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BR112020023015A2 - composições de fusossoma e usos das mesmas - Google Patents

composições de fusossoma e usos das mesmas Download PDF

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BR112020023015A2
BR112020023015A2 BR112020023015-4A BR112020023015A BR112020023015A2 BR 112020023015 A2 BR112020023015 A2 BR 112020023015A2 BR 112020023015 A BR112020023015 A BR 112020023015A BR 112020023015 A2 BR112020023015 A2 BR 112020023015A2
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BR
Brazil
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fusosome
cell
fusogen
cells
exogenous agent
Prior art date
Application number
BR112020023015-4A
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English (en)
Inventor
Geoffrey A. Von Maltzahn
Jacob Rosenblum Rubens
Michael Travis Mee
John Miles Milwid
Neal Francis Gordon
Jagesh Vijaykumar Shah
Kyle Marvin Trudeau
Brigham Jay Hartley
Peter Anthony Jones
Original Assignee
Flagship Pioneering Innovations V, Inc.
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Publication date
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Abstract

a presente invenção refere-se, pelo menos em parte, a métodos e composições para entrega in vivo de fusossoma. em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma combinação de elementos que promovem a especificidade para células-alvo, por exemplo, um ou mais dentre um fusogênio realvejado, um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo e um elemento regulatório específico de célula não alvo. em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma ou mais modificações que diminuem uma resposta imunológica contra o fusossoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSI- ÇÕES DE FUSOSSOMA E USOS DAS MESMAS”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade do documento de número serial US 62/671.838, depositado em 15 de maio de 2018, e do documento de número serial US 62/695.529, depositado em 9 de julho de 2018, cada um dos quais é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido está sendo depositado junto com a Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado V2050-7023WO Sequência Listing.TXT, criado em 14 de maio de 2019, que tem 651 kilobytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequência são incorporadas a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0003] Produtos biológicos complexos são candidatos terapêuticos promissores para uma variedade de doenças. No entanto, é difícil entregar grandes agentes biológicos em uma célula devido ao fato de que a membrana plasmática atua como uma barreira entre a célula e o espaço extracelular. Existe uma necessidade na técnica de novos métodos de entrega de produtos biológicos complexos em células de um indivíduo.
SUMÁRIO
[0004] A presente invenção fornece, pelo menos em parte, métodos e composições de fusossoma para entrega in vivo. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma combinação de elementos que promovem a especificidade para células-alvo, por exemplo, um ou mais dentre um fusogênio realvejado, um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo e um elemento regulatório específico de célula não alvo. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma ou mais modificações que diminuem uma resposta imunológica contra o fusossoma.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0005] As Figuras 1A a 1C são uma série de gráficos que mostram resultados para linhas de células, incluindo linhas de células de hepatoma humano alvo (HepG2) e linhas de células não alvo (não hepáticas), transduzidas com lentivírus (LV) que codifica construtos de ácido nucleico contendo TCSREs ou NTCSREs positivos. A Figura 1A mostra a expressão de GFP na linha de células de hepatoma humano (HepG2), linha de células de rim embrionárias humanas (293LX), linha de células T humanas de origem hematopoiética (Molt4.8) e linha de células endoteliais derivadas de cérebro de camundongo (bEND.3) transduzidas com LV gerado com sequências miRT (hPGK- eGFP+miRT) ou sem sequências miRT (hPGK-eGFP), sob o controle do promotor PGK. A Figura 1B mostra a expressão de GFP em células HepG2 e 293LX transduzidas com LV gerado sob o controle do promotor PGK (hPGK-eGFP) ou LVs contendo sequências mirT e GFP sob o controle do promotor específico de hepatócitos ApoE (hApoE- eGFP+miRT). A Figura 1C mostra a quantificação de fenilalanina (Phe) no sobrenadante de células HepG2 e 293LX transduzidas com LVs contendo o transgene fenilalanina amônia liase (PAL) sob o controle do promotor SFFV (SFFV-PAL), ou LVs contendo sequências mirT e sob o controle de o promotor hApoE (hApoE-PAL+miRT).
MODALIDADES ENUMERADAS
[0006] São fornecidos neste documento fusossomas, incluindo vetores ou partículas retrovirais, como vetores ou partículas lentivirais, que geralmente resultam no aumento da expressão de um agente exógeno desejado (por exemplo, um transgene terapêutico) em células- alvo em comparação com células não alvo após a introdução dos fusossomas em células, por exemplo, em um assunto. Por exemplo, em alguns casos, o aumento na expressão segue administração in vivo de um fusossoma fornecido (por exemplo, um vetor ou partícula retroviral) a um indivíduo, por exemplo, indivíduo humano. Em particular, um dos principais desafios para a terapia gênica bem-sucedida é a capacidade de manter a expressão estável e de longo prazo de um transgene terapêutico (por exemplo, um agente exógeno) a partir de células geneticamente modificadas in vivo. A expressão de transgene em células não alvo, como células apresentadoras de antígeno (APCs), pode, em alguns aspectos, resultar na ativação da resposta imunológica adaptativa levando à geração de anticorpos neutralizantes contra o produto do transgene pelas células B e/ou eliminação de células produtoras de transgene pelas células T. Assim, limitar a expressão do transgene para células-alvo pode, em algumas modalidades, impactar substancialmente a durabilidade da expressão do transgene, evitando a eliminação imune. Além disso, a expressão do transgene específico de tipo celular pode ser muito relevante para a biologia da doença, como, por exemplo, limitar a expressão de genes pró-apoptóticos a células tumorais ou outras células-alvo (por exemplo, células do fígado).
[0007] Em particular, são fornecidos neste documento fusossomas (por exemplo, partículas retrovirais pr de vetor) que, em alguns casos, incluem a expressão de sequências de ácido nucleico sob o controle de um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (TCSRE, por exemplo, um promotor específico de tecido) ou que são reguladas pelo mesmo e/ou um elemento regulatório específico de célula-alvo negativo (TCSRE negativo), por exemplo, um elemento regulatório específico de célula não alvo (NTCSRE). Em algumas modalidades, o TCSCRE negativo, como NCSRE, é por silenciamento de genes mediado por miRNA, como por complemento de sequências de ácido nucleico a sequências de miRNA em uma célula. Em algumas modalidades, os fusossomas fornecidos (por exemplo, vetores retrovirais ou partículas) podem conduzir especificamente a expressão do transgene (agente exógeno) em uma linha celular alvo (por exemplo, tumor ou célula hepática ou outra célula-alvo) enquanto restringe ou limita a expressão em células não alvo.
[0008] Entre as modalidades fornecidas estão:
[0009] 1. Um fusossoma que compreende:
[0010] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio redirecionado, e
[0011] b) um ácido nucleico que compreende ou codifica:
[0012] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula-alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico do tecido positivo; ou
[0013] (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específica a tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
[0014] 2. Um fusossoma que compreende:
[0015] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio realvejado;
[0016] b) um ácido nucleico que compreende ou codifica:
[0017] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula-alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico do tecido positivo; ou
[0018] (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específica a tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
[0019] 3. Um fusossoma que compreende:
[0020] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio (por exemplo, um fusogênio realvejado);
[0021] b) um ácido nucleico que compreende ou codifica:
[0022] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula-alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico do tecido positivo; ou
[0023] (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específica a tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
[0024] 4. Um fusossoma que compreende:
[0025] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio (por exemplo, um fusogênio realvejado);
[0026] b) um ácido nucleico que compreende ou codifica:
[0027] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno), em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em uma célula ou tecido-alvo em relação a um vetor retroviral sem o elemento regulatório específico de tecido positivo; e
[0028] (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específica a tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
[0029] 5. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais dos seguintes:
[0030] i) o fusossoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes;
[0031] ii) o fusossoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com outro fusossoma, por exemplo, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, 2 vezes, 3 vezes,
4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes;
[0032] iii) o fusossoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusossoma seja entregue a pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de células-alvo após 24, 48 ou 72 horas;
[0033] iv) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa mais alta do que a uma célula não alvo, por exemplo em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes;
[0034] v) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa mais alta do que a outro fusossoma, por exemplo, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes; ou
[0035] vi) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa tal que um agente no fusossoma seja entregue a pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo após 24, 48 ou 72 horas.
[0036] 6. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais dentre (por exemplo, 2 ou todos os 3) o seguinte se aplicam: o fusossoma é um vetor retroviral, a bicamada lipídica é composta por um envelope, por exemplo, um envelope viral, e o ácido nucleico é um ácido nucleico retroviral.
[0037] 7. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico compreende um ou mais dentre (por exemplo, todas) as seguintes sequências de ácido nucleico: LTR 5' (por exemplo, que compreende U5 e sem um domínio U3 funcional), elemento de empacotamento Psi (Psi), Trato central de polipurina (cPPT) Promotor operativamente ligado ao gene de carga útil, por exemplo, ácido nucleico que codifica o agente exógeno, gene de carga útil, por exemplo, ácido nucleico que codifica o agente exógeno (opcionalmente que compreende um íntron antes do quadro de leitura aberto), sequência de cauda Poli A, WPRE e LTR 3' (por exemplo, que compreende U5 e sem um U3 funcional).
[0038] 8. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ou mais dentre (por exemplo, todos dentre) uma polimerase (por exemplo, uma transcriptase reversa, por exemplo, pol ou uma porção da mesma), uma integrase (por exemplo, pol ou uma porção da mesma, por exemplo, uma variante funcional ou não funcional), uma proteína de matriz (por exemplo, gag ou uma porção da mesma), uma proteína de capsídeo (por exemplo, gag ou uma porção da mesma), uma proteína nucleocaspídeo (por exemplo, gag ou uma porção da mesma) e uma protease (por exemplo, pro).
[0039] 9. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que, quando o fusossoma é administrado a um indivíduo, um ou mais dos seguintes:
[0040] i) menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do agente exógeno presente, de modo detectável, no indivíduo está em células não alvo;
[0041] ii) pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das células do indivíduo que compreendem, de modo detectável, o agente exógeno, são células-alvo (por exemplo, células de um tipo de célula única, por exemplo, células T);
[0042] iii) menos de 1.000.000, 500.000, 200.000, 100.000, 50.000,
20.000 ou 10.000 células das células do indivíduo que compreendem, de modo detectável, o agente exógeno são células não alvo;
[0043] iv) os níveis médios do agente exógeno em todas as células- alvo no indivíduo são pelo menos 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou
1.000 vezes maiores do que os níveis médios do agente exógeno em todas as células não alvo no indivíduo; ou
[0044] v) o agente exógeno não é detectável em qualquer célula não alvo no indivíduo.
[0045] 10. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio realvejado compreende uma sequência escolhida a partir de proteínas F e G do vírus Nipah, proteínas F e H do vírus do sarampo, proteínas F e H do paramixovírus de tupaia, proteínas F e G do paramixovírus ou proteínas F e H ou proteínas F e HN, proteínas F e G do vírus Hendra, proteínas F e G do Henipavírus, proteínas F e H do morbilivírus, proteína F e HN do respirovírus, proteína F e HN do vírus Sendai, proteínas F e HN do rubulavírus ou proteínas F e HN do avulavírus, ou um derivado das mesmas, ou qualquer combinação das mesmas.
[0046] 11. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências para um fusogênio, por exemplo uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132.
[0047] 12. O fusossoma da modalidade 11, em que o paramixovírus é um vírus Nipah, por exemplo, um henipavírus.
[0048] 13. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico de célula-alvo positivo compreende um promotor específico de tecido, um intensificador específico de tecido, um local de emenda específico de tecido, um local específico de tecido que estende a meia-vida de um RNA ou proteína, um local de promoção de exportação nuclear de mRNA específico de tecido, um local de aprimoramento translacional específico de tecido ou um local de modificação pós-translacional específico de tecido.
[0049] 14. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido, local de reconhecimento de protease específico de tecido, local de ligase ubiquitina específico de tecido, local de repressão transcricional específico de tecido ou local de repressão epigenética específico de tecido.
[0050] 15. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo ou TCSRE negativo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido.
[0051] 16. O fusossoma da modalidade 15, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo ou TCSRE negativo está situado ou codificado dentro de uma região transcrita (por exemplo, a região transcrita que codifica o agente exógeno), por exemplo, de modo que um RNA produzido pela região transcrita compreende a sequência de reconhecimento de miRNA dentro de uma UTR ou região de codificação.
[0052] 17. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a célula-alvo é uma célula cancerosa e a célula não alvo é uma célula não cancerosa.
[0053] 18. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico, por exemplo, ácido nucleico retroviral, codifica um TCSRE positivo e/ou um NTCSRE ou TCSRE negativo.
[0054] 19. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico retroviral compreende o complemento de um TCSRE positivo e/ou um NTCSRE ou TCSRE negativo.
[0055] 20. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que não entrega ácido nucleico a uma célula não alvo, por exemplo, uma célula apresentadora de antígeno, uma célula MHC de classe II+, uma célula apresentadora de antígeno profissional, uma célula apresentadora de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa.
[0056] 21. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001%, 0,00001% ou 0,000001% de um tipo de célula não alvo (por exemplo, uma ou mais dentre uma célula de apresentação de antígeno, uma célula MHC de classe II+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa) compreendem o ácido nucleico, por exemplo, ácido nucleico retroviral, por exemplo, usando PCR quantitativo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 1.
[0057] 22. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células-alvo compreendem 0,00001 a 10, 0,0001 a 10, 0,001 a 10, 0,01 a 10, 0,1 a 10, 0,5 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 cópias do ácido nucleico, por exemplo, ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo, por genoma de célula hospedeira, por exemplo, em que o número de cópias do ácido nucleico é avaliado após administração in vivo.
[0058] 23. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que:
[0059] menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01% das células não alvo (por exemplo, uma célula de apresentação de antígeno, uma célula MHC de classe II+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa) compreendem o agente exógeno; ou
[0060] o agente exógeno (por exemplo, proteína) não está presente de modo detectável em uma célula não alvo, por exemplo, uma célula de apresentação de antígeno, uma célula MHC de classe II+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa.
[0061] 24. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma entrega o ácido nucleico, por exemplo, ácido nucleico retroviral, a uma célula-alvo, por exemplo, uma célula T, uma célula T CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, um hepatócito, uma célula-tronco hematepoiética, uma célula-tronco hematopoiética CD34+, uma célula-tronco hematepoiética CD105+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD105+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, uma célula cancerosa EpCAM+, uma célula canceladora CD19+, uma célula de câncer Her2/Neu+, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLC1A3+, um adipócito SLC7A10+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+.
[0062] 25. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,00001%, 0,0001%, 0,001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo (por exemplo, uma ou mais de uma célula T, uma célula T CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, um hepatócito, uma célula-tronco hematepoiética, uma célula-tronco hematepoiética CD34+, um Célula-tronco hematepoiética CD105+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD105+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, uma célula cancerosa EpCAM+, uma célula cancelada CD19+, Célula cancerosa Her2/Neu+, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLC1A3+, um adipócito SLC7A10+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+) compreendem o ácido nucleico, por exemplo, usando PCR quantitativo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 3.
[0063] 26. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,00001%, 0,0001%, 0,001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo (por exemplo, uma célula T, uma célula T CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, um hepatócito, uma célula-tronco hematepoiética, uma célula-tronco hematepoiética CD34+, uma célula-tronco hematepoiética CD105+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD105+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, uma célula cancerosa EpCAM+, uma célula canceladora CD19+, um câncer Her2/Neu+ célula, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLC1A3+, um adipócito SLC7A10+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+) compreendem o agente exógeno.
[0064] 27. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que, após a administração, a razão entre células-alvo que compreendem o ácido nucleico e células não alvo que compreendem o ácido nucleico é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo 3.
[0065] 28. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em quea razão entre o número médio de cópias de ácido nucleico ou uma porção do mesmo em células-alvo e o número médio de cópias de ácido nucleico ou uma porção do mesmo em células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000,
10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo 3.
[0066] 29. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o número de cópias mediano de ácido nucleico ou uma porção do mesmo em células-alvo e o número de cópias mediano de ácido nucleico ou uma porção do mesmo em células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000,
5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo
3.
[0067] 30. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre células-alvo que compreendem o agente de RNA exógeno e células não alvo que compreendem o agente de RNA exógeno é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0068] 31. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível médio de agente de RNA exógeno de células-alvo e o nível médio de agente de RNA exógeno de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0069] 32. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível de agente de RNA exógeno mediano de células-alvo e o nível de agente de RNA exógeno mediano de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0070] 33. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre células-alvo que compreendem o agente de proteína exógena e células não alvo que compreendem o agente de proteína exógena é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0071] 34. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível médio de agente de proteína exógena de células-alvo e o nível médio de agente de proteína exógena de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0072] 35. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível mediano do agente de proteína exógena de células-alvo e o nível mediano do agente de proteína exógena de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0073] 36. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ou ambos:
[0074] i) uma proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope; e
[0075] ii) uma proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
[0076] 37. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ou mais dentre:
[0077] i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope, e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope;
[0078] ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope, e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; ou
[0079] iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação a um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar de outra forma.
[0080] 38. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico compreende um ou mais elementos isolantes.
[0081] 39. Um fusossoma que compreende:
[0082] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio (por exemplo, um fusogênio realvejado), e
[0083] b) um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno) ou um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico retroviral) que codifica um agente exógeno; e
[0084] c) um ou mais dentre:
[0085] i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope, e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope;
[0086] ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica, por exemplo, envelope, e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; ou
[0087] iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação a um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar;
[0088] em que, quando administrado a um indivíduo (por exemplo,
um indivíduo humano ou um camundongo), um ou mais dentre:
[0089] i) o fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou anticorpos contra o fusossoma estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de detecção de anticorpo FACS, por exemplo, um ensaio do Exemplo 13 ou Exemplo 14;
[0090] ii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável (por exemplo, resposta de células T, resposta de células NK ou resposta de macrófago) ou uma resposta imunológica celular contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de lise de PBMC (por exemplo, um ensaio do Exemplo 5), por um ensaio de lise de células NK (por exemplo, um ensaio do Exemplo 6), por um ensaio de lise de células T exterminadoras CD8 (por exemplo, um ensaio do Exemplo 7), por um ensaio de fagocitose de macrófagos (por exemplo, um ensaio do Exemplo 8);
[0091] iii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica inata detectável, por exemplo, ativação do complemento (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou a resposta imunológica inata contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de atividade do complemento (por exemplo, um ensaio do Exemplo 9);
[0092] iv) menos de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,002% ou 0,001% dos fusossomas são inativados por soro, por exemplo, por um ensaio de inativação de soro, por exemplo, um ensaio do Exemplo 11 ou Exemplo 12;
[0093] v) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou anticorpos contra a célula-alvo estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de detecção de anticorpo FACS, por exemplo, um ensaio do Exemplo 15; ou
[0094] vi) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável (por exemplo, resposta de célula T, resposta de célula NK ou resposta de macrófago), ou uma resposta celular contra a célula-alvo está presente em um nível de menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de fagocitose de macrófagos (por exemplo, um ensaio do Exemplo 16), por um ensaio de lise de PBMC (por exemplo, um ensaio do Exemplo 17), por um ensaio de lise de células NK (por exemplo, um ensaio do Exemplo 18), ou por um ensaio de lise de células T exterminadoras CD8 (por exemplo, um ensaio do Exemplo 19).
[0095] 40. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais dentre (por exemplo, 2 ou todos os 3) o seguinte se aplicam: o fusossoma é um vetor retroviral, a bicamada lipídica é composta por um envelope, por exemplo, um envelope viral, e o ácido nucleico é um ácido nucleico retroviral.
[0096] 41. O fusossoma da modalidade 39 ou 40, em que o nível precedente é o nível correspondente no mesmo indivíduo antes da administração da partícula ou vetor.
[0097] 42. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 39 a 41, em que a proteína imunossupressora é uma proteína regulatória do complemento ou CD47.
[0098] 43. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 39 a 42,
em que a proteína imunoestimuladora é uma proteína MHC (por exemplo, HLA).
[0099] 44. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 39 a 43, em que um ou ambos: a primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa é diferente de CD47 e a segunda proteína imunoestimuladora é diferente de MHC.
[0100] 45. Um fusossoma que compreende:
[0101] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio,
[0102] b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno); e
[0103] c) MHC exógeno ou superexpresso, por exemplo, HLA (por exemplo, HLA-G ou HLA-E), ou uma combinação dos mesmos, na bicamada lipídica.
[0104] 46. Um fusossoma que compreende:
[0105] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem é estabelecido em qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 a 132; e
[0106] b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno);
[0107] c) CD47 exógeno ou superexpresso ou uma proteína regulatória do complemento, ou uma combinação dos mesmos, no envelope.
[0108] 47. Um fusossoma que compreende:
[0109] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80,
100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132, e
[0110] b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno); e
[0111] c) MHC I (por exemplo, HLA-A, HLA-B ou HLA-C) ou MHC II (por exemplo, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ ou HLA-DR) que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem similar não modificada.
[0112] 48. Um fusossoma que compreende:
[0113] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e
[0114] b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno); e
[0115] c) uma ou ambas de uma proteína imunossupressora exógena ou superexpressa ou uma proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%)
em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
[0116] 49. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 45 a 48, em que um ou mais dentre (por exemplo, 2 ou todos os 3) o seguinte se aplicam: o fusossoma é um vetor retroviral, a bicamada lipídica é composta por um envelope, por exemplo, um envelope viral, e o ácido nucleico é um ácido nucleico retroviral.
[0117] 50. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma está em circulação pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18, 24, 36 ou 48 horas após a administração ao indivíduo.
[0118] 51. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 30 minutos após a administração.
[0119] 52. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 1 hora após a administração.
[0120] 53. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 2 horas após a administração.
[0121] 54. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 4 horas após a administração.
[0122] 55. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 8 horas após a administração.
[0123] 56. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 12 horas após a administração.
[0124] 57. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 18 horas após a administração.
[0125] 58. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 24 horas após a administração.
[0126] 59. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 36 horas após a administração.
[0127] 60. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas estão em circulação 48 horas após a administração.
[0128] 61. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma redução na imunogenicidade medida por uma redução na resposta humoral após uma ou mais administrações do fusossoma a um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal descrito neste documento, em comparação com retrovírus de referência, por exemplo, um fusossoma não modificado de outra forma similar ao fusossoma.
[0129] 62. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a redução na resposta humoral é medida em uma amostra de soro por um título de anticorpo anti-célula, por exemplo,
título de anticorpo antirretroviral, por exemplo, por ELISA.
[0130] 63. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma amostra de soro de animais aos quais foi administrada a composição de retrovírus tem uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de um título de anticorpo anti-fusossoma em comparação com a amostra de soro de um indivíduo administrado com uma célula não modificada.
[0131] 64. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma amostra de soro de um indivíduo ao qual foi administrado o fusossoma tem um título de anticorpo anti-célula aumentado, por exemplo, aumentado em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% da linha de base, por exemplo, em que a linha de base se refere à amostra de soro do mesmo indivíduo antes administração do fusossoma.
[0132] 65. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que:
[0133] o indivíduo ao qual será administrado o fusossoma tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo pré-existente (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com o fusossoma;
[0134] o indivíduo ao qual será administrado o fusossoma não tem níveis detectáveis de um anticorpo pré-existente reativo com o fusossoma;
[0135] um indivíduo que recebeu o fusossoma tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com o fusossoma;
[0136] o indivíduo que recebeu o fusossoma (por exemplo, pelo menos uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais) não tem níveis detectáveis de anticorpos reativos com o fusossoma; ou
[0137] os níveis de anticorpo não aumentam mais do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 50% entre dois pontos de tempo, sendo o primeiro ponto no tempo antes da primeira administração do fusossoma, e o segundo momento sendo após uma ou mais administrações do fusossoma.
[0138] 66. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é um vetor retroviral produzido pelos métodos do Exemplo 5, 6 ou 7, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de HLA-G ou HLA-E.
[0139] 67. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é um vetor retroviral gerado a partir de células NMC-HLA-G e tem uma porcentagem diminuída de lise, por exemplo, lise mediada por PBMC, lise mediada por células NK e/ou lise mediada por células T CD8+, em pontos de tempo específicos em comparação com vetores retrovirais gerados a partir de NMCs ou vetor vazio de NMC.
[0140] 68. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossomamodificado evita a fagocitose por macrófagos.
[0141] 69. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é produzido pelo método do Exemplo 8, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de CD47.
[0142] 70. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é um vetor retroviral e em que o índice fagocítico é reduzido quando os macrófagos são incubados com vetores retrovirais derivados de NMC-CD47, versus aqueles derivados de NMC, ou vetor vazio de NMC.
[0143] 71. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma redução na fagocitose de macrófagos, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em macrófagos fagocitose em comparação com um fusossoma de referência, por exemplo, um fusossoma não modificado de outra forma similar ao fusossoma, em que a redução na fagocitose de macrófagos é determinada pelo ensaio do índice de fagocitose in vitro, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 8.
[0144] 72. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma composição que compreende uma pluralidade de fusossomas tem um índice de fagocitose de 0, 1, 10, 100 ou mais, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 8, quando incubado com macrófagos em um ensaio in vitro de fagocitose de macrófagos.
[0145] 73. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que é modificado e tem atividade de complemento reduzida em comparação com um vetor retroviral não modificado.
[0146] 74. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que é produzido pelos métodos do Exemplo 9, por exemplo, a partir de células transfectadas com um cDNA que codifica para proteínas reguladoras do complemento, por exemplo, DAF.
[0147] 75. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é um vetor retroviral, e em que a dose de vetor retroviral na qual 200 pg/ml de C3a está presente é maior para o vetor retroviral modificado (por exemplo, HEK293-DAF) incubado com soro de camundongo correspondente (por exemplo, soros de camundongo HEK-293 DAF) do que para o vetor retroviral de referência (por exemplo, vetor retroviral HEK293) incubado com soros de camundongo correspondentes (por exemplo, soro de camundongo HEK293).
[0148] 76. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma é um vetor retroviral, e em que a dose do vetor retroviral na qual 200 pg/ml de C3a está presente é maior para o vetor retroviral modificado (por exemplo, HEK293-DAF) incubado com soros de camundongo virgens do que para o vetor retroviral de referência (por exemplo, vetor retroviral HEK293) incubado com soros de camundongo virgens.
[0149] 77. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que é resistente à inativação mediada pelo complemento no soro do paciente 30 minutos após a administração de acordo com um ensaio do Exemplo 9.
[0150] 78. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de fusossomas são resistentes à inativação mediada pelo complemento.
[0151] 79. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a proteína regulatória do complemento compreende uma ou mais das proteínas que se ligam ao fator de aceleração de decaimento (DAF, CD55), por exemplo, proteína similar ao fator H (FH)- 1 (FHL-1), por exemplo, proteína de ligação a C4b (C4BP), por exemplo complemento do receptor 1 (CD35), por exemplo, proteína cofator de membrana (MCP, CD46), por exemplo Protectina (CD59), por exemplo proteínas que inibem as enzimas CD/C5 convertase da via clássica e alternativa do complemento, por exemplo, proteínas que regulam a montagem do MAC.
[0152] 80 O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que é produzido pelos métodos do Exemplo 10, por exemplo, a partir de células transfectadas com um DNA que codifica para um shRNA direcionado a classe I de MHC, por exemplo, em que vetores retrovirais derivados de classe I de shMHC de NMC têm expressão mais baixa de classe I de MHC em comparação com NMCs e controle de vetor de NMC.
[0153] 81. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para fusossomas (por exemplo, vetores retrovirais) é a inativação do soro, por exemplo, a inativação do soro medida como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 11.
[0154] 82. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre amostras de fusossoma que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de ratos virgens para fusossoma.
[0155] 83. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre amostras de fusossoma que foram incubadas com soro de camundongos virgens para fusossoma e incubações de controle sem soro.
[0156] 84. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno é menor em amostras de fusossoma que foram incubadas com soro de controle positivo do que em amostras de fusossoma que foram incubadas com soro de camundongos virgens para fusossoma.
[0157] 85. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, tem uma inativação sérica reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais), administrações do vetor retroviral modificado.
[0158] 86. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um fusossoma descrito neste documento não é inativado pelo soro após múltiplas administrações.
[0159] 87. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para fusossoma é a inativação do soro, por exemplo, após múltiplas administrações, por exemplo, inativação do soro após múltiplas administrações medida como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 12.
[0160] 88. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre amostras de fusossoma que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de camundongos tratados com (por exemplo, HEK293-HLA-G) fusossoma modificado.
[0161] 89. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre amostras de fusossoma que foram incubadas com soro de camundongos tratados 1, 2, 3, 5 ou 10 vezes com vetores retrovirais modificados (por exemplo, HEK293-HLA-G).
[0162] 90. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre amostras de fusossoma que foram incubadas com soro de camundongos tratados com veículo e de camundongos tratados com (por exemplo, HEK293-HLA-G) fusossomas modificados.
[0163] 91. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno é menor para fusossomas derivados de uma célula de referência (por exemplo, HEK293) do que (por exemplo, HEK293-HLA- G) fusossomas modificados.
[0164] 92. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para um fusossoma são as respostas de anticorpos.
[0165] 93. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um indivíduo que recebe um fusossoma descrito neste documento tem anticorpos pré-existentes que se ligam e reconhecem o fusossoma, por exemplo, medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 13.
[0166] 94. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que soro de camundongos virgens para fusossoma mostram mais sinal (por exemplo, fluorescência) do que o controle negativo, por exemplo, soro de um camundongo com depleção de IgM e IgG, por exemplo, indicando que ocorreu imunogenicidade.
[0167] 95. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que soro de camundongos virgens para fusossoma mostram sinal similar (por exemplo, fluorescência) em comparação com o controle negativo, por exemplo, indicando que a imunogenicidade não ocorreu de forma detectável.
[0168] 96. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, e que tem uma resposta humoral reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais), administrações do vetor retroviral modificado, por exemplo, medida como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 14.
[0169] 97. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusossoma, por exemplo, vetor retroviral, é produzido pelos métodos do Exemplo 5, 6, 7 ou 14, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de HLA-G ou HLA-E.
[0170] 98. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a resposta humoral é avaliada pela determinação de um valor para o nível de anticorpos anti-fusossoma (por exemplo, anticorpos IgM, IgG1 e/ou IgG2).
[0171] 99. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que fusossomas modificados (por exemplo, NMC-HLA- G), por exemplo, vetores retrovirais, diminuíram os títulos de anticorpos IgM ou IgG1/2 antivirais (por exemplo, conforme medido pela intensidade de fluorescência em FACS) após as injeções, em comparação com um controle, por exemplo, vetores retrovirais NMC ou vetores retrovirais vazios de NMC.
[0172] 100. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não são direcionadas por uma resposta de anticorpo, ou uma resposta de anticorpo estará abaixo de um nível de referência, por exemplo, medido como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 15.
[0173] 101. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sinal (por exemplo, intensidade média de fluorescência) é similar para células receptoras de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS.
[0174] 102. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta do macrófago.
[0175] 103. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não são direcionadas por macrófagos ou são direcionadas abaixo de um nível de referência.
[0176] 104. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o índice fagocítico, por exemplo, medido como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 16, é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com fusossomas e camundongos tratados com PBS.
[0177] 105. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta de PBMC.
[0178] 106. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não induzem uma resposta de PBMC.
[0179] 107. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com fusossoma e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 17.
[0180] 108. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta de célula exterminadora natural.
[0181] 109. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não induzem uma resposta de célula exterminadora natural ou induzem uma resposta de célula exterminadora natural inferior, por exemplo, inferior a um valor de referência.
[0182] 110. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com fusossoma e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 18.
[0183] 111. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta das células T CD8+.
[0184] 112. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não provocam uma resposta de células T CD8+ ou induzem uma resposta de células T CD8+ inferior, por exemplo, inferior a um valor de referência.
[0185] 113. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com fusossoma e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 19.
[0186] 114. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio é um fusogênio realvejado.
[0187] 115. O fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ácido nucleico retroviral que codifica um ou ambos dentre: (i) um elemento regulatório específico da célula- alvo positivo operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno, ou (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo ou TCSRE negativo operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno.
[0188] 116. Um fusossoma que compreende:
[0189] a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132, e
[0190] b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno), em que o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais elementos isolantes.
[0191] 117. O fusossoma da modalidade 116, em que um ou mais dentre (por exemplo, 2 ou todos os 3) o seguinte se aplicam: o fusossoma é um vetor retroviral, a bicamada lipídica é composta por um envelope, por exemplo, um envelope viral, por exemplo, um envelope pseudotipado, e o ácido nucleico é um ácido nucleico retroviral.
[0192] 118. O fusossoma da modalidade 116 ou 117, em que o ácido nucleico compreende dois elementos isolantes, por exemplo, um primeiro elemento isolante a montante de uma região que codifica o agente exógeno e um segundo elemento isolante a jusante de uma região que codifica o agente exógeno, por exemplo, em que o primeiro isolante elemento e segundo elemento isolante compreendem as mesmas sequências ou sequências diferentes.
[0193] 119. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 118, em que a variação no nível mediano do agente exógeno em uma amostra de células isolada após a administração do fusossoma ao indivíduo em um primeiro ponto no tempo é de, pelo menos, menos que ou cerca de 10.000%, 5.000%, 2.000%, 1.000%, 500%, 200%, 100%, 50%, 20%, 10% ou 5% do nível mediano do agente exógeno em uma amostra de células isolada após a administração do fusossoma ao indivíduo em um segundo ponto no tempo posterior.
[0194] 120. O fusossoma da modalidade 119, em que o nível mediano de expressão por célula é avaliado apenas em células que têm um número de cópias do genoma retroviral de pelo menos 1,0.
[0195] 121. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 120, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no indivíduo compreendem de forma detectável o agente exógeno.
[0196] 122. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 119 a 121, em que o nível mediano de expressão do gene de carga útil é avaliado através das células isoladas do indivíduo 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após a administração do fusossoma ao indivíduo.
[0197] 123. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a
122, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no indivíduo que compreendiam de forma detectável o agente exógeno em um primeiro ponto no tempo ainda compreende de forma detectável o agente exógeno em um segundo ponto no tempo posterior, por exemplo, em que o primeiro momento é 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após a administração do fusossoma ao indivíduo.
[0198] 124. O fusossoma da modalidade 123, em que o segundo ponto no tempo é 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após o primeiro ponto no tempo.
[0199] 125. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 124, que não é genotóxico ou não aumenta a taxa de formação de tumor nas células-alvo em comparação com células-alvo não tratadas com o fusossoma.
[0200] 126. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 125, em que o nível mediano do agente exógeno é avaliado em uma população de células de um indivíduo que recebeu o fusossoma.
[0201] 127. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 126, em que o nível mediano de agente exógeno avaliado em populações de células coletadas (por exemplo, isoladas) do indivíduo em dias diferentes após a administração é inferior a cerca de 10.000%,
1.000%, 100% ou 10%, por exemplo, 10.000% a 1.000%, 1.000% a 100%, ou 100% a 10% diferente do nível de agente exógeno mediano na população de células avaliada no dia 7, dia 14, dia 28 ou dia 56, em que as células na população têm um número de cópias de vetor de pelo menos 1,0.
[0202] 128. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 127, em que o nível de agente exógeno é avaliado através das células de um indivíduo que recebeu o fusossoma.
[0203] 129. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a
128, em que a porcentagem de células que compreende o agente exógeno é avaliada em uma pluralidade de células coletadas (por exemplo, isoladas) do indivíduo 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após a administração do fusossoma.
[0204] 130. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 129, em que a diferença na porcentagem de células que compreende o agente exógeno avaliado em células isoladas em dois dias diferentes após a administração é inferior a 1%, 5%, 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1.000%, 1.500% ou
2.000%.
[0205] 131. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 130, em que a porcentagem de células-alvo que são positivas para o agente exógeno é similar entre as células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias.
[0206] 132. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 131, em que:
[0207] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto 7 dias;
[0208] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 14 dias;
[0209] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 28 dias;
[0210] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 56 dias;
[0211] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 112 dias;
[0212] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 730 dias ou 1.095 dias quanto em 365 dias; ou
[0213] pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 1.095 dias quanto em 730 dias.
[0214] 133. O fusossoma de qualquer uma das modalidades 116 a 132, em que:
[0215] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno é similar em células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias;
[0216] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 7 dias;
[0217] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 14 dias;
[0218] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 28 dias;
[0219] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 112 dias, 365 dias, 730 dias ou
1.095 dias é pelo menos tão alto quanto em 56 dias;
[0220] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 112 dias;
[0221] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 730 dias, ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 365 dias; ou
[0222] o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto em 730 dias.
[0223] 134. Um método de entrega de um agente exógeno a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), que compreende administrar ao indivíduo um fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, entregando assim o agente exógeno ao indivíduo.
[0224] 135. Um método de modulação de uma função, em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), tecido-alvo ou célula- alvo, que compreende o contato, por exemplo administrar ao indivíduo, ao tecido-alvo ou à célula-alvo um fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0225] 136. O método da modalidade 135, em que o tecido-alvo ou a célula-alvo está presente em um indivíduo.
[0226] 137. Um método para tratar ou prevenir um distúrbio, por exemplo, um câncer, em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), que compreende a administração ao indivíduo um fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0227] 138. Um método para produzir um fusossoma de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende:
[0228] a) fornecer uma célula de origem que compreende o ácido nucleico e o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado);
[0229] b) cultivar a célula de origem sob condições que permitem a produção do fusossoma, e
[0230] c) separar, enriquecer ou purificar o fusossoma da célula de origem, produzindo assim o fusossoma.
[0231] 139. Uma célula de origem para produzir um fusossoma, que compreende:
[0232] a) um ácido nucleico;
[0233] b) proteínas estruturais que podem empacotar o ácido nucleico, em que pelo menos uma proteína estrutural compreende um fusogênio que se liga a um receptor de fusogênio; e
[0234] c) um receptor de fusogênio que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma célula de origem similar e não modificada.
[0235] 140. O método da modalidade 138 ou a célula de origem da modalidade 139, em que um ou mais dentre (por exemplo, 2 ou todos os 3) o seguinte se aplicam: o fusossoma é um vetor retroviral, o ácido nucleico é um ácido nucleico retroviral e o proteína é uma proteína estrutural viral.
[0236] 141. A célula de origem da modalidade 139 ou 140, em que o fusogênio causa a fusão do fusossoma com a célula-alvo após a ligação ao receptor de fusogênio.
[0237] 142. A célula de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 141, que se liga à segunda célula de origem similar, por exemplo, o fusogênio da célula de origem se liga ao receptor de fusogênio na segunda célula de origem.
[0238] 143. Uma população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 142.
[0239] 144. A população de células de origem da modalidade 143, em que menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na população são multinucleadas.
[0240] 145. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 144, em que
[0241] uma célula de origem é modificada para ter fusão reduzida (por exemplo, para não fundir) com outras células de origem durante a fabricação de um fusossoma descrito neste documento.
[0242] 146. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 145, em que o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado) não se liga a uma proteína composta por uma célula de origem, por exemplo, a uma proteína na superfície da célula de origem.
[0243] 147. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 146, em que o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado) se liga a uma proteína composta por uma célula de origem, mas não se funde com a célula.
[0244] 148. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 147, em que o fusogênio não induz a fusão com uma célula de origem.
[0245] 149. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 148, em que a célula de origem não expressa uma proteína (por exemplo, um antígeno) que se liga ao fusogênio.
[0246] 150. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 149, uma pluralidade de células de origem não forma um sincício ao expressar o fusogênio, ou menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na população são multinucleadas (por exemplo, compreendem dois ou mais núcleos).
[0247] 151. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 150, em que uma pluralidade de células de origem não forma um sincício ao produzir fusossomas, ou menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na população são multinucleadas.
[0248] 152. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 151, em que menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% dos núcleos na população estão em sincícios.
[0249] 153. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 152, em que pelo menos 50%,
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dos núcleos na população estão em células uninucleares.
[0250] 154. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 153, em que a porcentagem de células que são multinucleadas é menor em uma população de células de origem modificadas em comparação com uma população de células de origem não modificada, por exemplo, menor em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[0251] 155. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 154, em que a porcentagem de núcleos presentes em sincícios é menor em uma população de células de origem modificadas em comparação com uma população de outra forma similar de célula de origem não modificada, por exemplo, menor em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[0252] 156. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 155, em que células multinucleadas (por exemplo, células com dois ou mais núcleos) são detectadas por um ensaio de microscopia, por exemplo, usando uma coloração de DNA, por exemplo, um ensaio do Exemplo 20.
[0253] 157. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 139 a 156, em que os fusossomas funcionais (por exemplo, partículas virais) obtidos a partir das células de origem modificadas é pelo menos 10%, 20%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 8-%, 90%, 2 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior do que o número de fusossomas obtidos a partir de células de origem não modificadas similares, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 20.
[0254] 158. Um fusossoma que não tem um receptor de fusogênio ou compreende um receptor de fusogênio que está presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um fusossoma não modificado de uma célula de origem similar.
[0255] 159. Um método para produzir um fusossoma, que compreende:
[0256] a) fornecer uma célula de origem que compreende um fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado), em que a célula de origem carece de um receptor de fusogênio ou compreende um receptor de fusogênio que está presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma célula de origem não modificada similar de outra forma;
[0257] b) cultivar a célula de origem sob condições que permitem a produção do fusossoma, e
[0258] c) separar, enriquecer ou purificar o fusossoma da célula de origem, produzindo assim o fusossoma.
[0259] 160. O método da modalidade 159, em que fornecer a célula de origem compreende derrubar receptor de fusogênio ou realizar o Knockdown do mesmo na célula de origem ou um precursor do mesmo.
[0260] 161. O fusossoma da modalidade 158 ou o método da modalidade 159 ou 160, em que o fusossoma é um vetor retroviral ou uma partícula similar a retrovírus.
[0261] 162. Um vetor retroviral (por exemplo, adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0262] a) um envelope que compreende um fusogênio realvejado;
[0263] b) um ácido nucleico retroviral que compreende ou codifica:
[0264] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno), em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em uma célula ou tecido-alvo em relação a um vetor retroviral sem o elemento regulatório específico de tecido positivo; ou
[0265] (ii) um elemento regulatório específico de célula-alvo negativo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido negativo diminui a expressão do agente exógeno em uma célula ou tecido não alvo em relação a um vetor retroviral de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de tecido negativo.
[0266] 163. Um vetor retroviral (por exemplo, adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0267] a) um envelope que compreende um fusogênio (por exemplo, um fusogênio realvejado);
[0268] b) um ácido nucleico retroviral que compreende ou codifica:
[0269] (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo (por exemplo, um promotor específico de tecido) operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno), em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em uma célula ou tecido-alvo em relação a um vetor retroviral sem o elemento regulatório específico de tecido positivo; e
[0270] (ii) um elemento regulatório específico de célula-alvo negativo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido), operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido negativo diminui a expressão do agente exógeno em uma célula ou tecido não alvo em relação a um vetor retroviral de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de tecido negativo.
[0271] 164. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que, quando administrado a um indivíduo, um ou mais dos seguintes:
[0272] i) menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do agente exógeno presente de modo detectável no indivíduo está em células não alvo;
[0273] ii) pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das células do indivíduo que compreendem de forma detectável o agente exógeno são células-alvo (por exemplo, células de um único tipo de célula, por exemplo, células T);
[0274] iii) menos de 1.000.000, 500.000, 200.000, 100.000, 50.000,
20.000 ou 10.000 células das células do indivíduo que compreendem de modo detectável o agente exógeno são células não alvo;
[0275] iv) os níveis médios do agente exógeno em todas as células- alvo no indivíduo são pelo menos 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou
1.000 vezes maiores do que os níveis médios do agente exógeno em todas as células não alvo no indivíduo; ou
[0276] v) o agente exógeno não é detectável em qualquer célula não alvo no indivíduo.
[0277] 165. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio realvejado compreende uma sequência escolhida a partir de proteínas F e G do vírus Nipah, proteínas F e H do vírus do sarampo, proteínas F e H do paramixovírus de tupaia, proteínas F e G do paramixovírus ou proteínas F e H ou proteínas F e HN, proteínas F e G do vírus Hendra, proteínas F e G de Henipavírus, proteínas F e H do morbilivírus, proteína F e HN do respirovírus, proteína F e HN do vírus Sendai, proteínas F e HN do rubulavírus ou proteínas F e HN do avulavírus, ou um derivado das mesmas, ou qualquer combinação das mesmas.
[0278] 166. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132.
[0279] 167. O vetor retroviral da modalidade 166, em que o paramixovírus é um vírus Nipah, por exemplo, um henipavírus.
[0280] 168. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico de célula-alvo positivo compreende um promotor específico de tecido, um potencializador específico de tecido, um local de emenda específico de tecido, um local específico de tecido que estende a meia-vida de um RNA ou proteína, um local de promoção de exportação nuclear de mRNA específico de tecido, um local de aumento de tradução específico de tecido ou um local de modificação pós-tradução específico de tecido.
[0281] 169. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico de célula-alvo negativo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido, local de reconhecimento de protease específico de tecido, local de ubiquitina ligase específico de tecido, local de repressão transcricional específico de tecido ou local de repressão epigenética específico de tecido.
[0282] 170. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o elemento regulatório específico da célula-alvo negativo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido.
[0283] 171. O vetor retroviral da modalidade 170, em que o elemento regulatório específico de célula-alvo negativo está situado ou codificado dentro de uma região transcrita (por exemplo, a região transcrita que codifica o agente exógeno), por exemplo, de modo que um RNA produzido pela região transcrita compreenda a sequência de reconhecimento de miRNA dentro de uma UTR ou região de codificação.
[0284] 172. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a célula-alvo é uma célula cancerosa e a célula não alvo é uma célula não cancerosa.
[0285] 173. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico retroviral codifica um TCSRE positivo e/ou um TCSRE negativo.
[0286] 174. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico retroviral compreende o complemento de um TCSRE positivo e/ou um TCSRE negativo.
[0287] 175. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que não entrega ácido nucleico a uma célula não alvo, por exemplo, uma célula de apresentação de antígeno, uma célula classe II de MHC+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CDI le+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa.
[0288] 176. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001%, 0,00001% ou 0,000001% de um tipo de célula não alvo (por exemplo, uma ou mais dentre uma célula apresentadora de antígeno, uma célula classe II de MHC+, uma célula apresentadora de antígeno profissional, uma célula apresentadora de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CDI le+, uma célula
CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa) compreende o ácido nucleico retroviral, por exemplo, usando PCR quantitativo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 1.
[0289] 177. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células-alvo compreendem 0,00001 a 10, 0,0001 a 10, 0,001 a 10, 0,01 a 10, 0,1 a 10, 0,5 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 cópias do ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo, por genoma da célula hospedeira, por exemplo, em que o número de cópias do ácido nucleico retroviral é avaliado após administração in vivo.
[0290] 178. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que: menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01% das células não alvo (por exemplo, uma célula de apresentação de antígeno, um MHC célula de classe II+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa) compreende o agente exógeno; ou o agente exógeno (por exemplo, proteína) não está presente de modo detectável em uma célula não alvo, por exemplo, uma célula de apresentação de antígeno, uma célula classe II de MHC+, uma célula de apresentação de antígeno profissional, uma célula de apresentação de antígeno atípica, um macrófago, uma célula dendrítica, uma célula dendrítica mieloide, uma célula dendrítica plasmocitoide, uma célula CD11c+, uma célula CD11b+, um esplenócito, uma célula B, um hepatócito, uma célula endotelial ou uma célula não cancerosa.
[0291] 179. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor retroviral distribui o ácido nucleico retroviral a uma célula-alvo, por exemplo, uma célula T, uma célula T CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CDS+, um hepatócito, uma célula-tronco hematepoiética, uma célula-tronco hematopoiética CD34+, uma célula- tronco hematepoiética CD I05+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD I05+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, uma célula cancerosa EpCAM+, uma célula canceladora CD19+, uma célula de câncer Her2/Neu+, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLCIA3+, um adipócito SLC7AIO+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+.
[0292] 180. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,00001%, 20 0,0001%, 0,001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, I%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de células-alvo (por exemplo, uma ou mais células T, células T CD3+, células T CD4+, células T CDS+, hepatócitos, células-tronco hematepoiéticas, células-tronco hematopoiéticas CD34+, células-tronco hematopoiéticas CD I05+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD I05+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, uma célula cancerosa EpCAM+, uma célula canceladora CD19+, uma célula Her2/Neu+ célula cancerosa, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLCIA3+, um adipócito SLC7AIO+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+) compreendem o ácido nucleico retroviral, por exemplo, usando PCR quantitativo, por exemplo, usando um ensaio de Exemplo 3.
[0293] 181. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,00001%, 0,0001%, 0,001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, I%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo (por exemplo, uma célula T, uma célula T
CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CDS+, um hepatócito, uma célula-tronco hematopoiética uma célula-tronco hematepoiética CD34+, uma célula-tronco hematepoiética CD I05+, uma célula-tronco hematepoiética CD117+, uma célula endotelial CD I05+, uma célula B, uma célula B CD20+, uma célula B CD19+, uma célula cancerosa, uma célula cancerosa CD133+, um EpCAM+ célula cancerosa, uma célula canceladora CD19+, uma célula cancerosa Her2/Neu+, um neurônio GluA2+, um neurônio GluA4+, uma célula exterminadora natural NKG2D+, um astrócito SLCIA3+, um adipócito SLC7AlO+ ou uma célula epitelial pulmonar CD30+) compreendem o agente exógeno.
[0294] 182. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que, após a administração, a razão entre células-alvo que compreendem o ácido nucleico retroviral e células não alvo que compreendem o ácido nucleico retroviral é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo 3.
[0295] 183. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o número médio de cópias do ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo em células-alvo e o número médio de cópias do ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo em células não alvo é pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo
3.
[0296] 184. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o número de cópias mediano de ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo em células-alvo e o número de cópias mediano de ácido nucleico retroviral ou uma porção do mesmo em células não alvo é pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100,
500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 1 e Exemplo 3.
[0297] 185. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre células-alvo que compreendem o agente de RNA exógeno e células não alvo que compreendem o agente de RNA exógeno é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0298] 186. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível médio do agente de RNA exógeno de células-alvo e o nível médio do agente de RNA exógeno de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0299] 187. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível de agente de RNA exógeno mediano de células-alvo e o nível de agente de RNA exógeno mediano de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio de PCR quantitativo de transcrição reversa.
[0300] 188. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre células-alvo que compreendem o agente de proteína exógena e células não alvo que compreendem o agente de proteína exógena é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0301] 189. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível médio do agente de proteína exógena de células-alvo e o nível médio do agente de proteína exógena de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500,
1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0302] 190. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a razão entre o nível mediano do agente de proteína exógena de células-alvo e o nível mediano do agente de proteína exógena de células não alvo é de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, por exemplo, de acordo com um ensaio FACS, por exemplo, usando os ensaios do Exemplo 2 e/ou Exemplo 4.
[0303] 191. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ou ambos:
[0304] i) uma proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope; e
[0305] ii) uma proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
[0306] 192. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ou mais dos seguintes:
[0307] i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope;
[0308] ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; ou
[0309] iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar de outra forma e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar de outra forma.
[0310] 193. O vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais elementos isolantes.
[0311] 194. Uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0312] a) um envelope que compreende um fusogênio (por exemplo, um fusogênio realvejado), e
[0313] b) um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno) ou um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico retroviral) que codifica um agente exógeno; e
[0314] c) um ou mais dentre:
[0315] i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope;
[0316] ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa no envelope e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar de outra forma; ou
[0317] iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação a uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada similar de outra forma; em que, quando administrado a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano ou um camundongo), um ou mais dentre:
[0318] i) a partícula ou vetor não produz uma resposta de anticorpo detectável (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou anticorpos contra a partícula ou vetor estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3 %, 2% ou I% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de detecção de anticorpo FACS, por exemplo, um ensaio do Exemplo 13 ou Exemplo 14);
[0319] ii) a partícula ou vetor não produz uma resposta imunológica celular detectável (por exemplo, resposta de células T, resposta de células NK ou resposta de macrófagos), ou uma resposta imunológica celular contra a partícula ou vetor está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou I% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de lise de PBMC (por exemplo, um ensaio do Exemplo 5), por um ensaio de lise de células NK (por exemplo, um ensaio do Exemplo 6), por um ensaio de lise de células T exterminadoras CDS (por exemplo, um ensaio do Exemplo 7), por um ensaio de fagocitose de macrófagos (por exemplo, um ensaio do Exemplo 8);
[0320] iii) a partícula ou vetor não produz uma resposta imunológica inata detectável, por exemplo, ativação do complemento (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou a resposta imunológica inata contra a partícula ou vetor está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou I% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de atividade do complemento (por exemplo, um ensaio do Exemplo 9);
[0321] iv) menos de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,002% ou 0,001% dos vírus são inativados pelo soro, por exemplo, por um ensaio de inativação de soro, por exemplo, um ensaio do Exemplo 11 ou Exemplo 12;
[0322] v) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno da partícula ou vetor não produz uma resposta de anticorpo detectável (por exemplo, após uma única administração ou uma pluralidade de administrações), ou os anticorpos contra a célula-alvo estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou I% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de detecção de anticorpo FACS, por exemplo, um ensaio do Exemplo 15; ou
[0323] vi) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno da partícula ou vetor não produz uma resposta imunológica celular detectável (por exemplo, resposta de célula T, resposta de célula NK ou resposta de macrófago), ou uma resposta celular contra a célula-alvo está presente em um nível de menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou I% acima de um nível precedente, por exemplo, por um ensaio de fagocitose de macrófagos (por exemplo, um ensaio do Exemplo 16), por um ensaio de lise de PBMC (por exemplo, um ensaio do Exemplo 17), por um ensaio de lise de células NK (por exemplo, um ensaio do
Exemplo 18), ou por um ensaio de lise de células T exterminadoras CDS (por exemplo, um ensaio do Exemplo 19).
[0324] 195. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral da modalidade 194, em que o nível precedente é o nível correspondente no mesmo indivíduo antes da administração da partícula ou vetor.
[0325] 196. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral das modalidades 194 ou 195, em que a proteína imunossupressora é uma proteína regulatória do complemento ou CD47.
[0326] 197. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 194 a 196, em que a proteína imunoestimuladora é uma proteína MHC (por exemplo, HLA).
[0327] 198. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 194 a 197, em que um ou ambos dentre: a primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa é diferente de CD47, e a segunda proteína imunoestimuladora é diferente de MHC.
[0328] 199. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0329] a) um envelope que compreende um fusogênio, e
[0330] b) um ácido nucleico retroviral que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno);
[0331] c) MHC exógeno ou superexpresso, por exemplo, HLA (por exemplo, HLA-G ou HLA-E), ou uma combinação dos mesmos, no envelope.
[0332] 200. Uma partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0333] a) um envelope pseudotipado que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos
40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência dos aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e
[0334] b) um ácido nucleico retroviral que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno);
[0335] c) CD47 exógeno ou superexpresso ou uma proteína regulatória do complemento, ou uma combinação dos mesmos, no envelope.
[0336] 201. Uma partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0337] a) um envelope pseudotipado que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132, e
[0338] b) um ácido nucleico retroviral que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno); e
[0339] c) MHC I (por exemplo, HLA-A, HAL-B ou HLA-C) ou MHC II (por exemplo, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ ou HLA-DR) que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
70%, 80% ou 90%) em comparação com um retrovírus similar partícula ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
[0340] 202. Uma partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0341] a) um envelope pseudotipado que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e
[0342] b) um ácido nucleico retroviral que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno); e
[0343] c) uma ou ambas dentre uma proteína imunossupressora exógena ou superexpressa ou uma proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
[0344] 203. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral está em circulação pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18, 24, 36, ou 48 horas após a administração ao indivíduo.
[0345] 204. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%,
0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 30 minutos após a administração.
[0346] 205. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 1 hora após a administração.
[0347] 206. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, I%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou I00% dos retrovírus estão em circulação 2 horas após a administração.
[0348] 207. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 4 horas após a administração.
[0349] 208. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou I00% dos retrovírus estão em circulação 8 horas após a administração.
[0350] 209. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 12 horas após a administração.
[0351] 210. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 18 horas após a administração.
[0352] 211. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou I00% dos retrovírus estão em circulação 24 horas após a administração.
[0353] 212. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 36 horas após a administração.
[0354] 213. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus estão em circulação 48 horas após a administração.
[0355] 214. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma redução na imunogenicidade medida por uma redução na resposta humoral após uma ou mais administração do retrovírus a um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal descrito neste documento, em comparação com retrovírus de referência, por exemplo, um retrovírus não modificado de outra forma similar ao retrovírus.
[0356] 215. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a redução na resposta humoral é medida em uma amostra de soro por um título de anticorpo anti-célula, por exemplo, título de anticorpo antirretroviral, por exemplo, por ELISA.
[0357] 216 A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma amostra de soro de animais administrados com a composição de retrovírus tem uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de um título de anticorpo antirretrovírus em comparação com a amostra de soro de um indivíduo administrado com uma célula não modificada.
[0358] 217. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma amostra de soro de um indivíduo administrado com a composição de retrovírus tem um título de anticorpo anti-célula aumentado, por exemplo, aumentado em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% da linha de base, por exemplo, em que a linha de base se refere à amostra de soro do mesmo indivíduo antes da administração da composição de retrovírus.
[0359] 218. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que: o indivíduo ao qual será administrado o retrovírus ou composição farmacêutica tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo pré-existente (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com o retrovírus; o indivíduo ao qual será administrado a composição de retrovírus não tem níveis detectáveis de um anticorpo pré-existente reativo com o retrovírus; um indivíduo que recebeu o retrovírus ou composição farmacêutica tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com o retrovírus; o indivíduo que recebeu o retrovírus ou composição farmacêutica (por exemplo, pelo menos uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais) não tem níveis detectáveis de anticorpo reativo com o retrovírus; ou os níveis de anticorpo não aumentam mais do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 50% entre dois pontos de tempo, o primeiro ponto no tempo sendo antes da primeira administração do retrovírus, e o segundo ponto no tempo sendo após uma ou mais administrações do retrovírus.
[0360] 219. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor retroviral é produzido pelos métodos do Exemplo 5, 6 ou 7, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de HLA-G ou HLA-E.
[0361] 220. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que os vetores retrovirais gerados a partir de células NMC-HLA-G têm uma porcentagem diminuída de lise, por exemplo, lise mediada por PBMC, lise mediada por células NK e/ou lise mediada por células T CDS+, em pontos de tempo específicos, em comparação com vetores retrovirais gerados a partir de NMCs ou vetor vazio de NMC.
[0362] 221. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor retroviral modificado evita a fagocitose por macrófagos.
[0363] 222. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor retroviral é produzido pelos métodos do Exemplo 8, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de CD47.
[0364] 223. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o índice fagocítico é reduzido quando os macrófagos são incubados com vetores retrovirais derivados de NMC-CD47, versus aqueles derivados de NMC, ou vetor vazio de NMC.
[0365] 224. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que tem uma redução na fagocitose de macrófagos, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na fagocitose de macrófagos em comparação com um retrovírus de referência, por exemplo, um retrovírus não modificado de outra forma similar ao retrovírus, em que a redução na fagocitose de macrófagos é determinada pela análise do índice de fagocitose in vitro, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 8.
[0366] 225. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de retrovírus tem um índice de fagocitose de 0, 1, 10, 100 ou mais, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 8, quando incubado com macrófagos em um ensaio in vitro de fagocitose de macrófagos.
[0367] 226. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que é modificada e tem atividade de complemento reduzida em comparação com um vetor retroviral não modificado.
[0368] 227. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que é produzida pelos métodos do Exemplo 9, por exemplo, a partir de células transfectadas com um cDNA que codifica para proteínas reguladoras do complemento, por exemplo, DAF.
[0369] 228. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dose de vetor retroviral em que 200 pg/ml de C3a está presente é maior para o vetor retroviral modificado (por exemplo, HEK293-DAF) incubado com soro de camundongo correspondente (por exemplo, soros de camundongos HEK-293 DAF) do que para o vetor retroviral de referência (por exemplo, vetor retroviral HEK293) incubado com soros de camundongos correspondentes (por exemplo, soros de camundongos HEK293).
[0370] 229. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dose de vetor retroviral em que 200 pg/ml de C3a está presente é maior para o vetor retroviral modificado (por exemplo, HEK293-DAF) incubado com soros de camundongo virgens do que para o vetor retroviral de referência (por exemplo, vetor retroviral HEK293) incubado com soros de camundongo virgens.
[0371] 230. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de retrovírus é resistente à inativação mediada por complemento no soro do paciente 30 minutos após a administração de acordo com um ensaio do Exemplo 9.
[0372] 231. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos retrovírus são resistentes à inativação mediada pelo complemento.
[0373] 232. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a proteína regulatória do complemento compreende uma ou mais das proteínas que se ligam ao fator de aceleração de decaimento (DAF, CD55), por exemplo, proteína I similar ao fator H (FH) (FHL -1), por exemplo, proteína de ligação a C4b (C4BP), por exemplo, receptor I do complemento (CD35), por exemplo, proteína cofator de membrana (MCP, CD46), por exemplo protectina (CD59), por exemplo, proteínas que inibem as enzimas CD/C5 convertase da via clássica e alternativa do complemento, por exemplo, proteínas que regulam a montagem do MAC.
[0374] 233. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que é produzida pelos métodos do Exemplo 10, por exemplo, a partir de células transfectadas com uma codificação de DNA para um shRNA direcionado a MHC de classe I, por exemplo, em que vetores retrovirais derivados de classe I de shMHC de NMC têm menor expressão de classe I de MHC em comparação com NMCs e controle de vetor de NMC.
[0375] 234. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para vetores retrovirais é a inativação do soro, por exemplo, inativação do soro medida como descrito neste documento,
por exemplo, como descrito no Exemplo 11.
[0376] 235. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de camundongos virgens de vetor retroviral.
[0377] 236. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos virgens de vetor retroviral e incubações de controle sem soro.
[0378] 237. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno é menor em amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de controle positivo do que em amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos virgens de vetor retroviral.
[0379] 238. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, tem uma inativação de soro reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais), administrações do vetor retroviral modificado.
[0380] 239. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um vetor retroviral descrito neste documento não é inativado por soro após múltiplas administrações.
[0381] 240. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para o vetor retroviral é a inativação do soro, por exemplo, após múltiplas administrações, por exemplo, inativação do soro após múltiplas administrações medidas como descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito em Exemplo 12.
[0382] 241. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de camundongos tratados com vetores retrovirais modificados (por exemplo, HEK293-HLA-G).
[0383] 242. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas de camundongos tratados 1, 2, 3, 5 ou 10 vezes com vetores retrovirais modificados (por exemplo, HEK293-HLA-G).
[0384] 243. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não é diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos tratados com veículo e de camundongos tratados com vetores retrovirais modificados (por exemplo, HEK293-HLA-G).
[0385] 244. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células que recebem o agente exógeno é menor para vetores retrovirais derivados de uma célula de referência (por exemplo, HEK293) do que para vetores retrovirais modificados (por exemplo, HEK293-HLA-G).
[0386] 245. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida de imunogenicidade para um vetor retroviral são as respostas de anticorpos.
[0387] 246. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que um indivíduo que recebe um vetor retroviral descrito neste documento tem anticorpos pré- existentes que se ligam e reconhecem o vetor retroviral, por exemplo, medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 13.
[0388] 247. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o soro de camundongos virgens de vetor retroviral mostra mais sinal (por exemplo, fluorescência) do que o controle negativo, por exemplo, soro de um camundongo depletado de IgM e IgG, por exemplo, indicando que ocorreu imunogenicidade.
[0389] 248. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o soro de camundongos virgens de vetor retroviral mostra um sinal similar (por exemplo, fluorescência) em comparação com o controle negativo, por exemplo, indicando que a imunogenicidade não ocorreu de forma detectável.
[0390] 249. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que é um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, e que tem uma resposta humoral reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais), administrações do vetor retroviral modificado, por exemplo, medido como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 14.
[0391] 250. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor retroviral é produzido pelos métodos do Exemplo 5, 6, 7 ou 14, por exemplo, a partir de células transfectadas com cDNA de HLA-G ou HLA-E.
[0392] 251. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a resposta humoral é avaliada pela determinação de um valor para o nível de anticorpos de vetor antirretroviral (por exemplo, anticorpos IgM, IgGl e/ou IgG2).
[0393] 252. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que vetores retrovirais modificados (por exemplo, NMC-HLA-G) têm títulos de anticorpos IgM ou IgG1/2 antivirais diminuídos (por exemplo, conforme medido pela intensidade de fluorescência em FACS) após as injeções, em comparação com um controle, por exemplo, vetores retrovirais NMC ou vetores retrovirais vazios de NMC.
[0394] 253. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não são direcionadas por uma resposta de anticorpo ou uma resposta de anticorpo estará abaixo de um nível de referência, por exemplo, medido como descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 15.
[0395] 254. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, o sinal (por exemplo, intensidade média de fluorescência) é similar para células receptoras de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS.
[0396] 255. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta do macrófago.
[0397] 256. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não são direcionadas por macrófagos ou são direcionadas abaixo de um nível de referência.
[0398] 257. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o índice fagocítico, por exemplo, medido como descrito neste documento, por exemplo, como descrito no Exemplo 16, é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS.
[0399] 258. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta de PBMC.
[0400] 259. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não induzem uma resposta de PBMC.
[0401] 260. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetor retroviral e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 17.
[0402] 261. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta da célula exterminadora natural.
[0403] 262. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não induzem uma resposta de célula exterminadora natural ou induzem uma resposta de célula exterminadora natural inferior, por exemplo, inferior a um valor de referência.
[0404] 263. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetor retroviral e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 18.
[0405] 264. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta de células T CDS+.
[0406] 265. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células receptoras não induzem uma resposta de células T CDS+ ou induzem uma resposta de células T CDS+ inferior, por exemplo, inferior a um valor de referência.
[0407] 266. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a porcentagem de células CD3+/CMG+ é similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetor retroviral e camundongos tratados com PBS, por exemplo, conforme medido conforme descrito neste documento, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 19.
[0408] 267. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fusogênio é um fusogênio realvejado.
[0409] 268. A partícula similar a retrovírus ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende um ácido nucleico retroviral que codifica um ou ambos: (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno, ou (ii) um elemento regulatório específico de célula-alvo negativo operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno.
[0410] 269. Uma partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral (por exemplo, uma partícula ou vetor adequado para uso in vivo em um indivíduo humano), que compreende:
[0411] a) um envelope pseudotipado que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, por exemplo, uma sequência da Tabela 4 ou Tabela 5, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e
[0412] b) um ácido nucleico retroviral que codifica um agente exógeno (por exemplo, polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno), em que o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais elementos isolantes.
[0413] 270. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral da modalidade 269, em que o ácido nucleico retroviral compreende dois elementos isolantes, por exemplo, um primeiro elemento isolante a montante de uma região que codifica o agente exógeno e um segundo elemento isolante a jusante de uma região que codifica o agente exógeno, por exemplo, em que o primeiro elemento isolante e o segundo elemento isolante compreendem as mesmas sequências ou sequências diferentes.
[0414] 271. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral da modalidade 269 ou 270, em que a variação no nível mediano de agente exógeno em uma amostra de células isoladas após a administração da partícula ou vetor ao indivíduo em um primeiro ponto no tempo é pelo menos, menos que, ou cerca de 10.000%, 5.000%,
2.000%, 1.000%, 500%, 200%, 100%, 50%, 20%, 10% ou 5% do nível mediano do agente exógeno em uma amostra de células isolada após a administração da partícula ou vetor ao indivíduo em um segundo ponto no tempo posterior.
[0415] 272. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral da modalidade 271, em que o nível mediano de expressão por célula é avaliado apenas em células que têm um número de cópias do genoma retroviral de pelo menos 1,0.
[0416] 273. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 272, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no indivíduo, de forma detectável, compreende o agente exógeno.
[0417] 274. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 271 a 273, em que o nível mediano de expressão do gene de carga útil é avaliado através das células isoladas do indivíduo 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após a administração da composição retroviral ao indivíduo.
[0418] 275. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 274, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no indivíduo que compreende de forma detectável o agente exógeno em um primeiro ponto no tempo ainda compreende de forma detectável o agente exógeno em um segundo ponto no tempo posterior, por exemplo, em que o primeiro ponto no tempo é de 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após a administração da composição retroviral ao indivíduo.
[0419] 276. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral da modalidade 275, em que o segundo ponto no tempo é de 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias, 1.095 dias após o primeiro ponto no tempo.
[0420] 277. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 276, que não é genotóxico ou não aumenta a taxa de formação de tumor em células- alvo em comparação com células-alvo não tratadas com a partícula como retrovírus ou vetor retroviral.
[0421] 278. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 277, em que o nível mediano do agente exógeno é avaliado em uma população de células de um indivíduo que recebeu o vetor retroviral ou composição farmacêutica.
[0422] 279. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 278, em que o nível mediano do agente exógeno avaliado em populações de células coletadas (por exemplo, isoladas) do indivíduo em diferentes dias após a administração é inferior a cerca de 10.000%, 1.000%, 100% ou 10%, por exemplo, 10.000% a 1.000%, 1.000% a 100% ou 100% a 10% diferente do nível mediano de agente exógeno na população de células avaliada no dia 7, dia 14, dia 28, ou dia 56, em que as células na população têm um número de cópias do vetor de pelo menos 1,0.
[0423] 280. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 279, em que o nível de agente exógeno é avaliado através das células de um indivíduo que recebeu o vetor retroviral ou composição farmacêutica.
[0424] 281. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 280, em que a porcentagem de células que compreende o agente exógeno é avaliada em uma pluralidade de células coletadas (por exemplo, isoladas) do indivíduo 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias,
1.095 dias após a administração do vetor retroviral ou composição farmacêutica.
[0425] 282. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 281, em que a diferença na porcentagem de células que compreendem o agente exógeno avaliado em células isoladas em dois dias diferentes após a administração é inferior a I%, 5%, 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1.000%, 1.500% ou 2.000%.
[0426] 283. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 282, em que a porcentagem de células-alvo que são positivas para o agente exógeno é similar em células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias.
[0427] 284. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 283, em que: pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias em 7 dias; pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 14 dias; pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias como em 28 dias; pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias quanto em 56 dias; pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias a 112 dias; pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 730 dias ou
1.095 dias quanto em 365 dias; ou pelo menos tantas células-alvo são positivas para o agente exógeno em 1.095 dias quanto em 730 dias.
[0428] 285. A partícula similar a retrovírus pseudotipado ou vetor retroviral de qualquer uma das modalidades 269 a 284, em que: o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno é similar em células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias; o nível mediano do agente exógeno nas células-alvo que compreendem o agente exógeno em 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou
1.095 dias é de pelo menos alto quanto em 7 dias; o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 14 dias; o nível mediano do agente exógeno nas células-alvo que compreendem o agente exógeno em 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 28 dias; o nível mediano do agente exógeno nas células-alvo que compreendem o agente exógeno em 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto em 56 dias; o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 112 dias; o nível mediano do agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 730 dias ou 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto 365 dias; ou o nível mediano de agente exógeno em células-alvo que compreendem o agente exógeno em 1.095 dias é pelo menos tão alto quanto em 730 dias.
[0429] 286. Um método de entrega de um agente exógeno a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), que compreende administrar ao indivíduo uma partícula similar a retrovírus (por exemplo, uma partícula similar a retrovírus pseudotipado) ou vetor retroviral (por exemplo, vetor retroviral pseudotipado) de qualquer uma das modalidades anteriores, entregando assim o agente exógeno ao indivíduo.
[0430] 287. Um método de modulação de uma função, em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), tecido-alvo ou célula- alvo, que compreende colocar, por exemplo a administração a, o indivíduo, o tecido-alvo ou a célula-alvo em contato com uma partícula similar a retrovírus (por exemplo, uma partícula similar a retrovírus pseudotipado) ou vetor retroviral (por exemplo, vetor retroviral pseudotipado) de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0431] 288. O método da modalidade 287, em que o tecido-alvo ou a célula-alvo está presente em um indivíduo.
[0432] 289. O método para tratar ou prevenir um distúrbio, por exemplo, um câncer, em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), que compreende administrar ao indivíduo uma partícula similar a retrovírus (por exemplo, uma partícula similar a retrovírus pseudotipado) ou vetor retroviral (por exemplo, vetor retroviral pseudotipado) de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0433] 290. Um método de produção de um vetor ou partícula retroviral similar a retrovírus de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende:
[0434] a) fornecer uma célula de origem que compreende o ácido nucleico retroviral e o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado);
[0435] b) cultivar a célula de origem sob condições que permitem a produção do vetor retroviral, e
[0436] c) separar, enriquecer ou purificar o vetor retroviral da célula de origem, formando assim o vetor retroviral.
[0437] 291. Uma célula de origem para a produção de um vetor retroviral, que compreende:
[0438] a) um ácido nucleico retroviral;
[0439] b) proteínas estruturais virais que podem empacotar o ácido nucleico retroviral, em que pelo menos uma proteína estrutural viral compreende um fusogênio que se liga a um receptor de fusogênio; e
[0440] c) um receptor de fusogênio que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma célula de origem não modificada e similar de outra forma.
[0441] 292. A célula de origem da modalidade 291, em que o fusogênio causa a fusão do vetor retroviral com a célula-alvo após a ligação ao receptor de fusogênio.
[0442] 293. A célula de origem da modalidade 291 ou 292, que se liga à segunda célula de origem similar, por exemplo, o fusogênio da célula de origem se liga ao receptor de fusogênio na segunda célula de origem.
[0443] 294. Uma população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 293.
[0444] 295. A população de células de origem da modalidade 294, em que menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na população são multinucleadas.
[0445] 296. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 295, em que uma célula de origem é modificada para ter fusão reduzida (por exemplo, para não se fundir) com outras células de origem durante a fabricação de um retrovírus descrito neste documento.
[0446] 297. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 296, em que o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado) não se liga a uma proteína composta por uma célula de origem, por exemplo, a uma proteína na superfície da fonte célula.
[0447] 298. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 297, em que o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado) se liga a uma proteína composta por uma célula de origem, mas não se funde com a célula.
[0448] 299. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 298, em que o fusogênio não induz a fusão com uma célula de origem.
[0449] 300. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 299, em que a célula de origem não expressa uma proteína, por exemplo, um antígeno, que se liga ao fusogênio.
[0450] 301. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 300, uma pluralidade de células de origem não forma um sincício ao expressar o fusogênio, ou menos que 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5 %, 4%, 3%, 2% ou I% das células na população são multinucleadas (por exemplo, compreendem dois ou mais núcleos).
[0451] 302. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 301, em que uma pluralidade de células de origem não forma um sincício ao produzir lentivírus, ou menos que 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5 %, 4%, 3%, 2% ou I% das células na população são multinucleadas.
[0452] 303. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 302, em que menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou I% dos núcleos da população estão em sincícios.
[0453] 304. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 303, em que pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dos núcleos na população estão em células uninucleares.
[0454] 305. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 304, em que a porcentagem de células que são multinucleadas é menor em uma população de células de origem modificadas em comparação com uma população de outra forma similar de célula de origem não modificada, por exemplo, menor em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[0455] 306. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 305, em que a porcentagem de núcleos presentes no sincício é menor em uma população de células de origem modificadas em comparação com uma população de outra forma similar de células de origem não modificadas, por exemplo, menor em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[0456] 307. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 306, em que células multinucleadas (por exemplo, células com dois ou mais núcleos) são detectadas por um ensaio de microscopia, por exemplo, usando uma coloração de DNA, por exemplo, um ensaio do Exemplo 20.
[0457] 308. A célula de origem ou população de células de origem de qualquer uma das modalidades 291 a 307, em que as partículas virais funcionais obtidas a partir das células de origem modificadas são pelo menos 10%, 20%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior do que o número de partículas virais funcionais obtidas a partir de células de origem não modificadas similares, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 20.
[0458] 309. Um vetor ou partícula retroviral similar a retrovírus que não tem um receptor de fusogênio ou compreende um receptor de fusogênio que está presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com um vetor retroviral não modificado ou partícula similar a retrovírus de uma célula de origem similar.
[0459] 310. Um método para produzir um vetor ou partícula retroviral similar a retrovírus, que compreende:
[0460] a) fornecer uma célula de origem que compreende um fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado), em que a célula de origem carece de um receptor de fusogênio ou compreende um receptor de fusogênio que está presente em níveis reduzidos (por exemplo,
reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma célula de origem não modificada similar de outra forma;
[0461] b) cultivar a célula de origem sob condições que permitem a produção do vetor retroviral, e
[0462] c) separar, enriquecer ou purificar o vetor retroviral da célula de origem, formando assim o vetor retroviral.
[0463] 311. O método da modalidade 310, em que fornecer a célula de origem compreende derrubar receptor de fusogênio ou realizar o Knockdown do mesmo na célula de origem ou um precursor do mesmo.
[0464] Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e das reivindicações.
