BR112020026348A2 - Método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteínas, para selecionar um medicamento de proteína principal e para caracterizar complexos de proteínas, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

métodos para caracterizar complexos de proteínas formados entre medicamentos de proteína e ligantes solúveis são providos aqui. os métodos descritos podem determinar o tamanho, heterogeneidade e conformação de complexos de proteínas.

Description

1 / 46

MÉTODO PARA AVALIAR A ESTEQUIOMETRIA E DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE COMPLEXOS DE PROTEÍNAS, PARA SELECIONAR UM MEDICAMENTO DE PROTEÍNA PRINCIPAL E PARA CARACTERIZAR COMPLEXOS DE PROTEÍNAS, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e prioridade para o Pedido de Patente Provisória dos EUA nº 62/724.700, depositado em 30 de agosto de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] Geralmente, essa invenção se refere aos sistemas e métodos de caracterização de complexos de proteínas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os anticorpos monoclonais (mAbs) são um campo terapêutico em crescimento, com mais de 50 anticorpos monoclonais atualmente no mercado. A terapia combinada de mais de um anticorpo monoclonal tem o potencial de melhorar a eficácia das monoterapias existentes. Certas substâncias solúveis, particularmente substâncias multiméricas com vários epítopos repetidos, podem se ligar a dois ou mais anticorpos, levando à formação de grandes complexos. A produção de grandes complexos de anticorpos heterogêneos é conhecida como “bonecos de papel”. Grandes complexos de anticorpos podem ser eliminados rapidamente por fagocitose, levando à redução da eficácia do anticorpo. Grandes complexos de proteínas também podem aumentar a imunogenicidade do mAb.

[004] Os complexos de proteínas podem variar em tamanho de nanômetro a partículas visíveis, tornando difícil sua caracterização por uma única técnica analítica. Uma das técnicas mais difundidas usadas para determinar o tamanho das partículas de ∼1 nm a ∼1 µm é o espalhamento dinâmico de luz (DLS). O DLS é uma técnica analítica usada para determinar

2 / 46 o perfil de distribuição do tamanho da proteína e é passível de aplicações de alto rendimento (Zhou, M., et al., ChemMedChem, 11:738-756 (2016)). O movimento Browniano das proteínas em solução faz com que a luz seja espalhada, com as flutuações de intensidade espalhada resultantes dependentes do tamanho das partículas. Assim, o raio médio e a largura da distribuição em termos de polidispersidade podem ser determinados. No entanto, os resultados de DLS são frequentemente enviesados para partículas maiores e as populações de partículas devem diferir por um fator de pelo menos três para serem resolvidas. Portanto, DLS por si só não é suficiente para analisar complexos de proteínas.

[005] A alta polidispersidade de muitas amostras agregadas requer métodos baseados em separação para prover informações mais detalhadas devido à ampla faixa de tamanho dos complexos de proteínas. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é atualmente a técnica cromatográfica mais comumente usada para a separação de proteínas (Brusotti, et al., Chromatographia, 81:3-23 (2018)). Na SEC, a separação ocorre de acordo com o volume hidrodinâmico ou tamanho das moléculas. As moléculas menores são retidas por mais tempo porque são capazes de se difundir nos poros da fase estacionária, enquanto as moléculas maiores eluem primeiro, porque são excluídas dos poros. No entanto, SEC é limitado por limites superiores de exclusão de peso molecular, adsorção de amostra à fase estacionária, degradação por cisalhamento em altas pressões e taxas de fluxo e uma incapacidade de separar analitos com base na composição.

[006] O fracionamento de fluxo por campo e fluxo (FFF) é uma alternativa promissora para SEC quando se trata de separação de grandes proteínas e polímeros de alta massa molar. A separação de amostras FFF usa um método de separação e fracionamento assistido por fluxo em que os analitos são separados ao longo de uma faixa como canal por diferenças em seus coeficientes de difusão (Fraunhofer, W. e Winter, G., EUR. J. Pharm.

3 / 46 Biopharm, 58:369-383 (2004)). O FFF pode separar analitos em uma ampla faixa de tamanho (de nanômetros a mícrons). O canal aberto de FFF renderiza perda de amostra reduzida, baixas pressões e baixas taxas de cisalhamento. Embora o FFF tenha sido usado em combinação com outras técnicas moleculares, como dispersão de luz para detectar agregados de proteínas, ainda há uma necessidade crescente de caracterizar mais completamente a heterogeneidade e a conformação de complexos de proteínas, incluindo mAb e complexos de ligantes solúveis.

[007] Portanto, é um objetivo da invenção prover métodos para identificar medicamentos de proteína que têm a capacidade de formar grandes complexos de proteínas.

[008] É outro objetivo da invenção prover métodos de identificação e caracterização de medicamentos de proteínas e complexos de ligantes solúveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Métodos para caracterizar complexos de proteínas em uma amostra são providos. Uma modalidade provê um método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteína em uma amostra por fracionamento da amostra por fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (A4F) e determinação da massa molar, estequiometria e distribuição de tamanho dos complexos de proteína na amostra usando o Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS). Em algumas modalidades, os complexos de proteínas contêm um anticorpo ou proteína de fusão ligada ao seu ligante. O ligante é tipicamente um ligante solúvel. O ligante pode ser monomérico ou multimérico. Em uma modalidade, o ligante pode ser um homodímero ou heterodímero. Em outra modalidade, os complexos de proteínas compreendem ou consistem em complexos de anticorpo:ligante ou complexos de proteína de fusão:ligante.

[0010] Outra modalidade provê um método para selecionar um

4 / 46 medicamento de proteína principal adicionando um primeiro medicamento de proteína ao seu alvo ou ligante para produzir complexos de proteína:ligante e adicionar um segundo medicamento de proteína ao primeiro complexo de medicamento de proteína:ligante para formar múltiplos complexos de proteína:ligante. O método inclui separar os complexos de proteína:ligante e determinar a massa molar, estequiometria e distribuição de tamanho dos complexos de proteína:ligante usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico - MALLS. O método também inclui a seleção do medicamento de proteína que forma menos complexos de proteínas grandes:ligante como o medicamento de proteína alvo principal. Normalmente, o medicamento de proteína é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma proteína de fusão ou uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante solúvel. O ligante pode ser monomérico ou multimérico. Em algumas modalidades, os grandes complexos de proteínas são heterométricos.

[0011] Outra modalidade provê uma composição farmacêutica contendo o medicamento de proteína principal selecionado usando o método descrito acima.

[0012] Em algumas modalidades, os métodos descritos podem ser usados para determinar se dois anticorpos individuais direcionados ao mesmo ligante formarão grandes complexos heterogêneos.

[0013] Ainda outra modalidade provê um método para caracterizar complexos de proteínas formados entre medicamentos de proteína e ligantes solúveis, preparando uma amostra contendo o medicamento de proteína e seu ligante para produzir complexos de medicamento de proteína:ligante. O método inclui o fracionamento dos complexos de proteína:ligante e análise dos complexos de proteína fracionada:ligante por Espalhamento de Luz a Laser Multiangular para determinar a massa molar e a heterogeneidade dos complexos de proteínas. Em uma modalidade, o fracionamento da proteína

5 / 46 total é realizado por fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico. A concentração da proteína é determinada com UV/Vis.

[0014] As diferenças na conformação de complexos de proteína formados por diferentes medicamentos de proteína para o mesmo ligante podem ser determinadas comparando o perfil de eluição/tempo de complexos de medicamento de proteína:ligante formados por diferentes medicamentos de proteína. Perfis/tempos de eluição diferentes de complexos com a mesma massa molar indicam que os complexos podem ter conformações ou formatos diferentes. Em uma modalidade, cada medicamento de proteína e o mesmo ligante solúvel são analisados separadamente a fim de calcular uma massa molar para cada componente individual, em que a massa molar de cada componente é usada para determinar a estequiometria estimada dos referidos componentes em cada complexo de proteína.

[0015] Outra modalidade provê um método para caracterizar complexos de proteínas formados entre medicamentos de proteína e ligantes solúveis por fracionamento de complexos de medicamento de proteína:ligante usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico, analisando o complexos de medicamento de proteína:ligante fracionados por Espalhamento de Luz a Laser Multiangular para caracterizar a massa molar, estequiometria ou ambos dos complexos de proteína:ligante e determinar a heterogeneidade dos complexos de proteína, comparando o tamanho de cada complexo de proteína com o tamanho estimado de cada componente individual para determinar os componentes que compõem cada complexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Figura 1A é uma ilustração de um complexo formado entre um anticorpo e um ligante. A Figura 1B é uma ilustração de um complexo formado entre um anticorpo e dois ligantes. A Figura 1C é uma ilustração de um complexo formado entre quatro anticorpos e cinco ligantes, representativo de “bonecos de papel”.

6 / 46

[0017] As Figuras 2A-2B são uma ilustração de um complexo formado entre o anticorpo 1 (preto), dois ligantes e o anticorpo 2 (cinza) em uma conformação não linear. As Figuras 2C-2D são uma ilustração de um complexo formado entre o anticorpo 1 (preto), dois ligantes e o anticorpo 2 (cinza) em uma conformação linear.

[0018] A Figura 3A é um cromatograma da análise SEC-MALLS de Ab1, Proteína X e combinações de Ab1 e Proteína X em razões molares de 5:1, 1:1 e 1:5. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa a absorbância a 280 nm (AU). A Figura 3B é um fractograma de análise de fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico -MALLS (A4F- MALLS) de combinações de Ab1 e Ab2 em razões molares de 5:1, 1:1 e 1:5. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol). O eixo Y direito representa a absorbância a 215 nm (AU).

[0019] A Figura 4A é um fractograma da análise de A4F-MALLS do composto principal A (Principal A), Principal A + Proteína Y (1:3) e Composto principal B (Principal B) + Proteína Y (1:3). A Figura 4B é um fractograma da análise A4F-MALLS de Principal A, Principal A + Proteína Y (1:1) e Principal B + Proteína Y (1:1). A Figura 4C é um fractograma da análise A4F-MALLS de Principal A, Principal A + Proteína Y (3:1) e Principal B + Proteína Y (3:1). O eixo X representa o tempo (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0020] As Figuras 5A e 5B são gráficos de linha do título de anticorpo anti-humano de camundongo de complexos anti-Proteína Y com Principal A (Figura 5A) e Principal B (Figura 5B). O eixo X representa o tempo (dias) e o eixo Y representa a concentração (µg/ml).

