BR112020023128A2

BR112020023128A2 - anticorpo, métodos para imunizar passivamente um mamífero contra uma doença estreptocócica invasiva do grupo a e para tratar ou prevenir uma doença estreptocócica invasiva do grupo a, e, composição

Info

Publication number: BR112020023128A2
Application number: BR112020023128-2A
Authority: BR
Inventors: Michael Good; Manisha Pandey
Original assignee: Griffith University
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-02-02
Also published as: US20210292398A1; MX2020012245A; CN112449603A; KR20210010882A; SG11202011348YA; EP3806896A1; EP3806896A4; CA3100212A1; AU2019268417A1; JP2021523908A; WO2019218022A1

Abstract

  São aqui providos métodos para imunizar contra, tratar ou prevenir a síndrome do choque tóxico estreptocócico em um sujeito, pela administração de uma proteína M de estreptococo do grupo A, inclusive de fragmentos, variantes ou derivados da mesma ou um anticorpo que liga ou é incitado contra a proteína M e opcionalmente uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, inclusive de fragmentos, variantes ou derivados da mesma ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra, a proteína superantigênica.

Description

1 / 71 ANTICORPO, MÉTODOS PARA IMUNIZAR PASSIVAMENTE UM

MAMÍFERO CONTRA UMA DOENÇA ESTREPTOCÓCICA INVASIVA DO GRUPO A E PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA ESTREPTOCÓCICA INVASIVA DO GRUPO A, E, COMPOSIÇÃO CAMPO

[001] ESTA INVENÇÃO diz respeito à prevenção e ao tratamento de doenças causadas pela estreptococos do grupo A. Mais particularmente, esta invenção diz respeito aos anticorpos ou fragmentos de anticorpo para tratar ou prevenir síndrome do choque tóxico associado com o estreptococo do grupo A.

FUNDAMENTOS

[002] As infecções com estreptococo do grupo A (Streptococcus pyogenes, GAS) são altamente predominantes em todos os setores da sociedade com estimativas de mais do que 600 milhões de casos de incidentes de faringite estreptocócica e mais do que 160 milhões de casos predominantes de pioderma estreptocócico. A grande maioria dos casos é benigna e pode ser tratada com antibióticos e cuidados básicos de saúde. Contudo, a doença estreptocócica pode progredir além da garganta e pele, dando origem à doença de GAS invasiva (‘iGAS’), incluindo síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS). Além disso, as infecções não tratadas podem dar origem a sequelas pós estreptocócicas, incluindo doença do coração reumático e glomerulonefrite. A doença de iGAS e as sequelas pós estreptocócicas são particularmente predominantes entre as populações Aborígenes e Ilhéus do Estreito de Torres e entre as populações socialmente desfavorecidas por todo o mundo.

[003] Globalmente, estas condições são responsáveis pela perda de mais do que 500.000 vidas por ano. As estimativas conservadoras agora

2 / 71 colocam a GAS como a quarta causa mais comum de mortalidade relacionada por infecção globalmente (depois da HIV, tuberculose e Streptococcus pneumoniae). Estes números são considerados ser a ‘ponta do iceberg’ havendo aí uma epidemia da doença de iGAS tanto em nações desenvolvidas quanto subdesenvolvidas.

[004] A STSS é principalmente causada por toxinas de superantígeno que ligam de maneira não específica às moléculas MHC II humanas (fora do sulco de ligação de peptídeos) e às cadeias variáveis do receptor da célula T, resultando na ativação da célula T policlonal, frequentemente com >20 % das células T CD4+ sendo ativadas. Isto resulta em uma tempestade de citocina Th1 que é o vínculo causal proposto responsável pela hipotensão e falência de múltiplos órgãos, (que inclui o fígado, rins, sistema de coagulação e sistema respiratório).

[005] Em modelos de camundongo foi mostrado que as células de T são necessárias para a mortalidade mediada por superantígeno. Em um modelo usando um superantígeno estafilocócico (SEB), também foi mostrado que o pré-tratamento antiTNF pode bloquear a letalidade do choque tóxico

[2]. A STSS tem uma mortalidade muito alta, que pode exceder 50 %, mesmo em países de alta renda. Esta condição pode ocorrer depois de qualquer infecção estreptocócica, mas mais comumente ocorre depois de infecções da pele. Esta é geralmente associada com fasciíte necrosante, miosite ou hematomas profundos. A catapora, celulite e punção direta na pele podem ser cofatores significantes.

[006] Os superantígenos (SAgs) são exoproteínas de baixo peso molecular que são secretadas por todas as cepas de GAS patogênico e Staphylococcus aureus. Existem 11 superantígenos sorologicamente distintos em GAS. Nove dos 11 estão localizados nos genes presentes em bacteriófagos. Estes podem ativar as células T primárias e não requerem processamento de antígeno. Os superantígenos demonstram ligação de alta

3 / 71 afinidade à cadeia MHC II β humana e ligação de afinidade relativamente baixa às cadeias de TCR β. A afinidade dos superantígenos para MHC de camundongo é várias ordens de magnitude menor do que para a MHC humana [3] e como tal, camundongos normais não são modelos adequados para estudar a doença mediada por superantígeno. Dos 11 superantígenos que podem estar presentes em GAS, maioria dos casos de STTS são causados por uma ou outra da exotoxina pirogênica estreptocócica (Spe) A ou SpeC [4].

[007] Esforços para desenvolver vacinas para prevenir as STSS são limitados. Um grupo desenvolveu toxóides para SpeA e SpeC e mostrou que a vacinação de coelhos pode levar a anticorpos que neutralizam a toxina e protege os coelhos da toxina nativa administrada por uma bomba miniosmótica. Os coelhos foram não expostos a uma infecção estreptocócica [4, 5]. Este método de vacina sofre com a necessidade de vacinar com múltiplos toxóides para proteger contra somente um aspecto da doença estreptocócica

[008] Os camundongos HLA transgênicos foram usados como um modelo para desenvolver uma vacina candidata usando fragmentos definidos não tóxicos de superantígenos de S. aureus [3]. Estes camundongos não foram inoculados com o organismo, mas com o superantígeno recombinante.

[009] A imunoterapia passiva foi examinada como um meio para tratar STSS. A imunoglobulina intravenosa (IVIG) foi mostrada reduzir significantemente a fatalidade do caso de STSS [6]. Este estudo usou controles históricos, mas em um estudo sueco mais recente de 67 pacientes com controles prospectivos, a mortalidade foi 22 de 44 pacientes tratados com antibióticos sozinhos (50 %) contra 3 de 23 (13 %) no grupo tratado com IVIG mais antibióticos (P<0,01) [7]. Contudo, foi estimado que os tituladores de anticorpo superantígeno de > 40 na IVIG são necessários para o benefício clínico. Isto é aproximadamente a quantidade de anticorpo específico que é encontrado na IVIG e como tais doses múltiplas de IVIG são recomendadas.

4 / 71 Os altos custos de IVIG, variação de lote para lote [8] e dificuldades no fornecimento, salientam a necessidade por terapias adjuvantes alternativas.

SUMÁRIO

[0010] Surpreendentemente, os presentes inventores verificaram que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante destes com ou sem anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento de superantígeno do estreptococo do grupo A ou variante deste são surpreendentemente eficazes contra uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A tal como síndrome do choque tóxico estreptocócico.

[0011] Em uma forma ampla, a invenção, portanto, diz respeito ao uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta e opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta para imunizar passivamente contra, tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A tal como doença de GAS invasiva (iGAS) inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[0012] Em uma outra forma ampla, a invenção diz respeito ao uso de um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A, variante ou derivado deste e opcionalmente uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado deste para vacinar ou imunizar contra, tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A tal como a doença de GAS invasiva (iGAS) inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[0013] Um aspecto da invenção provê um método de imunizar passivamente um mamífero contra a síndrome do choque tóxico

5 / 71 estreptocócico, o dito método incluindo a etapa de administrar ao mamífero: um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra, uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta, para deste modo imunizar passivamente o mamífero contra a síndrome do choque tóxico estreptocócico no mamífero.

[0014] Em uma modalidade particular dos aspectos acima mencionados, o método também inclui a etapa de administrar um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra um superantígeno do estreptococo do grupo A ao mamífero.

[0015] Um outro aspecto da invenção provê um método de tratar ou prevenir a síndrome do choque tóxico estreptocócico em um mamífero, o dito método incluindo a etapa de administrar ao mamífero: uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta e/ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra, uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta para deste modo tratar ou prevenir síndrome do choque tóxico estreptocócico no mamífero.

[0016] Em uma modalidade particular dos aspectos acima mencionados, o método também inclui a etapa de administrar uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta e/ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra, uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta ao mamífero.

[0017] Um outro aspecto da invenção provê uma composição adequada para a administração a um mamífero, a dita composição compreendendo: um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta.

[0018] Em uma modalidade do presente aspecto, a composição

6 / 71 também compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta.

[0019] Para os aspectos acima mencionados, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é adequadamente um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo. Em uma modalidade particular dos aspectos acima mencionados, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é um anticorpo monoclonal recombinante humanizado ou fragmento deste.

[0020] Em um aspecto relacionado, a invenção reside em uma composição adequada para administração a um mamífero, a dita composição compreendendo: uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta e uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta.

[0021] Um outro aspecto relacionado da invenção provê um anticorpo monoclonal ou fragmento deste que liga ou é incitado contra, uma proteína M do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta; e/ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra, uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado desta.

[0022] Preferivelmente, o anticorpo monoclonal ou fragmento é um anticorpo monoclonal recombinante humanizado ou fragmento deste.

[0023] Este aspecto também provê um ácido nucléico isolado que codifica o anticorpo monoclonal recombinante humanizado ou fragmento deste, um construto genético compreendendo o ácido nucléico isolado e/ou uma célula hospedeira compreendendo o construto genético.

[0024] Em uma modalidade particular dos aspectos acima mencionados, o fragmento da proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M. Em uma modalidade, o fragmento M da proteína é, compreende ou está contido dentro de um peptídeo p145.

7 / 71

[0025] Em uma modalidade particular, o fragmento M da proteína é, está contido dentro ou compreende, um peptídeo J8, fragmento, variante ou derivado deste.

[0026] Em uma outra modalidade particular, o fragmento é, está contido dentro ou compreende, um peptídeo p17, fragmento, variante ou derivado deste.

[0027] Em uma outra modalidade particular dos aspectos acima mencionados, o superantígeno é exotoxina pirogênica estreptocócica (Spe) A ou SpeC.

[0028] Adequadamente, como definido nos aspectos acima mencionados o mamífero é um ser humano.

[0029] Como aqui usado, o artigo indefinido ‘um’ é aqui usado para se referir ou abranger os elementos ou características singulares ou plurais e não devem ser considerados como significando ou definindo “um” ou um “único” elemento ou característica.

[0030] A menos que o contexto exija de outra forma, os termos “compreendem”, “compreende” e “compreendendo” ou termos similares são intencionados significar uma inclusão não exclusiva, tal que uma lista citada de elementos ou características não incluem apenas os elementos determinados ou listados, mas podem incluir outros elementos ou características que não são listados ou determinados.

[0031] Por “consistindo essencialmente de” no contexto de uma sequência de aminoácido é intencionado significar a sequência de aminoácido citada junto com um, dois ou três aminoácidos adicionais no terminal N- ou C-.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] Figura 1: (A-B) Infectividade de GAS SN1 em camundongos HLA-B6. Os camundongos HLA-B6 e B6 ingênuos (n = 10/grupo) foram infectados com SN1 de GAS via pele. No dia 6 após a infecção, os

8 / 71 camundongos foram sacrificados e as cargas bacterianas da pele foram avaliadas (A). A presença da infecção sistêmica foi avaliada plaqueando-se as amostras de sangue no dia 3, 4, 5 e 6 após a infecção (B) ***p<0,001. (C-D). Análise de Western blot do soro dos camundongos infectados por SN1***. As amostras de soro coletadas de camundongos BALB/c (C) infectados por SN1 e HLA-B6 e B6 (D) infectados por SN1 e NS33 (um estreptococo do grupo C que não expressa os superantígenos) foram analisados para detectar a presença de SpeC no seu soro. As amostras foram operadas em 4 a 15 % de gel SDS-PAGE. Após transferir a proteína do gel, a membrana foi examinada com anticorpo primário, IgG de Coelho antiSpeC, seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT. A banda em ~26 KDa na amostra de soro dos camundongos SN1 infectados corresponde à rSpeC na amostra de controle positiva.

[0033] Figura 2: (A) Atividade mitogênica de SpeC em um modelo de murino. A proliferação de esplenócitos em resposta à SpeC SN1. Os esplenócitos de camundongos HLA-B6 e B6 foram estimulados in vitro com soro contendo SpeC filtrado estéril de camundongos infectados por GAS SN1 ou com rSpeC. Como controles, o soro filtrado estéril dos camundongos infectados com a cepa de superantígeno negativo GAS (NS33) e ConA também foram incluídos. A proliferação de esplenócitos foi avaliada depois de 72 h e os dados são representados como índices de estímulo (SI). A especificidade da resposta foi confirmada pela adição de anticorpos anti rSpeC, que inibiram a proliferação de esplenócitos em resposta ao soro e rSpeC. (B-C). Perfis de citocina após a proliferação de esplenócitos. As respostas de citocina nos esplenócitos de camundongos HLA-B6 e B6 foram medidas a 72 h após a incubação com vários estimulantes. As concentrações de TNF (B) e IFN-γ (C) nos sobrenadantes de culturas foram medidas usando um kit de CBA. A especificidade da resposta foi confirmada pela adição de anticorpos antirSpeC. ANOVA de uma via com o método post-hoc de Tukey

9 / 71 foi utilizada para calcular a significância entre vários grupos. *p<0,05 e **p<0,01.

[0034] SI foi definido como contagens por minuto na presença de antígeno/contagens por minuto na ausência de antígeno.

[0035] Figura 3. (A). Eficácia protetiva de J8-DT contra infecção por SN1 GAS. Os camundongos HLA-B6 foram vacinados com J8-DT ou PBS no dia 0, 21 e 28. Duas semanas após a imunização, os camundongos foram infectados com GAS SN1 via pele. No dia 6 após a infecção, os camundongos foram sacrificados e a carga bacteriana na pele (CFU/lesão), sangue (cfu/mL) e baço (CFU/baço) são mostradas. (B). Análise de Western blot para detectar toxina no soro. As amostras de soro agrupadas dos grupos vacinados e controle coletadas no dia 6 após a infecção por SN1, foram operadas em 4 a 15 % de géis SDS-PAGE. Depois da transferência da proteína do gel, a membrana foi examinada com IgG de Coelho antiSpeC seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT. A banda a 26 KDa na amostra de soro dos camundongos PBS corresponde à rSpeC na amostra de controle positiva. (C-D). Avaliação da proliferação induzida pelo soro de camundongos infectados vacinados. PBMCs de 2 indivíduos diferentes foram estimuladas com concentração do soro pré-otimizada de camundongos vacinados infectados por SN1 (J8- DT+SN1) ou controle não vacinado (PBS+SN1). PHA e rSpeC foram usados como controles para o estímulo. A especificidade da resposta foi avaliada através da adição de várias quantidades de antissoro rSpeC. PBMC na presença de soro ingênuo foi usado como um controle para a especificidade da neutralização. A proliferação foi medida pela absorção de timidina [3H] depois de 72 h. Os dados são Média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com experimentos repetidos duas vezes. Os dados representativos de dois indivíduos são mostrados. A ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizada para calcular a significância. *p<0,05,

10 / 71 **p<0,01 e ***p<0,001.

[0036] Figura 4. (A-C). Neutralização de rSpeC por antissoro rSpeC. As PBMCs de 3 indivíduos diferentes foram estimuladas com diferentes concentrações de rSpeC na presença de várias quantidades de antissoro rSpeC ou no soro. PHA foi usado como controle. A proliferação foi medida pela absorção de [3H] timidina depois de 72 horas. Os dados são a média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com os experimentos repetidos duas vezes. O índice de estímulo (SI) foi definido como contagens por minuto na presença de antígeno/contagens por minuto na ausência de antígeno. ANOVA de uma via com o método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância. *p<0,05 e ***p<0,001.

[0037] Figura 5. (A) Estudo de inoculação com GAS incubado com J8-DT antissoro. GAS cepa 2031(emm1) foi incubado com rotação for 1 h a 4º C com diluição de 1:50 de antissoro J8-DT. Após as lavagens, os inóculos bacterianos foram injetados intraperitonealmente em camundongos SCID. Depois de 48 horas, os camundongos foram sacrificados e o sangue coletado. As cargas bacterianas em camundongos individuais são mostradas. (B) Neutralização in vivo de SpeC por antissoro rSpeC. Aos camundongos BALB/c infectados por SN1 foram administrados antirSpeC ou soro ingênuo intraperitonealmente no dia 5 após a infecção. Para avaliar a neutralização de SpeC in vivo, as amostras de soro foram coletadas antes de (0 h) e depois de 6 e 24 horas da administração do antissoro. A presença de SpeC no soro de camundongo em vários pontos de tempo é mostrada. (C) Efeito de tratamento de antissoro rSpeC na carga bacteriana da pele. Aos camundongos BALB/c infectados por SN1 foram administrados antirSpeC ou soro ingênuo intraperitonealmente no dia 5 após a infecção. A 24 horas após o tratamento, os camundongos foram sacrificados e as cargas bacterianas foram avaliadas. As cargas bacterianas na pele para os camundongos tratados e não tratados são mostradas. A análise estatística foi realizada usando o teste em U não

11 / 71 paramétrico de Mann-Whitney não emparelhado para comparar os dois grupos. **p<0,01.

