BR112020005186A2 - tratamento de distúrbios autonômicos - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere ao tratamento de distúrbios autonômicos com uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A que seria usada para tratar o mesmo distúrbio autonômico.

Description

“TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS AUTONÔMICOS”

[0001] A presente invenção se refere ao tratamento de distúrbios autonômicos com neurotoxinas.

[0002] As bactérias no gênero Clostridia produzem toxinas altamente potentes e específicas de proteína, que podem envenenar neurônios e outras células para as quais elas são distribuídas. Os exemplos de tais toxinas clostridiais incluem as neurotoxinas produzidas pela C. tetani (TeNT) e pela C. botulinum (BoNT) sorotipos A-G, assim como aquelas produzidas pela C. baratii e C. butyricum.

[0003] As neurotoxinas clostridiais causam paralisia muscular pela inibição da transmissão colinérgica no sistema nervoso periférico, em particular na junção neuromuscular e pode assim ser letal. Por natureza, as neurotoxinas clostridiais são sintetizadas como um polipeptídeo de cadeia única que é modificada pós- traducionalmente por um evento de clivagem proteolítica para formar duas cadeias polipeptídicas unidas juntas por uma ligação de dissulfeto. A clivagem ocorre em um sítio de clivagem específico, frequentemente aludido como o sítio de ativação, que está localizado entre os resíduos de cisteína que provêem a ligação de dissulfeto intercadeia. É esta forma de cadeia dupla que é a forma ativa da toxina. As duas cadeias são chamadas de cadeia pesada (cadeia H), que tem uma massa molecular de aproximadamente 100 kDa e a cadeia leve (cadeia L), que tem uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa. A cadeia H compreende um componente de translocação de terminal N (domínio HN) e um componente de alvejamento de terminal C (domínio HC). O sítio de clivagem está localizado entre a cadeia L e o domínio HN.

[0004] O modo de ação das neurotoxinas clostridiais depende de cinco etapas distintas: (1) ligação do domínio HC à membrana celular do seu neurônio alvo, seguida pela (2) internalização da toxina ligada dentro da célula por intermédio de um endossoma, (3) translocação da cadeia L pelo domínio HN através da membrana endossômica e dentro do citossol, (4) clivagem proteolítica de proteínas de transporte intracelular conhecidas como proteínas SNARE pela cadeia L que provê uma função de protease não citotóxica e (5) inibição da secreção celular da célula alvo.

[0005] Nesta cascata de eventos, as proteínas SNARE (Receptor da Proteína de

Fixação do Fator Sensível à N-etilmaleimida Solúvel) são integrais com a fusão da vesícula intracelular e assim para secreção de moléculas por intermédio do transporte vesicular de uma célula. Os exemplos de proteínas SNARE presentes nos neurônios incluem, entre outras, SNAP-25, VAMP ou Sintaxina. A função de protease não citotóxica da cadeia L é, por outro lado, uma atividade de endopeptidase dependente de zinco, que exibe uma alta especificidade de substrato para as proteínas SNARE. Consequentemente, uma vez distribuída para uma célula neuronal alvo, a protease não citotóxica das neurotoxinas clostridiais, pela clivagem da sua proteína SNARE de substrato, inibe a liberação de neurotransmissor, que consequentemente leva à neuroparalisia.

