BR112020003097A2 - variantes de alfa-amilase - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a composições e métodos se relacionando com alfa-amilases variantes. As alfa-amilases variantes são úteis, por exemplo, para liquefação e sacarificação de amido, para limpeza de nódoas ricas em amido em roupas, lavagem de louças e outras aplicações, para processamento têxtil (por exemplo, desencolagem) em ração animal para melhorar a digestibilidade e para cozimento e fabricação de cerveja.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIAN- TES DE ALFA-AMILASE".
[0001] São divulgadas composições e métodos se relacionando com a-amilases variantes. As a-amilases variantes são úteis, por exem- plo, para liquefação e sacarificação de amido, limpeza de nódoas ricas em amido, desencolagem têxtil, cozimento e fabricação de cerveja.
[0002] O amido consiste em uma mistura de amilose (15-30% p/p) e amilopectina (70-85% p/p). A amilose consiste em cadeias lineares de unidades de glucose ligadas em a-1,4 tendo um peso molecular (MW) de cerca de 60.000 a cerca de 800.000. A amilopectina é um polímero ramiíficado contendo pontos de ramificação a-1,6 a cada 24-30 unidades de glucose; seu MW pode ser tão elevado quanto 100 milhões.
[0003] As a-amilases hidrolisam amido, glicogênio e polissacarí- deos relacionados por clivagem de ligações a-1,4-glucosídicas internas aleatoriamente. As a-amilases, particularmente de Bacilli, têm sido usa- das para uma variedade de diferentes propósitos, incluindo liquefação e sacarificação de amido, desencolagem têxtil, modificação de amido na indústria de papel e celulose, fabricação de cerveja, cozimento, produ- ção de xaropes para a indústria alimentar, produção de matérias-primas para processos de fermentação e em ração animal para aumentar a di- gestibilidade. Estas enzimas podem ser também usadas para remover manchas e nódoas ricas em amido durante a lavagem de louças e lava- gem de roupas.
[0004] Numerosas publicações têm descrito mutações em a-amila- ses. No entanto, continua a existir a necessidade de moléculas de a- amilases manipuladas mais robustas.
[0005] As presentes composições e métodos se relacionam com polipeptídeos de amilase variantes e métodos de seu uso. Os aspectos e as modalidades das presentes composições e métodos são resumidos nos seguintes parágrafos separadamente numerados:
1. Em um aspecto é proporcionada uma a-amilase variante recombinante, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AA5S60 de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes conhecidas.
2. Em algumas modalidades, a a-amilase variante do pará- grafo 1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 96% de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
3. Em outro aspecto é proporcionada uma a-amilase variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com o polinucleotídeo de SEQ ID NOs: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições es- tringentes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou o seu complemento.
4. Em outro aspecto é proporcionado um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com o polinucleotídeo de SEQ ID NOs: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, um vetor de expressão compre- endendo o polinucleotídeo ou um hospedeiro de expressão compreen- dendo o polinucleotídeo ou o vetor de expressão.
5. Em outro aspecto é proporcionada uma composição para liquefação de amido compreendendo a amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-3.
6. Em outro aspecto é proporcionada uma composição de detergente compreendendo a amilase variante de qualquer um dos pa- rágrafos 1-3.
7. Em outro aspecto é proporcionado um método para con- versão de amido em oligossacarídeos, compreendendo contato de amido com quantidade eficaz da amilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-3.
8. Em outro aspecto é proporcionado um método para remo- ção de uma nódoa ou mancha rica em amido de uma superfície, com- preendendo contato da superfície com uma quantidade eficaz da ami- lase variante de qualquer um dos parágrafos 1-3 e permissão para que o polipeptídeo hidrolise os componentes de amido presentes na nódoa rica em amido para produzir moléculas derivadas de amido mais peque- nas que se dissolvem na composição aquosa, removendo deste modo a nódoa rica em amido da superfície.
[0006] Estes e outros aspectos e modalidades das composições e métodos serão aparentes a partir da presente descrição e desenhos.
[0007] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequências de amino- ácidos por Clustal W de Amy707, Amy707-3790H, Amy707-2170D, Amy707-4037D, Amy707-3156D e Amy707-3915D.
[0008] São descritas composições e métodos se relacionando com enzimas a-amilase variantes. Aplicações exemplificativas para as enzi- mas amilase variantes são para liquefação e sacarificação de amido, para limpeza de nódoas ricas em amido em roupas, lavagem de louças e outras aplicações, para processamento têxtil (por exemplo, desenco- lagem), em ração animal para melhorar a digestibilidade e para cozi-
mento e fabricação de cerveja. Estes e outros aspectos das composi- ções e métodos são descritos em detalhe em baixo.
[0009] Antes da descrição dos vários aspectos e modalidades das presentes composições e métodos, as seguintes definições e abrevia- turas são descritas.
1. Definições e Abreviaturas
[0010] De acordo com esta descrição detalhada, as seguintes abre- viaturas e definições se aplicam. Se note que as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "uma en- zima" inclui uma pluralidade de tais enzimas, e a referência "à dosagem" inclui referência a uma ou mais dosagens ou seus equivalentes conhe- cidos pelos peritos na técnica e assim por diante.
[0011] O presente documento está organizado em um número de seções para facilidade de leitura; no entanto, o leitor apreciará que as afirmações feitas em uma seção se podem aplicar a outras seções. Desta maneira, os títulos usados para diferentes seções da divulgação não devem ser interpretados como limitantes.
[0012] A não ser que definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comu- mente entendido por um perito na técnica. Os seguintes termos são de- finidos, embaixo, para clareza.
1.1. Abreviaturas e Acrônimos
[0013] As seguintes abreviaturas/acrônimos têm os seguintes signi- ficados a não ser que de outro modo especificado: DNA ácido desoxirribonucleico EC Comissão de enzimas FH dureza francesa GA glucoamilase GH dureza geral
HDL detergente líquido de elevada densidade HDD detergente em pó para tarefas pesadas HSG detergente granular que produz muitas bolhas HFCS xarope de milho com elevado conteúdo de frutose IRS amido residual insolúvel kDa quiloDálton MW peso molecular MWU unidade de Wohlgemuth modificada; 1,6 x 10º mg/MWU = unidade de atividade NCBI National Center for Biotechnology Information PI Índice de desempenho ppm partes por milhão, por exemplo, ug de proteína por grama de sólido seco RCF força centrifuga/centrípeta relativa (i.e., x gravidade) Sp. espécie Tm temperatura de fusão pv peso/volume p/p peso/peso vv volume/volume % em peso percentagem em peso ºe graus Centígrados H2O água dH2O ou DI — água desionizada dIH2O água desionizada, filtração Milli-Q gougm gramas [To microgramas mg miligramas kg quilogramas uL eu! microlitros mLeml mililitros mm milímetros um micrômetro M molar mM milimolar pM micromolar U unidades Ss segundos min(s) minuto/minutos h(s) hora/horas EtoH etanol N normal MWCO valor de corte de peso molecular CAZy base de dados Carbohydrate-Active Enzymes
1.2.1. Definições
[0014] Os termos "amilase" ou "enzima amilolítica" se referem a uma enzima que é, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação de amido. As a-amilases são hidrolases que clivam as ligações a-D- (1—4) O-glicosídicas no amido. Geralmente, as a-amilases (EC 3.2.1.1; a-D-(1—4)-glucana glucano-hidrolase) são definidas como enzimas de atuação endo clivando as ligações a-D-(1—4) O-glicosídicas dentro da molécula de amido de um modo aleatório originando polissacarídeos contendo três ou mais unidades de D-glucose ligadas em (1-4)-a. Em contraste, as enzimas amilolíticas de atuação exo, tais como B-amilases (EC 3.2.1.2; a-D-(1—4)-glucana malto-hidrolase) e algumas amilases específicas de produtos como a-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), clivam a molécula de polissacarídeo a partir da extremidade não redu- tora do substrato. As B-amilases, a-glucosidases (EC 3.2.1.20; a-D-glu- cosídeo gluco-hidrolase), glucoamilase (EC 3.2.1.3; a-D-(1—4)-glucana gluco-hidrolase) e amilases específicas de produtos como as maltote-
traosidases (EC 3.2.1.60) e as malto-hexaosidases (EC 3.2.1.98) po- dem produzir malto-oligossacarídeos de um comprimento específico ou xaropes enriquecidos de malto-oligossacarídeos específicos.
[0015] O termo "amido" se refere a qualquer material compreendido pelos carboidratos de polissacarídeos complexos de plantas, compre- endidos por amilose e amilopectina com a fórmula (CsH10O5)«, em que X pode ser qualquer número. O termo inclui materiais à base de plantas tais como grãos, cereal, gramíneas, tubérculos e raízes e, mais especi- ficamente, materiais obtidos a partir de trigo, cevada, milho, centeio, ar- roz, sorgo, farelos, mandioca, milheto, milo, batata, batata-doce e tapi- oca. O termo "amido" inclui amido granular. O termo "amido granular" se refere a amido em bruto, i.e., não cozido, por exemplo, amido que não foi sujeito a gelatinização.
[0016] Como usado aqui, o termo "liquefação" ou "liquefazer" signi- fica um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas menos viscosas e de cadeia mais curta.
[0017] Os termos "tipo selvagem", "parental" ou "referência", no que refere-se a um polipeptídeo, se referem a um polipeptídeo ocorrendo naturalmente que não inclui uma substituição, inserção ou deleção feita pelo homem em uma ou mais posições de aminoácidos. Similarmente, os termos "tipo selvagem", "parental" ou "referência", no que refere-se a um polinucleotídeo, se referem a um polinucleotídeo ocorrendo natu- ralmente que não inclui uma mudança de nucleosídeos feita pelo ho- mem. No entanto se note que um polinucleotídeo codificando um poli- peptídeo de tipo selvagem, parental ou de referência não está limitado a um polinucleotídeo ocorrendo naturalmente e engloba qualquer poli- nucleotídeo codificando um polipeptídeo de tipo selvagem, parental ou de referência.
[0018] A referência ao polipeptídeo de tipo selvagem é entendida como incluindo a forma madura do polipeptídeo. Um polipeptídeo "ma- duro", ou sua variante, é um no qual uma sequência de sinal está au- sente, por exemplo, clivada a partir de uma forma imatura do polipeptí- deo durante a ou após expressão do polipeptídeo.
[0019] O termo "variante", no que refere-se a um polipeptídeo, se refere a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo de tipo selva- gem, parental ou de referência especificado na medida em que inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido ocorrendo naturalmente ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo "variante", no que refere-se a um polinucleotídeo, se refere a um poli- nucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucle- otídeo de tipo selvagem, parental ou de referência especificado. A iden- tidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo de tipo selvagem, parental ou de referência será aparente a partir do contexto.
[0020] No caso das presentes a-amilases, "atividade" se refere à atividade de a-amilase, que pode ser medida como descrito, aqui.
[0021] O termo "benefício de desempenho" se refere a uma melho- ria em uma propriedade desejável de uma molécula. Benefícios de de- sempenho exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, hidró- lise aumentada de um substrato de amido, desempenho aumentado de liquefação de grão, cereal ou outro substrato de amido, desempenho de limpeza aumentado, estabilidade térmica aumentada, estabilidade de detergente aumentada, estabilidade em armazenamento aumentada, solubilidade aumentada, um perfil de pH alterado, dependência de cál- cio diminuída, atividade específica aumentada, especificidade de subs- trato modificada, ligação de substrato modificada, atividade dependente de pH modificada, estabilidade dependente de pH modificada, estabili- dade oxidativa aumentada e expressão aumentada. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado a uma temperatura relativa- mente baixa. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado a uma temperatura relativamente elevada.
[0022] Os termos "protease" e "proteinase" se referem a uma prote- íÍna de enzima que tem a capacidade de realizar "proteólise" ou "cliva- gem proteolítica" que se refere à hidrólise de ligações de peptídeo que unem os aminoácidos em uma cadeia de peptídeos ou polipeptídeos formando a proteína. Esta atividade de uma protease como uma enzima de digestão de proteínas é referida como "atividade proteolítica".
[0023] O termo "serina protease" se refere a enzimas que clivam ligações de peptídeo em proteínas, nas quais a enzima serina serve como o aminoácido nucleofílico no local ativo da enzima. As serina pro- teases se encontram em duas amplas categorias com base em sua es- trutura: tipo quimotripsina (tipo tripsina) ou tipo subtilisina. As serina pro- teases, particularmente subtlisinas, são o mais comummente usadas em detergentes para lavagem de roupas e lavagem de louças.
[0024] "Variantes combinatoriais" são variantes compreendendo duas ou mais mutações, por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 ou mais, substituições, deleções e/ou inserções.
[0025] O termo "recombinante", quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor em questão, indica que o sujeito foi modificado a partir de seu estado nativo. Assim, por exemplo, as cé- lulas recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes na- tivos a níveis diferentes ou sob condições diferentes do que encontrado na natureza. Os ácidos nucleicos recombinantes diferem de uma se- quência nativa por um ou mais nucleotídeos e/ou estão operacional- mente ligados a sequências heterólogas, por exemplo, um promotor heterólogo em um vetor de expressão. As proteínas recombinantes po- dem diferir de uma sequência nativa por um ou mais aminoácidos e/ou estão fundidas a sequências heterólogas. Um vetor compreendendo um ácido nucleico codificando uma amilase é um vetor recombinante.