[0021] As Figuras 6A e 6B são gráficos de linha que mostram a

7 / 46 hemólise percentual de glóbulos vermelhos de coelho com concentrações crescentes de vários mAbs anti-Proteína Z (Figura 6A) ou combinações de Ab3 e vários mAbs anti-Proteína Z (Figura 6B). O eixo X representa a concentração de mAb (Log [M]). O eixo Y representa a porcentagem de hemólise.

[0022] A Figura 7 é um fractograma da análise de A4F-MALLS de mAb1 anti-Proteína Z livre, Proteína Z e 1µM:1µ combinação M de mAb1 anti-Proteína Z e Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0023] A Figura 8 é um fractograma da análise A4F-MALLS de mAb Livre, 1µM:1µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z e Proteína Z, 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z, mAb5 anti- Proteína Z e Proteína Z e 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb1 anti- Proteína Z, mAb7 anti-Proteína Z e Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0024] A Figura 9 é um fractograma da análise A4F-MALLS da combinação de mAb Livre, 1µM:1µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z e Proteína Z, 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de anti-Proteína Z mAb1, combinação anti-Proteína Z mAb3 e Proteína Z e 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de anti-Proteína Z mAb1, combinação anti-Proteína Z mAb6 e Proteína Z e 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb6 anti-Proteína Z, mAb7 anti-Proteína Z e Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0025] A Figura 10 é um fractograma da análise A4F-MALLS da combinação de mAb livre, 1µM:1µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z e Proteína Z, 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z, mAb2

8 / 46 anti-Proteína Z e Proteína Z e 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z, mAb COMP1 e Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0026] A Figura 11 é um fractograma da análise A4F-MALLS da combinação mAb Livre, 1µM:1µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z e Proteína Z, 0,5µM:0,5µM:1 µM combinação de mAb1 anti-Proteína Z, mAb4 anti-Proteína Z e Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0027] As Figuras 12A e 12B são fractogramas da análise de A4F- MALLS de adição simultânea (Figura 12A) ou adição sequencial (Figura 12B) de 0,3µM:1µM:1µM anti-Proteína Z mAb1: mAb COMP1: Proteína Z, 1µM:1µM:1µM anti-Proteína Z mAb1: mAb COMP1: Proteína Z e 3µM:1µM:1µM anti-Proteína Z mAb1: mAb COMP1: Proteína Z. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0028] A Figura 13 é um fractograma da análise de A4F-MALLS de um mAb representativo, Proteína W e combinações de mAb e Proteína W em razões de 1µM:1µM. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0029] A Figura 14 é um fractograma da análise de A4F-MALLS de um mAb representativo, Proteína W e combinações de mAb2 e Proteína W, mAb3 e Proteína W, e COMP1 e Proteína W em razões de 1µM:1µM. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

9 / 46

[0030] A Figura 15 é um fractograma da análise A4F-MALLS de COMP2, Proteína W e combinações de COMP2 e Proteína W em razões de 1µM:1µM. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

[0031] A Figura 16 é um fractograma da análise de A4F-MALLS de um mAb representativo, Proteína W e combinações de mAb4 e Proteína W e COMP3 e Proteína W em razões de 1µM:1µM. O eixo X representa o tempo de eluição (minutos). O eixo Y esquerdo representa a massa molar (g/mol) e o eixo Y direito representa absorbância a 215 nm (AU).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0032] Deve ser apreciado que essa descrição não está limitada às composições e métodos descritos nesse documento, bem como às condições experimentais descritas, pois tais podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada nesse documento tem a finalidade de descrever certas modalidades apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente descrição será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0033] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual essa descrição pertence. Embora quaisquer composições, métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos nesse documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações mencionadas são incorporadas nesse documento por referência em sua totalidade.

[0034] O uso dos termos “um”, “uma”, “o(a)” e similares, no contexto de descrever a invenção atualmente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) deve ser interpretado para cobrir tanto o singular quanto o

10 / 46 plural, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou claramente contraditório pelo contexto.

[0035] A recitação de intervalos de valores nesse documento destina- se apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma nesse documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado nesse documento.

[0036] O uso do termo “cerca de” destina-se a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em um intervalo de aprox. +/- 10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aprox. +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor ou acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aprox. +/- 2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor ou acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aproximadamente + +/- 1%. Os intervalos anteriores se destinam a tornar-se claros através do contexto, e nenhuma outra limitação é implícita. Todos os métodos descritos nesse documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou de outra forma contradito de forma clara pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, “tal como”) apresentada nesse documento é meramente para esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[0037] “Proteína” refere-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos um ao outro por uma ligação peptídica. A proteína inclui polipeptídeos e peptídeos e também pode incluir modificações tais como glicosilação, fixação lipídica, sulfatação, gama-

11 / 46 carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilacilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo fármacos à base de proteína, e proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quimérica ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes usando métodos de cultura de células bem conhecidos e geralmente são introduzidas na célula por técnicas de engenharia genética (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica, ou uma sequência otimizada por códon, uma sequência sem intron, etc.) onde pode residir como um epissoma ou ser integrada no genoma da célula.

[0038] “Anticorpo” se refere a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve possui um domínio variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo “anticorpo” inclui referência a ambas as imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo “anticorpo” inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina

12 / 46 heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Os anticorpos biespecíficos são geralmente descritos na Patente dos EUA No

8.586.713, que é incorporada por referência nesse pedido.

[0039] “Proteínas de fusão Fc” compreendem parte ou todas as duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não são encontradas juntos na natureza. A preparação de proteínas de fusão compreendendo certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; e Hollenbaugh et al., “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. “Proteínas de fusão de receptor Fc” compreendem um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de articulação seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc compreende duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um ou mais ligante(s). Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é um Trap, como, por exemplo, um Trap de IL-1 ou Trap de VEGF.

[0040] Como usado nesse documento, “ligante solúvel” refere-se a ligantes polares ou carregados que não podem cruzar facilmente a membrana plasmática de uma célula. A maioria dos ligantes solúveis se ligam aos domínios extracelulares dos receptores da superfície celular.

[0041] “A4F” representa o fracionamento assimétrico do campo- fluxo, que é uma técnica de fracionamento na qual a separação dos analitos é obtida através da interação da amostra com um campo físico externo perpendicular.

[0042] O Espalhamento de Luz Multiangular (MALS) descreve uma técnica para medir a luz espalhada por uma amostra em uma pluralidade de

13 / 46 ângulos. É usado para determinar a massa molar absoluta e o tamanho médio das moléculas em solução, detectando como elas espalham a luz. A luz colimada de uma fonte de laser é mais frequentemente usada, caso em que a técnica pode ser referida como Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS). Na prática, os termos MALS e MALLS são usados de forma intercambiável.

[0043] Como usado nesse documento, “movimento Browniano” se refere ao movimento contínuo de partículas suspensas em líquido. II. Métodos para Caracterizar Complexos de Proteínas

[0044] A terapia de combinação de anticorpos monoclonais surgiu como uma estratégia terapêutica promissora para doenças como câncer e condições inflamatórias nas quais várias vias de sinalização estão envolvidas. Além disso, a administração de mais de um anticorpo monoclonal direcionado à mesma via pode ser benéfica para bloquear completamente as vias envolvidas na patogênese de doenças quando a monoterapia por si só não inibe totalmente a via. No entanto, a ligação de mAbs terapêuticos a alvos multiméricos solúveis pode levar à formação de grandes complexos heterogêneos. O tamanho, a forma e a conformação de um complexo proteico podem afetar a imunogenicidade e o tempo de depuração do anticorpo, entre outros fatores. A análise de complexos de proteínas é importante para prover informações sobre a farmacocinética de um mAb durante o desenvolvimento do medicamento.

[0045] Portanto, métodos e sistemas para caracterizar complexos de proteínas são providos. Uma modalidade provê um método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho dos complexos de medicamento de proteína:ligante heterogêneos em uma amostra por fracionamento da amostra usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico e determinação da massa molar, estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteínas heterogêneos no amostra usando o Espalhamento de Luz a Laser

14 / 46 Multiangular. Os complexos de proteínas normalmente são compostos por uma proteína que se liga especificamente a uma proteína de interesse também referida como um alvo ou ligante. Em uma modalidade, a proteína que se liga especificamente ao alvo é um anticorpo ou proteína de fusão.

[0046] Quando um anticorpo ou proteína de fusão é combinado com seu alvo ou ligante in vivo ou in vitro, pode-se formar uma mistura heterogênea de anticorpo:ligante ou proteína de fusão:ligante. Em uma modalidade, a ligação de proteínas terapêuticas, tais como anticorpos monoclonais (mAbs) ou proteínas de fusão a alvos multiméricos solúveis levam a grandes complexos heterogêneos ou grandes complexos heteroméricos. Por exemplo, os grandes complexos de proteínas podem ser distinguidos como um complexo de proteínas com uma razão proteína:ligante selecionada a partir do grupo que consiste em 3:2, 2:3, 4:4, 6:6 ou [2:2]n. Grandes complexos heterogêneos referem-se a complexos formados entre várias moléculas de ligante multimérico e várias moléculas de medicamento de proteína. O termo complexo heteromérico grande refere-se ao ligante ligado por dois produtos de proteína diferentes, por exemplo, dois anticorpos diferentes, duas proteínas de fusão diferentes ou um anticorpo e uma proteína de fusão que se ligam ao mesmo ligante em locais diferentes.

[0047] Outra modalidade provê um método de identificação de medicamentos de proteína que formam grandes complexos heterogêneos com alvos solúveis in vivo, in vitro ou ambos. O método inclui a preparação de uma amostra contendo um medicamento de proteína e seu ligante solúvel para produzir complexos de medicamento de proteína:ligante, fracionamento da amostra para separar os complexos de medicamento de proteína:ligante e análise dos complexos de medicamento de proteína:ligante fracionados por Espalhamento de Luz a Laser Multiangular para determinar o tamanho e heterogeneidade dos complexos de proteínas. Em uma modalidade, a amostra de proteína é fracionada usando fracionamento de fluxo de campo-fluxo

15 / 46 assimétrico.