[0006] Graças às suas propriedades únicas, as neurotoxinas clostridiais, tais como a toxina botulínica, têm sido utilizadas com sucesso em uma ampla faixa de aplicações terapêuticas, em particular para distúrbios motores e autonômicos, para restaurar por exemplo a atividade de extremidades nervosas hiperativas aos níveis normais. Pelo menos sete sorotipos de BoNTs antigenicamente distintas foram descritas até agora, a saber BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G (Rossetto, O. et al., “Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights.” Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014): 535-549). A despeito desta diversidade, BoNT/A permanece o sorotipo de escolha na terapia, com três preparações comerciais habitualmente disponíveis (Botox®, Dysport® e Xeomin®), enquanto apenas um produto de BoNT/B está disponível no mercado (Neurobloc®/Myobloc®). Até hoje, estes produtos BoNT/A e BoNT/B, que são toxinas purificadas de cepas clostridiais, são os dois únicos sorotipos de BoNT que estão correntemente aprovados pelas agências reguladoras para o uso em seres humanos para aplicações variando, entre outras, de espasticidade, disfunção de bexiga ou hiper-hidrose (para BoNT/A) (ver por exemplo https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112,https://www.medicines.org.uk/emc/ medicine/870, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162, aqui incorporados por referência em sua totalidade) para distonia cervical (para BoNT/B) (ver por exemplo, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568, aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[0007] Entretanto, uma limitação corrente observada no seu uso terapêutico é a geração de anticorpos neutralizantes nos pacientes, que torna o tratamento futuro ineficaz. Embora poucos tenham relatado problemas de antigenicidade com Neurobloc®/MyoBloc®, tais respostas de anticorpo foram até agora principalmente relatadas com os produtos de BoNT/A que permanecem a toxina botulínica de escolha. Estas respostas imunológicas foram identificadas como estando diretamente correlacionadas com as doses de toxina (Lange, O., et al., Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: much ado about nothing? Clin Neuropharmacol, 2009, 32, 213-218). Efeitos adversos também podem resultar da difusão de toxinas para outras regiões do corpo e a possibilidade da difusão de toxina está diretamente relacionada com as doses injetadas.

[0008] Porque tanto a geração de anticorpos neutralizantes quanto a difusão de toxina estão diretamente relacionadas com as doses injetadas, existe uma necessidade na técnica para tratar pacientes com produtos, tais como os sorotipos de BoNT alternativos, que sejam capazes de alcançar o mesmo nível de efeito terapêutico com doses mais baixas.

[0009] Um desafio a este respeito é a diferença no modus operandi dos vários sorotipos BoNT, que parece traduzir em uma diferença na eficácia terapêutica para o mesmo distúrbio.

[0010] De fato, de modo a exercer atividade clínica, a toxina botulínica tem que entrar dentro do terminal de extremidade neuronal da sua célula alvo. Para assim fazê- lo, BoNTs alvejam e entram nos neurônios pela ligação aos seus receptores específicos através dos seus domínios de ligação de receptor (BoNT-HC), que são bem definidos na literatura (Schiavo, G., Matteoli, M. & Montecucco, C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis, Physiol Rev, 2000, 80, 717-766). A ligação de receptor geralmente dita a eficácia e especificidade de BoNTs para reconhecer neurônios. BoNT/B, D-C e G compartilham duas proteínas de vesícula sináptica homólogas sinaptotagmina I e II (Syt I/II) como seus receptores, enquanto BoNT/A, E, D e F usam uma outra proteína de vesícula sináptica SV2. A este respeito, deve ser mencionado que a afinidade de ligação de sorotipos de BoNT para seus receptores de proteína também pode variar de espécie para espécie: por exemplo, BoNT/B, /D-C e /G exibem uma afinidade muito mais alta para SytII do que SytI nos terminais nervosos motores em roedores, enquanto que, nos seres humanos, estes têm uma afinidade maior para SytI do que SytII – esta diferença sendo devida a uma única mudança de aminoácido entre as sequências de SytII de roedor e ser humano. Como um resultado desta mudança de aminoácido, a SytII humana é significantemente menos eficiente em mediar a entrada de BoNT/B, /D-C e /G, quando comparada com SytII de camundongo. Isto também significa que, nos seres humanos, o receptor de alta afinidade para BoNT/B, /D-C e /G parece estar restrito ao receptor menor SytI, pelo menos nos motoneurônios. Todas estas descobertas podem prover uma explicação para as observações clínicas que uma dose muito mais alta de BoNT/B do que BoNT/A (que liga um receptor diferente) parece ser necessária para se alcançar os mesmos níveis de efeitos terapêuticos em pacientes com distonia cervical (Brashear A. et al., Safety and efficacy of NeuroBloc (botulinum toxin type B) in type A-resistant cervical dystonia, 1999, Neurology 53, 1431-1438 ; Pappert, E.J. & Germanson, T. Botulinum toxin type B vs. type A in toxin-naive patients with cervical dystonia: Randomized, double-blind, noninferiority trial, 2008 Mov Disord 23, 510-517). Em particular, para o uso na junção neuromuscular, uma razão de conversão entre BOTOX® e MyoBloc® de 1:40 foi sugerida (Dressler et al., Botulinum toxin type B for treatment of axillar hyperhidrosis., 2002, J. Neurol. 249,1729-1732; Comella et al., 2005).

