BR112020001972A2

BR112020001972A2 - proteínas de ligação a nkg2d, cd16 e flt3

Info

Publication number: BR112020001972A2
Application number: BR112020001972-0A
Authority: BR
Inventors: Gregory P. Chang; Ann F. Cheung; William Haney; Bradley M. LUNDE; Bianka Prinz
Original assignee: Dragonfly Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2020-08-04
Also published as: MA49769A; WO2019028027A1; MX2020001257A; IL272374A; EP3661554A4; JP2020529410A; KR20200033302A; JP2023106433A; AU2018309712A1; EP3661554A1; EA202090387A1; CN111132698A; CA3070986A1; CO2020001981A2; SG11202000632QA; US20200165344A1

Abstract

Trata-se de proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D, CD 16 e um antígeno associado a tumor FLT3 são descritos, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento contra o câncer.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A NKG2D, CD16 E FLT3

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/539.421, depositado em 31 de julho de 2017; cujo conteúdo é incorporado na presente invenção a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e está incorporada na presente invenção a título de referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 30 de julho de 2018, é denominada DFY-027WO_SL.txt e tem 103.731 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção se refere a proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a NKG2D, CD16, e um antígeno associado a tumor FLT3.

FUNDAMENTOS

[004] O câncer continua a ser um problema de saúde significativo apesar dos esforços de pesquisa substanciais e avanços científicos relatados na literatura para tratar esta doença. Os cânceres de sangue e medula óssea são frequentemente tipos de câncer diagnosticados, incluindo múltiplos mielomas, leucemia e linfomas. As opções de tratamento atuais para estes cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem desafiadores para tratar usando opções terapêuticas existentes.

[005] As imunoterapias de câncer são desejáveis porque são altamente específicas e podem facilitar a destruição de células cancerígenas usando o próprio sistema imunológico do paciente. As proteínas e fusão como engatadores de célula T biespecíficos são imunoterapias de câncer descritas na literatura que se ligam às células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Os anticorpos que se ligam a certos antígenos associados a tumor e a certas células imunes foram descritos na literatura. Consultar, por exemplo, os documentos WO 2016/134371 e WO 2015/095412.

[006] As células exterminadoras naturais (NK) são um componente do sistema imunológico inato e constituem aproximadamente 15% de linfócitos de circulação. As células NK infiltram virtualmente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por capacidade da mesma de exterminar células tumorais de modo eficaz sem a necessidade de sensibilização anterior. As células NK ativadas exterminam células-alvo por meios similares às células T citotóxicas - isto é, por meio de grânulos citolíticos que contêm perforina e granzimas bem como por meio de trajetórias de receptor de morte. As células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias como IFN-γ e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos para o tecido-alvo.

[007] As células NK respondem a sinais através de uma variedade de receptores de ativação e inibidores na superfície da mesma. Por exemplo, quando as células NK encontram autocélulas saudáveis, sua atividade é inibida através da ativação dos receptores tipo imunoglobulina de célula exterminadora (KIRs). Alternativamente, quando as células NK encontram células estranhas ou células cancerígenas, as mesmas são ativadas por meio de receptores dos mesmos de ativação (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). As células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através de receptores de CD16 em sua superfície. A sensibilidade geral de células NK à ativação depende da soma de sinais estimulantes e inibidores.

[008] A tirosina quinase 3 tipo FMS (FLT3), uma tirosina quinase de receptor expressada em progenitores multipotentes e progenitores linfoides comuns, é importante para o desenvolvimento dos sistemas hematopoiético e imunológico. A sinalização através de FLT3 desempenha um papel importante na sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. As mutações do receptor de FLT3 podem levar ao desenvolvimento de leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia de célula T, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e tricoleucemia. As duplicações em tandem internas de FLT3 (FLT3-ITD) são as mutações mais comuns associadas à leucemia mielogênica aguda (AML).

SUMÁRIO

[009] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor de CD16 em células exterminadoras naturais, e um antígeno associado a tumor FLT3. Tais proteínas podem engatar mais de um tipo de receptor de ativação de NK, e pode bloquear a ligação de ligantes naturais a NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos. Em algumas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos e em outras espécies como roedores e macacos cinomolgos. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em detalhes adicionais abaixo.

[010] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece uma proteína que incorpora um primeiro sítio de ligação de antígeno que liga NKG2D; um segundo sítio de ligação de antígeno que liga um antígeno associado a tumor FLT3; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para ligar CD16, ou um terceiro sítio de ligação de antígeno que liga CD16.

[011] Os sítios de ligação de antígeno, cada um, podem incorporar um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (por exemplo, dispostos como em um anticorpo ou fundidos em conjunto para formar um scFv), ou um ou mais dos sítios de ligação de antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, como um anticorpo de VHH com um anticorpo camelídeo ou um anticorpo de VNAR como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos.

[012] Em um aspecto, a presente invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor de CD16 em células exterminadoras naturais, e um antígeno associado a tumor FLT3. O sítio de ligação de NKG2D inclui um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 93.

[013] O primeiro sítio de ligação de antígeno, que se liga a NKG2D, em algumas modalidades, pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1, como tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 1, e/ou incorporando sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 105), CDR2 (SEQ ID NO: 106) e CDR3 (SEQ ID NO: 107) de SEQ ID NO: 1. O domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1 pode ser acoplado a uma variedade de domínios variáveis de cadeia leve para formar um sítio de ligação de NKG2D. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação de antígeno que incorpora um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1 pode incorporar adicionalmente um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de qualquer uma das sequências relacionadas às SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 e 40. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação de antígeno incorpora um domínio variável de cadeia pesada com sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 1 e um domínio variável de cadeia leve com sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas a qualquer uma das sequências selecionadas a partir de SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 e 40.

[014] Alternativamente, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 42. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 41 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 43), CDR2 (SEQ ID NO: 44), e CDR3 (SEQ ID NO: 45) de SEQ ID NO: 41. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 42 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47), e CDR3 (SEQ ID NO: 48) de SEQ IDNO: 42.

[015] Em outras modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 49 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 50. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 49 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52), e CDR3 (SEQ ID NO: 53) de SEQ ID NO: 49. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%

ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 50 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55), e CDR3 (SEQ ID NO: 56) de SEQ IDNO: 50.

[016] Alternativamente, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 57 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 58, como tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 57 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 58, respectivamente.

[017] Em outra modalidade, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 59 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 60, Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 59, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 134), CDR2 (SEQ ID NO: 135) e CDR3 (SEQ ID NO: 136) de SEQ ID NO: 59. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 60, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 137), CDR2 (SEQ ID NO: 138) e CDR3 (SEQ ID NO: 139) de SEQ ID NO: 60.

[018] O primeiro sítio de ligação de antígeno, que se liga a NKG2D, em algumas modalidades, pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 61 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 62. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 61 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 63), CDR2 (SEQ ID NO: 64), e CDR3 (SEQ ID NO: 65) de SEQ ID NO:

61. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 62 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 66), CDR2 (SEQ ID NO: 67), e CDR3 (SEQ ID NO: 68) de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 70. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 69 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 71), CDR2 (SEQ ID NO: 72), e CDR3 (SEQ ID NO: 73) de SEQ ID NO: 69. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 70 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 74), CDR2 (SEQ ID NO: 75), e CDR3 (SEQ ID NO: 76) de SEQ ID NO: 70.

[019] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 78. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 77 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 79), CDR2 (SEQ ID NO: 80), e CDR3 (SEQ ID NO: 81) de SEQ ID NO: 77. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 78 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83), e CDR3 (SEQ ID NO: 84) de SEQ ID NO: 78.

[020] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 85 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87), CDR2 (SEQ ID NO: 88), e CDR3 (SEQ ID NO: 89) de SEQ ID NO: 85. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 86 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91), e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ IDNO: 86.

[021] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 94. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 93 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96), e CDR3 (SEQ ID NO: 97) de SEQ ID NO: 93. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 94 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 98), CDR2 (SEQ ID NO: 99) e CDR3 (SEQ ID NO: 100) de SEQ ID NO: 94.

[022] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 101 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 102, como tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 101 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 102, respectivamente. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação de antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 103 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 104, como tendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 103 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 104, respectivamente.

[023] Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a FLT3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 109 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:

113. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 109, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 110), CDR2 (SEQ ID NO: 111) e CDR3 (SEQ ID NO: 112) de SEQ ID NO: 109. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 113, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 114), CDR2 (SEQ ID NO: 115) e CDR3 (SEQ ID NO: 116) de SEQ ID NO: 113.

[024] Alternativamente, o segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a FLT3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 117 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 121. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 117, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 118), CDR2 (SEQ ID NO: 119) e CDR3 (SEQ ID NO: 120) de SEQ ID NO: 117. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 121, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) e CDR3 (SEQ ID NO: 124) de SEQ ID NO: 121.

[025] Alternativamente, o segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a FLT3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 125 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 129. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 125, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 126),

CDR2 (SEQ ID NO: 127) e CDR3 (SEQ ID NO: 128) de SEQ ID NO: 125. De modo similar, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação de antígeno pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 129, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 130), CDR2 (SEQ ID NO: 131) e CDR3 (SEQ ID NO: 132) de SEQ ID NO: 129.

[026] Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação de antígeno incorpora um domínio variável de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve presente no primeiro sítio de ligação de antígeno.

[027] Em algumas modalidades, a proteína incorpora uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para ligar CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende dobradiça e domínios de CH2 e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos 234 a 332 de um anticorpo de IgG humana.

[028] As formulações contendo qualquer uma das proteínas descritas na presente invenção; células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam as proteínas e métodos de intensificar a morte de célula tumoral usando as proteínas também são fornecidos.

[029] Outro aspecto da invenção fornece um método para tratar câncer em um paciente. O método compreende administrar a um paciente que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas de ligação multiespecíficas descritas na presente invenção. Os cânceres exemplificativos a serem tratados usando as proteínas de ligação multiespecíficas incluem leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia de célula T, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e tricoleucemia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[030] A Figura 1 é uma representação de um anticorpo heterodimérico multiespecífico. Cada braço pode representar o domínio de ligação de NKG2D ou o domínio de ligação de FLT3. Em algumas modalidades, os domínios de ligação de NKG2D e FLT3 podem compartilhar uma cadeia leve comum.

