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BR112020020744A2 - polipeptídeos tendo atividade de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando os mesmos - Google Patents

polipeptídeos tendo atividade de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando os mesmos Download PDF

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BR112020020744A2
BR112020020744A2 BR112020020744-6A BR112020020744A BR112020020744A2 BR 112020020744 A2 BR112020020744 A2 BR 112020020744A2 BR 112020020744 A BR112020020744 A BR 112020020744A BR 112020020744 A2 BR112020020744 A2 BR 112020020744A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
polypeptide
seq
alpha
amylase
fermentation
Prior art date
Application number
BR112020020744-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Tomoko Namoto
Takashi Nakanishi
Shiro Fukuyama
Noriko Tsutsumi
Keiichi Ayabe
Original Assignee
Novozymes A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes A/S filed Critical Novozymes A/S
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Abstract

  POLIPEPTÍDEOS TENDO ATIVIDADE DE ALFA-AMILASE E POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO OS MESMOS. A presente invenção se relaciona com um polipeptídeo híbrido tendo atividade de alfa-amilase, selecionado de uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico e uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; e (b) o CBM é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. A invenção se relaciona também com construtos de ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos, e domínios catalíticos.

Description

“POLIPEPTÍDEOS TENDO ATIVIDADE DE ALFA-AMILASE E POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO OS MESMOS” Referência a uma Listagem de Sequências
[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência. Antecedentes da Invenção Área da Invenção
[0002] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de alfa-amilase, domínios catalíticos e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, domínios catalíticos. A invenção se relaciona também com construtos de ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos e domínios catalíticos. Descrição da Técnica Relacionada
[0003] As alfa-amilases (1,4-α-D-glucano glucano-hidrolase, EC
3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise do amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados.
[0004] Outro grupo de alfa-amilases são referidos como “alfa- amilases tipo Fungamyl™”, que são alfa-amilases relacionadas com a ou homólogas à alfa-amilase derivada de Aspergillus oryzae. As alfa-amilases tipo Fungamyl têm uma termoestabilidade relativamente baixa, p. ex., o produto comercial vendido sob o nome registrado FUNGAMYL™ pela Novozymes A/S, Dinamarca, tem um ótimo em torno de 55 °C e não é adequado para processos levados a cabo a elevadas temperaturas. As alfa- amilases tipo Fungamyl™ são hoje em dia usadas para fazer xaropes para, p. ex., a indústria cervejeira.
[0005] Uma alfa-amilase com estabilidade térmica aumentada, preferencialmente a um pH ácido, foi previamente isolada com sucesso. WO2004/055178 divulga um gene de Rhizomucor pusillus codificando uma alfa-amilase denotada AM782. A caracterização desta amilase mostrou que é uma alfa-amilase altamente termoacidofílica. A amilase AM782 pode funcionar a uma temperatura muito elevada, pelo menos até 70 °C. Enzimas híbridas contendo CBM, bem como descrições detalhadas da sua preparação e purificação, são conhecidas na técnica (ver, p. ex., WO 90/00609, WO 94/24158 e WO 95/16782, WO 2006/069290, bem como Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295- 1305). WO2006/069290 divulga alfa-amilases híbridas compreendendo o núcleo catalítico (AM782) combinado com um ligante e um domínio de ligação ao amido derivado de uma glucolamilase de Aspergillus niger. Este híbrido tem sido usado durante mais do que uma década como um produto comercial usado na sacarificação de material contendo amido.
[0006] WO2013/006756 divulga variantes da alfa-amilase AM782 tendo estabilidade térmica melhorada em relação à alfa-amilase parental.
[0007] Existe ainda uma necessidade de se identificarem alfa- amilases ácidas fúngicas adequadas para uso em processos comerciais, p. ex., em uma etapa de sacarificação em um processo de produção de etanol a partir de material contendo amido. Sumário da Invenção
[0008] A presente invenção proporciona polipeptídeos híbridos tendo atividade de alfa-amilase, selecionado de uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico e uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; e (b) o CBM é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.
[0009] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácidos nucleicos; vetores de expressão recombinantes; células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção dos polipeptídeos.
[0010] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo consistindo em: (a) um domínio catalítico tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 1766 da SEQ ID NO: 10 ou a sua sequência de cDNA;
(c) um fragmento do domínio catalítico de (a) ou (b) que tem atividade de alfa-amilase.
[0011] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador; em que a etapa (b) é levado a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase da invenção e, opcionalmente, uma glucoamilase.
[0012] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material de amido em bruto, compreendendo as etapas de: (a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que a etapa (a) é levada a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase da invenção e, opcionalmente, uma glucoamilase.
[0013] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma alfa-amilase da invenção e, opcionalmente, uma glucoamilase. Definições
[0014] Alfa-amilase: As alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise do amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados. O perito na técnica saberá como determinar a atividade de alfa-amilase. Pode ser determinado de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos, p. ex., por medição da atividade residual a pH 4,0 usando um estojo comercial de ensaio colorimétrico de alfa-amilase (Kikkoman Biochemifa Company) ou por medição da atividade de amido em bruto. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, p. ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa- amilase (amido residual ou em bruto) do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, p. ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase (amido residual ou em bruto) do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, p. ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase (amido residual ou em bruto) do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, p. ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa- amilase (amido residual ou em bruto) do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0015] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutações e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações gênicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0016] Módulos de Ligação a Carboidratos: O termo "módulo de ligação a carboidratos” significa uma sequência de aminoácidos de polipeptídeo que se liga preferencialmente a um poli- ou oligossacarídeo (carboidrato), frequentemente - mas não necessariamente exclusivamente - a uma sua forma insolúvel em água (incluindo cristalina). Um módulo de ligação a carboidratos (CBM) é frequentemente referido como um domínio de ligação a carboidratos (CBD).
[0017] Os CBMs derivados de enzimas que degradam o amido são frequentemente referidos como módulos de ligação ao amido ou SBMs (que podem ocorrer em certas enzimas amilolíticas, tais como certas glucoamilases (GA), ou em enzimas como ciclodextrina glucanotransferases ou em alfa-amilases). Os SBMs são frequentemente referidos como SBDs (Domínios de Ligação ao Amido).
[0018] O “Módulo de Ligação a Carboidratos da Família 20” ou um módulo CBM-20 é no contexto desta invenção definido como uma sequência de aproximadamente 100 aminoácidos tendo pelo menos 45% de homologia com o Módulo de Ligação a Carboidratos (CBM) do polipeptídeo divulgado na figura 1 por Joergensen et al. (1997) em Biotechnol. Lett. 19: 1027-1031. O CBM compreende os últimos 102 aminoácidos do polipeptídeo, i.e., a subsequência do aminoácido 582 ao aminoácido 683. A numeração das Famílias de Glicosídeo Hidrolases aplicada em esta divulgação segue o conceito de Coutinho, PM & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Active Enzymes server na URL: http://afmb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html ou alternativamente Coutinho, PM & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. Em “Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”, K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tóquio, pp. 15-23 e Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001;
Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11: 593-600.
[0019] Exemplos de enzimas que compreendem um CBM adequado para uso no contexto da invenção são alfa-amilases, alfa-amilases maltogênicas, celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases. CBMs adicionais de interesse em relação à presente invenção incluem CBMs derivados de glucoamilases (EC 3.2.1.3) ou de CGTases (EC 2.4.1.19).
[0020] São preferenciais os híbridos compreendendo um CBM da Família de Módulos de Ligação a Carboidratos 20, 21 ou 25.
[0021] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima. Em uma modalidade, o domínio catalítico compreende os ou consiste nos aminoácidos 20-494 da SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 20-496 da SEQ ID NO: 1.
[0022] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.
[0023] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.
[0024] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.
[0025] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.
[0026] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão. Em uma modalidade, a(s) sequência(s) de controle é(são) heteróloga(s) ao polinucleotídeo da presente invenção.
[0027] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico tendo um ou mais (p. ex., vários) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 475 resíduos de aminoácidos (p. ex., aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1).
[0028] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula parental que não seja idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0029] Polipeptídeo híbrido ou enzima híbrida: Os termos “enzima híbrida” ou “polipeptídeo híbrido” são usados aqui para caracterizar aqueles dos polipeptídeos da invenção que compreendem uma primeira sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos um módulo catalítico tendo atividade de alfa-amilase e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos um módulo de ligação a carboidratos em que a primeira e a segunda sequências são derivadas de fontes diferentes. O termo “fonte” é entendido como, p. ex., mas não se limitando a uma enzima parental, p. ex., uma amilase ou glucoamilase, ou outra atividade catalítica compreendendo um módulo catalítico adequado e/ou um CBM adequado e/ou um ligante adequado.