[0038] Figura 6. (A-B) Virulência de isolados humanos em um modelo de infecção em pele de murino. Os grupos de camundongos BALB/c foram infectadas com a cepa GAS SN1 ou GAS NS33 por intermédio da via da pele de infecção. Após os dias 3, 6 ou 9 de inoculação, os camundongos foram sacrificados e as amostras da biópsia da pele (A) e baço (B) foram coletadas para determinar a carga bacteriana. Os resultados são mostrados como gráfico de caixas e traços onde a linha na caixa está indicando a média, as extremidades da caixa indicando os quartis superiores e inferiores e os traços mostrando os valores do mínimo ao máximo. (C) Detecção de SpeC em amostra de soro de camundongo individual a partir do dia 6 da coleta. As amostras de soro de cada camundongo individual no dia 6 após a infecção por SN1/NS33 também foram avaliadas quanto a presença de SpeC como descrito. Uma imagem representativa é mostrada. O * indica os camundongos que tiveram cultura no baço positiva. A análise estatística foi realizada usando o teste em U não paramétrico, teste em U de Mann-Whitney não emparelhado para comparar os dois grupos em cada ponto de tempo. **p<0,01 e ***p< 0,001.

[0039] Figura 7. (A) Atividade mitogênica de SpeC em um modelo de murino. Proliferação de esplenócitos em reposta ao SpeC SN1. Os esplenócitos de camundongos HLA-B6 e B6 foram estimulados in vitro com soro contendo SpeC filtrado estéril de camundongos infectados por GAS SN1 ou com rSpeC. Como controles, soro filtrado estéril de camundongos infectados com cepa de GAS de superantígeno negativa (NS33) e ConA também foram incluídos. A proliferação de esplenócitos foi avaliada depois de 72 h e os dados são representados como índices de estímulo (SI). A especificidade da resposta foi confirmada pela adição de anticorpos anti rSpeC, que inibiram a proliferação de esplenócitos em resposta ao soro e

12 / 71 rSpeC. (B-C). Perfis de citocina após a proliferação de esplenócitos. As respostas de citocina nos esplenócitos de camundongos HLA-B6 e B6 foram medidas a 72 h após a incubação com vários estimulantes. As concentrações de TNF (B) e IFN-γ (C) nos sobrenadantes de cultura foram medidas usando um kit de CBA (BD Biosciences). A especificidade da resposta foi confirmada pela adição de anticorpos antirSpeC. ANOVA de uma via com o método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre vários grupos. *p<0,05 e **p<0,01. SI foi definido como contagens por minuto na presença de antígeno/contagens por minuto na ausência de antígeno. (D-F). Proliferação de PBMC humano em resposta ao estímulo com soro de camundongos infectados por GAS SN1 ou GAS NS33. PBMC de três indivíduos diferentes foram cultivados na presença do soro coletado em vários pontos de tempo após a infecção com GAS SN1 ou GAS NS33. A proliferação foi medida através da absorção de [3H] timidina depois de 72 horas. Os dados são a Média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com experimentos repetidos duas vezes.

[0040] Figura 8. (A-B). Infectividade in vivo de GAS SN1 em camundongos HLA-B6. Os camundongos HLA-B6 e B6 ingênuos (n = 10/grupo) foram infectados com GAS SN1 por intermédio da via intraperitoneal de infecção por GAS. Os camundongos receberam 106, 107 ou 108 CFU de SN1. A 24 horas após a infecção, os camundongos foram contados quanto seus sintomas clinicos para avaliar a gravidade da doença. As contagens clínicas dos camundongos tanto HLA-B6 quanto B6 são mostradas. (B) Após a contagem, os camundongos foram sacrificados e a carga bacteriana no sangue e baços avaliada. Os resultados são mostrados como gráfico de caixas e traços onde a linha na caixa está indicando a média, as extremidades da caixa indicando os quartis superiores e inferiores e os traços mostrando os valores de mínimo ao máximo. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre os

13 / 71 grupos de controle e teste. (C) Análise de Western blot do soro de camundongos HLA-B6 e B6 infectados por SN1. As amostras de soro coletadas de camundongos SN1 infectados foram analisadas para detectar a toxina no seu soro. As amostras foram operadas em 4 a 15 % de gel SDS- PAGE. Após a transferência da proteína do gel, a membrana foi examinada com anticorpo primário, IgG de Coelho antiSpeC, seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT. A proteína rSpeC também foi operada como um controle positivo. (D-F) Perfil da citocina do soro de camundongos HLA-B6 após a infecção intraperitoneal com SN1. Os camundongos infectados com SN1 foram sacrificados a 24 h após a infecção os níveis de citocina no sangue foram medidos nas amostras de sangue coletadas do grupo que recebeu a dose mais alta (1x108 CFU) de SN1 usando um kit CBA. As respostas de TNF, IFN-ϒ e IL-2 são mostradas. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre vários grupos. *p<0,05 e **p<0,01. SI foi definido como contagens por minuto na presença de antígeno/contagens por minuto na ausência de antígeno.

[0041] Figura 9. (A-B). Infectividade de GAS SN1 em camundongos HLA-B6. Os camundongos HLA-B6 e B6 ingênuos (n=10/grupo) foram infectados com GAS SN1 ou GAS NS33 via pele. No dia 6 após a infecção, os camundongos foram sacrificados e as cargas bacterianas na pele foram avaliadas (A). A presença de infecção sistêmica foi avaliada plaqueando-se as amostras de sangue no dia 3, 4, 5 e 6 após a infecção (B). Os resultados são mostrados como gráfico de caixas e traços onde a linha na caixa está indicando a média, as extremidades da caixa indicando os quartis superiores e inferiores e os traços mostrando os valores de mínimo ao máximo. (C) Análise de Western blot do soro de camundongos infectados por SN1 ou NS33. As amostras de soro coletadas de camundongos HLA-B6 e B6 infectados por SN1 ou NS33 foram analisadas para detectar a presença

14 / 71 de SpeC no seu soro. As amostras foram operadas em 4 a 15 % de gel SDS- PAGE. Após a transferência da proteína do gel, a membrana foi examinada com anticorpo primário, IgG de Coelho antiSpeC, seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT. A banda a 26 KDa na amostra de soro de camundongos SN1 infectados corresponde ao rSpeC na amostra de controle positiva. (D-F). Respostas de citocina no soro de camundongos HLA-B6 e B6 após a infecção na pele. As respostas de citocina no soro de camundongos HLA-B6 e B6 foram medidas no dia 6 após a infecção com SN1 ou NS33. A concentração de TNF (C), IFN-ϒ (D) e IL-2 foram medidas usando um kit de CBA. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre vários grupos. ***p<0,001.

[0042] Figura 10. (A). Eficácia protetiva de J8-DT contra infecção por GAS SN1. Os camundongos HLA-B6 foram vacinados com J8-DT ou PBS no dia 0, 21 e 28. Duas semanas após a imunização, os camundongos foram infectados com GAS SN1 por intermédio da pele. No dia 6 após a infecção, os camundongos foram sacrificados e a carga bacteriana na pele (CFU/lesão), sangue (cfu/mL) e baço (CFU/baço) são mostradas. (B). Análise de Western blot para detectar toxina no soro. As amostras de soro agrupadas de grupos vacinados e de controle coletadas no dia 6 após a infecção por SN1, foram operadas em 4 a 15 % de géis SDS-PAGE. Após a transferência da proteína do gel, a membrana foi examinada com IgG de Coelho antiSpeC seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT. A banda a 26 KDa na amostra de soro de camundongos PBS corresponde a rSpeC na amostra de controle positiva. (C-D). Respostas de citocina no soro de camundongos HLA-B6 após a infecção da pele. As respostas de citocina no soro de camundongos HLA-B6 vacinados e de controle foram medidas no dia 6 após a infecção com SN1. A concentração de IL-4 e IL-10 (C) e TNF e IFN-ϒ (D)

15 / 71 foi medida usando um kit CBA. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre vários grupos. ***p<0,001. (E-G). Avaliação da proliferação induzida pelo soro de camundongos infectados vacinados/controle. PBMCs de 3 indivíduos diferentes foram estimulados com concentração do soro pré-otimizada de camundongos infectados por SN1 vacinados (J8-DT+SN1) ou infectados por SN1 não vacinados (PBS+SN1). PHA e rSpeC foram usados como controles para o estímulo. A especificidade da resposta foi avaliada através da adição de várias quantidades de rSpeC antissoro. PBMC na presença de soro ingênuo foi usado como um controle para a especificidade de neutralização. A proliferação foi medida através da absorção de [3H] timidina depois de 72 h. Os dados são a Média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com experimentos repetidos duas vezes. Os dados representativos de dois indivíduos são mostrados. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

[0043] Fig 11. Resposta de citocina de PBMC após o estímulo com soro vacinado e de controle. PBMC de três indivíduos diferentes foram estimulados com concentração pré-otimizada do soro de camundongos infectados por SN1 vacinados ou infectados por SN1 de controle. As concentrações ótimas de rSpeC e PHA foram usadas como um controle positivo para o estímulo. O efeito inibidor de rSpeC antissoro foi avaliado adicionando-se uma quantidade pré-otimizada (20 μl) de rSpeC antissoro aos poços selecionados contendo soro infectado por SN1 vacinado ou infectado por SN1 de controle ou rSpeC. Os poços apenas com meio foram usados como controles negativos. As respostas de citocina foram medidas usando um kit de CBA depois de 72 horas de cultura in vitro. Os dados são a média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com experimentos repetidos duas vezes. A análise estatística foi realizada usando o teste em U de Mann-

16 / 71 Whitney não paramétrico, não emparelhado para comparar os dois grupos. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

[0044] Figura 12. (A) Neutralização in vivo de SpeC por antissoro rSpeC. Os camundongos HLA-B6 foram infectados com GAS SN1 via pele. No dia 5 após a infecção, os camundongos foram administrados com antirSpeC ou soro ingênuo intraperitonealmente. Para avaliar a neutralização de SpeC in vivo, as amostras de soro foram coletadas entes de (0 h) e depois a 6 e 24 h após a administração antissoro. A presença de SpeC em soro de camundongos HLA-B6 tratados e não tratados em vários pontos de tempo é mostrada. (B) Potencial terapêutico de antissoro rSpeC. Para avaliar o potencial terapêutico do antissoro de rSpeC, o número indicado de camundongos que foram sacrificados a 6 e 24 h após a administração do soro. A carga bacteriana na pele e sangue de camundongos tratados e não tratados são mostradas. Os resultados são mostrados como gráfico de caixas e traços onde a linha na caixa está indicando a média, as extremidades da caixa indicando os quartis superiores e inferiores e os traços mostrando os valores mínimos ao máximo. NS p>0,05.

[0045] Figura 13. Potencial terapêutico da imunoterapia de combinação (A) Linha de tempo da infecção e protocolo de tratamento (B) Quatro grupos de camundongos HLA-B6 (n = 3 a 5/grupo) foram infectadas intraperitonealmente com uma dose pré-otimizada de GAS SN1. Dezoito horas após a infecção, os camundongos foram classificados quanto os sintomas clinicos e intravenosamente administrados com 200 μL de antiJ8- DT, antirSpeC, uma combinação de antiJ8-DT e antirSpeC ou soro ingênuo. A 24 h após o tratamento (42 h após a infecção) os camundongos foram avaliados quando as classificações clínicas e depois sacrificados. As amostras de sangue e do baço foram coletadas, processadas e plaqueadas para a quantificação bacteriana. As cargas bacterianas no sangue e no baço dos camundongos são mostradas. (C) Todos os camundongos foram classificados

17 / 71 quanto os sintomas clinicos antes e depois do tratamento para avaliar a severidade da doença. As classificações clínicas para todas os grupos antes (0h) e depois (24 h) do tratamento antissoro são mostradas. (D-G) Para avaliar a neutralização de SpeC in vivo, as amostras de soro de todas os grupos foram coletadas antes (0 h) e depois a 24 h após a administração do antissoro. A presença de SpeC em camundongos HLA-B6 tratados com soros de antissoro de J8-DT (D), antissoro de rSpeC (E) antissoro de J8-DT+rSpeC (F) ou antissoro de PBS (G) antes e depois tratamento são mostradas. O teste de Mann-Whitney foi realizado para comparar cada grupo com o grupo tratado com PBS de controle. *p<0,05, **p< 0,01, ***p<0,001 e NS p>0,05.

[0046] Figura 14. Proliferação de esplenócitos e inibição em resposta aos antígenos de StrepA e vários antissoros. (A) Avaliação da proliferação em resposta ao soro infectado por SN1 e sua inibição pelo antissoro. A proliferação dos esplenócitos foi avaliada em resposta aos soros de camundongos contendo SpeC infectados por GAS SN1 na presença ou ausência de antissoro de J8-DT, rSpeC, J8-DT+rSpeC ou PBS. (B) Os esplenócitos estimulados com rSpeC, rM1 ou rSpeC+rM1 também foram incluídos como controles. Como agente de bloqueio, os antissoros de J8-DT, rSpeC ou J8-DT+rSpeC foram usados. A proliferação dos esplenócitos foi avaliada depois de 72 h e os dados são representados como índices de estímulo (SI). **p< 0,01, ***p<0,001 e NS p>0,05.

[0047] Figura 15. O DNA genômico foi extraído de culturas de fase estacionária durante a noite usando o kit de extração de gDNA bacteriano GenElute da Sigma. O gDNA foi qualificado o Nanodrop1000 e depois 2 µg de gDNA usados para a amplificação dos superantígenos. Géis foram depois fluidos como pela legenda da imagem.

[0048] Figura 16. Crescimento In vitro de isolados humanos de GAS no sangue de murinos. Os isolados de GAS foram cultivados O/N em THB com 1 % de neopeptona. Cada isolado foi diluído em série até 10-6 e

18 / 71 incubado com sangue de murino heparinizado fresco em uma razão de 1:3. O crescimento bacteriano no sangue de murinos foi medido depois de 3 horas de incubação a 37ºC e comparado com as contagens de CFU na cultura de partida. Os isolados mostrando um aumento de >20 vezes na CFU foram definidos como isolados com maior potencial de causar as infecções estreptocócicas sistêmicas em um modelo de murino. Os dados mostrados é a média ± SEM para cada isolado.

[0049] Figura 17. Resposta proliferativa de PBMC humano em resposta ao estímulo com soro de camundongos infectados por GAS NS1 ou GAS NS33. As PBMC de três indivíduos diferentes foram estimuladas com diferentes volumes de soro coletados de camundongos infectados com GAS SN1 ou GAS NS33. PHA foi usado como controle. A proliferação foi medida pela absorção de [3H] timidina depois de 72 h. Os dados são a Média ± SEM de 3 réplicas em cada experimento com experimentos repetidos duas vezes. ANOVA de uma via com método post-hoc de Tukey foi utilizado para calcular a significância entre vários grupos. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0050] A presente invenção é pelo menos parcialmente pressuposta na verificação de que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam uma proteína M do estreptococo do grupo A (GAS), fragmento, variante ou derivado desta com ou sem um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado deste são surpreendentemente eficazes contra uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A tal como a doença de GAS invasiva inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[0051] Em uma forma ampla, a invenção, portanto, diz respeito ao uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante deste e opcionalmente um

19 / 71 anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento ou variante deste para imunizar passivamente contra, tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A, tal como a doença de GAS invasiva e inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[0052] Em uma outra forma ampla, a invenção diz respeito ao uso de um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A, variante ou derivado deste e opcionalmente uma proteína do superantígeno do estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado deste para vacinar ou imunizar contra, tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição associados com o estreptococo do grupo A tal como doença de GAS invasiva (iGAS) e inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[0053] Como aqui usado, os termos “estreptococo do grupo A”, “Estreptococos do Grupo A”, “Grupo Estreptocócico A”, “Strep do Grupo A” e a abreviação “GAS” se referem à bactéria estreptocócica do sorogrupo A de Lancefield que são bactérias β-hemolíticas gram positivas da espécie Streptococcus pyogenes. Um fator de virulência importante de GAS é a proteína M, que é fortemente antifagocítica e liga ao fator H do soro, destruindo a C3-convertase e prevenindo a opsonização por C3b. Estes também incluem as “mutantes” virulentas tais como as mutantes CovR/S ou CovRS tal como descritas em Graham et al., 2002, PNAS USA 99 13855, embora sem limitação a estas.