[031] A Figura 2 é uma representação de um anticorpo heterodimérico multiespecífico. O domínio de ligação de NKG2D ou o domínio de ligação de FLT3 pode assumir o formato de scFv (braço direito).

[032] A Figura 3 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.

[033] A Figura 4 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a NKG2D recombinante cinomolgo em um ensaio ELISA.

[034] A Figura 5 são gráficos de linhas que demonstram a afinidade de ligação de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a NKG2D recombinante de camundongo em um ensaio ELISA.

[035] A Figura 6 consiste em gráficos de barras demonstrando a ligação de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a células de EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo mostrando dobra sobre segundo plano (FOB) de intensidade de fluorescência média (MFI).

[036] A Figura 7 consiste em gráficos de barras demonstrando a ligação de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a células de EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo mostrando dobra sobre segundo plano (FOB) de intensidade de fluorescência média (MFI).

[037] A Figura 8 consiste em gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a

NKG2D-Fc humano recombinante através da competição com ULBP-6 de ligante natural.

[038] A Figura 9 consiste em gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a NKG2D-Fc humano recombinante através da competição com MICA de ligante natural.

[039] A Figura 10 consiste em gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) a NKG2D-Fc de camundongo recombinante através da competição com Rae-1 delta de ligante natural.

[040] A Figura 11 são gráficos de barras que mostram ativação de NKG2D humano por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) através da quantificação da porcentagem de células positivas de TNF-α, que expressam proteínas de fusão de NKG2D humano-CD3 zeta.

[041] A Figura 12 são gráficos de barras que mostram ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) através da quantificação da porcentagem de células positivas de TNF-α, que expressam proteínas de fusão de NKG2D de camundongo-CD3 zeta.

[042] A Figura 13 consiste em gráficos de barras que mostram a ativação de células NK humanas por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones).

[043] A Figura 14 consiste em gráficos de barras que mostram a ativação de células NK humanas por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones).

[044] A Figura 15 consiste em gráficos de barras que mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones).

[045] A Figura 16 consiste em gráficos de barras que mostram a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação de NKG2D (listados como clones).

[046] A Figura 17 consiste em gráficos de barras que mostram o efeito citotóxico de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) em células tumorais.

[047] A Figura 18 consiste em gráficos de barras que mostram a temperatura de fusão de domínios de ligação de NKG2D (listados como clones) medida por fluorimetria de varredura diferencial.

[048] As Figuras 19A a 19C consiste em gráficos de barras de ativação de células NK sinérgica usando ligação de CD16 e NKG2D. A Figura 19A demonstra níveis de CD 107a; a Figura 19B demonstra níveis de IFN-γ; a Figura 19C demonstra níveis de CD 107a e IFN-γ. Os gráficos indicam o ± SD (n = 2) médio. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.

[049] A Figura 20 é uma representação de um TriNKET na forma de Triomab, que é um anticorpo trifuncional biespecífico que mantém um formato tipo IgG. Esta quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que originam de dois anticorpos parentais. A forma de Triomab pode ser um construto heterodimérico contendo 1/2 de anticorpo de rato e 1/2 de anticorpo de camundongo.

[050] A Figura 21 é uma representação de um TriNKET na forma de Cadeia Leve Comum de KiH, que envolve a tecnologia de knobs-into-holes "ressaltos em orifícios" (KIHs). KiH é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.TriNKET no formato de KiH pode ser um construto heterodimérico com 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2, contendo duas cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que é emparelhada com ambas as cadeias pesadas.

[051] A Figura 22 é uma representação de um TriNKET na forma de imunoglobulina de domínio duplamente variável (DVD-Ig™), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de ligantes de ocorrência natural flexíveis, e produz uma molécula tipo IgG tetravalente. DVD-Ig™ é um construto homodimérico em que o domínio variável que alveja o antígeno 2 é fundido à terminação N de um domínio variável de Fab que alveja o antígeno 1. A forma de DVD- Ig™ contém Fc normal.

[052] A Figura 23 é uma representação de um TriNKET na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab), que é um construto heterodimérico que contém 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos a Fc. O emparelhamento de cadeia leve (LC)-cadeia pesada (HC) é assegurado pela interface ortogonal. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.

[053] A Figura 24 é uma representação de um TriNKET no formato de Ig 2- em-1.

[054] A Figura 25 é uma representação de um TriNKET na forma de ES, que é um construto heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direcionamento eletrostático no Fc.

[055] A Figura 26 é uma representação de um TriNKET na forma de Troca de Braço de Fab: anticorpos que trocam braços de Fab troca de uma cadeia pesada e cadeia leve fixada (meia molécula) com um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, resultando em anticorpos biespecíficos. A forma de Troca de Braço de Fab (cFae) é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.

[056] A Figura 27 é uma representação de um TriNKET na forma de Corpo de SEED, que é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.

[057] A Figura 28 é uma representação de um TriNKET na forma de LuZ-Y,

em que um zipper de leucina é usado para induzir heterodimerização de duas HCs diferentes. A forma de LuZ-Y é um heterodímero contendo dois scFabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos a Fc. A heterodimerização é assegurada através de motivos de zipper de leucina fundidos à terminação C de Fc.

[058] A Figura 29 é uma representação de um TriNKET na forma de Corpo de Cov-X.

[059] As Figuras 30A a 30B são representações de TriNKETs nas formas de Corpo Kλ, que são construtos heterodiméricos com dois Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: um Fab que alveja o antígeno 1 contém kappa LC, e o segundo Fab que alveja o antígeno 2 contém lambda LC. A Figura 30A é uma representação exemplificativa de uma forma de um Corpo de Kλ; a Figura 30B é uma representação exemplificativa de outro Corpo de Kλ.

[060] A Figura 31 é um construto heterodimérico de Oasc-Fab que inclui ligação de Fab ao alvo 1 e scFab que se liga ao alvo 2, ambos os quais são fundidos ao domínio Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no domínio Fc.

[061] A Figura 32 é um DuetMab, que é um construto heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antígenos 1 e 2, e um Fc que é estabilizado por mutações de heterodimerização. Os Fab 1 e 2 contêm pontes de S-S diferenciais que asseguram o emparelhamento correto de cadeia leve e cadeia pesada.

[062] A Figura 33 é um CrossmAb, que é um construto heterodimérico com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Os domínios de CL e CH1, e os domínios de VH e VL são comutados, por exemplo, CH1 é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.

[063] A Figura 34 é um Fit-Ig, que é um construto homodimérico em que a ligação de Fab ao antígeno 2 é fundida à terminação N de HC de Fab que se liga ao antígeno 1. O construto contém Fc tipo selvagem.

[064] A Figura 35 consiste em gráficos de linhas que mostram a ligação de TriNKETs que alvejam FLT3 a NKG2D expressados em células de EL4. O anticorpo monoclonal de FLT3 IMCEB10 foi usado como um controle.

[065] As Figuras 36A e 36B são gráficos de linhas que mostram a ligação de TriNKETs que alvejam FLT3 a FLT3 expressados em linhagens celulares de AML humana Molm-13 (Figura 36A) e EOL-1 (Figura 36B). O anticorpo monoclonal de FLT3 IMCEB10 foi usado como um controle.

[066] As Figuras 37A e 37B são gráficos de linhas que mostram a internalização de TriNKETs que alvejam FLT3 em células de EOL-1 (Figura 37A) e células de Molm-13 (Figura 37B) após 2 horas e 20 horas de incubação a 37°C. Lintuzumab foi usado como um controle.

[067] As Figuras 38A e 38B são gráficos de linhas que mostram citotoxicidade mediada por TriNKETs de células NK humanas em relação a células de EOL-1 que expressam FLT3. O anticorpo monoclonal de FLT3 IMCEB10 e TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 derivado de IMCEB10 são mostrados na Figura 38A. O anticorpo monoclonal de FLT3 4G8 e TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 derivado de 4G8 são mostrados na Figura 38B.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[068] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que ligam o receptor NKG2D e ao receptor de CD16 em células exterminadoras naturais, e o antígeno associado a tumor FLT3. Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas incluem, ainda, um sítio de ligação de antígeno adicional que liga FLT3 ou outro antígeno associado a tumor. A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem tais proteínas de ligação multiespecíficas e métodos terapêuticos usando tais proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, para propósitos como tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo em seções; entretanto, os aspectos da invenção descritos em uma seção particular não devem ser limitados a qualquer seção particular.

[069] Para facilitar um entendimento da presente invenção, inúmeros termos e frases são definidos abaixo.

[070] Os termos “um” e “uma” como usados na presente invenção significam “um ou mais” e incluem o plural, exceto se o contexto for inadequado.

[071] Como usado na presente invenção, o termo “sítio de ligação de antígeno” se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação de antígeno. Em anticorpos humanos, o sítio de ligação de antígeno é formado por resíduos de aminoácido das regiões variáveis ("V") N-terminais das cadeias pesada (“H”) e leve (“L”). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve são chamados de “regiões hipervariáveis” que são interpostas entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como “regiões de framework", ou “FR". Portanto, o termo “FR” se refere às sequências de aminoácidos que são naturalmente encontradas entre e adjacentes às regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas em relação uma à outra em espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação de antígeno. A superfície de ligação de antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são chamadas de “regiões determinantes de complementaridade" ou “CDRs". Em certos animais, como camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação de antígeno é formado por uma cadeia de anticorpo único que fornece um “anticorpo de domínio único". Os sítios de ligação de antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que retém a superfície de ligação de antígeno, ou em um polipeptídeo recombinante como um scFv, usando um ligante de peptídeo para conectar o domínio variável de cadeia pesada ao domínio variável de cadeia leve em um único polipeptídeo.

[072] O termo “antígeno associado a tumor” como usado na presente invenção significa qualquer antígeno incluindo, mas sem limitações, uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídeo que é associado ao câncer. Tal antígeno pode ser expressado em células malignas ou no microambiente de tumor como em vasos sanguíneos associados ao tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrações imunes.

[073] Como usado na presente invenção, os termos “indivíduo” e “paciente” se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos na presente invenção. Tais organismos preferencialmente incluem, mas sem limitações, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e similares) e, mais preferencialmente, incluem seres humanos.