[0030] Temperatura de gelatinização inicial: O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta, bem como com as condições de crescimento. No contexto da presente invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura na qual a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stärke 44 (12): 461-466.
[0031] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância que inclui, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada em natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p. ex., produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação; p. ex., uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção. O caldo de fermentação dessa célula hospedeira compreenderá o polipeptídeo isolado.
[0032] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO:
1. Os aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 1 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (p. ex., tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.
[0033] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de alfa- amilase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro são os nucleotídeos 58 a 1766 da SEQ ID NO: 10, ou a sua sequência de cDNA, e os nucleotídeos 1 a 57 da SEQ ID NO: 10 codificam um peptídeo sinal. Em outra modalidade, a sequência codificante do polipeptídeo maduro (sem íntrons) é os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10.
[0034] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada a partir de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção.
[0035] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.
[0036] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.
[0037] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:
[0038] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0039] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:
[0040] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0041] Condições de estringência: O termo “condições de estringência muito baixa” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 45 °C.
[0042] O termo “condições de estringência baixa ” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 25%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50 °C.
[0043] O termo “condições de estringência média” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55°C.
[0044] O termo “condições de estringência média-elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante
12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60°C.
[0045] O termo “condições de estringência elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65°C.
[0046] O termo “condições de estringência muito elevada” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70°C.
[0047] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p. ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de alfa- amilase.
[0048] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.
Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos Tendo Atividade de Alfa-amilase
[0049] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com alfa-amilases híbridas compreendendo o núcleo catalítico derivado de uma alfa-amilase de Acidomyces acidothermus e pelo menos um módulo de ligação a carboidratos.
[0050] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo híbrido tendo atividade de alfa-amilase, selecionado de uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico e uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; e (b) o CBM é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
[0051] Em uma modalidade, a alfa-amilase híbrida pode compreender um ligante. O ligante pode compreender uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos, tal como de 15 a 25 resíduos de aminoácidos. Mais particularmente, o ligante pode em uma modalidade ser selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%,
pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, em pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[0052] Em uma modalidade, a alfa-amilase híbrida é selecionada de um polipeptídeo tendo 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
[0053] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo híbrido tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0054] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 70% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0055] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0056] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0057] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 85% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0058] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 90% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0059] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 95% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0060] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.
[0061] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo híbrido tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0062] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 70% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0063] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0064] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0065] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 85% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0066] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 90% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0067] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 95% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0068] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.
[0069] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo híbrido tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0070] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 70% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0071] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0072] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0073] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 85% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0074] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 90% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0075] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 95% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0076] Em uma modalidade particular, a invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequências com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 9.
[0077] Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado. Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de alfa-amilase.
[0078] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0079] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0080] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 22 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0081] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 2201 da SEQ ID NO: 22 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0082] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 64 a 1920 da SEQ ID NO: 23 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0083] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 64 a 1923 da SEQ ID NO: 24 de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.
[0084] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes dos polipeptídeos maduros da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[0085] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
[0086] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-
64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
[0087] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso a erros,
exibição em fagos (p. ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832- 10837; patente dos E.U.A. n.º 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese sítio- dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0088] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para se detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
[0089] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao N-terminal ou C-terminal de uma região de outro polipeptídeo.
[0090] Os termos “enzima híbrida” ou “polipeptídeo híbrido” são usados aqui para caracterizar os polipeptídeos da invenção que compreendem uma primeira sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos um módulo catalítico tendo atividade de alfa-amilase e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos um módulo de ligação a carboidratos em que a primeira e a segunda são derivadas de fontes diferentes. O termo “fonte” é entendido como, p. ex., mas não se limitando a uma enzima parental, p. ex., uma amilase ou glucoamilase, ou outra atividade catalítica compreendendo um módulo catalítico adequado e/ou um CBM adequado e/ou um ligante adequado.
[0091] Os Números de classificação da enzima (números EC) estão de acordo com as Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press Inc, 1992.
[0092] Os polipeptídeos como referidos aqui incluem espécies compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma enzima alfa-amilase (EC 3.2.1.1) ligada (i.e., covalentemente ligada) a uma sequência de aminoácidos compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM).
[0093] Enzimas híbridas contendo CBM, bem como descrições detalhadas da sua preparação e purificação, são conhecidas na técnica (ver, p. ex., WO 90/00609, WO 94/24158 e WO 95/16782, WO 2006/069290, bem como Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) pp. 1295-1305). Podem, p. ex., ser preparadas por transformação em uma célula hospedeira de um construto de DNA compreendendo pelo menos um fragmento de DNA codificando o módulo de ligação a carboidratos ligado, com ou sem um ligante, a uma sequência de DNA codificando o polipeptídeo de interesse e cultura da célula hospedeira transformada para expressar o gene fundido. O CBM em um polipeptídeo da invenção pode estar posicionado C-terminalmente, N-terminalmente ou internamente no polipeptídeo. Em uma modalidade, um polipeptídeo pode compreender mais do que um CBM, p. ex., dois CBMs; um posicionado C-terminalmente, o outro N-terminalmente ou os dois CBMs em tandem posicionados C- terminalmente, N-terminalmente ou internamente.
[0094] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no N- terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem a ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
[0095] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. Domínios Catalíticos
[0096] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em um aspecto, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0097] O domínio catalítico preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de alfa-amilase.
[0098] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em um aspecto, os domínios catalíticos compreendem sequências de aminoácidos que diferem em até 10 aminoácidos, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0099] O domínio catalítico preferencialmente compreende os ou consiste nos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de alfa-amilase.
[0100] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 70% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0101] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 75% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0102] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 80% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0103] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 85% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0104] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 90% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0105] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 95% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1.
[0106] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a
494 da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 70% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0107] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 75% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0108] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 80% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0109] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 85% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0110] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 90% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0111] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 95% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0112] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona também com um domínio catalítico tendo uma identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o catalítico domínio tem pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1.
[0113] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos que hibridam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-elevada, condições de estringência elevada ou condições de estringência muito elevada (como definido acima) com (i) os nucleotídeos 58 a 1766 da SEQ ID NO: 10, (iii) a sua sequência de cDNA,
ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).
[0114] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com domínios catalíticos codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 1766 da SEQ ID NO: 10 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 60%, p. ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[0115] O polinucleotídeo codificando o domínio catalítico preferencialmente compreende ou consiste em 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10.
[0116] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona também com variantes do domínio catalítico dos aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (p. ex., várias) posições. Em um aspecto, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas na sequência de aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1 é até 10, p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ou 10. Sequência ligante
[0117] A sequência ligante pode ser qualquer sequência ligante adequada, p. ex., uma sequência ligante derivada de uma alfa-amilase ou glucoamilase. O ligante é preferencialmente uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos, tal como de 15 a 25 resíduos de aminoácidos.
[0118] Em uma modalidade preferencial, o ligante é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Módulos de ligação a carboidratos
[0119] Um módulo de ligação a carboidratos (CBM) ou, como frequentemente referido, um domínio de ligação a carboidratos (CBD), é uma sequência de aminoácidos de polipeptídeo que se liga preferencialmente a um poli- ou oligossacarídeo (carboidrato), frequentemente - mas não necessariamente exclusivamente - a uma sua forma insolúvel em água (incluindo cristalina).
[0120] Os CBMs derivados de enzimas que degradam o amido são frequentemente referidos como módulos de ligação ao amido ou SBMs que podem ocorrer em certas enzimas amilolíticas, tais como certas glucoamilases (GA), ou em enzimas como ciclodextrina glucanotransferases ou em alfa-amilases. Os SBMs são frequentemente referidos como SBDs (Domínios de Ligação ao Amido).
[0121] Os CBMs são encontrados como partes integrantes de grandes polipeptídeos ou proteínas consistindo em duas ou mais regiões de sequência de aminoácidos de polipeptídeo, especialmente em enzimas hidrolíticas (hidrolases) que compreendem tipicamente um módulo catalítico contendo o local ativo para hidrólise de substrato e um módulo de ligação a carboidratos (CBM) para ligação ao substrato de carboidrato em questão. Tais enzimas podem compreender mais do que um módulo catalítico e um, dois ou três CBMs e, opcionalmente, compreender adicionalmente uma ou mais regiões de sequência de aminoácidos de polipeptídeo ligando o(s) CBM(s) com o(s) módulo(s) catalítico(s), sendo uma região do último tipo usualmente denotado um “ligante”. Exemplos de enzimas hidrolíticas compreendendo um CBM - algumas das quais já foram mencionadas acima - são celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases.
