m de idade em um mês após o tratamento com OSK Off ou OSK On. A FIG. 43F mostra a comparação da medição de pERG em diferentes idades em um mês após o tratamento com - OSK ou + OSK. -OSK: AAV-rtTA + AAV-TRE-OSK; + OSK: AAVtTA + AAV-TRE-OSK. A FIG. 43G mostra o limiar de frequência espacial em camundongos de 18 meses de idade tratados com AAV -OSK ou +OSK por 4 semanas.
[00188] As FIGs. 44A-44D mostram a análise de RNA-seq de genes que redefinem sua expressão pelo tratamento com Reviver. A FIG. 44A é um gráfico de dispersão de mudanças induzidas por OSK nos níveis de RNA versus mudanças associadas à idade nos níveis de mRNA. Os pontos representam genes diferencialmente expressos em RGCs. Cri- térios de exclusão de genes: genes com baixa expressão geral (log2 (CPM) <2), genes que não mudaram significativamente com a idade (log2 absoluto mudança <1) ou genes alterados pelo vírus (expressos diferencialmente entre o velho intacto e o velho tratado com TRE-OSK AAV). A FIG. 44B é um mapa de calor hierárquico agrupado que mostra a expressão de RNA-Seq de genes sensoriais em células RGCs purifi- cadas de camundongos jovens intactos (5 meses) ou camundongos ve- lhos intactos (12 meses), ou camundongos velhos tratados com AAV (TRE-OSK) ou OSK-On AAV. A FIG. 44C mostra os processos biológi- cos do topo 10 que são menores em velhos em comparação com jovens e restaurados por OSK. A FIG. 44D mostra o processo biológico supe- rior 10 que são maiores em velhos em comparação com jovens e redu- zidos por OSK.
[00189] As FIGs. 45A-45C mostram a análise do relógio de metilação de RGCs de camundongo e neurônios humanos. A FIG. 45A mostra a correlação entre a idade de metilação do rDNA e a idade cronológica de RGCs de camundongos classificados. A FIG. 45B mostra os níveis mé- dios de metilação do DNA de RGCs de diferentes idades e tratamentos. A FIG. 45C mostra os níveis médios de metilação do DNA de neurônios humanos tratados com OSK antes do tratamento com vincristina (VCS) (-) ou dias pós-dano VCS (1 e 9).
[00190] As FIGs. 46A-46B mostram que OSK media a regeneração de axônio de uma maneira dependente de Tet2. Um mouse nocaute condicional Tet2 foi usado. Olhos de camundongo foram injetados com
(1) AAV-CRE (Tet2 cKO); (2) AAV-tTA + AAV-TRE-OSK: OSK (Tet2 WT); ou (3) AAV-tTA + AAV-TRE-OSK + AAV-CRE: OSK (Tet2 cKO). A regeneração do axônio foi avaliada após esmagamento do nervo óptico. A FIG. 46A são imagens representativas do nervo óptico. A FIG. 46B é um gráfico que quantifica os números dos axônios. DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVEN-
ÇÃO
[00191] A presente descrição é baseada, pelo menos em parte, nos resultados inesperados que demonstram que a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 na ausência de expressão de c-Myc exógeno pode ser usada para promover a reprogramação parcial e regeneração de tecido in vivo. Surpreendentemente, usando o olho como um tecido modelo, como aqui descrito, em algumas modalidades, foi determinado que a combinação de OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) poderia ser usada para re- definir os padrões de expressão do gene jovem e a idade epigenética do gânglio retinal células para promover o crescimento do nervo óptico e a restauração da visão em um roedor modelo de glaucoma e em ani- mais velhos. Em algumas modalidades, as DNA desmetilases Tet1 e Tet2 são necessárias para essas atividades restauradoras, que, sem estar ligadas a uma teoria particular, sugere que o relógio de metilação do DNA não é apenas um correlato da idade, mas um regulador dela.
[00192] São fornecidos aqui, em certas modalidades, ácidos nuclei- cos modificados (por exemplo, vetores de expressão, incluindo vetores virais) que codificam OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, adenovírus, vírus do herpes ou AAV) compre- endendo o mesmo, composições farmacêuticas que compreendem os ácidos nucleicos modificados e/ou vírus recombinantes, kits compreen- dendo os ácidos nucleicos modificados e/ou vírus recombinantes, e mé- todos de regulação (por exemplo, indução, indução e parada, etc.) da reprogramação celular, reversão do envelhecimento, reparação de teci- dos, regeneração de órgãos e regeneração de tecidos.
[00193] Em certas modalidades, a expressão de um ou mais dos ge- nes é transitória (por exemplo, usando um promotor induzível para re- gular a expressão do gene). A expressão de um ou mais dos genes (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos) pode ser modulada alterando a atividade de um agente indutor. Como um exemplo não limitante, o transativador de tetraciclina (tTA) é capaz de induzir a expressão de um promotor responsivo à tetraciclina na ausên- cia de tetraciclina. Quando a tetraciclina é adicionada, o tTA não pode mais se ligar ao promotor e não pode induzir a expressão. Como outro exemplo não limitante, o transativador de tetraciclina reversa (rtTA) é capaz de induzir a expressão de um promotor responsivo à tetraciclina na presença de tetraciclina. Quando a tetraciclina é removida, o rtTA não pode mais se ligar ao promotor e não pode induzir a expressão. Conforme descrito neste documento, um vetor AAV induzível que codi- fica OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) promoveu a regeneração óptica in vivo após o dano. Portanto, a expressão desses três genes pode ser útil na regeneração de tecidos e órgãos, reparo de tecidos e órgãos, reverter o envelhecimento, tratar doenças e condições neurodegenerativas, repro- gramação celular. Conforme descrito abaixo, os vetores descritos neste documento podem ser empacotados, em alguns casos, em vírus com um título de mais de 2 x 1012 partículas por preparação e permitem o controle preciso da expressão de OSK em células de mamíferos in vitro e in vivo.
[00194] A reprogramação celular permite a produção de vários tipos de células a partir de células somáticas existentes. Embora os fatores de Yamanaka (OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc, também conhecidos cole- tivamente como OSKM) tenham demonstrado induzir pluripotência em células diferenciadas, a administração desses fatores pode induzir tera- tomas ou outros cânceres in vivo (Takahashi et al., Cell . 25 de agosto de 2006; 126 (4): 663-76); (Abad et al., Nature. 17 de outubro de 2013; 502 (7471): 340-5). Como resultado dessas preocupações com a segu- rança, o uso dos fatores de Yamanaka foi amplamente limitado a apli- cações in vitro. Além disso, os métodos existentes de terapia gênica são atormentados pela transdução gênica ineficiente e inconsistente de cé- lulas-alvo. Os ácidos nucleicos modificados, vírus recombinantes com- preendendo os mesmos, composições farmacêuticas dos mesmos e kits fornecidos neste documento superam muitas dessas limitações. Ácidos nucleicos modificados
[00195] Os ácidos nucleicos modificados da presente descrição po- dem codificar OCT4, SOX2, KLF4 e homólogos ou variantes (por exem- plo, variantes funcionais) dos mesmos, cada um sozinho ou em combi- nação. Em certas modalidades, um ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) não codifica c-Myc. Em certas mo- dalidades, um ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) não codifica um c-Myc funcional porque não possui uma sequência de c-Myc. Os ensaios para determinar a atividade do fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) são conhecidos na técnica e incluem ensaios de transcri- ção baseados em células e ensaios de transcrição in vitro. A expressão do fator de transcrição também pode ser determinada usando outros métodos, incluindo ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), western blots e quantificação de RNA (por exemplo, usando a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa).
[00196] Um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou homólogos ou variantes dos mesmos, incluindo OCT4 de mamífero, SOX2 de mamífero e KLF4 de mamífero) pode ser codificado por um único ácido nucleico ou um único ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) pode codificar dois ou mais fatores de transcrição (por exemplo, cada um operacionalmente ligado a um promotor dife- rente, ou ambos operacionalmente ligados ao mesmo promotor). Por exemplo, em certas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) pode codificar OCT4; SOX2; KLF4; OCT4 e SOX2; OCT4 e KLF4; SOX2 e KLF4; ou OCT4, SOX2 e KLF4, em qual- quer ordem.
[00197] Em certas modalidades, um ácido nucleico modificado (por exemplo, ácido nucleico modificado) codifica um agente indutor (por exemplo, tTA ou rtTA). Em certas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) pode codificar um ou mais fatores de transcrição (por exemplo, um, dois ou três fatores de transcrição) e um agente indutor. Em certas modalidades, um agente indutor é codifi- cado por um ácido nucleico separado (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que também não codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2 ou KLF4). Em certas modalidades, um agente indutor é codificado por um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) que também codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2 e/ou KLF4). Em certas modalidades, um agente indutor é codifi- cado por um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que também codifica um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos (por exemplo, OCT4; SOX2; KLF4; OCT4 e SOX2; OCT4 e KLF4; SOX2 e KLF4; ou OCT4, SOX2 e KLF4).
[00198] Os fatores de transcrição aqui descritos (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) ou agentes induto- res podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar sequências polipeptídicas conhecidas por alguém versado na técnica,
tais como aquelas encontradas em referências que compilam tais mé- todos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sam- brook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. As substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (Husa; (f) Q, N; e (g) E, D.
[00199] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos modificados da presente descrição compreendem RNA (por exemplo, mRNA) e/ou DNA. Em algumas modalidades, o RNA e/ou DNA é modificado adicio- nalmente. Como um exemplo não limitante, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) da presente descrição pode ser RNA modificado (por exemplo, mRNA) que codifica OCT4, KLF4, SOX2, um indutor ou qualquer combinação dos mesmos. Veja, por exemplo, Warren et al., Cell Stem Cell. 5 de novembro de 2010; 7 (5): 618-30. Como um exemplo não limitante, os ácidos nucleicos modificados (por exemplo, RNA, incluindo mRNA ou DNA) da presente descrição podem ser formulados em uma nanopartícula para entrega. Veja, por exemplo, Dong et al., Nano Lett. 10 de fevereiro de 2016; 16 (2): 842-8. Em algu- mas modalidades, a nanopartícula compreende galactose acetilada. Veja, por exemplo, Lozano-Torres et al., J Am Chem Soe. 5 de julho de 2017; 139 (26): 8808-8811. Em algumas modalidades, os ácidos nuclei- cos modificados (por exemplo, RNA, incluindo mRNA ou DNA) são ele- troporados ou transfectados em uma célula. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos modificados são liberados como um ácido nucleico nu (por exemplo, DNA nu ou RNA nu).
[00200] Em algumas modalidades, um ácido nucleico modificado que é formulado em uma nanopartícula para liberação não é um vetor AAV.
Os esqueletos de vetor adequados para formulação em uma nanopartí- cula incluem, mas não estão limitados a, vetores NANOPLASMIDTM e vetores de expressão de mamíferos da série NTC '8'. Exemplos não li- mitantes de estruturas de vetor para formulação em uma nanopartícula incluem NTC9385R e NTC8685. Sem estar limitado por uma teoria par- ticular, os vetores de expressão de mamíferos da série NTC '8' podem ser úteis, pois são geralmente eliminados pelas células em semanas. O vetor de expressão de mamíferos da série NTC '8' compreende um pro- motor CMV, que pode ser operacionalmente ligado a uma sequência que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos. Sem estar limitado por uma teoria particular, o vetor NANOPLASMIDTM pode ser menos imunogênico do que outros vetores e expressar em um nível mais alto e pode expressar por um longo tempo, o que poderia ser útil na expressão de longo prazo de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Em algumas modalidades, o vetor NANOPLASMIDTM pode ser útil na expressão de longo prazo de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combi- nação dos mesmos.
[00201] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos modificados que codificam OSK podem ser úteis na produção de células-tronco plu- ripotentes induzidas). Sem estar ligado a uma teoria particular, o RNA modificado (por exemplo, mRNA) pode ter uma vantagem de ativação mínima de respostas imunes inatas e citotoxicidade limitada, permitindo assim a expressão de proteína robusta e prolongada. Em algumas mo- dalidades, o RNA (por exemplo, mRNA) compreende modificações in- cluindo a substituição completa de 5-metilcitidina (5mC) por citidina ou pseudouridina (psi) por uridina.
[00202] Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 pode ser ativada usando um sistema de ativação de CRISPR. Em algumas modalidades, a expressão de um ou mais fatores de transcri- ção selecionados do grupo que consiste em OCT4, KLF4, SOX2 e suas combinações podem ser ativadas usando um sistema de ativação de CRISPR. Veja, por exemplo, Liao et al., Cell. 14 de dezembro de 2017; 171 (7): 1495-1507.e15; Liu et al., 2018, Cell Stem Cell 22, 1-10 1 de fevereiro de 2018. Em geral, um sistema de ativação de CRISPR com- preende uma nuclease Cas9 enzimaticamente morta (ou Cas9 defici- ente em nuclease (dCas9)) fundida a um complexo de ativação de trans- crição (por exemplo, compreendendo VP64, P65, Rta e/ou MPH). Exem- plos não limitantes de sequências que codificam VP64, P65, Rta e/ou MPH são fornecidos abaixo. Um VP64, P65, Rta ou MPH pode ser co- dificado por uma sequência que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a qualquer uma das sequências VP64, P65, Rta e/ou MPH aqui descritas. Esta proteína de fusão Cas9 pode ser referida como um ativador CRISPR. Um RNA guia direcionado ao promotor e/ou região realçadora de um gene de interesse é usado em um sistema de ativação de CRISPR para direcionar o complexo de ativação da trans- crição dCas9 e conduzir a expressão do gene endógeno.
[00203] Em algumas modalidades, expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos pode ser ativada usando nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALEN) ou um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN).
[00204] Os ácidos nucleicos modificados da presente descrição po- dem codificar sgRNA para direcionar e o promotor e/ou região realça- dora do locus endógeno de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 em uma célula. Os ácidos nucleicos modificados da presente descrição podem codificar sgRNA para direcionar e o promotor e/ou região realçadora do locus endógeno de um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos em uma célula. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado (por exemplo,
vetor de expressão) codifica ainda uma dCas9 (Cas9 morta) e um com- plexo de ativação transcricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH). Em algumas modalidades, a dCas9 (Cas9 morta) e um complexo de ativação transcricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH) são admi- nistrados a uma célula em um ácido nucleico modificado (por exemplo, vetor de expressão). Em algumas modalidades, o vetor que codifica o sgRNA e/ou uma dCas9 (Cas9 morta) e um complexo de ativação trans- cricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH) é um vetor viral (por exemplo, vetor AAV). Em algumas modalidades, dCas9 (Cas9 morta) e um complexo de ativação transcricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH) são introduzidos em uma célula como proteína.
[00205] Em algumas modalidades, o RNA guia direcionado ao real- çador e/ou região promotora de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 é formulado em uma nanopartícula e injetado com a proteína dCas9-VP64. Em al- gumas modalidades, o RNA guia direcionado ao realçador e/ou região promotora de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é formulado em uma nanopartícula e injetado com a proteína dCas9- VP64. Em algumas modalidades, o RNA guia e/ou ácido nucleico codi- ficando dCas9 (Cas9 morta) e um complexo de ativação transcricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH) é administrado como ácido nu- cleico nu (por exemplo, DNA nu formulado em uma nanopartícula). Em algumas modalidades, o RNA guia e/ou ácido nucleico que codifica dCas9 (Cas9 morta) e um complexo de ativação transcricional (por exemplo, VP64, P65, Rta, MPH) é liberado por meio de um vírus recom- binante (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, herpes vírus, al- favírus, vírus da vacínia ou vírus adenoassociado (AAV)).
[00206] Exemplo não limitante, as sequências de RNAs guia direcio- nados ao locus OCT4 endógeno ou ao locus SOX2 são fornecidas em Liu et al., Cell Stem Cell. 01 de fevereiro de 2018; 22 (2): 252-261.e4. Exemplos não limitantes de RNAs guia direcionados a OCT4, SOX2 e/ou KLF4 também são fornecidos em Weltner et al., Nat Commun. 6 de julho de 2018; 9 (1): 2643.
[00207] Sem estar ligado a uma teoria particular, o uso de um sis- tema CRISPR-CAS9 para ativar a expressão endógena de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 na ausência de expressão de c-Myc pode evitar a toxicidade potencial associada à expressão do gene exógeno e/ou expressão do gene superfisiológico.
[00208] Os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifi- cados) que codificam um fator de transcrição (OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) ou que codificam um agente indu- tor) podem ser introduzidos em um vetor de expressão usando técnicas convencionais de clonagem. Os vetores de expressão adequados in- cluem vetores com um promotor (por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível, incluindo um promotor TRE) operativamente ligado a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, SOX2, KLF4, ou qualquer combinação dos mesmos, e um se- quência de terminação (por exemplo, uma sequência de SV40 como aqui descrito). Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) codifica um promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente indutor. Em algumas modalidades, um vetor compreende uma sequência WPRE. Os vetores de expressão contendo os elementos necessários para a expressão es- tão disponíveis comercialmente e são conhecidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Quarta Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012).
[00209] Os vetores da invenção podem compreender ainda uma se- quência de marcador para uso na identificação de células que foram ou não foram transformadas ou transfectadas com o vetor, ou foram repro- gramadas. Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou sensibilidade a antibióticos (por exemplo, genes de resistência à ampicilina, genes de resistência à canamicina, genes de resistência à neomicina, genes de resistência à tetraciclina e genes de resistência ao cloranfenicol) ou ou- tros compostos, genes que codificam enzimas com atividades detectá- veis por ensaios padrão conhecidos na técnica (por exemplo, β-galac- tosidase, beta-galactosidase associada à senescência, luciferase ou fosfatase alcalina) e genes que afetam visivelmente o fenótipo de célu- las transformadas ou transfectadas, hospedeiros, colônias ou placas (por exemplo, proteína fluorescente verde). Em algumas modalidades, os vetores usados aqui são capazes de replicação autônoma e expres- são dos produtos de genes estruturais presentes nos segmentos de DNA aos quais estão operacionalmente ligados.
[00210] Em certas modalidades, o vetor de expressão compreende um promotor induzível (por exemplo, um promotor responsivo à tetraci- clina) operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combina- ção dos mesmos). Em certas modalidades, o promotor operacional- mente ligado a uma sequência que codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) é um promotor específico do tecido ou específico do tipo de célula (por exemplo, promotor específico do cérebro, específico do fígado, especí- ficos do músculo, específico da célula nervosa, específico da célula glial, específico da célula endotelial, específico do pulmão, específico do co- ração, específico do osso, específico do intestino, específico da pele ou específico do olho). Como um exemplo, o promotor específico do mús- culo pode ser um promotor de desmina (por exemplo, uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 29). Em algumas modalidades, um promotor específico do olho pode ser um pro- motor que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 101-104.
[00211] Em certas modalidades, o promotor operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) é específico para a idade ou senescência (por exemplo, o promotor específico para a idade ou senescência pode ser um promotor p16 ou um fator de trans- crição dirigido por Cas9 que se liga ao DNA metilado, que se acumula com a idade).
[00212] Em certas modalidades, um vetor de expressão compreende um promotor constitutivo operacionalmente ligado a um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, tal vetor pode ser inativado usando um sistema de repetições palindrô- micas curtas com espaçamento regular entre espaçamento agrupado (CRISPR)/RNA guia. Por exemplo, um RNA guia pode ser complemen- tar ao vetor e é capaz de direcionar uma nuclease Cas9 para o vetor. Em algumas modalidades, o RNA guia é complementar a um transgene (por exemplo, transgene que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma com- binação dos mesmos) em qualquer um dos vetores de expressão aqui descritos. Cas9 pode, então, gerar quebras de fita dupla no vetor e/ou transformar o vetor, tornando o vetor inativo.
[00213] Em certas modalidades, o promotor operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um agente indutor é um promotor consti- tutivo (por exemplo, CMV, EF1 alfa, um promotor SV40, PGK1, UBC, CAG, promotor do gene da beta actina humana ou UAS). Em certas modalidades, o promotor operacionalmente ligado a uma sequência que codifica um agente indutor é um promotor específico do tecido (por exemplo, promotores específicos do cérebro, específicos do fígado, es- pecíficos do músculo, específicos da célula nervosa, específicos do pul- mão, específicos do coração, específicos do osso, específicos do intes- tino, específicos da pele ou promotor específico do olho). Como um exemplo, o promotor específico do músculo pode ser um promotor de desmina (por exemplo, uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 29).
[00214] Um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, um vetor de expressão) pode compreender ainda uma sequência separadora (por exemplo, um IRES ou um sinal de clivagem de polipeptídeo). Sinais de clivagem de polipeptídeo exemplares in- cluem peptídeos 2A (por exemplo, T2A, P2A, E2A e F2A). Um peptídeo 2A pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 9 . Para ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) que codificam mais de um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos), cada fator de transcrição pode ser operacionalmente ligado a um promotor diferente ou para o mesmo promotor. Os fatores de transcrição podem ser separados (por exemplo, por sequência separadora de peptídeo) no ácido nucleico. A expressão do ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) resulta em sequências de aminoácidos separadas que codificam cada fator de transcrição.
[00215] Em certas modalidades, um vetor de expressão (por exem- plo, um vetor de expressão que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos) da presente descrição pode compreender ainda um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico, incluindo blasticidina, geneticina, higromicina B, ácido micofenólico, puromicina,
zeocina, actinomicina D, ampicilina, carbenicilina, canamicina e neomi- cina) e/ou marcador detectável (por exemplo, GFP, RFP, luciferase, CFP, mCherry, DsRed2FP, mKate, biotina, marcador FLAG, marcador HA, marcador His, marcador Myc, marcador V5, etc.).
[00216] Em certas modalidades, um vetor de expressão que codifica um agente indutor da presente descrição pode compreender ainda um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico, incluindo blasticidina, geneticina, higromicina B, ácido micofenólico, puromicina, zeocina, ac- tinomicina D, ampicilina, carbenicilina, canamicina e neomicina) e/ou marcador detectável (por exemplo, GFP, RFP, luciferase, CFP, mCherry, DsRed2FP, mKate, biotina, marcador FLAG, marcador HA, marcador His, marcador Myc, marcador V5, etc. )
[00217] Em certas modalidades, um vetor de expressão (por exem- plo, codificando OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mes- mos) está presente em um vetor viral (por exemplo, vetor AAV). Em cer- tas modalidades, um vetor de expressão que codifica um agente indutor está presente em um vetor viral (por exemplo, vetor AAV). Um vetor AAV, quando aqui usado, geralmente compreende ITRs flanqueando um cassete de expressão (por exemplo, um ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) compreendendo uma sequência promo- tora operacionalmente ligada a uma sequência que codifica OCT4, SOX2, KLF4, ou qualquer combinação dos mesmos e um sequência terminadora, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) compreendendo uma sequência promotora operacionalmente li- gada a uma sequência que codifica um agente indutor, ou uma combi- nação dos mesmos).
[00218] Em certas modalidades, o número de pares de bases entre dois ITRs em um vetor AAV da presente descrição é inferior a 5 quilo- bases (kb) (por exemplo, inferior a 4,9 kb, inferior a 4,8 kb, inferior a 4,7 kb, inferior a 4,6 kb, inferior a 4,5 kb, inferior a 4,4 kb, inferior a 4,3 kb,
inferior a 4,2 kb, inferior a 4,1 kb, inferior a 4 kb, inferior a 3,5 kb, inferior a 3 kb, inferior a 2,5 kb, inferior a 2 kb, inferior a 1,5 kb, inferior a 1 kb ou inferior a 0,5 kb). Em certas modalidades, um vetor AAV com uma distância de inferior a 4,7 kb entre dois ITRs é capaz de ser empacotado em vírus a um título de pelo menos 0,5 x10 ^ 10 unidades formadoras de partículas por ml (pfu/ml), pelo menos 1x10 ^ 10 pfu/ml, pelo menos 5 x 10 ^ 10 pfu/ml, pelo menos 1 x 10 ^ 11 pfu/ml, pelo menos 5 x 10 ^ 11 pfu/ml, pelo menos 1 x 10 ^ 12 pfu/ml, em pelo menos 2 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 3 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 4 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 5 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 6 x10 ^ 12 pfu/ml/ml, pelo menos 7 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 8 x 10 ^ 12 pfu/ml, pelo menos 9 x 10 ^ 12 pfu/ml, ou pelo menos 1 x 10 ^ 13 pfu/ml.
[00219] Em certas modalidades, um vetor de expressão da presente descrição tem pelo menos 1 quilobase (kb) (por exemplo, pelo menos 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 50 kb ou 100 kb). Em certas modalidades, um vetor de expressão da presente descrição é inferior a 10 kb (por exemplo, inferior a 9 kb, inferior a 8 kb, inferior a 7 kb, inferior a 6 kb, inferior a 5 kb, inferior a 4 kb, inferior 3 kb, inferior a 2 kb ou inferior a 1 kb).
[00220] Sem ser limitado por uma teoria particular, um vetor de ex- pressão (por exemplo, um vetor AAV) que codifica OCT4, SOX2 e KLF4 sob um promotor resulta em uma transdução mais eficiente de todos os três fatores de transcrição in vivo em comparação com ácidos nucleicos separados (por exemplo, engenharia ácidos nucleicos) que codificam um ou dois dos fatores de transcrição. Em certas modalidades, a efici- ência de infecção de um vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, adenovírus, vírus do herpes ou AAV) abrigando um vetor da presente descrição em células (por exem- plo, células animais, incluindo células de mamíferos) é pelo menos 20 % (por exemplo, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50
%, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % ou 100 %). Vírus Recombinantes
[00221] Aspectos da presente descrição fornecem vírus recombinan- tes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, vírus do herpes, retrovírus ou AAVs). Os vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, vírus do herpes, retro- vírus ou AAVs) podem abrigar um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) que codifica um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer com- binação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um vírus recombinante abriga um ácido nucleico que co- difica pelo menos dois fatores de transcrição selecionados de OCT4, SOX2 e KLF4 (por exemplo, OCT4 e SOX2; KLF4 e SOX2 ; OCT4, KLF4 e SOX2; ou OCT4 e KLF4). Em algumas modalidades, um vírus recom- binante abriga um ácido nucleico que codifica pelo menos três fatores de transcrição selecionados de OCT4, SOX2 e KLF4 (por exemplo, OCT4, SOX2 e KLF4). Em alguns casos, um vírus recombinante da pre- sente descrição compreende um ácido nucleico que codifica um agente indutor.
[00222] Em certas modalidades, o vírus recombinante é um AAV re- combinante. Em algumas modalidades, um AAV recombinante tem ca- pacidades de direcionamento específico de tecido, de modo que um transgene do AAV será liberado especificamente a um ou mais tecido (s) predeterminado (s). Geralmente, o capsídeo de AAV é um fator rele- vante na determinação das capacidades de direcionamento específicas do tecido de um AAV. Uma capsídeo de AAV pode compreender uma sequência de aminoácidos derivada de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e variantes dos mes- mos. Exemplos não limitantes da especificidade de tecido de sorotipos de AAV são fornecidos na Tabela 1. Um "x" indica que o sorotipo de AAV indicado é capaz de liberar um transgene a um tecido específico. Tabela 1. Exemplos não limitantes de sorotipos de AAV e sua utili- dade em tecidos específicos. Tecido Relevante Músculo Sistema Ner- Sistema Imuno- (por exem- voso Central lógico plo, Mús- Sistema Ner- (Barreira He- (Células T, Cé- Sorotipo de AAV culo Esque- voso Central matoencefá- lulas B e Célu- Fígado Coração lético) Olho (CNS) lica) Pâncreas Pulmão las Dendríticas) AAV1 x x x AAV2 x x x x AAV3 x x x x AAV4 x x x AAV5 x x x x AAV6 (por exemplo, AAV6.2) x x x x AAV7 x x AAV8 x x x x AAV9 x x x x x x x x AAV10 (por exemplo, AAVrh10) x x x x x x x x AAVDJ x x x AAVPHP.B x x
[00223] Os AAVs recombinantes compreendendo uma proteína de capsídeo particular podem ser produzidos usando qualquer método adequado. Veja, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Norte- americano US 2003/0138772, que é aqui incorporado por referência. Sequências de proteínas de capsídeo de AAV também conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, o pedido PCT publicado, WO 2010/138263, que é aqui incorporado por referência. Geralmente, AAV recombinante é produzido em uma célula hospedeira com os seguintes componentes: (1) uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) que codifica uma proteína do capsídeo de AAV ou um frag- mento desta, (2) um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modi- ficado) que codifica um gene rep funcional, (3) um vetor AAV recombi- nante compreendendo repetições terminais invertidas de AAV flanque- ando um transgene (por exemplo, ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, KLF4, SOX2 ou uma com- binação dos mesmos), e (4) funções auxiliares que permitem o empa- cotamento do vetor AAV recombinante em proteínas de capsídeo de
AAV. Em alguns casos, um vetor AAV recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um agente indutor. Em certas modalidades, as funções auxiliares são introduzidas por meio de um vetor auxiliar que é conhecido na técnica.
[00224] Em alguns casos, uma linha celular hospedeira adequada (por exemplo, células HEK293T) pode ser usada para produzir um AAV recombinante descrito neste documento seguindo a prática de rotina. Um ou mais vetores de expressão que codificam um ou mais dos com- ponentes descritos acima podem ser introduzidos em uma célula hos- pedeira por ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados), que podem ser cultivados em condições adequadas, per- mitindo a produção de partículas de AAV. Quando necessário, um vetor auxiliar pode ser usado para facilitar a replicação, para facilitar a mon- tagem das partículas de AAV ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o vetor AAV recombinante está presente em um ácido nucleico separado (por exemplo, ácido nucleico modificado) de outros componentes (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica uma proteína do capsídeo de AAV ou um fragmento desta, um ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico modificado) que codifica um gene rep funcional e funções auxiliares que permitem o empacotamento do vetor AAV recom- binante em proteínas de capsídeo de AAV. Em certas modalidades, uma célula hospedeira pode expressar de forma estável um ou mais compo- nentes necessários para produzir Vírus AAV. Nesse caso, os compo- nentes restantes podem ser introduzidos na célula hospedeira. O sobre- nadante da cultura de células pode ser coletado e as partículas virais nele contidas podem ser coletadas por meio de metodologia de rotina. Métodos de ativação de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, e suas substituições
[00225] Aspectos da presente descrição, em algumas modalidades,
se referem à ativação de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, em uma célula, tecido e/ou órgão. Em algumas modalida- des, OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, são ativados na ausência de ativação de c-Myc. A célula, tecido e/ou órgão podem estar in vivo (por exemplo, em um indivíduo) ou ser ex vivo. Quando aqui usado, a ativação inclui qualquer ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico compreendendo RNA, compreendendo DNA ou qualquer combinação dos mesmos), proteína, anticorpo, agente quí- mico ou qualquer combinação dos mesmos que seja capaz de aumentar a atividade biológica de uma proteína de interesse (por exemplo, OCT4, SOX2 e/ou KLF4). A atividade biológica (por exemplo, expressão gê- nica, capacidade de reprogramação, atividade do fator de transcrição, etc.) pode ser medida usando qualquer método de rotina conhecido na técnica. Em algumas modalidades, qualquer ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico compreendendo RNA, compreendendo DNA ou qualquer combinação dos mesmos), proteína, anticorpo, agente quí- mico ou qualquer combinação dos mesmos aqui descritos substitui OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, qualquer ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico compreendendo RNA, compreen- dendo DNA ou qualquer combinação dos mesmos), proteína, anticorpo, agente químico ou qualquer combinação dos mesmos aqui descritos substitui OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, proteínas modificadas que codificam um agente indutor, agentes químicos capa- zes de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente indutor e/ou Os vírus recombinantes que codificam um agente indutor aqui descrito são usados para ativar um agente indutor.
[00226] A ativação de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, inclui o aumento da expressão (por exemplo, expressão de RNA e/ou proteína) de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combinação, é aumentada em pelo menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % ou 1000 % após a administração de um ácido nucleico (por exem- plo, ácido nucleico compreendendo RNA, compreendendo DNA, ou qualquer combinação dos mesmos) que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4, proteína que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4, anticorpo capaz de ativar a codificação de OCT4, SOX2 e/ou KLF4, agente químico ca- paz de ativar a codificação OCT4, SOX2 e/ou KLF4, ou qualquer com- binação dos mesmos a uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo em comparação com antes da administração. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4, cada um sozinho ou em combina- ção, é aumentada em pelo menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % ou 1000 % após a administração de um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico compreendendo RNA, com- preendendo DNA, ou qualquer combinação dos mesmos) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos, proteína que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos, an- ticorpo capaz de ativar a codificação de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos, agente químico capaz de ativar a codificação de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos, ou qual- quer combinação dos mesmos em uma célula, tecido, órgão e/ou indi- víduo em comparação com antes da administração.
[00227] A ativação de um agente indutor inclui o aumento da expres- são (por exemplo, expressão de RNA e/ou proteína) de um agente in- dutor. Em algumas modalidades, a expressão de um agente indutor é aumentada em pelo menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %,
60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % ou 1000 % após a administração de um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico compreendendo RNA, compreen- dendo DNA, ou qualquer combinação dos mesmos) que codifica o agente indutor, proteína que codifica o agente indutor, agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor ou qualquer combina- ção dos mesmos em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo em com- paração com antes da administração.
[00228] A expressão pode ser medida por qualquer método de rotina conhecido na técnica, incluindo a quantificação do nível de uma proteína de interesse (por exemplo, usando um ELISA e/ou análise de western blot com anticorpos que reconhecem uma proteína de interesse) ou quantificação de RNA (por exemplo, mRNA) níveis para um gene de interesse (por exemplo, usando a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa).
[00229] Além dos ácidos nucleicos modificados aqui discutidos, OCT4, SOX2, KLF4, sozinhos ou em combinação, podem ser ativados em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo por meio do uso de proteí- nas modificadas. Por exemplo, a proteína que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4 pode ser gerada (por exemplo, de forma recombinante ou sintética) e administrada a uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo por qualquer via adequada. Por exemplo, proteína que codifica um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos podem ser gera- das (por exemplo, de forma recombinante ou sintética) e administradas a uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo por qualquer via adequada.
[00230] Em algumas modalidades, ativação da expressão de OCT4; SOX2; KLF4; uma substituição; ou qualquer combinação dos mesmos a partir de um vetor de expressão induzível por tetraciclina compreende a administração de uma tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) a uma célula, órgão, tecido ou um indivíduo. Como alguém versado na técnica apreciaria, a via de administração de tetraciclina pode ser dependente do tipo de célula, órgão, tecido e/ou características de um indivíduo. Em algumas modalidades, a tetraciclina é administrada diretamente a uma célula, órgão e/ou tecido. Como um exemplo não limitante, a tetraciclina pode ser administrada ao olho de um indivíduo através de qualquer mé- todo adequado, incluindo colírios compreendendo tetraciclina, dispositi- vos de liberação prolongada (por exemplo, microbombas, partículas e/ou depósitos de fármacos) e lentes de contato medicamentosas com- preendendo uma tetraciclina). Em algumas modalidades, a tetraciclina é administrada sistemicamente (por exemplo, através de água potável ou injeção intravenosa) a um indivíduo. A tetraciclina pode ser adminis- trada topicamente (por exemplo, em um creme) ou através de uma bomba subcutânea (por exemplo, para liberar tetraciclina a um tecido específico). A tetraciclina pode ser administrada intravenosamente, in- tradermicamente, intra-arterialmente, intralesionalmente, intratumoral- mente, intracranianamente, intra-articularmente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intranasalmente, intravitreamente, intravaginal- mente, intraretalmente, topicamente, intratumoralmente, intramuscular- mente, intraperitonealmente, subcutaneamente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosalmente, intrapericardicamente, intraumbili- calmente, intraocularmente, oralmente, topicamente, localmente, siste- micamente, injeção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada, ba- nhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter, em cremes, em partículas (por exemplo, nanopartículas, micropartículas), em com- posições lipídicas (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação dos anteriores, como seria conhecido por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sci- ences (1990), aqui incorporado por referência).
[00231] Como um exemplo não limitante, uma proteína modificada pode ser ainda modificada ou formulada para liberação a uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo. Por exemplo, os domínios de transdução de proteína (isto é, PTD ou peptídeos de penetração celular) podem ser anexados a uma proteína modificada (por exemplo, OCT4, SOX2 e/ou KLF4). Como um exemplo não limitante, um domínio de transdução de proteína (isto é, PTD ou peptídeo de penetração celular) pode ser ane- xado a uma proteína modificada que codifica um agente indutor. Sem estar limitado por uma teoria particular, um domínio de transdução de proteína facilita a liberação de uma carga (por exemplo, uma proteína, ácidos nucleicos, nanopartículas, partículas virais, etc.) através das membranas celulares. Os domínios de transdução de proteína incluem peptídeos catiônicos, peptídeos hidrofóbicos e/ou peptídeos específicos de células. Veja, por exemplo, Zhou et al., Cell Stem Cell. 8 de maio de 2009; 4 (5): 381-4; Zahid et al., Curr Gene Ther. Out 2012; 12 (5): 374-
80.
[00232] Em algumas modalidades, uma proteína que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4 e/ou um agente indutor é formulada em uma nanopar- tícula (por exemplo, para liberação nuclear). Em algumas modalidades, uma proteína que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, OCT4 e SOX2; KLF4 e SOX2; OCT4 e KLF4; ou KLF4, SOX2 e OCT4) é formulada em uma nanopartícula (por exemplo, para nuclear Entrega). Em certas modalidades, uma nanopar- tícula compreende ainda uma proteína que codifica um agente indutor. Por exemplo, a quitosana [poli (N-acetil glucosamina)] é um polissaca- rídeo biodegradável e pode ser usada para formular nanopartículas por vários métodos. Em algumas modalidades, uma nanopartícula polimé- rica de quitosana é carregada com proteína que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4 e/ou um agente indutor e é liberado ao núcleo de uma célula. Veja, por exemplo, Tammam et al., Oncotarget. 21 de junho de 2016; 7 (25): 37728-37739.
[00233] Em algumas modalidades, um agente químico, anticorpo e/ou proteína substitui OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalida- des, um agente químico, anticorpo, proteína ou qualquer combinação dos mesmos substitui OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, OCT4 e SOX2; OCT4 e KLF4; KLF4 e SOX2; ou KLF4, SOX2 e OCT4). Por exemplo, um agente químico, anticorpo e/ou proteína pode promover a expressão de OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em certos casos, um agente químico, anticorpo e/ou proteína pode promo- ver a expressão de um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos. Em algu- mas modalidades, um agente químico, anticorpo e/ou proteína pode ati- var genes alvo a jusante de OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas mo- dalidades, um agente químico, anticorpo, proteína ou qualquer combi- nação dos mesmos pode ativar genes alvo a jusante de um ou mais fatores de transcrição selecionados do grupo que consiste em OCT4; SOX2; KLF4; e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, diz-se que um agente químico, anticorpo e/ou proteína subs- titui OCT4, SOX2 e/ou KLF4 se o agente químico, anticorpo e/ou prote- ína puder ser usado junto com os outros dois fatores de transcrição e promover a reprogramação celular. Em algumas modalidades, um agente químico, anticorpo, proteína ou qualquer combinação dos mes- mos é dito para substituir OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos se o agente químico, anticorpo, proteína ou qualquer com- binação dos mesmos pode ser usado junto com os outros dois fatores de transcrição e promovem a reprogramação celular. Por exemplo, a reprogramação celular pode ser determinada medindo a expressão gê- nica (por exemplo, expressão de marcadores embrionários e/ou marca- dores de pluripotência). Em algumas modalidades, os marcadores de pluripotência incluem AP, SSEA1 e/ou Nanog.
[00234] Em algumas modalidades, um anticorpo é usado para ativar
OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, um anticorpo é usado para ativar um ou mais fatores de transcrição selecionados de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo não tem como alvo OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, o anticorpo não tem como alvo OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo aumenta a expressão de OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algu- mas modalidades, o anticorpo aumenta a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo não aumenta a expressão de OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, um anticorpo substitui OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, o anticorpo não aumenta a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um anticorpo substitui OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer método adequado de identificação de anticorpos que podem substituir um fator de transcrição (por exem- plo, OCT4, SOX2 e/ou KLF4) pode ser usado. Qualquer método ade- quado de identificação de anticorpos que podem substituir um fator de transcrição (por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos) pode ser usado. Veja, por exemplo, Blanchard et al., Nat Biotechnol. Outubro de 2017; 35 (10): 960-968.
[00235] Em algumas modalidades, outra proteína (por exemplo, um ácido nucleico que codifica a proteína ou um polipeptídeo que codifica a proteína) pode ser usada para substituir OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, outra proteína (por exemplo, um ácido nucleico que codifica a proteína ou um polipeptídeo que codifica a proteína) pode ser usada para substituir OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, OCT4 pode ser substituído por Tet1, NR5A-2, Sall4, E-caderina, NKX3-1 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, OCT4, SOX2 e/ou KLF4 podem ser substituídos por NANOG e/ou TET2. Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos podem ser substituídos por NA- NOG e/ou TET2. Veja, por exemplo, Nat Cell Biol. Agosto de 2018; 20 (8): 900-908; Gao et al., Cell Stem Cell. 4 de abril de 2013; 12 (4): 453-
69. Nanog e Lin28 podem substituir Klf4. Veja, por exemplo, Yu et al, Science. 318, 1917-1920, 2007). Em algumas modalidades, OCT4, SOX2 e/ou KLF4 é substituído por Tet3 (tet metilcitosina dioxigenase 3). Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é substituído por Tet3 (tet metilcitosina dioxigenase 3). Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um Tet1 DNA desmetilase compreende uma sequência que é de pelo menos 70 % (por exemplo, em pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a NM_030625.3 ou NM_001253857.2. Em algu- mas modalidades, um aminoácido que codifica um Tet1 DNA desmeti- lase compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NP_085128.2 ou NP_001240786.1. Em algumas modalida- des, um ácido nucleico que codifica uma Tet2 DNA desmetilase com- preende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo me- nos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NM_001127208.2, NM_001040400.2, NM_001346736.1 ou NM_017628.4. Em algumas modalidades, um aminoácido que codifica uma Tet2 DNA desmetilase compreende uma sequência que é pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NP_060098.3, NP_001035490.2, NP_001333665.1 ou NP_001120680.1. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um Tet3 DNA desmetilase compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NM_001287491.2, NM_001347313.1, NM_183138.2 ou
NM_001366022.1. Em algumas modalidades, um aminoácido que codi- fica um Tet3 DNA desmetilase compreende uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a NP_001274420.1, NP_001334242.1, NP_898961.2 ou NP_001352951.1. Tet1, Tet2 e/ou Tet3 podem ser de- rivados de qualquer espécie. Em algumas modalidades, Tet1, Tet2 e/ou Tet3 é uma forma truncada de uma contraparte tipo selvagem. Como um exemplo não limitante, Tet1, Tet2 e/ou Tet3 é truncado no terminal N em comparação com uma contraparte Tet1, Tet2 e/ou Tet3 tipo sel- vagem e é cataliticamente ativo. Em algumas modalidades, Tet1, Tet2 e/ou Tet3 compreende apenas o domínio catalítico de Tet1, Tet2 e/ou Tet3. Em algumas modalidades, Tet1, Tet2 e/ou Tet3 compreende o do- mínio catalítico de Tet1, Tet2, Tet3 ou qualquer combinação dos mes- mos. Exemplos não limitantes de Tet1 truncado funcional podem ser encontrados em Hrit et al., Elife. 16 de outubro de 2018; 7. pii: e34870.
[00236] Métodos adicionais de substituição de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 para promover a reprogramação celular são conhecidos na téc- nica. Veja, por exemplo, Heng et al., Cell Stem Cell 6, 167-174 (2010); Eguchi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, E8257-E8266 (2016); Gao et al., Cell Stem Cell 12, 453-469 (2013); Long et al., Cell Res. 25, 1171- 1174 (2015); Hou et al., Science 341, 651-654 (2013); Redmer et al., EMBO Rep. 12, 720-726 (2011); Tan et al., J. Biol. Chem. 290, 4500- 4511 (2014); Anokye-Danso et al., Cell Stem Cell 8, 376-388 (2011); Miyoshi et al., Cell Stem Cell 8, 633-638 (2011); Shu et al., Cell 153, 963-975 (2013); Yu, J. et al., Science 318, 1917-1920 (2007).
[00237] Em algumas modalidades, um agente químico substitui OCT4, SOX2 e/ou KLF4 (por exemplo, pode ser usado no lugar de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 junto com os outros dois fatores de transcrição para promover a reprogramação celular). Em algumas modalidades, um agente químico substitui OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, pode ser usado no lugar de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos, juntamente com os outros dois fatores de transcrição para promover a reprogramação celular) . Por exemplo, SOX2 pode ser substituído por CHIR, FSK ou 616452. OCT4 pode ser substituído por DZNep. Uma vez que Sall4 pode ser usado para substituir OCT4 conforme mencionado acima, qualquer composto que substitua Sall4 também pode ser usado para substituir OCT4. Por exemplo, CHIR, FSK e 616452 podem ser usados para subs- tituir Sall4. Nanog pode ser substituído por meio 2i. Veja, por exemplo, Hou et al., Science. 9 de agosto de 2013; 341 (6146): 651-4. Veja, tam- bém, por exemplo, Zhao et al., Cell. 17 de dezembro de 2015; 163 (7): 1678-91.
[00238] Em algumas modalidades, a reprogramação química com- preende o uso de produtos químicos que reduzem a toxicidade dos agentes químicos que induzem a reprogramação. Exemplos não limi- tantes de produtos químicos que reduzem a toxicidade da reprograma- ção química incluem inibidores ROCK (por exemplo, Y27632 e Fasudil) e inibidores P38 MAPK (por exemplo, SB203580 e BIRB796). Veja, por exemplo, Li et al., Cell Stem Cell. 6 de agosto de 2015; 17 (2): 195-203.
[00239] OCT4, KLF4, SOX2, substituições ou qualquer combinação dos mesmos podem ser ativados (por exemplo, a expressão pode ser induzida) em combinação com a ativação de um realçador de reprogra- mação e/ou inibição de uma barreira de reprogramação. Um realçador de reprogramação pode ser ativado usando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo a superexpressão do realçador, aumen- tando a expressão de um gene endógeno que codifica o realçador (por exemplo, usando a tecnologia CRISPR), o uso de um agente químico e/ou anticorpo para aumentar a atividade biológica do realçador e usar um agente químico e/ou anticorpo para promover a expressão do real-
çador. Uma barreira de reprogramação pode ser inibida usando qual- quer método adequado conhecido na técnica, incluindo a eliminação da expressão do inibidor (por exemplo, com siRNAs, miRNAs, shRNAs), eliminando uma cópia endógena do inibidor (por exemplo, usando a tec- nologia CRISPR, TALENs, nucleases de dedo de zinco, etc.), usando um agente químico e/ou anticorpo para diminuir a atividade biológica do inibidor e usando um agente químico e/ou anticorpo para diminuir a ex- pressão do inibidor.
[00240] Exemplos não limitantes de realçadores e barreiras de repro- gramação são fornecidos na Tabela 2. Veja também, por exemplo, Ebra- himi, Cell Regen (Lond). 11 de novembro de 2015; 4:10, que é incorpo- rado por referência em sua totalidade para esta finalidade. Tabela 2. Exemplos não limitantes de estratégias para realçar a re- programação. Estratégia de Realce de Repro- gramação Realçadores C/EBPα; UTF1; Mef2c; Tdgf1; FOXH1; GLIS1; fatores de reprogramação mutados, MDM2; Bcl-2; CCL2; Kdm3a, Kdm3b, Kdm4c e Kdm4b/2b; Jhdm1a/1b; MOF; Mbd1-4 (ou seus ativadores de pequenas moléculas); Sinaliza- ção de Wnt/β-catenina; Pitstops 1 e 2 de molécula pequena; vitamina C, palbiociclibe; citocinas, por exemplo, IL- Ativação de Realçadores 6; CDK4, CDK8, CDK19; lincU Barreiras p53, p57, p38, p16Ink4a/p19Arf, p21Cip1, Rb TGF-β, MAP cinase, Aurora A cinase, MEK/ERK, Gsk3, vias de sinalização de Wnt/β-catenina, LATS2, PKC, IP3K, CDK8, CDK19. Gene nativo/somático ou rede reguladora da transcrição (GRN/TRN). Membros específicos da família ADAM (por exemplo, ADAM7, ADAM21, ADAM29), endocitose: (por exemplo, DRAM1, SLC17A5, ARSD), fosfatase: (por exemplo, PTPRJ, PTPRK, PTPN11). Regulatores de cromatina: (por exemplo, ATF7IP, MacroH2A, Mbd1-4, Setdb1a) Inibição de Barreiras Fatores de transcrição: (por exemplo, TTF1, TTF2, TMF1, T), Bright. Fbxw7 (um membro do sistema de ubiquitina-proteassoma (UPS)) Lzts1, Ssbp3, Arx, Tfdp1, Nfe2, Ankrd22, Msx3, Dbx1, Lasp1 e Hspa8. Citocinas por exemplo, TNF Células (por exemplo, células senescentes e células NK) (por exemplo, navitoclax, BAY117082) NuRD, Mbd1-4, Gatad2a, Chd4 (veja, por exemplo, Mor et al., Cell Stem Cell. 2018 Sep 6;23(3):412-425.e10) KDM1a Kaiso (veja, por exemplo, Kaplunet al., Biochemistry (Mosc). Março de 2019; 84(3):283-290)
[00241] Realçadores de reprogramação adicionais que podem ser ativados em combinação com a ativação de OCT4, KLF4, SOX2, suas substituições, ou qualquer combinação dos mesmos, incluem histona lisina desmetilases (por exemplo, KDM2, KDM3 e KDM4). As histona lisina desmetilases podem ser ativadas por serem superexpressas em uma célula, tecido, órgão e/ou um indivíduo. Ativadores químicos de his- tona lisina desmetilases também estão incluídos na presente descrição. Por exemplo, a vitamina C pode ser usada para ativar KDM3 e/ou KDM4.
[00242] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos, são ativados juntamente com a ativação de C/EBPα e Tfcp2l1. Sem estar limitado por uma teoria particular, C/EBPα e Tfcp2l1 juntamente com Klf4 podem conduzir a desmetilação e ativação do realçador mediada por Tet2 durante a re- programação.
[00243] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos são ativados em uma cé- lula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com uma citocina que facilita a reprogramação. IL6 é um exemplo não limitante de uma citocina. Veja, por exemplo, Mosteiro et al, Science. 25 de novembro de 2016; 354 (6315), que é aqui incorporado por referência em sua totali- dade para esta finalidade.
[00244] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos são ativados em uma cé- lula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com a ativação de um miRNA (por exemplo, administração de um miRNA e/ou expressão de um miRNA). Por exemplo, um miRNA que promove a progressão do ciclo celular pode ser introduzido em uma célula, tecido, órgão e/ou in- divíduo. Exemplos não limitantes de miRNAs que promovem a progres- são do ciclo celular incluem miR 302-367, miR 371-373, miR-200b, miR- 200c, miR-205, miR 290-295, miR-93, miR-106 e miR 135b.