[074] Como usado na presente invenção, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma formulação ou via de administração particular. Como usado na presente invenção, o termo “tratar” inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuir, reduzir, modular, melhorar ou eliminar, que resulte no aprimoramento da afecção, doença, distúrbio e similares, ou melhorar um sintoma do mesmo.

[075] Como usado na presente invenção, o termo “composição farmacêutica” se refere à combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso para diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.

[076] Como usado na presente invenção, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” se refere a qualquer um dos carreadores farmacêuticos-padrão, como uma solução salina tamponada de fosfato, água, emulsões (por exemplo, como um óleo/água ou água/óleo emulsões) e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Como exemplos de carreadores, estabilizadores e adjuvantes, consultar, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975],

[077] Como usado na presente invenção, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) dum composto da presente invenção que, mediante a administração a um indivíduo, é capaz de fornecer um composto desta invenção ou um metabólito ativo ou resíduo do mesmo. Como é conhecido por aqueles versados na técnica, “sais” dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Os ácidos exemplificativos incluem, mas sem limitações, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, fórmico, benzoico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzenossulfônico e similares. Outros ácidos, como oxálico, embora não sejam, eles próprios, farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e sais dos mesmos de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.

[078] As bases exemplificativas incluem, mas não limitadas a, hidróxidos de metal alcalino (por exemplo, sódio), hidróxidos de metal terroso alcalino (por exemplo, magnésio), amônia e compostos de formula NW4+, em que W é C1-4 alquila e similares.

[079] Os sais exemplificativos incluem, mas sem limitações: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, sulfato de dodecila, etanossulfonato, fumarato, fluco-heptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodo-hidrato, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2- naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato e similares. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção compostos com um cátion adequado como Na+, NH4+ e NW4+ (em que W é um grupo C1-4 alquila) e similares.

[080] Para uso terapêutico, os sais dos compostos da presente invenção são contemplados como sendo farmaceuticamente aceitáveis. Entretanto, os sais de ácidos e bases que não são farmaceuticamente aceitáveis podem também encontrar uso, por exemplo, na preparação ou na purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.

[081] Ao longo da descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo, ou compreendendo componentes específicos, ou onde os processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, haja composições da presente invenção que consistem essencialmente nos, ou consistem nos componentes mencionados, e que haja processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente nas, ou consistem nas etapas de processamento mencionadas.

[082] De modo geral, as composições que especificam uma porcentagem são em peso, exceto se especificado de outro modo. Ademais, se uma variável não for acompanhada por uma definição, então, a definição anterior da variável controla. I. PROTEÍNAS

[083] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor de CD16 em células exterminadoras naturais, e o antígeno associado a tumor FLT3. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos descritos na presente invenção. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas ao receptor NKG2D e receptor de CD16 em uma célula exterminadora natural intensifica a atividade da célula exterminadora natural em relação à destruição de células tumorais que expressam FLT3. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas a células que expressam FLT3 coloca as células cancerígenas em proximidade com a célula exterminadora natural, o que facilita a destruição direta e indireta das células cancerígenas pela célula exterminadora natural. A descrição adicional de algumas proteínas de ligação multiespecíficas exemplificativas é fornecida abaixo.

[084] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga a células que expressam receptor NKG2D, que podem incluir, mas sem limitações, células NK, células T de γδ e células T de CD8+ αβ. Mediante a ligação de NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem impedir os aglutinantes naturais, como ULBP6 e MICA, de se ligarem a NKG2D e ativarem receptores NKG2D.

[085] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga a FLT3. As células que expressam FLT3 podem ser encontradas em leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda e leucemia de célula T.

[086] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam CD16, um receptor de Fc na superfície de leucócitos incluindo células exterminadoras naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células de masto e células dendríticas foliculares.

[087] As proteínas de ligação multiespecíficas descritas na presente invenção podem assumir vários formatos. Por exemplo, um formato é um anticorpo heterodimérico multiespecífico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina (Figura 1). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio de Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um primeiro domínio de cadeia pesada de CH1. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um primeiro domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio constante de cadeia leve. A primeira cadeia leve de imunoglobulina, junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, forma um sítio de ligação de antígeno que liga NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio de Fc (dobradiça-CH2- CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um segundo domínio de cadeia pesada de CH1. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um segundo domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia leve de imunoglobulina, junto com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, forma um sítio de ligação de antígeno que liga FLT3. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligarem a CD16 (Figura 1). Em algumas modalidades, a primeira cadeia leve de imunoglobulina é idêntica à segunda cadeia leve de imunoglobulina.

[088] Outro formato exemplificativo envolve um anticorpo heterodimérico multiespecífico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina (Figura 2). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio de Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido por meio de um ligante ou uma articulação anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto por um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve que emparelha e liga NKG2D, ou liga o antígeno de FLT3. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio de Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um domínio de cadeia pesada de CH1. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina emparelha com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga a NKG2D ou liga o antígeno associado a tumor FLT3. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc, juntos, são capazes de se ligarem a CD16 (Figura 2).

[089] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos à terminação C do domínio de CH3 de região constante, opcionalmente por meio de uma sequência ligante. Em certas modalidades, o motivo de ligação de antígeno é uma região variável de cadeia única ou estabilizada por dissulfeto (scFv) formando uma molécula tetravalente ou trivalente.

[090] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Triomab, que é um anticorpo trifuncional biespecífico que mantém um formato tipo IgG. Esta quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que originam de dois anticorpos parentais.

[091] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é a forma de Cadeia Leve Comum de KiH (LC), que envolve a tecnologia de knobs- into-holes "ressaltos em orifícios" (KIHs). A KIH envolve domínios de CH3 de modificação genética para criar um “ressalto” ou um “orifício” em cada cadeia pesada para promover a heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia de Fc de “Knobs-into-Holes (KiH) (Ressaltos em Orifícios)” foi introduzir um “ressalto” em um domínio de CH3 (CH3 A) por substituição de um pequeno resíduo por um volumoso (por exemplo, T366WCH3A em numeração de EU). Para acomodar o “ressalto", uma superfície de “orifício” complementar foi criada no outro domínio de CH3 (CH3B) substituindo-se os resíduos vizinhos mais próximos ao ressalto por menores (por exemplo, T366S/L368A/Y407VCH3B)- A mutação de “orifício” foi otimizada por examinação de biblioteca guiada estruturada (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). As estruturas de cristal de raios X de variantes de Fc de KiH (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, etaB Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9): 1947-57; Mimoto F, Kadono S, KatadaH, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1): 132-8) demonstrou que a heterodimerização é termodinamicamente preferida por interações hidrofóbicas conduzidas por complementaridade estérica na interface de núcleo interdomínio de CH3, enquanto as interfaces de ressalto-ressalto e de orifício- orifício não favorecem a homodimerização devido ao impedimento estérico e à perturbação das interações favoráveis, respectivamente.

[092] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de imunoglobulina de domínio duplamente variável (DVD-Ig™), que combina os domínios de ligação de alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de ligantes de ocorrência natural flexíveis e produz uma molécula tipo IgG tetravalente.

[093] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab). Na abordagem de IgG de orto-Fab (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structurebased design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2): 191-8), o projeto regional com base em estrutura introduz mutações complementares na interface de LC e HCVH-CH1 em apenas um Fab, sem quaisquer alterações serem realizadas no outro Fab.

[094] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está no formato de Ig 2-em-1. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de ES, que é um construto heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direcionamento eletrostático no Fc.

[095] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Corpo de kλ, que é um construto heterodimérico com dois Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: Fab1 alvejando o antígeno 1 contém kappa LC, enquanto o segundo Fab que alveja o antígeno 2 contém lambda LC. A Figura 30A é uma representação exemplificativa de uma forma de um Corpo de kλ; a Figura 30B é uma representação exemplificativa de outro Corpo de kλ.

[096] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Troca de Braço de Fab (anticorpos que trocam braços de Fab pela troca de uma cadeia pesada e cadeia leve fixada (meia molécula) por um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, que resulta em anticorpos biespecíficos).

[097] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Corpo de SEED. A plataforma de domínio geneticamente modificado de troca de filamento (SEED) foi projetada para gerar moléculas tipo anticorpo assimétrico e biespecífico, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas de anticorpos naturais. Esta plataforma geneticamente modificada por proteína é baseada na troca de sequências estruturalmente relacionadas de imunoglobulina dentro dos domínios de CH3 conservados. O projeto de SEED permite a geração eficaz de heterodímeros de AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização de domínios de CH3 de SEED de AG e GA. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sei. 2011 24(5):447-54.).

[098] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de LuZ-Y, em que um zipper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas HCs diferentes. (Wranik, BJ. et al.,J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).

[099] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Corpo de Cov-X. Em Corpos de CovX biespecíficos, dois peptídeos diferentes são unidos usando um ligante de azetidinona ramificado e fundidos ao anticorpo de arcabouço sob condições brandas de uma maneira específica quanto ao sítio. Embora os farmacóforos sejam responsáveis por atividades funcionais, o arcabouço de anticorpo confere meia vida longa e distribuição tipo Ig. Os farmacóforos podem ser quimicamente otimizados ou substituídos por outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou exclusivos. (Doppalapudi VRetal.,PNAS (2010), 107(52);22611-22616).

[0100] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica de Oasc-Fab que inclui a ligação de Fab ao alvo 1, e ligação de scFab ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.

[0101] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de DuetMab, que é um construto heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antígenos 1 e 2, e o Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. O Fab 1 e 2 contêm pontes de S-S diferenciais que asseguram o emparelhamento de LC e HC correto.

[0102] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de CrossmAb, que é um construto heterodimérico com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios de CL e CH1, e os domínios de VH e VL são comutados, por exemplo, CH1 é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.