[0048] Mais detalhes dos métodos e sistemas descritos são providos abaixo. A. Sistema para Caracterizar Complexos de Proteínas

[0049] Em uma modalidade, o sistema inclui um sistema de fracionamento de fluxo de campo e fluxo assimétrico (A4F) e um sistema de Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS). Um exemplo de sistema A4F disponível comercialmente é um Sistema de Separação Eclipse™ 3+ A4F. Um exemplo de sistema MALLS disponível comercialmente é o instrumento de dispersão de luz laser Wyatt Technology Dawn HELEOS® II. O sistema normalmente inclui um detector de UV/VIS e/ou um detector de índice de refração. Um detector de UV/VIS exemplar disponível comercialmente é o detector de UV Agilent 1260 Infinity. Um detector de índice de refração exemplar disponível comercialmente é o detector de índice de refração Optilab® T-rEX. Em uma modalidade, o sistema A4F inclui um canal curto A4F equipado com um espaçador de 350 W e uma membrana hidrofílica PES (PESH) MWCO NADIR® de 4 kDa. Em outra modalidade, o canal curto A4F é equipado com um espaçador de 490 W e uma membrana de celulose regenerada de 10 kDa MWCO Nadir®. Fases móveis exemplares incluem fosfato 10 mM e NaCl 500 mM a pH 7,0. No entanto, uma vantagem do A4F sobre a separação por cromatografia em coluna é que não há limitações no tipo de fase móvel ou fluido transportador que pode ser usado. Em uma modalidade, as amostras são separadas usando um gradiente linear ao longo de 60 minutos. Em uma modalidade, o fluxo de canal e o programa de fluxo cruzado são especificamente otimizados para atingir uma resolução desejada em uma base caso a caso. Deve ser entendido que uma pessoa versada na técnica poderia modificar e otimizar o perfil de eluição de acordo com a resolução exigida da amostra específica sendo separada usando A4F.

16 / 46

[0050] Normalmente, a amostra é injetada na porta de entrada de amostra do canal A4F. A amostra é então focada, permitindo que o fluido transportador flua para o canal de ambas as portas de entrada e saída, encontrando-se em um ponto no canal, normalmente perto da porta de entrada da amostra, para formar uma zona de foco. Durante o período de foco, as partículas da amostra injetada são mantidas nessa zona de foco para permitir o relaxamento antes do fracionamento. A etapa final é o fracionamento das partículas. Conforme as partículas fluem ao longo do canal, o campo de separação de fluxo cruzado perpendicularmente oposto empurra as moléculas em direção ao fundo do canal. À medida que se acumulam próximo ao fundo do canal, elas sofrem uma difusão de contra-ação de volta para o canal contra o campo de fluxo cruzado. A extensão na qual as moléculas podem se difundir de volta para o canal é ditada por seu movimento Browniano natural, uma característica definida pelo coeficiente de difusão translacional, que, por sua vez, está relacionado ao tamanho e forma exclusivos de cada espécie individual. Geralmente, as partículas menores têm um coeficiente de difusão mais rápido do que as maiores e são capazes de se difundir mais alto no canal contra o campo de fluxo cruzado. A taxa de fluxo laminar dentro do canal não é uniforme. Ele viaja em um padrão parabólico com a velocidade do fluxo aumentando em direção ao centro do canal e diminuindo em direção às paredes superior e inferior do canal. Portanto, a taxa na qual as partículas serão transportadas dependerá de sua posição dentro do canal. Aqueles com difusão mais rápida, localizados próximos ao centro do canal, serão transportados com maior velocidade. As partículas maiores no fluxo raso e mais lento perto da parede de acumulação inferior do canal são transportadas com velocidade de fluxo mais baixa e eluem mais tarde do que as partículas menores. Isso resulta em uma separação suave de partículas com base na massa com a ordem de eluição do menor para o maior.

[0051] Conforme a amostra flui através do canal A4F, a porção

17 / 46 principal da amostra sai do canal através de uma porta de saída. O detector de Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS) está em comunicação fluida com o sistema A4F e recebe amostra da porta de saída A4F. Em algumas modalidades, a amostra flui primeiro através de um detector de UV/VIS para medir a concentração da amostra em função da absorbância. O sistema MALLS focaliza um feixe de luz polarizada (ou laser) na molécula da amostra e a luz espalhada é detectada com um fotodetector.

[0052] O Espalhamento de Luz Multiangular (MALS) mede a luz sendo espalhada de uma amostra contendo moléculas, partículas ou complexos de proteínas. Esse espalhamento depende da configuração óptica da configuração e, em uma realização experimental típica, a luz é então detectada em um ou vários ângulos diferentes. Na solução de um ângulo de espalhamento, os três projetos mais populares são 90 graus (também espalhamento de luz em ângulo reto ou RALS), 7 graus (também espalhamento de luz em baixo ângulo ou LALS) ou 173 graus (também espalhamento de volta não invasivo ou NIBS). Na configuração de vários ângulos, há, em princípio, aqueles em que os ângulos são fixos (isso é mais frequentemente chamado de configuração MALS ou MALLS) e aqueles em que os ângulos são variáveis (normalmente referido como um goniômetro de dispersão de luz ou espectrômetro). MALS geralmente se refere a um sistema com múltiplos ângulos fixos usados como parte de uma configuração de separação de partículas, por exemplo, A4F. A aplicação mais difundida do MALS é como um detector de massa molar absoluta em conjunto com um detector de concentração (como RI ou UV de comprimento de onda único).

[0053] O MALS pode ser usado para medir: MW - massa molar média ponderada de um complexo de proteínas; Rg - raio médio do complexo proteico; e A2 - solubilidade da proteína em solução. B. Métodos de Caracterização de Complexos de Proteínas

[0054] Os sistemas e métodos descritos podem ser usados para

18 / 46 caracterizar complexos de proteína, por exemplo, complexos de medicamento de proteína:ligante em uma amostra. Uma modalidade provê um método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteína heterogêneos em uma amostra, fracionando a amostra por fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (A4F) e determinando a massa molar, estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteínas na amostra usando o Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS), em que os complexos compreendem ou consistem em complexos de anticorpo:ligante ou complexos de proteína de fusão:ligante. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante solúvel. Normalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade, o complexo de proteína é distinguido pela sua razão de anticorpo ou proteína de fusão sobre ligante. Em um exemplo não limitativo, a razão de anticorpo ou proteína de fusão sobre ligante pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em 1:0, 0:1,1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, ou [2:2]n. Deve ser entendido que a razão de anticorpo ou proteína de fusão sobre ligante será dependente do anticorpo específico ou proteína de fusão e ligante que estão sendo testados.

1. Misturas de Complexos de Proteínas

[0055] Para determinar as características dos complexos de proteínas, uma massa molar pode ser determinada experimentalmente para cada componente do complexo para calcular uma massa molar esperada de complexos com estequiometrias variáveis. Em uma modalidade, cada proteína e ligante na mistura são analisados separadamente para determinar uma massa molar para cada componente. Em uma modalidade, um medicamento de proteína e seu ligante são misturados para formar complexos de medicamento de proteína:ligante e os complexos são então distinguidos. Os medicamentos de proteína fracionada:ligantes são submetidos a A4F-MALLS para determinar a massa molar dos complexos. Os valores calculados dos complexos fracionados são então comparados com as massas molares

19 / 46 determinadas experimentalmente dos componentes individuais para determinar a provável razão estequiométrica dos componentes individuais presentes em cada complexo. Em uma modalidade, os métodos podem detectar um complexo de medicamento de proteína:ligante de 1:1. Em outra modalidade, os métodos podem detectar qualquer razão de medicamento de proteína:ligante. Em um exemplo não limitante, os métodos podem detectar um complexo de medicamento de proteína:ligante de 1:0, 0:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:2, 2: 3, 4:4, 6:6 ou [2:2]n. Deve ser entendido que a razão de anticorpo ou proteína de fusão sobre ligante será dependente do anticorpo específico ou proteína de fusão e ligante que estão sendo testados. Em algumas modalidades, o complexo contém vários medicamentos de proteína diferentes complexados com um ligante solúvel comum. a. Ligantes

[0056] O ligante no complexo de medicamento de proteína:ligante pode ser um ligante monomérico ou multimérico. Em uma modalidade, o ligante é um ligante solúvel. Em algumas modalidades, os ligantes solúveis correspondem às porções extracelulares de proteínas transmembrana, incluindo, mas não se limitando a proteínas receptoras transmembrana.

[0057] Os ligantes monoméricos contêm apenas uma proteína ou uma unidade de proteína. Os ligantes multiméricos podem ser, por exemplo, diméricos, triméricos, etc., contendo várias proteínas ou subunidades de proteínas. Por exemplo, os ligantes podem ser homodímeros ou heterodímeros. Em algumas modalidades, os ligantes multiméricos se ligam a mais de uma molécula de um medicamento proteico. A Figura 1A mostra um exemplo de complexo anticorpo:ligante de 1:1. A Figura 1B mostra um exemplo de complexo de anticorpo:ligante de 1:2, e a Figura 1C mostra um exemplo do efeito de “bonecos de papel” em que cada braço de um anticorpo interno se liga a um ligante diferente criando um grande complexo heterogêneo.

20 / 46

[0058] Em uma modalidade, o grande e heterogêneo complexo de medicamento de proteína:ligante tem um tamanho de 500 kDa ou mais. Em outra modalidade, o complexo de medicamento de proteína:ligante heterogêneo tem um tamanho de 500-4000 kDa. Em outra modalidade, o grande e heterogêneo medicamento de proteína:ligante tem uma razão de medicamento de proteína:ligante de 3:2, 2:3, 4:4 ou 6:6.

[0059] Em uma modalidade, os métodos descritos são usados para determinar se um medicamento de proteína principal projetado para direcionar um ligante multimérico formará grandes complexos de medicamento de proteína:ligante heterogêneos.

[0060] Em uma modalidade, os métodos descritos podem ser usados para determinar se um ligante multimérico formará complexos com mais de um medicamento de proteína ou proteína de fusão. Os complexos que podem ser formados incluem, mas não estão limitados a razões de proteína:ligante de 1:0, 0:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, ou [2:2]n. As Figuras 1A-1C ilustram complexos exemplares que podem ser formados entre um ligante multimérico e um anticorpo monoclonal. b. Combinação de Vários mAbs

[0061] A terapia combinada usando vários medicamentos de proteína para atingir a mesma via ou o mesmo ligante está crescendo em popularidade. Em algumas modalidades, os métodos descritos podem ser usados para distinguir entre diferentes combinações de anticorpos direcionados ao mesmo ligante com base na estequiometria e distribuições de tamanho de complexos de proteínas formados pelos medicamentos de proteína. Quando dois medicamentos de proteína são misturados com um ligante monomérico, os medicamentos de proteína têm o potencial de formar um complexo heteromérico. Um complexo heteromérico, conforme definido nesse documento, refere-se a dois medicamentos de proteína diferentes que se ligam à mesma molécula alvo. Além disso, cada um dos dois braços do mesmo

21 / 46 anticorpo tem a capacidade de se ligar a dois ligantes que também podem ser ligados por um segundo anticorpo para formar um complexo heteromérico. As Figuras 2A-2D mostram complexos heteroméricos representativos. As Figuras 2A e 2C mostram complexos formados quando um medicamento de proteína (preto), ou anticorpo, se liga a dois ligantes e um dos ligantes também é ligado por um segundo medicamento de proteína único (cinza). Se a proteína cinza for ligada por outro ligante que é então ligado pela proteína preta, complexos maiores e mais heterogêneos podem se formar, como representado nas Figuras 2B e 2D.