[0026] Os termos "recuperado", "isolado" e "separado" se referem a um composto, proteína (polipeptídeos), célula, ácido nucleico, aminoá- cido ou outro material ou componente especificado que é removido de pelo menos um outro material ou componente com o qual está natural- mente associado como encontrado na natureza. Um polipeptídeo "iso- lado", portanto, inclui, mas não está limitado a, um caldo de cultura con- tendo polipeptídeo secretado expresso em uma célula hospedeira hete- róloga.
[0027] O termo "purificado" se refere a material (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado) que está em um estado relati- vamente puro, por exemplo, pelo menos cerca de 90% puro, pelo me- nos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro ou mesmo pelo menos cerca de 99% puro.
[0028] O termo "enriquecido" se refere a material (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado) que é pelo menos cerca de 50% puro, pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro ou mesmo pelo menos cerca de 70% puro.
[0029] Os termos "termoestável" e "termoestabilidade", com refe- rência a uma enzima, se referem à capacidade da enzima de reter ativi- dade após exposição a uma temperatura elevada. A termoestabilidade de uma enzima, tal como uma enzima amilase, é medida por sua meia- vida (t1/2) dada em minutos, horas ou dias, durante a qual metade da atividade de enzima é perdida sob condições definidas. A meia-vida pode ser calculada por medição da atividade residual de a-amilase após exposição a (i.e., desafio por) uma temperatura elevada.
[0030] Uma "gama de pH", com referência a uma enzima, se refere à gama de valores de pH sob os quais a enzima exibe atividade catalí- tica.
[0031] Os termos "estável ao pH " e "estabilidade ao pH", com refe- rência a uma enzima, se relacionam com a capacidade da enzima de reter atividade ao longo de uma gama ampla de valores de pH durante um período de tempo predeterminado (por exemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).
[0032] O termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo dos termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" e é usado indistintamente. Onde tais sequências de aminoácidos exibem atividade podem ser referidas como "enzima". Os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos são usados, com sequências de amino- ácidos sendo apresentadas na orientação terminal amino-para-carbóxi padrão (i.e., NC).
[0033] O termo "ácido nucleico" engloba DNA, RNA, heteroduple- xes e moléculas sintéticas capazes de codificar um polipeptídeo. Os áci- dos nucleicos podem ter fita simples ou fita dupla e podem conter modi- ficações químicas. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente. Uma vez que o código genético é degenerado pode ser usado mais do que um códon para codificar um aminoácido particular, e as presentes composições e métodos englobam sequên- cias de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos par- ticular. A não ser que de outro modo indicado, as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas na orientação 5'-para-3'.
[0034] "Hibridação" se refere ao processo pelo qual uma fita de áci- dos nucleicos forma um dúplex com, i.e., emparelha em termos de ba- ses com, uma fita complementar, como ocorre durante as técnicas de hibridação por transferência e técnicas de PCR. As condições de hibri- dação estringentes são exemplificadas por hibridação sob as seguintes condições: 65 ºC e 0,1X SSC (onde 1X SSC = NaCl a 0,15 M, citrato de Na; a 0,015 M, pH 7,0). Os ácidos nucleicos em dúplex, hibridados são caracterizados por uma temperatura de fusão (Tm), onde uma metade dos ácidos nucleicos hibridados está desemparelhada com a fita com-
plementar. Os nucleotídeos não correspondidos dentro do dúplex bai- xam a Tm. Um ácido nucleico codificando uma a-amilase variante pode ter uma Tm reduzida em 1 ºC - 3 ºC ou mais em comparação com um dúplex formado entre o nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 e seu comple- mento idêntico.
[0035] Uma molécula "sintética" é produzida por síntese química ou enzimática in vitro em vez de por um organismo.
[0036] Os termos "transformada", "estavelmente transformada" e "transgênica" usados com referência a uma célula significam que a cé- lula contém uma sequência de ácidos nucleicos não nativa (por exem- plo, heteróloga) integrada no seu genoma ou transportada como um epissoma que é mantido ao longo de múltiplas gerações.
[0037] O termo "introduzido", no contexto de inserção de uma se- quência de ácidos nucleicos em uma célula, significa "transfecção", "transformação" ou "transdução", como conhecido na técnica.
[0038] Uma "estirpe hospedeira" ou "célula hospedeira" é um orga- nismo no qual um vetor de expressão, fago, vírus ou outro construto de DNA, incluindo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de inte- resse (por exemplo, uma amilase), foi introduzido. Estirpes hospedeiras exemplificativas são células de microrganismos (por exemplo, bacté- rias, fungos filamentosos e levedura) capazes de expressarem o poli- peptídeo de interesse e/ou fermentarem sacarídeos. O termo "célula hospedeira" inclui protoplastos criados a partir de células.
[0039] O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre na- turalmente em uma célula hospedeira.
[0040] O termo "endógeno" com referência a um polinucleotídeo ou proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre natural- mente na célula hospedeira.
[0041] O termo "expressão" se refere ao processo pelo qual um po- lipeptídeo é produzido com base em uma sequência de ácidos nuclei- cos. O processo inclui tanto transcrição como tradução.
[0042] Um "marcador seletivo" ou "marcador selecionável" se refere a um gene capaz de ser expresso em um hospedeiro para facilitar a seleção de células hospedeiras carregando o gene. Exemplos de mar- cadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a antimicrobia- nos (por exemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutri- cional, à célula hospedeira.
[0043] Um "vetor" se refere a uma sequência de polinucleotídeos desenhada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de cé- lula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores vai-vem, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e similares.
[0044] Um "vetor de expressão" se refere a um construto de DNA compreendendo uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo de interesse, sequência de codificação essa que está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a ex- pressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de con- trole podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequên- cia operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência co- dificando locais de ligação a ribossomo adequados no mRNA, intensifi- cadores e sequências que controlam a terminação da transcrição e tra- dução.
[0045] O termo "operacionalmente ligado" significa que os compo- nentes especificados estão em uma relação (incluindo mas não se limi- tando a justaposição) permitindo que os mesmos funcionem de uma maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência reguladora está ope- racionalmente ligada a uma sequência codificante tal que a expressão da sequência codificante esteja sob controle das sequências regulado- ras.
[0046] Uma "sequência de sinal" é uma sequência de aminoácidos anexada à porção N-terminal de uma proteína, que facilita a secreção da proteína fora da célula. A forma madura de uma proteína extracelular não tem a sequência de sinal, que é removida por clivagem durante o processo de secreção.
[0047] "Biologicamente ativo" se refere a uma sequência tendo uma atividade biológica especificada, tal como atividade enzimática.
[0048] O termo "atividade específica" se refere ao número de moles de substrato que pode ser convertido em produto por uma enzima ou preparação de enzimas por unidade de tempo sob condições especiífi- cas. A atividade específica é geralmente expressa como unidades (U)/mg de proteína.
[0049] Como usado aqui, "dureza da água" é uma medição dos mi- nerais (por exemplo, cálcio e magnésio) presentes na água.
[0050] Uma "amostra" é um pedaço de material tal como um tecido que tem uma nódoa aplicada ao mesmo. O material pode ser, por exem- plo, tecidos produzidos a partir de algodão, poliéster ou misturas de fi- bras naturais e sintéticas. A amostra pode ser adicionalmente papel, tal como papel de filtro ou nitrocelulose, ou um pedaço de um material duro tal como cerâmica, metal ou vidro. Para amilases, a nódoa é à base de amido, mas pode incluir sangue, leite, tinta, gramínea, chá, vinho, espi- nafre, molho, chocolate, ovo, queijo, argila, pigmento, óleo ou misturas destes compostos.
[0051] Uma "amostra mais pequena" é uma seção da amostra que foi cortada com um dispositivo de perfuração de orifício único ou foi cor- tada com um dispositivo de perfuração de 96 orifícios personalizado, onde o padrão da perfuração de múltiplos orifícios é correspondido às placas de microtitulação de 96 poços padrão, ou a seção foi de outro modo removida da amostra. A amostra pode ser de têxtil, papel, metal ou outro material adequado. A amostra mais pequena pode ter a nódoa afixada antes de ou após ser colocada no poço de uma placa de micro- titulação de 24, 48 ou 96 poços. A amostra mais pequena pode ser tam- bém produzida por aplicação de uma nódoa a um pequeno pedaço de material. Por exemplo, a amostra mais pequena pode ser um pedaço enodoado de tecido com 5/8" ou 0,25" em diâmetro. A perfuração per- sonalizada é desenhada de uma tal maneira que entregue 96 amostras simultaneamente a todos os poços de uma placa de 96 poços. O dispo- sitivo permite entrega de mais do que uma amostra por poço por carga simples da mesma placa de 96 poços múltiplas vezes. Os dispositivos de perfuração de múltiplos orifícios podem ser concebidos para entregar simultaneamente amostras a qualquer placa de formato, incluindo mas não se limitando a placas de 24 poços, 48 poços e 96 poços. Em outro método concebível, a plataforma de teste manchada pode ser uma es- férula produzida a partir de metal, plástico, vidro, cerâmica ou outro ma- terial adequado que é revestido com o substrato de mancha. A uma ou mais esférulas revestidas são depois colocadas nos poços de placas de 96, 48 ou 24 poços ou formatos maiores, contendo tampão e enzima adequados.
[0052] "Um material de células cultivadas compreendendo uma amilase" ou linguagem similar se refere a um lisato de células ou sobre- nadante (incluindo meios) que inclui uma amilase como um compo- nente. O material de células pode ser de um hospedeiro heterólogo que é cultivado em cultura para o propósito de produzir a amilase.
[0053] "Percentagem de identidade de sequências" significa que uma sequência particular tem pelo menos uma certa percentagem de resíduos de aminoácidos idênticos àqueles em uma sequência de refe- rência especificada, quando alinhadas usando o algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res.
22: 4673-4680. Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade de abertura de lacuna: 10,0 Penalidade de extensão de lacuna: 0,05 Matriz de ponderação de proteína: série BLOSUM Matriz de ponderação de DNA: IUB % de sequências divergentes de retardamento: 40 Distância de separação de lacuna: 8 Ponderação de transições de DNA: 0,50 Resíduos hidrofílicos de lista: GPSNDQEKR Usar matriz negativa: DESLIGADO Alternar Penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade de separação de lacuna de extremidade DESLIGADO.
[0054] As deleções são contadas como resíduos não idênticos, em comparação com uma sequência de referência.
[0055] As sequências de polipeptídeos "fundidas" estão conecta- das, i.e., operacionalmente ligadas, através de uma ligação de peptídeo entre duas sequências de polipeptídeos em questão.
[0056] O termo "fungos filamentosos" se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina, particularmente a espécie Pe- zizomycotina.
[0057] O termo "conteúdo de sólidos secos" (ds) se refere aos sóli- dos totais de uma pasta semifluida em uma base de percentagem em peso seco. O termo "pasta semifluida" se refere a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.
[0058] A frase "sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)" se refere a um processo na produção de bioquímicos no qual um orga- nismo microbiano, tal como um microrganismo etanologênico, e pelo menos uma enzima, tal como uma amilase, estão presentes durante o mesmo passo de processo. A SSF inclui a hidrólise contemporânea de substratos de amido (granular, liquefeito ou solubilizado) até sacarí- deos, incluindo glucose, e a fermentação dos sacarídeos até álcool ou outro bioquímico ou biomaterial no mesmo vaso de reator.
[0059] Um "microrganismo etanologênico" se refere a um microrga- nismo com a capacidade de converter um açúcar ou oligossacarídeo em etanol.
[0060] O termo "bebida fermentada" se refere a qualquer bebida produzida por um método compreendendo um processo de fermenta- ção, tal como uma fermentação microbiana, por exemplo, uma fermen- tação bacteriana e/ou fúngica. "Cerveja" é um exemplo de uma tal be- bida fermentada, e o termo "cerveja" se destina a compreender qualquer mosto fermentado produzido por fermentação/infusão de um material vegetal contendo amido. Frequentemente, a cerveja é produzida exclu- sivamente a partir de malte ou adjunto ou qualquer combinação de malte e adjunto.
[0061] O termo "malte" se refere a qualquer grão de cereal maltado, tal como cevada ou trigo maltado.
[0062] O termo "adjunto" se refere a qualquer material vegetal con- tendo amido e/ou açúcar que não seja malte, tal como malte de trigo ou cevada. Exemplos de adjuntos incluem grãos prontos para moagem de milho comuns, grãos prontos para moagem de milho refinados, levedura moída de cerveja, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal torrificado, flocos de cereal, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xaropes, tais como xarope de milho, xarope de cana-de-açúcar, xarope de açúcar invertido, xaropes de cevada e/ou trigo e similares.
[0063] O termo "farelada" se refere a uma pasta semifluida aquosa de qualquer material vegetal contendo amido e/ou açúcar, tal como grão pronto para moagem, por exemplo, compreendendo malte de cevada esmagada, cevada esmagada e/ou outro adjunto ou uma sua combina- ção, misturados com água para serem posteriormente separados em mosto e grãos gastos.
[0064] O termo "mosto" se refere ao escoamento de licor não fer- mentado após extração do grão pronto para moagem durante a brassa- gem.
[0065] O termo "cerca de" se refere a + 15% em relação ao valor referenciado.