[0103] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de Fit-Ig, que é um construto homodimérico em que a ligação de Fab ao antígeno 2 é fundida à terminação N de HC de Fab que se liga ao antígeno

1. O construto contém Fc tipo selvagem.

[0104] A Tabela 1 lista sequências de peptídeos de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a NKG2D. Os domínios de ligação de NKG2D podem variar em sua afinidade de ligação a NKG2D, no entanto, todos ativam NKG2D humano e células NK. Tabela 1 Clones Sequência de aminoácidos de Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada região variável de cadeia leve

ADI- 27705

ADI- 27724

ADI- 27740 (A40)

ADI- 27741

ADI- 27743

ADI- 28153

ADI- 28226 (C26)

ADI- 28154

ADI- 29399

ADI- 29401

ADI- 29403

ADI- 29405

ADI- 29407

ADI- 29419

ADI- 29421

ADI- 29424

ADI- 29425

ADI- 29426

ADI- 29429

ADI- 29447 (F47)

ADI- 27727

ADI- 29443 (F43)

ADI- 29404 (F04)

ADI- 28200

ADI- 29379 (E79)

ADI- 29463 (F63)

ADI- 27744 (A44)

ADI- 27749 (A49) ADI- 29378 (E78)

[0105] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado pela SEQ ID NO: 101 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado pela SEQ ID NO: 102 para formar um sítio de ligação de antígeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado no documento nº U.S. 9.273.136.

[0106] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado pela SEQ ID NO: 103 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado pela SEQ ID NO: 104 para formar um sítio de ligação de antígeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado no documento nº U.S. 7.879.985.

[0107] Em um aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e receptor de CD16 nas células exterminadoras naturais e ao antígeno FLT3. A Tabela 2 lista algumas sequências exemplificativas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a FLT3. Tabela 2 Clones Sequência de aminoácido de Sequência de aminoácido domínio variável de cadeia pesada de domínio variável de cadeia leve anti-FLT3 (IMCEB10) (Patente no U.S.

8.071.099) anti-FLT3 (4G8) (Patente nº U.S.

9.023.996)

anti-FLT3 (BV10) (Patente no U.S.

9.023.996)

[0108] Alternativamente, sítios de ligação de antígeno inovadores que podem se ligar a FLT3 podem ser identificados por exibição para ligação à sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 133.

[0109] Dentro do domínio Fc, a ligação de CD16 é mediada pela região de dobradiça e o domínio de CH2. Por exemplo, dentro da IgG1 humana, a interação com CD16 é primariamente focalizada em resíduos de aminoácido Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 e N-acetil-D- glucosamina residual de carboidrato no domínio de CH2 (consultar, Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273). Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para intensificar ou reduzir a afinidade de ligação a CD16, como com o uso de bibliotecas exibidas em fago ou bibliotecas de cDNA exibidas em superfície de levedura, ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.

[0110] A montagem de cadeias pesadas de anticorpo heterodimérico pode ser alcançada pela expressão de duas sequências de cadeia pesada de anticorpo diferentes na mesma célula, que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpo bem como montagem de heterodímeros. Promover a montagem preferencial de heterodímeros pode ser alcançada incorporando-se diferentes mutações no domínio de CH3 de cada região constante de cadeia pesada de anticorpo como mostrado nos documentos nos U.S. 13/494870, U.S. 16/028850, U.S. 11/533709, U.S. 12/875015, U.S. 13/289934, U.S. 14/773418, U.S. 12/811207, U.S. 13/866756, U.S. 14/647480 e U.S. 14/830336. Por exemplo, as mutações podem ser realizadas no domínio de CH3 com base em IgG1 humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácido dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que permite que estas duas cadeias heterodimerizem seletivamente uma com a outra. As posições de substituições de aminoácido ilustradas abaixo são todas numeradas de acordo com o índice de EU como em Kabat.

[0111] Em uma situação, uma substituição de aminoácido no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original por um aminoácido maior, selecionado a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W), e pelo menos uma substituição de aminoácido no segundo polipeptídeo substitui o aminoácido (ou aminoácidos) original por um aminoácido (ou aminoácidos) menor, escolhido a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) ou valina (V), de modo que a substituição de aminoácido maior (uma protuberância) se encaixe na superfície das substituições de aminoácido menores (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição de T366W, e o outro pode incorporar três substituições incluindo T366S, L368A e Y407V.

[0112] Um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo da invenção pode ser opcionalmente acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo, como uma região constante de IgG incluindo dobradiça, domínios de CH2 e CH3 com ou sem domínio de CH1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, como uma região constante de IgG1 humana, uma região constante de IgG2, região constante de IgG3 ou região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, como coelho, cachorro, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante em comparação com a região constante de IgG1 humana,

por exemplo, em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e/ou K439. As substituições exemplificativas incluem, por exemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.

[0113] Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas na CH1 de uma região constante de IgG1 humana podem estar no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas na CK de uma região constante de IgG1 humana podem estar no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou T164.

[0114] Alternativamente, as substituições de aminoácido poderiam ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 3. Tabela 3 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F

Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S Conjunto 9 L368D/K370S S364K Conjunto 10 L368E/K370S S364K Conjunto 11 K360E/Q362E D401K Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L Conjunto 13 K370S S364K/E357Q Conjunto 14 F405L K409R Conjunto 15 K409R F405L

[0115] Alternativamente, as substituições de aminoácido poderiam ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 K409W D399V/F405T Conjunto 2 Y349S E357W Conjunto 3 K360E Q347R Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T

[0116] Alternativamente, as substituições de aminoácido poderiam ser selecionadas a partir do seguinte conjunto de substituições mostrados na Tabela

5. Tabela 5 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E

Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D

[0117] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido em cada cadeia de polipeptídeos pode ser selecionada a partir da Tabela 6. Tabela 6 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo L351Y, D399R, D399K, S400K, T366V, T366I, T366L, T366M, S400R, Y407A, Y407I, Y407V N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E

[0118] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 7, em que a posição (ou posições) indicada na coluna de Primeiro Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna de Segundo Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido. Tabela 7 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo K392, K370, K409, orK439 D399, E356 ou E357

[0119] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto na Tabela 8, em que a posição (ou posições) indicada na coluna de Primeiro Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna de Segundo Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido. Tabela 8 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392

[0120] Alternativamente, as substituições de aminoácido poderiam ser selecionadas a partir do seguinte conjunto na Tabela 9. Tabela 9 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo T350V, L351Y, F405A e Y407V T350V, T366L, K392L e T394W

[0121] Alternativa ou adicionalmente, a estabilidade estrutural de uma proteína heteromultidimérica pode ser aumentada através da introdução de S354C na primeira ou na segunda cadeia de polipeptídeos e Y349C na cadeia de polipeptídeos oposta, que forma uma ponte de dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptídeos.

[0122] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 na posição T366, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em T366, L368 e Y407.

[0123] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em T366, L368 e Y407, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de

IgG1 na posição T366.

[0124] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405, e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.

[0125] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.

[0126] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411.

[0127] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407.

[0128] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q347, Y349, K360, e K409, e em que the sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405.

[0129] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405 , e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Y349, K360, Q347 e K409.

[0130] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em D356, E357 e D399.

[0131] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em D356, E357 e D399, e em que the sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439.

[0132] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409.

[0133] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409, e em que the sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399.

[0134] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de S354C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de Y349C.

[0135] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de Y349C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de S354C.

[0136] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de K360E e K409W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de O347R, D399V e F405T.

[0137] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de a cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de O347R, D399V e F405T e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de K360E e K409W.

[0138] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de T366W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T366S, T368A e Y407V.

[0139] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T366S, T368A e Y407V e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de T366W.

[0140] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T350V, L351Y, F405A e Y407V e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T350V, T366L, K392L e T394W.

[0141] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T350V, T366L, K392L e T394W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeos da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por substituições de T350V, L351Y, F405A e Y407V.

[0142] As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser produzidas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; e o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser transfectados de modo estável juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.

[0143] Para alcançar a produção mais alta da proteína multiespecífica, diferentes razões do primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser exploradas para determinar a razão ideal para transfecção para as células hospedeiras. Após a transfecção, clones únicos podem ser isolados para geração de banco celular usando métodos conhecidos na técnica, como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.

[0144] Os clones podem ser cultivados sob condições adequadas para escalonamento ascendente de biorreator e expressão mantida de da proteína multiespecífica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica incluindo centrifugação, filtração de profundidade, lise celular, homogeneização, condensação de congelamento, purificação por afinidade, filtração de gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto. II. CARACTERÍSTICAS DAS PROTEÍNAS MULTIESPECÍFICAS

[0145] As proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção incluem um sítio de ligação de NKG2D, um sítio de ligação de CD16 e um sítio de ligação de FLT3. Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam a células que expressam NKG2D e/ou CD16, como células NK e células tumorais que expressam FLT3 simultaneamente. A ligação das proteínas multiespecíficas às células NK pode intensificar a atividade das células NK em relação à destruição das células tumorais.

[0146] Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam a FLT3 com uma afinidade similar ao anticorpo monoclonal de FLT3 correspondente (isto é, um anticorpo monoclonal contendo o mesmo sítio de ligação de FLT3 que aquele incorporado nas proteínas multiespecíficas). Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas são mais eficazes na exterminação das células tumorais que expressam FLT3 que os anticorpos monoclonais de FLT3 correspondentes.

[0147] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um sítio de ligação de NKG2D e um sítio de ligação para FLT3, ativam as células NK humanas primárias quando cocultivadas com células que expressam FLT3. A ativação de célula NK é marcada pelo aumento em desgranulação de CD 107a e produção de citocina de IFN-γ. Ademais, em comparação com um anticorpo monoclonal de FLT3 correspondente, as proteínas multiespecíficas podem mostrar ativação de células NK humanas superior na presença de células que expressam FLT3.

[0148] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um sítio de ligação de NKG2D e um sítio de ligação para FLT3, intensificam a atividade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 cocultivadas com células que expressam FLT3.

[0149] Em certas modalidades, em comparação com um anticorpo monoclonal correspondente que se liga a FLT3, as proteínas multiespecíficas oferecem uma vantagem no alvejamento de células tumorais que expressam níveis médios e baixos de FLT3.

III APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[0150] A invenção fornece métodos para tratar câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica descrita na presente invenção e/ou uma composição farmacêutica descrita na presente invenção. Os métodos podem ser usados para tratar uma variedade de cânceres que expressam FLT3. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia de célula T, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou tricoleucemia.

