BR112020018117A2 - Vírus da pseudovaríola (pcpv), métodos para gerar o pcpv e para amplificar o pcpv, composição, método de tratamento, método para inibir o crescimento de células tumorais, uso ou método e método para induzir ou estimular e/ ou reorientar uma resposta imune - Google Patents

Abstract

a presente invenção está no campo da imunoterapia viral. a invenção fornece novos vírus da pseudovaríola (pcpv), em particular pcpv recombinante, sua composição, bem como seu uso terapêutico para prevenir ou tratar doenças e, notavelmente, doenças proliferativas como câncer e restenose e doenças infecciosas, como as crônicas. a presente invenção também fornece métodos para gerar e amplificar tal pcpv e um método para induzir ou estimular e/ ou reorientar uma resposta imune usando tal pcpv. mais especificamente, a invenção fornece uma alternativa aos vetores de poxvírus existentes, tais como mva (vírus ankara modificado) e pode ser amplamente utilizado para a vacinação terapêutica.

Description

“VÍRUS DA PSEUDOVARÍOLA (PCPV), MÉTODOS PARA GERAR O PCPV E PARA AMPLIFICAR O PCPV, COMPOSIÇÃO, MÉTODO DE TRATAMENTO, MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS, USO OU MÉTODO E MÉTODO PARA INDUZIR OU ESTIMULAR E/ OU REORIENTAR UMA RESPOSTA IMUNE” CAMPO TÉCNICO DO INVENÇÃO

[001] A presente invenção está no campo da imunoterapia viral.

A invenção fornece novos vírus da pseudovaríola (pseudocowpox virus - PCPV), em particular PCPV recombinante, sua composição, bem como seu uso terapêutico para prevenir ou tratar doenças e, notavelmente, doenças proliferativas como câncer e restenose e doenças infecciosas. A presente invenção também fornece métodos para gerar e amplificar tal PCPV e um método para induzir ou estimular e/ ou reorientar uma resposta imune usando tal PCPV. Mais especificamente, a invenção fornece uma alternativa aos vetores de poxvírus existentes, tais como MVA (vírus Ankara modificado - Modified Virus Ankara) e pode ser amplamente utilizado para a vacinação terapêutica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A imunoterapia visa estimular o sistema imunológico do hospedeiro para ajudar o corpo a erradicar patógenos e células anormais.

Amplamente utilizada na vacinação tradicional, a imunoterapia também está sendo ativamente investigada como uma modalidade potencial para o tratamento de doenças graves, crônicas ou com risco de vida, na tentativa de estimular respostas imunes específicas e inatas. Um grande número de imunoterapêuticos foram descritos na literatura durante décadas. Em particular, vários vetores virais e não virais já surgiram, todos eles tendo vantagens e limites relativos, tornando-os mais adequados para certas indicações (ver por exemplo Cattaneo e Russell, 2017, PLOS Pathogens doi:

10.1371/journalppat.1006190; Kaufman et al., 2015, Nature Reviews Drug Discovery 14: 642-661; Gomez et al., 2013 expert Rev Vaccines 12 (12): 1395- 1416). Um grande número de plataformas de imunoterapia estão sendo avaliadas em ensaios clínicos e o número de estudos clínicos atuais baseados na terapia com poxvírus, sejam oncolíticos ou não, reflete seu interessante potencial terapêutico. Por exemplo, vetores baseados em vírus Vaccinia recombinante (VV) são candidatos atraentes por seu excelente perfil de segurança e sua capacidade de combinar respostas imunes robustas específicas a antígenos celulares com uma estimulação generalizada do sistema imunológico inato. TG4010 (ou MVATG9931 com seu nome de pesquisa) é uma vacina terapêutica contra o câncer baseada em um vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA) que codifica o antígeno associado ao tumor MUC1 e a interleucina 2 humana (IL-2). O TG4010, em combinação com a quimioterapia de tratamento padrão de primeira linha em câncer de pulmão de células não pequenas metastático avançado (NSCLC), demonstrou eficácia em dois ensaios clínicos diferentes de fase 2b randomizados e controlados (Quoix et al., 2011, The Lancet Oncology 12 (12): 1125-33).

[003] Os parapoxvírus representam diferentes candidatos que podem ser usados em vacinas de vetor. O parapoxvírus pertence à família Poxviridae e à subfamília Chordopoxvirinae. Os parapoxvírus são comumente conhecidos como agentes causadores de doenças dérmicas em ruminantes, levando à estomatite papular e dermatite pustulosa contagiosa, especialmente nas regiões dos lábios, narinas, mucosa oral e tetos. Como outros membros da família Poxviridae, os parapoxvírus são vírus de DNA de fita dupla relativamente grandes e envelopados com geometrias ovoides que podem infectar vertebrados, incluindo uma ampla seleção de mamíferos e humanos. Os parapoxvírus têm um revestimento espiral exclusivo que os distingue de outros poxvírus.

[004] Quanto aos poxvírus, a replicação viral do parapox é citoplasmática. A entrada na célula hospedeira é alcançada pela ligação das proteínas virais aos glicosaminoglicanos (GAGs) que medeiam a endocitose do vírus na célula hospedeira. A fusão com a membrana plasmática permite a liberação do núcleo no citoplasma do hospedeiro. Os genes iniciais são transcritos no citoplasma pela RNA polimerase viral. A expressão precoce começa 30 minutos após a infecção. A fase intermediária desencadeia a replicação do DNA genômico aproximadamente 100 minutos após a infecção.

Os genes tardios são então expressos de 140 minutos a 48 horas após a infecção, produzindo todas as proteínas estruturais. A montagem dos vírions da progênie começa nas fábricas virais citoplasmáticas, produzindo uma partícula imatura esférica. Esta partícula de vírus amadurece em vírion maduro intracelular em forma de tijolo (IMV). O vírion IMV pode ser liberado após a lise celular ou pode adquirir uma segunda membrana dupla do trans-Golgi e germinar como receptores de hospedeiro de vírion com envelope externo (EEV), que medeiam a endocitose. O vírus sai da célula hospedeira saindo em corpos de oclusão após a morte celular e permanece infeccioso até encontrar outro hospedeiro.

[005] Os Parapoxvírus competentes para a replicação, bem como os inativados, são conhecidos por suas propriedades imunomoduladoras (Schulze et al., 2009, Vet Microbiol. 137: 260-7). O Parapoxvirus ovis (ORFV), a espécie protótipo do gênero Parapoxvirus, tem sido usado com sucesso na medicina veterinária para aumentar a resistência geral em infecções virais cronicamente persistentes em animais (ver, por exemplo, US 6,365,393; WO 97/32029 e US 2003-0013076), bem como na medicina humana para o tratamento de HIV (WO 2006/005529) e considerado como oncolítico por alguns (Rintoul et al., 2012, Mol. Ther.20 (6): 1148-57). Vários locais de inserção foram identificados no genoma de ORFV (WO 97/37031).

Notavelmente, o antígeno do vírus da cinomose canina (CDV) que codifica o ORFV recombinante foi usado como vacina contra o CDV (WO 2012/01145) e o vírus da pseudoraiva em porcos (Rooij et al., 2010, Vaccine 28 (7): 1808-13).

Zylexis®, anteriormente conhecido como Baypamune®, que é uma preparação de ORFV quimicamente inativado derivado da cepa D1701, é usado para a profilaxia e tratamento terapêutico de doenças infecciosas e para prevenir doenças induzidas por estresse em animais. O ORFV inativado mostrou induzir células dendríticas plasmocitoides (pDC), provavelmente através do envolvimento de uma via dependente de TLR-9 (Von Buttlar et al., 2014, PLOS One 9 (8): e106188). Mais recentemente, Choi et al. (2017, Surgery, doi

10.1016/j.surg.2017.09.030) relataram atividades citotóxicas potentes de um parapoxvírus quimérico em tumores de câncer de mama triplo negativo (TNBC). A replicação ativa do vírus ORF quimérico foi detectada nos tecidos tumorais uma semana após a sua injeção e a infiltração de células natural killers (NK) foi observada na periferia dos tecidos tumorais tratados com vírus.

[006] Há claramente uma necessidade importante de desenvolver abordagens eficazes para o tratamento de doenças potencialmente fatais, como cânceres e doenças infecciosas. Na verdade, as células doentes desenvolveram mecanismos imunossupressores potentes para iludir o sistema imunológico, o que representa um grande obstáculo para uma imunoterapia eficaz. Portanto, o desencadeamento de mecanismos imunes inatos e específicos pode ser a chave para o desenvolvimento bem sucedido de imunoterapêuticos mais eficazes.

[007] A presente invenção refere-se ao uso de parapoxvírus como um vetor para a entrega de genes terapêuticos. Os inventores descobriram surpreendentemente que o vírus da pseudovaríola (PCPV) oferece vantagens notáveis que o torna particularmente apropriado para terapia anticâncer considerando sua patogenicidade limitada e propriedades de modulação imunológica. Os inventores descobriram que o PCPV fornece um forte perfil imunológico inato diferente daqueles de outros poxvírus, conforme evidenciado por sua capacidade de ativar a secreção de uma série de citocinas e quimiocinas que estimulam as células efetoras imunológicas em um nível superior ao MVA e VV convencionais. Outro membro do gênero Parapoxvirus, o vírus da estomatite popular bovina (BPSV), apresentou efeitos semelhantes em PBMCs como PCPV com forte aumento de IFN-alfa secretado nos sobrenadantes. Além disso, o aumento da expressão de CD86 em macrófagos humanos do tipo M2 derivados in vitro sugere um papel de PCPV na reprogramação de macrófagos M2 em direção a um fenótipo menos supressor.

Finalmente, um vírus PCPV recombinante modificado geneticamente para expressar antígenos associados a tumor (TAA) mostrou-se particularmente eficaz para controlar o crescimento do tumor e aumentar a sobrevivência em um modelo animal singênico. A combinação de PCPV com um anticorpo anti- PD1 mostrou melhora estatisticamente significativa do controle do tumor em um modelo de “dois tumores”.

[008] Devido às propriedades imunogênicas melhoradas exibidas pelos vírus PCPV e BPSV, pode-se antecipar que o parapoxvírus pode ser usado com sucesso como uma alternativa a outras terapias virais para tratar ou prevenir doenças proliferativas, como câncer e doenças infecciosas (por exemplo, HBV crônico). Assim, o PCPV ou BPSV é um candidato a uma vacina terapêutica que pode ter efeitos no ambiente tumoral.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] Um aspecto da invenção se refere a um vírus da pseudovaríola (PCPV) em que o referido PCPV compreende pelo menos um ácido nucleico estranho inserido em seu genoma.

[0010] Em uma forma de realização, o referido PCPV é obtido a partir da cepa TJS do tipo selvagem conforme identificado pelo número de referência do ATCC ATCC VR-634™ ou a partir de uma cepa de vírus com o mesmo nome ou semelhante ou fragmentos funcionais e variantes dos mesmos.

[0011] Em outra forma de realização, o PCPV pode ser ainda defeituoso para uma função viral codificada pelo genoma de PCPV e, de preferência, para uma função viral não essencial e, mais preferencialmente, para uma função de gene viral codificada no local de inserção do referido ácido nucleico estranho.

[0012] Em uma outra forma de realização, o referido ácido nucleico estranho codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos que compensam proteínas defeituosas ou deficientes em um sujeito, polipeptídeos que atuam por meio de efeitos tóxicos para limitar ou remover células doentes do corpo, como produtos de genes suicidas; polipeptídeos capazes de potenciar a eficácia antitumoral, como produtos de genes armados; e polipeptídeos capazes de induzir ou ativar uma resposta imune, tais como polipeptídeos imunoestimuladores e antigênicos. De preferência, o polipeptídeo imunoestimulador é selecionado a partir do grupo que consiste em citocinas, tais como interleucinas, quimiocinas, interferons, fator de necrose tumoral, fatores estimuladores de colônia, proteínas expostas a APC, polipeptídeos com um efeito anti-angiogênico e polipeptídeos que afetam a regulação de receptores de superfície celular, tais como agonistas ou antagonistas de pontos de controle imunológicos com uma preferência específica por uma interleucina ou um fator estimulador de colônias e, em particular GM-CSF ou um anticorpo dirigido por agonista OX40. Também é preferido um antígeno de câncer, como o antígeno MUC-1, um polipeptídeo antigênico viral, como os antígenos E7 de HPV-16 ou antígenos de HBV.

[0013] Em ainda uma outra forma de realização, o pelo menos um ácido nucleico estranho está operacionalmente ligado a elementos reguladores adequados para expressão em uma célula hospedeira ou sujeito desejado.

[0014] Em uma forma de realização adicional, o pelo menos um ácido nucleico estranho é inserido no locus de VEGF.

[0015] Em outro aspecto, a presente invenção fornece ainda um método para gerar o PCPV da invenção, por recombinação homóloga entre um plasmídeo de transferência compreendendo o ácido nucleico estranho flanqueado em 5’ e 3’ com sequências de PCPV respectivamente presentes a montante e a jusante do local de inserção e um genoma de PCPV, em que o referido método compreende uma etapa de geração do referido plasmídeo de transferência e uma etapa de introdução do referido plasmídeo de transferência em uma célula hospedeira adequada, notavelmente junto com um vírus PCPV compreendendo a sequência de flanqueamento presente no plasmídeo de transferência.

[0016] Em uma forma de realização, o local de inserção do pelo menos um ácido nucleico estranho no genoma de PCPV está em um gene viral, com preferência para um gene viral não essencial, em uma região intergênica, em uma porção do genoma de PCPV que não codifica produtos gênicos ou em um locus duplicado e, de preferência, o locus de VEGF.

[0017] Em uma forma de realização, o plasmídeo de transferência compreende ainda um ou mais genes de seleção e/ ou detectáveis para facilitar a identificação do PCPV recombinante com uma preferência para o gene GPT de seleção e/ ou um gene detectável que codifica GFP, e-GFP ou mCherry.

[0018] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere ainda a um método para amplificar o PCPV da invenção ou gerado pelo método da invenção, compreendendo as etapas de a) preparar uma linhagem celular produtora, b) transfectar ou infectar a linhagem celular produtora preparada, c) cultivar a linhagem celular produtora transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus, d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem celular produtora e opcionalmente e) purificar o referido vírus recuperado.

[0019] Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do PCPV da invenção ou amplificado pelo método de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, a composição é formulada em doses individuais compreendendo de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 ufp. De preferência, é formulado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intratumoral.

[0020] Em uma forma de realização, a composição é para uso no tratamento ou prevenção de doenças ou condição patológica causada por um organismo patogênico ou uma divisão celular indesejada.

[0021] Em ainda um outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento e um método para inibir o crescimento de células tumorais compreendendo a administração da composição da invenção a um sujeito em necessidade da mesma em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição patológica causada por um organismo patogênico ou uma divisão celular indesejada.

[0022] Em uma forma de realização, o referido câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer pancreático e câncer de ovário e um câncer que superexpressa MUC1.

[0023] Em outra forma de realização, o referido método ou uso é realizado em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos selecionados a partir do grupo que consiste em cirurgia, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia com toxinas, imunoterapia, terapia com citocinas, terapia direcionada ao câncer, terapia gênica, terapia fotodinâmica e transplante.

[0024] Em uma outra forma de realização, o referido método ou uso é realizado de acordo com uma abordagem de reforço inicial que compreende administrações sequenciais de uma composição(ões) de primeira imunização e uma composição(ões) de reforço.

[0025] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para induzir ou estimular e/ ou reorientar uma resposta imune, que compreende a administração da composição da invenção a um sujeito em necessidade da mesma, em uma quantidade suficiente para ativar a imunidade do sujeito.

[0026] Em uma forma de realização, o método resulta em pelo menos uma das seguintes propriedades (a) a secreção de altos níveis de IFN- alfa a partir da PBMC; (b) a ativação de células dendríticas derivadas de monócitos; (c) a indução da proliferação de células T (por exemplo, refletida indiretamente por células T altamente granzima B+); (d) um melhor perfil de citocina/ quimiocina em MDSC; (e) ativação da APC; (f) uma conversão de M2 em M1 de macrófagos humanos; e/ ou (g) a indução de imunidade através de uma via mediada por TLR9 ou outras vias estimuladoras da imunidade inata.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A Figura 1 ilustra a secreção de IFN-alfa em PBMCs de 2 doadores em dois experimentos diferentes (Exp 1 e exp 2) em diferentes MOI (MOI de 0,1; MOI 1 e MOI 5). Mock representa o controle negativo, enquanto os diferentes vírus testados são Parapoxvírus (vírus da pseudovaríola (PCPV) e Parapoxvirus ovis (ORFV)), MVA (um vetor MVA vazio denominado MVAN33.1), vírus da varíola bovina (CPX), vírus Vaccinia de Copenhagen (Copwt), vírus da bouba aviária (FPV), Myxomavirus (MYXV), Vírus da varíola suína (SWPV), Raccoonpoxvirus (RCN), Cotiavirus (CTV) e vírus da doença semelhante a Yaba (YLDV).

[0028] A Figura 2 ilustra os níveis de expressão do marcador de ativação CD86 medidos por citometria de fluxo em moDCs infectados com vírus obtidos de três doadores diferentes. É mostrada a intensidade de fluorescência mediana (MedFI) para CD86 em moDCs (3 doadores), observada 16 horas após a infecção com o vetor MVA vazio MVAN33.1 ou PCPV em MOI 0,03, 0,3 ou 1 ou simulado como controle negativo. Os níveis de expressão foram medidos por coloração com quantificação de anti-CD86-PE do sinal ligado à célula por citometria de fluxo.

[0029] A Figura 3 ilustra os níveis de citocina medidos por análise Luminex no sobrenadante de macrófagos M2 CD163+ CD206+ gerados a partir de PBMCs como descrito neste documento após incubação com MVAN33.1 ou PCPV em MOI 5, 1 e 0,3.

[0030] A Figura 4 ilustra A) Proliferação de CTL relativa sozinha ou em co-cultura com MDSCs derivadas na presença de 20 ng/ ml de GM-CSF, 10 ng/ ml de IL4 e 1 µM de prostaglandina E2 (razão MDSC/ T de ½) após tratamento com PCPV em MOI 0,03, 0,3 ou 3. B) Expressão relativa de Granzima B em células T altamente proliferantes sozinhas ou em co-cultura com MDSC (co-cultivada como indicado em A) tratadas com PCPV no MOI indicado. C) Secreção de IFN-alfa após tratamento de MDSCs com PCPV durante a noite no MOI indicado.

[0031] A Figura 5 ilustra A) Proliferação de CTL relativo sozinho ou em co-cultura com MDSCs derivados na presença de 10 ng/ ml de GM-CSF e 10 ng/ ml de IL-6 (razão MDSC/ T de ½ e 1/1) após o tratamento com PCPV em MOI 0,03, 0,3 ou 3. B) Expressão relativa de Granzima B em células T em proliferação sozinhas ou em co-cultura com MDSC (co-cultura como indicado em A) tratadas com PCPV em MOI indicado.

[0032] A Figura 6 ilustra a evolução do crescimento tumoral e sobrevivência animal no modelo de tumor MC38. Os animais foram divididos em três grupos de dez camundongos. Para todos os grupos, camundongos C57BL/6 singênicos foram injetados por via subcutânea com 2 . 106 células

MC38 de acordo com o protocolo mostrado em (A). O local da injeção foi marcado com um marcador permanente. O animal recebeu três injeções intratumorais de 1 . 107 ufp de MVA-HPV16E7m (B) ou PCPV-HPV16E7m (C) ou tampão (D), respectivamente 2 dias após a implantação celular (no local de injeção da linhagem celular) e no tumor emergente nos dias 9 e 16. O crescimento do tumor foi estimado medindo os volumes do tumor ao longo do tempo. (E): Taxas de sobrevida geral (SG) representadas como curvas de Kaplan-Meier. A linha sólida (˗) representa o grupo de animais tratados com MVA-HPV16E7m (MVATG14197), a linha tracejada (- -) o grupo tratado com PCPV-HPV16E7m (PCPV19178) e a linha pontilhada (..) o grupo tratado com tampão (S08).

[0033] A Figura 7 ilustra o efeito do PCPV na viabilidade das células MC38. 2 x 104 células foram plaqueadas e infectadas em MOI 1, 10-1, 10-2 e 10-3 com PCPV-GFP; VV-GFP (designado VVTG) como controle positivo e simulado como controle negativo. Cinco dias depois, as células foram colhidas por raspagem e o número e a proporção de células vivas foram determinados usando coloração com azul de tripano e o contador de células Vicell.

[0034] A Figura 8 ilustra a citocina local e o perfil de quimiocina após a injeção s.c. de PCPV ou MVA ou tampão (como controles negativos). 5 x 105 ufp de vírus/ flanco foram injetados s.c. em ambos os flancos depilados de quatro camundongos por grupo. Para cada camundongo, a pele de ambos os flancos foi retirada após 16 horas, e mecanicamente dissociada preservando as células (liberação de analitos intersticiais/ extracelulares). Após centrifugação a 300g, os sobrenadantes foram transferidos para tubos Eppendorf e centrifugados a 18000g no frio. O sobrenadante limpo foi analisado com quimiocina de camundongo Procartaplex e kits multiplex de citocina usando um dispositivo MagPix de acordo com as recomendações do fabricante.

[0035] A Figura 9 ilustra o efeito de PCPV na composição de TIL.