2. Variantes de a-amilase
[0066] Um aspecto das presentes composições e métodos é enzi- mas a-amilase variantes que incluem combinações de mutações que melhoram seu desempenho em aplicações industriais. As variantes são o mais intimamente relacionadas com uma a-amilase de uma Bacillus Sp. 707, aqui, referida como "Amy707". A sequência de aminoácidos de a- de Amy707 é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 1:
[0067] Em algumas modalidades, a a-amilase variante é Amy707- 3790H, tendo a sequência de aminoácidos mostrada embaixo, como SEQ ID NO: 2:
[0068] Em algumas modalidades, a a-amilase variante tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AA560 de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes conhecidas. Em modalidades particulares, a a-amilase variante tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2.
[0069] Em algumas modalidades, a a-amilase variante é Amy707- 2170D, tendo a sequência de aminoácidos mostrada embaixo, como SEQ ID NO: 3:
[0070] Em algumas modalidades, a a-amilase variante tem pelo me- nos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 3, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AA560 de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas va- riantes conhecidas. Em modalidades particulares, a a-amilase variante tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 3.
[0071] Em algumas modalidades, a a-amilase variante é Amy707- 4037D, tendo a sequência de aminoácidos mostrada embaixo, como SEQ ID NO: 4:
RTGTVTINSDGWGQFFVNGGSVSIWVNK Em algumas modalidades, a a-amilase variante tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoáci- dos com SEQ ID NO: 4, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AASG6O de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes co- nhecidas. Em modalidades particulares, a a-amilase variante tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 4.
[0072] Em algumas modalidades, a a-amilase variante é Amy707- 3156D, tendo a sequência de aminoácidos mostrada embaixo, como SEQ ID NO: 5:
VTINADGWGQFFVNGGSVSIWVNK Em algumas modalidades, a a-amilase variante tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoáci- dos com SEQ ID NO: 5, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AASG6O de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes co- nhecidas. Em modalidades particulares, a a-amilase variante tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 5.
[0073] Em algumas modalidades, a a-amilase variante é Amy707- 3915D, tendo a sequência de aminoácidos mostrada embaixo, como SEQ ID NO: 6:
VTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK Em algumas modalidades, a a-amilase variante tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoáci- dos com SEQ ID NO: 6, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AASG6O de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes co- nhecidas. Em modalidades particulares, a a-amilase variante tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 6.
[0074] A sequência de aminoácidos da a-amilase de Bacillus sp. AAB560 é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 7:
[0075] Um alinhamento de sequências de aminoácidos por Clustal W de Amy707, Amy707-3790H, Amy707-2170D, Amy707-4037D, Amy707-3156D e Amy707-3915D é mostrado na Figura 1.
[0076] As presentes amilases podem incluir qualquer número de substituições de aminoácidos conservativas. Substituições de aminoá- cidos conservativas são listadas na Tabela 1: Tabela 1. Substituições de aminoácidos conservativas Para o Aminoá- | Código | Substituir por qualquer um de [at a Arginina D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, A pele [sans [5 Tom A Aa Gu DOR GR DER [aan ja nona DA GUDaNARDAS — | [asso cuamio e non DA a As DA an Dan [ssa qr otevarova ter pres Merome — Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D- o leusemendos TO Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4 ou 5-fenilprolina, cis-3,4 oo eee
Para o Aminoá- | Código | Substituir por qualquer um de [at as Prolina D-Pro, ácido L-I-tioazolidina-4-carboxílico, ácido D- O Tatiommiameno Serina Ss D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D- E oras Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, DO omumoraovana
[0077] Será apreciado que algumas das mutações conservativas mencionadas acima podem ser produzidas por manipulação genética, enquanto outras são produzidas por introdução de aminoácidos sintéti- cos em um polipeptídeo por genética ou outro meio.
[0078] A presente amilase pode ser também derivada de qualquer uma das variantes de amilase descritas acima por substituição, deleção ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos, por exemplo menos do que 10, menos do que 9, menos do que 8, menos do que 7, menos do que 6, menos do que 5, menos do que 4, menos do que 3 ou mesmo menos do que 2 substituições, deleções ou adições. Tais variantes devem ter a mesma atividade que a amilase a partir da qual foram derivadas.
[0079] As presentes amilases podem ser "precursoras", "imaturas" ou "de comprimento total", caso esse em que incluem uma sequência de sinal, ou "maduras", caso esse em que não têm uma sequência de sinal. As formas maduras dos polipeptídeos são geralmente as mais úteis. A não ser de outro modo notado, a numeração de resíduos de aminoácidos usada aqui se refere às formas maduras dos respectivos polipeptídeos de amilase. Os presentes polipeptídeos de amilase po- dem ser também truncados para se removerem aos terminais N ou C, desde que os polipeptídeos resultantes retenham atividade de amilase.
[0080] A presente amilase pode ser um polipeptídeo "quimérico", "híbrido" ou com "troca de domínios", na medida em que inclui pelo me- nos uma porção de um primeiro polipeptídeo de amilase e pelo menos uma porção de um segundo polipeptídeo de amilase. As presentes ami- lases podem incluir adicionalmente sequência de sinal heteróloga, um epítopo para permitir rastreamento ou purificação ou similares. Sequên- cias de sinal heterólogas exemplificativas são de amilase de B. licheni- formis (LAT), B. subtilis (AMyE ou AprE) e Streptomyces CelA.
2.5. Nucleotídeos codificando polipeptídeos de amilase variantes
[0081] Em outro aspecto são proporcionados ácidos nucleicos codi- ficando um polipeptídeo de amilase variante. O ácido nucleico pode co- dificar um polipeptídeo de amilase particular ou uma amilase tendo um grau especificado de identidade de sequências de aminoácidos com a amilase particular.
[0082] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma amilase tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de iden- tidade de sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, 3,4, 5 ou6. Será apreciado que, devido à degeneração do código genético, uma pluralidade de ácidos nucleicos pode codificar o mesmo polipeptídeo.
[0083] Em algumas modalidades, o próprio ácido nucleico tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 ou 12, que são mos- tradas, em baixo.
[0084] Em algumas modalidades, o ácido nucleico hibrida sob con- dições estringentes ou muito estringentes com um ácido nucleico codi-
ficando (ou complementar a um ácido nucleico codificando) uma ami- lase tendo pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 ou 12.
[0085] A sequência de DNA codificando a forma madura de Amy707-3790H é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 8:
[0086] A sequência de DNA codificando a forma madura de Amy707-2170D é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 9:
[0087] A sequência de DNA codificando a forma madura de Amy707-4037D é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 10:
[0088] A sequência de DNA codificando a forma madura de Amy707-3156D é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 11:
[0089] A sequência de DNA codificando a forma madura de Amy707-3915D é mostrada, em baixo, como SEQ ID NO: 12:
3. Produção de Amilases Variantes
[0090] As presentes amilases variantes podem ser produzidas em células hospedeiras, por exemplo, por secreção ou expressão intrace- lular, usando métodos bem conhecidos na técnica. As técnicas de fer- mentação, separação e concentração são bem conhecidas na técnica e métodos convencionais podem ser usados para preparar uma solução contendo polipeptídeo de a-amilase variante, concentrada.
[0091] Para recuperação à escala da produção, os polipeptídeos de a-amilase variantes podem ser enriquecidos ou parcialmente purifica- dos como geralmente descrito acima por remoção de células através de floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enrique- cida ou purificada por microfiltração seguida por concentração por ultra- filtração usando membranas e equipamentos disponíveis. No entanto, para algumas aplicações, a enzima não necessita de ser enriquecida ou purificada e a cultura de caldo inteira pode ser lisada e usada sem tra- tamento adicional. A enzima pode ser depois processada, por exemplo, em grânulos.
4. Composições e Usos de Amilases Variantes
[0092] As amilases variantes são úteis para uma variedade de apli- cações industriais. Por exemplo, as amilases variantes são úteis em um processo de conversão de amido, particularmente em um processo de sacarificação de um amido que foi sujeito a liquefação. O produto final desejado pode ser qualquer produto que possa ser produzido pela con- versão enzimática do substrato de amido. Por exemplo, o produto dese- jado pode ser um xarope rico em glucose e maltose, que pode ser usado em outros processos, tais como a preparação de HFCS, ou que pode ser convertido em um número de outros produtos úteis, tais como inter- mediários de ácido ascórbico (por exemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L- gulônico; 5-ceto-gluconato; e 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilalanina e tripto- fano); ácidos orgânicos (por exemplo, lactato, piruvato, succinato, iso- citrato e oxaloacetato); aminoácidos (por exemplo, serina e glicina); an- tibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; e hormônios.
[0093] O processo de conversão de amido pode ser um precursor de, ou simultâneo com, um processo de fermentação desenhado para produzir álcool para combustível ou bebida (i.e., álcool potável). Um pe- rito na técnica está ciente de várias condições de fermentação que po- dem ser usadas na produção destes produtos finais. As amilases vari- antes podem ser também úteis em composições e métodos de prepara- ção alimentar. Estes vários usos de amilases variantes são descritos em mais detalhe em baixo.
4.1. Preparação de Substratos de Amido
[0094] Métodos para preparação de substratos de amido para uso nos processos divulgados aqui são bem conhecidos. Substratos de amido úteis podem ser obtidos de, por exemplo, tubérculos, raízes, cau- les, leguminosas, cereais ou grão inteiro. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido de milho, espigas, trigo, cevada, centeio, triti- cale, milo, sagu, milheto, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. O milho contém cerca de 60-68% de amido; a cevada con- tém cerca de 55-65% de amido; o milheto contém cerca de 75-80% de amido; o trigo contém cerca de 60-65% de amido; e o arroz polido con- tém 70-72% de amido. Substratos de amido especificamente contem- plados são amido de milho e amido de trigo. O amido de um grão pode ser triturado ou inteiro e inclui sólidos do milho, tais como miolos, farelo e/ou sabugos. O amido pode ser também amido em bruto altamente refinado ou matéria-prima de processos de refinaria de amido.
4.2. Gelatinização e Liquefação de Amido
[0095] A gelatinização é geralmente realizada simultaneamente com, ou seguida por, contato de um substrato de amido com uma a- amilase, embora possam ser adicionadas opcionalmente enzimas indu- toras da liquefação. Em algumas modalidades, o substrato de amido preparado como descrito acima é empastado com água. A pasta semi- fluida de amido pode conter amido como uma percentagem em peso de sólidos secos de cerca de 10-55%, cerca de 20-45%, cerca de 30-45%, cerca de 30-40% ou cerca de 30-35%. A a-amilase pode ser adicionada à pasta semifluida, com uma bomba medidora, por exemplo. Para se otimizar a estabilidade e atividade da a-amilase, o pH da pasta semiflu- ida é tipicamente ajustado até cerca de pH 4,5-6,5 e cerca de 1 mM de cálcio (cerca de 40 ppm de íons de cálcio livres) pode ser também adi- cionado, dependendo das propriedades da amilase usada. A a-amilase restante na pasta semifluida após liquefação pode ser desativada atra- vés de um número de métodos, incluindo diminuição do pH em um passo de reação subsequente ou por remoção de cálcio a partir da pasta semifluida nos casos onde a enzima está dependente do cálcio.
[0096] A pasta semifluida de amido mais a a-amilase pode ser bom- beada continuamente através de um cozidor a jato, que é aquecido por vapor até 105 ºC. É depois permitido que a pasta semifluida resfrie até à temperatura ambiente. Este passo de resfriamento pode ser 30 minu- tos a 180 minutos, por exemplo, 90 minutos a 120 minutos. O amido liquefeito está tipicamente na forma de uma pasta semifluida tendo um conteúdo de sólidos secos (p/p) de cerca de 10-50%; cerca de 10-45%; cerca de 15-40%; cerca de 20-40%; cerca de 25-40%; ou cerca de 25- 35%.
[0097] A liquefação com amilases variantes pode ser vantajosa- mente conduzida a baixo pH, eliminando o requisito de se ajustar o pH até cerca de pH 5,5-6,5. As amilases variantes podem ser usadas para liquefação a uma gama de pH de 2 a 7, por exemplo, pH 3,0-7,5, pH 4,0-6,0 ou pH 4,5-5,8. As amilases variantes podem manter a atividade de liquefação a uma gama de temperaturas de cerca de 85 º*C-95 “ºC, por exemplo, 85 ºC, 90 ºC ou 95 ºC. Por exemplo, a liquefação pode ser conduzida com 800 ug de uma amilase em uma solução de amido de milho com DS a 25% durante 10 min a pH 5,8 e 85 ºC ou pH 4,5 e 95 ºC, por exemplo. A atividade de liquefação pode ser avaliada usando qualquer um de um número de ensaios de viscosidade conhecidos na técnica.
[0098] Em modalidades particulares usando as presentes amilases variantes, a liquefação de amido é realizada a uma gama de tempera- turas de 90-115 ºC, para o propósito de se produzirem xaropes de glu- cose de elevada pureza, HFCS, maltodextrinas, etc.
4.3. Sacarificação
[0099] O amido liquefeito pode ser sacarificado em um xarope que é rico em sacarídeos de DP mais baixo (por exemplo, DP1 + DP2), usando amilases variantes, opcionalmente na presença de outra(s) en- zima(s). A composição exata dos produtos de sacarificação depende da combinação de enzimas usada, bem como do tipo de amido granular processado. Vantajosamente, o xarope obtenível usando as amilases variantes proporcionadas pode conter uma percentagem em peso de DP?2 dos oligossacarídeos totais no amido sacarificado excedendo 30%, por exemplo, 45%-65% ou 55%-65%. A percentagem em peso de (DP1 + DP2) no amido sacarificado pode exceder cerca de 70%, por exemplo, 75%-85% ou 80%-85%. As presentes amilases produzem também um rendimento relativamente elevado de glucose, por exemplo, DP1 > 20%, no produto de xarope.