[0151] Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer de mama, ovariano, esofágico, de bexiga ou gástrico, carcinoma do duto salivar, carcinomas do duto salivar, adenocarcinoma do pulmão ou formas agressivas de câncer uterino, como carcinoma endometrial seroso uterino. Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer do esôfago, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer retal, câncer renal, câncer de estômago, câncer testicular ou câncer uterino. Ainda em outras modalidades, o câncer é um carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de célula pequena, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer da laringe, câncer parotídeo, câncer do trato biliar, câncer de tiroide, melanoma lentiginoso acral, ceratoses actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma cístico de adenoide, adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocítico, carcinoma de glândula de bartholin, carcinoma de célula basal, câncer biliar, câncer ósseo, câncer de medula óssea, câncer bronquial, carcinoma de glândula bronquial, carcinoide, colangiocarcinoma, condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coroide,

leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, carcinoma de célula clara, câncer de tecido conjuntivo, cistadenoma, câncer do sistema digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, câncer de célula endotelial, câncer ependimal, câncer de célula epitelial, sarcoma de Ewing, câncer de olho e órbita, câncer da genitália feminina, hiperplasia nodular focal, câncer da vesícula biliar, câncer do antro gástrico, câncer do fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer cardíaco, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, carcinoma hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, câncer do duto biliar intra-hepático, câncer conjunto de câncer do jejuno e carcinoma de célula escamosa invasivo, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de célula grande, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas de lentigo maligna, linfoma, male genital câncer, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer meningeal, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer da boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiplo, câncer do músculo, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, melanoma nodular de adenocarcinoma neuroepitelial, câncer de pele não epitelial, linfoma não Hodgkin, carcinoma de célula de aveia, câncer oligodendroglial, câncer da cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer peniano, câncer de faringe, tumores pituitários, plasmacitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de célula renal, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer sinusal, câncer de pele, carcinoma de célula pequena, câncer do intestino delgado, câncer do músculo liso, câncer do tecido mole, tumor de secreção de somatostatina, câncer espinhal, carcinoma de célula escamosa, câncer do músculo estriado, câncer submesotelial, melanima de difusão superficial, leucemia de célula T, leucemia de língua, carcinoma não diferenciado, câncer do ureter, câncer da uretra, câncer da bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer do colo uterino, câncer do corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer da vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.

[0152] Em algumas outras modalidades, o câncer a ser tratado é linfoma não Hodgkin, como um linfoma de célula B ou um linfoma de célula T. Em certas modalidades, a linfoma não Hodgkin é um linfoma de célula B, como um linfoma de célula B grande e difusa, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de célula do manto, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de célula B de zona marginal extranodal, linfoma de célula B de zona marginal nodal, linfoma de célula B de zona marginal esplênico, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, tricoleucemia ou linfoma de sistema nervoso central primário (CNS). Em certas outras modalidades, o linfoma não Hodgkin é um linfoma de célula T, como um linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula T cutânea, linfoma de célula T angioimunoblástico, linfoma de célula T/exterminadora natural extranodal, linfoma de célula T tipo enteropatia, linfoma de célula T tipo paniculite subcutânea, linfoma de célula grande anaplástico ou linfoma de célula T periférico.

IV TERAPIA DE COMBINAÇÃO

[0153] Outro aspecto da invenção fornece terapia de combinação. Uma proteína de ligação multiespecífica descrita na presente invenção pode ser usada em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.

[0154] Os agentes terapêuticos exemplificativos que podem ser usados como parte duma terapia de combinação no tratamento de câncer incluem, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoína, ribomustina, gemcitabina, vincristina, etoposídeo, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatia, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, eliptínio acetato, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoína, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenila, butocina, carmofur, razoxano, sizofilano, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanila, levamisol, teniposida, improssulfano, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferon-beta, interferon-gama (IFN-γ), fator 1 de estimulação de colônia, fator 2 de estimulação de colônia, denileucina diftitóxi, interleucina 2, fator de liberação de hormônio luteinizante e variações dos agentes supracitados que podem exibir ligação diferencial ao seu receptor cognato e meia vida de soro aumentada ou diminuída.

[0155] Uma classe adicional de agentes que pode ser usada como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer consiste em inibidores de ponto de verificação imune. Os inibidores de ponto de verificação imune exemplificativos incluem agentes que inibem um ou mais de (i) antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico (CTLA4), (ii) proteína 1 de morte celular programada (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor de CTLA4, ipilimumab, foi aprovado pela Administração Americana de Alimentos e Fármacos para tratamento de melanoma.

[0156] Contudo, outros agentes que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer são agentes de anticorpo monoclonal que alvejam alvos diferentes de ponto de verificação (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosina- quinase).

[0157] Contudo, outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado a partir de um inibidor de ALK, um inibidor de ATR, um agonista de A2A, um Inibidor de Reparo de Excisão de Base, um Inibidor de Tirosina Quinase de Bcr-Abl, um Inibidor Tirosina Quinase de Bruton, um Inibidor de CDC7, um Inibidor de CHK1, um Inibidor de Quinase Dependente de Ciclina, um Inibidor de DNA-PK, um Inibidor tanto de DNA-PK quanto de mTOR, um Inibidor de DNMT1, um Inibidor de DNMT1 mais 2-cloro- desoxiadenosina, um Inibidor de HD AC, um Inibidor de Trajetória de Sinalização tipo Porco-espinho (Hedgehog), um Inibidor de IDO, um Inibidor de JAK, um Inibidor de mTOR, um Inibidor de MEK, um Inibidor de MELK, um Inibidor de MTH1, um Inibidor de PARP, um Inibidor de Fosfoinositídio 3-Quinase, um Inibidor tanto de PARP1 quanto de DHODH, um Inibidor de Proteassoma, um Inibidor de Topoisomerase-II, um Inibidor de Tirosina Quinase, um Inibidor de VEGFR e um Inibidor de WEE1; (ii) um agonista de 0X40, CD 137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada a partir de IL- 12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.

[0158] As proteínas da invenção também podem ser usadas como um adjunto para remoção cirúrgica da lesão primária.

[0159] A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e a temporização relativa de administração podem ser selecionados para alcançar um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, ao administrar uma terapia de combinação a um paciente que precisa de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas que compreendem os agentes terapêuticos, podem ser administradas em qualquer ordem como, por exemplo, sequencialmente, concorrente, juntos, simultaneamente e similares. Ademais, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo quando o agente (ou agentes) terapêutico adicional exerce seu efeito profilático ou terapêutico ou vice-versa. V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0160] A presente divulgação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita na presente invenção. A composição pode ser formulada para uso em uma variedade de sistemas de distribuição de fármaco. Um ou mais carreadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação adequada. As formulações adequadas para uso na presente divulgação são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17a ed.,

1985. Para uma breve revisão de métodos para distribuição de fármaco, consultar, por exemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).

[0161] A formulação de distribuição de fármaco intravenosa da presente divulgação pode ser contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode ser conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 ampolas. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento e 45 mg da formulação seca por congelamento podem ser contidos em uma ampola. Em certas modalidades, cerca de 40 mg a cerca de 100 mg de formulação seca por congelamento podem ser contidos em uma ampola. Em certas modalidades, a formulação seca por congelamento de 12, 27 ou 45 ampolas são combinadas para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação de fármaco intravenosa. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/ampola a cerca de 1000 mg/ampola. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/ampola. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/ampola.

[0162] A proteína pode existir em uma formulação farmacêutica aquosa líquida incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína em uma solução tamponada formando uma formulação.

[0163] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem ser filtradas até a esterilização. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como estão, ou liofilizadas, em que a preparação liofilizada é combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente será entre 3 e 11, mais preferencialmente, entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e com máxima preferência, entre 7 e 8, como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes mencionados acima. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.

[0164] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma formulação com um período de armazenamento estendido incluindo a proteína da presente divulgação, em combinação com manitol, monohidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, dihidrato de fosfato de sódio, dihidrato de fosfato de dihidrogênio de sódio, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.

[0165] Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteína da presente divulgação em uma solução de pH tamponado. O tampão desta invenção pode ter um pH que varia de cerca de 4 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Faixas intermediárias aos pHs mencionados também são destinadas a serem parte desta divulgação. Por exemplo, as faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores mencionados acima como limites superior e/ou inferior são destinadas serem incluídas. Os exemplos de tampões que irão controlar o pH dentro desta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácido orgânico.

[0166] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema de tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de 8. Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5, ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema de tampão inclui mono- hidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, hi-hidrato de fosfato dissódico e/ou hi- hidrato de fosfato de di-hidrogênio de sódio. Em certas modalidades, o sistema de tampão inclui cerca de 1,3 mg/mL de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/mL), cerca de 0,3 mg/mL de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/mL), cerca de 1,5 mg/mL de hi-hidrato de fosfato dissódico (por exemplo, 1,53 mg/mL), cerca de 0,9 mg/mL de hi-hidrato de fosfato de di-hidrogênio de sódio (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/mL de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/mL). Em certas modalidades, o sistema de tampão inclui 1 a 1,5 mg/mL de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/mL de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/mL de hi- hidrato de fosfato dissódico, 0,7 a 1,1 mg/mL de hi-hidrato de fosfato de di-

hidrogênio de sódio e 6,0 a 6,4 mg/mL de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.

[0167] Um poliol, que atua como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionada também pode ser alterada em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade inferior de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (como trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é o manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 5 a cerca de 20 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 7,5 a 15 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 10 a 14 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 12 mg/mL. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.

[0168] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Os detergentes exemplificativos incluem detergentes não iônicos como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionada é de modo que reduza a agregação do anticorpo formulado e/ou minimize a formação de particulados na formulação e/ou reduza a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever polioxietileno (20) sorbitanmono-oleato (consultar, Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor

Verlag Aulendorf, 4a ed., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado na formulação.

[0169] Em modalidades, o produto de proteína da presente divulgação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada a uma concentração de 10 mg/mL em uma ampola de 50R tipo I de USP/Ph Eur fechada com uma tampa de borracha e vedada com um fecho de vedação de alumínio tipo crimp. A tampa pode ser produzida a partir de elastômero em conformidade com USP e Ph Eur. Em certas modalidades, as ampolas podem ser preenchidas com 61,2 mL da solução de produto de proteína para permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com 0,9% de solução salina.