A porcentagem de neutrófilos foi detectada na população de células CD11b+ Ly6G+ CD45+ (A). TAMs foram identificados como subpopulação de CD11c- dentro das células Ly6G- CD11b+. Várias subpopulações foram estratificadas com MHC II e Ly6C. “TAM C” de acordo com Brauner et al, foram caracterizados como MHC II lo e Ly6C+.

[0036] A Figura 10 ilustra (A) a geração de células T específicas de HPV16 E7 em baços agrupados (ELISPOT) após estimulação com peptídeo R9F, (B) a geração de células T específicas de MVA após estimulação com T8V, (C) o aparecimento da população de células T CD3dimCD8dim em pulmões agrupados de camundongos repetidamente tratados por via intravenosa (i.v.) com o vírus indicado e (D) a geração de células T específicas de E7 DE HPV- 16 em pulmões agrupados dentro da população de células T CD3dimCD8dim.

[0037] A Figura 11 ilustra a indução em vezes (peptídeo específico versus peptídeo controle) do aparecimento de células T específicas de HPV16 E7 na população de células T CD3dimCD8dim medida por ICS após infecção com um MVA vazio (MVATGN33.1), MVA que codifica HPV16E7 (MVATG14197) e PCPV que codifica HPV16E7.

[0038] A Figura 12 ilustra um experimento de controle de tumor em camundongos portadores de MC38 após injeção intratumoral de 1 x 107 ufp de PCPV (A) ou tampão (E) e injeção intraperitoneal de anticorpos de depleção anti-Ly6G (B), anti-CD8 (C) e anti-CD4 (D) para esgotar neutrófilos de camundongo, células CD8+ e células CD4+, respectivamente. Cada grupo compreende 13 camundongos.

[0039] A Figura 13 ilustra a análise ELISPOT em esplenócitos de camundongos sobreviventes que receberam injeções de PCPV e mostrando tumores MC38 reduzidos ou resolvidos no dia 34. Baços de 5 animais sobreviventes (pool de sobreviventes de PCPV) e de dois sobreviventes individuais (sobreviventes de PCPV) e de camundongos naïve (Naives) foram coletados para isolar linfócitos das suspensões de esplenócitos. 107 células por mL foram semeadas em placas ELISA e estimuladas com células MC38 tratadas com Mitomicina C ou peptídeo I8L irrelevante ou com meio completo (meio). Os pontos foram contados com um leitor ELISPOT (leitor CTL Immunoqpot). Cada condição foi testada em quadriplaca e os resultados expressos como o número médio de unidades formadoras de manchas (ufs) por 1 x 106 linfócitos esplênicos.

[0040] A Figura 14 ilustra um experimento de controle de tumor em camundongos C57BL/6 portadores de TC1 de acordo com uma configuração de primeira imunização/ reforço. As células TC1 foram implantadas por via subcutânea no flanco de camundongos C57BL/6. Após 14 dias, camundongos com tumor foram randomizados (10 camundongos por grupo) e injetados intratumoralmente com 1 . 106 ufp de MVA-HPV16E7 (A e B) ou PCPV-HPV16E7 (C) ou tampão (D) (injeção de dose preparatória). Uma semana depois, os camundongos receberam um reforço com injeção intravenosa de 1 x 106 ufp do vírus homólogo, isto é, PCPV-HPV16E7 (D) ou MVA-HPV16E7 (A e C) ou tampão (B nos camundongos preparados com tampão). O crescimento do tumor foi acompanhado ao longo do tempo.

[0041] A Figura 15 ilustra um experimento de controle de tumor em camundongos com MC38 após injeção intratumoral de 1 x 107 ufp de PCPV (A) ou VV (B) como autônomo (cinza escuro) ou em combinação com o anti- PD1 murino (injeção intraperitoneal) (cinza médio). O grupo controle recebeu tampão S08 (cinza mais claro) ou anticorpo anti-PD1 sozinho (cinza claro).

Cada grupo é composto por 13 camundongos.

[0042] A Figura 16 ilustra a secreção de IFN-alfa em PBMCs obtidas de um doador representativo e infectado com MVA, PCPV ou BPSV em MOI 0,3. Mock representa o controle negativo e ODN2216 um ligante TLR9 do tipo CpG como controle do efeito imunoestimulador.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0043] Como usados em todo o pedido, os termos “um” e “uma” são usados no sentido de que significam “pelo menos um”, “pelo menos um primeiro”, “um ou mais” ou “uma pluralidade” dos componentes ou etapas citados, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.

[0044] O termo “um ou mais” refere-se a um ou a um número acima de um (por exemplo, 2, 3, 4, etc.).

[0045] O termo “e/ ou” sempre que aqui utilizado inclui o significado de “e”, “ou” e “todas ou qualquer outra combinação dos elementos ligados pelo referido termo”.

[0046] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” como aqui utilizado significa dentro de 20%, preferencialmente dentro de 10%, e mais preferencialmente dentro de 5% de um dado valor ou intervalo.

[0047] Tal como aqui utilizado, quando usado para definir produtos e composições, os termos “compreender” (e qualquer forma de compreender, tal como “compreende” e “compreendendo”), “ter” (e qualquer forma de ter, tal como “tem” e “tendo”), “incluir” (e qualquer forma de incluir, como “inclui” e “incluindo”) ou “conter” (e qualquer forma de conter, como “contém” e “contendo”) são termos abertos e não excluem elementos ou etapas de método adicionais não citadas.

A expressão “consistindo essencialmente em” significa excluir outros componentes ou etapas de qualquer significado essencial. Assim, uma composição consistindo essencialmente nos componentes citados não excluiria vestígios, contaminantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis. “Consistindo em” significa excluir mais do que vestígios de elementos de outros componentes ou etapas.

[0048] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” referem-se a polímeros de resíduos de aminoácidos que compreendem pelo menos nove ou mais aminoácidos ligados por meio de ligações peptídicas. O polímero pode ser linear, ramificado ou cíclico e pode compreender análogos de aminoácidos e/ ou de ocorrência natural e pode ser interrompido por não aminoácidos. Como uma indicação geral, se o polímero de aminoácidos tiver mais de 50 resíduos de aminoácidos, é de preferência referido como um polipeptídeo ou uma proteína, enquanto se tiver 50 aminoácidos de comprimento ou menos, é referido como um “peptídeo”.

[0049] No contexto da presente invenção, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleotídeo” e “sequência de nucleotídeos” são usados indistintamente e definem um polímero de qualquer comprimento de qualquer um dos polidesoxirribonucleotídeos (DNA) (por exemplo, cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado, sondas, primers e qualquer mistura dos mesmos) ou polirribonucleotídeos (RNA) (por exemplo, mRNA, RNA antisense, SiRNA) ou polirribopolidesoxirribonucleotídeos mistos. Eles abrangem polinucleotídeos de cadeia simples ou dupla, linear ou circular, natural ou sintética, modificada ou não modificada. Além disso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos de ocorrência não natural e pode ser interrompido por componentes não nucleotídicos.

[0050] Os termos “variante”, “análogo”, “derivado” e semelhantes podem ser usados indistintamente para se referir a um componente (polipeptídeo, ácido nucleico, vírus, etc.) que exibe uma ou mais modificação(ões) em relação à contraparte nativa. Qualquer modificação(ões) pode(m) ser considerada(s), incluindo substituição, inserção e/ ou deleção de um ou mais resíduo(s) de nucleotídeo/ aminoácido. São preferidas as variantes que retêm um grau de identidade de sequência de pelo menos 75%,

vantajosamente pelo menos 80%, desejavelmente pelo menos 85%,

preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade após alinhamento global ótimo com a sequência da contraparte nativa, isto é, após o alinhamento das sequências a serem comparadas tomadas em sua totalidade em todo o seu comprimento.

Para fins ilustrativos, “pelo menos 75% de identidade” significa

75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,

89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. De uma forma geral, o termo “identidade” refere-se a uma correspondência de aminoácido para aminoácido ou nucleotídeo para nucleotídeo entre duas sequências de polipeptídeos ou de ácido nucleico.

A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas que precisam ser introduzidas para o alinhamento ideal e o comprimento de cada lacuna.

Vários programas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis na técnica para determinar a porcentagem de identidade entre as sequências de aminoácidos, como, por exemplo, o programa Blast disponível no NCBI ou ALIGN em Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed,

1981, Supl., 3: 482-9). Programas para determinar a identidade entre sequências de nucleotídeos também estão disponíveis em bancos de dados especializados

(por exemplo, Genbank, os programas Wisconsin Sequence Analysis Package,

BESTFIT, FASTA e GAP). Para alinhamentos globais ideais, o algoritmo de

Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch.

J.

Mol.

Biol. 48,443–453, 1970)

pode ser usado, por exemplo, usando o software Emboss Needle disponível em https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Este software lê duas sequências de entrada e grava seu alinhamento de sequência global ideal no arquivo.

Ele usa o algoritmo de alinhamento Needleman-Wunsch para encontrar o alinhamento ideal (incluindo intervalos) de duas sequências ao longo de todo o seu comprimento. O algoritmo usa um método de programação dinâmico para garantir que o alinhamento seja ideal, explorando todos os alinhamentos possíveis e escolhendo o melhor. É lida uma matriz de pontuação que contém valores para cada resíduo ou correspondência de nucleotídeo possível. Needle encontra o alinhamento com a pontuação máxima possível onde a pontuação de um alinhamento é igual à soma das correspondências tiradas da matriz de pontuação, menos as penalidades decorrentes da abertura e extensão das lacunas nas sequências alinhadas. A matriz de substituição e as penalidades de abertura e extensão da lacuna são especificadas pelo usuário. No contexto da invenção, a fim de obter um alinhamento global ideal, o software Emboss Needle pode ser usado com parâmetros padrão, ou seja: - Para sequências de aminoácidos: “Gap open” = 10,0, “Gap extend” = 0,5, “End gap penalty” = “false”, “End gap open” = 10,0, “End gap extend” = 0,5 e uma Matriz “Blosum 62”; e - Para sequências de nucleotídeos: “Gap open” = 10,0, “Gap extend” = 0,5, “End gap penalty” = “false”, “End gap open” = 10,0, “End gap extend” = 0,5, e uma matriz “DNAfull”.

[0051] Conforme usado neste documento, o termo “célula hospedeira” deve ser entendido amplamente, sem qualquer limitação em relação à organização particular em tecido, órgão ou células isoladas. Essas células podem ser de um único tipo de células ou um grupo de diferentes tipos de células, como linhagens celulares em cultura, células primárias e células em divisão. No contexto da invenção, o termo “células hospedeiras” refere-se mais particularmente a células eucarióticas e, notavelmente, a células de mamíferos (por exemplo, humanas ou não humanas), bem como a células capazes de produzir o vírus PCPV da invenção (por exemplo célula produtora). Este termo também inclui células que podem ser ou foram receptoras do vírus aqui descrito, bem como a progênie de tais células.

[0052] Os termos “vírus”, “partícula viral”, “vetor viral” e “vírion” são usados indistintamente e devem ser entendidos amplamente como significando um veículo que compreende pelo menos um elemento de um genoma de vírus do tipo selvagem que pode ser empacotado em ums partícula viral (também designada como um vetor viral) ou para a própria partícula viral. Normalmente, um vírus compreende um genoma viral de DNA ou RNA empacotado em um capsídeo viral e, no caso de um vírus com envelope, lipídios e outros componentes (por exemplo, membranas de células hospedeiras, etc.). A presente invenção abrange vírus do tipo selvagem e geneticamente modificados.

Como mencionado acima, o termo “vírus” e semelhantes devem ser entendidos amplamente como incluindo o vetor viral (por exemplo, vetor viral de DNA), bem como partículas virais geradas a partir do mesmo. O termo “infeccioso” refere-se à capacidade de um vírus de infectar e entrar em uma célula hospedeira ou sujeito.

[0053] O termo “de ocorrência natural”, “nativo” ou “tipo selvagem” é usado para descrever uma molécula ou organismo biológico que pode ser encontrado na natureza como distinto de ser artificialmente produzido pelo homem. Por exemplo, um vírus de ocorrência natural, nativo ou selvagem refere- se a um vírus que pode ser isolado de uma fonte na natureza ou obtido de coleções específicas (por exemplo, ECCAC, ATCC, CNCM, etc.). Uma molécula biológica ou um organismo que foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório não ocorre naturalmente. Exemplos representativos de vírus de ocorrência não natural incluem, entre muitos outros, vírus recombinantes modificados geneticamente pela inserção de um ou mais ácido(s) nucleico(s) de interesse no genoma viral e/ ou vírus defeituoso resultante de uma ou mais modificação(ões) no genoma viral (por exemplo, deleção total ou parcial de um gene viral).

[0054] O termo “obtido de”, “originário” ou “originado” é usado para identificar a fonte original de um componente (por exemplo, um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vírus, etc.), mas não se destina a limitar o método pelo qual o componente é feito o qual pode ser, por exemplo, por síntese química, recombinação homóloga, meios recombinantes ou quaisquer outros meios.

[0055] O termo “tratamento” (e qualquer forma de tratamento, como “tratando”, “tratar”), tal como aqui utilizado, abrange a profilaxia (por exemplo, medida preventiva em um sujeito em risco de ter a condição patológica) e/ ou terapia (por exemplo, em um sujeito diagnosticado como portador do quadro patológico), opcionalmente em associação com modalidades terapêuticas convencionais. O resultado do tratamento é retardar, curar, melhorar ou controlar a progressão da condição patológica alvo. Por exemplo, um sujeito é tratado com sucesso para um câncer se após a administração de um PCPV como aqui descrito, sozinho ou em combinação, o sujeito mostra uma melhora observável de seu estado clínico.

[0056] O termo “administração” (ou qualquer forma de administração, tal como “administrado”), tal como aqui utilizado, refere-se à entrega a um sujeito de um agente terapêutico, tal como o PCPV aqui descrito.

[0057] O termo “sujeito” geralmente se refere a um organismo para o qual qualquer produto e método da invenção é necessário ou pode ser benéfico. Normalmente, o sujeito é um mamífero, particularmente um mamífero selecionado a partir do grupo que consiste em animais domésticos, animais de fazenda, animais de esporte e primatas. De preferência, o sujeito é um ser humano que foi diagnosticado como portador ou em risco de ter uma doença patológica (por exemplo, um câncer). Os termos “sujeito” e “pacientes” podem ser usados indistintamente quando se referem a um organismo humano e abrangem masculino e feminino. O sujeito a ser tratado pode ser um recém- nascido, uma criança, um jovem adulto, um adulto ou um idoso.

VÍRUS DA PSEUDOVARÍOLA

[0058] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um vírus da pseudovaríola (PCPV) compreendendo pelo menos um ácido nucleico estranho inserido em seu genoma. Em uma forma de realização, o referido PCPV é para uso no tratamento de doenças, como doenças proliferativas ou infecciosas, conforme descrito a seguir.

[0059] O termo “vírus da pseudovaríola” ou “PCPV” é usado neste documento de acordo com seu significado comum em Virologia e se refere a um membro da família Poxviridae que se replica no citoplasma de seu hospedeiro e pertencente ao gênero Parapoxvirus. O PCPV possui um genoma de DNA linear e de fita dupla, tipicamente com 130-150 kilobases. A presente invenção abrange formas de ocorrência natural do vírus da pseudovaríola de qualquer cepa, bem como suas variantes que podem ser modificadas para vários fins, incluindo aqueles aqui descritos.

[0060] O gênero Parapoxvirus abrange uma série de espécies diferentes, incluindo Parapoxvirus ovis (ORFV), vírus da pseudovaríola (PCPV) e vírus da estomatite papular bovina(BPSV) e em cada espécie diferentes cepas foram descritas na técnica com a divulgação de sequências genômicas completas ou parciais; por exemplo, 01701, NZ2, NZ7, IA82, F07.821R, F09.1160S e cepas SA00 de ORFV e AR02 e cepas V660 do vírus da estomatite papular bovina. Exemplos representativos de cepas de PCPV adequadas para uso aqui incluem, sem limitação, YG2828 (número de acesso do Genbank LC230119), F07.801R (número de acesso do Genbank JF773693), F10.3081C (número de acesso do Genbank JF773695), F07.798R (número de acesso do Genbank JF773692), F99.177C (número de acesso do Genbank AY453678), IT1303/05 (número de acesso do Genbank JF800906), F00.120R (número de acesso do Genbank GQ329669; Tikkanen et al., 2004, J. Gen. Virol. 85: 1413-8) e TJS (também denominado VR634; número de acesso do Genbank GQ329670;

Friedman-Kien et al., 1963, Science 140: 1335-6; disponível em ATCC sob o número de acesso VR634). Essas cepas podem ter diferenças morfológicas, estruturais e/ ou genéticas entre si, por exemplo, em termos de comprimento de ITR, número de genes previstos e/ ou conteúdo rico em GC (ver por exemplo Hautaniemi et al., 2010, J. Gen. Virol.91: 1560-76).

[0061] No contexto da presente invenção, é dada preferência às espécies de PCPV. Em uma forma de realização preferida, o vírus PCPV da presente invenção é obtido a partir da cepa TJS do tipo selvagem conforme identificado pelo número de referência do ATCC ATCC VR-634™ ou a partir de uma cepa de vírus com o mesmo nome ou semelhante e seus fragmentos funcionais e variantes. De preferência, tal variante mantém pelo menos 75% de identidade no nível do nucleotídeo ou aminoácido com pelo menos um segmento de 10 quilobases (por exemplo, uma sequência contínua de 10 kb) no genoma do vírus da pseudovaríola TJS do tipo selvagem.

[0062] Modificações exemplares que são apropriadas no contexto da presente invenção incluem, sem qualquer limitação, inserção(ões), substituição(ões) e/ ou deleção(ões) de um ou mais nucleotídeo(s) dentro do genoma de PCPV com o objetivo de modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) a expressão de um ou mais genes virais ou infectividade do vírus em comparação com o vírus da pseudovaríola do tipo selvagem (por exemplo, cepa TJS) ou aumentar sua eficácia terapêutica (por exemplo, aumentar a capacidade do vírus PCPV de se expressar diferencialmente em células doentes em relação a células saudáveis) ou inserção de um ou mais ácidos nucleicos estranhos de interesse terapêutico ou geração de um vírus quimérico contendo fragmento(s) genômico(s) de PCPV com aqueles obtidos de uma origem de vírus diferente.

[0063] Em uma forma de realização preferida, o PCPV da invenção compreende inserido em seu genoma pelo menos um ácido nucleico estranho (por exemplo, resultando em um vírus PCPV recombinante). Alternativamente,

ou em combinação, o vírus PCPV pode ser defeituoso para uma função viral codificada pelo genoma de PCPV (por exemplo, uma função viral não essencial), de preferência para uma função de gene viral codificada no(s) local(is) de inserção do ácido nucleico estranho.

PCPV RECOMBINANTE

[0064] O termo “recombinante”, tal como aqui utilizado em relação ao vírus da presente invenção indica que o vírus foi modificado pela introdução de pelo menos um ácido nucleico estranho (também chamado de gene ou ácido nucleico recombinante), notavelmente um ácido nucleico de interesse conforme descrito aqui. No contexto da invenção, o “ácido nucleico estranho” que é inserido no genoma de PCPV não é encontrado ou expresso por um genoma de PCPV de ocorrência natural. No entanto, o ácido nucleico estranho pode ser homólogo ou heterólogo ao sujeito no qual o PCPV recombinante é introduzido.

Mais especificamente, pode ser de origem humana ou não (por exemplo, de origem bacteriana, de levedura ou viral, exceto de PCPV). Vantajosamente, o referido ácido nucleico estranho codifica um polipeptídeo ou é uma sequência de ácido nucleico capaz de se ligar pelo menos parcialmente (por hibridização) a um ácido nucleico celular complementar (por exemplo, DNA, RNA, miRNA) presente em uma célula doente com o objetivo de inibir um gene envolvido na referida doença. Um polipeptídeo é entendido como qualquer produto de tradução de um polinucleotídeo, independentemente do tamanho, e se glicosilado ou não, e inclui peptídeos e proteínas. Tal ácido nucleico estranho pode ser um gene nativo ou porção(ões) do mesmo (por exemplo, cDNA), ou qualquer variante deste obtido por mutação, deleção, substituição e/ ou adição de um ou mais nucleotídeos.

[0065] Em uma forma de realização preferida, o ácido nucleico estranho codifica um polipeptídeo que é capaz de fornecer uma atividade terapêutica ou profilática quando administrado apropriadamente a um sujeito

(isto é, um polipeptídeo de interesse terapêutico), levando a um efeito benéfico no curso ou sintoma da condição patológica a ser tratada. Um grande número de polipeptídeos de interesse terapêutico pode ser considerado. Em uma forma de realização, o ácido nucleico estranho codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos que compensam proteínas defeituosas ou deficientes em um sujeito, polipeptídeos que atuam por meio de efeitos tóxicos para limitar ou remover células doentes do corpo (por exemplo, produtos de genes suicidas); polipeptídeos capazes de potencializar a eficácia antitumoral (por exemplo, produtos de genes armados); e polipeptídeos capazes de induzir ou ativar uma resposta imune (tais como polipeptídeos imunoestimuladores e antigênicos). Um ácido nucleico estranho que codifica um produto gênico detectável também pode ser útil no contexto da invenção.