[0465] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionados neste documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Por exemplo, todas as sequências GenBank, Unigene e Entrez referidas neste documento, por exemplo, em qualquer Tabela neste documento, são incorporadas a título de referência. A menos que especificado de outra forma, os números de acesso de sequência especificados neste documento, incluindo em qualquer Tabela neste documento, se referem às entradas do banco de dados atuais em 15 de maio de 2018. Quando um gene ou proteína faz referência a uma pluralidade de números de acesso de sequência, todas as variantes de sequência são abrangidas. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0466] A presente invenção fornece, pelo menos em parte, métodos e composições de fusossoma para entrega in vivo. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma combinação de elementos que promovem a especificidade para células-alvo, por exemplo, um ou mais dentre um fusogênio realvejado, um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo e um elemento regulatório específico de célula não alvo. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende uma ou mais modificações que diminuem uma resposta imunológica contra o fusossoma.
DEFINIÇÕES
[0467] Os termos usados nas reivindicações e especificações são definidos conforme estabelecido abaixo, a menos que especificado de outra forma.
[0468] Tal como utilizado neste documento, "presente de modo detectável", quando usado no contexto de um agente exógeno estando presente de forma detectável, significa que o próprio agente exógeno está presente de forma detectável. Por exemplo, se o agente exógeno for uma proteína, o agente de proteína exógena pode estar presente de forma detectável, independentemente de se um ácido nucleico que o codifica está presente ou não de forma detectável.
[0469] Tal como utilizado neste documento, "fusossoma" se refere a uma bicamada de lipídios anfipáticos envolvendo um lúmen ou cavidade e um fusogênio que interage com a bicamada lipídica anfipática. Nas modalidades, o fusossoma compreende um ácido nucleico. Em algumas modalidades, o fusossoma é uma preparação fechada por membrana. Em algumas modalidades, o fusossoma é derivado de uma célula de origem.
[0470] Tal como utilizado neste documento, "composição de fusossoma" se refere a uma composição que compreende um ou mais fusossomas.
[0471] Tal como utilizado neste documento, "fusogênio" se refere a um agente ou molécula que cria uma interação entre dois lúmens fechados por membrana. Nas modalidades, o fusogênio facilita a fusão das membranas. Em outras modalidades, o fusogênio cria uma conexão, por exemplo, um poro, entre dois lúmens (por exemplo, um lúmen de um vetor retroviral e um citoplasma de uma célula-alvo). Em algumas modalidades, o fusogênio compreende um complexo de duas ou mais proteínas, por exemplo, em que nenhuma proteína tem atividade fusogênica sozinha. Em algumas modalidades, o fusogênio compreende um domínio de direcionamento.
[0472] Tal como utilizado neste documento, um "receptor de fusogênio" se refere a uma entidade (por exemplo, uma proteína) composta por uma célula-alvo, em que a ligação de um fusogênio em um fusossoma (por exemplo, retrovírus) a um receptor de fusogênio em uma célula-alvo promove a entrega de um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico retroviral) (e opcionalmente também um agente exógeno codificado no mesmo) à célula-alvo.
[0473] Conforme usado neste documento, um "elemento isolante" se refere a uma sequência de nucleotídeos que bloqueia intensificadores ou evita a propagação de heterocromatina. Um elemento isolante pode ser do tipo selvagem ou mutante.
[0474] O termo "quantidade eficaz", tal como utilizado neste documento, significa uma quantidade de uma composição farmacêutica que é suficiente para modificar significativa e positivamente os sintomas e/ou condições a serem tratadas (por exemplo, fornecer uma resposta clínica positiva). A quantidade eficaz de um ingrediente ativo para uso em uma composição farmacêutica irá variar com a condição particular a ser tratada, a gravidade da condição, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea, o ingrediente (ou ingredientes) ativo particular sendo empregado, o excipiente (ou excipientes) e/ou transportador (ou transportadores) específico farmaceuticamente aceitável utilizado, e fatores similares com o conhecimento e experiência do médico assistente.
[0475] Um "agente exógeno", tal como utilizado neste documento com referência a um vírus, VLP ou fusossoma, se refere a um agente que não é compreendido nem codificado no vírus de tipo selvagem correspondente ou fusogênio feito a partir de uma célula de origem de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o agente exógeno não existe naturalmente, como uma proteína ou ácido nucleico que tem uma sequência que é alterada (por exemplo, por inserção, deleção ou substituição) em relação a uma proteína de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o agente exógeno não existe naturalmente na célula de origem. Em algumas modalidades, o agente exógeno existe naturalmente na célula de origem, mas é exógeno ao vírus. Em algumas modalidades, o agente exógeno não existe naturalmente na célula receptora. Em algumas modalidades, o agente exógeno existe naturalmente na célula receptora, mas não está presente em um nível desejado ou em um momento desejado. Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende RNA ou proteína.
[0476] O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme usado neste documento, se refere a excipientes, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco razoável.
[0477] Tal como utilizado neste documento, um "elemento regulatório específico de célula-alvo positivo" (ou TCSRE positivo) se refere a uma sequência de ácido nucleico que aumenta o nível de um agente exógeno em uma célula-alvo em comparação com uma célula não alvo, em que o ácido nucleico que codifica o agente exógeno está operacionalmente ligado ao TCSRE positivo. Em algumas modalidades, o TCSRE positivo é uma sequência de ácido nucleico funcional, por exemplo, o TCSRE positivo pode compreender um promotor ou intensificador. Em algumas modalidades, o TCSRE positivo codifica uma sequência de RNA funcional, por exemplo, o TCSRE positivo pode codificar um local de splice que promove o splicing correto do RNA na célula-alvo. Em algumas modalidades, o TCSRE positivo codifica uma sequência de proteína funcional, ou o TCSRE positivo pode codificar uma sequência de proteína que promove a modificação pós-tradução correta da proteína. Em algumas modalidades, o TCSRE positivo diminui o nível ou atividade de um regulador descendente ou inibidor do agente exógeno.
[0478] Tal como utilizado neste documento, um "elemento regulatório específico de célula-alvo negativo" (ou TCSRE negativo) se refere a uma sequência de ácido nucleico que diminui o nível de um agente exógeno em uma célula não alvo em comparação com uma célula-alvo, em que o ácido nucleico que codifica o agente exógeno está operacionalmente ligado ao TCSRE negativo. Em algumas modalidades, o TCSRE negativo é uma sequência de ácido nucleico funcional, por exemplo, um local de reconhecimento de miRNA que causa degradação ou inibição do ácido nucleico retroviral em uma célula não alvo. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de RNA funcional, por exemplo, o ácido nucleico codifica uma sequência de miRNA presente em um mRNA que codifica um agente de proteína exógena, de modo que o mRNA é degradado ou inibido em uma célula não alvo. Em algumas modalidades, o TCSRE negativo aumenta o nível ou atividade de um regulador descendente ou inibidor do agente exógeno.
[0479] Tal como utilizado neste documento, um "elemento regulatório específico de célula não alvo" (ou NTCSRE) se refere a uma sequência de ácido nucleico que diminui o nível de um agente exógeno em uma célula não alvo em comparação com uma célula-alvo, em que o ácido nucleico que codifica o agente exógeno está operacionalmente ligado ao NTCSRE. Em algumas modalidades, o NTCSRE é uma sequência de ácido nucleico funcional, por exemplo, um local de reconhecimento de miRNA que causa degradação ou inibição do ácido nucleico retroviral em uma célula não alvo. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de RNA funcional, por exemplo, o ácido nucleico codifica uma sequência de miRNA presente em um mRNA que codifica um agente de proteína exógena, de modo que o mRNA é degradado ou inibido em uma célula não alvo. Em algumas modalidades, o NTCSRE aumenta o nível ou atividade de um regulador descendente ou inibidor do agente exógeno. Os termos “TCSRE negativo” e “NTCSRE” são usados de forma intercambiável neste documento.
[0480] Conforme usado neste documento, um "fusogênio realvejado" se refere a um fusogênio que compreende uma porção química de direcionamento tendo uma sequência que não faz parte da forma de ocorrência natural do fusogênio. Nas modalidades, o fusogênio compreende uma porção química de direcionamento diferente em relação à porção química de direcionamento na forma de ocorrência natural do fusogênio. Nas modalidades, a forma de ocorrência natural do fusogênio carece de um domínio de direcionamento, e o fusogênio realvejado compreende uma porção química de direcionamento que está ausente da forma de ocorrência natural do fusogênio. Nas modalidades, o fusogênio é modificado para compreender uma porção química de direcionamento. Nas modalidades, o fusogênio compreende uma ou mais alterações de sequência fora da porção química de direcionamento em relação à forma de ocorrência natural do fusogênio,
por exemplo, em um domínio transmembranar, domínio fusogenicamente ativo ou domínio citoplasmático.
[0481] Tal como utilizado neste documento, um "ácido nucleico retroviral" se refere a um ácido nucleico contendo pelo menos os requisitos de sequência mínimos para empacotamento em um retrovírus ou vetor retroviral, sozinho ou em combinação com uma célula auxiliar, vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende ainda ou codifica um agente exógeno, um elemento regulatório específico da célula-alvo positivo, um elemento regulatório específico de célula não alvo ou um TCSRE negativo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais dentre (por exemplo, todos) uma LTR 5' (por exemplo, para promover a integração), U3 (por exemplo, para ativar a transcrição de RNA genômico viral), R (por exemplo, uma região de ligação de Tat), U5, uma LTR 3' (por exemplo, para promover a integração), um local de empacotamento (por exemplo, psi ()), RRE (por exemplo, para vincular a Rev e promover a exportação nuclear). O ácido nucleico retroviral pode compreender RNA (por exemplo, quando parte de um vírion) ou DNA (por exemplo, quando sendo introduzido em uma célula de origem ou após a transcrição reversa em uma célula receptora). Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral é empacotado usando uma célula auxiliar, vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar que compreende um ou mais dentre (por exemplo, todos) gag, pol e env.
[0482] Tal como utilizado neste documento, uma "célula-alvo" se refere a uma célula de um tipo ao qual se deseja que um fusossoma (por exemplo, vetor lentiviral) entregue um agente exógeno. Nas modalidades, uma célula-alvo é uma célula de um tipo ou classe de tecido específico, por exemplo, uma célula efetora imunológica, por exemplo, uma célula T. Em algumas modalidades, uma célula-alvo é uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerosa. Em algumas modalidades, o fusogênio, por exemplo, fusogênio realvejado (sozinho ou em combinação com o TCSRE positivo, NTCSRE, TCSRE negativo ou qualquer combinação dos mesmos) leva à entrega preferencial do agente exógeno a uma célula-alvo em comparação com uma célula não alvo.
[0483] Tal como utilizado neste documento, uma "célula não alvo" se refere a uma célula de um tipo para o qual não é desejado que um fusossoma (por exemplo, vetor lentiviral) entregue um agente exógeno. Em algumas modalidades, uma célula não alvo é uma célula de um tipo ou classe de tecido específico. Em algumas modalidades, uma célula não alvo é uma célula não doente, por exemplo, uma célula não cancerosa. Em algumas modalidades, o fusogênio, por exemplo, fusogênio realvejado (sozinho ou em combinação com o TCSRE positivo, NTCSRE, TCSRE negativo ou qualquer combinação dos mesmos) leva a uma entrega mais baixa do agente exógeno a uma célula não alvo em comparação com um alvo célula.
[0484] Tal como utilizado neste documento, os termos "tratar", “que trata" ou "tratamento" se referem a melhorar uma doença ou distúrbio, por exemplo, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou distúrbio, por exemplo, uma causa raiz do distúrbio ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos. FUSOSSOMAS, POR EXEMPLO, FUSOSSOMAS DERIVADOS DE
CÉLULAS
[0485] Os fusossomas podem assumir várias formas. Por exemplo, em algumas modalidades, um fusossoma descrito neste documento é derivado de uma célula de origem. Um fusossoma pode compreender, por exemplo, uma vesícula extracelular, uma microvesícula, uma nanovesícula, um exossomo, um corpo apoptótico (de células apoptóticas), uma micropartícula (que pode ser derivada de, por exemplo, plaquetas), um ectossomo (derivável de, por exemplo,
neutrófilos e monócitos no soro), um prostatossomo (obtido a partir de células de câncer de próstata), um cardiossoma (derivado de células cardíacas) ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um fusossoma é liberado naturalmente de uma célula de origem e, em algumas modalidades, a célula de origem é tratada para aumentar a formação de fusossomas. Em algumas modalidades, o fusossoma está entre cerca de 10 a 10.000 nm de diâmetro, por exemplo, cerca de 30 a 100 nm de diâmetro. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende um ou mais lipídios sintéticos.
[0486] Em algumas modalidades, o fusossoma é ou compreende um vírus, por exemplo, um retrovírus, por exemplo, um lentivírus. Em algumas modalidades, um fusossoma que compreende uma bicamada lipídica compreende um vetor retroviral que compreende um envelope. Por exemplo, em algumas modalidades, a bicamada do fusossoma de lipídios anfipáticos é ou compreende o envelope viral. O envelope viral pode compreender um fusogênio, por exemplo, um fusogênio que é endógeno ao vírus ou um fusogênio pseudotipado. Em algumas modalidades, o lúmen ou a cavidade do fusossoma compreende um ácido nucleico viral, por exemplo, um ácido nucleico retroviral, por exemplo, um ácido nucleico lentiviral. O ácido nucleico viral pode ser um genoma viral. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende ainda uma ou mais proteínas não estruturais virais, por exemplo, em sua cavidade ou lúmen.
[0487] Fusossomas podem ter várias propriedades que facilitam a entrega de uma carga útil, como, por exemplo, um transgene ou agente exógeno desejado, para uma célula-alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, o fusossoma e a célula de origem juntos compreendem ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) suficiente para produzir uma partícula que pode se fundir com uma célula-alvo. Nas modalidades, esse ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) codifica proteínas com uma ou mais dentre (por exemplo, todas) as seguintes atividades: atividade de poliproteína gag, atividade de polimerase, atividade de integrase, atividade de protease e atividade de fusogênio.
[0488] Os fusossomas também podem compreender várias estruturas que facilitam a entrega de uma carga útil a uma célula-alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, o fusossoma (por exemplo, vírus, por exemplo, retrovírus, por exemplo, lentivírus) compreende um ou mais dentre (por exemplo, todas) as seguintes proteínas: poliproteína gag, polimerase (por exemplo, pol), integrase (por exemplo, uma variante funcional ou não funcional), protease e um fusogênio. Em algumas modalidades, o fusossoma compreende ainda rev. Em algumas modalidades, uma ou mais das proteínas supracitadas são codificadas no genoma retroviral e, em algumas modalidades, uma ou mais das proteínas supracitadas são fornecidas em trans, por exemplo, por uma célula auxiliar, vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) compreende uma ou mais dentre (por exemplo, todas) as seguintes sequências de ácido nucleico: LTR 5' (por exemplo, que compreende U5 e sem um domínio U3 funcional), elemento de empacotamento Psi (Psi), promotor do trato polipurina central (cPPT) operativamente ligado ao gene de carga útil, gene de carga útil (opcionalmente compreendendo um íntron antes da estrutura de leitura aberta), sequência de cauda Poly A, WPRE e LTR 3' (por exemplo, que compreende U5 e sem um U3 funcional). Em algumas modalidades, o ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) compreende ainda um ou mais elementos isolantes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) compreende ainda um ou mais locais de reconhecimento de miRNA. Em algumas modalidades, um ou mais dos locais de reconhecimento de miRNA estão situados a jusante da sequência da cauda poli A, por exemplo, entre a sequência da cauda poli A e o WPRE.
[0489] Em algumas modalidades, um fusossoma fornecido neste documento é administrado a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano. Em tais modalidades, o indivíduo pode estar em risco de, pode ter um sintoma de, ou pode ser diagnosticado ou identificado como tendo, uma doença ou condição específica (por exemplo, uma doença ou condição descrita neste documento). Em uma modalidade, o indivíduo tem câncer. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença infecciosa. Em algumas modalidades, o fusossoma contém sequências de ácido nucleico que codificam um agente exógeno para o tratamento da doença ou condição.
COMPONENTES LENTIVIRAIS E CÉLULAS AUXILIARES
[0490] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais dentre (por exemplo, todos): um promotor 5’ (por exemplo, para controlar a expressão de todo o RNA empacotado), uma LTR 5' (por exemplo, que inclui R (cauda de poliadenilação sinal) e/ou U5 que inclui um sinal de ativação do iniciador), um local de ligação do iniciador, um sinal de empacotamento psi, um elemento RRE para exportação nuclear, um promotor diretamente a montante do transgene para controlar a expressão do transgene, um transgene (ou outro agente exógeno elemento), um trato de polipurina e uma LTR 3' (por exemplo, que inclui um U3 mutado, um R e um U5). Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende ainda um ou mais dentre um cPPT, um WPRE e/ou um elemento isolante.
[0491] Um retrovírus normalmente se replica por transcrição reversa de seu RNA genômico em uma cópia linear de DNA de fita dupla e, subsequentemente, integra covalentemente seu DNA genômico em um genoma hospedeiro. Retrovírus ilustrativos adequados para uso em modalidades particulares incluem, porém sem limitação: vírus da leucemia murina Moloney (M-MuLV), vírus do sarcoma murino Moloney (MoMSV), vírus do sarcoma murino Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário murino (MuMTV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da leucemia felina (FLV), spumavírus, vírus da leucemia murina Friend, vírus da célula-tronco murina (MSCV) e vírus do sarcoma de Rous (RSV)) e lentivírus.
[0492] Em algumas modalidades, o retrovírus é um Gammaretrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Epsilonretrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Alpharetrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Betaretrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Deltaretrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Lentivírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um Spumaretrovírus. Em algumas modalidades, o retrovírus é um retrovírus endógeno.
[0493] Lentivírus ilustrativos incluem, porém sem limitação: HIV (vírus da imunodeficiência humana; incluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2); vírus visna-maedi (VMV); o vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV); vírus da anemia infecciosa equina (EIAV); vírus da imunodeficiência felina (FIV); vírus da imunodeficiência bovina (BIV); e vírus da imunodeficiência símia (SIV). Em algumas modalidades, cadeias principais de vetores baseados em HIV (isto é, elementos de sequência de ação cis do HIV) são usadas.
[0494] Em algumas modalidades, um vetor neste documento é uma molécula de ácido nucleico capaz de transferir ou transportar outra molécula de ácido nucleico. O ácido nucleico transferido está geralmente ligado, por exemplo, inserido na molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor pode incluir sequências que direcionam a replicação autônoma em uma célula ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira. Os vetores úteis incluem, por exemplo, plasmídeos (por exemplo, plasmídeos de DNA ou plasmídeos de RNA), transposons, cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos e vetores virais. Os vetores virais úteis incluem, por exemplo, retrovírus e lentivírus com defeito de replicação.
[0495] Um vetor viral pode compreender, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo de transferência) que inclui elementos de ácido nucleico derivados de vírus que normalmente facilitam a transferência da molécula de ácido nucleico ou integração no genoma de uma célula ou a uma partícula viral que medeia a transferência de ácido nucleico. As partículas virais incluirão tipicamente vários componentes virais e às vezes também componentes da célula hospedeira além do ácido nucleico (ou ácidos nucleicos). Um vetor viral pode compreender, por exemplo, um vírus ou partícula viral capaz de transferir um ácido nucleico para uma célula, ou para o ácido nucleico transferido (por exemplo, como DNA nu). Os vetores virais e plasmídeos de transferência podem compreender elementos genéticos estruturais e/ou funcionais que são principalmente derivados de um vírus. Um vetor retroviral pode compreender um vetor viral ou plasmídeo contendo elementos genéticos estruturais e funcionais, ou porções dos mesmos, que são principalmente derivados de um retrovírus. Um vetor lentiviral pode compreender um vetor viral ou plasmídeo contendo elementos genéticos estruturais e funcionais, ou porções dos mesmos, incluindo LTRs que são derivadas principalmente de um lentivírus.
[0496] Nas modalidades, um vetor lentiviral (por exemplo, vetor de expressão lentiviral) pode compreender um plasmídeo de transferência lentiviral (por exemplo, como DNA nu) ou uma partícula lentiviral infecciosa. No que diz respeito a elementos como locais de clonagem, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., deve ser entendido que as sequências desses elementos podem estar presentes na forma de RNA em partículas lentivirais e podem estar presentes na forma de DNA no DNA plasmídeos.
[0497] Em alguns vetores descritos neste documento, pelo menos parte de uma ou mais regiões de codificação de proteína que contribuem ou são essenciais para a replicação podem estar ausentes em comparação com o vírus de tipo selvagem correspondente. Isso torna a replicação do vetor viral deficiente. Em algumas modalidades, o vetor é capaz de transduzir uma célula hospedeira alvo sem divisão e/ou integrar seu genoma em um genoma hospedeiro.
[0498] A estrutura de um genoma de retrovírus de tipo selvagem frequentemente compreende uma repetição terminal longa (LTR) 5’ e uma LTR 3', entre ou dentro das quais estão localizados um sinal de empacotamento para permitir que o genoma seja empacotado, um local de ligação de iniciador, locais de integração para permitir a integração no genoma de uma célula hospedeira e os genes gag, pol e env que codificam os componentes de empacotamento que promovem a montagem de partículas virais. Retrovírus mais complexos têm características adicionais, como sequências rev e RRE no HIV, que permitem a exportação eficiente de transcritos de RNA do pró-vírus integrado do núcleo para o citoplasma de uma célula-alvo infectada. No provírus, os genes virais são flanqueados em ambas as extremidades por regiões chamadas de repetições terminais longas (LTRs). As LTRs estão envolvidas na integração e transcrição proviral. LTRs também servem como sequências intensificadoras-promotoras e podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos RNAs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência psi localizada na extremidade 5' do genoma viral.
[0499] As próprias LTRs são tipicamente sequências similares (por exemplo, idênticas) que podem ser divididas em três elementos, que são chamados de U3, R e U5. U3 é derivado da sequência única da extremidade 3' do RNA. R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do RNA e U5 é derivado da sequência única para a extremidade 5' do RNA. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre os diferentes retrovírus.
[0500] Para o genoma viral, o local de iniciação da transcrição está tipicamente na fronteira entre U3 e R em uma LTR e o local de adição (terminação) de poli (A) está na fronteira entre R e U5 na outra LTR. U3 contém a maioria dos elementos de controle da transcrição do provírus, que incluem o promotor e múltiplas sequências potenciadoras responsivas às proteínas ativadoras da transcrição celular e, em alguns casos, viral. Alguns retrovírus compreendem um ou mais dos seguintes genes que codificam para proteínas que estão envolvidas na regulação da expressão gênica: tot, rev, tax e rex.
[0501] No que diz respeito aos próprios genes estruturais gag, pol e env, gag codifica a proteína estrutural interna do vírus. A proteína Gag é processada proteoliticamente nas proteínas maduras MA (matriz), CA (cápside) e NC (nucleocapsídeo). O gene pol codifica a transcriptase reversa (RT), que contém DNA polimerase, associada a RNase H e integrase (IN), que medeia a replicação do genoma. O gene env codifica a glicoproteína de superfície (SU) e a proteína transmembrana (TM) do vírion, que formam um complexo que interage especificamente com proteínas receptoras celulares. Essa interação promove infecção, por exemplo, pela fusão da membrana viral com a membrana celular.
[0502] Em um genoma de vetor retroviral deficiente para replicação, gag, pol e env podem estar ausentes ou serem não funcionais. As regiões R em ambas as extremidades do RNA são sequências tipicamente repetidas. U5 e U3 representam sequências únicas nas extremidades 5' e 3' do genoma do RNA, respectivamente.
[0503] Os retrovírus também podem conter genes adicionais que codificam para proteínas diferentes de gag, pol e env. Exemplos de genes adicionais incluem (no HIV), um ou mais dentre vif, vpr, vpx, vpu,
tat, rev e nef. EIAV tem (entre outros) o gene adicional S2. As proteínas codificadas por genes adicionais têm várias funções, algumas das quais podem ser uma duplicação de uma função fornecida por uma proteína celular. Em EIAV, por exemplo, tat atua como um ativador transcricional da LTR viral (Derse e Newbold 1993 Virology 194: 530 a 536; Maury et al. 1994 Virology 200: 632 a 642). O mesmo se liga a uma estrutura secundária de RNA de haste-loop estável, conhecida como TAR. Rev regula e coordena a expressão de genes virais através de elementos de resposta a rev (RRE) (Martarano et al. 1994 J. Virol. 68: 3.102 a 3.111). Os mecanismos de ação dessas duas proteínas são considerados amplamente similares aos mecanismos análogos dos vírus primatas. Além disso, foi identificada uma proteína EIAV, Ttm, que é codificada pelo primeiro éxon de tat unido à sequência de codificação env no início da proteína transmembranar.
[0504] Além da protease, da transcriptase reversa e da integrase, os lentivírus não primatas contêm um quarto produto do gene pol que codifica uma dUTPase. Isso pode desempenhar um papel na capacidade desses lentivírus de infectar certos tipos de células que não se dividem ou se dividem lentamente.
[0505] Nas modalidades, um vetor lentiviral recombinante (RLV) é um vetor com informação genética retroviral suficiente para permitir o empacotamento de um genoma de RNA, na presença de componentes de empacotamento, em uma partícula viral capaz de infectar uma célula- alvo. A infecção da célula-alvo pode compreender a transcrição reversa e integração no genoma da célula-alvo. O RLV tipicamente carrega sequências de codificação não virais que devem ser entregues pelo vetor à célula-alvo. Nas modalidades, um RLV é incapaz de replicação independente para produzir partículas retrovirais infecciosas dentro da célula-alvo. Normalmente, o RLV carece de um gene gag-pol e/ou env e/ou outros genes envolvidos na replicação. O vetor pode ser configurado como um vetor de íntron dividido, por exemplo, conforme descrito no pedido de patente PCT WO 99/15683, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
[0506] Em algumas modalidades, o vetor lentiviral compreende um genoma viral mínimo, por exemplo, o vetor viral foi manipulado de modo a remover os elementos não essenciais e reter os elementos essenciais a fim de fornecer a funcionalidade necessária para infectar, transduzir e entregar uma sequência de nucleotídeos de interesse para uma célula hospedeira alvo, por exemplo, como descrito no documento WO 98/17815, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
[0507] Um genoma lentiviral mínimo pode compreender, por exemplo, (5') R-U5- uma ou mais primeiras sequências de nucleotídeos- U3-R (3'). No entanto, o vetor de plasmídeo usado para produzir o genoma lentiviral dentro de uma célula de origem também pode incluir sequências de controle regulador da transcrição operacionalmente ligadas ao genoma lentiviral para direcionar a transcrição do genoma em uma célula de origem. Essas sequências reguladoras podem compreender as sequências naturais associadas à sequência retroviral transcrita, por exemplo, a região 5' U3, ou podem compreender um promotor heterólogo, tal como outro promotor viral, por exemplo, o promotor CMV. Alguns genomas lentivirais compreendem sequências adicionais para promover a produção eficiente de vírus. Por exemplo, no caso do HIV, as sequências rev e RRE podem ser incluídas. Alternativamente ou em combinação, a otimização de códons pode ser usada, por exemplo, o gene que codifica o agente exógeno pode ser otimizado por códons, por exemplo, conforme descrito no documento WO 01/79518, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade. Também podem ser utilizadas sequências alternativas que desempenham uma função similar ou igual à do sistema rev/RRE. Por exemplo, um análogo funcional do sistema rev/RRE é encontrado no vírus do macaco Mason Pfizer. Isso é conhecido como CTE e compreende uma sequência do tipo RRE no genoma que se acredita interagir com um fator na célula infectada. O fator celular pode ser considerado um análogo do rev. Assim, o CTE pode ser usado como uma alternativa ao sistema rev/RRE. Além disso, a proteína Rex do HTLV-I pode substituir funcionalmente a proteína Rev do HIV-I. Rev e Rex têm efeitos similares ao IRE-BP.
[0508] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral (por exemplo, um ácido nucleico lentiviral, por exemplo, um ácido nucleico lentiviral de primata ou não primata) (1) compreende um gene gag deletado em que a deleção em gag remove um ou mais nucleotídeos a jusante de cerca de nucleotídeo 350 ou 354 da sequência de codificação gag; (2) tem um ou mais genes acessórios ausentes do ácido nucleico retroviral; (3) não tem o gene tat, mas inclui a sequência líder entre a extremidade da LTR 5' e o ATG de gag; e (4) combinações de (1), (2) e (3). Em uma modalidade, o vetor lentiviral compreende todas as características (1) e (2) e (3). Essa estratégia é descrita em mais detalhes no documento WO 99/32646, que é incorporado neste documento a título de referência na sua totalidade.
[0509] Em algumas modalidades, um sistema mínimo de lentivírus de primata não requer nenhum dos genes adicionais HIV/SIV vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev e nef para produção de vetor ou para transdução de células em divisão e não em divisão. Em algumas modalidades, um sistema de vetor mínimo EIAV não requer S2 para produção de vetor ou para transdução de células em divisão e não divisão.
[0510] A deleção de genes adicionais pode permitir que os vetores sejam produzidos sem os genes associados à doença em infecções lentivirais (por exemplo, HIV). Em particular, a tat está associada a doenças. Em segundo lugar, a deleção de genes adicionais permite que o vetor empacote mais DNA heterólogo. Em terceiro lugar, genes cuja função é desconhecida, como S2, podem ser omitidos, reduzindo assim o risco de causar efeitos indesejáveis. Exemplos de vetores lentivirais mínimos são divulgados no documento WO 99/32646 e no documento WO 98/17815.
[0511] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral é desprovido de pelo menos tat e S2 (se for um sistema de vetor EIAV) e possivelmente também vif, vpr, vpx, vpu e nef. Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral também é desprovido de rev, RRE ou ambos.
[0512] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende vpx. O polipeptídeo Vpx se liga ao fator de restrição SAMHD1 e induz a degradação do mesmo, que degrada dNTPs livres no citoplasma. Assim, a concentração de dNTPs livres no citoplasma aumenta à medida que Vpx degrada SAMHD1 e a atividade de transcrição reversa é aumentada, facilitando assim a transcrição reversa do genoma retroviral e a integração no genoma da célula-alvo.
[0513] Diferentes células diferem no uso de códons específicos. Essa tendência de códon corresponde a uma tendência na abundância relativa de tRNAs particulares no tipo de célula. Ao alterar os códons na sequência de modo que sejam adaptados para corresponder à abundância relativa de tRNAs correspondentes, é possível aumentar a expressão. Da mesma forma, é possível diminuir a expressão escolhendo deliberadamente códons para os quais os tRNAs correspondentes são conhecidos por serem raros no tipo de célula particular. Assim, um grau adicional de controle translacional está disponível. Uma descrição adicional de otimização de códon é encontrada, por exemplo, no documento WO 99/41397, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
[0514] Muitos vírus, incluindo HIV e outros lentivírus, usam um grande número de códons raros e, alterando-os para corresponder aos códons comumente usados em mamíferos, pode ser alcançada uma expressão aumentada dos componentes de empacotamento em células produtoras de mamíferos.
[0515] A otimização de códons tem várias outras vantagens. Em virtude de alterações em suas sequências, as sequências de nucleotídeos que codificam os componentes de empacotamento podem ter sequências de instabilidade de RNA (INS) reduzidas ou eliminadas das mesmas. Ao mesmo tempo, a sequência de codificação da sequência de aminoácidos para os componentes de embalagem é retida de modo que os componentes virais codificados pelas sequências permaneçam os mesmos, ou pelo menos suficientemente similares para que a função dos componentes de embalagem não seja comprometida. Em algumas modalidades, a otimização de códons também supera o requisito Rev/RRE para exportação, tornando sequências otimizadas independentes de Rev. Em algumas modalidades, a otimização de códons também reduz a recombinação homóloga entre diferentes construtos dentro do sistema de vetor (por exemplo, entre as regiões de sobreposição nas estruturas de leitura aberta gag-pol e env). Em algumas modalidades, a otimização de códons leva a um aumento no título viral e/ou segurança aprimorada.
[0516] Em algumas modalidades, apenas os códons relacionados a INS são otimizados por códons. Em outras modalidades, as sequências são otimizadas por códons em sua totalidade, com exceção da sequência que abrange o local de deslocamento de quadro de gag-pol.
[0517] O gene gag-pol compreende dois quadros de leitura sobrepostos que codificam as proteínas gag-pol. A expressão de ambas as proteínas depende de uma mudança de quadro durante a tradução. Essa mudança de quadro ocorre como resultado do "deslizamento" do ribossomo durante a tradução. Acredita-se que esse deslizamento seja causado, pelo menos em parte, por estruturas secundárias de RNA que paralisam o ribossomo. Essas estruturas secundárias existem a jusante do local de deslocamento de quadro no gene gag-pol. Para o HIV, a região de sobreposição se estende do nucleotídeo 1222 a jusante do início do gag (em que o nucleotídeo 1 é o A do ATG do gag) até o final do gag (nt 1503). Consequentemente, um fragmento de 281 bp abrangendo o local de deslocamento de quadro e a região de sobreposição dos dois quadros de leitura é, de preferência, não otimizado por códon. Em algumas modalidades, reter esse fragmento permitirá uma expressão mais eficiente das proteínas gag-pol. Para EIAV, o início da sobreposição é no nt 1262 (em que o nucleotídeo 1 é o A do ATG gag). O fim da sobreposição está no nt 1461. A fim de garantir que o local de deslocamento de quadro e a sobreposição de gag-pol sejam preservados, a sequência de tipo selvagem pode ser retida de nt 1156 a 1465.
[0518] Podem ser feitas derivações da utilização ideal de códons, por exemplo, a fim de acomodar locais de restrição convenientes, e mudanças conservativas de aminoácidos podem ser introduzidas nas proteínas gag-pol.
[0519] Em algumas modalidades, a otimização de códons é baseada em códons com uso pobre de códons em sistemas de mamíferos. A terceira e às vezes a segunda e a terceira bases podem ser alteradas.
[0520] Devido à natureza degenerada do código genético, será apreciado que numerosas sequências gag-pol podem ser obtidas por um trabalhador especializado. Além disso, existem muitas variantes retrovirais descritas que podem ser usadas como um ponto de partida para gerar uma sequência gag-pol otimizada por códons. Os genomas lentivirais podem ser bastante variáveis. Por exemplo, existem muitas quase espécies de HIV-I que ainda são funcionais. Esse também é o caso do EIAV. Essas variantes podem ser usadas para melhorar partes específicas do processo de transdução. Exemplos de variantes do HIV- I podem ser encontrados nos bancos de dados de HIV mantidos pelo Laboratório Nacional de Los Alamos. Detalhes dos clones de EIAV podem ser encontrados no banco de dados NCBI mantido pelo National Institutes of Health.
[0521] A estratégia para sequências gag-pol com códon otimizado pode ser usada em relação a qualquer retrovírus, por exemplo, EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-I e HIV-2. Além disso, esse método pode ser usado para aumentar a expressão de genes de HTLV-I, HTLV- 2, HFV, HSRV e retrovírus endógenos humanos (HERV), MLV e outros retrovírus.
[0522] Conforme descrito acima, os componentes de empacotamento para um vetor retroviral podem incluir produtos de expressão dos genes gag, pol e env. Além disso, o empacotamento pode utilizar uma sequência curta de 4 loops de haste seguida por uma sequência parcial de gag e env como um sinal de empacotamento. Assim, a inclusão de uma sequência gag deletada no genoma do vetor retroviral (além da sequência gag completa no construto de empacotamento) pode ser usada. Nas modalidades, o vetor retroviral compreende um sinal de empacotamento que compreende de 255 a 360 nucleotídeos de gag em vetores que ainda retêm sequências env, ou cerca de 40 nucleotídeos de gag em uma combinação particular de mutação de doador de splice, deleções gag e env. Em algumas modalidades, o vetor retroviral inclui uma sequência gag que compreende uma ou mais deleções, por exemplo, a sequência gag compreende cerca de 360 nucleotídeos deriváveis do terminal N.
[0523] O vetor retroviral, célula auxiliar, vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar pode compreender proteínas retrovirais estruturais e acessórias, por exemplo proteínas gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx ou nef ou outras proteínas retrovirais. Em algumas modalidades, as proteínas retrovirais são derivadas do mesmo retrovírus. Em algumas modalidades, as proteínas retrovirais são derivadas de mais de um retrovírus, por exemplo, 2, 3, 4 ou mais retrovírus.
[0524] As sequências de codificação gag e pol são geralmente organizadas como o precursor Gag-Pol no lentivírus nativo. A sequência gag codifica uma proteína precursora de Gag de 55 kD, também chamada de p55. O p55 é clivado pela protease4 codificada por vírus (um produto do gene pol) durante o processo de maturação em quatro proteínas menores designadas MA (matriz [p17]), CA (cápside [p24]), NC (nucleocapsídeo [p9]) e p6. A proteína precursora de pol é clivada de Gag por uma protease codificada por vírus e posteriormente digerida para separar as atividades de protease (p10), RT (p50), RNase H (p15) e integrase (p31).
[0525] As sequências nativas de Gag-Pol podem ser utilizadas em um vetor auxiliar (por exemplo, plasmídeo auxiliar ou vírus auxiliar) ou podem ser feitas modificações. Essas modificações incluem Gag-Pol quimérico, em que as sequências Gag e Pol são obtidas de diferentes vírus (por exemplo, diferentes espécies, subespécies, cepas, clados, etc.) e/ou em que as sequências foram modificadas para melhorar a transcrição e/ou translação, e/ou reduzir a recombinação.
[0526] Em vários exemplos, o ácido nucleico retroviral inclui um polinucleotídeo que codifica uma porção de nucleotídeo 150 a 250 (por exemplo, 168) de uma proteína gag que (i) inclui uma sequência inibidora de INS1 mutada que reduz a restrição de exportação nuclear de RNA em relação ao tipo selvagem INS1, (ii) contém a inserção de dois nucleotídeos que resulta em mudança de quadro e término prematuro e/ou (iii) não inclui as sequências inibidoras de INS2, INS3 e INS4 de gag.
[0527] Em algumas modalidades, um vetor descrito neste documento é um vetor híbrido que compreende sequências retrovirais (por exemplo, lentivirais) e sequências virais não lentivirais. Em algumas modalidades, um vetor híbrido compreende retrovirais, por exemplo, lentivirais, sequências para transcrição reversa, replicação, integração e/ou empacotamento.
[0528] De acordo com certas modalidades específicas, a maioria ou todas as sequências da cadeia principal do vetor viral são derivadas de um lentivírus, por exemplo, HIV-1. No entanto, deve ser entendido que muitas fontes diferentes de sequências retrovirais e/ou lentivirais podem ser usadas, ou combinadas e numerosas substituições e alterações em algumas das sequências lentivirais podem ser acomodadas sem prejudicar a capacidade de um vetor de transferência de realizar as funções descritas neste documento. Uma variedade de vetores lentivirais são descritos em Naldini et al., (1996a, 1996b e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat. nº US 6.013.516; e
5.994.136, muitos dos quais podem ser adaptados para produzir um ácido nucleico retroviral.
[0529] Em cada extremidade do provírus, repetições terminais longas (LTRs) são normalmente encontradas. Uma LTR tipicamente compreende um domínio localizado nas extremidades do ácido nucleico retroviral que, em seu contexto de sequência natural, são repetições diretas e contêm regiões U3, R e U5. As LTRs geralmente promovem a expressão de genes retrovirais (por exemplo, promoção, iniciação e poliadenilação de transcritos de genes) e replicação viral. A LTR pode compreender vários sinais reguladores, incluindo elementos de controle da transcrição, sinais de poliadenilação e sequências para replicação e integração do genoma viral. A LTR viral é normalmente dividida em três regiões chamadas U3, R e U5. A região U3 contém tipicamente os elementos intensificadores e promotores. A região U5 é tipicamente a sequência entre o local de ligação do iniciador e a região R e pode conter a sequência de poliadenilação. A região R (repetição) pode ser flanqueada pelas regiões U3 e U5. A LTR é tipicamente composta de regiões U3, R e U5 e pode aparecer nas extremidades 5' e 3' do genoma viral. Em algumas modalidades, adjacentes à LTR 5' estão sequências para a transcrição reversa do genoma (o local de ligação do iniciador tRNA) e para empacotamento eficiente de RNA viral em partículas (o local Psi).
[0530] Um sinal de empacotamento pode compreender uma sequência localizada dentro do genoma retroviral que medeia a inserção do RNA viral no capsídeo ou partícula viral, consultar, por exemplo, Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2.101 a 2.109. Vários vetores retrovirais usam um sinal de empacotamento mínimo (uma sequência psi [Ψ]) para encapsidação do genoma viral.
[0531] Em várias modalidades, os ácidos nucleicos retrovirais compreendem LTR 5' e/ou LTR 3's modificadas. Uma ou ambas os LTR podem compreender uma ou mais modificações incluindo, porém sem limitação, uma ou mais deleções, inserções ou substituições. As modificações da LTR 3' são frequentemente feitas para melhorar a segurança dos sistemas lentivirais ou retrovirais, tornando os vírus defeituosos na replicação, por exemplo, vírus que não é capaz de replicação completa e eficaz, de modo que vírions infecciosos não sejam produzidos (por exemplo, progênie lentiviral de replicação defeituosa).
[0532] Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de autoinativação (SIN), por exemplo, vetor de replicação defeituosa, por exemplo, vetor retroviral ou lentiviral, em que a região promotora- intensificadora de LTR direita (3'), conhecida como região U3, foi modificada (por exemplo, por deleção ou substituição) para prevenir a transcrição viral além da primeira rodada de replicação viral. Isso ocorre porque a região direita (3') LTR U3 pode ser usada como um modelo para a região esquerda (5') LTR U3 durante a replicação viral e, portanto, a ausência do intensificador-promotor U3 inibe a replicação viral. Nas modalidades, a LTR 3' é modificada de modo que a região U5 seja removida, alterada ou substituída, por exemplo, por uma sequência exógena de poli (A). A LTR 3', a LTR 5', ou ambas LTRs 3′ e 5', podem ser LTRs modificadas.
[0533] Em algumas modalidades, a região U3 da LTR 5' é substituída por um promotor heterólogo para conduzir a transcrição do genoma viral durante a produção de partículas virais. Exemplos de promotores heterólogos que podem ser usados incluem, por exemplo, vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), citomegalovírus (CMV) (por exemplo, início imediato), vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma de Rous (RSV) e promotores do vírus herpes simplex (HSV) (timidina quinase). Em algumas modalidades, os promotores são capazes de conduzir altos níveis de transcrição de uma maneira independente de Tat. Em certas modalidades, o promotor heterólogo tem vantagens adicionais no controle da maneira pela qual o genoma viral é transcrito. Por exemplo, o promotor heterólogo pode ser indutível, de modo que a transcrição de todo ou parte do genoma viral ocorrerá apenas quando os fatores de indução estiverem presentes. Os fatores de indução incluem, porém sem limitação, um ou mais compostos químicos ou as condições fisiológicas, como temperatura ou pH, em que as células hospedeiras são cultivadas.
[0534] Em algumas modalidades, os vetores virais compreendem um elemento TAR (resposta de transativação), por exemplo, localizado na região R de LTRs lentivirais (por exemplo, HIV). Esse elemento interage com o elemento genético transativador lentiviral (tat) para aumentar a replicação viral. No entanto, esse elemento não é necessário, por exemplo, em modalidades em que a região U3 da LTR
5’ é substituída por um promotor heterólogo.
[0535] A região R, por exemplo, a região dentro de LTRs retrovirais começando no início do grupo de cobertura (isto é, o início da transcrição) e terminando imediatamente antes do início do trato poli A, pode ser flanqueada pelas regiões U3 e U5. A região R desempenha um papel durante a transcrição reversa na transferência de DNA nascente de uma extremidade do genoma para a outra.
[0536] O ácido nucleico retroviral também pode compreender um elemento FLAP, por exemplo, um ácido nucleico cuja sequência inclui o trato central de polipurina e sequências de terminação central (cPPT e CTS) de um retrovírus, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2. Elementos FLAP adequados são descritos na Pat. nº US 6.682.907 e no documento Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173, que são incorporados neste documento a título de referência na sua totalidade. Durante a transcrição reversa do HIV-1, a iniciação central do DNA de fita positiva no trato central de polipurina (cPPT) e a terminação central na sequência de terminação central (CTS) podem levar à formação de uma estrutura de DNA de três fitas: o DNA flap central de HIV-1. Em algumas modalidades, a estrutura do vetor retroviral ou lentiviral compreende um ou mais elementos FLAP a montante ou a jusante do gene que codifica o agente exógeno. Por exemplo, em algumas modalidades, um plasmídeo de transferência inclui um elemento FLAP, por exemplo, um elemento FLAP derivado ou isolado de HIV-1.
[0537] Nas modalidades, um ácido nucleico retroviral ou lentiviral compreende um ou mais elementos de exportação, por exemplo, um elemento regulatório pós-transcricional de ação cis que regula o transporte de um transcrito de RNA do núcleo para o citoplasma de uma célula. Exemplos de elementos de exportação de RNA incluem, porém sem limitação, o elemento de resposta rev do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (RRE) (consultar, por exemplo, Cullen et al., 1991. J.
Virol. 65: 1.053; e Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), e o elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite B (HPRE), que são incorporados neste documento a título de referência em sua totalidade. Geralmente, o elemento de exportação de RNA é colocado dentro da UTR 3' de um gene e pode ser inserido como uma ou várias cópias.
[0538] Em algumas modalidades, a expressão de sequências heterólogas em vetores virais é aumentada pela incorporação de um ou mais dentre, por exemplo, todos os elementos reguladores pós- transcricionais, locais de poliadenilação e sinais de terminação da transcrição nos vetores. Uma variedade de elementos reguladores pós- transcricionais podem aumentar a expressão de um ácido nucleico heterólogo na proteína, por exemplo, elemento regulatório pós- transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73: 2886); o elemento regulatório pós-transcricional presente no vírus da hepatite B (HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3864); e similares (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9: 1.766), cada um dos quais é incorporado neste documento a título de referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento compreende um elemento regulatório pós- transcricional, como um WPRE ou HPRE.
[0539] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento carece ou não compreende um elemento regulatório pós-transcricional, como um WPRE ou HPRE.
[0540] Elementos que direcionam a terminação e poliadenilação dos transcritos de ácido nucleico heterólogos podem ser incluídos, por exemplo, para aumentar a expressão do agente exógeno. Os sinais de terminação da transcrição podem ser encontrados a jusante do sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, os vetores compreendem uma sequência de poliadenilação 3' de um polinucleotídeo que codifica o agente exógeno. Um local poliA pode compreender uma sequência de
DNA que dirige tanto a terminação como a poliadenilação do transcrito de RNA nascente pela RNA polimerase II. As sequências de poliadenilação podem promover a estabilidade do mRNA pela adição de uma cauda poliA à extremidade 3' da sequência de codificação e, assim, contribuir para o aumento da eficiência da tradução. Exemplos ilustrativos de sinais de poliA que podem ser usados em um ácido nucleico retroviral incluem AATAAA, ATTAAA, AGTAAA, uma sequência de poliA do hormônio de crescimento bovino (BGHpA), uma sequência de poliA de β-globina de coelho (rβgpA) ou outra sequência de poliA heteróloga ou endógena adequada.
[0541] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou lentiviral compreende ainda um ou mais elementos isolantes, por exemplo, um elemento isolante descrito neste documento.
[0542] Em várias modalidades, os vetores compreendem um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um agente exógeno. Os vetores podem ter uma ou mais LTRs, em que qualquer LTR compreende uma ou mais modificações, tais como uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos. Os vetores podem compreender ainda um ou mais elementos acessórios para aumentar a eficiência de transdução (por exemplo, um cPPT/FLAP), empacotamento viral (por exemplo, um sinal de empacotamento Psi (Ψ), RRE) e/ou outros elementos que aumentam a expressão do gene exógeno (por exemplo, sequências poli (A)), e pode opcionalmente compreender um WPRE ou HPRE.
[0543] Em algumas modalidades, um ácido nucleico lentiviral compreende um ou mais dentre, por exemplo, todos dentre, por exemplo, de 5' a 3', um promotor (por exemplo, CMV), uma sequência R (por exemplo, que compreende TAR), uma sequência U5 (por exemplo, para integração), uma sequência de PBS (por exemplo, para transcrição reversa), uma sequência DIS (por exemplo, para dimerização do genoma), um sinal de empacotamento psi, uma sequência gag parcial, uma sequência RRE (por exemplo, para exportação nuclear), um sequência de cPPT (por exemplo, para importação nuclear), um promotor para conduzir a expressão do agente exógeno, um gene que codifica o agente exógeno, uma sequência WPRE (por exemplo, para a expressão eficiente do transgene), uma sequência PPT (por exemplo, para a transcrição reversa), uma sequência R (por exemplo, para poliadenilação e terminação) e um sinal U5 (por exemplo, para integração).
VETORES PROJETADOS PARA REMOVER LOCAIS DE SPLICE
[0544] Alguns vetores lentivirais se integram dentro de genes ativos e possuem fortes sinais de splicing e poliadenilação que podem levar à formação de transcritos aberrantes e possivelmente truncados.
[0545] Os mecanismos de ativação do proto-oncogene podem envolver a geração de transcritos quiméricos originados da interação de elementos promotores ou locais de splice contidos no genoma do mutagênico de inserção com a unidade de transcrição celular direcionada pela integração (Gabriel et al. 2009. Nat Med 15: 1.431 a
1.436; Bokhoven, et al. J Virol 83: 283-29). Transcritos de fusão quimérica que compreendem sequências de vetor e mRNAs celulares podem ser gerados por transcrição de leitura começando a partir de sequências de vetor e prosseguindo para os genes celulares flanqueadores, ou vice-versa.
[0546] Em algumas modalidades, um ácido nucleico lentiviral descrito neste documento compreende uma cadeia principal lentiviral em que pelo menos dois dos locais de splice foram eliminados, por exemplo, para melhorar o perfil de segurança do vetor lentiviral. As espécies de tais locais de splice e métodos de identificação são descritos no documento WO2012156839A2, cuja totalidade é incluída a título de referência.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO RETROVIRAL
[0547] A produção de partículas virais em grande escala é frequentemente útil para atingir um título viral desejado. As partículas virais podem ser produzidas por transfecção de um vetor de transferência em uma linha de células de empacotamento que compreende genes estruturais e/ou acessórios virais, por exemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx ou nef ou outros genes retrovirais.
[0548] Nas modalidades, o vetor de empacotamento é um vetor de expressão ou vetor viral que carece de um sinal de empacotamento e compreende um polinucleotídeo que codifica um, dois, três, quatro ou mais genes estruturais e/ou acessórios virais. Normalmente, os vetores de empacotamento são incluídos em uma célula de empacotamento e são introduzidos na célula por meio de transfecção, transdução ou infecção. Um vetor de transferência retroviral, por exemplo, lentiviral, pode ser introduzido em uma linha de células de empacotamento, via transfecção, transdução ou infecção, para gerar uma célula ou linha de células de origem. Os vetores de empacotamento podem ser introduzidos em células ou linhas de células humanas por métodos padrão incluindo, por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, lipofecção ou eletroporação. Em algumas modalidades, os vetores de empacotamento são introduzidos nas células juntamente com um marcador selecionável dominante, como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinase, DHFR, Gln sintetase ou ADA, seguido por seleção na presença do fármaco apropriado e isolamento de clones. Um gene marcador selecionável pode ser ligado fisicamente a genes que codificam pelo vetor de empacotamento, por exemplo, por IRES ou peptídeos virais de autoclivagem.
[0549] As linhas de células de empacotamento incluem linhas de células que não contêm um sinal de empacotamento, mas expressam de forma estável ou transiente proteínas estruturais virais e enzimas de replicação (por exemplo, gag, pol e env) que podem empacotar partículas virais. Qualquer linha de células adequada pode ser empregada, por exemplo, células de mamíferos, por exemplo, células humanas. As linhas de células adequadas que podem ser utilizadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células BOSC 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, Células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 e células 211A. Nas modalidades, as células de empacotamento são células 293, células 293T ou células A549.
[0550] Uma linha de células de origem inclui uma linha de células que é capaz de produzir partículas retrovirais recombinantes, que compreende uma linha de células de empacotamento e um construto de vetor de transferência que compreende um sinal de empacotamento. Os métodos de preparação de soluções estoque virais são ilustrados pelos documentos, por exemplo, Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 628 a 633 e NR Landau et al. (1992) J. Virol. 66: 5.110 a 5.113, que são incorporados neste documento a título de referência. Partículas de vírus infecciosas podem ser coletadas das células de empacotamento, por exemplo, por lise celular ou coleta do sobrenadante da cultura de células. Opcionalmente, as partículas de vírus coletadas podem ser enriquecidas ou purificadas.
PLASMÍDEOS DE EMPACOTAMENTO E LINHAS CELULARES
[0551] Em algumas modalidades, a célula de origem compreende um ou mais plasmídeos que codificam para proteínas estruturais virais e enzimas de replicação (por exemplo, gag, pol e env) que podem empacotar partículas virais. Em algumas modalidades, as sequências que codificam para pelo menos dois dos precursores gag, pol e env estão no mesmo plasmídeo. Em algumas modalidades, as sequências que codificam para os precursores gag, pol e env estão em plasmídeos diferentes. Em algumas modalidades, as sequências que codificam para os precursores gag, pol e env têm o mesmo sinal de expressão, por exemplo, promotor. Em algumas modalidades, as sequências que codificam para os precursores gag, pol e env têm um sinal de expressão diferente, por exemplo, promotores diferentes. Em algumas modalidades, a expressão dos precursores gag, pol e env é indutível. Em algumas modalidades, os plasmídeos codificação para proteínas estruturais virais e enzimas de replicação são transfectados ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em algumas modalidades, os plasmídeos codificação para proteínas estruturais virais e enzimas de replicação são transfectados ao mesmo tempo ou em um momento diferente do vetor de empacotamento.
[0552] Em algumas modalidades, a linha celular fonte compreende um ou mais genes estruturais virais integrados de forma estável. Em algumas modalidades, a expressão dos genes estruturais virais integrados de forma estável é induzível.
[0553] Em algumas modalidades, a expressão dos genes estruturais virais é regulada no nível transcricional. Em algumas modalidades, a expressão dos genes estruturais virais é regulada no nível de tradução. Em algumas modalidades, a expressão dos genes estruturais virais é regulada no nível de pós-tradução.
[0554] Em algumas modalidades, a expressão dos genes estruturais virais é regulada por um sistema dependente de tetraciclina (Tet), em que um repressor transcricional regulado por Tet (Tet-R) se liga a sequências de DNA incluídas em um promotor e reprime a transcrição por impedimento estérico (Yao et al, 1998; Jones et al, 2005). Após a adição de doxiciclina (dox), o Tet-R é liberado, permitindo a transcrição. Vários outros promotores reguladores da transcrição adequados, fatores de transcrição e indutores de moléculas pequenas são adequados para regular a transcrição de genes estruturais virais.
[0555] Em algumas modalidades, os componentes de lentivírus de terceira geração, vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV) Rev, Gag/Pol e um envelope sob o controle de promotores regulados por Tet e acoplados a cassetes de resistência a antibióticos são integrados separadamente no genoma da célula de origem. Em algumas modalidades, a célula de origem tem apenas uma cópia de cada Rev, Gag/Pol e uma proteína de envelope integrada no genoma.
[0556] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o agente exógeno (por exemplo, um ácido nucleico retroviral que codifica o agente exógeno) também é integrado no genoma da célula de origem. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o agente exógeno é mantido epissomalmente. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o agente exógeno é transfectado na célula de origem que integrou de forma estável Rev, Gag/Pol e uma proteína de envelope no genoma. Consultar, por exemplo, Milani et al. EMBO Molecular Medicine, 2017, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
[0557] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento é incapaz de sofrer transcrição reversa. Tal ácido nucleico, nas modalidades, é capaz de expressar transitoriamente um agente exógeno. O retrovírus ou VLP pode compreender uma proteína de transcriptase reversa desativada ou pode não compreender uma proteína de transcriptase reversa. Nas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende um local de ligação do iniciador desativado (PBS) e/ou no local. Nas modalidades, um ou mais genes acessórios virais, incluindo rev, tat, vif, nef, vpr, vpu, vpx e S2 ou seus equivalentes funcionais, estão desativados ou ausentes do ácido nucleico retroviral. Nas modalidades, um ou mais genes acessórios selecionados de S2, rev e tat estão desativados ou ausentes do ácido nucleico retroviral.
ESTRATÉGIAS PARA EMPACOTAR UM ÁCIDO NUCLEICO RETROVIRAL
[0558] Normalmente, os sistemas de vetores retrovirais modernos consistem em genomas virais portadores de sequências de vetores de ação cis para transcrição, transcrição reversa, integração, tradução e empacotamento de RNA viral nas partículas virais e (2) linhas de células produtoras que expressam as sequências de genes retrovirais de ação trans (por exemplo, gag, pol e env) necessárias para a produção de partículas de vírus. Ao separar completamente as sequências do vetor de ação cis e trans, o vírus é incapaz de manter a replicação por mais de um ciclo de infecção. A geração de vírus vivos pode ser evitada por uma série de estratégias, por exemplo, minimizando a sobreposição entre as sequências de ação cis e trans para evitar a recombinação.
[0559] Uma partícula de vetor viral que compreende uma sequência que é desprovida ou sem RNA viral pode ser o resultado da remoção ou eliminação do RNA viral da sequência. Em uma modalidade, isso pode ser alcançado usando um local de ligação de sinal de empacotamento endógeno na gag. Alternativamente, o local de ligação do sinal de empacotamento endógeno está no pol. Nessa modalidade, o RNA que deve ser entregue conterá um sinal de empacotamento cognato. Em outra modalidade, um domínio de ligação heterólogo (que é heterólogo para gag) localizado no RNA a ser entregue, e um local de ligação cognato localizado em gag ou pol, podem ser usados para garantir o empacotamento do RNA a ser entregue. A sequência heteróloga pode ser não viral ou pode ser viral, caso em que pode ser derivada de um vírus diferente. As partículas do vetor podem ser usadas para entregar RNA terapêutico, caso em que a integrase funcional e/ou transcriptase reversa não é necessária. Essas partículas de vetor também podem ser usadas para entregar um gene terapêutico de interesse, caso em que pol é tipicamente incluído.
[0560] Em uma modalidade, gag-pol são alterados e o sinal de empacotamento é substituído por um sinal de empacotamento correspondente. Nessa modalidade, a partícula pode empacotar o RNA com o novo sinal de empacotamento. A vantagem dessa abordagem é que é possível empacotar uma sequência de RNA que é desprovida de sequência viral, por exemplo, RNAi.
[0561] Uma abordagem alternativa é contar com a superexpressão do RNA a ser empacotado. Em uma modalidade, o RNA a ser empacotado é superexpresso na ausência de qualquer RNA contendo um sinal de empacotamento. Isso pode resultar em um nível significativo de RNA terapêutico sendo empacotado e que essa quantidade é suficiente para transduzir uma célula e ter um efeito biológico.
[0562] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína gag viral ou gag retroviral e proteínas pol, em que a proteína gag ou proteína pol compreende um domínio de ligação de RNA heterólogo capaz de reconhecer uma sequência correspondente em uma sequência de RNA para facilitar o empacotamento da sequência de RNA em uma partícula de vetor viral.
[0563] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de RNA heterólogo compreende um domínio de ligação de RNA derivado de uma proteína de revestimento de bacteriófago, uma proteína Rev, uma proteína da partícula de ribonucleoproteína nuclear pequena U1, uma proteína Nova, uma proteína TF111A, uma proteína TIS11, uma proteína de atenuação de ligação de RNA trp (TRAP) ou uma pseudouridina sintase.
[0564] Em algumas modalidades, um método compreende neste documento a detecção ou confirmação da ausência de retrovírus competente para replicação. Os métodos podem incluir a avaliação dos níveis de RNA de um ou mais genes alvo, como genes virais, por exemplo, genes estruturais ou de empacotamento, a partir dos quais os produtos gênicos são expressos em certas células infectadas com um retrovírus competente para replicação, como um gammaretrovírus ou lentivírus, mas não está presente em um vetor viral usado para transduzir células com um ácido nucleico heterólogo e não, ou que não se espera que esteja, presente e/ou expresso em células que não contêm retrovírus competente para replicação. Retrovírus competente para replicação pode ser determinado como estando presente se os níveis de RNA de um ou mais genes alvo forem maiores do que um valor de referência, que pode ser medido direta ou indiretamente, por exemplo, de uma amostra de controle positivo contendo o gene alvo. Para divulgações adicionais, consulte o documento WO2018023094A1.
REPRESSÃO DE UM GENE QUE CODIFICA UM AGENTE EXÓGENO EM UMA CÉLULA DE ORIGEM
[0565] A proteína (sobre)expressa na célula de origem pode ter um efeito indireto ou direto na montagem e/ou infetividade do vírion do vetor. A incorporação do agente exógeno em vírions de vetor também pode impactar o processamento a jusante de partículas de vetor.
[0566] Em algumas modalidades, um promotor específico de tecido é usado para limitar a expressão do agente exógeno nas células de origem. Em algumas modalidades, um sistema de controle de tradução heterólogo é usado em culturas de células eucarióticas para reprimir a tradução do agente exógeno em células de origem. Mais especificamente, o ácido nucleico retroviral pode compreender um local de ligação operacionalmente ligado ao gene que codifica o agente exógeno, em que o local de ligação é capaz de interagir com uma proteína de ligação a RNA de modo que a tradução do agente exógeno seja reprimida ou evitada na fonte célula.
[0567] Em algumas modalidades, a proteína de ligação a RNA é a proteína de atenuação de ligação a RNA de triptofano (TRAP), por exemplo, proteína de atenuação de ligação a RNA de triptofano bacteriano. O uso de uma proteína de ligação de RNA (por exemplo, a proteína regulatória do operon trp bacteriana, proteína de atenuação de ligação de triptofano RNA, TRAP), e alvos de RNA aos quais se liga, reprimirá ou evitará a tradução do transgene dentro de uma célula de origem. Esse sistema é referido como sistema de células de produção de vetores de repressão no transgene ou sistema TRIP.
[0568] Nas modalidades, a colocação de um local de ligação para uma proteína de ligação de RNA (por exemplo, uma sequência de ligação TRAP, tbs) a montante do códon de iniciação da tradução NOI permite a repressão específica da tradução de mRNA derivado do cassete de expressão interno, embora não tenha nenhum efeito danoso na produção ou estabilidade do RNA vetor. O número de nucleotídeos entre o tbs e o códon de iniciação da tradução do gene que codifica o agente exógeno pode ser variado de 0 a 12 nucleotídeos. O tbs pode ser colocado a jusante de um local de entrada do ribossomo interno (IRES) para reprimir a tradução do gene que codifica o agente exógeno em um mRNA multicistrônico.
SISTEMA DE INTERRUPTORES E AMPLIFICAÇÃO
[0569] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou célula que abriga o gene que codifica o agente exógeno utiliza um gene suicida, por exemplo, um gene suicida induzível, para reduzir o risco de toxicidade direta e/ou proliferação descontrolada. Em aspectos específicos, o gene suicida não é imunogênico para a célula hospedeira que abriga o agente exógeno. Exemplos de genes suicidas incluem caspase-9, caspase-8 ou citosina desaminase. A caspase-9 pode ser ativada usando um indutor químico específico de dimerização (CID).
[0570] Em certas modalidades, os vetores compreendem segmentos gênicos que fazem com que as células-alvo, por exemplo, células efetoras imunes, por exemplo, células T, sejam suscetíveis à seleção negativa in vivo. Por exemplo, a célula transduzida pode ser eliminada como resultado de uma mudança na condição in vivo do indivíduo. O fenótipo selecionável negativo pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Genes selecionáveis negativos são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, os seguintes: o gene da timidina quinase do vírus Herpes simplex tipo I (TK de HSV-I) (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene celular hipoxantina fosfribosiltransferase (HPRT), o gene celular adenina fosforibosiltransferase (APRT) e citosina desaminase bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 33 (1992)).
[0571] Em algumas modalidades, células transduzidas, por exemplo, células efetoras imunes, como células T, compreendem um polinucleotídeo que compreende ainda um marcador positivo que permite a seleção de células do fenótipo selecionável negativo in vitro. O marcador selecionável positivo pode ser um gene que, ao ser introduzido na célula-alvo, expressa um fenótipo dominante que permite a seleção positiva de células portadoras do gene. Os genes desse tipo incluem, entre outros, o gene da higromicina-B fosfotransferase (hph) que confere resistência à higromicina B, o gene da fosfotransferase do amino glicosídeo (neo ou aph) de Tn5 que codifica a resistência ao antibiótico G418, o gene da dihidrofolato redutase (DHFR), o gene da adenosina desaminase (ADA) e o gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR).
[0572] Em algumas modalidades, o marcador selecionável positivo e o elemento selecionável negativo estão ligados de modo que a perda do elemento selecionável negativo também seja necessariamente acompanhada pela perda do marcador selecionável positivo. Por exemplo, os marcadores selecionáveis positivos e negativos podem ser fundidos de forma que a perda de um leve obrigatoriamente à perda do outro. Um exemplo de um polinucleotídeo fundido que produz como um produto de expressão um polipeptídeo que confere ambas as características de seleção positiva e negativa desejadas descritas acima é um gene de fusão de higromicina fosfotransferase timidina quinase (HyTK). A expressão desse gene produz um polipeptídeo que confere resistência à higromicina B para seleção positiva in vitro e sensibilidade ao ganciclovir para seleção negativa in vivo. Consultar Lupton SD, et al., Mol. and Cell. Biology 11: 3.374 a 3.378, 1991. Além disso, nas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os receptores quiméricos estão em vetores retrovirais contendo o gene fundido, particularmente aqueles que conferem resistência à higromicina B para seleção positiva in vitro e sensibilidade ao ganciclovir para seleção negativa in vivo, por exemplo, o vetor retroviral HyTK descrito em Lupton, SD et al. (1991), supra. Consultar também as publicações de PCT U591/08442 e PCT/U594/05601, que descrevem o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de marcadores selecionáveis positivos dominantes com marcadores selecionáveis negativos.
[0573] Marcadores selecionáveis positivos adequados podem ser derivados de genes selecionados do grupo que consiste em hph, nco e gpt, e marcadores selecionáveis negativos adequados podem ser derivados de genes selecionados do grupo que consiste em citosina desaminase, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT e gpt. Outros marcadores adequados são genes de fusão selecionáveis bifuncionais em que o marcador selecionável positivo é derivado de hph ou neo, e o marcador selecionável negativo é derivado de citosina desaminase ou um gene TK ou marcador selecionável.
ESTRATÉGIAS PARA REGULAR A INTEGRAÇÃO LENTIVIRAL
[0574] São divulgados ácidos nucleicos retrovirais e lentivirais que estão ausentes ou desativados em proteínas/sequências-chave de modo a evitar a integração do genoma retroviral ou lentiviral no genoma da célula-alvo. Por exemplo, ácidos nucleicos virais sem cada um dos aminoácidos que constituem o motivo DDE altamente conservado (Engelman e Craigie (1992) J. Virol. 66: 6.361 a 6.369; Johnson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei USA 83: 7.648 a 7.652; Khan et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 851-860) de integrase retroviral permite a produção de ácidos nucleicos retrovirais defeituosos de integração.
[0575] Por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral neste documento compreende uma integrase lentiviral que compreende uma mutação que faz com que a dita integrase seja incapaz de catalisar a integração do genoma viral em um genoma celular. Em algumas modalidades, as ditas mutações são mutações do tipo I que afetam diretamente a integração, ou mutações do tipo II que desencadeiam defeitos pleiotrópicos que afetam a morfogênese do vírion e/ou a transcrição reversa. Exemplos ilustrativos não limitantes de mutações do tipo I são aquelas mutações que afetam qualquer um dos três resíduos que participam no domínio do núcleo catalítico da integrase: DX39-58DX35E (resíduos D64, D116 e E152 da integrase do HIV-1). Em uma modalidade particular, a mutação que faz com que a dita integrase seja incapaz de catalisar a integração do genoma viral em um genoma celular é a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos do motivo DDE do domínio do núcleo catalítico da integrase, de preferência a substituição do primeiro resíduo aspártico do dito motivo DEE por um resíduo asparagina. Em algumas modalidades, o vetor retroviral não compreende uma proteína integrase.
[0576] Em algumas modalidades, o retrovírus se integra em unidades de transcrição ativas. Em algumas modalidades, o retrovírus não se integra perto dos locais de início da transcrição, a extremidade 5' dos genes ou os locais de clivagem de DNAse1. Em algumas modalidades, a integração do retrovírus não ativa proto-oncogenes ou genes supressores de tumor inativos. Em algumas modalidades, o retrovírus não é genotóxico. Em algumas modalidades, o lentivírus se integra aos íntrons.
[0577] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral se integra ao genoma de uma célula-alvo com um número de cópias específico. O número médio de cópias pode ser determinado a partir de células individuais, uma população de células ou colônias de células individuais. Métodos exemplificativos para determinar o número de cópias incluem reação em cadeia da polimerase (PCR) e citometria de fluxo.
[0578] Em algumas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é integrado no genoma. Em algumas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é mantido epissomalmente. Em algumas modalidades, a razão entre DNA integrado e DNA epissomal que codifica o agente exógeno é de pelo menos 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 5, 10,
100.
[0579] Em algumas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é linear. Em algumas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é circular. Em algumas modalidades, a razão entre cópias lineares e cópias circulares de DNA que codificam o agente exógeno é de pelo menos 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 5, 10, 100.
[0580] Nas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é circular com 1 LTR. Em algumas modalidades, o DNA que codifica o agente exógeno é circular com 2 LTRs. Em algumas modalidades, a razão entre DNA circular que compreende 1 LTR que codifica o agente exógeno e DNA circular que compreende 2 LTRs que codifica o agente exógeno é de pelo menos 0,1, 0,5, 1,0, 2, 5, 10, 20, 50, 100.
MANUTENÇÃO DE UM VÍRUS EPISSOMAL
[0581] Em retrovírus com deficiência de integração, produtos derivados de cDNA circular da retrotranscrição (por exemplo, de 1 LTR e de 2 LTRs) podem se acumular no núcleo da célula sem se integrar ao genoma do hospedeiro (consultar Yáñez-Muñoz RJ et al., Nat. Med. 2006, 12: 348 a 353). Como outro DNA exógeno, esses intermediários podem então se integrar no DNA celular em frequências iguais (por exemplo, 103 a 105/célula).
[0582] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral epissomal não se replica. O DNA do vírus episomal pode ser modificado para ser mantido em células em replicação através da inclusão de origem eucariótica de replicação e uma região de fixação de estrutura/matriz (S/MAR) para associação com a matriz nuclear.
[0583] Assim, em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento compreende uma origem eucariótica de replicação ou uma variante da mesma. Exemplos de origens eucarióticas de replicação de interesse são a origem de replicação do gene β-globina, conforme descrito por Aladjem et al (Science, 1995, 270: 815 a 819), uma sequência de consenso de sequências de replicação autônoma associadas a sequências de alfa- satélite isoladas anteriormente de células CV-1 de macaco e fibroblastos de pele humana, conforme descrito por Price et al Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 (22): 19.649 a 19.659, a origem de replicação da região do promotor c-myc humano foi descrito por McWinney e Leffak (McWinney C. e Leffak M., Nucleic Acid Research 1990, 18 (5): 1.233 a 1.242). Nas modalidades, a variante mantém substancialmente a capacidade de iniciar a replicação em eucariotos. A capacidade de uma sequência particular de iniciar a replicação pode ser determinada por qualquer método adequado, por exemplo, o ensaio de replicação autônoma com base na incorporação de bromodeoxiuridina e mudança de densidade (Araujo FD et al., Supra; Frappier L. et al., Supra).
[0584] Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende uma região de fixação de estrutura/matriz (S/MAR) ou uma variante da mesma, por exemplo, um elemento de DNA rico em AT não similar a consenso com várias centenas de pares de bases de comprimento, que organiza o DNA nuclear do genoma eucariótico em domínios de cromatina, por fixação periódica à estrutura da proteína ou matriz do núcleo da célula. As mesmas são normalmente encontradas em regiões não codificantes, como regiões flanqueadoras, regiões de fronteira da cromatina e íntrons. Exemplos de regiões S/MAR são S/MAR de 1,8 kbp do gene IFN-γ humano (hIFN-γgrande), conforme descrito por Bode et al (Bode J. et al., Science, 1992, 255: 195 a 197), a região mínima de 0,7 Kbp do S/MAR do gene IFN-γ humano (hIFN- γcurto), como foi descrito por Ramezani (Ramezani A. et al., Blood 2003, 101: 4.717 a 4.724), a região mínima de 0,2 Kbp do S/MAR do gene da desidrofolato redutase humana (hDHFR), como foi descrito por Mesner LD et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 3.281 a 3.286). Nas modalidades, a variante funcionalmente equivalente da S/MAR é uma sequência selecionada com base no conjunto de seis regras que, juntas ou sozinhas, foram sugeridas para contribuir para a função S/MAR (Kramer et al (1996) Genomics 33, 305; Singh et al (1997) Nucl. Acids Res 25, 1.419). Essas regras foram incorporadas ao programa de computador MAR-Wiz, disponível gratuitamente em genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz. Nas modalidades, a variante mantém substancialmente as mesmas funções da S/MAR da qual deriva, em particular, a capacidade de se ligar especificamente ao nuclear da matriz. O indivíduo versado na técnica pode determinar se uma variante particular é capaz de se ligar especificamente à matriz nuclear, por exemplo, pelos ensaios MAR in vitro ou in vivo descritos por Mesner et al. (Mesner LD et al, supra). Em algumas modalidades, uma sequência específica é uma variante de uma S/MAR se a variante particular mostra propensão para a separação da fita de DNA. Essa propriedade pode ser determinada usando um programa específico baseado em métodos da mecânica estatística de equilíbrio. A técnica de análise de desestabilização duplex induzida por estresse (SIDD) “[...] calcula até que ponto o nível imposto de estresse superélico diminui a energia livre necessária para abrir o duplex em cada posição ao longo de uma sequência de DNA. Os resultados são exibidos como um perfil SIDD, no qual os locais de forte desestabilização aparecem como profundos mínimos [...] ”Conforme definido em Bode et al (2005) J. Mol. Biol. 358.597. O algoritmo SIDD e a base matemática (Bi e Benham (2004) Bioinformatics 20, 1.477) e a análise do perfil do SIDD podem ser realizados utilizando o recurso de internet disponível gratuitamente no WebSIDD (www.genomecenter.ucdavis.edu/benham). Por conseguinte, em algumas modalidades, o polinucleotídeo é considerado uma variante da sequência de S/MAR se o mesmo mostrar um perfil SIDD similar à S/MAR.
FUSOGÊNIOS E PSEUDOTIPAGEM
[0585] Fusogênios, que incluem proteínas do envelope viral (env), geralmente determinam a gama de células hospedeiras que podem ser infectadas e transformadas por fusossomas. No caso de lentivírus, como HIV-1, HIV-2, SIV, FIV e EIV, as proteínas env nativas incluem gp41 e gp120. Em algumas modalidades, as proteínas env virais expressas por células de origem descritas neste documento são codificadas em um vetor separado dos genes gag e pol virais, como foi anteriormente descrito.
[0586] Exemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirais que podem ser empregados incluem, porém sem limitação: envelopes MLV, envelope 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ebola, Sendai, FPV (vírus da peste aviária) e envelopes de vírus da gripe. De modo similar, envelopes que codificam genes a partir de vírus de RNA (por exemplo, famílias de vírus de RNA de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) bem como os vírus de DNA (famílias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae, and Iridoviridae) podem ser utilizados. Exemplos representativos incluem FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Raiva, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 e EIAV.
[0587] Em algumas modalidades, as proteínas de envelope para exibição em um fusossoma incluem, porém sem limitação, qualquer uma das seguintes fontes: Influenza A, como H1N1, H1N2, H3N2 e H5N1 (gripe aviária), Influenza B, vírus da Influenza C, vírus da hepatite A, Vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da hepatite D, vírus da hepatite E, rotavírus, qualquer vírus do grupo do vírus Norwalk, adenovírus entéricos, parvovírus, vírus da dengue, varíola do macaco, mononegavirales, lyssavírus, como vírus da raiva, vírus do morcego de Lagos, Vírus Mokola, vírus Duvenhage, vírus do morcego europeu 1 e 2 e vírus do morcego australiano, Ephemerovírus, Vesiculovírus, Vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus do Herpes, tais como vírus Herpes simplex tipos 1 e 2, varicela zoster, citomegalovírus, vírus Epstein-Bar (EBV), herpesvírus humano (HHV), herpesvírus humano tipo 6 e 8, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do papiloma, gammaherpesvírus murino, Arenavírus como o vírus da febre hemorrágica argentina, vírus da febre hemorrágica boliviana, vírus da febre hemorrágica associado a Sabia, vírus da febre hemorrágica venezuelana, vírus da febre de Lassa, vírus Machupo, vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae, como vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, Hantavírus, vírus causador da febre hemorrágica com síndrome renal, vírus da febre do Vale do Rift, Filoviridae (filovírus) incluindo febre hemorrágica de Ebola e febre hemorrágica de Marburg, Flaviviridae incluindo vírus da doença de Kaysanur Forest, vírus da febre hemorrágica de Omsk, vírus que causa encefalite transmitida por carrapato e Paramyxoviridae, como vírus Hendra e vírus Nipah, varíola maior e varíola menor (varíola), alfavírus como o vírus da encefalite equina venezuelana, vírus da encefalite equina oriental, vírus da encefalite equina ocidental, coronavírus associado a SARS (SARS-CoV), vírus do Nilo Ocidental, qualquer vírus causador de encefalilite.