[0122] Em proteínas/polipeptídeos nas quais ocorrem CBMs (p. ex., enzimas, tipicamente enzimas hidrolíticas), um CBM pode estar localizado no terminal N ou C ou em uma posição interna.
[0123] Essa parte de um polipeptídeo ou proteína (p. ex., enzima hidrolítica) que constitui um CBM per se consiste tipicamente em mais do que cerca de 30 e menos do que cerca de 250 resíduos de aminoácidos.
[0124] O “Módulo de Ligação a Carboidratos da Família 20” ou um módulo CBM-20 é no contexto desta invenção definido como uma sequência de aproximadamente 100 aminoácidos tendo pelo menos 45% de homologia com o Módulo de Ligação a Carboidratos (CBM) do polipeptídeo divulgado na figura 1 por Joergensen et al. (1997) em Biotechnol. Lett. 19: 1027-1031. O CBM compreende os últimos 102 aminoácidos do polipeptídeo, i.e., a subsequência do aminoácido 582 ao aminoácido 683. A numeração das Famílias de Glicosídeo Hidrolases aplicada em esta divulgação segue o conceito de Coutinho, PM & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Active Enzymes server na URL: http://afmb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html ou alternativamente Coutinho, PM & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. Em “Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation”, K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tóquio, pp. 15-23 e Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11: 593-600.
[0125] Exemplos de enzimas que compreendem um CBM adequado para uso no contexto da invenção são alfa-amilases, alfa-amilases maltogênicas, celulases, xilanases, mananases, arabinofuranosidases, acetilesterases e quitinases. CBMs adicionais de interesse em relação à presente invenção incluem CBMs derivados de glucoamilases (EC 3.2.1.3) ou de CGTases (EC 2.4.1.19).
[0126] Os CBMs derivados de fontes fúngicas, bacterianas ou vegetais serão geralmente adequados para uso no híbrido da invenção. Os CBMs de origem fúngica são preferenciais. A este respeito, técnicas adequadas para isolamento dos genes relevantes são bem conhecidas na técnica.
[0127] São preferenciais os híbridos compreendendo um CBM da Família de Módulos de Ligação a Carboidratos 20, 21 ou 25, preferencialmente família 20, tal como um CBM selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de alfa-amilase
[0128] Um polipeptídeo tendo atividade de alfa-amilase da presente invenção pode ser obtido de um fungo do gênero Acidomyces. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido de” como usado aqui em conexão com uma dada fonte deverá significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.
[0129] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acidomyces, p. ex., um polipeptídeo obtido de Acidomyces acidothermus.
[0130] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba os estados tanto perfeitos como imperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, p. ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.
[0131] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0132] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (p. ex., solo, composto, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p. ex., solo, composto, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra mista de DNA. Logo que um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tenha sido detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles peritos na técnica (ver, p. ex., Sambrook et al., 1989, supra). Polinucleotídeos
[0133] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando um polipeptídeo híbrido tendo atividade de alfa- amilase, ou um domínio catalítico tendo atividade de alfa-amilase da presente invenção, como descrito aqui. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido, ou domínio catalítico, da presente invenção foi isolado.
[0134] Em uma modalidade particular, os polinucleotídeos são selecionados de: a) um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10; b) um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 2201 da SEQ ID NO: 22; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 64 a 1920 da SEQ ID NO: 23; d) um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 64 a 1923 da SEQ ID NO: 24.
[0135] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento do DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p. ex., por uso da bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para se detectarem fragmentos de DNA clonados com as mesmas características estruturais. Ver, p. ex., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma estirpe de Acidomyces, ou um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo.
[0136] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Construtos de Ácidos Nucleicos
[0137] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácidos nucleicos compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção.
[0138] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.
[0139] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores variantes, truncados e híbridos e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
[0140] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes de acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobio- hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de
Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores variantes, truncados e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente dos E.U.A. n.º 6,011,147.
[0141] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfogliceratocinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0142] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira na presente invenção.
[0143] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum, beta-
glucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.
[0144] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[0145] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.
[0146] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado à terminação 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.
[0147] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
[0148] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[0149] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.
[0150] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes de antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0151] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0152] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural para intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.
[0153] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.
[0154] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes de fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[0155] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes de lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0156] Onde estiverem presentes sequências tanto do peptídeo sinal como do pró-peptídeo, a sequência do pró-peptídeo está posicionada próxima do terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada próxima do terminal N da sequência do pró-peptídeo.
[0157] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Nas leveduras pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei e promotor de celobio- hidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação gênica. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene de di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora. Vetores de Expressão
[0158] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor adequado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.
[0159] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p. ex., um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e podem dar origem à expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
[0160] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p. ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.
[0161] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores de seleção que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos e similares.
[0162] Os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus são preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus. Os genes adeA, adeB, amdS, hph e pyrG são preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma.
[0163] O marcador selecionável pode ser um sistema marcador selecionável dual como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável dual é um sistema marcador selecionável dual hph- tk.
[0164] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.
[0165] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
[0166] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
[0167] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.
[0168] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.
[0169] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultura das células na presença do agente selecionável apropriado.
[0170] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p. ex., Sambrook et al., 1989, supra). Células Hospedeiras
[0171] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula parental que não seja idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.
[0172] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p. ex., um procariota ou um eucariota.
[0173] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fúngica.
[0174] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8ª edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).
[0175] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0176] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolitica.
[0177] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidas por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
[0178] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.
[0179] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.
[0180] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque;
Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de Produção
[0181] A presente divulgação se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultura de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspecto, a célula é uma célula de Acidomyces. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Acidomyces acidothermus.
[0182] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.
[0183] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. A cultura tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p. ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.
[0184] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptídeo.
[0185] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutritivo por procedimentos convencionais, incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.
[0186] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p. ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p. ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p. ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p. ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.
[0187] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés disso uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. Produção em plantas
[0188] A presente invenção se relaciona também com plantas isoladas, p. ex., uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado a partir da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.
[0189] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocots são gramíneas, tais como grama de prado (capim do campo, Poa), forragem tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, p. ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.
[0190] Exemplos de plantas dicot são tabaco, leguminosas, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.
[0191] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p. ex., epiderme, mesofilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas.
[0192] Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta.
[0193] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas e células de plantas.
[0194] A planta ou célula de planta transgênica expressando o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0195] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo ou domínio da presente invenção compreendendo (a) cultura de uma planta ou uma célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperação do polipeptídeo ou domínio. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células
[0196] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou composições de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.
[0197] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteínas (p. ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p. ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p. ex., por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.
[0198] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo- hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.
[0199] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que esteja isenta destes componentes.
[0200] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem compreender ainda um agente conservante e/ou antimicrobiano (p. ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.
[0201] O caldo inteiro de células mortas ou composição pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p. ex., células fúngicas filamentosas)
serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro de células mortas ou composição podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.
[0202] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.
[0203] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. Composições de Enzimas:
[0204] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de alfa-amilase da composição foi aumentada, p. ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.
[0205] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, p. ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p. ex., várias) enzimas selecionadas de, p. ex., uma alfa-galactosidase, alfa- glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta- glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase,
celobio-hidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. Em uma modalidade particular, a composição compreende a alfa-amilase da invenção e uma glucoamilase.
[0206] Em uma modalidade, a glucoamilase compreendida na composição é de origem fúngica, preferencialmente de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii ou uma estirpe de Trametes, preferencialmente T. cingulata, ou uma estirpe de Pycnoporus, preferencialmente P. sanguineus, ou uma estirpe de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou uma estirpe dos Nigrofomes.
[0207] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Trametes, tal como uma estirpe de Trametes cingulata, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 11 aqui.
[0208] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 11 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 11 aqui.
[0209] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 12 aqui.
[0210] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12 aqui.
[0211] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mostrada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576 ou SEQ ID NO: 13 aqui.
[0212] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 13 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo SEQ ID NO: 13 aqui.
[0213] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é a Gloeophyllum sepiarium mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 14 aqui.
[0214] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum serpiarium, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 14 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 aqui.
[0215] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum trabeum tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 15 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15 aqui.