POLIPEPTÍDEOS IMUNOESTIMULADORES

[0066] Tal como aqui utilizado, o termo “polipeptídeo imunoestimulador” refere-se a um polipeptídeo que tem a capacidade de estimular o sistema imunológico, de uma forma específica ou não específica. Um grande número de polipeptídeos é conhecido na técnica por sua capacidade de exercer um efeito imunoestimulador. Exemplos de proteínas imunoestimuladoras adequadas no contexto da invenção incluem, sem limitação, citocinas, com uma preferência específica por interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-24), quimiocinas (por exemplo, CXCL10, CXCL9, CXCL11), interferons (por exemplo, IFNα, IFNβ, IFNγ), fator de necrose tumoral (TNF), fatores estimuladores de colônias (por exemplo, GM-CSF, C- CSF, M-CSF...), proteínas expostas a APC (para Célula Apresentadora de Antígeno) (por exemplo, B7.1, B7.2 e semelhantes), polipeptídeos com efeito anti-angiogênico (por exemplo, inibidores do Fator de Crescimento Endotelial Vascular, como bevacizumab ou ranibizumab) e polipeptídeos que afetam a regulação dos receptores de superfície celular, tais como agonistas ou antagonistas de pontos de verificação imunológicos (por exemplo, anticorpos direcionados a PD1 ou seu ligante (por exemplo, anti-PD-L1), CTLA4, LAG3, OX40, etc). Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo imunoestimulador é uma interleucina ou um fator de estimulação de colônia (por exemplo, GM-CSF) ou um anticorpo agonista direcionado a OX40.

POLIPEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS

[0067] Conforme ilustrado na seção Exemplo, o PCPV pode estimular a imunidade inata (não específica) do sujeito injetado. Portanto, a combinação deste efeito com a expressão de um polipeptídeo antigênico pode fornecer um vírus capaz de estimular respostas imunes inatas e específicas. Isso pode ser importante para a obtenção de uma resposta anticâncer eficaz e para fins de vacinação para fornecer proteção contra um patógeno específico. Esse efeito pode durar semanas.

[0068] O termo “antigênico” refere-se à capacidade de induzir ou estimular uma resposta imune mensurável em um sujeito no qual o PCPV recombinante que codifica o polipeptídeo qualificado como antigênico foi introduzido. A resposta imune estimulada ou induzida contra o polipeptídeo antigênico expresso pelo referido PCPV recombinante pode ser humoral e/ ou celular (por exemplo, produção de anticorpos, citocinas e/ ou quimiocinas envolvidas na ativação de células imunes efetoras). A resposta imune estimulada ou induzida geralmente contribui para um efeito protetor no sujeito administrado. Uma grande variedade de ensaios biológicos diretos ou indiretos estão disponíveis na técnica para avaliar a natureza antigênica de um polipeptídeo in vivo (animais ou seres humanos) ou in vitro (por exemplo, em uma amostra biológica). Por exemplo, a capacidade de um determinado antígeno em estimular a imunidade inata pode ser realizada, por exemplo, medição das células NK/ NKT (por exemplo, representatividade e nível de ativação), bem como, citocinas relacionadas com IFN e/ ou cascatas produtoras de quimiocinas, ativação de TLRs e outros marcadores de imunidade inata (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5 (1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964- 2968). A capacidade de um determinado antígeno para estimular uma resposta imune mediada por células pode ser realizada, por exemplo, por quantificação de citocina(s) produzida(s) por células T ativadas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+, usando bioensaios de rotina (por exemplo, caracterização e/ ou quantificação de células T por ELISPOT, por citometria de fluxo de multiparâmetros, ICS, por análise de perfil de citocinas utilizando tecnologias multiplex ou ELISA), por determinação da capacidade proliferativa das células T (por exemplo, ensaios de proliferação de células T por ensaio de incorporação de timidina [ 3H]), avaliando a capacidade citotóxica de linfócitos T específicos para antígeno em um sujeito sensibilizado ou identificando subpopulações de linfócitos por citometria de fluxo e por imunização de modelos animais apropriados, conforme descrito neste documento.

[0069] É contemplado que o termo polipeptídeo antigênico engloba antígeno nativo, bem como fragmento (por exemplo, epítopos, domínios imunogênicos, etc.) e sua variante, desde que tal fragmento ou variante seja capaz de ser o alvo de uma resposta imune. Os polipeptídeos antigênicos preferidos para uso aqui são antígenos associados a tumor e antígenos de organismos patogênicos (bactérias, vírus, parasitas, fungos, viroides ou príons). Está dentro do escopo do técnico no assunto selecionar um ou mais polipeptídeos antigênicos que são apropriados para o tratamento de uma condição patológica particular.

[0070] Em uma forma de realização, o(s) polipeptídeo(s) antigênico(s) codificado(s) pelo vírus PCPV é/ são antígeno(s) de câncer (também chamados de antígenos associados a tumor) que estão associados com e/ ou servem como marcadores de cânceres. Os antígenos de câncer abrangem várias categorias de polipeptídeos, por exemplo, aqueles que são normalmente silenciosos (ou seja, não expressos) em células saudáveis, aqueles que são expressos apenas em níveis baixos ou em certos estágios de diferenciação e aqueles que são expressos temporariamente, como antígenos embrionários e fetais como bem como aqueles resultantes da mutação de genes celulares, como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), proto-oncogenes (por exemplo, família ErbB) ou proteínas resultantes de translocações cromossômicas.

[0071] Alguns exemplos não limitativos de antígenos de câncer incluem, sem limitação, MART-1/Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína de ligação à adenosina desaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorretal associado (CRC)-C017-1A/GA733, Antígeno Carcinoembrionário (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP-2, etv6, aml1, Antígeno Específico da Próstata (PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA-1, PSA-2 e PSA-3, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor de células T/ cadeia CD3-zeta, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE- 5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE- 9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC (por exemplo, MUC1, MUC16, etc; ver, por exemplo, US 6,054,438; WO 98/04727; ou WO 98/37095), HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfa-fetoproteína, E-caderina, alfa-catenina, beta-catenina e gama-catenina, p120ctn, gp100.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína polipose adenomatosa coli (APC), fodrin, Connexina 37, Ig-idiotipo, p15, gp75, gangangliosídeos GM2 e GD2, família Smad de antígenos de câncer de glicogênio fosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX- 4, SSX-5, SCP-1 e CT-7 e c-erbB-2.

[0072] Os antígenos de câncer também podem abranger antígenos codificados por organismos patogênicos que são capazes de induzir uma condição maligna em um sujeito (especialmente sujeito infectado cronicamente), como vírus de tumor de RNA e DNA (por exemplo, HPV, HCV, HBV, EBV, etc) e bactérias (por exemplo, Helicobacter pilori).

[0073] Os polipeptídeos antigênicos virais para uso nesta invenção incluem, por exemplo, antígenos do vírus da hepatite A, B, C, D ou E, vírus da imunodeficiência (por exemplo, HIV), vírus do herpes (HSV), citomegalovírus, varicela zoster, vírus do papiloma (HPV), Vírus Epstein Barr (EBV), vírus influenza, vírus para-influenza, adenovírus, vírus coxsakie, vírus picorna, rotavírus, vírus sincicial respiratório, poxvírus, rinovírus, vírus da rubéola, papovírus, vírus da caxumba, vírus do sarampo. Alguns exemplos não limitativos de antígenos de HIV incluem gp120 gp40 , gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef tat, nef. Alguns exemplos não limitativos de antígenos do vírus do herpes humano incluem gH, gL gM gB gC gK gE ou gD ou proteína inicial imediata, como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 de HSV1 ou HSV2. Alguns exemplos não limitativos de antígenos de citomegalovírus incluem gB. Alguns exemplos não limitativos de derivados do vírus Epstein Barr (EBV) incluem gp350 e o antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1. Alguns exemplos não limitativos de antígenos do vírus varicela zoster incluem gp1, 11, 111 e IE63. Alguns exemplos não limitativos de antígenos do vírus da hepatite C (HCV) incluem a proteína E1 ou E2 env, proteína central, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a e NS5b. Alguns exemplos não limitativos de antígenos do vírus da hepatite B (VHB) incluem polimerase, polipeptídeo núcleo e env (por exemplo, a combinação de antígenos VHB descritos em WO 2013/007772). Alguns exemplos não limitativos de antígenos do papiloma vírus humano (HPV) incluem L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7. Antígenos derivados de outros patógenos virais, como o vírus respiratório sincicial (por exemplo, proteínas F e G), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, flavivírus (por exemplo, vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapato, vírus da encefalite japonesa) e as células do vírus da gripe (por exemplo, proteínas HA, NP, NA ou M) também podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção. Em uma forma de realização preferida, o PCPV da invenção é modificado geneticamente para codificar e expressar antígenos E6 e/ ou E7 do HPV-16 ou HPV-18.

[0074] Os polipeptídeos antigênicos bacterianos incluem, por exemplo, antígenos de Mycobacteria causando TB e lepra, pneumocci, bacilos Gram negativos aeróbicos, micoplasma, estafilococos, estreptococos, salmonelas, chlamydiae, neisseriae e semelhantes.

[0075] Os polipeptídeos antigênicos parasitas incluem, por exemplo, antígenos da malária, leishmaniose, tripanossomíase, toxoplasmose, esquistossomose e filariose.

[0076] Os polipeptídeos antigênicos preferidos para expressão pelo PCPV da presente invenção são: - o antígeno MUC-1 aberrantemente glicosilado e superexpresso em uma variedade de cânceres epiteliais; - o antígeno E7 de HPV-16, em particular uma variante não oncogênica do mesmo; e - antígenos de HBV, em particular uma fusão compreendendo HBV polimerase, proteína central de HBV e domínios imunogênicos de HBsAg (por exemplo, conforme descrito em WO2013/

007772).

PRODUTOS DE GENES SUICIDAS

[0077] O termo “produto do gene suicida” refere-se a um polipeptídeo capaz de converter um precursor de uma droga, também denominado “pró-droga”, em um composto citotóxico. Exemplos de produtos de genes suicidas e pró-drogas correspondentes são divulgados na tabela a seguir: TABELA 1 Produto de gene suicida Pró-droga Timidina Quinase Ganciclovir; Éster de ácido elaídico de ganciclovir; penciclovir; Aciclovir; Valacyclovir; (E)-5-(2-bromovinil)-2’-desoxiuridina; zidovudina; 2’-Exo-metanocarbatimidina Citosina desaminase 5-Fluorocitosina Purina nucleosídeo fosforilase 6-metilpurina desoxirribósido; Fludarabina Uracil fosforibosil transferase 5-fluorocitosina; 5-Fluorouracil Timidilato quinase Azidotimidina

[0078] Desejavelmente, o PCPV da invenção carrega em seu genoma um gene suicida que codifica um polipeptídeo possuindo pelo menos atividade da citosina desaminase (CDase). Nos procariotos e eucariotos inferiores (não está presente em mamíferos), a CDase está envolvida na via metabólica da pirimidina, pela qual a citosina exógena é transformada em uracila por meio de uma desaminação hidrolítica. A CDase também desamina um análogo da citosina, ou seja, 5-fluorocitosina (5-FC), formando assim 5- fluorouracila (5-FU), um composto que é citotóxico por si só, mas ainda mais quando é convertido em 5-fluoro-UMP (5-FUMP) pela ação da uracila fosforibosil transferase (UPRTase).

[0079] O ácido nucleico que codifica CDase e UPRTase pode ser obtido a partir de quaisquer procariotos e eucariotos inferiores. As sequências de genes e enzimas codificadas foram publicadas e estão disponíveis em bancos de dados especializados, como SWISSPROT EMBL, Genbank, Medline e semelhantes). CDase de Saccharomyces cerevisiae (gene FCY1) e/ ou UPRTase (gene FUR1) são preferidas no contexto desta invenção (Kern et al., 1990, Gene, 88: 149-57). Variantes funcionais desses genes também podem ser usadas. Tais variantes retêm de preferência um grau de identidade de pelo menos 75%, com a sequência de aminoácidos da contraparte nativa.

Um análogo funcional de UPRTase N-terminal truncado é particularmente útil no contexto da invenção devido à sua capacidade de exibir uma atividade de UPRTase mais alta do que a da enzima nativa (por exemplo, como descrito em EP 998568 com uma deleção dos 35 primeiros resíduos até o segundo resíduo Met da proteína nativa). Também é preferido um polipeptídeo com atividades de CDase e UPRTase modificadas geneticamente por fusão de duas atividades enzimáticas (ver, por exemplo, FCY1::FUR1 e FCY1::FUR1 [Delta] 105 (FCU1) e polipeptídeos FCU1-8 descritos em WO 96/16183, EP 998568 e WO 2005/07857). De particular interesse é o gene suicida FCU1 (ou fusão FCY1::FUR1 [Delta] 105) que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos representada no identificador de sequência SEQ ID NO: 1 de WO 2009/065546).

PRODUTOS DO GENE DE ARMAMENTO

[0080] Outros ácidos nucleicos estranhos podem ser usados no contexto da invenção para armar o vírus PCPV com o objetivo de potencializar a eficácia antitumoral. Em uma forma de realização, o produto do gene armado é selecionado a partir do grupo que consiste em moduladores de pool de nucleosídeos (por exemplo, citidina desaminase e notavelmente citidina desaminase de levedura (CDD1) ou citidina desaminase humana (hCD); ver EP 16306831.5); polipeptídeos que atuam nas vias metabólicas e imunológicas (por exemplo, adenosina desaminase e notavelmente a adenosina desaminase humana huADA1 ou huADA2; ver EP 17306012.0); polipeptídeos atuando na via apoptótica; endonucleases (como enzimas de restrição, CRISPR/Cas9) e RNAs específicos de alvo (por exemplo, miRNA, shRNA, siRNA).

PRODUTOS GENÉTICOS DETECTÁVEIS

[0081] Normalmente, esse polipeptídeo é detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos ou outros meios físicos e, portanto, pode permitir a identificação do PCPV recombinante dentro de uma célula hospedeira ou sujeito. Exemplos não limitativos de produtos de genes detectáveis adequados incluem mCherry, Emerald, luciferase de vagalume e proteínas fluorescentes verdes (GFP e sua versão aprimorada e-GFP) detectáveis por meios fluorescentes, bem como beta- galactosidase detectável por meios colorimétricos.

[0082] A presente invenção também abrange PCPV que expressa dois ou mais polipeptídeos de interesse, conforme descrito neste documento, por exemplo, pelo menos dois polipeptídeos antigênicos (por exemplo, polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16), pelo menos um antígeno e uma citocina (por exemplo, antígeno MUC1 e IL-2), pelo menos dois antígenos e uma citocina (por exemplo, antígenos E6 e E7 de HPV e IL-2), etc.

[0083] No contexto da presente invenção, o polipeptídeo codificado de interesse para uso aqui pode incorporar características estruturais que são benéficas para sua expressão pelo PCPV da invenção e seu efeito terapêutico no sujeito; tais como aqueles que permitem facilitar a clonagem no genoma de PCPV (modificação de potenciais locais de clivagem), para reforçar a natureza antigênica (modificação de locais de glicosilação) e/ ou para melhorar a apresentação de MHC classe I e/ ou MHC classe II (por exemplo, ancoragem na membrana). A ancoragem membrana pode ser conseguida por incorporação no polipeptídeo de interesse de uma sequência de ancoragem à membrana e uma sequência secretora (isto é, um peptídeo sinal), se o polipeptídeo nativo não o tem. Resumidamente, os peptídeos sinal geralmente compreendem 15 a 35 aminoácidos essencialmente hidrofóbicos que são então removidos por uma endopeptidase localizada em ER (retículo endoplasmático) específica para dar o polipeptídeo maduro. Os peptídeos transmembrana também são de natureza altamente hidrofóbica e servem para ancorar os polipeptídeos na membrana celular. A escolha dos peptídeos transmembrana e/ ou de sinal que podem ser utilizados no contexto da presente invenção é vasta. Eles podem ser obtidos a partir de polipeptídeos celulares ou virais, tais como os de imunoglobulinas, ativador de plasminogênio tecidual, insulina, glicoproteína da raiva, a glicoproteína do envelope do vírus HIV ou a proteína F do vírus do sarampo ou podem ser sintéticos. De preferência, a sequência secretora é inserida no terminal N do polipeptídeo a jusante do códon para o início da tradução e a sequência de ancoragem na membrana no terminal C, de preferência imediatamente a montante do códon de parada.

GERAÇÃO E EXPRESSÃO DO(S) ÁCIDO(S) NUCLEICO(S) ESTRANHO(S)

[0084] O(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) a ser(em) expresso(s) pelo PCPV da presente invenção pode(m) ser facilmente gerado(s) por uma série de maneiras conhecidas pelos técnicos no assunto (por exemplo, clonagem, amplificação por PCR, embaralhamento de DNA). Por exemplo, tal ácido nucleico estranho pode ser isolado a partir de qualquer fonte disponível (por exemplo, materiais biológicos descritos na técnica, cDNA e bibliotecas genômicas, ou qualquer vetor do estado da técnica conhecido por incluí-lo) usando dados de sequência disponíveis para o técnicos no assunto (por exemplo, publicações, pedidos de patentes, Genbank, etc.) e, em seguida, inseridos adequadamente no genoma do PCPV. Alternativamente, eles também podem ser gerados por síntese química em processo automatizado (por exemplo, montados a partir de oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos ou gene sintético). De preferência, esse ácido nucleico estranho é obtido a partir de cDNA e não compreende sequências intrônicas. A(s) modificação(ões) podem ser geradas por uma série de maneiras conhecidas pelos técnicos no assunto, tais como síntese química, mutagênese dirigida ao local, mutagênese por PCR, etc.

[0085] No contexto da presente invenção, o ácido nucleico estranho pode ser otimizado para fornecer expressão de alto nível em uma célula hospedeira ou sujeito particular. De fato, foi observado que os padrões de uso de códons de organismos são altamente não aleatórios e o uso de códons pode ser marcadamente diferente entre diferentes hospedeiros. Como o ácido nucleico estranho pode ser de procarioto (por exemplo, antígeno bacteriano ou viral) ou de origem eucariota inferior (por exemplo, produto do gene suicida), ele pode ter um padrão de uso de códon inadequado para expressão eficiente em células eucarióticas superiores (por exemplo, humano). Normalmente, a otimização do códon é realizada substituindo um ou mais códons “nativos” correspondentes a um códon raramente usado por um ou mais códons que codificam o mesmo aminoácido que é mais frequentemente usado no sujeito a ser tratado. Não é necessário substituir todos os códons nativos correspondentes pelos códons usados com pouca frequência, uma vez que a expressão aumentada pode ser alcançada mesmo com substituição parcial.

[0086] Além da otimização do uso do códon, a expressão também pode ser melhorada por meio de modificações adicionais do ácido nucleico estranho. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico pode ser modificada de modo a evitar o agrupamento de códons raros e não ótimos presentes em áreas concentradas e/ ou para suprimir ou modificar elementos de sequência “negativa” que se espera que influenciem negativamente os níveis de expressão.

Esses elementos de sequência negativa incluem, sem limitação, as regiões com conteúdo de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (< 30%); Alongamentos de sequência ricos em AT ou ricos em GC; sequências de repetição direta ou invertida instáveis; Estruturas secundárias de R A; e/ ou elementos reguladores crípticos internos, como TATA-box internos, chi-sites, locais de entrada de ribossomo e/ ou locais doadores/ aceitadores de splicing.

[0087] Além disso, quando os ácidos nucleicos estranhos homólogos precisam ser expressos pelo PCPV da invenção, pelo menos uma das sequências homólogas (pelo menos uma porção desta) pode ser degenerada sobre o ácido nucleico de comprimento total ou porção(ões) do mesmo, de modo a reduzir a identidade da sequência. Na verdade, é aconselhável degenerar as porções de sequências que mostram um alto grau (por exemplo, pelo menos 70%) de identidade de sequência de modo a evitar problemas de recombinação homóloga durante o processo de produção e o técnicos no assunto é capaz de identificar essas porções por alinhamento de sequência. Exemplos de degeneração de sequência apropriada aplicada a antígenos de HPV obtidos de vários serotipos (por exemplo, antígenos E6 e/ ou E7 de HPV-16 e HPV-18) podem ser encontrados em WO 2008/092854.

[0088] Em uma forma de realização, o(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) a ser(em) inserido(s) e expresso(s) pelo PCPV da invenção está/ estão operacionalmente ligados a elementos reguladores adequados para expressão em uma célula hospedeira ou sujeito desejado.

[0089] Tal como aqui utilizado, o termo “elementos reguladores” ou “sequência reguladora” refere-se a qualquer elemento que permite, contribui ou modula a expressão do(s) ácido(s) nucleico(s) em uma determinada célula hospedeira ou sujeito, incluindo replicação, duplicação, transcrição, splicing, tradução, estabilidade e/ ou transporte do(s) ácido(s) nucleico(s) ou seu(s) derivado(s) (isto é, mRNA). Conforme usado neste documento, “operacionalmente ligado” significa que os elementos sendo ligados são dispostos de modo que funcionem em conjunto para os fins pretendidos. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico se o promotor efetua a transcrição desde o início da transcrição ao terminador do referido ácido nucleico pelo menos em uma célula hospedeira permissiva.