[00245] Como um exemplo não limitante, a regeneração do nervo pode ser realçada combinando a ativação de OCT4, SOX2, KLF4, suas substituições ou qualquer combinação destes com a ativação de um re-
alçador. A ativação não limitativa de realçadores inclui a superexpres- são de um membro da família KLF (por exemplo, KLF7), superexpres- são de c-Myc, ativação de STAT3, superexpressão de SOX11, superex- pressão de Lin28, superexpressão ou liberação de proteína solúvel que codifica fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1) e osteo- pontina (OPN), e ativação de B-RAF (por exemplo, introdução de uma mutação de ganho de função). Veja também, por exemplo, Blackmore et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 8 de Maio de 2012; 109(19):7517-22; Belin et al., Neuron. 20 de Maio de 2015;86(4):1000-1014; Bareyre et al., Proc Natl Acad Sci USA. 12 de Abril de 2011;108(15):6282-7; Norsworthy et al., Neuron. 21 de Junho de 2017;94(6):1112-1120.e4; Wang et al., Cell Rep. 2018 Sep 4;24(10):2540-2552.e6; Liu et al., Neu- ron. 16 de Agosto de 2017;95(4):817-833; O’Donovan et al., J Exp Med,
2014. 211(5): p. 801-14, cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade para esta finalidade.
[00246] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos, são ativados em uma célula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com supressão ou nocauteada de barreiras de reprogramação. Exemplos não limitantes de barreiras de reprogramação incluem Chaf1a, Chaf1b, Ube2i, sumo2, e/ou Nudt21. Veja, por exemplo, Brumbaugh et al., Cell. 11 de Janeiro de 2018;172(1-2):106-120.e21; Cheloufi et al., Nature. 10 de Dezembro de 2015;528 (7581):218-24; e Borkent et al., Stem Cell Reports, 2016. 6(5): p. 704-716, cada um aqui incorporado por referência em sua tota- lidade para esta finalidade.
[00247] Como um exemplo não limitante, uma barreira de reprogra- mação pode ser uma DNA metiltransferase (DNMT) e uma DNMT pode ser inibida para promover a reprogramação de um tecido, célula e/ou órgão. A maioria das DNA metiltransferases usa S-adenosil-L-metionina como doador de metila. DNMT pode ser de qualquer espécie. Existem pelo menos três tipos diferentes de metiltransferases. As metiltransfera- ses m6A são capazes de metilar o grupo amino na posição c-6 das ade- ninas no DNA (por exemplo, Enzyme Commission (EC) No. 2.1.1.72). As metiltransferases m4C são capazes de gerar N4-metilcitosina (por exemplo, Enzyme Commission (EC) No. 2.1.1.113). As metiltransfera- ses M5C são capazes de gerar C5-metilcitosina (por exemplo, Enzyme Commission (EC) No. 2.1.1.37).
[00248] Exemplos não limitantes de DNA metiltransferases de mamí- feros (DNMTs) incluema DNMT1 e suas isoformas DNMT1b e DNMT1o (específico para oócitos), DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L. Nºs de acesso do GenBank NM_001130823.3 (isoforma a), NM_00187.1 (isoforma a), NM_00187, NM_001318731.1 (isoforma d) e NM_001379.3 (isoforma b) são exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos que codifi- cama DNMT1 humano. Um ácido nucleico que codifica uma DNMT1 pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exem- plo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica ao conjunto de sequência adiante nos números de acesso do GenBank NM_001130823.3 (isoforma a), NM_001318730.1 (isoforma c), NM_001318731.1 (isoforma d) e/ou NM_001379.3 (isoforma b). Os números de acesso do GenBank NP_001124295.1 (isoforma a), NP_001305659.1 (isoforma c), NP_001305660.1 (isoforma d) e NP_001370.1 (isoforma b) são exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos que codificama DNMT1 humano. Uma sequência de aminoácidos que codifica uma DNMT1 pode compreender uma sequên- cia que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a um sequência apre- sentada nos números de acesso do GenBank .NP_001124295.1 (iso- forma a), NP_001305659.1 (isoforma c), NP_001305660.1 (isoforma d) e/ou NP_001370.1 (isoforma b). Um ácido nucleico que codifica DNMT3A humano inclui o Nº de acesso GenBank NM_001320892.1,
NM_001320893.1, NM_022552.4, NM_153759.3, NM_175629.2 e NM_175630.1. Um ácido nucleico que codifica uma DNMT3A pode ser pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a uma sequência apresentada no GenBank Nº de acesso NM_001320892.1, NM_001320893.1, NM_022552.4, NM_153759.3, NM_175629.2 e/ou NM_175630.1. Uma sequência de aminoácidos que codifica DNMT3A humano inclui os nú- meros de acesso do GenBank NP_001307821.1, NP_001307822.1, NP_072046.2, NP_715640.2, NP_783328.1 e NP_783329.1. Uma se- quência de aminoácidos que codifica uma DNMT3A pode ser pelo me- nos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência apresentada em Nº de acesso do GenBank NP_001307821.1, NP_001307822.1, NP_072046.2, NP_715640.2, NP_783328.1 e/ou NP_783329.1. Um ácido nucleico que codifica DNMT3B humano inclui o Nº de acesso Gen- Bank NM_001207055.1, NM_001207056.1, NM_006892.3, NM_175848.1, NM_175849.1 e NM_175850.2. Um ácido nucleico que codifica uma DNMT3B pode ser pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a uma sequência apresentada no GenBank Nº de acesso NM_001207055.1, NM_001207056.1, NM_006892.3, NM_175848.1, NM_175849.1 e/ou NM_175850.2. Uma sequência de aminoácidos que codifica DNMT3B humano inclui os números de acesso do GenBank NP_001193984.1, NP_001193985.1, NP_008823.1, NP_787044.1, NP_787045.1 e NP_787046.1. Uma sequência de aminoácidos que co- difica uma DNMT3B pode ser pelo menos 70 % (por exemplo, pelo me- nos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência apresentada em Nº de acesso do GenBank NP_001193984.1, NP_001193985.1, NP_008823.1, NP_787044.1, NP_787045.1 e/ou NP_787046.1. Um ácido nucleico que codifica
DNMT3L humano inclui o Nº de Acesso GenBank NM_013369.3 e NM_175867.2. Um ácido nucleico que codifica uma DNMT3L pode ser pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico a uma sequência apresentada no GenBank Nº de Acesso NM_013369.3 e/ou NM_175867.2. Uma se- quência de aminoácidos que codifica DNMT3L humano inclui os núme- ros de acesso do GenBank NP_037501.2 e NP_787063.1. Uma sequên- cia de aminoácidos que codifica uma DNMT3L pode ser pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica a uma sequência apresentada em Nº de Acesso do GenBank NP_037501.2 e/ou NP_787063.1.
[00249] Uma DNMT pode ser inibida usando qualquer método ade- quado conhecido na técnica. Os métodos adequados incluem nocaute de um mRNA de DNMT, nocaute genético de uma DNMT e o uso de um inibidor de DNMT (por exemplo, inibidores químicos). Os inibidores DNMT estão sendo investigados em ensaios clínicos (por exemplo, en- saios clínicos de fase III) nos Estados Unidos da América e além. Exem- plos não limitantes de inibidores DNMT incluem VIDAZATM (azacitidina) (por exemplo, para o tratamento de Síndromes Mielodisplásicas e trata- mento de leucemia mieloide aguda (LMA)), DACOGENTM (decitabina) (por exemplo, para tratamento de AML e tratamento de leucemia mie- loide crônica (CML)) e Guadecitabina (SGI-110) (por exemplo, para o tratamento de AML). Em 2012, a União Europeia aprovou o DACOGE- NTM (decitabina) para uso em pacientes com LMA.
[00250] Uma DNMT pode ser inibida pela inibição de um estabiliza- dor de DNMT. Métodos adequados de inibição de um estabilizador de DNMT incluem nocaute do mRNA que codifica o estabilizador, nocaute geneticamente do gene que codifica o estabilizador e uso de um inibidor (por exemplo, inibidores químicos). Como um exemplo não limitante, KDM1a, que também é referido como Lsd1 ou Aof2, é um estabilizador de DNMT1. Veja, por exemplo, Wang et al., Nat Genet. Janeiro de 2009; 41 (1): 125-9. Em algumas modalidades, a expressão de KDM1a é eli- minada usando um shRNA aqui descrito ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, KDM1a é inibido para prevenir lesão induzida por hipermetilação de DNMTs, o que poderia ser útil na promoção da repro- gramação.
[00251] Em algumas modalidades, uma histona metiltransferase é uma barreira de reprogramação e é inibida para facilitar a reprograma- ção de uma célula, tecido e/ou órgão. As metiltransferases de histona podem ser inibidas por qualquer método adequado, incluindo o uso de inibidores químicos. Por exemplo, 3-deazaneplanocina A (Dznep), epz004777 e BIX-01294 são exemplos de inibidores de histona metil- transferase.
[00252] Em algumas modalidades, uma barreira de reprogramação é uma histona desacetilase (HDAC) e um HDAC é inibido para facilitar a reprogramação de uma célula, tecido e/ou órgão. Exemplos não limitan- tes de inibidores de HDAC incluem ácido valproico (VPA), tricostatina A (TSA), ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), butirato de sódio (SB), Belinostate (PXD101), Panobinostate (LBH589), Quisinostate (JNJ- 26481585), Abexinostate (PCI-24781), Givinostate (ITF2357), Resmi- nostate (4SC-201), Fenilbutirato (PBA), Depsipeptídeo (romidepsina), Entinostate (MS-275), Mocetinostate (MGCD0103) e Tubastatina A (TBA).
[00253] Em algumas modalidades, uma barreira de reprogramação é um NF-κB e é inibida para facilitar a reprogramação de uma célula, te- cido e/ou órgão. Exemplos não limitantes de inibidor de NF-κB incluem BAY 11-7082, TPCA 1 e p65 siRNA. Veja, por exemplo, o guia de mo- léculas pequenas NF-κB compilado pela Abcam, que está disponível no site da Abcam (www.abcam.com/reagents/nf-kb-small-molecule-guide).
[00254] Em algumas modalidades, uma barreira de repogramação é uma citocina secretada por células senescentes em que uma citocina é inibida para facilitar a reprogramação de uma célula, tecido e/ou órgão. Nenhum exemplo limitante de inibidores de citocinas inclui Anti-TNF (Mahmoudi et al, Biorxiv, 2018) e fármacos, incluindo Navitoclax, que matam células de senescência.
[00255] Em algumas modalidades, uma barreira de reprogramação é um microRNA (miRNA) e um microRNA é inibido para facilitar a repro- gramação de uma célula, tecido e/ou órgão. Exemplos não limitantes de microRNAs que são barreiras de reprogramação incluem miR Let-7 e miR-34. Sem estar limitado por uma teoria particular, a inibição de miR Let-7 pode aumentar a eficiência da reprogramação porque miR Let-7 inibe o ciclo celular e a inibição de miR-34 pode facilitar a reprograma- ção porque miR-34 inibe a translação de p53.
[00256] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos são ativados em uma cé- lula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com a inibição de PTEN, SOCS3, RhoA e/ou ROCK para realçar a regeneração do nervo. Em algumas modalidades, PTEN é deletado, SOCS3 é deletado, RhoA é nocauteado e/ou ROCK é nocauteado em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo. Veja, por exemplo, Park et al., Science. 7 de novembro de 2008; 322 (5903): 963-6; Smith et al., Neuron. 10 de dezembro de 2009; 64 (5): 617-23; Koch et al., Front Cell Neurosci. 5 de setembro de 2014; 8: 273; Koch et al., Cell Death Dis. 15 de maio de 2014; 5: e1225 para descrições de inibição de PTEN, SOCS3, RhoA e/ou ROCK. Cada referência é aqui incorporada por referência em sua totalidade para este propósito.
[00257] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos são ativados em uma cé- lula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com estimulação elétrica neuronal (por exemplo, estimulação visual de alto contraste)
para promover a regeneração do nervo. Veja, por exemplo, Lim et al., Nat Neurosci.Agosto de 2016; 19 (8): 1073-84 para uma descrição da estimulação visual de alto contraste. Esta referência é aqui incorporada por referência em sua totalidade para este propósito.
[00258] Em algumas modalidades, OCT4, SOX2, KLF4, suas substi- tuições ou qualquer combinação dos mesmos são ativados em uma cé- lula, tecido, órgão e/ou um indivíduo em combinação com estimulação de luz de banda gama para promover a regeneração nervosa. Veja, por exemplo, McDermott et al., J Alzheimers Dis. 2018; 65 (2): 363-392 para uma descrição da estimulação de luz de banda gama. Esta referência é aqui incorporada por referência em sua totalidade para este propósito. Células modificadas
[00259] Células modificadas e método de produção de células modi- ficadas também são abrangidos pela presente descrição. As células mo- dificadas, por exemplo, podem ser úteis em terapias baseadas em cé- lulas (por exemplo, terapias com células-tronco). Embora a terapia com células-tronco esteja atualmente em ensaios clínicos (veja, por exem- plo, David Cyranoski, Nature 557, 619-620 (2018), a toxicidade (por exemplo, toxicidade fora do alvo) é uma preocupação. células da pre- sente descrição (por exemplo, células modificadas usando vetores AAV que codificam OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou um agente indutor) podem ter uma toxicidade mais baixa porque o AAV não se integra no genoma das células hospedeiras e o uso de os sistemas indutíveis aqui descritos para controlar a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 podem permitir o controle preciso (por exemplo, quantidade e tempo) da expressão gê- nica.
[00260] Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nu- cleico modificado) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), proteínas modificadas aqui descritas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expres- são de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exemplo, in- duzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombi- nantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinho ou em com- binação pode ser introduzido em uma célula hospedeira, tecido hospe- deiro ou órgão para produzir uma célula modificada, um tecido modifi- cado ou um órgão modificado. Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, expressão vetor) ca- paz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos, proteínas modificadas aqui descritas, agentes quí- micos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lenti- vírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação podem ser intro- duzidos em uma célula hospedeira, tecido hospedeiro ou órgão para produzir uma célula modificada, um tecido modificado ou um órgão mo- dificado. Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, um agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente in- dutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor tam- bém é introduzido em uma célula hospedeira, tecido hospedeiro ou ór- gão para produzir uma célula modificada, um tecido modificado ou um órgão modificado.
[00261] Em algumas modalidades, a célula modificada é uma célula- tronco pluripotente induzida (iPSC).
[00262] Em algumas modalidades, um vetor viral (por exemplo, um vetor AAV, incluindo um vetor com um promotor TRE operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica OCT4, KLF4 e SOX2) é empa- cotado em um vírus com um capsídeo AAV-DJ. Em algumas modalida- des, o capsídeo AAV-DJ aumenta a eficiência de transdução em células cultivadas em comparação com células sem o capsídeo AAV-DJ. Em algumas modalidades, o vírus AAV que codifica OSK é administrado a uma célula. Em algumas modalidades, um vírus AAV (por exemplo, ví- rus AAV-DJ) que codifica o agente indutor ou uma proteína que codifica o agente indutor é administrado às mesmas células. Em algumas mo- dalidades, este sistema produz uma célula modificada (por exemplo, uma célula-tronco pluripotente induzida). Em algumas modalidades, a célula modificada é ainda diferenciada em (por exemplo, diferenciada em um olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo ca- belo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou célula do intestino). Em algumas modalida- des, a célula diferenciada é usada para fins de transplante. Em algumas modalidades, a célula modificada é cultivada para criar um tecido modi- ficado. Em algumas modalidades, a célula modificada é cultivada para criar um órgão modificado. Em algumas modalidades, as células modi- ficadas são células do epitélio pigmentar da retina, células neuronais, células beta pancreáticas ou células cardíacas. Composições
[00263] As composições da descrição podem compreender pelo me- nos um de qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nu- cleico modificado) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), proteínas modificadas, célu- las modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exem- plo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos isoladamente ou em combinação.
Em certas modalidades, as composições da descri- ção compreendem pelo menos um de qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expres- são) capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas, células modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos sozinhos ou em combinação.
Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ácidos nucleicos diferentes (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir OCT4, KLF4 e/ou SOX2 ex- pressão (por exemplo, vetores de expressão que codificam OCT4, KLF4 e/ou SOX2). Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ácidos nucleicos diferentes (por exem- plo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos (por exem- plo, vetores de expressão que codificam OCT4; KLF4; SOX2; ou qual- quer combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, uma com- posição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vírus diferentes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retroví- rus, vírus do herpes ou AAV) cada um tendo um ou mais transgenes diferentes.
Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais diferentes agentes químicos ativando
(por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2. Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais agentes químicos diferentes ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em algumas modalidades, uma composição compre- ende ainda um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam um agente indutor, uma ou mais proteínas modificadas que codificam um agente indutor, um ou mais agentes quí- micos capazes de modular (por exemplo, ativando ou inibindo) a ativi- dade de um agente indutor e/ou um ou mais vírus recombinantes que codificam um agente indutor. Em algumas modalidades, uma composi- ção compreende células modificadas (por exemplo, células-tronco plu- ripotentes induzidas e/ou células diferenciadas). Em algumas modalida- des, uma composição compreende uma proteína modificada que codi- fica OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Em algumas modalidades, uma composi- ção compreende uma proteína modificada que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma composição compreende ainda uma proteína modificada que codi- fica um agente indutor.
[00264] Em algumas modalidades, uma composição compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável. Os transportado- res adequados podem ser facilmente selecionados por alguém versado na técnica em vista da indicação para a qual os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), químico agentes ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, ativação de anticorpos (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, proteínas modificadas, células modificadas e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, é direcionado. Os transportadores adequados podem ser facilmente sele- cionados por alguém versado na técnica em vista da indicação para a qual os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetores de expressão) são capazes de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas, células mo- dificadas e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, é direcionado. Os transportadores adequados também podem ser facilmente selecionados por alguém versado na técnica em vista da indicação para a qual os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nuclei- cos modificados) que codificam um agente indutor, proteínas modifica- das que codificam um agente indutor, agentes químicos capazes de mo- dular (por exemplo, ativando ou inibindo) a atividade de um agente in- dutor e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, al- favírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) compreen- dendo um agente indutor, por exemplo, é direcionado. Por exemplo, um transportador adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros exemplos de veículos incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim e água. A seleção da transportadora não é uma limitação da presente descrição.
[00265] Opcionalmente, as composições da descrição podem com- preender, além dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modificadas compreendendo
OCT4, KLF4 e/ou SOX2, proteínas modificadas, agentes químicos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lenti- vírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, e transportador (es), outros ingredientes farma- cêuticos, tais como conservantes ou estabilizadores químicos. Opcio- nalmente, as composições da descrição podem compreender, além dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exem- plo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, células modificadas com- preendendo OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mes- mos, proteínas modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combina- ção dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expres- são de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, e transportador (es), outros ingredientes farmacêuticos, tais como conser- vantes ou estabilizadores químicos. Conservantes exemplares adequa- dos incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propilgalato, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e pa- raclorofenol. Os estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina. As composições da presente descrição podem compreender ainda ácido anucleico (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, agentes químicos capazes de modular (por exemplo, ati- var ou inibir) a atividade de um agente indutor, e/ou vírus recombinantes que codificam um agente indutor.
[00266] O ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado)
(por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, células mo- dificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expres- são de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, pro- teínas modificadas que codificam OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer com- binação dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus de herpes ou AAV) que codificam o mesmo aqui descrito são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo mús- culo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nada- deira, ovário ou tecido intestinal) e para fornecer níveis suficientes de transferência e expressão de genes sem efeitos adversos indevidos.
Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos mo- dificados) que codificam um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor, agentes químicos capazes de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade de um agente indutor e/ou ví- rus recombinantes que codificam um agente indutor é administrado em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido dese- jado (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo coração músculo, fígado, vaso sanguíneo, pele, in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou tecido do intestino) e para for- necer níveis suficientes de transferência e expressão gênica sem efeitos adversos indevidos.
Exemplos de vias de administração farmaceutica- mente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, liberação direta ao órgão selecionado (por exemplo, liberação direta ao olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardí- aco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino). Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modificadas, ati- vação de agentes químicos (por exemplo, expressão de indução de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, proteínas modificadas, ativação de anticorpos (por exemplo, expressão de indução de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos podem ser administrados intravenosamente, intradermicamente, intra-arterial- mente, intralesionalmente, intratumoralmente, intracranianamente, in- tra-articularmente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intranasal, intravitreamente, intravaginalmente, intrarretalmente, topicamente, in- tratumoralmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutane- amente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosalmente, in- trapericardicamente, intraumbilicamente, intraocularmente, oralmente, topicamente, localmente, sistemicamente, injeção, infusão, infusão con- tínua, perfusão localizada banhando células alvo diretamente através de um cateter, em cremes, em composições de lipídeos (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação do prece- dente como seria conhecido por alguém versado na técnica.
Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de
OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, células mo- dificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expres- são de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, pro- teínas modificadas, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos po- dem ser administrados intravenosamente, intradermicamente, intra-ar- terialmente, intralesionalmente, intratumoralmente, intracranianamente, intra-articularmente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intranasal- mente, intravitreamente, intravaginalmente, intrarretalmente, topica- mente, intratumoralmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosal- mente, intrapericardicamente, intraumbilicamente, intraocularmente, oralmente, topicamente, localmente, sistemicamente, injeção, infusão, infusão contínua, perfusionalmente localizada banhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter, em cremes, em composições lipí- dicas (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer com- binação dos anteriores, como seria conhecido por alguém versado na técnica.
Qualquer um dos ácidos nucleicos que codificam um agente indutor, agentes químicos capazes de modular a atividade de um agente indutor, proteínas modificadas que codificam um agente indutor e/ou ví- rus recombinantes que codificam um agente indutor podem ser admi- nistrados intravenosamente, intradermicamente, intra-arterialmente, in- tralesionalmente, intratumoralmente, intracranianamente, intra-articular- mente, intraprostaticamente, intrapleuralmente, intranasalmente, intra- vitreamente, intravaginalmente, intrarretalmente, topicamente, intratu- moralmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutanea- mente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosalmente, intra-
pericardialmente, intraumbilicamente, intraocularmente, oralmente, topi- camente, localmente, sistemicamente, injecção, infusão, infusão contí- nua, perfusão localizada, banhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter, em cremes, em composições lipídicas (por exem- plo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação dos an- teriores, como seria conhecido por alguém versado na técnica. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.
[00267] Em algumas modalidades, um ácido nucleico é liberado de forma não viral (por exemplo, não em um vetor viral e/ou não em um vírus). Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4 e/ou um agente indutor é administrado em um lipossoma. Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um agente indutor é admi- nistrado em um lipossoma. Em algumas modalidades, um ácido nu- cleico (por exemplo, RNA ou DNA) que codifica OCT4, SOX2 e/ou KLF4 e/ou um agente indutor é administrado em uma partícula. Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) que codi- fica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um agente indutor é administrado em uma partícula. Em algumas modali- dades, o ácido nucleico é RNA (por exemplo, mRNA).
[00268] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um vetor de expressão que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2 ou uma composição farmacêutica que compreende um vírus que abriga o vetor de expressão é administrada a uma célula, tecido, órgão ou um indivíduo. Em algumas modalidades, uma composição farmacêu- tica que compreende um vetor de expressão que codifica um agente indutor ou uma composição farmacêutica que compreende um vírus que abriga o vetor de expressão é administrada a uma célula, tecido, órgão ou um indivíduo.
Em algumas modalidades, o vírus e/ou vetor de ex- pressão que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2 é administrado sistemica- mente.
Em algumas modalidades, o vírus e/ou vetor de expressão que codifica um agente indutor é administrado sistemicamente.
Em algumas modalidades, o vírus e/ou vetor de expressão que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2 é administrado localmente (por exemplo, diretamente a um tecido ou órgão de interesse, incluindo olho, ouvido, nariz, boca, inclu- indo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pân- creas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido ner- voso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intes- tino). Em algumas modalidades, um vírus e/ou vetor de expressão que codifica um agente indutor é administrado localmente (por exemplo, di- retamente a um tecido ou órgão de interesse, incluindo olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardí- aco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino). Em algumas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o agente indutor, uma proteína que co- difica o agente indutor ou um vírus que codifica o agente indutor) e/ou agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a ativi- dade do agente indutor é administrado usando a mesma via de admi- nistração que o OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, ácido nucleico que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2). Em algumas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o agente indutor, uma proteína que codifica o agente indutor ou um vírus que co- difica o agente indutor) e/ou agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade do agente indutor é administrado por uma via de administração diferente como OCT4, KLF4 e/ou SOX2
(por exemplo, ácido nucleico que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2).
[00269] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um vetor de expressão que codifica OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, ou uma composição far- macêutica compreendendo um vírus que abriga o vetor de expressão, é administrada a uma célula, tecido, órgão ou indivíduo. Em algumas mo- dalidades, uma composição farmacêutica que compreende um vetor de expressão que codifica um agente indutor ou uma composição farma- cêutica que compreende um vírus que abriga o vetor de expressão é administrada a uma célula, tecido, órgão ou indivíduo. Em algumas mo- dalidades, o vírus e/ou vetor de expressão que codifica OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação destes é administrada sistemicamente. Em algumas modalidades, o vírus e/ou vetor de expressão que codifica um agente indutor é administrado sistemicamente. Em algumas moda- lidades, o vírus e/ou vetor de expressão que codifica OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos é administrada localmente (por exemplo, diretamente a um tecido ou órgão de interesse, incluindo olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele, incluindo cabelo, cora- ção, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, na- dadeira, ovário ou intestino). Em algumas modalidades, um vírus e/ou vetor de expressão que codifica um agente indutor é administrado local- mente (por exemplo, diretamente a um tecido ou órgão de interesse, incluindo olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo in- cluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo ca- belo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino). Em algumas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o agente indutor, uma proteína que codifica o agente indutor ou um vírus que co- difica o agente indutor) e/ou agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade do agente indutor é administrado usando a mesma via de administração que o OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, ácido nucleico que co- difica OCT4; KLF4; SOX2; OCT4 e SOX2; OCT4 e KLF4; KLF4 e SOX2; ou KLF4, OCT4 e SOX2). Em algumas modalidades, o agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o agente indutor, uma pro- teína que codifica o agente indutor ou um vírus que codifica o agente indutor) e/ou agente químico capaz de modular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade do agente indutor é administrado por uma via de ad- ministração diferente como o OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos (por exemplo, ácido nucleico que codifica ácido nu- cleico que codifica OCT4; KLF4; SOX2; OCT4 e SOX2; OCT4 e KLF4; KLF4 e SOX2; ou KLF4, OCT4 e SOX2).
[00270] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor induzível em que um ácido nucleico que codifica OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou agente indutor está operacionalmente ligado a um promotor TRE induzível (por exemplo, TRE3G, TRE2 ou à prova de P). Em algu- mas modalidades, o vetor de expressão é um vetor induzível no qual um ácido nucleico que codifica OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combina- ção dos mesmos, e/ou agente indutor, está operacionalmente ligado a um promotor TRE induzível (por exemplo, TRE3G, TRE2 ou à prova de P). Em algumas modalidades, o vírus e/ou vetor induzível é adminis- trado com tetraciclina (por exemplo, doxiciclina). Em algumas modalida- des, o vírus e/ou vetor de expressão compreendendo um promotor TRE é administrado separadamente da tetraciclina (por exemplo, doxici- clina). Por exemplo, qualquer um dos vírus e/ou vetores de expressão compreendendo um promotor TRE aqui descrito pode ser administrado sistemicamente e a tetraciclina pode ser administrada localmente (por exemplo, a um órgão ou tecido de interesse). Em algumas modalidades, qualquer um dos vírus e/ou vetores de expressão compreendendo um promotor TRE aqui descrito pode ser administrado localmente (por exemplo, diretamente a um tecido ou órgão de interesse, incluindo olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pul- mão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, cora- ção, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, na- dadeira, ovário, ou intestino) e a tetraciclina pode ser administrada sis- temicamente. Como um exemplo não limitante, um vírus e/ou vetor de expressão compreendendo um promotor TRE é administrado direta- mente (por exemplo, injetado) no olho de um indivíduo e a tetraciclina (por exemplo, doxiciclina) é administrada sistemicamente (por exemplo, oralmente como uma pílula).
[00271] Em algumas modalidades, a tetraciclina é administrada intra- venosamente, intradermicamente, intra-arterialmente, intralesional- mente, intratumoralmente, intracranianamente, intra-articularmente, in- traprostaticamente, intrapleuralmente, intranasalmente, intravitrea- mente, intravaginalmente, intrarretalmente, topicamente, intratumoral- mente, intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, subconjuntivamente, intravesicularmente, mucosamente, intrapericardi- almente, intraumbilicamente, intraocularmente, oralmente, topicamente, localmente, sistemicamente, injeção, infusão, infusão contínua, perfu- são localizada banhando células alvo diretamente, por meio de um ca- teter, em cremes ou em composições lipídicas. Em algumas modalida- des, a tetraciclina é administrada diretamente a uma célula, órgão e/ou tecido. Como um exemplo não limitante, a tetraciclina pode ser adminis- trada ao olho de um indivíduo através de qualquer método adequado, incluindo colírios compreendendo tetraciclina, dispositivos de liberação prolongada (por exemplo, microbombas, partículas e/ou depósitos de fármacos) e lentes de contato medicamentosas compreendendo tetraci- clina. Em algumas modalidades, a tetraciclina é administrada sistemica- mente (por exemplo, através de água potável ou injeção intravenosa) a um indivíduo. A tetraciclina pode ser administrada topicamente (por exemplo, em um creme) ou através de uma bomba subcutânea (por exemplo, para liberar tetraciclina a um tecido específico).
[00272] Como um exemplo, a dose de vírus recombinante (por exem- plo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) vírions necessária para atingir um determinado efeito terapêutico, por exemplo, as unidades de dose em cópias do ge- noma/por quilograma de peso corporal (GC/kg), irá variar com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a: a via de administração do vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vací- nia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), o nível de expres- são de gene ou RNA necessário para atingir um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio específico a ser tratado e a estabilidade do gene ou produto de RNA. Alguém versado na técnica pode facilmente determinar a faixa de dose de um vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfa- vírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou vírion AAV) para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio particular com base nos fatores mencionados acima, bem como outros fatores.
[00273] Uma quantidade eficaz de um vírus recombinante (por exem- plo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é uma quantidade suficiente para infectar um animal, atingir um tecido desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é uma quan- tidade suficiente para produzir um modelo animal transgênico somático estável. A quantidade eficaz dependerá principalmente de fatores como a espécie, idade, peso, saúde do indivíduo e o tecido a ser visado e,
portanto, pode variar entre o animal e o tecido. Por exemplo, uma quan- tidade eficaz do vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) está geralmente na faixa de cerca de 1 ml a cerca de 100 ml de solução contendo cerca de 109 para 1016 cópias do genoma. Em alguns casos, uma dosagem entre cerca de 1011 a 1013 vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, alfavírus, vírus da vacínia, vírus do herpes ou AAV) cópias do genoma é apropriada. Em certas modalidades, as cópias do genoma de 1010 ou 1011 vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, alfavírus, vírus da vací- nia, vírus do herpes ou AAV) são eficazes para o tecido ocular alvo (por exemplo, tecido retinal). Em alguns casos, os animais transgênicos es- táveis são produzidos por múltiplas doses de um vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes, alfaví- rus, vírus da vacínia ou AAV).
[00274] Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, adenovírus, retrovírus, herpes vírus, alfavírus, vírus da vacínia ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez por dia (por exemplo, um período de 24 horas). Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez por 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias corridos. Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, ade- novírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indiví- duo não mais do que uma vez por semana (por exemplo, 7 dias corri- dos). Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que duas vezes por semana (por exemplo, uma vez em um período de duas semanas ) Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retroví- rus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez por mês (por exemplo, uma vez a cada 30 dias corri- dos). Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez a cada seis meses civis. Em algumas modalidades, uma dose de vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vací- nia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez por ano civil (por exemplo, 365 dias ou 366 dias em um ano bissexto).
[00275] Em algumas modalidades, as composições de vírus recom- binantes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) são formuladas para reduzir a agre- gação de partículas de AAV na composição, particularmente onde vírus altamente recombinantes (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da va- cínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) concentrações estão presentes (por exemplo, ~ 1013 GC/ml ou mais). Métodos apropri- ados para reduzir a agregação de podem ser usados, incluindo, por exemplo, adição de surfactantes, ajuste de pH, ajuste de concentração de sal, etc. (Veja, por exemplo, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178, cujos conteúdos são aqui incorporados por referên- cia.)
[00276] Como um exemplo não limitante, a liberação de transgenes via AAV demonstrou ser viável e não tóxica em humanos. Por exemplo, AAV pode ser administrado ao olho. Veja, por exemplo, Smalley Nat Biotechnol. 9 de novembro de 2017; 35 (11): 998-999.
[00277] A formulação de excipientes e soluções transportadoras far- maceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos versados na técnica,
assim como o desenvolvimento de dosagens e regimes de tratamento adequados para usar as composições específicas aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento. Normalmente, essas formu- lações podem conter pelo menos cerca de 0,1 % do composto ativo ou mais, embora a porcentagem do (s) ingrediente (s) ativo (s) possa, é claro, ser variada e possa estar convenientemente entre cerca de 1 ou 2 % e cerca de 70 % ou 80 % ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de composto ativo em cada composi- ção terapeuticamente útil pode ser preparada de tal forma que uma do- sagem adequada será obtida em qualquer dose unitária do composto. Fatores como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, prazo de validade do produto, bem como outras con- siderações farmacológicas, serão considerados por alguém versado na técnica de preparação de tais formulações farmacêuticas e, como tal, uma variedade de dosagens e regimes de tratamento podem ser dese- jáveis.
[00278] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modifica- das compreendendo OCT4, KLF4 e/ou SOX2, proteínas modificadas que codificam Oct4, KLF4 e/ou SOX2, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, ativando anticorpos (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, al- favírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exem- plo, em composições farmacêuticas adequadamente formuladas descri- tas neste documento são liberados diretamente ao tecido alvo, por exemplo, direto a um tecido de interesse (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama,
úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardí- aco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino).
[00279] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) são capa- zes de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos, células modificadas compreendendo OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas que codificam Oct4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, em composições farmacêuticas adequa- damente formuladas descritas neste documento são liberados direta- mente ao tecido alvo, por exemplo, direto a um tecido de interesse (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo in- cluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo ca- belo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino).
[00280] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codificam um agente indutor (por exem- plo, um vetor de expressão), células modificadas compreendendo um agente indutor, proteínas modificadas que codificam um agente indutor, agentes químicos capazes de modular a atividade de um agente indutor agente e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus,
alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus de herpes ou AAVs) que co- dificam um agente indutor, por exemplo, em composições farmacêuticas adequadamente formuladas descritas neste documento são liberados diretamente ao tecido alvo, por exemplo, direto a um tecido de interesse (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino).
[00281] No entanto, em certas circunstâncias, pode ser desejável li- berar separadamente ou em adição qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão) e/ou ácido nucleico codificando um agente indutor, ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a expressão de uma combinação de fatores de transcrição selecionados de OCT4, KLF4 e/ou ácido nucleico que codifica um agente indutor, células modi- ficadas, proteínas modificadas, agentes químicos ativadores (por exem- plo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, agentes quími- cos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de fatores de transcrição selecionados de OCT4, KLF4 e SOX2, agentes químicos capazes de modular (por exemplo, inibir ou ativar ) a atividade de um agente indutor, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exem- plo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) por meio de outra via, por exemplo, subcutânea, intraopancreati- camente, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal,
ou por via oral, intraperitoneal ou por inalação. Em algumas modalida- des, as modalidades de administração conforme descrito na Patente Norte-americana Nos. 5.543.158; 5.641.515 e 5.399.363 (cada um es- pecificamente incorporado neste documento por referência em sua to- talidade) podem ser usados para liberar vírus recombinantes (por exem- plo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAVs). Em algumas modalidades, um modo preferido de administração é por injeção intraestromal.
[00282] Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, mRNA) que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é nanoformulado em um poliplexo, que pode ser útil, por exem- plo, para inalação de aerossol não invasiva e liberação do ácido nucleico ao pulmão (por exemplo, epitélio pulmonar). Veja, por exemplo, Patel et al., Adv Mater. 4 de janeiro de 2019: e1805116. doi:
10.1002/adma.201805116 para a descrição de poliplexos de mRNA na- noformulados, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para esta finalidade.
[00283] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável in- cluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esté- reis. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polieti- lenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de micro-organismos. Em muitos casos, a forma é estéril e fluida na medida em que existe fácil seringabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, gli- cerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), suas misturas adequadas e/ou óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dis- persão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro-orga- nismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifún- gicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, time- rosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção pro- longada das composições injetáveis pode ser conseguida pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, mo- noestearato de alumínio e gelatina.
[00284] Para administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada, se necessá- rio, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especial- mente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, sub- cutânea e intraperitoneal. Neste contexto, pode ser utilizado um meio aquoso estéril adequado. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissol- vida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto de infusão (veja, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, pági- nas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do hospedeiro. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o hospedeiro individual.
[00285] Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de indu- zir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de ex- pressão), células modificadas, proteínas modificadas, ativação de agen- tes químicos (por exemplo, induzir a expressão de) OCT4, KLF4, an e/ou SOX2, ativação de anticorpos (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes ativos (por exem- plo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV), por exemplo, na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes aqui enumerados, con- forme necessário, seguido de esterilização por filtração.
As soluções in- jetáveis estéreis são preparadas incorporando o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou qualquer com- binação destes, células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos ativadores (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes ativos (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus de herpes ou AAV), por exemplo, na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes aqui enumera- dos, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração.
Em certas modalidades, as soluções injetáveis estéreis são preparadas in- corporando um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica um agente indutor, proteína modificada que codifica um agente indutor, agentes químicos capazes de modular a atividade de um agente indutor e/ou recombinante ativo vírus (por exemplo, lentiví- rus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) que codificam um agente indutor, por exemplo, na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes aqui enumerados, conforme necessário, seguido de esterilização por fil- tração.
Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vá- rios ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daque- les enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a vácuo e de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.
[00286] As composições compreendendo ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modificadas, pro- teínas modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) descritos neste documento também podem ser formulado em uma forma neutra ou salina. As com- posições compreendendo ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nuclei- cos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) que codificam OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, células mo- dificadas, proteínas modificadas, agentes químicos ativando (por exem- plo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus de herpes ou AAV) descritos neste do- cumento também podem ser formulados em uma forma neutra ou sa- lina. As composições podem compreender um agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um agente indutor ou uma pro- teína que codifica um agente indutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor) e/ou um agente químico capaz de modular a atividade de um agente indutor. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino li- vres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais for- mados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cál- cio ou hidróxidos férricos e bases orgânicas como isopropilamina, trime- tilamina, histidina, procaína e semelhantes. Após a formulação, as solu- ções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e na quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As for- mulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármacos e semelhantes.
[00287] Um transportador inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacteria- nos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção, tampões, soluções transportadoras, suspensões, coloides e semelhan- tes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ati- vas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00288] Veículos de liberação, tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microcontas, partículas lipídicas, vesículas e semelhan- tes, podem ser usados para a introdução das composições da presente descrição em células hospedeiras adequadas. Em particular, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exem- plo, vetor de expressão), qualquer uma das proteínas modificadas, qual- quer um dos agentes químicos ativadores (por exemplo, indução ex- pressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ati- vando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou
SOX2, células modificadas e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retroví- rus, vírus do herpes ou AAV) podem ser encapsulados em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanosfera ou uma nanopar- tícula ou semelhantes. Em algumas modalidades, qualquer um dos áci- dos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exem- plo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, qualquer uma das prote- ínas modificadas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, células modificadas e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) podem ser encapsu- lados em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma na- nosfera, ou uma nanopartícula ou semelhante. Um agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um agente indutor ou uma pro- teína que codifica um agente indutor e/ou um vírus recombinante que codifica um agente indutor) e/ou um agente químico capaz de modular a atividade de um agente indutor pode ser encapsulada em uma partí- cula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanosfera ou uma na- nopartícula ou semelhantes.
[00289] Em algumas modalidades, o veículo de liberação tem como alvo a carga. Por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos, proteínas modificadas, agentes químicos, anticorpos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retroví- rus, vírus de herpes ou AAV) descritos neste documento podem ser li- berados através de uma nanopartícula que liberação a carga a um de-
terminado tipo de tecido ou célula. Nanopartículas revestidas com polí- meros de galactose, por exemplo, são conhecidas por liberar sua carga dentro das células senescentes como resultado de sua atividade beta- galactosidase endógena. Veja, por exemplo, Lozano-Torres et al., J Am Chem Soc. 5 de julho de 2017; 139 (26): 8808-8811.
[00290] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nuclei- cos, proteínas modificadas, agentes químicos, anticorpos e/ou vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus de herpes ou AAV) é formulado em uma poli (gli- coamidoamina) nanopartículas de escova. Veja, por exemplo, Dong et al., Nano Lett. 10 de fevereiro de 2016; 16 (2): 842-8.
[00291] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nuclei- cos, proteínas modificadas, agentes químicos, anticorpos e/ou vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) é formulado em uma nanopar- tícula lipídica. Veja, por exemplo, Cullis e Hope Mol Ther. 5 de julho de 2017; 25 (7): 1467-1475. Em algumas modalidades, a nanopartícula de lipídeo compreende uma ou mais proteínas de fusão de membrana, que entregam plasmídeos diretamente no citoplasma ou nos fatores OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos pode ser fundida diretamente à proteína de direcionamento com ou sem encapsulação de nanopartículas. Em algumas modalidades, a nanopartícula lipídica é uma nanopartícula lipídica Fusogenix. Em algumas modalidades, a na- nopartícula de lipídeo é um "Lipossomas Embrulhados" (WL). Veja, por exemplo, Yamauchi et al., Biochim Biophys Acta. Janeiro de 2006; 1758 (1): 90-7. Em algumas modalidades, a nanopartícula de lipídeo é um lipossoma PEGuilado (por exemplo, DOXILTM) (por exemplo, Allen & Hansen, Biochim Biophys Acta. 1 de Julho de 1991; 1066 (1): 29-36.), 1, 2-dioleoil-sn-glicerol-3 fosfatidiletanolamina (DOPE), uma fosfatidile- tanolamina (PE) de lipídeo auxiliar neutra ou combinações dos mesmos
(por exemplo, Farhood et al., Biochim Biophys Acta. 4 de maio de 1995; 1235 (2): 289-95; Zhou & Huang, Biochim Biophys Acta. 19 de Janeiro de 1994; 1189 (2): 195-203.). Em algumas modalidades, a nanopartícula de lipídeo ou proteína de fusão compreende empregar uma molécula ou proteína para imitar métodos empregados por vírus para liberação intra- celular de macromoléculas (por exemplo, Kobayashi et al., Bioconjug Chem. 20 de maio de 2009; 20 (5): 953-9 ), por exemplo, usando uma variedade de peptídeos sensíveis ao pH, como proteínas do vírus da estomatite vesicular (VSV G), proteínas do revestimento do fago e/ou shGALA e/ou proteínas pequenas transmembrana associadas à fusão (FAST), por exemplo, reovírus aviário (ARV), reovírus da baía de Nelson (NBV) e reovírus de babuíno (BBV), reovírus de aquareovírus (AQV) e reovírus reptiliano (RRV) e/ou peptídeo de direcionamento de Bombe- sina. Veja, por exemplo, Peisajovich et al., Eur J Biochem. Setembro de 2002; 269 (17): 4342-50.; Sakurai et al., 2011. Veja também Nesbitt, Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formu- lated with Multifunctional FAST proteins, Western University Thesis,
2012. https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1 4&ved=2ahUKEwiX-YW5puzfAhXGTd8KHUmCAT0QFjANegQIA- hAB&url=http %3A %2F %2Fir.lib.uwo.ca %2Fcgi %2Fviewcontent.cgi %3Farticle %3D1571 %26context %3Detd&usg=AOvVaw3A20aOe- fHfJIJSZRR_-kPD
[00292] Em algumas modalidades, um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA, incluindo um plasmídeo) que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos é encapsulado em uma nanopartícula lipídica Fusogenix. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um agente indutor (por exemplo, rtTA ou tTA) é encapsulado em uma nanopartícula de lipídeo Fusogenix. Em algumas modalidades,
uma nanopartícula lipídica compreende uma proteína de membrana vi- ral. Sem ser limitada por uma teoria particular, uma nanopartícula de lipídeo pode ser não tóxica porque compreende uma proteína de fusão de membrana que não é uma proteína de fusão de membrana viral. Exemplos não limitantes de proteínas de fusão de membrana incluem proteínas de fusão de membrana descritas na Patente Norte-americana No. 7.851.595, Patente Norte-americano No. 8.252.901, Publicação do Pedido Internacional No. WO 2012/040825 e Publicação do Pedido In- ternacional No. WO 2002/044206.
[00293] Em algumas modalidades, uma composição da presente descrição (por exemplo, compreendendo um ácido nucleico que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos) é distribuída de forma não viral. Os métodos de liberação não viral de ácidos nucleicos incluem lipofecção, nucleofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policátion ou conjugados de lipí- deo:ácido nucleico, ácido nucleico puro (por exemplo, RNA ou DNA), vírions artificiais e realçado por agente captação de um ácido nucléico (por exemplo, RNA ou DNA).
[00294] Em algumas modalidades, um lipídeo catiônico é usado para liberar um ácido nucleico. Um lipídeo catiônico é um lipídeo que possui uma carga catiônica ou positiva em pH fisiológico. Os lipídeos catiônicos podem assumir uma variedade de formas, incluindo, mas não se limi- tando a, lipossomas ou micelas. Lipídeos catiônicos úteis para certos aspectos da presente descrição são conhecidos na técnica e, geral- mente compreendem domínios polares e não polares, ligam-se a poliâ- nions, tais como moléculas de ácido nucleico ou proteínas sobrecarre- gadas negativamente e são tipicamente conhecidos por facilitar a libe- ração de ácidos nucléicos em células. Exemplos de lipídeos catiônicos úteis incluem polietilenimina, dendrímeros starburst poliamidoamina (PAMAM), Lipofectina (uma combinação de DOTMA e DOPE, veja, por exemplo, as Patentes Norte-americanas Nos. 5.049.386, 4.946.787; e
4.897.355), Lipofectase, LIPOFECTAMINE® (por exemplo, LIPOFEC- TAMINE® 2000, LIPOFECTAMINE® 3000, LIPOFECTAMINE® RNAi- MAX, LIPOFECTAMINE® LTX), SAINT-RED (Synvolux Therapeutics, Groningen Netherlands), DOPE, Citofectina (Gilead Sciences, Foster City, Calif.), e Eufectins (JBL, San Luis Obispo, Calif.). Lipossomas ca- tiônicos exemplares podem ser feitos a partir de cloreto de N-[1-(2,3- dioleolóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), metilsulfato de N-[1- (2,3-dioleolóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-di- metilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), trifluoroacetato de 2,3,-dioleilóxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propana- mínio (DOSPA), brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amônio; e brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB). Lipídeos catiô- nicos têm sido usados na técnica para liberar moléculas de ácido nu- cleico às células (veja, por exemplo, Patente Norte-americana Nos.
5.855.910; 5.851.548; 5.830.430; 5.780.053; 5.767.099; 8.569.256;
8.691.750; 8.748.667; 8.758.810; 8.759.104; 8.771.728; Lewis et al.
1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1).
[00295] Além disso, outras composições lipídicas também são co- nhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas ensinadas na Pa- tente Norte-americana No. 4.235.871; Patente Norte-americano No.
4.501.728; Patente Norte-americano No. 4.837.028; Patente Norte- americano No. 4.737.323. Os Lipídeos catiónicos e neutros que são adequados para a lipofecção de polinucleotídeos de reconhecimento de receptor eficiente incluem os de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. A liberação pode ser para células (por exemplo, administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos alvo (por exemplo, administração in vivo).
[00296] A preparação de complexos de lipídeo: ácido nucleico, inclu- indo lipossomas direcionados, tais como complexos de imunolipídeos,
é bem conhecida por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patente Norte-americana Nos. 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871,
4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 e 4.946.787).
[00297] Os sistemas de liberação à base de polímero também podem ser usados para liberar um ácido nucleico. Polímeros incluindo polietile- nimina (PEI), quitosana, poli (DL-Lactídeo) (PLA) e poli (DL-Lactídeo- co-glicosídeo) (PLGA), dedrímeros e polimetacrilato podem ser usados. Veja, por exemplo, Yang et al., Macromol Biosci. Dezembro de 2012; 12 (12): 1600-14; Ramamoorth et al., J Clin Diagn Res. Janeiro de 2015; 9 (1): GE01-GE06. Como um exemplo não limitante, um polímero catiô- nico pode ser usado. Um polímero catiônico é um polímero com uma carga líquida positiva. Os polímeros catiônicos são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em Samal et al., Catationic polymers and their therapeutic potencial. Chem Soc Rev. 7 de novembro de 2012; 41 (21): 7147-94; em pedidos de patente Norte-americano pu- blicados U.S. 2014/0141487 A1, U.S. 2014/0141094 A1, U.S. 2014/0044793 A1, U.S. 2014/0018404 A1, U.S. 2014/0005269 A1 e U.S. 2013/0344117 A1; e na Pat. 8.709.466; 8.728.526; 8.759.103; e
8.790.664; todo o conteúdo de cada um é incorporado aqui por referên- cia. Polímeros catiônicos exemplares incluem, mas não estão limitados a, polialilamina (PAH); polietilenoimina (PEI); poli (L-lisina) (PLL); poli (L-arginina) (PLA); homo- ou copolímero de polivinilamina; um sal de poli (vinilbenzil-tri-C1-C4-alquilamônio); um polímero de um di-haleto ali- fático ou aralifático e um N,N,N',N'-tetra-alquil-C1-C4-alquilenodiamina alifático; um sal de poli (vinilpiridina) ou poli (vinilpiridínio); um haleto de poli(N,N-dialil-N,N-di-C1-C4-alquil-amônio); um homo- ou copolímero de um di-C1-C4-alquil-aminoetil acrilato ou metacrilato; POLYQUADTM; uma poliaminoamida; e similar.
[00298] Tais formulações podem ser preferidas para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos ácidos nucleicos, proteínas modificadas, agentes químicos, anticorpos e/ou ví- rus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descrito. A forma- ção e utilização de lipossomas são geralmente conhecidas por aqueles versados na técnica. Recentemente, os lipossomas foram desenvolvi- dos com estabilidade do soro melhorada e meia-vida de circulação (Pa- tente Norte-americana 5.741.516). Além disso, foram descritos vários métodos de lipossomas e preparações semelhantes a lipossomas como potenciais transportadores de fármacos (Patentes US 5.567.434;
5.552.157; 5.565.213; 5.738.868; e 5.795.587).