[0054] As doenças, distúrbios e condições causadas pelos estreptococos do grupo A incluem celulite, erisipelas, impetigo, escarlatina, infecções da garganta tal como faringite aguda (“faringite estreptocócica”), bacteremia, doença de GAS invasiva tal como a síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS), fasciíte necrotizante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitação a estes. Em uma modalidade particular, a doença ou condição é ou compreende a síndrome do choque

20 / 71 tóxico estreptocócico (STSS).

[0055] Por “proteína” é intencionado significar um polímero de aminoácido. Os aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou não naturais, D- ou L-aminoácidos como são bem entendidos na técnica.

[0056] O termo “proteína” inclui e abrange “peptídeo”, que é tipicamente usado para descrever uma proteína tendo não mais do que cinquenta (50) aminoácidos e “polipeptídeo”, que é tipicamente usado para descrever uma proteína tendo mais do que cinquenta (50) aminoácidos.

[0057] Um “fragmento” é um segmento, domínio, porção ou região de uma proteína (tal como proteína M, p145, p17, J8 ou J14 ou um superantígeno ou um anticorpo incitado contra ou direcionado a este), que constitui menos do que 100 % da sequência de aminoácido da proteína. Será reconhecido que o fragmento pode ser um fragmento único ou pode ser repetido sozinho ou com outros fragmentos.

[0058] Em geral, os fragmentos podem compreender, consistir essencilamente de ou consiste em até 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou 1600 aminoácidos da proteína de comprimento total.

[0059] Adequadamente, o fragmento é “imunogênico”, em que é intencionado significar que o fragmento pode elicitar uma resposta do anticorpo na administração a um mamífero.

[0060] Como geralmente aqui usado um “anticorpo” é, ou é derivado de, um produto proteico do complexo genético da imunoglobulina, inclusiva dos isótipos tais como IgG, IgM, IgD, IgA e IgE e subtipos tais como IgG1, IgG2a etc, embora sem limitação a estes. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, nativos ou recombinantes. Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fc, Fab ou F(ab)2 e/ou

21 / 71 podem compreende anticorpos Fv de cadeia única (scFvs). Tais scFvs podem ser preparados, por exemplo, como definido nos métodos respectivamente descritos na Patente dos Estados Unidos No 5.091.513, Patente Européia No

239.400 ou o artigo por Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293. Os anticorpos também podem incluir fragmentos de anticorpo multivalentes recombinantes, tais como diacorpos, triacorpos e/ou tetracorpos, compreendendo uma pluralidade de scFvs, bem como demicorpos ativados por dimerização (por exemplo, WO/2007/062466). Por via de exemplo, tais anticorpos podem ser preparados como definido nos métodos descritos em Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 6444; ou em Kipriyanov, 2009 Methods Mol Biol 562 177. Os protocolos bem conhecidos aplicáveis à produção, purificação e uso de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, no Capítulo 2 de Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NI, 1991-1994) e Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

[0061] Os métodos de produzir anticorpos policlonais são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Os protocolos exemplares que podem ser usados são descritos, por exemplo, em Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra e em Harlow & Lane, 1988, supra. Em uma modalidade particular, os anticorpos policlonais podem ser obtidos ou purificados do soro humano de indivíduos expostos a ou infectados por estreptocócicos do Grupo A. Alternativamente, os anticorpos policlonais podem ser incitados contra a proteína M purificada, sintética química ou recombinante, superantígenos ou um fragmento imunogênico ou variante deste, em espécies de produção tais como cavalos e depois subsequentemente purificadas antes da administração.

[0062] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando o método padrão como, por exemplo, originalmente descrito em um artigo por

22 / 71 Köhler & Milstein, 1975, Nature 256, 495 ou pelas modificações mais recentes destes como, por exemplo, descrito em Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra imortalizando-se o baço ou outras células que produzem anticorpos derivadas de uma espécie de produção que foi inoculada com uma ou mais das proteínas isoladas, fragmentos, variantes ou derivados da invenção. O anticorpo monoclonal ou fragmento deste pode estar na forma recombinante. Isto pode ser particularmente vantajoso para “humanizar” o anticorpo monoclonal ou fragmento se o anticorpo monoclonal é inicialmente produzido pelas células do baço de um mamífero não humano.

[0063] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga e/ou é incitado contra uma proteína M, fragmento ou variante desta.

[0064] Como aqui usado um “Fragmento M da proteína” é qualquer fragmento de uma proteína M de GAS que é imunogênica e/ou é capaz de ser ligada por um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Tipicamente, o fragmento é, compreende ou está contido dentro de uma sequência de aminoácido de uma região de repetição C de uma proteína M de GAS ou um fragmento deste. Os exemplos não limitantes incluem p145, que é um 20mer com a sequência de aminoácido LRRDLDASREAKKQVEKALE (SEQ ID NO: 1). Uma sequência de epítopo p145 mínima é SREAKKQVEKAL (SEQ ID NO: 5).

[0065] Em modalidades particulares, o fragmento M da proteína é ou compreende o epítopo p145 mínimo da SEQ ID NO: 5 ou uma variante ou derivado deste.

[0066] A este respeito, os fragmentos da sequência de aminoácido p145 pode estar presente em um peptídeo p17, J14 ou J8s. Portanto, em modalidades particulares, o fragmento M da proteína, variante ou derivado deste consiste, consiste essencialmente de ou compreende um peptídeo p17, um peptídeo J14 ou um peptídeo J8.

[0067] No trabalho realizado antes da presente invenção, algumas

23 / 71 modificações ao peptídeo p145 podem melhorar substancialmente a imunogenicidade contra os estreptococos do grupo A. Em uma modalidade, um peptídeo p17 é um peptídeo p145 modificado que compreende um resíduo N correspondendo ao resíduo 13 da SEQ ID NO: 1 e um aminoácido R no resíduo 17 da SEQ ID NO: 1.

[0068] Preferivelmente, p17 compreende um epítopo mínimo p145 modificado que compreende um resíduo de N correspondendo ao resíduo 6 da SEQ ID NO: 5 e um aminoácido R no resíduo 10 da SEQ ID NO: 1.

[0069] Em uma modalidade, um peptídeo p17 compreende a sequência de aminoácido LRRDLDASREAKNQVERALE (SEQ ID NO: 2).

[0070] Em uma modalidade, um peptídeo p17 compreende um fragmento de epítopo mínimo de p145 modificado que compreende a sequência de aminoácido SREAKNQVERAL (SEQ ID NO: 6).

[0071] As variantes p145 de peptídeo adicional são esboçadas na PCT/AU2018/050893, que é aqui incorporada por referência. As variantes p145 exemplares são providas abaixo: p145 LRRDLDA SREAKKQVEKAL E (SEQ ID NO: 1) p*1. LRRDLDA ENEAKKQVEKAL E (SEQ ID NO: 13) p*2. LRRDLDA EDEAKKQVEKAL E (SEQ ID NO: 14) p*3. LRRDLDA EREAKNQVEKAL E (SEQ ID NO: 15) p*4. LRRDLDA EREAKKQVERAL E (SEQ ID NO: 16) p*5. LRRDLDA EREAKKQVEMAL E (SEQ ID NO: 17) p*6. LRRDLDA VNEAKKQVEKAL E (SEQ ID NO: 18) p*7. LRRDLDA VDEAKKQVEKAL E (SEQ ID NO: 19) p*8. LRRDLDA VREAKNQVEKAL E (SEQ ID NO: 20) p*9. LRRDLDA VREAKKQVERAL E (SEQ ID NO: 21) p*10. LRRDLDA VREAKKQVEMAL E (SEQ ID NO: 22) p*11. LRRDLDA SNEAKNQVEKAL E (SEQID NO: 23) p*12. LRRDLDA SNEAKKQVERAL E (SEQ ID NO: 24)

24 / 71 p*13. LRRDLDA SNEAKKQVEMAL E (SEQ ID NO: 25) p*14. LRRDLDA SDEAKNQVEKAL E (SEQ ID NO: 26) p*15. LRRDLDA SDEAKKQVERAL E (SEQ ID NO: 27) p*16. LRRDLDA SDEAKKQVEMAL E (SEQ ID NO: 28) p*17 LRRDLDA SREAKNQVERAL E (SEQ ID NO: 6) p*18. LRRDLDA SREAKNQVEMAL E (SEQ ID NO: 29)

[0072] Como aqui usado, um “peptídeo de J14” pode compreender a sequência de aminoácido KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (SEQ ID NO: 3) ou um fragmento ou variante desta, um peptídeo com epítopos das células B e T mínimos dentro de p145 que foi identificada como um peptídeo da região C da proteína M de GAS desprovida de autoepítopos da célula T potencialmente deletérios, mas que continha um epítopo da célula B opsônico. J14 é um peptídeo quimérico que contém 14 aminoácidos da região C da proteína M (mostrados em negrito) e é flanqueado por sequências de GCN4 derivadas de levedura que foram necessárias para manter a dobra helicoidal correta e a estrutura configuracional do peptídeo.

[0073] Como aqui usado um “peptídeo J8” é um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácido pelo menos parcialmente derivada de ou correspondente a um peptídeo da região C da proteína M de GAS. O peptídeo J8 adequadamente compreende um epítopo da célula B configuracional e sem autoepítopos da célula T potencialmente deletérios. Uma sequência de aminoácidos preferida do peptídeo J8 é a QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID NO: 4) ou um fragmento ou variante desta, em que os resíduos em negrito correspondem aos resíduos 344 a 355 da proteína M de GAS. Nesta modalidade, J8 é um peptídeo quimérico que também compreende sequências de proteína que ligam ao DNA de GCN4 de flanqueamento que ajudam a manter a dobra helicoidal correta e a estrutura configuracional do peptídeo J8.

[0074] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo

25 / 71 liga e/ou é incitado contra um superantígeno de GAS.

[0075] Como aqui usado um “superantígeno” é uma exoproteína de baixo peso molecular que é secretada pro toda ou uma porção substancial de cepas de GAS patogênicas. Existem 11 superantígenos sorologicamente distintos em Spe-A, Spe-C, Spe-G, Spe-H, Spe-I, Spe-J, Spe-K, Spe-L, Spe- M, SSA e SMEZ designados para GAS. Os superantígenos estreptocócicos demonstram a ligação de alta afinidade à cadeia MHC II β humana e ligação de afinidade relativamente baixa para as cadeias TCR β. As estruturas de proteína de superantígeno estreptocócico mostram uma arquitetura de dois domínios conservados e a presença de uma α-hélice longa acessível ao solvente que atravessa o centro da molécula. O domínio N-terminal é um β- barril misturado com uma dobra de ligação (OB) de oligo- nucleotídeo/oligossacarídeo. O domínio C-terminal mais largo é uma prega β e consiste em uma lâmina β torcida que é encapada pela α4-hélice central que empacota contra uma lâmina torcida antiparalela de quatro tiras. Os superantígenos estreptocócicos são proteínas extremamente estáveis que resistem à desnaturação por calor e ácido e isto é obtido pelo empacotamento próximo dos domínios N- e C-terminal. A estrutura também é estabilizada através de uma seção do terminal N que se estende sobre o topo do domínio C-terminal. notavelmente, a seção mais conservada de todos os superantígenos estreptocócicos é a região que forma a interface entre a α4- hélice e o lado interno do domínio de dobra OB N-terminal. Dos 11 superantígenos que podem estar presentes em GAS, a maioria dos casos de STTS são causados por uma ou outra da exotoxina pirogênica estreptocócica (Spe) A ou SpeC.

[0076] Como aqui usado, uma “variante” de proteína compartilha uma relação de sequência de aminoácido definível com uma sequência de aminoácido de referência. A sequência de aminoácido de referência pode ser uma sequência de aminoácido de uma proteína M, superantígeno ou um

26 / 71 fragmento destes, como anteriormente descrito. A proteína “variante” pode ter uma ou uma pluralidade de aminoácidos da sequência de aminoácido de referência excluída ou substituída por aminoácidos diferentes. É bem entendido na técnica que alguns aminoácidos podem ser substituídos ou excluídos sem mudar a atividade do fragmento imunogênico e/ou proteína (substituições conservativas). Preferivelmente, as variantes proteicas compartilham pelo menos 70 % ou 75 %, preferivelmente pelo menos 80 % ou 85 % ou ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de referência.

[0077] Os exemplos não limitantes de variantes de peptídeo p17 e/ou p145 são descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos US2009/0162369, que é aqui incorporado por referência.

[0078] Os exemplos não limitantes de variantes do peptídeo J8 incluem:

SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID NO: 7)

SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAK C (SEQ ID NO: 8)

SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID NO: 9)

SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID NO: 10)

[0079] Outras variantes podem ser baseadas em heptades tais como descritas em Cooper et al., 1997, que é aqui incorporada por referência.

[0080] Por via de exemplo, se um epítopo é conhecido residir dentro de uma configuração estrutural proteica de α-hélice, então um peptídeo modelo pode ser sintetizado para dobrar a esta configuração. Nós projetamos um modelo de peptídeo α-helicoidal de bobina enrolada com base na estrutura

27 / 71 do zíper de leucina GCN4 (O’Shea et al., 1991). A primeira heptade contém a sequência MKQLEDK (SEQ ID NO: 11), que inclui diversas das características encontradas em um motivo de repetição de heptade em espiral espiralada estável (a-b-c-d-e-f-g)n (Cohen & Parry, 1990). Estes incluem resíduos apolares grandes nas posições a e d, um par ácido/base (Glu/Lys) nas posições e e g (usualmente favorecendo interações iônicas intercadeia) e grupos polares nas posições b, c, f (compatível com a previsão de Lupas et al. (1991)). O peptídeo GCN4 também contém um consenso de valina na posição a. Também foi notado que quando as posições a e d são ocupadas por V e L, um dímero de bobina enrolada é favorecida (Harbury et al., 1994). A repetição de heptade modelo foi derivada destas características de consenso do peptídeo de zíper de leucina GCN4: (VKQLEDK; SEQ ID NO: 12) com o potencial de formar uma bobina enrolada α-helicoidal. Este peptídeo se tornou o peptídeo estrutural. Os fragmentos de sobreposição de um epítopo configuracional sob estudo foram embebidos dentro do peptídeo de bobina enrolada modelo para fornecer um peptídeo quimérico. As substituições de aminoácidos, designadas para garantir as configurações de bobina enrolada helicoidal correta (Cohen & Parry, 1990) foram incorporadas nos peptídeos quiméricos se um resíduo idêntico foi encontrado tanto no peptídeo de modelo helicoidal quanto na sequência de epítopo. As seguintes substituições foram tipicamente usadas: posição a, V para I; b, K para R; c, Q para N; d, L para A; e, E para Q; f: D para E; g, K para R, todos estes resíduos de substituição são comumente encontrados na sua respectiva posição nas proteínas de bobina enrolada (Lupas et al., 1991).

[0081] Os termos geralmente aqui usados para descrever as relações de sequências entre as respectivas proteínas e ácidos nucléicos incluem “janela de comparação”, “identidade de sequência”, “porcentagem da identidade de sequência” e “identidade substancial”. Devido aos respectivos ácidos nucléicos/proteínas poderem cada um compreender (1) apenas uma ou

28 / 71 mais porções de uma sequência de ácido nucléico/proteína completa que são compartilhadas pelo ácido nucléicos/proteínas e (2) uma ou mais porções que são divergentes entre os ácidos nucléicos/proteínas, as comparações de sequência são tipicamente realizadas comparando-se as sequências sobre uma “janela de comparação” para identificar e comparar as regiões locais da semelhança de sequência. A “janela de comparação” se refere a um segmento conceitual de tipicamente 6, 9 ou 12 resíduos contíguos que é comparado a uma sequência de referência. A janela de comparação pode compreende adições ou exclusões (isto é, intervalos) de cerca de 20 % ou menos se comparado à sequência de referência para o alinhamento ótimo das respectivas sequências. O alinhamento ótimo das sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (programa Geneworks pela Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA, aqui incorporado por referência) ou através da inspeção e o melhor alinhamento (isto é, resultando na homologia de porcentagem mais alta sobre a janela de comparação) gerado por qualquer um dos vários métodos selecionados. Referência também pode ser feita à família BLAST de programas como, por exemplo, descrito por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, que é aqui incorporada por referência. A discussão detalhada da análise de sequência pode ser encontrada na Unidade 19.3 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NI, 1995-1999).

[0082] O termo “identidade de sequência” é aqui usado no seu sentido mais amplo para incluir o número exato de emparelhamentos de nucleotídeos ou aminoácidos tendo relação com um alinhamento apropriado usando um algoritmo padrão, tendo relação com o grau em que as sequências são idênticas sobre uma janela de comparação. Deste modo, uma

29 / 71 “porcentagem da identidade de sequência” é calculada comparando-se duas sequências perfeitamente alinhadas durante a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo o número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela) e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem da identidade de sequência. Por exemplo, “identidade de sequência” pode ser entendido significar a “percentagem de emparelhamento” calculada pelo programa computacional DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível da Hitachi Software engineering Co., Ltd., São Franciso do Sul, Califórnia, EUA).