[0090] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que a escolha das sequências regulatórias pode depender de fatores como o(s)

próprio(s) ácido(s) nucleico(s), o nível de expressão desejado, etc. O promotor é de especial importância. No contexto da invenção, pode ser a expressão de direção constitutiva do ácido nucleico estranho em muitos tipos de células ou específico para certos tipos de células ou tecidos ou regulado de acordo com a fase de um ciclo viral (por exemplo, tardio, intermediário ou precoce). Pode-se também usar promotores que são reprimidos durante a etapa de produção em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (por exemplo, componentes específicos, temperatura, etc.), a fim de otimizar a produção do PCPV recombinante e contornar a toxicidade potencial do(s) polipeptídeo(s) expresso(s).

[0091] Os promotores de poxvírus são particularmente adaptados para expressão em PCPV recombinante. Em uma forma de realização, o ácido nucleico estranho inserido no genoma de PCPV é colocado sob o controle de um promotor de poxvírus, de preferência, um promotor de vírus Vaccinia e mais preferencialmente um selecionado a partir do grupo que consiste em 7,5K, H5R, 11K7,5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28), promotor SE, TK, pB2R, p28, p11 e K1L, promotores sintéticos como os descritos em Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; e Kumar e Boyle, 1990, Virology 179: 151-8) e promotores quiméricos precoces/ tardios.

[0092] Os técnicos no assunto apreciarão que os elementos reguladores que controlam a expressão de pelo menos um ácido nucleico estranho podem compreender ainda elementos adicionais para a iniciação, regulação e/ ou terminação adequada da transcrição (por exemplo, sequências de terminação de transcrição poliA), transporte de mRNA (por exemplo sequências de localização nuclear), tradução (por exemplo, um iniciador Met, sequências líderes tripartidas, etc.), processamento (por exemplo, peptídeos de sinal, sequências de ancoragem transmembrana, etc.) e etapas de purificação

(por exemplo, um marcador).

INSERÇÃO NO GENOMA DO PCPV E GERAÇÃO DO PCPV RECOMBINANTE

[0093] A inserção do(s) pelo menos um do(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) (equipados com elementos reguladores apropriados) no genoma de PCPV é feita por meios convencionais, usando enzimas de restrição apropriadas ou, de preferência, por recombinação homóloga.

[0094] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para gerar o PCPV recombinante da invenção por recombinação homóloga entre um plasmídeo de transferência compreendendo o ácido nucleico estranho (com seus elementos reguladores) flanqueado em 5’ e 3’ com sequências de PCPV respectivamente presentes a montante e a jusante do local de inserção e um genoma de PCPV. Em uma forma de realização, o referido método compreende uma etapa de geração do referido plasmídeo de transferência (por exemplo, por métodos convencionais de biologia molecular) e uma etapa de introdução do referido plasmídeo de transferência em uma célula hospedeira adequada, nomeadamente em conjunto com um vírus PCPV compreendendo a sequência de flanqueamento presente na transferência plasmídeo (por exemplo, um vírus PCPV do tipo selvagem). De preferência, o plasmídeo de transferência é introduzido na célula hospedeira por transfecção e o vírus PCPV por infecção.

[0095] O tamanho de cada sequência de flanqueamento de PCPV pode variar. É geralmente pelo menos 100 pb e no máximo 1500 pb, com uma preferência de aproximadamente 150 a 500 pb em cada lado do ácido nucleico estranho, vantajosamente de 180 a 450 pb, de preferência de 200 a 400 pb e mais preferencialmente de 250 a 350 pb com um preferência por aproximadamente 300 pb em cada lado do ácido nucleico estranho a ser inserido.

[0096] Vários locais de inserção podem ser considerados no genoma do PCPV incluindo, sem qualquer limitação, em um gene viral, com preferência por um gene viral não essencial, em uma região intergênica, em uma porção do genoma de PCPV que não codifica o produtos de gene ou em locus duplicado (genes ou locus que ocorrem em 2 ou mais cópias no genoma do vírus nativo). Após a inserção do(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) no genoma de PCPV de acordo com o método da invenção, o locus viral no local de inserção pode ser eliminado pelo menos parcialmente. Em uma forma de realização, esta deleção ou deleção parcial pode resultar na expressão suprimida do produto do gene viral codificado pela sequência de PCPV deletada resultando em um vírus PCPV defeituoso para a referida função do vírus.

[0097] Exemplos de locais de inserção são fornecidos em US 6,365,393. Em uma forma de realização preferida, o(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) é/ são inserido(s) em um locus não essencial e duplicado do genoma de PCPV com preferência para o locus de VEGF (Rziha et al., 2000, J.

Biotechnol. 83 (1-2): 137-145). Deve-se notar que o gene VEGF existe em 2 cópias no genoma de PCPV e a presente invenção contempla a inserção em ambos os locus de VEGF ou em apenas um (deixando uma cópia intacta para fornecer a função viral). De preferência, o ácido nucleico estranho é inserido em ambos os locus de VEGF, resultando em duas cópias do ácido nucleico estranho inserido no genoma de PCPV.

[0098] Em certas formas de realização, o método da presente invenção usa ainda uma seleção e/ ou um gene detectável para facilitar a identificação do PCPV recombinante. Em formas de realização preferidas, o plasmídeo de transferência compreende ainda um marcador de seleção com uma preferência específica para o gene GPT (que codifica uma guanina fosforibosil transferase) permitindo o crescimento em um meio seletivo (por exemplo, na presença de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina) ou um gene detectável que codifica um produto de gene detectável, como GFP, e-GFP ou mCherry. Em uma forma de realização, o plasmídeo de transferência é introduzido na célula hospedeira na presença de uma endonuclease capaz de fornecer uma quebra de fita dupla no referido gene de seleção ou detectável. A referida endonuclease pode estar na forma de uma proteína ou expressa por um vetor de expressão. Formas de realização representativas são ilustradas na seção Exemplo.

[0099] A recombinação homóloga que permite gerar o PCPV recombinante é preferencialmente realizada em células hospedeiras apropriadas (por exemplo, células de turbinato bovino).

[00100] As formas de realização particularmente preferidas são métodos para a geração de: - um vírus PCPV compreendendo, inserido dentro de um ou ambos os locus de VEGF, um ácido nucleico que codifica o antígeno MUC-1 humano (por exemplo, como descrito em WO 92/07000 e US 5,861,381) de preferência sob o controle transcricional do promotor precoce/ tardio de pH5R de Vaccinia; ou - um vírus PCPV compreendendo, inserido dentro de um ou ambos os locus de VEGF, um ácido nucleico que codifica um antígeno E7 não oncogênico HPV-16 ancorado na membrana (como descrito em WO 99/03885) de preferência sob o controle transcricional do promotor p7.5 precoce/ tardio da Vaccinia.

PRODUÇÃO DE VÍRUS PCPV

[00101] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para amplificar o PCPV da invenção. De preferência, o referido método compreende as etapas de a) preparar uma linhagem celular produtora, b) transfectar ou infectar a linhagem celular produtora preparada, c) cultivar a linhagem celular produtora transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus (por exemplo, partículas virais infecciosas), d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem celular produtora e, opcionalmente, e) purificar o referido vírus recuperado.

[00102] Em uma forma de realização, a célula produtora é uma célula de mamífero (por exemplo, humana ou não humana) e preferencialmente células HeLa (por exemplo, ATCC-CRM-CCL-2TM ou ATCC- CCL-2.2TM).

[00103] As células produtoras são preferencialmente cultivadas em um meio apropriado que pode, se necessário, ser suplementado com soro e/ ou fator(es) de crescimento adequado(s) ou não (por exemplo, um meio quimicamente definido de preferência livre de produtos derivados de animais ou humanos). Um meio apropriado pode ser facilmente selecionado por aqueles técnicos no assunto dependendo das células produtoras. Esses meios estão disponíveis comercialmente. As células produtoras são preferencialmente cultivadas a uma temperatura compreendida entre +30 °C e +38 °C (mais preferencialmente a aproximadamente 37 °C) durante entre 1 e 8 dias antes da infecção. Se necessário, várias passagens de 1 a 8 dias podem ser feitas para aumentar o número total de células.

[00104] Na etapa b), as células produtoras são infectadas pelo vírus PCPV aqui descrito em condições apropriadas, usando uma multiplicidade de infecção (MOI) apropriada para permitir a infecção produtiva das células produtoras. Para fins ilustrativos, uma MOI apropriada varia de 10-3 a 50, com uma preferência específica para uma MOI compreendendo de 0,01 a

5. A etapa de infecção é realizada em um meio que pode ser igual ou diferente do meio usado para a cultura de células produtoras.

[00105] Na etapa c), as células produtoras infectadas são então cultivadas em condições apropriadas bem conhecidas dos técnicos no assunto até que a progênie do vírus (por exemplo, partículas de vírus infecciosas) seja produzida. A cultura de células produtoras infectadas também é preferencialmente realizada em um meio que pode ser o mesmo ou diferente do meio/ ambiente usado para cultura de células produtoras e para a etapa de infecção, a uma temperatura entre +32 °C e +37 °C, por 1 a 5 dias.

[00106] Na etapa d), o vírus produzido na etapa c) é coletado do sobrenadante da cultura e/ ou das células produtoras. A recuperação das células produtoras pode exigir uma etapa que permita a ruptura da membrana da célula produtora para permitir a liberação do vírus. A ruptura da membrana da célula produtora pode ser induzida por várias técnicas bem conhecidas dos técnicos no assunto, incluindo, mas não se limitando a: congelamento/ descongelamento, lise hipotônica, sonicação, microfluidização, homogeneização de alto cisalhamento (também chamado de alta velocidade) ou homogeneização de alta pressão.

[00107] Os vetores virais podem então ser purificados adicionalmente, usando etapas de purificação bem conhecidas na técnica.

Várias etapas de purificação podem ser consideradas, incluindo clarificação, tratamento enzimático (por exemplo, endonuclease, protease, etc), etapas cromatográficas e de filtração. Métodos apropriados são descritos na técnica (por exemplo, em WO 2007/147528).

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00108] Em um aspecto, é fornecida uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do PCPV aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em formas de realização, o PCPV é recombinante e compreende inserido em seu genoma um ou mais ácidos nucleicos estranhos (com elementos reguladores adequados, conforme descrito acima), notavelmente um ou mais ácidos nucleicos estranhos que codificam um polipeptídeo antigênico, como um antígeno de câncer, um antígeno originado de um organismo patogênico e/ ou um polipeptídeo imunoestimulador, etc). Em uma forma de realização específica, a composição pode compreender exossomos gerados após a infecção por PCPV.

[00109] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” corresponde à quantidade de PCPV que é suficiente para produzir resultados benéficos. Essa quantidade terapeuticamente eficaz pode variar em função de vários parâmetros, tais como o modo de administração; a idade e o peso do sujeito; a natureza e extensão dos sintomas; a capacidade do sujeito de responder ao tratamento, tipo de tratamento concomitante; a frequência do tratamento e/ ou a necessidade de prevenção ou terapia, etc.

[00110] Quando o uso “profilático” está em causa, a composição é administrada em uma dose suficiente para prevenir ou atrasar o início e/ ou estabelecimento e/ ou recidiva da condição patológica, especialmente em um sujeito em risco. Para uso “terapêutico”, a composição é administrada a um sujeito diagnosticado como portador de uma doença ou condição patológica com o objetivo de tratá-la, opcionalmente em associação com uma ou mais modalidades terapêuticas convencionais.

[00111] O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” se destina a incluir todos e quaisquer veículos, solventes, diluentes, excipientes, adjuvantes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de absorção e semelhantes compatíveis com a administração em mamíferos e em indivíduos humanos em particular. Exemplos não limitativos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, NaCl, soluções salinas normais, lactato de Ringer, solução de sacarídeo (por exemplo, glicose, trealose, sacarose, dextrose, etc), álcoois, óleos, gelatinas, carboidratos, tais como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácido graxo, hidroximetilcelulose e semelhantes, bem como outras soluções salinas aquosas fisiologicamente equilibradas (ver por exemplo a edição mais atual de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins).

[00112] Em uma forma de realização, a composição de PCPV da invenção é formulada de forma adequada para garantir sua estabilidade sob as condições de fabricação e armazenamento de longo prazo (ou seja, por pelo menos 6 meses, com preferência de pelo menos dois anos) no congelamento (por exemplo, -70 °C, -20 °C), temperatura refrigerada (por exemplo, 4 °C) ou ambiente (por exemplo, 20-25 °C). Essas formulações geralmente incluem um veículo líquido, como soluções aquosas.

[00113] Vantajosamente, a formulação para uso neste documento é adequadamente tamponada para uso humano, de preferência em pH fisiológico ou ligeiramente básico (por exemplo, de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9 com uma preferência específica para um pH compreendido entre 7 e 8 e mais particularmente próximo a 7,5). Os tampões adequados incluem, sem limitação, TRIS (tris(hidroximetil)metilamina), TRIS- HCl (tris(hidroximetil)metilamina-HCl), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1- piperazinoetanossulfônico), tampão fosfato (por exemplo, PBS), ACES (Ácido N- (2-acetamido)-aminoetanossulfônico), PIPES (Piperazina-N,N’-bis(ácido 2- etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-(N-Morfolino)-2-hidroxipropanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico), TES (ácido 2- {[tris(hidroximetil)metil]amino}etanossulfônico), DIPSO (ácido 3-[bis(2- hidroxietil)amino]-2-hidroxipropano-1-sulfônico), MOBS (ácido 4-(N- morfolino)butanossulfônico), TAPSO (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2- hidroxipropanossulfônico), HEPPSO (ácido 4-(2-Hidroxietil)-piperazina-1-(2- hidroxi)-propanossulfônico), POPSO (ácido 2-hidroxi-3-[4-(2-hidroxi-3- sulfopropil)piperazin-1-il] propano-1-sulfônico), TEA (trietanolamina), EPPS (ácido N-(2-Hidroxietil)-piperazina-N’-3-propanossulfônico), e TRICINA (N- [Tris(hidroximetil)-metil]-glicina). De preferência, o referido tampão é selecionado a partir de TRIS-HCl, TRIS, Tricina, HEPES e tampão de fosfato compreendendo uma mistura de Na2HPO4 e KH2PO4 ou uma mistura de Na2HPO4 e NaH2PO4. O referido tampão (em particular aqueles mencionados acima e notavelmente

TRIS-HCl) está preferencialmente presente em uma concentração de 10 a 50 mM. Pode ser benéfico incluir também em tais formulações um sal monovalente de modo a assegurar uma pressão osmótica apropriada. O referido sal monovalente pode de forma notável ser selecionado a partir a partir de NaCl e KCl, de preferência o referido sal monovalente é NaCl, de preferência em uma concentração de 10 a 500 mM.

[00114] A formulação também pode incluir um crioprotetor de modo a proteger a composição à base de vírus a baixa temperatura de armazenamento. Crioprotetores adequados incluem, sem limitação, sucrose (ou sacarose), trealose, maltose, lactose, manitol, sorbitol e glicerol, de preferência em uma concentração de 0,5 a 20% (peso em g/ volume em L, referido como p/ v). Por exemplo, a sacarose está preferencialmente presente em uma concentração de 5 a 15% (p/ v).

[00115] A composição de PCPV, e especialmente uma composição líquida da mesma, pode ainda compreender um agente quelante farmaceuticamente aceitável e, em particular, um agente quelante para melhorar a estabilidade. O agente quelante farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado, notavelmente, a partir de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético (BAPTA), ácido etilenoglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA) e ácido 2,3-dimercapto-1- propanossulfônico (DMPS). O agente quelante farmaceuticamente aceitável está preferencialmente presente em uma concentração de pelo menos 50 µM com uma preferência específica para uma concentração de 50 a 1000 µM. De preferência, o referido agente quelante farmaceuticamente aceitável é EDTA presente em uma concentração próxima de 150 µM.

[00116] Compostos adicionais podem ainda estar presentes para aumentar a estabilidade da composição de PCPV. Tais compostos adicionais incluem, sem limitação, álcool C2-C3 (desejavelmente em uma concentração de 0,05 a 5% (volume/ volume ou v/ v)), glutamato de sódio (desejavelmente em uma concentração inferior a 10 mM), tensoativo não iônico (US 7,456,009, US 2007-0161085), como Tween 80 (também conhecido como polissorbato 80) em baixa concentração abaixo de 0,1%. Sais divalentes, tais como MgCl2 ou CaCl2 foram encontrados como introduzindo a estabilização de vários produtos biológicos no estado líquido (ver Evans et ai 2004, J Pharm Sci 93:2458-75 e US 7,456,009). Verificou-se que os aminoácidos e, em particular, histidina, arginina ou metionina induzem a estabilização de vários vírus no estado líquido (ver WO 2016/087457).

[00117] A presença de polímeros de alto peso molecular, como dextrano ou polivinilpirrolidona (PVP) é particularmente adequada para composições liofilizadas, geralmente obtidas por um processo envolvendo secagem a vácuo e liofilização e a presença desses polímeros auxilia na formação do bolo durante a liofilização (ver, por exemplo, WO 03/053463; WO 2006/085082; WO 2007/056847; WO 2008/114021 e WO 2014/053571).

[00118] De acordo com a presente invenção, a formulação da composição de PCPV também pode ser adaptada ao modo de administração para garantir a distribuição adequada ou liberação retardada in vivo. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido polilático e polietileno glicol. (ver, por exemplo, J. R. Robinson em “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; WO 01/23001; WO 2006/93924; WO 2009/53937).

[00119] Para fins ilustrativos, as formulações tamponadas com Tris (Tris-HCl a pH8) compreendendo sacarose a 5% (p/ v), glutamato de sódio a 10 mM e NaCl a 50 mM são adaptadas para a preservação da composição da invenção de -20 °C a 5 °C.

DOSAGEM

[00120] A composição da presente invenção pode ser formulada em doses individuais, contendo cada dose de cerca de 103 a 1012 pv (partículas virais), Ul (unidade infecciosa) ou ufp (unidades formadoras de placas) de um PCPV definido dependendo da técnica quantitativa utilizada. A quantidade de um PCPV definida presente em uma amostra pode ser determinada por técnicas de titulação de rotina, por exemplo, contando o número de placas após a infecção de células permissivas (por exemplo, células HeLa) para obter um título de unidades formadoras de placa (ufp), medindo a absorbância A260 (títulos vp), ou ainda por imunofluorescência quantitativa, por exemplo, usando anticorpos antivírus (títulos ui). O refinamento adicional dos cálculos necessários para adaptar a dosagem apropriada para um sujeito ou grupo de sujeitos pode ser feito rotineiramente por um médico, à luz das circunstâncias relevantes. Como orientação geral, as doses individuais que são adequadas para a composição de PCPV compreendem de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 ufp, vantajosamente de aproximadamente 104 ufp a aproximadamente 1011 ufp, de preferência de aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 1010 ufp; e mais preferencialmente de aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 109 ufp e notavelmente doses individuais de aproximadamente 107, 5 x 107, 108 ou 5 x 108 ufp são particularmente preferidos.

ADMINISTRAÇÃO

[00121] Qualquer uma das vias de administração convencionais é aplicável no contexto da invenção, incluindo as vias parentérica, tópica ou mucosa. As vias parentéricas são destinadas à administração como uma injeção ou infusão e abrangem as vias sistêmica e local. Os tipos de injeção parenteral que podem ser usados para administrar a composição de PCPV incluem intravenosa (em uma veia, como a veia porta que alimenta o fígado), intravascular (em um vaso sanguíneo), intra-arterial (em uma artéria como a artéria hepática),

intradérmica (na derme), subcutânea (sob a pele), intramuscular (no músculo), intraperitoneal (no peritônio) e intratumoral (em um tumor ou sua vizinhança) e também escarificação. A administração pode ser na forma de uma única dose em bolus ou pode ser, por exemplo, por uma bomba de perfusão contínua. As administrações na mucosa incluem, sem limitação, via oral/ alimentar, intranasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal ou intra-retal. A administração tópica também pode ser realizada usando meios transdérmicos (por exemplo, emplastros e semelhantes). De preferência, a composição de PCPV é formulada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intratumoral.

[00122] As administrações podem usar seringas e agulhas convencionais (por exemplo, agulhas de injeção Quadrafuse) ou qualquer composto ou dispositivo disponível na técnica capaz de facilitar ou melhorar a entrega de um vírus no sujeito (por exemplo, eletroporação para facilitar a administração intramuscular). Uma alternativa é o uso de um dispositivo de injeção sem agulha (por exemplo, dispositivo Biojector TM). Os adesivos transdérmicos também podem ser considerados.

[00123] A composição da invenção é adequada para uma única administração ou uma série de administrações. Também é possível proceder por meio de ciclos sequenciais de administrações que se repetem após um período de descanso. Os intervalos entre cada administração podem ser de três dias a seis meses (por exemplo, 24h, 48h, 72h, semanalmente, a cada duas semanas, mensal ou trimestralmente, etc.). Os intervalos também podem ser irregulares. As doses podem variar para cada administração dentro do intervalo descrito acima.