[0170] Em certas modalidades, a formulação líquida da divulgação pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um carreador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizante pode ser adicionado em uma quantidade não maior que aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode consistir em dissacarídeos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo e um conservante.

[0171] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.

[0172] Além da agregação, a desamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, coleta/clarificação celular, purificação, substância de fármaco/armazenamento de produto de fármaco e durante a análise de amostra. A desamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de succinimida que pode ser submetido à hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 dalton do peptídeo parental. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 dalton. O isolamento do intermediário de succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. De tal modo, a desamidação é tipicamente detectável como aumento de massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica de solvente, força iônica, sequência primária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes a Asn na cadeia de peptídeos afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após um Asn em sequências de proteínas resulta em uma suscetibilidade superior à desamidação.

[0173] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente divulgação pode ser preservada sob condições de pH e umidade para prevenir a desaminação do produto de proteína.

[0174] O carreador aquoso de interesse na presente invenção é um que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Os carreadores ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução de pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[0175] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações na presente invenção para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de múltiplos usos (múltiplas doses).

[0176] As formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferencial em casos particulares, como quando um paciente está no hospital após um transplante recebendo todos os fármacos por meio da via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com 0,9% de solução de Cloreto de Sódio antes da administração. Em certas modalidades, o produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.

[0177] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas de “formação de base”. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode consistir em tampões de glicinato, carbonato, citrato, o caso em que os íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contraíons.

[0178] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações na presente invenção para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de múltiplos usos (múltiplas doses).

[0179] O carreador aquoso de interesse na presente invenção é um que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Os carreadores ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução de pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[0180] A proteína da presente divulgação pode existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais dentre um agente de tamponamento, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.

[0181] A quantidade de sacarose ou maltose úteis para estabilização do produto de fármaco liofilizado pode ser em uma razão de peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão de peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.

[0182] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser definido pela adição dum ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.

[0183] Antes da liofilização, o pH da solução contendo a proteína da presente divulgação pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto de fármaco liofilizado pode ser de 7 a 8.

[0184] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas de “formação de base”. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode consistir em tampões de glicinato, carbonato,

citrato, o caso em que os íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contraíons.

[0185] Em certas modalidades, um “agente de volume” pode ser adicionado. Um “agente de volume” é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui à estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção dum bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poro aberto). Os agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.

[0186] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações na presente invenção para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de múltiplos usos (múltiplas doses).

[0187] Em certas modalidades, o produto de fármaco liofilizado pode ser constituído com um carreador aquoso. O carreador aquoso de interesse na presente invenção é um que é farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida após a liofilização. Os diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução de pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[0188] Em certas modalidades, o produto de fármaco liofilizado da atual divulgação é reconstituído com Água Estéril para Injeção, USP (SWFI) ou 0,9% de Injeção de Cloreto de Sódio, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.

[0189] Em certas modalidades, o produto de proteína liofilizado da presente divulgação é constituído a cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com 0,9% de solução salina (solução de cloreto de sódio).

[0190] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente.

[0191] A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50 a 5000 mg de proteína. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso corporal ou área de superfície aproximados do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem adequada podem incluir a doença ou afecção a ser tratada ou prevenida, a gravidade da doença, a via de administração e a idade, o sexo e condição médica do paciente. O refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem adequada para tratamento é realizado de modo rotineiro pelos técnicos no assunto, especialmente à vista das informações de dosagem e ensaios divulgados na presente invenção. A dosagem também pode ser determinada através do use de ensaios conhecidos para determinar dosagens usadas em conjunto com dados de resposta à dose adequados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada à medida em que o progresso da doença é monitorado. Os níveis de sangue do construto ou complexo alvejável em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para alcançar ou manter uma concentração eficaz. A farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construtos e/ou complexos alvejáveis, e dosagens dos mesmos, são mais propensos a serem eficazes para um dado indivíduo (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).

[0192] Em geral, as dosagens baseadas em peso corporal são de cerca de 0,01 µg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal, como cerca de 0,01 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 10 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 1 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 µg a cerca de 0,1 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 10 µg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 µg a cerca de 1 µg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corporal, cerca de 1 µg a cerca de 10 µg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corporal, cerca de 100 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de

100 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.

[0193] As doses podem ser fornecidas uma vez ou mais vezes de modo diário, semanal, mensal ou anual, ou até mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Os técnicos no assunto podem estimar facilmente as taxas de repetição para dosagem com base em concentrações e tempos de residência medidos do construto ou complexo alvejável em fluidos ou tecidos corporais. A administração da presente invenção pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Esta pode ser administrada uma vez ou mais vezes diariamente, uma vez ou mais vezes semanalmente, uma vez ou mais vezes mensalmente e uma vez ou mais vezes anualmente.

[0194] A descrição acima descreve múltiplos aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente contempla especificamente todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.

EXEMPLOS

[0195] A invenção agora sendo geralmente descrita, será mais prontamente entendida a título de referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente com propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destina a limitar a invenção. EXEMPLO 1 - DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE NKG2D SE LIGAM A NKG2D Domínios de ligação de NKG2D se ligam a nkg2d recombinante purificado

[0196] As sequências de ácidos nucleicos de ectodomínios de NKG2D humano, de camundongo ou cinomolgo foram fundidas com sequências de ácidos nucleicos que codificam domínios de Fc de IgG1 humana e introduzidas em células de mamíferos para serem expressadas. Após a purificação, as proteínas de fusão de NKG2D-Fc foram adsorvidas para poços de microplacas. Após bloquear os poços com albumina de soro bovino para impedir a ligação não específica, os domínios de ligação de NKG2D foram titulados e adicionados aos poços pré-adsorvidos com proteínas de fusão de NKG2D-Fc. A ligação de anticorpo primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado a peroxidase de raiz forte e reconhece especificamente uma cadeia leve de kappa humana para evitar a reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de raiz forte, foi adicionado aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Um clone de domínio de ligação de NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo (que compreende domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados a partir das SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) foi adicionado a cada poço.

[0197] O controle de isótipo mostrou ligação mínima a proteínas de NKG2D recombinante-Fc, enquanto o controle positivo se ligou de modo mais forte aos antígenos recombinantes. Os domínios de ligação de NKG2D produzidos totalmente por clones demonstraram ligação através de proteínas de NKG2D recombinante-Fc humana, de camundongo e cinomolgo, embora com afinidades variáveis de clone para clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D se ligou a NKG2D recombinante-Fc humano (Figura 3) e cinomolgo (Figura 4) com afinidade similar, porém, com afinidade inferior ao (Figura 5) NKG2D recombinante-Fc de camundongo. Os domínios de ligação de nkg2d se ligam a células que expressam NKG2D

[0198] As linhagens celulares de linfoma de camundongo de EL4 foram geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico de domínio de sinalização de NKG2D-CD3 zeta humano ou de camundongo. Um clone de ligação a NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo foi usado a uma concentração de 100 nM para manchar NKG2D extracelular expressado nas células de EL4. A ligação de anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários de IgG anti-humana conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a dobra sobre o segundo plano (FOB) foram calculadas usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de NKG2D-que expressa células comparadas com células de EL4 parentais.

[0199] Os domínios de ligação de NKG2D produzidos por todos os clones ligados às células de EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Os anticorpos de controle positivo (que compreendem domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones de NKG2D anticamundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) forneceram o melhor sinal de ligação de FOB. A afinidade de ligação a NKG2D para cada clone foi similar entre as células que expressam NKG2D humano (Figura 6) e NKG2D de camundongo (Figura 7). EXEMPLO 2 - DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE NKG2D BLOQUEIAM A LIGAÇÃO DE AGLUTINANTE NATURAL A NKG2D Competição com ULBP-6

[0200] As proteínas de NKG2D recombinante-Fc humano foram adsorvidas para poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Uma concentração de ULBP-6- His-biotina de saturação foi adicionada aos poços, seguido por adição dos clones de domínio de ligação de NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, poços foram lavados e a ULBP-6-His-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com

NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada à peroxidase de raiz forte e substrato de TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigido a 540 nM. Após subtrair o segundo plano, a ligação específica de domínios de ligação de NKG2D às proteínas de NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de ULBP- 6-His-biotina que foi bloqueada da ligação às proteínas de NKG2D-Fc em poços. O anticorpo de controle positivo (que compreende domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104) e vários domínios de ligação de NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 a NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (Figura 8).

[0201] A sequência de ULBP-6 é representada por SEQ ID NO: 108

MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVD EKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENY TPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMK

EKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRA TATTLILCCLLIILPCFILPGI (SEQ ID NO: 108) Competição com MICA

[0202] As proteínas de proteínas de MICA recombinante-Fc humano foram adsorvidas para poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. A NKG2D-Fc- biotina foi adicionada aos poços seguidos por domínios de ligação de NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligado aos poços revestidos de MICA-Fc foi detectado usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigido a 540 nM. Após a subtração do segundo plano, a ligação específica de domínios de ligação de NKG2D às proteínas de NKG2D-Fc foi calculada da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi impedido de ligação aos poços revestidos de MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (que compreende domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104) e vários domínios de ligação de NKG2D impediram a ligação de MICA a NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com MICA (Figura 9). Competição com Rae-1 delta

[0203] Rae-1delta-Fc camundongo recombinante (adquirido de Sistemas de R&D) foi adsorvido a poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir ligação não específica. A NKG2D-Fc- biotina foi adicionada aos poços seguida por domínios de ligação de NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligado aos poços revestidos de Rae-1delta-Fc foi detectado usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigido a 540 nM. Após a subtração do segundo plano, a ligação específica de domínios de ligação de NKG2D às proteínas de NKG2D-Fc foi calculada da porcentagem de NKG2D- Fc-biotina que foi impedido de ligação aos poços revestidos de Rae-1delta-Fc. O controle positivo (que compreende domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones de NKG2D anticamundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) e vários clones de domínio de ligação de NKG2D bloquearam a ligação de Rae-1 delta ao NKG2D de camundongo, enquanto o anticorpo de controle de isótipo mostrou pouca competição com Rae-1delta (Figura 10). EXEMPLO 3 - CLONES DE DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE NKG2D ATIVAM NKG2D

[0204] As sequências de ácidos nucleicos de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas às sequências de ácidos nucleicos que codificam um domínio de sinalização de CD3 zeta para obter construtos de receptor de antígeno quimérico (CAR). Os construtos de NKG2D-CAR foram, então, clonados em um vetor de retrovírus usando conjunto de Gibson e transfectados para células de expi293 para produção de retrovírus. As células de EL4 foram infectadas com vírus contendo NKG2D-CAR junto com 8 µg/mL de polibreno. 24 horas após a infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células de EL4 foram analisadas por citometria de fluxo, e clones que expressam altos níveis do NKG2D-CAR na superfície celular foram selecionados.