[00299] Os lipossomas têm sido usados com sucesso com vários ti- pos de células que são normalmente resistentes à transfecção por ou- tros procedimentos. Além disso, os lipossomas estão livres das restri- ções de comprimento do DNA que são típicas dos sistemas de liberação baseados em vírus. Os lipossomas têm sido usados de forma eficaz para introduzir genes, fármacos, agentes radioterapêuticos, vírus, fato- res de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhagens celulares de cultura e animais. Além disso, vários ensaios clínicos bem- sucedidos examinando a eficácia da administração de fármacos medi- ada por lipossomas foram concluídos.
[00300] Os lipossomas são formados a partir de fosfolipídeos que es- tão dispersos em um meio aquoso e espontaneamente formam vesícu- las multilamelares concêntricas de bicamada (também chamadas de ve- sículas multilamelares (MLVs). MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4 µm. A sonicação de MLVs resulta na formação de pequenas unilamelares vesículas (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500
.ANG., contendo uma solução aquosa no núcleo.
[00301] Alternativamente, as formulações de nanocápsulas do vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, ade- novírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) podem ser usadas. As na- nocápsulas geralmente podem aprisionar substâncias de maneira está- vel e reproduzível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (com tamanho em torno de 0,1 µm) devem ser modificadas usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. Nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegra- dáveis que atendem a esses requisitos são consideradas para uso. Kits e Composições Relacionadas
[00302] Qualquer um dos ácidos nucleicos, proteínas modificadas, agentes químicos, anticorpos e/ou vírus recombinantes aqui descritos podem, em algumas modalidades, ser montados em kits farmacêuticos ou de diagnóstico ou de pesquisa para facilitar seu uso em aplicações terapêuticas, diagnósticas ou de pesquisa. Um kit pode incluir um ou mais recipientes que alojam os componentes da descrição e instruções de uso. Especificamente, esses kits podem incluir um ou mais agentes descritos neste documento, juntamente com instruções que descrevem a aplicação pretendida e o uso adequado desses agentes. Em certas modalidades, os agentes em um kit podem estar em uma formulação farmacêutica e dosagem adequada para uma aplicação particular e para um método de administração dos agentes. Os kits para fins de pesquisa podem conter os componentes em concentrações ou quantidades apro- priadas para a execução de vários experimentos.
[00303] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um kit para a produção de um vírus recombinante (por exemplo, lentiví- rus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) e/ou células modificadas, o kit compreendendo um recipiente que abriga ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codifica OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos e/ou cé- lulas hospedeiras. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda instruções para a produção do vírus recombinante (por exemplo, lenti- vírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) e/ou instruções para a produção de células modificadas. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda pelo menos um recipi- ente que aloja um vetor AAV recombinante, em que o vetor AAV recom- binante compreende um transgene (por exemplo, um gene associado à doença ocular, como doença da córnea).
[00304] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere a um kit que compreende um recipiente que aloja qualquer um dos ácidos nucleicos modificados (por exemplo, vetores de expressão), agentes químicos, anticorpos, células modificadas ou vírus recombinantes aqui descritos. Por exemplo, um vetor de expressão ou vírus recombinante que codifica KLF4, SOX2, OCT4 ou uma combinação dos mesmos pode compreender uma sequência que é pelo menos 70 % (por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 121. Em algumas modalidades, um vetor de expressão ou vírus recombinante que codifica KLF4, SOX2, OCT4 ou uma combinação dos mesmos compreende SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 121. Em algumas modalidades, o vetor de expressão que codifica estes três fatores de transcrição consiste em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 121. O kit pode ainda compreender um vetor de expressão ou vírus recombinante que codifica um agente indutor. Em algumas modalida- des, um vetor de expressão que codifica um agente indutor compreende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32. Em algumas moda- lidades, o vetor de expressão que codifica um agente indutor consiste em SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO: 32. Veja, por exem-
plo, Pedido Provisório Norte-americano No. 62/738.894, intitulado MU- TANT REVERSE TETRACYCLINE TRANSACTIVATORS FOR EX- PRESSION OF GENES, que foi arquivado em 28 de setembro de 2018, sob o número de registro do procurador H0824 .70300US00, e é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00305] O kit pode ser modificado para facilitar o uso dos métodos descritos neste documento por pesquisadores e pode assumir várias formas. Cada uma das composições do kit, quando aplicável, pode ser fornecida na forma líquida (por exemplo, em solução) ou na forma sólida (por exemplo, um pó seco). Em certos casos, algumas das composições podem ser constitutíveis ou de outra forma processáveis (por exemplo, para uma forma ativa), por exemplo, pela adição de um solvente ade- quado ou outra espécie (por exemplo, água ou um meio de cultura de células), que pode ou pode não ser fornecido com o kit. Quando aqui usado, "instruções" podem definir um componente de instrução e/ou promoção e, normalmente, envolvem instruções escritas ou associadas ao empacotamento da descrição. As instruções também podem incluir quaisquer instruções orais ou eletrônicas fornecidas de qualquer ma- neira, de modo que um usuário reconheça claramente que as instruções devem ser associadas ao kit, por exemplo, audiovisual (por exemplo, fita de vídeo, DVD, etc.), Internet e/ou comunicações baseadas na web, etc. As instruções escritas podem estar na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujas instruções também podem refletir a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para ad- ministração de animais.
[00306] O kit pode conter qualquer um ou mais dos componentes descritos neste documento em um ou mais recipientes. Como exemplo, em uma modalidade, o kit pode incluir instruções para misturar um ou mais componentes do kit e/ou isolar e misturar uma amostra e aplicar a um indivíduo. O kit pode incluir agentes de alojamento de um recipiente aqui descritos. Os agentes podem estar na forma de um líquido, gel ou sólido (pó). Os agentes podem ser preparados esterilmente, embalados em seringas e enviados refrigerados. Alternativamente, pode ser alo- jado em um frasco ou outro recipiente para armazenamento. Um se- gundo recipiente pode ter outros agentes preparados esterilmente. Al- ternativamente, o kit pode incluir os agentes ativos pré-misturados e en- viados em uma seringa, frasco, tubo ou outro recipiente. O kit pode ter um ou mais ou todos os componentes necessários para administrar os agentes a um animal, como uma seringa, dispositivos de aplicação tó- pica ou tubo de agulha iv e bolsa, particularmente no caso dos kits para a produção de modelos animais somáticos específicos.
[00307] O kit pode ter uma variedade de formas, como uma bolsa de blister, uma bolsa de embalagem retrátil, uma bolsa selável a vácuo, uma bandeja termoformada selável ou uma forma de bolsa ou bandeja semelhante, com os acessórios frouxamente embalados dentro da bolsa, um ou mais tubos, recipientes, uma caixa ou um saco. O kit pode ser esterilizado após a adição dos acessórios, permitindo assim que os acessórios individuais no recipiente sejam desembrulhados. Os kits po- dem ser esterilizados usando quaisquer técnicas de esterilização apro- priadas, como esterilização por radiação, esterilização por calor ou ou- tros métodos de esterilização conhecidos na técnica. O kit também pode incluir outros componentes, dependendo da aplicação específica, por exemplo, recipientes, meios celulares, sais, tampões, reagentes, serin- gas, agulhas, um tecido, como gaze, para aplicar ou remover um agente desinfetante, luvas descartáveis, um suporte para os agentes antes da administração, etc.
[00308] As instruções incluídas no kit podem envolver métodos para detectar um AAV latente em uma célula. Além disso, os kits da descrição podem incluir instruções, um controle negativo e/ou positivo, recipien- tes, diluentes e tampões para a amostra, tubos de preparação de amos- tra e uma tabela impressa ou eletrônica da sequência de referência de AAV para comparações de sequência. Aplicações Terapêuticas
[00309] Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nu- cleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modificadas, pro- teínas modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) descritos aqui pode ser usado para regular (por exemplo, induzir ou induzir e interromper) a re- programação celular, reparação de tecidos, regeneração de tecidos, re- generação de órgãos, reversão do envelhecimento, tratamento de uma doença ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de in- duzir a expressão de uma combinação de fatores de transcrição seleci- onados de OCT4, KLF4 e SOX2 (por exemplo, OCT4 e KLF4, OCT4 e SOX2, SOX2 e KLF4, ou KLF4, OCT4, e SOX2), células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos ativando (por exemplo, indu- zindo a expressão de) uma combinação de fatores de transcrição sele- cionados de OCT4, KLF4 e SOX2 (por exemplo, OCT4 e KLF4, OCT4 e SOX2, SOX2 e KLF4 ou KLF4, OCT4 e SOX2), anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) combinação de fatores de transcrição selecionados de OCT4, KLF4 e SOX2 (por exemplo, OCT4 e KLF4, OCT4 e SOX2, SOX2 e KLF4, ou KLF4, OCT4 e SOX2 ), e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví-
rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) descritos neste do- cumento podem ser usados para regular (por exemplo, induzir ou induzir e interromper) reprogramação celular, reparo de tecido, tecido regene- ração, regeneração de órgãos, reversão do envelhecimento, tratar uma doença, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalida- des, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico mo- dificado) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), qualquer uma das células modificadas, qualquer uma das proteínas modificadas, qualquer um dos agentes quí- micos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, indu- zindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) podem ser úteis na regulação da reprogramação celular, reparo de tecido, sobrevivência de tecido, regeneração de tecido, crescimento de tecido, função de tecido, regeneração de órgão, sobrevivência de órgão, função de órgão, ou qualquer combinação dos mesmos, opcionalmente em que a regulação compreende induzir a reprogramação celular, reverter o envelheci- mento, melhorar a função do tecido, melhorar a função do órgão, reparo do tecido, sobrevivência do tecido, regeneração do tecido, crescimento do tecido, angiogênese, formação de cicatriz, a aparência de envelheci- mento, regeneração de órgãos, sobrevivência de órgãos, alteração do sabor e da qualidade de produtos agrícolas derivados de animais, o tra- tamento de uma doença ou qualquer combinação dos mesmos, in vivo ou in vitro, pode ser administrado a uma célula, tecido ou órgão que está in vivo (por exemplo, parte de um indivíduo), ou pode ser administrado a uma célula, tecido ou órgão ex vivo.
Em algumas modalidades, qual- quer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) é capaz de induzir a expressão de
OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, qualquer uma das células modificadas, qualquer uma das proteínas modificadas, qualquer um dos agentes químicos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mes- mos, qualquer um dos anticorpos ativando (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, e/ou qualquer um dos vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, ade- novírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) pode ser útil na regulação da reprogramação celular, reparo de tecido, sobrevivência de tecido, regeneração de tecido, crescimento de tecido, função de tecido, regeneração de órgão, sobrevivência de órgão, função de órgão ou qualquer combinação dos mesmos, opcionalmente em que a regulação compreende a indução da reprogramação celular, rever- tendo o envelhecimento, melhorando a função do tecido, melhorando a função do órgão, reparo do tecido, sobrevivência do tecido, regeneração do tecido, crescimento do tecido, angiogênese, formação de cicatriz, a aparência do envelhecimento, regeneração do órgão, sobrevivência do órgão, alterando o sabor e a qualidade dos produtos agrícolas derivados de animais, tratamento de uma doença, ou qualquer combinação dos mesmos, in vivo ou in vitro podem ser administrados a uma célula, te- cido ou órgão que está in vivo (por exemplo, g., parte de um indivíduo), ou pode ser administrado a uma célula, tecido ou órgão ex vivo. Quando aqui usado, a regulação pode se referir a qualquer tipo de modulação, incluindo indução ou promoção, inibição e/ou parada. A angiogênese se refere ao crescimento de novos vasos sanguíneos, incluindo capilares.
[00310] Em alguns casos, um vetor viral (por exemplo, vetor de len- tivírus, vetor de alfavírus, vetor de vírus da vacínia, vetor de adenovírus, vetor de vírus do herpes, vetor de retrovírus ou vetor AAV) é adminis- trado em um vírus recombinante (por exemplo, lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, adenovírus, vírus do herpes, retrovírus ou AAV). Sem estar limitado por uma teoria particular, a expressão transitória de OCT4, SOX2 e KLF4 pode resultar na reprogramação parcial de uma célula. Por exemplo, a reprogramação parcial pode induzir uma célula total- mente diferenciada a rejuvenescer e ganhar pluripotência. Em algumas modalidades, a expressão transitória de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 não induz a expressão de marcadores de células-tronco (por exemplo, Na- nog).
[00311] Em algumas modalidades, a expressão transitória de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos não induz a expressão de marcadores de células-tronco (por exemplo, Nanog). Sem ser limi- tado por qualquer teoria particular, a ativação de Nanog pode induzir teratomas e causar a morte do hospedeiro. Em algumas modalidades, o método não induz a formação de teratoma. Em algumas modalidades, o método não induz a proliferação celular indesejada. Em algumas mo- dalidades, o método não induz o crescimento de células malignas. Em algumas modalidades, o método não induz câncer. Em algumas moda- lidades, o método não induz glaucoma. Em algumas modalidades, a ex- pressão transitória é de no máximo 1 hora, 5 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5, dias ou 1 semana. Em alguns casos, a expressão pro- longada (por exemplo, expressão contínua por pelo menos 5 dias, pelo menos 1 semana ou pelo menos 1 mês) de OCT4, SOX2 e KLF4 resulta na reprogramação completa de uma célula. Por exemplo, uma célula pode ser totalmente reprogramada em uma célula pluripotente (por exemplo, célula pluripotente induzida). Em alguns casos, a expressão prolongada (por exemplo, expressão contínua por pelo menos 5 dias, pelo menos 1 semana ou pelo menos 1 mês) de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos resulta na reprogramação completa de uma célula. Por exemplo, uma célula pode ser totalmente reprogramada em uma célula pluripotente (por exemplo, célula pluripotente induzida).
[00312] Sem ser limitado por uma teoria particular, a expressão de
OCT4, SOX2 e KLF4 pode promover a reprogramação celular, promo- ver a regeneração do tecido, promover a regeneração do órgão, reverter o envelhecimento, tratar uma doença ou qualquer combinação dos mes- mos porque OCT4, SOX2 e KLF4 induzem a reprogramação parcial. Quando aqui usada, a reprogramação parcial ou incompleta de uma cé- lula refere-se a uma célula que não são células-tronco, mas têm carac- terísticas juvenis. Em algumas modalidades, uma característica jovem é um epigenoma semelhante a uma célula jovem. Em algumas modali- dades, uma célula-tronco mostra níveis mais elevados de expressão Nanog em comparação com uma célula que não é uma célula-tronco. Em algumas modalidades, as características juvenis se referem ao re- juvenescimento de uma célula sem alterar a identidade celular. Veja, por exemplo, mostrado na FIG. 16, em que a expressão dos genes de histona e Chaf (Fator de montagem da cromatina) diminui durante o en- velhecimento em fibroblastos de orelha de camundongos idosos (12 me- ses ou 15 meses) em comparação com aqueles de camundongos jo- vens, curto prazo da indução de OSKM (3 dias) ou da expressão de OSK (5 dias) pode redefinir seu nível de expressão gênica para o estado jovem, sem transformar as células em células-tronco (por exemplo, a expressão Nanog não é induzida nessas células).
[00313] Para praticar esta modalidade, uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modi- ficados) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lenti- vírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) são administrados a uma célula, um tecido, órgão e/ou indiví- duo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exem- plo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) são administrados a uma célula, um tecido, órgão e/ou indivíduo. As células modificadas podem ser administradas a qual- quer tecido, órgão e/ou indivíduo. Quando o vetor de expressão com- preende um promotor induzível (por exemplo, um promotor TRE, inclu- indo um TRE3G, TRE2 ou à prova de P), o agente indutor também pode ser introduzido na célula (por exemplo, simultaneamente ou sequenci- almente com um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nuclei- cos modificados) que codificam OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer com- binação dos mesmos). Em uma modalidade, OCT4, SOX2 e KLF4 são codificados por um vetor de expressão que é separado de um vetor de expressão que codifica o agente indutor. Em alguns casos, o agente indutor é codificado pelo mesmo vetor de expressão que codifica OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00314] Em alguns casos, um agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um agente indutor, uma proteína modificada que codifica um agente indutor ou um vírus que codifica um agente indutor) e/ou um agente químico (por exemplo, tetraciclina) que é capaz de mo- dular (por exemplo, ativar ou inibir) a atividade do agente indutor tam- bém é introduzido em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo. Em cer- tas modalidades, uma célula, tecido, indivíduo e/ou órgão é ainda culti- vado na presença ou ausência de um agente químico que seja capaz de modular a atividade de um agente indutor (por exemplo, tetraciclina,
que inclui a doxiciclina). Para um sistema Tet-On, o agente indutor pode ser rtTA (por exemplo, rtTA3 ou rtTA4), e o agente indutor promove a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mes- mos na presença de tetraciclina. Para um sistema Tet-Off, o agente in- dutor pode ser tTA, e o agente indutor promove a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos na ausência de te- traciclina.
[00315] A administração de um vetor de expressão que codifica um fator de transcrição aqui descrito e, em alguns casos, o agente indutor (por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modifi- cado) que codifica um agente indutor ou o agente indutor como proteína) e/ou agente químico que é capaz de modular a atividade do agente in- dutor sob condições adequadas para a expressão pode aumentar a ex- pressão do transgene por pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, pelo menos 400 %, pelo me- nos 500 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 % ou pelo menos 1.000 % em uma célula. A expressão do gene pode ser determinada por métodos de ro- tina, incluindo ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISAs), western blots e quantificação de RNA (por exemplo, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa).
[00316] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), proteí- nas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticor- pos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenoví- rus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descrito, sozinhos ou em combinação podem ser introduzidos em um tecido, célula ou órgão ex vivo (por exemplo, não em um indivíduo) e o tecido, célula e/ou órgão pode ser posteriormente cultivado ex vivo.
Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qual- quer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação podem ser introduzidos em um tecido, célula ou órgão ex vivo (por exemplo, não em um indivíduo) e o tecido, célula e/ou órgão podem ser posterior- mente cultivados ex vivo.
Em alguns casos, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor é intro- duzido em um tecido, célula e/ou órgão ex vivo e o tecido, célula e/ou órgão podem ser posteriormente cultivados ex vivo.
Em algumas moda- lidades, as células modificadas são cultivadas para produzir um tecido modificado.
Em algumas modalidades, as células modificadas são cul- tivadas para produzir um órgão modificado.
Em algumas modalidades, um tecido modificado é cultivado para produzir um órgão modificado.
Esses métodos podem ser úteis na produção de uma célula modificada (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele, in-
cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, barbatana, ovário ou intestino), tecido ou órgão mo- dificado (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raí- zes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esô- fago, músculo, incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele, incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino) (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, cora- ção, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, na- dadeira, ovário ou intestino) para transplante em um indivíduo. Em al- gumas modalidades, a célula, tecido e/ou órgão modificado é transplan- tado para um indivíduo.
[00317] Em algumas modalidades, células, tecidos, órgãos ou qual- quer combinação dos mesmos a serem modificados são autólogos para o indivíduo, por exemplo, obtidos de um indivíduo em necessidade dos mesmos. A administração de células autólogas, tecidos autólogos, ór- gãos autólogos ou qualquer combinação dos mesmos pode resultar na rejeição reduzida das células, tecidos, órgãos ou qualquer combinação dos mesmos em comparação com a administração de células não au- tólogas, tecido não autólogo e/ou órgãos não autólogos. Alternativa- mente, as células, tecidos ou órgãos a serem modificados podem ser células alogênicas, tecidos alogênicos ou órgãos alogênicos. Por exem- plo, células alogênicas, tecido alogênico, órgãos alogênicos ou qualquer combinação dos mesmos podem ser derivados de um doador (por exemplo, de uma espécie particular) e administrados a um receptor (por exemplo, da mesma espécie) que é diferente do doador. Em algumas modalidades, células alogênicas, tecido alogênico, órgãos alogênicos ou qualquer combinação dos mesmos podem ser derivados de um indi- víduo doador de uma espécie particular e administrados a um indivíduo receptor de uma espécie diferente do doador.
[00318] Em algumas modalidades, a célula modificada é uma célula- tronco (iPSC) incluindo iPSC naïve que pode ser diferente em três ca- madas germinativas. Em algumas modalidades, a iPSC é ainda mais diferenciada em outro tipo de célula (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo músculo car- díaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino). A iPSC pode ser ainda mais diferenciada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ex vivo).
[00319] Em algumas modalidades, as células modificadas compre- endem mais de um tipo de célula (por exemplo, olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo músculo car- díaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino).
[00320] Como um exemplo não limitante, qualquer um dos ácidos nu- cleicos modificados (por exemplo, ácidos nucleicos nus ou ácidos nu- cleicos formulados em um veículo de liberação, incluindo um vetor viral e/ou nanopartícula) que codifica OCT4, KLF4 e SOX2, pode ser liberado a uma célula (por exemplo, uma célula diferenciada) para produzir uma célula-tronco pluripotente induzida. Em algumas modalidades, a célula- tronco pluripotente induzida é ainda mais diferenciada (por exemplo, di- ferenciada em um olho, orelha, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago,
músculo, incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou célula do intestino). Em algu- mas modalidades, as células são modificadas ex vivo e administradas a um indivíduo em necessidade das mesmas. Em algumas modalidades, um órgão ou tecido pode ser regenerado in vitro usando iPSCs e o órgão ou tecido é transplantado para um indivíduo.
[00321] Como um exemplo não limitante, os métodos descritos neste documento podem ser usados para produzir pele modificada, um fígado modificado, um olho modificado, um fígado modificado, qualquer célula modificada, qualquer órgão modificado ou qualquer tecido modificado ex vivo. O órgão modificado, tecido modificado, órgão modificado ou qualquer combinação dos mesmos pode ser administrado a um indiví- duo. Em algumas modalidades, a administração de uma célula modifi- cada, tecido modificado, órgão modificado ou uma combinação dos mesmos melhora a sobrevivência de um indivíduo (por exemplo, au- menta a vida útil de um indivíduo em relação a não receber a célula, tecido ou órgão modificado).
[00322] Uma composição farmacêutica aqui descrita pode ser admi- nistrada a um indivíduo em necessidade da mesma. Exemplos não limi- tantes de indivíduos incluem qualquer animal (por exemplo, mamíferos, incluindo humanos). Um indivíduo pode ser suspeito de ter, estar em risco ou ter uma condição. Por exemplo, a condição pode ser uma lesão ou doença e a condição pode afetar qualquer tecido (por exemplo, ore- lha, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo, incluindo mús- culo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele, incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nada- deira, ovário ou intestino). Exemplos não limitantes de condições, doen- ças e distúrbios incluem lesões agudas, doenças neurodegenerativas,
doenças crônicas, doenças proliferativas, doenças cardiovasculares, doenças genéticas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doen- ças neurológicas, doenças hematológicas, condições dolorosas, distúr- bios psiquiátricos, distúrbios metabólicos, câncer, envelhecimento, do- enças relacionadas à idade e doenças que afetam qualquer tecido em um indivíduo. Em algumas modalidades, a doença é uma doença ocular.
[00323] Em certas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a expres- são de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), pro- teínas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticor- pos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenoví- rus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descrito, sozinhos ou em combinação podem ser introduzidos a um in- divíduo antes do início de uma doença (por exemplo, para prevenir uma doença ou para prevenir danos a uma célula, tecido ou órgão). Em cer- tas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nucleico modificado) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de in- duzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, len- tivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do her- pes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação podem ser introduzidos a um indivíduo antes do início de um doença (por exemplo, para prevenir uma doença ou para prevenir danos a uma célula, tecido ou órgão). Em certas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor pode ser intro- duzido em um indivíduo antes do início de uma doença.
Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um indivíduo saudável.
Em certas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácido nu- cleico modificado) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), proteínas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exem- plo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus re- combinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da va- cínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descrito, sozinhos ou em combinação podem ser apresentados a um indivíduo após o início da doença (por exemplo, para aliviar os danos ou sintomas associados a uma doença). Em certas modalidades, qualquer um dos ácidos nuclei- cos (por exemplo, ácido nucleico modificado) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, proteínas modificadas aqui descritas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, indu- zindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adeno- vírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos, sozinhos ou em combinação, podem ser introduzidos a um indivíduo após o início da doença (por exemplo, para aliviar os danos ou sintomas associados a uma doença). Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 é induzida antes do início de uma doença.
Em algumas modalidades, a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação destes é induzida antes do início de uma do- ença.
Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, KLF4 e/ou
SOX2 é induzida após o início de uma doença. Em algumas modalida- des, a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação des- tes é induzida após o início de uma doença. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 é induzida em um indivíduo jovem, célula jovem, tecido jovem e/ou órgão jovem. Em algumas mo- dalidades, a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 é induzida em um indivíduo envelhecido, célula envelhecida, tecido envelhecido e/ou ór- gão envelhecido. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos é induzida em um indivíduo jovem, célula jovem, tecido jovem e/ou órgão jovem. Em algu- mas modalidades, a expressão de, OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos é induzida em um indivíduo envelhecido, cé- lula envelhecida, tecido envelhecido e/ou órgão envelhecido. Em certas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de mo- dular a atividade do agente indutor pode ser introduzido em um indivíduo após o início de uma doença.
[00324] Em certas modalidades, o tecido pode ser considerado sau- dável, porém, abaixo do ideal para o desempenho ou sobrevivência nas condições atuais ou futuras (por exemplo, na agricultura ou em condi- ções adversas, incluindo tratamentos de doenças, terapias tóxicas, ex- posição ao sol ou viagens espaciais fora da atmosfera terrestre).
[00325] Em certas modalidades, a condição é o envelhecimento. To- dos os animais normalmente passam por um período de crescimento e maturação seguido por um período de declínio fisiológico progressivo e irreversível que termina em morte. O período de tempo desde o nasci- mento até a morte é conhecido como o tempo de vida de um organismo, e cada organismo tem um tempo de vida médio característico. O enve- lhecimento é uma manifestação física das mudanças subjacentes à pas- sagem do tempo, medida pela porcentagem da expectativa de vida mé- dia.
[00326] Em alguns casos, as características do envelhecimento po- dem ser bastante óbvias. Por exemplo, as características de humanos mais velhos incluem enrugamento da pele, cabelos grisalhos, calvície e catarata, bem como hipermelanose, osteoporose, atrofia cortical cere- bral, depleção linfoide, atrofia tímica, aumento da incidência de diabetes tipo II, aterosclerose, câncer e doença cardíaca. Nehlin et al. (2000), Annals NY Acad Sci 980:176-79. Outros aspectos do envelhecimento dos mamíferos incluem perda de peso, lordoquifose (coluna lombar), ausência de vigor, atrofia linfoide, diminuição da densidade óssea, es- pessamento dérmico e tecido adiposo subcutâneo, diminuição da capa- cidade de tolerar o estresse (incluindo calor ou frio, ferimentos, aneste- sia e ablação de células precursoras hematopoética), patologia hepá- tica, atrofia das vilosidades intestinais, ulceração da pele, depósitos ami- loides e doenças articulares. Tyner et al. (2002), Nature 415:45-53.
[00327] Os versados na técnica reconhecerão que o processo de en- velhecimento também se manifesta no nível celular, bem como nas mi- tocôndrias. O envelhecimento celular se manifesta na perda da capaci- dade de duplicação, aumento dos níveis de apoptose, alterações no fe- nótipo diferenciado e alterações no metabolismo, por exemplo, diminui- ção dos níveis de síntese de proteínas e regeneração.
[00328] Dada a natureza programada do envelhecimento celular e orgânico, é possível avaliar a “idade biológica” de uma célula ou orga- nismo por meio de características fenotípicas que se correlacionam com o envelhecimento. Por exemplo, a idade biológica pode ser deduzida de padrões de expressão gênica, resistência ao estresse (por exemplo, es- tresse oxidativo ou genotóxico), taxa de proliferação celular e as carac- terísticas metabólicas das células (por exemplo, taxas de síntese de pro- teínas e regeneração, função mitocondrial, biossíntese de ubiquinona, biossíntese de colesterol, níveis de ATP dentro da célula, níveis de um intermediário do ciclo de Krebs na célula, metabolismo de glicose, me- tabolismo de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado), taxas de translação ribossômica, etc.). Quando aqui usado, "idade bio- lógica" é uma medida da idade de uma célula ou organismo com base nas características moleculares da célula ou organismo. A idade bioló- gica é diferente de “idade temporal”, que se refere à idade de uma célula ou organismo medida por dias, meses e anos.
[00329] A taxa de envelhecimento de um organismo, por exemplo, um invertebrado (por exemplo, um verme ou uma mosca) ou um verte- brado (por exemplo, um roedor, por exemplo, um camindongo) pode ser determinada por uma variedade de métodos, por exemplo, por um ou mais dentre: a) avaliar o tempo de vida da célula ou do organismo; (b) avaliar a presença ou abundância de uma transcrição de gene ou pro- duto de gene na célula ou organismo que tem um padrão de expressão dependente da idade biológica; (c) avaliar a resistência da célula ou or- ganismo ao estresse, por exemplo, estresse genotóxico (por exemplo, etoposídeo, irradiação UV, exposição a um mutagênico e assim por di- ante) ou estresse oxidativo; (d) avaliar um ou mais parâmetros metabó- licos da célula ou organismo; (e) avaliar a capacidade proliferativa da célula ou de um conjunto de células presentes no organismo; e (f) ava- liar a aparência física ou comportamento da célula ou organismo. Em um exemplo, avaliar a taxa de envelhecimento inclui medir diretamente a média de vida de um grupo de animais (por exemplo, um grupo de animais geneticamente pareados) e comparar a média resultante com a média de vida de um grupo de animais de controle (por exemplo, um grupo de animais que não recebeu o composto de teste, porém, são geneticamente combinados com o grupo de animais que recebeu o composto de teste). Alternativamente, a taxa de envelhecimento de um organismo pode ser determinada medindo um parâmetro relacionado à idade. Exemplos de parâmetros relacionados à idade incluem: aparên- cia, por exemplo, sinais visíveis de idade; a expressão de um ou mais genes ou proteínas (por exemplo, genes ou proteínas que têm um pa- drão de expressão relacionado à idade); resistência ao estresse oxida- tivo; parâmetros metabólicos (por exemplo, síntese ou degradação de proteínas, biossíntese de ubiquinona, biossíntese de colesterol, níveis de ATP, metabolismo de glicose, metabolismo de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado), taxas de translação ribossômica, etc.); e proliferação celular (por exemplo, de células retinais, células ós- seas, glóbulos brancos, etc.).
[00330] O envelhecimento também pode ser determinado pela taxa de mudança de biomarcadores (por exemplo, marcas epigenéticas in- cluindo o nível de metilação do DNA da ilha CpG no genoma (conhecido como "Horvath Clock") células positivas para beta-galactosidase em cé- lulas, alterações de expressão gênica ou certas alterações na abundân- cia de moléculas na corrente sanguínea). Um exemplo é um algoritmo da Segterra Inc. que determina “InnerAge” com base em biomarcadores de sangue (veja InsideTracker.com).
[00331] Como mostrado nos Exemplos aqui, vírus recombinantes (por exemplo, AAVs) que codificam OCT4, KLF4 e SOX2 promoveram a regeneração de axônios, que podem ser usados para prevenir ou ali- viar a neurodegeneração que é frequentemente associada ao envelhe- cimento. Os métodos podem ser usados para prevenir ou aliviar a neu- rodegeneração e neuropatias periféricas associadas. As doenças neu- rodegenerativas incluem doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amniotrópica (ALS), doença de Huntington e distrofia muscular. A neurodegeneração pode ser quantifi- cada usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a função executiva de um indivíduo pode ser determinada (Moreira et al., Front Aging Neurosci. 2017 Nov 9; 9:369).
[00332] Em algumas modalidades, a expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos, conforme descrito neste documento, aumenta o número de axônios por nervo em um tecido, órgão ou um indivíduo em relação a um controle. Em algu- mas modalidades, um método aqui descrito aumenta o número de axô- nios por nervo por pelo menos 1,5 vezes, por pelo menos 2 vezes, por pelo menos 3 vezes, por pelo menos 5 vezes, por pelo menos 6 vezes, por pelo menos 7 vezes, por pelo menos 8 vezes, por pelo menos 9 vezes, por pelo menos 10 vezes, por pelo menos 20 vezes, por pelo menos 30 vezes, por pelo menos 40 vezes, por pelo menos 50 vezes, por pelo menos 60 vezes, por pelo menos 70 vezes, por pelo menos 80 vezes, por pelo menos 90 vezes, ou por pelo menos 100 vezes em re- lação a um controle. Em algumas modalidades, o controle é o número de axônios por nervo no tecido, órgão ou indivíduo antes da expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos.
[00333] Condições adicionais relacionadas à idade que podem ser tratadas incluem insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral, dia- betes, doenças hepáticas, doenças fibróticas, osteoporose, artrite, perda de audição (parcial ou total), condições relacionadas aos olhos (por exemplo, visão deficiente, doença da retina, qualquer doença ocu- lar (por exemplo, qualquer condição que afete o olho)), glaucoma, do- enças musculares (por exemplo, sarcopenia e distrofias musculares), fragilidade, uma síndrome progeroide (por exemplo, síndrome de Hut- chinson-Gilford progeria) e câncer. Em certas modalidades, a doença é uma doença da retina (por exemplo, degeneração macular).
[00334] Em algumas modalidades, a expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um neu- rônio aumenta a área de neurito do neurônio por pelo menos 1,5 vezes, por pelo menos 2 vezes, por pelo menos 3 vezes, por pelo menos pelo menos 5 vezes, por pelo menos 6 vezes, por pelo menos 7 vezes, por pelo menos 8 vezes, por pelo menos 9 vezes, por pelo menos 10 vezes, por pelo menos 20 vezes, por pelo menos 30 vezes, por pelo menos 40 vezes, por pelo menos 50 vezes, por pelo menos 60 vezes, por pelo menos 70 vezes, por pelo menos 80 vezes, por pelo menos 90 vezes, ou por pelo menos 100 vezes em relação ao neurônio sem expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos.
[00335] Em algumas modalidades, a expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos, conforme descrito neste documento, aumenta a densidade do axônio em um te- cido, órgão ou um indivíduo em relação a um controle. Em algumas mo- dalidades, um método aqui descrito aumenta a densidade de axônios por pelo menos 1,5 vezes, por pelo menos 2 vezes, por pelo menos 3 vezes, por pelo menos 5 vezes, por pelo menos 6 vezes, por pelo menos 7 vezes, por pelo menos 8 vezes, por pelo menos 9 vezes, por pelo menos 10 vezes, por pelo menos 20 vezes, por pelo menos 30 vezes, por pelo menos 40 vezes, por pelo menos 50 vezes, por pelo menos 60 vezes, por pelo menos 70 vezes, por pelo menos 80 vezes, por pelo menos 90 vezes, ou por pelo menos 100 vezes em relação a um con- trole. Em algumas modalidades, o controle é a densidade do axônio no tecido, órgão ou indivíduo antes da expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos.
[00336] Em algumas modalidades, a expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um indiví- duo aumenta a acuidade visual do indivíduo em relação a um controle. Em algumas modalidades, um método aqui descrito aumenta a acui- dade visual de um indivíduo por pelo menos 1,5 vezes, por pelo menos 2 vezes, por pelo menos 3 vezes, por pelo menos 5 vezes, por pelo menos 6 vezes, por pelo menos 7 vezes, por pelo menos 8 vezes, por pelo menos 9 vezes, por pelo menos 10 vezes, por pelo menos 20 ve- zes, por pelo menos 30 vezes, por pelo menos 40 vezes, por pelo menos 50 vezes, por pelo menos 60 vezes, por pelo menos 70 vezes, pelo me- nos 80 vezes, pelo menos 90 vezes ou pelo menos 100 vezes em rela- ção a um controle. Em algumas modalidades, o controle é a acuidade visual do indivíduo antes da expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalida- des, a acuidade visual é medida pela acuidade optomotora. Em algumas modalidades, a acuidade visual é medida usando uma resposta de ele- trorretinograma padrão. Em alguns exemplos, a acuidade visual é me- dida usando um teste de acuidade visual à distância, que pode incluir o uso de um gráfico de Snellen ou gráfico E. Veja, por exemplo, Marsden et al., Community Eye Health. 2014; 27(85):16 e os Exemplos abaixo.
[00337] Em algumas modalidades, a expressão, indução ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um indiví- duo diminui a pressão intraocular do indivíduo em relação a um controle. Em algumas modalidades, um método aqui descrito diminui a pressão intraocular de um indivíduo por pelo menos 1,5 vezes, por pelo menos 2 vezes, por pelo menos 3 vezes, por pelo menos 5 vezes, por pelo menos 6 vezes, por pelo menos 7 vezes, por pelo menos 8 vezes, por pelo menos 9 vezes, por pelo menos 10 vezes, por pelo menos 20 ve- zes, por pelo menos 30 vezes, por pelo menos 40 vezes, por pelo menos 50 vezes, por pelo menos 60 vezes, por pelo menos 70 vezes, por pelo menos 80 vezes, por pelo menos 90 vezes, ou por pelo menos 100 ve- zes em relação a um controle. Em algumas modalidades, o controle é a pressão intraocular do indivíduo antes da expressão, indução ou ativa- ção de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos. Veja, por exemplo, os Exemplos abaixo.
[00338] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos
(por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ati- vam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes, ou AAV) aqui descritos podem ser usados para tratar e/ou prevenir qual- quer uma das doenças aqui descritas. Em algumas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é usado.
[00339] Como um exemplo não limitante, uma célula modificada da presente descrição pode ser usada para substituir uma célula disfunci- onal em um indivíduo em necessidade da mesma. Como outro exemplo não limitante, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expres- são) capazes de induzir a expressão de uma combinação de pelo me- nos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecio- nados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, proteínas modificadas, agentes quí- micos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a ex- pressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, indu- zindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exem- plo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4,
KLF4 e SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, ade- novírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrov irus, vírus do herpes ou AAV) pode ser usada para (por exemplo, incompleta ou totalmente) reprogra- mar uma célula in vivo ou in vitro.
Em algumas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é usado.
Por exemplo, qualquer um dos ácidos nuclei- cos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expres- são), proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exem- plo, induzir a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, al- favírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) podem ser usados para produzir uma célula modificada (por exemplo, uma célula- tronco pluripotente induzida). Por exemplo, qualquer um dos ácidos nu- cleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, proteínas modificadas, agentes quí- micos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lenti- vírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes, ou AAV) podem ser usados para produzir uma célula modificada (por exemplo, uma célula-tronco pluripotente induzida). A célula modificada (por exemplo, célula-tronco pluripotente induzida) pode, então, ser ad- ministrada a um indivíduo em necessidade da mesma.
Em algumas mo- dalidades, a célula modificada é cultivada na presença de um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor.
Em algumas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é ad- ministrado ao indivíduo.
[00340] Usos não limitantes dos ácidos nucleicos (por exemplo, áci- dos nucleicos modificados) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de ex- pressão) capazes de induzir a expressão de uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição sele- cionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, células modificadas, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos que ati- vam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição sele- cionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) incluem a cicatrização de ferimentos, sangra- mento, lesões, ossos quebrados, ferimentos por arma de fogo, cortes, cicatrizes durante a cirurgia (por exemplo, cesariana). Em algumas mo- dalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é usado.
[00341] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de induzir a expressão de uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, células modi- ficadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, um KLF4 e/ou SOX2, agen- tes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, va- cínia vírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) são usados para tratar doenças que afetam um indivíduo não humano (por exemplo, uma do- ença que afeta criações, animais domésticos e/ou outros animais não humanos). Em algumas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é usado. Por exemplo, a doença pode ser uma doença do gado, uma doença dos primatas (por exemplo, macacos cinomolgo, macacos reso), uma doença que afeta um animal comercialmente relevante, como gado, porcos, cavalos, ovelhas, cabras, gatos e/ou cães) e/ou uma doença que afeta pássaros (por exemplo, pássaros comercial- mente relevantes, como galinhas, patos, gansos e/ou perus).
[00342] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de induzir a expressão de uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, células modi- ficadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma com- binação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos são usados para promover a cicatrização de ferimentos (por exemplo, para um corte), tratar uma lesão (por exemplo, ossos quebrados, sangra- mento, ferimento por arma de fogo e/ou reduzir cicatrizes durante a ci- rurgia). Em algumas modalidades, a cirurgia inclui cesariana. Em algu- mas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a atividade do agente indutor também é usado.
[00343] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetor de expressão), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetor de expressão) capazes de induzir a expressão de uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, células modi- ficadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) uma com- binação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de)
uma combinação de pelo menos dois (por exemplo, pelo menos três) fatores de transcrição selecionados dentre OCT4, KLF4 e SOX2, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, ví- rus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos são úteis na cura de uma lesão e/ou inflamação. Em algumas modalidades, um agente indutor e/ou um agente químico capaz de modular a ativi- dade do agente indutor também é usado. Em algumas modalidades, a inflamação é hiperinflamação, que pode ser um efeito colateral do en- velhecimento. Em algumas modalidades, a hiperinflamação é inflama- ção.
[00344] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) capazes de induzir a ex- pressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 (por exemplo, vetores de expres- são), células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4 e/ou SOX2 e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lenti- vírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes, ou AAV) aqui descritos fornecem uma capacidade de cura.
[00345] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modifica- das, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vacínia vírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos fornecem uma capacidade de cura.
[00346] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos
(por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modifica- das, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vacínia vírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos são úteis no realce ou rejuvenesci- mento de órgãos ideais ou subideais. Como um exemplo não limitante, qualquer uma das composições aqui descritas (por exemplo, vírus re- combinantes incluindo vírus AAV recombinantes) que codificam OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos podem ser úteis no re- alce ou rejuvenescimento órgãos subideais (por exemplo, de indivíduos mais velhos) que são usados para transplante ou para promover a so- brevivência do órgão durante o transporte ou para promover a sobrevi- vência do órgão após o reimplante do órgão em um indivíduo.
[00347] Qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nu- cleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modificadas, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma com- binação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes, ou AAV) aqui descrito podem ser usados para rejuvenescer ou aumentar a sobrevivência e longevidade das células (por exemplo, células-tronco hematopoéticas, células T, etc.) que são usadas para transplante. Em algumas modalidades, os vírus recombinantes (por exemplo, vírus AAV)
que codificam OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos são úteis no rejuvenescimento ou aumento da sobrevivência e longevi- dade das células (por exemplo, células-tronco hematopoéticas, células T, etc.) que são usadas para transplante.
[00348] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modifica- das, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vacínia vírus, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos são usados para prevenir ou aliviar os efeitos colaterais de uma toxina e/ou um fármaco (por exemplo, uma quimioterapia) em um indivíduo. Exemplos não limitantes de efeitos co- laterais incluem perda de cabelo e neuropatia periférica. As quimiotera- pias incluem vincristina (VCS). Veja, por exemplo, exemplo 15. Em cer- tas modalidades, uma composição compreendendo um vírus recombi- nante (por exemplo, vírus AAV) que codifica SOX2, KLF4, OCT4, ou uma combinação dos mesmos, é administrada para tratar (por exemplo, recuperar de) ou prevenir os efeitos colaterais induzidos por uma toxina e/ou terapia de fármaco prejudicial (por exemplo, um fármaco quimiote- rápico incluindo VCS).
[00349] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modifica- das, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos, anticorpos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4, KLF4, SOX2, ou uma combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retrovírus, vírus do herpes ou AAV) descritos neste documento são administrados a um indivíduo para prevenir ou aliviar os efeitos colaterais de uma to- xina e/ou um fármaco (por exemplo, uma quimioterapia).
[00350] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) (por exemplo, vetores de expressão) capazes de induzir a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou uma combinação dos mesmos, células modificadas, proteínas modifica- das, agentes químicos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, anticor- pos que ativam (por exemplo, induzindo a expressão de) OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos e/ou vírus recombinantes (por exemplo, lentivírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia, retroví- rus, vírus do herpes ou AAV) aqui descritos são administrados a um indivíduo para proteger um tecido, órgão e/ou corpo inteiro do indivíduo da radiação (por exemplo, prevenir os efeitos prejudiciais da radiação). Em certas modalidades, AAV que codifica OCT4, SOX2, KLF4, ou qual- quer combinação dos mesmos, é administrado a um indivíduo para pro- teger um tecido, órgão e/ou corpo inteiro do indivíduo da proteção contra radiação (por exemplo, prevenir os efeitos prejudiciais da radiação).
[00351] Métodos para identificar indivíduos com suspeita de ter uma condição podem incluir exame físico, histórico médico familiar do indiví- duo, histórico médico do indivíduo, biópsia, teste genético, sequencia- mento de DNA de patógenos ou do microbioma, proteômica ou uma sé- rie de tecnologias de imagem, como ultrassonografia, tomografia com- putadorizada, imagem por ressonância magnética, espectroscopia de ressonância magnética ou tomografia por emissão de pósitrons.
[00352] Quantidades eficazes dos ácidos nucleicos modificados (por exemplo, vetores de expressão, incluindo vetores virais), vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus, retrovírus, alfavírus, vírus da vacínia ou AAVs) ou suas composições variam, conforme reconhecido por aqueles versados na técnica, dependendo da rotina de administra- ção, uso de excipiente e couso com outros agentes ativos. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a idade do indivíduo, a gravidade da condição, o peso do indi- víduo, a genética do indivíduo, as células, tecido ou órgão a ser direcio- nado, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00353] A expressão de um ou mais fatores de transcrição da pre- sente descrição (por exemplo, OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combi- nação dos mesmos) pode resultar na reprogramação de uma célula, re- paro de tecido, regeneração de tecido, aumento do fluxo sanguíneo, re- generação de órgão, imunidade melhorada, reversão de envelheci- mento, contra-senescência ou qualquer combinação dos mesmos. A re- programação celular pode ser determinada determinando a extensão da diferenciação de uma célula (por exemplo, determinando a expressão de um ou mais marcadores de linhagem ou marcadores de pluripotên- cia, incluindo OCT4, KLF4, SOX2, NANOG, ESRRB, NR4A2 e C/EBPα). O potencial de diferenciação de uma célula também pode ser determi- nado usando ensaios de diferenciação de rotina ou padrões de expres- são de genes. A reparação do tecido pode ser determinada por ensaios de substituição de tecido e regeneração de tecido. Por exemplo, os en- saios de substituição de tecido incluem ensaios de cicatrização de feri- mentos em cultura de células ou em camundongos. A regeneração do tecido pode ser determinada pela quantificação de um tipo de célula particular após a expressão de um ou mais fatores de transcrição em comparação com antes da expressão de OCT4, KLF4 e SOX2 (veja, por exemplo, os Exemplos fornecidos abaixo). A regeneração do tecido pode ser determinada quantificando um tipo de célula particular após a expressão de um ou mais fatores de transcrição em comparação com antes da expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns casos, os métodos descritos neste documento promovem a regeneração de órgãos (por exemplo, regeneração do fí- gado ou reversão da fibrose e crescimento do fígado). Em alguns casos, os métodos descritos neste documento promovem a sobrevivência do tecido e da célula. A sobrevivência celular em face da adversidade e dano pode ser determinada usando ensaios de viabilidade celular que são padrão na técnica (por exemplo, teste de sobrevivência neuronal com o ensaio de células vivas nano-glo de Promega corp.). Em alguns casos, os métodos descritos neste documento podem prevenir a dege- neração axonal ou Walleriana, que pode ser determinada quantificando a taxa de degeneração axonal após esmagamento do nervo in vitro usando culturas de células nervosas ou em modelos de esmagamento do nervo de rato e camundongo conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00354] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste docu- mento não induzem a formação de teratoma. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos ou a ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um indivíduo, tecido ou órgão resulta em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 % de redução na formação de teratoma em com- paração com a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos e c-MYC ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4, ou uma com- binação dos mesmos e c-MYC no indivíduo, tecido ou órgão. Em algu- mas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 ou ativação de OCT4, SOX2 e KLF4 em um indivíduo, tecido ou órgão resulta em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %,
pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 % de redução na formação de teratoma em comparação com a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 e c -MYC ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC no indivíduo, tecido ou órgão. Em algumas modalidades, o número de teratomas ou o tama- nho de um teratoma em um indivíduo, tecido ou órgão é o mesmo ou é reduzido após a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4, ou uma combinação dos mesmos em um indivíduo, tecido ou órgão em comparação com o número de teratomas ou o tamanho de um teratoma no indivíduo, tecido ou órgão antes da ativação ou expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos.
[00355] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste docu- mento não induzem proliferação celular indesejada. Em algumas moda- lidades, a proliferação celular indesejada é a proliferação celular aber- rante, que pode ser benigna ou cancerosa. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos ou a ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um indivíduo, tecido ou órgão reduz a proliferação celular indesejada em um indivíduo, tecido ou órgão, por pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 % em comparação com o mesmo método com expressão ou ativação de c-Myc. Em algumas modalidades, a proliferação celular indesejada em um indivíduo, tecido ou órgão é a mesma ou é reduzida após a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mes- mos ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mes- mos em um indivíduo, tecido ou órgão em comparação com a quanti- dade de proliferação celular indesejada no indivíduo, tecido ou órgão antes da ativação ou expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combi- nação dos mesmos.
[00356] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos não in- duzem a formação de tumor ou o crescimento do tumor. Em algumas modalidades, a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos ou a ativação de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos em um indivíduo, tecido ou órgão reduz o número de tu- mores ou o tamanho de um tumor em um indivíduo, tecido ou órgão por pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40%, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo me- nos 80%, pelo menos 90 %, ou pelo menos 100 % em comparação com o mesmo método com expressão ou ativação de c-Myc. Em algumas modalidades, o número de tumores ou o tamanho de um tumor em um indivíduo, tecido ou órgão é o mesmo ou é reduzido após a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos ou ativação de OCT4, SOX2, KLF4, ou uma combinação dos mesmos em um indi- víduo, tecido ou órgão em comparação com o número de tumores ou o tamanho de um tumor no indivíduo, tecido ou órgão antes da ativação ou expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um método aqui descrito não induz câncer. Em algumas modalidades, um método aqui descrito não induz glau- coma.
[00357] Métodos de reprogramação também são fornecidos aqui. Em algumas modalidades, um método de reprogramação aqui descrito compreende reverter ou rejuvenescer o relógio epigenético de uma cé- lula, tecido, órgão ou um indivíduo. Em algumas modalidades, o relógio epigenético pode ser parcial ou totalmente revertido. Em algumas mo- dalidades, o relógio epigenético de uma célula, tecido, órgão ou um in- divíduo é medido usando a idade baseada na metilação do DNA (idade
DNAmAGE ou DNAm). Em algumas modalidades, um método aqui des- crito reduz a idade DNAmAge de uma célula em 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 %.
[00358] Em algumas modalidades, um método de reprogramação aqui descrito compreende alterar a expressão de um ou mais genes as- sociados ao envelhecimento. Em algumas modalidades, a expressão de um gene é aumentada por pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo me- nos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 %. Em algumas modalidades, a expressão de um gene é reduzida por pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo me- nos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 100 %. Em algumas moda- lidades, a expressão de um ou mais genes após o desempenho de um método é determinada em relação à expressão de um ou mais genes antes do desempenho do método. Em algumas modalidades, a expres- são de um ou mais genes é determinada em relação à expressão de um ou mais genes em uma célula jovem, um indivíduo jovem, um tecido jovem, um órgão jovem ou qualquer combinação dos mesmos. Em al- gumas modalidades, a expressão de um ou mais genes é determinada em relação à expressão de um ou mais genes em uma célula velha, um indivíduo velho, um tecido velho, um órgão velho ou qualquer combina- ção dos mesmos.