USO TERAPÊUTICO DA COMPOSIÇÃO DE PCPV E MÉTODO DE TRATAMENTO

[00124] Em outro aspecto, a invenção se refere a um vírus da pseudovaríola recombinante (PCPV) ou uma composição da invenção (em particular uma composição farmacêutica), para uso como um medicamento, em particular para o tratamento ou prevenção de doenças ou condição patológica causada por um organismo patogênico ou uma divisão celular indesejada de acordo com as formas de realização aqui descritas, bem como a um método de tratamento compreendendo a administração do vírus da pseudovaríola recombinante (PCPV) ou a composição da invenção a um sujeito em necessidade da mesma em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir tal doença ou condição patológica. A invenção também se relaciona com o uso do vírus da pseudovaríola recombinante (PCPV) ou a composição da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças ou condição patológica provocada por um organismo patogênico ou de uma divisão celular não desejada de acordo com as formas de realização aqui descritas. A invenção também se relaciona com o uso do vírus da pseudovaríola recombinante (PCPV) ou com a composição da invenção para o tratamento ou prevenção de doenças ou condição patológica provocada por um organismo patogênico ou de uma divisão celular não desejada de acordo com as formas de realização aqui descritas. Um esquema terapêutico ou método de tratamento preferido envolve 2 a 6 administrações semanais, possivelmente seguidas por 2 a 15 administrações com intervalo de 3 semanas da composição de PCPV compreendendo 106 a 109 ufp.

[00125] Em uma forma de realização preferida, a doença ou condição patológica a ser tratada é uma doença proliferativa.

Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método para inibir o crescimento de células tumorais que compreende a administração da composição da presente invenção a um sujeito em necessidade da mesma. No contexto da invenção, os métodos e o uso de acordo com a invenção visam retardar, curar, melhorar ou controlar a ocorrência ou a progressão da doença alvo.

[00126] Uma “doença” (e qualquer forma de doença, como “distúrbio” ou “condição patológica” e semelhantes) é tipicamente caracterizada por sintomas identificáveis. Doenças exemplares incluem, mas não estão limitadas a, doenças infecciosas que resultam de uma infecção com um organismo patogênico (por exemplo, bactérias, parasitas, vírus, fungos, etc.) e doenças proliferativas envolvendo proliferação anormal de células. Conforme usado neste documento, o termo “doença proliferativa” abrange qualquer doença ou condição patológica resultante do crescimento e disseminação celular descontrolados, incluindo câncer e algumas doenças cardiovasculares (por exemplo, restenose que resulta da proliferação das células musculares lisas da parede do vaso sanguíneo, etc.) O termo “câncer” pode ser usado indistintamente com qualquer um dos termos “tumor”, “malignidade”, “neoplasia”, etc. Estes termos se destinam a incluir qualquer tipo de tecido, órgão ou célula, qualquer estágio de malignidade (por exemplo, de uma pré-lesão ao estágio IV) e engloba tumores sólidos e tumores transmitidos pelo sangue, bem como cânceres primários e metastáticos.

[00127] Exemplos representativos de cânceres que podem ser tratados usando a composição e métodos da invenção incluem, sem limitação, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia e mais particularmente câncer ósseo, câncer gastrointestinal, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer de orofaringe, câncer de laringe, carcinoma de glândula salivar, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de cabeça ou pescoço, câncer de pele, câncer de células escamosas, melanoma, câncer uterino, câncer cervical, carcinoma endometrial, câncer vulvar, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, câncer do sistema endócrino, sarcoma de tecidos moles, câncer de bexiga, câncer de rim, glioblastoma e vários tipos do sistema nervoso central (SNC), etc. Em uma forma de realização, os métodos e uso de acordo com a presente invenção é para o tratamento de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras),

câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata hormônio refratário), câncer de mama (por exemplo, câncer de mama metastático), câncer colorretal, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de fígado (por exemplo, hepatocarcinoma), câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer pancreático e câncer de ovário e um câncer que superexpressa MUC1. As formas de realização preferenciais são direcionadas a um PVPC que codifica o antígeno MUC1, conforme descrito neste documento, para uso no tratamento de um sujeito com um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL) e um PVPC que codifica o antígeno E7 de HPV16, conforme descrito neste documento, para uso no tratamento de um sujeito com um Câncer HPV-positivo, como câncer de colo do útero ou de cabeça e pescoço.

[00128] Exemplos representativos de doenças infecciosas que podem ser tratadas usando a composição e métodos da invenção incluem, sem limitação, a) doenças virais, tais como aquelas resultantes da infecção por um vírus do herpes (HSV1, HSV2 ou VZV), um papilomavírus (HPV), um poxvírus causando varíola ou catapora, um enterovírus, um retrovírus como o HIV causando AIDS, um citomegalovírus, um flavivírus (por exemplo, causando encefalite japonesa, hepatite C, dengue e febre amarela), um Hepadnavírus (por exemplo, HBV), um ortomixovírus (por exemplo, vírus da gripe), um paramixovírus (por exemplo, parainfluenzavírus, vírus da caxumba, vírus do sarampo e vírus sincicial respiratório (RSV)), um coronavírus (por exemplo, SARS), rabdovírus e rotavírus; b) doenças resultantes da infecção por bactérias, por exemplo, Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemophilus ou Bordetella;

e (c) doenças fúngicas incluindo, mas não se limitando a, candidíase, aspergilose, histoplasmose, meningite criptocócica; e d) doenças parasitárias incluindo, mas não se limitando a malária, pneumonia por Pneumocystis carnii, leishmaniose, criptosporidiose, toxoplasmose e infecção por tripanossoma.

[00129] Tipicamente, após a administração de acordo com as formas de realização aqui descritas, a composição da invenção fornece um benefício terapêutico para o sujeito tratado que pode ser evidenciado por uma melhora observável do estado clínico em relação ao estado de linha de base ou ao longo do estado esperado se não tratado. Uma melhoria do estado clínico pode ser facilmente avaliada por qualquer medição clínica relevante normalmente usada por médicos ou outro pessoal de saúde qualificado. No contexto da invenção, o benefício terapêutico pode ser transitório (por um ou alguns meses após a cessação da administração) ou sustentado (por vários meses ou anos). Como o curso natural do estado clínico que pode variar consideravelmente de um sujeito para outro, não é necessário que o benefício terapêutico seja observado em cada sujeito tratado, mas em um número significativo de sujeitos (por exemplo, diferenças estatisticamente significativas entre dois grupos podem ser determinadas por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como o teste paramétrico de Tukey, o teste de Kruskal- Wallis, o teste U de Mann e Whitney, o teste t de Student, o teste de Wilcoxon, etc.).

[00130] Quando o método ou uso da invenção se destina ao tratamento de uma doença proliferativa, em particular câncer, um benefício terapêutico pode ser evidenciado pelo menos temporariamente, por exemplo, uma redução no número de tumor; uma redução do tamanho do tumor, uma redução no número ou extensão das metástases, um aumento na duração da remissão, uma estabilização (ou seja, sem agravamento) do estado da doença, um atraso ou retardamento da progressão ou gravidade da doença, uma sobrevida prolongada, uma melhor resposta ao tratamento padrão, uma melhoria da qualidade de vida, uma redução da mortalidade, etc. “Tratar” também pode significar prolongar a sobrevivência de um sujeito além do esperado na ausência de tratamento.

[00131] Quando o método ou uso da invenção se destina ao tratamento de uma doença infecciosa, um benefício terapêutico pode ser evidenciado por, por exemplo, uma diminuição da quantidade do organismo patogênico infectante quantificado no sangue, plasma ou soro de um sujeito tratado, e/ ou um estado estabilizado (sem agravamento) da doença infecciosa (por exemplo, estabilização de condições tipicamente associadas com a doença infecciosa, como estado inflamatório), e/ ou a redução do nível de marcadores séricos específicos (por exemplo, diminuição da alanina aminotransferase (ALT) e/ ou aspartato aminotransferase (AST) associada à má condição hepática geralmente observada na hepatite C crônica), diminuição no nível de qualquer antígeno associado à ocorrência de uma doença infecciosa e/ ou o aparecimento ou a modificação do nível de anticorpos ao organismo patogênico e/ ou uma resposta melhorada do sujeito tratado a terapias convencionais (por exemplo, antibióticos) e/ ou uma extensão de sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento com a composição.

[00132] As medições apropriadas, como testes de sangue, análise de fluidos biológicos e biópsias, bem como técnicas de imagens médicas, podem ser usadas para avaliar um benefício clínico. Eles podem ser realizados antes da administração (linha de base) e em vários momentos durante o tratamento e após a interrupção do tratamento. Para orientação geral, tais medições são avaliadas rotineiramente em laboratórios médicos e hospitais e um grande número de kits estão disponíveis comercialmente (por exemplo, imunoensaios, ensaios por PCR quantitativo).

[00133] Em outro aspecto, a composição da invenção é usada ou administrada para induzir ou estimular e/ ou redirecionar uma resposta imune no sujeito tratado. Consequentemente, a presente invenção também abrange um método para induzir ou estimular e/ ou reorientar uma resposta imune (por exemplo, para células tumorais ou infectadas), compreendendo a administração da composição da invenção a um sujeito em necessidade da mesma, em uma quantidade suficiente de acordo com as formas de realização aqui descritas de modo a ativar a imunidade do sujeito. A resposta imune induzida, estimulada ou redirecionada pode ser específica (isto é, direcionada a epítopos/ antígenos) e/ ou não específica (inata), humoral e/ ou celular, notavelmente uma resposta de células T mediada por CD4+ ou CD8+. A capacidade da composição aqui descrita de induzir, estimular ou redirecionar uma resposta imune pode ser avaliada in vitro (por exemplo, usando amostras biológicas coletadas do sujeito) ou in vivo usando uma variedade de ensaios diretos ou indiretos que são padrão na técnica (ver, por exemplo, Coligan et al., 1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health ou edições subsequentes). Os citados acima em relação à natureza antigênica de um polipeptídeo também são apropriados.

[00134] Em formas de realização preferidas, o método de acordo com a invenção resulta em pelo menos uma das seguintes propriedades: - A secreção de altos níveis de IFN-alfa a partir da PBMC, de preferência em níveis pelo menos 50 vezes maiores do que os níveis observados após a administração de um MVA nas mesmas condições ou em níveis pelo menos 10 vezes maiores do que os níveis observados após a administração de um ORFV sob a mesma condição; - A ativação de células dendríticas derivadas de monócitos (por exemplo, pode ser refletida pela indução do marcador de ativação CD86, de preferência em níveis pelo menos duas vezes os níveis observados após a administração de um MVA nas mesmas condições);

- A indução da ativação ou proliferação de células T (por exemplo, refletida indiretamente por células T altamente granzima B+); - Um melhor perfil de citocinas/ quimiocinas em MDSC (por exemplo, pode ser refletido por níveis mais altos de pelo menos um de IFN-alfa e MIP1alfa secretados por MDSC após infecção de PCPV do que após infecção com MVA); - Ativação de APC (por exemplo, pode ser refletida pela regulação positiva de CD86 em macrófagos humanos após a administração de PCPV); - Uma conversão de M2 em M1 de macrófagos humanos (por exemplo, pode ser refletida por secreção mais elevada de IL-18, IL-6 e IP-10 em macrófagos humanos após a administração de PCPV do que após a infecção com MVA; e/ ou - A indução de imunidade por meio de uma via mediada por TLR9 ou outras vias estimuladoras da imunidade inata, como cGAS-STING e receptores semelhantes a RIG-I (RLRs) (por exemplo, gene I indutível por ácido retinoico (RIG-I) e gene 5 associado à diferenciação de melanoma (MDA5)).

[00135] Consequentemente, a presente invenção também abrange métodos para aumentar a secreção de IFN-alfa de uma célula imune, como PBMC, para induzir a ativação de células dendríticas derivadas de monócitos, para induzir a ativação e/ ou proliferação de células T, para induzir a conversão de M2 a M1 de macrófagos humanos, para reduzir a supressão imunológica associada a MDSC e/ ou para reduzir a supressão imunológica, qualquer um de tais métodos compreendendo a administração da composição da invenção a um sujeito em necessidade da mesma (método in vivo) ou o contato de uma célula precursora com a composição da invenção (método in vitro) de modo a atingir o(s) resultado(s) desejado(s).

[00136] Em uma forma de realização, a composição ou os métodos da invenção podem ser usados ou realizados em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos que estão disponíveis para tratar ou prevenir a doença ou condição patológica a ser tratada ou prevenida. Em uma forma de realização, o outro agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em cirurgia, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia com toxinas, imunoterapia, terapia com citocinas, terapia direcionada ao câncer, terapia gênica, terapia fotodinâmica e transplante, etc. Um método ou o uso de acordo com a invenção pode incluir um terceiro ou mesmo outro agente terapêutico.

[00137] Essas terapias anticâncer adicionais são administradas ao sujeito de acordo com a prática padrão antes, depois, essencialmente simultaneamente ou de uma maneira intercalada com a composição de PCPV da presente invenção. A administração essencialmente simultânea de dois ou mais agentes terapêuticos não requer que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, desde que haja uma sobreposição no período de tempo durante o qual os agentes estão exercendo seu efeito terapêutico. A administração simultânea inclui a administração da composição da invenção no mesmo dia (por exemplo, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 horas) que o outro agente terapêutico. Embora qualquer ordem seja contemplada pela presente invenção, é preferido que a composição da invenção seja administrada ao sujeito antes do outro agente terapêutico.

[00138] Em formas de realização específicas, o método ou uso de acordo com a invenção pode ser realizado em conjunto com a cirurgia.

Por exemplo, a composição pode ser administrada após ressecção cirúrgica parcial ou total de um tumor (por exemplo, por aplicação local dentro da zona excisada, por exemplo).

[00139] Em outras formas de realização, o método ou uso de acordo com a invenção pode ser usado em associação com radioterapia. Os técnicos no assunto podem formular prontamente protocolos e parâmetros de terapia de radiação apropriados (ver, por exemplo, Perez e Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2a Ed. JB Lippincott Co; usando adaptações e modificações apropriadas como será facilmente aparente para aqueles qualificados na área). Os tipos de radiação que podem ser usados notavelmente no tratamento do câncer são bem conhecidos na técnica e incluem feixes de elétrons, fótons de alta energia de um acelerador linear ou de fontes radioativas, como cobalto ou césio, prótons e nêutrons. As faixas de dosagem dos radioisótopos variam amplamente e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida e da captação pelas células neoplásicas.

Doses regulares de raios X por períodos prolongados de tempo (3 a 6 semanas), ou altas doses únicas são contempladas pela presente invenção.

[00140] Em certas formas de realização da invenção, a composição da invenção pode ser usada em conjunto com a quimioterapia.

Exemplos representativos de agentes quimioterápicos adequados atualmente disponíveis para o tratamento de câncer incluem, sem limitação, agentes alquilantes, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, derivados de platina, inibidores de receptores de tirosina quinase, ciclofosfamidas, antimetabólitos, agentes de dano ao DNA e agentes antimitóticos. Exemplos representativos de agentes quimioterápicos adequados atualmente disponíveis para o tratamento de doenças infecciosas incluem, entre outros antibióticos, antimetabólitos, antimitóticos e drogas antivirais (por exemplo, interferon alfa).

[00141] Em outras formas de realização, a composição da invenção pode ser usada em conjunto com imunoterapêuticos, tais como anticorpos antineoplásicos, bem como siRNA e polinucleotídeos antisense. Exemplos representativos incluem, entre outros anticorpos monoclonais que bloqueiam pontos de verificação imunológicos específicos, como anti-PD-1, anti-

PD-L1, anti-CTLA-4, anti-LAG3, anti-OX40 etc. (por exemplo, ipilimumab, tremelimumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, durvalumab, daclizumab, avelumab, atezolizumab, etc.,), anticorpos monoclonais que bloqueiam o Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (em particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, trastuzumab (Herceptin™), etc.) e anticorpos bloqueadores de Fator de Crescimento Endotelial (em particular bevacizumab e ranibizumab).

[00142] Em ainda outras formas de realização, a composição da presente invenção pode ser usada em conjunto com o adjuvante. Exemplos representativos de adjuvantes adequados incluem, sem limitação, ligantes TLR3 (Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88 (10): 5242-55), ligantes TLR9 (por exemplo, CpGs, como ODN1826 (Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163-74) e Litenimod (Li28) (Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8 (1): 60-6; EP 1 162 982; US 7,700,569 e US 7,108,844) e inibidores de PDE5, tais como sildenafil (US 5,250,534, US 6,469,012 e EP 463 756).

[00143] Em formas de realização adicionais, a composição ou métodos da invenção podem ser usados de acordo com uma abordagem de reforço inicial que compreende administrações sequenciais de uma composição(ões) de primeira imunização (priming) e uma composição(ões) de reforço. Normalmente, as composições de primeira imunização e de reforço usam diferentes vetores que compreendem ou codificam pelo menos um domínio antigênico em comum. Além disso, as composições de primeira imunização e de reforço podem ser administradas no mesmo local ou em locais alternativos pela mesma via ou por diferentes vias de administração. Uma abordagem de reforço inicial preferida no contexto da invenção envolve uma composição de PCPV como aqui descrita e uma composição de MVA que codifica o mesmo polipeptídeo de interesse (por exemplo, o mesmo antígeno).

Em uma forma de realização, o MVA é usado para iniciação e a composição de PCPV da invenção é usada para reforço ou vice-versa (PCPV para iniciação e MVA para reforço). A presente invenção abrange uma ou várias administrações da(s) composição(ões) de primeira imunização e/ ou de reforço, com preferência para as vias subcutânea, intratumoral e intravenosa. Um regime de reforço inicial particularmente preferido compreende uma composição de primeira imunização de PCPV administrada por via intratumoral e uma composição de reforço de MVA administrada por via intravenosa. Em uma forma de realização preferida, a composição de PCPV e de MVA codifica o mesmo antígeno associado a tumor.

Em outra forma de realização, o período de tempo que separa as administrações de primeira imunização e de reforço varia de uma semana a 6 meses, com preferência de uma semana a um mês e ainda mais por um período de uma a duas semanas. As doses individuais de aproximadamente 106 ufp a cerca de 109 ufp são particularmente adaptadas para as composições de primeira imunização e de reforço e doses individuais, nomeadamente de aproximadamente 106, 5 x 106 107, 5 x 107, 108 ou 5 x 108 ufp.

[00144] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um vírus de estomatite papular bovina (BPSV), de preferência um BPSV recombinante compreendendo pelo menos um ácido nucleico estranho inserido em seu genoma. O termo “vírus da estomatite papular bovina” ou “BPSV” é usado neste documento de acordo com seu significado comum em Virologia e se refere a um membro da família Poxviridae pertencente ao gênero Parapoxvirus.

[00145] O(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) a ser(em) expresso(s) pelo BPSV recombinante é/ são semelhantes aos descritos em conexão com PCPV, bem como os elementos reguladores necessários para a expressão em uma célula hospedeira ou sujeito desejado. O(s) local(is) de inserção do(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) no genoma do BPSV e o método de produção do BPSV recombinante também estão ao alcance do técnico no assunto. O método para amplificar BPSV é rotineiro com base na descrição dada aqui para o vírus PCPV e conhecimento geral, embora linhagens celulares produtoras, MOI, meio de cultura, etc. possam ser adaptados ao vírus BPSV pelo técnico no assunto.

[00146] A composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do BPSV e um veículo farmaceuticamente aceitável também fazem parte desta invenção. As dosagens, vias de administração e utilizações terapêuticas adequadas são as descritas acima para composições compreendendo PCPV.

[00147] Todas as divulgações acima citadas de patentes, publicações e entradas de banco de dados são especificamente incorporadas neste documento por referência em sua totalidade. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e das reivindicações. Os exemplos seguintes são incorporados para demonstrar as formas de realização preferidas da invenção. No entanto, à luz da presente divulgação, os técnicos no assunto devem apreciar que mudanças podem ser feitas nas formas de realização específicas que são divulgadas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLOS

[00148] Vários vírus e cepas foram desenvolvidos para expressar antígenos tumorais e citocinas, e alguns deles estão em testes clínicos avançados. No entanto, novas cepas virais com propriedades imunogênicas melhoradas são procuradas. Nesta perspectiva, rastreamos Parapoxvirus, como Vírus da Pseudovaríola (PCPV) e Parapoxvirus ovis (ORF) e os comparamos a uma variedade de outros poxvírus. A comparação foi conduzida in vitro com células imunes primárias humanas e in vivo com modelos de tumor singênico de camundongo.

EXEMPLO 1: PERFIL DE CITOCINAS/ QUIMIOCINAS SECRETADAS EM CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO HUMANO (PBMCS) INFECTADAS

[00149] Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) foram isoladas de sangue humano total de dois doadores saudáveis (EFS, Etablissement de Strasbourg; doador A e B). As PBMCs foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade usando Ficoll-Paque PLUS (GE HealthCare) e Blood Separation Tubes (Greiner) e armazenados em nitrogênio líquido.

[00150] Alíquotas congeladas de PBMCs foram descongeladas em RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FSC) e despachadas em placas de 24 poços (5 . 105 células em 500 µL/ poço). Após 5 a 6 horas, as células foram infectadas com os diferentes vírus (ver abaixo) em multiplicidades de infecção (MOI) entre 10-3 e 10. Após incubação durante a noite (16 horas), as células foram raspadas, as células e o sobrenadante foram transferidos para Tubos Eppendorf e centrifugados por 10 min a 300 g. O sobrenadante foi isolado e congelado a -80 °C. Os perfis de citocinas e quimiocinas foram quantificados por uma abordagem Multiplex nos sobrenadantes usando um painel de inflamação Procartaplex 20plex (EPX200-12185-901). A análise foi realizada de acordo com a recomendação do fabricante usando um dispositivo MagPix.