[00100] Ao passo que a liquefação seja geralmente operada como um processo contínuo, a sacarificação é frequentemente conduzida como um processo descontínuo. A sacarificação é tipicamente o mais eficaz a temperaturas de cerca de 60-65 “ºC e um pH de cerca de 4,0- 4,5, por exemplo, pH 4,3, necessitando de resfriamento e ajuste do pH do amido liquefeito. A gama de temperaturas e pH pode variar depen- dendo das propriedades das enzimas. A sacarificação pode ser reali- zada, por exemplo, a uma temperatura entre cerca de 40 ºC, cerca de 50 ºC ou cerca de 55 “ºC a cerca de 60 ºC ou cerca de 65 ºC. A sacari- ficação é normalmente conduzida em tanques agitados, que podem le- var várias horas a encher ou esvaziar. As enzimas são tipicamente adi- cionadas a uma razão fixa a sólidos secos à medida em que os tanques são cheios ou adicionadas como uma dose única no início da etapa de enchimento. Uma reação de sacarificação para preparar um xarope é tipicamente operada ao longo de cerca de 24-72 horas, por exemplo, 24-48 horas. Quando um DE máximo ou desejado tiver sido alcançado, a reação é parada por aquecimento até 85 ºC durante 5 min , por exem- plo. A incubação adicional resultará em um DE mais baixo, eventual- mente até cerca de 90 DE, à medida que a glucose acumulada repoli- meriza até isomaltose e/ou outros produtos de reversão através de uma reação de reversão enzimática e/ou com a abordagem de equilíbrio ter- modinâmico. Quando se usa uma amilase, a sacarificação é otimamente conduzida a uma gama de temperaturas de cerca de 30 ºC a cerca de 75 "ºC, por exemplo, 45 ºC-75 ºC ou 47 ºC-74 ºC. A sacarificação pode ser conduzida ao longo de uma gama de pH de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, pH 3,0-pH 7,5, pH 3,5-pH 5,5, pH 3,5, pH 3,8 ou pH 4,5.
[00101] Uma a-amilase pode ser adicionada à pasta semifluida na forma de uma composição. Uma a-amilase pode ser adicionada a uma pasta semifluida de um substrato de amido granular em uma quantidade de cerca de 0,6 - 10 ppm de ds, por exemplo, 2 ppm de ds. Uma a- amilase pode ser adicionada como uma enzima de caldo inteiro, clarifi- cada, enriquecida, parcialmente purificada ou purificada. A atividade es- pecífica da amilase pode ser cerca de 300 U/mg de enzima, por exem- plo, medida com o ensaio PAHBAH. A a-amilase pode ser também adi- cionada como um produto de caldo inteiro.
[00102] Uma o-amilase pode ser adicionada à pasta semifluida como uma solução de enzima isolada. Por exemplo, uma a-amilase pode ser adicionada na forma de um material de células cultivadas produzido por células hospedeiras expressando uma amilase. Uma a-amilase pode ser também secretada por uma célula hospedeira no meio de reação durante o processo de fermentação ou SSF, tal que a enzima seja pro- porcionada continuamente à reação. A célula hospedeira produzindo e secretando amilase pode também expressar uma enzima adicional, tal como uma glucoamilase. Por exemplo, a Patente dos E.U.A. 5,422,267 divulga o uso de uma glucoamilase em levedura para produção de be- bidas alcoólicas. Por exemplo, uma célula hospedeira, por exemplo, Tri- choderma reesei ou Aspergillus niger, pode ser geneticamente modifi- cada para coexpressar uma a-amilase e uma glucoamilase, por exem- plo, HgGA, TrGA ou uma variante de TrGA, durante a sacarificação. À célula hospedeira pode ser geneticamente modificada de modo a não expressar sua glucoamilase endógena e/ou outras enzimas, proteínas ou outros materiais. A célula hospedeira pode ser manipulada para ex- pressar um amplo espectro de várias enzimas sacarolíticas. Por exem- plo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode compreender ácidos nucleicos codificando uma glucoamilase, uma alfa-glucosidase, uma enzima que utiliza o açúcar pentose, uma a-amilase, uma pulula- nase, uma isoamilase e/ou uma isopululanase. Ver, por exemplo, WO 2011/153516 A2.
4.4. ISsomerização
[00103] O hidrolisado de amido solúvel produzido por tratamento com amilase pode ser convertido em xarope à base de amido com ele- vado conteúdo de frutose (HFSS), tal como xarope de milho com ele- vado conteúdo de frutose (HFCS). Esta conversão pode ser alcançada usando uma glucose isomerase, particularmente uma glucose isome- rase imobilizada em um suporte sólido. O pH é aumentado até cerca de 6,0 a cerca de 8,0, por exemplo, pH 7,5 (dependendo da isomerase), e o Ca?* é removido por troca iônica. Isomerases adequadas incluem SWEETZYMES, IT (Novozymes A/S); G-ZYMEº IMGI, e G-ZYME?º G993, KETOMAX?, G-ZYME?º G993, G-ZYMEº G993 líquido e GENSWEET?º IGI. Após isomerização, a mistura contém tipicamente cerca de 40-45% de frutose, por exemplo, 42% de frutose.
4.5. Fermentação
[00104] O hidrolisado de amido solúvel, particularmente um xarope rico em glucose, pode ser fermentado por contato do hidrolisado de amido com um organismo fermentador tipicamente a uma temperatura em torno de 32 ºC, tal como de 30 ºC a 35 ºC para levedura produtora de álcool. A temperatura e pH da fermentação dependerão do orga- nismo fermentador. Os produtos de EOF incluem metabolitos, tais como ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, ácido itacônico e outros ácidos carboxílicos, glucono delta-lac- tona, eritorbato de sódio, lisina e outros aminoácidos, ácido graxo de ômega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol e outros biomateriais.
[00105] Os microrganismos etanologênicos incluem leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae e bactérias, por exemplo, Zymomonas moblis, expressando álcool desidrogenase e piruvato descarboxilase. O microrganismo etanologênico pode expressar xilose redutase e xilitol desidrogenase, que convertem xilose em xilulose. Estirpes melhoradas de microrganismos etanologênicos, que podem suportar temperaturas mais elevadas, por exemplo, são conhecidas na técnica e podem ser usadas. Ver Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27: 1049-
56. Fontes comerciais de levedura incluem ETHANOL REDG (LeSaf- fre); FERMAXTY (Martrex), THERMOSACCOPO (Lallemand); RED STARO (Red Star); FERMIOLGO (DSM Specialties); e SUPERSTARTO (Alltech). Microrganismos que produzem outros metabolitos, tais como ácido cí- trico e ácido láctico, por fermentação são também conhecidos na téc- nica. Ver, por exemplo, Papagianni (2007) Biotechnol. Adv. 25: 244-63; John et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27: 145-52.
[00106] Os processos de sacarificação e fermentação podem ser le- vados em consideração como um processo SSF. A fermentação pode compreender enriquecimento, purificação e recuperação subsequentes de etanol, por exemplo. Durante a fermentação, o conteúdo de etanol do caldo ou "cerveja" pode alcançar cerca de 8-18% v/v, por exemplo, 14-15% v/v. O caldo pode ser destilado para produzir soluções de etanol enriquecidas, por exemplo, 96% puras. Adicionalmente, o CO> gerado por fermentação pode ser coletado com um purificador de CO>2, compri- mido e comercializado para outros usos, por exemplo, carbonação de bebidas ou produção de gelo seco. O refugo sólido do processo de fer- mentação pode ser usado como produtos ricos em proteína, por exem- plo, alimentação de gado.
[00107] Como mencionado acima, um processo SSF pode ser con- duzido com células fúngicas que expressam e secretam amilase conti- nuamente ao longo de SSF. As células fúngicas expressando amilase podem também ser o microrganismo fermentador, por exemplo, um mi- crorganismo etanologênico. A produção de etanol pode ser assim le- vada a cabo usando uma célula fúngica que expressa amilase suficiente tal que menos ou nenhuma enzima tenha de ser adicionada exogena- mente. A célula hospedeira fúngica pode ser de uma estirpe fúngica apropriadamente manipulada. Células hospedeiras fúngicas que ex- pressam e secretam outras enzimas, adicionalmente à amilase, podem ser também usadas. Tais células podem expressar glucoamilase e/ou uma pululanase, fitase, alfa-glucosidase, isoamilase, beta-amilase, ce- lulase, xilanase, outras hemicelulases, protease, beta-glucosidase, pec- tinase, esterase, enzimas redox, transferase ou outra enzima.
[00108] Uma variação em «este processo é um sistema de "fermenta- ção descontínua alimentada", onde o substrato é adicionado em incre- mentos à medida que a fermentação progride. Os sistemas descontí- nuos alimentados são úteis quando a repressão de catabolitos pode ini- bir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limi-
tadas de substrato no meio. A concentração de substrato real em siste- mas descontínuos alimentados é estimada pelas mudanças de fatores mensuráveis tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases de refugo, tais como CO». As fermentações descontínuas e des- contínuas alimentadas são comuns e bem conhecidas na técnica.
[00109] A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultanea- mente para processamento. A fermentação contínua mantém, geral- mente, as culturas a uma densidade elevada constante onde as células estão maioritariamente em crescimento de fase log. A fermentação con- tínua permite a modulação do crescimento de células e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante tal como a fonte de car- bono ou fonte de nitrogênio é mantido a uma taxa fixa e é permitido que todos os outros parâmetros se moderem. Como o crescimento é man- tido em um estado estacionável, a perda de células devido ao meio ser retirado deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento de células na fermentação. Métodos de otimização dos processos de fermentação contínuos e maximização da taxa de formação de produto são bem co- nhecidos na técnica de microbiologia industrial.
4.6. Composições Compreendendo Amilases Variantes
[00110] As amilases variantes podem ser combinadas com uma glu- coamilase (EC 3.2.1.3), por exemplo, uma glucoamilase de Tricho- derma ou sua variante. Uma glucoamilase exemplificativa é glucoami- lase de Trichoderma reesei (TTGA) e suas variantes que possuem ativi- dade específica e estabilidade térmica superiores. Ver Pedidos Publica- dos dos E.U.A. Nos. 2006/0094080, 2007/0004018 e 2007/0015266 (Danisco US Inc.). Variantes adequadas de TrGA incluem aquelas com atividade de glucoamilase e pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequências com TrGA de tipo selvagem.
As amilases variantes aumentam vantajosamente o rendimento de glu- cose produzida em um processo de sacarificação catalisado por TrGA.
[00111] — Alternativamente, a glucoamilase pode ser Aspergillus, Tala- romyces, Clostridium, Fusarium, Thielavia, Thermomyces, Athelia, Hu- micola, Penicillium, Artomyces, Gloeophyllum, Pycnoporus, Steccheri- num, Trametes, etc. Glucoamilases comerciais adequadas incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN'Y SUPER e AMGTY E (Novozymes); OP- TIDEXº 300 e OPTIDEX L-400 (Danisco US Inc.); AMIGASETY e AMI- GASET!" PLUS (DSM); G-ZYMEº G900 (Enzyme Bio-Systems); e G- ZYMEº? G990 ZR. As glucoamilases são tipicamente adicionadas em uma quantidade de cerca de 0,1-2 unidades de glucoamilase (GAU)/g de ds, por exemplo, cerca de 0,16 GAU/g de ds, 0,23 GAU/g de ds ou 0,33 GAU/g de ds.
[00112] —Outrasenzimas adequadas que podem ser usadas com ami- lase incluem fitase, protease, pululanase, B-amilase, isoamilase, a-glu- cosidase, celulase, xilanase, outras hemicelulases, B-glucosidase, transferase, pectinase, lipase, cutinase, esterase, enzimas redox, uma a-amilase diferente ou uma sua combinação.
[00113] As composições compreendendo as presentes amilases po- dem ser formulações aquosas ou não aquosas, grânulos, pós, géis, pas- tas semifluidas, pastas, etc. que podem compreender adicionalmente qualquer uma ou mais das enzimas listadas adicionais, aqui, em con- junto com tampões, sais, conservantes, água, cossolventes, tensoativos e similares. Tais composições podem funcionar em combinação com enzimas endógenas ou outros ingredientes já presentes em uma pasta semifluida, banho de água, máquina de lavar, produto alimentar ou de bebida, etc., por exemplo, enzimas vegetais endógenas (incluindo de alga), enzimas residuais de um passo de processamento prévio e simi- lares.
5. Composições e Métodos para Cozimento e Preparação de Ali- mentos
[00114] Apresente invenção se relaciona também com uma "compo- sição alimentar", incluindo mas não se limitando a um produto alimentar, ração animal e/ou aditivos alimentares/de ração, compreendendo uma amilase e métodos para preparação de uma tal composição alimentar compreendendo mistura de amilase variante com um ou mais ingredi- entes alimentares ou seus usos.