[00359] Um gene associado ao envelhecimento pode ser um gene cuja expressão é alterada em um tecido velho, um órgão velho, um in- divíduo velho ou qualquer combinação destes em comparação com uma contraparte jovem. Em algumas modalidades, o gene associado ao en- velhecimento é 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik,
4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik, Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248, Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025, Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648, Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124,
Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263, Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706, Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113, Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356, Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722, Gm45516, Gm45532, Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Prickle2, Qsox1, Rapgef4os2,
Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1, Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech, Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Slitrk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o gene é um gene sensorial.
[00360] Em algumas modalidades, um método aqui descrito reduz a expressão de 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356, Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722, Gm45516, Gm45532, Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Pri- ckle2, Qsox1, Rapgef4os2, Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1,
Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech, Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Sli- trk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos. Veja, por exemplo, a Tabela 5 para genes associados ao envelheci- mento.
[00361] Em algumas modalidades, um método aqui descrito aumenta a expressão de 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik, 4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik, Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248, Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025, Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648,
Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124, Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263, Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706, Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113, Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, ou qualquer combina- ção dos mesmos.
[00362] Aspectos da presente descrição se referem a métodos que compreendem redefinir o perfil transcricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho e/ou qualquer combinação dos mesmos in vitro. Aspectos da presente descrição se referem a métodos que com- preendem redefinir o perfil transcricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um indivíduo velho e/ou qualquer combinação dos mesmos in vivo. Em algumas modalidades, redefinir o perfil trans- cricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um in- divíduo velho e/ou qualquer combinação dos mesmos envolve alterar a expressão gênica de um ou mais genes associados ao envelhecimento. Em algumas modalidades, redefinir o perfil transcricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um indivíduo velho e/ou qual- quer combinação dos mesmos envolve a reversão do relógio epigené- tico. Em algumas modalidades, o perfil de transcrição de uma célula an- tiga é redefinido. Em algumas modalidades, o perfil transcricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um indivíduo velho ou qualquer combinação dos mesmos é redefinido para o de uma célula jovem, um tecido jovem, um órgão jovem, um indivíduo jovem ou qual- quer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um método aqui descrito reverte uma ou mais alterações na expressão gênica que são detectadas entre uma célula velha, um órgão velho, um tecido ve- lho, um indivíduo velho ou qualquer combinação destes e um controle. Em algumas modalidades, o controle é uma célula jovem, um órgão jo- vem, um tecido jovem, um indivíduo jovem ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o perfil transcricional de uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um indivíduo velho ou qualquer combinação dos mesmos é alterado de uma contraparte jovem. Em al- gumas modalidades, um método aqui descrito redefine pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, por pelo menos 90 % ou 100 % da alteração da expressão do gene em uma célula velha, um órgão velho, um tecido velho, um indivíduo velho ou qualquer combinação destes para um nível jovem. Em algumas modali- dades, um gene sensorial é um gene receptor sensorial. Sem estar limi- tado por uma teoria particular, a redefinição de um nível de expressão do gene receptor sensorial em uma célula envelhecida para um nível jovem pode ser indicativo de uma melhoria da função das células gan- glionares da retina.
[00363] Em alguns aspectos, os métodos de reprogramação celular descritos neste documento podem ser usados para promover a transdi- ferenciação de células, o que pode ser útil no tratamento de doenças. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento po- dem melhorar a eficiência dos métodos existentes de transdiferencia- ção. Por exemplo, OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mes- mos podem ser ativados (por exemplo, expressos) em um tipo de célula juntamente com uma ou mais perturbações de genes que afetam o des- tino celular para promover a reprogramação de linhagem ou conversão para outro tipo de célula. Em algumas modalidades, a perturbação está reduzindo a expressão de um fator determinante de linhagem. Em algu- mas modalidades, a perturbação é a expressão de um fator determi- nante de linhagem. Em algumas modalidades, o fator determinante de linhagem é um fator de transcrição de linhagem.
[00364] Como um exemplo não limitante, a cegueira noturna é cau- sada pela morte dos bastonetes e a cegueira diurna é causada pela morte dos cones. Tipos de células, incluindo cones, bastonetes e células de Muller, podem ser reprogramados em outro tipo de célula necessário para restaurar a visão. Por exemplo, a perda de Nrl promove a transdi- ferenciação de bastonetes adultos em células do cone. Veja, por exem- plo, Montana et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jan 29; 110(5):1732-
7. Em algumas modalidades, os fatores de transcrição que promovem o destino das células de bastonete incluem Otx2, Crx e Nrl. Como um exemplo não limitante, a glia de Müller (MG) pode ser reprogramada em células de bastonete expressando β-catenina, Otx2, Crx e Nrl. Veja, por exemplo, Yao et al., Nature. 2018 Aug; 2018; 560(7719):484-488.
[00365] Como outro exemplo não limitante, alfa pancreática pode ser reprogramada em células beta para o tratamento de doenças autoimu- nes e diabetes. Fatores de transcrição, incluindo Pdx1 e MafA, podem ser usados para reprogramar células alfa de camundongo em células beta. Veja, por exemplo, Xiao et al., Cell Stem Cell. 2018 Jan 4;
22(1):78-90.e4.
[00366] Exemplos adicionais não limitantes de fatores indutores de transdiferenciação para a produção de vários tipos de células podem ser encontrados em Cieślar-Pobudaet al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Jul; 1864(7):1359-1369, que é aqui incorporado por re- ferência em sua totalidade. Veja, por exemplo, Tabela 4 de Cieślar- Pobudaet al., Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2017 Jul; 1864(7):1359-1369.
[00367] A indução de OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos pode aumentar a eficiência da transdiferenciação de células por pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo me- nos 100 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, pelo menos 400 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 %, ou pelo menos 1000 %, incluindo todos os valores intermediários, em comparação com um controle. A eficiência da transdiferenciação pode ser medida por qualquer método adequado, incluindo a comparação da porcentagem de células que foram transdi- ferenciadas quando OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mes- mos foi ativado em comparação com células de controle em que OCT4, SOX2, KLF4 ou uma combinação dos mesmos não foi ativado.
[00368] Estes e outros aspectos da presente invenção serão ainda apreciados após consideração dos seguintes Exemplos, que se desti- nam a ilustrar certas modalidades particulares da invenção, porém, não se destinam a limitar seu escopo, conforme definido pelas reivindica- ções.
EXEMPLOS
[00369] A fim de que a presente descrição possa ser mais completa-
mente entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Os exem- plos sintéticos e biológicos descritos neste pedido são oferecidos para ilustrar os compostos, composições farmacêuticas e métodos forneci- dos neste documento e não devem ser interpretados de forma alguma como limitante de seu escopo. Exemplo 1: Desenvolvimento de um vetor do vírus adenoassociado (AAV) para expressão induzível de OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) em cé- lulas de mamíferos.
[00370] Um vetor do AAV que é capaz de expressar OCT4, SOX2 e KLF4 em células de mamíferos foi desenvolvido conforme descrito neste documento. Conforme mostrado na FIG. 1, tal vetor compreende um promotor TRE3G (SEQ ID NO: 7), ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modificados) que codificam OCT4, SOX2, KLF4 e uma se- quência terminadora SV40 polyA (SV40pA) (SEQ ID NO: 8). Esse vetor será denominado TRE3G-OSK-SV40pA. Sequências de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) que codificam peptídeos de autoclivagem (T2A, um peptídeo 2A, SEQ ID NO: 9) foram usadas para separar os ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos modifica- dos) que codificam OCT4, SOX2 e KLF4. Conforme mostrado na FIG. 2, todo o vetor tem 7.408 pares de bases no comprimento e duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) flanqueiam as sequências OSK. Os sítios de digestão da enzima de restrição no vetor estão representados na FIG. 3. Um mapeamento esquemático das características mostradas nos mapas vetoriais das FIGS. 4A-4AL sobre a sequência de ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) do vetor é mostrado nas FIGS. 2-3. Os sítios de corte da enzima de restrição são mostrados na Tabela 3 abaixo. Conforme mostrado nas FIGS. 5A-5D, a estrutura de leitura aberta (estrutura 3 ORF) que codifica OSK e os peptídeos 2A intervenientes (peptídeos T2A) tem 3.610 pares de bases. Tabela 3. Sítios de Corte da Enzima de Restrição no vetor TRE3G-
OSK-SV40pA.
Enzimas Sítios Localização AatII 1 4033 Acc65I 1 6074 AfeI 1 5333 AflII 1 2847 AleI 1 5656 BbvCI 1 5098 BclI 1* 4246* BmtI 1 3349 Bpu10I 1 5098 BsaBI 1* 6098* BspQI 1 1436 BsrDI 1 371 BstAPI 1 4016 BstXI 1 4667 BstZ17I 1 5078 EcoRI 1 1893 KpnI 1 6078 NheI 1 3345 NotI 1 2276 PaeR7I 1 4449 PflFI 1 3546 RsrII 1 3542 SacII 1 3765 SapI 1 1436 ScaI 1 7358 SexAI 1* 2330* SpeI 1 5907
Tth111I 1 3546 XhoI 1 4449 ZraI 1 4031
[00371] O vetor mostrado nas FIGS. 3 e 4A-4AL foi clonado usando métodos de rotina. Resumidamente, uma sequência do promotor TRE3G (SEQ ID NO: 7) de Clonetech foi sintetizada usando sítios de restrição de flanqueamento, os iniciadores foram modificados para clo- nar OSK de um plasmídeo TetO-FUW-OSKM e um códon de interrup- ção foi adicionado. Para tornar o vetor mais curto, uma sequência curta de SV40 foi sintetizada com sítios de corte de restrição de flanquea- mento. Considerando que os vetores do AAV convencionais que codifi- cam OSK estão acima do limite de empacotamento do AAV, só podem ser empacotados no capsídeo de AAV9 com baixo título (menos de 2 x 10^12 partículas por preparação viral), e o vírus de baixo título não é funcional devido ao possível truncamento como mostrado na FIG.17. O vetor representado nas FIGS. 3 e 4A-4AL produziram o vírus com mais de 2 x 10^12 viral parcial por preparação ou 1 x 10^13 por mL (dados não mostrados).
[00372] Para determinar se o vetor OSK poderia ser usado para ex- pressão induzível de OSK em células de mamíferos, o vetor OSK foi empacotado em diferentes sorotipos do vírus AAV (AAV9 (FIG. 6A), AAV2 (FIG. 6B) e AAV.PhP.b (FIG. 6C)) usando métodos de rotina. Ba- teladas Lotes adicionais do vírus AAV9 e AAV.PHP.b com um vetor que codifica rtTA3 (sistema Tet-On) e vírus AAV2 com um vetor que codifica tTA (sistema Tet-Off) foram produzidos. Em seguida, células 293T de mamífero foram coinfectadas com o vírus OSK juntamente com o mesmo sorotipo do vírus rtTA3 ou tTA. As células foram subsequente- mente tratadas com ou sem doxiciclina (DOX) e a expressão de OCT4, KLF4 e o controle de carregamento H3 foi determinado por western blot com anticorpos contra OCT4, KLF4 e H3.
[00373] Conforme mostrado com o sistema Tet-On na FIG. 6A, o tra- tamento com doxiciclina aumentou a expressão de OCT4 e KLF4 em células 293T infectadas com vírus AAV9 que codificam OSK e rtTA3. A expressão OSK também pode ser controlada com um sistema Tet-Off. O tratamento com DOX diminuiu a expressão de OCT4 e KLF4 em cé- lulas 293T infectadas com OSK AAV2 e AAV2 com um vetor que direci- ona a expressão de tTA sob um promotor CAG constitutivo (FIG. 6B). Além disso, a expressão de OSK pode ser rigidamente controlada, mesmo após a estimulação da expressão do transgene. Conforme mos- trado na quarta faixa da FIG. 6C, um dia de tratamento com DOX é su- ficiente para aumentar a expressão de OCT4 e KLF4 em células 293T infectadas com vírus TRE3G-OSK-SV40pA AAV.PHP.b e com vírus Ubc-rTtA3-p2a-mkate AAV.PHP.b. A remoção de DOX por três dias após um dia de tratamento com DOX, no entanto, retorna a expressão de OCT4 e KLF4 aos níveis não induzidos (última faixa da FIG. 6C). O vetor Ubc-rtTA3-p2a-mkate compreende um promotor Ubc constitutivo que conduz a expressão de rtTA3, um peptídeo 2A de autoclivagem e uma proteína fluorescente vermelha distante (mKate).
[00374] Portanto, um vetor de AAV que permite a expressão contro- lada de OSK em células de mamíferos (por exemplo, in vivo) foi desen- volvido. Além disso, o vetor de AAV foi empacotado em diferentes soro- tipos de AAV que liberaram com sucesso um vetor funcional em células 293T. Exemplo 2: AAV que codifica a regeneração do nervo ótico promovida por OSK e a sobrevivência dos nervos das células ganglionares da re- tina (RGCs) após o esmagamento do nervo de uma maneira induzível.
[00375] Para determinar se OSK pode ser liberado por AAV e induti- velmente expresso in vivo, o vírus do AAV com o vetor TRE-OSK-SV40 e o vírus AAV que codifica tTA sob o promotor constitutivo de CAG fo- ram produzidos através de métodos de rotina e injetados na retina de camundongos. Em seguida, uma seção de tomografia de coerência ótica (OCT) foi manchada com anticorpo contra RBPMS para identificar células ganglionares da retina (RGCs) e com um anticorpo contra KLF4 para detectar a expressão de KLF4. Conforme mostrado na FIG. 7A, KLF4 foi expresso em RGCs (células RBPMS-positivas), o que sugeriu que os vetores eram funcionais.
[00376] A indutibilidade do sistema também foi testada in vivo. Na ausência de tratamento com DOX, OCT4 e KLF4 foram expressos na retina de camundongo conforme determinado por manchamento de montagem da retina inteira (FIG. 7B, parte superior). Após quatro dias de tratamento com DOX, no entanto, o manchamento de OCT4 e KLF4 foi significativamente reduzido, indicando que a expressão do vetor TRE-OSK-SV40 foi desligada (FIG. 7B, parte inferior). Portanto, a ex- pressão do vetor OSK pode ser rigidamente controlada.
[00377] Para determinar se a expressão de OSK induzível pode in- duzir a reprogramação parcial e promover a regeneração após danos nos nervos, o vírus AAV com o vetor TRE-OSK-SV40 e o vírus AAV que codifica tTA sob o promotor constitutivo de CAG foram injetados na re- tina de camundongos de 4 semanas (n = 6) como mostrado na linha do tempo experimental fornecida na FIG. 7C. Como um controle, uma co- orte separada de camundongos (n = 2) foi injetada apenas com o vírus OSK. O dano mecânico foi induzido por esmagamento do nervo ótico em ambas as coortes, duas semanas após a injeção do vírus. Para ras- trear a regeneração do axônio por microscopia fluorescente do nervo ótico, a subunidade β da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB) foi injetada intraocularmente em camundongos e a perfusão foi realizada dois dias após a injeção de CTB. A regeneração do axônio e a análise da sobrevivência do axônio foram subsequentemente condu- zidas.
[00378] A regeneração de axônios foi determinada estimando o nú- mero de axônios por nervo. Conforme mostrado na FIG. 7D, a coadmi- nistração do vírus OSK e tTA promoveu significativamente a regenera- ção do nervo ótico longe do sítio do esmagamento do nervo ótico em comparação com a administração de vírus OSK sozinho. Este efeito também foi visualmente aparente ao comparar a intensidade de fluores- cência dos nervos óticos de camundongos que receberam o vírus OSK e tTA em comparação com camundongos que receberam o vírus OSK sozinho. A intensidade de fluorescência dos nervos óticos de camun- dongos que receberam ambos os vírus foi maior do que a dos camun- dongos que receberam o vírus OSK sozinho, indicando que a regenera- ção do nervo foi maior com o tratamento de combinação (FIGS. 7E-7F).
[00379] Para mostrar que a regeneração do axônio observada após lesão por esmagamento foi especificamente mediada por OSK, um ex- perimento de regeneração de axônio foi usado para comparar os efeitos do vírus tTA em combinação com (1) vírus TRE-OSK sem tratamento com DOX, (2) vírus TRE-d2EGFP sem tratamento com DOX e (3) vírus TRE-OSK com tratamento com DOX. A linha do tempo experimental dos tratamentos (1) - (3) é indicada nas FIGS. 8B, 8D e 8F, respectivamente. CTB marcado com fluorescência foi usado para visualizar os axônios. Conforme mostrado na FIG. 8A e 8G, a extensão da regeneração do nervo ótico em camundongos nos quais a expressão de OSK foi indu- zida (camundongos que receberam vírus OSK e tTA na ausência de DOX) foi muito significativa em 200 µm e 500 µm do local de esmaga- mento. Em contraste, mesmo quando a expressão de d2EGFP foi indu- zida (camundongos recebendo os vírus d2EGFP e tTA na ausência de DOX), a regeneração mínima foi observada (FIG. 8A e FIG. 8C). Nota- velmente, a regeneração do axônio era dependente da indução da ex- pressão de OSK. Quando os camundongos foram tratados com DOX para inibir a expressão de OSK, conforme descrito na FIG. 8D, a admi- nistração de vírus tTA e OSK não induziu regeneração de axônio (FIG. 8A). A intensidade dos axônios marcados com CTB nestes camundon- gos tratados com DOX foram semelhantes aos camundongos que rece- beram o vírus d2EGFP de controle (comparar a FIG. 8E com a FIG. 8C). Portanto, a administração de um sistema de expressão de OSK induzí- vel baseado em AAV pode ser usada para promover a regeneração após lesão do nervo ótico.
[00380] O efeito do OSK na taxa de sobrevivência das células gan- glionares da retina (RGCs) também foi avaliado. Conforme mostrado nas FIGS. 9A-9D, OSK aumenta significativamente a taxa de sobrevi- vência de RGC. RGCs (células RBPMS positivas) que foram infectadas com vírus OSK e tTA (verde) ou não infectadas com ambos (vermelho) mostrado após esmagamento do nervo ótico, RGC infectado por OSK teve 3 vezes maior a taxa de sobrevivência (54 % vs 18 %) após esma- gamento em comparação às células sem infecção por OSK, quantifica- ção de uma série de imagens como mostrado (FIG. 9A). Portanto, a porcentagem de células RBPMS-positivas que expressam KLF4 (célu- las infectadas com OSK) foi inferior a 40 % antes do esmagamento, po- rém, aumentou significativamente para cerca de 70 % após o esmaga- mento do nervo ótico devido à sua maior taxa de sobrevivência. En- quanto a porcentagem de células infectadas com d2EGFP se manteve em 35-40 % após o esmagamento. Isso indica um forte efeito de prote- ção celular da expressão de OSK (FIG. 9B). Conforme mostrado na FIG. 9C, em d2EGFP ou OSK mais CAG-tTA (SEQ ID NO: 32) retina infec- tada por AAV, não há diferença significativa no número de RGC (RBPMs positivos) sem o não esmagado, porém após o esmagamento há clara- mente mais RGCs que sobreviveram quando infectados com OSK e CAG-tTA em comparação com aqueles infectados com d2EGFP e CAG-
tTA. FIG. 9D mostra a quantificação dos números de RGC sobreviven- tes de cada grupo. Embora inferior a 40 % das células infectadas com OSK e CAG-tTA AAV, aumenta o número de RGC de sobrevivência total em comparação com d2EGFP (542 em comparação com 323).
[00381] A ativação de mTOR foi relatada como uma via para a rege- neração do nervo ótico (Parker et al., Science, 322(5903), 963-966 Nov. 2008). Para determinar se a expressão de OSK ativou a via de mTOR, as células infectadas com vírus de controle e OSK foram imageadas usando anticorpos contra RBPMS e S6 fosforilado (pS6) na ausência de dano (não esmagado) e após o dano (esmagado). Imagens representa- tivas do manchamento são mostradas na FIG. 10A, e conforme quanti- ficado na FIG. 10B, a porcentagem de células pS6-positivas não foi sig- nificativamente diferente entre as células de controle e as células infec- tadas com OSK após esmagamento do nervo ótico. Exemplo 3. Um sistema Tet-On de AAV induz uma expressão gênica mais rápida em comparação com um sistema Tet-Off de AAV em células retinais após o esmagamento do nervo.
[00382] Para comparar a taxa de expressão gênica entre os sistemas Tet-On e Tet-Off baseados em AAV, o vírus TRE-d2EGFP e (1) o vírus que codifica tTA (Tet-Off) ou (2) o vírus que codifica rtTA (Tet-On) foram administrados na retina de camundongos de 4 semanas. No sistema Tet-Off, os camundongos receberam DOX a partir da injeção de vírus e DOX foi removida por 3 dias, 5 dias ou 8 dias (FIG. 11A). Como um controle, uma coorte de camundongos no sistema Tet-Off não recebeu DOX. Aproximadamente 8 dias de remoção de DOX foram necessários para induzir o mesmo nível de expressão de GFP como nenhum trata- mento de DOX no sistema Tet-Off (FIG. 11B). No sistema Tet-On, os camundongos foram tratados como indicado na FIG. 11C. A expressão de GFP foi observada após apenas 2 dias de tratamento com DOX no sistema Tet-On (FIG. 11D). Portanto, um período de tempo mais curto foi necessário para induzir a expressão do transgene na retina de ca- mundongos infectados com um sistema Tet-On baseado em AAV em comparação com a infecção com um sistema Tet-Off baseado em AAV. Exemplo 4: Um vetor de AAV que codifica o transativador de tetraciclina reversa mutante (rtTA) mostrou baixa fluidez no fígado de camundongos e baixa toxicidade.
[00383] Conforme mostrado nas FIGS. 13A-13C, OCT4, SOX2 e KLF4 através da liberação de AAV9 (TRE-OSK com UBC-rtTA4) podem ser induzidos com sucesso no fígado dos camundongos com tratamento com DOX, mostrado com western blot e manchamento imune. Enquanto os camundongos com transgene de OCT4, SOX2, KLF4 morreram após 2 dias de indução de água de doxiciclina (FIG. 14) devido à displasia citológica e arquitetural generalizada no epitélio intestinal, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 AAV aqui descrito não causa toxicidade ou te- ratoma in vivo, mesmo com expressão contínua por meio da adminis- tração de doxiciclina na água de beber. Nenhum teratoma ou perda de peso corporal foi detectado por três meses quando AAV9 que codifica esses três fatores de transcrição foi liberado a todo o corpo dos camun- dongos (FIG. 14). Exemplo 5: Expressão da reprogramação parcial induzida por OCT4, SOX2 e KLF4 em camundongos.
[00384] FIGS. 15A-15B mostram que a expressão dos genes de his- tona e Chaf (fator de montagem da Cromatina) declinou durante o en- velhecimento em fibroblastos da orelha de camundongos idosos (12 me- ses ou 15 meses) em comparação com aqueles de camundongos jo- vens, curto prazo da indução da Expressão de OSKM (3 dias) ou OSK (5 dias) redefiniu seu nível de expressão gênica para o estado jovem, sem transformá-los em células-tronco (por exemplo, Nanog não foi ati- vado).
[00385] Os vetores convencionais de AAV que codificam OSK estão acima do limite de empacotamento de AAV (por exemplo, 4,7 Kb), só podem ser empacotados no capsídeo AAV9 com baixo título (menos de 2 x 10^12 partículas por preparação viral), e o vírus de baixo título não é funcional (por exemplo, nenhuma superexpressão de OCT4 ou KLF4 foi detectada) devido ao possível truncamento, como mostrado na FIG. 16 Exemplo 6: Um vetor de AAV que codifica o transativador de tetraciclina reversa mutante (rtTA) mostrou baixa fluidez no fígado de camundon- gos.
[00386] Um sistema Tet-On compreendendo rtTA4 (SEQ ID NO: 13) também foi testado in vivo usando vírus AAV9 recombinante. Dois veto- res do AAV compreendendo os componentes mostrados na FIG. 13B foram usados. Vírus AAV que codifica rtTA4 operacionalmente ligado a um promotor UBC (vetor pAAV-UBC-rtTA4-WPRE3-SV40pA é forne- cido como SEQ ID NO: 17 e um mapa de vetor exemplar de SEQ ID NO: 17 é fornecido na FIG. 12) e vírus AAV que codifica um vetor de AAV TRE3G-OSK-SV40pA (SEQ ID NO: 16) com um mapa de vetor representado na FIG. 3 foram administrados a camundongos. Os ca- mundongos foram tratados sem doxiciclina ou com doxiciclina e amos- tras de fígado foram coletadas. Conforme mostrado nas imagens de imunofluorescência da FIG. 13A, na ausência de doxiciclina, a expres- são de KLF4 não foi detectável no fígado. Quando os camundongos fo- ram tratados com doxiciclina através da água de beber, a expressão de KLF4 foi detectada no fígado (FIG. 13A). Estes resultados também fo- ram evidentes por western blot usando anticorpos contra OCT4, KLF4 e SOX2 para determinar a expressão dessas proteínas (FIG. 13C). A ac- tina foi usada como um controle de carregamento (FIG. 13C). OCT4, KLF4 e SOX2 só foram detectados no fígado quando os camundongos foram tratados com doxiciclina (FIG. 13C). Exemplo 7. mRNAs modificados que codificam a expressão induzida por
OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) de OSK em fibroblastos de camundongo.
[00387] Fibroblastos de camundongo foram transfectados com su- cesso com o mRNA modificado que codifica OCT4, SOX2, KLF4 e c- MYC (OSKM). O Reagente de Transfecção Lipofectamine™ Messen- gerMAX™ de Invitrogen foi usado para transfectar os mRNAs modifica- dos. As modificações foram a substituição completa de 5-metilcitidina (5mC) por citidina ou pseudouridina (psi) por uridina. Veja, por exemplo, Warren et al., Cell Stem Cell. 2010 Nov 5; 7(5):618-30; Mandal et al., Nat Protoc. 2013 Mar; 8(3):568-82. A dose de cada RNA que foi usada é fornecida na Tabela 4 abaixo. Os números 1-5 na primeira coluna da Tabela 4 correspondem aos números 1-5 na FIG. 17. Tabela 4. Doses de mRNA administradas. mRNA (µg) NDG O S K M Total 1 0 0 0 0 0 0 0 2 1X 0,2 0,6 0,2 0,2 0,2 1,4 3 2X 0,4 1,2 0,4 0,4 0,4 2,8 4 4X 0,8 2,4 0,8 0,8 0,8 5,6 5 6X 1,2 3,6 1,2 1,2 1,2 8,4
[00388] Um western blot foi usado para confirmar que a administra- ção do mRNA modificado induziu a expressão da proteína nos fibroblas- tos de camundongo. Conforme mostrado na FIG. 17, a transfecção de mRNA modificado por OSK em células de fibroblastos de camundongo para induzir a expressão da proteína OCT4, KLF4 e SOX2 (NDG e zsGreen são mRNA modificado que expressam proteína fluorescente verde para indicar a eficiência da transfecção).
[00389] Este exemplo mostra que a liberação de RNA (por exemplo, mRNA, RNA modificado, mRNA modificado, etc.) que codifica OCT4, KLF4 e SOX2 para células de camundongo é viável. Essas descobertas podem ser estendidas à liberação in vivo de mRNA que codifica OCT4,
KLF4 e SOX2. Como um exemplo, para liberação muscular in vivo, ele- troporação, é usada. Como um exemplo, para a distribuição de fígado e outros órgãos internos, nanopartículas compreendendo RNA que codi- ficam OCT4, KLF4 e SOX2, nanopartículas são usadas. Veja, por exem- plo, Dong et al., Nano Lett. 2016 Feb 10; 16(2):842-8. Exemplo 8. Reprogramação química de células.
[00390] Um protocolo não limitante para reprogramar quimicamente um fibroblasto embrionário de camundongo para uma célula-tronco plu- ripotente induzida é fornecido abaixo. Um protocolo semelhante pode ser encontrado em Zhao et al., Cell. 2015 Dec 17; 163(7):1678-91. FIG. 21 mostra os resultados após usar o protocolo fornecido abaixo. Estágio 1 100 ng/ml de bFGF 0,5 mM de VPA, 20 µM de CHIR99021, 10 µM de 616452, 5 µM de tranilcipromina, 50 µM de forscolina, 0,05 µM de AM580 5 µM de EPZ004777
[00391] No dia 12, as células foram tripsinizadas, colhidas e, em se- guida, re-semeadas em 50.000-200.000 células por cavidade de uma placa de 6 cavidades (1:10-15)
[00392] Durante os dias 12-16, as concentrações de bFGF, CHIR e forscolina foram reduzidas para 25 ng/ml, 10 µM e 10 µM, respectiva- mente.
[00393] No dia 16, colônias epiteliais semelhantes a XEN foram for- madas e a cultura foi alterada para o meio do estágio 2. Estágio 2 25 ng/ml de bFGF,
0,5 mM de VPA, 10 µM de CHIR99021, 10 µM de 616452, 5 µM de tranilcipromina, 10 µM de forscolina, 0,05 µM de AM580, 0,05 µM de DZNep, 0,5 µM de 5-aza-dC, 5 µM de SGC0946
[00394] No dia 28, a cultura foi transferida para o meio do estágio 3. Estágio 3 Meio N2B27-2iL 3 µM de CHIR99021, 1 µM de PD0325901,
1.000 U/ml de LIF
[00395] Após mais 8-12 dias, as colônias de CiPSC 2i-competentes, semelhantes a ESC e GFP-positivas (se estiver usando o repórter pOct4-GFP) surgiram e foram, então, selecionadas para expansão e ca- racterização. Exemplo 9. Expressão da regeneração de axônios melhorada por OCT4, SOX2 e KLF4 em camundongos adultos e idosos após lesão por esmagamento do nervo ótico.
[00396] No sistema Tet-Off representado na FIG. 22, o painel supe- rior foi usado para determinar se um vetor que codifica TRE-OSK-SV40 (SEQ ID NO: 16) poderia ser usado para promover a regeneração do axônio do nervo ótico em camundongos adultos (3 meses de idade) e idosos (12 meses de idade).
[00397] O vírus AAV2 com o vetor TRE-OSK-SV40 e o vírus AAV2 que codifica tTA sob o promotor constitutivo de CAG foram injetados na retina de camundongos de 1 mês, 3 meses ou 12 meses de idade (n =
5-9), semelhante à linha do tempo experimental fornecida na FIG. 7C. Como controle, uma coorte separada de camundongos com 1 mês de idade (n = 5-6) foi injetada com o vírus AAV2 com um vetor de AAV2 TRE-d2EGFP-SV40 e o vírus AAV2 que codifica tTA. O dano mecânico foi induzido por esmagamento do nervo ótico em ambas as coortes, duas semanas após a injeção do vírus. Para rastrear a regeneração do axônio por microscopia fluorescente do nervo ótico, a subunidade β da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB) foi injetada intraocu- larmente em camundongos duas semanas após a lesão por esmaga- mento do nervo ótico e a perfusão foi realizada dois dias após a injeção de CTB. A análise de regeneração de axônio foi subsequentemente con- duzida.
[00398] Conforme mostrado nas FIGS. 23A-23B, a administração do vírus AAV2 que codifica OSK aumentou o número de axônios estimados por nervo em camundongos de 1 mês (jovens), 3 meses de idade (adul- tos) e 12 meses de idade (idosos) em relação à administração do vírus de controle que codifica d2EGFP. Além disso, o vírus TRE-OSK também aumentou a sobrevivência de RGCs após lesão do nervo ótico em ca- mundongos adultos (3 meses de idade) e idosos (12 meses de idade) em comparação com GFP de controle (FIG. 23C). Portanto, a expressão de OSK surpreendentemente promoveu a regeneração de axônios e a sobrevivência de RGC após lesão por esmagamento do nervo em ca- mundongos jovens, adultos e idosos.
[00399] Em seguida, foi determinado o impacto da duração da ex- pressão de OSK na regeneração de axônios em camundongos idosos. Os camundongos foram administrados com vírus tTA e vírus TRE-OSK ou vírus TRE-GFP 2 semanas antes do esmagamento do nervo ótico. Em seguida, a subunidade β da toxina da cólera marcada com fluores- cência (CTB) foi injetada intraocularmente em camundongos que esta-
vam cinco semanas em vez de duas semanas após a lesão por esma- gamento do nervo ótico. Como mostrado nas FIGS. 24A-24B, o au- mento do período de tempo de expressão de OSK pós-lesão para cinco semanas aumentou o número de axônios estimados por nervo nos ca- mundongos de 12 meses de idade em comparação com duas semanas pós-lesão de expressão de OSK na FIG. 23B. Em contraste, o aumento do período de tempo da expressão de GFP pós-lesão não teve efeito sobre a regeneração do axônio (compare os resultados com GFP nas FIGS. 24A-24B com aqueles mostrados nas FIGS. 23A-23B). Portanto, os dados sugerem que um tempo mais longo de expressão de OSK pode ser benéfico na promoção da regeneração de axônios e sobrevi- vência de RGC após lesão por esmagamento do nervo em camundon- gos idosos. Exemplo 10. Indução da expressão de OSK após lesão por esmaga- mento do nervo ótico aumentou a regeneração de axônios e a sobrevi- vência de RGC em camundongos.
[00400] Também foi determinado se a indução da expressão de OSK após lesão por esmagamento do nervo ótico promoveria a regeneração do axônio e a sobrevivência de RGC. Ambos os sistemas Tet-On e Tet- Off representados no painel da FIG. 22 foram usados. No sistema Tet- On, o vírus AAV com o vetor TRE-OSK-SV40 e o vírus AAV que codifica rtTA sob o promotor constitutivo de CMV foram produzidos através de métodos de rotina e injetados na retina de camundongos. Conforme re- presentado na FIG. 25A, no sistema Tet-On (painel superior), a expres- são de OSK foi induzida administrando doxiciclina a camundongos an- tes da lesão por esmagamento do nervo ótico ou após a lesão por es- magamento do nervo ótico. Uma coorte de camundongos não foi tratada com doxiciclina como controle (sem indução). No sistema Tet-Off, o ví- rus AAV com o vetor TRE-OSK-SV40 e o vírus AAV que codifica tTA sob o promotor constitutivo de CAG foram produzidos através de méto- dos de rotina e injetados na retina dos camundongos. Conforme repre- sentado na FIG. 25A, no sistema Tet-Off (painel inferior), a expressão de OSK foi suprimida após lesão por esmagamento do nervo ótico. A injeção da subunidade β da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB) foi usada para visualizar os axônios.
[00401] Conforme mostrado na FIG. 25B, a indução da expressão de OSK após a lesão através do sistema Tet-On aumentou significativa- mente o número de axônios estimados por nervo em comparação com nenhuma indução de OSK ou indução de OSK antes da lesão (pré-le- são) apenas por meio do sistema Tet-On ou Tet-Off. Além disso, a in- dução da expressão de OSK após lesão aumentou significativamente a sobrevivência de células RBPMS+ em comparação com a ausência de indução de expressão de OSK ou em comparação com a indução de OSK pré-lesão apenas através do sistema Tet-On ou Tet-Off (FIG. 25C). Portanto, o sistema Tet-On representado na FIG. 25A, painel superior, permitiu o controle temporal da expressão de OSK e indução de OSK após a lesão por esmagamento do nervo ótico promoveu a regeneração do axônio e a sobrevivência do RGC. Sem estar limitado por uma teoria particular, a indução da expressão de OCT4, KLF4 e SOX2 usando um sistema Tet-Off após uma lesão pode promover a regeneração quando a recuperação de uma lesão não requer a expressão imediata de OCT4, KLF4 e/ou SOX2. Exemplo 11. Efeito superior da expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 (OSK) a partir de uma única transcrição em comparação com as trans- crições individuais na promoção da regeneração de axônios.
[00402] Este exemplo explorou o efeito da expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 sob um promotor em comparação com a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 sozinho ou em combinação sob promotores sepa- rados. Vírus AAV que codifica tTA sob o promotor constitutivo de CAG e vírus AAV ou codificação de vírus (1) OCT4 sob o promotor TRE, (2) SOX2 sob um promotor TRE, (3) KLF4 sob um promotor TRE, (4) OCT4 e SOX2 sob um promotor TRE, (5) OCT4, SOX2 e KLF4 cada qual sob promotores separados, ou (6) OCT4, SOX2 e KLF4 sob o mesmo pro- motor foram injetados na retina de camundongos. Um esquema que mostra os vários vetores usados neste estudo é mostrado na FIG. 26A. A lesão por esmagamento do nervo ótico foi induzida 2 semanas após a administração do vírus. A injeção da subunidade β da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB) 2 semanas após o esmagamento do nervo ótico foi usada para a imagem dos axônios.
[00403] Conforme mostrado na FIG. 26B, quando todos os três fato- res de transcrição (OSK) foram expressos sob um promotor, o número de axônios estimados por nervo foi pelo menos quatro vezes maior do que quando OCT4, SOX2 e KLF4 foram cada qual expresso sob um promotor separado (por exemplo, compare os resultados de OCT4, SOX2, KLF4 (5) e OCT4-SOX2-KLF4 (6)). Da mesma forma, o número de axônios estimados por nervo também foi pelo menos quatro vezes maior quando OSK foi expresso em uma única transcrição do que quando OCT4, SOX2 e KLF4 expressos isoladamente (FIG. 26B) (por exemplo, compare OCT4 (1), SOX2 (2), e KLF4 (3) com resultados de OCT4-SOX2-KLF4 (6)). O aumento na regeneração de axônios foi pro- vavelmente atribuído à expressão de todos os três fatores de transcrição (OSK) sob um promotor, uma vez que a expressão de OCT4 e SOX2 sob um promotor não aumentou significativamente o número de axônios estimados por nervo em relação à expressão de cada fator de transcri- ção sozinho (FIG. 26B) (por exemplo, compare os resultados de OCT4- SOX2 (4) com os resultados de OCT4-SOX2-KLF4 (6)).
[00404] A análise da sobrevivência das células ganglionares da re- tina (RGC) também foi conduzida pela quantificação das células RBPMS+. Conforme mostrado na FIG. 26C, a expressão de OSK de um promotor aumentou a sobrevivência de células RBPMS+ em relação à expressão de OCT4, SOX2 ou KLF4 sozinho e em relação à expressão de OCT4 e SOX2 sob um promotor. A expressão de OSK de um promo- tor também aumentou a sobrevivência de células RBPMS+ em relação à expressão de OCT4, SOX2 ou KLF4 de vetores separados em vírus separados.
[00405] Como mostrado pela manchamento de fluorescência repre- sentado na FIG. 26D, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 em vetores separados em vírus separados resultou em uma população heterogê- nea de RGCs. Algumas células expressaram apenas OCT4, SOX2 ou KLF4. Algumas células expressaram uma combinação de apenas dois dos três fatores de transcrição e apenas alguns RGCs positivos de três fatores foram detectados (célula de cor branca no canto inferior direito do painel superior esquerdo na FIG. 26D). Em contraste, como mos- trado na FIG. 26E, a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 a partir de um único vetor resultou em uma população mais homogênea. Todas as cé- lulas expressaram todos os três fatores de transcrição de OSK (células de cor branca no painel superior esquerdo). Mesmo em células que não eram brancas puras, a expressão de todos os três fatores de transcrição foi detectada como mostrado na FIG. 26E, sugerindo que os resultados foram devido a diferenças na intensidade do manchamento para os três fatores de transcrição.
[00406] Portanto, este exemplo mostra que a expressão de OCT4, SOX2 e KLF4 usando um promotor teve maior efeito terapêutico (por exemplo, aumento da regeneração de axônios e uma maior sobrevivên- cia de células ganglionares da retina) em comparação com a expressão de cada fator de transcrição sozinho, expressão de todos os três fatores de transcrição sob promotores separados, ou expressão de apenas dois dos fatores de transcrição (por exemplo, OCT4 e SOX2) sob um promo- tor.
Exemplo 12. Nocaute de Tet1 ou Tet2 anulou a regeneração de axônio induzida por OSK após lesão por esmagamento do nervo ótico.
[00407] Este exemplo determinou o efeito de nocautear DNA desme- tilases Tet1 e Tet2 na regeneração de axônio induzida por OSK. Um sistema Tet-Off foi usado. AAV2 de CAG-tTA + TRE-OSK-SV40 foi inje- tado em camundongos por meio de injeção intravítrea duas semanas antes do esmagamento junto com AAV2 de U6-shRNA. Os camundon- gos tinham um mês de idade com quatro camundongos em cada grupo.
[00408] Plasmídeos de AAV Addgene que codificam sequências de shRNA foram usados. O shRNA de controle compreendia a sequência 5'-GTTCAGATGTGCGGCGAGT-3' (plasmídeo # 85741 de Addgene). mTET1 (Tet1 shRNA) compreendia a sequência 5'-GCTCATGGAGAC- TAGGTTTGG-3' (plasmídeo #85742 de Addgene). mTet2 (Tet2 shRNA) compreendia a sequência 5'-GGATGTAAGTTTGCCAGAAGC-3' (Plas- mídeo #85743 de Addgene).
[00409] Conforme mostrado na FIG. 27, o nocaute de Tet1 ou Tet2 reduziu significativamente o número de axônios estimados por nervo em animais também tratados com vírus OSK e submetidos a lesão por es- magamento do nervo ótico em comparação com o grampo de cabelo de controle (sh-cntl).
[00410] Estes resultados sugerem que as Tet DNA metilases podem estar envolvidas na regeneração de axônios induzida por OSK e a su- perexpressão de Tet (por exemplo, Tet1 ou Tet2) sozinha ou em com- binação com a expressão de OSK pode promover a regeneração.
[00411] Como um exemplo não limitante, mTet3 compreendendo a sequência 5′-GCTCCAACGAGAAGCTATTTG-3′ (Plasmídeo #85740 de Addgene) pode ser usado para nocautear Tet3. Exemplo 13. Expressão de OSK reverteu o declínio relacionado à idade na acuidade visual e reverteu o declínio relacionado à idade na função das células ganglionares da retina (RGC).
[00412] Para determinar se a perda de acuidade visual relacionada à idade pode ser revertida com a expressão de OSK, um ensaio de res- posta optomotora (OMR) foi conduzido em camundongos adultos (ca- mundongos de 3 meses) e camundongos idosos (camundongos de 12 meses de idade e 18 meses de idade). OMR é um movimento reflexivo da cabeça usado para avaliar a acuidade visual. Para induzir OMR, os camundongos individuais são colocados em uma plataforma no meio de uma arena cercada por monitores de computador exibindo listras. A ro- tação do padrão listrado induz o rastreamento da cabeça do camun- dongo na mesma direção por movimentos reflexivos do pescoço. O ras- treamento é monitorado por dois observadores mascarados indepen- dentes. A acuidade visual é quantificada aumentando a frequência es- pacial das listras até que uma OMR não possa ser obtida.
[00413] Os camundongos foram injetados retinalmente com vírus AAV que codifica tTA e vírus AAV que codifica TRE-OSK na ausência de doxiciclina (condição de indução de OSK). Neste sistema Tet-Off, OSK é expresso a partir de um único promotor na ausência de doxici- clina. Como controles, camundongos da mesma idade foram adminis- trados com o vírus que codifica o vírus que codifica rtTA e o vírus TRE- OSK na ausência de doxiciclina (controle não induzido, ctl). No sistema Tet-On de controle, a expressão de OSK requer tratamento com doxici- clina. Camundongos adultos (3 meses de idade (3m)) também foram usados como controle. Um estudo de OMR foi conduzido para medir o limite de frequência espacial um mês após a injeção do vírus.
[00414] Conforme mostrado na FIG. 28, na ausência da expressão de OSK (condição de controle (ctl)) os camundongos idosos (camun- dongos de 12 meses e 18 meses) tiveram perda de visão em compara- ção com os camundongos adultos (camundongos de 3 meses). A dimi- nuição no limiar de frequência espacial para os camundongos idosos em relação aos camundongos de 3 meses indicou perda de visão na ausência de expressão de OSK. Quando OSK foi expresso, no entanto, o limiar de frequência espacial em média aumentou para os camundon- gos de 12 meses de idade e 18 meses de idade em relação a nenhuma expressão de OSK. Além disso, os limites de frequência espacial para os camundongos de 12 meses de idade e 18 meses de idade com ex- pressão de OSK foram semelhantes aos dos camundongos de controle de 3 meses de idade na presença e ausência de expressão de OSK. Estes resultados demonstram que a indução da expressão de OSK re- verteu a perda de visão relacionada à idade em camundongos.
[00415] Para determinar se o declínio relacionado à idade na função das células ganglionares da retina (RGC) também pode ser revertido pelo tratamento com OSK, as ondas elétricas de RGCs foram medidas usando eletrorretinogramas padrão (ERGs ou pERGs padrão). Em en- saios de pERG, um estímulo de padrão de luz e escuro de um quadro de verificação é modificado através de eletrodos colocados na córnea de camundongos de várias idades (camundongos de 3 meses de idade, 12 meses de idade ou 18 meses de idade). Um padrão de reversão de contraste é exibido sem alteração geral na luminância. As ondas elétri- cas geradas a partir das RGCs são, então, medidas.
[00416] Os camundongos foram injetados retinalmente com vírus AAV que codifica tTA e vírus AAV que codifica TRE-OSK na ausência de doxiciclina (condição de indução de OSK). Neste sistema Tet-Off, OSK é expresso a partir de um único promotor na ausência de doxici- clina. Como controles, camundongos da mesma idade foram adminis- trados com o vírus que codifica o vírus que codifica rtTA e o vírus TRE- OSK na ausência de doxiciclina (controle não induzido, ctl). No sistema Tet-On de controle, a expressão de OSK requer tratamento com doxici- clina. Camundongos adultos (3 meses de idade (3m)) também foram usados como controle. Um estudo de pERG foi conduzido para medir a amplitude das ondas elétricas nos RGCs seguindo o estímulo padrão um mês após a injeção do vírus.
[00417] Conforme mostrado na FIG. 29, as ondas elétricas geradas a partir de RGCs diminuíram em camundongos idosos (camundongos de 3 meses de idade em comparação com camundongos de 12 meses de idade e 18 meses de idade) na ausência de expressão de OSK (con- dição ctl). Em contraste, a administração de vírus AAV que codifica tTA e vírus AAV que codifica TRE-OSK na ausência de doxiciclina (condição de indução de OSK) restaurou as ondas elétricas de RGC em camun- dongos de 12 meses de idade. Para camundongos de 18 meses de idade, no entanto, a função de RGC provavelmente não foi restaurada porque a opacidade da córnea bloqueou o estímulo padrão. Estes re- sultados sugerem que a expressão de OSK melhorou a função de RGC em camundongos idosos (12 meses de idade).
[00418] Portanto, este exemplo demonstra que a indução da expres- são de OSK pode melhorar a acuidade visual e a função de RGC que é causada pelo envelhecimento. Exemplo 14. Expressão de OSK reverteu o declínio induzido pelo glau- coma na acuidade visual e reverteu o declínio induzido pelo glaucoma na função das células ganglionares da retina (RGC).
[00419] Para determinar se a expressão de OSK pode ser usada para reverter os declínios induzidos pelo glaucoma na acuidade visual e função de RGC, um modelo de camundongo de glaucoma foi usado. A elevação crônica da pressão intraocular (PIO) foi induzida unilateral- mente em camundongos adultos C57BL/6J pela injeção de microesfe- ras de poliestireno na câmara anterior. A PIO foi medida nas primeiras quatro semanas. Conforme mostrado na FIG. 30A, a injeção de micro- contas aumentou a PIO 4-21 dias após a injeção de microcontas. A den- sidade de axônio foi quantificada usando o manchamento de p-fenileno- diamina (PPD) (FIG. 30B). FIG. 30C inclui um gráfico que quantifica a densidade celular de RGC (painel esquerdo) usando manchamento de
Brn3a (mostrado, por exemplo, à direita). FIGS. 30B-30C mostram que 4 semanas após a injeção de microcontas na câmara anterior do olho, houve perda significativa de densidade de axônio e densidade de RGC em camundongos do tipo selvagem (WT) que não foram tratados com o vírus AAV que codifica TRE-OSK.
[00420] Nessas experiências, o glaucoma foi induzido com injeção de microconta, e em seguida, três semanas depois, os ensaios de OMR e pERG foram conduzidos (medições de injeção pré AAV nas FIGS. 30D-30E). Em seguida, os camundongos foram divididos em dois gru- pos de tratamento. Um grupo de camundongos foi injetado retinalmente com o vírus AAV que codifica rtTA e vírus AAV que codifica TRE-OSK na ausência de tetraciclina (OSK AAV OFF) ou com vírus AAV que co- difica tTA e vírus AAV que codifica TRE-OSK (OSK AAV ON). Quatro semanas após a injeção do vírus AAV, os ensaios de OMR e pERG foram conduzidos novamente (4 semanas após medições de AAV nas FIGS. 30D-30E). Como controle, os experimentos também foram con- duzidos com injeção de solução salina em vez de microcontas (sem controle de glaucoma).
[00421] Conforme mostrado na FIG. 30D, a indução da expressão de OSK (OSK AAV ON) aumentou o limiar de frequência espacial em com- paração com a não indução da expressão de OSK (OSK AAV OFF) para camundongos com glaucoma (camundongos injetados com microcon- tas). Esses resultados sugerem que a indução da expressão de OSK pode melhorar a perda de visão relacionada ao glaucoma.
[00422] Conforme mostrado na FIG. 30E, a indução da expressão de OSK restaurou a amplitude da onda elétrica em camundongos com glaucoma induzido por microcontas. Esses resultados sugerem que a indução da expressão de OSK também pode reverter o declínio relacio- nado ao glaucoma na função de RGC.
[00423] Portanto, a indução da expressão de OSK pode melhorar os sintomas induzidos pelo glaucoma. Exemplo 15. A expressão de OSK humano promoveu a sobrevivência de neurônios humanos e o reexcrescência de axônios após dano neu- ronal induzido por vincristina.
[00424] Para determinar se a expressão de OCT4 humano, KLF4 hu- mano e SOX2 humano (OSK humano) poderia proteger células neuro- nais humanas e regenerar axônios in vitro, um ensaio de regeneração de neurito foi usado como descrito abaixo. As células SH-SY5Y, que são células de neuroblastoma humano, foram diferenciadas em neurô- nios e foram transduzidas com um vetor de AAV.DJ que codifica OCT4 humano, KLF4 humano e SOX2 humano sob um promotor induzível por Tet (usando um sistema Tet-Off). Na condição OSK Off, a expressão de OSK não foi induzida nas células. Na condição OSK On, a expressão de OSK foi induzida nas células. Cinco dias após a transdução, vincris- tina (VCS) foi usada para induzir a degeneração da neurito. As células foram tratadas com VCS por 24 horas ou 48 horas. Um esquema de uma linha do tempo de tratamento (com tratamento com VCS de 24 ho- ras) é fornecido na porção esquerda da FIG. 31A. VCS é um medica- mento quimioterápico que desregula os microtúbulos. É frequentemente usada in vitro para determinar se os tratamentos mantêm e/ou promo- vem a função celular (por exemplo, função neuronal) após o dano. Con- forme descrito neste documento, a VCS foi usada para determinar o efeito do tratamento com OSK na sobrevivência neuronal e no recresci- mento do axônio. Após o tratamento com VCS, as células foram cultiva- das em meio de diferenciação e a excrescência de neuritos foi testada.