[00151] Os diferentes vírus testados são vírus da pseudovaríola de Parapoxvírus (PCPV e Parapoxvirus ovis (ORF), bem como MVA, vírus da varíola bovina (CPX), vírus da vacínia de Copenhague (Copwt), varíola da bouba aviária (FPV), Myxomavirus (MYXV), varíola suína (SWPV), raccoonpoxvírus (RCN), vírus Cotia (CTV) e vírus da doença semelhante a Yaba (YLDV). Os vírus foram obtidos a partir da coleção ATCC, respectivamente ATCC-VR-644 (PCPV TJS), ATCC VR-1548 (ORFV NZ2), ATCC VR-302 (CPX Brighton), ATCC VR-115 (MYXV Lausanne), ATCC VR-363 (SWPX Kasza), ATCC VR-838 (RCN Herman), ATCC VR-464 (CTV SP AN 32) e ATCC VR-937 (YLDV Davis); exceto MVA para o qual um vetor MVA vazio denominado MVAN33 foi usado (número de acesso do Genbank EF675191), o vírus da Vaccinia de Copenhagen (ver por exemplo, WO 2009/065546) e FPV (ver por exemplo Laidlaw e Skinner, 2004; J. Gen. Virol., 85: 305-22).

[00152] Como mostrado na Figura 1, PBMCs infectadas com PCPV induziram a secreção de níveis muito elevados de IFN-alfa de uma forma dependente de MOI. Embora os níveis secretados pelas PBMC infectadas com PCPV variem entre os dois experimentos, eles estão bem acima dos níveis moderados de secreção de IFN-alfa observados com SWPX e ORFV (outro parapoxvírus). Comparado com MVA, o PCPV induziu uma expressão 1000 vezes maior de IFN-alfa em PBMCs humanos, enquanto SWPX e ORF exibiram uma indução inferior de 10 a 100 vezes. Copenhagen VV e outros vetores oncolíticos (por exemplo, RCN, RPV, CTV, CPX e MYX) não aumentaram o nível de IFN alfa.

[00153] Estudos de viabilidade após infecção viral foram realizados. As células foram coradas com LiveDead “NearIR” e analisadas por citometria de fluxo (MacsQuant) para determinar a proporção de células mortas e vivas. Os resultados mostraram que ORFV e YLDV eram particularmente tóxicos: 90% das células infectadas no MOI de 5 morreram em 16 horas, enquanto pelo menos 50% das células vivas foram observadas para todos os outros vírus, incluindo PCPV.

EXEMPLO 2: EFEITO DE PCPV EM CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONÓCITOS HUMANOS, MACRÓFAGOS M2 E CÉLULAS SUPRESSORAS DERIVADAS DE MIELOIDE (MDSCS)

[00154] Interferons tipo I como IFN-alfa são peças-chave na imunoterapia do câncer, bem como ambiente tumoral imunossupressor alterado e respostas antitumorais adaptativas melhoradas contra antígenos codificados por vacina e/ ou apresentados por tumor, conforme descrito, por exemplo, por Parker et al. (2016, Nat Rev Cancer 16 (3): 131-44) e Zitvogel et al. (2015, Nat

Rev Immunol. 15 (7): 405-14). Para abordar esses aspectos, olhamos in vitro para células imunes primárias humanas na ativação de células dendríticas derivadas de monócitos humanos (moDC) e no efeito em populações de células imunossupressoras (reprogramação de células imunossupressoras como macrófagos M2 e MDSCs) após tratamento com PCPV. Estudos pré-clínicos sobre imunidade inata e adaptativa também foram investigados em modelos de tumor singênico murino.

ESTIMULAÇÃO DE MODCS

[00155] Para investigar a ativação de células apresentadoras de antígeno (APCs), trabalhamos com células dendríticas derivadas de monócitos (moDCs). Para obter essas células, monócitos humanos foram enriquecidos por depleção de PBMCs (Miltenyi, Monocyte Isolation kit II). Os monócitos foram diferenciados em células dendríticas (moDCs) por incubação em fator estimulador de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF 20 ng/ ml) e IL-4 (10 ng/ ml) por 3 dias. Para ensaios de estimulação, moDCs de três doadores diferentes (doador 12Jul16, doador 24Aug16 e doador 31Aug16) foram semeados em placas de 24 poços e infectados com MVAN33.1 ou PCPV a MOIs de 0,03, 0,3 e 1. No dia seguinte, o marcador de maturação CD86 foi quantificado por citometria de fluxo. Os níveis de expressão foram medidos por coloração com quantificação de anti-CD86-PE do sinal ligado à célula por citometria de fluxo

[00156] Conforme ilustrado na Figura 2, os moDCs tratados com PCPV mostraram níveis de expressão muito mais elevados do marcador de ativação CD86 em comparação com células tratadas com MVAN33.1. O efeito benéfico na estimulação de moDC foi observado em MOI baixo (0,03) e aumentou em MOI de 0,3 e 3. Como esperado, nenhuma estimulação de moDC foi detectada no tratamento simulado. Portanto, parece que a infecção por PCPV aumentou a expressão de CD86 em todos os doadores em todos os MOI para níveis mais elevados do que MVAN33. Copwt não teve efeito na expressão de CD86 em moDC (dados não mostrados).

EFEITOS EM MACRÓFAGOS M2

[00157] Em seguida, abordamos a questão de se e em que medida os tipos de células imunossupressoras podem ser alterados/ reeducados pelo PCPV.

[00158] Nós geramos macrófagos de CD163+ CD206+ “tipo M2” derivados in vitro de acordo com um protocolo adaptado a partir de Mia et al. (2014, Scand. J. Immunol. 79 (5): 305-14). Resumidamente, após o isolamento de PBMCs obtidos de doadores saudáveis por seleção positiva de CD14+ ou por seleção negativa usando kit de isolamento de monócitos II (Miltenyi, Biotec), 4 x 105 monócitos foram cultivados em placas de 48 poços em 500 μl de meio de base de macrófagos DXF (Promocell) suplementado com 50 ng/ ml de M-CSF (Miltenyi Biotec). O meio foi trocado no dia 3 e no dia 7. No dia 7, os macrófagos CD16hiCD68+CD11b+ M0 foram polarizados em direção a um fenótipo M2 adicionando IL-4, IL-10 e TGF-beta (Miltenyi Biotec) a uma concentração de 20 ng/ ml. Dois dias depois, os macrófagos CD163+ CD206+ M2 foram incubados com MVAN33.1 ou PCPV a uma MOI de 5, 1 e 0,3 e a secreção de IL-18, IL-6, IP-10 e CD86 foi testada por citometria de fluxo ou Análise Luminex. Para este propósito, as células foram incubadas por 20 min com reagente de bloqueio de FcR humano (Miltenyi Biotec) e anti-CD86 marcado com APC (clone FM95, Miltenyi Biotec). As células mortas foram marcadas por coloração automática com iodeto de propídio antes das aquisições de células registradas usando o citômetro MACSQuant (Miltenyi). Os dados foram analisados usando o software Kaluza (Beckman Coulter). Os níveis de citocinas no sobrenadante das células estimuladas foram quantificados por análise Luminex (ProcartaPlex, eBiosciences) em um dispositivo MAGPIX (Luminex XMAP Technologies).

[00159] Conforme ilustrado na Figura 3, em comparação com MVA, PCPV aumentou a secreção de IL-18 em MOI 5 e 1, a secreção de IL-6 e IP-10 em MOI 5. Assim, parece que PCPV altera o fenótipo de macrófagos M2 em direção a um fenótipo do tipo M1. Os macrófagos M2 estão associados a um resultado negativo no NSCLC humano, enquanto os macrófagos M1 representam um marcador de prognóstico positivo (Yuan et al, 2015, Nature, Scientific Reports). Esses dados sugerem uma conversão para um fenótipo menos supressor após o tratamento com PCPV em comparação com o tratamento com MVA.

EFEITOS EM CÉLULAS SUPRESSORAS DERIVADAS DE MIELOIDE MDSCS

[00160] Monócitos CD14+ autólogos e células T CD8+ foram isolados de doadores saudáveis por tecnologia de esferas magnéticas (Miltenyi).

Dois modelos foram investigados. As MDSCs foram geradas a partir de monócitos por incubação com 20 ng/ ml de GM-CSF, 10 ng/ ml de IL-4 e 1 µM de prostaglandina E2, (Figura 4) ou na presença de 10 ng/ ml de GM-CSF e 10 ng/ ml de IL-6 (Figura 5) durante 6 a 7 dias. Os MDSCs resultantes foram co-cultivados com células T CD8+ marcadas com CFSE autólogas na presença de esferas de ativação de células T revestidas com anti-CD2, anti-CD3 e anti-CD28 ou Reagente de Células T TransAct + IL-2 (Miltenyi Biotec). Após 4-5 dias, a proliferação de células T e a expressão de Granzima B em células T em proliferação foram medidas por citometria de fluxo. Além disso, as MDSCs sozinhas foram tratadas com PCPV, no dia seguinte o sobrenadante foi retirado para quantificar analitos como citocinas e quimiocinas. Como mostrado na Figura 4, a proliferação de células T ativadas foi inibida por MDSCs derivadas de co-cultura in vitro (ver controles não infectados na Figura 4A; razão MDSC/ T de ½). No entanto, a atividade supressora fornecida por MDSCs na proliferação de CTL pode ser inibida após o tratamento com PCPV adicionado à co-cultura, conforme evidenciado pela capacidade de PCPV de restaurar a proliferação de CTL em MOIs crescentes (Figura 4A) correlacionando-

se com a suprarregulação da produção de Granzima B em co-culturas tratadas com PCPV (Figura 4B). Ressalta-se que o efeito antissupressor na presença de PCPV foi detectado mesmo em baixo MOI. Estas observações se correlacionam com a secreção de IFN alfa medida em culturas de MDSCs no dia após o tratamento com PCPV (Figura 4C).

[00161] Como acima, e como mostrado na Figura 5 que ilustra o GM-CSF, modelo de MDSC derivado de IL-6, a proliferação de células T ativadas foi fortemente inibida por MDSCs derivadas de co-cultura in vitro. A proliferação foi parcialmente restaurada e a expressão da Granzima B foi regulada positivamente quando as co-culturas foram tratadas com PCPV em MOIs crescentes.

[00162] Em resumo, PCPV mostrou ser superior ao MVA e VV para desencadear a expressão de CD86 em moDCs primários. Além disso, o tratamento com PCPV aumentou a expressão de CD86 em macrófagos humanos do tipo “M2” CD163+ CD206+ derivados in vitro, sugerindo uma mudança para um fenótipo apresentador de antígeno. Nessas células, o PCPV aumentou significativamente a secreção de IL-18, IL-6 e IP-10, sinalizando uma conversão para um fenótipo de macrófago menos supressor. O modo de ação do PCPV em MDSCs poderia ser a maturação para um fenótipo menos supressor ou efeitos tóxicos de PCPV em MDSCs.

EXEMPLO 3: CONSTRUÇÃO DE PCPV RECOMBINANTE E PROPRIEDADES ANTI-

TUMORAIS

[00163] O interesse pelo PCPV como estrutura viral foi avaliado através da geração de antígenos tumorais codificadores de PCPV recombinantes e testando-os em experimentos de controle de tumor.

[00164] Os vetores PCPV recombinantes foram construídos a partir da cepa do tipo selvagem TJS (ATTC, VR-634). O PCPV, como todos os Parapoxvírus, carece de genes presentes ou conservados em outros poxvírus.

Estes compreendem homólogos da maioria dos genes de poxvírus provavelmente envolvidos no metabolismo de nucleotídeos, incluindo homólogos de ribonucleotídeo redutase (RR), timidina quinase (TK), guanilato quinase e timidilato quinase. Portanto, o locus TK geralmente usado para a geração do vírus Vaccinia recombinante não pode ser usado para a introdução do gene recombinante em PCPV. No entanto, foi demonstrado que o vírus ORF recombinante pode ser gerado pela inserção do transgene no gene VEGF não essencial (Rziha et al., 2000, J. Biotechnol. 83 (1-2): 137-145). Este locus foi portanto avaliado para a geração de PCPV recombinante. Deve-se notar que o gene VEGF está presente em duas cópias no genoma do PCPV no terminal esquerdo e direito do genoma.

[00165] Um plasmídeo de transferência foi gerado por clonagem no plasmídeo pUC18 (disponível, por exemplo, em Thermo Fisher Scientific) duas sequências de cerca de 300 pb flanqueando o gene VEGF de PCPV. As sequências a montante do gene VEGF correspondem à posição de nucleotídeo 6391 a 6089 ou 138899 a 139201 de PCPV (Genbank NC_013804).

As sequências a jusante do gene VEGF correspondem à posição de nucleotídeo 5545 a 5225 ou 139745 a 140065 de PCPV. Estas sequências permitirão a recombinação homóloga entre o plasmídeo de transferência e o vírus PCPV levando ao vírus recombinante com o ácido nucleico estranho inserido em ambos os locus de VEGF.

GERAÇÃO DE PCP-GFP (PCPTG19106)

[00166] A cassete de seleção (eGFP/ GPT), uma fusão do gene que codifica a proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) e o gene que codifica a guanina fosforibosil transferase (GPT) (ver, por exemplo, WO 2009/065546) foi posicionada sob o controle do promotor de Vaccinia p11K7.5 e inserido no plasmídeo de transferência que carrega a pTG19106.

[00167] A geração de PCPTG19106 foi realizada por recombinação homóloga em células de turbinato bovino (BT, ATCC CRL-1390)

infectadas com PCPV e transfectadas por nucleofecção com pTG19106 (de acordo com a tecnologia Amaxa Nucleofector). Placas fluorescentes e seletivas (GPT+) foram selecionadas. Mais especificamente, o PCPV recombinante GPT+ têm uma vantagem de crescimento em um meio seletivo (ácido micofenólico, xantina, hipoxantina), através da manutenção do marcador de seleção GPT durante o isolamento de PCPV recombinante. O vírus recombinante foi isolado de placas fluorescentes de GFP e submetido à purificação de placas adicionais em células BT. A estrutura do vírus e a ausência de PCPV parental foram confirmadas por múltiplos PCRs e sequenciamento de DNA da cassete de expressão. O vírus resultante PCPTG19106 foi amplificado em células BT. Os estoques de vírus foram titulados em células BT por ensaio de placa.

GERAÇÃO DE PCP-MCHERRY (PCPTG19153)

[00168] A sequência que codifica para a proteína fluorescente mCherry foi posicionada sob o controle do promotor de Vaccinia pH5R e inserida no plasmídeo de transferência levando a pTG19153.

[00169] A geração de PCPTG19153 foi realizada por recombinação homóloga em células BT infectadas com PCPTG19106 e transfectadas por nucleofecção com pTG19153. O vírus recombinante foi isolado por placas fluorescentes de mCherry selecionadas e submetido à purificação de placas adicionais em células BT. A estrutura do vírus e a ausência de PCPTG19106 parental foram confirmadas por múltiplos PCRs e sequenciamento de DNA da cassete de expressão. O vírus resultante PCPTG19153 foi amplificado em células BT.

GERAÇÃO DE PCP-HPV16E7 (PCPTG19178)

[00170] A sequência que codifica para SR-E7*Tm (WO 99/03885) foi posicionada sob o controle do promotor p7.5K e inserida no plasmídeo de transferência que conduz a pTG19178. A geração de PCPTG19178 foi realizada por recombinação homóloga em células BT infectadas com PCPTG19106 e transfectadas por nucleofecção com pTG19178 na presença de uma endonuclease que gera quebra de fita dupla no gene GFP.

O vírus recombinante foi isolado por placas negativas fluorescentes para GFP selecionadas e submetido à purificação de placas adicionais em células BT. A estrutura do vírus e a ausência de PCPTG19106 parental foram confirmadas por múltiplos PCRs e sequenciamento de DNA da cassete de expressão. O vírus resultante PCPTG19178 foi amplificado em células BT.

[00171] A produção do lote pré-clínico de PCPTG19178 foi realizada por células Hela infectadas (ATCC® CCL-2TM) em vários frascos F500.

A amplificação viral foi realizada em 34 a 37 °C, 5% de CO2 por 72 h. As células infectadas e o meio foram então peletizados e congelados. A colheita do bruto foi interrompida usando homogeneizador de alto cisalhamento (SILVERSON L4R) e submetida a um processo de purificação (por exemplo, conforme descrito em WO 2007/147528). Resumidamente, a preparação viral lisada pode ser clarificada por filtração e purificada por uma etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF). O vírus purificado foi ressuspenso em um tampão de formulação de vírus adequado (por exemplo, sacarose a 5% (p/ v), NaCl a 50 mM, Tris/ HCl a 10 mM, Glutamato de sódio a 10 mM, pH 8).

GERAÇÃO DE PCP-MUC1 (PCPTG19194)

[00172] A sequência que codifica para Muc1 (US 5,861,381) foi posicionada sob o controle do promotor pH5R e inserida no plasmídeo de transferência que conduz a pTG19194. A geração de PCPTG19194 foi realizada por recombinação homóloga em células BT infectadas com PCPTG19153 e transfectadas por nucleofecção com pTG19106 na presença de uma endonuclease que gera quebra de fita dupla no gene m-Cherry. O vírus recombinante foi isolado por placas negativas fluorescentes de mCherry selecionadas e submetido à purificação de placas adicionais em células BT. A estrutura do vírus e a ausência de PCPTG19194 parental foram confirmadas por múltiplos PCRs e sequenciamento de DNA da cassete de expressão. O vírus resultante PCPTG19194 foi amplificado em células BT. Os lotes pré-clínicos foram produzidos em células Hela conforme descrito acima.

GERAÇÃO DE PCP-HBV (PCPTG19179)

[00173] A sequência que codifica para uma fusão dos antígenos Pol e env do núcleo do HBV (conforme descrito em WO 2013/007772) foi posicionada sob o controle do promotor p7.5K e inserida no plasmídeo de transferência que leva a pTG19179. A geração de PCPTG19179 foi realizada por recombinação homóloga em células BT infectadas com PCPTG19106 e transfectadas por nucleofecção com pTG19179 na presença de uma endonuclease que gera quebra de fita dupla no gene GFP. O vírus recombinante foi isolado por placas negativas fluorescentes para GFP selecionadas e submetido à purificação de placas adicionais em células BT. A estrutura do vírus e a ausência do vírus parental foram confirmadas por múltiplos PCRs e sequenciamento de DNA da cassete de expressão.

EXPERIMENTOS DE CONTROLE DE TUMOR NO MODELO SINGÊNICO MC38

[00174] A capacidade do PCPV de controlar o crescimento do tumor e aumentar as taxas de sobrevivência foi testada na linhagem celular de carcinoma do cólon MC38 (2 x 106 células) (disponível em Kerafast) injetada por via subcutânea em camundongos C57BL/6 singênicos depilados previamente.

O local da injeção foi marcado com um marcador permanente. Dia 2, 1 x 107 ufp de PCPV que codifica E7 DE HPV-16 ou um vírus MVA, ou tampão foram injetados no local de injeção da linhagem celular (D2) e mais tarde no tumor emergente nos dias 9 e 16 (D9 e D16). Dez camundongos por grupo foram injetados. O crescimento do tumor e a sobrevivência foram monitorados durante um mês após a implantação das células MC38. O protocolo de administração é ilustrado na Figura 6A.

[00175] Em todos os animais tratados com tampão, os tumores cresceram rapidamente para além do volume de 1500 mm3, dentro dos 11 a 18 dias após a implantação de MC38 (Figura 6D). Em contraste, os animais tratados com o MVA que codifica E7 de HPV16 recombinante mostraram um atraso no crescimento do tumor. Mais especificamente, os tumores que excedem 1500 mm3 no dia 18 foram observados em 5/10, enquanto o crescimento do tumor é moderado nos outros 5 (< 1000 mm3 no dia 18 após a implantação do tumor), conforme ilustrado na Figura 6B. Surpreendentemente, o tratamento com PCPV fornece uma proteção antitumoral mais forte em comparação com o tratamento com MVA. De fato, os tumores atingindo um volume de 1500 mm3 foram observados em apenas 4/10 animais após 15 a 24 dias após a implantação do tumor e nenhum crescimento do tumor foi observado nos outros 6 (Figura 6C). Na mesma linha, o PCPV aumentou a sobrevivência nos animais tratados (Figura 6E).

[00176] Em conclusão, quando injetada intratumoralmente em tumores MC38 de crescimento rápido, a injeção de PCPV levou ao controle do crescimento do tumor e aumentou a sobrevivência em comparação com o tampão ou animais injetados com MVA.

EXPERIMENTOS DE DEPLEÇÃO

[00177] O experimento de controle de tumor em camundongos com MC38 foi repetido, mas a depleção de populações de células específicas, respectivamente CD4+, CD8+ e neutrófilos, foi aplicada com anticorpos de depleção apropriados injetados antes e durante o tratamento com PCPV. Mais especificamente, a depleção de células CD8+ foi realizada por injeção intraperitoneal (ip) de 200 µg de um anticorpo monoclonal de rato (MAb) anti-rato CD8 (clone 53-6-7; BioXCell) nos dias 1, 2, 6 e 13. A depleção de células CD4+ resultou da injeção intraperitoneal de 200 µg de um Mab de rato contra CD4 de camundongo (clone GK1.5 disponível em BioXCell) nos dias 1, 2, 6 e 13. A depleção de neutrófilos (e outras Células Ly6G) foi feita de acordo com o protocolo descrito em Wozniak et al. (2012, BMC Immunology, 13:65), usando um MAb de rato contra Ly6G de camundongo (clone 1A8; BioXCell) injetado ip a uma dose de 200 µg no dia 2 e, em seguida, a cada dois dias ou a cada três dias durante o fim de semana.