[0588] Em algumas modalidades, uma célula de origem descrita neste documento produz um fusossoma, por exemplo, retrovírus recombinante, por exemplo, lentivírus, pseudotipado com a glicoproteína VSV-G.
[0589] Um fusossoma ou vírus pseudotipado geralmente tem uma modificação em uma ou mais de suas proteínas de envelope, por exemplo, uma proteína de envelope é substituída por uma proteína de envelope de outro vírus. Por exemplo, o HIV pode ser pseudotipado com proteínas do envelope da proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), o que permite que o HIV infecte uma gama mais ampla de células porque as proteínas do envelope do HIV (codificadas pelo gene env) normalmente direcionam o vírus para a apresentação de células CD4+. Em algumas modalidades, as proteínas do envelope lentiviral são pseudotipadas com VSV-G. Em uma modalidade, as células-fonte produzem retrovírus recombinantes, por exemplo, lentivírus, pseudotipados com a glicoproteína do envelope VSV-G.
[0590] Além disso, um fusogênio ou proteína de envelope viral pode ser modificado ou projetado para conter sequências polipeptídicas que permitem que o vetor de transdução alveje e infecte células hospedeiras fora de sua faixa normal ou, mais especificamente, limite a transdução para uma célula ou tipo de tecido. Por exemplo, o fusogênio ou a proteína de envelope podem ser unidos em quadro com sequências de direcionamento, tais como ligantes de receptor, anticorpos (usando uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo ou uma molécula do tipo de anticorpo recombinante, como um anticorpo de cadeia única), e porções químicas polipeptídicas ou modificações das mesmas (por exemplo, em que um local de glicosilação está presente na sequência de direcionamento) que, quando exibido no revestimento do vetor de transdução, facilita a entrega dirigida da partícula de vírion a uma célula- alvo de interesse. Além disso, as proteínas de envelope podem compreender ainda sequências que modulam a função celular. A modulação da função celular com um vetor de transdução pode aumentar ou diminuir a eficiência de transdução para certos tipos de células em uma população mista de células. Por exemplo, as células- tronco podem ser transduzidas mais especificamente com sequências de envelope contendo ligantes ou parceiros de ligação que se ligam especificamente às células-tronco, em vez de outros tipos de células que são encontrados no sangue ou na medula óssea. Exemplos não limitantes são o fator de células-tronco (SCF) e o ligante Flt-3. Outros exemplos incluem, por exemplo, anticorpos (por exemplo, anticorpos de cadeia única que são específicos para um tipo de célula) e, essencialmente, qualquer antígeno (incluindo receptores) que se liga a tecidos como câncer de pulmão, fígado, pâncreas, coração, endotelial, liso, mama, próstata, epitelial, vascular, etc.
FUSOGÊNIOS EXEMPLIFICATIVOS
[0591] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP inclui um ou mais fusogênios, por exemplo, para facilitar a fusão do vetor retroviral ou VLP para uma membrana, por exemplo, uma membrana celular.
[0592] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende um ou mais fusogênios em seu envelope para direcionar uma célula ou tipo de tecido específico. Os fusogênios incluem, sem limitação, fusogênios baseados em proteínas, lipídios e produtos químicos. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP inclui um primeiro fusogênio que é um fusogênio de proteína e um segundo fusogênio que é um fusogênio lipídico ou fusogênio químico. O fusogênio pode se ligar a um parceiro de ligação ao fusogênio na superfície de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP que compreende o fusogênio irá integrar a membrana em uma bicamada lipídica de uma célula-alvo.
[0593] Em algumas modalidades, um ou mais dos fusogênios descritos neste documento podem ser incluídos no vetor retroviral ou VLP.
PROTEÍNA FUSOGÊNICA
[0594] Em algumas modalidades, o fusogênio é uma proteína fusogênica, por exemplo, uma proteína de mamífero ou um homólogo de uma proteína de mamífero (por exemplo, tendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade superior), uma proteína de não mamífero, como uma proteína viral ou um homólogo de uma proteína viral (por exemplo, tendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade superior), uma proteína nativa ou um derivado de uma proteína nativa, uma proteína sintética, um fragmento da mesma, uma variante da mesma, uma fusão de proteína que compreende um ou mais dos fusogênios ou fragmentos, e qualquer combinação dos mesmos.
[0595] Em algumas modalidades, o fusogênio resulta na mistura entre lipídios no vetor retroviral ou VLP e lipídios na célula-alvo. Em algumas modalidades, o fusogênio resulta na formação de um ou mais poros entre o interior do vetor retroviral ou VLP e o citosol da célula- alvo.
PROTEÍNAS DE MAMÍFEROS
[0596] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína de mamífero, consulte a Tabela 1. Exemplos de fusogênios de mamíferos podem incluir, porém sem limitação, uma proteína da família SNARE, como vSNAREs e tSNAREs, uma proteína sincitina, como Syncytin-1 (DOI: 10.1128/JVI.76.13.6442–6452.2002), e Syncytin-2, myomaker (biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158, doi.org/10.1101/123158, doi: 10.1096/fj.201600945R, doi:
10.1038/nature12343), myomixer (www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html, doi:
10.1038/nature12343), myomerger (science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361, DOI: 10.1126/science.aam9361), FGFRL1 (similar ao receptor de fator de crescimento de fibroblastos 1), Minion (doi.org/10.1101/122697), uma isoforma de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (por exemplo, conforme divulgado no documento US 6.099.857A), uma proteína de junção de lacuna, como conexina 43, conexina 40, conexina 45, conexina 32 ou conexina 37 (por exemplo, conforme divulgado no documento US 2007/0224176, Hap2, qualquer proteína capaz de induzir a formação de sincício entre células heterólogas (consultar Tabela 2), qualquer proteína com propriedades de fusogênio (consultar Tabela 3), um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma variante da mesma e uma fusão de proteína que compreende uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, o fusogênio é codificado por um elemento retroviral endógeno humano (hERV) encontrado no genoma humano. Fusogênios exemplificativos adicionais são divulgados nos documentos US 6.099.857A e US
2007/0224176, cujo conteúdo total é incorporado neste documento a título de referência.
TABELA 1: EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE FUSOGÊNIOS HUMANOS E NÃO HUMANOS.
Classes de fusogênio humano e não humano
Classe de ID da família de proteínas nº de sequências Fusogênio Uniprot
EFF-AFF PF14884 191
SNARE PF05739 5.977
DC-STAMP PF07782 633
ENV PF00429 312 TABELA 2: GENES QUE CODIFICAM PROTEÍNAS COM PROPRIEDADES FUSOGÊNICAS.
Genes humanos com a anotação de ontologia genética de:
Formação de sincício por proteínas de fusão da membrana plasmática
ID Símbolo
A0A024R0I0 DYRK1B
A0A024R1N1 MYH9
A0A024R2D8 CAV3
A0A096LNV2 FER1L5
A0A096LPA8 FER1L5
A0A096LPB1 FER1L5
A0AVI2 FER1L5
A6NI61 TMEM8C (myomaker)
Genes humanos com a anotação de ontologia genética de:
Formação de sincício por proteínas de fusão da membrana plasmática
ID Símbolo
B3KSL7 -
B7ZLI3 FER1L5
H0YD14 MYOF
O43184 ADAM12
O60242 ADGRB3
O60500 NPHS1
O95180 CACNA1H
O95259 KCNH1
P04628 WNT1
P15172 MYOD1
P17655 CAPN2
P29475 NOS1
P35579 MYH9
P56539 CAV3
Q2NNQ7 FER1L5
Q4KMG0 CDON
Q53GL0 PLEKHO1
Q5TCZ1 SH3PXD2A
Q6YHK3 CD109
Q86V25 VASH2
Genes humanos com a anotação de ontologia genética de:
Formação de sincício por proteínas de fusão da membrana plasmática
ID Símbolo
Q99697 PITX2
Q9C0D5 TANC1
Q9H295 DCSTAMP
Q9NZM1 MYOF
Q9Y463 DYRK1B TABELA 3: CANDIDATOS A FUSOGÊNIO HUMANO Classe de Fusogênio ID de Gene
SNARE O15400
Q16623
K7EQB1
Q86Y82
E9PN33
Q96NA8
H3BT82
Q9UNK0
P32856
Q13190
O14662
P61266
O43752
Classe de Fusogênio ID de Gene
O60499
Q13277
B7ZBM8
A0AVG3
Q12846
DC-STAMP Q9H295
Q5T1A1
Q5T197
E9PJX3
Q9BR26
ENV Q9UQF0
Q9N2K0
P60507
P60608
B6SEH9
P60508
B6SEH8
P61550
P60509
Q9N2J8
Fusão muscular (Myomaker) H0Y5B2
H7C1S0
Classe de Fusogênio ID de Gene
Q9HCN3
A6NDV4
K4DI83
Fusão muscular (Myomixer) NP_001302423.1
ACT64390.1
XP_018884517.1
XP_017826615.1
XP_020012665.1
XP_017402927.1
XP_019498363.1
ELW65617.1
ERE90100.1
XP_017813001.1
XP_017733785.1
XP_017531750.1
XP_020142594.1
XP_019649987.1
XP_019805280.1
NP_001170939.1
NP_001170941.1
XP_019590171.1
XP_019062106.1
Classe de Fusogênio ID de Gene EPQ04443.1 EPY76709.1 XP_017652630.1 XP_017459263.1 OBS58441.1 XP_017459262.1 XP_017894180.1 XP_020746447.1 ELK00259.1 XP_019312826.1 XP_017200354.1 BAH40091.1 HA P03452 Q9Q0U6 P03460 GAP JUNCTION P36382 P17302 P36383 P08034 P35212 De outros FGFRL1
GAPDH
[0597] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende uma proteína geradora de curvatura, por exemplo, Epsin1, dinamina ou uma proteína que compreende um domínio BAR. Consultar, por exemplo, Kozlovet al, CurrOp StrucBio 2015, Zimmerberget al. Nat Rev 2006, Richard et al, Biochem J 2011.
PROTEÍNAS DE NÃO MAMÍFEROS PROTEÍNAS VIRAIS
[0598] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína de não mamífero, por exemplo, uma proteína viral. Em algumas modalidades, um fusogênio viral é uma proteína de fusão de membrana viral de Classe I, uma proteína de membrana viral de Classe II, uma proteína de fusão de membrana viral de Classe III, uma glicoproteína de membrana viral ou outras proteínas de fusão viral, ou um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma variante da mesma, ou uma fusão de proteínas que compreende uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas.
[0599] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão de membrana viral de Classe I incluem, porém sem limitação, proteína F de baculovírus, por exemplo, proteínas F do gênero nucleopoliedrovírus (NPV), por exemplo, proteína F de Spodoptera exigua MNPV (SeMNPV) e proteína F Lymantria dispar MNPV (LdMNPV) e proteínas F de paramixovírus.
[0600] Em algumas modalidades, as proteínas de membrana virais de Classe II incluem, porém sem limitação, encefalite E óssea do carrapato (TBEV E), Semliki Forest Virus E1/E2.
[0601] Em algumas modalidades, proteínas de fusão de membrana viral de Classe III incluem, porém sem limitação, rabdovírus G (por exemplo, proteína G fusogênica do Vesicular Estomatatis Vírus (VSV- G)), glicoproteína B do herpesvírus (por exemplo, Herpes Simplex vírus 1 (HSV -1) gB)), glicoproteína B do vírus de Epstein Barr (EBV gB), thogotovírus G, baculovírus gp64 (por exemplo, Autographa California
Multiple NPV (AcMNPV) gp64) e glicoproteína do vírus da doença de Borna (BDV) (BDV G).
[0602] Exemplos de outros fusogênios virais, por exemplo, glicoproteínas de membrana e proteínas de fusão virais, incluem, porém sem limitação: proteínas sincicias virais, tais como hemaglutinina de influenza (HA) ou mutantes, ou proteínas de fusão das mesmas; proteína de envelope do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV- 1 ENV), gp120 de LFA-1 de ligação de HIV para formar sincício de linfócitos, gp41 de HIV, gp160 de HIV ou Transativador de Transcrição (TAT) de HIV; glicoproteína viral VSV-G, glicoproteína viral do vírus da estomatite vesicular da família Rhabdoviridae; glicoproteínas gB e gH- gL do vírus varicela-zoster (VZV); vírus da leucemia murina (MLV)- 10A1; Glicoproteína do vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV); glicoproteínas tipo G em Raiva, Mokola, vírus da estomatite vesicular e Togavírus; proteína de projeção de superfície JHM do vírus da hepatite murina; glicoproteínas de membrana e pico de coronavírus respiratório suíno; glicoproteína em pico de bronquite infecciosa aviária e seu precursor; proteína em pico de coronavírus entérico bovino; os genes F e H, HN ou G do vírus do sarampo; vírus da cinomose canina, vírus da doença de Newcastle, vírus da parainfluenza humana 3, vírus símio 41, vírus Sendai e vírus sincicial respiratório humano; gH de herpesvírus humano 1 e vírus da varicela de símio, com a proteína chaperona gL; herpesvírus gB humano, bovino e cercopiticina; glicoproteínas de envelope do vírus da leucemia murina Friend e vírus do macaco Mason Pfizer; hemaglutinina neuraminidase do vírus da caxumba e glicoproteínas F1 e F2; glicoproteínas de membrana da encefalomielite equina venezuelana; proteína F de paramixovírus; Proteína gp160 de SIV; Proteína G do vírus Ebola; ou proteína de fusão do vírus Sendai, ou um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma variante da mesma, e uma proteína de fusão que compreende uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas.
[0603] Fusogênios de não mamíferos incluem fusogênios virais, homólogos dos mesmos, fragmentos dos mesmos e proteínas de fusão que compreendem uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Os fusogênios virais incluem fusogênios de classe I, fusogênios de classe II, fusogênios de classe III e fusogênios de classe IV. Nas modalidades, os fusogênios de classe I, como gp41 do vírus da imunodeficiência humana (HIV), têm uma conformação pós-fusão característica com um trímero de assinatura de hairpins α-helicoidais com uma estrutura de bobina espiral central. As proteínas de fusão viral de classe I incluem proteínas com um feixe central de seis hélices pós- fusão. Proteínas de fusão virais de classe I incluem influenza HA, parainfluenza F, HIV Env, Ebola GP, hemaglutininas de ortomixovírus, proteínas F de paramixovírus (por exemplo, sarampo, (Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37)), Proteínas ENV de retrovírus e fusogênios de filovírus e coronavírus. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe II, como a glicoproteína E da dengue, têm uma assinatura estrutural de folhas β formando um ectodomínio alongado que se renova para resultar em um trímero de hairpins. Nas modalidades, o fusogênio viral de classe II não possui a bobina espiral central. O fusogênio viral de classe II pode ser encontrado em alfavírus (por exemplo, proteína E1) e flavivírus (por exemplo, glicoproteínas E). Os fusogênios virais de Classe II incluem fusogênios do vírus Semliki Forest, Sinbis, vírus da rubéola e vírus da dengue. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe III, como a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular, combinam assinaturas estruturais encontradas nas classes I e II. Nas modalidades, um fusogênio viral de classe III compreende hélices α (por exemplo, formando um feixe de seis hélices para dobrar a proteína como com os fusogênios virais de classe I) e folhas β com um peptídeo de fusão anfifílico em sua extremidade, uma reminiscência do fusogênios virais de classe II. Fusogênios virais de classe III podem ser encontrados em rabdovírus e herpesvírus. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe IV são proteínas transmembranares pequenas (FAST) associadas à fusão (doi: 10.1038/sj.emboj.7600767, Nesbitt, Rae L., "Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated with Multifunctional FAST protein" (2012). Repositório Eletrônico de Teses e Dissertações. Artigo 388), que são codificados por retrovírus não envelopados. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe IV são suficientemente pequenos para não formarem hairpins (doi: 10.1146/annurev-cellbio-101512-122422, doi:
10.1016/j.devcel.2007.12.008).
[0604] Em algumas modalidades, o fusogênio é um fusogênio de paramixovírus. Em algumas modalidades, o fusogênio é uma proteína F do vírus Nipah, uma proteína F do vírus do sarampo, uma proteína F do paramixovírus de tupaia, uma proteína F do paramixovírus, uma proteína F do vírus Hendra, uma proteína F do Henipavírus, uma proteína F do Morbilivírus, uma proteína F do respirovírus, uma proteína F do vírus Sendai, uma proteína F do rubulavírus ou uma proteína F do avulavírus.
[0605] Em algumas modalidades, o fusogênio é um fusogênio de poxviridae.
[0606] Fusogênios exemplificativos adicionais são divulgados nos documentos US 9.695.446, US 2004/0028687, US 6.416.997, US
7.329.807, US 2017/0112773, US 2009/0202622, WO 2006/027202 e US 2004/0009604, cujo conteúdo é incorporado neste documento a título de referência.
[0607] Em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos da Tabela 4, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência identidade com a mesma,
ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer sequência de aminoácidos da Tabela 4. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico descrita neste documento codifica uma sequência de aminoácidos da Tabela 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento.
[0608] Em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 56, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a
56. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico descrita neste documento codifica uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 56, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento.
[0609] Tabela 4. Agrupamentos de sequência F de paramixovírus. Coluna 1, Genbank ID inclui a ID de Genbank de toda a sequência do genoma do vírus que é a sequência centroide do agrupamento. Coluna 2, Nucleotídeos de CDS fornece os nucleotídeos correspondentes ao CDS do gene em todo o genoma. A coluna 3, Nome completo do gene, fornece o nome completo do gene, incluindo ID de Genbank, espécie de vírus, cepa e nome da proteína. A coluna 4, Sequência, fornece a sequência de aminoácidos do gene. A coluna 5, nº de Sequências/Agrupamento, fornece o número de sequências que se agrupam com esta sequência centroide. ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto KP31792 5630-7399 gb: MIPQARTELNLG 993 1 7 KP317927: QITMELLIHRSSAI 5630-7399 | FLTLAINALYLTS Organismo: SQNITEEFYQST Vírus CSAVSRGYLSAL sincicial RTGWYTSVITIEL respiratório SNIKETKCNGTD humano | TKVKLIKQELDKY Nome da KNAVTELQLLMQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto cepa: NTPAANNRARR Kilifi_9465_7 EAPQYMNYTINT _RSVB_201 TGSLNVSISKKR 1 | Nome da KRRFLGFLLGVG proteína: SAIASGIAVSKVL glicoproteína HLEGEVNKIKNA de fusão | LLSTNKAVVSLS Símbolo do NGVSVLTSKVLD gene: F LKNYINNQLLPIV
NQQSCRISNIET VIEFQQKNSRLL EITREFSVNAGV TTPLSTYMLTNS ELLSLINDMPITN DQKKLMSSNVQI VRQQSYSIMSIIK EEVLAYVVQLPIY GVIDTPCWKLHT SPLCTTNIKEGS NICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFP QADTCKVQSNR VFCDTMNSLTLP SEVSLCNTDIFN SKYDCKIMTSKT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
DISSSVITSLGAIV SCYGKTKCTASN KNRGIIKTFSNGC DYVSNKGVDTVS VGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIIN YYDPLVFPSDEF DASISQVNEKIN QSLAFIRRSDELL HNVNTGKSTTNI MITAIIIVIIVVLLSL IAIGLLLYCKAKN TPVTLSKDQLSGI
NNIAFSK AB52440 4556-6217 gb: MDPKPSTSYLHA 418 2 5 AB524405: FPLIFVAISLVFM 4556-6217 | AGRASALDGRPL Organismo: AAAGIVVTGDKA vírus da VNIYTSSQTGTIII doença de KLLPNMPKDKEQ Newcastle | CAKSPLDAYNRT Nome da LTTLLAPLGDSIR cepa: RIQESVTTSGGE Goose/Alask RQERLVGAIIGG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto a/415/91 | VALGVATAAQIT Nome da AASALIQANQNA proteína: ANILKLKESIAAT proteína de NEAVHEVTSGLS fusão | QLAVAVGKMQQ Símbolo do FVNDQFNKTAQE gene: F IDCIKITQQVGVE
LNLYLTELTTVFG PQITSPALTQLTI QALYNLAGGNM DYMLTKLGVGN NQLSSLISSGLIS GNPILYDSQTQL LGIQVTLPSVGN LNNMRATYLETL SVSTNKGFASAL VPKVVTQVGSVI EELDTSYCIETDL DLYCTRIVTFPM SPGIFSCLGGNT SACMYSKTEGAL TTPYMTLKGSVI ANCKMTTCRCA DPPGIISQNYGE AVSLIDKKVCNIL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
TLDGITLRLSGEF DATYQKNISIQDS QVVITGNLDISTE LGNVNNSISNAL DKLEESNSKLDK VNVRLTSTSALIT YIVLTTIALICGIVS LVLACYIMYKQK AQQKTLLWLGN NTLDQMRATTK
M AF26628 4875-7247 gb: MSIMGLKVNVSA 128 3 6 AF266286: IFMAVLLTLQTPT 4875-7247 | GQIHWGNLSKIG Organismo: VVGIGSASYKVM Cepa do TRSSHQSLVIKL vírus do MPNITLLNNCTR sarampo VEIAEYRRLLRTV AIK-C | LEPIRDALNAMT Nome da QNIRPVQSVASS cepa: Cepa RRHKRFAGVVLA do vírus do GAALGVATAAQI sarampo TAGIALHQSMLN Edmonston SQAIDNLRASLE
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto (vacina AIK- TTNQAIEAIRQAG C) | Nome QEMILAVQGVQD da proteína: YINNELIPSMNQL proteína de SCDLIGQKLGLK fusão | LLRYYTEILSLFG Símbolo do PSLRDPISAEISIQ gene: F ALSYALGGDINK
VLEKLGYSGGDL LGILESRGIKARIT HVDTESYFIVLSI AYPTLSEIKGVIV HRLEGVSYNIGS QEWYTTVPKYV ATQGYLISNFDE SSCTFMPEGTVC SQNALYPMSPLL QECLRGYTKSCA RTLVSGSFGNRF ILSQGNLIANCAS ILCKCYTTGTIINQ DPDKILTYIAADN CPVVEVNGVTIQ VGSRRYPDAVYL HRIDLGPPILLER LDVGTNLGNAIA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
KLEDAKELLESS DQILRSMKGLSS TCIVYILIAVCLGG LIGIPALICCCRG RCNKKGEQVGM SRPGLKPDLTGT
SKSYVRSL AB50385 3068-4687 gb: MSWKVVIIFSLLIT 125 4 7 AB503857: PQHGLKESYLEE 3068-4687 | SCSTITEGYLSVL Organismo: RTGWYTNVFTLE metapneum VGDVENLTCSD ovírus GPSLIKTELDLTK humano | SALRELKTVSAD Nome da QLAREEQIEKPR cepa: QSRFVLGAIALG Jpn03-1 | VATAAAVTAGVA Nome da IAKTIRLESEVTAI proteína: KNALKTTNEAVS precursor da TLGNGVRVLATA glicoproteína VRELKDFVSKNL de fusão | TRAINKNKCDIDD Símbolo do LKMAVSFSQFNR gene: F RFLNVVRQFSDN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
AGITPAISLDLMT DAELARAVSNMP TSAGQIKLMLEN RAMVRRKGFGIL IGVYGSSVIYMV QLPIFGVIDTPC WIVKAAPSCSEK KGNYACLLREDQ GWYCQNAGSTV YYPNEKDCETR GDHVFCDTAAGI NVAEQSKECNINI STTNYPCKVSTG RHPISMVALSPL GALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQL NKGCSYITNQDA DTVTIDNTVYQL SKVEGEQHVIKG RPVSSSFDPIKF PEDQFNVALDQV FENIENSQALVD QSNRILSSAEKG NTGFIIVIILIAVLG SSMILVSIFIIIKKT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
KKPTGAPPELSG
VTNNGFIPHS EU27765 5078-6700 gb: MIIIVITMILSLTPS 93 5 8 EU277658: SLCQIDITKLQSV 5078-6700 | GVLVNSPKGIKIS Organismo: QNFETRYLILSLI Vírus da PKIEDSHSCGNQ parainfluenz QIDQYKKLLDRLII a bovina 3 | PLYDGLKLQKDV Nome da IVVNHESHNNTN cepa: Q5592 LRTKRFFGEIIGTI | Nome da AIGIATSAQITAAV proteína: ALVEAKQARSDI proteína de DKLKEAIKDTNK fusão | AVQSIQSSVGNLI Símbolo do VAVKSVQDYVN gene: F NEIVPSITRLGCE
AAGLQLGIALTQ HYSELTNIFGDNI GTLGEKGVKLQ GIASLYRTNITEV FTTSTVDQYDIY DLLFTESIKMRVI DVDLSDYSITLQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VRLPLLTKVSNT QIYKVDSISYNIQ GKEWYIPLPHHI MTKGAFLGGADI KECIESFSNYICP SDPGFILNHEME NCLSGNITQCPK TIVTSDIVPRYAF VDGGVIANCIPTT CTCNGIDNRINQ SPDQGIKIITYKE CQIVGINGMLFK TNQEGTLAKYTF DNIKLNNSVALN PIDISLELNKAKS DLEESKRWIEKS NQKLDSIGSWH QSSVTIIIIIVMIVV LLIINAIIIMIMIRYL RDRNRHLNNKD
SEPYVLTNRQ AB04087 4546-6162 gb: MKVFLVTCLGFA 89 6 4 AB040874: VFSSSVCVNINIL 4546-6162 | QQIGYIKQQVRQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Organismo: LSYYSQSSSSYI Vírus da VVKLLPNIQPTD caxumba | NSCEFKSVTQYN Nome da KTLSNLLLPIAENI cepa: NNIASPSSGSRR Miyahara | HKRFAGIAIGIAA Nome da LGVATAAQVTAA proteína: VSLVQAQTNARA proteína de IAAMKNSIQATN fusão | RAVFEVKEGTQR Símbolo do LAIAVQAIQDHIN gene: F TIMNTQLNNMSC
QILDNQLATSLGL YLTELTTVFQPQ LINPALSPISIQAL RSLLGSMTPAVV QATLSTSISAAEI LSAGLMEGQIVS VLLDEMQMIVKIN IPTIVTQSNALVID FYSISSFINNQESI IQLPDRILEIGNE QWSYPAKNCKL TRHHIFCQYNEA ERLSLESKLCLA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
GNISACVFSPIAG SYMRRFVALDGT IVANCRSLTCLC KSPSYPIYQPDH HAVTTIDLTACQT LSLDGLDFSIVSL SNITYAENLTISL SQTINTQPIDIST ELSKVNASLQNA VKYIKESNHQLQ SVNVNSKIGAIIV AALVLSILSIIISLL FCCWAYVATKEI RRINFKTNHINTI
SSSVDDLIRY AB47509 4908-6923 gb: MNPHEQTIPMHE 46 7 7 AB475097: KIPKRSKTQTHT 4908-6923 | QQDLPQQHSTK Organismo: SAESKTSRARHS Vírus da ITSAQRSTHYDP cinomose RTADWPDYYIMK canina | RTRSCKQASYR Nome da SDNIPAHGDHDG cepa: IIHHTPESVSQGA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto M25CR | KSRLKMGQSNA Nome da VKSGSQCTWLV proteína: LWCIGVASLFLC proteína de SKAQIHWNNLST fusão | IGIIGTDSVHYKIM Símbolo do TRPSHQYLVIKL gene: F MPNVSLIDNCTK
AELDEYEKLLSSI LEPINQALTLMTK NVKPLQSVGSG RRQRRFAGVVL AGAALGVATAAQ ITAGIALHQSNLN AQAIQSLRTSLE QSNKAIEEIREAT QETVIAVQGVQD YVNNELVPAMQ HMSCELVGQRL GLKLLRYYTELLS IFGPSLRDPISAEI SIQALSYALGGEI HKILEKLGYSGN DMIAILESRGIKT KITHVDLPGKFIIL SVSYPTLSEVKG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VIVHRLEAVSYNI GSQEWYTTVPR YVATNGYLISNF DESSCVFVSESA ICSQNSLYPMSP LLQQCIRGDTSS CARTLVSGTMG NKFILSKGNIVAN CASILCKCYSTST IINQSPDKLLTFIA SDTCPLVEIDGV TIQVGSRQYPDM VYESKVALGPAI SLERLDVGTNLG NALKKLDDAKVLI DSSNQILETVRR SSFNFGSLLSVPI LSCTALALLLLIC CCKRRYQQTHK QNTKVDPTFKPD
LTGTSRSYVRSL AJ84963 5526-7166 gb: MTRVAILTFLFLF 34 8 6 AJ849636: PNAVACQIHWG 5526-7166 | NLSKIGIVGTGSA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Organismo: SYKVMTRPSHQ vírus Peste- TLVIKLMPNITAID des-petits- NCTKSEIAEYKR ruminants | LLITVLKPVEDAL Nome da SVITKNVRPIQTL cepa: Turkey TPGRRTRRFAG 2000 | Nome AVLAGVALGVAT da proteína: AAQITAGVALHQ proteína de SLMNSQAIESLK fusão | TSLEKSNQAIEEI Símbolo do RLANKETILAVQ gene: F GVQDYINNELVP
SVHRMSCELVG HKLGLKLLRYYT EILSIFGPSLRDPI AAEISIQALSYAL GGDINRILDKLGY SGGDFLAILESK GIKARVTYVDTR DYFIILSIAYPTLS EIKGVIVHKIEAIT YNIGAQEWYTTI PKYVATQGYLIS NFDETSCVFTPD GTVCSQNALYP
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
MSPLLQECFQG STKSCARTLVSG TISNRFILSKGNLI ANCASVLCKCYT TETVISQDPDKLL TVVASDKCPVVE VDGVTIQVGSRE YPDSVYLHKIDL GPAISLEKLDVG TNLGNAVTRLEN AKELLDASDQILK TVKGVPFGGNM YIALAACIGVSLG LVTLICCCKGRC KNKEVPISKINPG LKPDLTGTSKSY
VRSL AF01714 6618-8258 gb: MATQEVRLKCLL 29 9 9 AF017149 | CGIIVLVLSLEGL Organismo: GILHYEKLSKIGL vírus Hendra VKGITRKYKIKSN | Nome da PLTKDIVIKMIPNV cepa: SNVSKCTGTVM
UNKNOWN ENYKSRLTGILSP
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto -AF017149 | IKGAIELYNNNTH Nome da DLVGDVKLAGVV proteína: MAGIAIGIATAAQI fusão | TAGVALYEAMKN Símbolo do ADNINKLKSSIES gene: F TNEAVVKLQETA
EKTVYVLTALQD YINTNLVPTIDQIS CKQTELALDLAL SKYLSDLLFVFG PNLQDPVSNSM TIQAISQAFGGN YETLLRTLGYAT EDFDDLLESDSIA GQIVYVDLSSYYI IVRVYFPILTEIQQ AYVQELLPVSFN NDNSEWISIVPN FVLIRNTLISNIEV KYCLITKKSVICN QDYATPMTASV RECLTGSTDKCP RELVVSSHVPRF ALSGGVLFANCI SVTCQCQTTGR
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
AISQSGEQTLLMI DNTTCTTVVLGN IIISLGKYLGSINY NSESIAVGPPVY TDKVDISSQISSM NQSLQQSKDYIK EAQKILDTVNPSL ISMLSMIILYVLSI AALCIGLITFISFVI VEKKRGNYSRLD DRQVRPVSNGD
LYYIGT AB00579 4866-6563 gb: MATYIQRVQCIS 23 10 5 AB005795: ALLSVVLTTLVSC 4866-6563 | QIPRDRLSNIGVI Organismo: VDEGKSLKIAGS Vírus Sendai HESRYIVLSLVP | Nome da GIDLENGCGTAQ cepa: Ohita | VIQYKSLLNRLLI Nome da PLRDALDLQEALI proteína: TVTNDTMTGADV proteína de PQSRFFGAVIGTI fusão | ALGVATSAQITA Símbolo do GIALAEAREAKR
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto gene: F DIALIKESMTKTH
KSIELLQNAVGE QILALKTLQDFVN DEIKPAISELGCE TAALRLGIKLTQH YSELLTAFGSNF GTIGEKSLTLQAL SSLYSANITEIMT TIRTGQSNIYDVI YTEQIKGTVIDVD LERYMVTLSVKIP ILSEVPGVLIHKA SSISYNIDGEEW YVTVPSHILSRAS FLGGANIADCVE SRLTYICPRDPA QLIPDSQQKCILG DTTRCPVTKVVD NIIPKFAFVNGGV VANCIASTCTCG TGRRPISQDRSK GVVFLTHDNCGL IGVNGIELYANRK GHDATWGVQNL TVGPAIAIRPVDI
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
SLNLAAATDFLQ DSRAELEKARKIL SEVGRWYNSGA TLITIIVVMIVVLVV IIVIVIVLYRLRRS MLMSNPAGRISR DTYTLEPKIRHM YTNGGFDAMTE
KR AF45710 5088-6755 gb: MQKSEILFLVYS 21 11 2 AF457102 | SLLLSSSLCQIPV Organismo: EKLSNVGVIINEG Cepa KLLKIAGSYESRY Washington/ IVLSLVPSIDLQD 1964 do GCGTTQIIQYKNL vírus da LNRLLIPLKDALD parainfluenz LQESLITITNDTT a humano 1 | VTNDNPQTRFFG Nome da AVIGTIALGVATA cepa: AQITAGIALAEAR Washington EARKDIALIKDSIV 1964 | Nome KTHNSVELIQRGI da proteína: GEQIIALKTLQDF glicoproteína VNDEIRPAIGELR
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto F | Símbolo CETTALKLGIKLT do gene: F QHYSELATAFSS
NLGTIGEKSLTLQ ALSSLYSANITEIL STTKKDKSDIYDII YTEQVKGTVIDV DLEKYMVTLLVKI PILSEIPGVLIYRA SSISYNIEGEEW HVAIPNYIINKAS SLGGADVTNCIE SKLAYICPRDPT QLIPDNQQKCIL GDVSKCPVTKVI NNLVPKFAFING GVVANCIASTCT CGTNRIPVNQDR SRGVTFLTYTNC GLIGINGIELYAN KRGRDTTWGNQ IIKVGPAVSIRPV DISLNLASATNFL EESKTELMKARA IISAVGGWHNTE STQIIMIIIVCILIIIIC
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GILYYLYRVRRLL VMINSTHNSPVN AYTLESRMRNPY
MGNNSN AB91030 4951-6582 gb: MGKIRVIIISSLLL 12 12 9 AB910309: SNITTAQVGWDN 4951-6582 | LTSIGVISTKQYD Organismo: YKITTLNTNQLM Morbilivírus VIKMVPNISSIINC felino | TKPELMKYRELV Nome da LGVIRPINESLEL cepa: SS1 | MNSYINMRAGSE Nome da RFIGAVIAGVALG proteína: VATAAQITSGIAL proteína de HNSIMNKRQIQE fusão | LRKALSTTNKAID Símbolo do EIRIAGERTLIAV gene: F QGVQDYINNIIIP
MQDKLQCDILSS QLAIALLRYYTNIL TVFGPSIRDPVT SIISIQALSQAFN GNLQALLDGLGY TGRDLRDLLESR
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SITGQIIHADMTD LFLVLRINYPSITE MQGVTIYELNSIT YHIGPEEWYTIM PNFIAVQGFLTS NFDERKCSITKS SILCQQNSIYPM STEMQRCIKGEI RFCPRSKAVGTL VNRFILTKGNLM ANCLGVICRCYS SGQIITQDPSKLI TIISQEECKEVGV DGIRIMVGPRKL PDVIFNARLEVG VPISLSKLDVGTD LAIASAKLNNSKA LLEQSDKILDSM SKLDSINSRITGLI LAIMAIFIITVTIIWI IYKRCRNKDNKF STSIEPLYIPPSY
NSPHSVVKSI KT07175 4310-6070 gb: MIAALFISLFATC 12 13
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 5 KT071755: GALDNSVLAPVG 4310-6070 | IASAQEWQLAAY Organismo: TNTLSGTIAVRFV Paramixovír PVLPGNLSTCAQ us aviário 2 | ATLAEYNKTVTNI Nome da LGPLKENLETLLS cepa: EPTKTAARFVGA APMV- IIGTVALGVATSA 2/Procarduel QITAAVALNQAQ is ENARNIWRLKES nipalensis/C IRKTNEAVLELKD hina/Suiling/ GLASTAIALDKV 53/2013 | QKFINEDIIPQIKE Nome da IDCQVVANKLGV proteína: YLSLYLTELTTIF proteína de GAQITNPALTPLS fusão | YQALYNLCGGD Símbolo do MGKLTELIGVKA gene: F KDINSLYEANLIT
GQVIGYDSESQII LIQVSYPSVSEVT GVRATELVTVSV TTPKGEGRAIAP KYVAQSRVVTEE LDTSTCRFSKTT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
LYCRSIITRPLPP LIANCLNGLYQD CQYTTEIGALSS RFITVNGGIIANC RATICKCVNPPKI IVQSDASSLTVID SAICKDVVLDNV QLRLEGKLSAQY FTNITIDLSQITTS GSLDISSEIGSIN NTVNKVEELIAES NAWLQAVNPHL VNNTSIIVLCVLA AIFVVWLVALTG CLAYYIKKSSATR MVGIGSSPAGNP
YVAQSATKM AY02929 4598-6265 gb: MGARLGPLAMA 11 14 9 AY029299 | PGRYVIIFNLILLH Organismo: RVVSLDNSRLLQ paramixovír QGIMSATEREIK us aviário 6 | VYTNSITGSIAVR Nome da LIPNLPQEVLKCS cepa: AGQIKSYNDTLN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto APMV- RIFTPIKANLERLL 6/duck/Taiw ATPSMLEDNQN an/Y1/98 | PAPEPRLIGAIIGT Nome da AALGLATAAQVT proteína: AALALNQAQDNA proteína de KAILNLKESITKT fusão | NEAVLELKDATG Símbolo do QIAIALDKTQRFI gene: F NDNILPAINNLTC
EVAGAKVGVELS LYLTELSTVFGS QITNPALSTLSIQ ALMSLCGNDFNY LLNLMGAKHSDL GALYEANLINGRI IQYDQASQIMVIQ VSVPSISSISGLR LTELFTLSIETPV GEGKAVVPQFV VESGQLLEEIDT QACTLTDTTAYC TIVRTKPLPELVA QCLRGDESRCQ YTTGIGMLESRF GVFDGLVIANCK
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
ATICRCLAPEMIIT QNKGLPLTVISQ ETCKRILIDGVTL QIEAQVSGSYSR NITVGNSQIAPS GPLDISSELGKV NQSLSNVEDLID QSNQLLNRVNP NIVNNTAIIVTIVLL VLLVLWCLALTISI LYVSKHAVRMIK TVPNPYVMQAK
SPGSATQF AY14176 5028-6665 gb: MTRITILQIILTLTL 8 15 0 AY141760 | PVMCQVSFDNL Organismo: EQVGVMFDKPK paramixovír FLKITGPASTATM us Fer-de- IIKLIPTLGTMESC Lance | GTSAVNEYKKTL Nome da DTILVPLRDTINK cepa: ATCC LSTDITVVEGTSN VR-895 | ISNKREKRFVGIA Nome da IAVGAVALATSA proteína: QITAGIALSNTIKN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto proteína de AEAIESIKSSIQAS fusão F | NQAIQKVIDAQG Símbolo do RTVTVINGIQDHI gene: F NSVINPALNQLG
CDVAKNTLAISLT QYFSKLSLLFGP NLRNPVEQPLSV QAIAGLMDGDIN AVVSQLGYTQSD LLDLLSTESIVGT VTAIDMVNYMIQI EMSFPQYITIPDT KVLEGHKITFND KGSEWQTQVPS TIAVRDILIAGVDP DGCSITSTSYICK NDPTYAMSEVLT NCFRGNTQECP RARITSTFATRFA IARSTVIANCVAA VCLCGDPGIPVV QKAEVTLTAMTL DQCSLITVDGLQI KPSKSIANVTAN FGNITLGPVVSV
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GDLDLSAELTKV QSDLKEAQDKLD ESNAILQGINNKI LTAPTSIALIVVSV VVILLIIGMISWLV WLTKAVRRSNT RSERVTPSAYNN
LGFIK EU87797 4330-6410 gb: MRLSRTILTLILG 8 16 6 EU877976: TLTGYLMGAHST 4330-6410 | NVNEGPKSEGIR Organismo: GDLIPGAGIFVTQ Paramixovír VRQLQIYQQSGY us aviário 4 | HDLVIRLLPLLPA Nome da ELNDCQREVVTE cepa: YNNTVSQLLQPI APMV- KTNLDTLLADGG 4/KR/YJ/06 | TRDADIQPRFIGA Nome da IIATGALAVATVA proteína: EVTAAQALSQSK proteína de TNAQNILKLRDSI fusão | QATNQAVFEISQ Símbolo do GLEATATVLSKL gene: F QTELNENIIPSLN
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NLSCAAMGNRL GVSLSLYLTLMT TLFGDQITNPVLT PISYSTLSAMAG GHIGPVMSKILA GSVTSQLGAEQL IASGLIQSQVVGY DSQYQLLVIRVN LVRIQEVQNTRV VSLRTLAVNRDG GLYRAQVPPEVV ERSGIAERFYAD DCVLTTTDYICSS IRSSRLNPELVK CLSGALDSCTFE RESALLSTPFFV YNKAVVANCKAA TCRCNKPPSIIAQ YSASALVTITTDT CADLEIEGYRFNI QTESNSWVAPN FTVSTSQIVSVD PIDISSDIAKINSSI EAAREQLELSNQ ILSRINPRIVNDE
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SLIAIIVTIVVLSLL VIGLIVVLGVMYK NLKKVQRAQAA MMMQQMSSSQ
PVTTKLGTPF AB17653 4793-6448 gb: MHHLHPMIVCIF 7 17 1 AB176531: VMYTGIVGSDAI 4793-6448 | AGDQLLNIGVIQS Organismo: KIRSLMYYTDGG vírus da ASFIVVKLLPNLP parainfluenz PSNGTCNITSLD a humana 2 | AYNVTLFKLLTPL Nome da IENLSKISTVTDT cepa: Nishio KTRQKRFAGVVV | Nome da GLAALGVATAAQ proteína: ITAAVAIVKANAN proteína de AAAINNLASSIQS fusão | TNKAVSDVIDAS Símbolo do RTIATAVQAIQDR gene: F INGAIVNGITSAS
CRAHDALIGSILN LYLTELTTIFHNQI TNPALTPLSIQAL RILLGSTLPIVIES
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KLNTNFNTAELL SSGLLTGQIISISP MYMQMLIQINVP TFIMQPGAKVIDL IAISANHKLQEVV VQVPNRILEYAN ELQNYPANDCVV TPNSVFCRYNEG SPIPESQYQCLR GNLNSCTFTPIIG NFLKRFAFANGV LYANCKSLLCRC ADPPHVVSQDD TQGISIIDIKRCSE MMLDTFSFRITS TFNATYVTDFSM INANIVHLSPLDL SNQINSINKSLKS AEDWIADSNFFA NQARTAKTLYSL SAIALILSVITLVV VGLLIAYIIKLVSQ IHQFRSLAATTM FHRENPAFFSKN NHGNIYGIS
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto BK00591 4677-6302 gb: MPQQQVAHTCV 7 18 8 BK005918 | MLWGIISTVSGIN Organismo: TEALSQYGVVVT Rubulavírus NVRQLTYYTQAG suíno | STYLAVRLLPSLA Nome da SPDQSCALHSIIN cepa: YNATLQAILSPIA
UNKNOWN ENLNLISTALREQ -BK005918 | HRKKRFAGVAIG Nome da LTALGVATAAQA proteína: TAAVALVRANKN proteína de AEKVEQLSQALG fusão | ETNAAISDLIDAT Símbolo do KNLGFAVQAIQN gene: F QINTAILPQIHNLS
CQVIDAQLGNILS LYLTELTTVFQP QLTNPALSPLTIQ ALRAVLGTTLPA LLSEKLKSNIPLG DLMSSGLLKGQL VGLNLQNMLMIIE LYIPTLSTHSTAK VLDLVTISSHVN GREVEIQVPNRV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
LELGSEVLGYGG SECALTMSHILC PFNDARVLSTDM KYCLQGNITHCIF SPVVGSFLRRFA LVNGVVIANCAD MSCVCFDPQEII YQNFQEPTTVIDI KKCGKVQLDTLT FTISTFANRTYGP PAYVPPDNIIQSE PLDISGNLIAVNN SLSSALNHLATS EILRNEQIWTSSL GISTIVALVIIGILII CLVVTWAALWAL LKEVRGLNSAVN SQLSSYVMGDK
FIRY KC23706 4530-6185 gb: MGTRIQFLMVSC 7 19 3 KC237063: LLAGTGSLDPAA 4530-6185 | LMQIGVIPTNVR Organismo: QLMYYTEASSAF vírus da IVVKLMPTIDSPIS
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Parainfluenz GCNITSISSYNAT a 5 | Nome MTKLLQPIGENL da cepa: 08- ETIRYQLIPTRRR 1990 | Nome RRFVGVVIGLAA da proteína: LGVATAAQVTAA proteína de VALVKANKNAAA fusão | ILNLKNAIQKTNA Símbolo do AVADVVQATQSL gene: F | GTAVQAVQDHIN Segmento: 4 SVVSPAITAANC
KAQDAIIGSILNLY LTELTTIFHNQIT NPALSPITIQALRI LLGSTLPTVVRK SFNTQISAAELLS SGLLTGQIVGLD LTYMQMVIKIELP TLTVQPATQIIDL VTISAFINNREVM AQLPTRIIVTGSLI QAYPASQCTITP NTVYCRYNDAQ VLSDDTMACLQ GNLTRCTFSPVV GSFLTRFVLFDGI
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VYANCRSMLCK CMQPAAVILQPS SSPVTVIDMHKC VSLQLDNLRFTIT QLANITYNSTIKL ETSQILPIDPLDIS QNLAAVNKSLSD ALQHLAQSDTYL SAITSATTTSVLSI IAICLGSLGLILIILI SVVVWKLLTIVA ANRNRMENFVY HNSAFHHSRSDL
SEKNQPATLGTR AY72901 5862-7523 gb: MIPGRIFLVLLVIF 6 20 6 AY729016: NTKPIHPNTLTEK 5862-7523 | FYESTCSVETAG Organismo: YKSALRTGWHM Vírus da TVMSIKLSQINIE pneumonia SCKSSNSLLAHE murina | LAIYSSAVDELRT Nome da LSSNALKSKRKK cepa: 15; RFLGLILGLGAAV ATCC VR- TAGVALAKTVQL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 25 | Nome ESEIALIRDAVRN da proteína: TNEAVVSLTNGM precursor da SVLAKVVDDLKN glicoproteína FISKELLPKINRV de fusão | SCDVHDITAVIRF Símbolo do QQLNKRLLEVSR gene: F EFSSNAGLTHTV
SSFMLTDRELTSI VGGMAVSAGQK EIMLSSKAIMRR NGLAILSSVNAD TLVYVIQLPLFGV MDTDCWVIRSSI DCHNIADKYACL ARADNGWYCHN AGSLSYFPSPTD CEIHNGYAFCDT LKSLTVPVTSRE CNSNMYTTNYD CKISTSKTYVSTA VLTTMGCLVSCY GHNSCTVINNDK GIIRTLPDGCHYI SNKGVDRVQVG NTVYYLSKEVGK
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
SIVVRGEPLVLKY DPLSFPDDKFDV AIRDVEHSINQTR TFLKASDQLLDL SENRENKNLNKS YILTTLLFVVMLIII MAVIGFILYKVLK MIRDNKLKSKST
PGLTVLS AB54333 5174-6805 gb: MGVKGLSLIMIGL 5 21 6 AB543336: LISPITNLDITHLM 5174-6805 | NLGTVPTAIRSLV Organismo: YYTYTKPSYLTV vírus da DLIPNLKNLDQN parainfluenz CNYSSLNYYNKT a humana ALSLIQPIADNINR 4a | Nome LTKPITSSEIQSR da cepa: M- FFGAVIGTIALGV 25 | Nome ATAAQVTAAIGL da proteína: AKAQENAKLILTL proteína de KKAATETNEAVR fusão | DLANSNKIVVKMI Símbolo do SAIQNQINTIIQPA gene: F IDQINCQIKDLQV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
ANILNLYLTEITTV FHNQLTNPALESI SIQALKSLLGPTL PEVLSKLDLNNIS AASVMASGLIKG QIIAVDIPTMTLVL MVQIPSISPLRQA KIIDLTSITIHTNS QEVQAVVPARFL EIGSEILGFDGSV CQITKDTIFCPYN DAYELPIQQKRC LQGQTRDCVFTP VAGTFPRRFLTT YGTIVANCRDLV CSCLRPPQIIYQP DENPVTIIDKDLC TTLTLDSITIEIQK SINSTFRREVVLE STQVRSLTPLDL STDLNQYNQLLK SAEDHIQRSTDY LNSINPSIVNNNA IIILIILCILLILTVTIC IIWLKYLTKEVKN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VARNQRLNRDA DLFYKIPSQIPVP
R AF29889 4834-6450 gb: MRIALTAVIVSIHF 5 22 5 AF298895 | DLAFPMNKNSLL Organismo: SVGLVHKSVKNL vírus Tioman YFYSQGSPSYIV | Nome da VKLVPTLGNVPG cepa: NCTLNSLVRYKS
UNKNOWN TVSSLLSPLAENL -AF298895 | EYLQKTLTVSRG Nome da GRRRRFAGVAIG proteína: LAALGVAAAAQA proteína de TAAVALVEARQN fusão | AAQIQSLSEAIQN Símbolo do TNLAVNELKTAIG gene: F ASATAIQAIQTQI
NEVINPAINRLSC EILDAQLASMLNL YLIHLTTVFQNQL TNPALTPLSIQSL QSLLQGTSSVLT NITSSSKLALNDA LVTGLITGQVVG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
LNMTSLQIVIAAY VPSVAKLSNAVV HNFIRITTSVNGT EVIIQSPTIIMEQN EVMYDLKTGHCT ESDLNIYCPYVD AQLLSPGMTNCI NGRLNDCTFSKV VGSFPTRFAAVE GAILANCKYLQC NCLTPPYIITPLN GEMISMIDLSKC QRLDLGTIVFDIN NPVNVTFNGNY RADVGQMIVTNP LDISAELNQINTS LSNAQGFLSKSD AWLHVSQWVTN SGTIFIILIIGLIVGI VYMIINTYVVVQII KEINRMRTSDRA
HLLKGSISSIST FJ21586 4499-6130 gb: MGQISVYLINSVL 5 23 3 FJ215863: LLLVYPVNSIDNT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 4499-6130 | LIAPIGVASANEW Organismo: QLAAYTTSLSGTI Paramixovír AVRFLPVLPDNM us aviário 8 | TTCLRETITTYNN Nome da TVNNILGPLKSNL cepa: DALLSSETYPQT goose/Dela RLIGAVIGSIALG ware/1053/7 VATSAQITAAVAL 6 | Nome da KQAQDNARNILA proteína: LKEALSKTNEAV proteína de KELSSGLQQTAI fusão | ALGKIQSFVNEEI Símbolo do LPSINQLSCEVTA gene: F NKLGVYLSLYLT
ELTTIFGAQLTNP ALTSLSYQALYN LCGGNMAMLTQ KIGIKQQDVNSLY EAGLITGQVIGYD SQYQLLVIQVNY PSISEVTGVRAT ELVTVSVTTDKG EGKAIVPQFVAE SRVTIEELDVAS CKFSSTTLYCRQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VNTRALPPLVAS CLRGNYDDCQY TTEIGALSSRYIT LDGGVLVNCKSI VCRCLNPSKIISQ NTNAAVTYVDAT ICKTIQLDDIQLQL EGSLSSVYARNI SIEISQVTTSGSL DISSEIGNINNTV NRVEDLIHQSEE WLAKVNPHIVNN TTLIVLCVLSALA VIWLAVLTAIIIYL RTKLKTISALAVT NTIQSNPYVNQT
KRESKF JN68922 4689-6521 gb: MKLSVVYTTLLV 5 24 7 JN689227: STFYSDLARSQL 4689-6521 | ALSELTKIGVIPG Organismo: RSYDLKISTQAS Vírus Tailam YQYMVVKLIPNL | Nome da TGLNNCTNGTIE cepa: TL8K | AYKKMLNRLLSPI
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Nome da DAALRKMKDAV proteína: NDKPPESVGNV proteína de KFWGAVIGGVAL fusão | GVATSAQITAGV Símbolo do ALHNSIQNANAIL gene: F ALKDSIRQSNKAI
QELQTAMSTTVV VLNALQDQINNQ LVPAINSLGCQV VANTLGLKLNQY FSEISLVFGPNLR DPTSETLSIQALS RAFNGDFDSML SKLKYDDSDFLD LLESDSIRGRIIDV SLSDYLITIQIEYP ALLSIKDAVIQTF NLISYNTRGTEWI SIFPKQLLVRGTY ISNIDISQCVIAAT SIICKSDTSTPISS ATWSCATGNITN CARTRVVNAHVP RFALYGGVVFAN CAPVVCKCQDPL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
YSINQEPKVTNV MVDVDACKEMY LDGLYITLGKTQI SRAMYAEDVSL GGPISVDPIDLG NEINSINSAINRS EEHLNHANELLD KVNPRIVNVKTF GVMIGLLVLVVL WCVITLVWLICLT KQLARTAYAGS MGSRASTVNSLS
GFVG JX85740 4831-6615 gb: MQVTTLRPAIILSI 5 25 9 JX857409: ALLVTGQVPRDK 4831-6615 | LANLGIIIKDSKAL Organismo: KIAGSYENRYIVL vírus da SLVPTIDNVNGC parainfluenz GSIQIAKYKEMLE a suína 1 | RLLIPIKDALDLQ Nome da ESLIVIDNETVNN cepa: NYSPQYRFVGAII S206N | GTIALGVATAAQ Nome da VTAGVALMEARE
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto proteína: AKRDISMLKEAIE proteína de KTQNSIEKLQNS fusão | AGEQILALKMLQ Símbolo do DYVNGEIKPAIEE gene: F LGCETAALKLGIA
LTQHYTELTNAF GSNLGSIGEKSL TLQALSSLYKTNI TNILTATNLGKTD IYDIIYAEQVKGR VIDVDLKRYMVTI SVKIPILSEIPGVL IYEVSSISYNIDG AEWYAAVPDHIL SKSAYIGGADISD CIESRLTYICPQD PAQIIADNQQQC FFGHLDKCPITK VIDNLVPKFAFIN GGVVANCIASTC TCGEERIQVSQD RNKGVTFLTHNN CGLIGINGIEFHA NKKGSDATWNV SPIGVGPAVSLR
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
PVDISLQIVAATN FLNSSRKDLMKA KEILNQVGNLKD LTTITIINIVIIIILLIC VIGLGILYHQLRS ALGMRDKMSVL NNSSYSLEPRTA
QVQVIKPTSFMG AY64031 2932-4571 gb: MDVRICLLLFLIS 4 26 7 AY640317: NPSSCIQETYNE 2932-4571 | ESCSTVTRGYKS Organismo: VLRTGWYTNVF metapneum NLEIGNVENITCN ovírus DGPSLIDTELVLT aviário | KNALRELKTVSA Nome da DQVAKESRLSSP cepa: LAH A RRRRFVLGAIAL | Nome da GVATAAAVTAGV proteína: F | ALAKTIRLEGEVK Símbolo do AIKNALRNTNEA gene: F VSTLGNGVRVLA
TAVNDLKEFISKK LTPAINQNKCNIA DIKMAISFGQNN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
RRFLNVVRQFSD SAGITSAVSLDL MTDDELVRAINR MPTSSGQISLML NNRAMVRRKGF GILIGVYDGTVVY MVQLPIFGVIETP CWRVVAAPLCR KRRGNYACILRE DQGWYCTNAGS TAYYPNKDDCEV RDDYVFCDTAA GINVALEVDQCN YNISTSKYPCKV STGRHPVSMVAL TPLGGLVSCYES VSCSIGSNKVGII KQLGKGCTHIPN NEADTITIDNTVY QLSKVVGEQRTI KGAPVVNNFNPI LFPVDQFNVALD QVFESIDRSQDLI DKSNDLLGADAK SKAGIAIAIVVLVI
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
LGIFFLLAVIYYCS RVRKTKPKHDYP
ATTGHSSMAYVS KU64651 4641-6498 gb: MARFSWEIFRLS 4 27 3 KU646513: TILLIAQTCQGSID 4641-6498 | GRLTLAAGIVPV Organismo: GDRPISIYTSSQT Paramixovír GIIVVKLIPNLPDN us aviário 13 KKDCAKQSLQSY goose/Kaza NETLSRILTPLAT khstan/5751 AMSAIRGNSTTQ /2013 | VRENRLVGAIIGS Nome da VALGVATAAQIT cepa: AATALIQANQNA APMV- ANIARLANSIAKT 13/white NEAVTDLTEGLG fronted TLAIGVGKLQDY goose/North VNEQFNNTAVAI ern DCLTLESRLGIQL Kazakhstan/ SLYLTELMGVFG 5751/2013 | NQLTSPALTPITI Nome da QALYNLAGGNLN proteína: ALLSRLGASETQ proteína de LGSLINSGLIKGM
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto fusão | PIMYDDANKLLA Símbolo do VQVELPSIGKLN gene: F GARSTLLETLAV
DTTRGPSSPIIPS AVIEIGGAMEELD LSPCITTDLDMF CTKIISYPLSQST LSCLNGNLSDCV FSRSEGVLSTPY MTIKGKIVANCK QVICRCMDPPQI LSQNYGEALLLID ENTCRSLELSGV ILKLAGTYESEYT RNLTVDPSQVIIT GPLDISAELSKV NQSIDSAKENIAE SNKFLSQVNVKL LSSSAMITYIVAT VVCLIIAITGCVIGI YTLTKLKSQQKT LLWLGNNAEMH
GSRSKTSF AF32611 4818-6482 gb: MMPRVLGMIVLY 3 28
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 4 AF326114 | LTHSQILCINRNT Organismo: LYQIGLIHRSVKK vírus VNFYSQGSPSYI Menangle | VVKLVPTLAAIPP Nome da NCSIKSLQRYKE cepa: TVTSLVQPISDNL
UNKNOWN GYLQDKLVTGQS -AF326114 | RRRRRFAGVAIG Nome da LAALGVAAAAQA proteína: TAAVALVETREN proteína de AGKIQALSESIQN fusão | TNQAVHSLKTAL Símbolo do GFSATAIQAIQN gene: F QVNEVINPAINKL
SCEVLDSQLASM LNLYLIHLTTVFQ TQLTNPALTPLSI QALTSVLQGTSG VLMNSTNSTLTQ PIDLLATGLITGQI ISVNMTSLQLIIAT FMPSIAELPNAVL HSFFRITTSVNLT EVMIQSPEFIME QNGVFYDFNTA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
HCQLGDNNVYC PYIDAARLSSMM TNCINGNLGECV FSRVIGSFPSRF VSLNGAILANCK FMRCNCLSPEKII TPLDGEMISLIDL RVCQKLTLGTITF EISQPVNVSFQG GFVANAGQIIVTN PFDISAELGQINN SLNDAQGFLDQS NNWLKVSGWIN NSGSLFIAGIVVI GLIVLCIVIIIYINV QIIREVNRLRSFI YRDYVLDHDKAP YSPESSSPHRKS
LKTVS GU20635 5441-7468 gb: MLQLPLTILLSILS 3 29 1 GU206351: AHQSLCLDNSKL 5441-7468 | IHAGIMSTTEREV Organismo: NVYAQSITGSIVV Paramixovír RLIPNIPSNHKSC
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto us aviário 5 | ATSQIKLYNDTLT Nome da RLLTPIKANLEGLI cepa: SAVSQDQSQNS budgerigar/ GKRKKRFVGAVI Kunitachi/74 GAAALGLATAAQ | Nome da VTATVALNQAQE proteína: NARNILRLKNSIQ proteína de KTNEAVMELKDA fusão | VGQTAVAIDKTQ Símbolo do AFINNQILPAISNL gene: F SCEVLGNKIGVQ
LSLYLTELTTVFG NQLTNPALTTLS LQALYNLCGDDF NYLINLLNAKNR NLASLYEANLIQ GRITQYDSMNQL LIIQVQIPSISTVS GMRVTELFTLSV DTPIGEGKALVP KYVLSSGRIMEE VDLSSCAITSTSV FCSSIISRPLPLE TINCLNGNVTQC QFTANTGTLESR
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YAVIGGLVIANCK AIVCRCLNPPGVI AQNLGLPITIISSN TCQRINLEQITLS LGNSILSTYSANL SQVEMNLAPSN PLDISVELNRVNT SLSKVESLIKESN SILDSVNPQILNV KTVIILAVIIGLIVV WCFILTCLIVRGF MLLVKQQKFKGL SVQNNPYVSNN
SH JQ00177 6129-8166 gb: MSNKRTTVLIIISY 3 30 6 JQ001776: TLFYLNNAAIVGF 6129-8166 | DFDKLNKIGVVQ Organismo: GRVLNYKIKGDP Vírus do MTKDLVLKFIPNI cedro | VNITECVREPLS Nome da RYNETVRRLLLPI cepa: CG1a HNMLGLYLNNTN | Nome da AKMTGLMIAGVI proteína: MGGIAIGIATAAQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto glicoproteína ITAGFALYEAKKN de fusão | TENIQKLTDSIMK Símbolo do TQDSIDKLTDSV gene: F GTSILILNKLQTYI
NNQLVPNLELLS CRQNKIEFDLML TKYLVDLMTVIG PNINNPVNKDMT IQSLSLLFDGNY DIMMSELGYTPQ DFLDLIESKSITG QIIYVDMENLYVV IRTYLPTLIEVPD AQIYEFNKITMSS NGGEYLSTIPNFI LIRGNYMSNIDV ATCYMTKASVIC NQDYSLPMSQN LRSCYQGETEYC PVEAVIASHSPR FALTNGVIFANCI NTICRCQDNGKT ITQNINQFVSMID NSTCNDVMVDK FTIKVGKYMGRK
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DINNINIQIGPQIII DKVDLSNEINKM NQSLKDSIFYLR EAKRILDSVNISLI SPSVQLFLIIISVL SFIILLIIIVYLYCK SKHSYKYNKFID DPDYYNDYKRE RINGKASKSNNIY
YVGD LC16874 4869-7235 gb: MGILFAALLAMT 2 31 9 LC168749: NPHLATGQIHWG 4869-7235 | NLSKIGVVGTGS Organismo: ASYKVMTQSSH morbilivírus QSLVIKLMPNVT da peste AIDNCTKTEIMEY bovina | KRLLGTVLKPIRE Nome da ALNAITKNIKPIQS cepa: Lv | STTSRRHKRFAG Nome da VVLAGAALGVAT proteína: AAQITAGIALHQS proteína F | MMNSQAIESLKA Símbolo do SLETTNQAIEEIR gene: F QAGQEMVLAVQ
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GVQDYINNELVP AMGQLSCEIVGQ KLGLKLLRYYTEI LSLFGPSLRDPV SAELSIQALSYAL GGDINKILEKLGY SGSDLLAILESKG IKAKITYVDIESYF IVLSIAYPSLSEIK GVIVHRLESVSY NIGSQEWYTTVP RYVATQGYLISN FDDTPCAFTPEG TICSQNALYPMS PLLQECFRGSTR SCARTLVSGSIG NRFILSKGNLIAN CASILCKCYTTG SIISQDPDKILTYI AADQCPVVEVG GVTIQVGSREYS DAVYLHEIDLGP PISLEKLDVGTNL WNAVTKLEKAKD LLDSSDLILENIK
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GVSVTNTGYILV GVGLIAVVGILIIT CCCKKRRSDNK VSTMVLNPGLRP DLTGTSKSYVRS
L LC18731 6250-7860 gb: MTRTRLLFLLTC 2 32 0 LC187310: YIPGAVSLDNSIL 6250-7860 | APAGIISASERQI Organismo: AIYTQTLQGTIAL paramixovír RFIPVLPQNLSS us aviário 10 CAKDTLESYNST | Nome da VSNLLLPIAENLN cepa: ALLKDADKPSQR rAPMV-10- IIGAIIGSVALGVA FI324/YmH TTAQVTAALAMT A | Nome da QAQQNARNIWK proteína: LKESIKNTNQAVL proteína de ELKDGLQQSAIA fusão | LDKVQSFINSEIL Símbolo do PQINQLGCEVAA gene: F NKLGIFLSLYLTEI
TTVFKNQITNPAL STLSYQALYNLC
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GGNMAALTKQIG IKDTEINSLYEAE LITGQVIGYDSAD QILLIQVSYPSVS RVQGVRAVELLT VSVATPKGEGKA IAPSFIAQSNIIAE ELDTQPCKFSKT TLYCRQVNTRTL PVRVANCLKGKY NDCQYTTEIGAL ASRYVTITNGVV ANCRSIICRCLDP EGIVAQNSDAAIT VIDRSTCKLIQLG DITLRLEGKLSSS YSKNITIDISQVTT SGSLDISSELGSI NNTITKVEDLISK SNDWLSKVNPTL ISNDTIIALCVIAGI VVIWLVIITILSYYI LIKLKNVALLSTM PKKDLNPYVNNT KF
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto NC_0052 5277-6935 gb: MAASNGGVMYQ 2 33 83 NC_005283: SFLTIIILVIMTEG 5277-6935 | QIHWGNLSKIGIV Organismo: GTGSASYKVMT Morbilivírus RPNHQYLVIKLM de golfinho | PNVTMIDNCTRT Nome da EVTEYRKLLKTV cepa: LEPVKNALTVITK
UNKNOWN NIKPIQSLTTSRR - SKRFAGVVLAGV NC_005283 ALGVATAAQITA | Nome da GVALHQSIMNSQ proteína: SIDNLRTSLEKSN proteína de QAIEEIRQASQET fusão | VLAVQGVQDFIN Símbolo do NELIPSMHQLSC gene: F EMLGQKLGLKLL
RYYTEILSIFGPS LRDPVSAEISIQA LSYALGGDINKIL EKLGYSGADLLAI LESRGIKAKVTH VDLEGYFIVLSIA YPTLSEVKGVIV HKLEAVSYNLGS
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
QEWYTTLPKYVA TNGYLISNFDES SCAFMSEVTICS QNALYPMSPLLQ QCLRGSTASCA RSLVSGTIGNRFI LSKGNLIANCAS VLCKCYSTGTIIS QDPDKLLTFVAA DKCPLVEVDGITI QVGSREYPDSV YVSRIDLGPAISL EKLDVGTNLGSA LTKLDNAKDLLD SSNQILENVRRS SFGGAMYIGILV CAGALVILCVLVY CCRRHCRKRVQ TPPKATPGLKPD
LTGTTKSYVRSL NC_0053 5374-7602 gb: MSNYFPARVIIIV 2 34 39 NC_005339: SLITAVSCQISFQ 5374-7602 | NLSTIGVFKFKEY Organismo: DYRVSGDYNEQ
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto vírus FLAIKMVPNVTG Mossman | VENCTASLIDEY Nome da RHVIYNLLQPINT cepa: TLTASTSNVDPY
UNKNOWN AGNKKFFGAVIA - GVALGVATAAQV NC_005339 TAGVALYEARQN | Nome da AAAIAEIKESLHY proteína: THKAIESLQISQK proteína de QTVVAIQGIQDQI fusão | NTNIIPQINALTCE Símbolo do IANQRLRLMLLQ gene: F YYTEMLSSFGPII
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TAVQDREAPRFL LLQGNLIVNCMS VNCKCEDPEETI TQDPAYPLMVLG SDTCKIHYIDGIRI KLGKVQLPPITVL NTLSLGPIVVLNP IDVSNQLSLVETT VKESEDHLKNAI GALRSQSRVGG VGIVAIVGLIIATV SLVVLVISGCCLV KYFSRTATLESS LTTIEHGPTLAPK SGPIIPTYINPVY
RHD NC_0074 4635-6384 gb: MKPVALIYLTILAF 2 35 54 NC_007454: TVKVRSQLALSD 4635-6384 | LTKIGIIPAKSYEL Organismo: KISTQAAQQLMVI J-virus | KLIPNVNGLTNC Nome da TIPVMDSYKKML cepa: DRILKPIDDALNH
UNKNOWN VKNAIQDKQGDG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto - VPGVRFWGAIIG NC_007454 GVALGVATSAQI | Nome da TAGVALHNSIQN proteína: ANAILQLKESIRN proteína de SNKAIEELQAGL fusão | QSTVLVINALQD Símbolo do QINSQLVPAINTL gene: F GCSVIANTLGLR
LNQYFSEISLVFG PNLRDPTSQTLSI QAIAKAFNGDFD SMMKKMHYTDS DFLDLLESDSIRG RIISVSLEDYLIIIQI DYPGLTTIPNSV VQTFNLITYNYK GTEWESIFPREL LIRGSYISNIDISQ CVGTSKSMICKS DTSTTISPATWA CATGNLTSCART RVVNSHSTRFAL SGGVLFANCAPI ACRCQDPQYSIN QEPKTTNVMVTS
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
EDCKELYIDGFY LTLGKKMLDRAM YAEDVALGGSVS VDPIDIGNELNSI NESINKSHEYLD KANELLEQVNPN IVNVSSFSFILVISI LLIIWFIVTLVWLI YLTKHMNFIVGK VAMGSRSSTVN
SLSGFVG NC_0094 4620-6500 gb: MRSSLFLVLTLLV 2 36 89 NC_009489: PFAHSIDSITLEQ 4620-6500 | YGTVITSVRSLAY Organismo: FLETNPTYISVRL Vírus MPAIQTDSSHCS Mapuera | YHSIENYNLTLTK Nome da LLLPLQENLHQIT cepa: BeAnn DSLSSRRRKKRF 370284 | AGVAVGLAALGV Nome da ATAAQVTAAIAV proteína: VKAKENSAKIAQ proteína de LTSAISETNRAV fusão | QDLIEGSKQLAV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Símbolo do AVQAIQDQINNVI gene: F QPQLTNLSCQVA
DAQVGTILNMYL TELTTVFHPQITN SALTPITIQALRSL LGSTLPQVVTSTI KTDVPLQDLLTS GLLKGQIVYLDL QSMIMVVSVSVP TIALHSMAKVYTL KAISAHVNNAEV QMQVPSRVMEL GSEIMGYDIDQC EETSRYLFCPYN GGSILSATMKMC LNGNISQCVFTPI YGSFLQRFVLVD GVIVANCRDMTC ACKSPSKIITQPD SLPVTIIDSTSCS NLVLDTLELPIISI NNATYRPVQYV GPNQIIFSQPLDL LSQLGKINSSLS DAIEHLAKSDEIL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