[00425] Na FIG. 31A, as células foram testadas quanto à excrescên- cia neuronal nove dias após as células serem tratadas com VCS por 24 horas. As células nas quais a expressão de OSK foi induzida (condição OSK On) mostraram aumento da sobrevivência neuronal e excrescên- cia de axônio em relação às células nas quais a expressão de OSK não foi induzida (condição OSK Off) (FIG. 31A). A quantificação da área de célula neuronal mostrou de forma semelhante que a expressão de OSK aumentou a área de célula de neurônios por pelo menos 8 vezes em comparação a nenhuma expressão de OSK (FIG. 31B). Resultados se- melhantes também foram observados com 48 horas de tratamento com VCS (FIG. 31C).
[00426] Estes resultados mostram que a expressão de OSK humana protegeu células de neurônios humanos contra a degeneração de neu- rônios induzida por VCS. Métodos Cultura de Células e Protocolo de Diferenciação
[00427] As células de neuroblastoma SH-SY5Y foram obtidas de American Tissue Culture Collection (ATCC, CRL-2266) e mantidas de acordo com as recomendações da ATCC. As células foram cultivadas em uma mistura de 1:1 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM, ATCC, 30-2003) e meio F12 (ThermoFisher Scientific, 11765054), su- plementado com 10 % de soro bovino fetal (FBS, Sigma, F0926) e 1 × penicilina/estreptomicina (ThermoFisher Scientific, 15140122). As célu- las foram cultivadas a 37 °C com 5 % de CO2 e 3 % de O2. As células foram passadas em ~80 % de confluência.
[00428] As células SH-SY5Y foram diferenciadas em neurônios con- forme descrito anteriormente (Encinas et al., J Neurochem. 2000 Sep; 75(3):991-1003; Shipley et al., J Vis Exp. 2016 Feb 17;(108):53193 ), com algumas modificações. Resumidamente, 1 dia após a semeadura, as células começaram a ser diferenciadas em meio EMEM/F12 (1:1) contendo 2,5 % de FBS, 1 × penicilina/estreptomicina e 10 µM de ácido totalmente trans retinoico (ATRA, Stemcell Technologies, 72264) (Meio de Diferenciação 1) por 3 dias, seguido de tratamento das células em EMEM/F12 (1:1) contendo 1 % de FBS, 1 × penicilina/estreptomicina e 10 µM de ATRA (Meio de Diferenciação 2) por 3 dias. As células foram,
então, divididas em placas de cultura de células de 35 mm revestidas com poli-D-lisina (ThermoFisher Scientific, A3890401). Um dia após a divisão, os neurônios foram amadurecidos em neurobasal/B27 sem soro mais meio de cultura (ThermoFisher Scientific, A3653401) contendo 1 × Glutamax (ThermoFisher Scientific, 35050061), 1 × penicilina/estrepto- micina e 50 ng/ml de BDNF (Alomone labs ) (Meio de Diferenciação 3) por pelo menos 5 dias. Ensaio de regeneração de neurito
[00429] Os neurônios diferenciados das células SH-SY5Y foram transduzidos com vetores de AAV.DJ em 106 cópias do genoma por cé- lula. Cinco dias após a transdução, 100 nM de vincristina (Sigma, V8879) foi adicionado às células por 24 horas ou 48 horas para induzir a degeneração de neuritos. Após o tratamento com vincristina, os neu- rônios foram lavados em PBS duas vezes e meio de diferenciação fresco foi adicionado de volta às placas. Os neurônios foram acompa- nhados para excrescência de neuritos por até 2 semanas. Exemplo 16. Recuperação de lesão e restauração da visão por redefini- ção dependente de Tet do relógio epigenético.
[00430] Para determinar se as células de mamíferos podem reter uma cópia fiel da informação epigenética do início da vida, foi testado se a combinação de três genes de OSK era suficiente para redefinir a idade. A combinação de OSK de três genes em fibroblastos de camun- dongos idosos e mediu seu efeito nos níveis de RNA de genes conhe- cidos por serem alterados com a idade, como H2A, H2B, LaminB1 e Chaf1b. O tratamento com OSK de fibroblastos de camundongos idosos restaurou os padrões de expressão gênica juvenil, semelhante ao que OSKM faz, sem perda aparente de identidade celular ou a indução de Nanog, um fator de transcrição embrionário precoce que pode induzir teratomas (FIG.36A-36C).
[00431] Para liberar e controlar a expressão de OSK in vivo, um sis- tema de vetor viral adenoassociado (AAV) Tet-ON e Tet-OFF rigida- mente regulado foi desenvolvido para acomodar todos os três genes de reprogramação em uma partícula viral (Smalley et al., First AAV gene therapy poised for landmark approval. Nat Biotechnol, 2017. 35(11): p. 998-999; Senis et al., AAV vector-mediated in vivo reprogramming into pluripotency. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 2651) (FIG. 32A). Em primeiro lugar, para testar se a indução de OSK AAVs causou toxicidade in vivo, camundongos C57BL/6J de 5 meses de idade foram infectados com rtTA e TRE-OSK AAV9s e induziu a expressão a níveis comparáveis aos de camundongos transgênicos (FIG. 36D). Surpreendentemente, a indução contínua de OSK por mais de um ano não teve nenhum efeito negativo discernível nos camundongos por mais de um ano (FIG. 32B e FIG. 36E). Sem estar limitado por uma teoria particular, não houve apa- rentemente nenhum efeito negativo discernível nos camundongos por- que a expressão de alto nível no intestino foi evitada (FIGs. 36F-36H), evitando assim a displasia e a perda de peso vista em outros estudos, incluindo Abad et al., Nature 502, 340-345, doi:10.1038/nature12586 (2013).
[00432] Quase todas as espécies experimentam um declínio no po- tencial regenerativo durante o envelhecimento. Em mamíferos, um dos primeiros sistemas a perder esse potencial é o sistema nervoso central (CNS). Um tipo de célula canônica do CNS, a célula ganglionar da re- tina, projeta um axônio da retina em direção ao cérebro, formando o nervo ótico. Durante a embriogênese e em neonatos, as RGCs podem se regenerar se danificadas, porém, essa capacidade é rapidamente perdida (Goldberg et al., Science, 2002. 296 (5574): p.1860-4). Com o tempo, conforme os organismos envelhecem, a função geral e a resili- ência do CNS continuam a declinar (Geoffroy et al., Cell Rep, 2016.
15(2): p. 238-46). Para explorar se é possível restaurar um perfil epige- nético precoce em RGCs adultas, a expressão de OSK foi induzida em um modelo de lesão por esmagamento do nervo em camundongos adul- tos de várias idades. O sistema Tet-Off (Tet-Off tTA-AAV2) carregando OSK, seja em AAVs separados ou no mesmo AAV, foi injetado no corpo vítreo, resultando em expressão gênica eficiente, seletiva e responsiva à doxiciclina em RGCs. Como controle negativo, um grupo de camun- dongos também foi tratado com doxiciclina para reprimir os AAVs (FIG. 32C e FIG. 37C). Duas semanas após a injeção, o esmagamento do nervo ótico foi realizado e, duas semanas depois disso, o comprimento do axônio e a densidade do nervo ótico foram calculados (FIG. 32D).
[00433] A indução do OSK-AAV2 policistrônico causou um aumento significativo na sobrevivência de RGC e regeneração axonal de longa distância (FIG. 32E e FIG. 37D) sem qualquer sinal de proliferação de RGC (FIG. 38A). Em contraste, quando introduzido em AAVs separa- dos, OCT4, SOX2, KLF4 não teve efeito sobre a capacidade regenera- tiva (FIG. 32E), ostensivamente devido à menor frequência de coinfec- ção (FIG. 37A e FIG. 37B). Porque Klf4 pode reprimir o crescimento axonal (Moore et al., Science, 2009. 326(5950): p. 298-301; Qin et al., Nat Commun, 2013. 4: p. 2633), OCT4, SOX2 e KLF4 também foram individualmente e um cistron dual de Oct4 e Sox2 foi testado. Nenhum efeito regenerativo, entretanto, foi observado na ausência de Klf4. No- tavelmente, se o OSK policistrônico foi induzido por 3 meses, as fibras do axônio de RGC se estenderam até o quiasma, uma distância de mais de 3 mm (FIG. 38B). De fato, quando OSK policistrônico foi induzido por 12-16 semanas, as fibras do axônio de RGC em regeneração se esten- deram ainda mais para o quiasma (5 mm de distância do sítio de esma- gamento), onde o nervo ótico se conecta ao cérebro (FIGs. 38B-38C).
[00434] Em seguida, o tempo necessário para a expressão de OSK foi testado para promover a sobrevivência e regeneração neuronal. Para essas experiências, o sistema Tet-On AAV foi utilizado devido à sua rá- pida taxa de ativação (FIG. 37D e FIGS. 39A-39B). Melhoria significativa na regeneração de axônio ocorreu apenas quando a expressão de OSK foi induzida após a lesão e quanto mais tempo OSK foi induzido, maior a distância dos neurônios estendidos, sem aumento no número total de RGCs (FIGS. 33B, 33C e 33D). Por comanchamento para OSK e reali- zação de contagens neuronais, a taxa de sobrevivência foi estimada em 2,5-3 vezes de RGCs não infectadas ou infectadas com GFP (52 vs. 17%-20%) (FIGS. 39C e 39D), sugerindo que o efeito de OSK é intrín- seco à célula. A via Pten-mTOR-S6K, anteriormente mostrado para me- lhorar a sobrevivência neuronal in vivo, não foi ativada em células infec- tadas com OSK pós-lesão (FIG. 40A e FIG. 40B), indicando que uma nova via pode estar envolvida.
[00435] Foi determinado se a lesão neuronal avançou a idade epige- nômica e se os benefícios de OSK foram devido à preservação de um epigenoma mais jovem. O DNA genômico de RGCs foi isolado por FACS antes da lesão ou 4 dias após a lesão na presença ou ausência de indução de OSK, e submetido ao sequenciamento de bissulfito de representação reduzida (RRBS-Seq). Sem estar limitado por uma teoria particular, o relógio rDNAme (Wang et al., Genome Res 29, 325-333, doi: 10.1101/gr.241745.118 (2019)) forneceu a melhor cobertura de site (sites 70/72 CpG) em relação a outros relógios de camundongo dispo- níveis (Meer et al., Elife 7, doi:10.7554/eLife.40675 (2018); Thompson et al., Aging (Albany NY) 10, 2832-2854, doi:10.18632/aging.101590 (2018)) e sua estimativa de idade permaneceu altamente correlacio- nada com a idade cronológica de RGCs (FIG. 45A e Métodos). Na au- sência de alterações de metilação global, RGCs lesadas experimenta- ram uma aceleração do relógio epigenético e a expressão de OSK neu- tralizou este efeito (FIG. 33K e FIG. 45B).
[00436] Foi determinado se o efeito de OSK na sobrevivência e re- generação neuronal ocorreu através da restauração de um epigenoma mais jovem. Nesse caso, esses efeitos devem ser dependentes da re- versão do relógio epigenético, o que exigiria a remoção de grupos metila do DNA por meio da atividade das dioxigenases Ten-Eleven-Transloca- tion (TET). AAVs previamente caracterizados que expressam RNAs cur- tos em forma de grampo de cabelo contra Tet1 e Tet2 (sh-Tet1 e sh- Tet2) (Guo et al., Cell 145, 423-434, doi:10.1016/j.cell.2011.03.022 (2011); Yu et al., Nat Neurosci 18, 836-843, doi:10.1038/nn.4008 (2015); Weng et al., Neuron 94, 337-346.e336, doi:10.1016/j.neu- ron.2017.03.034 (2017 )) foram utilizados, e a taxa de transdução e a eficiência do nocaute in vivo foram validadas (FIGs. 40C-40F). O no- caute de Tet1 ou Tet2 (sh-Tet1 e sh-Tet2 AAV2, a 1/5 do título de OSK AAV), que transduziu cerca de 70 % das células OSK positivas (FIGs. 40C e 40D), bloqueou de forma eficiente OSK de axônios em regenera- ção e melhorou a sobrevivência de RGC (FIGS. 33E e 33F).
[00437] Para testar se o rejuvenescimento neuronal por OSK é espe- cífico para RGCs de camundongo, os ensaios de regeneração de axônio foram realizados em neurônios humanos in vitro (FIG. 33G). Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram diferenciadas em neurônios e transduzidas com vetores de AAV-DJ para expressar OSK (FIG. 33G, FIG. 41A e FIG. 41B). Semelhante às RGCs de camundongo in vivo (FIG. 38A), OSK não induziu a proliferação celular (FIGs. 41C-41D). A degeneração do axônio foi, então, induzida por um tratamento de 24 horas com vincristina (VCS), um agente quimioterápico, e as células fo- ram, então, deixadas se recuperarem por 9 dias. O relógio epigenético desses neurônios foi medido usando o relógio das células da pele e do sangue (Horvath e Raj, Nat Rev Genet. 2018 Jun; 19(6):371-384). Da mesma forma, a idade de metilação do DNA é significativamente au- mentada após o dano de VCS em neurônios humanos (FIG. 41J), e a expressão de OSK não apenas evitou este aumento da idade de meti- lação do DNA, porém, também restaurou uma idade de metilação do DNA mais jovem sem uma redução global da metilação do DNA (FIG. 33H, painel inferior e FIG. 45C). DNAmAge é significativamente diminu- ído com o dia 9 do experimento após o dano de VCS em células tratadas com OSK, porém, não em células não tratadas com OSK (FIG. 33H). No dia 9 após o dano, a área de neurito era 15 vezes maior nas células rejuvenescidas transduzidas por OSK do que os controles (FIG. 41E e FIG. 41F) e a recuperação do dano era dependente da Tet2 desmetilase (FIG.33I, FIG. 33J e FIG. 41G), mesmo na presença de alta expressão de OSK (FIG. 41K), porém, não a via de mTOR-S6K, paralelamente às células dos gânglios retinais de camundongo (FIG. 41H e FIG. 41I). As- sim, a capacidade de OSK de reprogramar neurônios e promover o cres- cimento de axônios é intrínseca à célula, conservada em mamíferos, e requer rejuvenescimento epigenético por meio da desmetilação do DNA. Este processo é referido neste documento como a recuperação de informações via reprogramação epigenética, ou "REVIVER" abrevi- ado.
[00438] Glaucoma, uma perda progressiva de RGCs e seus axônios, na maioria das vezes devido ao aumento da pressão intraocular, é uma das principais causas de cegueira relacionada à idade em todo o mundo. Embora alguns tratamentos possam retardar a progressão da doença, atualmente não é possível restaurar a visão depois de perdida. Dada a capacidade de OSK de regenerar axônios após dano ao nervo agudo, decidimos testar se o tratamento REVIVER poderia restaurar a função de RGCs em um cenário acrônico como o glaucoma (FIG. 34A). A pressão intraocular elevada (IOP) foi induzida unilateralmente por 4- 21 dias por injeção de microcontas na câmara anterior. OSK AAVs ou PBS foram, então, injetados intravitrealmente e expressos em um ponto de tempo quando o dano glaucomatoso foi estabelecido, com uma dimi- nuição significativa em RGCs e densidade axonal (FIG. 34B, FIG. 42A e FIG. 42B) (Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197(12):p. 4626-4638). Quatro semanas após a injeção de AAV, os camundongos tratados com OSK-On apresentaram um aumento significativo na densidade do axô- nio quando comparados aos camundongos tratados com PBS e OSK- Off. O aumento da densidade do axônio observada foi equivalente à densidade do axônio nos camundongos não glaucomatosos, apenas com solução salina (FIGS.34C e 34D) e não foi associado à proliferação de RGCs (FIG. 42C).
[00439] Para determinar se o aumento da densidade do axônio ob- servada em camundongos tratados com OSK coincidiu com o aumento da visão, um ensaio de comportamento, resposta optomotora (OMR), foi usado (FIG 34E) para rastrear a acuidade visual de cada camun- dongo. Em comparação com os camundongos que receberam PBS ou OSK-Off AAV, o tratamento com OSK aumentou significativamente a acuidade visual em relação à medição da linha de base pré-tratamento, restaurando mais da metade da perda de visão (FIG. 34F). Uma leitura de ondas elétricas geradas por RGCs em resposta a um padrão de qua- dro de verificação de contraste reverso, conhecido como análise de res- posta de eletrorretinograma padrão (pERG), mostrou que o tratamento com OSK melhorou significativamente a função de RGC em relação às medições da linha de base pré-tratamento, bem como, em comparação com camundongos tratados com PBS ou OSK-Off AAV (FIG. 34G e H). Sem estar limitado por uma teoria particular, o tratamento com OSK AAV, como mostrado aqui, pode ser o primeiro tratamento para reverter a perda de visão em qualquer modelo de glaucoma. Notavelmente, o OSK reverteu a perda de visão em um modelo de glaucoma.
[00440] Dada a capacidade de OSK de induzir a regeneração de axô- nios após esmagamento do nervo ótico e de restaurar a visão após dano glaucomatoso em camundongos jovens, foi determinado se OSK tam- bém poderia restaurar a perda de visão associada ao envelhecimento fisiológico e regenerar axônios após lesão do nervo ótico em camun- dongos idosos. Isto é particularmente importante, uma vez que uma abordagem regenerativa de fotorreceptores de bastonete retinal recen- temente relatada que teve sucesso no tratamento de camundongos jo- vens foi significativamente diminuída no tratamento de camundongos mais velhos (Yao, K., et al., Restoration of vision after de novo Genesis of Rod photoreceptors in mammalian retinas. Nature, 2018. 560(7719): p. 484-488.).
[00441] Para determinar se o tratamento com OSK AAV poderia in- duzir a regeneração de axônio em camundongos envelhecidos, o mo- delo de lesão por esmagamento do nervo ótico foi realizado em camun- dongos de 12 meses de idade usando o mesmo protocolo que na FIG. 32D com o projeto experimental mostrado (FIG. 35A). Em camundongos idosos, o tratamento com OSK AAV por duas semanas pós-lesão mos- trou sobrevivência de RGC duplicada, semelhante à observada em ca- mundongos jovens (FIG. 43A). Embora a regeneração de axônio seja ligeiramente menor do que a de camundongos jovens em duas semanas pós-lesão (FIG. 43B), o tratamento com OSK AAV em camundongos idosos por cinco semanas pós-lesão mostrou um aumento significativo na regeneração de axônio (FIGS. 35B e 35C), semelhante àquele ob- servado em camundongos jovens. Estes dados indicam que o envelhe- cimento não diminui a eficácia do tratamento com OSK AAV na indução da regeneração do axônio após uma lesão por esmagamento do nervo ótico.
[00442] Para testar se o tratamento com OSK poderia reverter a perda de visão associada ao envelhecimento fisiológico, camundongos com 4 e 12 meses de idade receberam injeções intravítreas de OSK-Off ou OSK-On AAV. Como esperado, com um ano de idade, os camun- dongos mostraram uma redução significativa na acuidade visual e fun- ção de RGC medida por OMR e pERG, que foi restaurada por trata- mento com OSK AAV (FIG. 35D e FIG. 43C). Tal restauração não foi observada em camundongos de 18 meses de idade (FIG. 43F-43G) pro- vavelmente devido à opacidade espontânea da córnea desenvolvida nesta idade (McClellan et al., Am J Pathol 184, 631-643, doi:10.1016/j.ajpath.2013.11.019 (2014)), sugerindo que o efeito da res- tauração é especificamente contribuído pela camada de RGC infectada com AAV.
[00443] Em seguida, foi determinado se a restauração do transcrip- toma juvenil por OSK indica um epigenoma juvenil e, portanto, requer enzimas Tet. Notavelmente, o nocaute de Tet1 ou Tet2 bloqueou com- pletamente o efeito de rejuvenescimento do tratamento com OSK-On AAV conforme medido por ambas as análises de OMR e pERG (FIG.35E e FIG. 35F), consistente com a metilação do DNA como o pro- cesso chave para a restauração da visão. Notavelmente, não há RGC óbvio e aumento da densidade de axônio por OSK em camundongos idosos (FIG. 43D e FIG. 43E), sugerindo melhoria funcional de RGCs existentes. A idade de metilação do rDNA de RGCs classificados por FACS de camundongos de 12 meses de idade foi medida. A expressão de OSK AAV por 4 semanas diminuiu significativamente a idade de me- tilação do DNA e o nocaute de Tet1 e Tet2 bloqueou tal rejuvenesci- mento (FIG. 35I). Juntos, esses resultados demonstram que a reprogra- mação in vivo dependente de Tet pode restaurar os padrões de expres- são gênica juvenil, reverter o relógio de metilação do DNA e restaurar a função e capacidade regenerativa de um tecido complexo.
[00444] Para determinar ainda se o nocaute de Tet2 pode bloquear o efeito de OSK na regeneração de axônio, camundongos nocaute con-
dicional de OSK e Tet2 de camundongo (B6; 129S-Tet2tm1.1Iaai/J) fo- ram usados. Olhos de camundongo foram injetados com (1) AAV-CRE (Tet2 cKO); (2) AAV-tTA + AAV-TRE-OSK: OSK (Tet2 WT); ou (3) AAV- tTA + AAV-TRE-OSK + AAV-CRE: OSK (Tet2 cKO). Após duas sema- nas, o esmagamento do nervo ótico foi conduzido. A CTB foi adminis- trada duas semanas após o esmagamento do nervo ótico e os camun- dongos foram sacrificados dois dias após a administração do CTB para determinar a extensão da regeneração do axônio após a lesão. Con- forme mostrado nas FIGs. 46A-46B, o número de axônios por nervo até pelo menos 500 µm do sítio da lesão foi significativamente maior em camundongos tipo selvagem Tet2 que receberam OSK em comparação com camundongos nocaute Tet2 que receberam OSK. Esses resultados sugerem que a regeneração de axônios mediada por OSK é dependente de Tet2.
[00445] A fim de determinar o efeito da reprogramação no transcrip- toma na retina, RGCs purificadas por FACS de camundongos velhos intactos (12 meses) e aqueles que foram tratados com AAV de controle vazio (TRE-OSK) ou OSK-On (tTA + TRE -OSK) foram analisadas por RNA-seq de todo o genoma. Em comparação com RGCs de camundon- gos jovens intactos (5 meses), 464 genes foram identificados, os quais foram diferencialmente expressos durante o envelhecimento (FIG. 35G, FIG. 35I, FIG. 44A e Tabela 5) e não induzidos por AAV vazio sozinho. Destes, 268 genes foram regulados negativamente durante o envelhe- cimento, os quais foram enriquecidos em genes de percepção sensorial (FIG.35I), sugerindo um declínio dos receptores de sinalização/função sensorial durante o envelhecimento (FIGS. 44B e 44C). Curiosamente, 116 desses genes parecem não caracterizados, sem um nome de gene oficial. Os outros 196 genes que são ligeiramente super-regulados du- rante o envelhecimento são enriquecidos em genes transportadores de íons (FIG. 44D).
[00446] Notavelmente, consistente com OSK redefinindo a lands- cape epigenômica, a grande maioria (90 %, 418) dos 464 genes que mudam na expressão durante o envelhecimento foram restaurados para níveis juvenis após o tratamento (FIGS. 35G e 35H). Juntos, esses re- sultados demonstram que a reprogramação in vivo dependente de Tet pode restaurar os padrões de expressão gênica juvenil, reverter o reló- gio epigenético e restaurar a função de um tecido tão complexo quanto a retina.
[00447] Neurônios pós-mitóticos no sistema nervoso central são al- gumas das primeiras células do corpo a perder sua capacidade ou re- generar. Neste estudo, foi demonstrado que a reprogramação in vivo de neurônios idosos pode reverter a idade epigenética e permitir que eles se regenerem e funcionem como se fossem jovens novamente. O requi- sito de DNA desmetilases Tet1 e Tet2 para este processo indica que a metilação do DNA nos sítios do relógio não são meramente um indica- dor de envelhecimento, porém, um participante ativo dele. Concluiu-se que as células de mamíferos mantêm um conjunto de informações epi- genéticas originais, da mesma forma que o observador de Shannon ar- mazena informações para garantir a recuperação das informações per- didas em um momento posterior (SHANNON, CE, A Mathematical The- ory of Communication. The Bell System Technical Journal, 1948. 27: p. 379-423). Como as células são capazes de encontrar e remover as por- ções de metilação de DNA adequadas e restaurar os padrões de ex- pressão de genes jovens ainda é uma questão em aberto, porém, mesmo na ausência desse conhecimento, nossos dados indicam que a reversão da idade epigenética pode ser uma estratégia de translação eficaz, não apenas para restaurar a visão, porém para dar a outros teci- dos a capacidade de se recuperar de lesões e resistir ao declínio relaci- onado à idade. Tabela 5. Genes que foram expressos diferencialmente durante o envelhecimento em RGCs de camundongo.
Genes Sub-regulados Genes Super-regulados 1700031P21Rik 0610040J01Rik 1810053B23Rik 1700080N15Rik 2900045O20Rik 2900064F13Rik 2900060B14Rik 4833417C18Rik 4921504E06Rik 4921522P10Rik 4930402F11Rik 4930447C04Rik 4930453C13Rik 4930488N15Rik 4930455B14Rik Ace 4930500H12Rik Ackr1 4930549P19Rik Acot10 4930555B11Rik Acvr1 4930556J02Rik Adamts17 4932442E05Rik Adra1b 4933431K23Rik AI504432 4933438K21Rik Best3 6720475M21Rik Boc 9830132P13Rik Cadm3 A430010J10Rik Cand2 A530064D06Rik Ccl9 A530065N20Rik Cd14 Abcb5 Cd36 Abhd17c Cfh AC116759.2 Chrm3 AC131705.1 Chrna4 AC166779.3 Cntn4 Acot12 Cracr2b Adig Cryaa
Akr1cl CT573017.2 Ankrd1 Cyp26a1 Asb15 Cyp27a1 Atp2c2 D330050G23Rik AU018091 D930007P13Rik AW822073 Ddo Btnl10 Dgkg C130093G08Rik Dlk2 C730027H18Rik Dnaja1-ps Ccdc162 Drd2 Chil6 Dsel Col26a1 Dytn Corin Ecscr Crls1 Edn1 Cybrd1 Ednrb Cyp2d12 Efemp1 Cyp7a1 Elfn2 D830005E20Rik Epha10 Dlx3 Ephx1 Dnah14 Erbb4 Dsc3 Fam20a Dthd1 Fbxw21 Eid2 Ffar4 Eps8l1 Flt4 EU599041 Fmod Fam90a1a Foxp4 Fancf Fzd7 Fau-ps2 Gabrd Fezf1 Galnt15
Gja5 Galnt18 Gm10248 Gfra2 Gm10513 Ggt1 Gm10635 Gm10416 Gm10638 Gm14964 Gm10718 Gm17634 Gm10722 Gm2065 Gm10800 Gm32352 Gm10801 Gm33172 Gm11228 Gm34280 Gm11251 Gm35853 Gm11264 Gm36298 Gm11337 Gm36356 Gm11368 Gm36937 Gm11485 Gm3898 Gm11693 Gm42303 Gm12793 Gm42484 Gm13050 Gm42537 Gm13066 Gm42743 Gm13323 Gm43151 Gm13339 Gm43843 Gm13346 Gm44545 Gm13857 Gm44722 Gm14387 Gm45516 Gm14770 Gm45532 Gm15638 Gm47494 Gm16072 Gm47982 Gm16161 Gm47989 Gm16181 Gm48398
Gm17200 Gm48495 Gm17791 Gm48593 Gm18025 Gm48958 Gm18757 Gm49089 Gm18795 Gm49326 Gm18848 Gm49331 Gm19719 Gm49760 Gm20121 Gm5796 Gm20356 Gm6374 Gm2093 Gm7276 Gm21738 Gm8237 Gm21940 Gm9796 Gm22933 Gm9954 Gm24000 Gpr75 Gm24119 Gprc5c Gm25394 Grid2ip Gm26555 Gsg1l2 Gm27047 Hapln4 Gm28262 Hcn3 Gm28530 Hcn4 Gm29295 Hhatl Gm29825 Hs6st2 Gm29844 Htr3a Gm3081 Il1rap Gm32051 Il1rapl2 Gm32122 Inka1 Gm33056 Kbtbd12 Gm33680 Kcnj11 Gm34354 Kcnk4
Gm34643 Kdelc2 Gm3551 Klhl33 Gm36660 Lamc3 Gm36948 Lilra5 Gm37052 Lman1l Gm37142 Lrfn2 Gm37262 Lrrc38 Gm37535 Lrrn4cl Gm37569 Ltc4s Gm37589 Mansc1 Gm37647 Mir344c Gm37648 Msr1 Gm37762 Mycbpap Gm38058 Myoc Gm38069 Ngfr Gm38137 Nipal2 Gm38218 Olfr1372-ps1 Gm39139 Otop3 Gm42535 P2rx5 Gm42680 P2ry12 Gm42895 P4ha2 Gm42994 Pcdha12 Gm43027 Pcdha2 Gm43158 Pcdhac2 Gm43288 Pcdhb18 Gm43366 Pcdhb5 Gm44044 Pcsk2os1 Gm44081 Pcsk6 Gm44187 Perp
Gm44280 Pkp1 Gm44535 Plxna4 Gm45338 Prickle2 Gm45644 Qsox1 Gm45740 Rapgef4os2 Gm46555 Rbp4 Gm46565 Rcn3 Gm4742 Sec14l5 Gm47485 Sel1l3 Gm47853 Serpinh1 Gm47992 Sgpp2 Gm48225 Shisa6 Gm48314 Siah3 Gm48383 Siglech Gm48673 Slc12a4 Gm48804 Slc24a2 Gm48832 Slc2a5 Gm4994 Slc4a4 Gm5487 Slitrk3 Gm5724 Smagp Gm595 Smoc2 Gm6012 Speer4b Gm6024 Spon2 Gm7669 Sstr2 Gm7730 Sstr3 Gm8043 St3gal3 Gm8953 Stc1 Gm9348 Stc2 Gm9369 Syndig1
Gm9495 Syt10 H2al2a Thsd7a Ido2 Tlr8 Igfbp1 Tmem132a Kif7 Tmem132d Klhl31 Tmem200a Lrrc31 Tmem44 Mc5r Trpc4 Mgam Trpv4 Msh4 Unc5b Mucl2 Vgf Mug1 Vmn1r90 Mybl2 Vwc2l Myh15 Wfikkn2 Nek10 Wnt11 Neurod6 Wnt6 Nr1h5 Zeb2os Olfr1042 Zfp608 Olfr1043 Zfp976 Olfr1082 Olfr1090 Olfr1124 Olfr1167 Olfr1205 Olfr1206 Olfr1223 Olfr1263 Olfr1264 Olfr1269
Olfr127 Olfr1291-ps1 Olfr1406 Olfr1469 Olfr215 Olfr273 Olfr328 Olfr355 Olfr372 Olfr390 Olfr427 Olfr456 Olfr466 Olfr481 Olfr522 Olfr6 Olfr601 Olfr603 Olfr706 Olfr727 Olfr728 Olfr741 Olfr801 Olfr812 Olfr816 Olfr822 Olfr860 Olfr890 Olfr923
Olfr943 Otogl Pi15 Pkhd1 Pkhd1l1 Platr6 Pou3f4 Prr9 Pvalb Rhag Sav1 Serpinb9b Skint1 Skint3 Skint5 Slc10a5 Slc6a4 Smok2a Tcaf3 Tomm20l Trcg1 Trdn Ugt1a6a Usp17la Vmn1r178 Vmn1r179 Vmn1r33 Vmn1r74 Vmn1r87
Vmn2r102 Vmn2r113 Vmn2r17 Vmn2r52 Vmn2r66 Vmn2r68 Vmn2r76 Vmn2r78 Wnt16 Métodos Linhagens de Camundongo
[00448] Camundongos C57BL6/J tipo selvagem são adquiridos de Jackson Laboratory (000664) para esmagamento do nervo ótico e ex- perimento de modelo de glaucoma. Para experimentos de envelheci- mento, fêmeas de NIA Aged Rodent Colonies (https://www.nia.nih.gov/research/dab/aged- roedor-colonies-hand- book) são usadas. Os alelos Col1a1-tetOP-OKS-mCherry/Rosa26- M2rtTA são descritos em Bar-Nur et al., Nat Methods, 2014. 11(11): p. 1170-6. Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo comitê de uso e de cuidado animal Harvard Medical School, Boston Children’s Hospital, Mass Eye and Ear Institutional. Produção de AAVs
[00449] Os vetores de AAV-TRE-OSK foram feitos por clonagem de cDNA de camundongo Oct4, Sox2 e Klf4 em um plasmídeo de AAV con- sistindo em um Elemento de Resposta Tet (promotor de TRE3G) e ele- mento de SV40. Os outros vetores foram sintetizados quimicamente di- retamente. Todos os pAAVs, conforme listado na Tabela 6, foram, en- tão, empacotados em AAVs do sorotipo 2/2 ou 2/9 (títulos: > 5 x 1012 cópias do genoma por mililitro). Os vírus adenoassociados foram produ- zidos pelo Boston Children's Hospital Viral Core.
Liberação sistêmica de AAV9 para órgãos internos
[00450] A expressão em órgãos internos foi alcançada através da in- jeção retro-orbital de AAV9 (31011 TRE-OSK mais 71011 UBC-rtTA4). 1mg/mL de doxiciclina foi tratado 3 semanas após a injeção continua- mente para induzir a expressão de OSK. Cultura e diferenciação celular
[00451] Fibroblastos de orelha (EFs) foram isolados de camundon- gos Reprogramação 4F (Jackson Laboratory 011011) ou 3F (Hochedlin- ger lab) e cultivados a 37 ºC em DMEM (Invitrogen) contendo Gluta- MAX, aminoácidos não essenciais e 10 % de soro fetal bovino (FBS). EFs de camundongos WT 4F e WT 3F foram passados para P3 e trata- dos com doxiciclina (2 mg/ml) durante os períodos de tempo indicados no meio de cultura.
[00452] As células de neuroblastoma SH-SY5Y foram obtidas na American Tissue Culture Collection (ATCC, CRL-2266) e mantidas de acordo com as recomendações da ATCC. Basicamente, as células fo- ram cultivadas em uma mistura 1:1 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM, ATCC, 30-2003) e meio F12 (ThermoFisher Scientific, 11765054), suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FBS, Sigma, F0926) e 1 × penicilina/estreptomicina (ThermoFisher Scientific, 15140122). As células foram cultivadas a 37 °C com CO2 5 % e O2 3 %. As células foram passadas ao atingir ~ 80 % de confluência.
[00453] As células SH-SY5Y foram diferenciadas em neurônios con- forme descrito anteriormente 1,2, com algumas modificações. Resumi- damente, 1 dia após a semeadura, as células começaram a ser diferen- ciadas em meio EMEM/F12 (1:1) contendo 2,5 % de FBS, 1 × penici- lina/estreptomicina e 10 µM de ácido totalmente trans retinoico (ATRA, Stemcell Technologies, 72264) (Meio de diferenciação 1) por 3 dias, se- guido de tratamento das células em EMEM/F12 (1:1) contendo 1 % de
FBS, 1 × penicilina/estreptomicina e 10 µM de ATRA (meio de diferen- ciação 2) por 3 dias. As células foram então divididas em placas de cul- tura de células de 35 mm revestidas com poli-D-lisina (ThermoFisher Scientific, A3890401). 1 dia após a divisão, os neurônios foram amadu- recidos em neurobasal/B27 sem soro mais meio de cultura (ThermoFis- her Scientific, A3653401) contendo 1 × Glutamax (ThermoFisher Scien- tific, 35050061), 1 × penicilina/estreptomicina e 50 ng/ml BDNF (Alo- mone labs ) (Meio de diferenciação 3) por pelo menos 5 dias. Ensaio de Regeneração de Neurite
[00454] Os neurônios diferenciados das células SH-SY5Y foram transduzidos com vetores AAV.DJ a 106 cópias do genoma por célula. 5 dias após a transdução, vincristina 100 nM (Sigma, V8879) foi adicio- nada às células durante 24 horas para induzir a degeneração de neuri- tos. Após o tratamento com vincristina, os neurônios foram lavados em PBS duas vezes e meio de diferenciação fresco 3 foi adicionado de volta às placas. Os neurônios foram acompanhados para excrescência de neuritos por 2-3 semanas. Imagens de contraste de fase foram tiradas com ampliação de 100x a cada três a quatro dias. A área da neurita foi quantificada usando a imagem J. Análise do ciclo celular
[00455] As células foram colhidas e fixadas com etanol frio a 70 % durante 16 horas a 4 °C. Após a fixação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, seguido de incubação com PBS contendo 50 µg/mL de iodeto de propídio (Biotium, 40017) e 100 µg/mL de RNase A (Omega) por 1 hora em temperatura ambiente. As amostras manchadas com PI foram analisadas no analisador BD LSR II e apenas células individuais foram bloqueadas para análise. Os perfis do ciclo celular foram analisa- dos usando FCS Express 6 (De Novo Software). Estudos de metilação de neurônios humanos e relógio epigenético
[00456] O DNA foi extraído das células usando o kit Zymo Quick DNA mini-prep plus (D4069) de acordo com as instruções do fabricante e os níveis de metilação do DNA foram medidos em arranjos Illumina 850 EPIC de acordo com as instruções do fabricante. O Illumina BeadChip (EPIC) mede os níveis de DNAm de resolução de CpG único com base na conversão de bissulfito em diferentes sítios CpG no genoma humano. Esses dados foram gerados seguindo o protocolo padrão de ensaios de metilação Illumina, que quantifica os níveis de metilação pelo valor β usando a relação de intensidades entre os alelos metilados e não meti- lados. Especificamente, o valor β é calculado a partir da intensidade dos alelos metilados (M correspondendo ao sinal A) e não metilados (U cor- respondendo ao sinal B), como a relação dos sinais fluorescentes β = Max (M, 0)/[Max (M, 0) + Máx(U,0) +100]. Assim, os valores β variam de 0 (completamente não metilado) a 1 (completamente metilado). Usamos o método de normalização "noob", que é implementado no pacote R "minfi" (Triche et al., NAR 2013, Fortin et al., Bioinformatics 2017). O algoritmo matemático e o software disponível subjacentes ao relógio de pele e sangue (com base em 391 CpGs) são apresentados em Horvath et al., Aging 2018. Injeção Intravítrea de Vírus AAV2
[00457] Para injeção intravítrea, os animais adultos foram anestesia- dos com cetamina/xilazina (100/10 mg/kg) e, em seguida, AAV (1-3 µl) foi injetado intravitreamente, imediatamente posterior aos vasos conjun- tivais paralelos ao limbo, com uma pipeta de vidro fina acoplada à se- ringa de Hamilton usando tubo de plástico. No modelo de IOP elevada, os camundongos receberam uma injeção intravítrea de 1 µl entre 3-4 semanas após a injeção de microcontas. Esmagamento do Nervo Óptico
[00458] Para esmagamento do nervo óptico em animais anestesia- dos, o nervo óptico foi acessado intraorbitalmente e esmagado usando um par de pinças Dumont # 5 (FST), duas semanas após a injeção de
AAV. A injeção da subunidade beta da toxina da cólera conjugada com Alexa (CTB-555, 1 mg/ml; 1-2 µl) foi realizada 2-3 dias antes da eutaná- sia para rastrear axônios RGC em regeneração. Métodos cirúrgicos mais detalhados foram descritos por Park et al., Science, 2008. 322 (5903): p. 963-6. Indução ou Supressão de Doxiciclina In Vivo
[00459] A indução do sistema Tet-On ou supressão do sistema Tet- Off na retina foi realizada pela administração de hiclato de doxiciclina (2 mg/ml) (Sigma) na água de beber. A indução do sistema Tet-On em todo o corpo foi realizada pela administração de doxiciclina (1 mg/ml) (grau USP, MP Biomedicals 0219895505) na água de beber. Quantificação de Regeneração de Axônio
[00460] O número de axônios em regeneração no nervo óptico foi estimado contando o número de axônios marcados com CTB a diferen- tes distâncias do sítio de esmagamento, conforme descrito anterior- mente (Park, KK, et al., Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science, 2008. 322 (5903): p. 963-6). Preparação do Nervo Óptico de Montagem Completa
[00461] Os nervos ópticos e o quiasma de conexão foram desidrata- dos em metanol por 5 min, então incubados durante a noite com Visikol® HISTO-1 ™. Os nervos do dia seguinte foram transferidos para Visikol® HISTO-2 ™ e então incubados por 3 horas. Finalmente, nervos ópticos e quiasmas de conexão foram montados com Visikol® HISTO-2 ™. Imunofluorescência
[00462] Retinas inteiras foram bloqueadas com soro de cavalo 4°C durante a noite, em seguida, incubadas a 4 °C por 3 dias com anticorpos primários: anti-Oct4 de camundongo (1:100, BD bioscience, 611203), anti-Sox2 de coelho (1:100, Sinalização celular, 14962), anti-Klf4 de ca- bra (1:100, sistema R&D, AF3158), anti-Brn3a de coelho (1:200, EMD
Millipore, MAB1585) e anti-RBPMS de porquinho da índia (1:400, pedido personalizado de Raygene A008712 para o peptídeo GGKAE- KENTPSEANLQEEEVRC) diluído em PBS, BSA (3 %) Triton X-100 (0,5 %). Em seguida, os tecidos foram incubados a 4 °C durante a noite com anticorpos secundários de conjugado Alexa Fluor apropriados (Alexa 405, 488, 567, 674; Invitrogen) diluídos com a mesma solução de blo- queio que os anticorpos primários, geralmente usados na diluição final de 1:400. Para manchamento de seção, primário durante a noite a 4 °C e, em seguida, secundário em temperatura ambiente por 2h. Seções ou retinas de montagem inteira foram montadas com Meio de Montagem Antifade VECTASHIELD. Western Blot
[00463] A análise de SDS-PAGE e Western blot foi realizada de acordo com os procedimentos padrão e detectada com o kit de detecção ECL. Anticorpo usado: anti-Sox2 de coelho (1:100, EMD Millipore, AB5603), anti-Klf4 de camundongo (1:1000, ReproCell, 09-0021), anti- p-S6 de coelho (S240/244) (1:1000, CST, 2215), anti-S6 de camun- dongo (1:1000, CST, 2317), anti-β-tubulina de camundongo (1:1000, Sigma-Aldrich, 05-661), anticorpo anti-β-actina-peroxidase de camun- dongo (1 : 20.000, Sigma-Aldrich, A3854). RGCs Survival e Phospho-S6 Signal
[00464] As células RBPMS-positivas na camada ganglionar foram contadas usando um microscópio fluorescente após imunomancha- mento de retinas de montagem inteira com anticorpos anti-RBPMs. Um total de quatro campos aleatórios por retina foram enumerados. O nú- mero médio por campo foi determinado e as porcentagens de RGCs viáveis foram obtidas comparando os valores determinados a partir das retinas contralaterais não lesadas. Na mesma condição, após o man- chamento de fosfo-S6, as densidades de RGCs fosfo-S6-positivo foram obtidas comparando o valor das retinas contralaterais não lesadas.