[0216] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.
[0217] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de SS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de SS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de SS, tal como 0,1-2 AGU/g de SS.
[0218] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G- ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont).
[0219] Adicionalmente a uma glucoamilase, a composição pode compreender adicionalmente uma protease. Em particular, uma endoprotease da família S53, mais particularmente uma protease S53 derivada de Meripilus giganteus.
[0220] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.
[0221] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de granulado ou microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0222] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0223] A composição de enzimas da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, um caldo de fermentação em bruto com ou sem células removidas, um lisado de células com ou sem detritos celulares, uma composição de enzimas semipurificada ou purificada ou uma célula hospedeira, como uma fonte das enzimas.
[0224] A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco, um granulado sem formação de poeira, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida estabilizada. As composições enzimáticas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.
[0225] São dados em baixo exemplos de uso preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica. Métodos de uso da alfa-amilase (híbrida) da invenção - Aplicações Industriais
[0226] As alfa-amilases da presente invenção possuem propriedades valiosas permitindo uma variedade de aplicações industriais. Em particular, as alfa-amilases podem ser usadas na produção de etanol e processos de conversão de amido.
[0227] Adicionalmente, as alfa-amilases da invenção são particularmente úteis na produção de adoçantes/xaropes e etanol (ver, p. ex.,
Patente dos E.U.A. n.º 5,231,017), tal como etanol combustível, potável e industrial, a partir de amido ou grãos inteiros.
[0228] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um uso da alfa-amilase de acordo com a invenção em um processo de sacarificação, particularmente um processo de sacarificação e fermentação simultâneas. Processamento de Amido
[0229] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água à temperatura ambiente. Quando a pasta semifluida aquosa de amido é aquecida, os grânulos incham e eventualmente rompem, dispersando as moléculas de amido na solução. A temperaturas até cerca de 50 °C a 75 °C, o inchaço pode ser reversível. No entanto, com temperaturas mais elevadas, começa um inchaço irreversível chamado “gelatinização”. Durante este processo de “gelatinização” existe um aumento dramático na viscosidade. O amido granular a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro ou pode ser um material contendo amido mais em bruto compreendendo grãos inteiros (p. ex., moídos) incluindo frações diferentes de amido tais como resíduos germinativos e fibras. A matéria-prima, tal como grãos inteiros, pode ser reduzida no tamanho das partículas, p. ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação de gérmen e farinha (grânulos de amido e proteína) e é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, p. ex., xaropes. A moagem tanto a seco como a úmido é bem conhecida na técnica de processamento do amido e pode ser usada em um processo da invenção. Métodos para redução do tamanho das partículas do material contendo amido são conhecidos dos peritos na técnica.
[0230] Como o nível de sólidos é 30-40% em um processo industrial típico, o amido tem de ser diluído ou “liquefeito” tal que possa ser adequadamente processado. Esta redução na viscosidade é principalmente alcançada por degradação enzimática na prática comercial atual.
[0231] A liquefação é levada a cabo na presença de uma alfa- amilase, preferencialmente uma alfa-amilase bacteriana e/ou alfa-amilase fúngica ácida. Em uma modalidade, uma fitase está também presente durante a liquefação. Em uma modalidade, enzimas redutoras da viscosidade tais como uma xilanase e/ou beta-glucanase estão também presentes durante a liquefação.
[0232] Durante a liquefação, o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas) por uma alfa-amilase. A liquefação pode ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três etapas. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C (p. ex., 70-90 °C, tal como 77-86 °C, 80-85 °C, 83-85 °C) e uma alfa-amilase é adicionada para iniciar a liquefação (diluição).
[0233] A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida com jato a entre 95-140 °C, p. ex., 105-125 °C, durante cerca de 1-15 minutos, p. ex., cerca de 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A pasta semifluida é depois resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase é adicionada para se obter a hidrólise final (liquefação secundária). O processo de cozimento com jato é levado a cabo a pH 4,5-6,5, tipicamente a um pH entre 5 e 6. A alfa-amilase pode ser adicionada como uma dose única, p. ex., antes do cozimento com jato.
[0234] O processo de liquefação é levado a cabo a entre 70-95 °C, tal como 80-90 °C, tal como em torno de 85 °C, durante cerca de 10 minutos a 5 horas, tipicamente durante 1-2 horas. O pH é entre 4 e 7, tal como entre 5,5 e 6,2. De modo a assegurar estabilidade de enzimas ótima sob estas condições, cálcio pode ser opcionalmente adicionado (para proporcionar 1-60 ppm de íons de cálcio livres, tal como cerca de 40 ppm de íons de cálcio livres). Após tal tratamento, o amido liquefeito terá tipicamente um “equivalente de dextrose” (DE) de 10-16.
[0235] Geralmente, a liquefação e as condições de liquefação são bem conhecidas na técnica.
[0236] As alfa-amilases para uso em liquefação são preferencialmente alfa-amilases estáveis ácidas bacterianas. Particularmente, a alfa-amilase é de uma Exiguobacterium sp. ou uma Bacillus sp. tal como, p. ex., Bacillus stearothermophilus ou Bacillus licheniformis.
[0237] Em uma modalidade, a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma estipe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 16 aqui.
[0238] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma deleção dupla de dois aminoácidos na região da posição 179 a 182, mais particularmente uma deleção dupla nas posições I181 + G182, R179 + G180, G180 + I181, R179 + I181 ou G180 + G182, preferencialmente I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).
[0239] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, preferencialmente substituição S242Q. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, preferencialmente substituição E188P.
[0240] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações:
- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P +N224L +Q254S; - I181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q25 4S (usando SEQ ID NO: 16 para numeração).
[0241] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 16.
[0242] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmente produzidas na forma truncada. Em particular, o truncamento pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 16 aqui, ou suas variantes, seja truncada no terminal C preferencialmente para ter em torno de 490 aminoácidos, tal como de 482-493 aminoácidos. Preferencialmente, a alfa- amilase variante de Bacillus stearothermophilus é truncada, preferencialmente após a posição 484 da SEQ ID NO: 16, particularmente após a posição 485, particularmente após a posição 486, particularmente após a posição 487, particularmente após a posição 488, particularmente após a posição 489, particularmente após a posição 490, particularmente após a posição 491, particularmente após a posição 492, mais particularmente após a posição 493.
[0243] A sacarificação pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica com uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma alfa-amilase de acordo com a presente invenção e uma glucoamilase. Por exemplo, a etapa de sacarificação total pode durar de cerca de 24 a cerca de 72 horas. No entanto é comum fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 20-75 °C, p. ex., 25-65 °C e 40-70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre cerca de 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.
[0244] As etapas de sacarificação e fermentação podem ser levadas a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Em uma modalidade, a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente (referidas como “SSF”). No entanto é comum realizar uma etapa de pré-sacarificação durante cerca de 30 minutos a 2 horas (p. ex., 30 a 90 minutos) a uma temperatura de 30 a 65 °C, tipicamente em torno de 60 °C que é seguido por uma sacarificação completa durante a fermentação referido como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é usualmente entre 4,2-4,8, p. ex., pH 4,5. Em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), não existe etapa de retenção para a sacarificação, ao invés, a levedura e enzimas são adicionadas em conjunto.
[0245] Em um processo de sacarificação típico, as maltodextrinas produzidas durante a liquefação são convertidas em dextrose por adição de uma glucoamilase e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase (Patente dos E.U.A. n.º 4,335,208) ou uma pululanase. A temperatura é diminuída até 60 °C, antes da adição da glucoamilase e enzima desramificadora. O processo de sacarificação procede durante 24-72 horas. Antes da adição das enzimas de sacarificação, o pH é reduzido até abaixo de 4,5, enquanto se mantém uma temperatura elevada (acima de 95 °C), para inativar a alfa-amilase de liquefação. Este processo reduz a formação de oligossacarídeo curto chamado “precursores de panose”, que não podem ser hidrolisados apropriadamente pela enzima desramificadora. Normalmente, cerca de 0,2-0,5% do produto de sacarificação é a panose de trissacarídeo ramificada (Glc pα1-6Glc pα1- 4Glc), que não pode ser degradada por uma pululanase. Se a amilase ativa da liquefação permanecer presente durante a sacarificação (i.e., sem desnaturação), a quantidade de panose pode ser tão elevada quanto 1-2%, o que é altamente indesejável uma vez que diminui o rendimento da sacarificação significativamente.