[0083] Como aqui usado, “derivados” são moléculas tais como proteínas, fragmentos ou variantes destes foram alterados, por exemplo, pela conjugação ou complexação com outras porções químicas, pela modificação pós-translacional (por exemplo, fosforilação, acetilação e outros), modificação de glicosilação (por exemplo, adicionando, removendo ou alterando a glicosilação), lipidação e/ou inclusão da sequência adicional de aminoácidos como seria entendido na técnica. Em uma modalidade particular, uma sequência adicional de aminoácido pode compreender uma ou mais pluralidades de resíduos de lisina em um terminal N e/ou C deste. A pluralidade dos resíduos de lisina (por exemplo, polilisina) pode ser uma sequência linear de resíduos de lisina ou pode ser sequências de cadeia ramificada de resíduos de lisina. Estes resíduos adicionais de lisina podem facilitar a solubilidade de peptídeo aumentada. Um outro derivado particular é pela conjugação do peptídeo para toxina da difteria (DT). Isto pode ser facilitado pela adição de um resíduo de cisteína C-terminal.

[0084] A sequência adicional de aminoácidos pode incluir a sequência de aminoácidos de parceiro de fusão que cria uma proteína de fusão. Por via

30 / 71 de exemplo, a sequência de aminoácidos de parceiro de fusão pode auxiliar na detecção e/ou purificação da proteína de fusão isolada. Os exemplos não limitantes incluem ligação metálica (por exemplo, poli-histidina) parceiros de fusão, proteína de ligação de maltose (MBP), Proteína A, glutationa S- transferase (GST), sequências de proteína fluorescentes (por exemplo, GFP), etiquetas de epítopo tal como myc, FLAG e etiquetas de hemaglutinina.

[0085] Outra sequência adicional de aminoácidos pode ser de proteínas carreadoras tal como o toxóide da difteria (DT) ou um fragmento deste ou um fragmento CRM da proteína tal como descrito na Publicação Internacional WO2017/070735.

[0086] Outros derivados considerados pela invenção incluem, mas não são limitados à modificação às cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese de peptídeo ou proteína e o uso de reticuladores e outros métodos que impõe restrições configuracionais nas proteínas imunogênicas, fragmentos e variantes da invenção.

[0087] A este respeito, o técnico habilitado é indicado no Capítulo 15 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2008) para mais metodologia extensiva relacionada à modificação química das proteínas.

[0088] As proteínas M isoladas, proteínas de superantígeno, fragmentos e/ou derivados podem ser produzidos através de qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado à síntese química, tecnologia de DNA recombinante e clivagem proteolítica para produzir fragmentos de peptídeo.

[0089] A síntese química é inclusiva da fase sólida e a síntese de fase de solução. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, embora a referência seja feita aos exemplos das técnicas de síntese química como provido no Capítulo 9 da SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholson (Blackwell Scientific

31 / 71 Publications) e Capítulo 15 da CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NI, EUA 1995- 2008). A este respeito, referência também é feita à Publicação Internacional WO 99/02550 e Publicação Internacional WO 97/45444.

[0090] As proteínas recombinantes podem ser convenientemente preparadas por uma pessoa habilitada na técnica usando protocolos padrão como, por exemplo, descrito em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), em particular, Seções 16 e 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. NI, EUA 1995-2008), em particular, Capítulos 10 e 16; e CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NI, EUA 1995- 2008), em particular, Capítulos 1, 5 e 6. Tipicamente, a preparação da proteína recombinante inclui a expressão de um ácido nucléico que codifica a proteína em uma célula hospedeira adequada.

[0091] Alguns aspectos e modalidades da invenção dizem respeito aos anticorpos recombinantes e fragmentos de anticorpo que ligam ou são incitados contra as proteínas M, proteínas de superantígeno, fragmentos e/ou derivados para a administração aos mamíferos para a imunização passiva contra uma doença associada com o estreptococo do Grupo A da condição tal como STSS. Em uma modalidade particular, os anticorpos recombinantes e fragmentos de anticorpo são “humanizados”, como descrito em seguido. Portanto, alguns aspectos da invenção fornecem um ou mais ácidos nucléicos isolados que codificam os anticorpos recombinantes e os fragmentos de anticorpo que ligam ou são incitados contra as proteínas M, proteínas de superantígeno, fragmentos e/ou derivados.

[0092] O termo “ácido nucléico” como aqui usado indica o DNA de filamento único ou duplo e RNA. O DNA inclui o DNA genômico e cDNA. O RNA inclui mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA e RNA autocatalítico. Os

32 / 71 ácidos nucléicos também podem ser híbridos de DNA-RNA. O ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeos que tipicamente inclui os nucleotídeos que compreendem uma base de A, G, C, T ou U. Contudo, as sequências de nucleotídeos podem incluir outras bases tais como purinas modificadas (por exemplo inosina, metilinosina e metiladenosina) e pirimidinas modificadas (por exemplo, tiouridina e metilcitosina).

[0093] Em uma forma preferida, o um ou mais isolados de ácido nucléico que codificam um fragmento M da proteína, variante ou derivado deste e um agente que facilita a restauração ou que aumenta a atividade de neutrófilo estão na forma de um construto genético.

[0094] Adequadamente, o construto genético está na forma de ou compreende componentes genéticos de um plasmídeo, bacteriófago, um cosmídeo, uma levedura ou cromossomo artificial bacteriano como são bem entendidos na técnica. Os construtos gênicos também podem ser adequados para a manutenção e propagação do ácido nucléico isolado na bactéria ou outras células hospedeiras, para a manipulação pela tecnologia de DNA recombinante.

[0095] Para os propósitos da expressão proteica, o construto genético é um construto de expressão. Adequadamente, o construto de expressão compreende o um ou mais ácidos nucléicos operavelmente ligados a uma ou mais sequências adicionais, tais como sequências heterólogas, em um vetor de expressão. Um “vetor de expressão” pode ser um vetor extracromossômico de autorreplicação tal como um plasmídeo ou um vetor que integra em um genoma hospedeiro.

[0096] Por “operavelmente ligado” é intencionado significar que a(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeo adicional(is) está/estão posicionada(s) com relação ao ácido nucléico da invenção, preferivelmente para iniciar, regular ou de outro modo controlar a transcrição.

[0097] As sequências de nucleotídeo reguladoras serão geralmente

33 / 71 apropriadas para a célula hospedeira ou tecido onde a expressão é necessária. Vários tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras apropriadas são conhecidas na técnica para uma variedade de células hospedeiras.

[0098] Tipicamente, as ditas uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras podem incluir, mas não são limitadas às sequências promotoras, sequências líderes ou de sinal, sítios de ligação ribossômica, início transcricional e sequências de terminação, início de tradução e sequências de terminação e sequências intensificadoras ou ativadoras. Os promotores constitutivos ou indutíveis como conhecidos na técnica são considerados pela invenção. O construto de expressão também pode incluir uma sequência de nucleotídeo adicional codificando um parceiro de fusão (tipicamente provido pelo vetor de expressão) de modo que a proteína recombinante da invenção seja expressada como uma proteína de fusão, como anteriormente descrito.

[0099] Em uma forma preferida, o construto genético é adequado para a vacinação de DNA de um mamífero, tal como um ser humano, codificando- se a proteína M e/ou o superantígeno aqui descrito. Com relação a isso, será reconhecido que a proteína M e a proteína de superantígeno podem ser codificados nos mesmos construtos genéticos ou diferentes para propósitos de vacinação.

[00100] Adequadamente, o construto genético está na forma de ou compreende componentes genéticos de um plasmídeo, bacteriófago, um cosmídeo, uma levedura ou cromossomo artificial bacteriano como devem ser entendidos na técnica. Os construtos gênicos também podem ser adequados para a manutenção e propagação do ácido nucléico isolado na bactéria ou outras células hospedeiras, para a manipulação pela tecnologia de DNA recombinante.

[00101] Adequadamente, a vacinação do DNA é por via de um ou mais construtos de expressão do DNA de plasmídeo. Os plasmídeos tipicamente

34 / 71 compreendem um promotor viral (tal como, promotores SV40, RSV ou CMV). O intron A pode ser incluído para melhorar a estabilidade de mRNA e deste modo aumenta a expressão proteica. Os plasmídeos também podem incluir um sítio de clonagem múltiplo, um sinal de terminação de poliadenilação/transcrição forte, tal como hormônio do crescimento bovino ou sequências de poliadenilação de betaglobulina de Coelho. O plasmídeo também pode compreender elementos transcricionais de ação em cis do vírus do macaco de Mason-Pfizer (MPV-CTE) com ou sem a expressão de envelope aumentada no HIV rev. As modificações adicionais que podem melhorar a expressão incluem a inserção de sequências intensificadoras, introns sintéticos, sequências líderes de adenovírus tripartido (TPL) e/ou modificações à poliadenilação e/ou sequências de terminação de transcrição. O exemplo não limitante de um plasmídeo da vacina de DNA é pVAC que é comercialmente disponível da Invivogen.

[00102] Uma referência útil que descreve a vacinologia de DNA é DNA Vaccines, Methods and Protocols, Segunda Edição (Volume 127 de Methods in Molecular Medicine series, Human Press, 2006).

[00103] Como anteriormente descrito, a invenção provê composições, vacinas e/ou métodos de prevenir ou tratar uma doença distúrbio ou condição associadas com Estreptococo do Grupo A, em um mamífero, tal como a síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[00104] No contexto da presente invenção, por “doença, distúrbio ou condição associados com estreptococo do grupo A” é intencionado significar qualquer patologia clínica resultando da infeção pelo estreptococo do grupo A e inclui celulite, erisipelas, impetigo, escarlatina, infecções da garganta tal como faringite aguda (“faringite estreptocócica”), bacteremia, síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS), fasciíte necrotizante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitação a estas.

[00105] A STSS é principalmente causada pelas toxinas de

35 / 71 superantígeno que ligam não especificamente às moléculas de MHC II humanas (fora do sulco de ligação de peptídeos) e cadeias variáveis do receptor da célula T, resultando na ativação da célula T policlonal frequentemente com >20 % das células CD4+ T sendo ativadas. Isto resulta em uma tempestade de citocina Th1 que é o vínculo causal proposto responsável pela hipotensão e falência de múltiplos órgãos, (que inclui o fígado, rins, sistema de coagulação e sistema respiratório).

[00106] Adequadamente, as composições e/ou métodos “imunizam passivamente” o mamífero contra Estreptococo do Grupo A ou mais particularmente contra STSS. Portanto, a administração de uma combinação de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante deste e anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento de superantígeno do estreptococo do grupo A ou variante deste pode conferir, fornecer ou facilitar a imunidade passiva pelo menos parcial contra a subsequente infecção pelo Estreptococo Grupo A ou pode conferir, fornecer ou facilitar a imunidade pelo menos parcial, pelo menos passiva a uma infecção por estreptococo do Grupo A existente. Também será reconhecido que a “imunidade pelo menos passiva” não exclui a evocação de pelo menos alguns elementos de uma resposta imune de um mamífero hospedeiro tal como a indução de elementos da cascata de complemento, indução de elementos do sistema imune inato tal como macrófagos e outras células fagocíticas e/ou a indução de citocinas, fatores de crescimento, quimiocinas e/ou outras moléculas pró-inflamatórias.

[00107] Adequadamente, a imunização passiva trata ou previne uma doença, distúrbio ou condição associados com Estreptococo do Grupo A em um mamífero tal como doença de iGAS, inclusiva da síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

[00108] Como aqui usado, “tratando”, “tratar” ou “tratamento” se referem uma intervenção terapêutica que pelo menos parcialmente melhora,

36 / 71 elimina ou reduz um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associados com estreptococo do Grupo A, tal como STSS, depois de começar a se desenvolver. O tratamento não precisa ser absoluto para ser benéfico ao mamífero. O efeito benéfico pode ser determinado usando qualquer método ou padrão conhecido ao técnico de habilidade comum.

[00109] Como aqui usado, “prevenir”, “previne” ou “prevenção” se referem um curso de ação iniciado antes da infecção por ou exposição a, estreptococo do Grupo A e/ou antes do início de um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associados com estreptococo do Grupo A, tal como STSS, de modo a prevenir a infecção e/ou reduzir o sintoma ou sinal patológico. Deve ser entendido que tal prevenção não precisa ser absoluta para ser benéfica a um paciente. O tratamento “profilático” é um tratamento administrado a um paciente que não apresenta sinais de uma doença, distúrbio ou condição associada com estreptococo do grupo A ou apresenta somente sinais precoces para o propósito de diminuir o risco de desenvolver um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associados com estreptococo do Grupo A,.

[00110] Em alguns aspectos e modalidades, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante deste e anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento ou variante de superantígeno do estreptococo do grupo A, podem ser administrados a um mamífero separadamente ou em combinação.

[00111] Por “separadamente” é intencionado ser administrado como unidades discretas, respectivamente compreendendo os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante deste e anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam o fragmento de superantígeno do estreptococo do grupo A ou variante ao mesmo tempo ou que são temporariamente espaçados de

37 / 71 uma maneira que retém a eficácia combinatória ou sinergística dos respectivos anticorpos ou fragmentos de anticorpo.

[00112] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento da proteína M do estreptococo do grupo A ou variante deste e anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligam um fragmento ou variante de superantígeno do estreptococo do grupo A, podem ser administrados na forma de uma composição.

[00113] Em uma forma preferida, a composição compreende um carreador, diluente ou excipiente aceitáveis.

[00114] Por “carreador, diluente ou excipiente aceitáveis” é intencionado um enchedor diluente ou substância de encapsulamento sólidos ou líquidos, que podem ser usados de maneira segura na administração sistêmica. Dependendo da via particular de administração, uma variedade de carreadores, diluentes e excipientes bem conhecidos na técnica podem ser usados. Estes podem ser selecionados de um grupo incluindo açúcares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, óleos sintéticos, polióis, ácido algínico, soluções tamponadas de fosfato, emulsificadores, soluções salinas isotônicas e sais, tais como sais de ácido mineral incluindo cloridretos, brometos e sulfatos, ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos e malonatos, água e água isenta de pirógeno.

[00115] Uma referência útil descrevendo os carregadores, diluentes e excipientes aceitáveis é a Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. EUA, 1991) que é aqui incorporada por referência.

[00116] Adequadamente, a proteína M e/ou superantígeno de proteína aqui descritos, inclusivos de fragmentos, variantes e derivados destes, são imunogênicos. No contexto da presente invenção, o termo “imunogênico” como aqui usado indica a capacidade ou potencial de gerar ou evocar uma resposta imune, tal como para o estrep. do Grupo A ou componentes moleculares destes, tal como proteína M ou um superantígeno, na

38 / 71 administração de proteína ou peptídeo imunogênicos a um mamífero.

[00117] Por “evoca uma resposta imune” é intencionado gerar ou estimular a produção ou atividade de um ou mais elementos do sistema imunológico inclusiva do sistema imunológico celular, anticorpos e/ou o sistema imunológico nativo. Adequadamente, o um ou mais elementos do sistema imunológico incluem linfócitos B, anticorpos e neutrófilos.

[00118] Preferivelmente, para os propósitos de evocar uma resposta imune, alguns agentes imunológicos podem ser usados em combinação com a proteína M, fragmento, variante ou derivado desta, tal como um peptídeo J8, e/ou a proteína de superantígeno, fragmento, variante ou derivado, tal como SpeA e SpeC, ou com um ou mais construtos genéticos que codificam os mesmos.

[00119] O termo “agente imunológico” inclui dentro de seu escopo carregadores, agente de liberação, imunoestimulantes e/ou adjuvantes como são bem conhecidos na técnica. Como será entendido na técnica, imunoestimulantes e adjuvantes se referem a ou incluem uma ou mais substâncias que aumentam a imunogenicidade e/ou eficácia de uma composição. Os exemplos não limitantes de imunoestimulantes e adjuvantes adequados incluem esqualano e esqualeno (ou outros óleos vegetais ou de origem animal); copolímeros de bloco; detergentes tais como Tween® 80; Quil® A, óleos minerais tais como Drakeol ou Marcol, óleos vegetais tais como óleo de amendoim; adjuvantes derivados de Corynebacterium tais como Corynebacterium parvum; adjuvantes derivados de Propionibacterium tais como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacille Calmette and Guerin ou BCG); antígenos de Bordetella pertussis; toxóide de tétano; difteria toxóide; substâncias de superfície ativa tais como hexadecilamina, octadecilamina, ésteres do aminoácido de octadecila, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N-dicoctadecil-N’,N’1-bis(2-hidroxietil- propanediamina), metoxihexadecilglicerol, e polióis plurônicos; poliaminas

39 / 71 tais como pirano, sulfato de dextrano, pol IC carbopol; peptídeos tais como dipeptídeo de muramila e derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsões de óleo; e géis minerais tais como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alume; interleucinas tais como interleucina 2 e interleucina 12; monocinas tais como interleucina 1; fator de necrose tumoral; interferonas tais como gama interferona; DNA imunoestimulador tal como DNA de CpG, combinações tais como saponina-hidróxido de alumínio ou hidróxido de alumínio de Quil-A; lipossomos; ISCOM® e ISCOMATRIX® adjuvante; extrato de parede celular micobacteriana; glicopeptídeos sintéticos tais como dipeptídeos de muramila ou outros derivados; Avridina; derivados de lipídeo A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano sozinho ou com fosfato de alumínio; carboxipolmetileno tal como Carbopol’ EMA; emulsões de copolímero acrílico tal como Neocryl A640 (por exemplo, Pat. U.S. No. 5,047,238); emulsificadores de água em óleo tal como Montanida ISA 720; proteínas de poliovírus, vaccinia ou poxvírus animal; ou misturas destes.