EQIQWDSPQGY TLIALTSVLAFVV VAIVGLLISTRYLI FEIRRINTTLTQQ
LSSYVLSNKIIQY NC_0179 4534-6330 gb: MAEQEKTPLRYK 2 37 37 NC_017937: ILLIIIVINHYNITNV 4534-6330 | FGQIHLANLSSIG Organismo: VFVTKTLDYRTT vírus Nariva | SDPTEQLLVINM Nome da LPNISNIQDCAQ cepa: GVVNEYKHLISS
UNKNOWN LLTPINDTLDLITS - NINPYSGRNKLF NC_017937 GEIIAGAALTVAT | Nome da SAQITAGVALYE proteína: ARQNAKDIAAIKE proteína de SLGYAYKAIDKLT fusão | TATREITVVINEL Símbolo do QDQINNRLIPRIN gene: F DLACEVWATRL
QAMLLQYYAEIF SVIGPNLQDPLS GKISIQALARAAG
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GNIKLMVDELNY SGQDLSRLVKVG AIKGQIIDADPSL GVVIIKMRYPNIIK IPNVAISELSYVS YSSDGQDWITTG PNYIVTRGYSIAN IQTSSCSVGDDF VLCDRDMTYPM SQVTQDCLRGNI ALCSRMVVRDR EAPRYLILQGNM VANCMSITCRCE EPESEIYQSPDQ PLTLLTRDTCDT HVVDGIRIRLGV RKLPTISVINNITL GPIITTDPIDVSN QLNAVVSTIDQS AELLHQAQRVLS ERARGARDHILA TAAIVICVVLAVLI LVLLIGLVYLYRT QNEILVKTTMLE QVPTFAPKSFPM
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ESQIYSGKTNKG
YDPAE NC_0252 6865-8853 gb: MKKKTDNPTISK 2 38 56 NC_025256: RGHNHSRGIKSR 6865-8853 | ALLRETDNYSNG Organismo: LIVENLVRNCHH Paramixovír PSKNNLNYTKTQ us de KRDSTIPYRVEE morcego RKGHYPKIKHLID Eid_hel/GH- KSYKHIKRGKRR M74a/GHA/ NGHNGNIITIILLLI 2009 | Nome LILKTQMSEGAIH da cepa: YETLSKIGLIKGIT BatPV/Eid_h REYKVKGTPSSK el/GH- DIVIKLIPNVTGLN M74a/GHA/ KCTNISMENYKE 2009 | Nome QLDKILIPINNIIEL da proteína: YANSTKSAPGNA proteína de RFAGVIIAGVALG fusão | VAAAAQITAGIAL Símbolo do HEARQNAERINL gene: F LKDSISATNNAV
AELQEATGGIVN VITGMQDYINTNL
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VPQIDKLQCSQIK TALDISLSQYYSE ILTVFGPNLQNP VTTSMSIQAISQS FGGNIDLLLNLLG YTANDLLDLLES KSITGQITYINLEH YFMVIRVYYPIMT TISNAYVQELIKIS FNVDGSEWVSL VPSYILIRNSYLS NIDISECLITKNSV ICRHDFAMPMSY TLKECLTGDTEK CPREAVVTSYVP RFAISGGVIYANC LSTTCQCYQTGK VIAQDGSQTLMM IDNQTCSIVRIEEI LISTGKYLGSQE YNTMHVSVGNP VFTDKLDITSQIS NINQSIEQSKFYL DKSKAILDKINLN LIGSVPISILFIIAIL
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SLILSIITFVIVMIIV RRYNKYTPLINS DPSSRRSTIQDV YIIPNPGEHSIRS
AARSIDRDRD NC_0253 4471-6386 gb: MRVRPLIIILVLLV 2 39 47 NC_025347: LLWLNILPVIGLD 4471-6386 | NSKIAQAGIISAQ Organismo: EYAVNVYSQSNE Paramixovír AYIALRTVPYIPP us aviário 7 | HNLSCFQDLINT Nome da YNTTIQNIFSPIQ cepa: DQITSITSASTLP APMV- SSRFAGLVVGAI 7/dove/Tenn ALGVATSAQITA essee/4/75 | AVALTKAQQNAQ Nome da EIIRLRDSIQNTIN proteína: AVNDITVGLSSIG proteína de VALSKVQNYLND fusão | VINPALQNLSCQ Símbolo do VSALNLGIQLNLY gene: F LTEITTIFGPQITN
PSLTPLSIQALYT LAGDNLMQFLTR
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YGYGETSVSSIL ESGLISAQIVSFD KQTGIAILYVTLP SIATLSGSRVTKL MSVSVQTGVGE GSAIVPSYVIQQ GTVIEEFIPDSCIF TRSDVYCTQLYS KLLPDSILQCLQ GSMADCQFTRS LGSFANRFMTVA GGVIANCQTVLC RCYNPVMIIPQN NGIAVTLIDGSLC KELELEGIRLTMA DPVFASYSRDLII NGNQFAPSDAL DISSELGQLNNSI SSATDNLQKAQE SLNKSIIPAATSS WLIILLFVLVSISL VIGCISIYFIYKHS TTNRSRNLSSDII SNPYIQKAN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto NC_0253 4790-6570 gb: MAPCVLFLSSLL 2 40 48 NC_025348: LISTISPSHGINQ 4790-6570 | PALRRIGAIVSSV Organismo: KQLKFYSKTKPN vírus Tuhoko YIIVKLLPTINLSK 2 | Nome da SNCNLTSINRYK cepa: ESVIEIIKPLADNI
UNKNOWN DNLNQKLLPKNR - RKRMAGVAIGLA NC_025348 ALGVAAAAQATA | Nome da AVALVEARKNTQ proteína: MIQSLADSIQDT proteína de NAAVQAVNIGLQ fusão | NSAVAIQAIQNQI Símbolo do NNVINPALDRLN gene: F CEVLDAQIASILN
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ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
SSIYQFGGKQCV YGQFSAYCPFSD AVLMTQDLQLC MKGNIEHCIFSS VLGSFPNRFASV DGVFYANCKYM SCACSDPLQVIH QDDSVNLMVIDS SVCRSLTLGHVT FPIIAFSNVSYQM KTNISIEQMIVTS PLDLSTELKQINN SVNIANTFLDSS NRALKTSIFGTSS QIILIVLLIFTCLLIL YVIFLTYIIKILIKE VKRLRDGNSRT
GSKLSFINPDV NC_0253 4663-6428 gb: MLWLTILIALVGN 2 41 50 NC_025350: HESTCMNINFLQ 4663-6428 | SLGQINSQKRFL Organismo: NFYTQQPPSYM vírus Tuhoko VIRLVPTLQLSAN 3 | Nome da NCTLGSIVRYRN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto cepa: AIKELIQPMDENL
UNKNOWN RWLSSNLIPQRR - GKRFAGVAVGLA NC_025350 ALGVAVAAQATA | Nome da AVALVEARANAE proteína: KIASMSQSIQET proteína de NKAVTSLSQAVS fusão | ASGIAIQAIQNEIN Símbolo do NVIHPILNQVQC gene: F DVLDARVGNILN
LYLIKVTTIFQNQ LTNPALQRLSTQ ALSMLMQSTSSY LRNLSSSESAINA DLSMTNLIEAQIV GINMTNLQLVLA VFIPSIARLNGAL LYDFISITISSNQT EVMLQIPHRVLEI GNSLYTFEGTQC EMTKLNAYCLYS DAIPVTESLRDC MNGLFSQCGFV RIIGSFANRFASV NGVIYANCKHLT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
CSCLQPDEIITQD TNVPLTIIDTKRC TKISLGHLTFTIR EYANVTYSLRTEI ANSQITVVSPLDL SSQLTTINNSLAD ATNHIMNSDRILD RLNSGLYSKWVII FLICASIVSLIGLV FLGFLIRGLILELR SKHRSNLNKAST
YSIDSSIGLT NC_0253 5950-8712 gb: MALNKNMFSSLF 2 42 52 NC_025352: LGYLLVYATTVQ 5950-8712 | SSIHYDSLSKVG Organismo: VIKGLTYNYKIKG Vírus SPSTKLMVVKLIP Mojiang | NIDSVKNCTQKQ Nome da YDEYKNLVRKAL cepa: EPVKMAIDTMLN Tongguan1 | NVKSGNNKYRF Nome da AGAIMAGVALGV proteína: ATAATVTAGIALH proteína de RSNENAQAIANM
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto fusão | KSAIQNTNEAVK Símbolo do QLQLANKQTLAV gene: F IDTIRGEINNNIIP
VINQLSCDTIGLS VGIRLTQYYSEIIT AFGPALQNPVNT RITIQAISSVFNG NFDELLKIMGYT SGDLYEILHSELI RGNIIDVDVDAG YIALEIEFPNLTLV PNAVVQELMPIS YNIDGDEWVTLV PRFVLTRTTLLS NIDTSRCTITDSS VICDNDYALPMS HELIGCLQGDTS KCAREKVVSSYV PKFALSDGLVYA NCLNTICRCMDT DTPISQSLGATV SLLDNKRCSVYQ VGDVLISVGSYL GDGEYNADNVE LGPPIVIDKIDIGN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
QLAGINQTLQEA EDYIEKSEEFLK GVNPSIITLGSMV VLYIFMILIAIVSVI ALVLSIKLTVKGN VVRQQFTYTQH
VPSMENINYVSH NC_0253 4622-6262 gb: MAIPVPSSTALMI 2 43 63 NC_025363: FNILVSLAPASAL 4622-6262 | DGRLLLGAGIVP Organismo: TGDRQVNVYTS Paramixovír SQTGIIALKLLPN us aviário 12 LPKDKENCAEVS | Nome da IRSYNETLTRILT cepa: PLAQSMAAIRGN Wigeon/Itáli STVSTRGREPRL a/3920_1/20 VGAIIGGVALGVA 05 | Nome TAAQITAATALIQ da proteína: ANQNAENIARLA proteína de KGLAATNEAVTD fusão | LTKGVGSLAIGV Símbolo do GKLQDYVNEQF gene: F NRTGEAIECLTIE
SRVGVQLSLYLT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
EVIGVFGDQITSP ALSDISIQALYNL AGGNLNVLLQK MGIEGTQLGSLI NSGLIKGRPIMY DDGNKILGIQVTL PSVGRINGARAT LLEAIAVATPKGN ASPLIPRAVISVG SLVEELDMTPCV LTPTDIFCTRILSY PLSDSLTTCLKG NLSSCVFSRTEG ALSTPYVSVHGK IVANCKSVVCRC VEPQQIISQNYG EALSLIDESLCRIL ELNGVILKMDGQ FTSEYTKNITIDP VQVIISGPIDISSE LSQVNQSLDSAL ENIKESNSYLSK VNVKLISSSAMIT YIVITVICLILTFVA LVLGIYSYTKIRS
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
QQKTLIWMGNNI
ARSKEGNRF NC_0253 4617-6582 gb: MASPMVPLLIITV 2 44 73 NC_025373: VPALISSQSANID 4617-6582 | KLIQAGIIMGSGK Organismo: ELHIYQESGSLD Paramixovír LYLRLLPVIPSNL us aviário 3 | SHCQSEVITQYN Nome da STVTRLLSPIAKN cepa: LNHLLQPRPSGR turkey/Wisc LFGAVIGSIALGV onsin/68 | ATSAQISAAIALV Nome da RAQQNANDILAL proteína: KAAIQSSNEAIKQ proteína de LTYGQEKQLLAIS fusão | KIQKAVNEQVIPA Símbolo do LTALDCAVLGNK gene: F LAAQLNLYLIEMT
TIFGDQINNPVLT PIPLSYLLRLTGS ELNDVLLQQTRS SLSLIHLVSKGLL SGQIIGYDPSVQ GIIIRIGLIRTQRID
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
RSLVFXPYVLPITI SSNIATPIIPDCVV KKGVIIEGMLKSN CIELERDIICKTIN TYQITKETRACL QGNITMCKYQQ SRTQLSTPFITYN GVVIANCDLVSC RCIRPPMIITQVK GYPLTIINRNLCT ELSVDNLILNIET NHNFSLNPTIIDS QSRLIATSPLEID ALIQDAQHHAAA ALLKVEESNAHL LRVTGLGSSSW HIILILTLLVCTIAW LIGLSIYVCRIKND DSTDKEPTTQSS NRGIGVGSIQYM
T NC_0253 5548-7206 gb: MNPLNQTLIAKV 2 45 86 NC_025386: LGFLLLSSSFTV 5548-7206 | GQIGFENLTRIGV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto Organismo: HQVKQYGYKLA Vírus Salem HYNSHQLLLIRMI | Nome da PTVNGTHNCTH cepa: QVITRYREMVRE
UNKNOWN IITPIKGALDIMKK - AVSPDLVGARIF NC_025386 GAIVAGAALGIAT | Nome da SAQITAGVALHR proteína: TKLNGQEISKLK proteína de EAVSLTNEAVEQ fusão | LQYSQGKSILAIQ Símbolo do GIQDFINFNVVPL gene: F LEEHTCGIAKLHL
EMALMEYFQKLI LVFGPNLRDPIG STIGIQALATLFQ NNMFEVSLRLGY AGDDLEDVLQSN SIRANIIEAEPDS GFIVLAIRYPTLTL VEDQVITELAHIT FNDGPQEWVATI PQFVTYRGLVLA NIDVSTCTFTER NVICARDQTYPM
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
IIDLQLCMRGNIA KCGRTRVTGSTA SRFLLKDGNMYA NCIATMCRCMSS SSIINQEPSHLTT LIVKETCSEVMID TIRITLGERKHPPI DYQTTITLGQPIA LAPLDVGTELAN AVSYLNKSKVLL EHSNEVLSSVST AHTSLTATIVLGI VVGGLAILIVVMF LFLEAQVIKVQR AMMLCPITNHGY LPNEDLLTRGHSI
PTIG NC_0253 4805-6460 gb: MGYFHLLLILTAI 2 46 90 NC_025390: AISAHLCYTTTLD 4805-6460 | GRKLLGAGIVITE Organismo: EKQVRVYTAAQS Paramixovír GTIVLRSFRVVSL us aviário 9 | DRYSCMESTIES Nome da YNKTVYNILAPLG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto cepa: DAIRRIQASGVS pato/Nova VERIREGRIFGAI York/22/197 LGGVALGVATAA 8 | Nome da QITAAIALIQANE proteína: NAKNILRIKDSITK proteína de TNEAVRDVTNGV fusão | SQLTIAVGKLQD Símbolo do FVNKEFNKTTEAI gene: F NCVQAAQQLGV
ELSLYLTEITTVF GPQITSPALSKLT IQALYNLAGVSL DVLLGRLGADNS QLSSLVSSGLITG QPILYDSESQILA LQVSLPSISDLR GVRATYLDTLAV NTAAGLASAMIP KVVIQSNNIVEEL DTTACIAAEADLY CTRITTFPIASAV SACILGDVSQCL YSKTNGVLTTPY VAVKGKIVANCK HVTCRCVDPTSII
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
SQNYGEAATLID DQLCKVINLDGV SIQLSGTFESTYV RNVSISANKVIVS SSIDISNELENVN SSLSSALEKLDE SDAALSKVNVHL TSTSAMATYIVLT VIALILGFVGLGL GCFAMIKVKSQA KTLLWLGAHADR SYILQSKPAQSS
T NC_0254 4826-6649 gb: MWIMIILSLFQIIP 2 47 03 NC_025403: GVTPINSKVLTQL 4826-6649 | GVITKHTRQLKF Organismo: YSHSTPSYLVVK vírus LVPTINTESTVCN Achimota 1 | FTSLSRYKDSVR Nome da ELITPLAKNIDNL cepa: NSILTIPKRRKRM
UNKNOWN AGVVIGLAALGV - AAAAQATAAVALI NC_025403 EAKKNTEQIQAL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto | Nome da SESIQNTNKAVS proteína: SIEKGLSSAAIAV proteína de QAIQNQINNVINP fusão | ALTALDCGVTDA Símbolo do QLGNILNLYLIKTL gene: F TVFQKQITNPAL
QPLSIQALNIIMQ ETSSVLRNFTKT DEIEHTDLLTSGL ITGQVVGVNLTN LQLIIAAFIPSIAPL NQAYILDFIRITVN INNSESMIQIPERI MEHGISLYQFGG DQCTFSDWSAY CPYSDATLMAPG LQNCFRGQAAD CVFSTVMGSFPN RFVSVQGVFYVN CKFIRCACTQPQ RLITQDDSLSLTQ IDAKTCRMLTLG FVQFSINEYANV TYSFKNNVTAGQ LIMTNPIDLSTEIK
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
QMNDSVDEAAR YIEKSNAALNKL MYGGRSDIVTTV LLVGFILLVVYVIF VTYILKILMKEVA RLRNSNHPDLIK
PYNYPM NC_0254 4772-6647 gb: MLNSFYQIICLAV 2 48 04 NC_025404: CLTTYTVISIDQH 4772-6647 | NLLKAGVIVKSIK Organismo: GLNFYSRGQAN vírus YIIVKLIPNVNVTD Achimota 2 | TDCDIGSIKRYNE Nome da TVYSLIKPLADNI cepa: DYLRTQFAPTKR
UNKNOWN KKRFAGVAIGLT - ALGVATAAQVTA NC_025404 AVALVKAQENAR | Nome da KLDALADSIQAT proteína: NEAVQDLSTGLQ proteína de AGAIAIQAIQSEIN fusão | HVINPALERLSC Símbolo do EIIDTRVASILNLY gene: F LIRLTTVFHRQLV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
NPALTPLSIQALN HLLQGETEGLVK NESKMTDSKIDL LMSGLITGQVVG VNIKHMQLMIAV FVPTTAQLPNAY VINLLTITANINNS EVLVQLPNQILE RSGIIYQFRGKD CVSSPNHMYCP YSDASILSPELQL CLQGRLEMCLFT QVVGSFPTRFAS DKGIVYANCRHL QCACSEPEGIIY QDDTSAITQIDAS KCSTLKLDMLTF KLSTYANKTFDA SFSVGKDQMLVT NLLDLSAELKTM NASVAHANKLID KSNLLIQSNALIG HSNTIFIVVIVILA VMVLYLIIVTYIIK VIMVEVSRLKRM
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
NIYSIDK NC_0254 4958-6751 gb: MVTIIKPLILLVTVI 2 49 10 NC_025410: LQISGHIDTTALT 4958-6751 | SIGAVIASSKEIM Organismo: YYAQSTPNYIVIK vírus Tuhoko LIPNLPNIPSQCN 1 | Nome da FSSIAYYNKTLLD cepa: LFTPISDNINMLH
UNKNOWN QRLSNTGRNRR - FAGVAIGLAALG NC_025410 VATAAQVTAAFA | Nome da LVEAKSNTAKIA proteína: QIGQAIQNTNAAI proteína de NSLNAGIGGAVT fusão | AIQAIQTQINGIIT Símbolo do DQINAATCTALD gene: F AQIGTLLNMYLL
QLTTTFQPQIQN PALQPLSIQALH RIMQGTSIVLSNL TDSSKYGLNDAL SAGLITGQIVSVD LRLMQITIAANVP TLSRLENAIAHDI
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
MRITTNVNNTEVI VQLPETIMEHAG RLYQFNKDHCLS STQRFFCPYSDA KLLTSKISSCLSG IRGDCIFSPVVG NFATRFISVKGVII ANCKFIRCTCLQ PEGIISQLDDHTL TVIDLKLCNKLDL GLIQFDLQVLSNI SYEMTLNTSQN QLILTDPLDLSSE LQTMNQSINNAA NFIEKSNSLLNSS TYEFNRSVALLV ALILLSLTILYVIVL TCVVKLLVHEVS KNRRHIQDLESH
HK NC_0282 4850-7055 gb: MTRVKKLPVPTN 2 50 49 NC_028249: PPMHHSLDSPFL 4850-7055 | NPEHATGKISITD Organismo: DTSSQLTNFLYH
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto vírus da KYHKTTINHLSRT cinomose ISGTDPPSAKLN focina | KFGSPILSTYQIR Nome da SALWWIAMVILV cepa: HCVMGQIHWTN PDV/Wadde LSTIGIIGTDSSHY n_Sea.NLD/ KIMTRSSHQYLV 1988 | Nome LKLMPNVSIIDNC da proteína: TKAELDEYEKLL proteína de NSVLEPINQALTL fusão | MTKNVKSLQSLG Símbolo do SGRRQRRFAGV gene: F VIAGAALGVATA
AQITAGVALYQS NLNAQAIQSLRA SLEQSNKAIDEV RQASQNIIIAVQG VQDYVNNEIVPA LQHMSCELIGQR LGLKLLRYYTELL SVFGPSLRDPVS AEISIQALSYALG GEIHKILEKLGYS GNDMVAILETKGI RAKITHVDLSGK
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
FIVLSISYPTLSEV KGVVVHRLEAVS YNIGSQEWYTTV PRYVATNGYLIS NFDESSCVFVSE SAICSQNSLYPM SPILQQCLRGET ASCARTLVSGTL GNKFILSKGNIIA NCASILCKCHST SKIINQSPDKLLT FIASDTCSLVEID GVTIQVGSRQYP DVVYASKVILGP AISLERLDVGTNL GSALKKLNDAKV LIESSDQILDTVK NSYLSLGTLIALP VSIGLGLILLLLIC CCKKRYQHLFS QSTKVAPVFKPD
LTGTSKSYVRSL NC_0283 5217-6842 gb: MIKKIICIFSMPILL 2 51 62 NC_028362: SFCQVDIIKLQRV
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 5217-6842 | GILVSKPKSIKISQ Organismo: NFETRYLVLNLIP vírus da NIENAQSCGDQ parainfluenz QIKQYKKLLDRLII a caprina 3 | PLYDGLRLQQDII Nome da VVDNNLKNNTNH cepa: RAKRFFGEIIGTI JS2013 | ALGVATSAQITA Nome da AVALVEAKQARS proteína: DIERVKNAVRDT proteína de NKAVQSIQGSVG fusão | NLIVAVKSVQDY Símbolo do VNNEIVPSIKRLG gene: F CEAAGLQLGIAL
TQHYSELTNIFG DNIGTLKEKGIKL QGIASLYHTNITEI FTTSTVDQYDIY DLLFTESIKMRVI DVDLNDYSITLQ VRLPLLTKISDAQ IYNVDSVSYNIG GTEWYIPLPRNI MTKGAFLGGANL QDCIESFSDYICP
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
SDPGFILNRDIEN CLSGNITQCPKT LVISDIVPRYAFV DGGVIANCLSTT CTCNGIDNRINQ APDQGIKIITYKD CQTIGINGMLFKT NQEGTLAAYTPV DITLNNSVNLDPI DLSIELNRARSDL AESKEWIKRSEA KLDSVGSWYQS STTEIIQIVMIIVLFI INIIVLIVLIKYSRS QNQSMNNHMNE
PYILTNKVQ AF07978 5919-7580 gb: MASLLKTICYIYLI 1 52 0 AF079780 | TYAKLEPTPKSQ Organismo: LDLDSLASIGVVD Tupaia AGKYNYKLMTTG paramixovír SEKLMVIKLVPNI us | Nome TYATNCNLTAHT da cepa: AYTKMIERLLTPI
UNKNOWN NQSLYEMRSVIT
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto -AF079780 | ERDGGTIFWGAII Nome da AGAALGVATAAA proteína: ITAGVALHRAEQ proteína de NARNIAALKDAL fusão | RNSNEAIQHLKD Símbolo do AQGHTVLAIQGL gene: F QEQINNNIIPKLK
ESHCLGVNNQL GLLLNQYYSEILT VFGPNLQNPVSA SLTIQAIAKAFNG DFNSLMTNLNYD PTDLLDILESNSI NGRIIDVNLNEKY IALSIEIPNFITLTD AKIQTFNRITYGY GSNEWLTLIPDNI LEYGNLISNVDLT SCVKTKSSYICN QDTSYPISSELT RCLRGDTSSCP RTPVVNSRAPTF ALSGGHIYANCA KAACRCEKPPM AIVQPATSTLTFL
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
TEKECQEVVIDQI NIQLAPNRLNKTII TDGIDLGPEVIIN PIDVSAELGNIEL EMDKTQKALDR SNKILDSMITEVT PDKLLIAMIVVFGI LLLWLFGVSYYA FKIWSKLHFLDS YVYSLRNPSHHR SNGHQNHSFST
DISG EU40308 4664-6585 gb: MQPGSALHLPHL 1 53 5 EU403085: YIIIALVSDGTLGQ 4664-6585 | TAKIDRLIQAGIVL Organismo: GSGKELHISQDS Paramixovír GTLDLFVRLLPVL us aviário 3 | PSNLSHCQLEAI Nome da TQYNKTVTRLLA cepa: PIGKNLEQVLQA APMV3/PKT RPRGRLFGPIIGS /Netherland/ IALGVATSAQITA 449/75 | AIALVRAQQNAN Nome da DILALKNALQSSN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto proteína: EAIRQLTYGQDK proteína de QLLAISKIQKAVN fusão | EQILPALDQLDC Símbolo do AVLGTKLAVQLN gene: F LYLIEMTTIFGEQI
NNPVLATIPLSYIL RLTGAELNNVLM KQARSSLSLVQL VSKGLLSGQVIG YDPSVQGLIIRVN LMRTQKIDRALV YQPYVLPITLNSN IVTPIAPECVIQK GTIIEGMSRKDC TELEQDIICRTVT TYTLARDTRLCL QGNISSCRYQQS GTQLHTPFITYN GAVIANCDLVSC RCLRPPMIITQVK GYPLTIITRSVCQ ELSVDNLVLNIET HHNFSLNPTIIDP LTRVIATTPLEIDS LIQEAQDHANAA
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
LAKVEESDKYLR AVTGGNYSNWYI VLVIVLLFGNLG WSLLLTVLLCRS RKQQRRYQQDD SVGSERGVGVG
TIQYMS KX25820 4443-6068 gb: MEKGTVLFLAAL 1 54 0 KX258200: TLYNVKALDNTK 4443-6068 | LLGAGIASGKEH Organismo: ELKIYQSSVNGYI paramixovír AVKLIPFLPSTKR us aviário 14 ECYNEQLKNYNA | Nome da TINRLMGPINDNI cepa: KLVLSGVKTRTR APMV14/du EGKLIGAIIGTAAL ck/Japan/11 GLATAAQVTAAI OG0352/20 ALEQAQDNARAI 11 | Nome LTLKESIRNTNNA da proteína: VSELKTGLSEVSI proteína de ALSKTQDYINTQI fusão | MPALSNLSCEIV Símbolo do GLKIGIQLSQYLT gene: F EVTAVFGNQITN
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
PALQPLSMQALY QLCGGDFSLLLD KIGADRNELESL YEANLVTGRIVQ YDTADQLVIIQVS IPSVSTLSGYRVT ELQSISVDMDHG EGKAVIPRYIVTS GRVIEEMDISPC VLTATAVYCNRL LTTSLPESVLKCL DGDHSSCTYTS NSGVLETRYIAF DGMLIANCRSIV CKCLDPPYIIPQN KGKPLTIISKEVC KKVTLDGITLLID AEFTGEYGLNITI GPDQFAPSGAL DISTELGKLNNSI NKAEDYIDKSNE LLNRVNVDIVND TAVIVLCVMSALV VVWCIGLTVGLIY VSKNTLRAVAIK
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GTSIENPYVSSG
KHAKNSS KY51104 4592-6247 gb: MIFTMYHVTVLLL 1 55 4 KY511044: LSLLTLPLGIQLA 4592-6247 | RASIDGRQLAAA Organismo: GIVVTGEKAINLY Paramixovír TSSQTGTIVVKLL us aviário PNVPQGREACM UPO216 | RDPLTSYNKTLT Nome da SLLSPLGEAIRRI cepa: HESTTETAGLVQ APMV- ARLVGAIIGSVAL 15/WB/Kr/U GVATSAQITAAA PO216/2014 ALIQANKNAENIL | Nome da KLKQSIAATNEA proteína: VHEVTDGLSQLA proteína de VAVGKMQDFINT fusão | QFNNTAQEIDCI Símbolo do RISQQLGVELNL gene: F YLTELTTVFGPQI
TSPALSPLSIQAL YNLAGGNLDVLL SKIGVGNNQLSA LISSGLISGSPILY
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
DSQTQLLGIQVT LPSVSSLNNMRA IFLETLSVSTDKG FAAALIPKVVTTV GTVTEELDTSYCI ETDIDLFCTRIVT FPMSPGIYACLN GNTSECMYSKT QGALTTPYMSVK GSIVANCKMTTC RCADPASIISQNY GEAVSLIDSSVC RVITLDGVTLRLS GSFDSTYQKNITI RDSQVIITGSLDI STELGNVNNSIN NALDKIEESNQIL ESVNVSLTSTNA LIVYIICTALALICG ITGLILSCYIMYK MRSQQKTLMWL GNNTLDQMRAQ
TKM NC_0253 6104-8123 gb: MDGPKFRFVLLIL 1 56
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto 60 NC_025360: LTAPARGQVDYD 6104-8123 | KLLKVGIFEKGTA Organismo: NLKISVSSQQRY Paramixovír MVIKMMPNLGP us do MNQCGIKEVNLY salmão do KESILRLITPISTT Atlântico | LNYIKSEIQVERE Nome da VALQPNGTIVRF cepa: FGLIVAAGALTLA ASPV/Yrkje TSAQITAGIALHN 371/95 | SLENAKAIKGLTD Nome da AIKESNLAIQKIQ proteína: DATAGTVIALNAL proteína de QDQVNTNIIPAIN fusão | TLGCTAAGNTLG Símbolo do IALTRYYSELIMIF gene: F GPSLGNPVEAPL
TIQALAGAFNGD LHGMIREYGYTP SDIEDILRTNSVT GRVIDVDLVGMN IVLEINLPTLYTLR DTKIVNLGKITYN VDGSEWQTLVP EWLAIRNTLMGG
ID de Nucleotíde Nome Sequência Nº de SEQ Genbank os de CDS Completo do Sequência ID Gene s/ NO Agrupame nto
VDLSRCVVSSRD LICKQDPVFSLDT SIISCLNGNTESC PRNRVVNSVAP RYAVIRGNILANC ISTTCLCGDPGV PIIQKGDNTLTAM SINDCKLVGVDG YVFRPGPKAVNV TFNLPHLNLGPE VNVNPVDISGAL GKVEQDLASSR DHLAKSEKILSGI NPNIINTEMVLVA VILSLVCAMVVIGI VCWLSILTKWVR SCRADCRRPNK GPDLGPIMSSQD NLSF
[0610] Em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos da Tabela 5, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência identidade com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer sequência de aminoácidos da Tabela 5. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico descrita neste documento codifica uma sequência de aminoácidos da Tabela 5 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento.
[0611] Em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 57 a 132, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, em algumas modalidades, um fusogênio descrito neste documento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 57 a
132. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico descrita neste documento codifica uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 57 a 132, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma porção da sequência, por exemplo, uma porção de 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 aminoácidos de comprimento.
[0612] Tabela 5. Agrupamentos de sequências de proteína G, H e HN de paramixovírus. Coluna 1, Genbank ID inclui a ID de Genbank de toda a sequência do genoma do vírus que é a sequência centroide do agrupamento. Coluna 2, Nucleotídeos de CDS fornece os nucleotídeos correspondentes ao CDS do gene em todo o genoma. A coluna 3, Nome completo do gene, fornece o nome completo do gene, incluindo ID de Genbank, espécie de vírus, cepa e nome da proteína. A coluna 4, Sequência, fornece a sequência de aminoácidos do gene. A coluna 5, nº de Sequências/Agrupamento, fornece o número de sequências que se agrupam com esta sequência centroide. ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento KU950 4643- gb: MSKTKDQRTAKTLE 706 57 686 5638 KU950686: RTWDTLNHLLFISS 4643-5638 | CLYKLNLKSIAQITL Organismo: SILAMIISTSLIIAAIIFI Vírus ASANHKVTLTTAIIQ sincicial DATNQIKNTTPTYLT respiratório QNPQLGISFSNLSG humano | TTLQSTTILASTTPS Nome da AESTPQSTTVKIINT cepa: TTTQILPSKPTTKQR RSVA/Hom QNKPQNKPNNDFH
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento o FEVFNFVPCSICSN sapiens/US NPTCWAICKRIPNK A/TH_1050 KPGKKTTTKPTKKP 6/2014 | TLKTTKKDPKPQTT Nome da KPKEALTTKPTGKP proteína: TINTTKTNIRTTLLTS glicoproteín NTKGNPEHTSQEET a de fixação LHSTTSEGYLSPSQ | Símbolo do VYTTSGQEETLHST gene: G TSEGYLSPSQVYTT
SEYLSQSLSSSNTT
K AB524 6424- gb: MERGVSQVALEND 418 58 405 8274 AB524405: EREAKNTWRLVFR 6424-8274 | VTVLFLTIVTLAISAA Organismo: ALAFSMNASTPQDL vírus da EGIPVAISKVEDKIT doença de SALGASQDVMDRIY Newcastle | KQVALESPLALLNT Nome da ESTIMNALTSLSYQI cepa: NGAANASGCGAPV Goose/Alas PDPDYIGGIGKELIV ka/415/91 | DDTSDVTSFYPSAF Nome da QEHLNFIPAPTTGS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento proteína: GCTRIPSFDMSATH proteína YCYTHNVILSGCRD hemaglutini HSHSHQYLALGVLR na- TSATGRVFFSTLRSI neuraminida NLDDTQNRKSCSV se | Símbolo SATPLGCDMLCSKV do gene: HN TETEEEDYQSTDPT
LMVHGRLGFDGQY HERDLDVHTLFGD WVANYPGVGGGSF INNRVWFPVYGGLK PGSPTDKRQEGQY AIYKRYNDTCPDDQ EYQVRMAKSAYKP NRFGGKRVQQAILS IGVSTTLADDPVLTV TSNTITLMGAEGRV MTVGTSHYLYQRG SSYYSPAILYPLTIA NKTATLQDPYKFNA FTRPGSVPCQASA RCPNSCVTGVYTD PYPIVFHKNHTLRG VFGTMLDDEQARL NPVSAVFDSIARSR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
VTRVSSSSTKAAYT TSTCFKVVKTGKVY CLSIAEISNTLFGEF RIVPLLVEILRDEGR SEARSALTTQGHPG WNDEVVDPIFCAVT NQTDHRQKLEEYA
QSWP JQ5828 4686- gb: MSKNKNQRTARTL 278 59 44 5636 JQ582844: EKTWDTLNHLIVISS 4686-5636 | CLYKLNLKSIAQIAL Organismo: SVLAMIISTSLIIAAIIF Vírus IISANHKVTLTTVTV sincicial QTIKNHTEKNITTYL respiratório TQVSPERVSPSKQ humano | PTTTPPIHTNSATIS Nome da PNTKSETHHTTAQT cepa: KGRTTTPTQNNKPS NH1067 | TKPRPKNPPKKPKD Nome da DYHFEVFNFVPCSI proteína: CGNNQLCKSICKTIP glicoproteín NNKPKKKPTTKPTN a de ligação KPPTKTTNKRDPKT ao receptor | PAKTLKKETTINPTT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Símbolo do KKPTPKTTERDTST gene: G PQSTVLDTTTSKHT
ERDTSTPQSTVLDT TTSKHTIQQQSLHSI TPENTPNSTQTPTA
SEPSTSNSTQKL AB254 7271- gb: MSPHRDRINAFYRD 128 60 456 9136 AB254456: NPHPKGSRIVINRE 7271-9136 | HLMIDRPYVLLAVLF Organismo: VMFLSLIGLLAIAGIR Vírus do LHRAAIYTAEIHKSL sarampo | STNLDVTNSIEHQV Nome da KDVLTPLFKIIGDEV cepa: GLRTPQRFTDLVKFI SSPE- SDKIKFLNPDREYD Kobe-1 | FRDLTWCINPPERIK Nome da LDYDQYCADVAAE proteína: ELMNALVNSTLLEA Hemaglutini RATNQFLAVSKGNC na | Símbolo SGPTTIRGQFSNMS do gene: H LSLLDLYLSRGYNV
SSIVTMTSQGMYG GTYLVGKPNLSSKG SELSQLSMHRVFEV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GVIRNPGLGAPVFH MTNYFEQPVSNDF SNCMVALGELRFAA LCHREDSVTVPYQ GSGKGVSFQLVKL GVWKSPTDMQSW VPLSTDDPVIDRLYL SSHRGVIADNQAK WAVPTTRTDDKLR METCFQQACKGKN QALCENPEWAPLK DNRIPSYGVLSVNL SLTVELKIKIASGFG PLITHGSGMDLYKT NHDNVYWLTIPPMK NLALGVINTLEWIPR FKVSPNLFTVPIKEA GEDCHAPTYLPAEV DGDVKLSSNLVILP GQDLQYVLATYDTS RVEHAVVYYVYSPS RSFSYFYPFRLPIKG VPIELQVECFTWDQ KLWCRHFCVLADS ESGGHITHSGMVG
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
MGVSCTVTREDGT
NRRQGCQ AB040 6614- gb: MEPSKLFTMSDNAT 87 61 874 8362 AB040874: FAPGPVINAADKKT 6614-8362 | FRTCFRILVLSVQAV Organismo: TLILVIVTLGELVRMI Vírus da NDQGLSNQLSSIAD caxumba | KIRESATMIASAVGV Nome da MNQVIHGVTVSLPL cepa: QIEGNQNQLLSTLA Miyahara | TICTGKKQVSNCST Nome da NIPLVNDLRFINGIN proteína: KFIIEDYATHDFSIG hemaglutini HPLNMPSFIPTATS na- PNGCTRIPSFSLGK neuraminida THWCYTHNVINANC se | Símbolo KDHTSSNQYISMGI do gene: HN LVQTASGYPMFKTL
KIQYLSDGLNRKSC SIATVPDGCAMYCY VSTQLETDDYAGSS PPTQKLTLLFYNDT VTERTISPTGLEGN WATLVPGVGSGIYF
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ENKLIFPAYGGVLP NSSLGVKSAREFFR PVNPYNPCSGPQQ DLDQRALRSYFPSY FSNRRVQSAFLVCA WNQILVTNCELVVP SNNQTLMGAEGRV LLINNRLLYYQRSTS WWPYELLYEISFTF TNSGQSSVNMSWI PIYSFTRPGSGNCS GENVCPTACVSGV YLDPWPLTPYSHQ SGINRNFYFTGALL NSSTTRVNPTLYVS ALNNLKVLAPYGNQ GLFASYTTTTCFQD TGDASVYCVYIMEL ASNIVGEFQILPVLT
RLTIT AB736 6709- gb: MEYWKHTNHGKDA 78 62 166 8427 AB736166: GNELETATATHGNR 6709-8427 | LTNKITYILWTITLVL Organismo: LSIVFIIVLINSIKSEK
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Respirovíru AHESLLQDINNEFM s humano 3 | EVTEKIQVASDNTN Nome da DLIQSGVNTRLLTIQ cepa: SHVQNYIPISLTQQI ZMLS/2011 SDLRKFISEITIRND | Nome da NQEVPPQRITHDVG proteína: IKPLNPDDFWRCTS hemaglutini GLPSLMRTPKIRLM na- PGPGLLAMPTTVDG neuraminida CVRTPSLVINDLIYA se | Símbolo YTSNLITRGCQDIGK do gene: HN SYQVLQIGIITVNSD
LVPDLNPRISHTFNI NDNRKSCSLALLNT DVYQLCSTPKVDER SDYASSGIEDIVLDI VNYDGSISTTRFKN NNISFDQPYAALYP SVGPGIYYKGKIIFL GYGGLEHPINENAI CNTTGCPGKTQRD CNQASHSPWFSDR RMVNSIIVVDKGLN SVPKLKVWTISMRQ NYWGSEGRLLLLG
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NKIYIYTRSTSWHSK LQLGIIDITDYSDIRIK WTWHNVLSRPGNN ECPWGHSCPDGCI TGVYTDAYPLNPTG SIVSSVILDSQKSRV NPVITYSTATERVN ELAIRNKTLSAGYTT TSCITHYNKGYCFHI VEINHKSLNTFQPM
LFKTEIPKSCS KJ6273 6166- gb: MEVKVENIRAIDML 71 63 96 6885 KJ627396: KARVKNRVARSKCF 6166-6885 | KNASLILIGITTLSIAL Organismo: NIYLIINYTIQKTTSE metapneum SEHHTSSPPTESNK ovírus ETSTIPIDNPDITPNS humano | QHPTQQSTESLTLY Nome da PASSMSPSETEPAS cepa: TPGITNRLSLADRST HMPV/Hom TQPSESRTKTNSTV o HKKNKKNISSTISRT sapiens/PE QSPPRTTAKAVSRT R/FLI1305/2 TALRMSSTGERPTT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento 010/A | TSVQSDSSTTAQNH Nome da EETGPANPQASVST proteína: M glicoproteín a G de fixação | Símbolo do gene: G AB475 7079- gb: MLSYQDKVGAFYK 45 64 097 8902 AB475097: DNARANSSKLSLVT 7079-8902 | EEQGGRRPPYLLFV Organismo: LLILLVGILALLAIAG Vírus da VRFRQVSTSNVEFG cinomose RLLKDDLEKSEAVH canina | HQVMDVLTPLFKIIG Nome da DEIGLRLPQKLNEIK cepa: QFILQKTNFFNPNR M25CR | EFDFRDLHWCINPP Nome da SKIKVNFTNYCDAIG proteína: VRKSIASAANPILLS hemaglutini ALSGGRGDIFPPYR na | Símbolo CSGATTSVGRVFPL do gene: H SVSLSMSLISKTSEII
SMLTAISDGVYGKT
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YLLVPDYIEREFDT QKIRVFEIGFIKRWL NDMPLLQTTNYMVL PENSKAKVCTIAVG ELTLASLCVDESTV LLYHDSNGSQDSIL VVTLGIFGATPMNQ VEEVIPVAHPSVERI HITNHRGFIKDSVAT WMVPALVSEQQEG QKNCLESACQRKS YPMCNQTSWEPFG GVQLPSYGRLTLPL DASIDLQLNISFTYG PVILNGDGMDYYEN PLLDSGWLTIPPKN GTILGLINKASRGDQ FTVTPHVLTFAPRE SSGNCYLPIQTSQI MDKDVLTESNLVVL PTQNFRYVVATYDI SRENHAIVYYVYDPI RTISYTYPFRLTTKG RPDFLRIECFVWDD DLWCHQFYRFESDI
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TNSTTSVEDLVRIRF
SCNRSKP AJ8496 7326- gb: MSAQRERINAFYKD 34 65 36 9155 AJ849636: NPHNKNHRVILDRE 7326-9155 | RLVIERPYILLGVLL Organismo: VMFLSLIGLLAIAGIR Vírus Peste- LHRATVGTSEIQSR des-petits- LNTNIELTESIDHQT ruminants | KDVLTPLFKIIGDEV Nome da GIRIPQKFSDLVKFI cepa: SDKIKFLNPDREYD Turkey 2000 FRDLRWCMNPPER | Nome da VKINFDQFCEYKAA proteína: VKSIEHIFESPLNKS hemaglutini KKLQSLTLGPGTGC na | Símbolo LGRTVTRAHFSELT do gene: H LTLMDLDLEMKHNV
SSVFTVVEEGLFGR TYTVWRSDARDPS TDLGIGHFLRVFEIG LVRDLGLGPPVFHM TNYLTVNMSDDYR RCLLAVGELKLTAL CSSSETVTLGERGV
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PKREPLVVVILNLAG PTLGGELYSVLPTS DLMVEKLYLSSHRG IIKDDEANWVVPST DVRDLQNKGECLV EACKTRPPSFCNGT GSGPWSEGRIPAY GVIRVSLDLASDPG VVITSVFGPLIPHLS GMDLYNNPFSRAV WLAVPPYEQSFLG MINTIGFPNRAEVM PHILTTEIRGPRGRC HVPIELSRRVDDDIK IGSNMVILPTIDLRYI TATYDVSRSEHAIV YYIYDTGRSSSYFY PVRLNFKGNPLSLR IECFPWRHKVWCY HDCLIYNTITDEEVH
TRGLTGIEVTCNPV AB005 6693- gb: MDGDRSKRDSYWS 23 66 795 8420 AB005795: TSPGGSTTKLVSDS 6693-8420 | ERSGKVDTWLLILA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Organismo: FTQWALSIATVIICIVI Vírus AARQGYSMERYSM Sendai | TVEALNTSNKEVKE Nome da SLTSLIRQEVITRAA cepa: Ohita | NIQSSVQTGIPVLLN Nome da KNSRDVIRLIEKSCN proteína: RQELTQLCDSTIAV proteína HHAEGIAPLEPHSF hemaglutini WRCPAGEPYLSSD na- PEVSLLPGPSLLSG neuraminida STTISGCVRLPSLSI se | Símbolo GEAIYAYSSNLITQG do gene: HN CADIGKSYQVLQLG
YISLNSDMFPDLNP VVSHTYDINDNRKS CSVVATGTRGYQL CSMPIVDERTDYSS DGIEDLVLDILDLKG RTKSHRYSNSEIDL DHPFSALYPSVGSG IATEGSLIFLGYGGL TTPLQGDTKCRIQG CQQVSQDTCNEAL KITWLGGKQVVSVL IQVNDYLSERPRIRV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
TTIPITQNYLGAEGR LLKLGDQVYIYTRS SGWHSQLQIGVLDV SHPLTISWTPHEAL SRPGNEDCNWYNT CPKECISGVYTDAY PLSPDAANVATVTL YANTSRVNPTIMYS NTTNIINMLRIKDVQ LEAAYTTTSCITHFG KGYCFHIIEINQKSL NTLQPMLFKTSIPKL
CKAES AF4571 6903- gb: MAEKGKTNSSYWS 21 67 02 8630 AF457102 | TTRNDNSTVNTHIN Organismo: TPAGRTHIWLLIATT Cepa MHTVLSFIIMILCIDLI Washington/ IKQDTCMKTNIMTV 1964 do SSMNESAKIIKETIT vírus da ELIRQEVISRTINIQS parainfluenz SVQSGIPILLNKQSR a humano 1 DLTQLIEKSCNRQE | Nome da LAQICENTIAIHHAD cepa: GISPLDPHDFWRCP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Washington VGEPLLSNNPNISLL 1964 | Nome PGPSLLSGSTTISG da proteína: CVRLPSLSIGDAIYA glicoproteín YSSNLITQGCADIGK a HN | SYQVLQLGYISLNS Símbolo do DMYPDLNPVISHTY gene: HN DINDNRKSCSVIAA
GTRGYQLCSLPTVN ETTDYSSEGIEDLVF DILDLKGKTKSHRY KNEDITFDHPFSAM YPSVGSGIKIENTLI FLGYGGLTTPLQGD TKCVINRCTNVNQS VCNDALKITWLKKR QVVNVLIRINNYLSD RPKIVVETIPITQNYL GAEGRLLKLGKKIYI YTRSSGWHSNLQIG SLDINNPMTIKWAP HEVLSRPGNQDCN WYNRCPRECISGV YTDAYPLSPDAVNV ATTTLYANTSRVNP TIMYSNTSEIINMLR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
LKNVQLEAAYTTTS CITHFGKGYCFHIVE INQASLNTLQPMLF
KTSIPKICKITS KJ6273 6146- gb: MEVRVENIRAIDMF 21 68 97 6888 KJ627397: KAKMKNRIRSSKCY 6146-6888 | RNATLILIGLTALSM Organismo: ALNIFLIIDYATLKNM Metapneum TKVEHCVNMPPVE ovírus PSKKSPMTSAADLN humano | TKLNPQQATQLTTE Nome da DSTSLAATSENHLH cepa: TETTPTSDATISQQ HMPV/Hom ATDEHTTLLRPINR o QTTQTTTEKKPTGA sapiens/PE TTKKDKEKETTTRT R/FPP0009 TSTAATQTLNTTNQ 8/2010/B | TSNGREATTTSARS Nome da RNGATTQNSDQTIQ proteína: AADPSSKPYHTQTN glicoproteín TTTAHNTDTSSLSS a G de fixação | Símbolo do
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento gene: G AF0171 8913- gb: MMADSKLVSLNNN 14 69 49 10727 AF017149 | LSGKIKDQGKVIKN Organismo: YYGTMDIKKINDGLL vírus DSKILGAFNTVIALL Hendra | GSIIIIVMNIMIIQNYT Nome da RTTDNQALIKESLQ cepa: SVQQQIKALTDKIGT
UNKNOWN EIGPKVSLIDTSSTIT -AF017149 | IPANIGLLGSKISQS Nome da TSSINENVNDKCKF proteína: TLPPLKIHECNISCP glicoproteín NPLPFREYRPISQG a | Símbolo VSDLVGLPNQICLQ do gene: G KTTSTILKPRLISYTL
PINTREGVCITDPLL AVDNGFFAYSHLEK IGSCTRGIAKQRIIG VGEVLDRGDKVPS MFMTNVWTPPNPS TIHHCSSTYHEDFY YTLCAVSHVGDPIL NSTSWTESLSLIRL AVRPKSDSGDYNQ
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
KYIAITKVERGKYDK VMPYGPSGIKQGDT LYFPAVGFLPRTEF QYNDSNCPIIHCKY SKAENCRLSMGVN SKSHYILRSGLLKY NLSLGGDIILQFIEIA DNRLTIGSPSKIYNS LGQPVFYQASYSW DTMIKLGDVDTVDP LRVQWRNNSVISRP GQSQCPRFNVCPE VCWEGTYNDAFLID RLNWVSAGVYLNS NQTAENPVFAVFKD NEILYQVPLAEDDT NAQKTITDCFLLENV IWCISLVEIYDTGDS VIRPKLFAVKIPAQC
SES AF2123 8943- gb: MPAENKKVRFENTT 14 70 02 10751 AF212302 | SDKGKIPSKVIKSYY Organismo: GTMDIKKINEGLLDS vírus de KILSAFNTVIALLGSI
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Nipah | VIIVMNIMIIQNYTRS Nome da TDNQAVIKDALQGI cepa: QQQIKGLADKIGTEI
UNKNOWN GPKVSLIDTSSTITIP -AF212302 | ANIGLLGSKISQSTA Nome da SINENVNEKCKFTL proteína: PPLKIHECNISCPNP glicoproteín LPFREYRPQTEGVS a de fixação NLVGLPNNICLQKT | Símbolo do SNQILKPKLISYTLP gene: G VVGQSGTCITDPLL
AMDEGYFAYSHLE RIGSCSRGVSKQRII GVGEVLDRGDEVP SLFMTNVWTPPNP NTVYHCSAVYNNEF YYVLCAVSTVGDPI LNSTYWSGSLMMT RLAVKPKSNGGGY NQHQLALRSIEKGR YDKVMPYGPSGIKQ GDTLYFPAVGFLVR TEFKYNDSNCPITK CQYSKPENCRLSM GIRPNSHYILRSGLL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
KYNLSDGENPKVVF IEISDQRLSIGSPSKI YDSLGQPVFYQASF SWDTMIKFGDVLTV NPLVVNWRNNTVIS RPGQSQCPRFNTC PEICWEGVYNDAFL IDRINWISAGVFLDS NQTAENPVFTVFKD NEILYRAQLASEDT NAQKTITNCFLLKNK IWCISLVEIYDTGDN VIRPKLFAVKIPEQC
T EU439 6751- gb: MEYWKHTNSTKDT 14 71 428 8638 EU439428: NNELGTTRDRHSSK 6751-8638 | ATNIIMYIFWTTTSTI Organismo: LSVIFIMILINLIQENN vírus da HNKLMLQEIKKEFA parainfluenz VIDTKIQKTSDDIST a suíno 3 | SIQSGINTRLLTIQS Nome da HVQNYIPLSLTQQM cepa: 92- SDLRKFINDLTTKRE 7783_ISU- HQEVPIQRMTHDS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento 92 | Nome GIEPLNPDKFWRCT da proteína: SGNPSLTSSPKIRLI hemaglutini PGPGLLATSTTVNG na- CIRIPSLAINNLIYAY neuraminida TSNLITQGCQDIGK se HN | SYQVLQIGIITINSDL Símbolo do VPDLNPRVTHTFNI gene: HN DDNRKSCSLALLNT
DVYQLCSTPKVDER SDYASTGIEDIVLDI VTSNGLIITTRFTNN NITFDKPYAALYPSV GPGIYYKDKVIFLGY GGLEHEENGDVICN TTGCPGKTQRDCN QASYSPWFSNRRM VNSIIVVDKSIDTTFS LRVWTIPMRQNYW GSEGRLLLLGDRIYI YTRSTSWHSKLQL GVIDISDYNNIRINW TWHNVLSRPGNDE CPWGHSCPDGCIT GVYTDAYPLNPSGS VVSSVILDSQKSRE
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
NPIITYSTATNRVNE LAIYNRTLPAAYTTT NCITHYDKGYCFHIV EINHRSLNTFQPML
FKTEVPKNCS KF5301 6157- gb: MEVRVENIRAIDMF 14 72 64 6906 KF530164: KAKIKNRIRSSRCYR 6157-6906 | NATLILIGLTALSMA Organismo: LNIFLIIDHATLRNMI metapneum KTENCANMPSAEP ovírus SKKTPMTSTAGPST humano | KPNPQQATQWTTE Nome da NSTSPAATLEGHPY cepa: TGTTQTPDTTAPQQ HMPV/AUS/ TTDKHTALPKSTNE 172832788/ QITQTTTEKKTTRAT 2004/B | TQKREKRKENTNQ Nome da TTSTAATQTTNTTN proteína: QTRNASETITTSDG glicoproteín PRIDTTTQSSEQTA a G de RATEPGSSPYHAR fixação | RGAGPR Símbolo do gene: G
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento AB910 6960- gb: MKNINIKYYKDSNR 12 73 309 8747 AB910309: YLGKILDEHKIVNSQ 6960-8747 | LYSLSIKVITIIAIIVSL Organismo: IATIMTIINATSGRTT Morbilivírus LNSNTDILLNQRDEI felino | HSIHEMIFDRVYPLI Nome da TAMSTELGLHIPTLL cepa: SS1 | DELTKAIDQKIKIMN Nome da PPVDTVTSDLSWCI proteína: KPPNGIIIDPKGYCE proteína SMELSKTYKLLLDQ hemaglutini LDVSRKKSLTINRK na | Símbolo NINQCQLVDDSEIIF do gene: H ATVNIQSTPRFLNF
GHTVSNQRITFGQG TYSSTYILTIQEDGIT DVQYRVFEIGYISD QFGVFPSLIVSRVL PIRMVLGMESCTLT SDRQGGYFLCMNT LTRSIYDYVNIRDLK SLYITLPHYGKVNYT YFNFGKIRSPHEIDK LWLTSDRGQIISGY FAAFVTITIRNYNNY
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
PYKCLNNPCFDNSE NYCRGWYKNITGT DDVPILAYLLVEMY DEEGPLITLVAIPPY NYTAPSHNSLYYDD KINKLIMTTSHIGYIQ INEVHEVIVGDNLKA ILLNRLSDEHPNLTA CRLNQGIKEQYKSD GMIISNSALIDIQER MYITVKAIPPVGNYN FTVELHSRSNTSYIL LPKQFNAKYDKLHL ECFNWDKSWWCAL IPQFSLSWNESLSV
DTAIFNLINCK AB759 7116- gb: MASPSELNRSQATL 11 74 118 8957 AB759118: YEGDPNSKRTWRT 7116-8957 | VYRASTLILDLAILC Organismo: VSIVAIVRMSTLTPS Paramixovír DVTDSISSSITSLSD us aviário 6 | TYQSVWSDTHQKV Nome da NSIFKEVGISIPVTLD cepa: red- KMQVEMGTAVNIIT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento necked DAVRQLQGVNGSA stint/Japan/ GFSITNSPEYSGGID 8KS0813/20 ALIYPQKSLNGKSL 08 | Nome AISDLLEHPSFIPAP da proteína: TTSHGCTRIPTFHL hemaglutini GYRHWCYSHNTIES na- GCHDAGESIMYLSM neuraminida GAVGVGHQGKPVF se | Símbolo TTSAAVILDDGKNR do gene: HN KSCSVVANPNGCD
VLCSLVKQTEDQDY ADPTPTPMIHGRLH FNGTYTESMLDQSL FTGHWVAQYPAVG SGSVSHGRLFFPLY GGISKSSSLFPKLR AHAYFTHNEELECK NLTSKQREDLFNAY MPGKIAGSLWAQGI VICNLTTLADCKIAV ANTSTMMMAAEGR LQLVQDKVVLYQRS SSWWPVLIYYDILV SELVNARHLDIVNW VPYPQSKFPRPTW
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
TKGLCEKPSICPAV CVTGVYQDVWVVS VGDFSNETVVIGGY LEAASERKDPWIAA ANQYNWLTRRQLF TAQTEAAYSSTTCF RNTHQDKVFCLTIM EVTDNLLGDWRIAP LLYEVTVVDRQQSS RKAVAMSEAHRTR
FKYYSPENKFTPQH AY141 6791- gb: MDPKSYYCNEDLR 8 75 760 8485 AY141760 | SDGGEKSPGGDLY Organismo: KGIILVSTVISLIIAIIS Paramixovír LAFIIDNKINIQSLDP us Fer-de- LRGLEDSYLVPIKD Lance | KSESISQDIQEGIFP Nome da RLNLITAATTTTIPRS cepa: ATCC IAIQTKDLSDLIMNR VR-895 | CYPSVVNNDTSCD Nome da VLAGAIHSNLFSQL proteína: DPSTYWTCSSGTP proteína TMNQTVKLLPDNSQ hemaglutini IPGSTYSTGCVRIPT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento na- FSLGSMIYSYSHNVI neuraminida YEGCNDHSKSSQY se HN | WQLGYISTSKTGEP Símbolo do LQQVSRTLTLNNGL gene: HN NRKSCSTVAQGRG
AYLLCTNVVEDERT DYSTEGIQDLTLDYI DIFGAERSYRYTNN EVDLDRPYAALYPS VGSGTVYNDRILFL GYGGLMTPYGDQA MCQAPECTSATQE GCNSNQLIGYFSGR QIVNCIIEIITVGTEK PIIRVRTIPNSQVWL GAEGRIQTLGGVLY LYIRSSGWHALAQT GIILTLDPIRISWIVN TGYSRPGNGPCSA SSRCPAQCITGVYT DIFPLSQNYGYLAT VTLLSGVDRVNPVI SYGTSTGRVADSQL TSSSQVAAYTTTTC FTFNQKGYCYHIIEL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
SPATLGIFQPVLVVT
EIPKICS EU877 6248- gb: MQGNMEGSRDNLT 8 76 976 8161 EU877976: VDDELKTTWRLAYR 6248-8161 | VVSLLLMVSALIISIVI Organismo: LTRDNSQSIITAINQ Paramixovír SSDADSKWQTGIE us aviário 4 | GKITSIMTDTLDTRN Nome da AALLHIPLQLNTLEA cepa: NLLSALGGNTGIGP APMV- GDLEHCRYPVHDT 4/KR/YJ/06 | AYLHGVNRLLINQT Nome da ADYTAEGPLDHVNF proteína: IPAPVTTTGCTRIPS hemaglutini FSVSSSIWCYTHNVI na- ETGCNDHSGSNQYI neuraminida SMGVIKRAGNGLPY se | Símbolo FSTVVSKYLTDGLN do gene: HN RKSCSVAAGSGHC
YLLCSLVSEPEPDD YVSPDPTPMRLGVL TWDGSYTEQAVPE RIFKNIWSANYPGV GSGAIVGNKVLFPF
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
YGGVRNGSTPEVM NRGRYYYIQDPNDY CPDPLQDQILRAEQ SYYPTRFGRRMVM QGVLACPVSNNSTI ASQCQSYYFNNSL GFIGAESRIYYLNGN IYLYQRSSSWWPH PQIYLLDSRIASPGT QNIDSGVNLKMLNV TVITRPSSGFCNSQ SRCPNDCLFGVYS DIWPLSLTSDSIFAF TMYLQGKTTRIDPA WALFSNHAIGHEAR LFNKEVSAAYSTTT CFSDTIQNQVYCLSI LEVRSELLGAFKIVP
FLYRVL AB176 6821- gb: MEDYSNLSLKSIPK 7 77 531 8536 AB176531: RTCRIIFRTATILGIC 6821-8536 | TLIVLCSSILHEIIHLD Organismo: VSSGLMDSDDSQQ vírus da GIIQPIIESLKSLIALA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento parainfluenz NQILYNVAIIIPLKIDS a humano 2 IETVIFSALKDMHTG | Nome da SMSNTNCTPGNLLL cepa: Nishio HDAAYINGINKFLVL | Nome da KSYNGTPKYGPLLN proteína: IPSFIPSATSPNGCT proteína RIPSFSLIKTHWCYT hemaglutini HNVMLGDCLDFTTS na- NQYLAMGIIQQSAA neuraminida AFPIFRTMKTIYLSD se | Símbolo GINRKSCSVTAIPG do gene: HN GCVLYCYVATRSEK
EDYATTDLAELRLA FYYYNDTFIERVISL PNTTGQWATINPAV GSGIYHLGFILFPVY GGLISGTPSYNKQS SRYFIPKHPNITCAG NSSEQAAAARSSY VIRYHSNRLIQSAVL ICPLSDMHTARCNL VMFNNSQVMMGAE GRLYVIDNNLYYYQ RSSSWWSASLFYRI NTDFSKGIPPIIEAQ
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
WVPSYQVPRPGVM PCNATSFCPANCIT GVYADVWPLNDPE PTSQNALNPNYRFA GAFLRNESNRTNPT FYTASASALLNTTG FNNTNHKAAYTSST CFKNTGTQKIYCLIII EMGSSLLGEFQIIPF
LRELIP AF0527 6584- gb: MVAEDAPVRATCR 7 78 55 8281 AF052755 | VLFRTTTLIFLCTLLA Organismo: LSISILYESLITQKQI Vírus da MSQAGSTGSNSGL Parainfluenz GSITDLLNNILSVAN a 5 | Nome QIIYNSAVALPLQLD da cepa: TLESTLLTAIKSLQT W3A | Nome SDKLEQNCSWSAA da proteína: LINDNRYINGINQFY proteína FSIAEGRNLTLGPLL hemaglutini NMPSFIPTATTPEG na- CTRIPSFSLTKTHW neuraminida CYTHNVILNGCQDH se | Símbolo VSSNQFVSMGIIEPT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento do gene: HN SAGFPFFRTLKTLYL
SDGVNRKSCSISTV PGGCMMYCFVSTQ PERDDYFSAAPPE QRIIIMYYNDTIVERII NPPGVLDVWATLN PGTGSGVYYLGWV LFPIYGGVIKGTSLW NNQANKYFIPQMVA ALCSQNQATQVQN AKSSYYSSWFGNR MIQSGILACPLRQD LTNECLVLPFSNDQ VLMGAEGRLYMYG DSVYYYQRSNSWW PMTMLYKVTITFTN GQPSAISAQNVPTQ QVPRPGTGDCSAT NRCPGFCLTGVYA DAWLLTNPSSTSTF GSEATFTGSYLNTA TQRINPTMYIANNT QIISSQQFGSSGQE AAYGHTTCFRDTGS VMVYCIYIIELSSSLL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GQFQIVPFIRQVTLS BK005 6560- gb: MSQLGTDQIMHLAQ 7 79 918 8290 BK005918 | PAIARRTWRLCFRIF Organismo: ALFILIAIVITQIFMLT Rubulavírus FDHTLLTTTQFLTSI suíno | GNLQSTITSWTPDV Nome da QAMLSISNQLIYTTS cepa: ITLPLKISTTEMSILT
UNKNOWN AIRDHCHCPDCSSA -BK005918 | CPTRQMLLNDPRY Nome da MSGVNQFIGAPTES proteína: INITFGPLFGIPSFIP proteína de TSTTTQGCTRIPSF fixação | ALGPSHWCYTHNFI Símbolo do TAGCADGGHSNQY gene: HN LAMGTIQSASDGSP
LLITARSYYLSDGVN RKSCSIAVVPGGCA MYCYVATRSETDYY AGNSPPQQLLTLVF SNDTIIERTIHPTGLA NGWVMLVPGVGSG TLYNEYLLFPAYGG MQQILANQSGEINQ
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
FFTPYNATVRCAMA QPQFSQRAAASYY PRYFSNRWIRSAIV ACPYRAIYQTQCTLI PLPNRMVMMGSEG RIFTLGDRLFYYQR SSSWWPYPLLYQV GLNFLTTPPSVSSM TQVPLEHLARPGKG GCPGNSHCPATCV TGVYADVWPLTDP RSGVGGTSLVAAG GLDSTSERMAPVN YLAIGESLLSKTYLL SKTQPAAYTTTTCF RDTDTGKIYCITIAEL GKVLLGEFQIVPFL
REIKIQSRY EU338 6015- gb: MDFPSRENLAAGDI 7 80 414 7913 EU338414: SGRKTWRLLFRILTL 6015-7913 | SIGVVCLAINIATIAK Organismo: LDHLDNMASNTWT Paramixovír TTEADRVISSITTPL us aviário 2 | KVPVNQINDMFRIV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Nome da ALDLPLQMTSLQKE cepa: ITSQVGFLAESINNV APMV- LSKNGSAGLVLVND 2/Chicken/C PEYAGGIAVSLYQG alifornia/Yuc DASAGLNFQPISLIE aipa/56 | HPSFVPGPTTAKGC Nome da IRIPTFHMGPSHWC proteína: YSHNIIASGCQDAS hemaglutini HSSMYISLGVLKAS na- QTGSPIFLTTASHLV neuraminida DDNINRKSCSIVASK se | Símbolo YGCDILCSIVIETEN do gene: HN EDYRSDPATSMIIG
RLFFNGSYTESKINT GSIFSLFSANYPAV GSGIVVGDEAAFPI YGGVKQNTWLFNQ LKDFGYFTHNDVYK CNRTDIQQTILDAYR PPKISGRLWVQGIL LCPVSLRPDPGCRL KVFNTSNVMMGAE ARLIQVGSTVYLYQ RSSSWWVVGLTYK LDVSEITSQTGNTL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
NHVDPIAHTKFPRP SFRRDACARPNICP AVCVSGVYQDIWPI STATNNSNIVWVGQ YLEAFYSRKDPRIGI ATQYEWKVTNQLF NSNTEGGYSTTTCF RNTKRDKAYCVVIS EYADGVFGSYRIVP
QLIEIRTTTGKSE KC403 6234- gb: MEVKVENIRTIDMLK 6 81 973 6964 KC403973: ARVKNRVARSKCFK 6234-6964 | NASLILIGITTLSIALN Organismo: IYLIINYTMQENTSE metapneum SEHHTSSSPMESS ovírus RETPTVPIDNSDTN humano | PSSQYPTQQSTEG Nome da STLYFAASASSPET cepa: EPTSTPDTTSRPPF HMPV/USA/ VDTHTTPPSASRTK TN-82- TSPAVHTKNNPRIS 518/1982/A SRTHSPPWAMTRT | Nome da VRRTTTLRTSSIRKR proteína: SSTASVQPDSSATT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento glicoproteín HKHEEASPVSPQTS a G de ASTTRPQRKSMEA fixação | STSTTYNQTS Símbolo do gene: G | Segmento: 8
KF0152 4511- gb: MRPAEQLIQENYKL 6 82 81 5844 KF015281: TSLSMGRNFEVSG 4511-5844 | STTNLNFERTQYPD Organismo: TFRAVVKVNQMCKL Pneumovíru IAGVLTSAAVAVCV s canino | GVIMYSVFTSNHKA Nome da NSMQNATIRNSTSA cepa: PPQPTAGPPTTEQ dog/Bari/10 GTTPKFTKPPTKTT 0- THHEITEPAKMVTP 12/ITA/2012 SEDPYQCSSNGYL | Nome da DRPDLPEDFKLVLD proteína: VICKPPGPEHHSTN proteína de CYEKREINLGSVCP fixação | DLVTMKANMGLNN Símbolo do GGGEEAAPYIEVITL gene: G STYSNKRAMCVHN
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GCDQGFCFFLSGLS TDQKRAVLELGGQ QAIMELHYDSYWKH YWSNSNCVVPRTN CNLTDQTVILFPSFN NKNQSQCTTCADS AGLDNKFYLTCDGL SRNLPLVGLPSLSP QAHKAALKQSTGTT TAPTPETRNPTPAP RRSKPLSRKKRALC GVDSSREPKPTMP YWCPMLQLFPRRS
NS KF9733 4624- gb: MSKTKDQRAAKTLE 6 83 39 5310 KF973339: KTWDTLNHLLFISS 4624-5310 | CLYKSNLKSIAQITL Organismo: SILAMTIPTSLIIVATT Vírus FIASANNKVTPTTAII sincicial QDATSQIKNTTPTH respiratório LTQNPQPGISFFNL tipo A | SGTISQTTAILAPTT Nome da PSVEPILQSTTVKTK cepa: RSV- NTTTTQIQPSKLTTK
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A/US/BID- QRQNKPPNKPNDD V7358/2002 FHFEVFNFVPCSIC | Nome da SNNPTCWAICKRIP proteína: SKKPGKKTTTKPTK glicoproteín KQTIKTTKKDLKPQT a de fixação TKPKEAPTT truncada | Símbolo do gene: G
FJ2158 6383- gb: MSNIASSLENIVEQ 5 84 64 8116 FJ215864: DSRKTTWRAIFRWS 6383-8116 | VLLITTGCLALSIVSI Organismo: VQIGNLKIPSVGDLA Paramixovír DEVVTPLKTTLSDT us aviário 8 | LRNPINQINDIFRIVA Nome da LDIPLQVTSIQKDLA cepa: SQFSMLIDSLNAIKL pintail/Waku GNGTNLIIPTSDKEY ya/20/78 | AGGIGNPVFTVDAG Nome da GSIGFKQFSLIEHPS proteína: FIAGPTTTRGCTRIP proteína TFHMSESHWCYSH hemaglutini NIIAAGCQDASASS na- MYISMGVLHVSSSG
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento neuraminida TPIFLTTASELIDDG se | Símbolo VNRKSCSIVATQFG do gene: HN CDILCSIVIEKEGDD
YWSDTPTPMRHGR FSFNGSFVETELPV SSMFSSFSANYPAV GSGEIVKDRILFPIY GGIKQTSPEFTELV KYGLFVSTPTTVCQ SSWTYDQVKAAYR PDYISGRFWAQVIL SCALDAVDLSSCIV KIMNSSTVMMAAEG RIIKIGIDYFYYQRSS SWWPLAFVTKLDP QELADTNSIWLTNSI PIPQSKFPRPSYSE NYCTKPAVCPATCV TGVYSDIWPLTSSS SLPSIIWIGQYLDAP VGRTYPRFGIANQS HWYLQEDILPTSTA SAYSTTTCFKNTAR NRVFCVTIAEFADG LFGEYRITPQLYELV
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RNN JX8574 6619- gb: MEETKVKTSEYWA 5 85 09 8542 JX857409: RSPQIHATNHPNVQ 6619-8542 | NREKIKEILTILISFIS Organismo: SLSLVLVIAVLIMQS vírus da LHNGTILRCKDVGL parainfluenz ESINKSTYSISNAILD a suína 1 | VIKQELITRIINTQSS Nome da VQVALPILINKKIQDL cepa: SLIIEKSSKVHQNSP S206N | TCSGVAALTHVEGI Nome da KPLDPDDYWRCPS proteína: GEPYLEDELTLSLIP proteína GPSMLAGTSTIDGC hemaglutini VRLPSLAIGKSLYAY na | Símbolo SSNLITKGCQDIGKS do gene: H YQVLQLGIITLNSDL
HPDLNPIISHTYDIN DNRKSCSVAVSETK GYQLCSMPRVNEK TDYTSDGIEDIVFDV LDLKGSSRSFKFSN NDINFDHPFSALYP SVGSGIIWKNELYFL
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GYGALTTALQGNTK CNLMGCPGATQDN CNKFISSSWLYSKQ MVNVLIQVKGYLSS KPSIIVRTIPITENYV GAEGKLVGTRERIYI YTRSTGWHTNLQIG VLNINHPITITWTDH RVLSRPGRSPCAW NNKCPRNCTTGVY TDAYPISPDANYVA TVTLLSNSTRNNPTI MYSSSDRVYNMLR LRNTELEAAYTTTS CIVHFDRGYCFHIIEI NQKELNTLQPMLFK
TAIPKACRISNL KF9082 7510- gb: MQDSRGNTQIFSQ 5 86 38 9249 KF908238: ANSMVKRTWRLLF 7510-9249 | RIVTLILLISIFVLSLII Organismo: VLQSTPGNLQSDV vírus da DIIRKELDELMENFE parainfluenz TTSKSLLSVANQITY a humana DVSVLTPIRQEATET
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento 4b | Nome NIIAKIKDHCKDRVV da cepa: KGESTCTLGHKPLH QLD-01 | DVSFLNGFNKFYFT Nome da YRDNVQIRLNPLLD proteína: YPNFIPTATTPHGCI proteína RIPSFSLSQTHWCY hemaglutini THNTILRGCEDTAS na- SKQYVSLGTLQTLE neuraminida NGDPYFKVEYSHYL se | Símbolo NDRKNRKSCSVVA do gene: HN VLDGCLLYCVIMTK
NETENFKDPQLATQ LLTYISYNGTIKERII NPPGSSRDWVHISP GVGSGILYSNYIIFP LYGGLMENSMIYNN QSGKYFFPNSTKLP CSNKTSEKITGAKD SYTITYFSKRLIQSA FLICDLRQFLSEDCE ILIPSNDHMLVGAE GRLYNIENNIFYYQR GSSWWPYPSLYRIK LNSNKKYPRIIEIKFT KIEIAPRPGNKDCP
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GNKACPKECITGVY QDIWPLSYPNTAFP HKKRAYYTGFYLNN SLARRNPTFYTADN LDYHQQERLGKFNL TAGYSTTTCFKQTT TARLYCLYILEVGDS VIGDFQIFPFLRSID
QAIT KT0717 6066- gb: MDALSRENLTEISQ 5 87 57 7962 KT071757: GGRRTWRMLFRILT 6066-7962 | LVLTLVCLAINIATIA Organismo: KLDSIDTSKVQTWT paramixovír TTESDRVIGSLTDTL us aviário 2 | KIPINQVNDMFRIVA Nome da LDLPLQMTTLQKEIA cepa: SQVGFLAESINNFL APMV- SKNGSAGSVLVND 2/Emberiza PEYAGGIGTSLFHG spodocepha DSASGLDFEAPSLI la/China/Da EHPSFIPGPTTAKG xing'anling/9 CIRIPTFHMSASHW 74/2013 | CYSHNIIASGCQDA Nome da GHSSMYISMGVLKA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento proteína: TQAGSPSFLTTASQ proteína LVDDKLNRKSCSIIS hemaglutini TTYGCDILCSLVVE na- NEDADYRSDPPTD neuraminida MILGRLFFNGTYSE se | Símbolo SKLNTSAIFQLFSAN do gene: HN YPAVGSGIVLGDEIA
FPVYGGVKQNTWL FNQLKDYGYFAHN NVYKCNNSNIHQTV LNAYRPPKISGRLW SQVVLICPMRLFINT DCRIKVFNTSTVMM GAEARLIQVGSDIYL YQRSSSWWVVGLT YKLDFQELSSKTGN ILNNVSPIAHAKFPR PSYSRDACARPNIC PAVCVSGVYQDIWP ISTAHNLSQVVWVG QYLEAFYARKDPWI GIATQYDWKKNVRL FNANTEGGYSTTTC FRNTKRDKAFCVIIS EYADGVFGSYRIVP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
QLIEIRTTSKKGLPS LC0411 6605- gb: MQPGISEVSFVNDE 4 88 32 8437 LC041132: RSERGTWRLLFRIL 6605-8437 | TIVLCLTSIGIGIPALI Organismo: YSKEAATSGDIDKS paramixovír LEAVKTGMSTLSSK us aviário IDESINTEQKIYRQVI goose/Shim LEAPVSQLNMESNI ane/67/2000 LSAITSLSYQIDGTS | Nome da NSSGCGSPMHDQD cepa: FVGGINKEIWTTDN goose/Shim VNLGEITLTPFLEHL ane/67/2000 NFIPAPTTGNGCTRI | Nome da PSFDLGLTHWCYTH proteína: NVILSGCQDYSSSF hemaglutini QYIALGVLKISATGH na- VFLSTMRSINLDDE neuraminida RNRKSCSISATSIGC se | Símbolo DIICSLVTEREVDDY do gene: HN NSPAATPMIHGRLD
FSGKYNEVDLNVG QLFGDWSANYPGV GGGSFLNGRVWFPI YGGVKEGTPTFKEN
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DGRYAIYTRYNDTC PDSESEQVSRAKS SYRPSYFGGKLVQ QAVLSIKIDDTLGLD PVLTISNNSITLMGA ESRVLQIEEKLYFY QRGTSWFPSLIMYP LTVDDKMVRFEPPT IFDQFTRPGNHPCS ADSRCPNACVTGV YTDGYPIVFHNNHSI AAVYGMQLNDVTN RLNPRSAVWYGVS MSNVIRVSSSTTKA AYTTSTCFKVKKTQ RVYCLSIGEIGNTLF GEFRIVPLLLEVYSE KGKSLKSSFDGWE DISINNPLRPLDNHR
VDPILISNYTSSWP AF0929 4705- gb: MSNHTHHLKFKTLK 3 89 42 5478 AF092942 | RAWKASKYFIVGLS Organismo: CLYKFNLKSLVQTA Vírus LTTLAMITLTSLVITA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento sincicial IIYISVGNAKAKPTS respiratório KPTIQQTQQPQNHT bovino | SPFFTEHNYKSTHT Nome da SIQSTTLSQLPNTDT cepa: TRETTYSHSINETQ ATue51908 NRKIKSQSTLPATR | Nome da KPPINPSGSNPPEN proteína: HQDHNNSQTLPYV glicoproteín PCSTCEGNLACLSL a de fixação CQIGPERAPSRAPTI | Símbolo do TLKKTPKPKTTKKP gene: G TKTTIHHRTSPEAKL
QPKNNTAAPQQGIL
SSPEHHTNQSTTQI AF3261 6691-847 gb: MWNSIPQLVSDHEE 3 90 14 AF326114 | AKGKFTDIPLQDDT Organismo: DSQHPSGSKSTCR vírus TLFRTVSIILSLVILVL Menangle | GVTSTMFSAKYSG Nome da GCATNSQLLGVSNL cepa: INQIQKSIDSLISEVN
UNKNOWN QVSITTAVTLPIKIMD -AF326114 | FGKSVTDQVTQMIR Nome da QCNTVCKGPGQKP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento proteína: GSQNVRIMPSNNLS proteína de TFQNINMSARGIAY fixação | QDVPLTFVRPIKNP Símbolo do QSCSRFPSYSVSFG gene: HN VHCFANAVTDQTCE
LNQNTFYRVVLSVS KGNISDPSSLETKA ETRTPKGTPVRTCS IISSVYGCYLLCSKA TVPESEEMKTIGFS QMFILYLSMDSKRII YDNIVSSTSAIWSGL YPGEGAGIWHMGQ LFFPLWGGIPFLTPL GQKILNSTLDIPEVG SKCKSDLTSNPAKT KDMLFSPYYGENV MVFGFLTCYLLSNV PTNCHADYLNSTVL GFGSKAQFYDYRGI VYMYIQSAGWYPFT QIFRITLQLKQNRLQ AKSIKRIEVTSTTRP GNRECSVLRNCPYI CATGLFQVPWIVNS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
DAITSKEVDNMVFV QAWAADFTEFRKGI LSLCSQVSCPINDLL SKDNSYMRDTTTY CFPQTVPNILSCTSF VEWGGDSGNPINIL
EIHYEVIFVAS GU206 7500- gb: MDKSYYTEPEDQR 3 91 351 9714 GU206351: GNSRTWRLLFRLIV 7500-9714 | LTLLCLIACTSVSQL Organismo: FYPWLPQVLSTLISL Paramixovír NSSIITSSNGLKKEIL us aviário 5 | NQNIKEDLIYREVAI Nome da NIPLTLDRVTVEVGT cepa: AVNQITDALRQLQS budgerigar/ VNGSAAFALSNSPD Kunitachi/74 YSGGIEHLVFQRNT | Nome da LINRSVSVSDLIEHP proteína: SFIPTPTTQHGCTRI proteína PTFHLGTRHWCYS hemaglutini HNIIGQGCADSGAS na MMYISMGALGVSSL neuraminida GTPTFTTSATSILSD se | Símbolo SLNRKSCSIVATTE
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento do gene: HN GCDVLCSIVTQTED
QDYADHTPTPMIHG RLWFNGTYTERSLS QSLFLGTWAAQYP AVGSGIMTPGRVIF PFYGGVIPNSPLFL DLERFALFTHNGDL ECRNLTQYQKEAIY SAYKPPKIRGSLWA QGFIVCSVGDMGN CSLKVINTSTVMMG AEGRLQLVGDSVM YYQRSSSWWPVGI LYRLSLVDIIARDIQV VINSEPLPLSKFPRP TWTPGVCQKPNVC PAVCVTGVYQDLW AISAGETLSEMTFF GGYLEASTQRKDP WIGVANQYSWFMR RRLFKTSTEAAYSS STCFRNTRLDRNFC LLIFELTDNLLGDWR IVPLLFELTIV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento JQ0017 8170- gb: MLSQLQKNYLDNS 3 92 76 10275 JQ001776: NQQGDKMNNPDKK 8170-10275 LSVNFNPLELDKGQ | KDLNKSYYVKNKNY Organismo: NVSNLLNESLHDIKF Vírus do CIYCIFSLLIIITIINIITI cedro | SIVITRLKVHEENNG Nome da MESPNLQSIQDSLS cepa: CG1a SLTNMINTEITPRIGI | Nome da LVTATSVTLSSSINY proteína: VGTKTNQLVNELKD glicoproteín YITKSCGFKVPELKL a de fixação HECNISCADPKISKS | Símbolo do AMYSTNAYAELAGP gene: G PKIFCKSVSKDPDF
RLKQIDYVIPVQQD RSICMNNPLLDISD GFFTYIHYEGINSCK KSDSFKVLLSHGEI VDRGDYRPSLYLLS SHYHPYSMQVINCV PVTCNQSSFVFCHI SNNTKTLDNSDYSS DEYYITYFNGIDRPK TKKIPINNMTADNRY
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
