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BR112020015798A2 - Composições de vírus adeno-associado para restaurar função de gene da pah e métodos de uso das mesmas - Google Patents

Composições de vírus adeno-associado para restaurar função de gene da pah e métodos de uso das mesmas Download PDF

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BR112020015798A2
BR112020015798A2 BR112020015798-8A BR112020015798A BR112020015798A2 BR 112020015798 A2 BR112020015798 A2 BR 112020015798A2 BR 112020015798 A BR112020015798 A BR 112020015798A BR 112020015798 A2 BR112020015798 A2 BR 112020015798A2
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BR
Brazil
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amino acid
seq
capsid protein
pah
nucleotide
Prior art date
Application number
BR112020015798-8A
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English (en)
Inventor
Albert Barnes Seymour
Seemin Seher Ahmed
Jason Boke Wright
Serena Nicole Dollive
James Anthony McSwiggen
Jaime Michelle Prout
Danielle Lauren Sookiasian
Original Assignee
Homology Medicines, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

composições de vírus adeno-associado para restaurar função de gene da pah e métodos de uso das mesmas. são fornecidas nessa invenção composições de vírus adeno-associado (aav) que podem restaurar a função do gene da fenilalanina hidroxilase (pah) na célula. também são fornecidos métodos de uso das composições de aav e sistemas de acondicionamento para preparar as composições de aav.

Description

COMPOSIÇÕES DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO PARA RESTAURAR FUNÇÃO DE GENE DA PAH E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US com os Nos de série 62/625.149, depositado em 1 de fevereiro de 2018 e 62/672.377, depositado em 16 de maio de 2018, cujas divulgações inteiras são incorporadas nesse documento por referência.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[002] O conteúdo da listagem de sequência enviada eletronicamente em arquivo de texto ASCII (Nome: HMT- 024PC_SeqList_ST25.txt; Tamanho: 367.287 bytes; e Data de Criação: 30 de janeiro de 2019) é incorporado nesse documento por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[003] A fenilcetonúria (PKU) é uma doença genética autossômica recessiva em que a maioria dos casos é causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (PAH). O gene da PAH codifica uma enzima hepática que catalisa a hidroxilação de L-fenilalanina (Phe) em L-tirosina (Tyr) após multimerização. A redução ou perda da atividade da PAH leva ao acúmulo de fenilalanina e sua conversão em fenilpiruvato (também conhecido como fenilcetona). Essa anormalidade no metabolismo da fenilalanina prejudica a maturação neuronal e a síntese de mielina, resultando em retardo mental, convulsões e outros problemas médicos graves.
[004] Atualmente, não há cura para a PKU. O padrão de cuidado é o manejo dietético, minimizando os alimentos que contêm grandes quantidades de fenilalanina. O manejo dietético desde o nascimento com uma fórmula com baixo teor de fenilalanina previne amplamente o desenvolvimento das consequências neurológicas do distúrbio. No entanto, mesmo com uma dieta com baixo teor de proteína, as crianças ainda sofrem de retardo de crescimento, e os adultos geralmente apresentam osteoporose e deficiências de vitaminas. Além disso, a adesão ao tratamento dietético para toda a vida é difícil, especialmente após a idade escolar.
[005] Novas estratégias de tratamento surgiram recentemente, incluindo a suplementação de aminoácidos neutros grandes (LNAA), terapia com cofator tetra- hidrobiopterina, terapia de reposição enzimática e terapia probiótica geneticamente modificada. No entanto, essas estratégias apresentam desvantagens. A suplementação de LNAA é adequada apenas para adultos que não aderem a uma dieta com baixo teor de Phe. O cofator tetrahidrobiopterina só pode ser usado em algumas formas leves de PKU. A reposição enzimática pela administração de um substituto para a PAH, por exemplo, fenilalanina amônia-liase (PAL), pode levar a respostas imunológicas que reduzem a eficácia e/ou causam efeitos colaterais. Quanto à terapia probiótica geneticamente modificada, a patogenicidade de E. coli que expressa PAL tem sido uma preocupação.
[006] A terapia gênica fornece uma oportunidade única para curar PKU. Os vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais, são capazes de integrar ácidos nucleicos em genomas de células hospedeiras. No entanto, esses vetores podem levantar questões de segurança devido à sua inserção não direcionada para o genoma. Por exemplo, existe o risco de o vetor interromper um gene supressor de tumor ou ativar um oncogene, causando assim uma malignidade. De fato, em um ensaio clínico para o tratamento de imunodeficiência combinada grave ligada a X (SCID) por transdução de precursores de medula óssea CD34+ com um vetor gama- retroviral, quatro em cada dez pacientes desenvolveram leucemia (Hacein-Bey-Abina et al., J Clin Invest. (2008) 118(9):3132-42).
[007] Também foi especulado que tecnologias de edição de genes baseadas em nuclease, tais como, meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs), e tecnologia de repetição palindrômica curta (CRISPR) agrupada, regularmente intercalada, pode ser usada para corrigir defeitos no gene da PAH em pacientes com PKU. No entanto, cada uma dessas tecnologias levanta questões de segurança devido ao potencial de mutação fora do alvo de sítios no genoma humano similares em sequência ao sítio alvo pretendido.
[008] Consequentemente, há uma necessidade na técnica de composições e métodos de terapia gênica melhorados que possam restaurar de forma eficiente e segura a função do gene da PAH em pacientes com PKU.
SUMÁRIO
[009] São fornecidas nesse documento composições de vírus adeno-associado (AAV) que podem restaurar a função do gene da PAH nas células, e métodos para usar as mesmas para tratar doenças associadas à redução da função do gene da PAH (por exemplo, PKU). Também são fornecidos sistemas de empacotamento para preparar as composições de vírus adeno- associado.
[0010] Por conseguinte, em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para corrigir uma mutação em um gene da fenilalanina hidroxilase (PAH) em uma célula, o método compreendendo a transdução da célula com um vírus adeno-associado com defeito de replicação (AAV) compreendendo: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de correção que compreende: (i) um elemento de edição para editar um locus alvo no gene da PAH; (ii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ ao locus alvo; e (iii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ com o locus alvo, em que a célula é transduzida sem cotransduzir ou coadministrar uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena.
[0011] Em certas modalidades, a célula é um hepatócito, uma célula renal ou uma célula do(a) cérebro, glândula pituitária, glândula adrenal, pâncreas, bexiga urinária, vesícula biliar, cólon, intestino delgado ou mama. Em certas modalidades, a célula está em um indivíduo mamífero e o AAV é administrado ao indivíduo em uma quantidade eficaz para transduzir a célula no indivíduo. Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para tratar um indivíduo tendo um(a) doença ou distúrbio associado(a) a uma mutação do gene da PAH, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um AAV com defeito de replicação compreendendo:
(a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de correção que compreende: (i) um elemento de edição para editar um locus alvo no gene da PAH; (ii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ ao locus alvo; e (iii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ ao locus alvo, em que uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena não é coadministrada ao indivíduo.
[0012] Em certas modalidades, a(o) doença ou distúrbio é fenilcetonúria. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano.
[0013] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um vírus adeno-associado com defeito de replicação (AAV) que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de correção que compreende: (i) um elemento de edição para editar um locus alvo no gene da PAH; (ii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ ao locus alvo; e (iii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ ao locus alvo.
[0014] As seguintes modalidades se aplicam a cada um dos aspectos anteriores.
[0015] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende pelo menos uma porção de uma sequência de codificação de PAH. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de codificação de PAH. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é silenciosamente alterada. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139 ou 143.
[0016] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH, opcionalmente em que a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende um íntron não nativo inserido em uma sequência de codificação de PAH. Em certas modalidades, o íntron não nativo é selecionado do grupo que consiste em um primeiro íntron de um gene de hemoglobina beta e um vírus minuto em íntron de camundongo (MVM). Em certas modalidades, o íntron não nativo consiste em uma sequência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 28-30 e 120-130. Em certas modalidades, o íntron não nativo consiste em uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 28-30 e 120-130.
[0017] Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23. Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende de 5’ a 3’: uma primeira porção de uma sequência de codificação de PAH, o íntron e uma segunda porção de uma sequência de codificação de PAH, em que a primeira porção e a segunda porção, quando submetidas a emenda, formam uma sequência de codificação de PAH completa. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é silenciosamente alterada. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 25 ou 116. Em certas modalidades, a primeira porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65, e/ou a segunda porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66 ou 67. Em certas modalidades, a primeira porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65, e a segunda porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66 ou 67.
[0018] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: um elemento de salto ribossomal e a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH. Em certas formas de realização, o elemento de edição compreende adicionalmente uma sequência de poliadenilação 3’ em relação à sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH. Em certas modalidades, a sequência de poliadenilação é uma sequência de poliadenilação exógena, opcionalmente em que a sequência de poliadenilação exógena é uma sequência de poliadenilação SV40. Em certas modalidades, a sequência de poliadenilação SV40 compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31-34, e uma sequência complementar à mesma.
[0019] Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ do locus alvo está em um éxon do gene da PAH. Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está no éxon 1 do gene da PAH.
[0020] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende adicionalmente um aceitador de emenda 5’ para o elemento de salto ribossomal. Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está em um íntron do gene da PAH. Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ ao locus alvo está no íntron 1 do gene da PAH. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35.
[0021] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’ é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à primeira região genômica. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’ é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à segunda região genômica.
[0022] Em certas modalidades, a primeira região genômica está localizada em uma primeira janela de edição, e a segunda região genômica está localizada em uma segunda janela de edição. Em certas modalidades, a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36 ou 45. Em certas modalidades, a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36 ou 45. Em certas modalidades, a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36, e a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
[0023] Em certas modalidades, a primeira região genômica consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, a segunda região genômica consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
[0024] Em certas modalidades, cada uma das sequências de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e 3’ tem, independentemente, um comprimento de cerca de 100 a cerca de 2000 nucleotídeos.
[0025] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende: C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -433 da PAH gene, C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH, ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH e/ou A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende: (a) C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, e G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH; (b) A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH; (c) A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH; (d) G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH; (e) G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH; (f) C correspondente ao nucleotídeo -433 do gene da PAH e C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH; (g) ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH; e/ou (h) A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende as modificações de (c) e (d), (f) e (g) e/ou (b) e (h).
[0026] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ consiste em uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-44, 111, 115 e 142. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45, 112, 117, 144.
[0027] Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, 113, 118, 134, 136 e
145.
[0028] Em certas modalidades, o genoma de correção compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos de repetição terminal invertida 5’(ITR 5’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e uma sequência de nucleotídeos de repetição terminal invertida 3’ (ITR 3’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, A sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20, e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26, e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
[0029] Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-63, 114, 119, 135, 137 e
146. Em certas modalidades, o genoma de correção consiste na sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-63, 114, 119, 135, 137 e 146.
[0030] Em certas modalidades, a capsídeo de AAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV Clado F.
[0031] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G. Em certas modalidades, (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; (d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; ou (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C.
[0032] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203- 736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou
17.
[0033] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 da SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G. Em certas modalidades, (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; (d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; ou (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C.
[0034] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-
736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
[0035] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 da SEQ ID NO: 2 é T; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 68 da SEQ ID NO: 2 é V; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 da SEQ ID NO: 2 é L; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 da SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 da SEQ ID NO: 2 é T, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 da SEQ ID NO: 2 é I, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é Y; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 da SEQ ID NO: 2 é R e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; (d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 da SEQ ID NO: 2 é L, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G; (f) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; (g) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; (h) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; ou (i) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C.
[0036] Em certas modalidades, a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
[0037] Em certas modalidades, a eficácia de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 1% quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão. Em certas modalidades, a frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 0,5% quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão.
[0038] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um AAV divulgado nesse documento.
[0039] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um sistema de empacotamento para a preparação recombinante de um AAV, em que o sistema de empacotamento compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos Rep que codifica uma ou mais de proteínas Rep de AAV; (b) sequência de nucleotídeos Cap que codifica uma ou mais de proteínas do capsídeo de AAV Clado F como divulgado nesse documento; e (c) um genoma de correção ou genoma de transferência como divulgado nesse documento, em que o sistema de empacotamento é operativo em uma célula para encerrar o genoma de correção ou genoma de transferência no capsídeo para formar o AAV.
[0040] Em certas modalidades, o sistema de empacotamento compreende um primeiro vetor que compreende a sequência de nucleotídeos Rep e a sequência de nucleotídeos Cap, e um segundo vetor que compreende o genoma de correção. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos Rep codifica uma proteína Rep de AAV2. Em certas modalidades, a proteína Rep é 78/68 ou Rep 68/52 de AAV2. Em certas modalidades, a proteína Rep de AAV2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo uma porcentagem mínima de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos Rep de AAV2 da SEQ ID NO: 22, em que a porcentagem mínima de identidade de sequência é de pelo menos 70% ao longo do comprimento da sequência de aminoácidos que codifica a proteína Rep de AAV2.
[0041] Em certas modalidades, o sistema de empacotamento compreende adicionalmente um terceiro vetor, em que o terceiro vetor é um vetor de vírus auxiliar. Em certas modalidades, o vetor de vírus auxiliar é um terceiro vetor independente. Em certas modalidades, o vetor de vírus auxiliar é integral com o primeiro vetor. Em certas modalidades, o vetor de vírus auxiliar é integral com o segundo vetor. Em certas modalidades, o terceiro vetor compreende genes que codificam proteínas de vírus auxiliar.
[0042] Em certas modalidades, o vírus auxiliar é selecionado do grupo que consiste em adenovírus, vírus do herpes, vírus da vacínia e citomegalovírus (CMV). Em certas modalidades, o vírus auxiliar é adenovírus. Em certas modalidades, o genoma de adenovírus compreende um ou mais de genes de RNA de adenovírus selecionados do grupo que consiste em E1, E2, E4 e VA. Em certas modalidades, o vírus auxiliar é o vírus do herpes simplex (HSV). Em certas modalidades, o genoma de HSV compreende um ou mais de genes de HSV selecionados do grupo que consiste em UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 e UL30/UL42.
[0043] Em certas modalidades, o primeiro vetor e o terceiro vetor estão contidos dentro de um primeiro plasmídeo de transfecção. Em certas modalidades, os nucleotídeos do segundo vetor e do terceiro vetor estão contidos dentro de um segundo plasmídeo de transfecção. Em certas modalidades, os nucleotídeos do primeiro vetor e do terceiro vetor são clonados em um vírus auxiliar recombinante. Em certas modalidades, os nucleotídeos do segundo vetor e do terceiro vetor são clonados em um vírus auxiliar recombinante.
[0044] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para a preparação recombinante de um AAV, o método compreendendo a introdução de um sistema de empacotamento como descrito nesse documento em uma célula sob condições operacionais para encerrar o genoma de correção ou o genoma de transferência no capsídeo para formar o AAV.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0045] A Figura 1A é um mapa do vetor pHMI-hPAH-hAC-
008.
[0046] A Figura 1B é um mapa do vetor pHMI-hPAH-h1C-
007.
[0047] A Figura 1C é um mapa do vetor pHMIA-hPAH-hI1C-
032.1.
[0048] A Figura 2 é uma imagem de Western blot mostrando a expressão de PAH humana a partir dos vetores pCOH-WT-PAH (“WT PAH”), pCOH-CO-PAH (“CO PAH pCOH”), e pHMI-CO-PAH (“CO PAH pHMI”) . 5x105 células HEK 293 foram transfectadas com 1 µg de vetor. O lisado das células foi coletado 48 horas após a transfecção. A expressão de PAH humana foi detectada por Western blotting com um anticorpo anti-PAH (Sigma HPA031642). A quantidade de proteína GAPDH como detectada por um anticorpo anti-GAPDH (Millipore MAB 374) foi mostrada como um controle de carregamento.
[0049] A Figura 3A é um gráfico que mostra a quantificação do cassete de cDNA de PAH após amplificação linear (“Enriquecido com LAM”) ou amplificação por PCR (“Amplicon”) do sítio alvo de edição.
[0050] A Figura 3B é um gráfico que mostra a análise quantitativa da integração do vetor pHMI-hPAH-hA-002 por PCR digital por gotícula (ddPCR).
[0051] A Figura 4A mostra o projeto do vetor pHMI-hPAH- mAC-006 e sua integração esperada em um genoma de camundongo.
[0052] A Figura 4B é um diagrama que ilustra um método para detectar por PCR um alelo editado pelo vetor pHMI-hPAH- mAC-006. Dois pares de iniciadores foram projetados: o primeiro par poderia amplificar um DNA de 867 pb de um alelo não editado (“PCR de controle”); o segundo par poderia amplificar especificamente um DNA de 2459 bp de um alelo editado (“PCR de alelo editado”).
[0053] A Figura 4C é uma imagem de eletroforese de DNA mostrando o produto de PCR da PCR de controle (“PCR de controle”) e da PCR de alelo editado (“PCR de Edição”), como ilustrado na Figura 4A. O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em um capsídeo de AAVHSC foi injetado em dois camundongos neonatais do tipo selvagem por via intravenosa através da veia da cauda a uma dose de 2 x 1013 genomas de vetor por kg de peso corporal. Amostras de fígado foram coletadas após 2 semanas. Uma amostra de fígado de um camundongo tratado com solução salina e uma amostra de células de fibroblastos de camundongo 3T3 foram usadas como controle negativo para a PCR de alelo editado.
[0054] A Figura 5A é um diagrama que ilustra um método para quantificar um alelo editado por ddPCR. Um primeiro par de iniciadores foi projetado para amplificar uma primeira sequência no vetor pHMI-hPAH-mAC-006 e uma primeira sonda
(“sonda de vetor”) foi projetada para hibridizar com a primeira sequência. Um segundo par de iniciadores foi projetado para amplificar uma segunda sequência no genoma do camundongo próximo ao vetor, e uma segunda sonda (“sonda de locus”) foi projetada para hibridizar com a segunda sequência. As amostras de DNA foram particionadas em gotas de óleo. A concentração de DNA foi otimizada para 600 pg por 20 µL a fim de reduzir significativamente a probabilidade de que uma gota de óleo contenha aleatoriamente uma partícula de vetor e uma partícula de DNA genômico (p <0,001). Após a integração do vetor no genoma, a taxa de positividade dupla da sonda de vetor e da sonda de locus na mesma gota aumenta.
[0055] A Figura 5B é um diagrama que ilustra um resultado esperado o método descrito na Figura 5A. Nesse diagrama, cada ponto representa uma única gota de óleo. Os pontos com sinal de sonda de vetor negativo, mas com sinal de sonda de locus positivo, representam os alelos não editados, enquanto os pontos com sinal de sonda de vetor positivo, mas com sinal de sonda de locus positivo, representam os alelos editados.