[00120] Os agentes imunológicos podem incluir carregadores tais como tiroglobulina; albuminas tais como albumina do soro humano; toxinas, toxóides ou qualquer material reativo cruzado mutante (CRM) da toxina do tétano, difteria, coqueluche, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus, e Streptococcus; poliaminoácidos tais como poli(ácido de lisina:glutâmico); influenza; Rotavírus VP6, Parvovírus VP1 e VP2; proteína nuclear do vírus da hepatite B; vacina recombinante do vírus da hepatite B e outros. Alternativamente, um fragmento ou epítopo de uma proteína carregadora ou outra proteína imunogênica podem ser usados. Por exemplo, um epítopo da célula T de uma toxina bacteriana, toxóide ou CRM pode ser usado. A este respeito, referência pode ser feita à Patente U.S. No 5.785.973 que é aqui incorporada por referência.

[00121] Qualquer procedimento adequado é considerado para produzir as composições de vacina. Os procedimentos exemplares incluem, por

40 / 71 exemplo, aqueles descritos em New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong), que é aqui incorporada por referência.

[00122] Qualquer via segura de administração pode ser utilizada, incluindo a administração oral, retal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradérmica, subcutânea, por inalação, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, tópica, mucósica e transdérmica, embora sem limitação a estas.

[00123] As formas de dosagem incluem tabletes, dispersões, suspensões, injeções, soluções, xaropes, trociscos, cápsulas, pulverizadores nasais, supositórios, aerossóis, emplastros transdérmicos e outros. Estas formas dosagem também incluir dispositivos de injeção ou implante de liberação controlada especificamente projetado para este propósito ou outras formas de implantes modificados para agir adicionalmente desta maneira. A liberação controlada pode ser efetuada revestindo-se com polímeros hidrofóbicos incluindo resinas acrílicas, ceras, álcool alifático superior, ácidos poliláticos de poliglicóis e alguns derivados de celulose tais como hidroxipropilmetil celulose. Além disso, a liberação controlada pode ser efetuada usando-se outras matrizes poliméricas, lipossomos e/ou microesferas.

[00124] As composições podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, sachês, comidas/alimentos funcionais ou tabletes, cada um contendo uma quantidade pré-determinada de um ou mais agentes terapêuticos da invenção, como um pó ou grânulos ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso, um líquido não aquoso, uma emulsão de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo. Tais composições podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos da farmácia, mas todos os métodos incluem a etapa de trazer em associação um ou mais agentes como descrito acima com o carregador que constitui um ou

41 / 71 mais ingredientes necessários. Em general, as composições são preparadas misturando-se uniforme e intimamente os agentes da invenção com carregadores líquidos ou carregadores sólidos finamente dividido ou ambos, e depois, se necessário, modelando o produto na apresentação desejada.

[00125] As composições acima podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em uma quantidade que seja eficaz. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta benéfica em um paciente em um período apropriado de tempo. A quantidade de agente(s) a ser administrada pode depender do paciente a ser tratado, incluindo a idade, sexo, peso e condição de saúde geral deste, fatores que dependerão do julgamento do profissional de saúde.

[00126] Como geralmente aqui usado, os termos “paciente”, “indivíduo” e “sujeito” são usados no contexto de qualquer recipiente mamífero de um tratamento ou composição aqui descritos. Portanto, os métodos e composições aqui descritos podem ter aplicações médicas e/ou veterinárias. Em uma forma preferida, o mamífero é um ser humano.

[00127] De modo que a invenção possa ser completamente entendida e colocada em efeito prático, referência é feita aos seguintes Exemplos não limitantes.

EXEMPLOS INTRODUÇÃO

[00128] Quando considerando uma imunoterapia passiva com base em anticorpo, foi reconhecido que os anticorpos para a proteína M de superfície (e para superantígenos) são significantemente menores em indivíduos que desenvolvem uma doença invasiva [9] e que os baixos níveis de anticorpos na população geral podem ter contribuído para epidemia da doença invasiva que começou nos anos de 1980 [10, 11]. Contudo, não é possível determinar se os anticorpos são baixos nos indivíduos antes da infecção invasiva ou se

42 / 71 tornaram-se baixos depois do começo da infecção como um resultado do catabolismo do anticorpo. Nós raciocinamos que uma maneira direta de resolver esse problema é com um modelo de STSS no qual os animais podem ser vacinados e inoculados ou infectados e tratados. Desenvolvemos uma vacina para GAS que tem base em um segmento altamente conservado da proteína M (revisto em [12]). O antígeno é conhecido como J8 e sua sequência copia 12 aminoácidos da repetição C3 da proteína M. A vacinação com J8 ligada à difteria toxóide (J8-DT) induz anticorpos que opsonizam GAS in vitro sem relação com o tipo de M e pode proteger os camundongos da inoculação intraperitoneal e de pele [13-16]. Contudo, como os camundongos normais não são suscetíveis aos superantígenos (devido à afinidade muito baixa das moléculas de MHC II do camundongo aos superantígenos), não é conhecido se essa vacina preveniria STSS. O trabalho aqui descrito provê um modelo murino adequado para testar a vacina de GAS J8 como uma pré-infecção de medida preventiva e as imunoterapias passivas usando anticorpos para J8 e para SpeA e SpeC como opções de tratamento após a infecção.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00129] SN1SN4 são isolados de GAS clínicos coletados do sangue (x3) ou cotonete de ferida (x1) de quatro adultos que desenvolveram STSS em Brisbane aproximadamente ao mesmo tempo em 2015. Dois dos quatro pacientes sucumbiram à doença. Os organismos foram cultivados em nosso laboratório com SN1 sendo usado para desenvolver o conjunto de dados preliminares (abaixo). O SpeC recombinante (rSpeC) foi comercialmente adquirido da Toxin Tech (EUA) e usado em experimentos in vitro e para gerar anticorpos anti-SpeC em camundongos. camundongos B6 HLA- transgênicos (‘HLA-B6’) expressam HLA-DR3 e HLA-DQ2 [17].

[00130] Os organismos foram todos do tipo emm 89. O DNA genômico foi extraído das culturas de fase estacionária durante a noite usando o Kit de

43 / 71 extração de gDNA bacteriano GenElute (Sigma). O gDNA foi qualificado usando o Nanodrop1000 e depois 2 µg de gDNA foi usado para a amplificação de todos os genes de superantígeno conhecidos. SDS-PAGE demonstrou que SN14 continham todos o gene SpeC. Estes também foram positivos para SpeG e SmeZ mas negativos para Spes, A, L, M, H, I, J, K e ssa.

RESULTADOS

[00131] Verificamos que os camundongos HLA-B6 podem desenvolver a doença de iGAS após a infecção de pele com non-cepas de pele adaptadas a camundongo GAS (Fig 1A-B). Por contraste, as cepas GAS precisam ser adaptadas por passagem serial antes de serem capazes de causar a doença de iGAS em camundongos normais não humanizados. Isto pode se relacionar com a vantagem de sobrevivência que os superantígenos concedem ao GAS [18] e a necessidade das moléculas MHC II humanas para os superantígenos serem estimuladoras. Deste modo, os camundongos HLA-B6 devem ser ideais para modelar STTS. Mesmo assim, após a infecção com GAS que secreta SpeC, os camundongos BALB/c (que não HLA-transgênico) mostraram a presença da toxina SpeC no seu soro no dia 6 após a infecção (Fig 1 C). Este soro contendo toxina foi filtrado estéril e usado como um reagente para os ensaios in vitro e in vivo. Os camundongos C57/BL6 (B6), HLA-B6 e controle do tipo selvagem, foram infectados com SN1 e com um estreptococo do grupo C (NS33) que não expressa superantígenos. As amostras de soro agrupadas dos camundongos infectados foram coletadas no dia 6 após a infecção e operadas em um gel de SDS-PAGE com gradiente de 4 a 15 %. Após a transferência da proteína do gel, a membrana foi examinada com anticorpo primário, IgG de Coelho anti-SpeC (Toxin-Tech, EUA), seguido pela detecção com IgG-AP de Ovelha antiCoelho (Sigma-Aldrich) e desenvolvida usando substrato de BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). A proteína rSpeC também foi conduzida como um controle positivo. O SpeC foi

44 / 71 detectado no soro de camundongos SN1 infectados, considerando que o soro de camundongos infectados com NS33 não mostrou a presença da toxina (Fig 1 D).

[00132] O soro contendo SpeC de camundongos BALB/c infectados, ou rSpeC, foi adicionado às culturas de esplenócito de B6 ou camundongos HLA-B6. Nós observamos a proliferação significante de células esplênicas HLA-B6 (mas não as células do baço de camundongos B6) na presença do soro de camundongos infectados ou na presença de rSpeC, mas não na presença do soro de camundongos infectados com o estreptococo do grupo C (NS33) (Fig 2 A). A proliferação foi quase completamente bloqueada pelos anticorpos anti-rSpeC indicando que os outros superantígenos presentes em SN1 exerceram atividade mínima (Fig 2 A). Nós observamos respostas similares quando medindo a secreção de TNF e gama IFN (Fig 2 B-C). Os soros de camundongos BALB/c infectados, ou rSpeC, também foram adicionados às células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de três voluntários adultos saudáveis. Nós observamos uma proliferação significante dos linfócitos em todos os doadores, em uma maneira responsiva de dose (abaixo de 5 µL por poço) ao soro de camundongos infectados por SN1, mas não ao soro de camundongos infectados por NS33. A 20 µL de soro de SN1 por poço, a proliferação dos linfócitos foi similar àquela induzida pelo mitógeno, PHA. A proliferação foi bloqueada pelos anticorpos anti-rSpeC. Estes dados demonstram que o SN1 expressa SpeC que é capaz de ativar não especificamente os linfócitos de camundongos HLA humanizados e de humanos, consistente com a patogênese conhecida do STSS. Os dados também sugerem que os camundongos HLA-B6 podem ser usados para modelar STSS.

[00133] Prevenção de STSS de camundongo por intermédio da vacinação com J8. Para determinar se a vacinação com J8-DT vai prevenir STSS, nós inicialmente perguntamos se este preveniria a doença da pele e

45 / 71 iGAS causada por SN1. A vacinação intramuscular (x3) de camundongos HLA-B6 com J8-DT/Alume reduziu a carga bacteriana na pele, sangue e baço entre 10.000 e 10.000.000 de vezes (Fig 3 A). A análise de Western blot do soro coletado no dia 6 após a inoculação demonstrou o SpeC no soro dos camundongos de controle (PBS), mas não no soro de camundongos vacinados com J8-DT (Fig 3 B).

[00134] Nós então testamos se o soro de camundongos infectados por SN1 vacinados por J8-DT ativariam as PBMCs coletadas de voluntários saudáveis. Nós observamos que o soro de camundongos não vacinados causou a proliferação robusta em 3 de 3 indivíduos (até 50 % do nível induzido por PHA) mas aquele soro dos camundongos vacinados resultou em inicialmente uma proliferação menos significante. Os dados representativos de 2 indivíduos são mostrados (Fig 3 C-D). Similarmente, o antissoro para rSpeC significantemente reduziu a resposta proliferativa causada pelo soro dos camundongos infectados por SN1. Além disso, contudo, nós observamos que o antissoro anti-rSpeC (10 a 20 µL) adicionado ao soro de camundongos de camundongos HLA-B6 vacinados com J8-DT resultou na proliferação não maior do que os níveis de fundo (SI~ 1; P< 0,05-0,01).

[00135] Desenvolvimento de uma imunoterapia passiva. O objetivo é desenvolver uma imunoterapia de combinação passiva consistindo de anticorpos para SpeA/C e anticorpos para J8. Nossos dados preliminares mostram que o soro de camundongos BALB/c imunizados com rSpeC pode bloquear completamente o efeito mitogênico de rSpeC no PBMC humano quando a toxina foi adicionada a 0,05 µg/ml, 0,5 µg/ml e 5 µg/ml (Fig 4). O antissoro foi eficaz até um nível de 5 µL por poço.

[00136] No presente Exemplo, nós também mostramos a capacidade do antissoro J8 de limitar o desenvolvimento de STSS, mas nós mostramos que o antissoro J8 (predominantemente IgG1) de camundongos normais pode reduzir rapidamente a biocarga bacteriana em animais recipientes (Fig 5 A).

46 / 71 Contudo, nossos dados mostram que uma combinação de anti-SpeC e anticorpos anti-J8 são superiores em que estes neutralizam tanto SpeC quanto a proteína M e através da inclusão de anticorpos anti-J8, estes também removem a bactéria da circulação. Nós também vimos que o antissoro anti- SpeC administrado aos camundongos BALB/c 5 dias depois a infecção pode neutralizar o SpeC dentro de 6 horas de administração (Fig 5 B). Contudo, este tratamento não levou a uma redução na carga bacteriana da pele (Fig 5 C).

OUTROS ESTUDOS PROPOSTOS

[00137] Nós mostramos que a doença de iGAS pode desenvolver em camundongos HLA-B6 após a infecção com cepas de GAS não adaptadas aos camundongos e que os linfócitos de camundongos HLA-B6 em ao SpeC de GAS SN1 em uma maneira consistente com a patogênese de STSS. Para estender a pesquisa, nós primeiramente perguntamos se outras cepas de GAS que nós temos em nossa coleção e que conhecemos de triagens genômicas ser POS SpeC (Tabela 1), também ativarão os linfócitos de camundongos HLA- B6. Nós determinaremos, por intermédio de western blot, a presença de SpeC no soro de camundongos HLA-B6 infectados com 4 cepas de GAS POS SpeC adicionais. Os esplenócitos de camundongos HLA-B6 não infectados (n=5/GAS isolado) serão então cultivados com rSpeC ou soro de camundongos infectados com as diferentes cepas de SpeC-POS. A proliferação de linfócitos e TNF e IFN-gama secretados será medida como acima. Em resumo, os esplenócitos ingênuos serão estimulados com uma concentração pré-otimizada do soro de SpeC camundongos infectados com GAS POS. A proliferação será medida pela absorção de [3H] timidina depois de 72 h. Os sobrenadantes de cultura sem células serão testados por várias citocinas usando um kit CBA (BD Biosciences). O soro de camundongo normal (NMS) e o soro de camundongos infectados por Estreptococos NS33 do grupo C NEG para superantígeno serão usados como controles negativos.

47 / 71 Os experimentos serão repetidos pelo menos suas vezes, nós também coletaremos amostras clínicas de GAS e testar estas conforme se tornam disponíveis.

[00138] SpeC é um dos dois principais superantígenos de GAS, o outro sendo SpeA. Nos testaremos de maneira similar a capacidade de 5 diferentes tipos de cepas de GAS POS de SpeA (Tabela 1) e novas amostras (GAS isolados e soro de pacientes STSS) para ativar as células do baço de camundongos HLA-B6.

[00139] SpeA é conhecido ligar a HLA DR4 e DQ8 [18]; contudo, este também liga DR3 e DQ2, indicando que os camundongos HLA-B6 que possuímos atualmente serão adequados para estudos de STSS com GAS que carregam SpeA. Nós usaremos rSpeA como um controle positivo. Este será adquirido da ToxinTech, EUA.

[00140] Nós desenvolvemos previamente um modelos de inoculação de pele [14]. Por estreptococos de inoculação tópica à pele levemente desgastada, este modelo replica de perto a pioderma humana. Dado que a maioria dos casos de STTS começa da pele, isto é o modelo de inoculação ideal. A carga bacteriana pode ser precisamente quantificada pela eutanásia dos camundongos e estimando o número de colônias na pele extirpada homogeneizada. A carga bacteriana invasiva é determinada plaqueando-se amostras de sangue e baço homogeneizadas. Usando este modelo, nós mostramos que a vacinação intramuscular de diferentes cepas de camundongos normais com J8-DT/Alume (x3) pode proteger contra pioderma de GAS e doença de iGAS em uma maneira dependente do sorotipo.