IHFTFSGGGGVCLG EEFIIPVTTVINTDVF THDYCESFNCSVQT GKSLKEICSESLRS PTNSSRYNLNGIMII SQNNMTDFKIQLNG ITYNKLSFGSPGRL SKTLGQVLYYQSS MSWDTYLKAGFVE KWKPFTPNWMNNT VISRPNQGNCPRYH KCPEICYGGTYNDI APLDLGKDMYVSVI LDSDQLAENPEITV FNSTTILYKERVSKD ELNTRSTTTSCFLFL DEPWCISVLETNRF NGKSIRPEIYSYKIP
KYC KP271 6644- gb: MWSTQASKHPAMV 3 93 123 8431 KP271123: NSATNLVDIPLDHP 6644-8431 | SSAQFPINRKRTGR Organismo: LIYRLFSILCNLILISIL Vírus Teviot ISLVVIWSRSSRDC
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento | Nome da AKSDGLSSVDNQLS cepa: SLSRSINSLITEVNQI Geelong | SVTTAINLPIKLSEF Nome da GKSVVDQVTQMIR proteína: QCNAACKGPGEKP proteína de GIQNVRINIPNNFST fixação | YSELNRTANSLNFQ Símbolo do SRTALFARPNPYPK gene: HN TCSRFPSYSVYFGI
HCFSHAVTDSSCEL SDSTYYRLVIGVAD KNLSDPADVKYIGE TTTPVRVQTRGCSV VSSIYGCYLLCSKS NQDYQDDFREQGF HQMFILFLSRELKTT FFDDMVSSTTVTW NGLYPGEGSGIWH MGHLVFPLWGGIRF GTHASEGILNSTLEL PPVGPSCKRSLAD NGLINKDVLFSPYF GDSVMVFAYLSCY MLSNVPTHCQVET MNSSVLGFGSRAQ
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
FYDLKGIVYLYIQSA GWFSYTQLFRLSLQ SKGYKLSVKQIKRIP ISSTSRPGTEPCDII HNCPYTCATGLFQA PWIVNGDSIRDRDV RNMAFVQAWSGAI NTFQRPFMSICSQY SCPLSELLDSESSI MRSTTTYCFPSLTE SILQCVSFIEWGGP VGNPISINEVYSSIS
FRPD AY286 7644- gb: MVDPPAVSYYTGT 2 94 409 9542 AY286409 | GRNDRVKVVTTQS Organismo: TNPYWAHNPNQGL vírus RRLIDMVVNVIMVT Mossman | GVIFALINIILGIVIISQ Nome da SAGSRQDTSKSLDII cepa: QHVDSSVAITKQIV
UNKNOWN MENLEPKIRSILDSV -AY286409 | SFQIPKLLSSLLGPG Nome da KTDPPIALPTKASTP proteína: VIPTEYPSLNTTTCL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento glicoproteín RIEESVTQNAAALF a de fixação NISFDLKTVMYELVT | Símbolo do RTGGCVTLPSYSEL gene: G YTRVRTFSTAIRNP
KTCQRAGQETDLNL IPAFIGTDTGILINSC VRQPVIATGDGIYAL TYLTMRGTCQDHR HAVRHFEIGLVRRD AWWDPVLTPIHHFT EPGTPVFDGCSLTV QNQTALALCTLTTD GPETDIHNGASLGL ALVHFNIRGEFSKH KVDPRNIDTQNQGL HLVTTAGKSAVKKG ILYSFGYMVTRSPE PGDSKCVTEECNQ NNQEKCNAYSKTTL DPDKPRSMIIFQIDV GAEYFTVDKVVVVP RTQYYQLTSGDLFY TGEENDLLYQLHNK GWYNKPIRGRVTFD GQVTLHEHSRTYDS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
LSNQRACNPRLGC PSTCELTSMASYFP LDKDFKAAVGVIAL RNGMTPIITYSTDD WRNHWKYIKNADL EFSESSLSCYSPNP PLDDYVLCTAVITAK VMSNTNPQLLATS
WYQYDKCHT AY900 7809- gb: MNPVAMSNFYGIN 2 95 001 9938 AY900001 | QADHLREKGDQPE Organismo: KGPSVLTYVSLITGL J-virus | LSLFTIIALNVTNIIYL Nome da TGSGGTMATIKDNQ cepa: QSMSGSMRDISGM
UNKNOWN LVEDLKPKTDLINS -AY900001 | MVSYTIPSQISAMS Nome da AMIKNEVLRQCTPS proteína: FMFNNTICPIAEHPV glicoproteín HTSYFEEVGIEAISM a de fixação CTGTNRKLVVNQGI | Símbolo do NFVEYPSFIPGSTK gene: G PGGCVRLPSFSLGL
EVFAYAHAITQDDC
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TSSSTPDYYFSVGR IADHGTDVPVFETL AEWFLDDKMNRRS CSVTAAGKGGWLG CSILVGSFTDELTSP EVNRISLSYMDTFG KKKDWLYTGSEVR ADQSWSALFFSVG SGVVIGDTVYFLVW GGLNHPINVDAMCR APGCQSPTQSLCN YAIKPQEWGGNQIV NGILHFKHDTNEKP TLHVRTLSPDNNW MGAEGRLFHFHNS GKTFIYTRSSTWHT LPQVGILTLGWPLS VQWVDITSISRPGQ SPCEYDNRCPHQC VTGVYTDLFPLGVS YEYSVTAYLDQVQS RMNPKIALVGAQEK IYEKTITTNTQHADY TTTSCFAYKLRVWC VSIVEMSPGVITTRQ
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
PVPFLYHLNLGCQD TSTGSLTPLDAHGG TYLNTDPVGNKVDC YFVLHEGQIYFGMS VGPINYTYSIVGRSR EIGANMNVSLNQLC HSVYTEFLKEKEHP GTRNNIDVEGWLLK RIETLNGTKIFGLDD LEGSGPGHQSGPE
DPSIAPIGHN EF1997 6150- gb: MEVKVENVGKSQE 2 96 72 6944 EF199772: LKVKVKNFIKRSDC 6150-6944 | KKKLFALILGLVSFE Organismo: LTMNIMLSVMYVES metapneum NEALSLCRIQGTPA ovírus PRDNKTNTENATKE aviário | TTLHTTTTTRDPEV Nome da RETKTTKPQANEGA cepa: PL-2 | TNPSRNLTTKGDKH Nome da QTTRATTEAELEKQ proteína: SKQTTEPGTSTQKH glicoproteín TPARPSSKSPTTTQ a de fixação ATAQPTTPTAPKAS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento | Símbolo do TAPKNRQATTKKTE gene: G TDTTTASRARNTNN
PTETATTTPKATTET GKGKEGPTQHTTK EQPETTARETTTPQ
PRRTAGASPRAS JF4248 5981- gb: MGSKLYMVQGTSA 2 97 33 7156 JF424833: YQTAVGFWLDIGRR 5981-7156 | YILAIVLSAFGLTCT Organismo: VTIALTVSVIVEQSV metapneum LEECRNYNGGDRD ovírus WWSTTQEQPTTAP aviário | SATPAGNYGGLQT Nome da ARTRKSESCLHVQI cepa: SYGDMYSRSDTVL IT/Ty/A/259- GGFDCMGLLVLCK 01/03 | SGPICQRDNQVDPT Nome da ALCHCRVDLSSVDC proteína: CKVNKISTNSSTTS proteína de EPQKTNPAWPSQD fixação | NTDSDPNPQGITTS Símbolo do TATLLSTSLGLMLTS gene: G KTGTHKSGPPQALP
GSNTNGKTTTDREL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GSTNQPNSTTNGQ HNKHTQRMTLPPS YDNTRTILQHTTPW EKTFSTYKPTHSPT NESDQSLPTTQNSI NCEHFDPQGKEKIC YRVGSYNSNITKQC RIDVPLCSTYNTVC MKTYYTEPFNCWR RIWRCLCDDGVGLV
EWCCTS JN6892 7918- gb: MSQLAAHNLAMSN 2 98 27 12444 JN689227: FYGIHQGGQSTSQK 7918-12444 EEEQPVQGVIRYAS | MIVGLLSLFTIIALNV Organismo: TNIIYMTESGGTMQ Vírus Tailam SIKNAQGSIDGSMK | Nome da DLSGTIMEDIKPKTD cepa: TL8K | LINSMVSYNIPAQLS Nome da MIHQIIKNDVLKQCT proteína: PSFMFNNTICPLAE glicoproteín NPTHSRYFEEVNLD a de fixação SISECSGNEMSLEL | Símbolo do GTEPEFIEYPSFAP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento gene: G GSTKPGSCVRLPSF
SLSSTVFAYTHTIM GHGCSELDVGDHY LAIGRIADAGHEIPQ FETISSWFINDKINR RSCTVAAGVMETW MGCVIMTETFYDDL DSLDTGKITISYLDV FGRKKEWIYTRSEIL YDYTYTSVYFSIGS GVVVGDTVYFLLW GSLSSPIEETAYCY APGCSNYNQRMCN EAQRPAKFGHRQM ANAILRFKTNSMGK PSISVRTLSPTVIPF GTEGRLIYSDFTKIIY LYLRSTSWYVLPLT GLLILGPPVSISWVT QEAVSRPGEYPCG ASNRCPKDCITGVY TDLFPLGARYEYAV TVYLNAETYRVNPT LALIDRSKIIARKKIT TESQKAGYTTTTCF
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VFKLRIWCMSVVEL APATMTAFEPVPFL YQLDLTCKRNNGTT AMQFSGQDGMYKS GRYKSPRNECFFEK VSNKYYFVVSTPEG IQPYEVRDLTPERV SHVIMYISDVCAPAL SAFKKLIPAMRPITT LTIGNWQFRPVDIS GGLRVNIYRNLTRY GDLSMSAPEDPGT DTFPGTHAPSKGHE EVGHYTLPNEKLSE VTTAAVKTKESLNLI PDTKDTRGEEENG SGLNEIITGHTTPGH IKTHPAETKVTKHTV IIPQIEEDGSGATTS TELQDETGYHTEDY NTTNTNGSLTAPNE RNNYTSGDHTVSG EDITHTITVSDRTKT TQTLPTDNTFNQTP TKIQEGSPKSESTP
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KDYTAIESEDSHFT DPTLIRSTPEGTIVQ VIGDQFHSAVTQLG ESNAIGNSEPIDQG NNLIPTTDRGTMDN TSSQSHSSTTSTQG SHSAGHGSQSNMN LTALADTDSVTDQS TSTQEIDHEHENVS SILNPLSRHTRVMR DTVQEALTGAWGFI
RGMIP KC562 6178- gb: MEVRVENIRAIDMF 2 99 242 6926 KC562242: KAKIKNRIRNSRCY 6178-6926 | RNATLILIGLTALSM Organismo: ALNIFLIIDHATLRNM metapneum IKTENCANMPSAEP ovírus SKKTPMTSIAGPST humano | KPNPQQATQWTTE Nome da NSTSPAATLEGHPY cepa: TGTTQTPDTTAPQQ HMPV/USA/ TTDKHTALPKSTNE C1- QITQTTTEKKTTRAT 334/2004/B TQKRKKEKKTQTKP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento | Nome da QVQLQPKQPTPPT proteína: KSEMQVRQSQHPT glicoproteín DPELTPLPKAVNRQ a G de PGQQNQAPHHIMH fixação | GEVQDPGERNTQV Símbolo do SHPSS gene: G KC915 6154- gb: MEVKIENVGKSQEL 2 100 036 7911 KC915036: RVKVKNFIKRSDCK 6154-7911 | KKLFALILGLISFDIT Organismo: MNIMLSVMYVESNE metapneum ALSSCRVQGTPAP ovírus RDNRTNTENTAKET aviário tipo TLHTMTTTRNTEAG C | Nome da GTKTTKPQADERAT cepa: GDY | SPSKNPTIGADKHK Nome da TTRATTEAEQEKQS proteína: KQTTEPGTSTPKHI glicoproteín PARPSSKSPATTKT a de fixação TTQPTTPTVAKGGT | Símbolo do APKNRQTTTKKTEA gene: G DTPTTSRAKQTNKP
TGTETTPPRATTET DKDKEGPTQHTTKE
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QPETTAGGTTTPQP RRTTSRPAPTTNTK EGAETTGTRTTKST QTSASPPRPTRSTP SKTATGTNKRATTT KGPNTASTDRRQQ TRTTPKQDQQTQT KAKTTTNKAHAKAA TTPEHNTDTTDSMK ENSKEDKTTRDPSS KATTKQENTSKGTT ATNLGNNTEAGART PPTTTPTRHTTEPA TSTAGGHTKARTTR WKSTAARQPTRNN TTADTKTAQSKQTT PAQLGNNTTPENTT PPDNKSNSQTNVA PTEEIEIGSSLWRR RYVYGPCRENALE HPMNPCLKDNTTWI YLDNGRNLPAGYY DSKTDKIICYGIYRG NSYCYGRIECTCKN GTGLLSYCCNSYN
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WS LC1687 7239- gb: MSSPRDRVNAFYK 2 101 49 9196 LC168749: DNLQFKNTRVVLNK 7239-9196 | EQLLIERPYMLLAVL Organismo: FVMFLSLVGLLAIAG morbilivírus IRLHRAAVNTAEINS da peste GLTTSIDITKSIEYQV bovina | KDVLTPLFKIIGDEV Nome da GLRTPQRFTDLTKFI cepa: Lv | SDKIKFLNPDKEYD Nome da FRDINWCISPPERIK proteína: INYDQYCAHTAAEE proteína H | LITMLVNSSLAGTAV Símbolo do LRTSLVNLGRSCTG gene: H STTTKGQFSNMSLA
LSGIYSGRGYNISS MITITEKGMYGSTYL VGKHNQGARRPST AWQRDYRVFEVGII RELGVGTPVFHMT NYLELPRQPELEIC MLALGEFKLAALCL ADNSVALHYGGLR DDHKIRFVKLGVWP
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SPADSDTLATLSAV DPTLDGLYITTHRGII AAGKAVWAVPVTR TDDQRKMGQCRRE ACREKPPPFCNSTD WEPLEAGRIPAYGI LTIRLGLADKPEIDII SEFGPLITHDSGMD LYTPLDGNEYWLTI PPLQNSALGTVNTL VLEPSLKISPNILTLP IRSGGGDCYTPTYL SDLADDDVKLSSNL VILPSRNLQYVSAT YDTSRVEHAIVYYIY STGRLSSYYYPVKL PIKGDPVSLQIGCFP WGLKLWCHHFCSVI DSGTGKQVTHTGA
VGIEITCNSR LC1873 8144- gb: MDSSQMNILDAMD 2 102 10 9871 LC187310: RESSKRTWRGVFR 8144-9871 | VTTIIMVVTCVVLSAI Organismo: TLSKVAHPQGFDTN
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Paramixovír ELGNGIVDRVSDKIT us aviário 10 EALTVPNNQIGEIFK | Nome da IVALDLHVLVSSSQ cepa: QAIAGQIGMLAESIN rAPMV-10- SILSQNGSASTILSS FI324/YmH SPEYAGGIGVPLFS A | Nome da NKLTNGTVIKPITLIE proteína: HPSFIPGPTTIGGCT hemaglutini RIPTFHMASSHWCY na- SHNIIEKGCKDSGIS neuraminida SMYISLGVLQVLKK se | Símbolo GTPVFLVTASAVLS do gene: HN DDRNRKSCSIISSRF
GCEILCSLVTEAES DDYKSDTPTGMVH GRLYFNGTYREGLV DTETIFRDFSANYP GVGSGEIVEGHIHF PIYGGVKQNTGLYN SLTPYWLDAKNKYD YCKLPYTNQTIQNS YKPPFIHGRFWAQG ILSCELDLFNLGNC NLKIIRSDKVMMGA ESRLMLVGSKLLMY
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QRASSWWPLGITQ EIDIAELHSSNTTILR EVKPILSSKFPRPSY QPNYCTKPSVCPA VCVTGVYTDMWPIS ITGNISDYAWISHYL DAPTSRQQPRIGIA NQYFWIHQTTIFPT NTQSSYSTTTCFRN QVRSRMFCLSIAEF ADGVFGEFRIVPLL
YELRV NC_00 6590- gb: MWATSESKAPIPAN 2 103 4074 8563 NC_004074 STLNLVDVPLDEPQ : 6590-8563 TITKHRKQKRTGRL | VFRLLSLVLSLMTVI Organismo: LVLVILASWSQKINA Vírus CATKEGFNSLDLQI Tioman | SGLVKSINSLITEVN Nome da QISITTAINLPIKLSD cepa: FGKSIVDQVTQMIR
UNKNOWN QCNAVCKGPGEKP - GIQNIRINIPNNFSTY NC_004074 LELNNTVKSIELQR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento | Nome da RPALLARPNPIPKS proteína: CSRFPSYSVNFGIH proteína de CFAHAITDQSCELS fixação | DKTYYRLAIGISDKN Símbolo do LSDPSDVKYIGEAF gene: HN TPMGLQARGCSVIS
SIYGCYLLCSKSNQ GYEADFQTQGFHQ MYILFLSRDLKTTLF NDMISSTTVVWNGL YPGEGAGIWHMGY LIFPLWGGIKIGTPA STSILNSTLDLPLVG PSCKSTLEENNLIN KDVLFSPYFGESVM VFGFLSCYMLSNVP THCQVEVLNSSVLG FGSRSQLMDLKGIV YLYIQSAGWYSYTQ LFRLSLQSRGYKLT VKQIRRIPISSTTRP GTAPCDVVHNCPY TCATGLFQAPWIVN GDSILDRDVRNLVF VQAWSGNFNTFQK
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GLISICNQYTCPLTT LLDNDNSIMRSTTT YCYPSLSEYNLQCQ SFIEWGGPVGNPIGI
LEVHYIIKFK NC_00 7091- gb: MSSPRDKVDAFYK 2 104 5283 8905 NC_005283 DIPRPRNNRVLLDN : 7091-8905 ERVIIERPLILVGVLA | VMFLSLVGLLAIAGV Organismo: RLQKATTNSIEVNR Morbilivírus KLSTNLETTVSIEHH de golfinho | VKDVLTPLFKIIGDE Nome da VGLRMPQKLTEIMQ cepa: FISNKIKFLNPDREY
UNKNOWN DFNDLHWCVNPPD - QVKIDYAQYCNHIA NC_005283 AEELIVTKFKELMN | Nome da HSLDMSKGRIFPPK proteína: NCSGSVITRGQTIK proteína PGLTLVNIYTTRNFE hemaglutini VSFMVTVISGGMYG na | Símbolo KTYFLKPPEPDDPF do gene: H EFQAFRIFEVGLVR
DVGSREPVLQMTN
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FMVIDEDEGLNFCL LSVGELRLAAVCVR GRPVVTKDIGGYKD EPFKVVTLGIIGGGL SNQKTEIYPTIDSSI EKLYITSHRGIIRNS KARWSVPAIRSDDK DKMEKCTQALCKS RPPPSCNSSDWEP LTSNRIPAYAYIALEI KEDSGLELDITSNY GPLIIHGAGMDIYEG PSSNQDWLAIPPLS QSVLGVINKVDFTA GFDIKPHTLTTAVDY ESGKCYVPVELSGA KDQDLKLESNLVVL PTKDFGYVTATYDT SRSEHAIVYYVYDT ARSSSYFFPFRIKA RGEPIYLRIECFPW SRQLWCHHYCMIN STVSNEIVVVDNLV SINMSCSR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento NC_00 7978- gb: MSQLAAHNLAMSN 2 105 7803 12504 NC_007803 FYGTHQGDLSGSQ : 7978- KGEEQQVQGVIRY 12504 | VSMIVSLLSLFTIIAL Organismo: NVTNIIYMTESGGT Vírus MQSIKTAQGSIDGS Beilong | MREISGVIMEDVKP Nome da KTDLINSMVSYNIPA cepa: Li | QLSMIHQIIKNDVPK Nome da QCTPSFMFNNTICP proteína: LAENPTHSRYFEEV glicoproteín NLDSISECSGPDMH a de fixação LGLGVNPEFIEFPSF | Símbolo do APGSTKPGSCVRLP gene: G SFSLSTTVFAYTHTI
MGHGCSELDVGDH YFSVGRIADAGHEIP QFETISSWFINDKIN RRSCTVAAGAMEA WMGCVIMTETFYD DRNSLDTGKLTISYL DVFGRKKEWIYTRS EILYDYTYTSVYFSV GSGVVVGDTVYFLI WGSLSSPIEETAYC
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FAPDCSNYNQRMC NEAQRPSKFGHRQ MVNGILKFKTTSTG KPLLSVGTLSPSVV PFGSEGRLMYSEIT KIIYLYLRSTSWHAL PLTGLFVLGPPTSIS WIVQRAVSRPGEFP CGASNRCPKDCVT GVYTDLFPLGSRYE YAATVYLNSETYRV NPTLALINQTNIIASK KVTTESQRAGYTTT TCFVFKLRVWCISV VELAPSTMTAYEPI PFLYQLDLTCKGKN GSLAMRFAGKEGT YKSGRYKSPRNEC FFEKVSNKYYFIVST PEGIQPYEIRDLTPD RMPHIIMYISDVCAP ALSAFKKLLPAMRPI TTLTIGNWQFRPVE VSGGLRVNIGRNLT KEGDLTMSAPEDP
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GSNTFPGNHIPGNG
ILDAGYYTVEYPKE NC_00 6559- gb: MASLQSEPGSQKP 2 106 9489 8512 NC_009489 HYQSDDQLVKRTW : 6559-8512 RSFFRFSVLVVTITS | LALSIITLIGVNRIST Organismo: AKQISNAFAAIQANI Vírus LSSIPDIRPINSLLNQ Mapuera | LVYTSSVTLPLRISS Nome da LESNVLAAIQEACT cepa: YRDSQSSCSATMS BeAnn VMNDQRYIEGIQVY 370284 | SGSFLDLQKHTLSP Nome da PIAFPSFIPTSTTTV proteína: GCTRIPSFSLTKTH proteína de WCYTHNYIKTGCRD fixação | ATQSNQYIALGTIYT Símbolo do DPDGTPGFSTSRS gene: HN QYLNDGVNRKSCSI
SAVPMGCALYCFIS VKEEVDYYKGTVPP AQTLILFFFNGTVHE HRIVPSSMNSEWV MLSPGVGSGVFYN
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NYIIFPLYGGMTKDK AEKRGELTRFFTPK NSRSLCKMNDSVF SNAAQSAYYPPYFS SRWIRSGLLACNW NQIITTNCEILTFSN QVMMMGAEGRLILI NDDLFYYQRSTSW WPRPLVYKLDIELN YPDSHIQRVDQVEV TFPTRPGWGGCVG NNFCPMICVSGVYQ DVWPVTNPVNTTD SRTLWVGGTLLSNT TRENPASVVTSGGS ISQTVSWFNQTVPG AYSTTTCFNDQVQ GRIFCLIIFEVGGGL LGEYQIVPFLKELKY
QGAVHA NC_01 6334- gb: MAPINYPASYYTNN 2 107 7937 8544 NC_017937 AERPVVITTKSTESK : 6334-8544 GQRPLPLGNARFW | EYFGHVCGTLTFCM
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Organismo: SLIGIIVGIIALANYSS vírus Nariva DKDWKGRIGGDIQV | Nome da TRMATEKTVKLILED cepa: TTPKLRNILDSVLFQ
UNKNOWN LPKMLASIASKINTQ - TPPPPTTSGHSTAL NC_017937 ATQCSSNCENRPEI | Nome da GYDYLRQVEQSLQ proteína: RITNISIQLLEASEIH proteína de SMAGAYPNALYKIR fixação | TQDSWSVTAKECP Símbolo do LQAFQPNLNLIPAMI gene: H GTATGALIRNCVRQ
PVIVVDDGVYMLTY LAMRGSCQDHQKS VRHFEMGVITSDPF GDPVPTPLRHWTK RALPAYDGCALAVK GHAGFALCTETSVG PLRDRTAKRKPNIV LFKASLVGELSERVI PPQSWLSGFSFFSV YTVAGKGYAYHSKF HAFGNVVRVGQSE YQAKCRGTGCPTA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
NQDDCNTAQRVSQ EDNTYLHQAILSVDI DSVIDPEDVVYVIER DQYYQASAGDLYR VPETGEILYNLHNG GWSNEVQVGRIQP SDRFYMREIQLTST RVPAPNGCNRVKG CPGGCVAVISPAFT PMHPEFNVGVGIFP MNQPHNPSIMHVQ QQTELFWKPIVGGN ITLHESSIACYSTVP PNPSYDLCIGVMTL LLHQGQLPQFQALS WYQPTMCNGNAPQ NRRALIPVIVEDSKA
MSVSSDAPRTP NC_02 9117- gb: MPQKTVEFINMNSP 2 108 5256 11015 NC_025256 LERGVSTLSDKKTL : 9117- NQSKITKQGYFGLG 11015 | SHSERNWKKQKNQ Organismo: NDHYMTVSTMILEIL Paramixovír VVLGIMFNLIVLTMV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento us de YYQNDNINQRMAEL morcego TSNITVLNLNLNQLT Eid_hel/GH- NKIQREIIPRITLIDTA M74a/GHA/ TTITIPSAITYILATLT 2009 | Nome TRISELLPSINQKCE da cepa: FKTPTLVLNDCRINC BatPV/Eid_ TPPLNPSDGVKMS hel/GH- SLATNLVAHGPSPC M74a/GHA/ RNFSSVPTIYYYRIP 2009 | Nome GLYNRTALDERCIL da proteína: NPRLTISSTKFAYVH glicoproteín SEYDKNCTRGFKYY a | Símbolo ELMTFGEILEGPEK do gene: G EPRMFSRSFYSPTN
AVNYHSCTPIVTVN EGYFLCLECTSSDP LYKANLSNSTFHLVI LRHNKDEKIVSMPS FNLSTDQEYVQIIPA EGGGTAESGNLYF PCIGRLLHKRVTHP LCKKSNCSRTDDES CLKSYYNQGSPQH QVVNCLIRIRNAQR DNPTWDVITVDLTN
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
TYPGSRSRIFGSFS KPMLYQSSVSWHT LLQVAEITDLDKYQL DWLDTPYISRPGGS ECPFGNYCPTVCW EGTYNDVYSLTPNN DLFVTVYLKSEQVA ENPYFAIFSRDQILK EFPLDAWISSARTT TISCFMFNNEIWCIA ALEITRLNDDIIRPIY YSFWLPTDCRTPYP HTGKMTRVPLRSTY
NY NC_02 6398- gb: MESIGKGTWRTVY 2 109 5347 8418 NC_025347 RVLTILLDVVIIILSVI : 6398-8418 ALISLGLKPGERIINE | VNGSIHNQLVPLSGI Organismo: TSDIQAKVSSIYRSN Paramixovír LLSIPLQLDQINQAIS us aviário 7 | SSARQIADTINSFLA Nome da LNGSGTFIYTNSPE cepa: FANGFNRAMFPTLN APMV- QSLNMLTPGNLIEF
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento 7/dove/Tenn TNFIPTPTTKSGCIRI essee/4/75 | PSFSMSSSHWCYT Nome da HNIIASGCQDHSTS proteína: SEYISMGVVEVTDQ hemaglutini AYPNFRTTLSITLAD na- NLNRKSCSIAATGF neuraminida GCDILCSVVTETEN se | Símbolo DDYQSPEPTQMIYG do gene: HN RLFFNGTYSEMSLN
VNQMFADWVANYP AVGSGVELADFVIF PLYGGVKITSTLGA SLSQYYYIPKVPTV NCSETDAQQIEKAK ASYSPPKVAPNIWA QAVVRCNKSVNLA NSCEILTFNTSTMM MGAEGRLLMIGKNV YFYQRSSSYWPVGI IYKLDLQELTTFSSN QLLSTIPIPFEKFPR PASTAGVCSKPNV CPAVCQTGVYQDL WVLYDLGKLENTTA VGLYLNSAVGRMN
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
PFIGIANTLSWYNTT RLFAQGTPASYSTT TCFKNTKIDTAYCLS ILELSDSLLGSWRIT
PLLYNITLSIMS NC_02 6590- gb: MPPVPTVSQSIDEG 2 110 5348 8548 NC_025348 SFTDIPLSPDDIKHP : 6590-8548 LSKKTCRKLFRIVTL | IGVGLISILTIISLAQQ Organismo: TGILRKVDSSDFQS vírus YVQESFKQVLNLMK Tuhoko 2 | QFSSNLNSLIEITSV Nome da TLPFRIDQFGTDIKT cepa: QVAQLVRQCNAVC
UNKNOWN RGPIKGPTTQNIVYP - ALYETSLNKTLETK NC_025348 NVRIQEVRQEVDPV | Nome da PGPGLSNGCTRNP proteína: SFSVYHGVWCYTH hemaglutini ATSIGNCNGSLGTS na- QLFRIGNVLEGDGG neuraminida APYHKSLATHLLTT se | Símbolo RNVSRQCSATASY do gene: HN YGCYFICSEPVLTE
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
RDDYETPGIEPITIF RLDPDGNWVVFPNI NRFTEYSLKALYPGI GSGVLFQGKLIFPM YGGIDKERLSALGL GNIGLIERRMADTC NHTEKELGRSFPGA FSSPYYHDAVMLNF LLICEMIENLPGDCD LQILNPTNMSMGSE SQLSVLDNELFLYQ RSASWWPYTLIYRL NMRYTGKYLKPKSII PMVIKSNTRPGYEG CNHERVCPKVCVT GVFQAPWILSIGRD HKERVSNVTYMVA WSMDKSDRTYPAV SVCGSDTCKLTVPL GDSKVHSAYSVTR CYLSRDHMSAYCL VIFELDARPWAEMR
IQSFLYKLILT NC_02 6451- gb: MHNRTQSVSSIDTS 2 111
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento 5350 8341 NC_025350 SDVYLPRRKKAVTK : 6451-8341 FTFKKIFRVLILTLLL | SIIIIIAVIFPKIDHIRE Organismo: TCDNSQILETITNQN vírus SEIKNLINSAITNLNV Tuhoko 3 | LLTSTTVDLPIKLNN Nome da FGKSIVDQVTMMVR cepa: QCNAVCRGPGDRP
UNKNOWN TQNIELFKGLYHTSP - PSNTSTKLSMITEAS NC_025350 NPDDIVPRPGKLLG | Nome da CTRFPSFSVHYGL proteína: WCYGHMASTGNCS hemaglutini GSSPSVQIIRIGSIGT na- NKDGTPKYVIIASAS neuraminida LPETTRLYHCSVTM se | Símbolo TSIGCYILCTTPSVS do gene: HN ETDDYSTMGIEKMS
ISFLSLDGYLTQLG QPTGLDNQNLYALY PGPGSGVIFRDFLIF PMMGGIRLMDAQK MLNRNITYRGFPPS ETCTESELKLKQEV ANMLTSPYYGEVLV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
LNFLYVCSLLDNIPG DCSVQLIPPDNMTL GAESRLYVLNGSLI MYKRGSSWWPYTE LYQINYRVNNRAFR VRESVRINTTSTSR PGVQGCNLEKVCP KVCVSGIYQSPGIIS APVNPTRQEEGLLY FLVWTSSMSSRTG PLSSLCDHSTCRITY PIGDDTIFIGYTDSS CFMSSIKEGIYCIAF LELDNQPYSMMAIR
SLSYIIN NC_02 8716- gb: MATNRDNTITSAEV 2 112 5352 11257 NC_025352 SQEDKVKKYYGVE : 8716- TAEKVADSISGNKV 11257 | FILMNTLLILTGAIITI Organismo: TLNITNLTAAKSQQ Vírus NMLKIIQDDVNAKLE Mojiang | MFVNLDQLVKGEIK Nome da PKVSLINTAVSVSIP cepa: GQISNLQTKFLQKY
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Tongguan1 | VYLEESITKQCTCN Nome da PLSGIFPTSGPTYP proteína: PTDKPDDDTTDDDK glicoproteín VDTTIKPIEYPKPDG a de fixação CNRTGDHFTMEPG | Símbolo do ANFYTVPNLGPASS gene: G NSDECYTNPSFSIG
SSIYMFSQEIRKTDC TAGEILSIQIVLGRIV DKGQQGPQASPLL VWAVPNPKIINSCA VAAGDEMGWVLCS VTLTAASGEPIPHM FDGFWLYKLEPDTE VVSYRITGYAYLLD KQYDSVFIGKGGGI QKGNDLYFQMYGL SRNRQSFKALCEH GSCLGTGGGGYQV LCDRAVMSFGSEE SLITNAYLKVNDLAS GKPVIIGQTFPPSDS YKGSNGRMYTIGDK YGLYLAPSSWNRYL RFGITPDISVRSTTW
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
LKSQDPIMKILSTCT NTDRDMCPEICNTR GYQDIFPLSEDSEY YTYIGITPNNGGTKN FVAVRDSDGHIASID ILQNYYSITSATISCF MYKDEIWCIAITEGK KQKDNPQRIYAHSY KIRQMCYNMKSATV
TVGNAKNITIRRY NC_02 6503- gb: MESATSQVSFEND 2 113 5363 8347 NC_025363 KTSDRRTWRAVFR : 6503-8347 VLMIILALSSLCVTV | AALIYSAKAAIPGNI Organismo: DASEQRILSSVEAV Paramixovír QVPVSRLEDTSQKI us aviário 12 YRQVILEAPVTQLN | Nome da METNILNAITSLSYQI cepa: DASANSSGCGAPV Wigeon/Italy HDSDFTGGVGRELL /3920_1/200 QEAEVNLTIIRPSKF 5 | Nome da LEHLNFIPAPTTGN proteína: GCTRIPSFDLGQTH hemaglutini WCYTHNVVLNGCR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento na- DRGHSFQYVALGIL neuraminida RTSATGSVFLSTLR se | Símbolo SVNLDDDRNRKSC do gene: HN SVSATPIGCEMLCS
LVTETEEGDYDSID PTPMVHGRLGFDG KYREVDLSEKEIFA DWRANYPAVGGGA FFGNRVWFPVYGG LKEGTQSERDAEK GYAIYKRFNNTCPD DNTTQIANAKASYR PSRFGGRFIQQGIL SFKVEGNLGSDPIL SLTDNSITLMGAEA RVMNIENKLYLYQR GTSWFPSALVYPLD VANTAVKVRAPYIF DKFTRPGGHPCSA SSRCPNVCVTGVYT DAYPLVFSRSHDIV AVYGMQLAAGTAR LDPQAAIWYGNEM STPTKVSSSTTKAA YTTSTCFKVTKTKRI
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
YCISIAEIGNTLFGEF RIVPLLIEVQKTPLT RRSELRQQMPQPPI DLVIDNPFCAPSGN LSRKNAIDEYANSW
P NC_02 6619- gb: MEPTGSKVDIVPSQ 2 114 5373 8605 NC_025373 GTKRTCRTFYRLLIL : 6619-8605 ILNLIIIILTIISIYVSIST | DQHKLCNNEADSLL Organismo: HSIVEPITVPLGTDS Paramixovír DVEDELREIRRDTGI us aviário 3 | NIPIQIDNTENIILTTL Nome da ASINSNIARLHNATD cepa: ESPTCLSPVNDPRF turkey/Wisc IAGINKITKGSMIYR onsin/68 | NFSNLIEHVNFIPSP Nome da TTLSGCTRIPSFSLS proteína: KTHWCYSHNVISTG hemaglutini CQDHAASSQYISIGI na | Símbolo VDTGLNNEPYLRTM do gene: HN SSRLLNDGLNRKSC
SVTAGAGVCWLLC SVVTESESADYRSR
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APTAMILGRFNFYG DYTESPVPASLFSG RFTANYPGVGSGT QLNGTLYFPIYGGV VNDSDIELSNRGKS FRPRNPTNPCPDPE VTQSQRAQASYYP TRFGRLLIQQAILAC RISDTTCTDYYLLYF DNNQVMMGAEARI YYLNNQMYLYQRS SSWWPHPLFYRFS LPHCEPMSVCMITD THLILTYATSRPGTS ICTGASRCPNNCVD GVYTDVWPLTEGTT QDPDSYYTVFLNSP NRRISPTISIYSYNQ KISSRLAVGSEIGAA YTTSTCFSRTDTGA LYCITIIEAVNTIFGQ
YRIVPILVQLISD NC_02 7541- gb: MKAMHYYKNDFAD 2 115 5386 9403 NC_025386 PGTNDNSSDLTTNP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento : 7541-9403 FISNQIKSNLSPPVL | AEGHLSPSPIPKFR Organismo: KILLTISFVSTIVVLT Vírus de VILLVLTIRILTIIEAS Salem | AGDEKDIHTILSSLL Nome da NTFMNEYIPVFKNL cepa: VSIISLQIPQMLIDLK
UNKNOWN TSSTQMMQSLKTFP - RDLETLSTVTQSVA NC_025386 VLLEKAKSTIPDINK | Nome da FYKNVGKVTFNDPN proteína: IKVLTLEVPAWLPIV glicoproteín RQCLKQDFRQVISN a de fixação STGFALIGALPSQLF | Símbolo do NEFEGYPSLAIVSE gene: G VYAITYLKGVMFEN
QENFLYQYFEIGTIS PDGYNKPYFLRHTS VMLSTFKLSGKCTA AVDYRGGIFLCTPS PKIPKILQNPPDLPT LTVVSIPFDGRYTIR NISLMLTDEADIIYDL DTLQGRGVLQAMR FYALVRVISSSSPR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
HFPFCKNSWCPTA DDKICDQSRRLGAD GNYPVMYGLISIPA HSSYQGNVSLKLID PKYYAYTRDASLFY NSMTDTYHYSFGT RGWVSRPIIGELLL GDDIVLTRYTVRSV SRATAGDCTTVSM CPQACSGGMNSIFY PLNFDKPQVTGVAI RQYERQQEGIIVVT MNDHYYYSVPIIKN GTLLISSVTDCFWL MGDLWCMSLMEKN NLPLGVRSLAHLTW
NIHWSCS NC_02 6647- gb: MESGISQASLVNDN 2 116 5390 8386 NC_025390 IELRNTWRTAFRVV : 6647-8386 SLLLGFTSLVLTACA | LHFALNAATPADLS Organismo: SIPVAVDQSHHEILQ paramixovír TLSLMSDIGNKIYKQ us aviário 9 | VALDSPVALLNTES
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Nome da TLMSAITSLSYQINN cepa: AANNSGCGAPVHD pato/Nova KDFINGVAKELFVG York/22/197 SQYNASNYRPSRFL 8 | Nome da EHLNFIPAPTTGKG proteína: CTRIPSFDLAATHW hemaglutini CYTHNVILNGCNDH na- AQSYQYISLGILKVS neuraminida ATGNVFLSTLRSINL se | Símbolo DDDENRKSCSISAT do gene: HN PLGCDLLCAKVTER
EEADYNSDAATRLV HGRLGFDGVYHEQ ALPVESLFSDWVAN YPSVGGGSYFDNR VWFGVYGGIRPGS QTDLLQSEKYAIYR RYNNTCPDNNPTQI ERAKSSYRPQRFG QRLVQQAILSIRVEP SLGNDPKLSVLDNT VVLMGAEARIMTFG HVALMYQRGSSYF PSALLYPLSLTNGS AAASKPFIFEQYTR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
PGSPPCQATARCP NSCVTGVYTDAYPL FWSEDHKVNGVYG MMLDDITSRLNPVA AIFDRYGRSRVTRV SSSSTKAAYTTNTC FKVVKTKRVYCLSIA EIENTLFGEFRITPLL SEIIFDPNLEPSDTS
RN NC_02 6692- gb: MATNLSTITNGKFS 2 117 5403 8645 NC_025403 QNSDEGSLTELPFF : 6692-8645 EHNRKVATTKRTCR | FVFRSVITLCNLTILI Organismo: VTVVVLFQQAGFIK vírus RTESNQVCETLQN Achimota 1 | DMHGVVTMSKGVIT Nome da TLNNLIEITSVNLPF cepa: QMKQFGQGIVTQV
UNKNOWN TQMVRQCNAVCKG - PTIGPDIQNIVYPAS NC_025403 YESMIKHPVNNSNIL | Nome da LSEIRQPLNFVPNT proteína: GKLNGCTRTPSFSV
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento proteína de YNGFWCYTHAESD fixação | WNCNGSSPYMQVF Símbolo do RVGVVTSDYDYNVI gene: HN HKTLHTKTSRLANV
TYQCSTISTGYECY FLCSTPNVDEITDYK TPGIESLQIYKIDNR GTFAKFPITDQLNK ELLTALYPGPGNGV LYQGRLLFPMHGG MQSSELNKVNLNNT VLSQFNDNKGCNA TEIKLESEFPGTFTS PYYSNQVMLNYILIC EMIENLPGNCDLQI VAPKNMSMGSESQ LYSINNKLYLYQRS SSRWPYPLIYEVGT RLTNRQFRLRAINR FLIKSTTRPGSEGC NIYRVCPKVCVTGV YQAPWILHVSKAGS QSIAKVLYAVAWSK DHMSRKGPLFSICD NDTCFLTKSLASEH
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
VHSGYSITRCYLEN SERHIICVVIMELDA SPWAEMRIQSVIYNI
TLPS NC_02 6655- gb: MDNSMSISTISLDA 2 118 5404 8586 NC_025404 QPRIWSRHESRRT : 6655-8586 WRNIFRITSLVLLGV | TVIICIWLCCEVARE Organismo: SELELLASPLGALIM vírus AINTIKSSVVKMTTE Achimota 2 | LNQVTFTTSIILPNK Nome da VDQFGQNVVSQVA cepa: QLVKQCNAVCRGH
UNKNOWN QDTPELEQFINQKN - PTWILQPNYTTKLT NC_025404 NLHEIDSIIPLVDYP | Nome da GFSKSCTRFPSFSE proteína: GSKFWCFTYAVVK proteína de EPCSDISSSIQVVKY fixação | GAIKANHSDGNPYL Símbolo do VLGTKVLDDGKFRR gene: HN GCSITSSLYGCYLL
CSTANVSEVNDYAH TPAYPLTLELISKDG
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
ITTDLSPTYTVQLDK WSALYPGIGSGVIF KGYLMFPVYGGLPF KSPLISASWVGPGN KWPVDFSCSEDQY STFNFSNPYSALYS PHFSNNIVVSALFV CPLNENLPYSCEVQ VLPQGNLTIGAEGR LYVIDQDLYYYQRS TSWWPYLQLYKLNI RITNRVFRVRSLSLL PIKSTTRPGYGNCT YFKLCPHICVTGVY QSPWLISIRDKRPH EEKNILYFIGWSPDE QIRQNPLVSLCHET ACFINRSLATNKTH AGYSESHCVQSFE RNKLTCTVFYELTA KPWAEMRVQSLLF
QVDFL NC_02 6799- gb: MDSRSDSFTDIPLD 2 119 5410 8869 NC_025410 NRIERTVTSKKTWR
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento : 6799-8869 SIFRVTAIILLIICVVV | SSISLNQHNDAPLN Organismo: GAGNQATSGFMDAI vírus KSLEKLMSQTINEL Tuhoko 1 | NQVVMTTSVQLPN Nome da RITKFGQDILDQVTQ cepa: MVRQCNAVCRGPG
UNKNOWN VGPSIQNYVIQGHA - PTVSFDPISAEYQK NC_025410 FVFGITEKTLITAYH | Nome da NPWECLRFPSQHL proteína: FDTTWCVSYQILTQ hemaglutini NCSDHGPRITVIQL na- GEIMIANNLSTVFRD neuraminida PVIKYIRHHIWLRSC se | Símbolo SVVAYYSQCTIFCT do gene: HN STNKSEPSDYADTG
YEQLFLATLQSDGT FTEHSMHGVNIVHQ WNAIYGGVGNGVII GRNMLIPLYGGINY YDHNTTIVQTVDLR PYPIPDSCSQTDNY QTNYLPSMFTNSYY GTNLVVSGYLSCRL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
MAGTPTSCSIRVIPI ENMTMGSEGQFYLI NNQLYYYKRSSNWI RDTQVYLLSYSDKG NIIEITSAERYIFKSV TSPDEGDCVTNHG CPSNCIGGLFQAPW ILNDFKLCGSNITCP KIVTVWADQPDKRS NPMLSIAETDKLLLH KSYINYHTAVGYST VLCFDSPKLNLKTC VVLQELMSDDKLLI
RISYSIVSIMVE NC_02 7059- gb: MFSHQDKVGAFYK 2 120 8249 9010 NC_028249 NNARANSSKLSLVT : 7059-9010 DEVEERRSPWFLSI | LLILLVGILILLAITGIR Organismo: FHQVVKSNLEFNKL Vírus da LIEDMEKTKAVHHQ cinomose VKDVLTPLFKIIGDE focina | VGLRLPQKLNEIKQ Nome da FIVQKTNFFNPNRE cepa: FDFRELHWCINPPS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento PDV/Wadde KVKVNFTQYCEITE n_Sea.NLD/ FKEATRSVANSILLL 1988 | Nome TLYRGRDDIFPPYK da proteína: CRGATTSMGNVFP proteína LAVSLSMSLISKPSE hemaglutini VINMLTAISEGIYGK na | Símbolo TYLLVTDDTEENFE do gene: H TPEIRVFEIGFINRW
LGDMPLFQTTNYRII SNNSNTKICTIAVGE LALASLCTKESTILL NLGDEESQNSVLVV ILGLFGATHMDQLE EVIPVAHPSIEKIHIT NHRGFIKDSVATW MVPALALSEQGEQI NCLRSACKRRTYP MCNQTSWEPFGDK RLPSYGRLTLSLDV STDLSINVSVAQGPI IFNGDGMDYYEGTL LNSGWLTIPPKNGTI LGLINQASKGDQFIV TPHILTFAPRESSTD CHLPIQTYQIQDDD
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
VLLESNLVVLPTQS FEYVVATYDVSRSD HAIVYYVYDPARTV SYTYPFRLRTKGRP DILRIECFVWDGHL WCHQFYRFQLDAT NSTSVVENLIRIRFS
CDRLDP NC_02 6951- gb: MEYWGHTNNPDKI 2 121 8362 8675 NC_028362 NRKVGVDQVRDRS : 6951-8675 KTLKIITFIISMMTSIM | STVALILILIMFIQNN Organismo: NNNRIILQELRDETD Vírus da AIEARIQKASNDIGV parainfluenz SIQSGINTRLLTIQN a caprina 3 | HVQNYIPLALTQQV Nome da SSLRESINDVITKRE cepa: ETQSKMPIQRMTHD JS2013 | DGIEPLIPDNFWKC Nome da PSGIPTISASPKIRLI proteína: PGPGLLATSTTING hemaglutini CIRLPSLVINNLIYAY na- TSNLITQGCQDIGK neuraminida SYQVLQIGIITINSDL
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento se | Símbolo VPDLNPRITHTFDID do gene: HN DNRKSCSLALRNAD
VYQLCSTPKVDERS DYSSIGIEDIVLDIVT SEGTVSTTRFTNNN ITFDKPYAALYPSV GPGIYYDNKIIFLGY GGLEHEENGDVICN ITGCPGKTQHDCNQ ASYSPWFSNRRMV NAIILVNKGLNKVPS LQVWTIPMRQNYW GSEGRLLLLGNKIYI YTRSTSWHSKLQL GTLDISNYNDIRIRW THHDVLSRPGSEEC PWGNTCPRGCITG VYNDAYPLNPSGSV VSSVILDSRTSREN PIITYSTDTSRVNEL AIRNNTLSAAYTTTN CVTHYGKGYCFHIIE INHKSLNTLQPMLF KTEIPKSCN
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento AB548 5999- gb: MGSELYIIEGVSSSE 1 122 428 7261 AB548428: IVLKQVLRRSKKILL 5999-7261 | GLVLSALGLTLTSTI Organismo: VISICISVEQVKLRQ metapneum CVDTYWAENGSLH ovírus PGQSTENTSTRGKT aviário | TTKDPRRLQATGAG Nome da KFESCGYVQVVDG cepa: DMHDRSYAVLGGV VCO3/6061 DCLGLLALCESGPI 6 | Nome da CQGDTWSEDGNFC proteína: RCTFSSHGVSCCK glicoproteín KPKSKATTAQRNSK a de fixação PANSKSTPPVHSDR | Símbolo do ASKEHNPSQGEQP gene: G RRGPTSSKTTIAST
PSTEDTAKPTISKPK LTIRPSQRGPSGST KAASSTPSHKTNTR GTSKTTDQRPRTG PTPERPRQTHSTAT PPPTTPIHKGRAPT PKPTTDLKVNPREG STSPTAIQKNPTTQ SNLVDCTLSDPDEP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
QRICYQVGTYNPSQ SGTCNIEVPKCSTY GHACMATLYDTPFN CWRRTRRCICDSG
GELIEWCCTSQ AF0797 8118- gb: MDYHSHTTQTGSN 1 123 80 10115 AF079780 | ETLYQDPLQSQSG Organismo: SRDTLDGPPSTLQH Tupaia YSNPPPYSEEDQGI paramixovír DGPQRSQPLSTPH us | Nome QYDRYYGVNIQHTR da cepa: VYNHLGTIYKGLKL
UNKNOWN AFQILGWVSVIITMII -AF079780 | TVTTLKKMSDGNSQ Nome da DSAMLKSLDENFDA proteína: IQEVANLLDNEVRP hemaglutini KLGVTMTQTTFQLP na | Símbolo KELSEIKRYLLRLER do gene: H NCPVCGTEATPQG
SKGNASGDTAFCP PCLTRQCSEDSTHD QGPGVEGTSRNHK GKINFPHILQSDDC GRSDNLIVYSINLVP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GLSFIQLPSGTKHCI IDVSYTFSDTLAGYL IVGGVDGCQLHNKA IIYLSLGYYKTKMIYP PDYIAIATYTYDLVP NLRDCSIAVNQTSL AAICTSKKTKENQD FSTSGVHPFYIFTLN TDGIFTVTVIEQSQL KLDYQYAALYPATG PGIFIGDHLVFLMW GGLMTKAEGDAYC QASGCNDAHRTSC NIAQMPSAYGHRQL VNGLLMLPIKELGS HLIQPSLETISPKIN WAGGHGRLYYNW EINTTYIYIEGKTWR SRPNLGIISWSKPLS IRWIDHSVARRPGA RPCDSANDCPEDC LVGGYYDMFPMSS DYKTAITIIPTHHQW PSSPALKLFNTNRE VRVVMILRPPNNVK
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
KTTISCIRIMQTNWC LGFIIFKEGNNAWG QIYSYIYQVESTCPN
TK AY590 6138- gb: MEVKVENVGKSQE 1 124 688 7935 AY590688: LKVKVKNFIKRSDC 6138-7935 | KKKLFALILGLVSFE Organismo: LTMNIMLSVMYVES metapneum NEALSLCRIQGTPA ovírus PRDNKTNTENATKE aviário | TTLHTTTTTRDPEV Nome da RETKTTKPQANEGA cepa: TNPSRNLTTKGDKH Colorado | QTTRATTEAELEKQ Nome da SKQTTEPGTSTQKH proteína: TPTRPSSKSPTTTQ glicoproteín AIAQLTTPTTPKAST a de fixação APKNRQATTKKTET | Símbolo do DTTTASRARNTNNP gene: G TETATTTPKATTET
GKSKEGPTQHTTKE QPETTAGETTTPQP RRTASRPAPTTKIE EEAETTKTRTTKST
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
QTSTGPPRPTGGA PSGAATEGSGRAA AAGGPSAASAGGR RRTEAAAERDRRT RAGAGPTAGGARA RTAAASERGADTA GSAGGGPGGDGAT GGLSGGAPAERED ASGGTAAAGPGDG TEADGRAPPAAALA GRTTESAAGAAGD SGRAGTAGWGSAA DGRSTGGNAAAEA GAAQSGRAAPRQP SGGTAPESTAPPNS GGSGRADAAPTEE VGVGSGLWRGRYV CGPCGESVPEHPM NPCFGDGTAWICS DDGGSLPAGCYDG GTDGVVCCGVCGG NSCCCGRVECTCG GGAGLLSCCCGSY SWS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento EU403 6620- gb: MESPPSGKDAPAF 1 125 085 8593 EU403085: REPKRTCRLCYRAT 6620-8593 | TLSLNLTIVVLSIISIY Organismo: VSTQTGANNSCVN Paramixovír PTIVTPDYLTGSTTG us aviário 3 | SVEDLADLESQLRE Nome da IRRDTGINLPVQIDN cepa: TENLILTTLASINSNL APMV3/PK RFLQNATTESQTCL T/Netherlan SPVNDPRFVAGINRI d/449/75 | PAGSMAYNDFSNLI Nome da EHVNFIPSPTTLSG proteína: CTRIPSFSLSKTHW proteína CYTHNVISNGCLDH hemaglutini AASSQYISIGIVDTG na- LNNEPYFRTMSSKS neuraminida LNDGLNRKSCSVTA se | Símbolo AANACWLLCSVVTE do gene: HN YEAADYRSRTPTAM
VLGRFDFNGEYTEI AVPSSLFDGRFASN YPGVGSGTQVNGT LYFPLYGGVLNGSD IETANKGKSFRPQN PKNRCPDSEAIQSF
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
RAQDSYYPTRFGK VLIQQAIIACRISNKS CTDFYLLYFDNNRV MMGAEARLYYLNN QLYLYQRSSSWWP HPLFYSISLPSCQAL AVCQITEAHLTLTYA TSRPGMSICTGASR CPNNCVDGVYTDV WPLTKNDAQDPNL FYTVYLNNSTRRISP TISLYTYDRRIKSKL AVGSDIGAAYTTST CFGRSDTGAVYCLT IMETVNTIFGQYRIV
PILLRVTSR FJ9775 6139- gb: MEVKVENVGKSQE 1 126 68 7936 FJ977568: LKVKVKNFIKRSDC 6139-7936 | KKKLFALILGLVSFE Organismo: LTMNIMLSVMYVES metapneum NEALSLCRIQGTPA ovírus PRDNKTNTENATKE aviário | TTLHTTTTTRDPEV Nome da RETKTTKPQANEGA
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento cepa: TNPSRNLTTKGDKH aMPV/MN/t QTTRATTEAELEKQ urkey/2a/97 SKQTTEPGTSTQKH | Nome da TPARPSSKSPTTTQ proteína: ATAQPTTPTAPKAS glicoproteín TAPKNRQATTKKTE a de fixação TDTTTASRARNTNN | Símbolo do PTETATTTPKATTET gene: G GKGKEGPTQHTTK
EQPETTARETTTPQ PRRTASRPAPTTKI EEEAETTKTRTTKN TQTSTGPPRPTRST PSKTATENNKRTTT TKRPNTASTDSRQ QTRTTAEQDQQTQ TRAKPTTNGAHPQT TTTPEHNTDTTNST KGSPKEDKTTRDPS SKTPTEQEDASKGT AAANPGGSAEADR RAPPATTPTGRTTE SAAGTTGDDSGAE TTRRRSAADRRPT GGSTAAEAGTAQS
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GRATPKQPSGGTA AGNTAPPNNESSG RADAAPAEEAGVG PSIRRGRHACGPRR ESAPEHPTNPCPG DGTAWTRSDGGGN LPAGRHDSGADGA ARRGARGGNPRRR GRAERTRGGGAGP
PSCRCGSHNRS HG934 5997- gb: MGAKLYAISGASDA 1 127 339 7166 HG934339: QLMKKTCAKLLEKV 5997-7166 | VPIIILAVLGITGTTTI Organismo: ALSISISIERAVLSDC metapneum TTQLRNGTTSGSLS ovírus NPTRSTTSTAVTTR aviário tipo DIRGLQTTRTRELK D | Nome da SCSNVQIAYGYLHD cepa: SSNPVLDSIGCLGL Turkey/1985 LALCESGPFCQRNY /Fr85.1 | NPRDRPKCRCTLR Nome da GKDISCCKEPPTAV proteína: TTSKTTPWGTEVHP glicoproteín TYPTQVTPQSQPAT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento a de fixação MAHQTATANQRSS | Símbolo do TTEPVGSQGNTTSS gene: G NPEQQTEPPPSPQ
HPPTTTSQDQSTET ADGQEHTPTRKTPT ATSNRRSPTPKRQE TGRATPRNTATTQS GSSPPHSSPPGVD ANMEGQCKELQAP KPNSVCKGLDIYRE ALPRGCDKVLPLCK TSTIMCVDAYYSKP PICFGYNQRCFCME
TFGPIEFCCKS JN0321 4659- gb: MSKNKNQRTARTL 1 128 16 5252 JN032116: EKTWDTLNHLIVISS 4659-5252 | CLYKLNLKSIAQIAL Organismo: SVLAMIISTSLIIAAIIF Vírus IISANHKVTLTTVTV sincicial QTIKNHTEKNITTYL respiratório | TQVSPERVSPSKQ Nome da PTTTPPIHTNSATIS cepa: PNTKSEIHHTTAQT B/WI/629- KGRTSTPTQNNKP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
12/06-07 | NTKPRPKNPPKKDD Nome da YHFEVFNFVPCSIC proteína: GNNQLCKSICKTIPS glicoproteín NKPRKNQP a de fixação | Símbolo do gene: G
KX258 6254- gb: MEGSRTVIYQGDPN 1 129 200 7996 KX258200: EKNTWRLVFRTLTLI 6254-7996 | LNLAILSVTIASIIITS Organismo: KITLSEVTTLKTEGV Paramixovír EEVITPLMATLSDSV us aviário 14 QQEKMIYKEVAISIP | Nome da LVLDKIQTDVGTSV cepa: AQITDALRQIQGVN APMV14/du GTQAFALSNAPEYS ck/Japan/11 GGIEVPLFQIDSFVN OG0352/20 KSMSISGLLEHASFI 11 | Nome PSPTTLHGCTRIPSF da proteína: HLGPRHWCYTHNII proteína GSRCRDEGFSSMYI hemaglutini SIGAITVNRDGNPLF na- ITTASTILADDNNRK neuraminida SCSIIASSYGCDLLC
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento se | Símbolo SIVTESENDDYANP do gene: HN NPTKMVHGRFLYN
GSYVEQALPNSLFQ DKWVAQYPGVGSG ITTHGKVLFPIYGGI KKNTQLFYELSKYG FFAHNKELECKNMT EEQIRDIKAAYLPSK TSGNLFAQGIIYCNI SKLGDCNVAVLNTS TTMMGAEGRLQMM GEYVYYYQRSSSW WPVGIVYKKSLAEL MNGINMEVLSFEPI PLSKFPRPTWTAGL CQKPSICPDVCVTG VYTDLFSVTIGSTTD KDTYFGVYLDSATE RKDPWVAAADQYE WRNRVRLFESTTEA AYTTSTCFKNTVNN RVFCVSIVELRENLL GDWKIVPLLFQIGV SQGPPPK
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento KX940 7978- gb: MSQLAAHNLAMSN 1 130 961 12504 KX940961: FYGTHQGDLSGSQ 7978-12504 KGEEQQVQGVIRY | VSMIVGLLSLFTIIAL Organismo: NVTNIIYMTESGGT Vírus MQSIKTAQGSIDGS Beilong | MREISGVIMEDVKP Nome da KTDLINSMVSYNIPA cepa: QLSMIHQIIKNDVLK ERN081008 QCTPSFMFNNTICP _1S | Nome LAENPTHSRYFEEV da proteína: NLDSISECSGPDMH glicoproteín LGLGVNPEFIEFPSF a de fixação APGSTKPGSCVRLP | Símbolo do SFSLSTTVFAYTHTI gene: G MGHGCSELDVGDH
YFSVGRIADAGHEIP QFETISSWFINDKIN RRSCTVAAGAMEA WMGCVIMTETFYD DLNSLDTGKLTISYL DVFGRKKEWIYTRS EILYDYTYTSVYFSV GSGVVVGDTVYFLI WGSLSSPIEETAYC
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
FAPDCSNYNQRMC NEAQRPSKFGHRQ MVNGILKFKTTSTG KPLLSVGTLSPSVV PFGSEGRLMYSEIT KIIYLYLRSTSWHAL PLTGLFVLGPPTSIS WIVQRAVSRPGEFP CGASNRCPKDCVT GVYTDLFPLGSRYE YAATVYLNSETYRV NPTLALINQTNIIASK KVTTESQRAGYTTT TCFVFKLRVWCISV VELAPSTMTAYEPI PFLYQLDLTCKGKN GSLAMRFTGKEGT YKSGRYKSPRNEC FFEKVSNKYYFIVST PEGIQPYEIRDLTPD RMPHIIMYISDVCAP ALSAFKKLLPAMRPI TTLTIGNWQFRPVE VSGGLRVSIGRNLT KEGDLTMSAPEDP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
GSNTFPGGHIPGNG LFDAGYYTVEYPKE WKQTTPKPSEGGNI IDKNKTPVIPSRDNP TSDSSIPHRESIEPV RPTREVLKSSDYVT IVSTDSGSGSGDFA TGVPWTGVSPKAP QNGINLPGTELPHP TVLDRINTPAPSDP KVSADSDHTRDTID PTALSKPLNHDTTG DTDTRINTGTATYG FTPGREATSSGKLA NDLTNSTSVPSEAH PSASTSEASKPEKN TDNRVTQDPTSGTA ERPTTNAPVDGKHS TQLTDARPNTADPE RTSQHSSSTTRDEV KPSLPSTTEASTHQ RTEAATPPELVNNT LNPPSTQVRSVRSL MQDAIAQAWNFVR GVTP
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento KY511 6454- gb: MERGISEVALANDR 1 131 044 8310 KY511044: TEEKNTWRLIFRITV 6454-8310 | LVVSVITLGLTAASL Organismo: VYSMNAAQPADFD paramixovír GIIPAVQQVGTSLTN us aviário SIGGMQDVLDRTYK UPO216 | QVALESPLTLLNME Nome da STIMNAITSLSYKIN cepa: NGGNSSGCGAPIH APMV- DPEYIGGIGKELLID 15/WB/Kr/U DNVDVTSFYPSAFK PO216/201 EHLNFIPAPTTGAG 4 | Nome da CTRIPSFDLSATHY proteína: CYTHNVILSGCQDH proteína SHSHQYIALGVLKL hemaglutini SDTGNVFFSTLRSI na- NLDDTANRKSCSIS neuraminida ATPLGCDILCSKVT se | Símbolo ETELEDYKSEEPTP do gene: HN MVHGRLSFDGTYS
EKDLDVNNLFSDWT ANYPSVGGGSYIGN RVWYAVYGGLKPG SNTDQSQRDKYVIY KRYNNTCPDPEDY
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento
QINKAKSSYTPSYF GSKRVQQAILSIAVS PTLGSDPVLTPLSN DVVLMGAEGRVMHI GGYTYLYQRGTSY YSPALLYPLNIQDKS ATASSPYKFDAFTR PGSVPCQADARCP QSCVTGVYTDPYPL IFAKDHSIRGVYGM MLNDVTARLNPIAA VFSNISRSQITRVSS SSTKAAYTTSTCFK VIKTNRIYCMSIAEIS NTLFGEFRIVPLLVE ILSNGGNTARSAGG TPVKESPKGWSDAI AEPLFCTPTNVTRY
NADIRRYAYSWP NC_02 8127- gb: MPPAPSPVHDPSS 1 132 5360 10158 NC_025360 FYGSSLFNEDTASR : 8127- KGTSEEIHLLGIRW 10158 | NTVLIVLGLILAIIGIG Organismo: IGASSFSASGITGNT
ID de Nucleotíd ID de Sequência Nº de SEQ Genba eos de sequência Sequên ID nk CDS completa cias/ NO Agrupa mento Paramixovír TKEIRLIVEEMSYGL us do VRISDSVRQEISPKV salmão do TLLQNAVLSSIPALV Atlântico | TTETNTIINAVKNHC Nome da NSPPTPPPPTEAPL cepa: KKHETGMAPLDPTT ASPV/Yrkje YWTCTSGTPRFYS 371/95 | SPNATFIPGPSPLP Nome da HTATPGGCVRIPSM proteína: HIGSEIYAYTSNLIA proteína SGCQDIGKSYQNV hemaglutini QIGVLDRTPEGNPE na- MSPMLSHTFPINDN neuraminida RKSCSIVTLKRAAYI se | Símbolo YCSQPKVTEFVDYQ do gene: HN TPGIEPMSLDHINAN
GTTKTWIYSPTEVV TDVPYASMYPSVG SGVVIDGKLVFLVY GGLLNGIQVPAMCL SPECPGIDQAACNA SQYNQYLSGRQVV NGIATVDLMNGQKP HISVETISPSKNWF GAEGRLVYMGGRL
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[0613] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína dependente de pH, um homólogo da mesma, um fragmento da mesma e uma fusão de proteína que compreende uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Os fusogênios podem mediar a fusão da membrana na superfície da célula ou em um endossomo ou em outro espaço ligado à membrana da célula.
[0614] Em algumas modalidades, o fusogênio inclui um EFF-1, AFF-1, proteína de junção de lacuna, por exemplo, uma conexina (tal como Cn43, GAP43, CX43) (DOI: 10.1021/jacs.6b05191), outras proteínas de conexão de tumor, um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma variante da mesma e uma fusão de proteínas que compreende uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas.
FUSOGÊNIOS LIPÍDICOS
[0615] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP pode compreender um ou mais lipídios fusogênicos, como ácidos graxos saturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos saturados têm entre 10 a 14 carbonos. Em algumas modalidades, os ácidos graxos saturados têm ácidos carboxílicos de cadeia mais longa. Em algumas modalidades, os ácidos graxos saturados são monoésteres.
[0616] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP pode compreender um ou mais ácidos graxos insaturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos insaturados têm entre C16 e C18 ácidos graxos insaturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos insaturados incluem ácido oleico, mono-oleato de glicerol, glicerídeos, diacilglicerol, ácidos graxos insaturados modificados e qualquer combinação dos mesmos.
[0617] Sem desejar estar limitado pela teoria, em algumas modalidades, os lipídios de curvatura negativa promovem a fusão da membrana. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende um ou mais lipídios de curvatura negativa, por exemplo, lipídios de curvatura negativa exógena, na membrana. Nas modalidades, o lipídio de curvatura negativa ou um precursor do mesmo é adicionado ao meio que compreende células de origem, vetor retroviral ou VLP. Nas modalidades, a célula de origem é projetada para expressar ou superexpressar um ou mais genes de síntese de lipídios. O lipídio de curvatura negativa pode ser, por exemplo, diacilglicerol (DAG), colesterol, ácido fosfatídico (PA), fosfatidiletanolamina (PE) ou ácido graxo (FA).
[0618] Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, os lipídios de curvatura positiva inibem a fusão da membrana. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende níveis reduzidos de um ou mais lipídios de curvatura positiva, por exemplo, lipídios de curvatura positiva exógena, na membrana. Nas modalidades, os níveis são reduzidos pela inibição da síntese do lipídeo, por exemplo, por knockout ou knockdown de um gene de síntese de lipídeos, na célula de origem. O lipídeo de curvatura positiva pode ser, por exemplo, lisofosfatidilcolina (LPC), fosfatidilinositol (PtdIns), ácido lisofosfatídico (LPA), lisofosfatidiletanolamina (LPE) ou monoacilglicerol (MAG).
FUSOGÊNIOS QUÍMICOS
[0619] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP pode ser tratado com produtos químicos fusogênicos. Em algumas modalidades, o produto químico fusogênico é polietilenoglicol (PEG) ou derivados do mesmo.
[0620] Em algumas modalidades, o fusogênio químico induz uma desidratação local entre as duas membranas que leva a um empacotamento molecular desfavorável da bicamada. Em algumas modalidades, o fusogênio químico induz a desidratação de uma área próxima à bicamada lipídica, causando o deslocamento de moléculas aquosas entre duas membranas e permitindo a interação entre as duas membranas juntas.
[0621] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um cátion positivo. Alguns exemplos não limitantes de cátions positivos incluem Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, La3+, Sr3+ e H+.
[0622] Em algumas modalidades, o fusogênio químico se liga à membrana alvo, modificando a polaridade da superfície, o que altera a repulsão entre membranas dependente da hidratação.
[0623] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um solúvel de lipídeo solúvel. Alguns exemplos não limitantes incluem oleoilglicerol, dioleoilglicerol, trioleoilglicerol e variantes e derivados dos mesmos.
[0624] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um produto químico solúvel em água. Alguns exemplos não limitantes incluem polietilenoglicol, dimetilsulfóxido e variantes e derivados dos mesmos.
[0625] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é uma pequena molécula orgânica. Um exemplo não limitante inclui brometo de n-hexila.
[0626] Em algumas modalidades, o fusogênio químico não altera a constituição, a viabilidade celular ou as propriedades de transporte de íons do fusogênio ou membrana alvo.
[0627] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um hormônio ou uma vitamina. Alguns exemplos não limitantes incluem ácido abscísico, retinol (vitamina A1), um tocoferol (vitamina E) e variantes e derivados dos mesmos.
[0628] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende actina e um agente que estabiliza a actina polimerizada. Sem desejar ser limitado pela teoria, a actina estabilizada em um vetor retroviral ou VLP pode promover a fusão com uma célula-alvo. Nas modalidades, o agente que estabiliza a actina polimerizada é escolhido dentre actina, miosina, biotina-estreptavidina, ATP, proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich neuronal (N-WASP) ou formina. Consultar, por exemplo, Langmuir. 16 de agosto de 2011; 27 (16): 10.061 a 10.071 e Wen et al., Nat Commun. 31 de agosto de 2016; 7. Nas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende actina exógena, por exemplo, actina de tipo selvagem ou actina que compreende uma mutação que promove a polimerização. Nas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende ATP ou fosfocreatina, por exemplo, ATP exógeno ou fosfocreatina.
FUSOGÊNIOS DE MOLÉCULAS PEQUENAS
[0629] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP pode ser tratado com pequenas moléculas fusogênicas. Alguns exemplos não limitantes incluem halotano, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), como meloxicam, piroxicam, tenoxicam e clorpromazina.
[0630] Em algumas modalidades, o fusogênio de molécula pequena pode estar presente em agregados similares a micelas ou livre de agregados.
MODIFICAÇÕES EM FUSOGÊNIOS DE PROTEÍNA
[0631] Proteína fusogênica ou proteínas do envelope viral podem ser redirecionadas por mutação de resíduos de aminoácidos em uma proteína de fusão ou uma proteína de direcionamento (por exemplo, a proteína hemaglutinina). Em algumas modalidades, o fusogênio é sofre mutação aleatória. Em algumas modalidades, o fusogênio sofre mutação racional. Em algumas modalidades, o fusogênio é submetido à evolução direcionada. Em algumas modalidades, o fusogênio é truncado e apenas um subconjunto do peptídeo é usado no vetor retroviral ou VLP. Por exemplo, resíduos de aminoácidos na proteína hemaglutinina do sarampo podem sofrer mutação para alterar as propriedades de ligação da proteína, redirecionando a fusão (doi:
10.1038/nbt942, Molecular Therapy vol. 16 no. 8, 1.427 a 1.436, agosto de 2008, doi: 10.1038/nbt1060, DOI: 10.1128/JVI.76.7.3558–
3563.2002, DOI: 10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001, doi:
10.1073pnas.0604993103).
[0632] Proteínas fusogênicas podem ser redirecionadas por covalência conjugando uma porção química de direcionamento à proteína de fusão ou proteína de direcionamento (por exemplo, a proteína hemaglutinina). Em algumas modalidades, o fusogênio e a porção química de direcionamento são conjugados covalentemente pela expressão de uma proteína quimérica que compreende o fusogênio ligado à porção química de direcionamento. Um alvo inclui qualquer peptídeo (por exemplo, um receptor) que é exibido em uma célula-alvo. Em alguns exemplos, o alvo é expresso em níveis mais elevados em uma célula-alvo do que células não alvo. Por exemplo, o fragmento variável de cadeia única (scFv) pode ser conjugado a fusogênios para redirecionar a atividade de fusão para células que exibem o alvo de ligação de scFv (doi: 10.1038/nbt1060, DOI 10.1182/blood-2012-11- 468579, doi: 10.1038/nmeth.1514: 10.1006/mthe.2002.0550, HUMAN GENE THERAPY 11: 817 a 826, doi: 10.1038/nbt942, doi:
10.1371/journal.pone.0026381, DOI 10.1186/s12896-015-0142-z). Por exemplo, proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPin) podem ser conjugadas a fusogênios para redirecionar a atividade de fusão para células que exibem o alvo de ligação de DARPin (doi:
10.1038/mt.2013.16, doi: 10.1038/mt.2010.298, doi:
10.4049/jimmunol.1500956), bem como combinações de DARPins diferentes (doi: 10.1038/mto.2016.3). Por exemplo, ligantes de receptor e antígenos podem ser conjugados a fusogênios para redirecionar a atividade de fusão para células que exibem o receptor alvo (DOI:
10.1089/hgtb.2012.054, DOI: 10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002). Uma proteína de direcionamento também pode incluir, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, como sdAb (ou VL ou VH), nanocorpos ou domínios VHH de camelídeo), um esqueleto de fibronectina de ligação ao antígeno tipo III (Fn3), como um minicorpo de polipeptídeo de fibronectina, um ligante, uma citocina, uma quimiocina ou um receptor de células T (TCRs). Proteínas fusogênicas podem ser redirecionadas por conjugação não covalente de uma porção química de direcionamento à proteína de fusão ou proteína de direcionamento (por exemplo, a proteína hemaglutinina). Por exemplo, a proteína de fusão pode ser projetada para ligar a região Fc de um anticorpo que tem como alvo um antígeno em uma célula-alvo, redirecionando a atividade de fusão para células que exibem o alvo do anticorpo (DOI: 10.1128/JVI.75.17.8016–
8020.2001, doi: 10.1038/nm1192). Fusogênios alterados e não alterados podem ser exibidos no mesmo vetor retroviral ou VLP (doi:
10.1016/j.biomaterials.2014.01.051).
[0633] Uma porção química de direcionamento pode compreender, por exemplo, uma molécula de anticorpo humanizado, anticorpo IgA, IgG, IgE ou IgM intacto; anticorpo bi ou multiespecífico (por exemplo, Zybodies®, etc.); fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd', fragmentos Fd e CDRs isolados ou conjuntos dos mesmos; Fvs de cadeia única; fusões polipeptídeo-Fc; anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos de domínio único de tubarão, como IgNAR ou fragmentos dos mesmos); anticorpos cameloides; anticorpos mascarados (por exemplo, Probodies®); Imunofarmacêuticos modulares pequenos (“SMIPsTM”); diacorpos de cadeia simples ou Tandem (TandAb®); VHHs; Anticalins®; Nanobodies®; minibodies; BiTE®s; proteínas de repetição de anquirina ou DARPINs®; Avimers®; DARTs; anticorpos do tipo TCR;, Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; e KALBITOR®s.
[0634] Nas modalidades, o fusogênio realvejado se liga a um marcador de superfície celular na célula-alvo, por exemplo, uma proteína, glicoproteína, receptor, ligante de superfície celular, agonista, lipídio, açúcar, proteína transmembrana de classe I, proteína transmembrana de classe II ou proteína transmembrana de classe III.
[0635] Os vetores retrovirais ou VLPs podem exibir porções químicas de direcionamento que não são conjugadas a fusogênios de proteína, a fim de redirecionar a atividade de fusão para uma célula que está ligada pela porção química de direcionamento ou para afetar o homing.
[0636] A porção química de direcionamento adicionada ao vetor retroviral ou VLP pode ser modulada para ter diferentes forças de ligação. Por exemplo, scFvs e anticorpos com várias forças de ligação podem ser usados para alterar a atividade de fusão do vetor retroviral ou VLP para células que exibem quantidades altas ou baixas do antígeno alvo (doi: 10.1128/JVI.01415-07, doi: 10.1038/cgt.2014.25, DOI: 10.1002/jgm.1151). Por exemplo, DARPins com diferentes afinidades podem ser usados para alterar a atividade de fusão do vetor retroviral ou VLP para células que exibem quantidades altas ou baixas do antígeno alvo (doi: 10.1038/mt.2010.298). Porções de direcionamento também podem ser moduladas para direcionar diferentes regiões no ligante alvo, o que afetará a taxa de fusão com células exibindo o alvo (doi: 10.1093/proteína/gzv005).