[0056] A Figura 5C é um gráfico que mostra os dados gerados a partir do fígado de camundongo usando o método descrito na Figura 5A. O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em um capsídeo de AAVHSC foi injetado em dois camundongos neonatais do tipo selvagem por via intravenosa através da veia da cauda a uma dose de 2 x 1013 genomas de vetor por kg de peso corporal. Amostras de fígado foram coletadas após 2 semanas. Uma amostra foi analisada usando o método descrito na Figura 5A. Detectaram-se gotículas positivas duplas positivas por sonda de vetor e por sonda de locus.
[0057] A Figura 5D é um gráfico que mostra os dados gerados a partir de uma amostra contendo fígado de um camundongo tratado com solução salina e o plasmídeo pHMI- hPAH-mAC-006. Poucas gotículas de sonda e sonda de locus duplamente positivas foram detectadas, sugerindo que a amostra foi suficientemente diluída de modo que uma probabilidade de que uma gota de óleo contenha aleatoriamente uma partícula de vetor e uma partícula de DNA genômico seja muito baixa.
[0058] A Figura 5E é um gráfico que mostra a quantificação do gráfico na Figura 5D e os gráficos gerados a partir de outras amostras. Os dois camundongos de controle tiveram 0% e 0,0395% de alelos editados no fígado, respectivamente, e os dois camundongos tratados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 tiveram 2,504% e 2,783% de alelos editados no fígado, respectivamente.
[0059] A Figura 6 é um gráfico que mostra a expressão de mRNA de PAH humana no fígado após a administração do vetor pHMI-hPAH-mAC-006. O RNA foi extraído e transcrito reversamente. Um par de iniciadores e uma sonda foram transmitidos para detectar especificamente uma expressão de PAH a partir do alelo editado. Cada nível de expressão de PAH é normalizado para o nível de expressão de Hprt endógeno.
[0060] A Figura 7A é um gráfico que mostra a eficácia de transdução do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC em amostras de sangue de camundongo, medida por ddPCR usando conjuntos de iniciadores e sondas para medir o vetor e os números de cópias dos loci genômicos de PAH de camundongo. O número de genomas de vetor por célula (“VG por célula”) é calculado a partir da razão medida do número de vetores versus o número de cópias do locus genômico de PAH de camundongo.
[0061] A Figura 7B é um gráfico que mostra a porcentagem de eficácia de edição em amostras de sangue de camundongo medidas por ddPCR multiplexado usando conjuntos de sonda de iniciador para medir a frequência do DNA integrado do vetor de AAV (“carga útil”) que se integra ao locus de PAH de camundongo e o locus de PAH humana. A frequência de edição foi calculada com base na copartição detectada de uma carga útil e um DNA alvo em uma única gota em excesso da probabilidade esperada de copartição de uma carga útil e um DNA alvo em moléculas de ácido nucleico separadas.
[0062] A Figura 7C é um gráfico que mostra os níveis percentuais de fenilalanina no soro em relação à referência nos camundongos após a administração do vetor pHMI-hPAH-mAC- 006 empacotado em um capsídeo de AAVHSC. Os níveis médios nos animais tratados e animais de controle (camundongos que não receberam administração de AAV) são plotados.
[0063] A Figura 7D é um gráfico que mostra os níveis percentuais de fenilalanina no soro em relação à referência em cada camundongo individual injetado com o vetor pHMI- hPAH-mAC-006 empacotado em um capsídeo de AAVHSC ou em cada camundongo controle que não recebeu administração de AAV. Os valores de p foram calculados por ANOVA contra a distribuição de controle.
[0064] A Figura 7E é um gráfico que mostra a correlação entre os níveis percentuais de fenilalanina no soro em relação à referência e a eficácia de edição percentual.
[0065] A Figura 7F é um conjunto de imagens que mostra a hibridização in situ (ISH) de mRNA de Pah e possivelmente
DNA de vírus compreendendo a sequência de PAH em amostras de fígado de camundongos injetados com o vetor hPAH-mAC-006 (painel do meio), um vetor de transgene de Pah não integrante (painel direito) ou controle de solução salina (painel esquerdo).
[0066] A Figura 8A é um gráfico que mostra a eficácia de transdução do vetor hPAH-hAC-008 e vetor hPAH-hAC-008-HBB em hepatócitos humanos e de camundongo em camundongos administrados com o vetor empacotado em capsídeos de AAVHSC15, como medido por ddPCR usando iniciadores e conjuntos de sondas específicos para o vetor. O eixo y representa o número de vetores medidos em relação aos genomas das células de camundongo ou humanas.
[0067] A Figura 8B é uma série de fotos que mostram a hibridização in situ de mRNA de Pah humano e possivelmente DNA de vírus compreendendo a sequência de PAH com alteração de códon silenciosa em amostras de fígado de camundongos administrados com um vetor hPAH-hAC-008 não modificado ou modificado. A sonda detectou apenas o mRNA transcrito de um locus de gene editado pelo vetor hPAH-hAC-008 não modificado ou modificado.
[0068] A Figura 8C é um gráfico que mostra a porcentagem de eficácia de edição do vetor hPAH-hAC-008 em hepatócitos de camundongo e humanos de camundongos transplantados com hepatócitos humanos, como medido por ddPCR multiplexado. A metade esquerda da figura se refere à eficácia de edição de um animal tratado com o vetor hPAH-hAC-008-HBB e a metade direita se refere à de um animal tratado com o vetor hPAH- hAC-008. Os valores de p foram calculados por ANOVA.
[0069] A Figura 9A representa um esquema do ensaio usado para determinar a eficácia de edição do gene da PAH em camundongos.
[0070] A Figura 9B é um gráfico que mostra a eficácia de edição do gene da PAH em células de camundongos que foram administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 ou com veículo de controle.
[0071] A Figura 10A é um gráfico que mostra os níveis percentuais médios de fenilalanina no soro em relação à referência em camundongos após a administração do vetor pHMI- hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 ou em um veículo de controle.
[0072] A Figura 10B é um gráfico que mostra os níveis percentuais médios de tirosina sérica em relação à referência em camundongos após a administração do vetor pHMI-hPAH-mAC- 006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 ou em um veículo de controle.
[0073] A Figura 10C é um gráfico que mostra a razão entre os níveis de fenilalanina no soro e tirosina sérica em camundongos que receberam o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 ou em um veículo de controle.
[0074] A Figura 11A é um gráfico que mostra a eficácia de edição do gene da PAH média e a eficácia de transdução em células obtidas de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 ou um veículo de controle.
[0075] A Figura 11B representa um gráfico que mostra a quantidade relativa de mRNA de PAH expressado, normalizado para o nível de expressão de GAPDH de camundongo, em células obtidas de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH- mAC-006 (AAVHSC15-mPAH) e/ou um veículo de controle.
[0076] A Figura 12A é um esquema que mostra o modelo de camundongo com fígado humanizado HuLiv.
[0077] A Figura 12B representa a eficácia média de edição do gene da PAH em células obtidas de camundongos 1 semana e 6 semanas após a administração do vetor pHMIK-hPAH- hI1C-032 empacotado em capsídeos de AAVHSC15.
[0078] A Figura 13 é um gráfico que mostra a eficácia média de edição de genes da PAH, como determinado por ddPCR e sequenciamento de próxima geração (NGS), em células obtidas de camundongos HuLiv administrados com o vetor pHMIK-hPAH- hI1C-032 empacotado em capsídeos de AAVHSC15.
[0079] A Figura 14 é um gráfico que mostra os níveis séricos médios de fenilalanina de camundongos de modelo de camundongo knock-out com PAH (PAHENU2) administrados por via intravenosa com o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 (hPAH-032) ou o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (mPAH-006), empacotado em capsídeos de AAVHSC15, em comparação com camundongos de controle.
[0080] A Figura 15A é um gráfico que mostra a relação entre a expressão de PAH humana e os níveis séricos de Phe.
[0081] A Figura 15B é um gráfico que mostra a expressão de PAH humana em relação a GAPDH humano em dois camundongos HuLiv diferentes tratados com o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 empacotado em capsídeos de AAVHSC15.
[0082] A Figura 16 é um gráfico que mostra a expressão do gene da PAH humana em camundongos HuLiv tratados com (esquerda) e a expressão do gene da PAH de camundongo em camundongos PAHENU2 tratados com vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (direita) empacotado em capsídeos de AAVHSC15.
[0083] A Figura 17A, 17B, 17C, 17D, 17E representa mapas de vetores de pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-
HCR, pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3, pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3, and pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0084] A presente divulgação forneceu composições de vírus adeno-associado (AAV) que podem restaurar a função do gene da PAH em uma célula. Também são fornecidos sistemas de empacotamento para preparar as composições de vírus adeno- associado. I. Definições
[0085] Como usado nesse documento, o termo “vírus adeno-associado com defeito de replicação” refere-se a um AAV que compreende um genoma sem genes Rep e Cap.
[0086] Como usado nesse documento, o termo “gene da PAH” refere-se ao gene da fenilalanina hidroxilase (PAH), incluindo a(o)s, mas não se limitando às(aos), regiões codificantes, éxons, íntrons, UTR 5’, UTR 3’ e regiões reguladoras da transcrição do Gene da PAH. O gene da PAH humana é identificado por Entrez Gene ID 5053. Uma sequência de nucleotídeos exemplificativa de um mRNA de PAH é fornecida como SEQ ID NO: 24. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um polipeptídeo de PAH é fornecida como SEQ ID NO: 23.
[0087] Como usado nesse documento, o termo “corrigir uma mutação em um gene da PAH” refere-se à inserção, eliminação ou substituição de um ou mais nucleotídeo(s) em um locus alvo em um gene da PAH mutante para criar um gene da PAH que é capaz de expressar um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem. Em certas modalidades, “corrigir uma mutação em um gene da PAH” envolve inserir uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma porção de um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem ou um equivalente funcional do mesmo no gene da PAH mutante, de modo que um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem ou um equivalente funcional do mesmo é expressado a partir do locus do gene da PAH mutante (por exemplo, sob o controle de um promotor do gene da PAH endógeno).
[0088] Como usado nesse documento, o termo “genoma de correção” refere-se a um genoma de AAV recombinante que é capaz de integrar um elemento de edição (por exemplo, um ou mais nucleotídeo(s) ou uma ligação internucleotídica) por meio de recombinação homóloga a um locus alvo para corrigir um defeito genético em um gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo está no gene da PAH humana. O técnico habilitado apreciará que a porção de um genoma de correção que compreende o braço de homologia 5’, elemento de edição e braço de homologia 3’ pode estar na orientação de sentido ou antissentido em relação ao locus alvo (por exemplo, o gene da PAH humana).
[0089] Como usado nesse documento, o termo “elemento de edição” refere-se à porção de um genoma de correção que, quando integrado em um locus alvo, modifica o locus alvo. Um elemento de edição pode mediar a inserção, eliminação ou substituição de um ou mais nucleotídeo(s) no locus alvo.
[0090] Como usado nesse documento, o termo “locus alvo” refere-se a uma região de um cromossomo ou uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma região ou uma ligação internucleotídica do gene da PAH humana) que é modificada por um elemento de edição.
[0091] Como usado nesse documento, o termo “braço de homologia” refere-se a uma porção de um genoma de correção posicionado 5’ ou 3’ de um elemento de edição que é substancialmente idêntico ao genoma que flanqueia um locus alvo. Em certas modalidades, o locus alvo está em um gene da PAH humana, e o braço de homologia compreende uma sequência substancialmente idêntica ao genoma que flanqueia o locus alvo.
[0092] Como usado nesse documento, o termo “proteína do capsídeo Clado F” refere-se a uma proteína do capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de AAV que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências de aminoácidos VP1, VP2 ou VP3 apresentadas, respectivamente, nos aminoácidos 1-736, 138-736 e 203-736 da SEQ ID NO: 1 nesse documento.
[0093] Como usado nesse documento, a identidade entre duas sequências de nucleotídeos ou entre duas sequências de aminoácidos é determinada pelo número de nucleotídeos idênticos ou aminoácidos em alinhamento dividido pelo comprimento total do nucleotídeo mais longo ou da sequência de aminoácidos.
[0094] Como usado nesse documento, o termo “um(a) doença ou distúrbio associado(a) a uma mutação do gene da PAH” refere-se a qualquer doença ou distúrbio causada(o) por, exacerbada(o) por, ou geneticamente ligada(o) à variação de um gene da PAH. Em certas modalidades, a(o) doença ou distúrbio associada(o) a uma mutação do gene da PAH é fenilcetonúria (PKU).
[0095] Como usado nesse documento, o termo “alterado silenciosamente” refere-se à alteração de uma sequência de codificação ou uma sequência de codificação inserida no fragmento central de um gene (por exemplo, por substituição de nucleotídeo) sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela sequência de codificação ou pela sequência de codificação inserida no fragmento central. A alteração do códon pode ser conduzida por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, como descrito em Mauro & Chappell (2014) Trends Mol Med. 20(11):604-13, que é incorporado nesse documento por referência em sua totalidade). Essa alteração silenciosa é vantajosa porque reduz a probabilidade de integração do genoma de correção em loci de outros genes ou pseudogenes parálogos ao gene alvo. Essa alteração silenciosa também reduz a homologia entre o elemento de edição e o gene alvo, reduzindo assim a integração indesejada mediada pelo elemento de edição ao invés de ser por um braço de homologia.
[0096] Como usado nesse documento, o termo “sequência de codificação” refere-se à porção de um DNA complementar (cDNA) que codifica um polipeptídeo, começando no códon de partida e terminando no códon de parada. Um gene pode ter uma ou mais de sequências de codificação devido à emenda alternativa e/ou iniciação da tradução alternativa. Uma sequência de codificação pode ser do tipo selvagem ou silenciosamente alterada. Uma sequência de codificação de PAH do tipo selvagem de exemplo é apresentada na SEQ ID NO:
24.
[0097] Como usado nesse documento, o termo “sequência de codificação inserida no íntron” de um gene se refere a uma sequência de nucleotídeos compreendendo um ou mais de íntrons inseridos em uma sequência de codificação do gene. Em certas modalidades, pelo menos um dos íntrons é um íntron não nativo, isto é, tendo uma sequência diferente de um íntron nativo do gene.
Em certas modalidades, todos os íntrons na sequência de codificação inserida no íntron são íntrons não nativos.
Um íntron não nativo pode ter a sequência de um íntron de uma espécie diferente ou a sequência de um íntron em um gene diferente da mesma espécie.
Alternativamente ou adicionalmente, pelo menos uma porção de uma sequência de íntron não nativa pode ser sintética.
Uma pessoa habilitada apreciará que as sequências de íntron não nativas podem ser projetadas para mediar a emenda de RNA através da introdução de quaisquer motivos de emenda de consenso conhecidos na técnica.
Motivos de emenda de consenso exemplificativos são fornecidos em Sibley et al., (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21, que é incorporado por referência nesse documento em sua totalidade.
A inserção de um íntron não nativo pode promover a eficácia e robustez do empacotamento do vetor, uma vez que as sequências de fragmentos centrais permitem ajustes do vetor para atingir um tamanho ideal (por exemplo, 4,5-4,8 kb). Em certas modalidades, pelo menos um dos íntrons é um íntron nativo do gene.
Em certas modalidades, todos os íntrons na sequência de codificação inserida no íntron são íntrons nativos do gene.
Os íntrons não nativos ou nativos podem ser inseridos em quaisquer ligações internucleotídicas na sequência de codificação.
Em certas modalidades, um ou mais de íntrons não nativos ou nativos é(são) inserido(s) em ligações internucleotídicas previstas para promover emenda eficiente (ver, por exemplo, Zhang (1998) Human Molecular Genetics, 7(5):919-32, que é incorporado nesse documento por referência em sua totalidade). Em certas modalidades, um ou mais de íntrons não nativos ou nativos é(são) inserido(s) em ligações internucleotídicas que ligam dois éxons endógenos.
[0098] Como usado nesse documento, o termo “elemento de salto ribossomal” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de peptídeo curta capaz de causar a geração de duas cadeias de peptídeo a partir da tradução de uma molécula de mRNA. Em certas modalidades, o elemento de salto ribossomal codifica um peptídeo que compreende um motivo de consenso de X1X2EX3NPGP, em que X1 é D ou G, X2 é V ou I, e X3 é qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 75). Em certas modalidades, o elemento de salto ribossomal codifica o peptídeo 2A do vírus thosea-asigna (T2A), peptídeo 2A do teschovírus-1 porcino (P2A), peptídeo 2A do vírus da febre aftosa (F2A), peptídeo 2A do vírus da rinite A equina (E2A), peptídeo 2A do vírus da poliedrose citoplasmática (BmCPV 2A) ou vírus flacherie do peptídeo 2A de B. mori (BmIFV 2A). Sequências de aminoácidos exemplificativas do peptídeo T2A e do peptídeo P2A são apresentadas nas SEQ ID NOs: 76 e 77, respectivamente. Sequências de nucleotídeos exemplificativas do elemento T2A e do elemento P2A são apresentadas nas SEQ ID NOs: 78 e 79, respectivamente. Em certas modalidades, o elemento de salto ribossomal codifica um peptídeo que compreende adicionalmente uma sequência de Gly-Ser-Gly no terminal N, opcionalmente em que a sequência de Gly-Ser-Gly é codificada pela sequência de nucleotídeos de GGCAGCGGA. Embora não desejando estar limitado pela teoria, é hipotetizado que os elementos de salto ribossomal funcionam por: terminação da tradução da primeira cadeia de peptídeo e reinício da tradução da segunda cadeia de peptídeo; ou por clivagem de uma ligação peptídica na sequência de peptídeos codificada pelo elemento de salto ribossomal por uma atividade de protease intrínseca do peptídeo codificado, ou por outra protease no ambiente (por exemplo, citosol).
[0099] Como usado nesse documento, o termo “peptídeo de salto ribossomal” refere-se a um peptídeo codificado por um elemento de salto ribossomal.
[00100] Como usado nesse documento, o termo “sequência de poliadenilação” refere-se a uma sequência de DNA que, quando transcrita em RNA, constitui uma sequência de sinal de poliadenilação. A sequência de poliadenilação pode ser nativa (por exemplo, do gene da PAH) ou exógena. A sequência de poliadenilação exógena pode ser um mamífero ou uma sequência de poliadenilação viral (por exemplo, uma sequência de poliadenilação SV40).