[00178] Conforme descrito acima, a linhagem celular de carcinoma do cólon MC38 (2 x 106 células) foi injetada por via subcutânea em camundongos C57BL/6 singênicos depilados 2 dias antes. O local da injeção foi marcado com um marcador permanente. 107 ufp de PCPV ou tampão (controle negativo) foram injetados dia 2 no local de injeção da linhagem celular e mais tarde no tumor emergente (dias 9 e 16). 13 camundongos por grupo foram injetados.

[00179] A depleção de células CD4+, CD8+ e Ly6G+ foi confirmada no sangue e no baço (periferia) de camundongos sacrificados no dia 14 (dados não mostrados). No entanto, a ausência de neutrófilos em tumores MC38 de camundongos tratados com Ly6G não pôde ser demonstrada (o sinal MPO da mieloperoxidase permaneceu detectável). A redução da contagem de neutrófilos não pôde ser evidenciada devido à falta de medidas quantitativas. A depleção de células CD4+ e CD8+ em tumores não pôde ser investigada por razões técnicas.

[00180] Como esperado, os tumores crescem rapidamente no animal tratado com tampão (Figura 12E), enquanto o tratamento com PCPV atrasou o crescimento do tumor (Figura 12A). O tamanho do tumor foi ainda mais controlado entre os dias 16 e 29 no grupo tratado com PCPV e anti Ly6G (Figura 12B) em relação ao grupo tratado apenas com PCPV (valor p < 0,001). O tratamento com PCPV e anti CD8 levou a tamanhos de tumor maiores em comparação com o grupo tratado com PCPV (p-valor de 0,05) (Figura 12C), enquanto o tratamento com anticorpo de depleção de CD4 não mostrou efeito significativo no crescimento do tumor (Figura 12D). Além disso, o tratamento com

PCPV e anti CD8 diminuiu a sobrevida, enquanto o tratamento com PCPV e anti Ly6G aumentou a sobrevida (p-valor de 0,001).

[00181] Os resultados sugerem um papel das células CD8+ na resposta antitumoral induzida por PCPV. O tratamento com Ly6G aumenta a sobrevida, provavelmente devido à depleção de MDSCs circulantes e neutrófilos N2. Shaul e Fridlender (2017, J. Leuko. Biol. 102 (2): 343-9), descreveram a plasticidade funcional dos neutrófilos (pró-tumor (N2) e natureza antitumoral (N1) dos neutrófilos que se infiltram no tumor sob a influência de citocinas específicas.

INDUÇÃO DE CÉLULAS T ESPECÍFICAS DE TUMOR EM SOBREVIVENTES DE LONGO PRAZO

[00182] A presença de células T específicas de MC-38 foi investigada em sobreviventes de camundongos de longo prazo com tumores MC38 reduzidos/ resolvidos no dia 34 e em comparação com animais naive. Os esplenócitos foram isolados e processados essencialmente como se segue. Os baços de 5 animais sobreviventes foram coletados e combinados (pool de sobreviventes de PCPV) ou baço individual de 2 camundongos sobreviventes foi coletado em meio completo (CM) e depois esmagado com um êmbolo de seringa. A suspensão de esplenócitos foi diluída em CM, colocada sobre 4 mL de meio de células de separação Lympholyte®-M (Cedarlane). A interfase contendo linfócitos foi recolhida por centrifugação e ressuspensa em tampão de lise de RBC (BD PharmLyse, BD BioScience) até ocorrer a lise dos glóbulos vermelhos (RBC). Os linfócitos foram ressuspensos em CM e a concentração de células contadas (Beckman Coulter) foi ajustada para 1 x 107 células por mL com CM. A estimulação foi realizada com células MC38 tratadas com Mitomicina C, células estimuladas com meio (controle negativo) ou o peptídeo irrelevante i8L (controle negativo). A análise ELISpot para esplenócitos produtores de IFN- gama específico para antígeno (IFNg) foi realizada de acordo com o protocolo padrão.

[00183] A Figura 13 ilustra que após o tratamento com PCPV, células T específicas de (MC-38) específicas de tumor foram detectadas em esplenócitos de camundongos sobreviventes agrupados (em pool) ou individuais (tendo tumores MC38 reduzidos/ resolvidos no dia 34) após estimulação com células MC 38 tratadas com Mitocitina C. Em contraste, os controles negativos (estimulação com CM ou peptídeo irrelevante) ou camundongos naïve não mostraram quaisquer células produtoras de IFNg.

POTENCIAL ONCOLÍTICO DE PCVP

[00184] O potencial oncolítico de PCPV foi estudado em uma variedade de linhagens celulares tumorais murinas e humanas obtidas na American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), como LoVo (ATCC® CCL-229 TM ), HCT 116 (ATCC® CCL-247 TM ), linhagem celular de câncer humano de glioblastoma U-87 MG (ATCC® HTB-14), linhagem celular de câncer humano de colo do útero HeLa (ATCC® CCL-2TM) e MIA-Paca-2 (ATCC® CRL-1420TM) (dados não mostrados), bem como a linhagem celular MC38 de carcinoma do cólon murino. Em todas essas linhagens celulares, o PCPV mostrou uma atividade oncolítica leve ou nenhuma. Aqui, mostramos a viabilidade das células MC38 infectadas em MOI de 1, 10-1, 10-2 e 10-3 com PCPV-GFP ou um VV modificado geneticamente para expressar GFP (VVTG) como controle positivo. Cinco dias depois, as células foram colhidas por raspagem e o número e a proporção de células vivas foram determinados usando coloração com azul de tripano e o contador de células Vicell.

Conforme mostrado na Figura 7, a infecção por VV de células MC38 prejudicou fortemente a viabilidade de MC38 (55% e 30% das células ainda viáveis em MOI de 0,1 e 1). Dezenove por cento de MC38 foram infectados com PCPV-GFP, mas o vírus não mostrou nenhum efeito lítico nas células infectadas (conforme evidenciado pelo mesmo número de células vivas aumentando de MOI de 10-3 para 1). O tratamento simulado não tem efeito esperado na viabilidade do MC38.

[00185] Com base nesses resultados, pode-se antecipar que o controle do tumor observado com o PCPV não pode ser explicado com as virtudes oncolíticas desse vírus nas células MC38. Portanto, outros correlatos com a eficácia in vivo do PCPV foram estudados, como o perfil de citocinas/ quimiocinas e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs).

PERFIL DE CITOCINAS LOCAIS IN VIVO APÓS A APLICAÇÃO SUBCUTÂNEA (SC) DE MVAN33.1 OU PCPV

[00186] Para a detecção local de citocinas e quimiocinas, os camundongos foram injetados em ambos os flancos aplicando 5 . 105 ufp/ flanco. Duas amostras de pele por camundongo foram cortadas em pequenos pedaços em 500 µl de PBS em tubos do tipo C (Miltenyi Biotec) e mecanicamente dissociados (GentleMACS; Miltenyi Biotec). Após centrifugação a 300 g, os sobrenadantes foram transferidos para tubos Eppendorf e centrifugados a 18000 g no frio. O sobrenadante limpo foi analisado com quimiocina de camundongo Procartaplex e kits multiplex de citocina usando um dispositivo MagPix de acordo com as recomendações do fabricante.

[00187] Quatro camundongos por grupo foram analisados.

Os perfis obtidos após a injeção de MVA e PCPV foram comparados ao tampão (controle negativo). Em geral, cada analito foi secretado em graus maiores após a injeção de PCPV do que após MVA ou tampão. Como esperado, o tratamento com tampão não teve efeito sobre a secreção de citocinas. Surpreendentemente, em comparação com MVAN33.1, o PCPV induziu níveis locais significativamente mais elevados de IP-10, IFN-gama, TNF-alfa, IL-12, IL-1 beta, RANTES, IL-18, MCP-1 e MIP1-beta (como ilustrado na Figura 8), bem como de IL-4, GM-CSF, MIP-1alfa, Eotaxina, IL-6, GRO-alfa, MCP-3, G-CSF, M-CSF e LIF (dados não mostrados).

EFEITO DE PCPV EM TILS EM MODELO MC38 MURINO

[00188] Os camundongos foram divididos em 3 grupos de 6 animais. Os tumores palpáveis crescidos após a implementação s.c. de células MC38 (tumores palpáveis de pelo menos 100 mm 3) foram injetados intratumoralmente 9 dias após a implantação das células tumorais com 1 x 107 ufp de PCPV ou MVA recombinante (ambos os vírus codificam HPV16E7m, um antígeno irrelevante para este modelo de tumor) ou tampão (controle negativo).

No dia após a injeção de vírus, os camundongos foram sacrificados, os tumores foram isolados, dissociados enzimaticamente (produtos Miltenyi: kit de dissociação de tumor, tubo C, programa Gentle Macs: Tumores m_imp tumor 02 seguido por 40 min a 37 °C sob agitação encerrada com programa m_imptumor_03 duas vezes) e os TILs foram enriquecidos. Após a filtração da suspensão celular resultante (poros de 70 µm) e lise de eritrócitos (BD PharmLyse, 5 min), as células CD45+ foram enriquecidas usando tecnologia de esferas magnéticas (produtos Miltenyi: CD45 TILs MicroBeads, separação em MultiMAVS Cell24, programa: prog POSSEL + bloc 24). As subpopulações nas células enriquecidas com CD45+ foram identificadas por citometria de fluxo de acordo com Brauner et al. (Resumo do pôster AACR 2017 N° 1672). A porcentagem de neutrófilos foi detectada na população de células CD11b+ Ly6G+ CD45+. TAMs foram identificados como subpopulação de CD11c- dentro das células Ly6G-CD11b+. Várias subpopulações foram estratificadas com MHC II e Ly6C. “TAM C” de acordo com Brauner et al, foram caracterizados como MHC IIlo e Ly6C.

[00189] A Figura 9 ilustra a capacidade do PCPV de aumentar a porcentagem de neutrófilos em tumores em crescimento (9A), enquanto diminui a porcentagem da população TAM C (9B). Estes resultados podem ser indicativos de controle de tumor mediado por PCPV.

[00190] Há também uma valorização crescente da heterogeneidade de neutrófilos no câncer, com populações distintas de neutrófilos promovendo o controle ou progressão do câncer (revisado em Singel e Segal, 2016, Immunol Rev. 273: 329-43). Uma caracterização adicional das subpopulações pode ser útil, bem como o seu impacto na população e funções de CTL.

[00191] Em relação aos macrófagos TAM C (MHC IIlo), Movahedi et al. (2010, Cancer Res70: 5728-39) descreve diferentes subconjuntos de TAM em tumores mamários de camundongo. MHC IIlo TAM são mais de um fenótipo semelhante a M2, são enriquecidas em áreas hipóxicas de tumores, têm atividade pró-angiogênica superior, in vivo, e aumentadas em número a medida que os tumores progridem. A redução dessa população pode ser um indicativo para um melhor prognóstico de controle do tumor.

EXEMPLO 4: ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE IN VIVO USANDO PCPV EXPRESSANDO HPV-E7M

ANÁLISE ELISPOT

[00192] A imunogenicidade induzida pelo vetor de vacina PCPV foi avaliada por ELISPOT e comparada com MVA, os animais foram divididos em 4 grupos de 6 camundongos, um tratado com PCPV codificando HPV16 E7mut, um com sua contraparte de MVA (MVA-HPV16E7mut), um tratado com MVA vazio (MVA N33) e um grupo negativo que recebeu tampão. 1 x 105 ufp de vírus foram injetados por via intravenosa no dia 1 e no dia 8 em camundongos C57BL/6. Uma semana após a segunda imunização (no dia 15), os camundongos foram sacrificados e os baços e pulmões isolados. Os baços de todos os camundongos de um grupo foram agrupados para análises de ELISPOT. Os pulmões foram agrupados (exp ICS24) ou testados individualmente (exp ICS28) para células T CD8+ específicas do antígeno por coloração de citocina intracelular. A especificidade do antígeno foi sondada em ambos os testes com o peptídeo R9F específico de HPV16E7, o peptídeo T8V específico de MVA e os peptídeos irrelevantes I8L ou K9i-3C CTRL.

[00193] A análise ELISPOT para esplenócitos produtores de IFN-gama específicos de antígeno foi realizada de acordo com o protocolo padrão.

PREPARAÇÃO DA PLACA

[00194] As placas (Millipore, MSIPS4W10) foram pré- tratadas 1 minuto com Etanol 35% (15 µl/ poço) e lavadas cinco vezes com água estéril (200 µl/ poço). Os poços foram revestidos com 100 µl de anticorpo IFNg anti-camundongo a 15 µg/ ml (Mabtech, AN18, 3321-3-1000; diluído em PBS) e incubadas durante a noite ou durante o fim de semana a +4 °C. No dia do experimento, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS estéril (200 µL/ poço) e saturadas durante pelo menos 1 h a 37 °C com meio completo (CM 200 µL/ poço).

PREPARAÇÃO DE AMOSTRA

[00195] Elispots ex vivo foram realizados com linfócitos esplênicos frescos. Para cada experimento, baços de 5 animais de cada grupo foram coletados e agrupados. Os baços foram recolhidos em 4 mL de meio completo (CM; X-Vivo, Lonza BE04-380Q) e depois esmagados com um êmbolo de seringa através de um filtro de células de 70 µm em uma placa de 6 poços. A suspensão de esplenócitos obtida foi diluída 2 vezes em CM, colocada sobre 4 mL de meio de células de separação Lympholyte®-M (Cedarlane, ref: CL5035) e centrifugada por 20 minutos a 1500 g em temperatura ambiente. A interfase contendo linfócitos foi coletada e lavada duas vezes em 10 mL de PBS (centrifugação por 5 minutos a 400 g em temperatura ambiente). Os linfócitos foram ressuspensos em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (BD PharmLyse, BD BioScience, ref 555899) e incubados durante 5 a 15 minutos à temperatura ambiente para lisar glóbulos vermelhos. Após uma etapa de lavagem em CM (centrifugação por 5 minutos a 400g em temperatura ambiente),

os linfócitos foram ressuspensos em 10 mL de CM e contados usando o «Z2 Coulter contagem de partículas e analisador de tamanho» de Beckman Coulter.

A concentração de células foi ajustada para 1 x 107 células por mL com CM.

ENSAIO

[00196] Primeiro, o meio de saturação foi removido esvaziando as placas e 50 µL de CM foram adicionados em todos os poços. 50 µL de cada solução de peptídeo a 4 µg/ mL em CM ou 50 µL de CM (controle negativo) foram adicionados aos poços relevantes (de acordo com um esquema de pipetagem previamente definido; cada condição foi testada em quadriplicado).

Como controle positivo, 50 µL de 20 µg/ mL de Concanavalina A (ConA) foram adicionados aos poços pré-definidos. Em segundo lugar, 100 µL de cada suspensão de linfócitos (1 x 106 células) foram adicionados aos poços (com exceção dos poços T8V onde apenas 3 x 10 5 células foram adicionadas) e as placas foram incubadas por 18 h a 20 h a 37 °C em 5% de CO2.

[00197] No dia seguinte, as células foram removidas esvaziando as placas, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS (200 µL/ poço) e anticorpo monoclonal IFNg anti-camundongo biotinilado (Mabtech, R4-6A2, 3321-6-1000; 1 µg/ mL de concentração final em PBS a 0,5% de FCS) foi distribuída em cada poço (100 µL/ poço). As placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente, em seguida, lavadas cinco vezes com PBS e Extravidina-Fosfatase alcalina (SIGMA, E236, 1/ 5000e em PBS a 0,5% de FCS) foram distribuídas em cada poço (100 µL/ poço). As placas foram incubadas novamente por 1 hora em temperatura ambiente, lavadas cinco vezes com PBS e 100 µl de solução de substrato de BCIP/ NBT (comprimidos BCIP/ NBT, SIGMA, B5655; 0,45 µM filtrado) foram distribuídos em cada poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente, no escuro, até que pontos distintos fossem vistos nos poços positivos (por 5 a 10 minutos). O desenvolvimento da cor foi interrompido esvaziando as placas e lavando extensivamente com água da torneira. As placas foram deixadas no escuro sem tampa até que secassem por pelo menos 1 h em temperatura ambiente.

AQUISIÇÃO DE DADOS

[00198] Os pontos foram contados com um leitor ELISpot (leitor CTL Immunoqpot, S5UV). Um controle de qualidade foi realizado para cada poço para garantir que as contagens fornecidas pelo leitor ELISpot correspondam à realidade da imagem. Os resultados foram expressos para cada quadriplicado como o número médio de unidades formadoras de manchas (ufs) por 1 x 106 linfócitos esplênicos. A positividade foi determinada pelo script R (livelink Biostat).

RESULTADOS

[00199] Os esplenócitos retirados do grupo de animais tratados com PCPV e MVA que codificam HPV16E7m mostraram secreção de IFNγ específica de R9F como ilustrado na Figura 10 A, trazendo à tona a capacidade dos dois vírus recombinantes de induzir uma resposta imune específica direcionada ao antígeno codificado. Por outro lado, nenhuma secreção de IFNγ pôde ser detectada após a administração do MVA vazio ou tampão ou após estimulação com o peptídeo irrelevante K9i-3. Por outro lado, apenas os vetores MVA (MVA vazio ou recombinante) respondem após a estimulação com o peptídeo T8V específico de MVA (Figura 10 B).

ANÁLISE DE ICS EM AMOSTRAS DE PULMÃO AGRUPADAS

[00200] Os pulmões de camundongos imunizados foram combinados (ICS 024) ou tratados individualmente (ICS 028), conforme descrito em Remy-Ziller et al. (2018, Hum Vaccin Immunother. 14: 140-5). Primeiro, os pulmões foram dissociados enzimaticamente e mecanicamente (produtos Miltenyi: kit de dissociação de tumor, tubos C e GentleMacs). 2 x 106 células foram estimuladas ex vivo em 150 µl de meio TexMACS (Miltenyi) na presença de 1 µg de anti CD28 (abcam) e o peptídeo R9F específico de HPV16E7, o peptídeo T8V específico de MVA ou o peptídeo irrelevante I8L. Após cinco horas de incubação na presença de Brefeldin, as células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti CD3 e anti CD8. Após permeabilização (Cytofix/ Cytoperm, BD Bioscience), a ativação foi avaliada por coloração intracelular com anti-IFN-gama-FITC (clone XMG1.2, BD Pharmingen) ou seu controle de isotipo. Uma subpopulação de linfócitos foi definida como subpopulação CD3dimCD8dim compreendendo células efetoras de vida curta e células efetoras iniciais. A análise dot blot mostra que duas injeções de MVA ou PCPV recombinante levam ao aparecimento de uma população CD3 dimCD8dim (conforme descrito em Remy-Ziller et al, 2018, Hum Vaccin Immunother. 14: 140- 5) composta por Células T CD8+ efetoras (dados não mostrados). A extensão em que esta população foi expandida foi superior para MVA do que PCPV (Figura 10C). No entanto, números comparáveis de células T específicas de R9F foram detectados nessas subpopulações após injeções de PCPV ou MVA que codifica HPV16 E7m como mostrado na Figura 10D. Em outros termos, o número absoluto de células secretoras de IFN-gama específicas de R9F foi comparável em animais administrados com PCPV e MVA que codificam HPV16E7m, embora o número total de células CD3dimCD8dim induzidas por PCPV fosse menor. Isto sugere que a quantidade de indução de células T CD8+ específicas de E7 de HPV16 foi maior após a vacinação com o vetor PCPV do que com o vetor MVA.

[00201] Pulmões individuais de camundongos vacinados com MVAN33.1, MVA que codifica HPV16E7 e PCPV que codifica HPV16E7 (ou seja, sua versão não oncogênica) foram analisados em termos de aumento em vezes de células T CD8+ secretoras de IFN-gama específicas de R9F dentro da população de CD3dimCD8dim. Como mostrado na Figura 11, um número significativamente maior (aumento em vezes) de contagens foi encontrado no grupo tratado com PCPV HPVE7 em comparação com o grupo tratado com MVA HPVE7.

[00202] Todos juntos, esses dados mostraram que, como o MVA-E7, o PCPV-E7 induziu uma forte resposta celular (ELISPOT em esplenócitos e frequência de células efetoras de vida curta específicas do antígeno), mas o PCPV-E7 apresentou um perfil diferente no local de injeção, com níveis aumentados de citocinas pró-imunes, incluindo IP-10, IFN-gama, GM-CSF, IL-18, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, IL-12 e IL-6. Quando injetado por via intratumoral em tumores MC-38 de crescimento rápido, o PCPV levou ao controle do tumor. A análise dos infiltrados de tumores mostrou que o tratamento com PCPV levou a níveis mais elevados de neutrófilos e diminuição da frequência de TAMs MHCIIlo (M2).