[0246] Outros produtos de fermentação podem ser fermentados a condições e temperaturas bem conhecidas dos peritos na técnica, adequadas para o organismo fermentador em questão.
[0247] O produto de fermentação pode ser recuperado por métodos bem conhecidos na técnica, p. ex., por destilação.
[0248] Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes da conversão de um material contendo amido em açúcares/dextrinas, as etapas de: (x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido; e (y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.
[0249] Em uma modalidade, o material contendo amido é moído para reduzir o tamanho das partículas. Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05-3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm, ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% do material contendo amido passe através de um crivo com uma peneira de 0,05-3,0 mm, preferencialmente tela de 0,1-0,5 mm.
[0250] A pasta semifluida aquosa pode conter de 10-55% em peso de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos (DS), mais preferencialmente 30-40% em peso de sólidos secos (DS) de material contendo amido.
[0251] Processos convencionais de conversão de amido, tais como processos de liquefação e sacarificação, são descritos, p. ex., na Patente dos E.U.A. n.º 3,912,590, EP 252730 e EP 063909.
[0252] Em uma modalidade, o processo de conversão degradando amido até componentes de carboidratos de peso molecular mais baixo tais como açúcares ou substituintes de gordura inclui uma etapa de desramificação.
[0253] No caso de conversão de amido em um açúcar, o amido é despolimerizado. Um tal processo de despolimerização consiste em, p. ex., uma etapa de pré-tratamento e dois ou três processos de processo consecutivos, i.e., um processo de liquefação, um processo de sacarificação e, dependendo do produto final desejado, um processo de isomerização opcional.
[0254] Quando o produto de açúcar final desejado é, p. ex., xarope rico em frutose, o xarope de dextrose pode ser convertido em frutose. Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado até um valor na gama de 6-8, p. ex., pH 7,5, e o cálcio é removido por permuta iônica. O xarope de dextrose é depois convertido em xarope rico em frutose usando, p. ex., uma glucose isomerase imobilizada. Produção de Produtos de Fermentação
[0255] Açúcares fermentáveis (p. ex., dextrinas, monossacarídeos, particularmente glucose) são produzidos a partir de sacarificação enzimática. Estes açúcares fermentáveis podem ser adicionalmente purificados e/ou convertidos em produtos de açúcar úteis. Adicionalmente, os açúcares podem ser usados como uma matéria-prima de fermentação em um processo de fermentação microbiana para produção de produtos finais, tais como álcool (p. ex., etanol e butanol), ácidos orgânicos (p. ex., ácido succínico, 3-HP e ácido lático), álcoois de açúcar (p. ex., glicerol), intermediários de ácido ascórbico (p. ex., gluconato, 2-ceto-D- gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L-gulônico), aminoácidos (p. ex., lisina), proteínas (p. ex., anticorpos e seus fragmentos).
[0256] Em uma modalidade, os açúcares fermentáveis obtidos durante as etapas de processo de liquefação são usados para produzir álcool e particularmente etanol. Em produção de etanol é comumente usado um processo SSF em que as enzimas de sacarificação e organismos fermentadores (p. ex., levedura) são adicionados em conjunto e depois levados a cabo a uma temperatura de 30-40 °C.
[0257] O organismo usado na fermentação dependerá do produto final desejado. Tipicamente, se etanol for o produto final desejado, será usada levedura como o organismo fermentador. Em algumas modalidades preferenciais, o microrganismo produtor de etanol é uma levedura e especificamente Saccharomyces tal como estirpes de S. cerevisiae (Patente dos E.U.A. n.º 4,316,956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e estas incluem mas não estão limitadas a FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialities), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel
Yeast Company, China). A quantidade de levedura iniciadora empregue nos métodos é uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente significativa de etanol em uma quantidade de tempo adequado (p. ex., para produzir pelo menos 10% de etanol a partir de um substrato tendo entre 25-40% de DS em menos do que 72 horas). As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de cerca de 104 a cerca de 1012 e, preferencialmente, de cerca de 107 a cerca de 1010 contagens de leveduras viáveis por mL de caldo de fermentação. Após levedura ser adicionada ao mosto é tipicamente sujeita a fermentação durante cerca de 24-96 horas, p. ex., 35-60 horas. A temperatura é entre cerca de 26-34 °C, tipicamente a cerca de 32 °C, e o pH é de pH 3-6, p. ex., em torno de pH 4-5.
[0258] A fermentação pode incluir, adicionalmente a um microrganismo fermentador (p. ex., levedura), nutrientes e enzimas adicionais, incluindo fitases. O uso de levedura em fermentação é bem conhecido na técnica.
[0259] Em modalidades adicionais, o uso de microrganismos fermentadores apropriados, como é conhecido na técnica, pode resultar em produto final de fermentação incluindo, p. ex., glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L- gulônico, ácido succínico, ácido lático, aminoácidos e seus derivados. Mais especificamente, quando o ácido lático é o produto final desejado, uma Lactobacillus sp. (L. casei) pode ser usada; quando o glicerol ou 1,3- propanodiol são os produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e, quando o 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L- gulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o microrganismo fermentador. A lista enumerada acima são somente exemplos e um perito na técnica estará ciente de um número de microrganismos fermentadores que podem ser usados para se obter um produto final desejado. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido não gelatinizado
[0260] A invenção se relaciona também com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização (i.e., sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto”). O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefação da pasta semifluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (p. ex., moído), p. ex., amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de uma alfa-amilase da invenção e enzima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermentador adequado. Em esta modalidade, o produto de fermentação desejado, p. ex., etanol, é produzido a partir de grãos de cereais não gelatinizados (i.e., não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho.
[0261] Conformemente, em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo sacarificação e fermentação simultâneas de material contendo amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos e um organismo fermentador a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase da invenção.
[0262] A sacarificação e a fermentação também podem ser separadas. Assim, em outro aspecto, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação, compreendendo os seguintes etapas: (i) sacarificação de um material contendo amido em bruto a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a etapa (i) é levado a cabo usando pelo menos uma alfa- amilase da invenção e, opcionalmente, uma glucoamilase.
[0263] Em uma modalidade, o organismo fermentador expressa a alfa-amilase da invenção e/ou uma glucoamilase.
[0264] O produto de fermentação, p. ex., etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p. ex., por destilação. Tipicamente, amilase(s), tais como glucoamilase(s) e/ou outras enzimas geradas de fonte de carboidratos, e/ou alfa-amilase(s), está(estão) presente(s) durante a fermentação. Exemplos de glucoamilases e outras enzimas geradoras de fonte de carboidratos incluem glucoamilases hidrolisantes de amido em bruto. Exemplos de alfa-amilase(s) incluem alfa- amilases ácidas tais como alfa-amilases ácidas fúngicas, particularmente a alfa-amilase da invenção. Exemplos de organismos fermentadores incluem levedura, p. ex., uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta, bem como com as condições de crescimento. No contexto da presente invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura na qual a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stärke 44 (12): 461-466. Antes do início do processo pode ser preparada uma pasta semifluida de material contendo amido, tal como amido granular, tendo 10-55% p/p de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% p/p de sólidos secos, mais preferencialmente 30-40% p/p de sólidos secos de material contendo amido.
A pasta semifluida pode incluir água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água do separador lateral da destilação ou água de processo de outras instalações de produtos de fermentação.
Porque o processo da invenção é levado a cabo abaixo da temperatura de gelatinização inicial e, logo, não tem lugar nenhum aumento significativo da viscosidade, se desejado, podem ser usados elevados níveis de vinhaça.
Em uma forma de realização, a pasta aquosa contém de cerca de 1 a cerca de 70 % por vol., preferencialmente 15-60 % por vol., especialmente de cerca de 30 a 50 % por vol. de água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água descarregada dos lados da destilação, ou água do processo de outras instalações de produtos de fermentação, ou suas combinações, ou similares.
O material contendo amido pode ser preparado por redução do tamanho das partículas, preferencialmente por moagem a seco ou úmida, até 0,05 a 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm.
Após ser sujeito a um processo da invenção, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou preferencialmente pelo menos 99% dos sólidos secos no material contendo amido são convertidos em um hidrolisado de amido solúvel.