[0205] Para determinar se os domínios de ligação de NKG2D ativam NKG2D, os mesmos foram adsorvidos em poços duma microplaca, e células de EL4 de NKG2D-CAR foram coletadas nos poços revestidos de fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldin-A e monensina. A produção de TNF-α intracelular, um indicador para ativação de NKG2D, foi ensaiada por citometria de fluxo. A porcentagem de células positivas de TNF-α foi normalizada às células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação de NKG2D ativaram tanto NKG2D humano (Figura 11) quanto NKG2D de camundongo (Figura 12). EXEMPLO 4 - DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE NKG2D ATIVAM CÉLULAS NK Células NK humanas primárias

[0206] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de revestimentos volumosos de sangue periférico humano usando centrifugação de gradiente de densidade. As células NK (CD3-CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com microesferas magnéticas de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente > 95%. As células NK isoladas foram, então, cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24 a 48 horas antes de serem transferidas aos poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação de NKG2D foram adsorvidos e cultivados no meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldin-A e monensina. Após o cultivo, as células NK foram ensaiadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-γ. Manchamentos de CD107a e

IFN-γ foram analisados em células de CD56+ de CD3- para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplamente positivas para CD107a/IFN-γ é indicativo de melhor ativação de célula NK através do engate de dois receptores de ativação em vez de um receptor. Os domínios de ligação de NKG2D e o controle positivo (por exemplo, domínio variável de cadeia pesada representado pela SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 103 e o domínio variável de cadeia leve representado pela SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 104) mostraram uma porcentagem maior de células NK se tornando CD107a+ e IFN-γ+ que o controle de isótipo (Figura 13 e Figura 14 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando PBMC de um doador diferente para a preparação de célula NK). Células NK de camundongo primárias

[0207] Os baços foram obtidos de camundongos tipo C57B1/6 e esmagados através de um extensor de célula de 70 µm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise de ACK (adquirido junto à Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonato de potássio, 0,01 mM de EDTA) para remover glóbulos vermelhos. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para isolamento de célula NK. As células NK (CD3-NK1,1+) foram, então, isoladas de células de baço usando uma técnica de esgotamento negativo com microesferas magnéticas com tipicamente > 90% de pureza. As células NK purificadas foram, então, cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidas aos poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação de NKG2D foram adsorvidos e cultivados no meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldin-A e monensina. Após o cultivo em poços revestidos com domínio de ligação de NKG2D, as células NK foram ensaiadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-γ. Manchamentos de CD107a e IFN-γ foram analisados em células de NK1.1+ de CD3- para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplamente positivas para CD107a/IFN-γ é indicativo de melhor ativação de célula NK através do engate de dois receptores de ativação em vez de um receptor. Os domínios de ligação de NKG2D e o controle positivo (selecionado a partir de clones de NKG2D anticamundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) mostraram uma porcentagem superior de células NK se tornando CD107a+ e IFN-γ+ que o controle de isótipo (Figura 15 e Figura 16 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando um camundongo diferente para preparação de célula NK). EXEMPLO 5 - DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE NKG2D POSSIBILITAM A

CITOTOXICIDADE DE ALVO CÉLULAS TUMORAIS

[0208] Os ensaios de ativação de célula NK primárias humanas e de camundongo demonstraram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK após a incubação com domínios de ligação de NKG2D. Para abordar a possibilidade de isto se traduzir em lise de célula de tumor aumentada, um ensaio à base de célula foi utilizado em que cada domínio de ligação de NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região de Fc foi usada como um braço de alvejamento, enquanto a região de Fab (domínio de ligação de NKG2D) atuou como outro braço de alvejamento para ativar as células NK. As células de THP-1, que são de origem humana e expressam altos níveis de receptores de Fc, foram usadas como um alvo de tumor e um Kit de Citotoxicidade de Perkin Elmer DELFIA foi usado. As células de THP-1 foram identificadas com reagente de BATDA e ressuspensas a 105/mL em meio de cultura. As células de THP-1 identificadas foram, então, combinadas com anticorpos de NKG2D e células NK de camundongo isoladas em poços de uma placa de microtitulação a 37°C por 3 horas. Após a incubação, 20 µL do sobrenadante de cultura foram removidos, misturados com 200 µL de solução Europium e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por um leitor de placa PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvido no tempo (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.

[0209] O controle positivo, ULBP-6 - um aglutinante natural para NKG2D, mostrou lise específica aumentada de células de THP-1-alvo por células NK de camundongo. Os anticorpos de NKG2D também aumentou a lise específica de células de THP-1-alvo, enquanto o anticorpo de controle de isótipo mostrou lise específica reduzida. A linha pontilhada indica a lise específica de células de THP- 1 por células NK de camundongo sem anticorpo adicionado (Figura 17). EXEMPLO 6 - ANTICORPOS DE NKG2D MOSTRAM ALTA

TERMOESTABILIDADE

[0210] As temperaturas de fusão de domínios de ligação de NKG2D foram ensaiadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação aos anticorpos de IgG1 típicos (Figura 18). EXEMPLO 7 - ATIVAÇÃO SINÉRGICA DE CÉLULAS NK HUMANAS POR RETICULAÇÃO DE NKG2D E CD16 Ensaio de ativação de célula NK humana primária

[0211] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de revestimentos volumosos de sangue humano periférico usando centrifugação de gradiente de densidade. As células NK foram purificadas a partir de PBMCs usando microesferas magnéticas negativas (no de StemCell 17955). As células NK foram > 90% de CD56+ de CD3- como determinado por citometria de fluxo. As células foram, então, expandidas 48 horas em meio contendo 100 ng/mL de hIL-2 (no de Peprotech 200-02) antes do uso em ensaios de ativação. Os antibióticos foram revestidos em uma placa de fundo plano de 96 poços a uma concentração de 2 µg/mL (anti-CD16, Biolegend nº 302013) e 5 µg/mL (anti-NKG2D, R&D nº MAB139) em 100 µL de PBS estéril de um dia para outro a 4°C seguido pela lavagem minuciosa dos poços para remover o anticorpo em excesso. Para a avaliação de desgranulação células NK ativadas de IL-2 foram ressuspensas a 5x105 células/mL em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de IL-2 humana (hIL2) e 1 µg/mL de mAb anti-CD107a conjugado a APC (Biolegend nº 328619). 1x105 células/poço foram, então, adicionadas às placas revestidas com anticorpo. Os inibidores de transporte de proteína Brefeldin A (BFA, Biolegend nº 420601) e Monensina (Biolegend nº 420701) foram adicionadas a uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células em placas foram incubadas por 4 horas a 37°C em 5% de CO2. Para manchamento intracelular de IFN-γ, as células NK foram identificadas com anti-CD3 (Biolegend nº 300452) e mAb anti-CD56 (Biolegend nº 318328), e subsequentemente fixadas, permeabilizadas e identificadas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend nº 506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a um IFN- γ por citometria de fluxo após chaveamento em células vivas de CD56+CD3-.

[0212] Para investigar a potência relativa de combinação de receptor, a reticulação de NKG2D ou CD16, e correticulação de ambos os receptores por estimulação limitada à placa foi realizada. Como mostrado na Figura 19 (Figuras 19A a 19C), a estimulação combinada de CD16 e NKG2D resultou em níveis altamente elevados de CD 107a (desgranulação) (Figura 19A) e/ou produção de IFN-γ (Figura 19B). As linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estimulações individuais de cada receptor.

[0213] Os níveis de CD 107a e a produção de IFN-γ intracelular de células NK ativadas de IL-2 foram analisados após 4 horas de estimulação limitada à placa com anti-CD16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam o ± SD (n = 2) médio. A Figura 19A demonstra níveis de CD 107a; a Figura 19B demonstra níveis de IFN-γ; a Figura 19C demonstra níveis de CD 107a e IFN-γ. Os dados mostrados nas Figuras 19A a 19C são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes. EXEMPLO 8 - AVALIAÇÃO DE LIGAÇÃO DE TRINKETS AO NKG2D HUMANO

EXPRESSADO EM CÉLULA

[0214] As linhagens celulares de linfoma de camundongo de EL4 foram geneticamente modificadas para expressar NKG2D humano. As proteínas de ligação multiespecífica, por exemplo, proteínas de ligação triespecífica (TriNKETs), em que cada uma das mesmas contém um domínio de ligação de NKG2D, um domínio de ligação de FLT3 e um domínio Fc que se liga a CD16 foram testados quanto à afinidade da mesma para se ligar a NKG2D extracelular expressado em células de EL4. Os TriNKETs foram diluídos a 20 µg/mL e, então, diluídos serialmente. A ligação dos TriNKETs a NKG2D foi detectada usando anticorpos secundários de IgG anti-humana conjugados com fluoróforo. As células foram, então, analisadas por citometria de fluxo e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi normalizada aos controles de anticorpo secundário para obter valores de dobra sobre o segundo plano (FOB).