[00101] Na presente divulgação, as posições de nucleotídeos em um gene da PAH são especificadas ao primeiro nucleotídeo do códon de partida. O primeiro nucleotídeo de um códon de iniciação é a posição 1; os nucleotídeos 5’ do primeiro nucleotídeo do códon de iniciação têm números negativos; os nucleotídeos 3’ do primeiro nucleotídeo do códon de partida têm números positivos. Como usado nesse documento, o nucleotídeo 1 do gene da PAH humana é o nucleotídeo 5.473 da Sequência de Referência NCBI: NG_008690.1 e o nucleotídeo -1 do gene da PAH humana é o nucleotídeo 5.472 da Sequência de Referência NCBI: NG_008690.1.
[00102] Na presente divulgação, os éxons e íntrons em um gene da PAH são especificados em relação ao éxon que abrange o primeiro nucleotídeo do códon de partida, que é o nucleotídeo 5473 da Sequência de Referência NCBI: NG_008690.1. O éxon que abrange o primeiro nucleotídeo do códon de partida é o éxon 1. Os éxons 3’ ao éxon 1 são de 5’ a 3’: éxon 2, éxon 3, etc. Os íntrons 3’ ao éxon 1 são de 5’a 3’: íntron 1, íntron 2, etc. Consequentemente, o gene da PAH compreende de 5’ a 3’: éxon 1, íntron 1, éxon 2, íntron 2, éxon 3, etc. Como usado nesse documento, o éxon 1 do gene da PAH humana é de nucleotídeos 5001-5532 da Sequência de Referência NCBI: NG_008690.1 e o íntron 1 do gene da PAH humana é de nucleotídeos 5533-9704 da Sequência de Referência NCBI: NG_008690.1.
[00103] Como usado nesse documento, o termo “integração” refere-se à introdução de um elemento de edição em um locus alvo (por exemplo, de um gene da PAH) por recombinação homóloga entre um genoma de correção e o locus alvo. A integração de um elemento de edição pode resultar na substituição, inserção e/ou eliminação de um ou mais nucleotídeo(s) em um locus alvo (por exemplo, de um gene da PAH).
[00104] Como usado nesse documento, o termo “eficácia de integração do elemento de edição no locus alvo” refere-se à porcentagem de células em uma população transduzida na qual ocorreu a integração do elemento de edição no locus alvo.
[00105] Como usado nesse documento, o termo “frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo” refere-se à porcentagem de alelos em uma população de células transduzidas nas quais ocorreu a integração do elemento de edição no locus alvo.
[00106] Como usado nesse documento, o termo “condições de administração de AAV padrão” refere-se à transdução de hepatócitos humanos implantados em um camundongo após ablação de hepatócitos, em que o AAV é administrado por via intravenosa a uma dose de 1 x 1013 de genomas de vetor por quilograma de peso corporal, como fornecido pelo método do Exemplo 5, seção b.
[00107] Como usado nesse documento, o termo “quantidade eficaz” no contexto da administração de um AAV a um indivíduo refere-se à quantidade de AAV que atinge um efeito profilático ou terapêutico desejado. II. Composições de vírus adeno-associado
[00108] Em um aspecto, são fornecidas aqui novas composições de AAV com defeito de replicação, úteis para restaurar a expressão de PAH em células com função do gene da PAH reduzida ou defeituosa. Essas composições de AAV são altamente eficazes na correção de mutações no gene da PAH ou na restauração da expressão de PAH, e não requerem clivagem do genoma no locus alvo pela ação de uma nuclease exógena (por exemplo, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease tipo ativador transcricional (TALEN), ou uma nuclease guiada por RNA, tal como Cas9) para facilitar essa correção. Por conseguinte, em certas modalidades, a composição de AAV divulgada nesse documento não compreende uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena.
[00109] Em certas modalidades, o AAV divulgado nesse documento compreende: um capsídeo de AAV; e um genoma de correção para editar um locus alvo em um gene da PAH. As proteínas do capsídeo de AAV que podem ser usadas nas composições de AAV divulgadas nesse documento incluem, sem limitação, proteínas do capsídeo de AAV e derivados das mesmas de AAVs Clado A, AAVs Clado B, AAVs Clado C, AAVs Clado D, AAVs Clado E AAVs Clado F. Em certas modalidades,
a proteína do capsídeo de AAV é uma proteína do capsídeo de AAV ou um derivado da mesma de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh10. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV Clado F.
[00110] Qualquer proteína do capsídeo de AAV Clado F ou derivado da mesma pode ser usada(o) nas composições de AAV divulgadas nesse documento. Por exemplo, em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17, em que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo corresponde ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17.
[00111] Por exemplo, em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo em pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17, em que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 da SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo corresponde ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
[00112] Por exemplo, em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo em pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou
17, em que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 da SEQ ID NO: 2 é T; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 68 da SEQ ID NO: 2 é V; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 da SEQ ID NO: 2 é L; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 da SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 da SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 da SEQ ID NO: 2 é T, e aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 da SEQ ID NO: 2 é Q.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 da SEQ ID NO: 2 é I, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é Y.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 da SEQ ID NO: 2 é K.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 da SEQ ID NO: 2 é L, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao amino ácido 468 da SEQ ID NO: 2 é S.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo cor responder ao aminoácido 626 da SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 da SEQ ID NO: 2 é G.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao amino ácido 296 da SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 da SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo corresponde ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 da SEQ ID NO: 2 é M.
Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 da SEQ ID NO: 2 é R. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 da SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido ácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R. Em certas modalidades, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 da SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 da SEQ ID NO: 2 é R e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao amino ácido 706 da SEQ ID NO: 2 é C. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
[00113] Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende duas ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1- 736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende: (a) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 203- 736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17; (b) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou 17.
[00114] Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 8; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 8; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende duas ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 8; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende: (a) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 8; (b) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 138- 736 da SEQ ID NO: 8; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 8.
[00115] Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 11; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 11; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 11; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 11; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende duas ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 11; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 11; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende: (a) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 11; (b) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 138- 736 da SEQ ID NO: 11; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 11.
[00116] Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 13; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 13; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 13; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 13; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende duas ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 13; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 13; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende: (a) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 13; (b) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 138- 736 da SEQ ID NO: 13; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 13.
[00117] Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende duas ou mais de: (a) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16; (b) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV compreende:
(a) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16; (b) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 138- 736 da SEQ ID NO: 16; e (c) uma proteína do capsídeo Clado F tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nos aminoácidos 1-736 da SEQ ID NO: 16.
[00118] Genomas de correção úteis nas composições de AAV divulgadas nesse documento geralmente compreendem: (i) um elemento de edição para editar um locus alvo em um gene da PAH, (ii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ para o locus alvo, e (iii) uma sequência de nucleotídeos de braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ para o locus alvo, em que a porção do genoma de correção que compreende o braço de homologia 5’, o elemento de edição e o braço de homologia 3’ pode estar na orientação de sentido ou anti-sentido ao locus do gene da PAH. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende uma sequência de nucleotídeos de repetição terminal invertida 5’ (ITR 5’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e uma sequência de nucleotídeos de repetição terminal invertida 3’ (ITR 3’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’.
[00119] Elementos de edição usados nos genomas de correção divulgados nesse documento podem mediar a inserção, eliminação ou substituição de um ou mais nucleotídeo(s) no locus alvo.
[00120] Em certas modalidades, quando corretamente integrado por recombinação homóloga no locus alvo, o elemento de edição insere uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma porção de uma sequência de codificação de PAH em um gene da PAH mutante, de modo que um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem ou um equivalente funcional do mesmo é expressado a partir do locus do gene da PAH mutante. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de codificação de PAH completa (por exemplo, uma sequência de codificação de PAH do tipo selvagem ou uma sequência de codificação de PAH silenciosamente alterada). Em certas modalidades, o elemento de edição compreende os nucleotídeos 4 a 1359 de uma sequência de codificação de PAH. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH (por exemplo, compreendendo um íntron inserido em uma sequência de codificação de PAH do tipo selvagem ou silenciosamente alterada).
[00121] Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH codifica um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem (por exemplo, tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23). Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é do tipo selvagem (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 24). Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é silenciosamente alterada para ser menor que 100% (por exemplo, menor que 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, ou 50%) idêntica aos éxons correspondentes do gene da PAH do tipo selvagem. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 25). Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 116).
[00122] Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH codifica um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem (por exemplo, tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23). Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12) íntron inserido em uma sequência de codificação de PAH. O íntron pode compreender uma sequência de íntron nativa do gene da PAH, uma sequência de íntron de uma espécie diferente ou um gene diferente da mesma espécie e/ou uma sequência de íntron sintética. Em certas modalidades, o íntron não nativo não tem mais do que 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1.500 ou
2.000 nucleotídeos de comprimento. Embora não desejando ser limitado pela teoria, é hipotetizado que os íntrons podem aumentar a expressão do transgene, por exemplo, reduzindo o silenciamento da transcrição e intensificando a exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma. Uma pessoa habilitada apreciará que as sequências de íntron sintéticas podem ser projetadas para mediar a emenda de RNA, introduzindo quaisquer motivos de emenda de consenso conhecidos na técnica (por exemplo, em Sibley et al., (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21, que é incorporado por referência nesse documento em sua totalidade). Sequências de íntron exemplificativas são fornecidas em Lu et al. (2013) Molecular Therapy 21(5): 954-63, e Lu et al. (2017) Hum. Gene Ther. 28(1): 125-34, que são incorporados por referência nesse documento em sua totalidade. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um primeiro íntron de um gene de hemoglobina beta em qualquer espécie (por exemplo, humano, camundongo ou coelho). Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um primeiro íntron de um gene de HBB humano (por exemplo, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 28). Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um primeiro íntron de um gene de HBB de camundongo (por exemplo, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 29). Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron de vírus minuto de camundongo (MVM) (por exemplo, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 30).
[00123] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron de MVM quimérico (também referido aqui como ChiMVM), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:
120. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron SV40, por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:
121. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron líder tripartido de adenovírus (também referido nesse documento como AdTPL), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 122. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um mini-íntron de β-globina (também referido nesse documento como MiniBGlobina), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 123. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron quimérico de AdV/Ig (também referido nesse documento como AdVIgG), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 124. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron da cadeia pesada de Ig de β-globina (também referido nesse documento como BglobinIg), que é um íntron quimérico compreendendo uma região doadora de emenda de β-globina e uma região aceitadora de emenda de cadeia pesada de IgG, por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 125. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron de MVM Wu (também aqui referido como Wu de MVM), que é uma variante do íntron de MVM do tipo selvagem, por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 126. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um elemento de HCR1 (também referido nesse documento como OptHCR), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 127. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron de β- globina (também referido nesse documento como Bglobin), por exemplo, compreendendo ou consistindo em um sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 128. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron de Fator IX (também referido nesse documento como íntron de tFIX ou FIX), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:
129. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um íntron ch2BLood (também referido nesse documento como BloodEnh), por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 130. Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH codifica um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem (por exemplo, tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23). Em certas formas de realização, a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende porções de uma sequência de codificação de PAH que, quando emendadas juntas, formam uma sequência de codificação de PAH completa. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é do tipo selvagem (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 24). Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH é silenciosamente alterada para ser menos que 100% (por exemplo, menor que 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% ou 50%) idêntica aos éxons correspondentes do gene da PAH do tipo selvagem. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 25). Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 116. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH inserida no íntron compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:
116. Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 116. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH inserida no íntron compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132, ou 143. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH inserida no íntron compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132 ou 143. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH inserida no íntron consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 80, 81, 82, 131, 132 ou 143.
[00124] O íntron pode ser inserido em qualquer posição na sequência de codificação de PAH. Em certas modalidades, o íntron é inserido em uma posição correspondente a uma ligação internucleotídica que liga dois éxons nativos. Em certas modalidades, o íntron é inserido em uma posição correspondente a uma ligação internucleotídica que liga o éxon 8 e o éxon 9 nativos. Em certas modalidades, a sequência de codificação inserida no íntron PAH compreende de 5’ a 3’:
uma primeira porção de um sequência de codificação de PAH, o íntron, e uma segunda porção de uma sequência de codificação de PAH, em que a primeira porção e a segunda porção, quando emendadas juntas, formam uma sequência de codificação de PAH completa (por exemplo, sequência de codificação de PAH do tipo selvagem ou sequência de codificação de PAH silenciosamente alterada). Em certas modalidades, a primeira porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65 e/ou a segunda porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 66 ou 67. Em certas modalidades, a primeira porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65, e a segunda porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66 ou 67. Em certas modalidades, a primeira porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 65, e a segunda porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 67. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende de 3’ a 5’: uma primeira porção de uma sequência de codificação de PAH consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 64, ou uma variante silenciosamente alterada da mesma (por exemplo, consistindo na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 65); um íntron (por exemplo, consistindo na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 28, 29 ou 30); e uma segunda porção de uma sequência de codificação de PAH consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 66, ou em uma variante silenciosamente alterada da mesma (por exemplo, consistindo na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 66).
[00125] Em certas modalidades, a sequência de codificação de PAH compreende um sítio doador de emenda modificado. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH modificada no sítio doador de emenda compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 138 ou 139. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH modificada no sítio doador de emenda compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 138 ou 139. Em certas modalidades, uma sequência de codificação de PAH modificada no sítio doador de emenda consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 138 ou 139.
[00126] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende adicionalmente um terminador de transcrição 3’ para a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH. Em certas modalidades, o terminador de transcrição compreende uma sequência de poliadenilação (por exemplo, uma sequência de poliadenilação exógena). Em certas modalidades, a sequência de poliadenilação exógena compreende uma sequência de poliadenilação SV40 (por exemplo, compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31-34, ou uma sequência complementar à mesma). Em certas modalidades, a sequência de poliadenilação SV40 compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 31. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: uma sequência de codificação de PAH (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 25) ou uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 80), e uma sequência de poliadenilação SV40 (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 31).
[00127] Em certas modalidades, o elemento de edição pode compreender adicionalmente um cassete de ID 5’ para uma sequência de poliadenilação SV40 (por exemplo, compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 31). O cassete de ID fornece uma sequência que pode ser usada para fins de identificação ao realizar experimentos de sequenciamento de próxima geração. Em certas modalidades, o cassete de ID compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 33. Em certas modalidades, o cassete de ID compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 33. Em certas modalidades, o cassete de ID consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 33. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: uma sequência de codificação de PAH ou sequência de codificação inserida no íntron de PAH, um cassete de ID e uma sequência de poliadenilação SV40.
[00128] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende adicionalmente um elemento de salto ribossomal 5’ para a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH. Em certas modalidades,
o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: um elemento de salto ribossomal; uma sequência de codificação de PAH ou uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH; e opcionalmente um terminador de transcrição (por exemplo, sequência de poliadenilação). Em certas modalidades, os elementos de edição mencionados acima podem ser integrados em um éxon do gene da PAH (por exemplo, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está em um éxon do gene da PAH) por recombinação homóloga para produzir uma sequência recombinante compreendendo de 5’ para 3’: uma porção do gene da PAH 5’ para o locus alvo; o elemento de salto ribossomal; a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH; e o terminador de transcrição (por exemplo, sequência de poliadenilação), em que o elemento de salto ribossomal é posicionado de modo que esteja enquadrado com a porção do gene da PAH 5’ em relação ao locus alvo e a sequência de codificação de PAH completa. A transcrição e a tradução dessa sequência recombinante produz um primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos codificada pela porção do gene da PAH 5’ para o locus alvo fundido com uma porção 5’ do peptídeo de salto ribossômico codificado, e um segundo polipeptídeo compreendendo uma porção 3’ do peptídeo de salto ribossomal codificado fundido com a sequência de aminoácidos completa do polipeptídeo de PAH.
[00129] Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está em um éxon (por exemplo, éxon 1, éxon 2, éxon 3, éxon 4, éxon 5, éxon 6, éxon 7, éxon 8, éxon 9, éxon 10, éxon 11, éxon 12 ou éxon 13) do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma ligação internucleotídica em um éxon (por exemplo, éxon 1, éxon 2, éxon 3, éxon 4, éxon 5, éxon 6, éxon 7, éxon 8, éxon 9, éxon 10, éxon 11, éxon 12 ou éxon 13) do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma sequência no gene da PAH, em que a extremidade 5’ dessa sequência está em um éxon (por exemplo, éxon 1, éxon 2, éxon 3, éxon 4, éxon 5, éxon 6, éxon 7 , éxon 8, éxon 9, éxon 10, éxon 11, éxon 12 ou éxon 13) do gene da PAH ou na região intergênica entre homólogo Achaete-scute 1 (ASCL1) e PAH, e em que a extremidade 3’ dessa sequência pode ser qualquer nucleotídeo no gene da PAH ou na região intergênica entre PAH e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1). Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está no éxon 1, éxon 2 ou éxon 3 do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma ligação internucleotídica no éxon 1, éxon 2 ou éxon 3 do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma sequência no gene da PAH em que a extremidade 5’ dessa sequência está no éxon 1, éxon 2 ou éxon 3 do gene da PAH, em que a extremidade 3’ dessa sequência pode ser qualquer nucleotídeo no gene da PAH ou na região intergênica entre PAH e IGF1.
[00130] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende um aceitador de emenda 5’ para o elemento de salto ribossomal. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: um aceitador de emenda; um elemento de salto ribossomal; uma sequência de codificação de PAH ou uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH; e opcionalmente um terminador de transcrição (por exemplo, sequência de poliadenilação). Em certas modalidades, o elemento de edição mencionado acima pode ser integrado em um íntron do gene da PAH (por exemplo, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está em um íntron do gene da PAH) por recombinação homóloga para produzir uma sequência recombinante compreendendo de 5’ a 3’: uma porção do gene da PAH a 5’ em relação ao locus alvo incluindo o sítio doador de emenda endógeno, mas não o aceitador de emenda endógeno do íntron; o aceitador de emenda; o elemento de salto ribossomal, a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH; e o terminador de transcrição (por exemplo, sequência de poliadenilação), em que o elemento de salto ribossomal é posicionado de modo que esteja enquadrado com a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH, e de modo que a emenda do aceitador de emenda para o doador de emenda endógeno do íntron de PAH coloca-a enquadrada com a porção do gene da PAH 5’ em relação ao locus alvo. A expressão dessa sequência recombinante produz um primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos codificada pela porção do gene da PAH 5’ para o locus alvo fundido a uma porção 5’ do peptídeo de salto ribossômico codificado, e um segundo polipeptídeo compreendendo o aminoácido completo sequência do polipeptídeo de PAH fundido a uma porção 3’ do peptídeo de salto ribossomal codificado.