[00141] Os camundongos HLA-B6 serão vacinados (intramuscular x 3) com J8-DT/Alume (ou PBS/Alume como um controle) nos dias 0, 21 e 42. Duas semanas após a vacinação, os camundongos serão inoculados pela pele com 5 diferentes POS de SpeA e 5 diferentes cepas de GAS de POS de SpeC. Tamanhos de grupos de 15 animais serão usados. Os camundongos serão

48 / 71 observados quanto aos sinais de doença clínica no decorrer de 9 dias. As cargas bacterianas na pele, sangue e baço serão estimadas pela eutanásia de um número indicado de camundongos (n = 5 camundongos/grupo) nos dias 3, 6 e 9 após a inoculação. As amostras de soro do sangue coletadas em vários pontos de tempo serão usadas para determinar a presença de SpeA e SpeC, por intermédio de western blot. A presença de níveis elevados de enzimas hepáticas (como um indicador de dano hepático) será investigada como previamente descrito [19]. Os soros dos camundongos vacinados e de controle serão filtrados estéreis e testados quanto sua capacidade de estimular a proliferação linfocítica e a secreção de citocina através das células do baço dos camundongos HLA-B6 e PBMC humano. O ensaio de absorção de [3H] Timidina e kit de CBA serão utilizados para medir a proliferação e secreção de citocina, respectivamente.

[00142] Deste modo, teremos três leituras quanto a proteção de STSS: (i) análise clínica e sorológica de camundongos infectados vacinados; (ii) prevenção do estímulo de esplenócitos de camundongos HLA-B6 in vitro após a incubação com soro filtrado dos camundongos vacinados vs controle; e (iii) prevenção do estímulo de PBMC de voluntários humanos normais após a incubação com soro filtrado de camundongos vacinados vs controle.

[00143] A IVIG também mostrou melhorar significantemente a sobrevivência de STSS e isto tem sido atribuído à presença de anticorpos aos superantígenos estreptocócicos. Adicionalmente, os anticorpos aos superantígenos e à proteína M naturalmente adquiridos foram sugeridos ser responsáveis pela proteção contra STSS.

[00144] Nós testaremos uma combinação de anticorpos anti-SpeA/C e anti-J8 para a proteção contra a biocarga estreptocócica e estímulo de linfócitos mediados por SpeA/C após a infecção de camundongos HLA-B6 com GAS de POS de SpeA e GAS de POS de SpeC. Inicialmente, os experimentos serão realizados sem coterapia de antibiótico. Os anticorpos

49 / 71 monoclonais contra SpeA, SpeC e J8 serão produzidos. Para a produção de anticorpo monoclonal, proteína de superantígenos SpeA e SpeC serão comercialmente fornecidos da Toxin Technology Inc. FL, EUA. Nossos dados preliminares mostram que o antissoro anti-J8 (isótipo IgG1) pode reduzir a biocarga bacteriana em camundongos recipientes em quase 1000 vezes dentro de 48 horas (Fig 5 A) e que o antissoro anti-SpeC administrado aos camundongos BALB/c 6 dias depois da infecção pode neutralizar SpeC dentro de 6 h de administração (Fig 5 B). Contudo, o tratamento antissoro com anti-SpeC não levou a uma redução na carga bacteriana da pele, sugerindo a necessidade por atividade opsônica de anticorpos J8 (Fig 5 C). Os anticorpos monoclonais IgG1 serão testados junto com o antissoro para os superantígenos recombinante e para J8. A atividade será definida como ausência da faixa de superantígeno 26 kDa em WB do soro de camundongos infectados (para o superantígeno MAbs e o MAbs de J8) e a biocarga foi reduzida depois de 24 horas de tratamento (para o Mabs de J8). A quantidade ótima de anticorpo necessária para o bloqueio ou redução significantes de SpeA/C na biocarga será determinada. A maioria dos bloqueadores ativos serão carregados à diante para os estudos de imunoterapia de combinação usando a dose ótima determinada de anticorpo.

[00145] Os camundongos HLA-B6 (10 por grupo) serão infectados com POS de SpeA ou GAS de POS de SpeC. Os camundongos então receberão, ou um anticorpo anti-J8 sozinho, anticorpo anti-SpeA/C sozinho, uma combinação de ambos ou Mab emparelhado com o biotipo de controle por intermédio da via intravenosa. Os camundongos serão então observados quanto os sintomas clínicos e o sangue foi coletado diariamente para estimar a carga bacteriana e a presença/ausência de SpeA/C no sangue. O soro coletado em vários pontos de tempo após o tratamento será usado para testar se estes ativam os linfócitos de camundongos HLA-B6 e voluntários humanos (indicando a presença de superantígenos). O soro também será usado para

50 / 71 medir os níveis de enzimas hepáticas. STSS pode causar uma disfunção hepática resultando em icterícia e altos níveis de aminotransferases devido à hipoperfusão e toxinas circulantes. É esperado que uma melhora significante em todos os parâmetros seja observada dentro de 24 horas. As terapias que têm um benefício clínico positivo serão então administradas para outro grupo de camundongos que receberão a terapia de antibiótico (penicilina) [20] para determinar se a imunoterapia pode acelerar a recuperação.

[00146] Vários dos estudos acima foram realizados no Exemplo 2, descrito abaixo.

SUMÁRIO

[00147] STSS e a doença de iGAS estão aumentando em prevalência anualmente e afeta todos os setores da sociedade, embora as populações marginalizadas carreguem o impacto da epidemia. As melhores opções de tratamento atuais para STSS é IVIG e terapia de antibiótico. Enquanto a IVIG é cara e de qualidade variável, esta não fornece uma boa evidência de que os anticorpos específicos para estreptococos, junto com os antibióticos, sejam necessários para o tratamento. Nossos dados preliminares fornecem uma forte evidência de que os anticorpos para a proteína M e para toxinas específicas serão a melhor linha de tratamento. Os anticorpos específicos de J8 pode neutralizar GAS, e alvejar a região conservada da proteína M, tem a vantagem distinta de ser protetiva contra todas as cepas. Os anticorpos específicos da toxina SpeC podem neutralizar a toxina e fornecer a prova de princípio de que os anticorpos para as outras toxinas principais, SpeA, farão o mesmo. Estas duas toxinas são responsáveis pela maioria dos casos de STSS. A combinação de uma resposta imune alvejando o organismo (anti-J8) com aquela que neutraliza as toxinas principais (anti-SpeA, anti-SpeC) provê uma etapa inovadora que não foi testada ou desenvolvida previamente, mas aquela em que temos habilidades e experiência significantes para mais desenvolvimento e para eventualmente, levar à clínica.

51 / 71 Tabela 1. Lista de isolados de GAS que expressam a toxina SpeA ou SpeC. Nos Isolado Tipo emm Fonte SpeA SpeC 1 SN1 89 Sangue NEG POS 2 NS1 100 Pele NEG POS 3 NS7 80 Sangue NEG POS 4 NS12 61 Sangue NEG POS 5 NS35 53 cotonete de abscesso axilar NEG POS 6 NS24 24 Sangue POS NEG 7 NS25 12 Sangue POS NEG 8 5448 1 Sangue POS NEG 9 88/373 49 Sangue POS NEG Tecido de fasciíte profunda do braço anterior 10 HKU425 1 esquerdo POS NEG

REFERÊNCIAS

[00148] 1. Pahlman, L.I., et al., Streptococcal M protein: a multipotent and powerful inducer of inflammation. J Immunol, 2006. 177(2): p. 1221-8.

[00149] 2. Faulkner, L., et al., The mechanism of superantigen- mediated toxic shock: not a simple Th1 cytokine storm. J Immunol, 2005. 175(10): p. 6870-7.

[00150] 3. DaSilva, L., et al., Humanlike immune response of human leukocyte antigen-DR3 transgenic mice to staphylococcal enterotoxins: a novel model for superantigen vaccines. J Infect Dis, 2002. 185(12): p. 1754-

60.

[00151] 4. McCormick, J.K., et al., Development of streptococcal pyrogenic exotoxin C vaccine toxoids that are protective in the rabbit model of toxic shock syndrome. J Immunol, 2000. 165(4): p. 2306-12.

[00152] 5. Roggiani, M., et al., Toxoids of streptococcal pyrogenic exotoxin A are protective in rabbit models of streptococcal toxic shock syndrome. Infect Immun, 2000. 68(9): p. 5011-7.

[00153] 6. Kaul, R., et al., Intravenous immunoglobulin therapy for streptococcal toxic shock syndrome--a comparative observational study. The Canadian Streptococcal Study Group. Clin Infect Dis, 1999. 28(4): p. 800-7.

[00154] 7. Linner, A., et al., Clinical efficacy of polyspecific intravenous immunoglobulin therapy in patients with streptococcal toxic shock syndrome: a comparative observational study. Clin Infect Dis, 2014.

52 / 71 59(6): p. 851-7.

[00155] 8. Jolles, S., W.A. Sewell, and S.A. Misbah, Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol, 2005. 142(1): p. 1-11.

[00156] 9. Basma, H., et al., Risk factors in the pathogenesis of invasive group A streptococcal infections: role of protective humoral immunity. Infect Immun, 1999. 67(4): p. 1871-7.

[00157] 10. Holm, S.E., et al., Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infections in Sweden, 1988-1989. J Infect Dis, 1992. 166(1): p. 31-7.

[00158] 11. Stevens, D.L., Invasive group A streptococcus infections. Clin Infect Dis, 1992. 14(1): p. 2-11.

[00159] 12. Good, M.F., et al., Strategic development of the conserved region of the M protein and other candidates as vaccines to prevent infection with group A streptococci. Expert Rev Vaccines, 2015. 14(11): p. 1459-70.

[00160] 13. Batzloff, M.R., et al., Protection against group A streptococcus by immunization with J8-diphtheria toxoid: contribution of J8- and diphtheria toxoid-specific antibodies to protection. J Infect Dis, 2003. 187(10): p. 1598-608.

[00161] 14. Pandey, M., et al., A synthetic M protein peptide synergizes with a CXC chemokine protease to induce vaccine-mediated protection against virulent streptococcal pyoderma and bacteremia. J Immunol, 2015. 194(12): p. 5915-25.

[00162] 15. Pandey, M., et al., Combinatorial Synthetic Peptide Vaccine Strategy Protects against Hypervirulent CovR/S Mutant Streptococci. J Immunol, 2016. 196(8): p. 3364-74.

[00163] 16. Pandey, M., et al., Physicochemical characterisation, immunogenicity and protective efficacy of a lead streptococcal vaccine: progress towards Phase I trial. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 13786.

[00164] 17. Chen, Z., et al., A 320-kilobase artificial chromosome

53 / 71 encoding the human HLA DR3-DQ2 MHC haplotype confers HLA restriction in transgenic mice. J Immunol, 2002. 168(6): p. 3050-6.

[00165] 18. Kasper, K.J., et al., Bacterial superantigens promote acute nasopharyngeal infection by Streptococcus pyogenes in a human MHC Class II-dependent manner. PLoS Pathog, 2014. 10(5): p. e1004155.

[00166] 19. Ukpo, G.E., O.A. Ebuehi, and A.A. Kareem, Evaluation of Moxifloxacin-induced Biochemical Changes in Mice. Indian J Pharm Sci,

2012. 74(5): p. 454-7.

[00167] 20. Gonczowski, L. and G. Turowski, The effect of penicillin on skin graft survival in mice. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 1984. 32(3): p. 351-6. EXEMPLO 2 Introdução:

[00168] Infecções estreptocócicas aparentemente brandas podem rapidamente agravar para infecções invasivas sérias com uma alta taxa de mortalidade. A incidência global relatada para as doenças estreptocócicas invasivas (ISD) do grupo A varia entre 2 a 4 por 100.000 pessoas nos países desenvolvidos. Entretanto, a maior parte destes dados foram acumulados a partir de levantamentos múltiplos conduzidos entre 1996 e 2007 [1, 2]. Um estudo a partir da cobertura dos estados Unidos no período de 2005 a 2012 mostrou uma taxa constante de 3,8 por 100.000 [3]. Surtos periódicos nas taxas de incidência foram anteriormente descritos em vários países, mas os relatos mais recentes mostram um aumento preocupante e prolongado na incidência por todo o Canadá, particularmente a partir de 2013 (Public Health Agency of Canada). Em Alberta as taxas têm aumentado dramaticamente de 4,2 por 100.000 em 2003 para 10,2 por 100.000 em 2017 [4]. Taxas muito altas também são relatadas entre os jovens e os idosos e particularmente de países em desenvolvimento. Por exemplo, as taxas de incidência entre indígenas fijianos foram relatadas ser de aproximadamente 60 por 100.000 em

54 / 71 crianças jovens e 75 por 100.000 nos idosos em 2007 [2]. As taxas de incidência global correntes verdadeiras são desconhecidas, mas dados disponíveis apontam para taxas sendo significantemente mais altas do que aquelas relatadas.

[00169] Em aproximadamente 20% dos casos, a ISD é acompanhada por uma síndrome de choque tóxico estreptocócico (STSS) com falência de múltiplos órgãos e taxas de mortalidade em excesso de 40%, mesmo nas instalações melhor equipadas [5]. A mesma pode ocorrer depois de qualquer infecção estreptocócica, mas a maioria habitualmente ocorre depois de infecções da pele e está usualmente associada com fasciíte necrosante, miosite ou hematomas profundos. A gravidez e o puerpério são períodos de risco excessivo, especialmente nos países em desenvolvimento [6].

[00170] Os ‘superantígenos’ (SAgs) estreptocócicos são considerados desempenhar um papel chave na patogênese da STSS. Estas exotoxinas são secretadas por todas as cepas patogênicas de Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus [7]. Nove dos 11 genes SAg estreptocócicos estão localizados nos bacteriófagos. A exotoxina pitogênica (Spe) Estreptocócica codificada em fago A e SpeC são responsáveis pela maioria dos casos de STSS. Os SAgs têm profunda potência imunológica que é derivada da sua ligação não específica às moléculas de MHC humanas (HLA) Classe II (fora da ranhura de ligação de peptídeo) e regiões conservadas das cadeias receptoras de célula T, resultando na ativação policlonal de célula T frequentemente com >25% de células T CD4+ sendo ativadas. A tempestade de citocina Th1 resultante é a ligação causal proposta responsável pela hipotensão e insuficiência de múltiplos órgãos que definem STSS. Isto tem levado a toxóides de SAgs sendo propostos como candidatos para vacina [8, 9]. Entretanto, a patogênese da STSS não é completamente entendida. Outros fatores de virulência estreptocócica, incluindo SLO [10], peptidoglicano, ácido lipoteicóico [11, 12] e a proteína M [13] foram mostrados ser indutores

55 / 71 potentes de citocinas inflamatórias in vitro e estes e outros fatores podem desempenhar papéis importantes na STSS e ser chaves para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias bem sucedidas.

[00171] ‘J8’ é um candidato à vacina com base na região de repetição C-3 altamente conservada da proteína M. O mesmo pode proteger camundongos da septicemia estreptocócica dérmica, mucósica e intraperitoneal por intermédio da opsonofagocitose neutrofílica mediada por anticorpo [14-16]. Quando conjugado ao toxóide da difteria (DT), o mesmo é imunogênico em primatas não humanos [17] e nos seres humanos [18] e é correntemente sendo submetido a testes clínicos adicionais para estudar imunogenicidade e eficácia.

[00172] No presente Exemplo, camundongos transgênicos HLA DR3 DQ2 foram usados para modelar STSS e questionou-se sobre se a vacinação com J8 previniria a doença tipo STSS e se a imunoterapia passiva com anticorpos específicos de J8 e SpeC trataria STSS estabelecida. Os dados demonstram papéis críticos tanto para a proteína SAg quanto para a M na patogênese e mostram que anticorpos para ambas, atuando cooperativamente, completamente anularam tanto os sinais clínicos de doença quanto a atividade mitogênica potente associada de um organismo Estreptococo A isolado de um paciente que sucumbiu à STSS. Resultados Estabelecimento de um modelo de camundongo humanizado para STSS

[00173] SN1 é uma cepa emm 89 de S. pyogenes (estreptococo grupo A) isolado em 2015 a partir do sangue de um paciente em Brisbane que experienciou STSS e sucumbiu à doença. A análise genômica revelou que de todos os 11 genes SAg estreptocócicos conhecidos examinados, SN1 expressou o gene SpeC codificado por fago e os genes SmeZ e SpeG cromossomicamente codificado (Figura 15). O organismo foi negativo para SpeA. Um outro estreptococo grupo A (NS33) (isolado de um paciente com

56 / 71 úlcera no pé originário do Royal Darwin Hospital) não expressou nenhum dos genes SAg.

[00174] Camundongos BALB/c foram infectados por intermédio de escarificação da pele com SN1 ou NS33. Estes camundongos desenvolveram uma infecção de pele, mas não desenvolveram uma infecção sistêmica e não ficaram doentes; entretanto, amostras de sangue coletadas de camundongos infectados com SN1 foram positivas para a toxina SpeC como determinado pela análise de western blot (WB). SpeC não foi detectado no sangue de camundongos infectados com NS33 (Figure 6 A-C).