[00115] Além do mais, a presente invenção se relaciona com o uso de uma amilase na preparação de uma composição alimentar, em que a composição alimentar é cozida subsequente à adição do polipeptídeo da invenção. Como usado aqui, o termo "composição de cozimento" sig- nifica qualquer composição e/ou aditivo preparado no processo de pro- porcionar de um produto alimentar cozido, incluindo mas não se limi- tando a farinha de panificação, uma massa, um aditivo de cozimento e/ou um produto cozido. A composição ou aditivo alimentar pode ser líquido ou sólido.
6. Composições de Desencolagem Têxtil e Uso
[00116] São também contempladas composições e métodos de tra- tamento de tecidos (por exemplo, para desencolar um têxtil) usando uma amilase. Métodos de tratamento de tecidos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. No. 6,077,316). Por exemplo, a sensação tátil e aparência de um tecido podem ser melho- radas por um método compreendendo contato do tecido com uma ami- lase em uma solução. O tecido pode ser tratado com a solução sob pressão.
[00117] Uma amilase pode ser aplicada durante a ou após tecelagem de um têxtil ou durante a etapa de desencolagem ou um ou mais passos de processamento de tecidos adicionais. Durante a tecelagem de têx- teis, os filamentos são expostos a esforço mecânico considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura são frequente- mente revestidos com amido ou derivados de amido de encolagem para aumentar sua resistência à tração e para impedir a quebra. Uma amilase pode ser aplicada durante a ou após tecelagem para se removerem es- tes amidos ou derivados de amido de encolagem. Após tecelagem, uma amilase pode ser usada para se remover o revestimento de encolagem antes de se processar adicionalmente o tecido para assegurar um re- sultado homogêneo e à prova de lavagem.
[00118] Uma amilase pode ser usada sozinha ou com outros reagen- tes químicos de desencolagem e/ou enzimas de desencolagem para desencolar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos de detergente, por exemplo, em composições aquosas. Uma amilase pode ser também usada em composições e métodos para produção de uma aparência lavada a pedra em tecido e vestimentas de denim tingido com índigo. Para a fabricação de roupas, o tecido pode ser cortado e costurado em roupas ou vestimentas, que são posteriormente acaba- das. Em particular, para a fabricação de jeans de denim, diferentes mé- todos de acabamento enzimático foram desenvolvidos. O acabamento da vestimenta de denim é normalmente iniciado com um passo de de- sencolagem enzimático, durante o qual as vestimentas são sujeitas à ação de enzimas amilolíticas para proporcionar maciez ao tecido e tor- nar o algodão mais acessível aos passos de acabamento enzimático subsequentes. Uma amilase pode ser usada em métodos de acaba- mento de vestimentas de denim (por exemplo, um "processo de pré- lavagem biológica"), desencolagem enzimática e proporcionar de ma- ciez a tecidos e/ou processo de acabamento.
7. Composições de Limpeza
[00119] Um aspecto das presentes composições e métodos é uma composição de limpeza que inclui uma amilase como um componente. Um polipeptídeo de amilase pode ser usado como um componente em composições de detergente para, por exemplo, lavagem de mãos, la- vagem de roupas, lavagem de louças e limpeza de outras superfícies duras. Tais composições incluem composições de detergente para la- vagem de roupas líquidas para tarefas pesadas (HDL), secas para tare- fas pesadas (HDD) e à mão (manual), incluindo composições de deter- gente para lavagem de roupas em formato de dose unitária e composi- ções para lavagem de louças automática (ADW) e lavagem de louças à mão (manual), incluindo composições para lavagem de louças em for- mato de dose unitária.
7.1. 11. Visão geral
[00120] —Preferencialmente, uma amilase é incorporada em detergen- tes a ou próximo de a uma concentração convencionalmente usada para amilase em detergentes. Por exemplo, um polipeptídeo de amilase pode ser adicionado em quantidade correspondendo a 0,00001 - 1 mg (cal- culada como proteína de enzima pura) de amilase por litro de líquido de lavagem/lavagem de louças. Formulações exemplificativas são propor- cionadas aqui, como exemplificado pelo seguinte:
[00121] Um polipeptídeo de amilase pode ser um componente de uma composição de detergente, como a única enzima ou com outras enzimas incluindo outras enzimas amilolíticas. Como tal pode ser inclu- ído na composição de detergente na forma de um granulado sem pul- verização, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida. Os granu- lados sem pulverização podem ser produzidos, por exemplo, como di- vulgado nas Patentes dos E.U.A. 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exem- plos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos.
[00122] A composição de detergente pode estar em qualquer forma útil, por exemplo, como pós, grânulos, pastas, barras ou líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até cerca de 70% de água e 0% a cerca de 30% de solvente orgânico. Pode estar também na forma de um tipo de gel compacto contendo somente cerca de 30% de água.
[00123] —Acomposição de detergente compreende um ou mais tenso- ativos, cada um dos quais pode ser aniônico, não iônico, catiônico ou zwitteriônico. O detergente conterá usualmente 0% a cerca de 50% de tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear (LAS); a- olefinsulfonato (AOS); sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo) (AS); etoxissulfato de álcool (AEOS ou AES); alcanossulfonatos secundários SAS); ésteres de metila de ácido a-sulfo graxo; ácido alquil- ou alque- nilsuccínico; ou sabão. A composição pode também conter 0% a cerca de 40% de tensoativo não iônico, tal como etoxilato de álcool (AEO ou AE), etoxilatos de álcool carboxilados, etoxilato de nonilfenol, alquilpoli- glicosídeo, alquildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilada, monoetanolamida de ácido graxo ou amida de ácido graxo de alquila de poli-hidróxi (como descrito por exemplo em WO 92/06154).
[00124] A composição de detergente pode compreender adicional- mente uma ou mais outras enzimas, tais como proteases, outra enzima amilolítica, cutinase, lipase, celulase, pectato liase, peridrolase, xila- nase, peroxidase e/ou lacase em qualquer combinação.
[00125] O detergente pode conter cerca de 1% a cerca de 65% de um agente complexante ou adjuvante de detergente, tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapenta-acé- tico (DTMPA), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode estar também não adjuvado, i.e., essencialmente isento de adju- vante de detergente. As enzimas podem ser usadas em qualquer com- posição compatível com a estabilidade da enzima. As enzimas podem ser geralmente protegidas contra componentes prejudiciais por formas conhecidas de encapsulação, por exemplo, por granulação ou seques- tro em hidrogéis. As enzimas, e especificamente amilases, com ou sem domínios de ligação ao amido, podem ser usadas em uma variedade de composições incluindo aplicações de lavagem de roupas e lavagem de louças, limpadores de superfície, assim como em composições para produção de etanol a partir de amido ou biomassa.
[00126] O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), poli(álcool de vinila) (PVA), policarboxila- tos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e co- polímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.
[00127] O detergente pode conter um sistema de branqueamento, que pode compreender uma fonte de H2O,> tal como perborato ou per- carbonato, que pode ser combinada com um ativador de branquea- mento formador de perácido tal como tetra-acetiletilenodiamina (TAED) ou nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS). Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos (por exemplo, os peroxiácidos tipo amida, imida ou sulfona). O sistema de branquea- mento pode ser também um sistema de branqueamento enzimático, por exemplo, peridrolase, tal como aquele descrito no Pedido PCT Interna- cional WO 2005/056783.
[00128] Asenzimas da composição de detergente podem ser estabi- lizadas usando agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol tal como propilenoglicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido láctico; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico tal como, por exemplo, um éster de borato aromático; e a composição pode ser for- mulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708.
[00129] —Odetergente pode conter também outros ingredientes de de- tergente convencionais tais como, por exemplo, condicionadores de te- cido incluindo argilas, intensificadores de espuma, supressores de bo- lhas, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de manchas, siste- mas anti-redeposição de manchas, corantes, bactericidas, inibidores do deslustre, abrilhantadores ópticos ou perfumes.
[00130] O pH (medido em solução aquosa à concentração de uso) é usualmente neutro ou alcalino, por exemplo, pH cerca de 7,0 a cerca de 11,0, embora não sejam incomuns condições ligeiramente ácidas.
[00131] — Formas particulares de composições de detergente para in- clusão da presente a-amilase são descritas, em baixo. Muitas destas composições podem ser proporcionadas em formato de dose unitária para facilidade de uso. Formulações de dose unitária e embalagem são descritas em, por exemplo, US20090209445A1, US20100081598A1, US7001878B?2, EP1504994B1, WO2001085888A?2, WO2003089562A1, WO2009098659A1, WO2009098660A1, WOZ2009112992A1, WOZ2009124160A1, WO2009152031A1, WO2010059483A1, WO2010088112A1, WO2010090915A1, WOZ2010135238A1, WOZ2011094687A1, WO?2011094690A1, WOZ2011127102A1, WOZ2011163428A1, WO2008000567A1, WOZ2006045391A1, WOZ2006007911A1, WO2012027404A1, EP1740690B1, WO2012059336A1, US6730646B1, WO2008087426A1, WO2010116139A1, e WO2012104613A1.
7.2. Composição de Detergente Líquida para lavagem de roupas para tarefas pesadas (HDL)
[00132] “Composições de detergente para lavagem de roupas HDL exemplificativas incluem um tensoativo detersivo (10%-40% p/p), inclu-
indo um tensoativo detersivo aniônico (selecionado de um grupo de sul- fatos de alquila, sulfonatos de alquila, sulfato de alquila alcoxilado, fos- fatos de alquila, fosfonatos de alquila, carboxilatos de alquila e/ou suas misturas lineares ou ramificados ou de cadeia aleatória, substituídos ou não substituídos) e, opcionalmente, tensoativo não iônico (selecionado de um grupo de álcool de alquila alcoxilado linear ou ramificado ou de cadeia aleatória, substituído ou não substituído, por exemplo um álcool de alquila C8-C18 etoxilado e/ou alcoxilatos de fenol de alquila C6-C12), em que a razão de pesos entre tensoativo detersivo aniônico (com um índice hidrofílico (Hlc) de 6,0 a 9) e tensoativo detersivo não iônico é maior do que 1: 1. Tensoativos detersivos adequados incluem também tensoativos detersivos catiônicos (selecionados de um grupo de com- postos de piridínio de alquila, compostos de amônio quaternário de al- quila, compostos de fosfônio quaternário de alquila, compostos de sul- fônio terciário de alquila e/ou suas misturas); tensoativos detersivos zwitteriônicos e/ou anfotéricos (selecionados de um grupo de sulfo-be- taínas de alcanolamina); tensoativos anfotéricos; tensoativos não iôni- cos semipolares e suas misturas.
[00133] —Acomposição pode incluir opcionalmente um polímero de in- tensificação de tensoatividade consistindo em polímeros de limpeza de graxa alcoxilados anfifílicos (selecionados de um grupo de polímeros alcoxilados tendo propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas ramificadas, tais como polialquileniminas alcoxiladas na gama de 0,05% em peso- 10% em peso) e/ou polímeros de enxerto aleatórios (compreendendo tipicamente esqueleto hidrofílico compreendendo monômeros selecio- nados do grupo consistindo em: ácidos carboxílicos C1-C6 insaturados, éteres, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres, unidades de açúcar, unida- des de alcóxi, anidrido maleico, poliálcoois saturados tais como glicerol e suas misturas; e cadeia(s) lateral(is) hidrofóbica(s) selecionada(s) do grupo consistindo em: grupo alquila C4-C25, polipropileno, polibutileno,
éster de vinila de um ácido monocarboxílico C1-C6 saturado, éster de alquila C1-C6 de ácido acrílico ou metacrílico e suas misturas.
[00134] A composição pode incluir polímeros adicionais tais como polímeros de liberação de manchas (incluindo poliésteres com extremi- dade anionicamente capeada, por exemplo SRP1, polímeros compre- endendo pelo menos uma unidade de monômero selecionada de saca- rídeo, ácido dicarboxílico, poliol e suas combinações, em configuração em blocos ou aleatória, polímeros à base de tereftalato de etileno e seus copolímeros em configuração em blocos ou aleatória, por exemplo Re- pel-o-tex SF, SF-2 e SRP6, Texcare SRA100, SRASO0O0, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 e SRN325, Marloquest SL), polímeros anti- redeposição (0,1% em peso a 10% em peso, incluindo polímeros de carboxilato, tais como polímeros compreendendo pelo menos um mo- nômero selecionado de ácido acrílico, ácido maleico (ou anidrido ma- leico), ácido fumárico, ácido itacônico, ácido aconítico, ácido mesacô- nico, ácido citracônico, ácido metilenomalônico e qualquer sua mistura, homopolímero de vinilpirrolidona e/ou polietilenoglicol, peso molecular na gama de 500 a 100.000 Da); polímero celulósico (incluindo aqueles selecionados de celulose de alquila, celulose de alquilalcoxialquila, ce- lulose de carboxialquila, celulose de alquilcarboxialquila, exemplos dos quais incluem celulose de carboximetila, celulose de metila, celulose de metil-hidroxietila, celulose de metilcarboximetila e suas misturas) e car- boxilato polimérico (tal como copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero de poliacrilato).
[00135] A composição pode incluir adicionalmente ácido graxo satu- rado ou insaturado, preferencialmente ácido graxo C12-C24 saturado ou insaturado (0% em peso a 10% em peso); auxiliares da deposição (exemplos para os quais incluem polissacarídeos, preferencialmente polímeros celulósicos, haletos de amônio de polidialildimetila (DAD-
MAC) e copolímeros de DAD MAC com pirrolidona de vinila, acrilami- das, imidazóis, haletos de imidazolínio e suas misturas, em configura- ção em blocos ou aleatória, goma-guar catiônica, celulose catiônica tal como celulose de hidroxietila catiônica, amido catiônico, poliacilamidas catiônicas e suas misturas.