[0637] Em algumas modalidades, os fusogênios de proteína podem ser alterados para reduzir a imunorreatividade, por exemplo, conforme descrito neste documento. Por exemplo, proteínas fusogênicas podem ser decoradas com moléculas que reduzem interações imunológicas, como PEG (DOI: 10.1128/JVI.78.2.912–921.2004). Assim, em algumas modalidades, o fusogênio que compreende PEG, por exemplo, é um polipeptídeo PEGuilado. Os resíduos de aminoácidos no fusogênio que são direcionados pelo sistema imunológico podem ser alterados para não serem reconhecidos pelo sistema imunológico (doi:
10.1016/j.virol.2014.01.027, doi: 10.1371/journal.pone.0046667). Em algumas modalidades, a sequência da proteína do fusogênio é alterada para se parecer com as sequências de aminoácidos encontradas em seres humanos (humanizadas). Em algumas modalidades, a sequência de proteína do fusogênio é alterada para uma sequência de proteína que se liga a complexos de MHC menos fortemente. Em algumas modalidades, os fusogênios de proteína são derivados de vírus ou organismos que não infectam humanos (e contra os quais os humanos não foram vacinados), aumentando a probabilidade de que o sistema imunológico de um paciente seja virgem para os fusogênios de proteína (por exemplo, há uma resposta humoral insignificante ou imunológica adaptativa mediada por células em relação ao fusogênio) (doi:
10.1006/mthe.2002.0550, doi: 10.1371/journal.ppat.1005641, doi:
10.1038/gt.2011.209, DOI 10.1182/blood-2014-02-558163). Em algumas modalidades, a glicosilação do fusogênio pode ser alterada para alterar as interações imunológicas ou reduzir a imunorreatividade. Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, uma proteína fusogênica derivada de um vírus ou organismo que não infecta humanos não tem alvos de fusão naturais em pacientes e, portanto, tem alta especificidade. ELEMENTO REGULATÓRIO ESPECÍFICO DA CÉLULA-ALVO
POSITIVO
[0638] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento compreende um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo, como um promotor específico de tecido, um intensificador específico de tecido, um local de splice específico de tecido, um local específico de tecido que estende a meia- vida de um RNA ou proteína, um local de promoção de exportação nuclear de mRNA específico de tecido, um local de aumento de tradução específico de tecido ou um local de modificação pós-tradução específico de tecido.
[0639] Um ácido nucleico retroviral descrito neste documento pode compreender regiões, por exemplo, regiões não traduzidas, tais como origens de replicação, cassetes de seleção, promotores, intensificadores, sinais de iniciação de tradução (sequência Shine Dalgarno ou sequência Kozak), íntrons, uma sequência de poliadenilação, regiões 5' e 3’ não traduzidas - que interagem com proteínas celulares do hospedeiro para realizar a transcrição e tradução, e que são capazes de direcionar, aumentar, regular ou controlar a transcrição ou expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Esses elementos podem variar em sua força e especificidade.
Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores ubíquos e promotores, induzíveis pode ser usado.
[0640] Nas modalidades particulares, os elementos de controle são capazes de direcionar, aumentar, regular ou controlar a transcrição ou expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado de uma maneira específica para células. Nas modalidades particulares, os ácidos nucleicos retrovirais compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão que são específicas para células, tipos de células ou linhas de células particulares, por exemplo, células-alvo; isto é, a expressão de polinucleotídeos operativamente ligados a uma sequência de controle de expressão específica para células, tipos de células ou linhas de células particulares é expressa em células-alvo e não (ou em um nível inferior) em células não alvo.
[0641] Nas modalidades particulares, um ácido nucleico retroviral pode incluir sequências de controle exógenas, endógenas ou heterólogas, como promotores e/ou potencializadores.
[0642] Nas modalidades, o promotor compreende um local de reconhecimento ao qual uma RNA polimerase se liga. Uma RNA polimerase inicia e transcreve polinucleotídeos operacionalmente ligados ao promotor. Nas modalidades particulares, os promotores operativos em células de mamíferos compreendem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local no qual a transcrição é iniciada e/ou outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição, uma região CNCAAT na qual N pode ser qualquer nucleotídeo.
[0643] Nas modalidades, um intensificador compreende um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer transcrição aprimorada e, em alguns casos, pode funcionar independentemente da orientação em relação a outra sequência de controle. Um intensificador pode funcionar cooperativamente ou aditivamente com promotores e/ou outros elementos intensificadores. Em algumas modalidades, um segmento promotor/intensificador de DNA contém sequências capazes de fornecer funções de promotor e intensificador.
[0644] Sequências de controle de expressão ubíquas ilustrativas incluem, porém sem limitação, um promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), um vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), um promotor LTR do vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), uma LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV), um promotor do vírus herpes simplex (HSV) (timidina quinase), promotores H5, P7.5 e P11 do vírus vaccinia, um promotor do fator de alongamento 1-alfa (EF1a), resposta de crescimento inicial 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), fator de iniciação da tradução eucariótica 4A1 (EIF4A1), proteína de choque térmico 70 kDa 5 (HSPA5), proteína de choque térmico 90 kDa beta, membro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70), β-cinesina (β-KIN), o locus ROSA 26 humano Orions et al., Nature Biotechnology 25, 1.477 a 1.482 (2007)), um promotor Ubiquitina C (UBC), um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um promotor de citomegalovírus/promotor de β-actina de galinha (CAG), um promotor de β-actina e um intensificador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativa deletada, promotor do local de ligação do iniciador d1587rev substituído (MND) (Challita et al., J Virol. 69(2):748 a 755 (1995)).
[0645] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico de tecido, por exemplo, um promotor que conduz a expressão em células do fígado, por exemplo, hepatócitos, células endoteliais sinusoidais do fígado, colangiócitos, células estreladas, células apresentadoras de antígenos residentes no fígado (por exemplo, células de Kupffer), linfócitos imunes residentes no fígado (por exemplo, células T, células B ou células NK) ou fibroblastos portal. Vários promotores específicos do fígado adequados (por exemplo, promotores específicos dos hepatócitos e promotores de células endoteliais sinusoidais do fígado) são descritos na Tabela 6 abaixo. A Tabela 6 também lista vários promotores ubíquos que não são específicos a células do fígado. Em algumas modalidades, um fusossoma (por exemplo, vetor viral) descrito neste documento compreende, em seu ácido nucleico, um promotor tendo uma sequência da Tabela 6, ou fragmento transcricionalmente ativo da mesma, ou uma variante tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma. Em algumas modalidades, um fusossoma (por exemplo, vetor viral) descrito neste documento compreende, em seu ácido nucleico, um promotor com locais de ligação a fator de transcrição da região dentro de 3 kb do local de início da transcrição para os genes listados na Tabela
6. Em algumas modalidades, o fusossoma (por exemplo, vetor viral) descrito neste documento compreende, em seu ácido nucleico, uma região dentro de 2,5 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb ou 0,5 kb imediatamente a montante do local de início da transcrição de um gene listado na Tabela 6, ou um fragmento transcricionalmente ativo do mesmo, ou uma variante com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o mesmo.
[0646] Em algumas modalidades, um fusossoma (por exemplo, vetor viral) descrito neste documento compreende, em seu ácido nucleico, um promotor tendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 133 a 142 ou 161 a 168, ou fragmento transcricionalmente ativo da mesma, ou uma variante com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma.
[0647] Tabela 6. Promotores exemplificativos, por exemplo,
promotores específicos de hepatócitos Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO Hepatócitos hAAT Gene antitripsina α1 (gene AGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTG 161 (SerpinA1) Serpina1) AGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCT
GACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGT TTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGA AGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCG GGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTC CTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCT CCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGG ACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTG GGACAGTGAATGTCCCCCTGATCTGCGGCCGTGACTCTCTTAA GGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAA GTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTG GGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCAC CTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT
GTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCT Hepatócitos ApoE.HCR- Gene de apolipoproteína E/CI, gttaggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcc 133 hAAT gene de antitripsina α1 catcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcat gtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcct gctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatc cactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgt gagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgaga gcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccacc ttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtgga agctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagc cagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcag cctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctc agcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatgatccccctgatctgcggcctcgacg gtatcgataagcttgatatcgaattctagtcgtcgaccactttcacaatctgctagcaacctgag gaggttatcgtacgaaattcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaa aagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcac ctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgt tgtcaagcttgaggtgtggcaggcttgagatcgatctgaccatacacttgagtgacaatgacat ccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaac Hepatócitos Transtiretina Gene transtiretina CTCGAGGTCAATTCACGCGAGTTAATAATTACCAGCGCGGGCC 162 aprimorada AAATAAATAATCCGCGAGGGGCAGGTGACGTTTGCCCAGCGCG
CGCTGGTAATTATTAACCTCGCGAATATTGATTCGAGGCCGCGA TTGCCGCAATCGCGAGGGGCAGGTGACCTTTGCCCAGCGCGC GTTCGCCCCGCCCCGGACGGTATCGATAAGCTTAGGAGCTTGG GCTGCAGGTCGAGGGCACTGGGAGGATGTTGAGTAAGATGGA AAACTACTGATGACCCTTGCAGAGACAGAGTATTAGGACATGTT TGAACAGGGGCCGGGCGATCAGCAGGTAGCTCTAGAGGATCC CCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTA ATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCC TTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTC AGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTA TAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAA
GCTCCTGCCACCATGG Hepatócito TTR transtirretina CCCACCTCCCGGAGTCCTCTCCTGCACATTCTCATGTTCCTGAA 163
AGGCTTTTCTGTCCCTTCCACTACTCCCTGTAAGCTCCTGTGCT TCACAATTTCTTGTTGAATTTTTTCTAATCTGACTCTATCAGTTAT GGGAATGTTCCCTCAATTCTTAGTGCTCCAAACCGGACTTGCTC TTGGCTTGTATTTGTCCAAAATATTTGTCTTCTCTATGTTTTCTAC ATGTTTGTCTTATAAGGACAAAAACCTGCCTTAGTTTATCCATGA ACAAAGCCACGCATGCTAGTGGACACACACACACATGCGCGTG CGCGCGCACACACACACACACACACATACACACAGAGACTTTG TATGTGAGTAATGAATCATCAAATCATCATAATTTCTGGACTTGT ATTAATAAGTCGGCCAGGAGGAAAAGAATCTGCTGTCAATCATG GCTTCTGGTTCTCACAGTCATCTCTACTTTCTTCCAGCAAGTTTG GTTCTGTCAAAAACCAGCTGTCAGCCTTGTTCCTGCATGCCCAA
Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO
TGCAGAAGAGTCAGTAAAGAAGATTTGGTTCTCTGTATTTCAGG GGCATCAATGCCAGGTTGAAATATGCCATTCTGGCCCAGCTCA GTGGCTCACACGTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGGCCAAAGCG GGTGGATTGCTTGAGCTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGGCAA GAGGCTGAGGTGGGAGGATGACCTGAGCCCGGGAGGTCAAGG CTGCAGCGAGCTGTGATCGTGCCACTGCACTCGAGCCAGGGC GTTGGAGTGAGACCCTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAGGA AAAAAGGAAGGAAGGAAGGGAGGGAGGGAAGATGCCATTCTTA GATTGAAGTGGACTTTATCTGGGCAGAACACACACACACATACA CACATGCACACACACATTGTGGAGAAATTGCTGACTAAGCAAAG CTTCCAAATGACTTAGTTTGGCTAAAATGTAGGCTTTTAAAAATG TGAGCACTGCCAAGGGTTTTTCCTTGTTGACCCATGGATCCATC AAGTGCAAACATTTTCTAATGCACTATATTTAAGCCTGTGCAGCT AGATGTCATTCAACATGAAATACATTATTACAACTTGCATCTGTC TAAAATCTTGCATCTAAAATGAGAGACAAAAAATCTATAAAAATG GAAAACATGCATAGAAATATGTGAGGGAGGAAAAAATTACCCCC AAGAATGTTAGTGCACGCAGTCACACAGGGAGAAGACTATTTTT GTTTTGTTTTGATTGTTTTGTTTTGTTTTGGTTGTTTTGTTTTGGT GACCTAACTGGTCAAATGACCTATTAAGAATATTTCATAGAACG AATGTTCCGATGCTCTAATCTCTCTAGACAAGGTTCATATTTGTA TGGGTTACTTATTCTCTCTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAAT CAGCAGGTTTGCAGTCAGATTGGCAGGGATAAGCAGCCTAGCT
CAGG Hepatócitos Alva Gene da albumina ccaccgcggtggcggccgctctagcttccttagcatgacgttccacttttttctaaggtggagctt 134 acttctttgatttgatcttttgtgaaacttttggaaattacccatcttcctaagcttctgcttctctcagttt tctgcttgctcattccacttttccagctgaccctgccccctaccaacattgctccacaagcacaaa ttcatccagagaaaataaattctaagttttatagttgtttggatcgcataggtagctaaagaggtg gcaacccacacatccttaggcatgagcttgattttttttgatttagaaccttcccctctctgttcctag actacactacacattctgcaagcatagcacagagcaatgttctactttaattactttcattttcttgt atcctcacagcctagaaaataacctgcgttacagcatccactcagtatcccttgagcatgaggt gacactacttaacatagggacgagatggtactttgtgtctcctgctctgtcagcagggcactgta cttgctgataccagggaatgtttgttcttaaataccatcattccggacgtgtttgccttggccagtttt ccatgtacatgcagaaagaagtttggactgatcaatacagtcctctgcctttaaagcaatagga aaaggccaacttgtctacgtttagtatgtggctgtagaaagggtatagatataaaaattaaaact aatgaaatggcagtcttacacatttttggcagcttatttaaagtcttggtgttaagtacgctggagc tgtcacagctaccaatcaggcatgtctgggaatgagtacacggggaccataagttactgacat tcgtttcccattccatttgaatacacacttttgtcatggtattgcttgctgaaattgttttgcaaaaaaa accccttcaaattcatatatattattttaataaatgaattttaatttatctcaatgttataaaaaagtca attttaataattaggtacttatatacccaataatatctaacaatcatttttaaacatttgtttattgagct tattatggatgaatctatctctatatactctatatactctaaaaaagaagaaagaccatagacaa tcatctatttgatatgtgtaaagtttacatgtgagtagacatcagatgctccatttctcactgtaatac catttatagttacttgcaaaactaactggaattctaggacttaaatattttaagttttagctgggtga ctggttggaaaattttaggtaagtactgaaaccaagagattataaaacaataaattctaaagttt tagaagtgatcataatcaaatattaccctctaatgaaaatattccaaagttgagctacagaaatt tcaacataagataattttagctgtaacaatgtaatttgttgtctattttcttttgagatacagttttttctgt ctagctttggctgtcctggaccttgctctgtagaccaggttggtcttgaactcagagatctgcttgc ctctgccttgcaagtgctaggattaaaagcatgtgccaccactgcctggctacaatctatgttttat aagagattataaagctctggctttgtgacattaatctttcagataataagtcttttggattgtgtctgg agaacatacagactgtgagcagatgttcagaggtatatttgcttaggggtgaattcaatctgca gcaataattatgagcagaattactgacacttccattttatacattctacttgctgatctatgaaacat agataagcatgcaggcattcatcatagttttctttatctggaaaaacattaaatatgaaagaagc actttattaatacagtttagatgtgttttgccatcttttaatttcttaagaaatactaagctgatgcaga gtgaagagtgtgtgaaaagcagtggtgcagcttggcttgaactcgttctccagcttgggatcga cctgcaggcatgcttccatgccaaggcccacactgaaatgctcaaatgggagacaaagaga ttaagctcttatgtaaaatttgctgttttacataactttaatgaatggacaaagtcttgtgcatgggg gtgggggtggggttagaggggaacagctccagatggcaaacatacgcaagggatttagtca aacaactttttggcaaagatggtatgattttgtaatggggtaggaaccaatgaaatgcgaggta agtatggttaatgatctacagttattggttaaagaagtatattagagcgagtctttctgcacacag atcacctttcctatcaaccccgggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgat accgtcgacctcgagggggggcccggtac Hepatócitos Apoa2 Gene da apolipoproteína A-II CCGGGCGTGGTGGCGCATGTCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAT 164
Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO
GCTGAGGCAGGAGAATCCTTGAACCCGGGAGGTGGAGGTTGC AGTGAGCCGAGATCATGCCATTACGCTCCAGCCTGAGCAACAA GAGCAAAACTCCGTCTCAGGAAAACAAACAAAAAAACCTGCACA TATACTTCTGAATTTAAAACAAAAGTTAAAAAACAAAGATTTCTT GGTCTCTGGTCACTACCTCCCTCATCAGCTTTGCGCCTCCACTG TCACCCTCAGGAATGTTCCACATACTCAGCGAGTATGCTTGGG GGGCAAAAGGGTGAAAGATACAAAAGCTTCTGATATCTATTTAA CTGATTTCACCCAAATGCTTTGAACCTGGGAATGTACCTCTCCC CCTCCCCCACCCCCAACAGGAGTGAGACAAGGGCCAGGGCTA TTGCCCCTGCTGACTCAATATTGGCTAATCACTGCCTAGAACTG ATAAGGTGATCAAATGACCAGGTGCCTTCAACCTTTACCCTGGT AGAAGCCTCTTATTCACCTCTTTTCCTGCCAGAGCCCTCCATTG GGAGGGGACGGGCGGAAGCTGTTTTCTGAATTTGTTTTACTGG GGGTAGGGTATGTTCAGTGATCAGCATCCAGGTCATTCTGGGC TCTCCTGTTTTCTCCCCGTCTCATTACACATTAACTCAAAAACGG ACAAGATCATTTACACTTGCCCTCTTACCCGACCCTCATTCCCC TAACCCCCATAGCCCTCAACCCTGTCCCTGATTTCAATTCCTTT CTCCTTTCTTCTGCTCCCCAATATCTCTCTGCCAAGTTGCAGTA AAGTGGGATAAGGTTGAGAGATGAGATCTACCCATAATGGAATA AAGACACCATGAGCTTTCCATGGTATGATGGGTTGATGGTATTC CATGGGTTGATATGTCAGAGCTTTCCAGAGAAATAACTTGGAAT CCTGCTTCCTGTTGCACTCAAGTCCAAGGACCTCAGATCTCAAA AGAATGAACCTCAAATATACCTGAAGTGTACCCCCTTAGCCTCC ACTAAGAGCTGTACCCCCTGCCTCTCACCCCATCACCATGAGT CTTCCATGTGCTTGTCCTCTCCTCCCCCATTTCTCCAACTTGTTT ATCCTCACATAATCCCTGCCCCACTGGGCCCATCCATAGTCCCT GTCACCTGACAGGGGGTGGGTAAACAGACAGGTATATAGCCCC TTCCTCTCCAGCCAGGGCAGGCACAGACACCAAGGACAGAGA CGCTGGCTAGGTAAGATAAGGAGGCAAGATGTGTGAGCAGCAT CCAAAGAGGCCTGGGCTTCAGTTGTGGAGAGGGAGAGAGCCA GGTTGGAATGGGCAGCAGGTAGGGAGATCCCTGGGGAGGAGC TGAAGCCCATTTGGCTTCAGTGTCCCCCAAACCCCCACCACCC
T Hepatócitos Cyp3a4 Gene Cyp3a4 AGCTCCTGGGGCCTGCCCTCCTCCCATTAGAAAATCCTCCACTT 165
GTCAAAAAGGAAGCCATTTGCTTTGAACTCCAATTCCACCCCCA AGAGGCTGGGACCATCTTATTGGAGTCCTTGATGCTGTGTGAC CTGCAGTGACCACTGCCCCATCATTGCTGGCTGAGGTGGTTGG GGTCCATCTGGCTATCTGGGCAGCTGTTCTCTTCTCTCCTTTCT CTCCTGTTTCCAGACATGCAGTATTTCCAGAGAGAAGGGGCCA CTCTTTGGCAAAGAACCTGTCTAACTTGCTATCTATGGCAGGAC CTTTGAAGGGTTCACAGGAAGCAGCACAAATTGATACTATTCCA CCAAGCCATCAGCTCCATCTCATCCATGCCCTGTCTCTCCTTTA GGGGTCCCCTTGCCAACAGAATCACAGAGGACCAGCCTGAAAG TGCAGAGACAGCAGCTGAGGCACAGCCAAGAGCTCTGGCTGT ATTAATGACCTAAGAAGTCACCAGAAAGTCAGAAGGGATGACAT GCAGAGGCCCAGCAATCTCAGCTAAGTCAACTCCACCAGCCTT TCTAGTTGCCCACTGTGTGTACAGCACCCTGGTAGGGACCAGA GCCATGACAGGGAATAAGACTAGACTATGCCCTTGAGGAGCTC ACCTCTGTTCAGGGAAACAGGCGTGGAAACACAATGGTGGTAA AGAGGAAAGAGGACAATAGGATTGCATGAAGGGGATGGAAAGT GCCCAGGGGAGGAAATGGTTACATCTGTGTGAGGAGTTTGGTG AGGAAAGACTCTAAGAGAAGGCTCTGTCTGTCTGGGTTTGGAA GGATGTGTAGGAGTCTTCTAGGGGGCACAGGCACACTCCAGG CATAGGTAAAGATCTGTAGGTGTGGCTTGTTGGGATGAATTTCA AGTATTTTGGAATGAGGACAGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGA GAGGCGATTTAATAGATTTTATGCCAATGGCTCCACTTGAGTTT CTGATAAGAACCCAGAACCCTTGGACTCCCCAGTAACATTGATT GAGTTGTTTATGATACCTCATAGAATATGAACTCAAAGGAGGTC AGTGAGTGGTGTGTGTGTGATTCTTTGCCAACTTCCAAGGTGGA GAAGCCTCTTCCAACTGCAGGCAGAGCACAGGTGGCCCTGCTA CTGGCTGCAGCTCCAGCCCTGCCTCCTTCTCTAGCATATAAACA ATCCAACAGCCTCACTGAATCACTGCTGTGCAGGGCAGGAAAG
Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO
CTCCATGCA Hepatócitos LP1B Gene de apolipoproteína E/CI, cggcctctagactcgagccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacaca 135 gene de antitripsina α1 cagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatg ccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggc gtggtttaggtagtgtgagagggtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgact cagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaat attcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagg gccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatccggactctaaggt aaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttctctcttttagattccaa cctttggaactgaaccggt Hepatócitos MIR122 microRNA-122 GAATGCATGGTTAACTACGTCAGAAATGACCAGTTCAAGAGGA 166
GAATGAGATTGGCTTCCAAATGTTGGTCAAGAGCTCTACGTAGC ATGAGCCAAGGATCTATTGAACTTAGTAGGCTCCTGTGACCGG TGACTCTTCTGTCTCTAGAAATCTGGGGAGGTGACCAGGTCATA CATGGCAGTCTTCCCGTGAGGAACGTTAAACTGGTTGGAAGTT GGGGTTCTGAGGGGAAGATGTATTCACTAGGTGACCTGTCTTC TCTGCCTCGGTGGCCTCCATGGCTGCCTGCTGGCCGCACACC CCCACTCAGCAGAGGAATGGACTTTCCAATCTTGCTGAGTGTGT TTGACCAAAGGTGGTGCTGACTTAGTGGCCTAAGGTCGTGCCC TCCCTCCCCCACTGAATCGATAAATAATGCGACTTATCAGAAAG AGAAAGAATTGTTTACTTTTAAACCCTGGATCCCATAAAGGGAG AGGGGAGAGGCCTAAAGCCACAGAAGCTGTGGAAGGCGCCAT CCTGCCTGCCACAGGAAGGGCCTTGGACTGAGAGGACCGGAG CTGACTGGGGGTAAGTGCGGCTCTCCCCCGGCGCCTGCCGAC CCCCCTGAGTGATCAGGCCGTTCTTTGGGGTGGCCGCTGACC
GAGAAATGACGGGAGG Consultar Li et al., 2011, J. Hepatol., 55: 602 a 611 Hepatócitos hemopexina Gene da hemopexina GCAGCTTTGGGAGTGGGCCCAGGAAGTACTGAGGATAGCAGG 167
TGAGATCCCAGGAAGAGATGGATGTGGGGCCGAGACACTGGA GAGAGAAACAGGACTGTCAGATAAAGGGCGTCTGTGACTCCTA GATCTCATTATGCCTACTACCATAACCTACCCCCAATTCCTAATA TTCTCCTACCCTAGAGGGGGGGAAATTGTCAGAAATTTGGCTG CAACACTAGCAACACTACTCAGTACTTGAAATGCATTTTTGCATT TTTTTCATTCAACAAATATTTCTGGAACAACTCTTATATGCCAGG CACTATTTTAGGAGTCAGGGATATATAATGGTAAACAAGACAGG CAAAACAAAGCAAAGCAACAACAACCATCACCAGATAAGTAGAC AGATGAAAGAATTTCAAGTTTTAGTAAGTAAAATAAAACAAGCAA GGGTCTGAAATGGCTAGATAAGGTGGTCAAGAAAGGCTTCATT GAGAAGGTAGCATTTAAGCAGGAGTCAGCTAGAAATATTGTGAA ATTCCAGTTACAGTTCTATTTGTTCTGGGTTGGTTAAATAAAGCT TTTTCCCCCAAGGTGGAAACTACCAAGAAAGACTAATTACTAGT AGTGGTGGTGCTCTCTGGAAGAGAGACACCTCCTGTTTCTGCC TCATTACTGTCAACCCTTCACTTCCAGGCACTTTTTGCAAAGCC CTTTGCCAGTCAGGGAAGGCGAGAGGCTGGGCATGGGGCTTG GACATTTGACAACAGTGAGACATTATTGTCCCCAGACTCACTAG CCCAAGGGTAAAGCTGAAGAGGCTTGGGCATGCCCCAGAAAG GCCCCTGATGAAGCTTGGAAAAAGCTGTTCTCTGAGTATTTCTA AGTAAGTTTATCTGTGTGTGTGGTTACTAAAAGTAGTAAGTATTG CTGTCTCTAGCTGCCTTAGAGCAGGGCTTGACACAGTACACAG CAATATTAGTTCCCTCCTTTTCTCACCTCCCCCATTGTGGAGATA AACTCAATCACAAAAGGTGATCCTCAGTCTACTCACTTCCCTGA CTTATGGATGCCTGGACCCATTGCCAGTGTGAGAGTCACAGCT GGACGTCAGCAGTGTAGCCCAGTTACTGCTTGAAAATTGCTGA AGGGGGTTGGGGGGCAGCTGCCGGGAAAAAGGAGTCTTGGAT TCAGATTTCTGTCCAGACCCTGACCTTATTTGCAGTGATGTAAT CAGCCAATATTGGCTTAGTCCTGGGAGACAGCACATTCCCAGT
AGAGTTGGAGGTGGGGGTGGTGCTGCTGCCAACT Hepatócitos HLP Apolipoproteína, SERINA1 tgtttgctgcttgcaatgtttgcccattttagggtggacacaggacgctgtggtttctgagccaggg 136 ggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgacct tggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgag
Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO gacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc células VEC Gene da caderina endotelial CCCCTGCCCTCCTCCTCTGCCCTCTCCTGGCATTCCTCCTTCAT 168 endoteliais vascular CATGGGACCCTCTTCTAATGGATCCCCAAATGTCAGAGGGTCC sinusoidais do AAGTCCTCCCTCCCTCCAAGCTCATCCATGCCCATGGCCTCAG fígado ATGCCAGCCATAAGCTGTTGGGTTCCAAACCTCGACTCCAGGC
TGGACTCACCCCTGTCTCCCCCACCAGCCTGACACCTCCACCT GGGTATCTAACGAGCATCTCAAACTCAACCTGCCTGAGACAGA GGAATCACTATCCCCTCCTCCTCCAAAAATATCCTTCCATCACA CTCCCCATCTTGTGCTCTGATTTACTAAACGGCCCTGGGCCCTC TCTTTCTCAGGGTCTCTGCTTGCCCAGCTATATAATAAAACAAG TTTGGGACTTCCCAACCATTCACCCATGGAAAAACAGAAGCAAC TCTTCAAAGGACAGATTCCCAGGATCTGCCCTGGGAGATTCCA AATCAGTTGATCTGGGGTGAGCCCAGTCCTCTGTAGTTTTTAGA AGCTCCTCCTATGTCTCTCCTGGTCAGCAGAATCTTGGCCCCTC CCTTCCCCCCAGCCTCTTGGTTCTTCTGGGCTCTGATCCAGCCT CAGCGTCACTGTCTTCCACGCCCCTCTTTGATTCTCGTTTATGT CAAAAGCCTTGTGAGGATGAGGCTGTGATTATCCCCATTTTACA GATGAGGAAACTGTGGCTCCAGGATGACACAACTGGCCAGAG GTCACATCAGAAGCAGAGCTGGGTCACTTGACTCCACCCAATA TCCCTAAATGCAAACATCCCCTACAGACCGAGGCTGGCACCTT AGAGCTGGAGTCCATGCCCGCTCTGACCAGGAGAAGCCAACCT GGTCCTCCAGAGCCAAGAGCTTCTGTCCCTTTCCCATCTCCTGA AGCCTCCCTGTCACCTTTAAAGTCCATTCCCACAAAGACATCAT GGGATCACCACAGAAAATCAAGCTCTGGGGCTAGGCTGACCCC AGCTAGATTTTTGGCTCTTTTATACCCCAGCTGGGTGGACAAGC ACCTTAAACCCGCTGAGCCTCAGCTTCCCGGGCTATAAAATGG GGGTGATGACACCTGCCTGTAGCATTCCAAGGAGGGTTAAATG TGATGCTGCAGCCAAGGGTCCCCACAGCCAGGCTCTTTGCAGG TGCTGGGTTCAGAGTCCCAGAGCTGAGGCCGGGAGTAGGGGT TCAAGTGGGGTGCCCCAGGCAGGGTCCAGTGCCAGCCCTCTG TGGAGACAGCCATCCGGGGCCGAGGCAGCCGCCCACCGCAG GGCCTGCCTATCTGCAGCCAGCCCAGCCCTCACAAAGGAACAA TAACAGGAAACCATCCCAGGGGGAAGTGGGCCAGGGCCAGCT GGAAAACCTGAAGGGGAGGCAGCCAGGCCTCCCTCGCCAGCG GGGTGTGGCTCCCCTCCAAAGACGGTCGGCTGACAGGCTCCA CAGAGCTCCACTCACGCTCAGCCCTGGACGGACAGGCAGTCC AACGGAACAGAAACATCCCTCAGCCCACAGGCACGGTGAGTG GGGGCTCCCACACTCCCCTCCACCCCAAACCCGCCACCCTGC
G ubíquo Promotor de Gene EF1α gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattga 137 núcleo EF1a acgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctcc gcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttc gcaacgggtttgccgccagaacacag ubíquo EF1a Gene EF1α ggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttgggg 138 ggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagt gatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagt cgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctcc agtacgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcgggccttgcgctttaggagccccttcg cctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcac cttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgac gctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttgg gcccgcggccggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcct gcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtg cctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcac cagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggag gacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttc cgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgatt agttctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttcc ccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaat ttggcctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccat
Especificidade Nome do Fonte de elementos cis- Sequência exemplificativa SEQ ID Promotor reguladores NO ttcaggtgtcgtga ubíquo hPGK Gene PGK ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgg 139 gcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcg cagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcc cctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgca cgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccg cgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcggggcgcgccgagagcagcggccggga aggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcgg tgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatca ccgacctctctcccca ubíquo mCMV Citomegalovírus ggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagct 140 ubíquo Ubc Gene da ubiquitina C gtctaacaaaaaagccaaaaacggccagaatttagcggacaatttactagtctaacactgaa 141 aattacatattgacccaaatgattacatttcaaaaggtgcctaaaaaacttcacaaaacacact cgccaaccccgagcgcatagttcaaaaccggagcttcagctacttaagaagataggtacata aaaccgaccaaagaaactgacgcctcacttatccctcccctcaccagaggtccggcgcctgt cgattcaggagagcctaccctaggcccgaaccctgcgtcctgcgacggagaaaagcctacc gcacacctaccggcaggtggccccaccctgcattataagccaacagaacgggtgacgtcac gacacgacgagggcgcgcgctcccaaaggtacgggtgcactgcccaacggcaccgccat aactgccgcccccgcaacagacgacaaaccgagttctccagtcagtgacaaacttcacgtc agggtccccagatggtgccccagcccatctcacccgaataagagctttcccgcattagcgaa ggcctcaagaccttgggttcttgccgcccaccatgccccccaccttgtttcaacgacctcacag cccgcctcacaagcgtcttccattcaagactcgggaacagccgccattttgctgcgctcccccc aacccccagttcagggcaaccttgctcgcggacccagactacagcccttggcggtctctcca cacgcttccgtcccaccgagcggcccggcggccacgaaagccccggccagcccagcagc ccgctactcaccaagtgacgatcacagcgatccacaaacaagaaccgcgacccaaatccc ggctgcgacggaactagctgtgccacacccggcgcgtccttatataatcatcggcgttcaccg ccccacggagatccctccgcagaatcgccgagaagggactacttttcctcgcctgttccgctct ctggaaagaaaaccagtgccctagagtcacccaagtcccgtcctaaaatgtccttctgctgat actggggttctaaggccgagtcttatgagcagcgggccgctgtcctgagcgtccgggcggaa ggatcaggacgctcgctgcgcccttcgtctgacgtggcagcgctcgccgtgaggagggggg cgcccgcgggaggcgccaaaacccggcgcggaggcc ubíquo SFFV Vírus formador de foco no baço gtaacgccattttgcaaggcatggaaaaataccaaaccaagaatagagaagttcagatcaa 142 gggcgggtacatgaaaatagctaacgttgggccaaacaggatatctgcggtgagcagtttcg gccccggcccggggccaagaacagatggtcaccgcagtttcggccccggcccgaggcca agaacagatggtccccagatatggcccaaccctcagcagtttcttaagacccatcagatgtttc caggctcccccaaggacctgaaatgaccctgcgccttatttgaattaaccaatcagcctgcttct cgcttctgttcgcgcgcttctgcttcccgagctctataaaagagctcacaacccctcactcggcg cgccagtcctccgacagactgagtcgcccggg
[0648] Várias sequências de consenso dentro de módulos cis- reguladores específicos do fígado (por exemplo, promotores) foram descritas. Em algumas modalidades, um módulo cis-regulador específico do fígado compreende um local de ligação para um ou mais dentre HNF1α, C/EBP, LEF1, FOX, IRF, LEF1/TCF, Tal1β/E47 e MyoD. Em algumas modalidades, um módulo cis-regulador específico do fígado compreende uma sequência estabelecida na Figura 1 ou Tabela 1 de Chuah et al, "Liver-Specific Transcriptional Modules Identified by Genome-Wide In Silico Analysis Enable Efficient Gene Therapy in Mice and Non-Human Primates” Mol Ther. Setembro de 2014; 22 (9): 1.605 a 1.613, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade, incluindo as sequências da Figura 1 e da Tabela 1 no mesmo. Em algumas modalidades, um módulo cis-regulador específico do fígado compreende uma sequência humana de HS-CRM1, HS- CRM2, HS-CRM3, HS-CRM4, HS-CRM5, HS-CRM6, HS-CRM7, HS- CRM8, HS-CRM9, HS-CRM10, HS-CRM11, HS-CRM12, HS-CRM13 ou HS-CRM14 como descrito em Chuah et al supra.
[0649] Um local de entrada de ribossomo interno (IRES) tipicamente promove a entrada de ribossomo interno direto no códon de iniciação, como ATG, de um cístron (uma região de codificação de proteína), levando assim à tradução independente de cap do gene. Consultar, por exemplo, Jackson et al, (1990) Trends Biochem Sci 15 (12): 477-83) e Jackson e Kaminski. (1995) RNA 1 (10): 985 a 1.000. Nas modalidades particulares, um vetor inclui um ou mais genes exógenos que codificam um ou mais agentes exógenos. Nas modalidades particulares, para alcançar a tradução eficiente de cada um dentre a pluralidade de agentes proteicos exógenos, as sequências polinucleotídicas podem ser separadas por uma ou mais sequências IRES ou sequências polinucleotídicas que codificam polipeptídeos autoclaváveis.
[0650] Os ácidos nucleicos retrovirais neste documento também podem compreender uma ou mais sequências Kozak, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos curta que facilita a ligação inicial do mRNA à pequena subunidade do ribossomo e aumenta a tradução. A sequência de consenso Kozak é (GCC)RCCATGG, em que R é uma purina (A ou G) (Kozak, (1986) Cell. 44 (2): 283 a 292 e Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15 (20): 8.125 a 8.148).
PROMOTORES RESPONSIVOS A UM FATOR DE TRANSCRIÇÃO HETERÓLOGO E INDUTOR
[0651] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral compreende um elemento que permite a expressão condicional do agente exógeno, por exemplo, qualquer tipo de expressão condicional incluindo, porém sem limitação, expressão induzível; expressão reprimível; expressão específica do tipo de célula ou expressão específica do tecido. Em algumas modalidades, para atingir a expressão condicional do agente exógeno, a expressão é controlada submetendo- se uma célula, tecido ou organismo a um tratamento ou condição que faz com que o agente exógeno seja expresso ou que causa um aumento ou diminuição na expressão do agente exógeno.
[0652] Exemplos ilustrativos de promotores/sistemas indutíveis incluem, porém sem limitação, promotores indutíveis por esteroides, tais como promotores para genes que codificam glucocorticoides ou receptores de estrogênio (indutíveis por tratamento com o hormônio correspondente), promotor de metalotionina (indutível por tratamento com vários metais pesados), Promotor MX-1 (indutível por interferon), o sistema regulável de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin et al., 2003, Gene, 323: 67), a troca de gene induzível por cumate (WO 2002/088346), sistemas reguladores dependentes de tetraciclina, etc.
[0653] A expressão do transgene pode ser ativada ou reprimida pela presença ou ausência de uma molécula indutora. Em alguns casos, a molécula indutora ativa ou reprime a expressão gênica de maneira gradativa e, em alguns casos, as moléculas indutoras ativam ou reprimem a expressão gênica de uma maneira ou tudo ou nada.
[0654] Um promotor/sistema indutível comumente usado é o sistema regulado por tetraciclina (Tet). O sistema Tet é baseado na coexpressão de dois elementos na respectiva célula-alvo: (i) o elemento de resposta da tetraciclina contendo repetições das sequências do operador Tet (TetO) fundidas a um promotor mínimo e conectado a um gene de interesse (por exemplo, um gene que codifica o agente exógeno) e (ii) o transativador transcricional (tTA), uma proteína de fusão do repressor Tet (TetR) e o domínio de transativação da proteína
VP16 derivada do vírus herpes simplex. Enquanto na versão originalmente descrita a expressão do transgene era ativa na ausência de tetraciclina ou seu análogo potente doxiciclina (Do), referido como sistema Tet-OFF, a modificação de quatro aminoácidos dentro da proteína transativadora resultou em um tTA reverso (rtTA), que só se liga a TetO na presença de Dox (sistema Tet-ON). Em algumas modalidades, no transativador, o domínio VP16 foi substituído por domínios de ativação mínimos, locais potenciais de doador de splice e aceitador de splice foram removidos e a proteína foi otimizada por códon, resultando na variante de transativador rtTA2S-M2 melhorada com maior sensibilidade a Dox e menor atividade de linha de base. Além disso, diferentes elementos promotores responsivos a Tet foram gerados, incluindo modificação no TetO com espaçamento de 36 nucleotídeos de operadores vizinhos para aprimorar a regulação. Modificações adicionais podem ser úteis para reduzir ainda mais a atividade basal e aumentar a faixa dinâmica de expressão. Como exemplo, a variante pTet-T11 (abreviatura: TII) exibe uma alta faixa dinâmica e baixa atividade de fundo.
[0655] A expressão condicional também pode ser alcançada usando uma recombinase de DNA específica de local. De acordo com certas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende pelo menos um (tipicamente dois) local (ou locais) para recombinação mediada por uma recombinase específica de local, por exemplo, uma proteína excisiva ou integrativa, enzima, cofator ou proteína associada que está envolvida em reações de recombinação envolvendo um ou mais locais de recombinação (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, sete, dez, doze, quinze, vinte, trinta, cinquenta, etc.), que podem ser proteínas de tipo selvagem (consultar Landy, Current Opinion in Biotechnology 3: 699 a 707 (1993)), ou mutantes, derivados (por exemplo, proteínas de fusão contendo as sequências de proteína de recombinação ou fragmentos das mesmas), fragmentos e variantes dos mesmos. Exemplos ilustrativos de recombinases incluem, porém sem limitação: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvase, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, e ParA.
RIBOSWITCHES PARA REGULAR A EXPRESSÃO DO AGENTE EXÓGENO
[0656] Algumas das composições e métodos fornecidos neste documento incluem um ou mais riboswitches ou polinucleotídeos que incluem um ou mais riboswitches. Riboswitches são uma característica comum em bactérias para regular a expressão de genes e são um meio para alcançar o controle de RNA de funções biológicas. Os riboswitches podem estar presentes na região 5' não traduzida dos mRNAs e podem permitir o controle regulatório sobre a expressão do gene por meio da ligação de um ligante de pequena molécula que induz ou suprime uma atividade do riboswitch. Em algumas modalidades, o riboswitch controla um produto gênico envolvido na geração do ligante de molécula pequena. Riboswitches normalmente atuam de forma cis, embora tenham sido identificados riboswitches que atuam de forma trans. Os riboswitches naturais consistem em dois domínios: um domínio de aptâmero que se liga ao ligante por meio de uma estrutura de RNA dobrado tridimensional e um domínio de troca de função que induz ou suprime uma atividade no riboswitch com base na ausência ou presença do ligante. Assim, existem duas conformações sensíveis ao ligante alcançadas pelo riboswitch, representando estados ligado e desligado (Garst et al., 2011). O domínio de troca de função pode afetar a expressão de um polinucleotídeo regulando: um local de entrada de ribossomo interno, acessibilidade de doador de splice pré-mRNA na construção do gene retroviral, tradução, terminação da transcrição, degradação do transcrito, expressão de miRNA ou expressão de shRNA (Dambach e Winkler 2009). Os domínios de aptâmero e de comutação de função podem ser usados como componentes modulares, permitindo que dispositivos de RNA sintético controlem a expressão gênica como aptâmeros nativos, aptâmeros nativos qu sofreram mutação/evoluídos ou aptâmeros totalmente sintéticos que são identificados na triagem de bibliotecas de RNA aleatórias (McKeague et al 2016).
[0657] A família riboswitch purina representa uma das maiores famílias, com mais de 500 sequências encontradas (Mandal et al 2003; US20080269258; e WO2006055351). Os riboswitches de purina compartilham uma estrutura similar consistindo em três elementos helicoidais/estruturas de haste conservados (PI, P2, P3) com elementos de loop/junção intervenientes (Jl-2, L2, J2-3, L3, J3-1). Os domínios de aptâmero da família purina de riboswitches variam naturalmente em sua afinidade/regulação por vários compostos de purina, como adenina, guanina, adenosina, guanosina, desoxiadenosina, desoxiguanosina, etc. devido à variação de sequência (Kim et al. 2007).
[0658] Em algumas modalidades, um ácido nucleico retroviral descrito neste documento compreende um polinucleotídeo que codifica o agente exógeno operacionalmente ligado a um promotor e um riboswitch. O riboswitch inclui um ou mais dentre, por exemplo, todos dentre: a.) Um domínio de aptâmero, por exemplo, um domínio de aptâmero capaz de se ligar a um fármaco antiviral análogo de nucleosídeo e tendo ligação reduzida a guanina ou 2'-desoxiguanosina em relação ao fármaco antiviral análogo de nucleosídeo; e b.) um domínio de comutação de função, por exemplo, um domínio de comutação de função capaz de regular a expressão do agente exógeno, em que a ligação do análogo de nucleosídeo pelo domínio de aptâmero induz ou suprime a atividade de regulação da expressão do domínio de comutação de função, regulando assim a expressão do agente exógeno. Em algumas modalidades, o agente exógeno pode ser um polipeptídeo, um miRNA ou um shRNA. Por exemplo, em uma modalidade, o riboswitch está operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em exemplos ilustrativos não limitantes fornecidos neste documento, o gene exógeno codifica um ou mais polipeptídeos de sinalização projetados. Por exemplo, o riboswitch e o polinucleotídeo alvo que codifica um ou mais polipeptídeos de sinalização projetados podem ser encontrados no genoma de uma célula de origem, em uma partícula retroviral recombinante incompetente para replicação, em uma célula T e/ou em uma célula NK.
[0659] Os domínios de aptâmero podem ser usados, por exemplo, como componentes modulares e combinados com qualquer um dos domínios de comutação de função para afetar a transcrição de RNA. Em qualquer uma das modalidades neste documento divulgadas, o riboswitch pode afetar o transcrito de RNA regulando qualquer uma das seguintes atividades: local de entrada ribossomal interno (IRES), acessibilidade do doador de splice pré-mRNA, tradução, terminação da transcrição, degradação do transcrito, expressão de miRNA ou expressão de shRNA. Em algumas modalidades, o domínio de comutação de função pode controlar a ligação de um anti-IRES a um IRES (consultar, por exemplo, Ogawa, RNA (2011), 17: 478 a 488, cuja descrição é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade). Em qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, a presença ou ausência do ligante de molécula pequena pode fazer com que o riboswitch afete o transcrito de RNA. Em algumas modalidades, o riboswitch pode incluir uma ribozima. Riboswitches com ribozimas podem inibir ou aumentar a degradação do transcrito de polinucleotídeos alvo na presença do ligante de molécula pequena. Em algumas modalidades, a ribozima pode ser uma classe pistola de ribozima, uma classe cabeça de martelo de ribozima, uma classe torcida de ribozima, uma classe machadinha de ribozima ou o HDV (vírus da hepatite delta).
ELEMENTO REGULATÓRIO ESPECÍFICO DE CÉLULA NÃO ALVO
[0660] Em algumas modalidades, o elemento regulatório específico de célula não alvo ou TCSRE negativo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido, local de reconhecimento de protease específico de tecido, local de ubiquitina ligase específico de tecido, local de repressão transcricional específico de tecido ou local de repressão epigenética específico de tecido.
[0661] Em algumas modalidades, uma célula não alvo compreende um miRNA endógeno. O ácido nucleico retroviral (por exemplo, o gene que codifica o agente exógeno) pode compreender uma sequência de reconhecimento para esse miRNA. Assim, se o ácido nucleico retroviral entrar na célula não alvo, o miRNA pode regular negativamente a expressão do agente exógeno. Isso ajuda a atingir especificidade adicional para a célula-alvo versus células não alvo.
[0662] Em algumas modalidades, o miRNA é um pequeno RNA não codificante de 20 a 22 nucleotídeos, tipicamente excisado de estruturas precursoras de RNA de foldback de aproximadamente 70 nucleotídeos conhecidas como pré-miRNAs. Em geral, os miRNAs regulam negativamente seus alvos de uma de duas maneiras, dependendo do grau de complementaridade entre o miRNA e o alvo. Em primeiro lugar, miRNAs que se ligam com complementaridade perfeita ou quase perfeita às sequências de mRNA que codificam proteínas normalmente induzem a via de interferência mediada por RNA (RNAi). miRNAs que exercem seus efeitos regulatórios ligando-se a locais complementares imperfeitos dentro das regiões 3' não traduzidas (UTRs) de seus alvos de mRNA normalmente reprimem a expressão do gene alvo pós- transcricionalmente, aparentemente no nível da tradução, por meio de um complexo RISC que é similar, ou possivelmente idêntico, àquele que é usado para a via de RNAi. Consistente com o controle translacional,
os miRNAs que usam esse mecanismo reduzem os níveis de proteína de seus genes-alvo, mas os níveis de mRNA desses genes são minimamente afetados. miRNAs (por exemplo, miRNAs de ocorrência natural ou miRNAs projetados artificialmente) podem ter como alvo específico qualquer sequência de mRNA. Por exemplo, em uma modalidade, o indivíduo versado na técnica pode projetar construtos de RNA de hairpin curto expressos como transcritos primários de miRNA humano (por exemplo, miR-30 ou miR-21). Esse projeto adiciona um local de processamento de Drosha ao construto de hairpin e demonstrou aumentar muito a eficiência de knockdown (Pusch et al., 2004). A haste de hairpin consiste em 22 nt de dsRNA (por exemplo, antissenso tem complementaridade perfeita com o alvo desejado) e um loop de 15 a 19 nt de um miR humano. Adicionar as sequências de flanqueamento miR30 e de loop de miR em um ou ambos os lados do hairpin resulta em um aumento maior do que 10 vezes no processamento de Drosha e Dicer dos hairpins expressos quando comparados com projetos de shRNA convencionais sem microRNA. O aumento do processamento de Drosha e Dicer se traduz em maior produção de siRNA/miRNA e maior potência para hairpins expressos.
[0663] Centenas de genes de miRNA distintos são expressos diferencialmente durante o desenvolvimento e entre os tipos de tecido. Vários estudos sugeriram papéis regulatórios importantes para miRNAs em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo tempo de desenvolvimento, diferenciação celular, proliferação, apoptose, oncogênese, secreção de insulina e biossíntese de colesterol. (Consultar Bartel 2004 Cell 116: 281 a 297; Ambros 2004 Nature 431: 350 a 355; Du et al. 2005 Development 132: 4.645 a 4.652; Chen 2005 N. Engl. J. Med. 353: 1.768 a 1.771; Krutzfeldt et al. 2005 Nature 438: 685 a 689.) A análise molecular mostrou que os miRNAs têm perfis de expressão distintos em diferentes tecidos. Métodos computacionais têm sido usados para analisar a expressão de aproximadamente 7.000 alvos de miRNA humanos previstos. Os dados sugerem que a expressão de miRNA contribui amplamente para a especificidade da expressão de mRNA em muitos tecidos humanos. (Consultar Sood et al. 2006 PNAS USA 103 (8): 2.746 a 2.751.)
[0664] Assim, uma abordagem baseada em miRNA pode ser usada para restringir a expressão do agente exógeno a uma população de células-alvo, silenciando a expressão do agente exógeno em tipos de células não alvo usando espécies de microRNA endógenos. O microRNA induz o silenciamento do gene pós-transcricional específico da sequência em muitos organismos, seja pela inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) ou pela degradação do mRNA. Consultar, por exemplo, Brown et al. 2006 Nature Med. 12 (5): 585 a 591, e o documento WO2007/000668, cada um dos quais é incorporado neste documento a título de referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende um ou mais de (por exemplo, uma pluralidade de) sequências de reconhecimento de miRNA específicas de tecido. Em algumas modalidades, a sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido tem cerca de 20 a 25, 21 a 24 ou 23 nucleotídeos de comprimento. Nas modalidades, a sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido tem complementaridade perfeita com um miRNA presente em uma célula não alvo. Em algumas modalidades, o agente exógeno não compreende GFP, por exemplo, não compreende uma proteína fluorescente, por exemplo, não compreende uma proteína repórter. Em algumas modalidades, as células fora do alvo não são células hematopoiéticas e/ou o miRNA não está presente nas células hematopoiéticas.
[0665] Em algumas modalidades, um método neste documento compreende a expressão específica de tecido de um agente exógeno em uma célula-alvo que compreende colocar uma pluralidade de vetores retrovirais que compreendem um nucleotídeo que codifica o agente exógeno e pelo menos uma sequência alvo de microRNA específico de tecido (miRNA) em contato com uma pluralidade de células que compreendem células-alvo e células não alvo, em que o agente exógeno é preferencialmente expresso na célula-alvo, por exemplo, restrito à mesma.
[0666] Por exemplo, o ácido nucleico retroviral pode compreender pelo menos uma sequência de reconhecimento de miRNA operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos tendo um miRNA correspondente em uma célula não alvo, por exemplo, uma célula progenitora hematopoiética (HSPC), células-tronco hematopoiéticas (HSC), que impede ou reduz a expressão da sequência de nucleotídeos na célula não alvo, mas não em uma célula-alvo, por exemplo, célula diferenciada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico retroviral compreende pelo menos uma sequência de miRNA alvo para um miRNA que está presente em uma quantidade eficaz (por exemplo, a concentração do miRNA endógeno é suficiente para reduzir ou prevenir a expressão de um transgene) na célula não alvo, e compreende um transgene. Nas modalidades, o miRNA usado neste sistema é fortemente expresso em células não alvo, como HSPC e HSC, mas não na progênie diferenciada de, por exemplo, linhagem mieloide e linfoide, prevenindo ou reduzindo a expressão de um transgene em populações de células-tronco sensíveis, enquanto mantém a expressão e eficácia terapêutica nas células-alvo.
[0667] Em algumas modalidades, o TSCRE ou NTSCRE negativo compreende um local de reconhecimento de miRNA, por exemplo, um local de reconhecimento de miRNA que é ligado por um miRNA endógeno a células hematopoiéticas. Por exemplo, o TSCRE ou NTSCRE negativo é uma sequência que é complementar a um miRNA endógeno a uma célula hematopoiética. MiRNAs exemplificativos são fornecidos na Tabela 7 abaixo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico de fusossoma ou ácido nucleico retroviral) compreende uma sequência que é complementar a um miRNA da Tabela 7, ou tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade ao mesmo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico de fusossoma ou ácido nucleico retroviral) compreende uma sequência que é perfeitamente complementar a uma sequência semente dentro de um miRNA endógeno, por exemplo, miRNA da Tabela 7. Nas modalidades, a sequência de semente tem pelo menos 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento.
[0668] Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico de fusossoma ou ácido nucleico retroviral) compreende uma sequência que é complementar a um miRNA estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 143 a 160, ou uma sequência que tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade aos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico de fusossoma ou ácido nucleico retroviral) inclui um TSCRE ou NTSCRE que compreende uma sequência que é perfeitamente complementar a uma sequência de semente dentro de um miRNA endógeno estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 143 a 160. Nas modalidades, a sequência de semente tem pelo menos 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento.
[0669] Tabela 7. Sequências de miRNA exemplificativas. Tipo de célula nome de MiRNA maduro sequência de miRNA SEQ silenciada miRNA ID
NO células miR-142 hsa-miR-142- uguaguguuuccuacuu 143 hematopoiétic 3p uaugga
Tipo de célula nome de MiRNA maduro sequência de miRNA SEQ silenciada miRNA ID
NO as células miR-142 hsa-miR-142- cauaaaguagaaagcac 144 hematopoiétic 5p uacu as células mir-181a- hsa-miR-181a- aacauucaacgcugucg 145 hematopoiétic 2 5p gugagu as células mir-181a- hsa-miR-181a- accacugaccguugacu 146 hematopoiétic 2 2-3p guacc as células mir-181b- hsa-miR-181b- aacauucauugcugucg 147 hematopoiétic 1 5p gugggu as células mir-181b- hsa-miR-181b- cucacugaacaaugaau 148 hematopoiétic 1 3p gcaa as células mir-181c hsa-miR-181c- aacauucaaccugucgg 149 hematopoiétic 5p ugagu as células mir-181c hsa-miR-181c- aaccaucgaccguugag 150 hematopoiétic 3p uggac as células mir-181a- hsa-miR-181a aacauucaacgcugucg 151 hematopoiétic 1 gugagu
Tipo de célula nome de MiRNA maduro sequência de miRNA SEQ silenciada miRNA ID
NO as células mir-181a- hsa-miR-181a- accaucgaccguugauu 152 hematopoiétic 1 3p guacc as células mir-181b- hsa-miR-181b- aacauucauugcugucg 153 hematopoiétic 2 5p gugggu as células mir-181b- hsa-miR-181b- cucacugaucaaugaau 154 hematopoiétic 2 2-3p gca as células mir-181d hsa-miR-181d- aacauucauuguugucg 155 hematopoiétic 5p gugggu as células mir-181d hsa-miR-181d- ccaccgggggaugaaug 156 hematopoiétic 3p ucac as células miR-223 hsa-miR-223- cguguauuugacaagcu 157 hematopoiétic 5p gaguu as células miR-223 hsa-miR-223- ugucaguuugucaaau 158 hematopoiétic 3p acccca as pDCs miR-126 hsa-miR-126- cauuauuacuuuuggu 159 5p acgcg
Tipo de célula nome de MiRNA maduro sequência de miRNA SEQ silenciada miRNA ID
NO pDCs miR-126 hsa-miR-126- ucguaccgugaguaaua 160 3p augcg
[0670] Em algumas modalidades, o TSCRE ou NTSCRE negativo compreende um local de reconhecimento de miRNA para um miRNA descrito neste documento. MiRNAs exemplificativos incluem aqueles encontrados em Griffiths-Jones et al. Nucleic Acids Res. 1º de janeiro de 2006, 34; Chen e Lodish, Semin Immunol. Abril de 2005; 17 (2): 155 a 165; Chen et al. Ciência. 2 de janeiro de 2004; 303 (5654): 83 a 86; Barad et al. Genome Res. Dezembro de 2004; 14 (12): 2.486 a 2.494; Krichevsky et al., RNA. Outubro de 2003; 9 (10): 1.274 a 1.281; Kasashima et al. Biochem Biophys Res Commun. 17 de setembro de 2004; 322 (2): 403 a 410; Houbaviy et al., Dev Cell. Agosto de 2003; 5 (2): 351 a 358; Lagos-Quintana et al., Curr Biol. 30 de abril de 2002; 12 (9): 735 a 739; Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2 de março de 2004; 101 (9): 2.999 a 3.004; Sempere et al. Genome Biol. 2004; 5 (3): R13; Metzler et al., Genes Chromosomes Cancer. Fevereiro de 2004; 39 (2): 167 a 169; Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA. 26 de novembro de 2002; 99 (24): 15.524 15.529; Mansfield et al. Nat Genet. Outubro de 2004; 36 (10): 1.079 a 1.083; Michael et al. Mol Cancer Res. Outubro de 2003; 1 (12): 882 a 891; e em www.miRNA.org.
[0671] Em algumas modalidades, o TSCRE ou NTSCRE negativo compreende um local de reconhecimento de miRNA para um miRNA selecionado dentre miR-1b, miR-189b, miR-93, miR-125b, miR-130, miR-32, miR-128, miR-22, miR124a, miR-296, miR-143, miR-15, miR- 141, miR-143, miR-16, miR-127, miR99a, miR-183, miR-19b, miR-92, miR-9, miR-130b, miR-21, miR-30b, miR-16, miR-142-s, miR-99a, miR- 212, miR-30c, miR-213, miR-20, miR-155, miR-152, miR-139, miR-30b,
miR-7, miR-30c, miR-18, miR-137, miR-219, miR-1d, miR-178, miR-24, miR-122a, miR-215, miR-142-a, miR-223, miR-142, miR-124a, miR- 190, miR-149, miR-193, miR-181, let-7a, miR-132, miR-27a, miR-9*, miR-200b, miR-266, miR-153, miR-135, miR-206, miR-24, miR-19a, miR-199, miR-26a, miR-194, miR-125a, miR-15a, miR-145, miR-133, miR-96, miR-131, miR-124b, miR-151, miR-7b, miR-103 e miR-208.
[0672] Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico de fusossoma ou ácido nucleico retroviral) compreende dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA. Em algumas modalidades, cada um dos dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por um miRNA conforme descrito neste documento, por exemplo, tal como qualquer um estabelecido na Tabela
7. Em algumas modalidades, cada um dos dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por um miRNA estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 143 a 160. Em algumas modalidades, os dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA podem incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais locais de reconhecimento de miRNA. Os dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA podem ser posicionados em tandem no ácido nucleico para fornecer vários locais de ligação em tandem para um miRNA.
[0673] Em algumas modalidades, os dois ou mais locais de reconhecimento de miRNA podem incluir pelo menos um primeiro local de reconhecimento de miRNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais primeiros locais de reconhecimento de miRNA, e pelo menos um segundo local de reconhecimento de miRNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais locais de reconhecimento de segundo miRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém dois ou mais primeiros locais de reconhecimento de miRNA e cada um dos primeiros locais de reconhecimento de miRNA estão presentes em tandem no ácido nucleico para fornecer vários locais de ligação em tandem para um primeiro miRNA e/ou o ácido nucleico contém mais dois segundos locais de reconhecimento de miRNA e cada um dos segundos locais de reconhecimento de miRNA estão presentes em tandem no ácido nucleico para fornecer vários locais de ligação em tandem para um segundo miRNA.
Em algumas modalidades, o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos pelo mesmo miRNA e, em algumas modalidades, o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por diferentes miRNAs.
Em algumas modalidades, o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por miRNAs presentes na mesma célula não alvo, e em algumas modalidades, o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por miRNAs presentes em diferentes células não alvo.
Em algumas modalidades, um ou ambos o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por miRNAs conforme descrito neste documento, tal como qualquer um estabelecido na Tabela 7. Em algumas modalidades, um ou ambos o primeiro local de reconhecimento de miRNA e o segundo local de reconhecimento de miRNA são reconhecidos por um miRNAs estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 143 a 160. Em algumas modalidades, um ou mais dos locais de reconhecimento de miRNA no ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) são transcritos em cis com o agente exógeno.
Em algumas modalidades, um ou mais dos locais de reconhecimento de miRNA no ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) estão situados a jusante da sequência da cauda poli A, por exemplo, entre a sequência da cauda poli A e o WPRE.
Em algumas modalidades, um ou mais dos locais de reconhecimento de miRNA no ácido nucleico do fusossoma (por exemplo, ácido nucleico retroviral) estão situados a jusante do WPRE.
MODULAÇÃO IMUNOLÓGICA
[0674] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP descrito neste documento compreende CD47 elevado. Consultar, por exemplo, a Pat. nº US 9.050.269, que é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP descrito neste documento compreende proteína regulatória do complemento elevada. Consultar, por exemplo, os documentos ES2627445T3 e US6790641, cada um dos quais é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP descrito neste documento não tem uma proteína MHC, por exemplo, um MHC-1 classe 1 ou classe II, ou compreende níveis reduzidos da mesma. Consultar, por exemplo, o documento US20170165348, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.
[0675] Às vezes, os vetores retrovirais ou VLPs são reconhecidos pelo sistema imunológico do indivíduo. No caso de partículas de vetor viral com envelope (por exemplo, partículas de vetor retroviral), as proteínas ligadas à membrana que são exibidas na superfície do envelope viral podem ser reconhecidas e a própria partícula viral pode ser neutralizada. Além disso, ao infectar uma célula-alvo, o envelope viral torna-se integrado à membrana celular e, como resultado, as proteínas do envelope viral podem ser exibidas ou permanecer em associação próxima com a superfície da célula. O sistema imunológico pode, portanto, também ter como alvo as células que as partículas do vetor viral infectaram. Ambos os efeitos podem levar a uma redução na eficácia da entrega do agente exógeno por vetores virais.
[0676] Um envelope de partícula viral normalmente se origina em uma membrana da célula de origem. Portanto, proteínas de membrana que são expressas na membrana celular a partir das quais os botões de partículas virais podem ser incorporados ao envelope viral. A PROTEÍNA IMUNOMODULADORA CD47
[0677] A internalização de material extracelular em células é comumente realizada por um processo denominado endocitose (Rabinovitch, 1995, Trends Cell Biol. 5 (3): 85 a 87; Silverstein, 1995, Trends Cell Biol. 5 (3): 141 a 142; Swanson et al., 1995, Trends Cell Biol. 5 (3): 89 a 93; Allen et al., 1996, J. Exp. Med. 184 (2): 627 a 637). A endocitose pode se enquadrar em duas categorias gerais: fagocitose, que envolve a captação de partículas, e pinocitose, que envolve a captação de líquido e solutos.
[0678] Foi demonstrado que os fagócitos profissionais se diferenciam dos não próprios e dos próprios, com base em estudos com camundongos knockout sem o receptor de membrana CD47 (Oldenborg et al., 2.000, Science 288 (5473): 2.051 a 2.054). O CD47 é um membro ubíquo da superfamília Ig que interage com o receptor inibidor imunológico SIRPα (proteína regulatória de sinal) encontrado em macrófagos (Fujioka et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16 (12): 6.887 a 6.899; Veillette et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 (35): 22.719 a 22.728; Jiang et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (2): 559 a 562). Embora as interações CD47-SIRPα pareçam desativar macrófagos autólogos em camundongos, reduções graves de CD47 (talvez 90%) são encontradas em células sanguíneas humanas de alguns genótipos Rh que mostram pouca ou nenhuma evidência de anemia (Mouro-Chanteloup et al., 2003, Blood 101 (1): 338 a 344) e também pouca ou nenhuma evidência de interações celulares intensificadas com monócitos fagocíticos (Arndt et al., 2004, Br. J. Haematol. 125 (3): 412 a 414).
[0679] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP (por exemplo, uma partícula viral com um raio inferior a cerca de 1 μm, inferior a cerca de 400 nm ou inferior a cerca de 150 nm) compreende pelo menos uma porção biologicamente ativa de CD47, por exemplo, em uma superfície exposta do vetor retroviral ou VLP. Em algumas modalidades, o vetor retroviral (por exemplo, lentivírus) ou VLP inclui um revestimento lipídico. Nas modalidades, a quantidade de CD47 biologicamente ativo no vetor retroviral ou VLP está entre cerca de 20 a 250, 20 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200 ou 200 a 250 moléculas/μm2. Em algumas modalidades, o CD47 é CD47 humano.
[0680] Um método descrito neste documento pode compreender a evasão da fagocitose de uma partícula por uma célula fagocítica. O método pode incluir a expressão de pelo menos um peptídeo incluindo pelo menos uma porção biologicamente ativa de CD47 em um vetor retroviral ou VLP de modo que, quando o vetor retroviral ou VLP que compreende o CD47 é exposto a uma célula fagocítica, a partícula viral evita a facocitose pela célula fagocítica, ou mostra uma fagocitose diminuída em comparação com um vetor retroviral ou VLP de outra forma similar não modificado. Em algumas modalidades, a meia-vida do vetor retroviral ou VLP em um indivíduo é estendida em comparação com um vetor retroviral ou VLP de outra forma similar não modificado.
DELEÇÃO DE MHC
[0681] O principal complexo de histocompatibilidade de classe I (MHC-I) é uma proteína da membrana da célula hospedeira que pode ser incorporada aos envelopes virais e, por ser altamente polimórfica por natureza, é um alvo principal da resposta imunológica do corpo (McDevitt H. O. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 1 a 17). As moléculas MHC-I expostas na membrana plasmática das células de origem podem ser incorporadas no envelope da partícula viral durante o processo de brotamento do vetor. Essas moléculas MHC-I derivadas das células de origem e incorporadas nas partículas virais podem, por sua vez, ser transferidas para a membrana plasmática das células-alvo. Alternativamente, as moléculas MHC-I podem permanecer em estreita associação com a membrana da célula-alvo como resultado da tendência das partículas virais para absorver e permanecer ligadas à membrana da célula-alvo.
[0682] A presença de moléculas MHC-I exógenas na membrana plasmática de células transduzidas ou próximo à mesma pode desencadear uma resposta imunológica alorreativa em indivíduos. Isso pode levar à morte mediada por imunidade ou fagocitose de células transduzidas, seja por transferência de genes ex vivo seguida pela administração das células transduzidas ao indivíduo, seja por administração direta in vivo das partículas virais. Além disso, no caso de administração in vivo de partículas virais contendo MHC-I na corrente sanguínea, as partículas virais podem ser neutralizadas por anticorpos específicos de MHC-I pré-existentes antes de atingirem suas células- alvo.
[0683] Consequentemente, em algumas modalidades, uma célula de origem é modificada (por exemplo, geneticamente modificada) para diminuir a expressão de MHC-I na superfície da célula. Nas modalidades, a fonte compreende uma ruptura geneticamente modificada de um gene que codifica β2-microglobulina (β2M). Nas modalidades, a célula de origem compreende uma ruptura geneticamente modificada de um ou mais genes que codificam uma cadeia MHC-I α. A célula pode compreender interrupções geneticamente modificadas em todas as cópias do gene que codifica β2-microglobulina. A célula pode compreender interrupções geneticamente modificadas em todas as cópias dos genes que codificam uma cadeia MHC-I α. A célula pode compreender tanto interrupções por engenharia genética de genes que codificam β2- microglobulina quanto interrupções por engenharia genética de genes que codificam uma cadeia MHC-I α. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende um número reduzido de moléculas MHC-
I expostas à superfície. O número de moléculas MHC-I expostas à superfície pode ser diminuído de modo que a resposta imunológica ao MHC-I seja reduzida a um grau terapeuticamente relevante. Em algumas modalidades, a partícula de vetor viral envelopada é substancialmente desprovida de moléculas MHC-I expostas à superfície. SUPEREXPRESSÃO DE HLA-G/E
[0684] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP exibe em seu envelope uma proteína tolerogênica, por exemplo, um agonista ILT-2 ou ILT-4, por exemplo, HLA-E ou HLA-G ou qualquer outro agonista ILT-2 ou ILT-4. Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP aumentou a expressão de HLA-E, HLA-G, ILT-2 ou ILT-4 em comparação com um retrovírus de referência, por exemplo, um retrovírus não modificado de outra forma similar ao retrovírus.
[0685] Em algumas modalidades, uma composição de retrovírus diminuiu Classe I de MHC em comparação com um retrovírus não modificado e aumentou HLA-G em comparação com um retrovírus não modificado.
[0686] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem um aumento na expressão de HLA-G ou HLA-E, por exemplo, um aumento na expressão de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de HLA-G ou HLA-E, em comparação com um retrovírus de referência, por exemplo, um retrovírus não modificado similar ao retrovírus, em que a expressão de HLA-G ou HLA- E é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[0687] Em algumas modalidades, o retrovírus com expressão aumentada de HLA-G demonstra imunogenicidade reduzida, por exemplo, conforme medido pela infiltração de células imunes reduzida, em um ensaio de formação de teratoma.
PROTEÍNAS REGULATÓRIAS DO COMPLEMENTO
[0688] A atividade do complemento é normalmente controlada por várias proteínas reguladoras do complemento (CRPs). Essas proteínas evitam a inflamação espúria e os danos ao tecido do hospedeiro. Um grupo de proteínas, incluindo CD55/fator de aceleração de decaimento (DAF) e CD46/proteína cofator de membrana (MCP), inibe as enzimas de conversão C3/C5 da via clássica e alternativa. Outro conjunto de proteínas, incluindo CD59, regula a montagem do MAC. Os CRPs têm sido usados para prevenir a rejeição de tecidos xenotransplantados e também mostraram proteger os vírus e vetores virais da inativação do complemento.
[0689] Os fatores de controle do complemento residente na membrana incluem, por exemplo, fator de aceleração do decaimento (DAF) ou CD55, proteína-1 similar ao fator H (FH) (FHL-1), proteína de ligação a C4b (C4BP), receptor de complemento 1 (CD35), proteína cofator de membrana (MCP) ou CD46 e CD59 (protectina) (por exemplo, para prevenir a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) e proteger as células da lise).
PROTEÍNA DE LIGAÇÃO À ALBUMINA
[0690] Em algumas modalidades, o lentivírus se liga à albumina. Em algumas modalidades, o lentivírus compreende em sua superfície uma proteína que se liga à albumina. Em algumas modalidades, o lentivírus compreende em sua superfície uma proteína de ligação à albumina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à albumina é a proteína de ligação à albumina estreptocócica. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à albumina é o domínio de ligação à albumina estreptocócica.
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS NÃO FUSOGÊNICAS NO ENVELOPE LENTIVIRAL
[0691] Em algumas modalidades, o lentivírus é projetado para compreender uma ou mais proteínas em sua superfície. Em algumas modalidades, as proteínas afetam as interações imunológicas com um indivíduo. Em algumas modalidades, as proteínas afetam a farmacologia do lentivírus no indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína é um receptor. Em algumas modalidades, a proteína é um agonista. Em algumas modalidades, a proteína é uma molécula de sinalização. Em algumas modalidades, a proteína na superfície lentiviral compreende um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3) ou IL7.
[0692] Em algumas modalidades, uma proteína transmembrana mitogênica e/ou uma proteína transmembrana à base de citocina está presente na célula de origem, que pode ser incorporada ao retrovírus quando brota da membrana da célula de origem. A proteína transmembranar mitogênica e/ou uma proteína transmembrana à base de citocina pode ser expressa como uma molécula de superfície celular separada na célula de origem em vez de ser parte da glicoproteína do envelope viral.
[0693] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos descritos neste documento, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é substancialmente não imunogênico. A imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme descrito neste documento.
[0694] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP se funde com uma célula-alvo para produzir uma célula receptora. Em algumas modalidades, uma célula receptora que se fundiu a um ou mais vetores retrovirais ou VLPs é avaliada quanto à imunogenicidade. Nas modalidades, uma célula receptora é analisada quanto à presença de anticorpos na superfície da célula, por exemplo, por coloração com um anticorpo anti-IgM. Em outras modalidades, a imunogenicidade é avaliada por um ensaio de lise de células PBMC. Nas modalidades, uma célula receptora é incubada com células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e, em seguida, avaliada quanto à lise das células pelas PBMCs. Em outras modalidades, a imunogenicidade é avaliada por um ensaio de lise de células exterminadoras naturais (NK). Nas modalidades, uma célula receptora é incubada com células NK e, em seguida, avaliada quanto à lise das células pelas células NK. Em outras modalidades, a imunogenicidade é avaliada por um ensaio de lise de células T CD8+. Nas modalidades, uma célula receptora é incubada com células T CD8+ e, em seguida, avaliada quanto à lise das células pelas células T CD8+.
[0695] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende níveis elevados de um agente imunossupressor (por exemplo, proteína imunossupressora) em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um produzido a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293. Em algumas modalidades, o nível elevado é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende um agente imunossupressor que está ausente da célula de referência. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP compreende níveis reduzidos de um agente imunoestimulador (por exemplo, proteína imunoestimuladora) em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um produzido a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293. Em algumas modalidades, o nível reduzido é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% em comparação ao vetor retroviral ou VLP de referência. Em algumas modalidades, o agente imunoestimulador está substancialmente ausente do vetor retroviral ou VLP.
[0696] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP, ou a célula de origem da qual o vetor retroviral ou VLP é derivado, tem um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das seguintes características:
[0697] a. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de classe I de MHC ou classe II de MHC em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de origem de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HeLa, ou uma célula HEK293;
[0698] b. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de uma ou mais proteínas coestimuladoras incluindo, porém sem limitação: LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7- H3 ou B7-H4, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um retroviral não modificado vetor ou VLP de uma célula de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK, ou uma célula de referência descrita neste documento;
[0699] c. expressão de proteínas de superfície que suprimem o envolvimento de macrófagos, por exemplo, CD47, por exemplo, expressão detectável por um método descrito neste documento, por exemplo, mais de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais expressão da proteína de superfície que suprime o envolvimento de macrófagos, por exemplo, CD47, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula Jurkat ou uma célula HEK293;
[0700] d. expressão de citocinas imunossupressoras solúveis, por exemplo, IL-10, por exemplo, expressão detectável por um método descrito neste documento, por exemplo, mais de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais expressão de citocinas imunossupressoras solúveis, por exemplo, IL-10, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293;
[0701] e. expressão de proteínas imunossupressoras solúveis, por exemplo, PD-L1, por exemplo, expressão detectável por um método descrito neste documento, por exemplo, mais de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais expressão de proteínas imunossupressoras solúveis, por exemplo, PD-L1, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293;
[0702] f. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de citocinas estimulantes da imunidade solúvel, por exemplo, IFN-gama ou TNF-a, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293 ou uma célula U-266;
[0703] g. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor do antígeno imunoestimulante endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula HEK293 ou uma célula A549, ou uma célula SK-BR-3;
[0704] h. expressão de, por exemplo, expressão detectável por um método descrito neste documento, HLA-E ou HLA-G, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293, ou uma célula Jurkat;
[0705] i. perfil de glicosilação de superfície, por exemplo, contendo ácido siálico, que atua para, por exemplo, suprimir a ativação de células NK;
[0706] j. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de TCRα/β, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat;
[0707] k. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de grupos sanguíneos ABO, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula HeLa;
[0708] l. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de Antígeno de Histocompatibilidade Menor (MHA), em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat; ou
[0709] m. tem menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos de MHAs mitocondriais em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat, ou não ter MHAs mitocondriais detectáveis.
[0710] Nas modalidades, a proteína coestimuladora é 4-1BB, B7, SLAM, LAG3, HVEM ou LIGHT, e a célula de referência é HDLM-2. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é BY-H3 e a célula de referência é HeLa. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é ICOSL ou B7-H4 e a célula de referência é SK-BR-3. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é ICOS ou OX40 e a célula de referência é MOLT-4. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é CD28 e a célula de referência é U-266. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é CD30L ou CD27 e a célula de referência é Daudi.
[0711] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica não elicia substancialmente uma resposta imunogênica pelo sistema imunológico, por exemplo, sistema imunológico inato. Nas modalidades, uma resposta imunogênica pode ser quantificada, por exemplo, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, a resposta imunogênica do sistema imune inato compreende uma resposta de células imunes inatas incluindo, porém sem limitação, células NK, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, células dendríticas, mastócitos ou células T gama/delta. Em algumas modalidades, uma resposta imunogênica do sistema imune inato compreende uma resposta do sistema complemento que inclui componentes solúveis do sangue e componentes ligados à membrana.
[0712] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica não elicia substancialmente uma resposta imunogênica pelo sistema imunológico, por exemplo, sistema imunológico adaptativo. Em algumas modalidades, uma resposta imunogênica pelo sistema imune adaptativo compreende uma resposta imunogênica por uma célula imune adaptativa incluindo, porém sem limitação, uma mudança, por exemplo, aumento, no número ou atividade de linfócitos T (por exemplo, células T CD4, T CD8 células e ou células T gama-delta) ou linfócitos B. Em algumas modalidades, uma resposta imunogênica pelo sistema imune adaptativo inclui níveis aumentados de componentes do sangue solúveis incluindo, porém sem limitação, uma mudança, por exemplo, aumento, no número ou atividade de citocinas ou anticorpos (por exemplo, IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD).
[0713] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é modificado para ter imunogenicidade reduzida. Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica tem uma imunogenicidade menor que 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% menor do que a imunogenicidade de um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat.
[0714] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos descritos neste documento, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero, tendo um genoma modificado, por exemplo, modificado usando um método descrito neste documento, para reduzir, por exemplo, diminuir, imunogenicidade. A imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme descrito neste documento.