[00203] Em conclusão, nossos dados demonstram que o PCPV pode apresentar melhores propriedades do que os vetores virais atuais, em termos de resposta local e atividade de inicialização, capacidade de induzir células T efetoras e remodelar os perfis de infiltração tumoral. Embora muitas diferenças genéticas em comparação com outros poxvírus, o PCPV tem a capacidade de codificar e entregar uma grande carga genética, o que é útil para projetar vacinas antitumorais avançadas.

REFORÇO DE INICIALIZAÇÃO HETERÓLOGO (PCPV/ MVA)

[00204] Foi publicado que os pacientes com infecção por PCPV não desenvolvem imunidade à Vaccinia/ MVA e vice-versa (Friedman- Kien et al., 1963, Science 140: 1335-6). O tratamento de combinação com MVA- HPV16E7 e PCPV-HPV16E7 foi assim estudado no modelo de tumor TC1.

[00205] Para isso, células TC1 positivas para HPV16E7 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6. Após 14 dias, camundongos com tumor foram randomizados (10 camundongos por grupo) e injetados intratumoralmente com 1 x 106 ufp de MVA-HPV16E7 ou PCPV-HPV16E7. Uma semana depois, o reforço foi realizado por injeção intravenosa com 1 x 106 ufp de PCPV-HPV16E7 ou MVA-HPV16E7. O crescimento do tumor e a sobrevivência foram acompanhados ao longo do tempo em camundongos tratados com configurações de MVA/ MVA homólogo e MVA/ PCPV e PCPV/ MVA heterólogo ou com tampão nas mesmas condições (iniciação intratumoral e reforço iv) como controle negativo.

[00206] Conforme ilustrado na Figura 14, os tratamentos heterólogos resultaram em um melhor controle do tumor em comparação com o tratamento com reforço inicial de MVA-HPV16E7 homólogo. Curiosamente, tanto MVA de inicialização/ PCPV de reforço ou PCPV de inicialização/ MVA de reforço produziram um declínio no crescimento do tumor em relação ao grupo MVA de inicialização/ MVA de reforço, embora PCPV de inicialização/ MVA de reforço tenha a tendência de controlar melhor o crescimento do tumor (controle do tumor em um número maior de camundongos conforme mostrado na Figura 14C).

Como esperado, o tumor cresceu muito rapidamente em animais tratados com tampão.

EXEMPLO 5: TRATAMENTO COMBINADO DE PCPV COM UM ICI (INIBIDOR DE PONTO DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICO)

[00207] O efeito da combinação do tratamento com PCPV com tratamento com ICI sistêmico foi avaliado no modelo de tumor MC38. O anticorpo de rato anti mPD-1 (m para camundongo) RMP1-14 (disponível comercialmente na BioXcell) foi escolhido. Este anticorpo demonstrou bloquear a interação de mPD1 com seus ligantes (Yamazaki et al., 2005, J. Immunol. 175 (3): 1586-92).

[00208] No dia 1 (D1), a linhagem celular de carcinoma do cólon MC38 (2 x 106 células) foi injetada por via subcutânea (sc) no flanco direito de camundongos C57BL/6 singênicos rapados 2 dias antes. O local da injeção foi marcado com um marcador permanente. No mesmo dia, quatro vezes menos células MC38 (5 x 105) foram injetadas s.c. no flanco esquerdo. 107 ufp de PCPV (PCPTG19178) ou vírus VV (VVTG5095), ambos codificando HPV16E7m

(irrelevante para o modelo MC38), ou tampão (S08) foram injetados intratumoralmente (it) no local de injeção da linhagem celular no lado direito (dia 2) e posteriormente nos tumores emergentes do lado direito (dias 9 e 16). Por outro lado, 200 µg de anti-mPD-1 (RMPI1-14) foram injetados intraperitonealmente (ip) nos dias 5, 9 e 16. O crescimento do tumor dos tumores do lado direito (injetado) e esquerdo e a sobrevivência foram acompanhados ao longo do tempo.

[00209] Ao todo, os animais foram divididos em 6 grupos de 13 camundongos, respectivamente: - um grupo de controle recebendo tampão S08 (3 injeções it nos dias 2, 9 e 16); - um grupo de camundongos tratados com o vírus PCPV que expressa E7 (3 injeções it de 107 ufp de PCPTG19178 nos dias 2, 9 e 16); - um grupo de camundongos tratados com o vírus VV oncolítico que expressa E7 (3 injeções it de 107 ufp de VVTG5095 nos dias 2, 9 e 16); - um grupo de camundongos tratados com o anticorpo anti- PD1 (3 injeções ip de anticorpo RMP1-14 nos dias 5, 9 e 16; - um grupo que recebeu o vírus PCPV que expressa E7 e o anticorpo anti-PD1 (3 injeções it de 107 ufp de PCPTG19178 nos dias 2, 9 e 16 e 3 injeções ip de anticorpo RMP1-14 nos dias 5, 9 e 16); e - um grupo que recebe o vírus oncolítico VV que expressa E7 e o anticorpo anti-PD1 (3 injeções it de 107 ufp de VVTG5095 nos dias 2, 9 e 16 e 3 injeções ip de anticorpo RMP1-14 nos dias 5, 9 e 16).

[00210] A Figura 15 mostra a evolução do diâmetro dos tumores implantados nos flancos direitos nos grupos de camundongos tratados com PCPV (A) ou VV (B) isoladamente ou em combinação com o anti-PD1 murino. Mais especificamente, os tumores cresceram rapidamente no grupo de controle (S08) indo além de 2.000 mm3 em média antes do D13, enquanto o tratamento com anti-mPD1 permitiu adiar o volume médio de 2.000 mm3 em alguns dias (D16). Conforme ilustrado na Figura 15B, a mesma tendência foi observada após o tratamento com o VVTG5095 oncolítico (cinza escuro). Mas o crescimento do tumor foi controlado em camundongos tratados com VVTG5095 e anti-mPD1 em combinação (cinza médio), onde o volume médio de 2.000 mm3 foi obtido em D22. Em contraste, como mostrado na Figura 15A, o crescimento do tumor é significativamente atrasado após o tratamento com vírus PCPV (cinza escuro), onde o volume médio do tumor estava bem abaixo de 2.000 mm3 em D22 e ainda mais no grupo combo (cinza médio) recebendo tanto PCPTG19178 e anti-PD1. Notavelmente, no grupo combo PCPV-HPV16E7 + anti PD-1, a diferença no tamanho do tumor foi encontrada como significativa em relação aos tamanhos do tumor obtidos nos três outros grupos PCPV-HPV16E7, anti PD-1 e S08.

[00211] Em tumores contralaterais (flanco esquerdo), o tratamento com o anticorpo anti-mPD1 retardou a progressão do tumor. Uma redução significativa do tamanho do tumor foi encontrada no grupo anti-PD1 em relação aos outros grupos (dados não mostrados).

[00212] Para a análise de sobrevivência (dados não mostrados), um OS significativamente maior foi encontrado em ambos grupo PCPV-HPV16E7 e grupo combo PCPV-HPV16E7 + anti-PD-1 versus grupo tampão S08 (p-valores ajustados foram ambos de 0,036). As diferenças médias de sobrevivência foram, respectivamente, 4,4 dias e 3,4 dias. Um maior OS significativo também foi encontrado no grupo de combinação VV-HPV16E7 + anti PD-1 versus VV-HPV16E7 e grupos de controle (p-valores ajustados foram de 0,040 e 0,004). As diferenças médias de sobrevivência foram, respectivamente, 2,9 dias e 3,6 dias.

[00213] Estes resultados destacam que a combinação de um

PCPV recombinante com um ICI como o anti-PD1 permite fortalecer a proteção antitumoral.

EXEMPLO 6: EFEITO DO VÍRUS DA ESTOMATITE POPULAR BOVINA

[00214] O gênero Parapoxvirus compreende membros distintos, incluindo o vírus ORF, PCPV e o vírus da estomatite papular bovina (BPSV), todos podendo causar infecções em ruminantes e seus manipuladores (Zhao et al, 2013, J Virol Methods, 194: 229-34). A infecção por PAPV em humanos induz uma resposta imune mediada por células vigorosa e de curta duração e uma resposta humoral pobre e de curta duração, cerca de 8-12% dos indivíduos têm manipuladores de segunda infecção (Zhao et al., 2013, J Virol Methods, 194: 229-34).

[00215] Outro membro do gênero Parapoxvirus, (BPSV) foi testado quanto à sua capacidade de induzir a secreção de IFN alfa em PBMCs obtidos de 2 doadores diferentes e em comparação com MVA e PCPV (ver Exemplo 1). PBMCs frescos foram isolados, incubados durante a noite (repouso) e infectados no dia seguinte com o vírus em MOI de 0,3. Um ligante de TLR9 do tipo CpG (ODN2216 obtido da Invivogen) foi adicionado como um controle para pDC, secreção mediada por células B de IFN-alfa. Os sobrenadantes foram retirados 2, 4, 6, 16 ou 24h após a infecção, o IFN-alfa no sobrenadante foi quantificado por tecnologia Luminex conforme descrito acima.

[00216] Como mostrado na Figura 16, PBMCs infectadas com BPSV como PBMCs infectadas com PCPV induziram a secreção de níveis muito elevados de IFN-alfa 16 e 24h após a infecção celular. Os níveis de IFN- alfa secretados em ambos os casos estavam bem acima dos níveis de secreção moderados de IFN-alfa observados após infecção por MVA, confirmando os resultados obtidos no Exemplo 1 e acima do controle ODN2216.

[00217] Em conclusão, o BPSV mostrou efeitos semelhantes aos do PCPV, ou seja, forte aumento de IFN-alfa secretado no sobrenadante de

PBMCs obtidas de vários doadores.

[00218] Referências Bibliográficas: - Brauner et al. Resumo do pôster AACR 2017 N° 1672; - Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; - Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8 (1): 60-6; - Cattaneo e Russell, 2017, PLOS Pathogens doi:

10.1371/journalppat.1006190; - Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7; - Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968; - Choi et al. (2017, Surgery, doi 10.1016/j.surg.2017.09.030; - Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88 (10): 5242-55; - Coligan et al. (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health; - Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28; - Evans et al. 2004, J Pharm Sci. 93: 2458-75; - Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163-74; - Friedman-Kien et al., 1963, Science 140: 1335-6; - Gomez et al., 2013 expert Rev Vaccines 12 (12): 1395-1416; - Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; - Hautaniemi et al., 2010, J. Gen. Virol.91: 1560-76; - Kaufman et al., 2015, Nature Reviews Drug Discovery 14: 642- 661; - Kern et al., 1990, Gene, 88: 149-57 - Kumar e Boyle, 1990, Virology 179: 151-8; - Laidlaw e Skinner, 2004; J. Gen. Virol., 85: 305-22; - Mia et al., 2014, Scand. J. Immunol. 79 (5): 305-14; - Movahedi et al., 2010, Cancer Res 70: 5728-39; - Needleman e Wunsch. J.Mol. Biol. 48,443–453, 1970;

- Parker et al., 2016, Nat Rev Cancer 16 (3): 131-44;

- Perez e Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation

Oncology, 2ª Ed.

JB Lippincott Co;

- Quoix et al., 2011, The Lancet Oncology 12 (12): 1125-33;

- Remy-Ziller et al., 2018, Hum Vaccin Immunother. 14: 140-5;

- Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A.

Gennaro,

Lippincott, Williams & Wilkins;

- Rintoul et al., 2012, Mol.

Ther.20 (6): 1148-57;

- JR Robinson em “Sustained and Controlled Release Drug

Delivery Systems”, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978;

- Rooij et al., 2010, Vaccine 28 (7): 1808-13;

- Rziha et al., 2000, J.

Biotechnol. 83 (1-2): 137-145;

- Schulze et al., 2009, Vet Microbiol. 137: 260-7);

- Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5 (1), e8761;

- Shaul e Fridlender, 2017, J.

Leuko.

Biol. 102 (2): 343-9;

- Singel e Segal, 2016, Immunol Rev. 273: 329-43;

- Tikkanen et al., 2004, J.

Gen.

Virol. 85: 1413-8;

- Von Buttlar et al., 2014, PLOS One 9 (8): e106188;

- Wozniak et al., 2012, BMC Immunology, 13:65;

- Yamazaki et al., 2005, J.

Immunol. 175 (3): 1586-92;

- Yuan et al, 2015, Nature, Scientific Reports;

- Zhao et al, 2013, J Virol Methods, 194: 229-34;

- Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469;

Zitvogel et al., 2015, Nat Rev Immunol. 15 (7): 405-14;

- WO 92/07000;

- WO 96/16183; - WO 97/32029;

- WO 97/37031;

- WO 98/04727;

- WO 98/37095;

- WO 99/03885;

- WO 01/23001;

- WO 03/053463;

- WO 2005/07857;

- WO 2006/005529;

- WO 2006/085082;

- WO 2006/93924;

- WO 2007/056847;

- WO 2007/147528;

- WO 2008/092854;

- WO 2008/114021;

- WO 2009/065546;

- WO 2009/53937;

- WO 2012/01145;

- WO 2013/007772;

- WO 2014/053571;

- WO 2016/087457;

- EP 463 756;

- EP 998 568;

- EP 1 162 982;

- US 5,250,534;

- US 5,861,381;

- US 6,054,438;

- US6,365,393; - US 6,469,012;

- US 7,108,844;

- US 7,456,009;

- US 7,700,569;

- US 2003-0013076; e

- US 2007-0161085.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES

1. VÍRUS DA PSEUDOVARÍOLA (PCPV), caracterizado pelo referido PCPV compreender pelo menos um ácido nucleico estranho inserido em seu genoma.

2. PCPV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido PCPV ser obtido a partir da cepa TJS do tipo selvagem conforme identificado pelo número de referência do ATCC ATCC VR-634™ ou de uma cepa de vírus com o mesmo nome ou similar ou fragmentos funcionais e variantes dos mesmos.

3. PCPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo referido PCPV ser ainda defeituoso para uma função viral codificada pelo genoma de PCPV, e de preferência ser defeituoso para uma função viral não essencial e, mais preferencialmente, para uma função de gene viral codificada no local de inserção do referido ácido nucleico estranho.

4. PCPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo referido ácido nucleico estranho codificar um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos que compensam proteínas defeituosas ou deficientes em um sujeito, polipeptídeos que agem por meio de efeitos tóxicos para limitar ou remover células doentes do corpo, como produtos de genes suicidas; polipeptídeos capazes de potencializar a eficácia antitumoral, como produtos de genes armados; e polipeptídeos capazes de induzir ou ativar uma resposta imune, tais como polipeptídeos imunoestimuladores e antigênicos.

5. PCPV, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo referido polipeptídeo imunoestimulador ser selecionado a partir do grupo que consiste em citocinas, tais como interleucinas, quimiocinas, interferons, fator de necrose tumoral, fatores estimuladores de colônia, proteínas expostas a APC, polipeptídeos com um efeito anti-angiogênico e polipeptídeos que afetam a regulação dos receptores de superfície celular, como agonistas ou antagonistas de pontos de controle imunológicos.

6. PCPV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo referido polipeptídeo imunoestimulador ser uma interleucina ou um fator estimulador de colônias e, em particular GM-CSF ou ser um anticorpo agonista direcionado por OX40.

7. PCPV, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo referido polipeptídeo antigênico ser um antígeno de câncer, tais como o antígeno MUC-1, um polipeptídeo antigênico viral, tal como os antígenos E7 de HPV-16 ou antígenos de HBV.

8. PCPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por pelo menos um ácido nucleico estranho estar operacionalmente ligado a elementos reguladores adequados para expressão em uma célula hospedeira ou sujeito desejado.

9. PCPV, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por pelo menos um ácido nucleico estranho ser colocado sob o controle de um promotor de poxvírus, de um modo preferido, um promotor do vírus Vaccinia e mais preferivelmente um selecionado a partir do grupo que consiste no promotor

7.5K, H5R, 11K7.5, SE, TK, pB2R, p28, p11 e K1L, promotores sintéticos e promotores quiméricos precoces/ tardios.

10. PCPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por pelo menos um ácido nucleico estranho ser inserido no locus de VEGF.

11. MÉTODO PARA GERAR O PCPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, por recombinação homóloga entre um plasmídeo de transferência que compreende o ácido nucleico estranho flanqueado em 5’ e 3’ com sequências de PCPV presentes respectivamente a montante e a jusante do local de inserção e um genoma de PCPV, caracterizado pelo referido método compreende uma etapa de geração do referido plasmídeo de transferência e uma etapa de introdução do referido plasmídeo de transferência em uma célula hospedeira adequada, nomeadamente em conjunto com um vírus PCPV compreendendo a sequência de flanqueamento presente no plasmídeo de transferência.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo local de inserção de pelo menos um ácido nucleico estranho no genoma de PCPV estar em um gene viral, com preferência por um gene viral não essencial, em uma região intergênica, em um porção do genoma do PCPV que não codifica produtos gênicos ou em um locus duplicado.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por após a inserção do ácido nucleico estranho no genoma de PCPV, o locus viral no local de inserção ser deletado pelo menos parcialmente, resultando em um vírus PCPV defeituoso para a referida função do vírus.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo referido pelo menos um ácido nucleico estranho ser inserido no locus de VEGF.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo plasmídeo de transferência compreender ainda um ou mais genes de seleção e/ ou detectáveis para facilitar a identificação do PCPV recombinante.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo plasmídeo de transferência ser introduzido na célula hospedeira na presença de uma endonuclease capaz de fornecer uma quebra de fita dupla no referido gene de seleção ou detectável.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado pelo gene de seleção ser o gene GPT que codifica uma guanina fosforibosil transferase que permite o crescimento em um meio seletivo e/ ou o referido gene detectável codifica GFP, e-GFP ou mCherry.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pela referida célula hospedeira adequada ser uma célula de Turbinato Bovino (BT).

19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado por ser para gerar (a) um vírus PCPV compreendendo inserido dentro de um ou ambos os locus de VEGF um ácido nucleico que codifica o antígeno MUC-1 humano, de preferência sob o controle transcricional do promotor pH5R da vaccinia precoce/ tardio de ou (b) um vírus PCPV compreendendo inserido em um ou ambos os locus de VEGF um ácido nucleico que codifica um antígeno E7 não oncogênico de HPV-16 ancorado na membrana de preferência sob o controle transcricional do promotor p7.5 de vaccinia precoce/ tardio.

20. MÉTODO PARA AMPLIFICAR O PCPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou gerado pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, caracterizado por compreender as etapas de a) preparar uma linhagem celular produtora, b) transfectar ou infectar a linhagem celular produtora preparada, c) cultivar a linhagem celular produtora transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus, d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem celular produtora e opcionalmente e) purificar o referido vírus recuperado.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela referida célula produtora ser HeLa.

22. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de PCPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou amplificada pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 21, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pela referida composição ser formulada em doses individuais compreendendo de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 ufp, vantajosamente de aproximadamente 104 ufp a aproximadamente 1011 ufp, de preferência de aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 1010 ufp; e mais preferencialmente de aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 109 ufp de PCPV.

24. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizada pela composição ser formulada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intratumoral.

25. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por ser para uso no tratamento ou prevenção de doenças ou condição patológica causada por um organismo patogênico ou uma divisão celular indesejada.

26. MÉTODO DE TRATAMENTO, caracterizado por compreender a administração da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, a um sujeito em necessidade da mesma em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou uma condição patológica provocada por um organismo patogênico ou uma divisão celular indesejada.

27. MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS, caracterizado por compreender a administração da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, a um sujeito em necessidade da mesma.

28. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado por compreender 2 a 6 administrações semanais, possivelmente seguidas por 2 a 15 administrações com 3 semanas de intervalo da composição PCPV compreendendo 106 a 109 ufp.

29. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo referido método ou uso ser para o tratamento de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer pancreático e câncer de ovário e um câncer que superexpressa MUC1.

30. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por ser para o tratamento de um sujeito com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL) usando um PVPC que codifica o antígeno MUC1.

31. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por ser para o tratamento de um câncer HPV-positivo, como um câncer de colo do útero ou de cabeça e pescoço, usando um PVPC que codifica um antígeno E7 de HPV16.

32. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado por ser usado em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos selecionados a partir do grupo que consiste em cirurgia, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia de toxinas, imunoterapia, terapia com citocinas, terapia direcionada ao câncer, terapia gênica, terapia fotodinâmica e transplante.

33. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por ser realizado de acordo com uma abordagem de reforço inicial que compreende administrações sequenciais de uma composição(ões) de inicialização de imunização e uma composição(ões) de reforço.

34. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela composição de inicialização de imunização ser uma composição de PCPV administrada por via intratumoral e a composição de reforço ser uma composição de MVA administrada por via intravenosa.

35. MÉTODO PARA INDUZIR OU ESTIMULAR E/ OU REORIENTAR UMA RESPOSTA IMUNE, caracterizado por compreender a administração da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, a um sujeito em necessidade da mesma, em uma quantidade suficiente para ativar a imunidade do sujeito.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por resultar em pelo menos uma das seguintes propriedades: - A secreção de altos níveis de IFN-alfa a partir da PBMC; - A ativação de células dendríticas derivadas de monócitos; - A indução da ativação ou proliferação de células T; - Um melhor perfil de citocinas/ quimiocinas em MDSC; - ativação da APC; - uma conversão de M2 em M1 de macrófagos humanos; e/ ou - Indução de imunidade por meio de uma via mediada por TLR9 ou outras vias estimuladoras da imunidade inata.