[00136] —Acomposição pode incluir adicionalmente agentes inibidores da transferência de corantes, exemplos dos quais incluem ftalocianina de manganês, peroxidases, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimi- dazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis e/ou suas misturas; agentes quelantes, exemplos dos quais incluem ácido etileno-diamina- tetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentametilenofosfônico (DTPMP), ácido hidróxi-etanodifosfônico (HEDP), ácido etilenodiamina- N,N'-dissuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido di- etilenotriaminapenta-acético (DTPA), ácido propilenodiaminatetracético (PDTA), 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO) ou ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico ácido N, N-diacético (sal tetrassódico de ácido N N-dicarboximetilglutâmico (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-di-hidróxi-m-benzenodissulfônico, ácido cítrico e quaisquer seus sais; ácido N-hidroxietiletilenodiaminatri-acético (HEDTA), ácido trietile- notetra-amina-hexa-acético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), di-hidroxietilglicina (DHEG), ácido etilenodiaminatetrapropiô- nico (EDTP) e seus derivados.
[00137] A composição incluiu preferencialmente enzimas (geral- mente cerca de 0,01% em peso de enzima ativa a 0,03% em peso de enzima ativa) selecionadas de proteases, amilases, lipases, celulases, colina oxidases, peroxidases/oxidases, pectato liases, mananases, cu- tinases, lacases, fosfolipases, lisofosfolipases, aciltransferases, peridro- lases, arilesterases e qualquer sua mistura. A composição pode incluir um estabilizante de enzima (exemplos dos quais incluem polióis tais como propilenoglicol ou glicerol, açúcar ou álcool de açúcar, ácido lác- tico, inibidor de protease reversível, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático ou um deri- vado de ácido fenilborônico, tal como ácido 4-formilfenilborônico).
[00138] A composição inclui opcionalmente supressores de bolhas à base de ácidos graxos ou silicone; corantes de matização, cátions de cálcio e magnésio, ingredientes de sinalização visual, antiespumante (0,001% em peso a cerca de 4,0% em peso) e/ou estruturante/espes- sante (0,01% em peso a 5% em peso, selecionados do grupo consis- tindo em diglicerídeos e triglicerídeos, diestearato de etilenoglicol, celu- lose microcristalina, materiais à base de celulose, celulose de microfi- bras, biopolímeros, goma xantana, goma gelana e suas misturas).
[00139] A composição pode ser qualquer forma líquida, por exemplo uma forma em líquido ou gel ou qualquer sua combinação. A composi- ção pode estar em qualquer forma de dose unitária, por exemplo uma bolsa.
7.3. Composição de Detergente Seca/Sólida para lavagem de rou- pas para tarefas pesadas (HDL)
[00140] “Composições de detergente para lavagem de roupas HDD exemplificativas incluem um tensoativo detersivo aniônico (por exemplo, sulfatos de alquila, sulfonatos de alquila, sulfato de alquila alcoxilado, fosfatos de alquila, fosfonatos de alquila, carboxilatos de alquila e/ou suas misturas lineares ou ramificados ou de cadeia aleatória, substituí- dos ou não substituídos), tensoativo detersivo não iônico (por exemplo, etoxilatos de alquila C8-C18 e/ou alcoxilatos de fenol de alquila C6-C12 lineares ou ramificados ou de cadeia aleatória, substituídos ou não substituídos), tensoativos detersivos catiônicos (por exemplo, compos- tos de piridínio de alquila, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de fosfônio quaternário de alquila, compostos de sulfônio ter- nário de alquila e suas misturas), tensoativos detersivos zwitteriônicos e/ou anfotéricos (por exemplo, sulfo-betaínas de alcanolamina), tenso- ativos anfolíticos, tensoativos não iônicos semipolares e suas misturas; adjuvantes incluindo adjuvantes isentos de fosfato (por exemplo adju- vantes de zeólito, exemplos dos quais incluem zeólito A, zeólito X, zeó- lito P e zeólito MAP na gama de 0% em peso a menos do que 10% em peso), adjuvantes de fosfato (por exemplo, tri-polifosfato de sódio na gama de 0% em peso a menos do que 10% em peso), ácido cítrico, sais de citrato e ácido nitrilotriacético, sal de silicato (por exemplo, silicato de sódio ou potássio ou meta-silicato de sódio na gama de 0% em peso a menos do que 10% em peso, ou silicato em camadas (SKS-6)); sal de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio e/ou bicarbonato de sódio na gama de 0% em peso a menos do que 80% em peso); e agentes de branqueamento incluindo fotobranqueadores (por exemplo, ftalociani- nas de zinco sulfonadas, ftalocianinas de alumínio sulfonadas, corantes xantenos e suas misturas), ativadores de branqueamento hidrofóbicos ou hidrofílicos (por exemplo, sulfonato de dodecanoil oxibenzeno, sul- fonato de decanoil oxibenzeno, ácido decanoiloxibenzoico ou seus sais, sulfonato de hexanoil oxibenzeno de 3,5,5-trimetila, tetra-acetiletilenodi- amina-TAED, sulfonato de nonanoiloxibenzeno-NOBS, quats de nitrila e suas misturas), fontes de peróxido de hidrogênio (por exemplo, sais de peridrato inorgânicos, exemplos dos quais incluem sal de sódico mono- ou tetra-hidratado de perborato, percarbonato, persulfato, perfos- fato ou persilicato), perácidos hidrofílicos e/ou hidrofóbicos pré-forma- dos (por exemplo, ácidos e sais percarboxílicos, ácidos e sais percar- bônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroxidossulfúricos e suas misturas) e/ou catalisadores de branqueamento (por exemplo, re- forçadores de branqueamento de imina (exemplos dos quais incluem cátions e cátions de imínio), zwitteríons de imínio, aminas modificadas, óxidos de aminas modificadas, iminas de N-sulfonila, iminas de N-fosfo- nila, iminas de N-acila, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de açúcar cíclicas e suas misturas, e catalisadores de branqueamento contendo metais (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio ou manganês em conjunto com cátions de me- tais auxiliares tais como zinco ou alumínio e um sequestrado tal como ácido etilenodiaminotetra-acético, etilenodiaminotetra (ácido metileno- fosfônico) e seus sais solúveis em água).
[00141] A composição inclui preferencialmente enzimas, por exem- plo, proteases, amilases, lipases, celulases, colina oxidases, peroxida- ses/oxidases, pectato liases, mananases, cutinases, lacases, fosfolipa- ses, lisofosfolipases, aciltransferase, peridrolase, arilesterase e qual- quer sua mistura.
[00142] A composição pode incluir opcionalmente ingredientes de detergente adicionais incluindo microcápsulas de perfume, aroma de perfume encapsulado com amido, agentes de matiz, polímeros adicio- nais, incluindo polímeros de integridade de tecidos e catiônicos, ingre- dientes dye-lock, agentes de maciez de tecidos, abrilhantadores (por exemplo, Abrilhantadores fluorescentes C.|.), agentes floculantes, agen- tes quelantes, poliaminas alcoxiladas, auxiliares de deposição de teci- dos e/ou ciclodextrina.
7.4. Composição de detergente para lavagem de louças automática (ADW)
[00143] “Composição de detergente ADW exemplificativa inclui tenso- ativos não iônicos, incluindo tensoativos não iônicos etoxilados, tensoa- tivos alcoxilados com álcool, álcoois poli(oxialquilados) com capea- mento de epóxi ou tensoativos de óxido de amina presentes em quanti- dades de O a 10% em peso; adjuvantes na gama de 5-60% incluindo adjuvantes de fosfato (por exemplo, monofosfatos, difosfatos, tripolifos- fatos, outros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato de sódio-STPP) e adjuvantes isentos de fosfato (por exemplo, compostos à base de ami- noácidos incluindo ácido metil-glicina-diacético (MGDA) e seus sais e derivados, ácido glutâmico-N, N-diacético (GLDA) e seus sais e deriva- dos, ácido iminodissuccínico (IDS) e seus sais e derivados, inulina de carboximetila e seus sais e derivados, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), ácido B-alaninadiacético (B- ADA) e seus sais, homopolímeros e copolímeros de ácidos poli-carbo- xílicos e seus sais parcialmente ou completamente neutralizados, áci- dos policarboxílicos monoméricos e ácidos hidroxicarboxílicos e seus sais na gama de 0,5% a 50% em peso; polímeros sulfonados/carboxila- dos na gama de cerca de 0,1% a cerca de 50% em peso para proporci- onar estabilidade dimensional; auxiliares de secagem na gama de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso (por exemplo, poliésteres, especial- mente poliésteres aniônicos, opcionalmente em conjunto com monôme- ros adicionais com 3 a 6 funcionalidades - tipicamente funcionalidades de ácido, álcool ou éster que são conducentes à policondensação, com- postos de policarbonato-, poliuretano- e/ou poliureia-poliorganossi- loxano ou seus compostos precursores, particularmente do tipo carbo- nato e ureia cíclico reativo); silicatos na gama de cerca de 1% a cerca de 20% em peso (incluindo silicatos de sódio ou potássio, por exemplo dissilicato de sódio, meta-silicato de sódio e filossilicatos cristalinos); branqueador inorgânico (por exemplo, sais de peridrato tais como sais de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato e persilicato) e bran- queador orgânico (por exemplo, peroxiácidos orgânicos, incluindo pe- róxidos de diacila e tetra-acila, especialmente ácido diperoxidodecano- doico, ácido diperoxitetradecanodoico e ácido diperoxitetradecanodi- oico); ativadores de branqueamento (i.e., precursores de perácidos or- gânicos na gama de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso); catalisa- dores de branqueamento (por exemplo, triazaciclononano de manga- nês e complexos relacionados, bispiridilamina de Co, Cu, Mn eFee complexos relacionados e acetato de pentamina cobalto (Ill) e comple- xos relacionados); agentes de cuidado de metais na gama de cerca de
0,1% a 5% em peso (por exemplo, benzatriazóis, sais e complexos de metal e/ou silicatos); enzimas na gama de cerca de 0,01 a 5,0 mg de enzima ativa por grama de composição de detergente para lavagem de louças automática (por exemplo, proteases, amilases, lipases, celula- ses, colina oxidases, peroxidases/oxidases, pectato liases, mananases, cutinases, lacases, fosfolipases, lisofosfolipases, aciltransferase, peri- drolase, arilesterase e suas misturas); e componentes estabilizantes de enzimas (por exemplo, oligossacarídeos, polissacarídeos e sais inorgâà- nicos de metais divalentes).
7.5. Composições de detergente adicionais
[00144] “Formulações de detergente exemplificativas adicionais às quais a presente amilase pode ser adicionada são descritas, em baixo, nos parágrafos numerados.
[00145] 1) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 7% a cerca de 12%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12- 18, 1-2 óxidos de etileno (EO)) ou sulfato de alquila (por exemplo, C16- 18) cerca de 1% a cerca de 4%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C14-15, 7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio cerca de 14% a cerca de 20%; silicato solúvel cerca de 2 a cerca de 6%; zeó- lito cerca de 15% a cerca de 22%; sulfato de sódio 0% a cerca de 6%; citrato de sódio/ácido cítrico cerca de 0% a cerca de 15%; perborato de sódio cerca de 11% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 6%; carboximetilcelulose (CMC) e 0% a cerca de 2%; polímeros (por exem- plo, ácido maleico/acrílico, copolímero, PVP, PEG) 0-3%; enzimas (cal- culadas como enzima pura) 0,0001-0,1% de proteína; e ingredientes menores (por exemplo, supressores de bolhas, perfumes, abrilhantador óptico, fotobranqueador) 0-5%.
[00146] 2) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 11%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12- 18, 1-2 EO) ou sulfato de alquila (por exemplo, C16-18) cerca de 1% a cerca de 3%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C14-15,7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio cerca de 15% a cerca de 21%; silicato solúvel cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito cerca de 24% a cerca de 34%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 4% a cerca de 10%; citrato de sódio/ácido cítrico cerca de 0% a cerca de 15%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-6%; enzi- mas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; ingredi- entes menores (por exemplo, supressores de bolhas, perfume) 0-5%.
[00147] 3) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 5% a cerca de 9%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO) cerca de 7% a cerca de 14%; Sabão como ácido graxo (por exem- plo, ácido graxo C16-22) cerca de 1 a cerca de 3%; carbonato de sódio cerca de 10% a cerca de 17%; silicato solúvel cerca de 3% a cerca de 9%; zeólito cerca de 23% a cerca de 33%; sulfato de sódio 0% a cerca de 4%; perborato de sódio cerca de 8% a cerca de 16%; TAED cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato 0% a cerca de 1%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; ingredientes menores (por exemplo, su- pressores de bolhas, perfume, abrilhantador óptico) 0-5%.
[00148] 4) Uma composição de detergente formulada como um gra-
nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 8% a cerca de 12%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO) cerca de 10% a cerca de 25%; carbonato de sódio cerca de 14% a cerca de 22%; silicato solúvel cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito cerca de 25% a cerca de 35%; sulfato de sódio 0% a cerca de 10%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-3%; enzimas (calcu- ladas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes me- nores (por exemplo, supressores de bolhas, perfume) 0-5%.