[0715] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de mamífero exaurida, por exemplo, com um knockout de, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais dos seguintes:
[0716] a. classe I de MHC, classe II de MHC ou MHA;
[0717] b. uma ou mais proteínas coestimuladoras incluindo, porém sem limitação: LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 ou B7-H4;
[0718] c. citocinas imunoestimulantes solúveis, por exemplo, IFN- gama ou TNF-a;
[0719] d. antígeno imunoestimulador endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1;
[0720] e. Receptores de células T (TCR);
[0721] f. Os genes que codificam grupos sanguíneos ABO, por exemplo, gene ABO;
[0722] g. fatores de transcrição que impulsionam a ativação imunológica, por exemplo, NFkB;
[0723] h. fatores de transcrição que controlam a expressão de MHC, por exemplo, transativador de classe II (CIITA), fator regulador do Xbox 5 (RFX5), proteína associada a RFX (RFXAP) ou repetições de anquirina RFX (RFXANK; também conhecido como RFXB); ou
[0724] i. Proteínas TAP, por exemplo, TAP2, TAP1 ou TAPBP, que reduzem a expressão de MHC de classe I.
[0725] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP é derivado de uma célula de origem com uma modificação genética que resulta no aumento da expressão de um agente imunossupressor, por exemplo, um, dois, três ou mais dos seguintes (por exemplo, em que antes da modificação genética a célula não expressou o fator):
[0726] a. proteínas de superfície que suprimem o envolvimento de macrófagos, por exemplo, CD47; por exemplo, expressão aumentada de CD47 em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat;
[0727] b. citocinas imunossupressoras solúveis, por exemplo, IL-10, por exemplo, expressão aumentada de IL-10 em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat;
[0728] c. proteínas imunossupressoras solúveis, por exemplo, PD- 1, PD-L1, CTLA4 ou BTLA; por exemplo, expressão aumentada de proteínas imunossupressoras em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à fonte de célula, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat;
[0729] d. uma proteína tolerogênica, por exemplo, um agonista de ILT-2 ou ILT-4, por exemplo, HLA-E ou HLA-G ou qualquer outro agonista de ILT-2 ou ILT-4 endógeno, por exemplo, expressão aumentada de HLA-E, HLA-G, ILT-2 ou ILT-4 em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat; ou
[0730] e. proteínas de superfície que suprimem a atividade do complemento, por exemplo, proteínas reguladoras do complemento, por exemplo, proteínas que se ligam ao fator de aceleração de decaimento (DAF, CD55), por exemplo, proteína similar ao fator H (FH)-1 (FHL-1), por exemplo, proteína de ligação C4b (C4BP), por exemplo, receptor de complemento 1 (CD35), por exemplo, proteína cofator de membrana (MCP, CD46), por exemplo, Profectina (CD59), por exemplo, proteínas que inibem as enzimas de conversão CD/C5 da via de complemento clássica e alternativa, por exemplo, proteínas que regulam a montagem de MAC; por exemplo, expressão aumentada de uma proteína regulatória do complemento em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat.
[0731] Em algumas modalidades, o nível de expressão aumentado é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 5 dobrado, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência.
[0732] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP é derivado de uma célula de origem modificada para ter expressão diminuída de um agente imunoestimulador, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais dos seguintes:
[0733] a. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de classe I de MHC ou classe II de MHC, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula HeLa;
[0734] b. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de uma ou mais proteínas coestimuladoras incluindo, porém sem limitação: LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7- H3 ou B7-H4, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um retroviral não modificado vetor ou VLP de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula de referência descrita neste documento;
[0735] c. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, ou 5% ou expressão menor de citocinas imunoestimulantes solúveis, por exemplo, IFN-gama ou TNF-a, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula U-266;
[0736] d. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de antígeno imunoestimulante endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293, ou uma célula A549, ou uma célula SK-BR-3;
[0737] e. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de receptores de células T (TCR) em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat;
[0738] f. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de grupos sanguíneos ABO, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula HeLa;
[0739] g. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de fatores de transcrição que conduzem a ativação imunológica, por exemplo, NFkB; em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat
[0740] h. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de fatores de transcrição que controlam a expressão de MHC, por exemplo, classe II de transativador (CIITA), fator regulador do Xbox 5 (RFX5), proteína associada a RFX (RFXAP) ou repetições de anquirina RFX (RFXANK; também conhecido como RFXB) em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à fonte célula, uma célula HEK293 ou uma célula Jurkat; ou
[0741] i. menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou 5% ou expressão menor de proteínas TAP, por exemplo, TAP2, TAP1 ou TAPBP, que reduzem a expressão de classe I de MHC em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, uma célula HEK293 ou uma célula HeLa.
[0742] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica derivada de uma célula de mamífero, por exemplo, uma HEK293, modificada usando shRNA expressando lentivírus para diminuir a expressão de Classe I de MHC, tem menor expressão de Classe I de MHC em comparação com um vetor retroviral ou VLP não modificado, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP de uma célula (por exemplo, célula-tronco mesenquimal) que não foi modificada. Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou VLP derivado de uma célula de mamífero, por exemplo, uma HEK293, modificada usando lentivírus expressando HLA-G para aumentar a expressão de HLA-G, aumentou a expressão de HLA-G em comparação com um vetor retroviral ou VLP não modificado, por exemplo, de uma célula (por exemplo, uma HEK293) que não foi modificada.
[0743] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero, que não é substancialmente imunogênica, em que as células de origem estimulam, por exemplo, induzem a secreção de IFN-gama de células T, em um nível de 0 pg/ml a> 0 pg/ml, por exemplo, conforme testado in vitro, pelo ensaio ELISPOT de IFN-gama.
[0744] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero é de uma cultura de células tratada com um agente imunossupressor, por exemplo, um glucocorticoide (por exemplo, dexametasona), citostático (por exemplo, metotrexato), anticorpo (por exemplo, Muromonab (OKT3)-CD3) ou modulador de imunofilina (por exemplo, Ciclosporina ou rapamicina).
[0745] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero compreende um agente exógeno, por exemplo, um agente terapêutico.
[0746] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero é uma célula recombinante.
[0747] Em algumas modalidades, o vetor retroviral, VLP ou produto farmacêutico é derivado de uma célula de mamífero geneticamente modificada para expressar imunoevasinas virais, por exemplo, hCMV US2 ou US11.
[0748] Em algumas modalidades, a superfície do vetor retroviral ou VLP, ou a superfície da célula de origem, é covalentemente ou não covalentemente modificada com um polímero, por exemplo, um polímero biocompatível que reduz a imunogenicidade e a depuração mediada imunologicamente, por exemplo, PEG.
[0749] Em algumas modalidades, a superfície do vetor retroviral ou VLP, ou a superfície da célula de origem é covalentemente ou não covalentemente modificada com um ácido siálico, por exemplo, um ácido siálico que compreende glicopolímeros, que contêm epítopos de glicano supressores de NK.
[0750] Em algumas modalidades, a superfície do vetor retroviral ou VLP ou a superfície da célula de origem é tratada enzimaticamente, por exemplo, com enzimas glicosidase, por exemplo, α-N- acetilgalactosaminidases, para remover grupos sanguíneos ABO.
[0751] Em algumas modalidades, a superfície do vetor retroviral ou VLP, ou a superfície da célula de origem é tratada enzimaticamente, para dar origem a, por exemplo, induzir a expressão de, grupos sanguíneos ABO que correspondem ao tipo de sangue do receptor.
PARÂMETROS PARA AVALIAR A IMUNOGENICIDADE
[0752] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP é derivado de uma célula de origem, por exemplo, uma célula de mamífero que não é substancialmente imunogênica, ou modificada, por exemplo, modificada usando um método descrito neste documento, para ter uma redução na imunogenicidade. A imunogenicidade da célula de origem e do vetor retroviral ou VLP pode ser determinada por qualquer um dos ensaios descritos neste documento.
[0753] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem um aumento, por exemplo, um aumento de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais, na sobrevivência do enxerto in vivo em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem.
[0754] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem uma redução na imunogenicidade medida por uma redução na resposta humoral após uma ou mais implantações do vetor retroviral ou VLP em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal descrito neste documento, em comparação com um resposta humoral após uma ou mais implantações de um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal descrito neste documento. Em algumas modalidades, a redução na resposta humoral é medida em uma amostra de soro por um título de anticorpo anti-célula, por exemplo, título de anticorpo antirretroviral ou anti-VLP, por exemplo, por ELISA. Em algumas modalidades, a amostra de soro de animais administrados com o vetor retroviral ou VLP tem uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais de um título de anticorpo antirretroviral ou anti-VLP em comparação com a amostra de soro de animais administrados com um vetor retroviral ou VLP não modificado. Em algumas modalidades, a amostra de soro de animais administrados com o vetor retroviral ou VLP tem um título de anticorpo antirretroviral ou anti-VLP aumentado, por exemplo, aumentado em 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, ou 40% da linha de base, por exemplo, em que a linha de base se refere à amostra de soro dos mesmos animais antes da administração do vetor retroviral ou VLP.
[0755] Em algumas modalidades, o vetor retroviral vector ou VLP tem uma redução em fagocitose de macrófagos, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais em fagocitose de macrófagos em comparação a um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origiem, em que a redução na fagocitose de macrófagos é detemrinada por ensaio do índice de fagocitose in vitro, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 8. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem um índice de fagocitose de 0, 1, 10, 100 ou mais, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 8, quando incubado com macrófagos em um ensaio in vitro de fagocitose de macrófagos.
[0756] Em algumas modalidades, a célula de origem ou célula receptora tem uma redução na lise celular mediada por citotoxicidade por PBMCs, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na lise celular em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada similar à célula de origem, ou uma célula receptora que recebeu um vetor retroviral ou VLP não modificado, ou células-tronco mesenquimais, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 17. Nas modalidades, a célula de origem expressa HLA-G exógeno.
[0757] Em algumas modalidades, a célula de origem ou célula receptora tem uma redução na lise celular mediada por NK, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na lise celular mediada por NK em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada similar à célula de origem, ou uma célula receptora que recebeu um vetor retroviral ou VLP não modificado, em que a lise celular mediada por NK é avaliada in vitro, por um ensaio de liberação de cromo ou ensaio de liberação de európio, por exemplo, usando um ensaio do
Exemplo 18.
[0758] Em algumas modalidades, a célula de origem ou célula receptora tem uma redução na lise de células mediada por células T CD8+, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na lise de células mediadas por células T CD8 em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada similar à célula de origem, ou uma célula receptora que recebeu um vetor retroviral ou VLP não modificado em que a lise de células mediada por células T CD8 é avaliada in vitro, por um ensaio do Exemplo 19.
[0759] Em algumas modalidades, a célula de origem ou célula receptora tem uma redução na proliferação e/ou ativação de células T CD4+, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma similar à célula de origem, ou uma célula receptora que recebeu um vetor retroviral ou VLP não modificado, em que a proliferação de células T CD4 é testada in vitro (por exemplo, ensaio de cocultura de célula de origem de mamífero modificada ou não modificada e células T CD4+ com Dynabeads CD3/CD28).
[0760] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP causa uma redução na secreção de IFN-gama de células T, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na secreção de IFN-gama de células T em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em que a secreção de IFN-gama de célula T é avaliada in vitro, por exemplo, por ELISPOT de IFN-gama.
[0761] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP causa uma redução na secreção de citocinas imunogênicas, por exemplo, uma redução de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na secreção de citocinas imunogênicas em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em que a secreção de citocinas imunogênicas é testada in vitro usando ELISA ou ELISPOT.
[0762] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP resulta no aumento da secreção de uma citocina imunossupressora, por exemplo, um aumento de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na secreção de uma citocina imunossupressora em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em que a secreção da citocina imunossupressora é avaliada in vitro usando ELISA ou ELISPOT.
[0763] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem um aumento na expressão de HLA-G ou HLA-E, por exemplo, um aumento na expressão de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de HLA-G ou HLA-E, em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula similar à célula de origem, em que a expressão de HLA-G ou HLA-E é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP é derivado de uma célula de origem que é modificada para ter uma expressão aumentada de HLA-G ou HLA-E, por exemplo, em comparação com uma célula não modificada, por exemplo, uma expressão aumentada de 1%, 5 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de HLA-G ou HLA-E, em que a expressão de HLA-G ou HLA-E é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS. Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP derivado de uma célula modificada com expressão aumentada de HLA- G demonstra imunogenicidade reduzida.
[0764] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem ou causa um aumento na expressão de ligantes inibidores de células T (por exemplo, CTLA4, PD1, PD-L1), por exemplo, um aumento na expressão de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de ligantes inibidores de células T em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em que a expressão de ligantes inibidores de células T é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[0765] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem uma diminuição na expressão de ligantes coestimuladores, por exemplo, uma diminuição de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na expressão de ligantes coestimuladores em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula de outra forma similar à célula de origem, em que a expressão de ligantes é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[0766] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP tem uma diminuição na expressão de classe I de MHC ou classe II de MHC, por exemplo, uma diminuição na expressão de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de Classe I de MHC ou Classe II de MHC em comparação com um vetor retroviral ou VLP de referência, por exemplo, um vetor retroviral ou VLP não modificado de uma célula similar à célula de origem ou uma célula HeLa, em que a expressão de MHC de Classe I ou II é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[0767] Em algumas modalidades, o vetor retroviral ou VLP é derivado de uma fonte de células, por exemplo, uma fonte de células de mamíferos, que é substancialmente não imunogênica. Em algumas modalidades, a imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, a fonte de células de mamífero compreende qualquer um, todos ou uma combinação dos seguintes recursos:
[0768] a. em que a célula de origem é obtida a partir de uma fonte de células autólogas; por exemplo, uma célula obtida de um receptor que receberá, por exemplo, ao qual será administrado, o vetor retroviral ou VLP;
[0769] b. em que a célula de origem é obtida de uma fonte de célula alogênica que é de gênero compatível, por exemplo, similar a um receptor, por exemplo, um receptor descrito neste documento que receberá, por exemplo, ao qual será administrado; o vetor retroviral ou VLP;
[0770] c. em que a célula de origem é obtida de uma fonte de célula alogênica que é compatível em HLA com o HLA do receptor, por exemplo, em um ou mais alelos;
[0771] d. em que a célula de origem é obtida de uma fonte celular alogênica que é um homozigoto HLA;
[0772] e. em que a célula de origem é obtida de uma fonte de células alogênicas que não possui (ou tem níveis reduzidos em comparação com uma célula de referência) classe I e II de MHC; ou
[0773] f. em que a célula de origem é obtida a partir de uma fonte celular que é conhecida por ser substancialmente não imunogênica, incluindo, porém sem limitação, uma célula-tronco, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária, uma célula de Sertoli ou uma célula epitelial pigmentar da retina.
[0774] Em algumas modalidades, o indivíduo ao qual será administrado o vetor retroviral ou VLP tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo pré-existente (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com um vetor retroviral ou VLP. Em algumas modalidades, o indivíduo ao qual será administrado o vetor retroviral ou VLP não tem níveis detectáveis de um anticorpo pré-existente reativo com o vetor retroviral ou VLP. Os testes para o anticorpo são descritos, por exemplo, no Exemplo 13.
[0775] Em algumas modalidades, um indivíduo que recebeu o vetor retroviral ou VLP tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com um vetor retroviral ou VLP. Em algumas modalidades, o indivíduo que recebeu o vetor retroviral ou VLP (por exemplo, pelo menos uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais) não tem níveis detectáveis de anticorpo reativo com o vetor retroviral ou VLP. Nas modalidades, os níveis de anticorpo não aumentam mais do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 50% entre dois pontos de tempo, o primeiro ponto no tempo sendo antes da primeira administração do vetor retroviral ou VLP, e o segundo ponto no tempo sendo após uma ou mais administrações do vetor retroviral ou VLP. Os testes para o anticorpo são descritos, por exemplo, no Exemplo 14.
AGENTES EXÓGENOS
[0776] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, VLP ou composição farmacêutica descrito neste documento codifica um agente exógeno.
AGENTES EXÓGENOS DE PROTEÍNA
[0777] Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende uma proteína citosólica, por exemplo, uma proteína que é produzida na célula receptora e localizada no citoplasma da célula receptora. Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende uma proteína secretada, por exemplo, uma proteína que é produzida e secretada pela célula receptora. Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende uma proteína nuclear, por exemplo, uma proteína que é produzida na célula receptora e é importada para o núcleo da célula receptora. Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende uma proteína organelar (por exemplo, uma proteína mitocondrial), por exemplo, uma proteína que é produzida na célula receptora e é importada para uma organela (por exemplo, uma mitocondrial) da célula receptora.
[0778] Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende um ácido nucleico, por exemplo, RNA, íntron (ou íntrons), éxon (ou éxons), mRNA (RNA mensageiro), tRNA (RNA de transferência), RNA modificado, microRNA, siRNA (pequeno RNA interferente), tmRNA (RNA mensageiro de transferência), rRNA (RNA ribossomal), mtRNA (RNA mitocondrial), snRNA (RNA nuclear pequeno), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA SmY (RNAm trans-splicing RNA), gRNA (RNA guia), TERC (componente do RNA da telomerase), aRNA (RNA anti- senso), cis-NAT (transcrito antisense Cis-natural), RNA CRISPR (crRNA), lncRNA (RNA não codificador longo), piRNA (RNA interagente com piwi), shRNA (RNA de hairpin curto), tasiRNA (siRNA de ação trans), eRNA (RNA intensificador), RNA satélite, pcRNA (RNA codificador de proteínas), dsRNA (RNA de fita dupla), RNAi (RNA interferente), circRNA (RNA circular), RNAs reprogramados, aptâmeros e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico de tipo selvagem ou um ácido nucleico mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma fusão ou quimera de múltiplas sequências de ácido nucleico.
[0779] Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende um polipeptídeo, por exemplo, enzimas, polipeptídeos estruturais, polipeptídeos de sinalização, polipeptídeos reguladores, polipeptídeos de transporte, polipeptídeos sensoriais, polipeptídeos motores, polipeptídeos de defesa, polipeptídeos de armazenamento, fatores de transcrição, anticorpos, citocinas, hormônios, polipeptídeos catabólicos, polipeptídeos anabólicos, polipeptídeos proteolíticos, polipeptídeos metabólicos, quinases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases, polipeptídeos moduladores de enzimas, polipeptídeos de ligação de proteínas, polipeptídeos de ligação de lipídeos, polipeptídeos de fusão de membrana, polipeptídeos de diferenciação celular, polipeptídeos epigenéticos, polipeptídeos de morte celular, polipeptídeos de transporte nuclear, polipeptídeos de ligação de ácido nucleico, polipeptídeos de reprogramação, polipeptídeos de edição de DNA, polipeptídeos de reparo de DNA, polipeptídeos de recombinação de DNA, polipeptídeos de transposase, polipeptídeos de integração de DNA, endonucleases direcionadas (por exemplo, nucleases de dedo de zinco, nucleases similares a ativadores de transcrição (TALENs), cas9 e homólogos dos mesmos), recombinases e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína tem como alvo uma proteína na célula para degradação. Em algumas modalidades, a proteína tem como alvo uma proteína na célula para degradação localizando-se a proteína no proteassoma. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína de tipo selvagem ou uma proteína mutante. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína de fusão ou quimérica.
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
[0780] Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende uma proteína de membrana. Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR), um receptor de células T, uma integrina, um canal iônico, uma proteína formadora de poros, um receptor similar a Toll, um receptor de interleucina, uma proteína de adesão celular ou uma proteína de transporte.
[0781] Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende uma sequência dentre as SEQ ID NOs: 8.144 a 16.131 da
Publicação de Patente nº US 2016/0289674, que são incorporadas neste documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende um fragmento, variante ou homólogo de uma sequência dentre as SEQ ID NOs: 8.144 a 16.131 da Publicação de Patente nº US 2016/0289674. Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende uma sequência dentre as SEQ ID NOs: 8.144 a 16.131 da Publicação de Patente nº US 2016/0289674. Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende um fragmento, variante ou homólogo de uma sequência dentre as SEQ ID NOs: 8.144 a 16.131 da Publicação de Patente nº US 2016/0289674.
[0782] Em algumas modalidades, a proteína de membrana compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o CAR é ou compreende um CAR de primeira geração que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização (por exemplo, um, dois ou três domínios de sinalização). Em algumas modalidades, o CAR compreende um CAR de terceira geração que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e pelo menos três domínios de sinalização. Em algumas modalidades, um CAR de quarta geração que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana, três ou quatro domínios de sinalização e um domínio que após a sinalização bem-sucedida do CAR induz a expressão de um gene de citocina. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um scFv ou Fab.
[0783] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem como alvo uma característica do antígeno de uma célula neoplásica.
Em algumas modalidades, a característica do antígeno de uma célula neoplásica é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, receptor tirosina quinase, receptor associado à tirosina quinase, tirosina fosfatase similar a receptor, serina/treonina quinase receptora, guanilil ciclase receptor receptora, receptor associado a histidina quinase, Receptores de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) (incluindo ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 e ErbB4/HER4), Receptores de Fator de Crescimento de Fibrolasto (FGFR) (incluindo FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 e FGF21) Receptores de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR) (incluindo VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF), o receptor RET e a família de receptores Eph (incluindo EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2. EphB3, EphB4 e EphB6), CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC- 5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, Bestrophins, TMEM16A, receptor GABA, receptor de glicina, transportadores ABC, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P1R), canal NMDA, proteína transmembrana, proteína transmembrana multispan, motivos de receptor de células T; cadeias alfa de células T; cadeias β de células T; cadeias γ de células T; cadeias δ de células T; CCR7; CD3; CD4; CD5; CD7; CD8; CD11b; CD11c; CD16; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD34; CD35; CD40; CD45RA; CD45RO; CD52; CD56; CD62L; CD68; CD80; CD95; CD117; CD127; CD133; CD137 (4-1 BB); CD163; F4/80; IL-4Ra; Sca- 1; CTLA-4; GITR; GARP; LAP; granzima B; LFA-1; receptor de transferrina; NKp46, perforina, CD4+; Th1; Th2; Th17; Th40; Th22; Th9; Tfh, Canonical Treg.
FoxP3+; Tr1; Th3; Treg17; TREG; CDCP1, NT5E,
EpCAM, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, anidrase carbônica IX, PSMA, proteína de ligação a folato, Gangliosídeos (por exemplo, CD2, CD3, GM2), Lewis-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, Tenascina, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Smoothened, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR ou ANTXR1, receptor alfa de folato (FRa), ERBB2 (Her2/neu), EphA2, IL- 13Ra2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mesotelina, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16 (CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13R 1, L1-CAM, Tn Ag, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, receptor de interleucina-11 a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, receptor-beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta), SSEA-4, CD20, MUC1, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor IGF-1, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, tirosinase, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, receptor beta de folato, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, ácido polisial PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, legumaína, HPV E6, E7, ETV6-AML, proteína de esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacionado a Fos 1, p53, mutante de p53, prosteína, survivina, telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, mutante de Ras, hTERT, pontos de quebra de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1,
RU2, carboxil esterase intestinal, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, um neoantígeno, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A, B, C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB ou trkC, ou um fragmento antigênico ou porção antigênica dos mesmos.
[0784] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar CAR compreende pelo menos uma região transmembrana da cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 ou uma variante funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende pelo menos uma região (ou regiões) transmembrana de CD8α, CD8β, 4- 1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS e FGFR2B, ou uma variante funcional dos mesmos.
[0785] Em algumas modalidades, o CAR compreende pelo menos um domínio de sinalização selecionado dentre um ou mais dentre B7- 1/CD80; B7-2/CD86; B7-H1/PD-L1; B7-H2; B7-H3; B7-H4; B7-H6; B7- H7; BTLA/CD272; CD28; CTLA-4; Gi24/VISTA/B7-H5; ICOS/CD278; PD-1; PD-L2/B7-DC; PDCD6); 4-1BB/TNFSF9/CD137; Ligante 4- 1BB/TNFSF9; BAFF/BLyS/TNFSF13B; BAFF R/TNFRSF13C; CD27/TNFRSF7; Ligante CD27/TNFSF7; CD30/TNFRSF8; Ligante CD30/TNFSF8; CD40/TNFRSF5; CD40/TNFSF5; Ligante CD40/TNFSF5; DR3/TNFRSF25; GITR/TNFRSF18; Ligante GITR/TNFSF18; HVEM/TNFRSF14; LIGHT/TNFSF14; Linfotoxina- alfa/TNF-beta; OX40/TNFRSF4; Ligante OX40/TNFSF4; RELT/TNFRSF19L; TACI/TNFRSF13B; TL1A/TNFSF15; TNF-alfa; TNF RII/TNFRSF1B); 2B4/CD244/SLAMF4; BLAME/SLAMF8; CD2; CD2F-
10/SLAMF9; CD48/SLAMF2; CD58/LFA-3; CD84/SLAMF5; CD229/SLAMF3; CRACC/SLAMF7; NTB-A/SLAMF6; SLAM/CD150); CD2; CD7; CD53; CD82/Kai-1; CD90/Thy1; CD96; CD160; CD200; CD300a/LMIR1; Classe I de HLA; HLA-DR; Ikaros; Integrina alfa 4/CD49d; Integrina alfa 4 beta 1; Integrina alfa 4 beta 7/LPAM-1; LAG- 3; TCL1A; TCL1B; CRTAM; DAP12; Dectina-1/CLEC7A; DPPIV/CD26; EphB6; TIM-1/KIM-1/HAVCR; TIM-4; TSLP; TSLP R; antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1); NKG2C, um domínio zeta CD3, um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM), CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, ou um fragmento funcional dos mesmos. miRNA e siRNA
[0786] Nas modalidades, o genoma retroviral codifica uma ou mais (por exemplo, duas ou mais) moléculas de RNA inibidoras dirigidas contra um ou mais alvos de RNA. Uma molécula de RNA inibitória pode ser, por exemplo, um miRNA ou um shRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um precursor de um miRNA, como, por exemplo, um Pri-miRNA ou um Pré-miRNA ou um precursor de um shRNA. Em algumas modalidades, a molécula inibidora pode ser um miRNA ou shRNA derivado artificialmente. Em outras modalidades, a molécula de RNA inibitória pode ser um dsRNA (transcrito ou introduzido artificialmente) que é processado em um siRNA ou no próprio siRNA. Em algumas modalidades, a molécula de RNA inibitória pode ser um miRNA ou shRNA que tem uma sequência que não é encontrada na natureza, ou tem pelo menos um segmento funcional que não é encontrado na natureza, ou tem uma combinação de segmentos funcionais que não são encontrados na natureza. Nas modalidades ilustrativas, pelo menos uma ou todas as moléculas de RNA inibidoras são miR-155.
[0787] Em algumas modalidades, um vetor retroviral descrito neste documento codifica duas ou mais moléculas de RNA inibitórias dirigidas contra um ou mais alvos de RNA. Duas ou mais moléculas de RNA inibitórias, em algumas modalidades, podem ser direcionadas contra diferentes alvos. Em outras modalidades, as duas ou mais moléculas de RNA inibidoras são direcionadas contra o mesmo alvo.
[0788] Em algumas modalidades, o agente exógeno compreende um shRNA. Um shRNA (RNA de hairpin curto) pode compreender uma estrutura de fita dupla que é formada por uma única fita de RNA autocomplementar. Os construtos de shRNA podem compreender uma sequência de nucleotídeos idêntica a uma porção, de sequência codificante ou não, de um gene alvo. Sequências de RNA com inserções, deleções e mutações de ponto único em relação à sequência alvo também podem ser usadas. Pode ser usado mais de 90% de identidade de sequência, ou mesmo 100% de identidade de sequência, entre o RNA inibitório e a porção do gene alvo. Em certas modalidades, o comprimento da porção de formação de duplex de um shRNA é de pelo menos 20, 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, correspondendo em tamanho a produtos de RNA produzidos por clivagem dependente de Dicer. Em certas modalidades, o construto shRNA tem pelo menos 25, 50, 100, 200, 300 ou 400 bases de comprimento. Em certas modalidades, o construto shRNA tem 400 a 800 bases de comprimento. Os construtos shRNA são altamente tolerantes à variação na sequência e no tamanho do loop.
[0789] Nas modalidades, um vetor retroviral que codifica um siRNA, um miRNA, um shRNA ou uma ribozima compreende uma ou mais sequências regulatórias, como, por exemplo, uma forte pol III constitutiva, por exemplo, promotor U6 snRNA humano, o snRNA U6 de camundongo promotor, o promotor de RNA H1 humano e de camundongo e o promotor de tRNA-val humano, ou um forte promotor constitutivo de pol II.
RECEPTORES DE FUSOGÊNIO E MÉTODOS DE PREVENÇÃO DA FUSÃO DA CÉLULA DE ORIGEM
[0790] Em algumas modalidades, uma célula de origem é modificada (por exemplo, usando siRNA, miRNA, shRNA, edição de genoma ou outros métodos) para ter expressão reduzida (por exemplo, nenhuma expressão) de um receptor de fusogênio que se liga a um fusogênio expresso pela célula de origem. Em algumas modalidades, o fusogênio é um fusogênio realvejado, por exemplo, o fusogênio pode compreender um domínio de ligação ao alvo, por exemplo, um anticorpo, por exemplo, um scFv. Em algumas modalidades, o receptor de fusogênio é ligado ao anticorpo.
ELEMENTOS ISOLANTES
[0791] Em algumas modalidades, um vetor retroviral ou lentiviral ou VLP compreende ainda um ou mais elementos isolantes, por exemplo, um elemento isolante descrito neste documento. Elementos isolantes podem contribuir para proteger sequências expressas de lentivírus, por exemplo, polipeptídeos terapêuticos, de efeitos de local de integração, que podem ser mediados por elementos de ação cis presentes no DNA genômico e levar à expressão desregulada de sequências transferidas (por exemplo, efeito de posição; consultar, por exemplo, Burgess- Beusse et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99: 16.433; e Zhan et al, 2001, Hum. Genet., 109: 471) ou expressão desregulada de sequências endógenas adjacentes as sequências transferidas. Em algumas modalidades, os vetores de transferência compreendem um ou mais elementos isolantes da LTR 3’, e mediante integração do provírus no genoma hospedeiro, o provírus compreende um ou mais isolantes na LTR 5' e/ou LTR 3', em virtude de duplicar a LTR 3'. Isolantes adequados incluem, porém sem limitação, isolante de β-globina de frango (consultar Chung et al, 1993. Cell 74: 505; Chung et al, 1997. N4S 94: 575; e Bell et al., 1999. Cell 98: 387, incorporados neste documento a título de referência) ou um isolante de um locus de β- globina humana, como HS4 de frango. Em algumas modalidades, o isolante se liga ao fator de ligação CCCTC (CTCF). Em algumas modalidades, o isolante é um isolante de barreira. Em algumas modalidades, o isolante é um isolante de bloqueio de intensificador. Consultar, por exemplo, Emery et al., Human Gene Therapy, 2011, e em Browning e Trobridge, Biomedicines, 2016, ambos incluídos em sua totalidade a título de referência.
[0792] Em algumas modalidades, os isolantes no ácido nucleico retroviral reduzem a genotoxicidade nas células receptoras. A genotoxicidade pode ser medida, por exemplo, conforme descrito em Cesana et al, "Uncovering and dissecting the genotoxicity of self- inactivating lentiviral vectors in vivo” Mol Ther. Abr, 2014;22(4):774 a
785. doi: 10.1038/mt.2014.3. Epub 2014, 20 de janeiro.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS PARA PREPARAR AS MESMAS
[0793] Em algumas modalidades, uma ou mais unidades de transdução de vetor retroviral são administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 10, 100, 1.000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ou 1014 unidades de transdução por kg são administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 10, 100, 1.000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ou 1014 unidades de transdução por células-alvo por ml de sangue são administradas ao indivíduo.
CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE LENTIVÍRUS
[0794] Em algumas modalidades, uma formulação de vetor retroviral descrita neste documento pode ser produzida por um processo que compreende um ou mais dentre, por exemplo, todas as seguintes etapas (i) a (vi), por exemplo, em ordem cronológica:
[0795] (i) cultivar células que produzem vetor retroviral;
[0796] (ii) colher o vetor retroviral contendo o sobrenadante;
[0797] (iii) opcionalmente clarificar o sobrenadante;
[0798] (iv) purificar o vetor retroviral para gerar uma preparação de vetor retroviral;
[0799] (v) opcionalmente, esterilizar por filtração a preparação do vetor retroviral; e
[0800] (vi) concentrar a preparação do vetor retroviral para produzir o produto final a granel.
[0801] Em algumas modalidades, o processo não compreende a etapa de clarificar (iii). Em outras modalidades, o processo inclui a etapa de clarificar (iii). Em algumas modalidades, a etapa (vi) é realizada usando ultrafiltração ou filtração de fluxo tangencial, mais preferencialmente ultrafiltração de fibra oca. Em algumas modalidades, o método de purificação na etapa (iv) é cromatografia de troca iônica, mais preferencialmente cromatografia de troca aniônica. Em algumas modalidades, a esterilização por filtro na etapa (v) é realizada usando um filtro de esterilização de 0,22 μm ou 0,2 μm. Em algumas modalidades, a etapa (iii) é realizada por clarificação de filtro. Em algumas modalidades, a etapa (iv) é realizada usando um método ou uma combinação de métodos selecionados dentre cromatografia, ultrafiltração/diafiltração ou centrifugação. Em algumas modalidades, o método de cromatografia ou uma combinação de métodos é selecionada a partir de cromatografia de troca iônica, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por exclusão de tamanhos, cromatografia de afinidade, cromatografia de fase reversa e cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado. Em algumas modalidades, o método de centrifugação é selecionado a partir de centrifugação zonal, centrifugação isopícnica e centrifugação de peletização. Em algumas modalidades, o método de ultrafiltração/diafiltração é selecionado a partir de diafiltração de fluxo tangencial, diafiltração de células agitadas e diálise. Em algumas modalidades, pelo menos uma etapa é incluída no processo para degradar o ácido nucleico para melhorar a purificação. Em algumas modalidades, a dita etapa é o tratamento com nuclease.
[0802] Em algumas modalidades, a concentração dos vetores é feita antes da filtração. Em algumas modalidades, a concentração dos vetores é feita após a filtração. Em algumas modalidades, as etapas de concentração e filtração são repetidas.
[0803] Em algumas modalidades, a etapa final de concentração é realizada após a etapa de esterilização por filtro. Em algumas modalidades, o processo é um processo em grande escala para a produção de formulações de grau clínico que são adequadas para administração a seres humanos como agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, a etapa de esterilização por filtro ocorre antes de uma etapa de concentração. Em algumas modalidades, a etapa de concentração é a etapa final do processo e a etapa de esterilização por filtro é a penúltima etapa do processo. Em algumas modalidades, a etapa de concentração é realizada usando ultrafiltração, de preferência filtração de fluxo tangencial, mais preferencialmente ultrafiltração de fibra oca. Em algumas modalidades, a etapa de esterilização por filtro é realizada usando um filtro de esterilização com um tamanho de poro máximo de cerca de 0,22 μm. Em outra modalidade preferencial, o tamanho máximo do poro é de 0,2 μm.
[0804] Em algumas modalidades, a concentração do vetor é menos do que ou igual a cerca de 4,6 x 1011 de genoma de ARN de cópias por ml de preparação antes do filtro de esterilização. O nível de concentração apropriado pode ser alcançado controlando a concentração do vetor usando, por exemplo, uma etapa de diluição, se apropriado. Assim, em algumas modalidades, uma preparação de vetor retroviral é diluída antes da esterilização por filtro.
[0805] A clarificação pode ser feita por uma etapa de filtração, removendo detritos celulares e outras impurezas. Filtros adequados podem utilizar filtros de celulose, fibras de celulose regeneradas, fibras de celulose combinadas com auxiliares de filtro inorgânicos (por exemplo, terra diatomácea, perlita, sílica pirogênica), filtros de celulose combinados com auxiliares de filtro inorgânicos e resinas orgânicas, ou qualquer combinação dos mesmos, e filtros poliméricos (exemplos incluem, porém sem limitação, náilon, polipropileno, polietersulfona) para obter uma remoção eficaz e recuperações aceitáveis. Um processo de múltiplos estágios pode ser usado. Um exemplo de processo de dois ou três estágios consistiria em um filtro (ou filtros) grosso para remover precipitado (ou precipitados) grande e detritos celulares, seguido por filtro (ou filtros) de segundo estágio de polimento com tamanhos de poros nominais maiores que 0,2 mícron, mas menores que 1 mícron. A combinação ideal pode ser uma função da distribuição do tamanho do precipitado, bem como de outras variáveis. Além disso, as operações de estágio único empregando um filtro de tamanho de poro relativamente pequeno ou centrifugação também podem ser usadas para clarificação. De forma mais geral, qualquer abordagem de clarificação incluindo, porém sem limitação, filtração sem saída, microfiltração, centrifugação ou alimentação corporal de auxiliares de filtro (por exemplo, terra diatomácea) em combinação com filtração sem saída ou de profundidade, que fornece um filtrado de clareza adequada para não sujar a membrana e/ou resinas nas etapas subsequentes, será aceitável para uso na etapa de clarificação da presente invenção.
[0806] Em algumas modalidades, a filtração profunda e a filtração por membrana são usadas. Produtos comercialmente disponíveis úteis a esse respeito são, por exemplo, mencionados no documento WO
03/097797, p. 20 a 21. As membranas que podem ser usadas podem ser compostas de diferentes materiais, podem diferir no tamanho dos poros e podem ser usadas em combinações. As mesmas podem ser obtidas comercialmente junto a vários fornecedores. Em algumas modalidades, o filtro usado para esclarecimento está na faixa de 1,2 a 0,22 μm. Em algumas modalidades, o filtro usado para clarificação é um filtro de 1,2/0,45 μm ou um filtro assimétrico com um tamanho de poro nominal mínimo de 0,22 μm.
[0807] Em algumas modalidades, o método emprega nuclease para degradar DNA/RNA contaminante, ou seja, principalmente ácidos nucleicos de células hospedeiras. Nucleases exemplificativas adequadas para uso na presente invenção incluem Benzonase® Nuclease (EP 0229866) que ataca e degrada todas as formas de DNA e RNA (fita simples, fita dupla linear ou circular) ou qualquer outra DNase e/ou RNase comumente usada na técnica com a finalidade de eliminar DNA e/ou RNA indesejável ou contaminante de uma preparação. Nas modalidades preferenciais, a nuclease é Benzonase® Nuclease, que hidrolisa rapidamente ácidos nucleicos por hidrólise de ligações fosfodiéster internas entre nucleotídeos específicos, reduzindo assim o tamanho dos polinucleotídeos no vetor contendo o sobrenadante. A Benzonase® Nuclease pode ser obtida comercialmente junto à Merck KGaA (código W214950). A concentração na qual a nuclease é empregada está preferencialmente na faixa de 1 a 100 unidades/ml.
[0808] Em algumas modalidades, a suspensão de vetor é submetida a ultrafiltração (às vezes referida como diafiltração quando usada para troca de tampão) pelo menos uma vez durante o processo, por exemplo, para concentrar o vetor e/ou troca de tampão. O processo usado para concentrar o vetor pode incluir qualquer processo de filtração (por exemplo, ultrafiltração (UF)) em que a concentração do vetor é aumentada forçando-se o diluente a passar por um filtro de tal maneira que o diluente seja removido da preparação do vetor, enquanto o vetor não consegue passar pelo filtro e, assim, permanece, na forma concentrada, na preparação do vetor.
UF é descrito em detalhes em, por exemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L.
Zeman e A.
Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nova York, NY, 1996); e em: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; nº ISBN 87762-456-9). Um processo de filtração adequado é a Filtração de Fluxo Tangencial (“TFF”) conforme descrito, por exemplo, no catálogo MILLIPORE intitulado “Pharmaceutical Process Filtration Catalog” pp. 177 a 202 (Bedford, Mass., 1995/96). O TFF é amplamente utilizado na indústria de bioprocessamento para coleta, clarificação, purificação e concentração de células de produtos, incluindo vírus.
O sistema é composto por três fluxos de processo distintos: a solução de alimentação, o permeado e o retentado.
Dependendo da aplicação, filtros com diferentes tamanhos de poros podem ser usados.
Em algumas modalidades, o retentado contém o produto (vetor lentiviral). A membrana de ultrafiltração particular selecionada pode ter um tamanho de poro suficientemente pequeno para reter o vetor, mas grande o suficiente para limpar as impurezas com eficácia.
Dependendo do fabricante e do tipo de membrana, para vetores retrovirais, pontos de corte de peso molecular nominal (NMWC) entre 100 e 1.000 kDa podem ser apropriados, por exemplo, membranas com NMWC de 300 kDa ou 500 kDa.
A composição da membrana pode ser, porém sem limitação, celulose regenerada, polietersulfona, polissulfona ou derivados das mesmas.
As membranas podem ser folhas planas (também chamadas de telas planas) ou fibras ocas.
Uma UF adequada é a UF de fibra oca, por exemplo, filtração usando filtros com um tamanho de poro menor que 0,1 μm.
Os produtos são geralmente retidos, enquanto o volume pode ser reduzido através da permeação (ou ser mantido constante durante a diafiltração pela adição de tampão com a mesma velocidade com a qual o permeado, contendo tampão e impurezas, é removido no lado do permeado).
[0809] As duas geometrias mais amplamente utilizadas para TFF na indústria biofarmacêutica são placas e estruturas (telas planas) e módulos de fibra oca. As unidades de fibra oca para ultrafiltração e microfiltração foram desenvolvidas pela Amicon e Ramicon no início dos anos 1970 (Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook), embora agora haja vários fornecedores, incluindo Spectrum e GE Healthcare. Os módulos de fibra oca consistem em uma série de fibras autossustentáveis com uma densa camada de revestimento. Os diâmetros das fibras variam de 0,5 mm a 3 mm. Em certas modalidades, fibras ocas são usadas para TFF. Em certas modalidades, são utilizadas fibras ocas de tamanho de poro de 500 kDa (0,05 μm). A ultrafiltração pode compreender a diafiltração (DF). Os microssolutos podem ser removidos adicionando- se solvente à solução que está sendo ultrafiltrada a uma taxa igual à taxa de UF. Isso lava as microespécies da solução em um volume constante, purificando o vetor retido.
[0810] UF/DF podem ser usadas para concentrar e/ou trocar o tampão das suspensões de vetor em diferentes estágios do processo de purificação. O método pode utilizar uma etapa DF para trocar o tampão do sobrenadante após cromatografia ou outras etapas de purificação, mas a mesma também pode ser usada antes da cromatografia.
[0811] Em algumas modalidades, o eluato da etapa de cromatografia é concentrado e posteriormente purificado por ultrafiltração-diafiltração. Durante esse processo, o vetor é trocado por tampão de formulação. A concentração até a concentração final desejada pode ocorrer após a etapa de esterilização por filtro. Após a dita filtração estéril, a substância esterilizada por filtro é concentrada por
UF asséptico para produzir o produto vetorial a granel.
[0812] Nas modalidades, a ultrafiltração/diafiltração pode ser diafiltração de fluxo tangencial, diafiltração de células agitadas e diálise.
[0813] As técnicas de purificação tendem a envolver a separação das partículas do vetor do meio celular e, se necessário, a purificação adicional das partículas do vetor. Um ou mais dentre uma variedade de métodos cromatográficos podem ser usados para essa purificação. Cromatografia de troca iônica, e mais particularmente troca aniônica, é um método adequado e outros métodos podem ser usados. Uma descrição de algumas técnicas cromatográficas é fornecida abaixo.
[0814] A cromatografia de troca iônica utiliza o fato de que espécies carregadas, como biomoléculas e vetores virais, podem se ligar reversivelmente a uma fase estacionária (como uma membrana, ou então o empacotamento em uma coluna) que tem, fixada em sua superfície, grupos que possuem uma carga oposta. Existem dois tipos de trocadores de íons. Trocadores de ânions são fases estacionárias que carregam grupos com carga positiva e, portanto, podem ligar espécies com carga negativa. Os trocadores de cátions carregam grupos com carga negativa e, portanto, podem se ligar a espécies com carga positiva. O pH do meio tem influência sobre isso, pois pode alterar a carga de uma espécie. Assim, para uma espécie como uma proteína, se o pH estiver acima do pI, a carga líquida será negativa, enquanto abaixo do pI, a carga líquida será positiva.
[0815] O deslocamento (eluição) das espécies ligadas pode ser efetuado pelo uso de tampões adequados. Assim, comumente, a concentração iônica do tampão é aumentada até que a espécie seja deslocada por meio da competição de íons tampão pelos locais iônicos na fase estacionária. Um método alternativo de eluição envolve a mudança do pH do tampão até que a carga líquida da espécie não favoreça mais o desvio para a fase estacionária. Um exemplo seria reduzir o pH até que a espécie assuma uma carga positiva líquida e não se ligue mais a um trocador de ânions.
[0816] Alguma purificação pode ser alcançada se as impurezas não estiverem carregadas, ou então se as mesmas carregarem uma carga de sinal oposto ao da espécie desejada, mas o mesmo sinal daquele do trocador de íons. Isso ocorre porque as espécies sem carga e aquelas que têm uma carga do mesmo sinal daquele trocador de íons normalmente não se ligam. Para diferentes espécies ligadas, a força da ligação varia com fatores como a densidade de carga e a distribuição de cargas nas várias espécies. Assim, aplicando um gradiente iônico ou de pH (como um gradiente contínuo, ou como uma série de etapas), a espécie desejada pode ser eluída separadamente das impurezas.
[0817] A cromatografia de exclusão de tamanho é uma técnica que separa as espécies de acordo com seu tamanho. Normalmente é realizado pelo uso de uma coluna cheia de partículas com poros de um tamanho bem definido. Para a separação cromatográfica, são escolhidas partículas que tenham tamanhos de poros adequados em relação aos tamanhos das espécies na mistura a ser separada. Quando a mistura é aplicada, como uma solução (ou suspensão, no caso de um vírus), à coluna e então eluída com tampão, as partículas maiores irão eluir primeiro, pois têm acesso limitado (ou nenhum acesso) aos poros. Partículas menores eluirão mais tarde, pois podem entrar nos poros e, portanto, percorrer um caminho mais longo através da coluna. Assim, ao considerar o uso de cromatografia de exclusão de tamanho para a purificação de vetores virais, seria de se esperar que o vetor fosse eluído antes de impurezas menores, como proteínas.
[0818] As espécies, como as proteínas, têm em suas superfícies regiões hidrofóbicas que podem se ligar reversivelmente a locais fracamente hidrofóbicos em uma fase estacionária. Em meios com uma concentração de sal relativamente alta, essa ligação é promovida.
Normalmente, em HIC, a amostra a ser purificada é ligada à fase estacionária em um ambiente com alto teor de sal. A eluição é então alcançada pela aplicação de um gradiente (contínuo ou como uma série de etapas) de concentração decrescente de sal. Um sal comumente usado é o sulfato de amônio. As espécies com diferentes níveis de hidrofobicidade tenderão a ser eluídas em diferentes concentrações de sal e, portanto, a espécie alvo pode ser purificada de impurezas. Outros fatores, como pH, temperatura e aditivos ao meio de eluição, como detergentes, sais caotrópicos e orgânicos também podem influenciar a força de ligação das espécies às fases estacionárias de HIC. Um ou mais desses fatores podem ser ajustados ou utilizados para otimizar a eluição e purificação do produto.
[0819] Os vetores virais têm em sua superfície, porções químicas hidrofóbicas, como proteínas, e, portanto, o HIC pode ser potencialmente empregado como meio de purificação.
[0820] Como o HIC, o RPC separa as espécies de acordo com as diferenças em suas hidrofobicidades. É usada uma fase estacionária de maior hidrofobicidade do que aquela empregada em HIC. A fase estacionária geralmente consiste em um material, tipicamente sílica, ao qual estão ligadas porções químicas hidrofóbicas, como grupos alquila ou grupos fenila. Alternativamente, a fase estacionária pode ser um polímero orgânico, sem grupos anexados. A amostra contendo a mistura de espécies a ser resolvida é aplicada à fase estacionária em um meio aquoso de polaridade relativamente alta que promove a ligação. A eluição é então alcançada reduzindo a polaridade do meio aquoso pela adição de um solvente orgânico, como isopropanol ou acetonitrila. Normalmente, um gradiente (contínuo ou como uma série de etapas) de concentração crescente de solvente orgânico é usado e as espécies são eluídas na ordem de suas respectivas hidrofobicidades.
[0821] Outros fatores, como o pH do meio de eluição e o uso de aditivos, também podem influenciar a força de ligação das espécies às fases estacionárias RPC. Um ou mais desses fatores podem ser ajustados ou utilizados para otimizar a eluição e purificação do produto. Um aditivo comum é o ácido trifluoroacético (TFA). Isso suprime a ionização de grupos ácidos, como porções químicas carboxila na amostra. Também reduz o pH do meio de eluição e suprime a ionização de grupos silanol livres que podem estar presentes na superfície de fases estacionárias com matriz de sílica. O TFA faz parte de uma classe de aditivos conhecidos como agentes de emparelhamento iônico. Esses interagem com grupos iônicos, presentes nas espécies da amostra, que carregam uma carga oposta. A interação tende a mascarar a carga, aumentando a hidrofobicidade da espécie. Os agentes de emparelhamento de íons aniônicos, como TFA e ácido pentafluoropropiônico interagem com grupos carregados positivamente em uma espécie. Os agentes de emparelhamento de íons catiônicos, como a trietilamina, interagem com grupos carregados negativamente.
[0822] Os vetores virais têm em sua superfície porções químicas hidrofóbicas, como proteínas e, portanto, RPC, potencialmente, pode ser empregado como um meio de purificação.
[0823] A cromatografia de afinidade utiliza o fato de que certos ligantes que se ligam especificamente a biomoléculas, como proteínas ou nucleotídeos, podem ser imobilizados em uma fase estacionária. A fase estacionária modificada pode então ser usada para separar a biomolécula relevante de uma mistura. Exemplos de ligantes altamente específicos são anticorpos, para a purificação de antígenos alvo e inibidores de enzimas para a purificação de enzimas. Interações mais gerais também podem ser utilizadas, tal como o uso do ligante de proteína A para o isolamento de uma ampla gama de anticorpos.
[0824] Normalmente, a cromatografia de afinidade é realizada pela aplicação de uma mistura, contendo as espécies de interesse, à fase estacionária que tem o ligante relevante anexado. Sob condições apropriadas, isso levará à ligação da espécie à fase estacionária. Os componentes não ligados são então lavados antes da aplicação de um meio de eluição. O meio de eluição é escolhido para interromper a ligação do ligando à espécie alvo. Isso é comumente alcançado pela escolha de uma força iônica apropriada, pH ou pelo uso de substâncias que irão competir com as espécies-alvo por locais de ligante. Para algumas espécies ligadas, um agente caotrópico, como a ureia, é usado para efetuar o deslocamento do ligante. Isso, no entanto, pode resultar em desnaturação irreversível da espécie.
[0825] Os vetores virais têm em sua superfície porções químicas como proteínas, que podem ser capazes de se ligar especificamente a ligantes apropriados. Isso significa que, potencialmente, a cromatografia de afinidade pode ser usada em seu isolamento.
[0826] Biomoléculas, como proteínas, podem ter em sua superfície porções químicas doadoras de elétrons que podem formar ligações coordenadas com íons metálicos. Isso pode facilitar sua ligação a fases estacionárias que transportam íons metálicos imobilizados, como Ni2+, Cu2+, Zn2+ ou Fe3+. As fases estacionárias usadas no IMAC têm agentes quelantes, tipicamente ácido nitriloacético ou ácido iminodiacético covalentemente ligado à sua superfície, e é o agente quelante que retém o íon metálico. É necessário que o íon metálico quelado tenha pelo menos um local de coordenação disponível para formar uma ligação coordenada a uma biomolécula. Potencialmente, existem várias metades na superfície das biomoléculas que podem ser capazes de se ligar ao íon metálico imobilizado. Estes incluem resíduos de histidina, triptofano e cisteína, bem como grupos fosfato. Para proteínas, no entanto, o doador predominante parece ser o grupo imidazol do resíduo de histidina. As proteínas nativas podem ser separadas usando IMAC se exibirem porções químicas doadoras adequadas em sua superfície.
Caso contrário, o IMAC pode ser usado para a separação de proteínas recombinantes contendo uma cadeia de vários resíduos de histidina ligados.
[0827] Normalmente, o IMAC é realizado pela aplicação de uma mistura, contendo as espécies de interesse, à fase estacionária. Sob condições apropriadas, isso levará à ligação coordenada das espécies à fase estacionária. Os componentes não ligados são então lavados antes da aplicação de um meio de eluição. Para a eluição, podem ser usados gradientes (contínuos ou como uma série de etapas) de aumento da concentração de sal ou diminuição do pH. Também um procedimento comumente usado é a aplicação de um gradiente de concentração crescente de imidazol. Biomoléculas com diferentes propriedades de doador, por exemplo, tendo resíduos de histidina em ambientes diferentes, podem ser separadas pelo uso de eluição em gradiente.
[0828] Os vetores virais têm em sua superfície porções químicas como proteínas, que podem ser capazes de se ligar a fases estacionárias de IMAC. Isso significa que, potencialmente, o IMAC pode ser usado isoladamente.
[0829] As técnicas de centrifugação adequadas incluem centrifugação zonal, ultra isopicnica e centrifugação de peletização.
[0830] A esterilização por filtro é adequada para processos de materiais de grau farmacêutico. A esterilização por filtração torna a formulação resultante substancialmente livre de contaminantes. O nível de contaminantes após a esterilização por filtro é tal que a formulação é adequada para uso clínico. Concentração adicional (por exemplo, por ultrafiltração) após a etapa de esterilização por filtro pode ser realizada em condições assépticas. Em algumas modalidades, o filtro de esterilização tem um tamanho de poro máximo de 0,22 μm.
[0831] Os vetores retrovirais neste documento também podem ser submetidos a métodos para concentrar e purificar um vetor lentiviral usando ultracentrifugação de fluxo direto e centrifugação de alta velocidade e filtração de fluxo tangencial.
O fluxo através da ultracentrifugação pode ser usado para a purificação de vírus de tumor de RNA (Toplin et al, Applied Microbiology 15: 582 a 589, 1967; Burger et al., Journal of the National Cancer Institute 45: 499 a 503, 1970). Ultracentrifugação de fluxo direto pode ser usada para a purificação de vetores lentivirais.
Esse método pode compreender uma ou mais das seguintes etapas.
Por exemplo, um vetor lentiviral pode ser produzido a partir de células usando uma fábrica de células ou sistema de biorreator.
Um sistema de transfecção transiente pode ser usado ou linhas de células produtoras ou de empacotamento também podem ser usadas de forma similar.
Uma etapa de pré-clarificação antes de carregar o material na ultracentrífuga pode ser usada se desejado.
A ultracentrifugação de fluxo direto pode ser realizada usando fluxo contínuo ou sedimentação em lote.
Os materiais usados para a sedimentação são, por exemplo: cloreto de césio, tartarato de potássio e brometo de potássio, que criam altas densidades com baixa viscosidade, embora sejam todos corrosivos.
O CsCl é frequentemente usado para o desenvolvimento do processo, pois um alto grau de pureza pode ser alcançado devido ao amplo gradiente de densidade que pode ser criado (1,0 a 1,9 g/cm3). O brometo de potássio pode ser usado em altas densidades, por exemplo, em temperaturas elevadas, como 25 ºC, o que pode ser incompatível com a estabilidade de algumas proteínas.
A sacarose é amplamente utilizada por ser barata, não tóxica e pode formar um gradiente adequado para a separação da maioria das proteínas, frações subcelulares e células inteiras.
Tipicamente, a densidade máxima é de cerca de 1,3 g/cm3. O potencial osmótico da sacarose pode ser tóxico para as células, caso em que um material de gradiente complexo pode ser usado, por exemplo, Nycodenz.
Um gradiente pode ser usado com 1 ou mais etapas no gradiente. Uma modalidade é usar um gradiente de sacarose em etapas. O volume do material pode ser de 0,5 litros a mais de 200 litros por execução. A velocidade da vazão pode ser de 5 a mais de 25 litros por hora. Uma velocidade operacional adequada está entre 25.000 e 40.500 rpm, produzindo uma força de até 122.000 × g. O rotor pode ser descarregado estaticamente nas frações de volume desejadas. Uma modalidade é descarregar o material centrifugado em frações de 100 ml. A fração isolada contendo o vetor Lentiviral purificado e concentrado pode então ser trocada em um tampão desejado usando filtração em gel ou cromatografia de exclusão por tamanho. A cromatografia de troca aniônica ou catiônica também pode ser usada como um método alternativo ou adicional para troca de tampão ou purificação adicional. Além disso, a Filtração de Fluxo Tangencial também pode ser usada para troca de tampão e formulação final, se necessário. A Filtração de fluxo tangencial (TFF) também pode ser usada como uma etapa alternativa à centrifugação de ultra ou alta velocidade, em que um procedimento de TFF de duas etapas seria implementado. A primeira etapa reduziria o volume do sobrenadante do vetor, enquanto a segunda etapa seria usada para a troca do tampão, formulação final e alguma concentração adicional do material. A membrana de TFF pode ter um tamanho de membrana entre 100 e 500 kilodaltons, em que a primeira etapa de TFF pode ter um tamanho de membrana de 500 kilodaltons, enquanto o segundo TFF pode ter um tamanho de membrana entre 300 a 500 kilodaltons. O buffer final deve conter materiais que permitem que o vetor seja armazenado para armazenamento de longo prazo.
[0832] Nas modalidades, o método usa fábricas de células que contêm células aderentes ou um biorreator que contém células em suspensão que são transfectadas ou transduzidas com o vetor e construtos auxiliares para produzir o vetor lentiviral. Exemplos não limitantes ou biorreatores incluem o sistema de biorreator Wave e os biorreatores Xcellerex.
Ambos são sistemas descartáveis.
No entanto, sistemas não descartáveis também podem ser usados.
Os construtos podem ser aqueles descritos neste documento, bem como outros vetores de transdução lentiviral.
Alternativamente, a linha celular pode ser projetada para produzir o vetor lentiviral sem a necessidade de transdução ou transfecção.
Após a transfecção, o vetor lentiviral pode ser colhido e filtrado para remover as partículas e, em seguida, é centrifugado usando fluxo contínuo de alta velocidade ou ultra centrifugação.
Uma modalidade preferencial é usar um dispositivo de fluxo contínuo de alta velocidade como o rotor de fluxo zonal e contínuo JCF-A com uma centrífuga de alta velocidade.
Também é preferível o uso de centrífuga Contifuge Stratus para produção de vetor lentiviral em média escala.
Também é adequada qualquer centrífuga de fluxo contínuo em que a velocidade de centrifugação seja superior a 5.000 × g RCF e inferior a 26.000 × g RCF.
De preferência, a força centrífuga de fluxo contínuo é de cerca de 10.500 x g a 23.500 x g RCF com um tempo de rotação entre 20 horas e 4 horas, com tempos de centrifugação mais longos sendo usados com força centrífuga mais lenta.
O vetor lentiviral pode ser centrifugado em uma almofada de material mais denso (um exemplo não limitante é a sacarose, mas outros reagentes podem ser usados para formar a almofada e estes são bem conhecidos na técnica) de modo que o vetor lentiviral não forme agregados que são não filtráveis, como às vezes ocorre com a centrifugação direta do vetor que resulta em um pélete de vetor viral.
A centrifugação de fluxo contínuo em uma almofada permite que o vetor evite a formação de grande agregado, mas permite que o vetor seja concentrado em altos níveis de grandes volumes de material transfectado que produz o vetor lentiviral.
Além disso, uma segunda camada menos densa de sacarose pode ser usada para unir a preparação do vetor lentiviral.
A taxa de fluxo para a centrífuga de fluxo contínuo pode estar entre 1 e 100 ml por minuto, mas taxas de fluxo maiores e menores também podem ser usadas. A taxa de fluxo é ajustada para fornecer tempo suficiente para o vetor entrar no núcleo da centrífuga sem que quantidades significativas de vetor sejam perdidas devido à alta taxa de fluxo. Se uma taxa de fluxo mais alta for desejada, o material que sai da centrífuga de fluxo contínuo pode ser recirculado e passado pela centrífuga uma segunda vez. Depois que o vírus é concentrado usando centrifugação de fluxo contínuo, o vetor pode ser ainda mais concentrado usando Filtração de Fluxo Tangencial (TFF), ou o sistema TFF pode ser usado simplesmente para troca de tampão. Um exemplo não limitante de um sistema TFF é o sistema de cartucho Xampler produzido pela GB-Healthcare. Os cartuchos preferenciais são aqueles com um corte de MW de 500.000 MW ou menos. De preferência, um cartucho é usado com um corte de MW de
300.000 MW. Um cartucho de 100.000 MW de corte também pode ser usado. Para volumes maiores, cartuchos maiores podem ser usados e será fácil para aqueles na técnica encontrar o sistema TFF certo para essa troca de tampão final e/ou etapa de concentração antes do preenchimento final da preparação do vetor. A preparação de enchimento final pode conter fatores que estabilizam o vetor - açúcares são geralmente usados e são conhecidos na técnica.
TEOR DE PROTEÍNA
[0833] Em algumas modalidades, a partícula retroviral inclui várias proteínas derivadas do genoma da célula de origem, proteínas exógenas e proteínas derivadas do genoma viral. Em algumas modalidades, a partícula retroviral contém várias razões entre proteínas derivadas do genoma da célula de origem e proteínas derivadas do genoma viral, entre proteínas derivadas do genoma da célula de origem e proteínas exógenas e entre proteínas exógenas e proteínas derivadas do genoma viral.
[0834] Em algumas modalidades, as proteínas derivadas do genoma viral são precursor de poliproteína GAG, HIV-1 Integrase, precursor de poliproteína POL, Capsídeo, Nucleocapsídeo, matriz p17, p6, p2, VPR, Vif.
[0835] Em algumas modalidades, as proteínas derivadas de células de origem são Ciclofilina A, Choque Térmico 70kD, Fator de Elongação Humana-1 Alfa (EF-1R), Histonas H1, H2A, H3, H4, beta-globina, Precursor de Tripsina, Parvulina, Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, Lck, Ubiquitina, SUMO-1, CD48, Sintenina-1, Nucleofosmina, ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas C1/C2, Nucleolina, provável helicase dependente de ATP DDX48, Matrina-3, ERTPase de transição, proteína nuclear de ligação a GTP Ran, ribonucleoproteína U nuclear heterogênea, fator de ligação de intensificador de interleucina 2, domínio não POU contendo proteína de ligação de octâmero, RuvB like 2, HSP 90-b, HSP 90-a, fator de alongamento 2, D-3-fosfoglicerato desidrogenase, a-enolase, C-1- tetrahidrofolato sintase, citoplasmática, Piruvato quinase, isoenzimas M1/M2, Enzima de ativação de Ubiquitina E1, subunidade reguladora de protease 26S S10B, proteína ribossômica ácida P2 60S, proteína ribossômica ácida 60S P0, proteína ribossômica 40S S ribossomal SA, proteína ribossomal 40S S2, Proteína ribossomal S3 40S, ribossoma 60S l proteína L4, 60S proteína ribossômica L3, 40S proteína ribossômica S3a, 40S proteína ribossômica S7, 60S proteína ribossômica L7a, 60S proteína ribossômica ácida L31, 60S proteína ribossômica L10a, 60S proteína ribossômica L6, 26S proteassoma não- ATP subunidade regulatória de tubulina 1 cadeia b-2, Actina, citoplasmática 1, Actina, músculo liso aórtico, Tubulina a-cadeia ubíqua, Clatrina cadeia pesada 1, Histona H2B.b, Histona H4, Histona H3.1, Histona H3.3, Histona H2A tipo 8, Subunidade reguladora de protease 26S 6A, Ubiquitina-4, RuvB como 1, subunidade reguladora de protease
26S 7, Leucil-tRNA sintetase, citoplasmática, proteína ribossômica 60S L19, subunidade reguladora não-ATPase de proteassoma 26S subunidade 13 reguladora, Histona H2B.F, ribonucleoproteína nuclear pequena U5 200 kDa helicase, poli[ADP-ribose]polimerase-1, DNA helicase II dependente de ATP, fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, proteína de ligação de elemento sensível à nuclease 1, RNA helicase A dependente de ATP, fator de ligação de intensificador de interleucina 3, fator de alongamento da transcrição Polipeptídeo B 1, Pre-m Fator de processamento de RNA 8, domínio de nuclease estafilocócica contendo proteína 1, proteína de interação 6 de morte celular programada, Mediador de RNA polimerase II transcrição subunidade 8 homólogo, Nucleolar RNA helicase II, Endoplasmina, DnaJ homólogo subfamília A membro 1, Choque térmico 70 kDa proteína 1L, proteína do complexo T 1 e subunidade, proteína similar a GCN1 1, Serotransferrina, Frutose bifosfato aldolase A, Inosina- 5'monofosfato desidrogenase 2, 26S subunidade reguladora de protease 6B, ácido graxo sintase, subunidade catalítica de proteína quinase dependente de DNA, 40S proteína ribossômica S17, proteína ribossômica L7 60S, proteína ribossômica L12 60S, proteína ribossômica L9 60S, proteína ribossômica S8 40S, proteína ribossômica S4 40S isoforma X, proteína ribossômica L11 60S, subunidade regulatória 2 de proteassoma não-ATPase 26S, subunidade reguladora da histona de Coatase H2A.z, Histona H1.2, Dineína citosólica da cadeia pesada.Consultar: Saphire et al., Journal of Proteome Research, 2005, e Wheeler et al., Proteomics Clinical Applications, 2007.
[0836] Em algumas modalidades, o vetor retroviral é peguilado.
TAMANHO DA PARTÍCULA
[0837] Em algumas modalidades, o diâmetro médio do vetor retroviral está entre 10 e 1.000 nM, 25 e 500 nm, 40 e 300 nm, 50 e 250 nm, 60 e 225 nm, 70 e 200 nm, 80 e 175 nm, ou 90 e 150 nm.
[0838] Em algumas modalidades, 90% dos vetores retrovirais estão dentro de 50% do diâmetro médio do retrovírus. Em algumas modalidades, 90% dos vetores retrovirais estão dentro de 25% do diâmetro médio do retrovírus. Em algumas modalidades, 90% dos vetores retrovirais estão dentro de 20% do diâmetro médio do retrovírus. Em algumas modalidades, 90% dos vetores retrovirais estão dentro de 15% do diâmetro médio do retrovírus. Em algumas modalidades, 90% dos vetores retrovirais estão dentro de 10% do diâmetro médio do retrovírus.
INDICAÇÕES E USOS
[0839] Em algumas modalidades, o fusossoma, por exemplo, vetores ou partículas retrovirais, ou composições farmacêuticas dos mesmos, conforme descrito neste documento, podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano. Em alguns aspectos, são fornecidos neste documento vetores retrovirais, VLPs ou composições farmacêuticas, como qualquer um descrito neste documento, que podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano. Em tais modalidades, o indivíduo pode estar em risco de, pode ter um sintoma de, ou pode ser diagnosticado ou identificado como tendo, uma doença ou condição específica (por exemplo, uma doença ou condição descrita neste documento). Em uma modalidade, o indivíduo tem câncer. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença infecciosa. Em algumas modalidades, o fusossoma, por exemplo, vetores retrovirais ou partículas, contém sequências de ácido nucleico que codificam um agente exógeno para o tratamento da doença ou condição no indivíduo. Por exemplo, o agente exógeno é aquele que tem como alvo ou é específico para uma proteína de células neoplásicas e o fusossoma é administrado a um indivíduo para o tratamento de um tumor ou câncer no indivíduo. Em outro exemplo, o agente exógeno é um mediador inflamatório ou molécula imune, como uma citocina, e o fusossoma é administrado a um indivíduo para tratar qualquer condição na qual seja desejado modular (por exemplo, aumentar) a resposta imunológica, como um câncer ou doenças infecciosas.
[0840] Assim, também são fornecidos, em alguns aspectos, métodos de administração e usos, tais como usos terapêuticos e profiláticos, dos fusossomas fornecidos, por exemplo, vetores e partículas retrovirais, tais como vetores e partículas lentivirais e/ou composições que compreendem os mesmos. Tais métodos e usos incluem métodos e usos terapêuticos, por exemplo, envolvendo a administração dos fusossomas, por exemplo, vetores ou partículas retrovirais, tais como vetores ou partículas lentivirais, ou composições contendo os mesmos, a um indivíduo com uma doença, condição ou distúrbio para distribuição de um agente exógeno para tratamento da doença, condição ou distúrbio. Em algumas modalidades, o fusossoma (por exemplo, vetor ou partícula retroviral, como vetor ou partícula lentiviral) é administrado em uma quantidade ou dose eficaz para efetuar o tratamento da doença, condição ou distúrbio. São fornecidos neste documento os usos de qualquer um dos fusossomas fornecidos (por exemplo, vetor ou partícula retroviral, como vetor ou partícula lentiviral) em tais métodos e tratamentos e na preparação de um medicamento a fim de realizar tais métodos terapêuticos. Em algumas modalidades, os métodos são realizados administrando os fusossomas (por exemplo, vetor ou partícula retroviral, como vetor ou partícula lentiviral), ou composições que compreende os mesmos, ao indivíduo que tem, teve ou se suspeita ter a doença ou condição ou distúrbio. Em algumas modalidades, os métodos tratam assim a doença ou condição ou distúrbio no indivíduo. Também são fornecidos neste documento o uso de qualquer uma das composições, tais como composições farmacêuticas fornecidas neste documento, para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio associado a um determinado gene ou proteína direcionado por ou fornecido pelo agente exógeno.
[0841] Os cânceres incluem, por exemplo, leucemias, linfomas (de Hodgkin e não Hodgkin), mielomas e doenças mieloproliferativas; sarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tecido sólido, carcinomas de células escamosas da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer de fígado, cânceres geniturinários, como próstata, cervical, bexiga, uterino e endometrial e carcinomas de células renais, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer gastrointestinal e câncer do sistema nervoso, lesões benignas, tais como papilomas e similares.
[0842] Células-alvo de tecido de mamífero (por exemplo, ser humano) incluem células de tecido ou células epiteliais, conjuntivas, musculares ou nervosas e combinações dos mesmos. Células e sistemas de órgãos alvo de mamíferos (por exemplo, seres humanos) incluem o sistema cardiovascular (coração, vasculatura); sistema digestivo (esôfago, estômago, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestinos, cólon, reto e ânus); sistema endócrino (hipotálamo, glândula pituitária, corpo pineal ou glândula pineal, tireoide, paratireoides, glândulas suprarrenais); sistema excretor (rins, ureteres, bexiga); sistema linfático (linfa, nódulos linfáticos, vasos linfáticos, amígdalas, adenoides, timo, baço); sistema tegumentar (pele, cabelo, unhas); sistema muscular (por exemplo, músculo esquelético); sistema nervoso (cérebro, medula espinhal, nervos)'; sistema reprodutivo (ovários, útero, glândulas mamárias, testículos, vasos deferentes, vesículas seminais, próstata); sistema respiratório (faringe, laringe, traqueia, brônquios, pulmões, diafragma); sistema esquelético (osso, cartilagem) e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, células ou sistema de órgãos não alvo são escolhidos a partir do sistema cardiovascular (coração, vasculatura); sistema digestivo (esôfago, estômago, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestinos, cólon, reto e ânus); sistema endócrino (hipotálamo, glândula pituitária, corpo pineal ou glândula pineal, tireoide, paratireoides, glândulas suprarrenais); sistema excretor (rins, ureteres, bexiga); sistema linfático (linfa, nódulos linfáticos, vasos linfáticos, amígdalas, adenoides, timo, baço); sistema tegumentar (pele, cabelo, unhas); sistema muscular (por exemplo, músculo esquelético); sistema nervoso (cérebro, medula espinhal, nervos)'; sistema reprodutivo (ovários, útero, glândulas mamárias, testículos, vasos deferentes, vesículas seminais, próstata); sistema respiratório (faringe, laringe, traqueia, brônquios, pulmões, diafragma); sistema esquelético (osso, cartilagem) e combinações dos mesmos.
[0843] A administração de uma composição farmacêutica descrita neste documento pode ser, por exemplo, por meio de administração oral, inalada, transdérmica ou parenteral (incluindo intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, intramuscular, intracavidade e subcutânea). Os fusossomas podem, em algumas modalidades, ser administrados sozinhos ou formulados como uma composição farmacêutica.
[0844] Nas modalidades, a composição de fusossoma medeia um efeito em uma célula-alvo e o efeito dura pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 6 ou 12 meses. Em algumas modalidades (por exemplo, em que a composição de fusossoma compreende uma proteína exógena), o efeito dura menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 6 ou 12 meses.
[0845] Nas modalidades, a composição de fusossoma descrita neste documento é entregue ex vivo a uma célula ou tecido, por exemplo, uma célula ou tecido humano.
[0846] As composições de fusossoma descritas neste documento podem, em algumas modalidades, ser administradas a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano. Em certas modalidades, o indivíduo pode estar em risco de, pode ter um sintoma de, ou pode ser diagnosticado ou identificado como tendo uma doença ou condição específica (por exemplo, uma doença ou condição descrita neste documento).
[0847] Em algumas modalidades, a fonte de fusossomas é proveniente do mesmo indivíduo que recebe uma composição de fusossomas. Em outras modalidades, os mesmos são diferentes. Por exemplo, a fonte de fusossomas e tecido receptor pode ser autóloga (do mesmo indivíduo) ou heteróloga (de diferentes indivíduos). Em qualquer dos casos, o tecido doador para as composições de fusossoma descritas neste documento pode ser um tipo de tecido diferente do tecido receptor. Por exemplo, o tecido do doador pode ser tecido muscular e o tecido receptor pode ser tecido conjuntivo (por exemplo, tecido adiposo). Em outras modalidades, o tecido doador e o tecido receptor podem ser do mesmo tipo ou de tipo diferente, mas de sistemas de órgãos diferentes.
[0848] Em algumas modalidades, o fusossoma é coadministrado com um inibidor de uma proteína que inibe a fusão da membrana. Por exemplo, Suppressyn é uma proteína humana que inibe a fusão célula- célula (Sugimoto et al., "A novel human endogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion" Scientific Reports 3: 1.462 DOI:
10.1038/srep01462). Assim, em algumas modalidades, o fusossoma é coadministrado com um inibidor de sypressyn, por exemplo, um siRNA ou anticorpo inibidor.
[0849] As composições descritas neste documento podem, em algumas modalidades, ser usadas para modular de forma similar a função celular ou do tecido ou fisiologia de uma variedade de outros organismos, incluindo, porém sem limitação: animais de fazenda ou de trabalho (cavalos, vacas, porcos, galinhas, etc.), animais de estimação ou de zoológico (gatos, cães, lagartos, pássaros, leões, tigres e ursos, etc.), animais de aquicultura (peixes, caranguejos, camarões, ostras etc.), espécies de plantas (árvores, plantações, flores ornamentais etc.), espécies de fermentação (saccharomyces, etc.). As composições de fusossoma descritas neste documento podem ser feitas, em algumas modalidades, a partir de tais fontes não humanas e administradas a uma célula ou tecido-alvo ou indivíduo não humano.
[0850] As composições de fusossoma podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas para o alvo.
AGENTES TERAPÊUTICOS ADICIONAIS
[0851] Em algumas modalidades, a composição de fusossoma é coadministrada com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, a um indivíduo, por exemplo, um receptor, por exemplo, um receptor descrito neste documento. Em algumas modalidades, o agente terapêutico coadministrado é um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticoide (por exemplo, dexametasona), citostático (por exemplo, metotrexato), anticorpo (por exemplo, Muromonab-CD3) ou modulador de imunofilina (por exemplo, Ciclosporina ou rapamicina). Nas modalidades, o agente imunossupressor diminui a depuração mediada por imunidade de fusossomas. Em algumas modalidades, a composição de fusossoma é coadministrada com um agente imunoestimulador, por exemplo, um adjuvante, uma interleucina, uma citocina ou uma quimiocina.
[0852] Em algumas modalidades, a composição de fusossoma e o agente imunossupressor são administrados ao mesmo tempo, por exemplo, administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, a composição de fusossoma é administrada antes da administração do agente imunossupressor. Em algumas modalidades, a composição de fusossoma é administrada após a administração do agente imunossupressor.
[0853] Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é uma molécula pequena, como ibuprofeno, acetaminofeno, ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato, ciclofosfamida, glicocorticoides, sirolimus, azatriopina ou metotrexato.
[0854] Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é uma molécula de anticorpo, incluindo, porém sem limitação: muronomabe (anti-CD3), Daclizumabe (anti-IL12), Basiliximabe, Infliximabe (Anti- TNFa) ou rituximabe (Anti-CD20).
[0855] Em algumas modalidades, a coadministração da composição de fusossoma com o agente imunossupressor resulta em persistência aumentada da composição de fusossoma no indivíduo em comparação com a administração da composição de fusossoma sozinha. Em algumas modalidades, a persistência aprimorada da composição de fusossoma na coadministração é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, em comparação com persistência da composição fusossoma quando administrado sozinho. Em algumas modalidades, a persistência aumentada da composição de fusossoma na coadministração é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25 ou 30 dias ou mais, em comparação com a sobrevivência da composição de fusossoma quando administrado sozinho.