Um processo em este aspecto da invenção é conduzido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial, o que significa que a temperatura reside tipicamente na gama entre 30-75 °C,
preferencialmente entre 45-60 °C. Em uma modalidade, o processo realizou- se a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de 32 °C. Em uma modalidade, o processo é levado a cabo tal que o nível de açúcar, tal como nível de glucose, seja mantido a um nível baixo, tal como abaixo de 6% p/p, tal como abaixo de cerca de 3% p/p, tal como abaixo 2% p/p, tal como abaixo de cerca de 1% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,5% p/p ou abaixo de 0,25% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,1% p/p. Tais níveis baixos de açúcar podem ser alcançados por emprego simples de quantidades ajustadas de enzima e organismo fermentador. Um perito na técnica pode facilmente determinar que doses/quantidades de enzima e organismo fermentador usar. As quantidades empregues de enzima e organismo fermentador podem ser também selecionadas para se manterem baixas concentrações de maltose no caldo de fermentação. Por exemplo, o nível de maltose pode ser mantido abaixo de cerca de 0,5% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,2% p/p. O processo da invenção pode ser levado a cabo a um pH de cerca de 3 a 7, preferencialmente de pH 3,5 a 6 ou, mais preferencialmente, de pH 4 a 5. Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado
[0265] Em este aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, processo esse que inclui uma etapa de liquefação e etapas de sacarificação e fermentação sequencialmente ou simultaneamente realizadas. Consequentemente, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de:
(a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial na presença de uma alfa- amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido na etapa (a) usando uma alfa-amilase da invenção e, opcionalmente, uma glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo de fermentação.
[0266] Em uma modalidade, uma protease, tal como uma serina protease termoestável, uma protease fúngica ácida ou uma metaloprotease, é adicionada antes da, durante a e/ou após a liquefação. Em uma modalidade, a metaloprotease é derivada de uma estirpe de Thermoascus, p. ex., uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670. Em outra modalidade, a protease é uma protease bacteriana, particularmente uma serina protease, p. ex., uma protease S8, mais particularmente uma protease derivada de uma estirpe de Pyrococcus ou Thermococcus, mais particularmente de Pyrococcus furiosus divulgada em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 17 aqui.
[0267] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe de Aspergillus, p. ex., Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, uma estirpe de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma estirpe de Trametes, p. ex., Trametes cingulata; ou uma estirpe de Pycnoporus, ou uma estirpe de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium ou G. trabeum, ou uma estirpe do Nigrofomes; ou uma sua mistura. A etapa de sacarificação (b) e a etapa de fermentação (c) podem ser levadas a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Uma pululanase e/ou protease podem ser adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação quando o processo é levado a cabo como um processo de sacarificação e fermentação sequenciais e antes da ou durante a fermentação quando as etapas (b) e (c) são levados a cabo simultaneamente (processo SSF). A pululanase e/ou protease podem ser também vantajosamente adicionadas antes da liquefação (tratamento pré- liquefação), i.e., antes do ou durante a etapa (a) e/ou após a liquefação (tratamento pós-liquefação), i.e., após a etapa (a). A pululanase é o mais vantajosamente adicionada antes da ou durante a liquefação, i.e., antes do ou durante a etapa (a). O produto de fermentação, tal como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p. ex., por destilação. O organismo fermentador é preferencialmente levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade preferencial, a levedura está expressando a glucoamilase variante da invenção. Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes da etapa (a), as etapas de: x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem (p. ex., usando um moinho de martelos); y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.
[0268] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é mais pequeno do que uma tela # 7, p. ex., uma tela # 6. Uma tela # 7 é usualmente usada em processos da técnica prévia convencionais. A pasta semifluida aquosa pode conter de 10-55, p. ex., 25-45 e 30-40, % p/p de sólidos secos (DS) de material contendo amido. A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a alfa-amilase na etapa (a). A liquefação pode em uma modalidade ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três etapas. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C, preferencialmente entre 70-90 °C, tal como preferencialmente entre 80-85 °C a um pH 4-6, preferencialmente 4,5-5,5, e variante de alfa- amilase, opcionalmente em conjunto com uma pululanase e/ou protease,
preferencialmente metaloprotease, são adicionadas para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, a pasta semifluida pode ser depois cozida com jato a uma temperatura entre 95-140 °C, preferencialmente 100-135 °C, tal como 105-125 °C, durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3-10 minutos, especialmente em torno de cerca de 5 minutos.
A pasta semifluida é resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase e opcionalmente pululanase e/ou protease, preferencialmente metaloprotease, é(são) adicionada(s) para finalizar a hidrolise (liquefação secundária). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a pH 4,5-6,5, tal como em torno de 4,8, ou um pH entre 5,0-6,2, tal como 5,0-6,0, tal como entre 5,0- 5,5, tal como em torno de 5,2, tal como em torno de 5,4, tal como em torno de 5,6, tal como em torno de 5,8. A etapa de sacarificação (b) pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica.
Por exemplo, um processo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 20-75 °C, preferencialmente de 40-70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe uma fase de retenção para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto.
A SSF pode ser tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 36 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de cerca de 32 °C.
Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.
Processos para produção de xaropes a partir de material contendo amido gelatinizado
[0269] Em este aspecto, a etapa de fermentação é deixado de fora, no entanto, as condições são geralmente como descrito acima para “Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado”. Assim, em este aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para produção de um xarope a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial na presença de uma alfa-amilase; e b) sacarificação do produto da etapa a) na presença de uma glucoamilase e uma alfa-amilase da invenção. Protease Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação
[0270] De acordo com a invenção, uma protease termoestável pode em uma modalidade estar presente e/ou ser adicionada durante a liquefação em conjunto com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase termoestável, e opcionalmente uma enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular uma glucoamilase termoestável ou pululanase termoestável.
[0271] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas ou ainda não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.
[0272] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24
(metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).
[0273] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não, é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados no mesmo. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.
[0274] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser do mesmo modo adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 °C.
[0275] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como a Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos em baixo na seção “Materiais & Métodos”, dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial. Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease usada em um processo da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.
[0276] A protease pode ser uma variante, por exemplo, de uma protease de tipo selvagem desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas aqui.
[0277] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.
[0278] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80- 120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110- 120% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.
[0279] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).
[0280] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 com as seguintes mutações: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; ou A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.
[0281] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura da SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841.
[0282] A protease termoestável pode ser também derivada de uma bactéria, particularmente uma serina protease, mais particularmente uma protease S8, mais particularmente uma protease S8 de Pyrococcus sp. ou Thermococcus sp.
[0283] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma estirpe da bactéria Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu).
[0284] Em uma modalidade, a protease é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA n.º 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) e SEQ ID NO: 17 aqui.
[0285] Em outra modalidade, a protease termoestável é uma divulgada na SEQ ID NO: 17 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com a SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 17 aqui. Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Liquefação
[0286] Em uma modalidade, uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada na etapa de liquefação a) em um processo da invenção (i.e., processo de recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).
[0287] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase presente e/ou adicionada na etapa de liquefação a) é derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 18 aqui.
[0288] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 18 aqui.
[0289] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 18 aqui tendo uma substituição K79V (usando a sequência madura mostrada na SEQ ID NO: 18 para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.
[0290] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação é a glucoamilase de Penicillium oxalicum tendo uma substituição K79V e preferencialmente adicionalmente uma das seguintes substituições: - P11F + T65A + Q327F; - P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 18 para numeração).
[0291] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo da SEQ ID NO: 18 aqui.
[0292] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1-100 microgramas de EP/g, como 0,5-50 microgramas de EP/g, tal como 1-25 microgramas de EP/g, tal como 2-12 microgramas de EP/g de SS.
Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação E/Ou Fermentação
[0293] Uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação, preferencialmente sacarificação e fermentação simultâneas (SFS), em um processo da invenção (i.e., processo de recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).
[0294] Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica, preferencialmente de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii ou uma estirpe de Trametes, preferencialmente T. cingulata ou uma estirpe de Pycnoporus ou uma estirpe de Gloeophyllum, tal como G. sepiarium ou G. trabeum, ou uma estirpe de Nigrofomes.
[0295] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 12 aqui.
[0296] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12 aqui.
[0297] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mostrada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576 ou SEQ ID NO: 13 aqui.
[0298] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é a Gloeophyllum sepiarium mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 14 aqui.
[0299] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum sepiarium, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 14 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 aqui.
[0300] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum trabeum tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 15 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15 aqui;
(ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 15 aqui.
[0301] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.
[0302] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de SS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de SS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de SS, tal como 0,1-2 AGU/g de SS.
[0303] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G- ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont).