[00131] Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está em um íntron (por exemplo, íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12) do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma ligação internucleotídica em um íntron (por exemplo, íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11, ou íntron 12) do gene da
PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma sequência no gene da PAH em que a extremidade 5’ dessa sequência está em um íntron (por exemplo, íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12) do gene da PAH, em que a extremidade 3’ dessa sequência pode ser qualquer nucleotídeo no gene da PAH ou na região intergênica entre PAH e IGF1. Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está no íntron 1, íntron 2 ou íntron 3 do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma ligação internucleotídica no íntron 1, íntron 2 ou íntron 3 do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma sequência no gene da PAH em que a extremidade 5’ dessa sequência está no íntron 1, íntron 2 ou íntron 3 do gene da PAH, em que a extremidade 3’ dessa sequência pode ser qualquer nucleotídeo no gene da PAH ou na região intergênica entre PAH e IGF1. Em certas modalidades, o nucleotídeo 5’ para o locus alvo está no íntron 1 do gene da PAH. Em certas modalidades, o locus alvo é uma sequência no gene da PAH em que a extremidade 5’ dessa sequência está no íntron 1 do gene da PAH, em que a extremidade 3’ dessa sequência pode ser qualquer nucleotídeo no gene da PAH ou na região intergênica entre PAH e IGF1.
[00132] Qualquer e todos os elementos de edição divulgados nesse documento podem compreender adicionalmente um sítio de endonuclease de restrição não presente no gene da PAH do tipo selvagem. Esses sítios de endonuclease de restrição permitem a identificação de células que têm integração do elemento de edição no locus alvo com base na análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ou por análise de sequenciamento nucleico do locus alvo e suas regiões flanqueadoras, ou um ácido nucleico amplificado a partir do mesmo.
[00133] Todo e qualquer elemento de edição divulgado nesse documento pode compreender uma ou mais de alterações de nucleotídeos que causam uma ou mais de mutações de aminoácidos no polipeptídeo de PAH quando integrado no locus alvo. Em certas modalidades, o polipeptídeo de PAH mutante é um equivalente funcional do polipeptídeo de PAH do tipo selvagem, isto é, pode funcionar como um polipeptídeo de PAH do tipo selvagem. Em certas modalidades, o polipeptídeo de PAH funcionalmente equivalente compreende adicionalmente pelo menos uma característica não encontrada no polipeptídeo de PAH do tipo selvagem, por exemplo, a capacidade de estabilizar a proteína de PAH (por exemplo, dímero ou tetrâmero) ou a capacidade de resistir à degradação da proteína.
[00134] Em certas modalidades, um elemento de edição, como descrito nesse documento, compreende pelo menos 0, 1, 2, 10, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ou 5000 nucleotídeos. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende ou consiste em 1 a 5000, 1 a 4500, 1 a 4000, 1 a 3000, 1 a 2000, 1 a 1000, 1 a 500, 1 a 200, 1 a 100, 1 a 50, ou 1 a 10 nucleotídeos.
[00135] Em certas modalidades, um elemento de edição, como descrito nesse documento, compreende ou consiste em uma sequência de codificação de PAH ou uma porção da mesma (por exemplo, a sequência de codificação de PAH humana completa, ou nucleotídeos 4 a 1359 da sequência de codificação de PAH humana), uma região 5’ não traduzida (UTR), uma UTR 3’’, um promotor, um doador de emenda, um aceitador de emenda, uma sequência que codifica um RNA não codificante, um isolador, um gene ou uma combinação dos mesmos.
[00136] Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 35, 83 ou 84. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35, 83, ou 84. Em certas modalidades, o elemento de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35, 83 ou 84. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 152 ou 153. Em certas modalidades, o elemento de edição compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 152 ou 153. Em certas modalidades, o elemento de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150, 151, 1 52 ou 153.
[00137] Braços de homologia usados nos genomas de correção divulgados nesse documento podem ser direcionados a qualquer região do gene da PAH ou de um gene próximo ao genoma. A identidade e o posicionamento precisos dos braços de homologia são determinados pela identidade do elemento de edição e/ou locus alvo.
[00138] Braços de homologia empregados nos genomas de correção divulgados nesse documento são substancialmente idênticos ao genoma que flanqueia um locus alvo (por exemplo, um locus alvo em um gene da PAH). Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) de identidade de sequência de nucleotídeos com uma primeira região genômica 5’ em relação ao locus alvo. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem 100% de identidade de sequência de nucleotídeos com a primeira região genômica. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) de identidade da sequência de nucleotídeos para uma segunda região genômica 3’ com o locus alvo. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem 100% de identidade de sequência de nucleotídeos com a segunda região genômica. Em certas modalidades, os cada um dos braços de homologia 5’ e 3’ é pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) idêntica à primeira e à segunda regiões genômicas flanqueando o locus alvo (por exemplo, um locus alvo no gene da PAH), respectivamente. Em certas modalidades, os braços de homologia 5’ e 3’ são 100% idênticos à primeira e segunda regiões genômicas que flanqueiam o locus alvo (por exemplo, um locus alvo no gene da PAH), respectivamente. Em certas modalidades, as diferenças nas sequências de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e/ou do braço de homologia 3’ e as regiões correspondentes do genoma que flanqueia um locus alvo compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, diferenças não codificantes nas sequências de nucleotídeos.
[00139] A pessoa habilitada apreciará que os braços de homologia não precisam ser 100% idênticos à sequência genômica que flanqueia o locus alvo para ser capaz de mediar a integração de um elemento de edição nesse locus alvo por recombinação homóloga.
Por exemplo, os braços de homologia podem compreender uma ou mais de variações genéticas na população humana, e/ou uma ou mais modificação(ões) (por exemplo, substituições, inserções ou eliminações de nucleotídeos) projetada(s) para melhorar o nível de expressão ou especificidade.
As variações genéticas humanas incluem variações herdadas e variações de novo que são privadas para o genoma alvo, e abrangem polimorfismos, inserções, eliminações, rearranjos, inversões, duplicações, micro-repetições de nucleotídeo simples e combinações dos mesmos.
Essas variações são conhecidas na técnica, e podem ser encontradas, por exemplo, nas bases de dados de dnSNP (ver Sherry et al.
Nucleic Acids Res. 2001; 29(1): 308-11), a Base de Dados de Variantes Genômicas (ver Nucleic Acids Res. 2014; 42 (Publicação no banco de dados): D986-92), ClinVar (ver Nucleic Acids Res. 2014; 42 (Publicação no banco de dados): D980 – D985), Banco de dados (ver Nucleic Acids Res. 2016; 44 (Publicação no banco de dados): D67 – D72), ENCODE (genome.ucsc.edu/encode/terms.html), JASPAR (ver Nucleic Acids Res. 2018; 46 (D1): D260 – D266) e PROMO (ver Messeguer et al.
Bioinformática 2002; 18(2):333-334; Farré et al.
Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3651-3653), cada um dos quais é incorporado nesse documento por referência.
A pessoa habilitada apreciará adicionalmente que em situações em que um braço de homologia não é 100% idêntico à sequência genômica que flanqueia o locus alvo, a recombinação homóloga entre o braço de homologia e o genoma pode alterar a sequência genômica que flanqueia o locus alvo de modo que se torne idêntica à sequência do braço de homologia usado.
[00140] Em certas modalidades, a primeira região genômica 5’ para o locus alvo está localizada em uma primeira janela de edição, em que a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, a segunda a região genômica 3’ para o locus alvo está localizada em uma segunda janela de edição, em que a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45. Em certas modalidades, a primeira região genômica 5’ para o locus alvo é localizado em uma primeira janela de edição, em que a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36; e a segunda região genômica 3’ em relação ao locus alvo está localizada em um segundo locus de direcionamento de PAH, em que a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
[00141] Em certas modalidades, a primeira e a segunda janelas de edição são diferentes. Em certas modalidades, a primeira janela de edição está localizada em 5’ da segunda janela de edição. Em certas modalidades, a primeira região genômica consiste em uma sequência mais curta do que a sequência da primeira janela de edição na qual a primeira região genômica está localizada. Em certas modalidades, a primeira região genômica consiste na sequência da primeira janela de edição na qual a primeira região genômica está localizada. Em certas modalidades, a segunda região genômica consiste em uma sequência mais curta do que a sequência da segunda janela de edição na qual a segunda região genômica está localizada. Em certas modalidades, a segunda região genômica consiste na sequência da segunda janela de edição na qual a segunda região genômica está localizada. Em certas modalidades, a primeira região genômica 5’ para o locus alvo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, a segunda região genômica 3’ para o locus alvo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 45. Em certas modalidades, a primeira região genômica 5’ para o locus alvo e a segunda região genômica 3’ para o locus alvo têm as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 36 e 45, respectivamente.
[00142] Em certas modalidades, a primeira e a segunda janelas de edição são iguais. Em certas modalidades, o locus alvo é uma ligação internucleotídica ou uma sequência de nucleotídeos na janela de edição, em que a primeira região genômica consiste em uma primeira porção da janela de edição 5’ para o locus alvo, e a segunda região genômica consiste em uma segunda porção da janela de edição 3’ para o locus alvo. Em certas modalidades, a primeira porção da janela de edição consiste na sequência da extremidade 5’ da janela de edição para o nucleotídeo adjacentemente 5’ ao locus alvo. Em certas modalidades, a segunda porção da janela de edição consiste na sequência do nucleotídeo adjacentemente 3’ ao locus alvo até a extremidade 3’ da janela de edição. Em certas modalidades, a primeira porção da janela de edição consiste na sequência da extremidade 5’ da janela de edição para o nucleotídeo adjacentemente 5’ ao locus alvo, e a segunda porção da janela de edição consiste na sequência do nucleotídeo adjacentemente 3’ ao locus alvo para a extremidade 3’ da janela de edição. Em certas modalidades, a janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36 ou 45. Em certas modalidades, a primeira e a segunda porções das janelas de edição têm comprimentos substancialmente iguais (por exemplo, a razão do comprimento da porção mais curta para o comprimento da porção mais longa é maior do que 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95; 0,96; 0,97; 0,98 ou 0,99).
[00143] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem um comprimento de cerca de 50 a cerca de 4000 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 100 a cerca de 3000, cerca de 200 a cerca de 2000, cerca de 500 a cerca de 1000 nucleotídeos). Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem um comprimento de cerca de 800 nucleotídeos. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem um comprimento de cerca de 100 nucleotídeos. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem um comprimento de cerca de 50 a cerca de 4000 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 100 a cerca de 3000, cerca de 200 a cerca de 2000, cerca de 500 a cerca de 1000 nucleotídeos). Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem um comprimento de cerca de 800 nucleotídeos. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem um comprimento de cerca de 100 nucleotídeos. Em certas modalidades, cada um dos braços de homologia 5’ e 3’ tem, independentemente, um comprimento de cerca de 50 a cerca de 4000 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 100 a cerca de 3000, cerca de 200 a cerca de 2000, cerca de 500 a cerca de 1000 nucleotídeos). Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e 3’ tem um comprimento de cerca de 800 nucleotídeos.
[00144] Em certas modalidades, os braços de homologia 5’ e 3’ têm comprimentos de nucleotídeos substancialmente iguais. Em certas modalidades, os braços de homologia 5’ e
3’ têm comprimentos de nucleotídeos assimétricos. Em certas modalidades, a assimetria no comprimento do nucleotídeo é definida por uma diferença entre os braços de homologia 5’ e 3’ de até 90% no comprimento, tal como até 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de diferença no comprimento.
[00145] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende: C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -433 da PAH gene, C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH, ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo - 339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH e/ou A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH.
[00146] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende: (a) C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH,
G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, e G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH; (b) A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH; (c) A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH; (d) G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH; (e) G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH; (f) C correspondente ao nucleotídeo -433 do gene da PAH e C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH; (g) ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH; e/ou (h) A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH.
[00147] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende: (a) C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, e G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH; (b) A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH; (c) A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH;
(d) A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH; (e) G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH; (f) C correspondente ao nucleotídeo -433 do gene da PAH e C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH; (g) C correspondente ao nucleotídeo -433 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH, e ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH; e/ou (h) A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, e A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH.
[00148] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ tem pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36, opcionalmente compreendendo um ou mais de nucleotídeos nas posições apresentadas acima. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende adicionalmente uma ou mais de variações genéticas na população humana. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou
44.
[00149] Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ tem pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ compreende adicionalmente uma ou mais de variações genéticas na população humana. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
[00150] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ têm cada um pelo menos cerca de 90% (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5%) de identidade de sequência de nucleotídeos com as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 36 e 45, respectivamente, opcionalmente em que o braço de homologia 5’ compreende um ou mais de nucleotídeos nas posições apresentadas acima. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ compreendem as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 36 e 45, 37 e 45, 38 e 45, 39 e 45, 40 e 45, 41 e 45, 42 e 45, 43 e 45 ou, 44 e 45, respectivamente. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ consistem nas sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 36 e 45, 37 e 45,
38 e 45, 39 e 45, 40 e 45, 41 e 45, 42 e 45, 43 e 45 ou, 44 e 45, respectivamente.
[00151] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 69 ou 72. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 69 ou 72. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 70 ou 73. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 70 ou 73. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ compreendem as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 69 e 70, ou 72 e 73, respectivamente. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ consistem nas sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 69 e 70, ou 72 e 73, respectivamente.
[00152] Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 111, 115 ou 142. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 111, 115 ou 142. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 112, 117 ou 144. Em certas modalidades, o braço de homologia 3’ consiste no conjunto de sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 112, 117 ou 144. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ compreendem as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 111 e 112, 115 e 117, ou 142 e 144, respectivamente. Em certas modalidades, o braço de homologia 5’ e o braço de homologia 3’ consistem nas sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 111 e 112, 115 e 117, ou 142 e 144, respectivamente.
[00153] Em certas modalidades, o genoma de correção compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) idêntica à SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136 ou 145. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136 ou
145. Em certas modalidades, a correção o genoma consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 85, 86, 113, 118, 134, 136 ou
145.
[00154] Em certas modalidades, os genomas de correção divulgados nesse documento compreendem adicionalmente uma sequência de nucleotídeos 5’ de repetição terminal invertida 5’ (ITR 5’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’, e uma sequência de nucleotídeos 3’ de repetição terminal invertida 3’ (ITR 3’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’. As sequências de ITR de qualquer serotipo de AAV ou variante das mesmas podem ser usadas nos genomas de correção divulgados nesse documento. A ITR 5’ e 3’ pode ser de um AAV do mesmo serotipo ou de AAVs de diferentes serotipos. ITRs exemplificativas para uso nos genomas de correção divulgados nesse documento são apresentados na SEQ ID NO: 18-21 nesse documento. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ são substancialmente complementares entre si (por exemplo, são complementares entre si, exceto para incompatibilidade nas posições de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos nas posições de ITR 3’ ou 5’).
[00155] Em certas modalidades, a ITR 5’ ou ITR 3’ é de AAV2. Em certas modalidades, a ITR 5’ e a ITR 3’ são de AAV2. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, ou a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende um elemento de edição tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35, uma sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 18, e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO:
19. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, uma sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 18 e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 19.
Em certas modalidades, o genoma de correção consiste em 5’ a 3’ uma sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 18, a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 19.
[00156] Em certas modalidades, a ITR 5’ ou ITR 3’ são de AAV5. Em certas modalidades, a ITR 5’ e a ITR 3’ são de AAV5. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20, ou a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20, e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende um elemento de edição tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35, uma sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 20, e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, uma sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 20, e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o genoma de correção consiste em sequência de nucleotídeos de ITR 5’ em 5’ a 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 20, a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, e uma sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tendo a sequência da SEQ ID NO: 21.
[00157] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ são substancialmente complementares entre si (por exemplo, são complementares entre si, exceto para incompatibilidade em 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de nucleotídeos na ITR 5’ ou 3’).
[00158] Em certas modalidades, a ITR 5’ ou a ITR 3’ é modificada para reduzir ou abolir a resolução pela proteína Rep (“ITR não resolvível”). Em certas modalidades, a ITR não resolvível compreende uma inserção, eliminação ou substituição na sequência de nucleotídeos do sítio de resolução terminal. Essa modificação permite a formação de um genoma de DNA de fita dupla auto-complementar do AAV após o genoma de transferência ser replicado em uma célula infectada. Sequências de ITR exemplificativas não resolvíveis são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, aquelas fornecidas nas Patentes U.S. Nos 7.790.154 e
9.783.824, que são incorporadas nesse documento por referência em sua totalidade). Em certas modalidades, a ITR 5’ compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, a ITR 5’ consiste em uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, a ITR 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, a ITR 3’ compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, a ITR 5’ consiste em uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95 %, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, a ITR 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, a ITR 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 26, e ITR 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, a ITR 5’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 26, e a ITR 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 19.
[00159] Em certas modalidades, a ITR 3’ é flanqueada por uma sequência de nucleotídeos adicional derivada de uma sequência genômica de AAV2 do tipo selvagem. Em certas modalidades, a ITR 3’ é flanqueado por uma sequência adicional de 37 bp derivada de uma sequência de AAV2 do tipo selvagem que é adjacente a uma ITR de AAV2 do tipo selvagem. Ver, por exemplo, Savy et al., Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5): 277-289 (que é incorporado por referência nesse documento em sua totalidade). Em certas modalidades, a sequência adicional de 37 bp é interna à ITR 3’. Em certas modalidades, a sequência de 37 bp consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 140. Em certas modalidades, a ITR 3’ compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 141. Em certas modalidades, a ITR 3’ compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 141. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos da ITR 3’ consiste em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 141. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos da ITR 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 141.
[00160] Em certas modalidades, o genoma de correção divulgado nesse documento tem um comprimento de cerca de 0,5 a cerca de 8 kb (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 2 a cerca de 5, cerca de 3 a cerca de 5, cerca de 4 a cerca de 5, cerca de 4,5 a cerca de 4,8 ou cerca de 4,7 kb).
[00161] Em certas modalidades, o genoma de correção compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5%) idêntica à SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137 ou 146. Em certas modalidades, o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137 ou
146. Em certas modalidades, o genoma de correção consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 87, 88, 114, 119, 135, 137 ou
146.
[00162] Em certas modalidades, o AAV com defeito de replicação compreende: (a) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’ (por exemplo, a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ de SEQ ID NOs: 115), um aceitador de emenda
(por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 de SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ de SEQ ID NOs: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ de SEQ ID NOs: 19); (b) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’ (por exemplo, g., a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ de SEQ ID NOs: 115), um aceitador de emenda (por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 de SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ de SEQ ID NOs: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ de SEQ ID NOs: 19); e/ou (c) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’ (por exemplo, a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ de SEQ ID NOs: 115),
um aceitador de emenda (por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 de SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ de SEQ ID NOs: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ de SEQ ID NOs: 19).