EXEMPLOS
[0856] Os Exemplos abaixo são apresentados para auxiliar na compreensão das invenções, mas não se destinam a, e não devem ser interpretados como, limitação de seu escopo de nenhuma forma. EXEMPLO 1. ENSAIO DE CÉLULAS FORA DO ALVO PARA
DETECTAR A ESPECIFICIDADE DA ENTREGA DE ÁCIDO NUCLEICO RETROVIRAL
[0857] Este Exemplo descreve a quantificação de um ácido nucleico em células receptoras fora do alvo medindo-se o número de cópias do vetor em células individuais.
[0858] Em uma modalidade, os camundongos tratados têm um número de cópias de vetor similar em células fora do alvo como aqueles de camundongos não tratados, por exemplo, nenhum vetor ou um número de vetor similar aos níveis de controle negativo. Em uma modalidade, os camundongos tratados têm uma porcentagem similar de células fora do alvo que contêm o vetor como aquelas de camundongos não tratados, por exemplo, nenhuma célula ou um número de células similar aos níveis de controle negativo.
[0859] Neste exemplo, a célula receptora fora do alvo é uma célula CD11c+. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existem marcadores de superfície adequados e que podem ser isolados do indivíduo. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo.
[0860] Os camundongos são tratados com vetor retroviral produzido como descrito neste documento ou com PBS (controle negativo). 28 dias após o tratamento, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetor retroviral e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo EDTA a 5 μM e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos com uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo murino CD11c:APC-Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 117323) ou um anticorpo de controle de isotipo APC-Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 400230) a 4 ºC por 30 minutos no escuro, após ser bloqueado por Fc (Número de Catálogo da Biolegend: 101319) em tampão de coloração de células (Número de Catálogo da Biolegend: 420201) por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, CA.) com excitação a laser de 640 nm e emissão coletada a 780 -/+ 60 nm executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA) para definir portas negativas usando as células marcadas com anticorpo APC-Cy7 de controle de isotipo. As células positivas APC-Cy7 são classificadas em poços únicos da placa para análise do número de cópias do vetor.
[0861] O número de cópias do vetor é avaliado usando PCR aninhado de célula única. A PCR é realizada com qPCR usando iniciadores e sondas específicas para o vetor e um gene de controle endógeno. O número de cópias do vetor é determinado dividindo a quantidade de sinal qPCR do vetor pela quantidade do sinal qPCR do gene de controle endógeno. Uma célula que recebeu o vetor terá um número de cópias do vetor de pelo menos 1,0. O número de cópias do vetor é avaliado em toda a população pela média do número de cópias do vetor da pluralidade de células.
[0862] Em algumas modalidades, os camundongos tratados com vetores retrovirais têm um número médio de cópias de vetor em células fora do alvo similar ao dos camundongos tratados com veículo. Em algumas modalidades, camundongos tratados com vetores retrovirais têm uma porcentagem similar de células fora do alvo que receberam o vetor como aquelas de camundongos tratados com veículo. EXEMPLO 2. ENSAIO DE CÉLULAS FORA DO ALVO PARA
DETECTAR A ESPECIFICIDADE DA ENTREGA DE UM AGENTE DE PROTEÍNA EXÓGENA
[0863] Este Exemplo descreve a quantificação da expressão de um agente exógeno em células receptoras fora do alvo pela expressão de agente exógeno em células individuais.
[0864] Em uma modalidade, os camundongos tratados têm expressão de agente exógeno similar em células fora do alvo como aqueles de camundongos não tratados. Em uma modalidade, os camundongos tratados têm uma porcentagem similar de células fora do alvo que expressam o agente exógeno como aquelas de camundongos não tratados.
[0865] Neste exemplo, a célula receptora fora do alvo é uma célula CD11c+. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existem marcadores de superfície adequados e que podem ser isolados do indivíduo. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo. Neste exemplo, o agente exógeno é uma proteína fluorescente e a expressão é medida por meio de citometria de fluxo. Em outras modalidades, a expressão de um agente de proteína exógena pode ser medida com imunocoloração para a proteína. Em outras modalidades, a expressão do agente de proteína exógena pode ser medida por meio de microscopia ou Western blot.
[0866] Os camundongos são tratados com vetor retroviral com um agente de proteína tdtomato fluorescente produzido por meio de qualquer um dos métodos descritos neste pedido ou com PBS (controle negativo). 28 dias após o tratamento, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetor retroviral e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo EDTA a 5 μM e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos com uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo murino CD11c:APC- Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 117323) ou isotipo controla o anticorpo APC-Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 400230) a 4 ºC por 30 minutos no escuro, após ser bloqueado Fc (Número de Catálogo da Biolegend: 101319) em tampão de coloração de células (Número de
Catálogo da Biolegend: 420201) por 10 minutos. Após serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, CA.) executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA). Uma porta negativa para CD11c é definida usando as células marcadas com anticorpo APC-Cy7 de controle de isotipo e com uma excitação a laser de 640 nm e emissão coletada em 780 -/+ 60. Uma porta negativa para a expressão de tdtomato é definida com células isoladas de camundongos tratados com veículo e com uma excitação de laser de 552 nm e uma emissão coletada em 585 -/+ 42 nm.
[0867] A porcentagem de células CD11c+ que são positivas para tdtomato é medida. Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD11c+ que são positivas para tdtomato é similar em células de camundongos tratados e não tratados. O nível mediano de fluorescência de tdtomato é medido em células CD11c+. Em algumas modalidades, o nível de fluorescência de tdtomato médio em células CD11c+ é similar em células de camundongos tratados e não tratados. EXEMPLO 3. ENSAIO DE CÉLULAS-ALVO PARA DETECTAR A
ESPECIFICIDADE DA ENTREGA DE ÁCIDO NUCLEICO RETROVIRAL
[0868] Este Exemplo descreve a quantificação de um ácido nucleico em células receptoras alvo medindo-se o número de cópias do vetor em células individuais.
[0869] Em uma modalidade, os camundongos tratados têm um maior número de cópias do vetor em células-alvo do que aqueles de camundongos não tratados. Em uma modalidade, os camundongos tratados têm uma porcentagem maior de células-alvo do que aquelas de camundongos não tratados.
[0870] Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existem marcadores de superfície adequados e que podem ser isolados do indivíduo. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo.
[0871] Os camundongos são tratados com vetor retroviral, e uma amostra de sangue é coletada conforme descrito acima no Exemplo 1. As células são coradas com um anticorpo murino CD3:APC-Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 100330) ou um controle de isotipo usando o protocolo descrito acima no Exemplo 1. O número de cópias do vetor é avaliado usando PCR aninhado de célula única, conforme descrito no Exemplo 1.
[0872] Em algumas modalidades, camundongos tratados com vetores retrovirais têm um número médio de cópias de vetor maior em células-alvo do que aqueles de camundongos tratados com veículo. Em algumas modalidades, camundongos tratados com vetores retrovirais têm uma porcentagem maior de células-alvo que receberam o vetor do que aquelas de camundongos tratados com veículo. EXEMPLO 4. ENSAIO DE CÉLULAS-ALVO PARA DETECTAR A
ESPECIFICIDADE DA ENTREGA DE UM AGENTE DE PROTEÍNA EXÓGENA
[0873] Este Exemplo descreve a quantificação da expressão de um agente de proteína exógena em células receptoras alvo por expressão de agente de proteína exógena em células individuais.
[0874] Em uma modalidade, camundongos tratados têm maior expressão de agente de proteína exógena em células-alvo do que aqueles de camundongos não tratados. Em uma modalidade, os camundongos tratados têm uma porcentagem maior de células-alvo que expressam o agente de proteína exógena do que aquelas de camundongos não tratados.
[0875] Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula
CD3+. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existem marcadores de superfície adequados e que podem ser isolados do indivíduo. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo. Neste exemplo, o agente de proteína exógena é uma proteína fluorescente e a expressão é medida por meio de citometria de fluxo. Em outras modalidades, a expressão de um agente de proteína exógena pode ser medida com imunocoloração para a proteína. Em outras modalidades, a expressão do agente de proteína exógena pode ser medida por meio de microscopia ou Western blot.
[0876] Os camundongos são tratados com vetor retroviral, e uma amostra de sangue é coletada conforme descrito acima no Exemplo 2. As células são coradas com um anticorpo murino CD3:APC-Cy7 (Catálogo Biolegend nº: 100330) ou controles de isotipo e analisados por citometria de fluxo usando o protocolo descrito no Exemplo 2.
[0877] A porcentagem de células CD3+ que são positivas para tdtomato é medida. Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD3+ que são positivas para tdtomato é maior em células de camundongos tratados do que não tratados. O nível mediano de fluorescência de tdtomato é medido em células CD3+. Em algumas modalidades, o nível de fluorescência de tdtomato mediano em células CD3+ é maior em células de camundongos tratados do que não tratados. EXEMPLO 5. MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL COM HLA-G OU HLA-E PARA DIMINUIÇÃO DA CITOTOXICIDADE MEDIADA
PELA LISE DE CÉLULAS PBMC
[0878] Este Exemplo descreve vetores retrovirais derivados de células modificadas para ter citotoxicidade diminuída devido à lise celular por células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
[0879] Em uma modalidade, a lise celular de vetores retrovirais mediada por citotoxicidade por PBMCs é uma medida de imunogenicidade de vetores retrovirais, uma vez que a lise irá reduzir, por exemplo, inibir ou interromper a atividade de um vetor retroviral.
[0880] Os vetores retrovirais são criados a partir de: células não modificadas (doravante NMCs, controle positivo), células que são transfectadas com cDNA HLA-G ou HLA-E (doravante NMC-HLA-G) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo).
[0881] A lise mediada por PBMC de um vetor retroviral é determinada por ensaios de liberação de európio, conforme descrito em Bouma, et al. Murmurar. Immunol. 35 (2): 85 a 92; 1992 e van Besouw et al. Transplante 70 (1): 136 a 143; 2.000. PBMCs (doravante células efetoras) são isoladas de um doador apropriado e estimuladas com PMBCs irradiadas com gama alogênica e IL-2 a 200 UI/ml (proleucina, Chiron BV Amsterdam, Holanda) em uma placa de 96 poços de fundo redondo por 7 dias a 37 ºC. Os vetores retrovirais são marcados com európio-dietilenotriaminopentaacetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, EUA).
[0882] No dia 7, os ensaios de lise mediada por citotoxicidade são realizados incubando o vetor retroviral marcado com Eu63 com células efetoras em uma placa de 96 poços para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, ou 48 horas após o plaqueamento em razões efetora/alvo variando de 1.000:1 a 1:1 e 1:1,25 a 1:1.000. Após a incubação, as placas são centrifugadas e uma amostra do sobrenadante é transferida para placas de 96 poços com baixa fluorescência de fundo (fluoroimunoplacas, Nunc, Roskilde, Dinamarca).
[0883] Posteriormente, a solução de aprimoramento (PerkinElmer, Groningen, Holanda) é adicionada a cada poço. O európio liberado é medido em um fluorômetro resolvido no tempo (contador multilabel
Victor 1420, LKB-Wallac, Finlândia). A fluorescência é expressa em contagens por segundo (CPS). A liberação percentual máxima de európio por um vetor retroviral alvo é determinada incubando um número apropriado (1 x 102 a 1 x 108) de vetores retrovirais com triton a 1% (sigma-aldrich) por um período de tempo apropriado. A liberação espontânea de európio pelo vetor retroviral alvo é medida por incubação do vetor retroviral alvo marcado sem células efetoras. A porcentagem de vazamento é então calculada como: (liberação espontânea/liberação máxima) x 100%. A percentagem de lise mediada por citotoxicidade é calculada como % de lise = [(lise medida-lise espontânea-libertação espontânea)/(libertação máxima-libertação espontânea)] x 100%. Os dados são analisados observando-se a porcentagem de lise como uma função de diferentes razões de alvos efetores.
[0884] Em uma modalidade, os vetores retrovirais gerados a partir de células NMC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise por células-alvo em pontos de tempo específicos, em comparação com vetores retrovirais gerados a partir de NMCs ou vetor vazio de NMC. EXEMPLO 6. MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL COM HLA-G OU HLA-E PARA DIMINUIÇÃO DA ATIVIDADE DE LISE DE NK
[0885] Este Exemplo descreve a geração de uma composição de vetor retroviral derivada de uma fonte de células que foi modificada para diminuir a lise celular mediada por citotoxicidade por células NK. Em uma modalidade, a lise celular de vetores retrovirais por células NK mediada por citotoxicidade é uma medida de imunogenicidade para vetores retrovirais.
[0886] Os vetores retrovirais são criados a partir de: células não modificadas (doravante NMCs, controle positivo), células que são transfectadas com cDNA HLA-G ou HLA-E (doravante NMC-HLA-G) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo).
[0887] A lise mediada por células NK de um vetor retroviral é determinada por ensaios de liberação de európio, conforme descrito em Bouma, et al. Murmurar. Immunol. 35 (2): 85 a 92; 1992 e van Besouw et al. Transplante 70 (1): 136 a 143; 2.000. As células NK (doravante células efetoras) são isoladas de um doador apropriado de acordo com os métodos em Crop et al. Cell transplantation (20): 1.547 a 1.559; 2011, e estimulado com PMBCs irradiadas com gama alogênica e IL-2 a 200 UI/ml (proleukin, Chiron BV Amsterdam, Holanda) em uma placa de fundo redondo de 96 poços por 7 dias a 37 ºC. Os vetores retrovirais são marcados com európio-dietilenotriaminopentaacetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, EUA). Os ensaios de lise mediada por citotoxicidade e a análise de dados são realizados conforme descrito acima no Exemplo 5.
[0888] Em uma modalidade, os vetores retrovirais gerados a partir de células NMC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise por células-alvo em pontos de tempo específicos, em comparação com vetores retrovirais gerados a partir de NMCs ou vetor vazio de NMC. EXEMPLO 7. MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL COM HLA-G OU HLA-E PARA DIMINUIÇÃO DA LISE DE CÉLULAS T EXTERMINADORAS CD8
[0889] Este Exemplo descreve a geração de uma composição de vetor retroviral derivada de uma fonte de células que foi modificada para diminuir a lise celular mediada por citotoxicidade por células T CD8+. Em uma modalidade, a lise celular mediada por citotoxicidade do vetor retroviral por células T CD8+ é uma medida de imunogenicidade para vetores retrovirais.
[0890] Os vetores retrovirais são criados a partir de: células não modificadas (doravante NMCs, controle positivo), células que são transfectadas com cDNA HLA-G ou HLA-E (doravante NMC-HLA-G) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo).
[0891] A lise mediada por células T CD8+ de um vetor retroviral é determinada por ensaios de liberação de európio conforme descrito em Bouma, et al. Murmurar. Immunol. 35 (2): 85 a 92; 1992 e van Besouw et al. Transplante 70 (1): 136 a 143; 2.000. As células T CD8+ (doravante células efetoras) são isoladas de um doador apropriado de acordo com os métodos em Crop et al. Cell transplantation (20): 1.547 a 1.559; 2011, e estimulado com PMBCs irradiadas com gama alogênica e IL-2 a 200 UI/ml (proleukin, Chiron BV Amsterdam, Holanda) em uma placa de fundo redondo de 96 poços por 7 dias a 37 ºC. Os vetores retrovirais são marcados com európio- dietilenotriaminopentaacetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, EUA). Os ensaios de lise mediada por citotoxicidade e a análise de dados são realizados conforme descrito acima no Exemplo 5.
[0892] Em uma modalidade, os vetores retrovirais gerados a partir de células NMC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise por células-alvo em pontos de tempo específicos, em comparação com vetores retrovirais gerados a partir de NMCs ou vetor vazio de NMC. EXEMPLO 8: MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL COM CD47
PARA EVITAR A FAGOCITOSE DE MACRÓFAGOS
[0893] Este Exemplo descreve a quantificação da evasão da fagocitose pelo vetor retroviral modificado. Em uma modalidade, o vetor retroviral modificado evitará a fagocitose por macrófagos.
[0894] As células se envolvem em fagocitose, envolvendo partículas, permitindo o sequestro e destruição de invasores estranhos, como bactérias ou células mortas. Em algumas modalidades, a fagocitose de vetores lentivirais por macrófagos reduziria sua atividade. Em algumas modalidades, a fagocitose de vetores lentivirais é uma medida de imunogenicidade de vetores retrovirais.
[0895] Os vetores retrovirais são produzidos a partir de células que carecem de CD47 (doravante NMC, controle positivo), células que são transfectadas com cDNA de CD47 (a seguir NMC-CD47) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo). Antes da produção do vetor retroviral, as células são marcadas com CSFE.
[0896] A redução da depuração imunológica mediada por macrófagos é determinada com um ensaio de fagocitose de acordo com o seguinte protocolo. Os macrófagos são semeados imediatamente após a colheita em pratos confocais com fundo de vidro. Os macrófagos são incubados em DMEM + FBS a 10% + P/S 1% por 1h para fixar. Um número apropriado de vetores retrovirais produzidos a partir de NMC, NMC-CD47, vetor vazio de NMC são adicionados aos macrófagos conforme indicado no protocolo e são incubados por 2h, tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf.
[0897] Após 2h, o prato é cuidadosamente lavado e a fluorescência intracelular é examinada. A fluorescência intracelular emitida por partículas retrovirais engolfadas é visualizada por microscopia confocal a 488 de excitação. O número de macrófagos fagocitóticos positivos é quantificado usando software de imagem. Os dados são expressos como o índice fagocítico = (número total de células engolfadas/número total de macrófagos contados) × (número de macrófagos contendo células engolfadas/número total de macrófagos contados) × 100.
[0898] Em uma modalidade, o índice fagocítico será reduzido quando os macrófagos forem incubados com vetores retrovirais derivados de NMC-CD47, versus aqueles derivados de NMC ou vetor vazio de NMC. EXEMPLO 9: MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL COM
PROTEÍNAS REGULADORAS DO COMPLEMENTO PARA EVITAR O COMPLEMENTO
[0899] Este Exemplo descreve a quantificação da atividade do complemento contra um vetor retroviral usando um ensaio in vitro. Em algumas modalidades, um vetor retroviral modificado descrito neste documento terá atividade de complemento reduzida em comparação com um vetor retroviral não modificado.
[0900] Neste Exemplo, o soro de um camundongo é avaliado quanto à atividade do complemento contra um vetor retroviral. O exemplo mede o nível de complemento C3a, que é um nó central em todas as vias do complemento. Os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo.
[0901] Neste exemplo, os vetores retrovirais são gerados a partir de células HEK293 transfectadas com um cDNA que codifica para a proteína regulatória do complemento DAF (vetor retroviral HEK293- DAF) ou células HEK 293 que não expressam uma proteína regulatória complementar (vetor retroviral HEK293). Em outras modalidades, outras proteínas reguladoras do complemento podem ser utilizadas, tais como proteínas que se ligam ao fator de aceleração de decaimento (DAF, CD55), por exemplo, proteína-1 similar ao fator H (FH) (FHL-1), por exemplo, proteína de ligação a C4b (C4BP), por exemplo, receptor de complemento 1 (CD35), por exemplo, proteína cofator de membrana (MCP, CD46), por exemplo, Profectina (CD59), por exemplo, proteínas que inibem as enzimas CD/C5 convertase da via clássica e alternativa do complemento, por exemplo, proteínas que regulam a montagem do MAC.
[0902] O soro é recuperado de camundongos virgens, camundongos que recebem o vetor retroviral HEK293-DAF ou camundongos que recebem o vetor retroviral HEK293. Os soros são coletados de camundongos através da coleta de sangue total fresco e permitindo que coagule completamente por várias horas. Os coágulos são peletizados por centrifugação e os sobrenadantes do soro são removidos. Um controle negativo é soro de camundongo inativado pelo calor. As amostras de controle negativo são aquecidas a 56 graus Celsius por 1 hora. O soro pode ser congelado em alíquotas.
[0903] Os diferentes vetores retrovirais são testados para a dose em que 50% das células em uma população de células-alvo recebem o agente exógeno no vetor retroviral. O vetor retroviral pode conter qualquer um dos agentes exógenos descritos neste documento. Muitos métodos para testar a entrega retroviral de um agente exógeno às células receptoras também são descritos neste documento. Neste exemplo particular, o agente exógeno é a proteína Cre (codificada pelo ácido nucleico retroviral) e as células-alvo são células RPMI8226 que expressam de forma estável um cassete "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" sob um promotor CMV, que mediante a recombinação por Cre muda de GFP para expressão RFP, como um marcador de entrega. A dose identificada em que 50% das células receptoras são RFP positivas é usada para outros experimentos. Em algumas modalidades, a dose identificada na qual 50% das células receptoras recebem o agente exógeno será similar entre os vetores retrovirais.
[0904] As diluições de duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) dos vetores retrovirais, começando na dose de vetores retrovirais em que 50% das células-alvo recebem o agente exógeno, são misturados com uma diluição de 1:10 dos soros de camundongos tratados com os mesmos vetores retrovirais ou camundongos virgens (volume de ensaio, 20 μl) e incubados por 1 h a 37 ºC. As amostras são posteriormente diluídas 1:500 e utilizadas em um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) específico para C3a. O ELISA é um produto do kit LS-F4210 de complemento de camundongo C3a ELISA vendido pela LifeSpan BioSciences Inc, que mede a concentração de C3a em uma amostra. A dose de vetor retroviral na qual 200 pg/ml de C3a está presente é comparada entre soros isolados de camundongos.
[0905] Em algumas modalidades, a dose de vetor retroviral em que 200 pg/ml de C3a está presente será maior para o vetor retroviral HEK293-DAF incubado com soro de camundongo HEK-293 DAF do que para vetor retroviral HEK293 incubado com soro de camundongo HEK293, indicando que a atividade de complemento direcionadas ao vetor retroviral é maior em camundongos tratados com vetor retroviral HEK293 do que com o vetor retroviral HEK293-DAF. Em algumas modalidades, a dose do vetor retroviral na qual 200 pg/ml de C3a está presente será maior para o vetor retroviral HEK293-DAF incubado com soros de camundongos ingênuos do que para o vetor retroviral HEK293 incubado com soros de camundongos ingênuos, indicando que a atividade do complemento direcionada ao vetor retroviral é maior em camundongos tratados com vetor retroviral HEK293 do que com o vetor retroviral HEK293-DAF. EXEMPLO 10: MODIFICAÇÃO DO VETOR RETROVIRAL PARA
REALIZAR KNOCKDOWN DA PROTEÍNA IMUNOGÊNICA PARA REDUZIR A IMUNOGENICIDADE
[0906] Este Exemplo descreve a geração de uma composição de vetor retroviral derivada de uma fonte de células que foi modificada para reduzir a expressão de uma molécula que é imunogênica e a quantificação da expressão reduzida. Em uma modalidade, um vetor retroviral pode ser derivado de uma fonte de células, que foi modificada para reduzir a expressão de uma molécula que é imunogênica.
[0907] As terapias que estimulam uma resposta imunológica podem reduzir a eficácia terapêutica ou causar toxicidade ao receptor. Assim, a imunogenicidade é uma propriedade importante para vetores retrovirais terapêuticos seguros e eficazes. A expressão de certos agentes de ativação imunológica pode criar uma resposta imunológica. A classe I de MHC representa um exemplo de um agente de ativação imunológica.
[0908] Os vetores retrovirais são produzidos a partir de células não modificadas que normalmente expressam MHC-1 (doravante NMC, controle positivo), células que são transfectadas com um DNA que codifica para um shRNA direcionado a classe I de MHC (doravante NMC- classe I de shMHC) e células transfectadas com um Codificação de DNA para controle de vetor shRNA embaralhado não direcionado (doravante controle de vetor de NMC, controle negativo). Antes da produção retroviral, as células são marcadas com CSFE.
[0909] Os vetores retrovirais são testados quanto à expressão de classe I de MHC usando citometria de fluxo. Um número apropriado de vetores retrovirais é lavado e ressuspenso em PBS, mantido em gelo por 30 minutos com diluição 1:10 a 1:4.000 de anticorpos monoclonais conjugados por fluorescência contra classe I de MHC (Harlan Sera-Lab, Belton, UK). Os vetores retrovirais são lavados três vezes em PBS e ressuspensos em PBS. A fluorescência inespecífica é determinada, usando alíquotas iguais de preparação de vetor retroviral incubada com um anticorpo de controle de isotipo conjugado por fluorescência apropriado em diluições equivalentes. Os vetores retrovirais são testados em um citômetro de fluxo (FACSort, Becton-Dickinson) e os dados são analisados com software de análise de fluxo (Becton- Dickinson).
[0910] Os dados médios de fluorescência dos vetores retrovirais derivados de NMCs, classe I de shMHC de NMC e controle do vetor de NMC são comparados. Em uma modalidade, os vetores retrovirais derivados de classe I de shMHC de NMC terão menor expressão de MHC de classe I em comparação com NMCs e controle de vetor de NMC. EXEMPLO 11: MEDINDO A INATIVAÇÃO SÉRICA PRÉ-EXISTENTE
DE VETORES RETROVIRAIS
[0911] Este Exemplo descreve a quantificação da inativação de soro pré-existente de vetores retrovirais usando um ensaio de entrega in vitro.
[0912] Em algumas modalidades, uma medida de imunogenicidade para vetores retrovirais é a inativação sérica. A inativação sérica de vetores retrovirais pode ser devido à neutralização mediada por anticorpos ou degradação mediada por complemento. Em uma modalidade, alguns receptores de vetores retrovirais descritos neste documento terão fatores em seu soro que se ligam e inativam os vetores retrovirais.
[0913] Neste exemplo, um camundongo virgem de vetor retroviral é avaliado quanto à presença de fatores que inativam vetores retrovirais no soro. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo.
[0914] O controle negativo é soro de camundongo inativado pelo calor e o controle positivo é soro derivado de um camundongo que recebeu múltiplas injeções de vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem xenogênica. Os soros são coletados de camundongos através da coleta de sangue total fresco e permitindo que coagule completamente por várias horas. Os coágulos são peletizados por centrifugação e os sobrenadantes do soro são removidos. As amostras de controle negativo são aquecidas a 56 graus Celsius por 1 hora. O soro pode ser congelado em alíquotas.
[0915] Os vetores retrovirais são testados para a dose na qual 50% das células em uma população de células-alvo recebem o agente exógeno no vetor retroviral, como descrito acima no Exemplo 9.
[0916] Para avaliar a inativação sérica de vetores retrovirais, os vetores retrovirais são diluídos 1:5 em soro normal ou inativado por calor (ou meio contendo FBS inativado por calor a 10% como o controle sem soro) e a mistura é incubada a 37 ºC por 1 h. Após a incubação, o meio é adicionado à reação para uma diluição adicional de 1:5 e, em seguida, diluído em série duas vezes na razão de 1:10. Após esta etapa, os vetores retrovirais devem estar presentes na dose previamente identificada em que 50% das células receptoras receberam o agente exógeno (por exemplo, são positivas para RFP).
[0917] Os vetores retrovirais que foram expostos ao soro são então incubados com células-alvo. É calculada a porcentagem de células que recebem o agente exógeno e, portanto, são RFP positivas. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não será diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de camundongos virgens de vetor retroviral, indicando que não há inativação de soro do vetor retroviral. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não será diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos virgens de vetor retroviral e incubações de controle sem soro, indicando que não há inativação de soro de vetores retrovirais. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno será menor em amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de controle positivo do que em amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos virgens de vetor retroviral, indicando que não há inativação sérica de vetores retrovirais. EXEMPLO 12: MEDINDO A INATIVAÇÃO SÉRICA DE VETORES
RETROVIRAIS APÓS MÚLTIPLAS ADMINISTRAÇÕES
[0918] Este Exemplo descreve a quantificação da inativação de soro de vetores retrovirais usando um ensaio de entrega in vitro após múltiplas administrações dos vetores retrovirais. Em uma modalidade, um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, terá uma inativação sérica reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais) administrações do vetor retroviral modificado. Em uma modalidade, um vetor retroviral descrito neste documento não será inativado pelo soro após múltiplas administrações.
[0919] Em algumas modalidades, uma medida de imunogenicidade para o vetor retroviral é a inativação do soro. Em uma modalidade, as injeções repetidas de um vetor retroviral podem levar ao desenvolvimento de anticorpos de vetor antirretroviral, por exemplo, anticorpos que reconhecem vetores retrovirais. Em uma modalidade, os anticorpos que reconhecem vetores retrovirais podem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade do vetor retroviral ou longevidade e mediar a degradação do complemento.
[0920] Neste Exemplo, a inativação do soro é examinada após uma ou mais administrações de vetores retrovirais. Os vetores retrovirais são produzidos por qualquer um dos Exemplos anteriores. Neste exemplo, retrovirais são criados a partir de: células que são transfectadas com cDNA de HLA-G ou HLA-E (doravante NMC-HLA-G) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo). Em algumas modalidades, os vetores retrovirais são derivados de células que expressam outras proteínas imunorreguladoras.
[0921] O soro é retirado de coortes diferentes: camundongos injetados sistemicamente e/ou localmente com 1, 2, 3, 5 ou 10 injeções de veículo (grupo virgem de vetor retroviral), vetor retroviral HEK293- HLA-G ou vetor retroviral HEK293. Os soros são coletados de camundongos através da coleta de sangue total fresco e permitindo que coagule completamente por várias horas. Os coágulos são peletizados por centrifugação e os sobrenadantes do soro são removidos. Um controle negativo é soro de camundongo inativado pelo calor. As amostras de controle negativo são aquecidas a 56 graus Celsius por 1 hora. O soro pode ser congelado em alíquotas.
[0922] Os vetores retrovirais são testados para a dose na qual 50% das células em uma população de células-alvo recebem o agente exógeno no vetor retroviral, como descrito acima no Exemplo 9.
[0923] Para avaliar a inativação de soro de vetores retrovirais, os vetores retrovirais são expostos ao soro e incubados com células-alvo como descrito no Exemplo 11 acima.
[0924] É calculada a porcentagem de células que recebem o agente exógeno e, portanto, são RFP positivas. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não será diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro e soro inativado por calor de camundongos tratados com vetores retrovirais HEK293-HLA-G, indicando que não há soro inativação de vetores retrovirais ou uma resposta imunológica adaptativa. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não será diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas de camundongos tratados 1, 2, 3, 5 ou 10 vezes com vetores retrovirais HEK293-HLA-G, indicando que não é a inativação sérica de vetores retrovirais ou uma resposta imunológica adaptativa. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno não será diferente entre as amostras de vetor retroviral que foram incubadas com soro de camundongos tratados com veículo e de camundongos tratados com vetores retrovirais HEK293-HLA-G, indicando que não há inativação sérica de vetores retrovirais ou uma resposta imunológica adaptativa. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que recebem o agente exógeno será menor para vetores retrovirais derivados de HEK293 do que para vetores retrovirais HEK293-HLA-G, indicando que não há inativação sérica de vetores retrovirais HEK293-HLA-G ou uma resposta imune adaptativa.
EXEMPLO 13: MEDINDO ANTICORPOS IGG E IGM PRÉ-
EXISTENTES REATIVOS CONTRA VETORES RETROVIRAIS
[0925] Este Exemplo descreve a quantificação de títulos de anticorpos de vetor antirretroviral pré-existentes medidos usando citometria de fluxo.
[0926] Em algumas modalidades, uma medida de imunogenicidade para um vetor retroviral são as respostas de anticorpos. Os anticorpos que reconhecem o vetor retroviral podem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade ou longevidade do vetor retroviral. Em uma modalidade, alguns receptores de um vetor retroviral descrito neste documento terão anticorpos pré-existentes que se ligam e reconhecem o vetor retroviral.
[0927] Neste Exemplo, os títulos de anticorpos do vetor antirretroviral são testados usando o vetor retroviral produzido usando uma célula de origem xenogênica. Neste Exemplo, um camundongo virgem de vetor retroviral é avaliado quanto à presença de anticorpos de vetor antirretroviral. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo.
[0928] O controle negativo é soro de camundongo que foi depletado de IgM e IgG, e o controle positivo é soro derivado de um camundongo que recebeu múltiplas injeções de vetor retroviral gerado a partir de uma célula de origem xenogênica.
[0929] Para avaliar a presença de anticorpos pré-existentes que se ligam ao vetor retroviral, o soro de camundongos sem vetor retroviral é primeiro descomplementado por aquecimento a 56 ºC por 30 min e posteriormente diluído em 33% em PBS contendo FCS a 3% e NaN3 a 0,1%. Quantidades iguais de soros e suspensões de vetor retroviral (1x102 - 1x108 vetores retrovirais por ml) são incubadas por 30 min a 4 ºC e lavadas com PBS através de uma almofada de soro de bezerro.
[0930] Os anticorpos xenorreativos IgM são corados por incubação do vetor retroviral com anticorpos de cabra conjugados com PE específicos para a porção Fc de IgM de camundongo (BD Bioscience) a 4 ºC por 45 min. Notavelmente, anticorpos secundários IgG1 ou IgG2 anticamundongo também podem ser usados. Os vetores retrovirais de todos os grupos são lavados duas vezes com PBS contendo FCS a 2% e, em seguida, analisados em um sistema FACS (BD Biosciences). Os dados de fluorescência são coletados por meio de amplificação logarítmica e expressos como intensidade fluorescente média.
[0931] Em uma modalidade, o soro de controle negativo mostrará fluorescência desprezível comparável ao aos controles sem soro ou secundários isolados. Em uma modalidade, o controle positivo mostrará mais fluorescência do que o controle negativo e mais do que os controles sem soro ou secundários isolados. Em uma modalidade, nos casos em que ocorre imunogenicidade, o soro de camundongos sem vetor retroviral exibirá mais fluorescência do que o controle negativo. Em uma modalidade, nos casos em que a imunogenicidade não ocorre, o soro de camundongos sem vetor retroviral apresentará fluorescência similar em comparação com o controle negativo. EXEMPLO 14: MEDIÇÃO DE RESPOSTAS DE ANTICORPOS IGG E
IGM APÓS MÚLTIPLAS ADMINISTRAÇÕES DE VETORES RETROVIRAIS
[0932] Este Exemplo descreve a quantificação da resposta humoral de um vetor retroviral modificado após múltiplas administrações do vetor retroviral modificado. Em uma modalidade, um vetor retroviral modificado, por exemplo, modificado por um método descrito neste documento, terá uma resposta humoral reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um vetor retroviral não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de uma, por exemplo, 2 ou mais) administrações do vetor retroviral modificado.
[0933] Em algumas modalidades, uma medida de imunogenicidade para um vetor retroviral são as respostas de anticorpos. Em uma modalidade, as injeções repetidas de um vetor retroviral podem levar ao desenvolvimento de anticorpos de vetor antirretroviral, por exemplo, anticorpos que reconhecem o vetor retroviral. Em uma modalidade, os anticorpos que reconhecem o vetor retroviral podem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade ou longevidade do vetor retroviral.
[0934] Neste Exemplo, os títulos de anticorpos do vetor antirretroviral são examinados após uma ou mais administrações do vetor retroviral. O vetor retroviral é produzido por qualquer um dos Exemplos anteriores. Neste exemplo, retrovirais são criados a partir de: células que não são transfectadas com uma proteína imunomoduladora (NMCs), células que são transfectadas com cDNA HLA-G ou HLA-E (doravante NMC-HLA-G) e células transfectadas com um controle de vetor vazio (doravante vetor vazio de NMC, controle negativo). Em algumas modalidades, os vetores retrovirais são derivados de células que expressam outras proteínas imunorreguladoras.
[0935] O soro é retirado de coortes diferentes: camundongos injetados sistemicamente e/ou localmente com 1, 2, 3, 5, 10 injeções de veículo (grupo virgem de vetor retroviral), vetor retroviral NMC, vetor retroviral NMC-HLA-G ou vetor retroviral de vetores vazio de NMC.
[0936] Para avaliar a presença e abundância de anticorpos de vetores antirretrovirais, o soro dos camundongos é primeiro descomplementado por aquecimento a 56 ºC por 30 min e subsequentemente diluído em 33% em PBS com FCS a 3% e NaN3 a 0,1%. Quantidades iguais de soro e vetor retroviral (1x10 2 - 1x108 de vetor retroviral por ml) são incubadas por 30 min a 4 ºC e lavadas com PBS através de uma almofada de soro de bezerro.
[0937] Os anticorpos IgM reativos ao vetor retroviral são corados por incubação do vetor retroviral com anticorpos de cabra conjugados com PE específicos para a porção Fc de IgM de camundongo (BD Bioscience) a 4 ºC por 45 min. Notavelmente, anticorpos secundários IgG1 ou IgG2 anticamundongo também podem ser usados. Os vetores retrovirais de todos os grupos são lavados duas vezes com PBS contendo FCS a 2% e, em seguida, analisados em um sistema FACS (BD Biosciences). Os dados de fluorescência são coletados por meio de amplificação logarítmica e expressos como intensidade fluorescente média.
[0938] Em uma modalidade, os vetores retrovirais NMC-HLA-G terão títulos de anticorpos IgM antivirais (ou IgG1/2) diminuídos (conforme medido pela intensidade de fluorescência em FACS) após as injeções, em comparação com os vetores retrovirais NMC ou vetores retrovirais vazios de NMC. EXEMPLO 15: MEDINDO RESPOSTAS DE ANTICORPOS DE
TÍTULOS DE IGG E IGM PARA CÉLULAS RECEPTORAS DE VETOR RETROVIRAL
[0939] Este Exemplo descreve a quantificação de títulos de anticorpos contra células receptoras (células que se fundiram com vetores retrovirais) usando citometria de fluxo. Em algumas modalidades, uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta do anticorpo. Os anticorpos que reconhecem as células receptoras podem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade celular ou longevidade. Em uma modalidade, as células receptoras não serão direcionadas por uma resposta de anticorpo, ou uma resposta de anticorpo estará abaixo de um nível de referência.
[0940] Neste Exemplo, os títulos de anticorpos anti-células receptoras em um indivíduo (por exemplo, humano, rato ou macaco) são testados. Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existam marcadores de superfície adequados. Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+.
[0941] Os camundongos são tratados com vetores retrovirais produzidos por qualquer um dos métodos descritos neste pedido ou com PBS (controle negativo) diariamente durante 5 dias. 28 dias após o tratamento final, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetores retrovirais e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo EDTA a 5 μM e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos com uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo CD3-FITC murino (Catálogo Thermo Fisher: 11-0032-82), a 4 ºC por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas com albumina de soro bovino por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) com excitação a laser 488nm e emissão coletada a 530+/- 30nm executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA). As células CD3+ são classificadas.
[0942] As células CD3+ classificadas são então coradas com anticorpos IgM por incubação da mistura de reação com anticorpos de cabra conjugados com PE específicos para a porção Fc de IgM de camundongo (BD Bioscience) a 4 ºC por 45 min. Notavelmente, anticorpos secundários IgG1 ou IgG2 anti-camundongo também podem ser usados. As células de todos os grupos são lavadas duas vezes com PBS contendo FCS a 2% e depois analisadas em um sistema FACS (BD Biosciences). Os dados de fluorescência são coletados por meio de amplificação logarítmica e expressos como intensidade fluorescente média. A intensidade média de fluorescência é calculada para as células CD3 classificadas de camundongos tratados com vetores retrovirais e os camundongos tratados com PBS.
[0943] Uma baixa intensidade média de fluorescência é indicativa de uma resposta humoral baixa contra as células receptoras. Espera-se que camundongos tratados com PBS tenham baixa intensidade média de fluorescência. Em uma modalidade, a intensidade média de fluorescência será similar para células receptoras de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS. EXEMPLO 16: MEDINDO A RESPOSTA FAGOCÍTICA ÀS CÉLULAS
RECEPTORAS DO VETOR RETROVIRAL
[0944] Este Exemplo descreve a quantificação da resposta de macrófagos contra células receptoras com um ensaio de fagocitose.
[0945] Em algumas modalidades, uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta do macrófago. Os macrófagos se envolvem na fagocitose, engolfando células e permitindo o sequestro e destruição de invasores estranhos, como bactérias ou células mortas. Em algumas modalidades, a fagocitose de células receptoras por macrófagos reduziria sua atividade.
[0946] Em uma modalidade, as células receptoras não são direcionadas por macrófagos. Neste Exemplo, a resposta do macrófago contra células receptoras em um indivíduo é testada. Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existam marcadores de superfície adequados. Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+.
[0947] Os camundongos são tratados com vetores retrovirais produzidos por qualquer um dos métodos descritos neste pedido ou com PBS (controle negativo) diariamente durante 5 dias. 28 dias após o tratamento final, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetores retrovirais e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo EDTA a 5 μM e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos com uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK).
[0948] As células são coradas com um anticorpo CD3-FITC murino
(Catálogo Thermo Fisher: 11-0032-82), a 4 ºC por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas com albumina de soro bovino por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) com excitação de laser 488 nm e emissão coletada a 530+/- 30 nm executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células CD3+ são então classificadas.
[0949] Um ensaio de fagocitose é executado para avaliar a depuração imune mediada por macrófagos de acordo com o seguinte protocolo. Os macrófagos são semeados imediatamente após a colheita em pratos confocais com fundo de vidro. Os macrófagos são incubados em DMEM + FBS a 10% + P/S 1% por 1h para fixar. Um número apropriado de células CD3+ classificadas e coradas com FITC derivadas de camundongos que receberam vetores retrovirais e PBS são adicionados aos macrófagos conforme indicado no protocolo e são incubados por 2 h, por exemplo, conforme descrito no encarte de informações do produto Kit de Ensaio de Fagocitose Vybrant™ (Molecular Probes, revisado em 18 de março de 2001, encontrado em tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf).
[0950] Após 2h, o prato é cuidadosamente lavado e a fluorescência intracelular é examinada. Para identificar macrófagos, as células são primeiro incubadas com o anticorpo bloqueador do receptor Fc (eBioscence número de catálogo Nº 14-0161-86, clone 93) por 15 min em gelo para bloquear a ligação de mAbs marcados a receptores Fc, que são expressos abundantemente em macrófagos. Seguindo esta etapa, anticorpos anti-F4/80-PE (número de catálogo de ThermoFisher 12-4801-82, clone BM8) e anti-CD11b-PerCP-Cy5.5 (número de catálogo BD Biosciences 550993, clone M1/70) conjugados são adicionados para corar antígenos de superfície de macrófagos. As células são incubadas por 30 min no escuro a 4 ºC seguido por centrifugação e lavagem em PBS. As células são então ressuspensas em PBS. A citometria de fluxo de amostras é então realizada e os macrófagos são identificados por meio de sinal de fluorescência positivo para F4/80-PE e CD11b-PerCP-Cy5.5 usando excitação a laser 533 nm e 647 nm, respectivamente. Após o bloqueio para macrófagos, a fluorescência intracelular emitida por células receptoras engolfadas é avaliada por excitação a laser 488 nm. O número de macrófagos fagocitóticos positivos é quantificado usando software de imagem. Os dados são expressos como o índice fagocítico = (número total de células engolfadas/número total de macrófagos contados) × (número de macrófagos contendo células engolfadas/número total de macrófagos contados) × 100.
[0951] Um baixo índice fagocítico é indicativo de baixa fagocitose e direcionamento por macrófagos. Os camundongos tratados com PBS devem ter um índice fagocítico baixo. Em uma modalidade, o índice fagocítico será similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS. EXEMPLO 17: MEDINDO A RESPOSTA DE PBMC A CÉLULAS
RECEPTORAS DE VETOR RETROVIRAL
[0952] Este Exemplo descreve a quantificação de uma resposta de PBMC contra células receptoras com um ensaio de lise celular.
[0953] Em algumas modalidades, uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta de PBMC. Em uma modalidade, a lise celular mediada por citotoxicidade de células receptoras por PBMCs é uma medida de imunogenicidade, pois a lise irá reduzir, por exemplo, inibir ou interromper a atividade de um vetor retroviral.
[0954] Em uma modalidade, as células receptoras não induzem uma resposta de PBMC. Neste Exemplo, a resposta de PBMC contra células receptoras em um indivíduo é testada.
[0955] Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existam marcadores de superfície adequados. Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+.
[0956] Os camundongos são tratados com vetor retroviral produzido por meio de qualquer um dos métodos descritos neste pedido ou com PBS (controle negativo) diariamente durante 5 dias. 28 dias após o tratamento final, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetor retroviral e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo EDTA a 5 μM e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos com uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo murino CD3:APC-Cy7 (Número de Catálogo da Biolegend: 100330) ou um anticorpo de controle de isotipo APC-Cy7 (IC: APC-Cy7) (Número de Catálogo da Biolegend: 400230) a 4 ºC por 30 minutos no escuro, após ter Fc bloqueado (Número de Catálogo da Biolegend: 101319) em tampão de coloração de células (Número de Catálogo da Biolegend: 420201) por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, CA.) com excitação a laser de 640 nm e emissão coletada a 780 -/+ 60 nm executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA) para definir portas negativas usando as células marcadas com anticorpo APC-Cy7 de controle de isotipo e, em seguida, as células positivas APC-Cy7 são classificadas e coletadas. As células CD3+ classificadas são então marcadas com coloração de membrana de plasma CellMask™ Green (CMG, Número de Catálogo da ThermoFisher: C37608) ou DMSO como o controle negativo.
[0957] 7 dias antes do isolamento de células CD3+ dos camundongos tratados com vetor retroviral ou PBS, PBMCs são isoladas de camundongos tratados com vetor retroviral ou PBS de acordo com os métodos em Crop et al. Cell transplantation (20): 1.547 a 1.559; 2011 e simulado na presença de proteína de camundongo recombinante IL-2 (R&D Número de Catálogo da Systems: 402-ML-020) e microesferas CD3/CD28 (Número de Catálogo da ThermoFisher: 11456D) em uma placa de 96 poços de fundo redondo por 7 dias a 37C. No dia 7, as PBMCs estimuladas são coincubadas com células de controle CD3+/CMG+ ou CD3+/DMSO para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, 48 horas em uma razão de plaqueamento de PBMC: CD3+/CMG+ ou PBMC: células de controle CD3+/DMSO variando de
1.000:1 a 1:1 e 1:1,25 a 1:1.000. Como controle negativo, um conjunto de poços receberia apenas células de controle CD3+/CMG+ e CD3+/DMSO, sem PBMCs. Após a incubação, as placas são centrifugadas e processadas de modo que sejam marcadas com o anticorpo murino CD3:APC-Cy7 ou um anticorpo IC:APC-Cy7 conforme acima. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são ressuspensas em PBS e analisadas em um FACS Aria (APC-Cy7: excitação/emissão de laser a 640 nm coletada a 780 -/+ 60 nm e excitação/emissão de laser CMG a 561 nm coletada a 585 -/+ 16 nm) executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA). Os dados do evento FSC/SSC seriam então usados inicialmente para definir a porta para eventos rotulados como “células”. Essa porta de “células” seria então usada para exibir eventos para definir a tensão PMT para as amostras de análise de laser de 640 nm e 561 nm marcadas com IC: APC-Cy7/DMSO apenas. Essa amostra também seria usada para definir as portas para células negativas para APC-Cy7 e CMG. As células CD3+/CMG+ que não receberam nenhuma PBMC seriam então usadas para definir as portas positivas para células CD3+ e CMG+.
[0958] Os dados são analisados observando a porcentagem de células CD3+/CMG+ na população de células totais. Ao comparar os grupos de tratamento, uma porcentagem relativamente mais baixa de células CD3+/CMG+ em qualquer razão de ensaio de PBMC:células CD3+/CMG+ é indicativa de lise celular receptora. Em uma modalidade, a porcentagem de CD3+/CMG+ será similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetor retroviral e camundongos tratados com PBS. EXEMPLO 18: MEDINDO A RESPOSTA DAS CÉLULAS NK ÀS
CÉLULAS RECEPTORAS DO VETOR RETROVIRAL
[0959] Este Exemplo descreve a quantificação de uma resposta de células exterminadoras naturais contra células receptoras com um ensaio de lise celular.
[0960] Em algumas modalidades, uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta da célula exterminadora natural. Em uma modalidade, a lise celular mediada por citotoxicidade de células receptoras por células exterminadoras naturais é uma medida de imunogenicidade, uma vez que a lise irá reduzir, por exemplo, inibir ou parar, a atividade de um vetor retroviral.
[0961] Em uma modalidade, as células receptoras não induzem uma resposta de células exterminadoras naturais. Neste Exemplo, a resposta exterminadora natural contra células receptoras em um indivíduo é testada. Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existam marcadores de superfície adequados. Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+.
[0962] Os camundongos são tratados com vetor retroviral, uma amostra de sangue é coletada e as células CD3+ são classificadas conforme descrito acima no Exemplo 17. As células NK são isoladas, cultivadas com as células CD3+ e analisadas por FACS de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 17, exceto que as células NK são usadas no lugar das células PBMC usadas no Exemplo 17.
[0963] Os dados são analisados observando a porcentagem de células CD3+/CMG+ na população de células totais. Ao comparar os grupos de tratamento, uma porcentagem relativamente menor de células CD3+/CMG+ em qualquer razão de ensaio de células NK:células CD3+/CMG+ é indicativa de lise celular receptora. Em uma modalidade, a porcentagem de CD3+/CMG+ será similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetor retroviral e camundongos tratados com PBS. EXEMPLO 19: MEDINDO A RESPOSTA DAS CÉLULAS T CD8 ÀS
CÉLULAS RECEPTORAS DO VETOR RETROVIRAL
[0964] Este Exemplo descreve a quantificação de uma resposta de células T CD8+ contra células receptoras (células que se fundiram com vetores retrovirais) com um ensaio de lise celular.
[0965] Em algumas modalidades, uma medida da imunogenicidade das células receptoras é a resposta das células T CD8+. Em uma modalidade, a lise celular mediada por citotoxicidade de células receptoras por células T CD8+ é uma medida de imunogenicidade, uma vez que a lise irá reduzir, por exemplo, inibir ou parar, a atividade de um vetor retroviral.
[0966] Em uma modalidade, as células receptoras não induzem uma resposta de células T CD8+. Neste Exemplo, a resposta de células T CD8+ contra células receptoras em um indivíduo é testada. Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existam marcadores de superfície adequados. Neste exemplo, a célula receptora de destino é uma célula CD3+.
[0967] Os camundongos são tratados com vetor retroviral, uma amostra de sangue é coletada e as células CD3+ são classificadas conforme descrito acima no Exemplo 17. As células T CD8+ são isoladas, cultivadas com as células CD3+ e analisadas por FACS de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 17, exceto que as células T CD8+ são usadas no lugar das células PBMC usadas no Exemplo 17.
[0968] Os dados são analisados observando a porcentagem de células CD3+/CMG+ na população de células totais. Ao comparar os grupos de tratamento, uma porcentagem relativamente menor de células CD3+/CMG+ em qualquer razão de ensaio de células CD8+:células CD3+/CMG+ é indicativa de lise celular receptora. Em uma modalidade, a porcentagem de CD3+/CMG+ será similar para células receptoras derivadas de camundongos tratados com vetores retrovirais e camundongos tratados com PBS. EXEMPLO 20. CRIAÇÃO DE UMA CÉLULA DE ORIGEM
RESISTENTE AO FUSOGÊNIO
[0969] Este Exemplo descreve uma célula de origem que não pode ser direcionada (ou é direcionada em um nível reduzido) por um vetor retroviral porque a célula de origem foi modificada de modo que o receptor que o vetor retroviral tem como alvo está ausente ou em um nível reduzido.
[0970] Neste Exemplo, o fusogênio é Sincitina-1 (HERV-W), o receptor é ASCT2 e a expressão do receptor é reduzida em células de origem usando edição de genoma com Cas9 e um RNA guia direcionado ao locus ASCT2. Entende-se que uma variedade de outros receptores podem ser regulados negativamente por uma variedade de métodos, por exemplo, usando interferência de RNA.
[0971] Uma linha fonte HEK293T é transfectada com mRNA que codifica para Cas9 e um RNA guia direcionado para ASCT2 (HEK293T- ASCT2) ou com mRNA de controle que não expressa Cas9 (HEK293T- controle). As células são cultivadas por 3 semanas e, em seguida, coradas para expressão de ASCT2 usando imunocoloração e citometria de fluxo. Em algumas modalidades, pelo menos 90% das células na população HEK293T-ASCT2 irão corar negativamente para ASCT2 e pelo menos 90% das células na população de controle HEK293T irão corar positivamente para ASCT2. Essas células são então usadas para experimentos subsequentes.
[0972] As células são então transfectadas com vetores de empacotamento lentivirais (Gag, Pol e Rev), um vetor de envelope Syncytin-1 e um vetor de carga útil que codifica GFP. Após 24 horas, as células são fotografadas usando microscopia para testar a formação de sincícios e, em seguida, as partículas virais são coletadas do sobrenadante.
[0973] A quantidade de sincícios na população de células de origem pode ser avaliada quantificando o número de núcleos por sincício microscopicamente após a coloração com DAPI. Em algumas modalidades, a porcentagem de núcleos por sincício é menor nas células-fonte HEK293T-ASCT2 do que nas células-fonte de controle HEK293T.
[0974] A quantidade de partículas virais funcionais de células de origem HEK293T-ASCT2 e células de origem de controle HEK293T é quantificada por cultura de células HEK293T com as partículas virais coletadas do sobrenadante. As células são cultivadas por 5 dias após o cultivo com as partículas virais e a porcentagem de células positivas para GFP é analisada por meio de citometria de fluxo. Em algumas modalidades, a porcentagem de células positivas para GFP será maior em células HEK293T tratadas com partículas virais derivadas de células de origem HEK293T-ASCT2 do que em partículas virais derivadas de células de origem de controle HEK293T. EXEMPLO 21: AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO MEDIANA NAS CÉLULAS-ALVO AO LONGO DO TEMPO
[0975] Este Exemplo descreve a quantificação da expressão de um agente exógeno em células-alvo medindo os níveis de agente exógeno em células individuais.
[0976] Em uma modalidade, o nível de agente exógeno é maior do que um gene de manutenção. Em uma modalidade, a expressão da carga útil é similar nas células-alvo.
[0977] Neste Exemplo, a célula-alvo é uma célula CD3+. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer tipo de célula para o qual existem marcadores de superfície adequados e que podem ser isolados do indivíduo. Notavelmente, os métodos descritos neste documento podem ser igualmente aplicáveis a seres humanos, ratos, macacos com otimização do protocolo. Neste exemplo, a carga útil é uma proteína fluorescente e a expressão é medida por meio de citometria de fluxo. Em outras modalidades, a expressão de uma carga útil de proteína pode ser medida com imunocoloração para a proteína. Em outras modalidades, a expressão da carga útil da proteína pode ser medida por meio de microscopia ou Western blot.
[0978] Os camundongos são tratados com vetor retroviral com um agente de proteína tdtomato fluorescente produzido por meio de qualquer um dos métodos descritos neste pedido ou com PBS (controle negativo). 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias e 1.095 dias após o tratamento, o sangue periférico é coletado de camundongos que receberam vetor retroviral e camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado conforme descrito acima no Exemplo 2. As células são coradas com um anticorpo murino CD3:APC-Cy7 (Catálogo Biolegend nº: 100330) ou controles de isotipo e analisados por citometria de fluxo usando o protocolo descrito no Exemplo 2.
[0979] A porcentagem de células CD3+ que são positivas para tdtomato é medida. Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD3+ que são positivas para tdtomato será maior em células de camundongos tratados do que em camundongos não tratados. Em algumas modalidades, a porcentagem de células CD3+ que são positivas para tdtomato será similar nas células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias. O nível mediano de fluorescência de tdtomato é medido em células CD3+ Tdtomato+. Em algumas modalidades, o nível mediano de fluorescência de tdtomato em células CD3+ Tdtomato+ será similar em células coletadas em 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias, 112 dias, 365 dias, 730 dias ou 1.095 dias. EXEMPLO 22: AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DA EXPRESSÃO
DO TRANSGENE USANDO PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TECIDO E SILENCIAMENTO GÊNICO MEDIADO POR MIRNA.
[0980] Este Exemplo descreve a quantificação de um agente exógeno na linha de células de hepatoma humano alvo (HepG2) e em comparação com linhas de células não alvo (não hepáticas). As linhas celulares foram transduzidas com lentivírus (LV) contendo TCSREs positivos (por exemplo, promotor específico de tecido) ou uma combinação de TCSREs e NTCSREs positivos (por exemplo, silenciamento de gene mediado por miRNA com uma sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido). Linhas de células-alvo e não alvo foram transduzidas com partículas lentivirais geradas contendo os elementos reguladores positivos e negativos e o efeito da expressão do transgene nas linhas de células foi avaliado. A. EFEITO DA REGULAÇÃO GÊNICA MEDIADA POR MIRNA NA ESPECIFICIDADE DA EXPRESSÃO DO TRANSGENE.
[0981] Além dos hepatócitos, as principais populações de células que alinham os sinusoides do fígado incluem células endoteliais e células de Kupffer (macrófagos residentes derivados da linhagem hematopoiética), que expressam mir-126-3p e mir-142-3p, respectivamente. Esses miRNAs não são expressos substancialmente em hepatócitos. Os vetores lentivirais foram construídos para conter um cassete de expressão de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) sob o controle do promotor fosfoglicerato quinase constitutivamente ativo (hPGK, TCSRE positivo; consultar, por exemplo, SEQ ID NO: 139, com ou sem quatro cópias em tandem de cada uma das sequências complementares a mir-142-3p (por exemplo, Tabela 7, SEQ ID NO: 143) e miR-126-3p (por exemplo, Tabela 7, SEQ ID NO: 160) como um NTCSRE. Os construtos de vetor lentiviral (LV) com o NTCSRE foram designados hPGK-eGFP+ miRT e os construtos sem o NTCSRE são designados hPGK-eGFP.
[0982] Lentivírus (LVs) gerados a partir desses vetores hPGK- eGFP+ miRT e hPGK-eGFP, respectivamente, foram usados para transduzir uma linha celular de hepatoma humano alvo (HepG2), linha celular de rim embrionário humano (293LX), linha de células T humanas de origem hematopoiética (Molt4.8), ou uma linha de células endoteliais derivada de cérebro de camundongo (bEND.3). Sete dias após a transdução, a expressão de GFP foi medida por citometria de fluxo.
[0983] Como mostrado na Figura 1A, 18 a 30% de todos os tipos de células transduzidas com hPGK-eGFP LV expressaram GFP. Após a transdução de LVs contendo sequências mirT (hPGK-eGFP+ miRT) em células não alvo, apenas 0,6% de expressão de GFP foi observada em células Molt4.8 (expressa mir-142-3p) e nenhuma expressão foi observada em células bEND.3 (expresso mir-126-3p). A redução leve da expressão de GFP foi observada em células 293LX, que podem ter um nível muito baixo de expressão de um ou de ambos os miRNAs. Nenhum efeito na expressão de GFP foi observado em células-alvo HepG2 que haviam sido transduzidas com LVs contendo sequências mirT (hPGK-eGFP+ miRT). Estes resultados demonstraram que a incorporação de sequências de miRT em vetores lentivirais resultou em uma redução de pelo menos 50 vezes na expressão do transgene em células das linhagens hematopoiéticas e endoteliais, enquanto mantém a expressão robusta em células hepáticas. B. EFEITO COMBINADO DA REGULAÇÃO GÊNICA MEDIADA POR
MIRNA E PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TECIDO NA EXPRESSÃO DO TRANSGENE.
[0984] Vetores lentivirais adicionais (LVs) foram gerados substancialmente como descrito acima, mas com um eGFP ou com um transgene que codifica a enzima fenilalanina amônia liase (PAL) com um marcador N-terminal (sequência de nucleotídeos mostrada abaixo, sob o controle de um promotor hepatócito humano específico (ApoE.HCR-hAAT (hApoE) (por exemplo, como mostrado na Tabela 6, SEQ ID NO: 133) como um promotor regulador específico de tecido como um TCSREs positivo ou um promotor de vírus formador de foco do baço constitutivamente ativo (SFFV) (por exemplo, como mostrado na Tabela 6, SEQ ID NO: 142). A expressão de PAL em células do fígado usando os construtos de ácido nucleico fornecidos é representativa da expressão de um agente exógeno desejado em células-alvo. Por exemplo, a deficiência endógena de PAH em células hepáticas humanas pode resultar no acúmulo tóxico de Phe no sangue levando à fenilcetonúria (PKU), uma condição clínica caracterizada por distúrbios neurológicos graves e crescimento atrofiado. Em alguns aspectos, a administração precoce de PAL a pacientes com PKU demonstrou diminuir com sucesso os níveis de Phe no sangue e aliviar os sintomas.
[0985] A sequência de nucleotídeos do gene PAL é mostrada (SEQ ID NO: 169):
ATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGCCAAGACACTGTCTCAG GCCCAGAGCAAGACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTCACCGGCAA CAGCAGCGCCAACGTGATCATCGGCAACCAGAAGCTGACCATCA ACGACGTGGCCAGAGTGGCCCGGAATGGCACACTGGTGTCCCTG ACCAACAACACCGATATCCTGCAGGGCATCCAGGCCAGCTGCGA CTACATCAACAACGCCGTGGAAAGCGGCGAGCCCATCTACGGCG TGACATCTGGCTTTGGCGGCATGGCTAATGTGGCCATCAGCAGAG AGCAGGCCAGCGAGCTGCAGACCAATCTCGTGTGGTTCCTGAAA ACCGGCGCTGGCAACAAACTGCCCCTGGCTGATGTTCGGGCTGC CATGCTGCTGAGAGCCAACTCTCACATGAGAGGCGCCAGCGGCA TCCGGCTGGAACTGATCAAGCGGATGGAAATCTTCCTGAACGCTG GCGTGACCCCTTACGTGTACGAGTTTGGCTCTATCGGCGCCTCCG GCGATCTGGTGCCTCTGTCTTACATCACCGGCAGCCTGATCGGCC TGGATCCTAGCTTCAAGGTGGACTTCAACGGCAAAGAGATGGACG CCCCTACCGCTCTGAGACAGCTGAATCTGAGCCCTCTGACACTGC TGCCCAAAGAAGGCCTGGCCATGATGAATGGCACCAGCGTGATG ACAGGGATCGCCGCCAATTGCGTGTACGACACCCAGATCCTGAC CGCCATTGCCATGGGAGTGCACGCCCTGGATATTCAGGCCCTGA ACGGCACCAACCAGAGCTTTCACCCCTTCATCCACAACAGCAAGC CCCATCCTGGACAGCTGTGGGCCGCTGATCAGATGATTAGCCTG CTGGCCAACAGCCAGCTCGTGCGGGATGAGCTGGATGGCAAGCA CGACTACAGAGATCACGAGCTGATCCAGGACCGGTACAGCCTGA GATGCCTGCCTCAGTATCTGGGCCCTATCGTGGATGGCATCTCTC AGATCGCCAAGCAGATCGAGATTGAGATCAACAGCGTGACCGACA ATCCCCTGATCGACGTGGACAACCAGGCCTCTTATCACGGCGGC AACTTTCTGGGCCAGTACGTCGGCATGGGCATGGACCACCTGAG GTACTATATCGGCCTCCTGGCCAAGCACCTGGACGTGCAAATTGC CCTGCTGGCAAGCCCCGAGTTCAGCAATGGACTGCCTCCTAGCC TGCTCGGCAACCGCGAGAGAAAAGTGAACATGGGCCTGAAGGGC CTGCAGATCTGTGGCAACTCCATCATGCCCCTGCTGACCTTCTAC GGCAACTCTATCGCCGACAGATTCCCCACACACGCCGAGCAGTTC AACCAGAACATCAACTCCCAGGGCTACACCAGCGCCACACTGGCT AGAAGAAGCGTGGACATCTTCCAGAACTACGTGGCAATCGCCCTG ATGTTTGGAGTGCAGGCCGTGGACCTGCGGACCTACAAGAAAAC AGGCCACTACGACGCCAGAGCCAGCCTGTCTCCTGCCACCGAGA GACTGTATTCTGCCGTGCGGCATGTCGTGGGCCAGAAGCCTACA AGCGACAGACCCTACATCTGGAACGACAACGAGCAGGGCCTCGA CGAGCACATTGCCAGAATCTCTGCCGATATCGCTGCCGGCGGAG TGATTGTGCAGGCTGTGCAAGACATCCTGCCAAGCCTGCACTGA
[0986] Como mostrado na Figura 1B, a transdução com LVs contendo hPGK-eGFP ou LVs contendo sequências mirT e GFP sob o controle do promotor específico do hepatócito (hApoE-eGFP+ miRT), resultou em mais de 250 vezes a repressão da expressão de GFP em células 293LX, sem efeito substancial em células HepG2, conforme medido por citometria de fluxo.
[0987] As células HepG2 e 293LX foram transduzidas com LVs contendo o transgene PAL sob o controle do promotor SFFV (SFFV- PAL), ou LVs contendo transgene PAL juntamente com sequências mirT sob o controle do promotor hApoE (hApoE-PAL+ miRT). PAL catalisa a conversão de fenilalanina (Phe) em amônia e ácido cinâmico e tem sido usado na terapia de reposição enzimática em pacientes com deficiência congênita de fenilalanina hidroxilase (PAH). A especificidade da expressão do transgene PAL foi medida pela redução nos níveis de Phe no sobrenadante de cultura (SN) em relação ao meio fresco.
[0988] Como mostrado na Figura 1C, a expressão de um promotor constitutivo (SFFV) resultou em redução substancial nos níveis de Phe em SN coletados de ambos os tipos de células. No entanto, o construto hApoE-PAL+miRT levou a uma redução substancial de Phe apenas em células HepG2; os níveis de Phe em SN coletados a partir de células 293LX transduzidas com os LVs hApoE-PAL+miRT foram indistin- guíveis dos controles não transduzidos. Este resultado é consistente com a alta expressão do transgene PAL exemplificativo em células-alvo HepG2 quando transduzido com construtos LV contendo um TSCRE positivo e um NTSCRE, mas não em células 293LX não alvo. C. CONCLUSÃO
[0989] Juntos, esses dados apoiam a constatação de que o uso de um promotor específico de tecido em conjunto com locais alvo de miRNA pode conferir especificidade substancial à expressão do transgene.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio; e b) um ácido nucleico que compreende ou codifica: (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula-alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico do tecido positivo; ou (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
    2. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio; b) um ácido nucleico que compreende ou codifica: (i) um elemento regulatório específico de célula-alvo positivo operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de tecido positivo aumenta a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula-alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico do tecido positivo; e (ii) um elemento regulatório específico de célula não alvo operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o agente exógeno, em que o elemento regulatório específico de célula não alvo diminui a expressão do agente exógeno em um tecido ou célula não alvo em relação a um fusossoma de outra forma similar sem o elemento regulatório específico de célula não alvo.
    3. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende o agente exógeno ou um ácido nucleico que codifica o agente exógeno.
    4. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre: i) o fusossoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula- alvo do que com uma célula não alvo, opcionalmente em que a taxa mais alta é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes; ii) o fusossoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula- alvo do que com outro fusossoma, opcionalmente em que a taxa mais alta é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes; iii) o fusossoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que o agente exógeno no fusossoma seja entregue a pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de células-alvo após 24, 48 ou 72 horas; iv) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa mais alta do que a uma célula não alvo, opcionalmente em que a taxa mais alta é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes; v) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa mais alta do que a outro fusossoma, opcionalmente em que a taxa mais alta é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % ou 90%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes,
    50 vezes ou 100 vezes; ou vi) o fusossoma entrega o ácido nucleico a uma célula-alvo a uma taxa tal que o agente exógeno no fusossoma seja entregue a pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo após 24, 48 ou 72 horas.
    5. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, quando o fusossoma é administrado a um sujeito, tem-se um ou mais dentre: i) menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do agente exógeno presente, de modo detectável, no sujeito está em células não alvo; ii) pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das células do sujeito que compreendem, de modo detectável, o agente exógeno, são células-alvo, opcionalmente em que as células-alvo são de um tipo de célula única, opcionalmente em que as células-alvo são células T; iii) menos de 1.000.000, 500.000, 200.000, 100.000, 50.000,
    20.000 ou 10.000 células das células do sujeito que compreendem, de modo detectável, o agente exógeno são células não alvo; iv) os níveis médios do agente exógeno em todas as células- alvo no sujeito são pelo menos 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou
    1.000 vezes maiores do que os níveis médios do agente exógeno em todas as células não alvo no sujeito; ou v) o agente exógeno não é detectável em qualquer célula não alvo no sujeito.
    6. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o fusogênio é um fusogênio realvejado.
    7. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o fusogênio realvejado compreende uma sequência escolhida a partir de proteínas F e G do vírus Nipah,
    proteínas F e H do vírus do sarampo, proteínas F e H do paramixovírus de tupaia, proteínas F e G do paramixovírus ou proteínas F e H ou proteínas F e HN, proteínas F e G do vírus Hendra, proteínas F e G do Henipavírus, proteínas F e H do morbilivírus, proteína F e HN do respirovírus, proteína F e HN do vírus Sendai, proteínas F e HN do rubulavírus ou proteínas F e HN do avulavírus, ou um derivado das mesmas, ou qualquer combinação das mesmas.
    8. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências para um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem, opcionalmente em que o fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem é estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132.
    9. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o paramixovírus de tipo selvagem é um vírus Nipah, opcionalmente em que o vírus Nipah é um henipavírus.
    10. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento regulatório específico de célula-alvo positivo compreende um promotor específico de tecido, um intensificador específico de tecido, um local de emenda específico de tecido, um local específico de tecido que estende a meia-vida de um RNA ou proteína, um local de promoção de exportação nuclear de mRNA específico de tecido, um local de aprimoramento translacional específico de tecido ou um local de modificação pós-translacional específico de tecido.
    11. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento regulatório específico da célula-alvo positivo compreende um promotor específico do tecido.
    12. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento regulatório específico de célula não alvo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específico de tecido, local de reconhecimento de protease específico de tecido, local de ligase ubiquitina específico de tecido, local de repressão transcricional específico de tecido ou local de repressão epigenética específico de tecido.
    13. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento regulatório específico de célula não alvo compreende uma sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido.
    14. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o elemento regulatório específico de célula não alvo está situado ou codificado dentro de uma região transcrita que codifica o agente exógeno, opcionalmente em que um RNA produzido pela região transcrita compreende a sequência de reconhecimento de miRNA específica de tecido dentro de uma UTR ou de uma região de codificação.
    15. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula cancerosa e a célula não alvo é uma célula não cancerosa.
    16. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente exógeno é um polipeptídeo exógeno ou RNA exógeno, opcionalmente em que o agente exógeno é um agente terapêutico.
    17. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:
    i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica; ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; ou iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar, e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80% ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
    18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que, quando administrado a um sujeito, um ou mais dentre: i) o fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável, ou anticorpos contra o fusossoma estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente; ii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável, ou uma resposta imunológica celular contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente;
    iii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica inata detectável, ou a resposta imunológica inata contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente; iv) menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% dos fusossomas são inativados pelo soro; v) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável, ou anticorpos contra a célula-alvo estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente; ou vi) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável, ou uma resposta celular contra a célula-alvo está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente.
    19. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, e b) um agente exógeno ou um ácido nucleico que codifica um agente exógeno; e c) um ou mais dentre: i) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica e uma segunda proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica; ii) uma primeira proteína imunossupressora exógena ou superexpressa na bicamada lipídica e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; ou iii) uma primeira proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar, e uma segunda proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar; em que, quando administrado a um sujeito, opcionalmente em que o sujeito é um sujeito humano ou um camundongo, um ou mais dentre: i) o fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável, ou anticorpos contra o fusossoma estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima de um nível precedente; ii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável, ou uma resposta imunológica celular contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente; iii) o fusossoma não produz uma resposta imunológica inata detectável, ou a resposta imunológica inata contra o fusossoma está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente; iv) menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% dos fusossomas são inativados pelo soro; v) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta de anticorpo detectável, ou anticorpos contra a célula-alvo estão presentes em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente; ou vi) uma célula-alvo que recebeu o agente exógeno do fusossoma não produz uma resposta imunológica celular detectável, ou uma resposta celular contra a célula-alvo está presente em um nível inferior a 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima do nível precedente.
    20. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o nível precedente é o nível correspondente no mesmo sujeito antes da administração do fusossoma.
    21. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que a proteína imunossupressora é uma proteína regulatória do complemento ou CD47.
    22. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que a proteína imunoestimuladora é um MHC, opcionalmente em que o MHC é uma proteína HLA.
    23. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, e b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno; c) um MHC exógeno ou superexpresso, opcionalmente em que o MHC é um HLA, opcionalmente em que o HLA é um HLA-G ou HLA-E, ou uma combinação dos mesmos, na bicamada lipídica.
    24. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências com um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132.
    25. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências para um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno; e c) um CD47 exógeno ou superexpresso ou uma proteína regulatória do complemento, ou uma combinação dos mesmos, na bicamada lipídica.
    26. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132, e b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno; e c) MHC I, opcionalmente em que o MHC I é HLA-A, HLA-B ou HLA-C ou MHC II, opcionalmente em que MHC II é HLA-DP, HLA- DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ ou HLA-DR, que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
    27. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências para um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno; e c) uma ou ambas dentre uma proteína imunossupressora exógena ou superexpressa ou uma proteína imunoestimuladora que está ausente ou presente em níveis reduzidos, opcionalmente em que o nível reduzido é reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, em comparação com um fusossoma gerado a partir de uma célula de origem não modificada de outra forma similar.
    28. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um ou mais elementos isolantes.
    29. Fusossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma bicamada lipídica que compreende um fusogênio, em que o fusogênio compreende um domínio de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências para um fusogênio de paramixovírus de tipo selvagem estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 132; e b) um ácido nucleico que codifica um agente exógeno, em que o ácido nucleico compreende um ou mais elementos isolantes.
    30. Fusossoma, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende dois elementos isolantes, opcionalmente em que os dois elementos isolantes compreendem um primeiro elemento isolante a montante de uma região que codifica o agente exógeno e um segundo elemento isolante a jusante de uma região que codifica o agente exógeno, opcionalmente em que o primeiro elemento isolante e o segundo elemento isolante compreendem as mesmas sequências ou sequências diferentes.
    31. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a variação no nível médio do agente exógeno em uma amostra de células isolada após a administração do fusossoma ao sujeito em um primeiro ponto no tempo é de, pelo menos, menos que ou cerca de 10.000%, 5.000%,
    2.000%, 1.000%, 500%, 200%, 100%, 50%, 20%, 10% ou 5% do nível médio do agente exógeno em uma amostra de células isolada após a administração do fusossoma ao sujeito em um segundo ponto no tempo posterior.
    32. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no sujeito compreendem, de modo detectável, o agente exógeno.
    33. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células-alvo no sujeito que compreendiam, de modo detectável, o agente exógeno em um primeiro ponto no tempo ainda compreende, de modo detectável, o agente exógeno em um segundo ponto no tempo posterior.
    34. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que não é genotóxico ou não aumenta a taxa de formação de tumor nas células-alvo.
    35. Fusossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34, caracterizado pelo fato de que o agente exógeno é um polipeptídeo exógeno ou um RNA exógeno, opcionalmente em que o agente exógeno é um agente terapêutico.
    36. Método de entrega de um agente exógeno a um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um fusossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, entregando, assim, o agente exógeno ao sujeito, opcionalmente em que o sujeito é um sujeito humano.
    37. Método de modulação de uma função em um sujeito, tecido-alvo ou célula-alvo, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o tecido-alvo ou a célula-alvo em contato com um fusossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, opcionalmente em que o sujeito é um sujeito humano.
    38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o tecido-alvo ou a célula-alvo está presente em um sujeito.
    39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado pela administração do fusossoma ao sujeito.
    40. Método para tratar ou prevenir um distúrbio em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito um fusossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, opcionalmente em que o sujeito é um sujeito humano.
    41. Método para se produzir um fusossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer uma célula que compreende o ácido nucleico e o fusogênio (por exemplo, fusogênio realvejado); b) cultivar a célula em condições que permitam a produção do fusossoma, e c) separar, enriquecer ou purificar o fusossoma a partir da célula, produzindo, assim, o fusossoma.
    42. Célula de origem para produzir um fusossoma, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um ácido nucleico; b) proteínas estruturais que podem empacotar o ácido nucleico, em que pelo menos uma proteína estrutural compreende um fusogênio que se liga a um receptor de fusogênio; e c) um receptor de fusogênio que está ausente ou presente em níveis reduzidos (por exemplo, reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%) em comparação com uma célula de origem não modificada, de outra forma similar.
    43. Célula de origem, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o fusogênio causa a fusão do fusossoma com a célula-alvo após a ligação ao receptor de fusogênio.
    44. Célula de origem, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que se liga à segunda célula de origem similar, por exemplo, o fusogênio da célula de origem se liga ao receptor de fusogênio na segunda célula de origem.
    45. População de células de origem, caracterizada pelo fato de que é de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44.
    46. População de células de origem, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células na população são multinucleadas.
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