[00175] Os soros de camundongos BALB/c infectados por intermédio da pele com SN1, ou SpeC recombinante a partir da proteína da E. coli (recSpeC), foram adicionados às culturas de esplenócito B6 ou B6 transgênicos em HLA. Nós observamos proliferação significante de células do baço de camundongos HLA-B6 (mas não de camundongos B6) tanto no soro quanto no recSpeC (Figura 7 A). A proliferação não foi completamente bloqueada pelos anticorpos anti-recSpeC indicando que as outras moléculas presentes no SN1 exerceram alguma atividade mitogênica (Figura 7 A). As respostas proliferativas foram espelhadas pela produção de TNF e IFN-γ - duas citocinas chaves implicadas na patogênese da STSS (Figura 7 B-C). O soro de camundongos infectados com NS33 não induziu nenhuma proliferação nos esplenócitos dos camundongos HLA-B6 ou B6.

[00176] A relevância humana destas respostas foi confirmada quando soros dos camundongos BALB/c infectados, ou recSpeC, foram adicionados às células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de três voluntários adultos saudáveis. Nós observamos proliferação significante de linfócitos em todos os doadores, em uma maneira responsiva à dose (abaixo de 5 μl por poço) para soro de camundongos infectados com SN1, mas não de camundongos infectados com NS33 (Figura 17). Nós também observamos que os soros do dia 6 de camundongos infectados com SN1 causaram

57 / 71 proliferação máxima de linfócitos humano (Figuras 7 D-F), que se correlacionaram com a presença da toxina SpeC no soro neste momento (Figura 6 C). Estes dados demonstraram que SN1 expressa SpeC que é capaz de ativar não especificamente linfócitos a partir de camundongos HLA-B6 e a partir de seres humanos, compatível com a patogênese conhecida de STSS.

[00177] Nós em seguida avaliamos a virulência clínica de SN1 em HLA-B6. Os camundongos foram infectados intraperitonealmente com doses variáveis de SN1 (106, 107, ou 108 CFU). SpeC foi detectado nos soros de camundongos infectados com 1 x 106 CFU, 24 horas após a infecção (Figura 8 A). Neste momento, eles demonstraram sintomas clínicos (Figura 8 B) e foram eutanizados (como definido em um protocolo de comitê de ética aprovado). As cargas bacterianas foram avaliadas no sangue e baço (Figura 8 C). Nós observamos um surto de infecção dependente da dose com contagens clínicas diretamente relacionadas com a carga bacteriana. (Figuras 8 B-C). Altos níveis de TNF, IFN-γ e IL-2 foram detectados nos soros de camundongos infectados (Figuras 9 D-F).

[00178] Nós questionamos se a infecção de pele de camundongos HLA-B6 também causaria a patologia tipo STSS. No dia 6 após a infecção com 1 x 106 CFU, os camundongos HLA-B6 demonstraram carga bacteriana significantemente mais alta na lesão de pele comparados com os camundongos B6 (Figura 9 A). Estes camundongos também desenvolveram septicemia embora a carga bacteriana fosse muito mais baixa do que nos camundongos infectados por intermédio da via intraperitoneal (Figura 9 B). A infecção com NS33 nos camundongos tanto HLA-B6 quanto B6 resultou em uma infecção local modesta (103 a 104 CFU/lesão de pele) sem nenhuma septicemia (Figuras 9 A-B). A SpeC foi detectada no seu sangue (Fig. 9C), que também conteve altos níveis de TNF, IFN-γ e IL-2. Nem a infecção de pele de camundongos HLA-B6 com NS33 nem a de camundongos B6 com SN1 ou NS33, resultaram na indução de citocina (Figuras 9 D-F).

58 / 71 Prevenção por vacina de STSS

[00179] Tendo mostrado que os camundongos HLA-B6 desenvolveram uma patologia tipo STSS a seguir da infecção superficial ou sistêmica com SN1, nós questionamos se isto seria prevenido pela vacinação com J8 unida ao toxóide da difteria e administrados com Alume (J8-DT/Alume). Camundongos vacinados demonstraram uma carga bacteriana reduzida de 1000 a 1.000.000 de vezes na pele, sangue e baço a seguir de uma infecção de inoculação dérmica com SN1 (valores P, <0,05, <0,001 e <0,01, respectivamente) (Figura 10 A). SpeC foi detectada no soro de camundongos de controle vacinados com PBS, mas não no soro de camundongos vacinados com J8-DT (Figura 10 B). As citocinas Th1, IFN-γ e TNF, também foram detectadas no soro de camundongos de controle ao passo que as citocinas Th2, IL-4 e IL-10, foram verificadas no soro de camundongos protegidos (Figs. 10 C, D).

[00180] Os soros filtrados de camundongos vacinados com J8-DT e infectados e controle (vacinados com PBS/infectados), ou recSpeC foram adicionados às culturas de PBMCs humanas de 3 indivíduos saudáveis. O soro de camundongos vacinados com PBS/infectados causou proliferação robusta em PBMC de todos os indivíduos (até 50% do nível induzido por PHA). Isto foi amplamente devido à SpeC bacteriana presente no soro visto que a adição de antissoro recSpeC reduziu o nível de ativação de célula T entre 80 e 90% em uma maneira dependente da dose (Figs 10 E-G). O soro de camundongos vacinados com J8-DT/infectados causou significantemente menos proliferação de célula comparado ao soro de camundongos vacinados com PBS/infectados (90 a 95% de redução) e isto foi adicionalmente reduzido para os níveis de fundo pela adição de antissoro de recSpeC (Índice de Estimulação ~1; p<0,05-0,01) (Figuras 10 E-G). Isto indicou que havia ainda SpeC residual presente no soro de Camundongos vacinados com J8- DT/infectados, embora isto não estivesse evidente a partir da inspeção pelo

59 / 71 WB (Fig 10B). Compatível com os dados de proliferação, a indução de PBMC de citocinas inflamatórias (IFN-γ, TNF, IL-2, IL-6, IL-17) pelo soro de camundongos vacinados com J8-DT/infectados foi significantemente reduzida comparada com a produção de citocinas pelo soro de camundongos vacinados com PBS/infectados (Figura 11). As respostas induzidas pelos soros vacinados com PBS/infectados foram comparáveis com as respostas induzidas por recSpeC. Estes dados assim demonstram que a SpeC estreptocócica é responsável por >90% de toda a ativação de célula T e respostas de citocina observadas in vitro a seguir da infecção por SN1 e que antes da vacinação com J8-DT pode prevenir >90% das respostas in vitro que ocorrem como um resultado de fatores mitogênicos séricos. Embora nós tenhamos anteriormente mostrado que a vacinação com J8-DT pode significantemente reduzir a carga bacteriana a seguir da inoculação, os dados nas Figs. 10 e 11 não excluem um papel separado para anticorpos anti-J8 que estariam tendo um efeito direto sobre a proteína M de SN1 e bloqueariam qualquer efeito mitogênico que a mesma pudesse ter. Imunoterapia para STSS

[00181] Para avaliar a eficácia terapêutica de e antissoros, camundongos HLA-B6 foram infectados com SN1 por intermédio da pele e foram tratados com antissoro (ou soro ingênuo) no dia 5 após a infecção. SpeC foi presente no soro de camundongos infectados antes do tratamento, mas foi significantemente reduzido quando medido em 6 horas e ausente em 24 horas. A mesma foi presente nos camundongos de controle quando medidos em 6 e 24 horas (Fig. 12A). O tratamento com antissoro anti-SpeC não diminuiu a carga bacteriana na pele ou sangue em relação àqueles camundongos recebendo soro ingênuo (Figura 12 C).

[00182] Um grupo adicional de camundongos HLA-B6 foram infectados intraperitonealmente com 1 x 106 bactérias SN1. Estes camundongos ficaram doentes mais rapidamente e em 18 horas após a

60 / 71 infecção, quando as suas contagens clínicas médias foram 10 [19], eles foram administrados com 200 µL de antissoros SpeC, 200 µL de antissoros anti-J8, uma combinação de ambos ou 200 µL de soro ingênuo, intravenosamente (Figura 13A). Todos os camundongos que receberam antissoros J8-DT e/ou rSpeC se recuperaram dentro de 24 horas com redução significante nas contagens clínicas (P<0,01 – P<0,001; Figura 13B); entretanto, foi apenas naqueles camundongos que receberam anticorpos anti-J8 (sozinhos ou em combinação com anticorpos anti-SpeC) que nós observamos a depuração bacteriana do sangue e baço (P<0,01; Figura 13C) e apenas naqueles camundongos que receberam anticorpos anti-rSpeC (sozinhos ou em combinação com anticorpos anti-J8) que nós observamos a depuração de SpeC no sangue (usando o ensaio WB) (Figuras 13D-G). Proteína M de SN1 exerce um efeito mitogênico e contribui para a resposta pró-inflamatória

[00183] A capacidade dos antissoros específicos de J8-DT e SpeC para tratar a patologia tipo STSS in vivo, foi adicionalmente elucidada pelos estudos in vitro. O efeito mitogênico do soro de camundongos infectados com SN1 sobre os esplenócitos HLA-B6 foi parcialmente bloqueado pelo antissoro anti-SpeC e anti-J8-DT mas completamente bloqueado pela combinação de ambos antissoros (Fig. 14B), indicando que os anticorpos específicos de J8 têm um papel dual no tratamento de STSS neste modelo: eles depuram as bactérias mas também bloqueiam o efeito mitogênico da proteína M emm89. Isto tem um efeito sinergístico com o soro anti-SpeC. Embora improvável, o soro SN1 pode conter outros fatores mitogênicos que contenham um epítopo reativo cruzado com J8. Nós assim questionamos se anticorpos anti-J8 bloqueariam o efeito mitogênico de recM1. A Fig. 14C mostra que tanto recM1 quanto SpeC têm atividade mitogênica (como anteriormente mostrado) e que o efeito de ambos é aditivo. Além disso, antissoros anti-J8-DT bloqueiam o efeito mitogênico de recM1 completamente. Uma combinação de

61 / 71 anti-J8-DT e anti-SpeC bloqueou completamente as atividades mitogênicas combinadas de M1 + SpeC. Estes dados coletivamente indicam que anticorpos anti-J8 podem bloquear as atividades mitogênicas de duas proteínas M distintas. Os dados não sugerem que o epítopo de J8 tenha atividade mitogênica, simplesmente que os anticorpos para J8 podem neutralizar a proteína M. Outros sugeriram que o determinante mitogênico na proteína M esteja localizado na metade do terminal amino da proteína. Debate:

[00184] Os dados aqui apresentados mostram que em um modelo de camundongo humanizado em HLA é possível prevenir a doença tipo STSS pela vacinação e tratar rapidamente a doença estabelecida pelos anticorpos contendo imunoterapia específica para J8 e para SpeC. Os anticorpos para J8 têm um efeito dual: eles eliminam as bactérias, mas também diretamente bloqueiam o efeito mitogênico da proteína M, enquanto que os anticorpos para SpeC bloqueiam a atividade desta proteína. Juntos, o efeito é sinergístico e pode completamente resolver a doença tipo STSS.

[00185] Os esforços para desenvolver vacinas para prevenir STSS são limitados. Um grupo desenvolveu toxóides para SpeA e SpeC e mostraram que a vacinação de coelhos pode levar a anticorpos que neutralizam a toxina e protegem os coelhos da toxina nativa administrada por intermédio de uma bomba miniosmótica. Os coelhos não foram expostos a uma infecção estreptocócica [8, 9]. Embora este método de vacina seja promissor, o mesmo sofre da necessidade para vacinar com toxóides múltiplos para proteger contra apenas um aspecto da doença estreptocócica. Nossos dados sugerem que este método não reduz a septicemia bacteriana. Camundongos transgênicos em HLA foram usados para mostrar que certos tipos de HLA são mais propensos à STTS [20], mas não para modelar o desenvolvimento de vacina ou terapia para STSS estreptocócica; entretanto, eles foram usados para desenvolver uma vacina candidata usando fragmentos não tóxicos definidos de

62 / 71 superantígenos de Staphylococcus aureus [21]. Estes camundongos não foram inoculados com o organismo, mas com Sag recombinante.

[00186] Nós desenvolvemos uma vacina Estreptococo A candidata com base em um segmento altamente conservado da proteína M (revisada em

[22]). O antígeno é conhecido como J8 e a sua sequência copia 12 aminoácidos da repetição C3 da proteína M. A vacinação com J8 associado ao toxóide da difteria (J8-DT) induz anticorpos que opsonizam Estreptococo A in vitro, independentemente do tipo M e pode reduzir a carga bacteriana a seguir da inoculação e assim proteger os camundongos da inoculação intraperitoneal, dérmica e mucósica [14, 16, 23 a 25]. Foi assumido que tal proteção mediada pela vacina prolongaria a proteção contra STSS, embora isto não tivesse sido testado em camundongos humanizados com HLA. Entretanto, não foi assumido que a imunoterapia passiva com anticorpos anti- J8 resolveria a doença estabelecida, mesmo se houvesse alguma redução na carga bacteriana visto que sAgs são acreditados desempenha um papel central na doença e não houvesse nenhuma sugestão de que os anticorpos para J8 afetariam os níveis de sAgs séricos. Ficamos surpresos que 200 µL de soro imune ao J8 (com ou sem antissoro anti-SpeC) virtualmente eliminaria toda a carga bacteriana no sangue e baço assim como resolveria as contagens clínicas. Nossos dados não argumentam contra um papel importante para SpeC ou sAgs na patogênese de STSS, particularmente visto que os anticorpos anti-SpeC também podem rapidamente resolver os sinais clínicos. Entretanto, eles argumentam que as manifestações de doença requerem mais do que sAg sozinho.

[00187] Além dos SAgs, a proteína M estreptocócica foi relatada estar associada com respostas pró-inflamatórias levando às infecções estreptocócicas severas [26-29]. Pela estimulação de monócitos por intermédio de TLR2, a proteína M é capaz de produzir altas quantidades de citocinas pró-inflamatórias. Trabalhando-se em sinergia com a proteína de

63 / 71 ligação de heparina (HBP) derivada de neutrófilo, a proteína M induz ao derrame vascular e contribui para as consequências fisiopatológicas observadas nas infecções estreptocócicas severas [30]. Algumas proteínas M tais como M1, M3 e M5 estão compativelmente associadas com surtos de ISD e STSS [31-33]. A região de repetição B da proteína M em certos sorotipos tais como M1 e M5 também pode atuar como um superantígeno e contribui para respostas inflamatórias [34]. Embora certos sorotipos estreptocócicos (que distinguem as cepas com proteínas M de superfície diferentes) fossem relatados estar associados com ISD, é considerado que esta associação simplesmente reflete os sorotipos mais comuns na população geral neste momento [2]. Não obstante, a proteína M pode infrarregular tanto a imunidade inata quanto a adquirida e pode contribuir para a patogênese de ISD.

[00188] A associação de Estreptococo A e SpeC de emm89 com ISD foi observada em vários relatos recentes e no Japão onde emm89 foi o 2o genótipo mais predominante encontrado nos casos de STSS [35].

[00189] É conhecido que os anticorpos para a proteína M de superfície (e para SAgs) são significantemente mais baixos em indivíduos que desenvolvem doença invasiva [36] e foi sugerido que os níveis mais baixos de anticorpos na população geral tivessem contribuído para a epidemia de ISD que começou nos anos 80 [37, 38]. Entretanto, não é possível determinar se os anticorpos são baixos nos indivíduos antes da infecção ou se eles se tornam baixos depois da infecção começada como um resultado do catabolismo anticorpo. Um modo direto para tratar este problema é com um modelo STSS no qual os animais possam ser vacinados e inoculados ou infectados e tratados.

[00190] Nós verificamos que a presença de toxina foi independente da infecção sistêmica. SpeC foi detectado no sangue de camundongos a seguir da infecção dérmica superficial sem bacteremia detectável. Estes camundongos

64 / 71 demonstraram sinais patológicos de doença. Isto é observado em alguns casos de doença clínica [39]. Nós observamos que a seguir da infecção dérmica superficial a toxina foi detectada no soro infectado no dia 6 após a infecção. Isto sugeriu uma liberação lenta de toxina durante a fase inicial de infecção. Esta observação está em linha com o modelo da câmara de tecido e Teflon onde a expressão de altos níveis de SpeA foi observada no dia 7 após a infecção [40]. O início agudo de STSS fluindo para infecção IP foi bastante evidente com a toxina sendo detectada no sangue de camundongos infectados dentro de 24 horas após a infecção levando às altas contagens clínicas. Ao contrário, a infecção dérmica superficial representou o início progressivo de infecção.

[00191] Nós demonstramos tanto em camundongos quanto em seres humanos, a patologia típica associada com a atividade mitogênica de SAgs. A quantidade de SpeC no soro de camundongos infectados teve o potencial para estimular esplenócitos de camundongos HLA-B6 a um nível que foi comparável (se não mais alto) com aquele causado pela ConA ou rSpeC. A proliferação causada pelos soros infectados com SN1 foi mais alto do que a proliferação causada pela rSpeC sozinha; sugerindo assim o envolvimento de alguns outros fatores mitogênicos presentes nos soros infectados com SN1.