[00163] Em certas modalidades, o AAV com defeito de replicação compreende: (a) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146; (b) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146; e/ou (c) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146.
[00164] As composições de AAV divulgadas nesse documento são particularmente vantajosas pelo fato de serem capazes de corrigir um gene da PAH em uma célula com alta eficácia in vivo e in vitro. Em certas modalidades, a eficácia de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 1% (por exemplo, pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%) quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão. Em certas modalidades, a frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 0,5% (por exemplo, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%) quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão.
[00165] Quaisquer métodos para determinar a eficácia da edição do gene da PAH podem ser empregados. Em certas modalidades, as células individuais são separadas da população de células transduzidas e submetidas a PCR de célula única usando iniciadores de PCR que podem identificar a presença de um elemento de edição integrado corretamente no locus alvo do gene da PAH. Esse método pode compreender adicionalmente PCR de célula única das mesmas células usando iniciadores de PCR que amplificam seletivamente um locus alvo não modificado. Dessa forma, o genótipo das células pode ser determinado. Por exemplo, se a PCR de célula única mostrou que uma célula tem um locus alvo editado e um locus alvo não modificado, então a célula seria considerada heterozigótica para o gene da PAH editado.
[00166] Adicionalmente ou alternativamente, em certas modalidades, PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR), PCR quantitativa (qPCR) ou PCR digital por gotículas (ddPCR) pode ser realizada em DNA extraído da população de células transduzidas usando iniciadores e sondas que detectam apenas alelos de PAH editados. Esses métodos podem compreender adicionalmente um qPCR ou ddPCR adicional (na mesma reação ou em uma reação separada) para determinar o número de genomas totais na amostra e o número de alelos de PAH não editados. Esses números podem ser usados para determinar a frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo.
[00167] Adicionalmente ou alternativamente, em certas modalidades, o locus de PAH pode ser amplificado do DNA extraído da população de células transduzidas por PCR usando iniciadores que se ligam a regiões do gene da PAH que flanqueiam o locus alvo, ou por LAM-PCR usando um iniciador que se liga a uma região dentro do genoma de correção (por exemplo, uma região que compreende uma sequência exógena não nativa ao locus). Os amplicons de PCR resultantes podem ser sequenciados individualmente usando técnicas de sequenciamento de última geração (NGS) de molécula única para determinar o número relativo de alelos de PAH editados e não editados presentes na população de células transduzidas. Esses números podem ser usados para determinar a frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo.
[00168] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece composições farmacêuticas compreendendo um AAV como divulgado nesse documento, juntamente com um excipiente, adjuvante, diluente, veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável ou uma combinação dos mesmos. Um “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo de uma composição, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e sem causar reações fisiológicas perturbadoras, tal como uma reação imunológica não intencional. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solução salina tamponada com fosfato, emulsões, tais como, emulsão de óleo/água e agentes umectantes. As composições compreendendo esses carreadores são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos, tais como aqueles apresentados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, current Ed., Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, EUA; A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20a edição, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al, 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; e Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al, 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. III. Método de Uso
[00169] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece métodos para corrigir uma mutação no gene da PAH ou expressar um polipeptídeo de PAH em uma célula. Os métodos geralmente compreendem a transdução da célula com um AAV com defeito de replicação, como divulgado nesse documento. Esses métodos são altamente eficazes na correção de mutações no gene da PAH ou na restauração da expressão de PAH, e não requerem clivagem do genoma no locus alvo pela ação de uma nuclease exógena (por exemplo, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco, um ativador transcricional semelhante à nuclease
(TALEN), ou uma nuclease guiada por RNA, tal como Cas9) para facilitar essa correção. Por conseguinte, em certas modalidades, os métodos divulgados nesse documento envolvem transduzir a célula com um AAV com defeito de replicação, como divulgado nesse documento, sem cotransduzir ou coadministrar uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena.
[00170] Os métodos divulgados nesse documento podem ser aplicados a qualquer célula portadora de uma mutação no gene da PAH. A pessoa habilitada apreciará que as células que expressam ativamente PAH são de particular interesse. Por conseguinte, em certas modalidades, o método é aplicado a células no(a) fígado, rim, cérebro, glândula pituitária, glândula adrenal, pâncreas, bexiga urinária, vesícula biliar, cólon, intestino delgado ou mama. Em certas modalidades, o método é aplicado a hepatócitos e/ou células renais.
[00171] Os métodos divulgados nesse documento podem ser realizados in vitro para fins de pesquisa ou podem ser realizados ex vivo ou in vivo para fins terapêuticos.
[00172] Em certas modalidades, a célula a ser transduzida está em um indivíduo mamífero e o AAV é administrado ao indivíduo em uma quantidade eficaz para transduzir a célula no indivíduo. Consequentemente, em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para o tratamento de um indivíduo tendo um(a) doença ou distúrbio associado(a) a uma mutação do gene da PAH, o método geralmente compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um AAV com defeito de replicação, como divulgado nesse documento. O indivíduo pode ser um indivíduo humano ou um indivíduo roedor (por exemplo, um camundongo) contendo células de fígado humano. Indivíduos de camundongo adequados incluem, sem limitação, camundongos nos quais células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos humanos) foram enxertadas. Qualquer doença ou distúrbio associada(o) a uma mutação do gene da PAH pode ser tratada usando os métodos divulgados nesse documento. Doenças ou distúrbios adequados incluem, sem limitação, fenilcetonúria. Em certas modalidades, a célula é transduzida sem codeduzir ou coadministrar uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena.
[00173] Os métodos divulgados nesse documento são particularmente vantajosos pelo fato de serem capazes de corrigir um gene da PAH em uma célula com alta eficácia in vivo e in vitro. Em certas modalidades, a eficácia de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 1% (por exemplo, pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%) quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão. Em certas modalidades, a frequência alélica de integração do elemento de edição no locus alvo é de pelo menos 0,5% (por exemplo, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90% ou 95%) quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições de administração de AAV padrão.
[00174] Em certas modalidades, a transdução de uma célula com uma composição de AAV divulgada nesse documento pode ser realizada como fornecido nesse documento ou por qualquer método de transdução conhecido por um habilitado comum na técnica. Em certas modalidades, a célula pode ser contactada com o AAV em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50.000; 100.000; 150.000; 200.000; 250.000; 300.000;
350.000; 400.000; 450.000; ou 500.000, ou em qualquer MOI que forneça a transdução ideal da célula.
[00175] Em certas modalidades, os métodos precedentes empregam um AAV com defeito de replicação compreendendo: (a) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’ (por exemplo, a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ de SEQ ID NOs: 115), um aceitador de emenda (por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 de SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ de SEQ ID NOs: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ de SEQ ID NOs: 19); (b) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’
(por exemplo, a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ de SEQ ID NOs: 115), um aceitador de emenda (por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 de SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ de SEQ ID NOs: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ das SEQ ID NOs: 19); e/ou (c) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e um genoma de transferência compreendendo os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’ (por exemplo, a ITR 5’ de SEQ ID NOs: 18), um braço de homologia 5’ (por exemplo, o braço de homologia 5’ da SEQ ID NO: 115), um aceitador de emenda (por exemplo, o aceitador de emenda de SEQ ID NOs: 14), um elemento 2A (por exemplo, o elemento 2A de SEQ ID NOs: 74), uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (por exemplo, a sequência de codificação de PAH de SEQ ID NOs: 116), uma sequência de poliadenilação SV40, por exemplo, a sequência de poliadenilação SV40 da SEQ ID NOs: 31), um braço de homologia 3’ (por exemplo, o braço de homologia 3’ da SEQ ID NO: 117, e um elemento de ITR 3’ (por exemplo, a ITR 3’ da SEQ ID NO: 19).
[00176] Em certas modalidades, os métodos precedentes empregam um AAV com defeito de replicação compreendendo: (a) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo o nucleotídeo sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146; (b) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146; e/ou (c) uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e um genoma de correção compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 46-63, 113, 114, 116, 118, 119, 134-137, 145 e 146.
[00177] Uma composição de AAV divulgada neste documento pode ser administrada a um indivíduo por qualquer via apropriada incluindo, sem limitação, via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, tópica ou intradérmica. Em certas modalidades, a composição é formulada para administração por meio de injeção intravenosa ou injeção subcutânea. IV. Sistemas de empacotamento de AAV
[00178] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece sistemas de empacotamento para a preparação recombinante de um AAV com defeito de replicação divulgado nesse documento. Esses sistemas de empacotamento geralmente compreendem: uma sequência de nucleotídeos Rep que codifica uma ou mais de proteínas Rep de AAV; uma sequência de nucleotídeos Cap que codifica uma ou mais de proteínas do capsídeo de AAV Clado F como divulgado nesse documento; e um genoma de correção para correção do gene da PAH ou um genoma de transferência para expressão do gene da PAH como divulgado nesse documento, em que o sistema de empacotamento é operativo em uma célula para encerrar o genoma de correção no capsídeo para formar o AAV.
[00179] Em certas modalidades, o sistema de empacotamento compreende um primeiro vetor que compreende a sequência de nucleotídeos Rep e a sequência de nucleotídeos Cap, e um segundo vetor que compreende o genoma de correção ou genoma de transferência. Como usado no contexto de um sistema de empacotamento como descrito nesse documento, um “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico que é um veículo para a introdução de ácidos nucleicos em uma célula (por exemplo, um plasmídeo, um vírus, um cosmídeo, um cromossomo artificial, etc.).
[00180] Qualquer proteína Rep de AAV pode ser empregada nos sistemas de empacotamento divulgados nesse documento. Em certas modalidades do sistema de empacotamento, a sequência de nucleotídeos Rep codifica uma proteína Rep de AAV2. As proteínas Rep de AAV2 adequadas incluem, sem limitação, Rep 78/68 ou Rep 68/52. Em certas modalidades do sistema de empacotamento, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Rep de AAV2 compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína tendo uma porcentagem mínima de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos Rep de AAV2 da SEQ ID NO: 22, em que a porcentagem mínima de identidade de sequência é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) ao longo do comprimento da sequência de aminoácidos da proteína Rep de AAV2. Em certas modalidades do sistema de empacotamento, a proteína Rep de AAV2 tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22.
[00181] Em certas modalidades do sistema de empacotamento, o sistema de empacotamento compreende adicionalmente um terceiro vetor, por exemplo, um vetor de vírus auxiliar. O terceiro vetor pode ser um terceiro vetor independente, integral com o primeiro vetor ou integral com o segundo vetor. Em certas modalidades, o terceiro vetor compreende genes que codificam proteínas de vírus auxiliar.
[00182] Em certas modalidades do sistema de empacotamento, o vírus auxiliar é selecionado do grupo que consiste em adenovírus, vírus do herpes (incluindo vírus do herpes simplex (HSV)), poxvírus (tal como vírus vaccinia), citomegalovírus (CMV) e baculovírus. Em certas modalidades do sistema de empacotamento, onde o vírus auxiliar é adenovírus, o genoma do adenovírus compreende um ou mais de genes de RNA de adenovírus selecionados do grupo que consiste em El, E2, E4 e VA. Em certas modalidades do sistema de empacotamento, onde o vírus auxiliar é HSV, o genoma do HSV compreende um ou mais de genes de HSV selecionados do grupo que consiste em UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 e UL30/UL42.
[00183] Em certas modalidades do sistema de empacotamento, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor está(ão) contido(s) em um ou mais de plasmídeos de transfecção. Em certas modalidades, o primeiro vetor e o terceiro vetor estão contidos em um primeiro plasmídeo de transfecção. Em certas modalidades, o segundo vetor e o terceiro vetor estão contidos em um segundo plasmídeo de transfecção.
[00184] Em certas modalidades do sistema de empacotamento, o primeiro, segundo e/ou terceiro vetor está(ão) contido(s) em um ou mais de vírus auxiliares recombinantes. Em certas modalidades, o primeiro vetor e o terceiro vetor estão contidos em um vírus auxiliar recombinante. Em certas modalidades, o segundo vetor e o terceiro vetor estão contidos em um vírus auxiliar recombinante.
[00185] Em um aspecto adicional, a divulgação fornece um método para a preparação recombinante de um AAV como descrito nesse documento, em que o método compreende a transfecção ou transdução de uma célula com um sistema de empacotamento como descrito sob condições operativas para encerrar o genoma de correção no capsídeo para formar o AAV como descrito nesse documento. Métodos exemplificativos para a preparação recombinante de um AAV incluem transfecção transitória (por exemplo, com um ou mais de plasmídeos de transfecção contendo um primeiro e um segundo e opcionalmente um terceiro vetor como descrito nesse documento), infecção viral (por exemplo, com um ou mais de vírus auxiliares recombinantes, tal como um adenovírus, poxvírus (tal como vírus vaccinia), vírus do herpes (incluindo HSV, citomegalovírus ou baculovírus, contendo um primeiro e um segundo e opcionalmente um terceiro vetores como descrito nesse documento) e transfecção ou infecção de linha celular produtora estável (por exemplo, com uma célula produtora estável, tal como uma célula de mamífero ou inseto, contendo uma sequência de nucleotídeos Rep que codifica uma ou mais de proteínas Rep de AAV e/ou uma sequência de nucleotídeos Cap que codifica uma ou mais de proteínas de capsídeo de AAV Clado F como descrito nesse documento, e com um genoma de correção, como descrito nesse documento, sendo dispensado na forma de um plasmídeo de transfecção ou um vírus auxiliar recombinante). V. Exemplos
[00186] Os vetores de AAV recombinantes divulgados nesse documento medeiam a edição de genes altamente eficiente in vitro e in vivo. Os exemplos a seguir fornecem vetores de correção que podem ser empacotados com um capsídeo de AAV Clado F (por exemplo, AAVHSC7, AAVHSC15 ou AAVHSC17, como divulgado na Patente US No. 9.623.120, que é incorporada nesse documento por referência em sua totalidade), e demonstra a restauração eficiente da expressão do gene da PAH que sofre mutação em certas doenças humanas, tal como a fenilcetonúria. Esses exemplos são oferecidos a título de ilustração, e não como forma de limitação. Exemplo 1: Vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hAC-008 a) Vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hAC-008
[00187] O vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hAC-008, como mostrado na Figura 1A, compreende seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE TI”), um braço de homologia 3’, e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 1. O braço de homologia 5’ compreende uma sequência genômica do tipo selvagem 800 nucleotídeos a montante do códon de partida de PAH humana e, portanto, tem a capacidade de corrigir mutações no(a) códon de partida e/ou região não traduzida 5’ (UTR) que afeta a expressão de PAH, como observado em alguns pacientes com PKU. O braço de homologia 3’ compreende a sequência genômica do tipo selvagem 800 nucleotídeos a jusante do códon de partida. A integração do vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hAC-008 ao genoma humano insere a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, a sequência de poliadenilação SV40 e o cassete de restrição de integração direcionado ao locus alvo do códon inicial de PAH (isto é, substituindo os nucleotídeos 1 -3 do gene da PAH), restaurando assim a expressão de uma proteína de PAH do tipo selvagem que foi prejudicada por mutações em UTR 5’, sequência de codificação ou UTR 3’ do gene da PAH. Tabela 1: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hAC-008 Elemento Genético SEQ ID NO Elemento de ITR 5’ 18 Braço de homologia 5’ 69 Sequência de codificação de PAH humana silenciosamente 25 alterada Sequência de poliadenilação SV40 31 Cassete de restrição de integração direcionado 71 Braço de homolgia 3’ 70 Elemento de ITR 3’ 19 Elemento de edição 83 Genoma de correção do braço de homologia 5’ para o braço 85 de homolgia 3’ Genoma de correção da ITR 5’ para a ITR 3’ 87 b) Vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-h1C-007
[00188] O vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-h1C-007, como mostrado na Figura 1B, compreende seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, um aceitador de emenda, um elemento 2A, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE TI”), um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 2. O braço de homologia 5’ compreende a sequência genômica do tipo selvagem de 800 nucleotídeos a montante do nucleotídeo 2128 de PAH humana, que está localizado no íntron 1. O braço de homologia 3’ compreende a sequência genômica do tipo selvagem de 800 nucleotídeos a jusante do nucleotídeo 2127 de PAH humana.
A integração do vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-h1C-007 no genoma humano permite a transcrição do locus de PAH em um pré-mRNA compreendendo os seguintes elementos 5’ a 3’: éxon 1 de PAH endógeno, parte do íntron 1 de seu doador de emenda 5’ para o nucleotídeo 2127, o aceitador de emenda no vetor pHMI-hPAH-h1C-007, o elemento 2A, a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, e a sequência de poliadenilação SV40. A emenda desse pré-mRNA gera um mRNA compreendendo os seguintes elementos 5’ a 3’: éxon 1 de PAH endógeno, o elemento 2A (enquadrado com o éxon 1 de PAH), a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (enquadrada com o elemento 2A) e a sequência de poliadenilação SV40. O elemento 2A leva à geração de dois polipeptídeos: um peptídeo de PAH truncado terminado no final do éxon 1 fundido com uma parte N-terminal do peptídeo 2A, e uma prolina do peptídeo 2A fundida com um polipeptídeo de PAH de comprimento completo.
Portanto, a integração do vetor pHMI-hPAH-h1C-007 pode restaurar a expressão da proteína de PAH do tipo selvagem que foi prejudicada por mutações na sequência de codificação ou UTR 3’ do gene da PAH.
Tabela 2: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-h1C-007 Elemento Genético SEQ ID NO Elemento de ITR 5’ 18 Braço de homologia 5’ 72 Aceitador de emenda 14 Elemento 2A 74 Sequência de codificação de PAH humana silenciosamente 25 alterada Sequência de poliadenilação SV40 31 Cassete de restrição de integração direcionado 71 Braço de homolgia 3’ 73 Elemento de ITR 3’ 19 Elemento de edição 84 Genoma de correção do braço de homologia 5’ para o braço 86 de homolgia 3’ Genoma de correção da ITR 5’ para a ITR 3’ 88
[00189] A alteração silenciosa adotada nos dois vetores acima melhorou significativamente a expressão da proteína de PAH, como demonstrado pela comparação dos vetores de expressão pCOH-WT-PAH, pCOH-CO-PAH e pHMI-CO-PAH. O vetor pCOH-WT-PAH compreende um promotor CBA operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de PAH do tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 24. cada um dos vetores pCOH-CO- PAH e pHMI-CO-PAH compreende um promotor CBA operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, como apresentado na SEQ ID NO: 25. Os vetores pCOH-CO-PAH e pHMI-CO-PAH eram altamente semelhantes. Cada vetor foi transfectado em células HEK 293 que são naturalmente deficientes em PAH.