[0011] Além dos receptores de proteína, todos os sorotipos de BoNTs requerem gangliosídeos de correceptor lipídico que são abundantes nas superfícies neuronais e podem diferir entre sorotipos e clivar diferentes substratos da proteína SNARE, que podem impactar adicionalmente a sua eficácia terapêutica dependendo do tipo de célula alvejado. De fato, as proteases de cadeia L de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F e BoNT/G clivam VAMP, enquanto que as proteases da cadeia L de BoNT/A e BoNT/E clivam SNAP25 e a protease da cadeia L de BoNT/C cliva tanto SNAP25 quanto sintaxina.

[0012] Embora os usos terapêuticos iniciais de neurotoxinas botulínicas contassem com a inibição da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular de músculos esqueletais para tratar condições neuromusculares tais como distonias e espasticidade, foi mais tarde descoberto que estas neurotoxinas foram também eficazes nas glândulas e músculos lisos pela inibição da liberação de acetilcolina em nervos terminais autonômicos e assim seriam usadas para tratar uma variedade de distúrbios autonômicos tais como hiper-hidrose, sialorreia ou bexiga hiperativa.

[0013] A dose recomendada de Botox® (também conhecido como Onabotulinumtoxina A) para tratar hiper-hidrose é de 50 unidades por axila (https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112), que é uma dose de cerca de 0,365 ng da toxina BoNT/A de 150 kD. Neurobloc®/Myobloc® (também conhecido como Rimabotulinumtoxina B) não está aprovado para tratar hiper-hidrose; entretanto, doses variando de 2000 unidades a 4000 unidades foram divulgadas na literatura, isto é, doses variando de cerca de 4 a 40 ng da toxina BoNT/A de 150 kD. Tais dosagens altas, entretanto não são sem efeitos colaterais, tanto ao nível regional quanto sistêmico, tais como secura da boca, disfagia, azia, etc. (Dressler D. and Eleopra R., Clinical use of non-A botulinum toxins: botulinum toxin type B., Neurotoxicity research

9.2-3 (2006): 121-125; Tintner R. et al., Autonomic function after botulinum toxin type A or B: a double-blind, randomized trial., Neurology 65.5 (2005): 765-767; Birklein F. et al. Botulinum toxin type B blocks sudomotor function effectively: a 6 month follow up., Journal of investigative dermatology 121.6 (2003): 1312-1316). Não obstante, não foi investigado se a eficácia terapêutica seria atingida para distúrbios autonômicos com doses mais baixas de toxina.

[0014] A presente invenção visa prover tratamento melhorado de distúrbios autonômicos, que evitem os problemas clínicos correntemente observado nos pacientes, tais como produção de anticorpos neutralizantes contra a toxina, assim como efeitos colaterais regionais e/ou sistêmicos.

[0015] Em um aspecto, a invenção provê uma neurotoxina clostridial para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D,

BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G e em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Em outras palavras, a invenção se refere a um método para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, em uma dose equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Mais precisamente, a invenção se refere ao uso de uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

[0016] Em um aspecto particular, a invenção provê uma neurotoxina clostridial para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dita neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G e em que a dose da dita neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é de cerca de 1,1 vez a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vez a cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Em outras palavras, a invenção se refere a um método para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, em uma dose de cerca de 1,1 vez a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vez a cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Mais precisamente, a invenção se refere ao uso de uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é de cerca de

1,1 vez a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vezes a cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. A dita dose é preferivelmente quantificada em nanogramas.

[0017] Já, em um aspecto particular, a invenção provê uma neurotoxina clostridial para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dita neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G e em que uma dose variando de cerca de 0,00025 ng a cerca de 3 ng da dita neurotoxina clostridial deva ser administrada ao dito paciente. Em outras palavras, a invenção provê um método para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao paciente uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, em uma dose variando de cerca de 0,00025 ng a cerca de 3 ng.

[0018] Mais precisamente, a invenção se refere ao uso de uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente está variando de cerca de 0,00025 ng a cerca de 3 ng.