[0304] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase. Exemplos de alfa- amilase adequadas são descritos em baixo. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Sacarificação E/Ou Fermentação
[0305] Em uma modalidade, uma alfa-amilase da invenção está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em um processo da invenção. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é de origem fúngica ou bacteriana. Em uma modalidade preferencial, a alfa-
amilase é uma alfa-amilase fúngica estável em ácido da invenção. Uma alfa- amilase fúngica estável em ácido é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e preferencialmente na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.
[0306] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada de uma estirpe do gênero Acidomyces, preferencialmente uma estirpe de Acidomyces acidothermus, tal como uma mostrada na SEQ ID NO: 1 aqui, ou uma alfa- amilase híbrida de acordo com a invenção.
[0307] Em uma modalidade, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada da alfa-amilase madura da SEQ ID NO: 1 ou uma alfa-amilase híbrida da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou uma alfa-amilase tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou uma alfa-amilase híbrida da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9; ou uma alfa-amilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico, uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um ligante e uma terceira sequência de polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao amido (SBD), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1;
(b) o ligante é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; (c) o SBD é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.
[0308] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70. Meio de Fermentação
[0309] O ambiente no qual a fermentação é levada a cabo é frequentemente referido como os “meios de fermentação” ou “meio de fermentação". O meio de fermentação inclui o substrato da fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. De acordo com a invenção, o meio de fermentação pode compreender nutrientes e estimulante(s) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações. Organismos Fermentadores
[0310] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, especialmente levedura, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir o produto de fermentação desejado. Organismos fermentadores especialmente adequados são capazes de fermentar, i.e., converter açúcares, tais como glucose ou maltose, diretamente ou indiretamente, no produto de fermentação desejado, tal como etanol. Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae.
[0311] Concentrações adequadas do organismo fermentador viável durante a fermentação, tal como SFS, são bem conhecidas na técnica ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na técnica. Em uma modalidade, o organismo fermentador, tal como levedura fermentadora de etanol (p. ex., Saccharomyces cerevisiae), é adicionado ao meio de fermentação tal que a contagem do organismo fermentador viável, tal como levedura, por mL de meio de fermentação esteja na gama de 105 a 1012, preferencialmente de 107 a 1010, especialmente cerca de 5 x 107.
[0312] Exemplos de leveduras comercialmente disponíveis incluem, p. ex., levedura RED STAR™ e ETHANOL RED (disponível a partir da Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann’s Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a partir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível a partir da DSM Specialties). Materiais Contendo Amido
[0313] Pode ser usado qualquer material contendo amido de acordo com a presente invenção O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais contendo amido, adequados para uso em um processo da invenção, incluem grãos inteiros, milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu,
mandioca, tapioca, milho-zaburro, arroz, ervilhas, feijões ou batatas-doces, ou suas misturas ou amidos derivados destes, ou cereais. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido, usado para a produção de etanol de acordo com a invenção, é milho ou trigo. Produtos de Fermentação
[0314] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um processo incluindo uma etapa de fermentação usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (p. ex., etanol, metanol, butanol; poliois tais como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgânicos (p. ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p. ex., acetona); aminoácidos (p. ex., ácido glutâmico); gases (p. ex., H2 e CO2); antibióticos (p. ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p. ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, p. ex., etanol combustível; etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p. ex., cerveja e vinho), indústria dos laticínios (p. ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Preferencialmente, os processos da invenção são usados para produção de um álcool, tal como etanol. O produto de fermentação, tal como etanol, obtido de acordo com a invenção, pode ser usado como combustível, o qual é tipicamente misturado com gasolina. No entanto, no caso do etanol, pode ser também usado como etanol potável. Recuperação de Produtos de Fermentação
[0315] Após a fermentação, ou SFS, o produto de fermentação pode ser separado a partir do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (p. ex., etanol). Alternativamente, o produto da fermentação desejado pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica.
[0316] A presente invenção é adicionalmente ilustrada nas seguintes modalidades numeradas. Modalidade 1. Um polipeptídeo híbrido tendo atividade de alfa-amilase, selecionado de uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico e uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; e (b) o CBM é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
[0317] Modalidade 2. A alfa-amilase híbrida da modalidade 1, compreendendo adicionalmente um ligante compreendendo uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos, tal como de 15 a 25 resíduos de aminoácidos.
[0318] Modalidade 3. A alfa-amilase híbrida da modalidade 2, em que o ligante é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[0319] Modalidade 4. O polipeptídeo híbrido da modalidade 1, selecionado de um polipeptídeo tendo 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
[0320] Modalidade 5. O polipeptídeo híbrido de qualquer uma das modalidades 1-4, compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
[0321] Modalidade 6. Um polipeptídeo compreendendo um domínio catalítico selecionado do grupo consistindo em: (a) um domínio catalítico tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10; (c) um fragmento do domínio catalítico de (a) ou (b) que tem atividade de alfa-amilase.
[0322] Modalidade 7. O polipeptídeo da modalidade 6, compreendendo adicionalmente um módulo de ligação a carboidratos.
[0323] Modalidade 8. O polipeptídeo da modalidade 7, em que o CBM é selecionado de uma Família de CBM 20, 21 ou 25, particularmente a Família 20.
[0324] Modalidade 9. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 7-8 compreendendo adicionalmente um ligante.
[0325] Modalidade 10. O polipeptídeo da modalidade 9, em que o ligante compreende uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos, tal como de 15 a 25 resíduos de aminoácidos.
[0326] Modalidade 11. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-10. Modalidade 12. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-10.
[0327] Modalidade 13. Um uso de um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-10 para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.
[0328] Modalidade 14. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador; em que a etapa (b) é levado a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase de qualquer uma das modalidades 1-10 e, opcionalmente, uma glucoamilase.
[0329] Modalidade 15. O processo da modalidade 14, em que a etapa (b) e a etapa (c) são levados a cabo simultaneamente.
[0330] Modalidade 16. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material de amido em bruto, compreendendo as etapas de: (a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que a etapa (a) é levado a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase de qualquer uma das modalidades 1-10 e, opcionalmente, uma glucoamilase. Modalidade 17. Um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma alfa- amilase de qualquer uma das modalidades 1-10 e, opcionalmente, uma glucoamilase.
[0331] Modalidade 18. O processo de qualquer uma das modalidades 16-17, em que as etapas a) e b) são levados a cabo simultaneamente.
[0332] Modalidade 19. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-10.
[0333] Modalidade 20. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 19 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
Modalidade 21. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 19 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo.
[0334] Modalidade 22. A célula hospedeira de acordo com a modalidade 21, em que a célula hospedeira é uma célula de levedura, particularmente uma Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.
[0335] Modalidade 23. O processo de qualquer uma das modalidades 14-16, em que a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 21-22 é aplicada na etapa de fermentação.
[0336] Modalidade 24. O processo da modalidade 23, em que a célula de levedura está expressando a alfa-amilase de qualquer uma das modalidades 1-10 e uma glucoamilase.
[0337] Modalidade 25. Um método de produção de um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-10, compreendendo cultura da célula hospedeira da modalidade 21 sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. Modalidade 26. O método da modalidade 25, compreendendo adicionalmente recuperação do polipeptídeo. Modalidade 27. Uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 19.
[0338] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.
EXEMPLOS Estirpes
[0339] A estirpe NN070838 (Acidomyces acidothermus) foi isolada a partir de uma amostra ambiental coletada em Kalundborg, Dinamarca 09.10.2015.