2. Seleção de Produto de Proteína Principal

[0062] Outra modalidade provê um método para selecionar um medicamento de proteína principal adicionando um primeiro medicamento de proteína a uma primeira amostra compreendendo um alvo do primeiro medicamento de proteína para produzir complexos heterogêneos de proteína:ligante e adicionando um segundo medicamento de proteína a uma segunda amostra contendo o alvo para formar complexos de proteína:ligante. O método inclui separar os complexos heterogêneos de proteína:ligante e determinar a distribuição de tamanho e estequiometria de complexos heterogêneos de proteína:ligante usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico - Espalhamento de Luz a Laser Multiangular. Os métodos também incluem a seleção do medicamento de proteína que forma menos complexos heterogêneos de proteína:ligante como o medicamento de proteína alvo principal. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante solúvel. O ligante solúvel pode ser um ligante monomérico ou um ligante multimérico. Normalmente, o medicamento de proteína é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma proteína de fusão ou uma proteína recombinante. O complexo de proteína pode ser distinguido como um complexo de proteína com uma razão de anticorpo ou proteína de fusão sobre ligante selecionada a partir do grupo que consiste em, mas não limitado a 1:0,

22 / 46 0:1,1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, ou [2:2]n. Outra modalidade provê uma composição farmacêutica contendo o medicamento de proteína principal selecionado usando o método acima.

3. Determinando o Tamanho e a Forma dos Complexos de Proteínas

[0063] Em uma modalidade, os métodos descritos podem ser usados para determinar o tamanho dos complexos de proteínas. Uma mistura de produtos farmacêuticos de proteína e, opcionalmente, ligantes solúveis, são separados usando um fracionamento A4F. O tamanho e a estequiometria dos complexos de proteína podem então ser determinados usando a análise MALLS. Na análise MALLS, um feixe de luz polarizada (ou um laser) é focado na molécula da amostra e a luz espalhada é detectada com um fotodetector. A luz espalhada é detectada em vários ângulos diferentes simultaneamente. A intensidade da luz espalhada em cada ângulo é proporcional à massa molar do complexo. Em uma modalidade, a espectrometria UV/Vis é usada para determinar a concentração de cada complexo de proteína.

[0064] Em outra modalidade, a forma/conformação de um complexo de proteína formado entre diferentes medicamentos de proteína para um ligante comum pode ser distinguida usando os métodos descritos. As diferenças no tempo de eluição ou no perfil de eluição entre complexos com a mesma massa molar sugerem diferenças na forma ou conformação dos complexos de proteínas. Complexos com a mesma massa molar ou semelhante, mas com tempos de eluição diferentes, indicam que o complexo com o tempo de eluição mais lento tem um volume hidrodinâmico aumentado devido a uma diferença na forma ou conformação do complexo.

[0065] A massa molar e a heterogeneidade de tamanho dos complexos de proteínas podem ser usados para prever a depuração do produto proteico. Em uma modalidade, quanto maior o complexo de proteína, mais rápido o medicamento de proteína é eliminado do corpo.

23 / 46 C. Proteínas nos Complexos de Proteínas

[0066] Em uma modalidade, uma das proteínas no complexo de proteínas é um medicamento de proteína ou é uma proteína de interesse adequada para expressão em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, a proteína nos complexos de proteína pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um ScFv ou fragmento do mesmo, uma proteína de fusão Fc ou fragmento do mesmo, um fator de crescimento ou um fragmento do mesmo, uma citocina ou um fragmento do mesmo, ou um domínio extracelular de um receptor de superfície celular ou um fragmento do mesmo. As proteínas nos complexos podem ser polipeptídeos simples que consistem em uma única subunidade, ou proteínas complexas com várias subunidades compreendendo duas ou mais subunidades. A proteína de interesse pode ser um produto biofarmacêutico, aditivo alimentar ou conservante, ou qualquer produto proteico sujeito a padrões de purificação e qualidade.

[0067] Em algumas modalidades, a proteína nos complexos de proteínas é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, uma molécula de imunoglobulina G tetravalente específica dupla, denominada imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-IG), um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma dobradiça quimérica. Em ainda outras modalidades, o

24 / 46 anticorpo compreende um Fc quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG1/IgG4.

[0068] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-morte celular programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1, conforme descrito no pedido de publicação dos EUA No US2015/0203579A1), um ligante-1 anti-morte celular programada (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA No US2015/0203580A1), um anticorpo anti-Dll4, um anticorpo anti-Angiopoetina-2 (por exemplo, um anticorpo anti-ANG2 conforme descrito na Patente dos EUA No 9.402.898), um anticorpo anti- Angiopoetina-Semelhante 3 (por exemplo, um anticorpo anti-AngPtl3 como descrito na Patente dos EUA No 9.018.356), um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, um anticorpo anti- PDGFR como descrito na Patente dos EUA No 9.265.827), um anticorpo anti- Erb3, um anticorpo anti-receptor de prolactina (por exemplo, anticorpo anti- PRLR como descrito na Patente dos EUA No 9.302.015), um anticorpo anti- complemento 5 (por exemplo, um anticorpo anti-C5 conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA No US2015/0313194A1), um anticorpo anti- TNF, um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, um anticorpo anti-EGFR conforme descrito na Pat. dos EUA No

9.132.192 ou um anticorpo anti-EGFRvIII como descrito na Patente dos EUA No US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Proproteína Convertase Subtilisina Kexin-9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 conforme descrito na Patente dos EUA No 8.062.640 ou Patente dos EUA No

9.540.449), um anticorpo de Fator-8 Anti-Crescimento e Diferenciação (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8, também conhecido como anticorpo anti- miostatina, conforme descrito nas Patentes dos EUA No 8.871.209 ou

25 / 46

9.260.515), um receptor anti-glucagon (por exemplo, anticorpo anti-GCGR como descrito no Pedido de Patente dos EUA No US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-IL1R, um anticorpo receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R como descrito no Pedido de Patente dos EUA No US2014/0271681A1 ou Patentes dos EUA No 8.735.095 ou 8.945.559), um anticorpo anti-receptor de interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti-IL6R como descrito nas Patentes dos EUA No 7.582.298, 8.043.617 ou 9.173.880), um anticorpo anti- IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti-IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL5, um anticorpo anti-IL6, um anticorpo anti-IL7, um anti- interleucina 33 (por exemplo, o anticorpo anti-IL33 conforme descrito na Pat. dos EUA No 9.453.072 ou 9.637.535), um anticorpo anti-vírus sincicial respiratório (por exemplo, anticorpo anti-RSV como descrito no pedido de patente dos EUA No 9.447.173), um anti-Cluster de diferenciação 3 (por exemplo, um anticorpo anti-CD3, como descrito nas Patentes dos EUA No

9.447.173 e 9.447.173, e no Pedido dos EUA No 62/222.605), um anti- Cluster de diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como descrito nas Patentes dos EUA No 9.657.102 dos EUA No US20150266966A1, e na Patente dos EUA No 7.879.984), um anticorpo anti- CD19, um anticorpo anti-CD28, um anti-Cluster de diferenciação-48 (por exemplo, anticorpo anti-CD48 como descrito na Pat. dos EUA No 9.228.014), um anticorpo anti-Fel d1 (por exemplo, conforme descrito na Pat. dos EUA No 9.079.948), um vírus anti-Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti-MERS como descrito na Pat dos EUA No US2015/0337029A1), um anticorpo anti-vírus Ebola (por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA No US2016/0215040), um anticorpo anti-vírus Zika, um anticorpo anti-Gene de Ativação de Linfócitos 3 (por exemplo, um anticorpo anti-LAG3 y, ou um anticorpo anti-CD223), um anticorpo anti-fator de crescimento do nervo (por exemplo, um anticorpo anti-

26 / 46 NGF como descrito na Pat. dos EUA No US2016/0017029 e Pat dos EUA No. 8.309.088 e 9.353.176) e um anticorpo anti-Proteína Y. Em algumas modalidades, a proteína biespecífica de ligação a antígeno é selecionada dentre o grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti- CD20 (tal como descrito nas Publicações de Pedido de Patente U.S. Nº US2014/0088295A1 e US20150266966A1), um anticorpo biespecífico anti- CD3 x anti-Mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) e um anticorpo biespecífico anti-CD3 x antígeno de membrana específico anti-próstata (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, ado-trastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, brodalumab, canakinumab, capromab pendetide, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab- kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, ibritumomab tiuxetan, idarucizumab, infliximab, infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secukinumab, siltuximab, tocilizumab, trastuzumab, trevogrumab, ustekinumab e vedolizumab.

[0069] Em algumas modalidades, a proteína nos complexos é uma proteína recombinante que contém uma fração Fc e outro domínio (por exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc receptora, que contém um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc. Em

27 / 46 algumas modalidades, a fração Fc compreende uma região de articulação seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc do receptor contém duas ou mais cadeias receptoras distintas que se ligam a um único ligante ou múltiplos ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma proteína TRAP, tal como, por exemplo, uma trap IL-1 (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação a ligante IL-1RAcP fundida à região extracelular Il-1R1 fundida a Fc de hIgG1; ver Pat. dos EUA Nº 6.927.004, que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade), ou uma trap VEGF (por exemplo, aflibercept ou ziv-aflibercept, que compreende o domínio Ig 2 do receptor de VEGF Flk1 fundido ao domínio Ig 3 do receptor de VEGF Flk1 fundido ao Fc de hIgG1; ver Pat. dos EUA Nº 7.087.411 e 7.279.159). Em outras modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão ScFv-Fc, que contém um ou mais de um ou mais domínios de ligação ao antígeno, como um fragmento de cadeia pesada variável e um fragmento de cadeia leve variável, de um anticorpo acoplado a uma fração Fc.