Como mostrado na Figura 2, VG-GT-CO-PAH (“CO-hPAH”) deu origem a um nível de expressão de PAH humana notavelmente maior do que VG-GT-PAH (“WT-hPAH”). Exemplo 2: Vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 e seus variantes
[00190] A fim de identificar sequências de braço de homologia que facilitam a edição de genes eficaz, 130 vetores de correção foram projetados, e 70 deles foram testados em células de carcinoma hepatocelular humano. O vetor pHMIA- hPAH-hI1C-032.1 apresentou a maior eficácia de edição in vitro. Esse exemplo fornece a estrutura desse vetor e suas variantes. a) Vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-032.1
[00191] O vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-
032.1, como mostrado na Figura 1C, compreende os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, um aceitador de emenda, um elemento P2A, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 3. O braço de homologia 5’ compreende a sequência genômica do tipo selvagem dos nucleotídeos -686 a 274 de PAH humana, cuja extremidade 3’ está localizada no íntron 1. O braço de homologia 3’ compreende a sequência genômica do tipo selvagem dos nucleotídeos 415 a 1325 de PAH humana. A integração do vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 no genoma humano permite a transcrição do locus de PAH em um pré-mRNA compreendendo os seguintes elementos 5’ a 3’: éxon 1 de PAH endógeno, parte do íntron 1 de seu doador de emenda 5’ para o nucleotídeo 274, o aceitador de emenda no vetor pHMIA- hPAH-hI1C-032.1, o elemento P2A, a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, e a sequência de poliadenilação SV40. A emenda desse pré-mRNA gera um mRNA compreendendo os seguintes elementos 5’ a 3’: éxon 1 de PAH endógeno, o elemento P2A (enquadrado com o éxon 1 de PAH), a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada (enquadrada com o Elemento P2A) e a sequência de poliadenilação SV40. O elemento P2A leva à geração de dois polipeptídeos: um peptídeo de PAH truncado terminado no final do éxon 1 fundido com uma parte N-terminal do peptídeo P2A e uma prolina do peptídeo P2A fundido com um polipeptídeo de PAH de comprimento completo.
Portanto, a integração do vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 pode restaurar a expressão da proteína de PAH do tipo selvagem que foi prejudicada por mutações na sequência de codificação ou UTR 3’ do gene da PAH.
Tabela 3: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 Elemento Genético SEQ ID NO
Elemento de ITR 5’ 18
Braço de homologia 5’ 36
Aceitador de emenda 14
Elemento P2A 79
Sequência de codificação de PAH humana silenciosamente 25 alterada
Sequência de poliadenilação SV40 31
Braço de homolgia 3’ 45
Elemento de ITR 3’ 19
Elemento de edição 35
Genoma de correção do braço de homologia 5’ para o braço 46
Elemento Genético SEQ ID NO de homolgia 3’ Genoma de correção da ITR 5’ para a ITR 3’ 55 b) Variantes do vetor de correção de PAH pHMIA-hPAH-hI1C-
032.1
[00192] Oito variantes do vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 foram projetadas para melhorar a expressão do locus do gene da PAH. Essas variantes, denominadas pHMIA-hPAH-hI1C-032.2 a pHMIA-hPAH-hI1C-032.9, diferem de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 apenas no braço de homologia 5’. As sequências dos diferentes elementos são apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Variantes do vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.1
SEQ ID NO Braço de Genoma de Genoma de Nome do vetor homologia 5’ correção do HA correção da (HA) 5’ para o HA 3’ ITR 5’ para a ITR 3’ pHMIA-hPAH-hI1C-032.2 37 47 56 pHMIA-hPAH-hI1C-032.3 38 48 57 pHMIA-hPAH-hI1C-032.4 39 49 58 pHMIA-hPAH-hI1C-032.5 40 50 59 pHMIA-hPAH-hI1C-032.6 41 51 60 pHMIA-hPAH-hI1C-032.7 42 52 61 pHMIA-hPAH-hI1C-032.8 43 53 62 pHMIA-hPAH-hI1C-032.9 44 54 63
[00193] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.2 foi projetado para otimizar a sequência Kozak para recrutamento melhorado de ribossomo para o transcrito. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-
032.1 por ter os nucleotídeos C, G, G, G e G nas posições - 2, 4, 6, 7 e 9, respectivamente, do gene da PAH.
[00194] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.3 foi projetado para remover um único quádruplo em UTR 5’ do gene da PAH que pode suprimir a expressão. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter os nucleotídeos A e A nas posições -467 e -465, respectivamente, do gene da PAH.
[00195] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.4 foi projetado para otimizar um elemento de resposta de AMP cíclico para aumentar a expressão. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter o nucleotídeo A na posição -181 do gene da PAH.
[00196] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.5 foi projetado para otimizar dois elementos de resposta de AMP cíclico para aumentar a expressão. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter os nucleotídeos G, C, A e A nas posições -214, -212, -211 e -181, respectivamente, do gene da PAH.
[00197] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.6 foi projetado para incorporar o alelo menor do SNP rs1522295, que se correlaciona com a expressão alterada de PAH em humanos. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter o nucleotídeo G na posição 194 do gene da PAH.
[00198] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.7 foi projetado para otimizar um sítio de ligação de glicocorticóide na UTR 5’ para aumentar a expressão. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-
032.1 por ter os nucleotídeos C e C nas posições -433 e - 432, respectivamente, do gene da PAH.
[00199] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.8 foi projetado para modificar dois sítios de ligação de glucocorticóides e um único sítio de ligação de AP2 para expressão melhorada. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter os nucleotídeos C e C nas posições -433 e -432, respectivamente, do gene da PAH, e ter a sequência de nucleotídeos ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID
NO: 68) nas posições -394 a -388 do gene da PAH.
[00200] O vetor pHMIA-hPAH-hI1C-032.9 foi projetado para romper três quadruplexes G na UTR 5’ que podem suprimir a expressão. Ele difere de pHMIA-hPAH-hI1C-032.1 por ter o nucleotídeo A em cada uma das posições de nucleotídeo -467, -465, -341, -339, -225, -211 e -203 do gene da PAH. Exemplo 3: edição do gene da PAH humana in vitro
[00201] Esse exemplo fornece um método in vitro para examinar vetores de correção de PAH, tais como aqueles descritos nos exemplos anteriores.
[00202] Vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-hA-002, uma variante de pHMI-hPAH-hAC-008 em que a sequência de codificação de PAH é do tipo selvagem (isto é, não alterada silenciosamente), e vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-h1 - 001, uma variante de pHMI-hPAH-h1C-007 em que a sequência de codificação de PAH é do tipo selvagem (isto é, não alterada silenciosamente), foi examinada para avaliação da integração direcionada. As células K562 foram transduzidas com o vetor pHMI-hPAH-hA-002 empacotado em AAVHSC17 a um MOI de 150.000. O DNA genômico das células foi coletado após 48 horas. Iniciadores biotinilados únicos com as sequências ccaaatcccaccagctcact (SEQ ID NO: 89) e tcccatgaaactgaggtgtga (SEQ ID NO: 90), cada um localizado fora dos braços de homologia, foram usados separadamente para amplificar as amostras de DNA por amplificação linear. Ambos os alelos editados e não editados foram amplificados sem pretensão. As amostras de DNA amplificadas foram agrupadas e enriquecidas por precipitação de estreptavidina. O número de alelos com integração de pHMI-hPAH-hA-002 foi medido por ddPCR usando o conjunto de iniciador/sonda Conjunto 1 PAH_Genômico.
[00203] Como mostrado na Figura 3A, painel esquerdo (“Enriquecido com LAM”), a integração desejada foi detectada em uma amostra de células transduzidas com o vetor pHMI- hPAH-hA-002 (“R1ATG”), mas não detectado em amostras de células transduzidas com o vetor pHMI-hPAH-h1-001 (“Íntron R1”) ou células não transduzidas (“R1 WT”). No painel direito da Figura 3A (“Amplicon”), a quantidade de integração do vetor foi medida por ddPCR usando o conjunto de iniciador/sonda Conjunto 1 SV40_FAM. Os sinais positivos foram detectados em amostras de ambas as células transduzidas com o vetor pHMI-hPAH-hA-002 (“Frag T001”) e as células transduzidas com o vetor pHMI-hPAH-h1-001 (“Frag T002”), indicando que ambas as células foram submetidas à integração vetorial.
[00204] Para quantificar a integração direcionada, três conjuntos de iniciadores e sondas, como mostrado na Tabela 6, foram projetados para detecção da integração por ddPCR. Conjunto 1 PAH_Genômico detectou o genoma não editado e o genoma editado após a integração direcionada de pHMI-hPAH- hA-002. O Conjunto 1 SV40_FAM detectou uma sequência na sequência de poliadenilação SV40, que estava presente no genoma editado e nos vetores não integrados. O Conjunto 1 PAH_HA detectou uma região no braço de homologia, que estava presente em genomas editados e não editados, bem como nos vetores não integrados.
[00205] Amostras de DNA foram particionadas em gotículas de óleo. A concentração de DNA foi otimizada para uma concentração de 600 pg por 20 µL, a fim de reduzir significativamente a probabilidade de que uma gota de óleo contenha aleatoriamente duas moléculas de DNA (por exemplo,
uma partícula de vetor e uma partícula de DNA genômico) (p<0,001). A quantidade de DNA identificada por Conjunto 1 PAH_Genômico (Quantidade_genoma) representou a quantidade total de genomas não editados e editados.
A quantidade de DNA identificada por Conjunto 1 SV40_FAM (Quantidade_carga útil) representou a quantidade total de genomas editados e vetores não integrados.
A quantidade de DNA identificada por Conjunto 1 PAH_HA (Quantidade_HA) representou a quantidade total de genomas não editados, genomas editados e vetores não integrados.
Assim, a quantidade do genoma editado pode ser calculada pela seguinte fórmula: Quantidade_genoma + Quantidade_carga útil – Quantidade_HA.
A fração do genoma tendo a integração correta pode ser calculada como a quantidade de genoma editado dividido por Quantidade_genoma.
Tabela 5: Iniciadores e sondas para quantificar a integração de PAH humana ao genoma humano Iniciador ou Sonda Sequência SEQ ID NO
Conjunto 1 PAH_Genômico, GCTCCATCCTGCACATAGTT 91 iniciador F
Conjunto 1 PAH_Genômico, CCTATGCTTTCCTGATGAGATCC 92 iniciador R
Conjunto 1 PAH_Genômico, TTGGTGCTGCTGGCAATACGGTC 93 sonda
Conjunto 1 SV40_FAM, GCAATAGCATCACAAATTTCAC 94 iniciador F
Conjunto 1 SV40_FAM, GATCCAGACATGATAAGATACATTG 95 iniciador R
Conjunto 1 SV40_FAM, TCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCA 96 sonda
Iniciador ou Sonda Sequência SEQ ID NO Conjunto 1 PAH_HA, TCCAGTCACCAGACAGTTAGT 97 iniciador F Conjunto 1 PAH_HA, GGAGAGAAATGGAGCAAGTGAA 98 iniciador R Conjunto 1 PAH_HA, sonda ACAGCCTATATTTCACCATGCTGATCCC 99
[00206] Como mostrado na Figura 3B, a porcentagem do genoma com a integração correta do vetor pHMI-hPAH-hA-002, como medido pelos conjuntos de iniciador/sonda acima, foi de 17,86%. Nenhuma integração foi detectada nas células de controle que não foram transduzidas com o vetor pHMI-hPAH- hA-002. Exemplo 4: edição do gene da PAH in vivo no fígado de camundongo
[00207] Esse exemplo fornece modelos animais para examinar os vetores de correção de PAH que são capazes de editar o gene da PAH de camundongo e determinar sua eficácia de edição no fígado de camundongo. a) Edição do gene da PAH de camundongo em camundongos do tipo selvagem
[00208] Em um exemplo específico, é fornecido aqui a edição in vivo do genoma do camundongo usando o vetor pHMI- hPAH-mAC-006. O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 era semelhante ao vetor pHMI-hPAH-hAC-008, mas era capaz de editar o gene da PAH de camundongo em vez do gene da PAH humana (Figura 4A). Especificamente, pHMI-hPAH-mAC-006 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE
TI”), um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 6. O braço de homologia 5’ compreendia a sequência genômica do tipo selvagem a montante e incluindo o códon de partida de PAH de camundongo e, portanto, tinha a capacidade de corrigir mutações no códon de partida e/ou região não traduzida 5’ (UTR) do gene da PAH de camundongo.
O braço de homologia 3’ compreendia a sequência genômica do tipo selvagem a jusante do códon de partida de PAH de camundongo.
A integração do vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-mAC-006 no genoma de camundongo poderia inserir a sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, a sequência de poliadenilação SV40 e o cassete de restrição de integração direcionado no códon inicial do gene da PAH de camundongo (ou seja, substituindo os nucleotídeos 1-3 do gene da PAH de camundongo), expressando assim uma proteína de PAH humana do tipo selvagem em uma célula de camundongo.
O vetor sozinho não inclui uma sequência promotora e não pode conduzir a expressão independente de PAH sem integração genômica.
Tabela 6: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-mAC-006 Elemento Genético SEQ ID NO
Elemento de ITR 5’ 18
Braço de homologia 5’ 100
Sequência de codificação de PAH humana 25 silenciosamente alterada
Sequência de poliadenilação SV40 31
Cassete de restrição de integração direcionado 71
Braço de homolgia 3’ 101
Elemento de ITR 3’ 19
[00209] O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 foi empacotado no capsídeo de AAVHSC17 e injetado em dois camundongos neonatais do tipo selvagem por via intravenosa através da veia da cauda a uma dose de 2 x 1013 genomas de vetor por kg de peso corporal. Dois camundongos de controle receberam injeção de solução salina através da veia da cauda. Amostras de fígado foram coletadas após 2 semanas.
[00210] Um método de PCR foi desenvolvido para detectar a integração do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 no genoma do camundongo. Como mostrado na Figura 4B, um primeiro par de iniciadores (SEQ ID NOs: 62 e 63) foi projetado para amplificar um DNA de 867 pb de um alelo não editado (“PCR de controle”); um segundo par de iniciadores (SEQ ID NOs: 64 e 65) foi projetado para amplificar especificamente um DNA de 2459 bp de um alelo editado (“PCR de alelo editado”). Como mostrado na Figura 4C, uma amostra de fígado de um camundongo tratado com solução salina e uma amostra de células de fibroblastos de camundongo 3T3 não gerou o produto de PCR correspondente ao alelo editado, enquanto as amostras de fígado de dois camundongos injetados com o vetor pHMI-hPAH- mAC-006 gerou o produto de PCR correspondente ao alelo editado. Todas as quatro amostras geraram níveis similares do produto de PCR correspondente ao alelo não editado, sugerindo que as amostras eram comparáveis em qualidade.
[00211] Um método de ddPCR foi desenvolvido para quantificar a integração do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 no genoma do camundongo. Dois conjuntos de iniciadores e sondas, como mostrado na Tabela 7, foram projetados para detecção da integração por ddPCR. Conjunto 1 mPAH_ATG_gDNA_FAM detectou o genoma não editado e o genoma editado após a integração direcionada de pHMI-hPAH-mAC-006. O conjunto 1 SV40_FAM detectou uma sequência na sequência de poliadenilação SV40, que estava presente no genoma editado e nos vetores não integrados (Figura 5A).
[00212] Amostras de DNA foram particionadas em gotículas de óleo. A concentração de DNA foi otimizada para 600 pg por 20 µL, a fim de reduzir significativamente a probabilidade de que uma gota de óleo contenha aleatoriamente uma partícula de vetor e uma partícula de DNA genômico (p <0,001) (Figura 5C e 5D). Após a integração do vetor no genoma, a taxa de positividade dupla da sonda de vetor e da sonda de locus na mesma gota aumenta (Figura 5B). Como mostrado na Figura 5E, os dois camundongos de controle tinham 0% e 0,0395% de alelos editados no fígado, respectivamente, e os dois camundongos tratados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 tinham 2,504% e 2,783% de alelos editados no fígado, respectivamente. Assim, a eficácia de integração geral do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 no fígado sob as condições dadas foi de cerca de 2,6%. Espera- se que a eficácia de integração para cada célula individual seja maior, porque nem todas as células foram transduzidas com o vetor. Tabela 7: Iniciadores e sondas para quantificar a integração de PAH humana no genoma de camundongo Iniciador ou Sonda Sequência SEQ ID NO Conjunto 1 mPAH_ATG_gDNA_FAM, CAGCATCAGAAGCAGAACATTT 102 iniciador F Conjunto 1 mPAH_ATG_gDNA_FAM, AAAGCACATCAGCAGTTTCAA 103 iniciador R Conjunto 1 mPAH_ATG_gDNA_FAM, AGATGAAAGCAACTGAACATCGACTACGA 104 sonda
Iniciador ou Sonda Sequência SEQ ID NO Conjunto 1 SV40_FAM, iniciador F GCAATAGCATCACAAATTTCAC 105 Conjunto 1 SV40_FAM, iniciador R GATCCAGACATGATAAGATACATTG 106 Conjunto 1 SV40_FAM, sonda TCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCA 107 Conjunto 3 mPah_1C_LHA_FAM, gcaagctccagatcaccaata 108 iniciador F Conjunto 3 mPah_1C_LHA_FAM, ctgagcaatgcattcagcaataa 109 iniciador R Conjunto 3 mPah_1C_LHA_FAM, sonda CCCTGAACATCCCTTGACAGAGCA 110
[00213] A quantidade relativa do mRNA expressado a partir do alelo editado foi determinada por ddPCR. O conjunto 1 SV40_FAM foi usado para detectar especificamente a expressão de PAH humana a partir do alelo editado. Cada nível de expressão de PAH foi normalizado para o nível de expressão de Hprt endógeno. Como mostrado na Figura 6, os camundongos de controle não mostraram expressão de PAH humana, sugerindo que os iniciadores e a sonda não reagiram de forma cruzada com a PAH de camundongo endógeno. A expressão percentual de PAH em relação aos níveis do tipo selvagem foi calculada com base no sinal de PAH humana em relação ao Hprt normalizado contra o sinal de PAH de camundongo endógeno em relação ao Hprt. Os dois camundongos tratados com o vetor pHMI-hPAH- mAC-006 tinham níveis de mRNA de 5,378% e 4,846% em relação aos níveis de PAH endógenos de camundongo, respectivamente. Assim, o nível geral de mRNA do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 no fígado nas condições dadas foi de cerca de 5%. Espera-se que o nível de mRNA para cada célula individual seja mais alto, porque nem todas as células foram transduzidas com o vetor. b) Edição do gene da PAH de camundongo em camundongos nocauteados para pah
[00214] Em um experimento, a eficácia do vetor pHMI- hPAH-mAC-006 na correção fenotípica foi determinada usando um modelo de camundongo nocauteado para PAH (PAHENU2). Resumidamente, o vetor hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 foi administrado por via intravenosa, em 5 dias consecutivos, a esses camundongos em uma dose de 1,16 × 1014 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. A fenilalanina (Phe) sérica foi medida semanalmente durante 5 meses por espectrometria de massa. Após 5 meses, o DNA foi extraído de amostras de fígado e os números de genomas de vetor por célula foram analisados por ddPCR usando conjuntos de iniciadores e sondas para medir o vetor e os números de cópias do locus genômico de PAH humana.