[0019] A presente invenção está primeiramente fundamentada na descoberta inesperada pelos Inventores que BoNT/B é pelo menos tão potente quanto BoNT/A sobre tecido de músculo liso humano.

[0020] Esta descoberta é inesperada visto que, como mencionado acima, doses muito mais altas de BoNT/B (Neurobloc®/Myobloc®) são requeridas para tratar distúrbios de músculo esqueletal quando comparadas com BoNT/A (por exemplo, Botox®). Está provavelmente fundamentado nesta observação clínica que apenas doses mais altas de BoNT/B (Neurobloc®/Myobloc®) do que BoNT/A (por exemplo, Botox®) foram até agora testados e relatados na literatura para o tratamento de por exemplo, hiper-hidrose que envolve músculos lisos.

[0021] É levantada a hipótese que esta diferença em potência de BoNT/B nestes dois tecidos é devido ao fato de que distúrbios de músculo liso e esqueletal de fato não são dependentes das mesmas vias nervosas. As contrações de músculo liso são de fato dirigidas pelo sistema nervoso autonômico ao passo que as contrações de músculo esqueletal são dirigidas pelo sistema nervoso somático. Distonia cervical e muitos outros distúrbios tratados com neurotoxinas botulínicas tais como espasticidade são causadas pelas contrações de músculo esqueletal, ao passo que outros distúrbios tais como bexiga hiperativa (OAB) ou hiperatividade detrusora neurogênica (NDO) são causados pelas contrações excessivas de músculos lisos.

[0022] O sistema nervoso somático (SoNS ou sistema nervoso voluntário) é a parte do sistema nervoso periférico associada com controle voluntário de músculo esqueletal dos movimentos do corpo. O SoNS consiste de nervos aferentes e nervos eferentes. Os nervos aferentes SoNS são responsáveis pela sensação de retransmissão do corpo para o sistema nervoso central (CNS) e os nervos eferentes SoNS são responsáveis por enviar comandos do CNS para o corpo, estimulando a contração muscular; eles incluem todos os neurônios não sensoriais conectados com músculos esqueletais e pele.

[0023] O sistema nervoso autonômico (ANS) é um outro componente do sistema nervoso periférico e também consiste de nervos aferentes e nervos eferentes. O ANS é composto de duas ramificações: o sistema nervoso simpático (SNS) e o sistema nervoso parassimpático (PNS). O SNS controla as respostas mais ativas tais como frequência cardíaca e pressão sanguínea crescentes. Além dos músculos lisos, o ANS também controla secreções tais como suor, saliva e lágrimas.

[0024] Os músculos lisos são encontrados no sistema urinário (por exemplo, bexiga, ureteres), no sistema digestivo (por exemplo, paredes do estômago, trato gastrointestinal, intestinos, esfíncter de Oddi, esfíncter anal, traquéia, duto biliar), no sistema reprodutivo (por exemplo, próstata, útero), no trato respiratório, no sistema vascular (por exemplo, paredes de vaso sanguíneo, aorta, artérias, arteríolas, veias) e na íris do olho. As contrações de músculo liso são responsáveis por um amplo número de funções corporais tais como liberação de urina da bexiga, mover alimento através do trato digestivo, regular o fluxo de ar nos pulmões, regular a pressão sanguínea nas artérias e veias e contração do tamanho da pupila.

[0025] As extremidades do nervo sináptico dos neurônios colinérgicos que suprem as glândulas sudoríparas écrinas, glândulas salivares e glândulas lacrimais podem ser alvejadas com neurotoxinas botulínicas. Os distúrbios neurogênicos associados com a hiperatividade sudomotora ou secretomotora incluem hiper-hidrose, em particular hiper-hidrose focal das palmas, axilas ou pés, sudorese gustativa (síndrome de Frey), lacrimejamento aumentado durante a refeição (síndrome das lágrimas de crocodilo), hipersalivação (sialorreia, escoamento de saliva para fora da boca), etc.

[0026] Sem desejar estar ligado pela teoria, é levantada a hipótese de que a diferença na potência observada entre BoNT/A e BoNT/B no sistema somático versus o sistema autonômico está relacionada com o fato de que BoNT/A e BoNT/B diferem com respeito ao seu receptor de proteína (SV2 e Syt I/II respectivamente) e/ou com a sua SNARE alvo (SNAP25 e VAMP respectivamente).