EXEMPLOS

[0070] Exemplo 1: A análise A4F oferece resolução superior para amostras contendo grandes complexos heterogêneos em comparação com o fracionamento SEC. Métodos Tampão de Fase Móvel SEC-MALLS

[0071] Para a análise SEC-MALLS, a composição do tampão de fase móvel SEC era fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 e filtrada (0,2 μm) antes do uso. Análise SEC-MALLS

[0072] O sistema SEC-MALLS é composto por uma coluna Superose 6 GL (10 mm x 300 mm; GE Healthcare, cat nº 17-5172-01), acoplada a um sistema HPLC Agilent 1200 Series equipado com um detector de matriz de

28 / 46 diodo ultravioleta (UV), Wyatt Technology miniDawn TREOS® instrumento de espalhamento de luz laser (LS) e um detector de refratômetro diferencial (RI) Optilab® T-rEX. Os detectores foram conectados em série na seguinte ordem: UV-LS-RI. Os detectores LS e RI foram calibrados de acordo com as instruções providas pela Wyatt Technology.

[0073] Quantidades definidas de mAb anti-ProteínaX foram combinadas com ProteínaX recombinante e diluídas em 1X DPBS, pH 7,4 para render as seguintes razões molares: mAb anti-ProteínaX 5 μM: mAb anti-ProteínaX 1 μM, mAb anti-ProteínaX 1 μM: ProteínaX 1 μM, e mAb anti-ProteínaX 1 μM: ProteínaX 5 μM. Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e mantidas não filtradas a 4°C antes da injeção na coluna. A coluna foi pré-equilibrada com o tampão de fase móvel (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) a uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min, antes da injeção de cada amostra. Albumina sérica bovina (BSA; 2 mg/mL; carga de amostra de 150 μg) foi injetada separadamente e incluída como um controle de adequação do sistema.

[0074] O tampão de fase móvel SEC-MALLS (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) foi usado ao longo do fracionamento. Cada amostra (100~200 μg) foi injetada e eluída com uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min. O BSA foi fracionado usando as mesmas configurações de parâmetro. Tampão de Fase Móvel A4F-MALLS

[0075] Para a análise SEC-MALLS, a composição do tampão de fase móvel SEC era fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 e filtrada (0,2 μm) antes do uso. A4F-MALLS

[0076] O sistema A4F-MALLS era composto por um Sistema de Separação Eclipse™ 3+ A4F acoplado a um sistema HPLC Agilent 1200 Series equipado com um detector de matriz de diodo ultravioleta (UV),

29 / 46 instrumento de dispersão de luz laser Wyatt Technology Dawn HELEOS® II (LS) e um detector de refratômetro diferencial (RI) Optilab® T-rEX. Os detectores foram conectados em série na seguinte ordem: UV-LS-RI. Os detectores LS e RI foram calibrados de acordo com as instruções providas pela Wyatt Technology.

[0077] Quantidades definidas de mAb anti-ProteínaX foram combinadas com ProteínaX recombinante e diluídas em 1X DPBS, pH 7,4 para render as seguintes razões molares: mAb anti-ProteínaX 5 μM: mAb anti-ProteínaX 1 μM, mAb anti-ProteínaX 1 μM: ProteínaX 1 μM, e mAb anti-ProteínaX 1 μM: ProteínaX 5 μM. Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas e mantidas sem filtrar a 4°C antes da injeção em um canal curto Eclipse™ equipado com uma folha espaçadora W350 (espaçador de 350 μm de espessura, largura de espaçador de 2,2 cm) e usando um Nadir MWCO de 10 kDa membrana de celulose regenerada. O canal foi pré-equilibrado com o tampão de fase móvel (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1), antes da injeção de cada amostra. Albumina sérica bovina (BSA; 2 mg/mL; carga de amostra de 10 μg) foi injetada separadamente e incluída como um controle de adequação do sistema.

[0078] O método de fracionamento consistia em quatro etapas: injeção, foco, eluição e uma etapa de “lavagem” do canal. O tampão de fase móvel A4F-MALLS (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) foi usado ao longo do método de fracionamento. Cada amostra (7 μg) foi injetada a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min por 1 min e posteriormente focada por 2 min com uma taxa de fluxo de foco de 1,5 mL/min. A amostra foi eluída com uma taxa de fluxo de canal de 1,0 mL/min com o fluxo cruzado de gradiente linear de 3,0 mL/min a 0 mL/min ao longo de 45 min. Finalmente, o fluxo cruzado foi mantido a 0 mL/min por mais 5 min para lavar o canal. O BSA foi fracionado usando as mesmas

30 / 46 configurações de parâmetro. Análise de Dados MALLS

[0079] Os dados foram analisados usando o software ASTRA V (versão 5.3.4.14, Wyatt Technology). Os dados foram ajustados à equação que relaciona o excesso de luz espalhada à concentração de soluto e massa molar média em peso, Mw, (Wyatt, 1993; Kendrick, 2001) K *c 1 = + 2 A2c Equação 1: R(θ , c) MwP(θ ) onde c é a concentração de soluto, R(θ, c) é a razão de Raleigh em excesso do soluto em função do ângulo de espalhamento e da concentração, Mw é a massa molar, P (θ) descreve a dependência angular da luz espalhada (~1 para partículas com raio de giração < 50 nm), A2 é o segundo coeficiente virial na expansão da pressão osmótica (que pode ser desprezado, pois as medições são realizadas em soluções diluídas) e 2 4π 2 n02  dn  K* =   Equação 2: N Aλ40  dc  onde no representa o índice de refração do solvente, NA é o número de Avogadro, λ0 é o comprimento de onda da luz incidente no vácuo, e dn/dc representa o incremento do índice de refração específico para o soluto.

[0080] A massa molar do monômero BSA serviu para avaliar as constantes de calibração dos detectores de espalhamento de luz e índice de refração diferencial durante a coleta de dados (verificação de adequação do sistema). O desvio padrão relativo (%RSD) da massa molar média de BSA determinado a partir dos detectores UV e RI foi ≤ 5,0%.

[0081] Os coeficientes de normalização para os detectores de espalhamento de luz, volume de retardo inter-detector e termos de alargamento de banda foram calculados a partir dos cromatogramas BSA coletados para a condição A4F-MALLS empregada. Esses valores foram aplicados aos arquivos de dados coletados para todas as outras amostras para

31 / 46 corrigir esses termos.

[0082] O valor dn/dc e o coeficiente de extinção a 215 nm ou 280 nm (corrigido para glicosilação) foram determinados experimentalmente usando a análise de conjugado de proteína provida no software Astra. O coeficiente de extinção corrigido e o valor dn/dc foram usados para analisar todas as amostras do complexo proteína-proteína. Resultados

[0083] A análise SEC-MALLS das amostras mostrou resolução pobre de complexos de ordem superior (volume de eluição = 8 - 14 mL) e nenhuma distinção de complexos intermediários (Figura 3A, Tabela 1). Em contraste, a análise A4F-MALLS das amostras mostrou resolução superior de complexos de ordem superior (tempo de eluição = ~11 - 30 min) e distinção clara de complexos intermediários (Figura 3B, Tabela 2). Tabela 1. Massa molar aproximada e volume de retenção para complexos de mAb:proteína X. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo Razão Complexos de intacto]2: intacto]1: intacto]1: Amostra Molar Ordem Superior [ProteínaX]1 [ProteínaX]1 [ProteínaX]2 (mol:mol) Complexo Complexo Complexo EV, min Mw, kDa EV, min Mw, kDa EV, min Mw, kDa EV, min Mw, kDa ~390- mAb1:ProteínaX 5:1 9,0-12,6 13,1 331 N/A N/A N/A N/A 1000 ~400- mAb1:ProteínaX 1:1 8,0-13,4 N/A N/A 15,4 167 N/A N/A 3000 ~430- mAb1:ProteínaX 1:5 8,5-13,8 N/A N/A N/A N/A 16,0 216 2000 EV: Volume de Eluição; MW: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min: minutos; kDa: kiloDaltons; Tabela 2. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína X Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo Complexos de Razão intacto]1: intacto]2: intacto]3: intacto]4: Ordem Amostra Molar [ProteínaX]1-2 [ProteínaX]1 [ProteínaX]2 [ProteínaX]3 Superior (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Complexo M , M , M , M , Rt, M w, Rt, min w Rt, min w Rt, min w Rt, min w kDa kDa kDa kDa min kDa 830- mAb1:ProteínaX 5:1 N/A N/A 10,8 321 12,4 498 13,7 674 14,6 1190 780- mAb1:ProteínaX 1:1 N/A N/A 10,7 333 12,5 515 13,7 671 14,6 1620

32 / 46 Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo Complexos de Razão intacto]1: intacto]2: intacto]3: intacto]4: Ordem Amostra Molar [ProteínaX]1-2 [ProteínaX]1 [ProteínaX]2 [ProteínaX]3 Superior (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Complexo M , M , M , M , Rt, M w, Rt, min w Rt, min w Rt, min w Rt, min w kDa kDa kDa kDa min kDa 720- mAb1:ProteínaX 1:5 9,4 191 N/A N/A 11,8 461 13,3 600 14,4 1180 Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min.: minutos; kDa: kiloDaltons; Exemplo 2: Complexos anti-Proteína Y. Métodos Tampão de Fase Móvel A4F MALLS

[0084] 1X DPBS, pH 7,4, foi preparado diluindo 500 mL de 10X DPBS com água de qualidade HPLC até um volume total de 4,9 L. Uma solução de 0,0025% (p/v) de azida de sódio foi adicionada como um agente antimicrobiano. Ácido clorídrico (12 M) foi adicionado lentamente em pequenos incrementos de volume para ajustar o pH a 7,4 antes de trazer o volume final a 5,0 L. O pH final medido do tampão foi 7,4. A solução tampão foi preparada fresca e filtrada (0,2 μm) antes do uso. Análise A4F MALLS

[0085] Quantidades definidas de mAbs anti-Proteína Y (Principal A e Principal B) foram combinadas com Proteína Y humana recombinante e diluídos em 1X DPBS, pH 7,4 para produzir as seguintes razões molares: 1 μM de mAb anti-Proteína Y mAb: 3 μM de hActA, 1 μM anti-Proteína Y mAb: 1 μM de Proteína Y, e 3 μM anti-Proteína Y mAb: 1 μM de Proteína Y. Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas e mantidas sem filtrar a 4°C antes da injeção em um canal curto Eclipse™ equipado com uma folha espaçadora W490 (espaçador de 490 µm de espessura, espaçador de 2,2 cm de largura) e usando uma membrana de celulose regenerada MWCO Nadir de 10 kDa. O canal foi pré-equilibrado com tampão DPBS 1X, pH 7,4, antes da injeção de cada amostra. Albumina sérica bovina (BSA; 2 mg/mL; carga de amostra de 10 μg) foi injetada separadamente e incluída como um controle de adequação do sistema.