[00149] 5) Uma composição de detergente líquida aquosa compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12- 15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) cerca de 12% a cerca de 18%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) cerca de 3% a cerca de 13%; ácido alquenilsuccínico (C12-14) 0% a cerca de 13%; aminoetanol cerca de 8% a cerca de 18%; ácido cítrico cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato 0% a cerca de 3%; polímeros (por exemplo, PVP, PEG) 0% a cerca de 3%; borato 0% a cerca de 2%; etanol 0% a cerca de 3%; propilenoglicol cerca de 8% a cerca de 14%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, dispersantes, supressores de bolhas, perfume, abrilhantador óptico) 0-5%.
[00150] 6) Uma composição de detergente líquida estruturada aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) 3-9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) cerca de 3% a cerca de 10%; zeólito cerca de 14% a cerca de 22%; citrato de potássio cerca de 9% a cerca de 18%; borato 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose
(CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, PEG, PVP) 0% a cerca de 3%; polímeros de ancoramento tais como, por exemplo, copo- límero de metacrilato de laurila/ácido acrílico; razão molar 25:1, MW 3800) 0% a cerca de 3%; glicerol 0% a cerca de 5%; enzimas (calcula- das como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes meno- res (por exemplo, dispersantes, supressores de bolhas, perfume, abri- Ihantador ópticos) 0-5%.
[00151] 7) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo sulfato de álcool graxo cerca de 5% a cerca de 10%; monoe- tanolamida de ácido graxo etoxilada cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo 0-3%; carbonato de sódio cerca de 5% a cerca de 10%; Silicato solúvel cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito cerca de 20% a cerca de 40%; Sulfato de sódio cerca de 2% a cerca de 8%; perborato de sódio cerca de 12% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 7%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, abrilhantador óptico, supressores de bolhas, perfume) 0-5%.
[00152] 8) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 8% a cerca de 14%; monoetanolamida de ácido graxo etoxilada cerca de 5% a cerca de 11%; sabão como ácido graxo 0% a cerca de 3%; carbonato de sódio cerca de 4% a cerca de 10%; silicato solúvel cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito cerca de 30% a cerca de 50%; sulfato de sódio cerca de 3% a cerca de 11%; citrato de sódio cerca de 5% a cerca de 12%; polímeros (por exemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, supressores de bolhas, perfume) 0-5%.
[00153] 9) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 12%; tensoativo não iônico cerca de 1% a cerca de 4%; sabão como ácido graxo cerca de 2% a cerca de 6%; carbonato de sódio cerca de 14% a cerca de 22%; zeólito cerca de 18% a cerca de 32%; sulfato de sódio cerca de 5% a cerca de 20%; citrato de sódio cerca de 3% a cerca de 8%; perborato de sódio cerca de 4% a cerca de 9%; ativador de branqueador (por exemplo, NOBS ou TAED) cerca de 1% a cerca de 5%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, policarboxilato ou PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, abrilhantador óp- tico, perfume) 0-5%.
[00154] 10) Uma composição de detergente líquida aquosa compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 23%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 2-3 EO) cerca de 8% a cerca de 15%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido láurico) 0% a cerca de 3%; aminoetanol cerca de 1% a cerca de 5%; citrato de sódio cerca de 5% a cerca de 10%; hidrótropo (por exemplo, toluenossulfo- nato de sódio) cerca de 2% a cerca de 6%; borato 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose 0% a cerca de 1%; etanol cerca de 1% a cerca de 3%; propilenoglicol cerca de 2% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, polímeros, dispersantes, perfume, abrilhantador ópticos) 0-5%.
[00155] 11) Uma composição de detergente líquida aquosa compre- endendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 20% a cerca de 32%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-
15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) 6-12%; aminoetanol cerca de 2% a cerca de 6%; ácido cítrico cerca de 8% a cerca de 14%; borato cerca de 1% a cerca de 3%; polímero (por exemplo, copolímero de ácido ma- leico/acrílico, polímero de ancoramento tal como, por exemplo, copolí- mero de metacrilato de laurila/ácido acrílico) 0% a cerca de 3%; glicerol cerca de 3% a cerca de 8%; enzimas (calculadas como proteína de en- zima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, hidró- tropos, dispersantes, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-5%.
[00156] 12) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo tensoativo aniônico (alquilbenzenossulfonato linear, sulfato de alquila, a-olefinsulfonato, ésteres de metila de ácido a-sulfo graxo, alca- nossulfonatos, sabão) cerca de 25% a cerca de 40%; tensoativo não iônico (por exemplo, etoxilato de álcool) cerca de 1% a cerca de 10%; carbonato de sódio cerca de 8% a cerca de 25%; silicatos solúveis cerca de 5% a cerca de 15%; sulfato de sódio 0% a cerca de 5%; zeólito cerca de 15% a cerca de 28%; perborato de sódio 0% a cerca de 20%; ativa- dor de branqueador (TAED ou NOBS) cerca de 0% a cerca de 5%; en- zimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; ingre- dientes menores (por exemplo, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-3%.
[00157] 13) Composições de detergente como descrito nas composi- ções 1)-12) supra, em que todo o ou parte do alquilbenzenossulfonato linear está substituído por sulfato de alquila (C12-C18).
[00158] 14) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo sulfato de alquila (C12-C18) cerca de 9% a cerca de 15%; eto- xilato de álcool cerca de 3% a cerca de 6%; amida de ácido graxo de alquila de poli-hidróxi cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito cerca de 10% a cerca de 20%; dissilicato em camadas (por exemplo, SK56 da Hoe- chst) cerca de 10% a cerca de 20%; carbonato de sódio cerca de 3% a cerca de 12%; silicato solúvel 0% a cerca de 6%; citrato de sódio cerca de 4% a cerca de 8%; percarbonato de sódio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED cerca de 3% a cerca de 8%; polímeros (por exemplo, poli- carboxilatos e PVP) 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como pro- teína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exem- plo, abrilhantador óptico, fotobranqueador, perfume, supressores de bolhas) 0-5%.
[00159] 15) Uma composição de detergente formulada como um gra- nulado tendo uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compre- endendo sulfato de alquila (C12-C18) cerca de 4% a cerca de 8%; eto- xilato de álcool cerca de 11% a cerca de 15%; sabão cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito MAP ou zeólito A cerca de 35% a cerca de 45%; carbonato de sódio cerca de 2% a cerca de 8%; silicato solúvel 0% a cerca de 4%; percarbonato de sódio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED 1-8%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 3%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) 0% a cerca de 3%; enzimas (cal- culadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, abrilhantador óptico, fosfonato, perfume) 0-3%.
[00160] 16) Formulações de detergente como descrito em 1)-15) su- pra, que contêm um perácido estabilizado ou encapsulado, como um componente adicional ou como um substituto para sistemas de bran- queamento já especificados.
[00161] 17) Composições de detergente como descrito supra em 1), 3), 7), 9) e 12), em que perborato está substituído por percarbonato.
[00162] 18) Composições de detergente como descrito supra em 1), 3), 7), 9), 12), 14) e 15), que contêm adicionalmente um catalisador de manganês. O catalisador de manganês por exemplo é um dos compos- tos descritos por Hage et al. ((1994) Nature 369: 637-639).
[00163] 19) Composição de detergente formulada como um líquido de detergente não aquoso compreendendo um tensoativo não iônico lí- quido tal como, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sis- tema de adjuvante (por exemplo, fosfato), uma enzima(s) e alcalinos. O detergente pode também compreender tensoativo aniônico e/ou um sistema de branqueamento.
[00164] Como acima, o presente polipeptídeo de amilase pode ser incorporado a uma concentração convencionalmente empregue em de- tergentes. É presentemente contemplado que, na composição de deter- gente, a enzima pode ser adicionada em uma quantidade correspon- dendo a 0,00001-1,0 mg (calculada como proteína de enzima pura) de polipeptídeo de amilase por litro de líquido de lavagem.
[00165] A composição de detergente pode também conter outros in- gredientes de detergente convencionais, por exemplo, material desflo- culante, material de enchimento, depressores de espuma, agentes an- ticorrosão, agentes de suspensão de manchas, agentes sequestrantes, agentes anti-redeposição de manchas, agentes de desidratação, coran- tes, bactericidas, fluorescentes, espessantes e perfumes.
[00166] A composição de detergente pode ser formulada como uma composição de detergente para lavagem de roupas à mão (manual) ou por máquina (automática), incluindo uma composição aditiva para lava- gem de roupas adequada para pré-tratamento de tecidos enodoados e uma composição amaciante de tecido adicionada de enxaguamento ou ser formulada como uma composição de detergente para uso em ope- rações de limpeza de superfícies duras doméstica geral ou ser formu- lada para operações de lavagem de louças manuais ou automáticas.
[00167] “Qualquer uma das composições de limpeza descritas, aqui, pode incluir qualquer número de enzimas adicionais. Em geral, a(s) en- zima(s) deve(m) ser compatível(is) com o detergente selecionado (por exemplo, no que refere-se ao pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos e similares), e a(s) en- zima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. As seguin- tes enzimas são proporcionadas como exemplos.
[00168] Proteases: Proteases adequadas incluem aquelas de ori- gem animal, vegetal ou microbiana. São incluídos mutantes quimica- mente modificados ou com manipulação de proteínas, bem como prote- Ínas naturalmente processadas. A protease pode ser uma serina pro- tease ou uma metaloprotease, uma protease microbiana alcalina, uma protease tipo tripsina ou uma protease tipo quimotripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtili- sina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (ver, por exemplo, WO 89/06279). Proteases exemplificativas incluem aquelas mas não estão limitadas àquelas descritas em WO95/23221, WO 92/21760, WO2008010925, WO20100566356, WO2011072099, WO201113022, WOZ2011140364, WO 2012151534, WO2015038792, WO2015089441, WO2015089447, WO2015143360, WO2016001449, WO2016001450, WO2016061438, WO2016069544 WO2016069548, WO2016069552, WO 2016069557, WO2016069563, WO2016069569, WO2016087617, WO2016087619, WO2016145428, WO2016174234, WO2016183509, WO2016202835, WO2016205755, US 2008/0090747, US 5,801,039, US 5,340,735, US 5,500,364, US 5,855,625, RE 34,606, US 5,955,340, US 5,700,676, US 6,312,936, US 6,482,628, US8530219; Pedidos Pro- visórios dos EUA Nos. 62/331282, 62/343618, 62/351649, 62/437171, 62/437 174 e 62/437509; e Pedidos PCT Nos. POT/CN2017/076749 e, bem como metaloproteases descritas em WO 2007/044993, WO 2009/058303, WO 2009/058661, WO 2014/071410, WO 2014/194032, WO 2014/194034, WO 2014/194054 e WO 2014/194117.
[00169] —Proteases comerciais exemplificativas incluem, mas não es-
tão limitadas a, proteases MAXATASE, MAXACAL, MAXAPEM, OPTI- CLEANº, OPTIMASES, PROPERASES, PURAFECTºS, PURAFECTº OXP, PURAMAXº, EXCELLASEº, PREFERENZ'Y (por exemplo, P100, P110, P280), proteases EFFECTENZ'Y (por exemplo, P1000, P1050, P2000), proteases EXCELLENZ'Y (por exemplo, P1000), UL- TIMASEº e PURAFAST (Danisco US); ALCALASES, ALCALASEº UL- TRA, BLAZEº, BLAZEº EVITYº, BLAZE? EVITYº 16L, CORONASES?, SAVINASES, SAVINASEº ULTRA, SAVINASE? EVITYº, SAVINASE? EVERISº, PRIMASE, DURAZYM, POLARZYMEº, OVOZYMES, KAN- NASES, LIQUANASES, EVERISº, NEUTRASE?, PROGRESS UNO?º, RELASEº? e ESPERASEº (Novozymes); variantes BLAPTY e BLAP TV (Henkel); LAVERGY Y PRO 104 L (BASF) e KAPº (subtilisina de B. al- kalophilus) (Kao). Proteases adequadas incluem proteases ocorrendo naturalmente ou variantes manipuladas especificamente selecionadas ou manipuladas para funcionarem a temperaturas relativamente baixas.
[00170] Lipases: Lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modifica- dos, proteoliticamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos de lipases úteis incluem, mas não estão limitados a lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) (ver, por exemplo, EP 258068 e EP 305216), de H. insolens (ver, por exemplo, WO 96/13580); uma lipase de Pseudomo- nas (por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes; ver, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia (ver, p.ex. EP 331 376), P. stutzeri (ver, por exemplo, GB 1,372,034), P. fluorescens, estirpe de Pseudo- monas sp. SD 705 (ver, por exemplo, WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (ver, por exemplo, WO 96/12012); uma lipase de Ba- cillus (por exemplo, de B. subtilis; ver, por exemplo, Dartois et a/. (1993) Biochemica et Biophysica Acta 1131: 253-360), B. stearothermophilus (ver, por exemplo, JP 64/744992) ou B. pumilus (ver, por exemplo, WO
91/16422). Variantes de lipase adicionais contempladas para uso nas formulações incluem aquelas descritas por exemplo em: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 e EP 260105.
[00171] Lipases comerciais exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, M1 LIPASE, LUMA FAST e LIPOMAX (Genencor); LIPEXº, LIPOCLEANº, LIPOLASE? e LIPOLASE? ULTRA (Novozymes); e LI- PASE P (Amano Pharmaceutical Co. Ltd).