Exemplo 1: Ensaio de degradação de amido em bruto
[0340] O desempenho da degradação de amido em bruto foi medido por liberação de glucose a partir de amido granular com uma glucoamilase fúngica em combinação com as alfa-amilases híbridas da invenção. Uma alfa-amilase comercial foi usada como controle (mostrado na SEQ ID NO: 19). A alfa-amilase purificada foi diluída até 0,156 µg/mL por tampão de acetato a 50 mM (pH 4,0). Trinta microlitros da solução de enzimas foram transferidos para poços de placa com poços profundos de 2,0 mL, e 270 µL de solução de substrato (amido em bruto a 0,2% disperso em tampão de acetato a 50 mM pH 3,5 ou 4,0, CaCl2 a 1 mM, glucoamilase fúngica a 1,25 µg/mL (SEQ ID NO: 20), com ou sem etanol a 15% (v/v)) foram adicionados para iniciar a reação. A suspensão de substrato foi agitada até imediatamente antes de ter sido adicionada. Após incubação a 32 °C durante 180 min com agitação a 1200 rpm, as amostras foram centrifugadas para agitar o grânulo de amido residual e a concentração de glucose do sobrenadante foi medida por mistura de alíquota de 20 µL com 200 µL de solução de detecção de glucose com base no método de glucose oxidase- peroxidase comercial (teste de Glucose C2, Wako Chemical. Co) no qual acarbose como um inibidor de glucoamilase havia sido dissolvida até 0,5 mM antes do uso. A absorvância a 505 nm foi medida e o desempenho relativo foi calculado. RS RSH Núcleo Ligante SBD H c/ EtO
H AA de 1,00 1,00 AA de AMG de A. AMG de A. niger Control Rhizomucor niger (SEQ ID NO: 4) e pusillus (aa (SEQ ID NO: 1-438 da 2)
SEQ ID NO: 19) JA308 1,05 1,16 AA de AMG de A. AMG de A. niger Acidomyces niger (SEQ ID NO: 4) acidothermu (SEQ ID NO: s (aa 20-496 2) da SEQ ID NO: 1) JA503 1,20 1,41 AA de CH13 de AMG de Acidomyces Bulgaria Aspergillus acidothermu inquinans ochraceus s (aa 20-494 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 5) da SEQ ID 3) NO: 1) JA514 1,19 1,42 AA de AMG de A. AMG de Acidomyces niger Penicillium sp. acidothermu (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 6) s (aa 20-494 2) da SEQ ID NO: 1) Exemplo 2: Ensaio de degradação de amido em bruto prolongado
[0341] O desempenho da degradação de amido em bruto com tempo de incubação prolongado a pH baixo com ou sem EtOH foi medido por liberação de glucose a partir de amido granular com um núcleo catalítico de glucoamilase fúngica em combinação com as alfa-amilases híbridas da invenção. Uma alfa-amilase comercial foi usada como controle (mostrado na SEQ ID NO: 19). A alfa-amilase purificada foi diluída até 0,1 mg/mL por tampão de acetato a 50 mM (pH 3,5 e 3,75). O domínio de núcleo catalítico de glucoamilase fúngica (SEQ ID NO: 21) foi preparado como sobrenadante de cultura e diluído até 1 mg/mL.
O mesmo volume de alfa-amilase e núcleo catalítico de glucoamilase foi misturado.
A mistura de enzimas foi diluída três vezes com tampão de acetato a 50 mM (pH 3,5 e 3,75). Vinte microlitros de mistura de enzimas diluída foram transferidos para poços de placa com 24 poços, e 980 µL de solução de substrato (amido bruto a 1,5% disperso em tampão de acetato a 50 mM pH 3,5 e 3,75, CaCl2 a 1 mM, com ou sem etanol a 15% (v/v)) foram adicionados para iniciar a reação.
A solução de substrato foi agitada até imediatamente antes de ter sido adicionada.
Após incubação a 32 ° C durante 18 e 48 horas com agitação a 1200 rpm, as amostras foram centrifugadas para agitar o grânulo de amido residual e o sobrenadante foi diluído 15 vezes com água ultrapura.
A concentração de glucose do sobrenadante diluído foi medida por mistura de alíquota de 10 µL com 200 µL de solução comercial de detecção de glucose baseada no método de glucose oxidase-peroxidase (teste de Glucose C2, Wako Chemical.
Co) no qual acarbose como um inibidor de glucoamilase havia sido dissolvida até 0,5 mM antes do uso.
A absorvância a 505 nm foi medida e o desempenho relativo foi calculado.
JA 18 horas 42 horas pH pH pH pH pH 3,5 pH 3,5 pH pH 3,5 3,5 3,75 3,75 c/ 3,75 3,75 c/ c/ EtOH c/ EtOH EtOH EtOH AA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 de Contr ole JA30 2,3 3,2 1,3 2,0 2,4 2,9 1,3 1,8 8
JA50 1,5 2,2 1,1 1,5 1,4 2,0 1,1 1,4 3 JA51 2,2 2,5 1,2 1,8 2,3 2,5 1,2 1,7 4 Exemplo 3: Teste de estabilidade a pH baixo
[0342] A estabilidade da enzima a pH baixo com ou sem EtOH foi avaliada pela atividade residual após incubação a pH 3,0, 32 °C. A alfa- amilase purificada foi diluída até 0,1 mg/mL por tampão de acetato de glicina a 100 mM pH 4,0 com CaCl2 a 50 mM. Dez microlitros de enzimas diluídas foram transferidos para o tubo de PCR e misturados com 90 µL de tampão de diluição (tampão de acetato de glicina a 100 mM pH 3, CaCl2 a 50 mM, triton X-100 a 0,01% com ou sem EtOH a 15% (v/v)). Após incubação a 32 °C durante 0, 3 ou 20 horas, 10 µL das amostras foram transferidos para uma placa com 96 poços e misturados com 90 µL de NaOAc a 50 mM (pH 4,0). Vinte microlitros de amostras diluídas foram transferidos para nova placa com 96 poços e misturados com 60 µL de mistura 1:1 de solução de substrato e solução de enzimas do estojo comercial de ensaio colorimétrico de alfa- amilase (Kikkoman Biochemifa Company) usando substrato sintético (65- azido-65-desoxi-β-maltopentaosídeo de 2-cloro-4-nitrofenila, N3-G5-β-CNP). Após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, 120 µL de solução de paragem (CaCO2) foram adicionados. A absorvância a 405 nm foi medida e a atividade relativa foi calculada. A atividade residual foi medida para a alfa-amilase nuclear de acordo com a invenção, bem como as alfa- amilases híbridas da invenção. Uma alfa-amilase da técnica prévia (SEQ ID NO: 19) foi incluída como controle.
[0343] Atividade residual após incubação a pH baixo (3 h e 20 h) EtOH 3h
SEQ ID SEQ ID JA308 JA308 JA503 JA514 NO: 19 NO: 19 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID (aa 1-438) NO: 7 NO: 1 (aa NO: 8 NO: 9 20-496) s/ EtOH 0,93 0,93 1,03 0,99 0,94 0,96 c/ EtOH 0,12 0,36 0,63 0,68 0,69 0,68 EtOH 20 h SEQ ID SEQ ID JA308 JA308 JA503 JA514 NO: 19 NO: 19 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID (aa 1-438) NO: 7 NO: 1 (aa NO: 8 NO: 9 20-496) s/ EtOH 0,63 0,70 0,90 0,92 0,83 0,95 c/ EtOH 0,00 0,00 0,05 0,06 0,07 0,06
[0344] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos se pretendem como ilustrações de vários aspectos da invenção. É pretendido que quaisquer aspectos equivalentes estejam dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo híbrido tendo atividade de alfa-amilase, caracterizado por ser selecionado de uma primeira sequência de polipeptídeo compreendendo um núcleo catalítico e uma segunda sequência de polipeptídeo compreendendo um módulo de ligação a carboidratos (CBM), em que (a) o núcleo catalítico é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; e (b) o CBM é selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
2. Alfa-amilase híbrida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente um ligante compreendendo uma sequência de cerca de 2 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos, tal como de 15 a 25 resíduos de aminoácidos.
3. Alfa-amilase híbrida, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o ligante ser selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
4. Polipeptídeo híbrido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado de um polipeptídeo tendo 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
5. Polipeptídeo, caracterizado por compreender um domínio catalítico selecionado do grupo consistindo em: (a) um domínio catalítico tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 494 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos 20 a 496 da SEQ ID NO: 1; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% , pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com os nucleotídeos 58 a 228, 292 a 450, 501 a 590, 663 a 722, 769 a 1043, 1091 a 1766 da SEQ ID NO: 10; (c) um fragmento do domínio catalítico de (a) ou (b) que tem atividade de alfa-amilase.
6. Composição, caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. Uso de um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.
9. Processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado por compreender as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador; em que a etapa (b) é levada a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e opcionalmente uma glucoamilase.
10. Processo de produção de um produto de fermentação a partir de material de amido em bruto, caracterizado por compreender as etapas de: (a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que a etapa (a) é levada a cabo usando pelo menos uma alfa-amilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e opcionalmente uma glucoamilase.
11. Processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, caracterizado por compreender as etapas de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma alfa-amilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e opcionalmente uma glucoamilase.
12. Polinucleotídeo, caracterizado por codificar o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
13. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 12, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
14. Célula hospedeira recombinante, caracterizada por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 12, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo.
15. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a célula hospedeira ser uma célula de levedura, particularmente uma Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.
16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado por a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 15, ser aplicada na etapa de fermentação.
17. Método de produção de um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 14, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo.
18. Planta transgênica, parte de planta ou célula de planta caracterizada por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 12.
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