[00192] A adição de antissoros anti-SpeC ao soro de camundongos infectados foi capaz de inibir significantemente a resposta proliferativa, confirmando assim que a proliferação foi amplamente devido à SpeC. Não obstante, a proliferação residual observada no grupo tratado indicou o envolvimento de outros fatores de virulência de Estreptococo A incluindo outras proteínas SAg ou M.

[00193] Nós observamos que a vacinação de camundongos HLA-B6 foi eficaz na prevenção da STSS. Notavelmente o mecanismo de proteção envolveu a depuração de Estreptococo A e não a neutralização específica de SpeC secretada. A vacinação com J8-DT resultou na redução significante

65 / 71 (>90%) na carga bacteriana tanto local quanto sistêmica e assim protegeu os camundongos da patologia relacionada com a STSS. Além disso, os soros de camundongos vacinados-infectados também foram mostrados causar proliferação mínima de PBMC a partir de indivíduos saudáveis. Nós acreditamos que este efeito seria atribuído à falta de SpeC, mas também à falta de outros fatores no soro que estão usualmente presentes como um resultado da infecção por Estreptococo A e contribuem para o resultado global da doença.

[00194] A imunoterapia passiva mostrou-se promissora como um meio para tratar STSS. A imunoglobulina intravenosa (IVIG) foi mostrada reduzir significantemente a letalidade da STSS [41]. Este estudo usou controles históricos, mas em um estudo sueco mais recente de 67 pacientes com controles prospectivos, a mortalidade foi de 22 dos 44 pacientes tratados apenas com antibióticos (50%) vs 3 dos 23 (13%) no grupo tratado com IVIG mais antibióticos (P<0,01) [42]. Entretanto, foi estimado que títulos de anticorpo dos superantígenos de > 40 na IVIG são requeridos para benefício clínico. Isto é aproximadamente a quantidade de anticorpo específico que é encontrada na IVIG e como tal doses múltiplas de IVIG são recomendadas. Os altos custos da IVIG, a variação de lote para lote [43] e dificuldades no suprimento salienta a necessidade quanto a terapias adjuntas alternativas. Uma vacina que impeça a infecção com todas as cepas de Estreptococo A ou uma imunoterapia de anticorpo específica dadas no momento do diagnóstico com ou sem antibióticos teriam utilidade muito maior. Nós verificamos que a administração de antissoros de rSpeC foi capaz de neutralizar a toxina, entretanto foi incapaz de reduzir a carga bacteriana nos camundongos HLA- B6 infectados com SN1. Esta observação salientou o fato de que de modo a tratar um indivíduo, doses múltiplas de soro anti-rSpeC serão requeridas até que uma depuração completa da toxina do sistema esteja assegurada. Entretanto, enquanto estes indivíduos abriguem Estreptococo A vivo, os

66 / 71 problemas com respeito às toxinas e a patologia relacionada não serão eliminados.

[00195] Nós levantamos a hipótese de que uma imunoterapia de combinação que resultasse na neutralização da toxina assim como na depuração de Estreptococo A do sistema seria uma alternativa melhor. A depuração de Estreptococo A não apenas reduzirá a necessidade quanto a tratamento contínuo para a neutralização da toxina, mas também eliminará a possibilidade de outros fatores de virulência contribuindo para a patologia de STSS. Como definido nos relatos anteriores nós demonstramos que no modelo HLA-B6 SAgs de Estreptococo A pode não ser o único determinante da fisiopatologia de STSS e outros fatores de virulência de Estreptococo A incluindo a proteína M podem desempenhar um papel crítico. Pela utilização do isolado de Estreptococo A emm89 fomos capazes de mostrar que as proteínas SAg SpeC e M de Estreptococo A trabalham em parceria e contribuem para a doença clínica como observado após a infecção. A neutralização in vivo de proteína M pelos antissoros J8-DT impede a sua interação com fibrinogênio e reconhecimento subsequente por intermédio de integrinas B2 nos neutrófilos. Como um resultado final, não há nenhuma ativação e liberação de mediadores de vazamento vascular, que são uma ocorrência chave na STSS. É provável que a neutralização in vitro de proteína M possa ter seguido um mecanismo diferente envolvendo a falta de indução de citocina e daí por diante respostas inflamatórias.

[00196] Por todo este relatório descritivo, o objetivo foi descrever as modalidades preferidas da invenção sem limitar a invenção a nenhuma modalidade ou coleção específica de traços. Várias mudanças e modificações podem ser feitas às modalidades aqui descritas e ilustradas sem divergir do amplo espírito e escopo da invenção.

[00197] Todos os programas de computador, algoritmos, literatura de patente e científica aqui aludidos são aqui incorporados por referência em sua

67 / 71 totalidade. Referências:

[00198] 1. Lamagni, T.L., et al., Epidemiology of severe Streptococcus pyogenes disease in Europe. J Clin Microbiol, 2008. 46(7): p. 2359-67.

[00199] 2. Steer, A.C., et al., Invasive group a streptococcal disease: epidemiology, pathogenesis and management. Drugs, 2012. 72(9): p. 1213-

27.

[00200] 3. Nelson, G.E., et al., Epidemiology of Invasive Group A Streptococcal Infections in the United States, 2005-2012. Clin Infect Dis,

2016. 63(4): p. 478-86.

[00201] 4. Tyrrell, G.J., et al., Increasing Rates of Invasive Group A Streptococcal Disease in Alberta, Canada; 2003-2017. Open Forum Infect Dis, 2018. 5(8): p. ofy177.

[00202] 5. Lamagni, T.L., et al., Severe Streptococcus pyogenes infections, United Kingdom, 2003-2004. Emerg Infect Dis, 2008. 14(2): p. 202-9.

[00203] 6. Lamagni, E.a., Epidemiology of Streptococcus pyogenes”. In: Streptococcus Pyogenes. Basic biology to Clinical Manifestations. Eds: JJ Ferretti, DL Stevens, VA Fischetti. 2017. University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma. https://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK343616). , 2017: p. pp 601-

627. .

[00204] 7. Fraser, P.a., Streptococcal superantigens: Biological properties and potential role in disease”, In: Streptococcus Pyogenes. Basic biology to Clinical Manifestations. Eds: JJ Ferretti, DL Stevens, VA Fischetti.

2017. University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma. https://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK343616). 2017: p. pp 445-

485.

[00205] 8. Roggiani, M., et al., Toxoids of streptococcal pyrogenic

68 / 71 exotoxin A are protective in rabbit models of streptococcal toxic shock syndrome. Infect Immun, 2000. 68(9): p. 5011-7.

[00206] 9. McCormick, J.K., et al., Development of streptococcal pyrogenic exotoxin C vaccine toxoids that are protective in the rabbit model of toxic shock syndrome. J Immunol, 2000. 165(4): p. 2306-12.

[00207] 10. Hackett S. P., S.D.L., Streptococcal toxic shock syndrome: synthesis of tumor necrosis factor and interleukin-1 by monocytes stimulated with pyrogenic exotoxin A and streptolysin O. . The Journal of Infectious Diseases. , 1992. 165(5): p. 879–885.

[00208] 11. Hackett, S., Ferretti, J. J., & Stevens, D. L., Cytokine induction by viable group A streptococci: suppression by streptolysin O. The 94th Annual Meeting of the American Society for Microbiology 1994. 73.

[00209] 12. Muller-Alouf, H., et al., Comparative study of cytokine release by human peripheral blood mononuclear cells stimulated with Streptococcus pyogenes superantigenic erythrogenic toxins, heat-killed streptococci, and lipopolysaccharide. Infect Immun, 1994. 62(11): p. 4915-21.

[00210] 13. Kotb, M., et al., Temporal relationship of cytokine release by peripheral blood mononuclear cells stimulated by the streptococcal superantigen pep M5. Infect Immun, 1993. 61(4): p. 1194-201.

[00211] 14. Batzloff, M.R., et al., Protection against group A streptococcus by immunization with J8-diphtheria toxoid: contribution of J8- and diphtheria toxoid-specific antibodies to protection. J Infect Dis, 2003. 187(10): p. 1598-608.

[00212] 15. Pandey, M., M.R. Batzloff, and M.F. Good, Mechanism of protection induced by group A Streptococcus vaccine candidate J8-DT: contribution of B and T-cells towards protection. PLoS One, 2009. 4(4): p. e5147.

[00213] 16. Pandey, M., et al., A synthetic M protein peptide synergizes with a CXC chemokine protease to induce vaccine-mediated

69 / 71 protection against virulent streptococcal pyoderma and bacteremia. J Immunol, 2015. 194(12): p. 5915-25.

[00214] 17. Caro-Aguilar, I., et al., Immunogenicity in mice and non- human primates of the Group A Streptococcal J8 peptide vaccine candidate conjugated to CRM197. Hum Vaccin Immunother, 2013. 9(3): p. 488-96.

[00215] 18. Silvana Sekuloski1 ¶, M.B., Paul Griffin1,2,3,4, William Parsonage4 , Suzanne Elliott2, Jon Hartas5, Peter O'Rourke1, Manisha Pandey5, Tania…Fran Rubin6, Robin Mason6, Jonathan Carapetis7, James McCarthy1,4*¶ and Michael F Good5*¶,, Evaluation of safety and immunogenicity of a group A streptococcus vaccine candidate (MJ8VAX) in a randomized clinical trial PLoSOne, 2018.

[00216] 19. Shrum, B., et al., A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes, 2014. 7: p. 233.

[00217] 20. Nooh, M.M., et al., HLA transgenic mice provide evidence for a direct and dominant role of HLA class II variation in modulating the severity of streptococcal sepsis. J Immunol, 2007. 178(5): p. 3076-83.

[00218] 21. DaSilva, L., et al., Humanlike immune response of human leukocyte antigen-DR3 transgenic mice to staphylococcal enterotoxins: a novel model for superantigen vaccines. J Infect Dis, 2002. 185(12): p. 1754-

60.

[00219] 22. Good, M.F., et al., Strategic development of the conserved region of the M protein and other candidates as vaccines to prevent infection with group A streptococci. Expert Rev Vaccines, 2015. 14(11): p. 1459-70.

[00220] 23. Pandey, M., et al., Combinatorial Synthetic Peptide Vaccine Strategy Protects against Hypervirulent CovR/S Mutant Streptococci. J Immunol, 2016. 196(8): p. 3364-74.

[00221] 24. Pandey, M., et al., Physicochemical characterisation, immunogenicity and protective efficacy of a lead streptococcal vaccine: progress towards Phase I trial. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 13786.

70 / 71

[00222] 25. Zaman, M., et al., Novel platform technology for modular mucosal vaccine that protects against streptococcus. Sci Rep, 2016. 6: p.

39274.

[00223] 26. Tomai, M.A., P.M. Schlievert, and M. Kotb, Distinct T- cell receptor V beta gene usage by human T lymphocytes stimulated with the streptococcal pyrogenic exotoxins and pep M5 protein. Infect Immun, 1992. 60(2): p. 701-5.

[00224] 27. Watanabe-Ohnishi, R., et al., Characterization of unique human TCR V beta specificities for a family of streptococcal superantigens represented by rheumatogenic serotypes of M protein. J Immunol, 1994. 152(4): p. 2066-73.

[00225] 28. Perez-Lorenzo, R., et al., Peripheral blood mononuclear cells proliferation and Th1/Th2 cytokine production in response to streptococcal M protein in psoriatic patients. Int J Dermatol, 2006. 45(5): p. 547-53.

[00226] 29. Pahlman, L.I., et al., Streptococcal M protein: a multipotent and powerful inducer of inflammation. J Immunol, 2006. 177(2): p. 1221-8.

[00227] 30. Herwald, H., et al., M protein, a classical bacterial virulence determinant, forms complexes with fibrinogen that induce vascular leakage. Cell, 2004. 116(3): p. 367-79.

[00228] 31. Bisno, A.L., Group A streptococcal infections and acute rheumatic fever. N Engl J Med, 1991. 325(11): p. 783-93.

[00229] 32. Robinson, J.H. and M.A. Kehoe, Group A streptococcal M proteins: virulence factors and protective antigens. Immunol Today, 1992. 13(9): p. 362-7.

[00230] 33. Meisal, R., et al., Sequence type and emm type diversity in Streptococcus pyogenes isolates causing invasive disease in Norway between 1988 and 2003. J Clin Microbiol, 2008. 46(6): p. 2102-5.

71 / 71

[00231] 34. Wang, B., et al., Localization of an immunologically functional region of the streptococcal superantigen pepsin-extracted fragment of type 5 M protein. J Immunol, 1993. 151(3): p. 1419-29.

[00232] 35. Darenberg, J., et al., Molecular and clinical characteristics of invasive group A streptococcal infection in Sweden. Clin Infect Dis, 2007. 45(4): p. 450-8.

[00233] 36. Basma, H., et al., Risk factors in the pathogenesis of invasive group A streptococcal infections: role of protective humoral immunity. Infect Immun, 1999. 67(4): p. 1871-7.

[00234] 37. Holm, S.E., et al., Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infections in Sweden, 1988-1989. J Infect Dis, 1992. 166(1): p. 31-7.

[00235] 38. Stevens, D.L., Invasive group A streptococcus infections. Clin Infect Dis, 1992. 14(1): p. 2-11.

[00236] 39. Darenberg, J., et al., Intravenous immunoglobulin G therapy in streptococcal toxic shock syndrome: a European randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Clin Infect Dis, 2003. 37(3): p. 333-40.

[00237] 40. Kazmi, S.U., et al., Reciprocal, temporal expression of SpeA and SpeB by invasive M1T1 group a streptococcal isolates in vivo. Infect Immun, 2001. 69(8): p. 4988-95.

[00238] 41. Kaul, R., et al., Intravenous immunoglobulin therapy for streptococcal toxic shock syndrome--a comparative observational study. The Canadian Streptococcal Study Group. Clin Infect Dis, 1999. 28(4): p. 800-7.

[00239] 42. Linner, A., et al., Clinical efficacy of polyspecific intravenous immunoglobulin therapy in patients with streptococcal toxic shock syndrome: a comparative observational study. Clin Infect Dis, 2014. 59(6): p. 851-7.

[00240] 43. Jolles, S., W.A. Sewell, and S.A. Misbah, Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol, 2005. 142(1): p. 1-11.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra um fragmento de proteína M de estreptococo do grupo A, ou uma variante ou derivado da mesma, em que o fragmento de proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M e opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma, caracterizado pelo fato de ser para uso para imunizar passivamente contra, tratar ou prevenir uma doença invasiva pelo estreptococo do grupo A (iGAS) tal como a síndrome do choque tóxico estreptocócico (STSS).

2. Método para imunizar passivamente um mamífero contra uma doença estreptocócica invasiva (iGAS) do grupo A, tal como síndrome do choque tóxico estreptocócico, caracterizado pelo fato de que o dito método inclui a etapa de administrar ao mamífero: um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra um fragmento da proteína M de estreptococo do grupo A, ou uma variante ou derivado da mesma, em que o fragmento da proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M; e opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma; para desse modo imunizar passivamente o mamífero contra a iGAS no mamífero.

3. Método para tratar ou prevenir uma doença estreptocócica invasiva (iGAS) do grupo A, tal como uma síndrome de choque tóxico estreptocócico em um mamífero, o dito método caracterizado incluindo a etapa de administrar a um mamífero: pelo fato de que compreende: um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra um fragmento de proteína M de estreptococo do grupo A, ou uma variante ou derivado da mesma, em que o fragmento de proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M; e opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma; para desse modo tratar ou prevenir a iGAS no mamífero.

4. Composição adequada para administração a um mamífero, a dita composição caracterizada pelo fato de que compreende: um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga, ou é incitado contra, um fragmento de proteína M de estreptococo do grupo A, ou uma variante ou derivado da mesma, em que o fragmento da proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M; e um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga, ou é incitado contra, uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma.

5. Uso, método ou composição como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fragmento de proteína M é, compreende ou está contido dentro de um peptídeo p145.

6. Uso, método ou composição como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento de proteína M é, compreende ou está contido dentro de um peptídeo J8, fragmento, variante ou derivado da mesma.

7. Uso, método ou composição como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento de proteína M é, compreende ou está contido dentro de um peptídeo p17, fragmento, variante ou derivado da mesma.

8. Uso, método ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fragmento de proteína M é, compreende, ou está contido dentro de uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs:1-10 e

13 a 29.

9. Uso, método ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o superantígeno é a exotoxina pirogênica estreptocócica (Spe) A ou SpeC.

10. Uso, método ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína M de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma; e/ou o anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma é um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo.

11. Uso, método ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína M de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado da mesma; e/ou o anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é incitado contra uma proteína superantigênica de estreptococo do grupo A, fragmento, variante ou derivado é um anticorpo monoclonal humanizado ou fragmento de anticorpo.

12. Uso, método ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

13. Uso ou método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 3 de 5 a 12, caracterizado pelo fato de que a iGAS é uma síndrome de choque tóxico estreptocócica (STSS).