[0027] Com base nesta suposição, foi adicionalmente levantada a hipótese de que outros sorotipos de BoNT que também usam Syt I/II como um receptor de proteína e/ou clivam VAMP, tais como BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, exibirão uma potência similar como BoNT/B, se não uma potência melhor, para músculos lisos / o sistema autonômico, pelo menos em seres humanos.

[0028] Consequentemente, é um aspecto da presente invenção prover uma neurotoxina clostridial para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G e em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Em outras palavras, a invenção se refere a um método para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, em uma dose equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico. Mais precisamente, a invenção se refere ao uso de uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

[0029] Em uma modalidade, o distúrbio autonômico a ser tratado pela neurotoxina clostridial da invenção é selecionado do grupo consistindo de distúrbios de músculo liso, distúrbios hipersecretores, distúrbios respiratórios, distúrbios inflamatórios com um componente autonômico, distúrbios neuroendócrinos e outros distúrbios autonômicos diretamente associados com um distúrbio neurológico central.

[0030] Os exemplos de tais distúrbios autonômicos incluem, sem limitação: ● distúrbios de músculo liso, que são notavelmente causados pelas contrações musculares excessivas, anormal e/ou prolongadas (distúrbios espásticos), incluindo por exemplo: ○ distúrbios urinários, tais como hiperatividade detrusora neurogênica (NDO), bexiga hiperativa (OAB), em particular OAB idiopática (iOAB), espasmos de bexiga, dissinergia detrusor-esfíncter (DSD), incontinência urinária, retenção urinária, nocturia, incontinência de urgência, frequência urinária; distúrbios gastrointestinais, tais como disfunção do esfíncter de Oddi, espasmos esofágicos, espasmos intestinais, acalasia, gastroparesia, colite espástica, fissuras anais, constipação, diarréia ocasional, disfagia, disfagia orofaríngea, distúrbios de deglutição; ○ distúrbios vasculares e cardiovasculares tais como doença de Raynaud, trombose anastomótica, fibrilação atrial depois da cirurgia cardíaca, hipotensão ortostática, distúrbio de pressão sanguínea; ○ distúrbios prostáticos tais como hiperplasia prostática benigna (BPH), prostatite, prostodinia, aumento prostático; e ○ distúrbios sexuais: disfunção erétil, priapismo, insuficiência ejaculatória, vaginismo;

● distúrbios hipersecretores, tais como hiper-hidrose (hiper-hidrose axilar, palmar, plantar, sudorese difusa, síndrome de Frey, etc.), hipersalivação (escoamento de saliva para fora da boca, sialorreia), sudorese gustativa, lacrimejação excessiva, síndrome das lágrimas de crocodilo, secreção de muco excessiva, bromidrose, secreção ácida estomacal, acne; ● distúrbios respiratórios que tenham um componente hipersecretor e/ou muscular, tais como rinorréia, rinite crônica, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), hiperreatividade brônquica, estridor, suspiros inspiratórios involuntários, episódios apnéicos; ● distúrbios inflamatórios que têm um componente autonômico, tais como otite média, coceira, prurido, síndrome intestinal inflamatória; ● distúrbios neuroendócrinos: diabetes, hiperinsulinismo, distúrbios pancreáticos de hiperglucagonismo, distúrbios da tireóide, hipocalcemia, hipertiroidismo, distúrbios metabólicos, lipólise excessiva; e ● outros distúrbios autonômicos diretamente associados com distúrbios neurológicos centrais tais como traços parkinsonianos e cerebelar/piramidais.

[0031] Em uma modalidade preferida, o distúrbio autonômico a ser tratado de acordo com a invenção é um distúrbio de músculo liso selecionado do grupo consistindo de distúrbios urinários, distúrbios gastrointestinais, distúrbios vasculares e cardiovasculares, distúrbios prostáticos e distúrbios sexuais.