Enriquecimento de RGC
[00465] As retinas foram recentemente dissecadas e dissociadas em meio AMES usando papaína, depois trituradas cuidadosamente e man- chadas com anticorpo Thy1.2-PE-Cy7 (Invitrogen 25-0902-81) e man- chamento de células vivas-mortas com Calcine Blue, em seguida, o fluxo classificado em um BD FACS Aria usando um bocal de 130 µm para coletar mais de 10.000 células Thy1.2 + e Clacine blue + (1-2 % do total de eventos). As células congeladas foram enviadas para a Genewiz para extração de RNA e sequenciamento de RNA-seq de entrada ultra- baixa ou para a pesquisa da Zymo para extração de DNA e sequencia- mento de RRBS de entrada ultrabaixa. Preparação da Biblioteca RRBS Clássica
[00466] O DNA foi extraído usando Quick-DNA Plus Kit Microprep Kit. 2-10 ng de entrada de DNA genômico inicial foram digeridos com 30 unidades de MspI (NEB). Os fragmentos foram ligados a adaptadores pré-recozidos contendo 5'-metil-citosina em vez de citosina de acordo com as diretrizes especificadas da Illumina. Fragmentos ligados por adaptador ≥50 bp em tamanho foram recuperados usando o DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Cat #: D4003). Os fragmentos foram então trata- dos com bissulfito usando o kit EZ DNA Methylation-LightningTM (Cat #: D5030). A PCR em escala preparativa foi realizada e os produtos re- sultantes foram purificados com DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Cat #: D4003) para sequenciamento em um Illumina HiSequsing 2x125bp PE. Análise de idade de metilação do DNA de RGC de camundongo
[00467] As leituras foram filtradas usando trim galore v0.4.1 e mape- adas para o genoma de camundongo GRCm38 usando Bismark v0.15.0. As contagens de metilação em ambas as posições de cada sítio de CpG foram combinadas. Apenas os sítios de CpG cobertos em todas as amostras foram considerados para análise. Isso resultou em um total de 708156 sites. Para as leituras do relógio de metilação do rDNA foram mapeadas para BK000964, e as coordenadas foram ajustadas em con- formidade (Wang et al., Genome Res 29, 325-333, doi:
10.1101/gr.241745.118 (2019)). 70/72 sítios foram cobertos para o reló- gio de rDNA, em comparação com 102/435 sítios do relógio multi-tecido de toda a vida útil (Meer et al., Elife 7, doi: 10.7554/eLife.40675 (2018)), ou 248/582 e 77.342/193.651 sítios (cume) de dois relógios de múltiplos tecidos com tempo de vida completo (Thompson et al., Aging (Albany NY) 10, 2832-2854, doi: 10.18632/aging.101590 (2018)). Modelo de camundongo induzido por microcontas de IOP elevada
[00468] Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperi- toneal de uma mistura de cetamina (100 mg/kg; Ketaset; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) e xilazina (9 mg/kg; TranquiVed; Vedco, Inc., St. Joseph, MO) suplementado por aplicação tópica de proparaca- ína (0,5 %; Bausch & Lomb, Tampa, FL). A elevação da IOP foi induzida unilateralmente por injeção de microcontas de poliestireno (FluoSphe- res; Invitrogen, Carlsbad, CA; 15 μm de diâmetro) na câmara anterior do olho direito de cada animal sob um microscópio cirúrgico, conforme relatado anteriormente (Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197 (12): p. 4626-4638). Resumidamente, as microcontas foram preparadas a uma concentração de 5,0 × 106 contas/mL em solução salina fisiológica es- téril. A córnea direita foi perfurada suavemente perto do centro usando uma micropipeta de vidro afiada (World Precision Instruments Inc., Sa- rasota, FL). Um volume de 2 μL de microcontas foi injetado através do orifício pré-formado na câmara anterior, seguido pela injeção de uma bolha de ar através da micropipeta conectada com uma seringa Hamil- ton. Quaisquer camundongos que desenvolveram sinais de inflamação (turvação da córnea, córnea edematosa, etc.) foram excluídos do es- tudo. Medições de IOP (pressão intraocular)
[00469] As IOPs foram medidas com um tonômetro TonoLab de re- bote (Colonial Medical Supply, Espoo, Finland), conforme descrito ante- riormente (Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197 (12): p. 4626-4638; Mu- kai et al., PLoS One, 2019. 14 (1): p. E0208713). Os camundongos fo- ram anestesiados com 3 % de isoflurano em 100 % de oxigênio (indu- ção) seguido por 1,5 % de isoflurano em 100 % de oxigênio (manuten- ção) administrado com um vaporizador de precisão. A medição da IOP foi iniciada dentro de 2 a 3 minutos após a perda de um reflexo de pin- çamento do dedo do pé ou resposta de pinçamento da cauda. Os ca- mundongos anestesiados foram colocados em uma plataforma e a ponta do sensor de pressão foi colocada a aproximadamente 1/8 de po- legada da córnea central. A IOP média foi exibida automaticamente após 6 medições após a eliminação dos valores mais alto e mais baixo. A média gerada pela máquina foi considerada como uma leitura, e seis leituras foram obtidas para cada olho. Todas as IOPs foram tomadas na mesma hora do dia (entre 10:00 e 12:00 horas) devido à variação da IOP ao longo do dia. Resposta Optomotora
[00470] A acuidade visual de camundongos foi medida usando um teste de limiar de frequência espacial baseado em reflexo optomotor (Gao et al., Am J Pathol, 2016. 186(4): p. 985-1005; Sun et al., Glia,
2013. 61(8): p. 1218-1235). Os camundongos poderiam se mover livre- mente e foram colocados em um pedestal localizado no centro de uma área formada por quatro monitores de computador dispostos em um quadrilátero. Os monitores exibiam um padrão de grade sinusoidal preto e branco em movimento vertical. Um observador cego, incapaz de ver a direção das barras em movimento, monitorou o comportamento de ras- treamento do mouse. O rastreio foi considerado positivo quando houve movimento da cabeça (resposta motora) na direção das barras ou rota- ção do corpo na direção concordante com o estímulo. Cada olho seria testado separadamente, dependendo da direção de rotação da grade. O método da escada foi usado para determinar a frequência espacial começando de 0,15 a 0,40 ciclos/grau, o intervalo é de 0,05 ciclos/grau. A velocidade de rotação (12 °/s) e o contraste (100 %) foram mantidos constantes. As respostas foram medidas antes e depois do tratamento por indivíduos cegos para o grupo do animal e o tratamento. Eletrorretinograma Padrão (pERG)
[00471] Os camundongos foram anestesiados com cetamina/xilazina (100 mg/kg e 20 mg/kg) e as pupilas dilatadas com uma gota de solução oftálmica de tropicamida a 1 %. Os camundongos foram colocados em uma placa de aquecimento embutida (Celeris, Full-Field e Pattern Sti- mulation para o modelo de roedor), que manteve a temperatura corporal a 37 C e sob luz vermelha fraca durante todo o procedimento. Os estí- mulos visuais de um padrão xadrez reversível em preto e branco com um tamanho de verificação de 1 ° foram exibidos em eletrodos-estimu- ladores guia de luz colocados diretamente na superfície ocular de am- bos os olhos e centralizados com a pupila. Os estímulos visuais foram apresentados com 98 % de contraste e luminância média constante de 50 cd/m2, frequência espacial: 0,05 ciclo/grau; frequência temporal: 1Hz. Um total de 300 reversões de contraste completas de pERG foram re- petidas duas vezes em cada olho e os 600 ciclos foram segmentados, calculados e registrados. Os PERGs médios foram analisados para ava- liar a amplitude do pico ao vale de N1 a P1 (onda positiva). Quantificação de axônios do nervo óptico
[00472] Para a quantificação dos axônios, os nervos ópticos foram dissecados e fixados durante a noite em reagente de Karnovsky (50 % em tampão de fosfato). Cortes transversais semifinos do nervo foram obtidos a 1,0 mm posterior ao globo e manchados com 1 % de p-fenile- nodiamina (PPD) para avaliação por microscopia de luz. As seções transversais do nervo óptico foram fotografadas com ampliação de 60x usando um microscópio Nikon (Eclipse E800, Nikon, Japan) com o sof- tware DPController (Olympus, Japan) e 6-8 fotomicrografias não sobre- postas foram tiradas para cobrir toda a área de cada seção cruzada do nervo óptico. Usando ImageJ (versão 2.0.0-rc-65/1.51u), um quadrado de 100 μM x 100 μM foi colocado em cada imagem 60x e todos os axô- nios dentro do quadrado (0,01 mm2) foram contados usando a função de limiar e análise de partículas na imagem J como descrito anterior- mente (Krishnan et al., J Immunol, 2016. 197 (12): p. 4626-4638; Mukai et al., PLoS One, 2019. 14 (1): p. E0208713; Gao et al., Am J Pathol,
2016. 186 (4): p. 985-1005). Os axônios danificados se tingem de forma escura com PPD e não são contados. As contagens médias de axônios nas imagens de 6-8 foram usadas para calcular a densidade de axônios por milímetro quadrado de nervo óptico. Indivíduos cegos para os gru- pos experimentais realizaram todas as contagens de axônios. Quantificação de células ganglionares da retina
[00473] Para a contagem de células ganglionares, imagens de reti- nas inteiras foram adquiridas usando uma objetiva de imersão em óleo 63x do microscópio confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems). A montagem retinal inteira foi dividida em quatro quadrantes e três a qua- tro imagens (248,53 µm por 248,53 µm de tamanho) foram tiradas das regiões periféricas e médias de cada quadrante, para um total de doze a dezesseis imagens por retina foram tiradas das regiões periféricas e médias (4 imagens por quadrante). As imagens foram obtidas como pi- lhas z (0,5 µm) e todas as células positivas para Brn3a na camada de células ganglionares de cada imagem foram contadas manualmente como descrito anteriormente (Gao et al., Am J Pathol, 2016. 186 (4): p. 985-1005). Resumidamente, RGCs foram contadas usando o plugin “Cell Counter” (fiji.sc/Cell_Counter) em Fiji é o software Just ImageJ (ImageJ Fiji, versão 2.0.0-rc-69/1.52n). Cada imagem foi carregada em Fiji e um tipo de contador de cores foi escolhido para marcar todas as
RGCs manchadas com Brn3a em cada imagem (0,025 mm2). O número médio de RGCs nas 12 a dezesseis imagens foi usado para calcular a densidade RGC por milímetro quadrado de retina. Dois indivíduos cegos para os grupos experimentais realizaram todas as contagens de RGC. Extração de RNA total e QC da amostra
[00474] O RNA total foi extraído de acordo com o Trizol Reagent User Guide (Thermo Fisher Scientific). Adicionou-se 1 ul de glicogênio a 10 mg/ml ao sobrenadante para aumentar a recuperação de RNA. O RNA foi quantificado usando o fluorômetro Qubit 2.0 (Life Technologies, Car- lsbad, CA, USA) e a integridade do RNA foi verificada com o TapeSta- tion (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) para ver se a concen- tração atendia aos requisitos. Preparação e multiplexação de biblioteca de RNA de entrada ultrabaixa
[00475] As amostras de RNA foram quantificadas usando o fluorô- metro Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e a integridade do RNA foi verificada com 2100 TapeStation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). As preparações da biblioteca de RNA, as reações de sequenciamento e a análise inicial de bioinformática foram conduzidas na GENEWIZ, LLC. (South Plainfield, NJ, USA). O kit SMART-Seq v4 Ultra Low Input para sequenciamento foi usado para a síntese e ampli- ficação de cDNA de comprimento total (Clontech, Mountain View, CA) e a biblioteca Illumina Nextera XT foi usada para a preparação da biblio- teca de sequenciamento. Resumidamente, o cDNA foi fragmentado e o adaptador foi adicionado usando Transposase, seguido por PCR de ci- clo limitado para enriquecer e adicionar índice aos fragmentos de cDNA. A biblioteca final foi avaliada com Fluorômetro Qubit 2.0 e Agilent Ta- peStation. Sequenciamento 2x150bp PE
[00476] As bibliotecas de sequenciamento foram multiplexadas e agrupadas em duas pistas de uma célula de fluxo. Após o agrupamento,
a célula de fluxo foi carregada no instrumento Illumina HiSeq de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram sequenciadas usando uma configuração 2x150 Paired End (PE). A análise de imagem e a chamada de base foram realizadas pelo Software HiSeq Control (HCS) no instrumento HiSeq. Os dados de sequência brutos (arquivos .bcl) gerados de Illumina HiSeq foram convertidos em arquivos fastq e desmultiplexados usando o programa Illumina bcl2fastq v. 2.17. Um não pareamento foi permitido para a identificação da sequência do índice. Análise de RNA-seq
[00477] As leituras de extremidades pareadas foram alinhadas com hisat2 v2.1.0 para a montagem primária do Ensembl GRCm38 usando junções de splice da anotação Ensembl release 84. As contagens de leituras pareadas foram quantificadas usando featureCounts v1.6.4 usando leituras com um MAPQ >=20. Genes diferencialmente expres- sos para cada comparação de pares foram identificados com edgeR v3.26, testando apenas genes com pelo menos 0,1 contagens por mi- lhão (CPM) por pelo menos três amostras. A análise da ontologia gênica de genes diferencialmente expressos foi realizada com AmiGO v2.5.12. Genes de percepção sensorial associados à idade foram extraídos da categoria Percepção Sensorial de camundongo (GO:0007600) do banco de dados Gene Ontology, incluindo genes que foram expressos diferencialmente (q<= 0,05) em camundongos de 12 versus 5 meses de idade, excluindo genes que foram induzidos por o vírus de Controle so- zinho (q<= 0,1). Tabela 6. Vetores do AAV usados no Exemplo 16 Vetor Iniciador de qPCR para medir título Fonte pAAV-TRE-Oct4 TRE3G Descrito aqui pAAV-TRE-Sox2 TRE3G Descrito aqui pAAV-TRE-Klf4 TRE3G Descrito aqui pAAV-TRE-Oct4-Sox2 TRE3G Descrito aqui pAAV-TRE-OSK TRE3G Descrito aqui pAAV-TRE-d2EGFP TRE3G Descrito aqui pAAV-CMV-rtTAV16 WPRE Descrito aqui pAAV-CAG-tTA hGH Descrito aqui pAAV-sh-Scr-YFP WPRE Plasmid #85741 pAAV-Sh-Tet1-YFP WPRE Plasmid #85742 pAAV-sh-Tet2-YFP WPRE Plasmid #85743 Tabela 7. Iniciadores SEQ ID NO: Nome do inicidor Sequência 53 TRE3G F AACGTATCTACAGTTTACTCCCTATC 54 TRE3G R GGTAGGAAGTGGTACGGAAAG CACTGACAATTCCGTGGTGT 55
WPRE F GAGATCCGACTCGTCTGAGG 56
WPRE R 57 hGH F TGGGAAGACAACCTGTAGGG 58 hGH R TGAAACCCCGTCTCTACCAA Tabela 8. Iniciadores usados para RT-PCR SEQ ID NO: Gene Sequência do iniciador 59 mOct4 F ACA TCG CCA ATC AGC TTG G 60 mOct4 R AGA ACC ATA CTC GAA CCA CAT CC 61 mSox2 F ACA GAT GCA ACC GAT GCA CC 62 mSox2 R TGG AGT TGT ACT GCA GGG CG 63 mKlf4 F GTGCCCCGACTAACCGTTG 64 mKlf4 R GTCGTTGAACTCCTCGGTCT 65 mMyc F ATGCCCCTCAACGTGAACTTC 66 mMyc R CGCAACATAGGATGGAGAGCA 67 mHist1 h2a F GCG ACA ACA AGA AGA CGC GCA T 68 mHist1 h2a R CTG GAT GTT GGG CAG GAC GCC 69 mHist1 h2b F AAG AAG GAC GGC AAG AAG CGC A 70 mHist1 h2b R CGC TCG AAG ATG TCG TTC ACG A 71 mHIST1 H3.1/H3.2 F GAA GAA GCC TCA CCG CTA CCG 72 mHIST1 H3.1/H3.2 R GGT TGG TGT CCT CAA ACA GAC CC 73 mHist1 h4 F AAC ATC CAG GGC ATC ACC AAG C 74 mHist1 h4 R GTT CTC CAG GAA CAC CTT CAG C 75 mLmnb1 F CCG GCC TCA AGG CTC TCT A 76 mLmnb1 R TGC CGC CTC ATA CTC TCG AA 77 mActb F AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT 78 mActb R TGC TAG GAG CCA GAG CAG TA 79 mNanog F TCTTCCTGGTCCCCACAGTTT 80 mNanog R GCAAGAATAGTTCTCGGGATGAA 81 mChaf1a R GTG TCT TCC TCA ACT TTC TCC TTG G 82 mChaf1a F CGC GGA CAG CCG CGG CCG TGG ATT GC 83 mChaf1b R GGC TCC TTG CTG TCA TTC ATC TTC CAC 84 mChaf1b F CAC CGC CGT CAG GAT CTG GAA GTT GG mLmnb1 F CCG GCC TCA AGG CTC TCT A 86 mLmnb1 R TGC CGC CTC ATA CTC TCG AA 87 mTet1 F TCAAGCAATGGACCACTGGG 88 mTet1 R TCTCCATGAGCTCCCTGACA 89 mTet2 F ACT CCT GGT GAA CAA AGT CAG A 90 mTet2 R CAT CCC TGA GAG CTC TTG CC 91 mGAPDH F CCA ATG TGT CCG TCG TGG ATC T 92 mGAPDH R GTT GAA GTC GCA GGA GAC AAC C 93 mp16 (Cdkn2a) F ACA TCA AGA CAT CGT GCG ATA TT 94 mp16 (Cdkn2a) R CCA GCG GTA CAC AAA GAC CA 95 mApob F AAG CAC CTC CGA AAG TAC GTG 96 mApob R CTC CAG CTC TAC CTT ACA GTT GA 97 hTet2 F GATAGAACCAACCATGTTGAGGG 98 hTet2 R TGGAGCTTTGTAGCCAGAGGT 99 hActb F CACCATTGGCAATGAGCGGTTC 100 hActb R AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT Exemplo 17. Exemplos não limitantes de sequências.
[00478] Sequência de nucleotídeo codificando Mus Musculus OCT4 (códon de não interrupção) (SEQ ID NO: 1): ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCAC- CAGGTGGGGGTGATGGGT-
CAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTA AGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGGCT- CAGAGGTATTGGGGA- TCTCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCA TACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGG- CGTGGAGACTTTGCAG- CCTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGG GAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAATGCCGTGAAG- TTGGAGAAGGTGGAAC- CAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAG CTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCAC- CTTGGGGTACACCCAGGCCGA- CGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCC AGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCT- TAAGAACATGTGTAAGCTGCGG- CCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAA CCTTCAGGAGATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGA- AGAGAAAGCGAACTAG- CATTGAGAACCGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAA GTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATCACTCACATCGCCAAT- CAGCTTGGGCTAGAGAAG- GATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAA AAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCTA- CAGGGACACCTTTCCCA- GGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTTGG CACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACTCAG- TCCCTTTTCCTGAGGG- CGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCAT GCATTCAAAC
[00479] Sequência de aminoácido codificando Mus Musculus OCT 4 (SEQ ID NO: 2): MAGHLASDFAFSPPPGGGDGSAGLEPGWVDPRTWLSFQGPPGG- PGIGPGSEVLGISPCPPA-
YEFCGGMAYCGPQVGLGLVPQVGVETLQPEGQAGARVESNSEGTS SEPCADRPNAVKLEKVEPTPEESQDMKALQKELEQFAKLLKQKRITL- GYTQADVGLTLGVLF- GKVFSQTTICRFEALQLSLKNMCKLRPLLEKWVEEADNNENLQEICK SETLVQARKRKRTSIENRVRWSLETMFLKCPKPSLQQITHIANQL- GLEKDVVRVWFCNRR- QKGKRSSIEYSQREEYEATGTPFPGGAVSFPLPPGPHFGTPGYGSP HFTTLYSVPFPEGEAFPSVPVTALGSPMHSN
[00480] Sequência de nucleotídeos codificando Mus Musculus SOX2 (códon de não interrupção) (SEQ ID NO: 3):
ATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCA- GCAAGCTTCGGGGGGCGG- CGGCGGAGGAGGCAACGCCACGGCGGCGGCGACCGGCGGCAA CCAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGGCCCATGAACG- CCTTCATGGTATGG- TCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGAT GCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTGGA- AACTTTTGTCCGAGAC- CGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTGCGCGCT CTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCG- GAAAACCAAGACGCT- CATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGGCCC CCGGCGGGAACAGCATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCG- CCGGCCTGGGTGCGGGCGTGAAC- CAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGG CAGCTACAGCATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCAC- CCGGGCCTCAACGCT- CACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGACGTCAG CGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACA- TGAACGGCTCGCCCACCTACA- GCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCGCTGGGC TCCATGGGCTCTGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAG- CCCCCCCGTGGTTACCTCTT- CCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGA CATGATCAGCATGTACCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAG- CCCGCTGCGCCCAGTAGACTG- CACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGG CCATTAACGGCACACTGCCCCTGTCGCACATG
[00481] Sequência de aminoácido codificando Mus Musculus SOX2 (transladada) (SEQ ID NO: 4)
MYNMMETELKPPGPQQASGGGGGGGNATAAATGGNQKNSP- DRVKRPMNAFMVWSRGQRRK- MAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEH PDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGL- GAGVNQRMDSYAH- MNGWSNGSYSMMQEQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSAL QYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEAS- SSPPVVTSSSHS- RAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMAQHYQSGPVPGTA INGTLPLSHM
[00482] Sequência de nucleotídeo codificando Mus Musculus KLF4 (códon de não interrupção) (SEQ ID NO: 5): ATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACG- CTCTGCTCCCGTCCTT-
CTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTG CGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAAC- TCTCTCACATGAAGCGACTT- CCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGG CCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAG- TAACAACCCGGCCCTCC- TAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTA GACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGG- CCGCCACCGTGACCAC- CTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCC CTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTA- TCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGG- CGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAG AATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACAT- CAATGACGTGAG- CCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTG GACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGG- CGGGCTGATGGGCAAG- TTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAG CAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCA- GCCACCCCGTGGTAGTGG- CGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAG CAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGG- CCCATTTGAGCGCTGGAC- CCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCC CTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAG- TCCCGAGGAACTGCTGAACAG- CAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCC CCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATG- CAGTCACAAG- TCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCC TGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGG- CCCCGGAAAAGAACAGCCAC- CCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAG TTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAAC- CTTACCACTGTGACTGG- GACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAG GCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCA- GAAGTGCGACAGGGCCTTTT- CCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCAC
[00483] Sequência de aminoácido codificando Mus Musculus KLF4 (transladada) (SEQ ID NO: 6): MRQPPGESDMAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRPAGAPTNR- WREELSHMKRLPPL-
PGRPYDLAATVATDLESGGAGAACSSNNPALLARRETEEFNDLLDLD FILSNSLTHQESVAATVTTSASASSSSSPASSGPASAPSTCSFSYPI- RAGGDPGVAAS- NTGGGLLYSRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYI PPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLTTPGSEYSSPSVISVSKGSPD- GSHPVVVAPYSGG- PPRMCPKIKQEAVPSCTVSRSLEAHLSAGPQLSNGHRPNTHDFPLG RQLPTRTTPTLSPEELLNSRDCHPGLPLPPGFHPHPGPNYPPFLPD- QMQSQVPS- LHYQELMPPGSCLPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTY TKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDEL- TRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRH
[00484] Sequência do promotor TRE3G (Exemplo não limitante de um promotor TRE) (SEQ ID NO: 7): TTTACTCCCTATCAGTGATA- GAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATA-
GAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTAT AAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTT- TACTCCCTATCAGTGATA- GAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTAT ATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTT- TAGGCGTGTACGGTGGGCG- CCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA GCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTT- CCTACCCTCGTAAA
[00485] Sequência terminadora derivada de SV40 (SEQ ID NO: 8): TGCGCGCAGCGGCCGACCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCT- TATAATGGTTACAAA-
TAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACT GCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT- CATGTCTGGATCTCGGTACCG
[00486] Sequência T2A (SEQ ID NO: 9): GSGEGRGSLLTCGDVE-
ENPGP
[00487] Sequência de nucleotídeo codificando rtTA3 (com domínio 2 VP16 na extremidade 3′) (SEQ ID NO: 10): ATGTCTAGGCTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACGGAGCTCTGGA- ATTACTCAATGGTGTCGG-
TATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGT TGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGG- CCCTGCTCGATGCCCTGCCAA- TCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTTCTGCCCCCTGGAAG GCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATAC- CGCTGTGCTCTCCTCTCA- CATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGA GAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCA- GCAAGGCTTCTCCCTG- GAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTG GGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGA- AAGAGAGACACCTACCAC- CGATTCTATGCCCCCACTTCTGAGACAAGCAATTGAGCTGTTCGA CCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAA- TCATATGTGGCCTGGA- GAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTG ACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGA- CGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAA
[00488] Sequência de aminoácido codificando rtTA3 (SEQ ID NO: 11): MSRLDKSKVINGALELLNGVGIEGLTTRKLAQKL- GVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEML-
DRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPT EKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEE- QEHQVAKEE- RETPTTDSMPPLLRQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESG GPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG
[00489] Sequência de nucleotídeo codificando rtTA4 (com domínio 3 VP16 na extremidade 3′) (SEQ ID NO: 12): ATGTCCCGCTTGGATAAGAGCAAGGTAATAAATAGCGCAC- TCGAACTCCTCAACGGCGTGGG-
CATCGAAGGTCTGACTACTCGAAAGCTCGCCCAGAAATTGGGTGT GGAGCAACCTACATTGTATTGGCATGTCAAGAACAAAAGAG- CCCTGCTGGACGCTCTTCCTA- TTGAAATGCTTGACAGGCATCACACTCATTCCTGCCCCCTTGAGG TCGAGAGTTGGCAAGATTTTCTCCGAAACAATGCAAAGTCCTAC- CGCTGCGCACTTTTG- TCCCATAGGGATGGAGCAAAAGTGCACCTGGGAACCAGGCCAAC AGAGAAACAATACGAGACTCTCGAGAACCAGTTGGCTTTCTTGTG- CCAACAGGGGTTCTCAC- TTGAAAATGCCCTTTACGCACTGTCAGCCGTTGGACATTTTACCCT GGGGTGCGTTCTTGAGGAGCAAGAACATCAGGTTGCTAAGGAG- GAGCGCGAGACTCCAAC- CACTGATTCTATGCCACCTTTGCTGAAACAGGCCATTGAACTTTTC GATAGACAGGGTGCTGAACCTGCCTTTCTCTTCGGGTTGGAG- CTGATTATTTGTGG- TCTCGAAAAACAGCTGAAATGTGAAAGTGGTGGCCCTACTGACGC CCTCGATGATTTCGACCTGGATATGCTGCCAGCCGATGCAC- TTGATGATTTCGATTTGGATA- TGCTTCCAGCCGACGCACTGGACGACTTCGATTTGGACATGCTTC CCGGTTAA
[00490] Sequência de aminoácido codificando rtTA4 (SEQ ID NO:
13): MSRLDKSKVINSALELLNGVGIEGLTTRKLAQKL- GVEQPTLYWHVKNKRALLDALPIEML-
DRHHTHSCPLEVESWQDFLRNNAKSYRCALLSHRDGAKVHLGTRPT EKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEE- QEHQVAKEE- RETPTTDSMPPLLKQAIELFDRQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESG GPTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG
[00491] Sequência de nucleotídeo codificando M2-rtTA (SEQ ID NO: 14): ATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTT- CATTTTCTCCTCCTTGTATAAA-
TCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGG CAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCAC- TGGTTGGGGCATTGCCAC- CACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATT GCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGA- CAGGGGCTCGGCTGTTGGG- CACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCC TTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACG- TCCTTCTGCTACGTCCCTT- CGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCG GCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAG- TCGGATCTCCCTTTGGG- CCGCCTCCCCGCATCGATACCGTCGACCTCGAGACCTAGAAAAAC ATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATG- CTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCA- CAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACC TTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCAC- TTTTTAAAAGAAAAGGGGG- GACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTG ATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCA- GAACTACACACCAGGGCCA- GGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTA CCAGTTGAGCAAGAGAAGGTAGAAGAAGCCAATGAAGGAGAGAA- CACCCGCTTGTTACAC- CCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTATT AGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACATGG- CCCGAGAGCTGCATCCGGAC- TGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGA
[00492] Sequência de aminoácido codificando M2-rtTA (SEQ ID NO: 15): MPLYHAIASRMAFIFSSLYKSWLLSLYEELWPVVR- QRGVVCTVFADATPTGWGIATT-
CQLLSGTFAFPLPIATAELIAACLARCWTGARLLGTDNSVVLSGKSSS FPWLLACVATWILRGTSFCYVPSALNPADLPSRGLLPALRPLPRLRL- RPQTSRISLWAAS- PHRYRRPRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEEEEVGFPVTPQ VPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT- QGYFPDWQNYTPG- PGIRYPLTFGWCYKLVPVEQEKVEEANEGENTRLLHPVSLHGMDDP EREVLEWRFDSRLAFHHMARELHPDCTGSLWLDQI
[00493] Sequência de nucleotídeo do vetor pAAV-TRE3G-OSK- SV40pA, TRE-OSK-SV40, ou TRE3G-OSK-SV40pA (SEQ ID NO: 16): TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC- TTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAG- TTTACTCCCTATCAGTGA- TAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGT ATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAG- TTTACTCCCTATCAGTGA- TAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGT ATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTT- TAGGCGTGTACGGTGGG- CGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG GAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCAC- TTCCTACCCTCG- TAAAGCGGCCGCGCCACCATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTT CGCCTTCTCACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGG- CTGGAGCCGGGCTGGGTG- GATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCC TGGAATCGGACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATG- TCCGCCCGCATACGAGTT- CTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCC TAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCA- GGCAGGAGCACGAGTGGA- AAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCC CCAATGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAG- TCCCAGGACATGAAAG- CCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAG AAGAGGATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCT- CACCCTGGGCGTTCTCTTTG- GAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGC AGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCCTGCTGGA- GAAGTGGGTGGAGGAAG- CCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATATGCAAATCGGAGACCC TGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCG- TGTGAGGTGGAGTCTGGA- GACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATCAC TCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAG- TATGGTTCTGTAACCGG- CGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAA GAGTATGAGGCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTA- TCCTTTCCTCTGCCCCCAGG- TCCCCACTTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCAC ACTCTACTCAGTCCCTTTTCCTGAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTG- TTCCCGTCACTG- CTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCC ACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAAC- CCCGGGCCTGCATG- CATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGC AGCAAGCTTCGGGGGGCGGCGGCGGAGGAGGCAACGCCACGG- CGGCGGCGACCGGCGGCAAC- CAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGGCCCATGAACGCCTT CATGGTATGGTCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGA- GAACCCCAAGATGCACAAC- TCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTGGAAACTTTTGTC CGAGACCGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTG- CGCGCTCTGCACATGAAG- GAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCGGAAAACCAAGAC GCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGG- CCCCCGGCGGGAACAG- CATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGTGCGGG CGTGAACCAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTG- GAGCAACGGCAGCTACAG- CATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCA ACGCTCACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGA- CGTCAGCGCCCTGCAGTA- CAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCAC CTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCG- CTGGGCTCCATGGGCTCTG- TGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCT TCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGG- GACATGATCAGCATGTAC- CTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCTGCGCCCAGTAGAC TGCACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGG- CACGGCCATTAACGGCACACTG- CCCCTGTCGCACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAA GTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAC- TCGAGATGAGGCAGCCAC- CTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCTCTGCTCCCGTCC TTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACAC- TGCGTCCAGCAGGTG- CCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAACTCTCTCACATGAAGCGAC TTCCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGG- TGGCCACAGACCTGGAGAG- TGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAGTAACAACCCGGCCCTCC TAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTA- GACTTTATCCTTTCCAAC- TCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGGCCGCCACCGTGACCACCTC GGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCCCTG- CCAGCGCGCCCTCCAC- CTGCAGCTTCAGCTATCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGGC GTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAG- CCGAGAATCTGCGCCAC- CTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACATCAATGACGTGAGC CCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTG- GACCCAGTATACATTCCG- CCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTT TGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAGCA- GCCCTTCGGTCATCAGTG- TTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCAGCCACCCCGTGGTAGTGGCG CCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAG- CAAGAGGCGGTCCCGTCCTG- CACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGGCCCATTTGAGCGCTGGACCCC AGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTT- CCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAC- CAGGACTACCCCTACACTGAGTCCCGAGGAACTGCTGAACAGCA GGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATT- CCATCCCCATCCGGGGCCCAACTAC- CCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATGCAGTCACAAGTCCCCTCTCTC CATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCCTGCCAGAGGA- GCCCAAGCCAAAGAGGG- GAAGAAGGTCGTGGCCCCGGAAAAGAACAGCCACCCACACTTGT GACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAGTTCTCATCT- CAAGGCACACCTGCGAAC- TCACACAGGCGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTG GGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAGGCACTACCG- CAAACACACAGGGCACCGG- CCCTTTCAGTGCCAGAAGTGCGACAGGGCCTTTTCCAGGTCGGA CCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCACTAAATGACTAGTGCG- CGCAGCGGCCGACCATGG- CCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATA GCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG- TTGTGGTTTG- TCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGG ATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGA- TAAGTAGCATGGCGGGT- TAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTC CCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG- CTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTA ATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG- GAAAACCCTGGCGTTAC- CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCG TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG- CGCAGCCTGAATGGCGAA- TGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG- CCCGCTCCTTTCGCTTT- CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC TCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT- TACGGCACCTCGAC- CCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT- CTTTAATAGTGGAC- TCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAGCTGATTTAA- CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTC AGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTT- TATTTTTCTAAATACATT- CAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCA ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTG- TCGCCCTTATT- CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACATCGAACTG- GATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG- CGGTATTATCCCGTATTGA- CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACG- GATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00494] Sequência de nucleotídeo do vetor pAAV-UBC-rtTA4- WPRE3-SV40pA (SEQ ID NO: 17): TTATGCAGTGCTGCCATAAC- CATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCCTGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCG- CCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCT- CACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGT CCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCT- CATAAGACTCGGCCT- TAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGG GTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGG- CGAGGAAAAGTAGTCCCTT- CTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCC GATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCG- TCGCAGCCGGGATTTGGG- TCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGT AGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGG- CCGCTCGGTGGGACGGAAGCG- TGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAG GTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGG- CGGCTGTTCCCGAGTCTTGAA- TGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGG TGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGG- CCTTCGCTAATGCGGGAAAG- CTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCT GACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTG- TTGCGGGGGCGGCAGTTA- TGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCG CCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCA- GGGTGGGGCCACCTG- CCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGG TTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGAC- CTCTGGTGAGGGGAGGGA- TAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTC TTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGG- TTGGCGAGTGTGTTTTG- TGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATAT GTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGG- CCGTTTTTGGCTTTTTTG- TTAGACGAAGCGGCCGCATTAAACGCCACCATGTCCCGCTTGGAT AAGAGCAAGGTAATAAATAGCGCACTCGAACTCCTCAACGGCG- TGGGCATCGAAGGTCTGAC- TACTCGAAAGCTCGCCCAGAAATTGGGTGTGGAGCAACCTACATT GTATTGGCATGTCAAGAACAAAAGAGCCCTGCTGGACGCTCTT- CCTATTGAAATGCTTGACA- GGCATCACACTCATTCCTGCCCCCTTGAGGTCGAGAGTTGGCAAG ATTTTCTCCGAAACAATGCAAAGTCCTACCGCTGCGCACTTTTG- TCCCATAGGGATGGAG- CAAAAGTGCACCTGGGAACCAGGCCAACAGAGAAACAATACGAG ACTCTCGAGAACCAGTTGGCTTTCTTGTGCCAACAGGGGTTCT- CACTTGAAAATGCCCTT- TACGCACTGTCAGCCGTTGGACATTTTACCCTGGGGTGCGTTCTT GAGGAGCAAGAACATCAGGTTGCTAAGGAGGAGCGCGAGAC- TCCAACCACTGATTCTATG- CCACCTTTGCTGAAACAGGCCATTGAACTTTTCGATAGACAGGGT GCTGAACCTGCCTTTCTCTTCGGGTTGGAGCTGATTATTTGTGG- TCTCGAAAAACAGCTGAA- ATGTGAAAGTGGTGGCCCTACTGACGCCCTCGATGATTTCGACCT GGATATGCTGCCAGCCGATGCACTTGATGATTTCGATTTGGATA- TGCTTCCAGCCGACGCAC- TGGACGACTTCGATTTGGACATGCTTCCCGGTTAAACTAGTCTAG CAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATT- CTTAACTATGTTG- CTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCA TGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAA- TCCTGGTTAGTTCTTG- CCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACA GGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTG- TGAAATTTGTGATGCTA- TTGCTTTATTTGTAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATG CTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAA- CAACAACAATTGCATT- CATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA GCGGGGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGC- TACGTAGATAAGTAG- CATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGGGCGACCAAAGGTCG- CCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTA- CAACGTCGTGACTGGGA- AAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCC TTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCG- CCCTTCCCAACAGTTGCGCA- GCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC GCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG- CCAGCGCCCTAGCGCCCG- CTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTT TCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATT- TAGTGCTTTACGGCAC- CTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGG CCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG- TCCACGTTCTTTAATAGTG- GACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTA TTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAGCTGATT- TAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAAT TTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTA- TTTGTTTATTTTTCTAAATA- CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGC TTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCG- TGTCGCCCTTATT- CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACATCGAACTG- GATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG- CGGTATTATCCCGTATTGA- CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACG- GATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00495] Sequência do promotor UBC (SEQ ID NO: 18): GATCTGG- CCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCG- CCCCCCTCCTCACGGCGAGCG-
CTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCC GCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGG- CCTTAGAACCCCAGTATCA- GCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCAC TGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAG- TCCCTTCTCGGCGATTCTGCG- GAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGA CGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGA- TTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTG- TGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGC TGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACG- GAAGCGTGTGGAGAGACCG- CCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACT GGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAG- TCTTGAATGGAAGACGCTTG- TGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGT GGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGG- GAAAGCTCTTATTCGGGTGA- GATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTC ACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAG- TTATGCGGTGCCGTTGGG- CAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTG ACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCAC- CTGCCGGTAGGTGTGCGG- TAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTA GGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGA- GGGATAAGTGAGGCGTCAG- TTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCT CCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTG- TGAAGTTTTTTAGGCAC- CTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAG ACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGT- TAGAC
[00496] Sequência Tet-O (SEQ ID NO: 19): TCCCTATCAGTGATA-
GAGA
[00497] Sequência de ácido nucleico codificando o promotor de CMV mínimo (SEQ ID NO: 20): GCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTA-
TAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA
[00498] Sequência de ácido nucleico codificando WPRE (SEQ ID NO: 21):
[00499] AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATT- CTTAACTATGTTG-
CTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCA TGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAA- TCCTGGTTAGTTCTTG- CCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACA GGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTT
[00500] Sequência de ácido nucleico codificando sequência de repe- tição terminal invertida (SEQ ID NO: 22): CCTTAATTAGGCTGCGCG- CTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG-
TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[00501] Sequência de ácido nucleico de um promotor TRE2 (um exemplo não limitante de um promotor TRE) (SEQ ID NO: 23): AATT- CGTACACGCCTACCTCGACCCATCAAGTGCCACCTGACG- TCTCCCTATCAGTGATA-
GAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGGT ACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACG- TCTCGAGCTCCCTATCAG- TGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAG AAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGG- TACGTCTAGAACGTCTCCCTA- TCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGAT AGAGAAGGTACCCCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGT- CAGATCGCCTGGAGACG- CCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATC CAGCCTGGATCGC
[00502] Sequência de ácido nucleico do promotor à prova de P (um exemplo não limitante de um promotor TRE) (SEQ ID NO: 24): GAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTAC- TCCCTATCAGTGATA-
GAGAACGATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTAT GTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTT- TACTCCCTATCAGTGATA- GAGAACGTATGTCGAGTTTATCCCTATCAGTGATAGAGAACGTAT GTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGG- TAGGCGTGTACGGTGGGA- GGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC
[00503] Sequência de ácido nucleico codificando TetR (SEQ ID NO: 25): ATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCAT- TAGAGCTGCTTAATGAGGTCG-
GAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTG TAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGG- CTTTGCTCGACGCCTTAG- CCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGA AGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTT- TAGATGTGCTTTAC- TAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTA CAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATG- CCAACAAGGTTTTT- CACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTA CTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGC- TAAAGAAGAAAGGGAAACACC- TACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTA TTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAA- TTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGG
[00504] Sequência de aminoácido codificando TetR (SEQ ID NO: 26): MARLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKL- GVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEML-
DRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPT EKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLED- QEHQVAKEE- RETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESG
[00505] Sequência de ácido nucleico codificando TetR-Krab (SEQ ID NO: 27)
ATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAG- CTGCTTAATGAGGTCG- GAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTG TAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGG- CTTTGCTCGACGCCTTAG- CCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGA AGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTT- TAGATGTGCTTTAC- TAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTA CAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATG- CCAACAAGGTTTTT- CACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTA CTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGC- TAAAGAAGAAAGGGAAACACC- TACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTA TTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAA- TTGATCATATGCGGAT- TAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGA GAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTG- CTGTCACTCAAGGAAGTAT- CATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTG GTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCAC- CAGGGAGGAGTGGAAG- CTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTG GAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAG- CCAGATG- TGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAG AGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTG- CATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAA
[00506] Sequência de aminoácido codificando TetR-KRAB (SEQ ID
NO: 28): MARLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKL- GVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEML-
DRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPT EKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLED- QEHQVAKEE- RETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESG SPKKKRKVDGGGALSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSR- TLVTFKDVFVDFTREEW- KLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVE REIHQETHPDSETAFEIKSSV
[00507] Promotor de desmina (SEQ ID NO: 29): ACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTTCTCCTCTATAAATACCA- GCTCTGGTATTTCG-
CCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGAGACGGCTGGCTTGACATGC ATCTCCTGACAAAACACAAACCCGTGGTGTGAGTGGGTGTGGG- CGGTGTGAGTAGGGGGA- TGAATCAGAGAGGGGGCGAGGGAGACAGGGGCGCAGGAGTCAG GCAAAGGCGATGCGGGGGTGCGACTACACGCAGTTGGAAACAG- TCGTCAGAAGATTCTGGA- AACTATCTTGCTGGCTATAAACTTGAGGGAAGCAGAAGGCCAACA TTCCTCCCAAGGGAAACTGAGGCTCAGAGTTAAAACCCAGGTAT- CAGTGATATGCATGTG- CCCCGGCCAGGGTCACTCTCTGACTAACCGGTACCTACCCTACAG GCCTACCTAGAGACTCTTTTGAAAGGATGGTAGAGACCTG- TCCGGGCTTTGCCCACAGTCG- TTGGAAACCTCAGCATTTTCTAGGCAACTTGTGCGAATAAAACACT TCGGGGGTCCTTCTTGTTCATTCCAATAACCTAAAAC- CTCTCCTCGGAGAAAATAGGGGG- CCTCAAACAAACGAAATTCTCTAGCCCGCTTTCCCCAGGATAAGG CAGGCATCCAAATGGAAAAAAAGGGGCCGGCCGGGGG- TCTCCTGTCAGCTCCTTGCCCTG- TGAAACCCAGCAGGCCTGCCTGTCTTCTGTCCTCTTGGGGCTGTC CAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCG- CCCCCTCGCCTGTGGCCG- CCCTTTTCCTGGCAGGACAGAGGGATCCTGCAGCTGTCAGGGGA GGGGCGCCGGGGGGTGATGTCAGGAGGGCTACAAATAGTGCA- GACAGCTAAGGGGCTCCGT- CACCCATCTTCACATCCACTCCAGCCGGCTGCCCGCCCGCTGCC TCCTCTGTGCGTCCGCCCAGCCAGCCTCGTCCACGCC
[00508] Vetor desmin-rtTA4 (SEQ ID NO: 30): TTATGCAGTGCTG- CCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCCTAGATCTACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTT- CTCCTCTATAAATACCAG- CTCTGGTATTTCGCCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGAGACGGCT GGCTTGACATGCATCTCCTGACAAAACACAAACCCGTGGTG- TGAGTGGGTGTGGGCGGTG- TGAGTAGGGGGATGAATCAGAGAGGGGGCGAGGGAGACAGGGG CGCAGGAGTCAGGCAAAGGCGATGCGGGGGTGCGACTACACG- CAGTTGGAAACAGTCGTCA- GAAGATTCTGGAAACTATCTTGCTGGCTATAAACTTGAGGGAAGC AGAAGGCCAACATTCCTCCCAAGGGAAACTGAGGCTCAGAGT- TAAAACCCAGGTATCAGTGA- TATGCATGTGCCCCGGCCAGGGTCACTCTCTGACTAACCGGTACC TACCCTACAGGCCTACCTAGAGACTCTTTTGAAAGGATGGTAGA- GACCTGTCCGGGCTTTG- CCCACAGTCGTTGGAAACCTCAGCATTTTCTAGGCAACTTGTGCG AATAAAACACTTCGGGGGTCCTTCTTGTTCATTCCAATAACC- TAAAACCTCTCCTCGGA- GAAAATAGGGGGCCTCAAACAAACGAAATTCTCTAGCCCGCTTTC CCCAGGATAAGGCAGGCATCCAAATGGAAAAAAAGGGGCCGG- CCGGGGGTCTCCTGTCAG- CTCCTTGCCCTGTGAAACCCAGCAGGCCTGCCTGTCTTCTGTCCT CTTGGGGCTGTCCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGG- CCTCCCCGCCCCCTCG- CCTGTGGCCGCCCTTTTCCTGGCAGGACAGAGGGATCCTGCAGC TGTCAGGGGAGGGGCGCCGGGGGGTGATGTCAGGAGGGCTA- CAAATAGTGCAGACAGC- TAAGGGGCTCCGTCACCCATCTTCACATCCACTCCAGCCGGCTGC CCGCCCGCTGCCTCCTCTGTGCGTCCGCCCAGCCAGCCTCG- TCCACGCCAAGCTTGCGGCCG- CATTAAACGCCACCATGTCCCGCTTGGATAAGAGCAAGGTAATAA ATAGCGCACTCGAACTCCTCAACGGCGTGGGCATCGAAGG- TCTGACTACTCGAAAGCTCG- CCCAGAAATTGGGTGTGGAGCAACCTACATTGTATTGGCATGTCA AGAACAAAAGAGCCCTGCTGGACGCTCTTCCTATTGAAATG- CTTGACAGGCATCACACT- CATTCCTGCCCCCTTGAGGTCGAGAGTTGGCAAGATTTTCTCCGA AACAATGCAAAGTCCTACCGCTGCGCACTTTTGTCCCATAGGGA- TGGAGCAAAAGTGCAC- CTGGGAACCAGGCCAACAGAGAAACAATACGAGACTCTCGAGAA CCAGTTGGCTTTCTTGTGCCAACAGGGGTTCTCACTTGAAAATG- CCCTTTACGCACTGTCAG- CCGTTGGACATTTTACCCTGGGGTGCGTTCTTGAGGAGCAAGAAC ATCAGGTTGCTAAGGAGGAGCGCGAGACTCCAACCACTGATTC- TATGCCACCTTTGCTGAAA- CAGGCCATTGAACTTTTCGATAGACAGGGTGCTGAACCTGCCTTT CTCTTCGGGTTGGAGCTGATTATTTGTGGTCTCGAAAAACAG- CTGAAATGTGAAAGTGGTGG- CCCTACTGACGCCCTCGATGATTTCGACCTGGATATGCTGCCAGC CGATGCACTTGATGATTTCGATTTGGATATGCTTCCAGCCGACG- CACTGGACGACTT- CGATTTGGACATGCTTCCCGGTTAAACTAGTCTAGCAATCAACCTC TGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATG- TTGCTCCTTTTACGCTA- TGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCC GTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTT- CTTGCCACGGCGGAACT- CATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGT TGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTTATTTGTGAAATTTGTGATG- CTATTGCTTTATTTG- TAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTAT TTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTG- CATTCATTTTATGTTT- CAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGGGGATC CAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGA- TAAGTAGCATGGCGGGTTAA- TCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCT CTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGG- TCGCCCGACGCCCGGG- CTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTA ATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG- GAAAACCCTGGCGTTAC- CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCG TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG- CGCAGCCTGAATGGCGAA- TGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG- CCCGCTCCTTTCGCTTT- CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC TCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT- TACGGCACCTCGAC- CCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT- CTTTAATAGTGGAC- TCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAGCTGATTTAA- CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTC AGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTT- TATTTTTCTAAATACATT- CAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCA ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTG- TCGCCCTTATT- CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACATCGAACTG- GATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG- CGGTATTATCCCGTATTGA- CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACG- GATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00509] pAAV2_CMV_rtTA(V16) (SEQ ID NO: 31): AAATTG- TAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAAT- CAGCT-
CATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATC AAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAA- CAAGAGTCCACTAT- TAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATC AGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAG- TTTTTTGGGGTCGAGGTGCCG- TAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGC TTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGA- AGAAAGCGAAAGGAGCGGGCG- CTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACC ACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGG- TTGCTTTGACGTATGCGG- TGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG CGCCCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCG- CCCGGGCAAAGCCCGGGCG- TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTG- CGGCCGCTCGGTCCG- CACGATCTCAATTCGGCCATTACGGCCGGATCCGGCTCGAGGAG CTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATT- TATATTGGCTCATG- TCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAAT AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAG- TTCCGCGTTACATAACT- TACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCC CATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATA- GGGACTTTCCATTGACGT- CAATGGGTGGAGTATTTACGCTAAACTGCCCACTTGGCAGTACAT CAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGA- CGGTAAATGGCCCG- CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATG- CGGTTTTGGCAGTACATCA- ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCC ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAAT- CAACGGGACTTTCCAAAATG- TCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTG TACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGT- CAGATCGCCTGGAGACG- CCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATC CAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCACCATGTCTAGACTGGA- CAAGAGCAAAATCATAAACAGCG- CTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAA GGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTAC- TGGCACGTGAAGAACAAG- CGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCA TCATACCCACAGCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGAC- TTTCTGCGGAACAACG- CCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGGGGCTA AAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAAC- CCTGGAAAATCAGCTCGCG- TTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCT CTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGA- ACAGGAGCATCAAGTAG- CAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCAC TTCTGAAGCAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAG- CCGAACCTGCCTTCCTTTTCGG- CCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGA AAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACA- TGCTCCCAGCCGATG- CCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTG ACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAACTAAGTAAGGAT- CATCTTAATTAAATCGA- TAAGGATCTGGCCGCCTCGGCCTAATCAACCTCTGGATTACAAAA TTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTT- TACGCTATGTGGATACG- CTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTT CATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG- GAGTTGTGGCCCGTTG- TCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACC CCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGG- GACTTTCGCTTT- CCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTG CCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATT- CCGTGGTGTTGTCGGGGAAA- TCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATT CTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAA- TCCAGCGGACCTTCCTTCCCG- CGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTC GCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCA- GACATGATAAGATACA- TTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATG CTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTA- TAAGCTGCAATAAA- CAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGG GGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAA- TGTGGTAACTAGCGCGTG- CGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCT GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCG- CCCGACGCCCGGGCTTTG- CCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCA GGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCG- TAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCG- TTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGA CGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA- CCAGGCGTTTCCCCCTG- GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCG GATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCT- CATAGCTCACGCTGTAGG- TATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTG CACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGG- TAACTATCGTCTTGAG- TCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACT GGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACA- GAGTTCTTGAAGTGGTGGCC- TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCT GCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAG- CTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCG- CTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG- TCTGACGCTCAGTGGA- ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAG GATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAA- TCTAAAGTATATA- TGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA CCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGAC- TCCCCGTCGTGTAGA- TAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAA TGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCA- ATAAACCAGCCAGCCGGA- AGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCAT CCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCG- CCAGTTAATAGTTTGCG- CAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTC GTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG- CGAGTTACA- TGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCT CCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACT- CATGGTTATGGCAGCACTGCA- TAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACT GGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGA- CCGAGTTGCTCTTG- CCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTT AAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCT- CAAGGATCTTACCGCTG- TTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTT CAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAG- GAAGGCAAAATGCCG- CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAC TCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCT- CATGAGCGGATACATA- TTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACAT TTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTAT- CATGACATTAACCTA- TAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGG TGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGG- TCACAGCTTGTCTGTAAG- CGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGG TGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAG- CAGATTGTACTGAGAGTGCACCATA
[00510] CAG-tTA (SEQ ID NO: 32): CCTGCAGGCAGCTGCGCG- CTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG-
TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTG- CGGCCGCACGCGTGGAGCTAG- TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATA TGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGG- CTGACCGCCCAACGAC- CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACG TCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGG- TAAACTGCCCACTTGG- CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGT CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGA- CCTTATGGGACTTTCC- TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTG ATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGA- CTCACGGGGATTTCCAAG- TCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG- CAAATGGGCGGTAGGCG- TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATA- GAAGACACCGGGAC- CGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCA TTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCC- TATAGAGTCTATAGG- CCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTA TTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATA- CAATGTATCATG- CCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTA AGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAA- TTGTAACTGATG- TAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATT CTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAG- TCCAAGCTAGGCCCTTTTG- CTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCA ACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAA- TTGGGATTCGAACA- TCGATTGAATTCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACT CTGCTCTGGAATTACTCAATGAAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGA- CAAGGAAACTCGCT- CAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAA GAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGGCAATCGAGATGCTG- GACAGGCATCATACCCAC- TTCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAAC AACGCCAAGTCATTCCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGA- CGGGGCTAAAGTGCATCTCGG- CACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCT CGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTG- TACGCTCTGTCCGCCG- TGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGATCAGGAGCATC AAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATG- CCCCCACTTCTGAGA- CAAGCAATTGAGCTGTTCGACCATCAGGGAGCCGAACCTGCCTTC CTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGC- TAAAGTGCGAAAGCGG- CGGGCCGGCCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCC CAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTG- CTGACGCTCTTGA- CGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGATGAGGATCCTCTAGAGT CGACCTGCAGAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATC- TACGGGTGGCATCCCTG- TGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCC AGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTG- TCTGACTAGGTG- TCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAG GGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTA- TTGGGAACCAAGCTGGAGTG- CAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTC AAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCA- GGCATGCATGACCAGGCT- CAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTG GCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCAC- CTTGGCCTCCCAAATTG- CTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTG ATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAAC- CCCTAGTGATGGAGTTGG- CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGA CCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGCAG- CTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCT GTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACG- CGCCCTGTAGCGGCGCAT- TAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACA CTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTT- CCTTTCTCGCCACGTTCG- CCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGT TCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAAC- TTGATTTGGGTGATGGTTCACG- TAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTT GGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAA- CAACACTCAACCCTA- TCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAA- TTTTAACAAAATAT- TAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGA TGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCG- CTGACGCGCCCTGACGGG- CTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCT CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCAC- CGAAACGCGCGAGACGAAAGGG- CCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATG GTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCG- GAACCCCTATTTGTTTA- TTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC CTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT- CAACATTTCCGTGTCG- CCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCAC CCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGG- TGCACGAGTGGGTTACA- TCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCC CCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA- TGTGGCGCGGTATTA- TCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACA CTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACA- GAAAAGCATCTTACGGATGG- CATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGA TAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGAC- CGAAGGAGCTAACCG- CTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTG GGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACA- CCACGATGCCTGTAGCAA- TGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCT AGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAG- TTGCAGGACCACTTCTG- CGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGA GCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGG- CCAGATGGTAAGCCCTCCCG- TATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAG- CATTGGTAACTGTCAGAC- CAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAA TTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC- CAAAATCCCTTAACG- TGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTG- CAAACAAAAAAACCAC- CGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTC TTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATA- CTGTCCTTCTAGTGTAG- CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACA TACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG- CGATAAGTCGTGTCTTAC- CGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGT CGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAG- CGAACGACCTACACCGAAC- TGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCG AAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCG- GAACAGGAGAGCGCACGAGG- GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGG TTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA- GGGGGGCGGAGCCTATG- GAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTG CTGGCCTTTTGCTCACATGT
[00511] pAAV-Tet-O-OSK-SV40LpA (ou pAAV-TRE2-OSK-
SV40LpA) (SEQ ID NO: 33): TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAG- TGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCGTACACGCCTACCTCGACCCATCAAGTGCCACCTGA- CGTCTCCCTATCAGTGA- TAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAG GTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGTCGACACG- TCTCGAGCTCCCTATCA- GTGATAGAGAAGGTACGTCTAGAACGTCTCCCTATCAGTGATAGA GAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTGATAGAGAAGG- TACGTCTAGAACGTCTCCC- TATCAGTGATAGAGAAGTCGACACGTCTCGAGCTCCCTATCAGTG ATAGAGAAGGTACCCCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAAC- CGTCAGATCGCCTGGAGA- CGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGA TCCAGCCTGGATCGCGGCCGCGCCACCATGGCTGGACACCTGG- CTTCAGACTTCGCCTTCT- CACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCC GGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGG- CCTCCAGGTGGGCCTGGAATCG- GACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATGTCCGCCCGCA TACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTG- GACTGGGCCTAG- TCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCA GGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAG- CCCTGTGCCGACCGCCCCAA- TGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCC AGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAG- CTGCTGAAGCAGAAGAG- GATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGG GCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCG- CTTCGAGGCCTTGCAGCT- CAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGT GGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATATG- CAAATCGGAGACCCTGGTG- CAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGTGTGAG GTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCC- TACAGCAGATCACTCACA- TCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGT TCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATT- CCCAACGAGAAGAGTA- TGAGGCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTC CTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTTGGCACCCCAGGCTATGGAAG- CCCCCACTTCACCACACTC- TACTCAGTCCCTTTTCCTGAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCC GTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAG- CGGCGCCACGAACTT- CTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCC TGCATGCATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCG- CCGGGCCCGCAGCAAGCTT- CGGGGGGCGGCGGCGGAGGAGGCAACGCCACGGCGGCGGCGA CCGGCGGCAACCAGAAGAACAGCCCGGACCGCGTCAAGAGG- CCCATGAACGCCTTCATGGTA- TGGTCCCGGGGGCAGCGGCGTAAGATGGCCCAGGAGAACCCCA AGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCGGAGTG- GAAACTTTTGTCCGAGAC- CGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTGCGCGCT CTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCGCGGCG- GAAAACCAAGACGCT- CATGAAGAAGGATAAGTACACGCTTCCCGGAGGCTTGCTGGCCC CCGGCGGGAACAGCATGGCGAGCGGGGTTGGGGTGGGCG- CCGGCCTGGGTGCGGGCGTGAAC- CAGCGCATGGACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGG CAGCTACAGCATGATGCAGGAGCAGCTGGGCTACCCGCAGCAC- CCGGGCCTCAACGCT- CACGGCGCGGCACAGATGCAACCGATGCACCGCTACGACGTCAG CGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACA- TGAACGGCTCGCCCACCTACA- GCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCCGGTATGGCGCTGGGC TCCATGGGCTCTGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAG- CCCCCCCGTGGTTACCTCTT- CCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGA CATGATCAGCATGTACCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAG- CCCGCTGCGCCCAGTAGACTG- CACATGGCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGG CCATTAACGGCACACTGCCCCTGTCGCACATGGCATGCGG- CTCCGGCGAGGGCAGGGGAAG- TCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCACTCG AGATGAGGCAGCCACCTGGCGAGTCTGACATGGCTGTCAGCGA- CGCTCTGCTCCCGTCCTT- CTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTG CGTCCAGCAGGTGCCCCGACTAACCGTTGGCGTGAGGAAC- TCTCTCACATGAAGCGACTT- CCCCCACTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGACGGTGG CCACAGACCTGGAGAGTGGCGGAGCTGGTGCAGCTTGCAGCAG- TAACAACCCGGCCCTCC- TAGCCCGGAGGGAGACCGAGGAGTTCAACGACCTCCTGGACCTA GACTTTATCCTTTCCAACTCGCTAACCCACCAGGAATCGGTGG- CCGCCACCGTGACCAC- CTCGGCGTCAGCTTCATCCTCGTCTTCCCCAGCGAGCAGCGGCC CTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAGCTA- TCCGATCCGGGCCGGGGGTGACCCGGG- CGTGGCTGCCAGCAACACAGGTGGAGGGCTCCTCTACAGCCGAG AATCTGCGCCACCTCCCACGGCCCCCTTCAACCTGGCGGACAT- CAATGACGTGAG- CCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCTGAGCTCCTGCGGCCGGAGTTG GACCCAGTATACATTCCGCCACAGCAGCCTCAGCCGCCAGGTGG- CGGGCTGATGGGCAAG- TTTGTGCTGAAGGCGTCTCTGACCACCCCTGGCAGCGAGTACAG CAGCCCTTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAGGAAGCCCAGACGGCA- GCCACCCCGTGGTAGTGG- CGCCCTACAGCGGTGGCCCGCCGCGCATGTGCCCCAAGATTAAG CAAGAGGCGGTCCCGTCCTGCACGGTCAGCCGGTCCCTAGAGG- CCCATTTGAGCGCTGGAC- CCCAGCTCAGCAACGGCCACCGGCCCAACACACACGACTTCCCC CTGGGGCGGCAGCTCCCCACCAGGACTACCCCTACACTGAG- TCCCGAGGAACTGCTGAACAG- CAGGGACTGTCACCCTGGCCTGCCTCTTCCCCCAGGATTCCATCC CCATCCGGGGCCCAACTACCCTCCTTTCCTGCCAGACCAGATG- CAGTCACAAG- TCCCCTCTCTCCATTATCAAGAGCTCATGCCACCGGGTTCCTGCC TGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGAAGGTCGTGG- CCCCGGAAAAGAACAGCCAC- CCACACTTGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAAACCTATACCAAGAG TTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGAACTCACACAGGCGAGAAAC- CTTACCACTGTGACTGG- GACGGCTGTGGGTGGAAATTCGCCCGCTCCGATGAACTGACCAG GCACTACCGCAAACACACAGGGCACCGGCCCTTTCAGTGCCA- GAAGTGCGACAGGGCCTTTT- CCAGGTCGGACCACCTTGCCTTACACATGAAGAGGCACTAAATGA CTAGTCTAGCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGA- TTGACTGGTATTCTTAAC- TATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTT TGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTT- CTCCTCCTTGTATAAATCCTGGT- TAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCT GCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGG- TGTTTATTTGTGAAATTTG- TGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTCTAGCTTTATTTGTGAAAT TTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAA- CAAGTTAACAACAACA- ATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGG TTTTTTAAAGCGGGGGATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCC- TAGAGCATGGCTACGTAGA- TAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGT GATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCAC- TGAGGCCGGGCGACCAAAGG- TCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTT- TACAACGTCGTGACTGG- GAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCC CCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCG- CCCTTCCCAACAGTTGCG- CAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAA GCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC- TTGCCAGCGCCCTAGCG- CCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCG GCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTT- CCGATTTAGTGCTTTACGG- CACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGT GGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGA- GTCCACGTTCTTTAATAG- TGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTC TATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAG- CTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTT TATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC- CCCTATTTGTTTATTTTTC- TAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGAT AAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACA- TTTCCGTGTCGCCCT- TATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCA GAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACA- TCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCC CCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA- TGTGGCGCGGTATTA- TCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACA CTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACA- GAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00512] VP64, 4 repetições de VP16 (SEQ ID NO: 34) (Exemplo não limitante de um domínio de transativação): GAGGCCAGCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGA- CGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAG-
TGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGC CCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACG- CCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCTAGA
[00513] P65 (SEQ ID NO: 35) (Exemplo não limitante de um domínio de transativação): AGCCAGTACCTGCCCGACACCGACGACCGG- CACCGGATCGAGGAAAAGCGGAAGCGGACC-
TACGAGACATTCAAGAGCATCATGAAGAAGTCCCCCTTCAGCGGC CCCACCGACCCTAGACCTCCACCTAGAAGAATCGCCGTGCCCAG- CAGATCCAGCGCCAGCG- TGCCAAAACCTGCCCCCCAGCCTTACCCCTTCACCAGCAGCCTGA GCACCATCAACTACGACGAGTTCCCTACCATGGTGTTCCCCAG- CGGCCAGATCTCTCAGG- CCTCTGCTCTGGCTCCAGCCCCTCCTCAGGTGCTGCCTCAGGCT CCTGCTCCTGCACCAGCTCCAGCCATGGTGTCTGCACTGGCTCA- GGCACCAGCACCCGTG- CCTGTGCTGGCTCCTGGACCTCCACAGGCTGTGGCTCCACCAGC CCCTAAACCTACACAGGCCGGCGAGGGCACACTGTCTGAAG- CTCTGCTGCAGCTGCAGTT- CGACGACGAGGATCTGGGAGCCCTGCTGGGAAACAGCACCGATC CTGCCGTGTTCACCGACCTGGCCAGCGTGGACAACAGCGAGTT- CCAGCAGCTGCTGAACCA- GGGCATCCCTGTGGCCCCTCACACCACCGAGCCCATGCTGATGG AATACCCCGAGGCCATCACCCGGCTCGTGACAGGCGCTCA- GAGGCCTCCTGATCCAG- CTCCTGCCCCTCTGGGAGCACCAGGCCTGCCTAATGGACTGCTG TCTGGCGACGAGGACTTCAGCTCTATCGCCGATATGGATTTCTCA- GCCTTGCTG
[00514] RTA (SEQ ID NO: 36) (Exemplo não limitante de um domínio de transativação): CGGGATTCCAGGGAAGGGATGTTTTTGCCGAAGCCTGAGG- CCGGCTCCGCTATTAGTGACG- TGTTTGAGGGCCGCGAGGTGTGCCAGC CAAAACGAA TCCGG- CCA TTTCATCCTCCAGGAAGTCCATGGGCCAACCGCCCAC- TCCCCGCCAGCCTCGCACCAACAC-
CAACCGGTCCAGTACATGAGCCAGTCGGGTCACTGACCCCGGCA CCAGTCCC TCAGCCACTGGATCCAGCGCCCGCAGTGAC- TCCCGAGGCCAGTCACCTGTTGGAGGA- TCCCGATGAAGAGACGAGCCAGGCTGTCAAAGCCCTTCGGGAGA TGGCCGATACTGTGATTCCCCAGAAGGAA GAGGCTGCAA TCTG- TGGCCAAA TGGACCTTTCCCA TCCGCCCCCAAGGGGCCA TCTGGA TGAGCT GACAACCACACTTGAGTCCA TGACCGAGGA- TCTGAACCTGGACTCACCCCTGACCCCGGAATTGAACGAGATT- CTGGATAC- CTTCCTGAACGACGAGTGCCTCTTGCATGCCATGCATATCAGCAC AGGAC TGTCCA TCTTCGACACA TCTCTGTTT
[00515] MPH MS2-P65-HSF1 (SEQ ID NO: 37) (Exemplo não limi- tante de um domínio de transativação): GCTTCAAACTTTACTCAG- TTCGTGCTCGTGGACAATGGTGGGACAGGGGATGTGACAG-
TGGCTCCTTCTAATTTCGCTAATGGGGTGGCAGAGTGGATCAGCT CCAACTCACGGAGCCAGGCC- TACAAGGTGACATGCAGCGTCAGGCAGTCTAGTGCCCAGAA- GAGAAAGTATACCATCAAGGTGGAGGTCCCCAAAGTGGCTACCCA GACAGTGGGCGGAGTCGAACTGCCTGTCGCCGCTTGGAGGTCC- TAC- CTGAACATGGAGCTCACTATCCCAATTTTCGCTACCAATTCTGACT GTGAACTCATCGTGAAGGCAATGCAGGGGCTCCTCAAAGACGG- TAATCC- TATCCCTTCCGCCATCGCCGCTAACTCAGGTATCTACAGCGCTGG AGGAGGTGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAG- GAGGTAGCGGACCTAAGAAAAAGAG- GAAGGTGGCGGCCGCTGGATCCCCTTCAGGGCAGATCAGCAACC AGGCCCTGGCTCTGGCCCCTAGCTCCGCTCCAG- TGCTGGCCCAGACTATGGTGCCCTCTAG- TGCTATGGTGCCTCTGGCCCAGCCACCTGCTCCAGCCCCTGTGC TGACCCCAGGACCACCCCAGTCACTGAGCGCTCCAG- TGCCCAAGTC- TACACAGGCCGGCGAGGGGACTCTGAGTGAAGCTCTGCTGCACC TGCAGTTCGACGCTGATGAGGACCTGGGAGCTCTGCTGGG- GAACAGCACCGATCCCGGAG- TGTTCACAGATCTGGCCTCCGTGGACAACTCTGAGTTTCAGCAGC TGCTGAATCAGGGCGTGTCCATGTCTCATAGTACAGCCGAAC- CAATGCTGATGGAG- TACCCCGAAGCCATTACCCGGCTGGTGACCGGCAGCCAGCGGCC CCCCGACCCCGCTCCAACTCCCCTGGGAAC- CAGCGGCCTGCCTAATGGGCTGTCCGGA- GATGAAGACTTCTCAAGCATCGCTGATATGGACTTTAGTGCCCTG CTGTCACAGATTTCCTCTAGTGGGCAGGGAGGAGGTGGAA- GCGGCTTCAGCGTGGACACCAG- TGCCCTGCTGGACCTGTTCAGCCCCTCGGTGACCGTGCCCGACA TGAGCCTGCCTGACCTTGACAGCAGCCTGGCCAGTATCCAA- GAGCTCCTGTCTCCCCAG- GAGCCCCCCAGGCCTCCCGAGGCAGAGAACAGCAGCCCGGATTC AGGGAAGCAGCTGGTGCACTACACAGCG- CAGCCGCTGTTCCTGCTGGACCCCGGCTCCGTG- GACACCGGGAGCAACGACCTGCCGGTGCTGTTTGAGCTGGGAGA GGGCTCCTACTTCTCCGAAGGGGACGGCTTCGCCGAG- GACCCCAC- CATCTCCCTGCTGACAGGCTCGGAGCCTCCCAAAGCCAAGGACC CCACTGTCTCC
[00516] OCT4-2A-SOX2-2A-KLF4 (Exemplo não limitante de se- quência de ácido nucleico codificando OCT4 humano, SOX2 humano e KLF4 humano, cada qual separada por um peptídeo 2A) (SEQ ID NO: 38): ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGAT- TTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTG-
GAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCC TCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAG- GAATCGGGCCGGGGGTT- GGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGC CGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT- GGAGTGGGGCTAG- TGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCA GGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCG- GAGCCCTGCAC- CGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGC AAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAA- GAACTCGAGCAATTTGCCAA- GCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCG ATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGG- GAAGGTATTCAGCCAAACGAC- CATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTG TAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA- GCTGACAACAATGAAAATCTTCAG- GAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAA GCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGA- GAATTTGTTCCTGCAG- TGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCA GCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC- CGGCGCCAGAAGGGCAA- GCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTG CTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAG- TGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGG- TACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTC GGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAA- GCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCAC- TCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCA CGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAA- GAAAACCCCGGGCCTG- CATGCATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGC CCGCAGCAAACTTCGGGGGGCGGCGGCGGCAACTCCAC- CGCGGCGGCGGCCGGCGGCAAC- CAGAAAAACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTT CATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGCAAGATGGCCCAGGA- GAACCCCAA- GATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGA AACTTTTGTCGGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGAC- GAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTG- CACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAA AACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACAC- GCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCG AGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAAC- CAGCGCATGGACAGTTAC- GCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCA GGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCAC- GGCGCAGCG- CAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTA CAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAAC- GGCTCGCCCACCTACAGCATGTCC- TACTCGCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGG TTCGGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTA CCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGAC- CTCCGGGACATGATCAG- CATGTATCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCA GCAGACTTCACATGTCCCAGCACTAC- CAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGG- CACACTGCCCCTCTCACACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCA GGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAG- GAAAATCCCGGCCCACTCGA- GATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCGC GTCTGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCAA- GCAGGTGCCCCGAATAAC- CGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGT GCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGGCGGCGGCGAC- CGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCG- GAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCT CGGAGAGAGACCGAGGAGTTCAACGATCTCCTGGACCTG- GACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTG GCCGCCAC- CGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCGTCGA GCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCAC- CTATCCGATCCGGGCCGGGAAC- GACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGGCCTCCTCT ATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAAC- CTGGCGGACATCAACGAC- GTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCAG AATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCG- CAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGG- CAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAGT ACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAG- CAAAGGCAGCCCTGACGG- CAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCG CGCACGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTG- CACCCACTTGGGCGCTG- GACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTC CCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGAC- TACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAG- CAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCC ATCCCCACCCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGA TGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAA- GAGCTCATGCCACCCGGTTCCTG- CATGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGC CCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTAC- GCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAA- GAGTTCCCATCTCAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAA ACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTG- GATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGAC- CAGGCACTACCGTAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCC AAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCAC- CTCGCCTTACACATGAAGAGGCATTTT
[00517] OCT4-2A-SOX2-2A-KLF4 (Exemplo não limitante de uma sequência de aminoácido codificando OCT4 humano, SOX2 humano e KLF4 humano, cada qual separada por um peptídeo 2A) (SEQ ID NO: 39): MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGG- PEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVW-
GIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGV ESNSDGASPEPCTVTPGAVKLE- KEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGV LFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNEN- LQEICKAETLVQARKRKRT- SIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRR QKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYG- SPHFTALYS- SVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSNASGSGATNFSLLKQAGDVEEN PGPACMYN- MMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNA FMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRP- FIDEAKRLRALHMKE- HPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGL GAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAA QMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPG- MALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPG AEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHMAC- GSGEGRGSLLTCGDVEENPG- PLEMAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMK RLPPVLPGRPYDLAAATVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPR- RETEEFNDLLDLDFILS- NSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAG NDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAP- FNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVL KASLSAPGSEYGSPSVISVSKG- SPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAG- PPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPP GFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCM- PEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTC- DYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDEL TRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF
[00518] Sequência de ácido nucleico de OCT4 humano (Exemplo não limitante de uma sequência de ácido nucleico codificando OCT4 humano) (SEQ ID NO: 40): ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCG- CCCCCTCCAGGTGGTGGAGG-
TGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGG ACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAA- TCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGG- CTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGT TCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAG- TGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGG- CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGG AGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCAC- CCCTGGTGCCGTGAAGCTG- GAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACAT CAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAG- CTCCTGAAGCAGAAGAGGATCAC- CCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTC TATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGG- CTCTGCAGCTTAGCTT- CAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGG AGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCA- GAAACCCTCGTGCAGG- CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGC AACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCA- GCAGATCAGCCACATCG- CCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTC TGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATG- CACAACGAGAGGA- TTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTT TCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGA- GCCCTCACTTCACTGCAC- TGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTG TCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC
[00519] Sequência de aminoácido OCT4 humano (Exemplo não limi- tante de uma sequência de aminoácido codificando OCT4 humano) (SEQ ID NO: 41): MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQG- PPGGPGIGPGVG-
PGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEG EAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKAL- QKELE- QFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFK NMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIEN- RVRGNLENLFLQCPK- PTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEA AGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEA- FPPVSVTTLGSPMHSN
[00520] Sequência de ácido nucleico SOX2 humano (Exemplo não limitante de uma sequência de ácido nucleico codificando SOX2 hu- mano) (SEQ ID NO: 42): ATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCG- CAGCAAACTTCGGGGGGCGG-
CGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAA AACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGG- TGTGGTCCCGCGGGCAG- CGGCGCAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGA GATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGA- CGGAGAAGCGGCCGTT- CATCGACGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGC ACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCT- CATGAAGAAGGATAAGTA- CACGCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATG GCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCG- TGAACCAGCGCATGGACAGT- TACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGAT GCAGGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCG- CACGGCGCAGCGCAGATG- CAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTC CATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACA- GCATGTCCTACTCGCAG- CAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGT CAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTT- CCTCCCACTCCAGGGCG- CCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCT CCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTT- CACATGTCCCAGCACTAC- CAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGC CCCTCTCACACATG
[00521] Sequência de aminoácido SOX2 humana (Exemplo não limi- tante de uma sequência de aminoácido codificando SOX2 humano) (SEQ ID NO: 43): MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSP- DRVKRPMNAFMVWSRGQRRK-
MAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEH PDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGL- GAGVNQRMDSYAH- MNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSAL QYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEAS- SSPPVVTSSSHS- RAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTA INGTLPLSHM
[00522] KLF4 humano (Exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeo codificando KLF4 humano) (SEQ ID NO: 44): ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCG- CGTCTGGCCCGGCGGGA-
AGGGAGAAGACACTGCGTCAAGCAGGTGCCCCGAATAACCGCTG GCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGTGCTT- CCCGGCCGCCCCTATGAC- CTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCGGAG CCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCTCG- GAGAGAGACCGAGGAGTT- CAACGATCTCCTGGACCTGGACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACC CATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGCCACCGTGTCCTCGTCAGCGT- CAGCCTCCTCTTCGTCG- TCGCCGTCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCA GCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGGAACGACCCGGGCGTGG- CGCCGGGCGGCACGGGCGGA- GGCCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCC CTTCAACCTGGCGGACATCAACGACGTGAGCCCCTCGGGCGG- CTTCGTGGCCGAGCTCCTG- CGGCCAGAATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCA GCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGCG- TCGCTGAGCGCCCCTGGCA- GCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAGCAAAGGCAGC CCTGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGG- CGGGCCGCCGCGCACGTG- CCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTGCACCCACTTGG GCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACA- CGACTTCCCCCTGGGGCGG- CAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGT GCTGAGCAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTT- CCTCCCGGCTTCCATCCCCAC- CCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGATGCAGCC GCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTT- CCTGCATGCCAGAGGAG- CCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGAC CGCCACCCACACTTGTGATTACGCGGGCTGCGGCAAAACCTACA- CAAAGAGTTCCCATCT- CAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAAACCTTACCACTG TGACTGGGACGGCTGTGGATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAAC- TGACCAGGCACTACCG- TAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCCAAAAATGCGACC GAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGG- CATTTT
[00523] KLF4 humano (Exemplo não limitante de uma sequência de aminoácido codificando KLF4 humano) (SEQ ID NO: 45): MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRL- PPVLPGRPYDLAAA-
TVATDLESGGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHP PESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGND- PGVAPGGTGGGLLYGRESA- PPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGL MGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVSKGSPDGSHPVVVAPYNGG- PPRTCPKIKQEA- VSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSR DCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQV- PPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSW- PRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGC GWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALH- MKRHF
[00524] Promotor de RCVRN (recuperina) humano (Exemplo não li- mitante de um promotor de RCVRN (recuperina) humano) (SEQ ID NO: 46): ATTTTAATCTCACTAGGGTTCTGGGAGCACCCCCCCCCACCG- CTCCCGCCCTCCACAAAG-
CTCCTGGGCCCCTCCTCCCTTCAAGGATTGCGAAGAGCTGGTCG CAAATCCTCCTAAGCCACCAGCATCTCGGTCTTCAGCTCACACCA- GCCTTGAGCCCAGCCTG- CGGCCAGGGGACCACGCACGTCCCACCCACCCAGCGACTCCCCA GCCGCTGCCCACTCTTCCTCACTCA
[00525] Promotor de RSV (Exemplo não limitante de um promotor de RSV) (SEQ ID NO: 47):
AATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGG- TAACGATGAGTTAGCAACATG- CCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAA GTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGG- TCTGACATGGATTGGA- CGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCC TAGCTCGATACATAAAC
[00526] Promotor de CMV (Exemplo não limitante de um promotor de CMV) (SEQ ID NO: 48): CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT- TAGTTCATAGCCCATA-
TATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGG CTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACG- TATGTTCCCATAGTAACG- CCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAG- TACGCCCCCTATTGACGT- CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGAC CTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGT- CATCGCTATTACCATGG- TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTG ACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGG- GAGTTTGTTTTGGCAC- CAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATA- TAAGCAGAGCTGGTTTAG- TGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGC
[00527] Promotor de EFS (Exemplo não limitante de um promotor de EFS) (SEQ ID NO: 49):
TCGAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCG- CCCACAGTCCCCGAGAAG- TTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTG GCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCG- CCTTTTTCCCGAGGGTGGGG- GAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTC GCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGG
[00528] Promotor de GRK1 humano (rodopsina cinase) (Exemplo não limitante de um promotor humano) (SEQ ID NO: 50):
[00529] Gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttgga- ggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagca ccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttcgcctggtgctgtgt- cagccccggtctcccaggggcttcccagtggtccccaggaaccctcgacagggcccggtctctct cgtccagcaagggcagggacgggccacaggccaagggc
[00530] Promotor de CRX humano (fator de transcrição homeobox de cones-bastonetes) (Exemplo não limitante de um promotor de CRX humano) (SEQ ID NO: 51):
[00531] Gcctgtagccttaatctctcctagcagggggtttgggggagggaggaggagaaagaaaggg- ccccttatggctgagacacaatgacccagccacaaggagggattaccgggcg
[00532] Promotor de NRL humano (realçador do fator de transcrição do zíper de leucina de retina neural a montante do promotor do terminal TK humano) (Exemplo não limitante de um promotor de NRL humano) (SEQ ID NO: 52):
[00533] Aggtaggaagtggcctttaactccatagaccctatttaaacagcttcggacaggtttaaaca- tctccttggataattcctagtatccctgttcccactcctactcagggatgatagctctaagaggtgttag gggattaggctgaaaatgtaggtcacccctcagccatctgggaactagaatgagtgagagag- gagagaggggcagagacacacacattcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccg agcgaccctgcagcgacccgcttaa
[00534] Promotor de opsina vermelha humana (promotor de hred) (SEQ ID NO: 101):
[00535] Gatccggttccaggcctcggccctaaatagtctccctgggctttcaagagaaccaca- tgagaaaggaggattcgggctctgagcagtttcaccacccaccccccagtctgcaaatcctgacc cgtgggtccacctgccccaaaggcggacgcaggacagtagaagggaacagagaacaca- taaa- cacagagagggccacagcggctcccacagtcaccgccaccttcctggcggggatgggtgggg cgtctgagtttggttcccagcaaatccctctgagccgcccttgcgggctcgcctcaggagca- ggggagcaagaggtgggaggaggaggtctaagtcccaggcccaattaagagatcaggtagtg tagggtttgggagcttttaaggtgaagaggcccgggctgatcccacaggccagtataaagcg- ccgtgaccctcaggtgatgcgccagggccggctgccgtcggggacagggctttccatagc
[00536] Promotor de rodopsina humana (promotor de rho) (SEQ ID NO: 102):
[00537] Agttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaatt- cgcccttaagctagcagatcttccccacctagccacctggcaaactgctccttctctcaaaggccc aaacatggcctcccagactgcaacccccaggcagtcaggccctgtctccacaacctcacag- ccaccctggacggaatctgcttcttcccacatttgagtcctcctcagcccctgagctcctctgggcag ggctgtttctttccatctttgtattcccaggggcctgcaaataaatgtttaatgaacgaa- caagagagtgaattccaattccatgcaacaaggattgggctcctgggccctaggctatgtgtctgg caccagaaacggaagctgcaggttgcagcccctgccctcatggagctcctcctgtcagagga- gtgtggggactggatgactccagaggtaacttgtgggggaacgaacaggtaaggggctgtgtga cgagatgagagactgggagaataaaccagaaagtctctagctgtccagaggacatagcaca- gaggcccatggtccctatttcaaacccaggccaccagactgagctgggaccttgggacagaca agtcatgcagaagttaggggaccttctcctcccttttcctggatggatcctgagtacctt- ctcctccctgacctcaggcttcctcctagtgtcaccttggcccctcttagaagccaattaggccctca gtttctgcagcggggattaatatgattatgaacacccccaatctcccagatgctgattcag- ccaggagcttaggagggggaggtcactttataagggtctgggggggtcagaacccagagtcatc ccctgaattctgca
[00538] Promotor de arrestina de cone de camundongo (promotor de mcar) (SEQ ID NO: 103):
[00539] Ggttcttcccattttggctacatggtctttttttttacctttttggttcctttgg- ccttttggcttttggcttccagggcttctggatcccccccaacccctcccatacacatacacatgtgca ctcgtgcactcaacccagcacaggataatgttcattcttgacctttccacatacatctggc- tatgttctctctcttatctacaataaatctcctccactatacttaggagcagttatgttcttcttctttctttcttt tttttttttttcattcagtaacatcatcagaatcccctagctctggcctacctcctcagtaa- caatcagctgatccctggccactaatctgtactcactaatctgttttccaaactcttggcccctgagct aattatagcagtgcttcatgccacccaccccaaccctattcttgttctctgactcccactaa- tctacacattcagaggattgtggatataagaggctgggaggccagcttagcaaccagagctgga gg
[00540] Promotor de rodopsina cinase humana (promotor de hrk) (SEQ ID NO: 104):
[00541] Gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttgga- ggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagca ccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttagcctggtgctgtgt- cagccccggtctcccaggggcttcccagtggtccccaggaaccctcgacagggcccggtctctct cgtccagcaagggcagggacgggccacaggccaagggc
[00542] OSK-SV40 de TRE-humano (SEQ ID NO: 105):
[00543] TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC- TTACTTCTGA-
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[00544] OSK-SV40 de EFS-humano (SEQ ID NO: 106): TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC- TTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- 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[00545] TRE-Fluc-SV40 (SEQ ID NO: 107):
[00546] TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC-
TTACTTCTGA- CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAG- 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TGGTCTGCCTAAAGGTG- TCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCA GAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTT- TAAGTGTTGTTCCATT- CCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGT GGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTT- CTGAGGAGCCTTCAGGA- TTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTC TTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTA- CACGAAATTGCTTCTGG- TGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGA GGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGA- GACTACATCAGCTATT- CTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAA AGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGG- GAAAACGCTGGGCGTTA- ATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCG GTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAG- GATGGATGGCTACATT- CTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCG TTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGG- CTCCCGCTGAATTGGAA- TCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCA GGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTG- TTGTTTTGGAGCACGGAAA- GACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGT AACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGA- CGAAGTACCGAAAGGTCT- TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAA GGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAACTAGTGCGCG- CAGCGGCCGACCATGG- CCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATA GCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG- TTGTGGTTTG- TCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGG ATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGA- TAAGTAGCATGGCGGGT- TAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTC CCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG- CTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTA ATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG- GAAAACCCTGGCGTTAC- CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCG TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG- CGCAGCCTGAATGGCGAA- TGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG- CCCGCTCCTTTCGCTTT- CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC TCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT- TACGGCACCTCGAC- CCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT- CTTTAATAGTGGAC- TCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAGCTGATTTAA- CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTC AGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTT- TATTTTTCTAAATACATT- CAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCA ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTG- TCGCCCTTATT- CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACATCGAACTG- GATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG- CGGTATTATCCCGTATTGA- CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACG- GATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00547] shRNA contra KDM1a de camundongo (SEQ ID NO: 108):
CACAAGTCAAACCTTTAT
[00548] shRNA contra Tet1-1 humano (SEQ ID NO: 109):
GGACGTAATCCAGAAAGAAGA
[00549] shRNA contra Tet1-2 humano (SEQ ID NO: 110):
TTGTGCCTCTGGAGGTTATAA
[00550] shRNA contra Tet3-1 humano (SEQ ID NO: 111):
GGAAATAAAGGCTGGTGAAGG
[00551] shRNA contra Tet3-2 humano (SEQ ID NO: 112):
GAAAGATGAAGGTCCATATTA
[00552] shRNA contra Tet1-2 de camundongo (SEQ ID NO: 113):
GCAGATGGCCGTGACACAAAT
[00553] shRNA contra Tet1-1 de camundongo (SEQ ID NO: 114):
GCTCATGGAGACTAGGTTTGG
[00554] shRNA contra Tet2 de camundongo e humano (SEQ ID NO: 115):
GGATGTAAGTTTGCCAGAAGC
[00555] shRNA contra Tet3 de camundongo (SEQ ID NO: 116):
GCTCCAACGAGAAGCTATTTG
[00556] shRNA contra sequência de embaralhamento (sem alvo no genoma) (SEQ ID NO: 117):
GTTCAGATGTGCGGCGAGT
[00557] Sequência de aminoácido codificando P2A (SEQ ID NO: 118):
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[00558] Sequência de ácido nucleico codificando P2A (SEQ ID NO: 119): GGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGA-
TGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT
[00559] Sequência de ácido nucleico codificando T2A (SEQ ID NO: 120) GGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACG- TGGAGGAAAATCCCGGCCCA (SEQ ID NO: 120).
[00560] SEQ ID NO: 121: TTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAAC- TTACTTCTGA-
CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAG- CTGAATGAAGCCATAC- CAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAA CGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTT- CCCGGCAACAATTAATAGAC- TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG- TGAGCGTGGGTCTCGCGGTA- TCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA- GACAGATCGCTGAGATA- GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG- GATCTAGGTGAAGA- TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT- CTTGAGATCCTTTTTTT- CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT- CCGAAGGTAACTGGCTTCAG- CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG- CTCTGCTAATCCTGTTAC- CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG- CTGAACGGGGGGTTCGTGCA- CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATAC CTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA- GAAAGGCGGACAGGTA- TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAG CTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT- CGCCACCTCTGAC- TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG- CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA- CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGAC- CGAGCGCAGCGAGTCAG- TGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG- TTTCCCGACTGGAAAGCGGG- CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG- GAATTGTGAGCGGATAA- CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTA ATTAAGGCCTTAATTAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGG- CCGCCCGGGCAAAG- CCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGG- TTCCTTGTAGTTAATGAT- TAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGAT CGGAATTCTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAG- TTTACTCCCTATCAGTGA- TAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGT ATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAG- TTTACTCCCTATCAGTGA- TAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGT ATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTT- TAGGCGTGTACGGTGGG- CGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG GAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCAC- TTCCTACCCTCG- TAAAGCGGCCGCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTT CGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCA- GGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGG- TTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGG CCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTG- TGGGGGATTCCCCCATG- CCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGC CCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGAC- CTCTCAGCCTGAGGG- CGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCC CCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGA- GAAGGAGAAGCTGGAG- CAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGA ACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCAC- CCTGGGATATACACAGG- CCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCA GCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTT- CAAGAACATGTGTAAGCTG- CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGA AAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGG- CCCGAAAGAGAAAGCGAACCA- GTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGC AGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAG- CAGCTTGGGCTCGAGAAG- GATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAA GCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTG- CTGGGTCTCCTTTCTCA- GGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGG TACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTAC- TCCTCGGTCCCTTT- CCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGG GCTCTCCCATGCATTCAAACGCTAGCGGCAGCGGCGCCACGAAC- TTCTCTCTGTTAAAG- CAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTGCATGCATGTA CAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAG- CAAACTTCGGGGGGCGGCGG- CGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAAAAC AGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGGTG- TGGTCCCGCGGGCAGCGGCG- CAAGATGGCCCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCA GCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGACGGA- GAAGCGGCCGTTCATCGA- CGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCG GATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCT- CATGAAGAAGGATAAGTACACG- CTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCGA GCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAAC- CAGCGCATGGACAGTTACGCG- CACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGA CCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCACGG- CGCAGCGCAGATGCAG- CCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCCAT GACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAG- CATGTCCTACTCGCAGCA- GGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGTCA AGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTT- CCTCCCACTCCAGGGCGCCCTG- CCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCTCCCCG GCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACA- TGTCCCAGCACTACCAGAG- CGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCT CACACATGGCATGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTC- TAACATGCGGGGACGTGGAG- GAAAATCCCGGCCCACTCGAGATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCT CCCATCTTTCTCCACGTTCGCGTCTGGCCCGGCGGGAAGGGA- GAAGACACTGCGTCAAGCA- GGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAA GCGACTTCCCCCAGTGCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGG- CGGCGGCGACCGTGGCCACA- GACCTGGAGAGCGGCGGAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCA ACCTGGCGCCCCTACCTCGGAGAGAGACCGAGGAGTT- CAACGATCTCCTGGACCTGGACTT- TATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGC CACCGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCG- TCGAGCAGCGGCCCTGCCA- GCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGG AACGACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGG- CCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCG- CTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGAC GTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCA- GAATTGGACCCGGTGTACA- TTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGG CAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAG- TACGGCAGCCCGTCGGT- CATCAGCGTCAGCAAAGGCAGCCCTGACGGCAGCCACCCGGTGG TGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCGCGCACGTGCCCCAA- GATCAAGCAGGAGGCGG- TCTCTTCGTGCACCCACTTGGGCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATG GCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAG- CTCCCCAGCAGGACTAC- CCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAGCAGCAGGGACTGTC ACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCCATCCCCACCCGGGG- CCCAATTACCCATCCTT- CCTGCCCGATCAGATGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACC AAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCAGAGGAGCCCAAG- CCAAAGAGGGGAAGA- CGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTA CGCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAAGAGTTCCCATCTCAAGG- CACACCTGCGAACCCACA- CAGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGATGG AAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTACCGTAAACA- CACGGGGCACCGCCCGTT- CCAGTGCCAAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCT CGCCTTACACATGAAGAGGCATTTTTAAATGACTAGTGCGCGCAG- CGGCCGACCATGG- CCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATA GCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG- TTGTGGTTTG- TCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGGTACCGG ATCCAAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGA- TAAGTAGCATGGCGGGT- TAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTC CCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG- CTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTA ATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG- GAAAACCCTGGCGTTAC- CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCG TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG- CGCAGCCTGAATGGCGAA- TGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG- CCCGCTCCTTTCGCTTT- CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC TCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTT- TACGGCACCTCGAC- CCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT- CTTTAATAGTGGAC- TCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT- TAAAAAATGAGCTGATTTAA- CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTC AGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTT- TATTTTTCTAAATACATT- CAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCA ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTG- TCGCCCTTATT- CCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG- CACGAGTGGGTTACATCGAACTG- GATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG- CGGTATTATCCCGTATTGA- CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACG- GATGGCATGACAGTAAGAGAA
[00561] Promotor Thy1.2 (específico para RGC) (SEQ ID NO: 122): AATTCAGAGACCGGGAACCAAACTAGCCTTTAAAAAACATAAGTA- CAGGAGCCAGCAAGA-
TGGCTCAGTGGGTAAAGGTGCCTACCAGCAAGCCTGACAGCCTG AGTTCAGTCCCCACGAACTACGTGGTAGGAGAGGACCAACCAAC- TCTGGAAATCTGTTCTG- CAAACACATGCTCACACACACACACACAAATAGTATAAACAATTTT AAATTTCATTTAAAAATAATTTGTAAACAAAATCATTAGCACAGG- TTTTAGAAAGAG- CCTCTTGGTGACATCAAGTTGATGCTGTAGATGGGGTATCATTCCT GAGGACCCAAAACCGGGTCTCAGCCTTTCCCCATTCTGAGAGTT- CTCTCTTTTCTCAGCCAC- TAGCTGAAGAGTAGAGTGGCTCAGCACTGGGCTCTTGAGTTCCCA AGTCCTACAACTGGTCAGCCTGACTACTAACCAGCCATGAAGAAA- CAAGGAGTGGATGGG- CTGAGTCTGCTGGGATGGGAGTGGAGTTAGTAAGTGGCCATGGA TGTAATGACCCCAGCAATGCTGGCTAGAAGGCATGCCTCCTTT- CCTTGTCTGGAGACGGA- ACGGGAGGGATCATCTTGTACTCACAGAAGGGAGAACATTCTAGC TGGTTGGGCCAAAATGTGCAAGTTCACCTGGAGGTGGTGGTG- CATGCTTTTAACTCCAGTAC- TCAGGAGGCAGGGCCAGGTGGATCTCTGTGAGTTCAAGACCAGC CTGCACTATGGAGAGAGTTTTGGGACAGCCAGAGTTACACA- GAAAAATCCTGGTGGAAAA- TCTGAAAGAAAGAGAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGGAAGAAAGA AAGAAAGAGTGGCAGGCAGGCAGGCAGGAGGAAGGAAGGAAG- GAAGGAAGGAAGGAAGGAAG- GAAGGAAGGAAAATAGGTGCGACTTCAAGATCCGGAGTTACAAGC AGAATGCACTGTTTCCCTAACAGGGCCAAGTGTTTTGAGTAAC- TGAAGGTGGGCATGATG- CCTGGGAAGCAGAAACAAGCCAGGCAGATGCACCCCTTGCCTTG CTTCCGAAGGGCTGCAGTAGCATGGAAAACATGGAAAACAACCA- ATCCATTCCCTTTGCTGA- TATAACAGGCTCCAAAGCCAAAACCTGTCACTGGAGGCTCAAGAG CAGATCTCCAGCCAAGAGGCAAAGGAATGGGGGAAGCTGGA- GGGCCTCCCTCTGGTTATCCA- GGCTTCTGAAGGTTCAAGCAAAGAAAGGGTTACAACCTTAAAAGG AGAGCGTCCCGGGGTATGGGTAGAAGACTGCTCCACCCCGAC- CCCCAGGGTCCCTAACCG- TCTTTTCCCTGGGCGAGTCAGCCCAATCACAGGACTGAGAGTGCC TCTTTAGTAGCAGCAAGCCACTTCGGACACCCAAATGGAACAC- CTCCAGTCAGCCCTCG- CCGACCACCCCACCCCCTCCATCCTTTTCCCTCAGCCTCCGATTG GCTGAATCTAGAGTCCCTCCCTGCTCCCCCCTCTCTCCCCAC- CCCTGGTGAAAACTGCGGG- CTTCAGCGCTGGGTGCAGCAACTGGAGGCGTTGGCGCACCAGGA GGAGGCTGCAGCTAGGGGAGTCCAGGTGAGAGCAGGCCGACGG- GAGGGACCCGCACATG- CAAGGACCGCCGCAGGGCGAGGATGCAAGCCTTCCCCAGCTACA GTTTTGGGAAAGGATACCAGGGCGCTCCTATATGGGGGCGCGG- GAACTGGGGAAAGAAGGTG- CTCCCAGGTCGAGGTGGGAGAGGAAGGCAGTGCGGGGTCACGG GCTTTCTCCCTGCTAACGGACGCTTTCGAAGAGTGGGTGCCGGA- GGAGAACCATGAGGAAG- GACATCAAGGACAGCCTTTGGTCCCCAAGCTCAAATCGCTTTAGT GGTGCGAATAGAGGGAGGAGGTGGGTGGCAAACTGGAGGGAG- TCCCCAGCGGGTGACCTCG- TGGCTGGCTGGGTGCGGGGCACCGCAGGTAAGAAAACCGCAATG TTGCGGGAGGGGACTGGGTGGCAGGCGCGGGGGAGGGGAAAG- CTAGAAAGGATGCGAGGGAG- CGGAGGGGGGAGGGAGCGGGAGAATCTCAACTGGTAGAGGAAG ATTAAAATGAGGAAATAGCATCAGGGTGGGGTTAGCCAAG- CCGGGCCTCAGGGAAAGGGCG- CAAAGTTTGTCTGGGTGTGGGCTTAGGTGGGCTGGGTATGAGATT CGGGGCGCCGAAAACACTGCTGCGCCTCTGCCAAATCACGCTAC- CCCTGTATCTAGTTCTG- CCAGGCTTCTCCAGCCCCAGCCCCAATTCTTTTCTCTAGTGTTCC CCCTTCCCTCCCCTGAATCTCAAGCCCACACTCCCTCCTCCA- TAACCCACTGTTATCAAATC- TAAGTCATTTGCCACCCAACAACCATCAGGAGGCGGAAGCAGACG GGAGGAGTTTGAGATCAACTTGGGCTACATCACGAGTTCCAGG- CTCACCAAGGCTTCTTAAG- GAGACCTTGTCTCTAAAATTAATTAATTAATTAATTAATAGTCCCCT TTCTCTGCCACAGAACCTTGGGATCTGGCTCCTGGTCGCAG- CTCCCCCCACCCCAGGCTGA- CATTCACTGCCATAGCCCATCCGGAAATCCTAGTCTATTTCCCCAT GGATCTTGAACTGCAGAGAGAATGGCAGAGTGGCCCGCCCTGTG- CAAAGGATGTTCCTAGCC- TAGGTGGAGCTCGCGAACTCGCAGACTGTGCCTCTCTTGGGCAA GGACAGGCTAGACAGCCTGCCGGTGTGTTGAGCTAGGGCACTG- TGGGGAAGGCAGAGAAC- CTGTGCAGGGCAGCAATGAACACAGGACCAGAAAACTGCAGCCC TAGGAACACTCAAGAGCTGGCCATTTGCAAGCATCTCTGG- CCTCCGTGCTTCTCACTCATG- TCCCATGTCTTATACAGGCCTCTGTGGCACCTCGCTTGCCTGATC TCATCCCTAGCCGTTAAGCTTTCTGCATGACTTATCACTTGGGG- CATAATGCTGGATACC- TACCATTTTCTTAGACCCCATCAAAATCCTATTTGAGTGTACGGTT CGGAGAACCTCATTTATCCGGTAAATGTCTTTTACTCTGCTCTCA- GGGAGCTGAGGCAGGA- CATCCTGAGATACATTGGGAGAGGAGATACAGTTTCAATAAAATAA TAGGTTGGGTGGAGGTACATGCCTATAATGCCACCACTCAGGAA- ATGGTGGCAGCTTCG- TGAGTTTGAGGCCAACCCAAGAAACATAGTGAAACCCTGTCAGTA AATAAGTAAGCAAGTATTTGAGTATCTACTATATGCTAGGGCTGA- CCTGGACATTAGGGGT- CATCTTCTGAACAAACTAGTGCTTGAGGGAGGTATTTGGGGTTTTT GTTTGTTTAATGGATCTGAATGAGTTCCAGAGACTGGCTACACAG- CGATATGACTGAGCT- TAACACCCCTAAAGCATACAGTCAGACCAATTAGACAATAAAAGGT ATGTATAGCTTACCAAATAAAAAAATTGTATTTTCAAGAGAGTG- TCTGTCTGTGTAG- CCCTGGCTGTTCTTGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTGGA AATCCATCTGCCTGCCTCTGCCTCTCTGCCTCTCTGCCTCTCTG- CCTCTCTCTCTG- CCTCTCTCTGCCTCTCTCTGCCCCTCTCTGCCCCTCTCTGCCCCT CTCTGCCGCCCTCTGCCTTTTGCCCTCTGCCCTCTGTTCTCTGG- CCTCTGCCCTCTG- CCCTCTGGCCTCTGGCCTCTGCCTCTGCCTCTTGAGTGCTGGAAT CAAAGGTGTGAGCTCTGTAGGTCTTAAGTTCCAGAAGAAAGTAA- TGAAGTCACCCAGCAGG- GAGGTGCTCAGGGACAGCACAGACACACACCCAGGACATAGGCT CCCACTTCCTTGGCTTTCTCTGAGTGGCAAAGGACCTTAGGCAG- TGTCACTCCC- TAAGAGAAGGGGATAAAGAGAGGGGCTGAGGTATTCATCATGTGC TCCGTGGATCTCAAGCCCTCAAGGTAAATGGGGACCCACCTG- TCCTACCAGCTGGCTGAC- CTGTAGCTTTCCCCACCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTGGCAC CTAGAGGATCTCGAGGTCCTTCCTCTGCAGAGGTCTTGCTT- CTCCCGGTCAGCTGAC- TCCCTCCCCAAGTCCTTCAAATATCTCAGAACATGGGGAGAAACG GGGACCTTGTCCCTCCTAAGGAACCCCAGTGCTGCATGCCAT- CATCCCCCCCACCCTCG- CCCCCACCCCCGCCACTTCTCCCTCCATGCATACCACTAGCTGTC ATTTTGTACTCTGTATTTATTCCAGGGCTGCTTCTGATTATTTAG- TTTGTTCTTTCCCTGGA- GACCTGTTAGAACATAAGGGCGTATGGTGGGTAGGGGAGGCAGG ATATCAGTCCCTGGGGCGAGTTCCTCCCTGCCAACCAAGCCAGA- TGCCTGAAAGAGATATG- GATGAGGGAAGTTGGACTGTGCCTGTACCTGGTACAGTCATACTC TGTTGAAAGAATCATCGGGGAGGGGGGGGGGCTCAAGAGGGGA- GAGCTCTGCTGAGCCTTTG- TGGACCATCCAATGAGGATGAGGGCTTAGATTCTACCAGGTCATT CTCAGCCACCACACACAAGCGCTCTGCCATCACTGAAGAAG- CCCCCTAGGGCTCTTGGGCCA- GGGCACACTCAGTAAAGATGCAGGTTCAGTCAGGGAATGATGGG GAAAGGGGTAGGAGGTGGGGGAGGGATCACCCCCTCCTC- TAAAACACGAGCCTGCTG- TCTCCAAAGGCCTCTGCCTGTAGTGAGGGTGGCAGAAGAAGACA AGGAGCCAGAACTCTGACTCCAGGATCTAAGTCCGTGCAGGA- AGGGGATCCTAGAAC- CATCTGGTTGGACCCAGCTTACCAAGGGAGAGCCTTTATTCTTCTT TCCCTTGCCCCTCTGTGCCAGCCCCTCTTGCTG- TCCCTGATCCCCCAGACAGCGAGAG- TCTTGCAACCTGCCTCTTCCAAGACCTCCTAATCTCAGGGGCAGG CGGTGGAGTGAGATCCGGCGTGCACACTTTTTGGAAGATAG- CTTTCCCAAGGA- TCCTCTCCCCCACTGGCAGCTCTGCCTGTCCCATCACCATGTATA ATACCACCACTGCTACAGCATCTCACCGAGGAAAGAAAACTGCA- CAATAAAACCAAG- CCTCTGGAGTGTGTCCTGGTGTCTGTCTCTTCTGTGTCCTGGCGT CTGTCTCTTCTGTGTTCTTCCAAGGTCAGAAACAAAAACCACACA- CTTCAACCTGGATGG- CTCGGCTGAGCACTTCTGTGTGCAGAAGGTCCAACCAGACTCTGG GGTACCCCGGCCCTCCCTATTCCCTTGCCTCCTGTCTCCCG- CTTTTTATAGCTCCCTATG- CTGGGCTTCTCTGGAGAGTGAAATCTTTGCCCAAATCAATGCGCA TTCTCTCTGCTGAGTCATCTGGCGACAGCAGTTGAGTTCACCCG- CCAACACATGGGCCCAGC- TATGTAGCCGAACCCTGGCTCTGGAAGTGCCAGGGACTTTGTGCA TAAGTATGTACCATGCCCTTTTTTCACAGTCCTAGCTCTGCA- GAAGTGCAGCCTGAAGG- CCTGTCTGCTGAGAGGACATGCCCTGGAGCCCTGAAACAGGCAC AGTGGGAGGAGGAACGGAGGATGACAGGCATCAGGCCCTCAG- TCCAAAAGCAACCAC- TTGAGAATGGGCTGGAGTACGAAACATGGGGTCCCGTCCCTGGA TCCCTCCTCAAAGAGTAATAAGTAAAATATAAACAGGTACCCCA- GGCCGTTCTGGGTTTGGG- TTGTAATGGGATCCATTTGCAGAGAACTATTGAGACAGCCCAGCC GTACTGTGACAGGCAATGTGGGGGAGGAGGTTGAATCACTTGG- TATTTAGCATGAATAGAA- TAATTCCCTGAACATTTTTCTTAAACATCCATATCTAAATTACCACC ACTCGCTCCCAGTCTTCCTGCCTTTGCGCCAGCCTCCTGTCTGG- CCATGCCTGAAGAAGG- CTGGAGAAGCCACCCACCTCAGGCCATGACACTGCCAGCCACTT GGCAGGTGCAGCCAAACCTGAGCTGTCCCAGAAAGGGACATTCT- CAAGACCCAGGCAC- CCTGATCAGCACTGACTTGGAGCTACAAGTGTCATGCCAGAAAAG TCTCTAAGAAAACCTTTTCAGGGAAAAGGGGGTGACTCAACAC- CGGGCAAGTTTGGGAAG- CCCCACCCTTCGAGTGATGGAAGAGCAGATAGGAAGCCTCAGAA GAGAGACACCGGCACCCAGGTAACGTTCCTCATGTGGTCTCTGT- CACACTAGGTGCTCTT- CCCTGGACATCTCCGTGACCACACTCTCAGTTCTTAGGGAGATGC GGGTGCTCTCTGAGGCTATCTCAGAGTTGCAGATTCTGAGGCC- TAGAGTGACTACAGTCAG- CCTAGGAAGCCACAGAGGACTGTGGACCAGGAGGGCAGAAGAG GAGAAGGGAAGAAAAACCATCAGATAGGACTTGCAATGAAAC- TAACCCAAGACAATCATAA- TGCAGACAGGAATGTTAAAGGCGTTCAGCAGC
MODALIDADES ADICIONAIS Modalidade 1. O método que compreende: induzir em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; e (iii) expressão de KLF4; na ausência de indução da expressão de c-MYC. Modalidade 2. O método da modalidade 1, em que a expres- são de OCT4 é induzida pela administração de:
(i) um primeiro ácido nucleico modificado que codifica OCT4 ou que codifica uma proteína de fusão Cas9 (ativador de CRISPR) e uma sequência de RNA guia que direciona o promotor ou realçador no locus endógeno de Oct4, opcionalmente em que o primeiro ácido nu- cleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) compreende RNA e/ou DNA; (ii) um agente químico que induz a expressão de OCT4; (iii) um anticorpo que induz a expressão de OCT4; ou (iv) uma proteína modificada que codifica OCT4, opcionalmente, em que OCT4 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 41. Modalidade 3. O método de qualquer uma das modalidades 1-2, em que a expressão de SOX2 compreende a administração de: (v) um segundo ácido nucleico modificado que codifica SOX2 que codifica uma proteína de fusão Cas9 (ativador de CRISPR) e um promotor ou realçador de sequência de RNA guia no locus endógeno de SOX2, em que o segundo ácido nucleico modificado compreende RNA e/ou DNA; (vi) um agente químico que induz a expressão de SOX2; (vii) um anticorpo que induz a expressão de SOX2; ou (viii) uma proteína modificada que codifica SOX2, opcionalmente, em que SOX2 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 43. Modalidade 4. O método de qualquer uma das modalidades 1-3, em que a expressão de KLF4 compreende a administração de: (ix) um terceiro ácido nucleico modificado que codifica KLF4 que codifica uma proteína de fusão Cas9 (ativador de CRISPR) e uma sequência de RNA guia que direciona o promotor ou realçador no locus endógeno de KLF4, em que o terceiro ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico modificado) compreende RNA e/ou DNA;
(ix) um agente químico que induz a expressão de KLF4; (xi) um anticorpo que induz a expressão de KLF4; ou (xii) uma proteína modificada que codifica KLF4, opcionalmente, em que KLF4 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 45. Modalidade 5. O método de qualquer uma das modalidades 2-4, em que os referidos primeiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados ou uma combinação dos mesmos estão presentes em um vetor de expressão ou não estão presentes em um vetor de expressão, opcionalmente em que os primeiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados são mRNA ou DNA de plasmídeo.