33 / 46

[0086] O método de fracionamento consistia em quatro etapas: injeção, foco, eluição e uma etapa de “lavagem” do canal. O tampão de fase móvel A4F-MALLS (1X DPBS, pH 7,4) foi usado ao longo do método de fracionamento. Cada amostra (10 μg) foi injetada a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min por 1 min e posteriormente focada por 2 min com uma taxa de fluxo de foco de 1,5 mL/min. A amostra foi eluída com uma taxa de fluxo de canal de 1,0 mL/min com o fluxo cruzado de gradiente linear de 1,2 mL/min a 0 mL/min ao longo de 20 min. Finalmente, o fluxo cruzado foi mantido a 0 mL/min por mais 5 min para lavar o canal. O BSA foi fracionado usando as mesmas configurações de parâmetro. Título de Anticorpo Anti-Humano de Camundongo

[0087] Os títulos de anticorpo anti-humano de camundongo (MAHA) foram determinados usando um sanduíche ELISA específico para a detecção de mAb A ou mAb B de IgG de camundongo. Resumidamente, mAb A ou mAb B a 1 μg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram adsorvidos passivamente a uma placa de microtitulação durante a noite a 4°C seguido por um bloco de ligação não específica com 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Diluições em série de amostras de soro foram preparadas em tampão de diluição (0,5% BSA em PBS) começando em 1:100. Portanto, o fator de diluição correspondente (100) foi definido como o limite inferior de detecção (LOD) do ensaio. As amostras foram então adicionadas à placa revestida com mAb A ou mAb B (100 μL/poço) e incubadas 16-18 horas a 4°C. Os poços com adição de tampão de diluição apenas foram incluídos para determinar o sinal de fundo. Subsequentemente, o mAb A ou mAb B específico capturado em placa foi detectado usando Fcγ anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) a 40 ng/mL. O substrato cromogênico HRP, 3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) foi usado para detectar a atividade HRP; e a densidade óptica resultante em 450 nm (OD450) foi lida em um leitor de placa multimodo Perkin Elmer Victor X4.

34 / 46 Os dados do sinal de ligação versus fator de diluição foram analisados por regressão não linear usando o software GraphPad Prism e os títulos foram calculados. O título MAHA foi definido como o fator de diluição calculado da amostra de soro correspondendo a um sinal de ligação equivalente a duas vezes o sinal de fundo do ensaio. Resultados

[0088] Os dois mAbs principais formaram complexos distintamente diferentes com a Proteína Y. Em todas as condições testadas, o mAb Principal-A formou complexos menores e menos heterogêneos com a Proteína Y do que o mAb Lead-B (Figuras 4A-4C, Tabelas 3-5). Tabela 3. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Y. Pico 1 Pico 2 Pico 3 [Anticorpo intacto]1: [Anticorpo intacto]2: Razão Molar Complexos de Ordem Amostra [ProteínaY]2 [ProteínaY]3 (mol:mol) Superior Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Principal-A: 1:3 10,1 216 N/A N/A 13,1 ~500-1000 ProteínaY Principal-B: 1:3 10,1 219 12,5 390 14,3 ~550-2000 ProteínaY Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min.: minutos; kDa: kiloDaltons; Tabela 4. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Y. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo Razão Molar intacto]2: Intacto]2-3: intacto]4: Complexos de Amostra (mol:mol) [ProteínaY]1-2 [ProteínaY]3-4 [ProteínaY]3 Ordem Superior Complexo Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Principal-A: ~850- 1:1 11,9 348 13,5 589 N/A N/A 16,5 ProteínaY 1400 Principal-B: ~815- 1:1 N/A N/A 14,0 449 15,3 636 16,4 ProteínaY 2300 Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min.: minutos; kDa: kiloDaltons;

35 / 46 Tabela 5. Massa molar aproximada e tempo de retenção para complexos de mAb:proteína Y. Pico 1 Pico 2 Razão Molar [Anticorpo intacto]2: [ProteínaY]1 Amostra Complexos de Ordem Superior (mol:mol) Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Principal-A: 3:1 11,3 265 13,0 ~400-900 ProteínaY Principal-B: 3:1 11,6 307 12,9 ~480-1600 ProteínaY Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min.: minutos; kDa: kiloDaltons;

[0089] O tamanho e a heterogeneidade dos complexos anti-Proteína Y correlacionaram-se bem com as observações de PK de camundongo (Figuras 5A-5B). Complexos maiores observados para Principal-B com Proteína Y correlacionados com depuração mais rápida (Figura 5B). Exemplo 3: Complexos de Proteína Z anti-humana. Métodos Preparação da Amostra

[0090] As amostras foram preparadas em 1X DPBS, pH 7,4 e incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas antes do fracionamento da proteína total por A4F-MALLS. As amostras foram as seguintes:

[0091] 1 mM anti-Proteína Z mAb1 + mAb secundário (0,5 µM + 0,5 µM) + 1 µProteína Z do complemento M (7 combinações) ou mAb6 anti- Proteína Z 1 mM + mAb7 anti-Proteína Z (0,5 µM + 0,5 µM) + 1 µProteína Z do complemento M. A lista de anticorpos secundários pode ser encontrada na Tabela 6. Tabela 6. Nomenclatura da Amostra. MAbs Secundários Testados Nomenclatura de Combinação com Anti-Proteína Z mAb1 anti-Proteína Z mAb2 Combinação de mAb2 anti-Proteína Z mAb3 Combinação de mAb3 anti-Proteína Z mAb4 Combinação de mAb4 anti-Proteína Z mAb5 Combinação de mAb5 anti-Proteína Z mAb6 Combinação de mAb6 anti-Proteína Z mAb7 Combinação de mAb7 COMP1 mAb Combinação COMP1 Análise A4F MALLS

[0092] Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente

36 / 46 por um total de 2 horas e mantidas sem filtrar a 4°C antes da injeção em um canal curto Eclipse™ equipado com uma folha espaçadora W350 (espaçador de 350 μm de espessura, largura de espaçador de 2,2 cm) e usando um espaçador de 4 kDa Membrana MWCO hidrofílica PES (PESH). O canal foi pré-equilibrado com o tampão de fase móvel (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1), antes da injeção de cada amostra. BSA (2 mg/mL; carga de amostra de 10 μg) foi injetado separadamente e incluído como um controle de adequação do sistema.

[0093] O método de fracionamento consistia em quatro etapas: injeção, foco, eluição e uma etapa de “lavagem” do canal. O tampão de fase móvel A4F-MALLS (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) foi usado ao longo do método de fracionamento. Cada amostra (complexo de 7 μg ou componente individual de 4 μg) foi injetada a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min e focada por 5 min com uma taxa de fluxo de foco de 1 mL/min. A amostra foi eluída com uma taxa de fluxo de canal de 1 mL/min com o fluxo cruzado de gradiente linear de 2 mL/min a 0 mL/min ao longo de 45 min. Finalmente, o fluxo cruzado foi mantido a 0 mL/min por mais 5 min para lavar o canal. O BSA foi fracionado usando as mesmas configurações de parâmetro. Ensaio de Hemólise RBC

[0094] O ensaio de hemólise da via alternativa (AP) foi usado como medida da ativação do complemento para avaliar a capacidade dos mAbs anti- Proteína Z de bloquear a lise de glóbulos vermelhos de coelho (RbRBCs). A lise das hemácias de coelho pelo complexo de ataque à membrana é a base do ensaio pelo qual a ativação do complemento é medida experimentalmente.

[0095] Um número desejado de RbRBCs são lavados em tampão GVB-Mg2+/EGTA e ressuspensos a 2x108 células/ml. Para testar a eficácia de um único mAb anti-C5 ou combinação de mAbs anti-C5, soro humano normal foi diluído para 50-96% em GVB-Mg2+/tampão EGTA para atingir

37 / 46 uma concentração final de 25-48% quando adicionado a RBC. Placas de 96 poços de fundo redondo foram usadas para medir a atividade de hemólise. Um total de 100 µL RbRBCs (2x108 células/ml) foram colocadas em placas de 96 poços a 37oC seguido pela adição de 100 µL de soro diluído. As células foram suavemente misturadas e incubadas a 37°C durante 30-120 minutos. Após o tempo de incubação, as células foram centrifugadas por centrifugação a 1250 xg a 4°C. Um total de 100 µL do sobrenadante foi transferido para uma nova placa de fundo plano 96 e lido a 412 nm em um leitor de microplaca Spectramax. O cálculo da porcentagem de hemólise foi feito conforme descrito a seguir.