[0032] O termo “neurotoxina clostridial” como aqui usado significa qualquer polipeptídeo que entra dentro de um neurônio e inibe a liberação de neurotransmissor. Este processo abrange a ligação das neurotoxinas a um receptor de baixa ou alta afinidade, a internalização da neurotoxina, a translocação da porção de endopeptidase da neurotoxina dentro do citoplasma e a modificação enzimática do substrato de neurotoxina. Mais especificamente, o termo “neurotoxina” abrange qualquer polipeptídeo produzido pelas bactérias Clostridium (neurotoxinas clostridiais)

que entram dentro de um neurônio e inibem a liberação de neurotransmissor e tais polipeptídeos produzidos pelas tecnologias recombinantes ou técnicas químicas. É esta forma de cadeia dupla que é a forma ativa da toxina. As duas cadeias são chamadas de cadeia pesada (cadeia H), que tem uma massa molecular de aproximadamente 100 kDa e a cadeia leve (cadeia L), que tem uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa. Preferivelmente, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina botulínica (BoNT).

[0033] Os sorotipos A a G de BoNT podem ser distinguidos com base na inativação pelo antissoro neutralizante específico, com tal classificação pelo sorotipo correlacionando com a identidade de sequência percentual ao nível de aminoácido. As proteínas BoNT de um sorotipo dado são divididos adicionalmente em subtipos diferentes com base na identidade de sequência percentual de aminoácido.

[0034] Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/A é provida como SEQ ID NO: 1 (número de acesso UniProt A5HZZ9). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/B é provida como SEQ ID NO: 2 (número de acesso UniProt B1INP5). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/C é provida como SEQ ID NO: 3 (número de acesso UniProt P18640). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/D é provida como SEQ ID NO: 4 (número de acesso UniProt P19321). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/E é provida como SEQ ID NO: 5 (número de acesso WP_003372387). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/F é provida como SEQ ID NO: 6 (número de acesso UniProt Q57236) ou como SEQ ID NO: 11 (número de acesso UniProt/UniParc UPI0001DE3DAC). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/G é provida como SEQ ID NO: 7 (número de acesso WP_039635782). Um exemplo de uma sequência de aminoácidos da neurotoxina BoNT/D-C é provida como SEQ ID NO: 8 (número de acesso BAM65681).

[0035] O termo “domínio HC” como aqui usado se refere a uma região funcionalmente distinta da cadeia pesada de neurotoxina com um peso molecular de aproximadamente 50 kDa que permite a ligação da neurotoxina a um receptor localizado na superfície da célula alvo. O domínio HC consiste de dois subdomínios estruturalmente distintos, o “subdomínio HCN” (parte de terminal N do domínio HC) e o “subdomínio HCC” (parte de terminal C do domínio HC, também chamado de domínio Hcc), cada um dos quais tendo um peso molecular de aproximadamente 25 kDa. Um domínio HCC é capaz de ligação a um receptor de proteína de neurotoxina clostridial.

[0036] O termo “Domínio LHN” como aqui usado se refere a uma região de neurotoxina que é distinta do domínio HC e que consiste de um domínio de endopeptidase (“L” ou “cadeia leve”) e de um domínio responsável pela translocação da endopeptidase dentro do citoplasma (domínio HN da cadeia pesada). Um domínio de endopeptidase (“L” ou “cadeia leve”) é capaz de clivar uma proteína SNARE.

[0037] Os domínios L, HN, HCN e HCC exemplares são mostrados na tabela 1. Tabela 1 – Domínios L, HN, HCN e HCC Exemplares BoNT Número de acesso SEQ ID NO: L HN HCN HCC BoNT/A1 A5HZZ9 1 1-448 449-872 873-1094 1095-1296 BoNT/B1 B1INP5 2 1-441 442-859 860-1081 1082-1291 BoNT/C1 P18640 3 1-449 450-867 868-1095 1096-1291 BoNT/D P19321 4 1-442 443-863 864-1082 1083-1276 BoNT/E1 WP_003372387 5 1-423 424-846 847-1069 1070 -1252 BoNT/F1 Q57236 6 1-439 440-865 866-1087 1088-1278 BoNT/F7 UPI0001DE3DAC 11 1-508 509-862 863-1076 1077-1268 BoNT/G WP_039635782 7 1-446 447-864 865-1089 1090-1297 BoNT/DC BAM65681 8 1-442 443-863 864-1091 1092-1285

[0038] As sequências de referência identificadas acima devem ser consideradas um guia, visto que variações leves podem ocorrer de acordo com subsorotipos. Por via de exemplo, a US 2007/0166332 (por meio deste incorporada por referência na sua totalidade) cita sequências clostridiais levemente diferentes.