[0215] Os TriNKETs testados foram A44-TriNKET-FLT3-IMCEB10 (um domínio de ligação de NKG2D do clone ADI-27744; e um domínio de ligação de FLT3 derivado do anticorpo monoclonal de FLT3, IMCEB10, por exemplo, incorporando-se uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 113), A44-TriNKET-FLT3-4G8 (um domínio de ligação de NKG2D do clone ADI-27744; e um domínio de ligação de FLT3 derivado do anticorpo monoclonal 4G8, por exemplo, incorporando-se uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 121), A49-TriNKET-FLT3-IMCEB10 (um domínio de ligação de NKG2D do clone ADI-27749 e um domínio de ligação de FLT3 derivado de um anticorpo monoclonal de FLT3 IMCEB10, por exemplo, incorporando-se uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 109 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 113), A49-TriNKET-FLT3-4G8 (um domínio de ligação de NKG2D do clone ADI-27749; e um domínio de ligação de FLT3 derivado do anticorpo monoclonal 4G8, por exemplo, incorporando-se uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 121), C26-TriNKET-FLT3-4G8 (um domínio de ligação de NKG2D do clone ADI-28226; e um domínio de ligação de FLT3 derivado do anticorpo monoclonal 4G8, por exemplo, incorporando-se uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 117 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 121). O anticorpo monoclonal de FLT3 IMCEB10 foi usado como um controle. Os TriNKETs contendo um domínio de ligação de NKG2D (A44, A49 ou C26) mostraram ligação a NKG2D expressada na superfície celular. Os TriNKETs contendo o mesmo domínio de ligação de NKG2D, porém, um diferente domínio de ligação de FLT3 mostrou afinidade de ligação similar a NKG2D na superfície celular (Figura 35). EXEMPLO 9 - AVALIAÇÃO DE LIGAÇÃO DE TRINKETS A FLT3 EXPRESSADO EM

CÉLULAS CANCERÍGENAS

[0216] As linhagens celulares de AML humana (Molm-13 e EOL-1) que expressam FLT3 foram usadas para ensaiar uma ligação de TriNKETs que alvejam FLT3 ao antígeno associado a tumor. Os TriNKETs foram incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários de IgG anti- humana conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi normalizada aos controles de anticorpo secundário para obter valores de dobra sobre o segundo plano (FOB).

[0217] Os TriNKETs que alvejam FLT3 contendo um domínio de ligação de FLT3 de IMCEB10 ou 4G8 mostraram ligação positiva a células de Molm-13 e de EOL-1 (Figura 36A e Figura 36B). A ligação dos TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT-3 de IMCEB10 ou 4G8 às linhagens celulares de AML humana foi independente dos domínios de ligação de NKG2D. Os TriNKETs contendo o domínio de ligação de FLT3 de 4G8 mostraram ligação máxima e valores de EC50 superiores. EXEMPLO 10 - INTERNALIZAÇÃO DE TRINKETS QUE ALVEJAM FLT3 EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM FLT3

[0218] As linhagens celulares de AML humana Molm-13 e EOL-1 foram usadas para avaliar a internalização de TriNKETs que alvejam FLT3 após a ligação a FLT3 expressada na superfície celular. Os TriNKETs ou o anticorpo monoclonal, lintuzumab, foram diluídos a 20 µg/mL e usados para manchar as células. Após o manchamento, dois-terços da amostra foram colocados a 37°C de um dia para outro para facilitar a internalização, e o outro terço da amostra foi detectado usando um anticorpo secundário de IgG anti-humana conjugado com fluoróforo, fornecendo MFI de linha de base. Após 2 horas e 20 horas de incubação a 37°C, as amostras foram removidas do incubador, e o anticorpo ligado na superfície das células foi detectado usando um anticorpo secundário de IgG anti-humana conjugado com fluoróforo, fornecendo MFI de amostra. A internalização foi calculada: % de internalização = (1-(amostra MFI/MFI de linha de base)) * 100%.

[0219] As Figuras 37A e 37B mostraram a internalização de TriNKETs que alvejam FLT3 após a incubação com EOL-1 e células de Molm-13 respectivamente. O anticorpo monoclonal anti-CD33 Lintuzumab foi usado como um controle positivo para a internalização, visto que CD33 é expressado tanto em linhagens celulares de Molm-13 quanto em linhagens celulares de EOL-

1. Lintuzumab mostrou altos níveis de internalização em ambas as linhagens celulares, e a internalização aumentou com o tempo. Os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de IMCEB10 mostraram nível de internalização mais alto após 2 horas de incubação em comparação com os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de 4G8. Após 20 horas de incubação, os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de 4G8 e os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de IMCEB10 mostraram níveis de internalização similares nas células. EXEMPLO 11 - TRINKETS INTENSIFICAM A CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS NK

HUMANAS EM RELAÇÃO ÀS CÉLULAS CANCERÍGENAS

[0220] Para testar a capacidade de células NK humanas para lisar células que expressam FLT3 de câncer na presença de TriNKETs que alvejam FLT3, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e preparadas para isolamento de célula NK. As PBMCs foram isoladas de revestimentos volumosos de sangue periférico humano usando centrifugação de gradiente de densidade. As PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para o isolamento de célula NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com microesferas magnéticas, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente > 90% de CD3-CD56+. As células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 ou foram repousadas de um dia para outro sem citocina. As células NK ativadas por IL-2 ou repousadas foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.

[0221] Todos os ensaios de citotoxicidade foram preparados conforme a seguir: As células tumorais positivas para FLT-3, EOL-1 foram coletadas da cultura, lavadas com PBS e ressuspensas em meio de crescimento a 106/mL para identificação com reagente de BATDA (Perkin Elmer C136-100). As instruções do fabricante foram seguidas para identificar as células-alvo. Após a identificação, as células foram lavadas 3 vezes com HBS e ressuspensas a 0,5 a 1,0 x 105/mL no meio de cultura. Para preparar os poços de segundo plano, uma alíquota das células identificadas foi separada, e as células foram giradas para fora do meio. 100 µL do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em tríplice para evitar a perturbação das células peletizadas. 100 µL de células de BATDA identificadas foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea de células-alvo, e os poços foram preparados para lise máxima de células-alvo por adição de 1% de Triton-X. Os anticorpos monoclonais de FLT3 ou TriNKETs que alvejam FLT3 foram diluídos em meio de cultura e 50 µL de anticorpos monoclonais diluídos ou TriNKETs foram adicionados a cada poço. As células NK repousadas e/ou ativadas foram coletadas a partir da cultura, lavadas e foram ressuspensas a 105-2,0 x 106/mL em meio de cultura dependendo da célula efetora desejada para alvejar a razão celular. 50 µL de células NK foram adicionadas a cada poço da placa para produzir um volume total de cultura de 200 µL. A placa foi incubada a 37°C com 5% de CO2 por 2 a 3 horas antes de desenvolver o ensaio.

[0222] Após a cultura por 2 a 3 horas, a placa foi removida do incubador e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 µL de sobrenadante de cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida a partir do fabricante, e 200 µL de solução de európio à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placa a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando instrumentos de Victor 3 ou SpectraMax i3X. A % de lise específica foi calculada como a seguir: % lise específica = ((liberação experimental - liberação espontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea)) * 100%.

[0223] Os TriNKETs que alvejam FLT3 mediaram a citotoxicidade de células

NK humanas em relação às células cancerígenas de EOL-1 positivas para FLT3. Como mostrado na Figura 38A, ambos os TriNKETs (A49-TriNKET-IMCEB10 e A44-TriNKET-IMCEB10) foram capazes de intensificar a atividade citotóxica de células NK em relação às células cancerígenas de uma maneira responsiva à dose. Ambos os TriNKETs foram significativamente mais potentes que o anticorpo monoclonal de FLT3 correspondente IMCEB10. Como mostrado na Figura 38B, os TriNKETs (A49-TriNKET-4G8, A44-TriNKET-4G8 e C26-TriNKET- 4G8) foram capazes de intensificar a atividade citotóxica de células NK em relação às células cancerígenas duma maneira responsiva à dose. Os TriNKETs são significativamente mais potentes que o anticorpo monoclonal de FLT3 correspondente 4G8. Ademais, os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de 4G8 foram mais potentes na mediação de citotoxicidade de células NK humanas que os TriNKETs contendo um domínio de ligação de FLT3 de IMCEB10.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0224] A divulgação integral de cada um dos documentos de patente e artigos científicos mencionados na presente invenção é incorporada a título de referência para todos os propósitos.

EQUIVALENTES

[0225] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características essenciais da mesma. As modalidades supracitadas, portanto, devem ser consideradas em todos os sentidos, ilustrativas em vez de limitantes da invenção descrita na presente invenção. O escopo da invenção é, assim, indicado pelas reivindicações anexas em vez de pela descrição anterior, e todas as mudanças que estejam dentro do significado e abrangência de equivalência das reivindicações, são destinadas a serem abrangidas pelas mesmas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a FLT3; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para ligar CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D em humanos.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.

4. Proteína de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptídeo.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.

6. Proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.

7. Proteína de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve do primeiro sítio de ligação ao antígeno tem uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno.

8. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 93.

9. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 42.

10. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 49 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 50.

11. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 57 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 58.

12. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 59 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 60.

13. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 61 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à

SEQ ID NO: 62.

14. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 70.

15. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 78.

16. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 86.

17. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 94.

18. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 101 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 102.

19. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,

caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 103 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 104.

20. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.

21. Proteína de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de domínio único é um fragmento de VHH ou um fragmento de VNAR.

22. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 20 e 21, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.

23. Proteína de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.

24. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a FLT3, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 109 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 113.

25. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a FLT3, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 117 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 121.

26. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a FLT3, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 125 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 129.

27. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 8 a 21, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.

28. Proteína de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é um fragmento de VHH ou um fragmento de VNAR.

29. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para ligar CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende dobradiça e domínios de CH2.

30. Proteína de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende dobradiça e domínios de CH2 de um anticorpo IgG1 humano.

31. Proteína de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.

32. Proteína de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc de IgG1 humano e difere em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, K439.

33. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 32 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

34. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais ácidos nucleicos que expressam uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.

35. Método para aperfeiçoar morte de célula tumoral, caracterizado pelo fato de que compreende expor células tumorais e células exterminadoras naturais a uma quantidade eficaz da proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que as células tumorais expressam FLT3.

36. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz da proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 32 ou formulação definida na reivindicação 33 a um paciente.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia.

38. Método para tratar câncer de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a leucemia é selecionada a partir do grupo que consiste em leucemia mieloide aguda, leucemia de célula T, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e tricoleucemia.