[00215] A eficácia de transdução (medida em número de genomas de vetor por célula (“VG por célula”)) foi determinada por ddPCR usando conjuntos de iniciadores e sondas para medir o vetor, e os números de cópias de loci genômico de PAH de camundongo e humano. A frequência de edição foi medida por ddPCR multiplexado usando conjuntos de sondas e iniciadores para medir a frequência do DNA do elemento de edição do vetor de AAV (“carga útil”) integrado no locus de PAH de camundongo e no locus de PAH humana. Resumidamente, fitas simples de DNA foram particionadas em gotas de óleo. Cada gota foi testada quanto à presença de DNA de PAH humana ou de camundongo, juntamente com a presença ou ausência da carga útil. A frequência de edição foi calculada com base na copartição detectada de uma carga útil e um DNA alvo em uma única gota em excesso da probabilidade esperada de copartição de uma carga útil e um DNA alvo em moléculas de ácido nucleico separadas.
[00216] Os camundongos nocauteados para PAH tinham um fenótipo de níveis aumentados de fenilalanina (Phe) no sangue. Para examinar as alterações fenotípicas, os níveis séricos de Phe após a administração dos vetores de AAV foram medidos, os níveis percentuais foram calculados em relação à referência no tempo zero, e os níveis percentuais foram comparados com os camundongos de controle que não receberam os vetores de AAV.
[00217] Os camundongos administrados com o vetor hPAH- mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 mostraram uma eficácia de transdução de cerca de 8 a 18 genomas de vetor por célula (Figura 7A), e uma eficácia de edição média de cerca de 4,4% em relação ao número de alelos (Figura 7B). Essa eficácia de edição apoiou um nível de expressão de PAH suficiente para reduzir os níveis de Phe no soro dos camundongos em cerca de 50% por pelo menos 5 meses (Figuras 7C e 7D), e as alterações fenotípicas correlacionadas com a eficácia de edição (Figura 7E). A recombinação homóloga correta do vetor no locus de Pah foi verificada pelo comprimento do produto de PCR amplificado a partir do locus genômico editado usando um primeiro iniciador que hibridizou com a carga útil e um segundo iniciador que hibridizou com uma sequência genômica a jusante do braço de homologia direito (dados não mostrados).
[00218] Para determinar se a recombinação homóloga introduziu quaisquer alterações genômicas nos alelos editados, as sequências de DNA nas regiões genômicas correspondentes aos braços de homologia foram posteriormente analisadas por sequenciamento profundo (Illumina). Todas as amostras tinham leituras de sequência de alta qualidade, e todas as posições foram sequenciadas com uma profundidade de mais de 20.000 leituras.
As inserções e eliminações (doravante denominadas “indels”) foram identificadas por Somatic Variant Callers com um filtro de qualidade indel e um filtro de polarização de fita.
Especificamente, uma região no braço de homologia direito compreendendo 10 G contínuos mostrou uma taxa de indel elevada de cerca de 0,02-0,05% em ambos os animais de controle e tratados.
Indels nesse locus, bem como em vários outros loci, não passaram pelos filtros para mudanças genuínas, e foram removidos de análises posteriores.
Como mostrado na Tabela 8, os animais de controle não tratados mostraram uma taxa de indel de 0,002- 0,006%. O animal tratado 1 teve uma taxa de indel de 0,031%; o animal tratado 2 não teve indels que passassem pelos filtros; o animal 3 tratado teve uma taxa de indel semelhante à dos animais de controle.
Todos os indels identificados estavam localizados em regiões não traduzidas.
Tabela 8. Dados de sequenciamento profundo para animais individuais Animal Leituras Profundidade Número de Mutações totais média por mutações acumulativas que base que passam passam pelo pelo filtro filtro em %
Animal de 4.218.356 341.291 1 0,002%
controle 1
Animal de 5.599.928 453.069 2 0,006%
controle 2
Animal tratado 4.785.826 387.203 9 0,031%
1
Animal tratado 3.353.288 271.302 0 0,000%
Animal tratado 9.514.938 769.817 9 0,006% 3
[00219] Os resultados acima demonstraram a viabilidade de reverter os fenótipos de deficiência de PAH usando vetores de correção que inserem uma sequência de codificação de PAH em um genoma.
[00220] Para detectar a expressão de PAH humana em hepatócitos de camundongo individuais após a transdução in vivo, a hibridização in situ de RNA (ISH) foi realizada em seções de tecido hepático usando uma sonda específica para >1kb do RNA de PAH humana tendo a alteração do códon silencioso como descrito acima (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Hayward, CA). Como mostrado na Figura 7F, essa sonda detectou RNA de PAH humana e possivelmente DNA de vírus compreendendo a sequência de PAH em hepatócitos de camundongo transduzidos com o vetor hPAH-mAC-006, mas não hibridizou cruzadamente com RNA de Pah de camundongo endógeno. Uma amostra de fígado de um camundongo transduzida com uma construção de transgene compreendendo um promotor de CMV que conduz a expressão de um RNA de Pah humana tendo a mesma alteração silenciosa de códon foi usada como um controle positivo. c) Vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-mAC-006
[00221] O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 9. Tabela 9: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMI-hPAH-mAC-006 Elemento Genético SEQ ID NO Elemento de ITR 5’ 18 Braço de homologia 5’ 111 Sequência de codificação de PAH humana silenciosamente 25 alterada Sequência de poliadenilação SV40 31 Cassete de restrição de integração direcionado 71 Braço de homolgia 3’ 112 Elemento de ITR 3’ 19 Genoma de correção (HA 5’ a HA 3’) 113 Genoma de correção (ITR 5’ a ITR 3’) 114 d) Eficiência de edição do gene da PAH em camundongos administrados com pHMI-hPAH-mAC-006
[00222] A Figura 9A representa um esquema do ensaio usado para determinar a eficácia de edição do gene da PAH em camundongos que receberam o vetor pHMI-hPAH-mAC-006. ddPCR e LAM-NGS (LAM-PCR seguido por sequenciação de próxima geração (NGS)) foi realizado como descrito nesse documento e indicado na Figura 9A. A Figura 9B mostra um gráfico da eficácia de edição do gene da PAH como determinado em células de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 ou com veículo de controle. Como mostrado na Figura 9B, a eficácia da edição do gene da PAH em camundongos administrados com o vetor HMI-hPAH-mAC-006 foi determinada como sendo cerca de 8% em relação ao número de alelos. Nenhum erro foi detectado nas regiões editadas. e) Correção fenotípica durável de hiperfenilalaninemia em modelos de camundongo
[00223] Em um experimento, a eficácia do vetor pHMI- hPAH-mAC-006 na correção fenotípica foi determinada usando um modelo de camundongo nocauteado para PAH (PAHENU2). O vetor pHMI-hPAH-mAC-006 foi empacotado em capsídeos de AAVHSC15 e administrado por via intravenosa a camundongos em uma dose de 1 × 1014 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Para examinar as alterações fenotípicas, os níveis séricos de fenilalanina (Phe) e tirosina (Tyr) após a administração do vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15 foram medidos semanalmente além de 7 semanas, os níveis percentuais foram calculados em relação à referência no tempo zero, e os níveis percentuais foram comparados com os camundongos de controle que receberam um veículo de controle. Um total de 4 camundongos foi administrado com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 empacotado em capsídeos de AAVHSC15, e 2 camundongos foram administrados com veículo de controle. Como mostrado na Figura 10, uma redução significativa nos níveis séricos de Phe (Figura 10A; *indica p<0,0001 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs veículo; p<0,0001 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs tempo) e um aumento significativo nos níveis séricos de Tyr (Figura 10B; * indica p<0,05 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs veículo; p<0,0003 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs tempo) foram observados em camundongos que receberam o vetor. A Figura 10C mostra a razão entre Phe no soro e Tyr no soro em camundongos que receberam o vetor ou um veículo de controle (*indica p<0,002 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs veículo; p <0,0004 por medidas repetidas por ANOVA de 2 vias vs tempo).
[00224] A Figura 11A representa um gráfico que mostra a eficácia de edição do gene da PAH e a eficácia de transdução de células obtidas de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 ou um veículo de controle. O eixo y esquerdo da Figura 11A indica a porcentagem de eficácia de edição e mostra que os camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (AAVHSC15-mPAH) tiveram cerca de 5% de eficácia de edição em relação ao número de alelos. O eixo y direito da Figura 11A indica o número de genomas de vetor por célula e mostra que os camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (AAVHSC15-mPAH) tiveram uma eficácia de transdução de cerca de 140 genomas de vetor por célula.
[00225] A Figura 11B representa um gráfico que mostra a quantidade relativa de mRNA de PAH expressado, normalizado para o nível de expressão de GAPDH de camundongo, de células obtidas de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH- mAC-006 (AAVHSC15-mPAH) ou um veículo ao controle. Como mostrado, as células obtidas de camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (AAVHSC15-mPAH) tinham níveis significativos de mRNA de PAH humana, quando camundongos comparados administrados com um veículo de controle (*indica p<0,005 pelo teste de Mann Whitney bicaudal vs veículo). Exemplo 5: edição in vivo do gene da PAH humana em um modelo de camundongo
[00226] Esse exemplo fornece modelos animais para examinar vetores de correção de PAH, tais como aqueles descritos nos exemplos anteriores, na edição do gene da PAH humana em um modelo de camundongo. a) Edição de PAH humana em células sanguíneas humanas em um modelo de camundongo
[00227] Resumidamente, camundongos NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) foram mieloablados através de irradiação subletal e transplantados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas. Os níveis de enxerto foram determinados após 12 semanas, identificando as quantidades de células CD45+ humanas e murinas no sangue periférico por citometria de fluxo, e os camundongos tendo mais que 50% de células CD45+ humanas circulantes foram selecionados. O vetor hPAH-hAC-008 empacotado com o capsídeo de AAVHSC17 foi administrado por via intravenosa a 12 desses camundongos divididos igualmente em quatro grupos. O primeiro e o segundo grupos de camundongos receberam uma dose de 1,54 x 1013 genomas de vetor por quilograma de peso corporal, e o terceiro e o quarto grupos receberam uma dose de 2,1 x 1012 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Os camundongos foram sacrificados 6 semanas após as injeções. Amostras de sangue, medula óssea e tecidos do baço foram coletados, e o DNA genômico foi extraído.
[00228] A frequência de edição em células de camundongo e humanas foi medida por PCR digital por gotículas multiplexadas (ddPCR) usando conjuntos de sonda de iniciador para medir a frequência do DNA integrado do vetor de AAV (“carga útil”) que se integra ao locus de PAH de camundongo e ao humano locus de PAH. Em resumo, fitas simples de DNA foram particionadas em gotículas de óleo. Cada gota foi testada quanto à presença de DNA de PAH humana ou de camundongo, juntamente com a presença ou ausência da carga útil. A frequência de edição foi calculada com base na copartição detectada de uma carga útil e um DNA alvo em uma única gota em excesso da probabilidade esperada de copartição de uma carga útil e um DNA alvo em moléculas de ácido nucleico separadas.
[00229] Como mostrado na Tabela 10, a edição de células humanas foi detectada em amostras de medula óssea de uma maneira dependente da dose. Notavelmente, a edição foi específica para o genoma humano, uma vez que nenhuma edição foi detectada em células de camundongo. Tabela 10: Eficácias de edição de hPAH-hAC-008 em tecidos de camundongo Grupo % de Edição na medula % de Edição no % Edição no óssea baço sangue 1 0,16 0,0 0,0 2 0,25 0,01 0,0 3 0,09 0,09 0,0 4 0,02 0,013 0,001
[00230] A Figura 8A mostra a eficácia de transdução do vetor hPAH-hAC-008 e do vetor hPAH-hAC-008-HBB em hepatócitos humanos e de camundongo em camundongos administrados com o vetor empacotado em capsídeos de AAVHSC15. b) Edição de PAH humana em hepatócitos humanos em um modelo de camundongo usando um vetor compreendendo um íntron de HBB
[00231] O vetor hPAH-hAC-008 compreende uma sequência de codificação de PAH humana completa sem qualquer íntron. Um vetor hPAH-hAC-008-HBB modificado, em que o primeiro íntron do gene de HBB humano (tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 28) é adicionado entre os nucleotídeos 912 e 913 da sequência de codificação de PAH humana, foi gerado para melhorar a exportação nuclear e a estabilidade das moléculas de RNA transcritas do vetor. A ligação internucleotídica entre os nucleotídeos 912 e 913 corresponde ao sítio de emenda entre o éxon 8 e o éxon 9 do gene da PAH nativo, que não foi rompido pela alteração silenciosa dos códons.
[00232] Os vetores eram pacotes com capsídeos de AAVHSC15, e foram administrados em camundongos por via intravenosa a uma dose de 1 x 1013 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Seis semanas após a administração, as amostras de fígado foram coletadas, e a localização do mRNA de PAH humana silenciosamente alterado e, possivelmente, do DNA do vírus compreendendo a sequência de PAH foi examinada por hibridização in situ. Como mostrado na Figura 8B, a adição do íntron de HBB melhorou substancialmente a exportação nuclear do mRNA. Esse resultado demonstrou que a adição de um íntron na sequência de codificação de PAH poderia aumentar potencialmente o nível de expressão do gene da PAH, e essa característica pode ser incluída no projeto de vetores de correção de PAH. c) Edição de PAH humana em hepatócitos humanos em um modelo de camundongo
[00233] Resumidamente, camundongos Fah-/- Rag2-/- Il2rg-/- na base de C57Bl/6, comumente referidos como camundongos nocauteados FRG®, foram usados como um modelo para humanização do fígado. Os camundongos eram imunodeficientes e não tinham a enzima catabólica de tirosina fumarilacetoacetato hidrolase (Fah). A ablação de hepatócitos de camundongo foi induzida pela retirada do fármaco protetor 2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3- ciclohexanediona (NTBC). Os camundongos foram então enxertados com hepatócitos humanos, e um adenovírus que expressa a uroquinase foi administrado para intensificar o repovoamento dos hepatócitos humanos. O enxerto foi mantido ao longo da vida do animal com um regime apropriado de Nitisinona CuRx™ (20-0026) e tratamento profilático de antibióticos SMX/TMP (20-0037). Os animais pesavam 22 gramas em média e tinham uma vida útil típica de 18 a 24 meses.
[00234] O vetor hPAH-hAC-008 ou hPAH-hAC-008-HBB foi empacotado com capsídeos de AAVHSC15, e foi administrado em camundongos por via intravenosa a uma dose de 1 x 1013 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Seis semanas após a administração, as amostras de fígado foram coletadas, os hepatócitos humanos e de camundongo foram separados e purificados usando colunas Miltenyi autoMACS após a perfusão do fígado. O DNA foi extraído, e a eficácia da edição do gene foi medida usando o mesmo método de ddPCR como descrito acima.
[00235] Como mostrado na Figura 8C, a porcentagem de eficácia de edição em hepatócitos humanos, medida como a porcentagem de alelos editados de todos os alelos, foi de 2,2% em um animal tratado com o vetor hPAH-hAC-008 e de 4,3% em um animal tratado com o vetor hPAH-hAC-008-HBB. A edição não foi detectada em hepatócitos de camundongo de nenhum dos animais. A falta de detecção de edição em hepatócitos de camundongo de qualquer um dos animais é improvável que seja devido à falta de eficácia de transdução, uma vez que os hepatócitos de camundongo foram bem transduzidos (Figura 8A). Em um experimento separado, a edição do genoma humano pelo vetor hPAH-hAC-008 foi detectada a uma taxa de 2,131% em relação ao número de alelos do genoma humano, enquanto a edição do genoma do camundongo na amostra de fígado foi detectada em um taxa de 0,05% em relação ao número de alelos do genoma do camundongo. Esses resultados mostraram edição específica para humanos do gene da PAH pelo vetor hPAH-hAC- 008 ou uma versão modificada do mesmo, e forneceram um modelo in vivo para examinar a eficácia de edição em hepatócitos. d) Edição de PAH humana em hepatócitos humanos em um modelo de camundongo
[00236] Em um experimento, camundongos Fah-/- Rag2-/- Il2rg-/- na base de C57Bl/6, comumente referidos como camundongos nocauteados FRG® (também referidos nesse documento como camundongos HuLiv), foram usados como um modelo para humanização do fígado, como descrito acima (ver Figura 12A).
[00237] O vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, um aceitador de emenda, um elemento 2A, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada, uma sequência de poliadenilação SV40, um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 11. Tabela 11: Elementos genéticos no vetor de correção de PAH pHMIK-hPAH-hI1C-032 Elemento Genético SEQ ID NO Elemento de ITR 5’ 18 Braço de homologia 5’ 115 Aceitador de emenda 14 Element 2A 74 Sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada 116 Sequência de poliadenilação SV40 31 Braço de homolgia 3’ 117 Elemento de ITR 3’ 19
Elemento Genético SEQ ID NO Genoma de correção (HA 5’ a HA 3’) 118 Genoma de correção (ITR 5’ à ITR 3’) 119
[00238] O vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 foi empacotado com capsídeos de AAVHSC15 e foi administrado em camundongos por via intravenosa a uma dose de 1 x 1014 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Amostras de fígado de 3 camundongos que receberam o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 empacotado com capsídeos de AAVHSC15 foram coletadas, os hepatócitos humanos e de camundongo foram separados e purificados, e o DNA foi extraído. A eficácia da edição de genes foi medida usando o mesmo método de ddPCR descrito acima.