[0039] O termo “alça de ativação” se refere a um domínio de polipeptídeo compreendendo um sítio de clivagem proteolítica. As alças de ativação de neurotoxinas foram descritas na técnica, tal como na WO2016156113 (por meio deste incorporada por referência na sua totalidade).

[0040] Em uma modalidade da invenção, o domínio HCC da neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1083 a 1276 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1088 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1077 a 1268 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1090 a 1297 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1092 a 1285 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0041] Como usado por todo o relatório descritivo, o termo “identidade de sequência percentual” entre duas ou mais sequências de aminoácidos significa uma função do número de aminoácidos idênticos nas posições idênticas compartilhadas pelas sequências de aminoácidos alinhadas. Assim, % de identidade como aqui usada pode ser calculada como o número de aminoácidos idênticos em cada posição em um alinhamento dividido pelo número total de aminoácidos na sequência alinhada, multiplicado por 100. Os cálculos de % de identidade de sequência também podem levar em conta o número de interstícios e o comprimento de cada interstício que precisa ser introduzido para otimizar o alinhamento de duas ou mais sequências. As comparações de sequência e a determinação da identidade percentual entre duas ou mais sequências podem ser realizadas usando algoritmos matemáticos específicos, em particular um algoritmo matemático de alinhamento global (tal como descrito por Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3), 443-453, 1972), que será familiar a uma pessoa habilitada.

[0042] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1088 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1077 a 1268 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0043] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0044] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 1088 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0045] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 1077 a 1268 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0046] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11.

[0047] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11.

[0048] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[0049] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6.

[0050] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[0051] Em uma modalidade mais preferida, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina BoNT/B. Preferivelmente, a neurotoxina BoNT/B clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[0052] Em uma modalidade mais preferida, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina BoNT/F. Preferivelmente, a neurotoxina BoNT/F clostridial consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 ou a SEQ ID NO: 11.

[0053] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica.

[0054] O termo “neurotoxina quimérica” como aqui usado significa uma neurotoxina compreendendo um ou mais domínios originando de uma primeira neurotoxina e um ou mais domínios originando de uma segunda neurotoxina. Por exemplo, uma neurotoxina quimérica pode compreender um domínio LHN originando de um primeiro sorotipo ou subtipo de neurotoxina e um domínio HC originando de um segundo sorotipo ou subtipo de neurotoxina. um outro exemplo de uma neurotoxina quimérica é uma neurotoxina compreendendo um domínio LHN HCN originando de um primeiro sorotipo ou subtipo de neurotoxina e um domínio HCC originando de um segundo sorotipo ou subtipo de neurotoxina. um exemplo adicional de uma neurotoxina quimérica é uma neurotoxina compreendendo um domínio LHN de um primeiro sorotipo ou subtipo de neurotoxina e uma alça de ativação de um segundo sorotipo ou subtipo de neurotoxina. Os exemplos de neurotoxinas quiméricas são providos na WO2017191315 e WO2016156113, ambas aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0055] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica que compreende um domínio HC de uma BoNT/B e um domínio LHN de uma BoNT/A, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou BoNT/D-C.

[0056] Em uma modalidade de uma neurotoxina quimérica de acordo com a invenção, o domínio HC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 860 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 864 a 1276 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma,

- resíduos de aminoácido 866 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 863 a 1268 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 865 a 1297 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 864 a 1285 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma,

[0057] e o domínio LHN consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1 a 872 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 859 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 867 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 863 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 846 da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 865 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 862 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 864 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1 a 863 da SEQ ID NO: 8 ou um polipeptídeo sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0058] Em uma modalidade preferida, o domínio HC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 860 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e o domínio LHN consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1 a 872 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 867 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 863 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 846 da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma,

- resíduos de aminoácido 1 a 865 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 862 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 864 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1 a 863 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0059] Em uma modalidade mais preferida, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica que compreende um domínio HC de uma BoNT/B e um Domínio LHN de uma BoNT/A.

[0060] Em uma modalidade mais preferida, o domínio HC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 860 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e o domínio LHN compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 1 a 872 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0061] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica que compreende um domínio HCC de uma BoNT/B e um domínio LHNHCN de uma BoNT/A, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou BoNT/D-C.