[0096] A porcentagem de hemólise foi calculada com os valores de absorbância usando a seguinte equação: Equação 3:

[0097] Nessa equação, “lise de células de fundo” é a DO em A412 nm das células incubadas em GVB-Mg2+/tampão EGTA sem soro. A “lise celular máxima” é a DO em A412nm das células tratadas com água. A inibição máxima de lise foi calculada como uma diferença entre os valores inferior e superior na curva expressa como uma porcentagem do valor superior. Dados representados como erro média + padrão da média. Resultados

[0098] Anti-Proteína Z mAb1 (principal anti-Proteína Z mAb) em combinação com COMP1 mAb ou outros mAbs de Proteína Z bloqueia completamente a hemólise de eritrócitos de coelho através da ativação de via alternativa (Figura 6B, Tabela 8), em comparação com monoterapias que não bloqueiam completamente a hemólise (Figura 6A, Tabela 7). Como todas as combinações de mAb1 anti-Proteína Z:mAb anti-Proteína Z bloquearam completamente a hemólise de RBC de coelho, era importante determinar se há diferenças na formação do complexo, como tamanho, forma e orientação que

38 / 46 podem prover uma visão sobre a farmacocinética (PK) de um mAb durante o desenvolvimento do medicamento, como imunogenicidade e/ou depuração mediada por alvo. Tabela 7. Efeito dos anticorpos anti-Proteína Z na hemólise de RBC de coelho. ID da Proteína AP, IC50 [M] AP, IC80 [M] % inibição máxima de lise Anti-Proteína Z mAb1 8,896e-008 1,970e-007 81,25 Anti-Proteína Z mAb2 8,366e-008 1,813e-007 88,66 Anti-Proteína Z mAb3 5,252e-008 9,390e-008 59,24 Anti-Proteína Z mAb4 4,942e-008 5,963e-008 36,63 Anti-Proteína Z mAb5 7,419e-008 1,467e-007 77,83 Anti-Proteína Z mAb6 9,346e-008 2,260e-007 62,80 Anti-Proteína Z mAb7 7,424e-008 1,414e-007 76,21 COMP1 mAb 6,291e-008 1,185e-007 61,14 COMP2 mAb 4,568e-008 5,600e-008 88,83 Tabela 8. Efeito das combinações de anticorpos anti-Proteína Z na hemólise de eritrócitos de coelhos. ID da Proteína AP, IC50 [M] AP, IC80 [M] % inibição máxima de lise Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 7,182e-008 7,528e-008 97,59 Proteína Z mAb2 Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 7,709e-008 8,749e-008 98,11 Proteína Z mAb3 Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 9,751e-008 1,064e-007 98,16 Proteína Z mAb4 Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 9,571e-008 1,051e-007 98,10 Proteína Z mAb5 Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 7,737e-008 8,461e-008 97,29 Proteína Z mAb6 Anti-Proteína Z mAb1 + Anti- 8,353e-008 9,432e-008 98,14 Proteína Z mAb7 Anti-Proteína Z mAb1 + COMP1 7,372e-008 7,776e-008 98,26 mAb Anti-Proteína Z mAb1 + COMP2 7,306e-008 8,017e-008 98,07 mAb

[0099] Na ausência de mAbs secundários, o mAb1 anti-Proteína Z formou complexos canônicos 1:1 e 1:2 com a Proteína Z quando misturados em quantidades equimolares (Figura 7, Tabela 9). Tabela 9. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Pico 1 Pico 2 Razão Molar [Anticorpo intacto]1: [ProteínaZ]1 [Anticorpo intacto]1: [ProteínaZ]2 Amostra (mol:mol) Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa mAb1:ProteínaZ 1:1 13,7 341 15,3 499 Rt: Tempo de retenção; MW: massa molar média ponderal; min: minutos; kDa: kiloDaltons;

[00100] A maioria das combinações de mAb secundários com mAb1

39 / 46 anti-Proteína Z favoreceu complexos menores e bem definidos consistentes com um complexo heteromérico mAb 2:2: Proteína Z (Figuras 8 e 9 e Tabelas 10-12). Tabela 10. Massa molar do complexo de mAb:proteína Z. mAb: Complexo de proteína Z Massa molar teórica (kDa) 1:0 150 0:1 195 1:1 345 2:1 495 1:2 540 2:2 690 3:2 840 2:3 885 4:4 1380 6:6 2070 Tabela 11:. Massa molar aproximada e tempo de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Razão [Anticorpo intacto]2: [Anticorpo intacto]4: [Anticorpo Intacto]6: Complexos de Amostra Molar [ProteínaZ]2 [ProteínaZ]4 [ProteínaZ]6 Ordem Superior (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa mAb1:mAb5 ~2250- 0,5:0,5:1 16,0 684 18,5 1342 20,1 1876 21,5 : ProteínaZ 3560 mAb1:mAb7 ~2380- 0,5:0,5:1 16,1 688 18,5 1327 20,1 1866 21,5 : ProteínaZ 4250 Rt: Tempo de retenção; MW: massa molar média ponderal; min: minutos; kDa: kiloDaltons.

Tabela 12. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Razão [Anticorpo intacto]2: [Anticorpo intacto]4: [Anticorpo Intacto]6: Complexos de Amostra Molar [ProteínaZ]2 [ProteínaZ]4 [ProteínaZ]6 Ordem Superior (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa mAb1:mAb ~1700- 0,5:0,5:1 16,4 685 18,4 1262 N/A N/A 20,2 3:ProteínaZ 2700 mAb1:mAb ~2300- 0,5:0,5:1 15,7 686 17,7 1320 19,4 1850 20,6 6:ProteínaZ 3800 mAb6:mAb ~2300- 0,5:0,5:1 15,8 688 17,8 1334 19,3 1872 20,6 7:ProteínaZ 3600

[00101] Embora a combinação de mAb1 anti-Proteína Z/anti-Proteína Z mAb3 formou complexos de tamanhos semelhantes com a Proteína Z, as diferenças no tempo de eluição/perfil sugeriram que os complexos formados tinham diferenças na forma/orientação em comparação com outras combinações (Figura 9). As combinações de mAb1 antiproteína Z com mAb2

40 / 46 antiproteína Z e mAb COMP1 favoreceram complexos maiores e mais heterogêneos com a proteína Z indicativa de “bonecos de papel” (Figura 10, Tabela 13). Tabela 13. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Razão [Anticorpo intacto]2: [Anticorpo intacto]4: [Anticorpo Intacto]6: Complexos de Amostra Molar [ProteínaZ]2 [ProteínaZ]4 [ProteínaZ]6 Ordem Superior (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa mAb1: ~2300- mAb2: 0,5:0,5:1 15,5 665 19,2 1304 21,9 1901 23,6 4100 ProteínaZ mAb1: ~2500- COMP1: 0,5:0,5:1 15,4 714 18,8 1346 21,5 2002 24,2 5000 ProteínaZ Rt: Tempo de retenção; MW: massa molar média ponderal; min: minutos; kDa: kiloDaltons.

[00102] A combinação de mAb4 antiproteína Z com mAb1 antiproteína Z exibiu uma tendência reduzida para formar complexos heteroméricos com a proteína Z (Figura 11, Tabela 14). Presença de espécies de mAb livre e 1:1 mAb:Proteína Z indicaram a formação incompleta de complexos heteroméricos com a proteína Z. As misturas de complexos homoméricos e heteroméricos com a proteína Z também foram evidentes. Tabela 14. Massa molar aproximada e tempo de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Razão [Anticorpo intacto]2: [Anticorpo intacto]4: Complexos de Ordem Amostra Molar [ProteínaZ]2 [ProteínaZ]4 Superior (mol:mol) Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa mAb1:mAb4: 0,5:0,5:1 15,9 650 19,1 1288 20,6 ~1700-2300 ProteínaZ Rt: Tempo de retenção; MW: massa molar média ponderal; min: minutos; kDa: kiloDaltons

[00103] Exemplo 4: A ordem de adição não afeta significativamente a massa molar e a distribuição dos complexos formados entre o mAb1 antiproteína Z, o mAb COMP1 e a proteína Z. Métodos

[00104] Para determinar se a ordem de adição impacta a formação do complexo, combinações equimolares de mAb COMP1 e Proteína Z foram

41 / 46 preparadas em 1X DPBS, pH 7,4 para produzir uma razão molar de 1 μM COMP1 mAb: 1 μM de Proteína Z e incubados em temperatura ambiente por 1 hr. Após a incubação, quantidades variáveis de mAb1 antiproteína Z foram adicionadas aos complexos COMP1 pré-formados mAb:Proteína Z e diluídos em 1X DPBS, pH 7,4 para produzir as seguintes razões molares: 0,3 μM Anti- Proteína Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM Proteína Z, 1 μM Anti-Proteína Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM Proteína Z, e 3 μM Anti-Proteína Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM Proteína Z e incubadas por uma hora adicional antes da injeção no instrumento. Os métodos de análise A4F MALLS do Exemplo 3 foram seguidos. Resultados

[00105] Complexos semelhantes, em relação à massa molar e distribuição, foram formados entre o mAb1 anti-Proteína Z, mAb COMP1 e Proteína Z, independentemente se o mAb1 anti-Proteína Z foi adicionado simultaneamente (Figura 12A, Tabela 15) ou sequencialmente (Figura 12B, Tabela 15) para os outros componentes. A ligeira mudança no tempo de eluição observada entre os dois conjuntos de dados é indicativa da variabilidade inerente ao método e não é considerada incomum. Tabela 15. Massa molar aproximada e tempos de retenção para complexos de mAb:proteína Z. Amostra mAb1: Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 COMP1: [Anticorpo [Anticorpo [Anticorpo Complexos de ProteínaZ intacto]1: intacto]1: intacto]2-3: Ordem Superior Razão Molar [ProteínaZ]1 [ProteínaZ]2 [ProteínaZ]2-3 (mol:mol) Complexo Complexo Complexo Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Adição 3:1:1 N/A N/A 14,5 537 16,7 89 18,0 ~1200- Simultânea 1950 1:1:1 N/A N/A 14,6 523 16,7 793 18,6 ~1400- 2300 0,3:1:1 13,3 344 15,0 541 16,6 750 18,4 ~1000- 1800 Adição 3:1:1 N/A N/A 15,6 500 18,0 817 20,0 ~1200- Sequencial 1800 1:1:1 N/A N/A 15,7 496 18,0 806 20,0 ~1500- 2400 0,3:1:1 14,2 380 16,4 663 17,9 818 19,9 ~1500- 2600

42 / 46 Exemplo 5: Complexos anti-Proteína W. Métodos Tampão de Fase Móvel A4F-MALLS

[00106] O tampão de fase móvel (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) foi preparado combinando 1,4 g de monohidrato monobásico de fosfato de sódio, 10,7 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado e 500 mL de cloreto de sódio 5 M; a solução foi então levada a um volume de 5,0 L com água de qualidade HPLC. O pH final medido do tampão foi de 7,0. O tampão de fase móvel foi filtrado (0,2 μm) antes do uso. Análise A4F MALLS

[00107] O sistema A4F-MALLS era composto por um Sistema de Separação Eclipse™ 3+ A4F acoplado a um sistema HPLC Agilent 1200 Series equipado com um detector de matriz de diodo ultravioleta (UV), instrumento de dispersão de luz laser Wyatt Technology Dawn HELEOS® II (LS) e um detector de refratômetro diferencial (RI) Optilab® T-rEX. Os detectores foram conectados em série na seguinte ordem: UV-LS-RI. Os detectores LS e RI foram calibrados de acordo com as instruções providas pela Wyatt Technology.