[00239] A durabilidade da edição do gene da PAH em hepatócitos humanos foi medida determinando a porcentagem de alelos editados de todos os alelos em células obtidas de camundongos tratados 1 semana e 6 semanas após a administração do vetor. Como mostrado na Figura 12B, cerca de 4% da edição do gene da PAH foi medida em células obtidas de camundongos 1 semana após a administração do vetor, e cerca de 7% de edição foi medida em células obtidas de camundongos 6 semanas após a administração do vetor.
[00240] A edição do genoma mediada pelo vetor pHMIK- hPAH-hI1C-032 foi considerada específica para hepatócitos humanos em camundongos HuLiv. Como mostrado na Figura 13, em 1 semana após a administração do vetor, a edição do gene da PAH (como determinado por ddPCR e NGS) foi detectada a uma taxa de cerca de 3% a 3,5% em relação ao número de alelos do genoma humano, enquanto a edição do genoma do camundongo na amostra de fígado foi próximo a 0% em relação ao número de alelos do genoma do camundongo. Em 6 semanas após a administração do vetor, a edição foi detectada a uma taxa de cerca de 5% a 6,5% em relação ao número de alelos do genoma humano. *indica p<0,0025 em comparação com os valores do camundongo.
[00241] Além disso, o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 foi considerado ineficaz em células não humanas. Como mostrado na Figura 14, quando camundongos nocauteados para PAH (PAHENU2) foram administrados por via intravenosa com o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 (hPAH-032) empacotado com capsídeos de AAVHSC15 a uma dose de 1 x 1014 genomas de vetor por quilograma de corpo peso, o nível de fenilalanina no soro foi semelhante ao dos camundongos administrados com um controle até 3 semanas após a injeção. Em contraste, os camundongos administrados com o vetor pHMI-hPAH-mAC-006 (mPAH-006) mostraram redução nos níveis séricos de Phe logo 1 semana após a injeção.
[00242] A Figura 15A mostra a relação entre a expressão de PAH humana e os níveis séricos de Phe. Como mostrado, em dados coletados de experimentos usando o vetor pHMI-hPAH- mAC-006 em camundongos PAHENU2, 10% da expressão de PAH humana corrige o fenótipo em camundongos PAHENU2. Assim, 10% da expressão de PAH humana em relação aos níveis endógenos foram determinados como o nível necessário para corrigir a fenilalaninemia (por exemplo, um nível terapêutico).
[00243] Os níveis terapêuticos de expressão foram detectados com o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032. A expressão de PAH humana em hepatócitos humanos foi medida em relação ao GAPDH humano em camundongos HuLiv administrados com o vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 (hPAH-032) a uma dose de 1 x 1014 genomas de vetor por quilograma de peso corporal. Como mostrado na Figura 15B, usando duas sondas de expressão diferentes para medir a expressão de PAH humana em dois camundongos HuLiv diferentes tratados com o vetor, a expressão de PAH humana foi determinada como sendo maior do que 10% em hepatócitos humanos. A faixa de edição do gene da PAH em hepatócitos humanos de camundongos HuLiv administrados com o vetor foi medida em cerca de 5% a cerca de 11% em 13 camundongos diferentes em 3 experimentos diferentes.
[00244] O vetor pHMIK-hPAH-hI1C-032 foi encontrado para direcionar o gene da PAH humana e resultou em níveis corrigidos de mRNA editado em camundongos HuLiv. O nível de mRNA de PAH necessário para correção fenotípica foi apresentado pela primeira vez em um modelo murino (usando o modelo de camundongo nocauteado para PAH (PAHENU2)). Esse foi determinado ser cerca de 10% da expressão de PAH em relação aos níveis endógenos (ver Figura 15A). Como mostrado na Figura 16, a expressão do gene da PAH humana em relação à expressão de GAPDH foi determinada em cerca de 44,9% (esquerda), e a expressão do gene da PAH em camundongo em relação à expressão de GAPDH foi determinada para cerca de 39,7% (direita). Exemplo 6: Vetores de correção de PAH humana
[00245] Esse exemplo fornece os vetores de correção de PAH humana pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR, pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3, pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3, e pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1. Os esquemas dos vetores são representados nas Figuras 17A, 17B, 17C, 17D e 17E, respectivamente. a) pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR e pHMIA2-
hPAH-mAC-006-HBB1
[00246] Os vetores pKITR-hPAH-mAC-006-HCR e pKITR-hPAH- hI1C-032-HCR foram gerados pela inserção de um íntron de HCR na sequência de codificação de PAH. O vetor pHMIA2-hPAH-mAC- 006-HBB1 foi gerado inserindo um íntron de HBB1 na sequência de codificação de PAH. Os íntrons HCR e HBB1 foram selecionados com base em seu desempenho em experimentos de triagem de íntron usando um repórter de luciferase para determinar os íntrons que exibem alta expressão em linhas de células de fígado e sangue. Os íntrons usados na triagem são apresentados na Tabela 12. Tabela 12: Sequências de íntron usadas na triagem do repórter luciferase Íntron SEQ ID NO Íntron de MVM quimérico (ChiMVM) 120 Íntron de SV40 121 Íntron Líder Tripartido de Adenovírus (AdTPL) 122 Mini Íntron B-Globina 123 Íntron Quimérico AdV/Ig (AdVIgG) 124 Íntron da cadeia pesada de Ig de B-globina (BGlobinIg) 125 Íntron de MVM Wu (MVM Wu) 126 Íntron de HCR1 (OptHCR) 127 Íntron de B-Globina 128 Íntron de tFIX (FIX) 129 Íntron de ch2BLood (BloodEnh) 130
[00247] pKITR-hPAH-mAC-006-HCR compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada com íntron de HCR inserido na mesma, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE TI”), um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, um aceitador de emenda, um elemento 2A, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada com íntron de HCR inserido na mesma, uma sequência de poliadenilação SV40, um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. pHMIA2-hPAH- mAC-006-HBB1 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada com o íntron de HBB inserido na mesma, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE TI”), um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 13. Tabela 13: Elementos genéticos nos vetores de correção de PAH pKITR-hPAH-mAC-006-HCR, pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR e pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1
SEQ ID NO Elemento Genético -006-HCR -032-HCR -006-HBB1 Elemento de ITR 5’ 18 18 18 Braço de homologia 5’ 111 115 142 Aceitador de emenda N/A 14 N/A Element 2A N/A 74 N/A Sequência de codificação de PAH Humana 131 132 143 Sequência de poliadenilação SV40 31 31 31 Cassete de restrição de integração 71 N/A 71 direcionado Braço de homolgia 3’ 112 117 144
Elemento de ITR 3’ 19 19 19 Genoma de correção (HA 5’ a HA 3’) 134 136 145
[00248] b) Vetores pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 e pHMIA2- hPAH-hI1C-032-SD.3 pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 e pHMIA2-hPAH- hI1C-032-SD.3 foram gerados modificando um sítio doador de emenda. O doador de emenda foi modificado como indicado nas Figuras 17C e 17D, respectivamente. pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada com modificação de doador de emenda, uma sequência de poliadenilação SV40, um cassete de restrição de integração direcionado (“RE TI”), um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3 compreendia os seguintes elementos genéticos 5’ a 3’: um elemento de ITR 5’, um braço de homologia 5’, um aceitador de emenda, um elemento 2A, uma sequência de codificação de PAH humana silenciosamente alterada com modificação do doador de emenda, uma sequência de poliadenilação SV40, um braço de homologia 3’ e um elemento de ITR 3’. As sequências desses elementos são apresentadas na Tabela 14. Tabela 14: Elementos genéticos nos vetores de correção de PAH pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3 e pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3
SEQ ID NO Elemento Genético -006-SD.3 -032-SD.3 Elemento de ITR 5’ 18 18 Braço de homologia 5’ 111 115 Aceitador de emenda N/A 14 elemento 2A N/A 74 Sequência de codificação de PAH humana 138 139
Sequência de poliadenilação SV40 31 31 Cassete de restrição de integração 71 N/A direcionado Braço de homolgia 3’ 112 117 Elemento de ITR 3’ 19 19 * * *
[00249] A invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas nesse documento. Na verdade, várias modificações da invenção além daquelas descritas tornar-se-ão evidentes para os habilitados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Essas modificações destinam-se a cair dentro do escopo das reivindicações anexas.
[00250] Todas as referências (por exemplo, publicações ou patentes ou pedidos de patente) citadas nesse documento são incorporadas nesse documento por referência em sua totalidade e para todos os fins, na mesma medida como se cada referência individual (por exemplo, publicação ou patente ou pedido de patente) fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins. Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindicações.

Claims (70)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para corrigir uma mutação em um gene da fenilalanina hidroxilase (PAH) em uma célula, o método caracterizado pelo fato de que compreende a transdução da célula com um vírus adeno-associado (AAV) com defeito na replicação, compreendendo: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de correção compreendendo: (i) um elemento de edição para editar um local alvo no gene da PAH; (ii) uma sequência de nucleotídeos 5’ do braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ com o local alvo; e (iii) uma sequência de nucleotídeos 3’ do braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ com o local alvo, em que a célula é transduzida sem cotransduzir ou coadministrar uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é um hepatócito, uma célula renal ou uma célula do cérebro, da glândula pituitária, da glândula adrenal, do pâncreas, da bexiga urinária, da vesícula biliar, do cólon, do intestino delgado ou da mama.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula está em um indivíduo mamífero, e o AAV é administrado ao indivíduo em uma quantidade eficaz para transduzir a célula no indivíduo.
4. Método para tratar um indivíduo tendo uma doença ou um distúrbio associado a uma mutação no gene da PAH, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um AAV com defeito na replicação, compreendendo: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de correção compreendendo: (i) um elemento de edição para editar um local alvo no gene da PAH; (ii) uma sequência de nucleotídeos 5’ do braço de homologia 5’ do elemento de edição tendo homologia com uma primeira região genômica 5’ com o local alvo; e (iii) uma sequência de nucleotídeos 3’ do braço de homologia 3’ do elemento de edição tendo homologia com uma segunda região genômica 3’ com o local alvo, em que uma nuclease exógena ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma nuclease exógena não é coadministrada ao indivíduo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é fenilcetonúria.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende pelo menos uma porção de uma sequência de codificação de PAH.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende uma sequência de codificação de PAH.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-9, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 24.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-9, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH é silenciosamente alterada.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139 ou 143.
13. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende uma sequência de codificação inserida no íntron de PAH, opcionalmente em que a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende um íntron não nativo inserido em uma sequência de codificação de PAH.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o íntron não nativo é selecionado do grupo que consiste em um primeiro íntron de um gene beta hemoglobina e um vírus minuto de íntron de camundongo (MVM).
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o íntron não nativo consiste em uma sequência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 28-30 e 120-130.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o íntron não nativo consiste em uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 28-30 e 120-130.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação inserida no íntron de PAH codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 23.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação inserida no íntron de PAH compreende de 5’ a 3’: uma primeira porção de uma sequência de codificação de PAH, o íntron, e uma segunda porção de uma sequência de codificação de PAH, em que a primeira porção e a segunda porção, quando unidas, formam uma sequência completa de codificação de PAH.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 24.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH é alterada silenciosamente.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de PAH compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 25, 116, 131, 132, 138, 139 ou 143.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que a primeira porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65 e/ou a segunda porção da sequência de codificação de PAH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66 ou 67.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a primeira porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64 ou 65, e a segunda porção da sequência de codificação de PAH consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66 ou 67.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 23, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende de 5’ a 3’: um elemento de salto ribossômico, e a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende adicionalmente uma sequência de poliadenilação 3’ para a sequência de codificação de PAH ou a sequência de codificação inserida no íntron de PAH.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sequência de poliadenilação é uma sequência de poliadenilação exógena, opcionalmente em que a sequência de poliadenilação exógena é uma sequência de poliadenilação SV40.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência de poliadenilação SV40 compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31-34.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo 5’ para o local alvo está em um éxon do gene da PAH.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo 5’ para o local alvo está no éxon 1 do gene da PAH.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
24 a 27, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende adicionalmente um aceitador de emenda 5’ ao elemento de salto ribossômico.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo 5’ para o local alvo está em um íntron do gene da PAH.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo 5’ para o local alvo está no íntron 1 do gene da PAH.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o elemento de edição compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 35.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’ é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à primeira região genômica.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’ é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à segunda região genômica.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira região genômica está localizada em uma primeira janela de edição e a segunda região genômica está localizada em uma segunda janela de edição.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36 ou 45.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36 ou 45.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36-38, caracterizado pelo fato de que a primeira janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36, e a segunda janela de edição consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira região genômica consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 36.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda região genômica consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que cada uma das sequências de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e 3’ tem independentemente um comprimento de cerca de 100 a cerca de 2000 nucleotídeos.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o braço de homologia 5’ compreende: C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -181 de o gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH, C correspondente a nucleotídeo -433 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH, ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH , A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH e/ou A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o braço de homologia 5’ compreende: (a) C correspondente ao nucleotídeo -2 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 4 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 6 do gene da PAH, G correspondente ao nucleotídeo 7 do gene da PAH e G correspondente ao nucleotídeo 9 do gene da PAH; (b) A correspondente ao nucleotídeo -467 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -465 do gene da PAH; (c) A correspondente ao nucleotídeo -181 do gene da PAH; (d) G correspondente ao nucleotídeo -214 do gene da PAH, C correspondente ao nucleotídeo -212 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH; (e) G correspondente ao nucleotídeo 194 do gene da PAH;
(f) C correspondente ao nucleotídeo -433 do gene da PAH e C correspondente ao nucleotídeo -432 do gene da PAH; (g) ACGCTGTTCTTCGCC (SEQ ID NO: 68) correspondente aos nucleotídeos -394 a -388 do gene da PAH; e/ou (h) A correspondente ao nucleotídeo -341 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -339 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -225 do gene da PAH, A correspondente ao nucleotídeo -211 do gene da PAH e A correspondente ao nucleotídeo -203 do gene da PAH.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o braço de homologia 5’ compreende as modificações de (c) e (d), (f) e (g) e/ou (b) e (h).
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o braço de homologia 5’ consiste em uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-44, 111, 115 e 142.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o braço de homologia 3’ consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45, 112, 117, 144.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46-54, 113, 118, 118, 134, 136 e 145.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o genoma de correção compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos 5’ de repetição terminal invertida 5’ (ITR 5’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 5’ e uma sequência de nucleotídeos 3’ de repetição terminal invertida 3’ (ITR 3’) da sequência de nucleotídeos do braço de homologia 3’.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 19.
51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20 e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 21.
52. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de ITR 5’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26 e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’ tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
27.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o genoma de correção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-63, 114, 119, 135, 137 e
146.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o genoma de correção consiste na sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 55-63, 114, 119, 135, 137 e
146.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o capsídeo AAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV Clado F.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203-736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 de SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 de SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 de SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que: (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R; (d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; ou (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ
ID NO: 2 é R e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C.
59. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 203- 736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, ou
17.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138-736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou
17.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 de SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 de SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 de SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 de SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que: (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R;
(d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; ou (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C.
63. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 138- 736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV Clado F compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que: o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 de SEQ ID NO: 2 é T; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 de SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 68 de SEQ ID NO: 2 é V; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 2 é L; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 151 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 160 de SEQ ID NO: 2 é D; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2 é C; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 de SEQ ID NO: 2 é Q; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 de SEQ ID NO: 2 é S; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 590 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G ou Y; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 de SEQ ID NO: 2 é K; o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C; ou, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que: (a) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 2 de SEQ ID NO: 2 é T, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 312 de SEQ ID NO: 2 é Q; (b) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 65 de SEQ ID NO: 2 é I, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é Y; (c) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 77 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 690 de SEQ ID NO: 2 é K; (d) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 2 é L, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 468 de SEQ ID NO: 2 é S; (e) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 626 de SEQ ID NO: 2 é G, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 718 de SEQ ID NO: 2 é G; (f) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 296 de SEQ ID NO: 2 é H, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 464 de SEQ ID NO: 2 é N, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 681 de SEQ ID NO: 2 é M; (g) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 687 de SEQ ID NO: 2 é R;
(h) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 346 de SEQ ID NO: 2 é A, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R; ou (i) o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 501 de SEQ ID NO: 2 é I, o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 505 de SEQ ID NO: 2 é R, e o aminoácido na proteína do capsídeo correspondente ao aminoácido 706 de SEQ ID NO: 2 é C.
67. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-736 de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16 ou 17.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a eficiência de integração do elemento de edição no local geométrico alvo é de pelo menos 1% quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições padrão de administração de AAV.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a frequência alélica da integração do elemento de edição no local alvo é de pelo menos 0,5% quando o AAV é administrado a um camundongo implantado com hepatócitos humanos na ausência de uma nuclease exógena sob condições padrão de administração de AAV.
70. Vírus adeno-associado (AAV) com defeito na replicação, caracterizado pelo fato de que compreende:
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202140791A (zh) * 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
US20210361778A1 (en) * 2020-04-06 2021-11-25 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for ids gene transfer and methods of use thereof
TW202208632A (zh) * 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI3517134T3 (fi) * 2001-12-17 2024-04-03 Univ Pennsylvania Adeno-assosioituneen viruksen (aav) serotyypin 8 sekvenssejä, niitä sisältäviä vektoreita ja niiden käyttöjä
US20030198620A1 (en) * 2002-04-16 2003-10-23 Keiya Ozawa Method of treating amino acid metabolic disorders using recombinant adeno-associated virus virions
US20040142416A1 (en) * 2002-04-30 2004-07-22 Laipis Philip J. Treatment for phenylketonuria
US8628966B2 (en) * 2010-04-30 2014-01-14 City Of Hope CD34-derived recombinant adeno-associated vectors for stem cell transduction and systemic therapeutic gene transfer
WO2013173635A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
US10612041B2 (en) * 2014-03-21 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
LT3152312T (lt) * 2014-06-06 2020-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tikslinio lokuso modifikavimo būdai ir kompozicijos
PT3198018T (pt) * 2014-09-24 2021-02-24 Hope City Variantes dos vetores de vírus adenoassociados para edição do genoma de alta eficácia e métodos da mesma
EP3389723A1 (en) * 2015-12-14 2018-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition for treatment of crigler-najjar syndrome
GB201603577D0 (en) * 2016-03-01 2016-04-13 Oxford Genetics Ltd Promoter
KR20190100318A (ko) * 2016-12-30 2019-08-28 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 유전자 치료
US11939601B2 (en) * 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria

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