Modalidade 6. O método da modalidade 5, em que dois ou três dos referidos primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos modifi- cados estão presentes no mesmo vector de expressão.
Modalidade 7. O método de qualquer uma das modalidades 1-5, em que os referidos primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos modificados estão presentes em vetores de expressão separados.
Modalidade 8. O método de qualquer uma das modalidades 5-7, em que o(s) referido(s) vetor(es) de expressão inclui(em) um pro- motor induzível operacionalmente ligado aos primeiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados, ou uma combinação dos mesmos, opcio- nalmente em que o referido método compreende ainda a administração um agente indutor.
Modalidade 9. O método da modalidade 8, em que o referido promotor compreende um elemento de resposta à tetraciclina (TRE). Modalidade 10. O método da modalidade 9, em que a admi- nistração do agente indutor compreende a administração de uma prote- ína ou um quarto ácido nucleico modificado que codifica o agente indu- tor, opcionalmente em que o quarto ácido nucleico modificado é intro- duzido simultaneamente como os primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos modificados.
Modalidade 11. O método da modalidade 10, em que o quarto ácido nucleico modificado está presente em um vetor de expres- são separado dos primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos modifi- cados.
Modalidade 12. O método da modalidade 10, em que o quarto ácido nucleico modificado está presente no mesmo vetor de ex- pressão com pelo menos um dentre os primeiro, segundo e terceiro áci- dos nucleicos modificados.
Modalidade 13. O método de qualquer uma das modalidades 9-12, em que o agente indutor é capaz de induzir a expressão dos pri- meiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados, ou uma combi- nação dos mesmos a partir do promotor induzível na presença de uma tetraciclina e o método compreende ainda a administração de tetraci- clina e/ou remoção de tetraciclina, opcionalmente em que a tetraciclina é doxiciclina.
Modalidade 14. O método da modalidade 13, em que o agente indutor é um transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA). Modalidade 15. O método da modalidade 14, em que o rtTA é M2-rtTA ou rtTA3. Modalidade 16. O método da modalidade 15, em que M2- rtTA compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou o rtTA3 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 11. Modalidade 17. O método de qualquer uma das modalidades 9-12, em que o agente indutor é capaz de induzir a expressão dos pri- meiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados ou uma combi- nação dos mesmos a partir do promotor induzível na ausência de uma tetraciclina, opcionalmente, em que a tetraciclina é doxiciclina.
Modalidade 18. O método da modalidade 17, em que o agente indutor é uma temperatura, um produto químico, um pH, um ácido nucleico, uma proteína, opcionalmente em que a proteína é um transativador controlado por tetraciclina (tTA). Modalidade 19. O método de qualquer uma das modalidades 11 ou 13-18, em que os primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos modificados estão presentes em um primeiro vetor de expressão e o quarto ácido nucleico modificado está presente em um segundo vetor de expressão. Modalidade 20. O método de qualquer uma das modalidades 9-19, em que o promotor é um TRE3G, um promotor TRE2 ou um pro- motor à prova de P, opcionalmente, em que o promotor compreende uma sequência de ácido nucleico modificada que é pelo menos 70 % idêntica a SEQ ID NO: 7, opcionalmente, em que o promotor compre- ende uma sequência de ácido nucleico modificada que é pelo menos 70 % idêntica a SEQ ID NO: 23 e, opcionalmente, em que o promotor com- preende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO:
24. Modalidade 21. O método de qualquer uma das modalidades 1-7 ou 10-20, em que o(s) referido(s) vetor(es) de expressão compreen- dem um promotor constitutivo operacionalmente ligado aos primeiro, se- gundo, terceiro, quarto ácidos nucleicos modificados ou qualquer com- binação dos mesmos. Modalidade 22. O método da modalidade 21, em que o pro- motor constitutivo está operacionalmente ligado ao quarto ácido nu- cleico modificado, porém, não ao primeiro, segundo ou terceiro ácidos nucleicos modificados, opcionalmente em que o promotor constitutivo é CP1, CMV, EF1 alfa, SV40, PGK1, Ubc, beta actina humana, CAG, Ac5, poliedrina, TEF1, GDS, CaM3 5S, Ubi, H1 e promotor U6, ou um pro- motor específico de tecido.
Modalidade 23. O método da modalidade 19-22, em que o primeiro vetor de expressão compreende a sequência fornecida na SEQ ID NO: 16, opcionalmente, em que o segundo vetor de expressão com- preende a sequência fornecida na SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32. Modalidade 24. O método de qualquer uma das modalidades 2-23, em que pelo menos um dentre (i) - (xii) é liberado em um vetor viral ou é liberado sem um vetor viral, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo que consiste de um vetor de lentivírus, retrovírus, ade- novírus, alfavírus, vírus da vacínia e vírus adenoassociado (AAV), opci- onalmente em que a liberação sem um vetor viral compreende a admi- nistração de um ácido nucleico nu, eletroporação, uso de uma nanopar- tícula ou uso de lipossomas.
Modalidade 25. O método de qualquer uma das modalidades 19-24, em que o primeiro vetor de expressão é um primeiro vetor viral e o segundo vetor de expressão é um vetor viral, opcionalmente em que o primeiro e o segundo vetores virais são vetores do AAV.
Modalidade 26. O método de qualquer uma das modalidades 1-25, em que pelo menos um ácido nucleico modificado compreende uma sequência derivada de SV40 incluindo uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 8. Modalidade 27. Os métodos de qualquer uma das modalida- des 1-26, em que OCT4, KLF4 ou SOX2 é uma proteína de mamífero.
Modalidade 28. O método de qualquer uma das modalidades 1-27, em que a célula ou tecido está em um indivíduo, em que o indiví- duo tem uma condição, é suspeito de ter uma condição, ou em risco de uma condição, opcionalmente em que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em doença ocular, envelhecimento, câncer, do- ença musculoesquelética, doença relacionada à idade, uma doença que afeta um animal não humano e doença neurodegenerativa.
Modalidade 29. O método de qualquer uma das modalidades
1-28, em que o método compreende ainda regular: reprogramação ce- lular, reparo de tecido, sobrevivência de tecido, regeneração de tecido, crescimento de tecido, função de tecido, regeneração de órgão, sobre- vivência de órgão, função de órgão, doença, ou qualquer combinação dos mesmos, opcionalmente em que a regulação compreende induzir a reprogramação celular, reverter o envelhecimento, melhorar a função do tecido, melhorar a função do órgão, reparo do tecido, sobrevivência do tecido, regeneração do tecido, crescimento do tecido, promover a an- giogênese, tratar uma doença, reduzir a formação de cicatriz, reduzir a aparência de envelhecimento, promover a regeneração de órgãos, pro- mover a sobrevivência de órgãos, alterar o sabor e a qualidade de pro- dutos agrícolas derivados de animais, tratar uma doença ou qualquer combinação dos mesmos, ex vivo ou in vitro e, opcionalmente, em que o tratamento de uma doença compreende a induzir a expressão de OCT4, KLF4, e/ou SOX2 antes do início da doença ou em que o trata- mento de uma doença compreende induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2 após o início da doença.
Modalidade 30. O método da modalidade 29, em que a célula ou tecido é do olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino, opcionalmente em que o tecido está danificado ou o tecido pode ser considerado saudável, porém abaixo do ideal para o desempenho ou sobrevivência nas condi- ções atuais ou futuras.
Modalidade 31. O método de qualquer uma das modalidades 1-30, em que o ácido nucleico modificado compreende ainda um peptí- deo de autoclivagem, opcionalmente em que o peptídeo de autocliva- gem é um peptídeo 2A que é pelo menos 70 % idêntico à SEQ ID NO:
Modalidade 32. O método de qualquer uma das modalidades 1-31, em que o ácido nucleico modificado compreende ainda repetições terminais invertidas (ITRs) flanqueando o primeiro ácido nucleico, o se- gundo ácido nucleico, o terceiro ácido nucleico ou uma combinação dos mesmos, opcionalmente, em que a distância entre as ITRs é de 4,7 kb ou menos.
Modalidade 33. Um vetor de expressão que compreende: (i) um primeiro ácido nucleico modificado que codifica OCT4; (ii) um segundo ácido nucleico modificado que codifica SOX2; e (iii) um terceiro ácido nucleico modificado que codifica KLF4; na ausência de um ácido nucleico modificado capaz de expressar c- MYC.
Modalidade 34. O vetor de expressão da modalidade 33, em que a proteína OCT4 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 41. Modalidade 35. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-34, em que a proteína SOX2 compreende uma sequên- cia que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 43. Modalidade 36. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-35, em que a proteína KLF4 compreende uma sequên- cia que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 45. Modalidade 37. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-36, compreendendo ainda um promotor induzível ope- racionalmente ligado aos primeiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 38. O vetor de expressão da modalidade 37, em que um agente indutor é capaz de induzir a expressão dos primeiro,
segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados, ou qualquer combina- ção dos mesmos a partir do promotor induzível na presença de uma tetraciclina, opcionalmente em que a tetraciclina é doxiciclina.
Modalidade 39. O vetor de expressão da modalidade 38, em que o agente indutor é um transativador controlado por tetraciclina re- versa (rtTA). Modalidade 40. O vetor de expressão da modalidade 39, em que o rtTA é M2-rtTA ou rtTA3. Modalidade 41. O vetor de expressão da modalidade 40, em que o M2-rtTA compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou o rtTA3 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 11. Modalidade 42. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 38-41, em que o agente indutor é capaz de induzir a ex- pressão dos primeiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados, ou qualquer combinação dos mesmos a partir do promotor induzível na ausência de uma tetraciclina, opcionalmente, em que a tetraciclina é do- xiciclina.
Modalidade 43. O vetor de expressão da modalidade 42, em que o agente indutor é um transativador controlado por tetraciclina (tTA). Modalidade 44. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 37-43, em que o promotor induzível compreende um ele- mento responsivo à tetraciclina (TRE), opcionalmente, em que o promo- tor é um promotor TRE3G compreendendo uma sequência de ácido nu- cleico modificada que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 7, op- cionalmente, em que o promotor compreende uma sequência de ácido nucleico modificada que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 23 e, opcionalmente, em que o promotor compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 24.
Modalidade 45. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-36, em que o(s) referido(s) vetor(es) de expressão com- preende(m) um promotor constitutivo operacionalmente ligado aos pri- meiro, segundo, terceiro ácidos nucleicos modificados ou uma combi- nação dos mesmos. Modalidade 46. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-44, em que o vetor de expressão compreende a se- quência fornecida na SEQ ID NO: 16. Modalidade 47. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-46, em que o vetor de expressão é um vetor viral, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo que consiste em um lentivírus, alfavírus, vírus da vacínia, um vírus do herpes, um retrovírus, um adenovírus e um vetor de vírus adenoassociado (AAV). Modalidade 48. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-47, em que pelo menos um ácido nucleico modificado compreende uma sequência derivada de SV40 incluindo uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO: 8. Modalidade 49. Os vetores de expressão de qualquer uma das modalidades 33-48, em que OCT4, KLF4 ou SOX2 é uma proteína de mamífero. Modalidade 50. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-49, em que o vetor de expressão compreende ainda um peptídeo de autoclivagem, opcionalmente em que o peptídeo de au- toclivagem é peptídeo 2A, opcionalmente em que o peptídeo 2A com- preende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à SEQ ID NO:
9. Modalidade 51. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 37-44 e 46-50, em que o vetor de expressão compreende um promotor induzível. Modalidade 52. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 45-50, em que o vetor de expressão compreende um pro- motor constitutivo.
Modalidade 53. O vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-52, em que o ácido nucleico modificado compreende ainda repetições terminais invertidas (ITRs) que flanqueiam o primeiro ácido nucleico, o segundo ácido nucleico, o terceiro ácido nucleico ou uma combinação dos mesmos.
Modalidade 54. O vetor de expressão da modalidade 32, em que a distância entre as ITRs é de 4,7 kb ou menos.
Modalidade 55. Um vírus recombinante compreendendo o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 47-54, opcional- mente em que o vírus recombinante é um retrovírus, um adenovírus, um AAV, alfavírus, vírus da vacínia, um vírus do herpes ou um lentivírus.
Modalidade 56. Uma célula modificada produzida por qual- quer um dos métodos das modalidades 1-32, 63-66, 70-75, 81 e 85-87, opcionalmente em que a célula modificada compreende o vetor de ex- pressão de qualquer uma das modalidades 33- 54 Modalidade 57. Uma composição que compreende o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-54, o vírus recom- binante da modalidade 55, a célula modificada da modalidade 56, um agente químico que é capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2, uma proteína modificada selecionada a partir do grupo que consiste em OCT4, KLF4 e/ou SOX2, um anticorpo capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2, opcionalmente em que a com- posição compreende um transportador farmaceuticamente aceitável.
Modalidade 58. A composição da modalidade 57, compreen- dendo ainda um segundo vetor de expressão que codifica um agente indutor, uma segunda proteína que codifica um agente indutor ou um segundo vírus recombinante que codifica um agente indutor, opcional- mente em que o segundo vetor de expressão é um vetor de AAV e/ou o segundo vírus recombinante é um AAV.
Modalidade 59. A composição da modalidade 58, em que o agente indutor é um transativador de tetraciclina reversa (rtTA) ou tran- sativador de tetraciclina (tTA). Modalidade 60. A composição de qualquer uma das modali- dades 58-59, em que o agente indutor é codificado por um vetor viral, opcionalmente, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo que consiste em um vetor lentiviral, um vetor adenoviral, um vetor viral ade- noassociado e um vetor retroviral.
Modalidade 61. A composição da modalidade 60, em que o vector viral que codifica o agente indutor compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32. Modalidade 62. Um kit compreendendo o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-54, vírus recombinante da moda- lidade 55, a célula modificada da modalidade 56, um agente químico que é capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2, um proteína modificada selecionada a partir do grupo que consiste em OCT4, KLF4 e/ou SOX2, um anticorpo capaz de induzir a expressão de OCT4, KLF4 e/ou SOX2, ou a composição de qualquer uma das moda- lidades 56-61. Modalidade 63. Um método de produção de uma célula mo- dificada que compreende o método de qualquer uma das modalidades 1-32, produzindo assim a célula modificada.
Modalidade 64. O método da modalidade 63, em que a célula modificada é uma célula-tronco pluripotente induzida.
Modalidade 65. O método de qualquer uma das modalidades 63-64, em que a célula modificada é a célula da modalidade 56. Modalidade 66. Um método de produção de uma célula mo- dificada, que compreende o método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 63-65, em que a célula modificada é produzida ex vivo.
Modalidade 67. O método de qualquer uma das modalidades 63-66, compreendendo ainda a geração de um tecido ou órgão modifi- cado.
Modalidade 68. O método de qualquer uma das modalidades 66-67, compreendendo ainda a administração da célula modificada, te- cido modificado e/ou órgão modificado a um indivíduo em necessidade do mesmo, opcionalmente em que a célula, tecido e/ou órgão é do olho, ouvido, nariz, boca incluindo gengiva e raízes dos dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo mús- culo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele incluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, próstata, pênis, cloaca, nada- deira, ovário ou célula do intestino.
Modalidade 69. O método de qualquer uma das modalidades 63-68, em que o método compreende ainda o tratamento de uma do- ença, opcionalmente em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em lesões agudas, doenças neurodegenerativas, doenças crônicas, doenças proliferativas, doenças oculares, doenças cardiovas- culares, doenças genéticas, doenças inflamatórias, doenças autoimu- nes, doenças neurológicas, doenças hematológicas, condições doloro- sas, distúrbios psiquiátricos, distúrbios metabólicos, doenças crônicas, câncer, envelhecimento, doenças relacionadas à idade e doenças que afetam qualquer tecido em um indivíduo, opcionalmente em que a do- ença é uma doença ocular.
Modalidade 70. Método que compreende: (i) ativar OCT4; (ii) ativar SOX2; e (iii) ativar KLF4; em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo e na ausência de ativação de c-Myc.
Modalidade 71. O método da modalidade 71, em que a ati- vação em qualquer um dentre (i) - (iii) compreende a administração de um anticorpo, proteína, ácido nucleico ou agente químico.
Modalidade 72. O método de qualquer uma das modalidades 72, em que o ácido nucleico, anticorpo, proteína e/ou agente químico substitui OCT4, SOX2 e/ou KLF4. Modalidade 73. O método da modalidade 72, em que a subs- tituição compreende a promoção da reprogramação celular.
Modalidade 74. O método de qualquer uma das modalidades 70-73, em que a ativação de qualquer um dentre (i) - (iii) compreende a substituição de OCT4, SOX2 e/ou KLF4, selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína, um ácido nucleico e um agente químico.
Modalidade 75. O método da modalidade 74, em que a subs- tituição de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 compreende a administração de um ácido nucleico e/ou proteína que codifica Tet1, NR5A-2, Sall4, E-cade- rina, NKX3-1, NANOG e/ou Tet2. Modalidade 76. O método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 70-75, em que o indivíduo é saudável.
Modalidade 77. O método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 70-76, em que o indivíduo é um indivíduo pediátrico.
Modalidade 78. O método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 70-76, em que o indivíduo é um indivíduo adulto.
Modalidade 79. O método de qualquer uma das modalidades 28-32 e 70-78, em que o indivíduo tem, é suspeito de ter, ou está em risco de glaucoma.
Modalidade 80. O método de qualquer uma das modalidades 28-32 e 70-79, em que o indivíduo tem, é suspeito de ter ou está em risco de declínio relacionado à idade na acuidade visual e/ou função retiniana.
Modalidade 81. Um método que compreende a administra- ção de um ácido nucleico e/ou proteína que codifica Tet1 ou Tet2 a uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo.
Modalidade 82. O método da modalidade 81, em que o indi- víduo tem uma doença.
Modalidade 83. O método da modalidade 82, em que a do- ença é selecionada a partir de lesões agudas, doenças neurodegenera- tivas, doenças crônicas, doenças proliferativas, doenças oculares, do- enças cardiovasculares, doenças genéticas, doenças inflamatórias, do- enças autoimunes, doenças neurológicas, doenças hematológicas, con- dições dolorosas, distúrbios psiquiátricos, distúrbios metabólicos, doen- ças crônicas, câncer, envelhecimento, doenças relacionadas à idade e doenças que afetam qualquer tecido em um indivíduo.
Modalidade 84. O método da modalidade 83, em que a do- ença é uma doença ocular.
Modalidade 85. O método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 63-84, compreendendo ainda a ativação de um realçador de re- programação na célula, tecido, órgão e/ou indivíduo.
Modalidade 86. O método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 63-85, que compreende ainda inibir uma barreira de reprograma- ção na célula, tecido, órgão e/ou indivíduo.
Modalidade 87. O método da modalidade 86, em que a bar- reira de reprogramação é uma DNA metiltransferase (DNMT) na célula, tecido, órgão e/ou indivíduo.
Modalidade 88. Um método que compreende: induzir em um indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; e (iii) expressão de KLF4; na ausência de indução da expressão de c-MYC, em que o indivíduo foi tratado com um fármaco de quimioterapia.
Modalidade 89. O método da modalidade 89, em que o fár- maco de quimioterapia é vincristina (VCS). Modalidade 90. Um método que compreende induzir em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; e (iii) expressão de KLF4; em que OCT4, SOX2 e KLF4 são codificados por um ácido nucleico e a expressão de OCT4, SOX2 e/ou KLF4 é induzida a partir de um único promotor.
Modalidade 91. Método que compreende: induzir em uma célula, tecido, órgão e/ou indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; (iii) expressão de KLF4; ou (iv) qualquer combinação dentre (i) - (iii), na ausência de indução da expressão de c-MYC.
Modalidade 92. O método da modalidade 91, em que a com- binação de (i) - (iii) compreende (i) e (ii); (i) e (iii); (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). Modalidade 93. Um vetor de expressão que compreende: (i) um primeiro ácido nucleico modificado que codifica OCT4; (ii) um segundo ácido nucleico modificado que codifica SOX2; (iii) um terceiro ácido nucleico modificado que codifica KLF4; ou (iv) qualquer combinação dentre (i) - (iii), na ausência de um ácido nucleico modificado capaz de induzir a expres- são de c-MYC.
Modalidade 94. O vetor de expressão da modalidade 93, em que a combinação de (i) - (iii) compreende (i) e (ii); (i) e (iii); (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). Modalidade 95. Um vírus recombinante compreendendo o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 47-54 e 93-94, opcionalmente em que o vírus recombinante é um retrovírus, um ade- novírus, um AAV, alfavírus, vírus da vacínia, um vírus do herpes ou um lentivírus.
Modalidade 96. Uma célula modificada produzida por qual- quer um dos métodos das modalidades 1-32, 63-66, 70-75, 81, 85-87 e 91-92, opcionalmente em que a célula modificada compreende o vetor de expressão de qualquer um das modalidades 33-54 e 93-94. Modalidade 97. Uma composição que compreende o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-54 e 93-94, o vírus recombinante da modalidade 55 ou modalidade 95, a célula modificada da modalidade 56 ou 96, um agente químico que é capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mes- mos, uma proteína modificada selecionada a partir do grupo que con- siste em OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de induzir a expressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, opcionalmente em que a composi- ção compreende um transportador farmaceuticamente aceitável.
Modalidade 98. Um kit compreendendo o vetor de expressão de qualquer uma das modalidades 33-54 e 93-94, vírus recombinante da modalidade 55 ou 95, a célula modificada da modalidade 56 ou 96, um agente químico que é capaz de induzir a expressão de OCT4 ; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, uma proteína modificada selecionada a partir do grupo que consiste em OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de induzir a ex- pressão de OCT4; KLF4; SOX2; ou qualquer combinação dos mesmos,
ou a composição de qualquer uma das modalidades 56-61 ou 97. Modalidade 99. Um método de produção de uma célula mo- dificada que compreende o método de qualquer uma das modalidades 1-32 e 91-92, produzindo assim a célula modificada.
Modalidade 100. Um método de produção de uma célula mo- dificada, que compreende o método de qualquer uma das modalidades 1-32, 63-65, 91-92 e 99, em que a célula modificada é produzida in vivo.
Modalidade 101. Um método de produção de uma célula mo- dificada, que compreende o método de qualquer uma das modalidades 1-32, 63-65, 91-92 e 99, em que a célula modificada é produzida ex vivo.
Modalidade 102. Um método que compreende: (i) ativar OCT4; (ii) ativar SOX2; (iii) ativar KLF4; ou (iv) qualquer combinação dentre (i) - (iii), em uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos, e na ausência de ativação de c-Myc acima dos níveis endóge- nos.
Modalidade 103. O método da modalidade 102, em que a combinação de (i) - (iii) compreende (i) e (ii); (i) e (iii); (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). Modalidade 104. Um método que compreende: induzir em um indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; (iii) expressão de KLF4; ou (iv) qualquer combinação dentre (i) - (iii), na ausência de indução da expressão de c-MYC, em que o indivíduo foi tratado com um fármaco de quimioterapia.
Modalidade 105. O método da modalidade 104, em que a combinação de (i) - (iii) compreende (i) e (ii); (i) e (iii); (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). Modalidade 106. Um método que compreende induzir em uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mes- mos: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; (iii) expressão de KLF4; ou (iv) qualquer combinação dentre (i) - (iii), em que OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é codificado por um ácido nucleico e a expressão de OCT4, SOX2, KLF4 ou qualquer combinação dos mesmos é induzida a partir de um único promotor.
Modalidade 107. O método da modalidade 106, em que a combinação de (i) - (iii) compreende (i) e (ii); (i) e (iii); (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). Modalidade 108. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-107, em que o indivíduo é um humano.
Modalidade 109. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-108, em que o método não induz a formação de teratoma.
Modalidade 110. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-109, em que o método não induz a formação ou crescimento tumoral.
Modalidade 111. O método da modalidade 110, em que o método reduz a formação ou crescimento do tumor.
Modalidade 112. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-111, em que o método aumenta a acuidade vi- sual do indivíduo.
Modalidade 113. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-112, em que o método não induz câncer.
Modalidade 114. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-113, em que o método não induz glaucoma.
Modalidade 115. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-114, em que o método inverte o relógio epige- nético da célula, do tecido, do órgão, do indivíduo ou de qualquer com- binação dos mesmos.
Modalidade 116. O método da modalidade 115, em que o relógio epigenético é determinado usando um DNA estimador de idade baseado em metilação (DNAm). Modalidade 117. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92 ou 102-116, em que o método altera a expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento.
Modalidade 118. O método da modalidade 117, em que o método reduz a expressão de um ou mais genes associados ao enve- lhecimento.
Modalidade 119. O método da modalidade 118, em que o método reduz a expressão de 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356, Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722, Gm45516, Gm45532,
Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Prickle2, Qsox1, Rapgef4os2, Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1, Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech, Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Slitrk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 120. O método da modalidade 119, em que o gene é um gene sensorial.
Modalidade 121. O método de qualquer uma das modalida- des 118-120, em que o gene é Ace, Kcnk4, Lamc3, Edn1, Syt10, Ngfr, Gprc5c, Cd36, Chrna4, Ednrb, Drd2 ou uma combinação dos mesmos.
Modalidade 122. O método da modalidade 117, em que o método aumenta a expressão de um ou mais genes associados ao en- velhecimento.
Modalidade 123. O método de qualquer uma das modalida- des 1-32, 68-92, 102-122, em que o método aumenta a expressão de 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik, 4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik,
Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248, Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025, Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648, Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124, Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263, Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706,
Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113, Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 124. O método da modalidade 123, em que o método aumenta a expressão de Olfr816, Olfr812, Olfr1264, Olfr727, Olfr923, Olfr1090, Olfr328, Olfr1124, Olfr522, Olfr1082, Olfr1206, Olfr1167, Olfr706, Olfr6, Pou3f4, Olfr603, Olfr127, Olfr1263, Olfr1269, Olfr1205, Olfr390, Olfr601, Olfr860, Olfr215, Olfr741, Olfr1469, Olfr355, Olfr481, Olfr456, Olfr1042, Olfr728, Olfr372, Olfr801, Olfr1223, Olfr822, Otogl, Olfr943, Olfr1406, Olfr273, Olfr466, Olfr1043, Olfr427, Olfr890, Rbp4, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 125. Método de reprogramação que compre- ende o rejuvenescimento do relógio epigenético de uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 126. O método da modalidade 125, em que o rejuvenescimento do relógio epigenético de uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos compreende a introdu- ção, ativação e/ou expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou qualquer com- binação dos mesmos.
Modalidade 127. O método de qualquer uma das modalida- des 126, em que o relógio epigenético de uma célula, tecido, órgão, in- divíduo ou qualquer combinação dos mesmos é rejuvenescido ao de uma célula jovem, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 128. O método de qualquer uma das modalida-
des 125-127, em que o rejuvenescimento do relógio epigenético com- preende alterar a expressão de um ou mais genes associados ao enve- lhecimento na célula, tecido, órgão, indivíduo ou a combinação dos mes- mos.
Modalidade 129. O método da modalidade 128, em que o método compreende a redução da expressão de um ou mais genes as- sociados ao envelhecimento.
Modalidade 130. O método da modalidade 129, em que o método compreende a redução da expressão de 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356, Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722, Gm45516, Gm45532, Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Prickle2, Qsox1, Rapgef4os2, Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1, Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech,
Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Slitrk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 131. O método da modalidade 128-130, em que um ou mais genes são um ou mais genes sensoriais.
Modalidade 132. O método de qualquer uma das modalida- des 128-131, em que o gene é Ace, Kcnk4, Lamc3, Edn1, Syt10, Ngfr, Gprc5c, Cd36, Chrna4, Ednrb, Drd2 ou uma combinação dos mesmos.
Modalidade 133. O método de qualquer uma das modalida- des 128-132, em que o método compreende o aumento da expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento.
Modalidade 134. O método da modalidade 133, em que o método aumenta a expressão de 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik, 4930455B14Rik, 4930500H12Rik, 4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik, Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248, Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025,
Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648, Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124, Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263, Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706, Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113, Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 135. O método de qualquer uma das modalida- des 133-134, em que o método compreende o aumento da expressão de Olfr816, Olfr812, Olfr1264, Olfr727, Olfr923, Olfr1090, Olfr328,
Olfr1124, Olfr522, Olfr1082, Olfr1206, Olfr1167, Olfr706, Olfr6, Pou3f4, Olfr603, Olfr127, Olfr1263, Olfr1269, Olfr1205, Olfr390, Olfr601, Olfr860, Olfr215, Olfr741, Olfr1469, Olfr355, Olfr481, Olfr456, Olfr1042, Olfr728, Olfr372, Olfr801, Olfr1223, Olfr822, Otogl, Olfr943, Olfr1406, Olfr273, Olfr466, Olfr1043, Olfr427, Olfr890, Rbp4, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 136. Um método de reprogramação que compre- ende alterar a expressão de um ou mais genes associados ao envelhe- cimento.
Modalidade 137. O método da modalidade 136, que compre- ende aumentar a expressão de OCT4, KLF4, SOX2 ou qualquer combi- nação dos mesmos.
Modalidade 138. O método de qualquer uma das modalida- des 136-137, em que o método rejuvenesce o relógio epigenético de uma célula, tecido, órgão, indivíduo ou qualquer combinação dos mes- mos.
Modalidade 139. O método de qualquer uma das modalida- des de realização 136-138, em que o método compreende a redução da expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento.
Modalidade 140. O método da modalidade 139, em que o método reduz a expressão de 0610040J01Rik, 1700080N15Rik, 2900064F13Rik, 4833417C18Rik, 4921522P10Rik, 4930447C04Rik, 4930488N15Rik, Ace, Ackr1, Acot10, Acvr1, Adamts17, Adra1b, AI504432, Best3, Boc, Cadm3, Cand2, Ccl9, Cd14, Cd36, Cfh, Chrm3, Chrna4, Cntn4, Cracr2b, Cryaa, CT573017.2, Cyp26a1, Cyp27a1, D330050G23Rik, D930007P13Rik, Ddo, Dgkg, Dlk2, Dnaja1-ps, Drd2, Dsel, Dytn, Ecscr, Edn1, Ednrb, Efemp1, Elfn2, Epha10, Ephx1, Erbb4, Fam20a, Fbxw21, Ffar4, Flt4, Fmod, Foxp4, Fzd7, Gabrd, Galnt15, Galnt18, Gfra2, Ggt1, Gm10416, Gm14964, Gm17634, Gm2065, Gm32352, Gm33172, Gm34280, Gm35853, Gm36298, Gm36356,
Gm36937, Gm3898, Gm42303, Gm42484, Gm42537, Gm42743, Gm43151, Gm43843, Gm44545, Gm44722, Gm45516, Gm45532, Gm47494, Gm47982, Gm47989, Gm48398, Gm48495, Gm48593, Gm48958, Gm49089, Gm49326, Gm49331, Gm49760, Gm5796, Gm6374, Gm7276, Gm8237, Gm9796, Gm9954, Gpr75, Gprc5c, Grid2ip, Gsg1l2, Hapln4, Hcn3, Hcn4, Hhatl, Hs6st2, Htr3a, Il1rap, Il1rapl2, Inka1, Kbtbd12, Kcnj11, Kcnk4, Kdelc2, Klhl33, Lamc3, Lilra5, Lman1l, Lrfn2, Lrrc38, Lrrn4cl, Ltc4s, Mansc1, Mir344c, Msr1, Mycbpap, Myoc, Ngfr, Nipal2, Olfr1372-ps1, Otop3, P2rx5, P2ry12, P4ha2, Pcdha12, Pcdha2, Pcdhac2, Pcdhb18, Pcdhb5, Pcsk2os1, Pcsk6, Perp, Pkp1, Plxna4, Prickle2, Qsox1, Rapgef4os2, Rbp4, Rcn3, Sec14l5, Sel1l3, Serpinh1, Sgpp2, Shisa6, Siah3, Siglech, Slc12a4, Slc24a2, Slc2a5, Slc4a4, Slitrk3, Smagp, Smoc2, Speer4b, Spon2, Sstr2, Sstr3, St3gal3, Stc1, Stc2, Syndig1, Syt10, Thsd7a, Tlr8, Tmem132a, Tmem132d, Tmem200a, Tmem44, Trpc4, Trpv4, Unc5b, Vgf, Vmn1r90, Vwc2l, Wfikkn2, Wnt11, Wnt6, Zeb2os, Zfp608, Zfp976, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 141. O método de qualquer uma das modalida- des 136-140, em que um ou mais genes são um ou mais genes senso- riais.
Modalidade 142. O método de qualquer uma das modalida- des 136-140, em que o gene é Ace, Kcnk4, Lamc3, Edn1, Syt10, Ngfr, Gprc5c, Cd36, Chrna4, Ednrb, Drd2 ou uma combinação dos mesmos.
Modalidade 143. O método de qualquer uma das modalida- des de modalidade 136-142, em que o método compreende o aumento da expressão de um ou mais genes associados ao envelhecimento.
Modalidade 144. O método da modalidade 143, em que o método compreende aumentar a expressão de 1700031P21Rik, 1810053B23Rik, 2900045O20Rik, 2900060B14Rik, 4921504E06Rik, 4930402F11Rik, 4930453C13Rik, 4930455B14Rik, 4930500H12Rik,
4930549P19Rik, 4930555B11Rik, 4930556J02Rik, 4932442E05Rik, 4933431K23Rik, 4933438K21Rik, 6720475M21Rik, 9830132P13Rik, A430010J10Rik, A530064D06Rik, A530065N20Rik, Abcb5, Abhd17c, AC116759.2, AC131705.1, AC166779.3, Acot12, Adig, Akr1cl, Ankrd1, Asb15, Atp2c2, AU018091, AW822073, Btnl10, C130093G08Rik, C730027H18Rik, Ccdc162, Chil6, Col26a1, Corin, Crls1, Cybrd1, Cyp2d12, Cyp7a1, D830005E20Rik, Dlx3, Dnah14, Dsc3, Dthd1, Eid2, Eps8l1, EU599041, Fam90a1a, Fancf, Fau-ps2, Fezf1, Gja5, Gm10248, Gm10513, Gm10635, Gm10638, Gm10718, Gm10722, Gm10800, Gm10801, Gm11228, Gm11251, Gm11264, Gm11337, Gm11368, Gm11485, Gm11693, Gm12793, Gm13050, Gm13066, Gm13323, Gm13339, Gm13346, Gm13857, Gm14387, Gm14770, Gm15638, Gm16072, Gm16161, Gm16181, Gm17200, Gm17791, Gm18025, Gm18757, Gm18795, Gm18848, Gm19719, Gm20121, Gm20356, Gm2093, Gm21738, Gm21940, Gm22933, Gm24000, Gm24119, Gm25394, Gm26555, Gm27047, Gm28262, Gm28530, Gm29295, Gm29825, Gm29844, Gm3081, Gm32051, Gm32122, Gm33056, Gm33680, Gm34354, Gm34643, Gm3551, Gm36660, Gm36948, Gm37052, Gm37142, Gm37262, Gm37535, Gm37569, Gm37589, Gm37647, Gm37648, Gm37762, Gm38058, Gm38069, Gm38137, Gm38218, Gm39139, Gm42535, Gm42680, Gm42895, Gm42994, Gm43027, Gm43158, Gm43288, Gm43366, Gm44044, Gm44081, Gm44187, Gm44280, Gm44535, Gm45338, Gm45644, Gm45740, Gm46555, Gm46565, Gm4742, Gm47485, Gm47853, Gm47992, Gm48225, Gm48314, Gm48383, Gm48673, Gm48804, Gm48832, Gm4994, Gm5487, Gm5724, Gm595, Gm6012, Gm6024, Gm7669, Gm7730, Gm8043, Gm8953, Gm9348, Gm9369, Gm9495, H2al2a, Ido2, Igfbp1, Kif7, Klhl31, Lrrc31, Mc5r, Mgam, Msh4, Mucl2, Mug1, Mybl2, Myh15, Nek10, Neurod6, Nr1h5, Olfr1042, Olfr1043, Olfr1082, Olfr1090, Olfr1124, Olfr1167, Olfr1205, Olfr1206, Olfr1223, Olfr1263,
Olfr1264, Olfr1269, Olfr127, Olfr1291-ps1, Olfr1406, Olfr1469, Olfr215, Olfr273, Olfr328, Olfr355, Olfr372, Olfr390, Olfr427, Olfr456, Olfr466, Olfr481, Olfr522, Olfr6, Olfr601, Olfr603, Olfr706, Olfr727, Olfr728, Olfr741, Olfr801, Olfr812, Olfr816, Olfr822, Olfr860, Olfr890, Olfr923, Olfr943, Otogl, Pi15, Pkhd1, Pkhd1l1, Platr6, Pou3f4, Prr9, Pvalb, Rhag, Sav1, Serpinb9b, Skint1, Skint3, Skint5, Slc10a5, Slc6a4, Smok2a, Tcaf3, Tomm20l, Trcg1, Trdn, Ugt1a6a, Usp17la, Vmn1r178, Vmn1r179, Vmn1r33, Vmn1r74, Vmn1r87, Vmn2r102, Vmn2r113, Vmn2r17, Vmn2r52, Vmn2r66, Vmn2r68, Vmn2r76, Vmn2r78, Wnt16, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 145. O método da modalidade 144, em que o método compreende aumentar a expressão de Olfr816, Olfr812, Olfr1264, Olfr727, Olfr923, Olfr1090, Olfr328, Olfr1124, Olfr522, Olfr1082, Olfr1206, Olfr1167, Olfr706, Olfr6, Pou3f4, Olfr603, Olfr127, Olfr1263, Olfr1269, Olfr1205, Olfr390, Olfr601, Olfr860, Olfr215, Olfr741, Olfr1469, Olfr355, Olfr481, Olfr456, Olfr1042, Olfr728, Olfr372, Olfr801, Olfr1223, Olfr822, Otogl, Olfr943, Olfr1406, Olfr273, Olfr466, Olfr1043, Olfr427, Olfr890, Rbp4, ou qualquer combinação dos mesmos.
Modalidade 146. Um método que compreende reiniciar o perfil transcricional de células velhas in vitro.
Modalidade 147. Um método que compreende reiniciar o perfil transcricional de células velhas in vivo.
Modalidade 148. Um método que compreende induzir em um indivíduo: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; e/ou (iii) expressão de KLF4; na ausência de indução da expressão de c-MYC, em que o indivíduo tem, está em risco ou é suspeito de ter uma condição que aumenta a idade baseada na metilação do DNA de uma célula, de um tecido e/ou de um órgão dentro o indivíduo, em comparação com uma célula de controle, um tecido de controle e/ou de um órgão de controle de um indivíduo de controle que não tem a condição. Modalidade 149. O método da modalidade 148, em que o método reduz a idade baseada na metilação do DNA da célula, do te- cido, do órgão e/ou do indivíduo. Modalidade 150. Um método de transdiferenciação, que compreende a indução em um tipo de célula: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; (iii) expressão de KLF4; e (iv) expressão de um fator determinante de linhagem, em que (i) - (iii) são expressos a partir de um único vetor, transdiferen- ciando assim a célula para outro tipo de célula. Modalidade 151. Um método de transdiferenciação, que compreende a indução em uma célula: (i) expressão de OCT4; (ii) expressão de SOX2; e (iii) expressão de KLF4; e Reduzindo a expressão de um fator determinante de linhagem, em que (i) - (iii) são expressos a partir de um único vetor.
EQUIVALENTES E ESCOPO
[00562] Nos artigos das reivindicações, tais como “um”, “uma” e “a/o” podem significar um ou mais de um, a menos que indicado em contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregados ou de outra forma relevan- tes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto. A descrição inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo está pre- sente, empregado ou de outra maneira relevante para um determinado produto ou processo. A descrição inclui modalidades nas quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou relevantes de outra maneira para um determinado produto ou processo.
[00563] Além disso, a descrição abrange todas as variações, combi- nações e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas e termos descritivos de uma ou mais das reivindicações lista- das são introduzidos em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer rei- vindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modi- ficada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer ou- tra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação de base. Onde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no for- mato de grupo Markush, cada subgrupo dos elementos também é des- crito e qualquer(quaisquer) elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve ser entendido que, em geral, onde a descrição, ou aspectos aqui descritos, é/são referido(s) como compreendendo elementos e/ou características particulares, certas modalidades aqui descritas ou as- pectos aqui descritos consistem, ou consistem essencialmente em, tais elementos e/ou aspectos. Para fins de simplicidade, essas modalidades não foram especificamente estabelecidas in haec verba aqui. Também é observado que os termos "compreendendo" e "contendo" se destinam a ser abertos e permitem a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Onde os intervalos são fornecidos, os pontos finais são incluídos. Além disso, a menos que indicado de outra forma ou de outra forma evidente a partir do contexto e compreensão de alguém versado na técnica, os valores que são expressos como faixas podem assumir qualquer valor específico ou subfaixa dentro das faixas declaradas em diferentes mo- dalidades aqui descritas, até o décimo da unidade do limite inferior da faixa, a menos que o contexto claramente dite o contrário.
[00564] Este pedido refere-se a várias patentes emitidas, pedidos de patentes publicados, artigos de jornal, e outras publicações, todos os quais são incorporados neste documento por referência. Se houver um conflito entre qualquer uma das referências incorporadas e a presente especificação, a especificação deve prevalecer. Além disso, qualquer modalidade particular da presente descrição que se enquadre na téc- nica anterior pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Uma vez que tais modalidades são consideradas conhecidas por alguém versado na técnica, elas podem ser excluídas mesmo se a exclusão não for estabelecida explicitamente neste docu- mento. Qualquer modalidade particular aqui descrita pode ser excluída de qualquer reivindicação, por qualquer motivo, seja ou não relacionado à existência da técnica anterior.
[00565] Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas aqui descritas. O escopo das presentes modalidades aqui descritas não se destina a ser limitado à Descrição acima, porém sim como estabelecido nas reivindicações ane- xas. Aqueles versados na técnica apreciarão que várias mudanças e modificações nesta descrição podem ser feitas sem se afastar do espí- rito ou escopo da presente descrição, conforme definido nas seguintes reivindicações.

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição para uso no rejuvenescimento de pelo menos uma célula, tecido ou órgão em um indivíduo em necessidade da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um agente que induz a expressão de OCT4; b) um agente que induz a expressão de SOX2; e c) um agente que induz a expressão de KLF4.
2. Método de rejuvenescimento de pelo menos uma célula, tecido ou órgão em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracte- rizado pelo fato de que compreende a administração in vivo ao indivíduo de uma composição que compreende; a) um agente que induz a expressão de OCT4; b) um agente que induz a expressão de SOX2; e c) um agente que induz a expressão de KLF4.
3. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o rejuvenescimento de pelo menos uma célula não compreende a reprogramação de pelo menos uma cé- lula, tecido ou órgão para um estado pluripotente.
4. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição induz a expressão de OCT4, SOX2 e ou KLF4 por um período de tempo que é suficiente para rejuvenescer pelo menos uma célula, tecido ou órgão e que é insuficiente para reprogramar a célula a um estado pluripotente.
5. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que após a administra- ção da composição ao indivíduo, pelo menos uma célula, tecido ou ór- gão rejuvenescido não expressa pelo menos um marcador de célula- tronco.
6. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o marcador de células-tronco é Esrrb,
Nanog, Lin28, TRA-1-60/TRA-1-81/TRA-2-54, SSEA1, SSEA4 ou qual- quer combinação dos mesmos.
7. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que após a administra- ção da composição ao indivíduo, pelo menos uma célula, tecido ou ór- gão rejuvenescido expressa RBPMS, Brn3a ou qualquer combinação dos mesmos.
8. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o rejuvenescimento de pelo menos uma célula, tecido ou órgão compreende restaurar a in- formação epigenética por pelo menos uma célula, tecido ou órgão.
9. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o rejuvenescimento de pelo menos uma célula, tecido ou órgão compreende restaurar a in- formação epigenética perdida devido ao envelhecimento, lesão, doença ou qualquer combinação destes por pelo menos uma célula, tecido, ou órgão.
10. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o rejuvenesci- mento de pelo menos uma célula, tecido ou órgão compreende o resta- belecimento do estado epigenético da célula, tecido ou órgão para um estado epigenético que é semelhante ao estado formado logo após fer- tilização ou diferenciação final.
11. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o(s) agente(s) é(são) um ácido nucleico, molécula pequena, anticorpo ou polipeptídeo.
12. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o(s) agente(s) compreende(m) pelo menos uma nanopartícula.
13. Composição ou método, de acordo com a reivindicação
11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o(s) agente(s) é(são) encapsu- lado(s) por pelo menos uma nanopartícula.
14. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o ácido nu- cleico é DNA ou RNA.
15. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o DNA é DNA de plasmídeo.
16. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o RNA é mRNA.
17. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente que induz a expressão de OCT4 é um ácido nucleico modificado que codifica OCT4.
18. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que o agente que induz a expressão de SOX2 é um ácido nucleico modificado que codifica SOX2.
19. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente que induz a expressão de KLF4 é um ácido nucleico modificado que codifica KLF4.
20. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos modi- ficados estão presentes em um ou mais vetores de expressão.
21. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos modificados es- tão presentes no mesmo vetor de expressão.
22. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o(s) referido(s) vetor(es) de expressão inclui(em) um promotor induzível operacionalmente ligado a qualquer um dos ácidos nucleicos modificados ou uma combinação dos mesmos.
23. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor TRE3G, um TRE2 ou um promotor à prova de P.
24. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o referido promotor compre- ende um elemento de resposta à tetraciclina (TRE).
25. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão compreende um peptídeo de autoclivagem.
26. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de autoclivagem é um peptídeo 2A.
27. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) flanque- ando o primeiro ácido nucleico, o segundo ácido nucleico, o terceiro ácido nucleico ou uma combinação dos mesmos, em que a distância entre as ITRs é de 4,7 kb ou menos.
28. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a com- posição compreende ainda um agente indutor ou em que o método com- preende ainda administrar ao referido indivíduo um agente indutor.
29. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agente indutor é uma tetraciclina ou um transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA).
30. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a tetraciclina é doxiciclina.
31. Composição ou método, de acordo com a reivindicação
29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o rtTA está presente em um vetor de expressão.
32. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão não é o mesmo vetor de expressão que os ácidos nucleicos modificados que codificam Oct4, Sox2 e/ou KLF4.
33. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o rtTA é M2- rtTA ou rtTA3.
34. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 33, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor viral.
35. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de lentivírus, retrovírus, adenovírus, alfavírus, vírus da vacínia ou vírus adenoassoci- ado (AAV).
36. Composição ou método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é AAV2 ou AAV9.
37. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o indiví- duo tem, é suspeito de ter ou está em risco de uma doença ocular, en- velhecimento, câncer, doença musculoesquelética, doença relacionada à idade ou doença neurodegenerativa.
38. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o indiví- duo é um mamífero humano ou não humano.
39. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula, tecido ou órgão é do olho, ouvido, nariz, boca, incluindo gengiva e raízes de dentes, osso, pulmão, mama, úbere, pâncreas, estômago, esôfago, músculo incluindo músculo cardíaco, fígado, vaso sanguíneo, pele in- cluindo cabelo, coração, cérebro, tecido nervoso, rim, testículo, prós- tata, pênis, cloaca, nadadeira, ovário ou intestino.
40. Composição ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a refe- rida administração é a administração direta ao tecido ou órgão.
41. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com- preende elementos de ácido nucleico na seguinte ordem: a. uma primeira sequência da sequência de repetição termi- nal invertida (ITR); b. uma sequência promotora de TRE3G; c. uma sequência Oct4; d. uma sequência de clivagem P2A; e. uma sequência Sox2; f. uma sequência de clivagem T2A; g. uma sequência Klf4; h. uma sequência terminadora derivada de SV-40; e i. uma segunda sequência de repetição terminal invertida (ITR).
42. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a sequência Oct4 é SEQ ID NO: 40.
43. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que a sequência Sox2 é SEQ ID NO:
42.
44. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que a sequência Klf4 codifica a proteína Klf4 humana.
45. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que a sequência Klf4 é SEQ ID NO: 44.
46. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que a sequência P2A codifica um polipeptídeo com a sequência GSGATNFSLLKQAGDVE- ENPGP (SEQ ID NO: 118).
47. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato de que a sequência P2A é GGCAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGA- GATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT (SEQ ID NO: 119).
48. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que a sequência T2A codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9.
49. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 48, caracterizado pelo fato de que a sequência T2A é GGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGA- CGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA (SEQ ID NO: 120).
50. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, caracterizado pelo fato de que a sequência do promotor TRE3G é SEQ ID NO: 7.
51. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 50, caracterizado pelo fato de que a sequência ter- minadora derivada de SV-40 é SEQ ID NO: 8.
52. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 51, caracterizado pelo fato de que as sequências do promotor TRE3G compreendem pelo menos uma sequência do promo- tor de CMV mínimo.
53. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 52, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma sequência do promotor de CMV mínimo é a SEQ ID NO: 20.
54. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 53, caracterizado pelo fato de que a primeira se- quência de ITR é SEQ ID NO: 22.
55. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 54, caracterizado pelo fato de que o construto com- preende a SEQ ID NO: 38.
56. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 55, caracterizado pelo fato de que o construto com- preende a SEQ ID NO: 121.
57. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 56, caracterizado pelo fato de que o construto é en- capsulado por pelo menos uma nanopartícula.
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