[00172] —Poliesterases: Poliesterases adequadas podem ser incluí- das na composição, tais como aquelas descritas em, por exemplo, WO 01/34899, WO 01/14629 e US6933140.
[00173] Amilases: As presentes composições podem ser combina- das com outras amilases, incluindo outras a-amilases. Uma tal combi- nação é particularmente desejável quando diferentes a-amilases de- monstram diferentes características de desempenho, e a combinação de uma pluralidade de diferentes a-amilases resulta em uma composi- ção que proporciona os benefícios das diferentes a-amilases. Outras amilases incluem amilases comercialmente disponíveis, tais como mas não se limitando a STAINZYMES, NATALASEº, DURAMYLº, TER- MAMYLº, FUNGAMYLº e BANTY (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S); RAPIDASE?, POWERASEº, PURASTARº e PREFERENZ'Y (da Du- Pont Industrial Biosciences.). a-Amilases exemplificativas são descritas em WOS9418314A1, US20080293607, WO2013063460, WO10115028, WO2009061380A?2, WO2014099523, WO?2015077126A1, WO2013184577, —“WO2014164777, WO9510603, WOS9526397, WO9623874, WO9623873, WO9741213, WO9919467, WOO006006860, WO0029560, WO9923211, WO9946399, WOO060058, WOO060059, WOS9942567, WO0114532, WO02092797, WOO0166712, WO0188107, WO0196537, WO0210355, WO2Z006002643, WOZ2004055178 e
WO9813481.
[00174] Celulases: Celulases podem ser adicionadas às composi- ções. Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com ma- nipulação de proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gê- neros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremo- nium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas a partir de Humi- cola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divul- gadas por exemplo nas Patentes dos E.U.A. Nos. 4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; e WO 89/09259. Celulases exemplificativas con- templadas para uso são aquelas tendo benefício de cuidados da cor para o têxtil. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em, por exemplo, EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 e WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase, tais como aquelas descritas em WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; Patentes dos E.U.A. Nos. 5,457,046; 5,686,593; e 5,763,254. Celulases exemplificativas incluem aquelas descritas em WO2005054475, WO2005056787, US 7,449,318, US 7,833,773, US 4,435,307; EP 0495257; e Pedidos Provisórios dos EUA Nos. 62/296,678 e 62/435340. Celulases comerciais exemplificativas in- cluem, mas não estão limitadas a, CELLUCLEANº, CELLUZYME?º, CA- REZYMES, CAREZYMEº PREMIUM, ENDOLASEº? e RENOZYMEº (Novozymes); REVITALENZº 100, REVITALENZº 200/220 e REVITA- LENZº 2000 (Danisco US); e KAC-500(B) (Kao Corporation).
[00175] “Mananases: Mananases exemplificativas incluem aquelas, mas não estão limitadas àquelas, de origem bacteriana ou fúngica, tais como, por exemplo, como é descrito em WOZ2016007929; USPNs 6566114, 6602842 e 6440991; e Pedidos Internacionais Nos. PCT/US2016/060850 e PCT/US2016/060844. Mananases exemplifica-
tivas incluem aquelas, mas não estão limitadas àquelas, de origem bac- teriana ou fúngica, tais como, por exemplo, como é descrito em WO2016007929; USPNs 6566114, 6602842 e 6440991; e Pedidos In- ternacionais Nos. POCT/US2016/060850 e PCT/US2016/060844.
[00176] Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas contempladas para uso nas composições incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos de peroxida- ses úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus e suas variantes como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente disponíveis in- cluem por exemplo, GUARDZYMETY (Novo Nordisk A/S e Novozymes A/S).
[00177] A composição de detergente pode também compreender 2,6-B-D-frutana hidrolase, que é eficaz para remoção/limpeza do bio- filme presente em têxtil/roupa doméstico e/ou industrial.
[00178] A(s) enzima(s) de detergente pode(m) ser incluída(s) em uma composição de detergente por adição de aditivos separados con- tendo uma ou mais enzimas ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente, i.e., um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, um líquido, uma pasta semifluida e simi- lares. Formulações de aditivo de detergente exemplificativas incluem mas não estão limitados a granulados, em particular granulados sem pulverização, líquidos, em particular líquidos ou pastas semifluidas es- tabilizadas.
[00179] A composição de detergente pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um comprimido, um pó, um grâà- nulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até cerca de 70% de água e 0% a cerca de 30%
de solvente orgânico. Géis de detergente compactos contendo cerca de 30% ou menos de água são também contemplados. A composição de detergente pode compreender opcionalmente um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos, incluindo semipolares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwitteriônicos. Os tensoativos podem estar presentes em uma gama ampla, de cerca de 0,1% a cerca de 60% em peso.
[00180] “Quando incluído nos mesmos, o detergente conterá tipica- mente de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear, a-olefinsulfonato; sulfato de al- quila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool; alcanossulfonato secundário, éster de metila de ácido a-sulfo graxo, ácido alquil- ou al- quenilsuccínico ou sabão.
[00181] Quando incluído nos mesmos, o detergente conterá usual- mente de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico tal como etoxilato de álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilada, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de alquila de poli-hidróxi ou derivados de N-acil-N-alquila de glicosamina ("glucami- das").
[00182] O detergente pode conter 0% a cerca de 65% de um adju- vante ou agente complexante de detergente tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodia- minatetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapenta-acético, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).
[00183] O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Po- límeros exemplificativos incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinil- pirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) (PEG), poli(álcool de vinila) (PVA), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, por exem- plo, poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico) e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.
[00184] A(s) enzima(s) da composição de detergente pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizantes convencionais, por exem- plo, um poliol (por exemplo, propilenoglicol ou glicerol), um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático) ou um derivado de ácido fenilborônico (por exemplo, ácido 4-formilfenilborônico). A com- posição pode ser formulada como descrito em WO 92/19709 e WO 92/19708.
[00185] É contemplado que, nas composições de detergente, em particular as variantes de enzima podem ser adicionadas em uma quan- tidade correspondendo a cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem (por exemplo, cerca de 0,05 a cerca de 5,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem ou 0,1 a cerca de 1,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem).
[00186] —Numerosas formulações de detergente exemplificativas às quais as presentes amilases podem ser adicionadas (ou é em alguns casos são identificadas como um componente de) são descritas em WOZ2013063460. Estas incluem formulações/embalagens de detergente de dose unitária comercialmente disponíveis tais como PUREXº Ultra- Packs (Henkel), FINISHº Quantum (Reckitt Benckiser), CLOROX'Y 2 Packs (Clorox), OxiClean Max Force Power Paks (Church & Dwight), TIDEº Stain Release, CASCADE?º ActionPacs e TIDE? Pods (Procter & Gamble), PS.
7.6. Métodos de Avaliação da Atividade de Amilase em Composi- ções de Detergente
[00187] — Numerosos ensaios de limpeza de a-amilase são conhecidos na técnica, incluindo ensaios de amostra e microamostra. Os Exemplos anexos descrevem somente alguns tais ensaios.
[00188] De modo a ilustrar adicionalmente as composições e méto- dos, e suas vantagens, os seguintes exemplos específicos são dados com o entendimento de que são ilustrativos em vez de limitantes.
8. Composições de Fabricação de Cerveja
[00189] A presente amilase variante pode ser um componente de uma composição de fabricação de cerveja usada em um processo de fabricação de cerveja, i.e., preparação de uma bebida de malte fermen- tada. Os carboidratos não fermentáveis formam a maior parte dos sóli- dos dissolvidos na cerveja final. Este resíduo permanece por causa da incapacidade de amilases de malte de hidrolisarem as alfa-1,6-ligações do amido. Os carboidratos não fermentáveis contribuem cerca de 50 calorias por 12 onças de bebida. Uma amilase, em combinação com uma glucoamilase e opcionalmente uma pululanase e/ou isoamilase, auxilia na conversão do amido em dextrinas e açúcares fermentáveis, diminuindo os carboidratos não fermentáveis residuais na cerveja final.
[00190] Todas as referências citadas aqui são aqui incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos. De modo a ilustrar adicionalmente as composições e métodos, e suas vantagens, os se- guintes exemplos específicos são dados com o entendimento de que são ilustrativos em vez de limitantes.
EXEMPLO Exemplo 1: Preparação de amilases variantes
[00191] Sequências de DNA codificando a-amilases variantes, um peptídeo de sinal para secreção e sequências 5' e 3' adicionais para amplificação e subclonagem foram construídas por amplificação de PCR padrão ou pedidas a um vendedor comercial (GeneArt). Foram usados procedimentos-padrão para inserir a sequência de DNA em um vetor bacteriano para expressão de proteínas secretadas em células de Bacillus subtilis. Os construtos foram verificados por sequenciamento de DNA. As células foram cultivadas durante cerca de 68 horas em meio de expressão adequado para expressão de proteínas secretadas a par- tir de B. subtilis. As células foram separadas do sobrenadante contendo proteína por centrifugação seguida por filtração através de membranas de 0,45 um (EMD Millipore). Quando necessário foi alcançada purifica- ção adicional através de cromatografia de permuta iônica com resina Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). A concentração das proteínas foi determinada por cromatografia líquida de elevado desem- penho (HPLC) e absorvância a 280 nm.
Exemplo 2: Atividade de limpeza de amido em ensaio de microa- mostra CS28
[00192] A atividade de limpeza de amido de a-amilases variantes foi avaliada com amido de arroz em tecido de teste comercial de algodão (CS28, Center for Test Materials, Países Baixos) cortado até amostras circulares de 5,5 mm. Duas amostras foram colocadas em cada poço de uma placa de microtitulação de poliestireno com fundo plano Corning 9017 de 96 poços. Soluções de proteína em tampão (CAPS a 50 mM, CaCl2 a 1 MM, Tween-80 a 0,005% v/v, pH 10,5), diluídas a partir do sobrenadante original, foram adicionadas ao tecido de teste. A solução foi agitada durante 15 minutos a 23 ºC. Amostras do sobrenadante fo- ram avaliadas quanto à liberação de corante por medição da absorvân- cia da solução a 488 nm com um espectrofotômetro. A curva-padrão foi ajustada a uma curva de progresso da reação exponencial e as amos- tras da variante foram similarmente ajustadas usando absorvâncias ini- ciais e finais fixas. O índice de desempenho foi definido como a razão entre a constante de ajuste exponencial para a variante e aquela de uma curva padrão baseada nos resultados obtidos com CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2 em WOZ2014/164777 e US20160017303A1). STAINZYME? 12L (SEQ ID NO: 1 em WO2017114891) foi incluída como uma referência co- mercial. STAINZYMEº 12L é uma variante da a-amilase de Bacillus sp. AAB560 (SEQ ID NO: 7 presente e SEQ ID NO: 2 em WO2017114891). Os resultados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Desempenho de limpeza de variantes de a-amilase [famiase — — indicede Desempenho — |
[00193] Amy707-3790H, Amy707-2170D, Amy707-3156D e Amy707-3915D superaram claramente tanto CspAmy2-v1 como STAIN- ZYMEº 12L. Amy707-4037D superou CspAmy2-v1. Exemplo 3: Estabilidade das variantes
[00194] A estabilidade relativa das variantes de a-amilase foi avali- ada por medição da perda de atividade após incubação em tampão (CAPS a 50 mM, CaCl2 a 2 mM, Tween-80 a 0,005% v/v, pH 10,5) a uma temperatura elevada. As soluções da enzima em tampão foram es- tressadas a 85 ºC durante 15 minutos em um termociclador. Amostras de enzima nas soluções de teste foram tiradas tanto antes do como após estresse da solução a temperatura elevada. A atividade de amilase presente nas amostras foi avaliada usando o ensaio Amilase HR (Me- gazyme). Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Estabilidade de variantes de a-amilase [amiaso — avidadeResídual — |
[00195] —Amy707-3790H e Amy707-2170D superaram claramente CspAmy2-v1, enquanto todas as variantes superaram STAINZYMES 12L.
[00196] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são deste modo incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos e na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e indivi- dualmente indicado como estando assim incorporado por referência.
Claims (8)
1. a-Amilase variante recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, excluindo a enzima Amy707 de tipo selvagem, a enzima AASG6O de Bacillus sp. de tipo selvagem e suas variantes co- nhecidas.
2. a-Amilase variante, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 96% de identidade de sequências de aminoáci- dos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
3. a-Amilase variante caracterizada pelo fato de que é codi- ficada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições estringen- tes com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou o seu complemento.
4. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 90% de identidade de sequências de ácidos nucleicos com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo ou um hospedeiro de expressão compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor de expressão.
5. Composição para liquefação de amido caracterizada pelo fato de que compreende a amilase variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Composição de detergente caracterizada pelo fato de que compreende a amilase variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
7. Método para conversão de amido em oligossacarídeos, caracterizado pelo fato de que compreende contato de amido com quan- tidade eficaz da amilase variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
8. Método para remoção de uma nódoa ou mancha rica em amido de uma superfície, caracterizado pelo fato de que compreende contato da superfície com uma quantidade eficaz da amilase variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e permissão para que o polipeptídeo hidrolise os componentes de amido presentes na nódoa rica em amido para produzir moléculas derivadas de amido menores que se dissolvem na composição aquosa, removendo, deste modo, a nódoa rica em amido da superfície.
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