[00108] Quantidades definidas de mAb anti-Proteína W foram combinadas com Proteína W e diluídas em 1X DPBS, pH 7,4 para produzir a razão equimolar: 1 μM anti-Proteína W mAb: 1 μM de Proteína W. Todas as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas e mantida sem filtrar a 4°C antes da injeção em um canal curto Eclipse™ equipado com uma folha espaçadora W350 (espaçador de 350 μm de espessura, largura de espaçador de 2,2 cm) e usando uma membrana de celulose regenerada MWCO de 10 kDa. O canal foi pré-equilibrado com o tampão de fase móvel (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1), antes da injeção de cada amostra. Albumina sérica bovina (BSA; 2 mg/mL; carga de amostra de 10 μg) foi injetada separadamente e incluída como um controle de

43 / 46 adequação do sistema.

[00109] O método de fracionamento consistia em quatro etapas: injeção, foco, eluição e uma etapa de “lavagem” do canal. O tampão de fase móvel A4F-MALLS (fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,0 ± 0,1) foi usado ao longo do método de fracionamento. Cada amostra (7 μg) foi injetada a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min por 1 min e posteriormente focada por 3 min com uma taxa de fluxo de foco de 1,0 mL/min. A amostra foi eluída com uma taxa de fluxo de canal de 1,0 mL/min com o fluxo cruzado de gradiente linear de 3,0 mL/min a 0 mL/min ao longo de 25 min. Finalmente, o fluxo cruzado foi mantido a 0 mL/min por mais 5 min para lavar o canal. O BSA foi fracionado usando as mesmas configurações de parâmetro. Resultados:

[00110] A4F-MALLS foi usado para avaliar a distribuição de tamanho relativo de complexos formados entre a Proteína W, um ligante dimérico de múltiplos domínios e vários anticorpos anti-Proteína W que se ligam especificamente a diferentes domínios dentro do ligante. A massa molar teórica e a estequiometria prevista de complexos de anticorpos potenciais com a Proteína W são providas na Tabela 16. Tabela 16. Massa molar teórica de complexos de mAb:Proteína W. Complexo mAb:ProteínaW Massa Molar (kDa) 1:0 146 0:1 146 1:1 292 1:21 438 2:2 584 2:31 730 3:3 876 3:41 1022 4:4 1168 1 Razões desiguais (como 1:2 e 2:1) não podem ser diferenciadas, pois terão o mesmo MW.

[00111] No geral, fora do painel de mAbs, mAb1 direcionado ao Domínio A formou a maior proporção de complexos de ordem inferior com as espécies predominantes representando um complexo discreto de 1:1 e 2:2 com a Proteína W quando combinados em razões equimolares (Pico 2, ~289 kDa;

44 / 46 e pico 3, ~562 kDa, Figura 13, Tabela 17). Tabela 17. Massas molares e tempos de retenção de complexos de proteína humana W com o domínio de direcionamento de mAb1 A. Amostra Razão Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 Molar MAb/Proteína [mAb]1: [mAb]2: [mAb]3: Complexos (mol:mol) W livre [ProteínaW]1 [ProteínaW]2 [ProteínaW]3 Heteroméricos de Complexo Complexo Complexo Ordem Superior Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, kDa min kDa min kDa min kDa min kDa min ProteínaW - 9,6 1476 ND ND ND ND ND ND ND ND mAb1 - 9,5 145 ND ND ND ND ND ND ND ND mAb1:ProteínaW1:1 9,3 146 10,7 289 12,6 562 13,7 824 14,5 ~1000- 2000 Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min: minutos; kDa: kiloDaltons.

[00112] Cada um dos mAbs direcionados ao DomínioB (mAb2, mAb3 e COMP1) formou predominantemente um complexo 2:2 discreto com a Proteína W (Pico 3, ~563-580 kDa, Figura 14, Tabela 18) com mAb2 e COMP1 formando a distribuição mais homogênea de complexos em relação a outros mAbs testados. Embora COMP2 direcionado ao Domínio A favoreceu principalmente uma mistura de complexos 1:2 e 2:2 com ProteínaW (Pico 3, ~550 kDa, Figura 15, Tabela 19), um grau moderado de grandes complexos heterogêneos também foi observado. Isso sugere que, ao contrário do mAb1, que também tem como alvo o DomínioA, o COMP2 se liga a um epítopo único na Proteína W que permite a formação de redes estendidas de anticorpo-antígeno em um processo denominado “boneco de papel”. Nessa amostra, um pico distinto (Pico 4) com uma massa molar de aproximadamente 835 kDa foi observado, seguido por uma série de espécies amplas e mal resolvidas (pico 5) com uma ampla distribuição de massa molar variando de ~1000-1900 kDa (Figura 15, Tabela 19).

45 / 46 Tabela 18. Massas molares e tempos de retenção de complexos de proteína humana W com mAbs direcionados ao domínio B. Amostra Razão Molar Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 (mol:mol) MAb/Proteína [mAb]1: [mAb]2: [mAb]3: Complexos W livre [ProteínaW]1 [ProteínaW]2 [ProteínaW]3 Heteroméricos Complexo Complexo Complexo de Ordem Superior Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, min kDa min kDa min kDa min kDa min kDa ProteínaW - 9,6 147 ND ND ND ND ND ND ND ND mAb2 - 9,6 152 ND ND ND ND ND ND ND ND mAb2:ProteínaW 1:1 9,4 144 10,9 283 13,2 574 13,9 731 15,4 ~1000- 1900 mAb3:ProteínaW 1:1 9,3 144 10,7 26,8 12,9 563 14,0 831 14,6 ~1000- 1900 COMP1:ProteínaW 1:1 9,4 143 10,8 298 13,0 580 13,9 765 15,0 ~1000- 1900 Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min: minutos; kDa: kiloDaltons.

Tabela 19. Massas molares e tempos de retenção de complexos de proteína humana W com COMP2 direcionado ao domínio A. Amostra Razão Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 Molar Proteína Livre MAb livre [mAb]1-2: [mAb]2-3: Complexos (mol:mol) W [ProteínaW]2 [ProteínaW]3 Heteroméricos Complexo Complexo de Ordem Superior Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, Rt, Mw, min kDa min kDa min kDa min kDa min kDa ProteínaW - 9,6 147 ND ND ND ND ND ND ND ND COMP2 - 10,5 122 ND ND ND ND ND ND ND ND COMP2:ProteínaW 1:1 ND ND 9,4 147 13,1 550 15,2 835 16,9 ~1000- 1900 Rt: Tempo de Retenção; Mw: massa molar média ponderal; N/A: Não aplicável; min: minutos; kDa: kiloDaltons.

[00113] Com base nas massas molares calculadas dos componentes individuais, o pico 4 provavelmente representa complexos contendo pelo menos 3 moléculas de mAb coordenando 2-3 moléculas de Proteína W, enquanto o pico 5 corresponde a uma distribuição heterogênea de complexos heteroméricos de ordem superior compostos de ≥3 moléculas de mAb coordenando ≥4 moléculas de Proteína W (Tabela 18). Em contraste, mAbs direcionados ao Domínio C (mAb4 e COMP3) formaram uma ampla distribuição de grandes complexos heterogêneos (massa molar variando de ~700-8000 kDa) com mAb4 exibindo o “boneco de papel” mais extenso entre o painel de mAbs testado (Figura 16, Tabela 20).

46 / 46 Tabela 20. Massas molares e tempos de retenção de complexos de proteína humana W com mAbs direcionados ao domínio C. Amostra Razão Molar Pico 1 Pico 2 Pico 3 (mol:mol) MAb/Proteína W livre [mAb]1-2: Complexos [ProteínaW]2 Heteroméricos de Complexo Ordem Superior Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa Rt, min Mw, kDa ProteínaW - 9,6 147 ND ND ND ND mAb4 - 9,5 148 ND ND ND ND mAb4:ProteínaW 1:1 9,5 158 ND ND 28,5 1400-4000 COMP3:ProteínaW 1:1 9,7 161 13,9 528 14,6 700-8000

[00114] Embora no relatório descritivo precedente essa invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades da mesma, e muitos detalhes tenham sido apresentados para fins de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que certos detalhes descritos nesse documento podem variar consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

[00115] Todas as referências citadas nesse documento são incorporadas por referência em sua totalidade. A presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou atributos essenciais da mesma e, consequentemente, deve-se referir-se às reivindicações anexas, em vez do relatório descritivo precedente, para indicar o escopo da invenção.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para avaliar a estequiometria e distribuição de tamanho de complexos de proteínas em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: fracionar a amostra por fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (A4F); e determinar a massa molar, estequiometria e distribuição de tamanho dos complexos de proteínas na amostra usando o Espalhamento de Luz a Laser Multiangular (MALLS), em que os complexos heterogêneos consistem em complexos heterogêneos de anticorpo:ligante ou complexos de proteína de fusão heterogênea:ligante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante solúvel.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

5. Método para selecionar um medicamento de proteína principal, caracterizado pelo fato de que compreende: adicionar um primeiro medicamento de proteína a uma primeira amostra incluindo um alvo do primeiro medicamento de proteína para produzir complexos heterogêneos de proteína:ligante; adicionar um segundo medicamento de proteína a uma segunda amostra contendo o mesmo alvo para formar complexos de proteína:ligante; separar complexos heterogêneos de proteína:ligante e determinar a distribuição de tamanho e estequiometria de complexos heterogêneos de proteína:ligante usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico - Espalhamento de Luz a Laser Multiangular; e selecionar o medicamento de proteína que forma menos complexos de proteína:ligante como o medicamento de proteína alvo principal.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento de proteína que é selecionado forma menos complexos de medicamento de proteína tendo uma razão de medicamento de proteína sobre ligante de 3:2, 2:3, 4:4, 6:6 ou [2:2]n.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante solúvel.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento de proteína é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma proteína de fusão ou uma proteína recombinante.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento de proteína que é selecionado forma complexos de medicamento de proteína com uma razão de medicamento de proteína sobre ligante selecionada a partir do grupo que consiste em 1:0, 0:1,1:1, 1:2 e 2:1.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o medicamento de proteína principal selecionado como definido qualquer uma das reivindicações 5 a 9.

11. Método para caracterizar complexos de proteínas formados entre um medicamento de proteína e seu ligante, caracterizado pelo fato de que compreende: combinar o medicamento de proteína e o seu ligante em uma solução para formar uma amostra compreendendo complexos de medicamento de proteína:ligante;

fracionar a amostra usando fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico; e submeter os complexos de medicamento de proteína:ligante fracionados à dispersão de luz a laser multiangular para caracterizar a estequiometria e o tamanho dos complexos de medicamento de proteína:ligante.