[0062] Em uma modalidade de uma neurotoxina quimérica de acordo com a invenção, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1083 a 1276 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1088 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1077 a 1268 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1090 a 1297 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1092 a 1285 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma,

[0063] e o domínio LHNHCN consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1 a 1094 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1081 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1095 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1082 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%,

90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1069 da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1087 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1076 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1089 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1 a 1091 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0064] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma e o domínio LHNHCN consiste de ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: - resíduos de aminoácido 1 a 1094 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1095 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1082 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%,

90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1069 da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1087 da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1076 da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, - resíduos de aminoácido 1 a 1089 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma, e - resíduos de aminoácido 1 a 1091 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0065] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica que compreende um domínio LHN de um primeiro subtipo BoNT/F e uma alça de ativação de um segundo subtipo BoNT/F, em que o dito segundo subtipo BoNT/F difere do dito primeiro subtipo BoNT/F. Tais subtipos BoNT/F e as neurotoxinas quiméricas BoNT/F foram descritas na técnica, tal como na WO2016156113 (por meio deste incorporada por referência na sua totalidade).

[0066] Em uma modalidade preferida, o dito domínio LHN é um domínio LHN de BoNT/subtipo F7 e/ou a dita alça de ativação é uma alça de ativação BoNT/subtipo F1.

[0067] Em uma modalidade preferida, a dita alça de ativação compreende a (ou consiste da) sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14.

[0068] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina quimérica compreende a (ou consiste da) sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%,

90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0069] A neurotoxina clostridial pode ser uma neurotoxina modificada ou um derivado da mesma, incluindo, mas não limitado àqueles descritos abaixo. Uma neurotoxina modificada ou derivado podem conter um ou mais aminoácidos que foram modificados quando comparados com a forma nativa da neurotoxina. Os exemplos de tal modificação, também conhecida como mutação, incluem, sem limitação, uma substituição, adição ou deleção de resíduo de aminoácido. No contexto da presente invenção, uma neurotoxina clostridial modificada pode, por exemplo, ter sequência(s) de aminoácidos modificada(s) em um ou mais domínios em relação à sequência de aminoácidos da neurotoxina clostridial nativa. Os termos nativa, não modificada, natural, de ocorrência natural ou tipo selvagem podem ser aqui usados intercambiavelmente.

[0070] Tais modificações podem impactar aspectos funcionais da neurotoxina, por exemplo atividade biológica ou persistência. Entretanto, no contexto da presente invenção, uma neurotoxina modificada é dita ser funcional. Em outras palavras, a neurotoxina modificada da invenção retém a(s) função(ões) de uma neurotoxina, selecionada(s) da capacidade para se ligar a um receptor de neurotoxina de afinidade baixa ou alta em uma célula alvo, a capacidade para translocar a porção de endopeptidase da neurotoxina (cadeia leve) dentro do citoplasma da célula e a capacidade para clivar uma proteína SNARE.

[0071] Uma neurotoxina modificada de acordo com a invenção pode ter uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos da cadeia pesada (tal como no domínio HC), em que a dita cadeia pesada modificada se liga às células nervosas alvo com uma afinidade mais alta ou mais baixa do que a neurotoxina nativa. Tais modificações no domínio HC podem incluir modificações de resíduos de aminoácido no sítio de ligação de gangliosídeo do domínio HCC que pode alterar a ligação ao gangliosídeo da célula nervosa alvo e/ou modificações de resíduos de aminoácido no sítio de ligação do receptor de proteína do domínio HCC que pode alterar a ligação ao receptor de proteína da célula nervosa alvo. Os exemplos de tais neurotoxinas modificadas são descritos na WO2006027207 e WO2006114308, ambas as quais são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade.

[0072] Em uma modalidade de uma neurotoxina clostridial modificada de acordo com a invenção, o domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G é modificada quando comparada ao domínio HCC natural dos ditos sorotipos BoNT.

[0073] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC de uma neurotoxina BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C BoNT/F ou BoNT/G compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido que aumenta a afinidade de ligação do dito domínio HCC para Syt II humano quando comparada ao domínio HCC natural de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ou BoNT/D-C. Os inventores de fato descobriram que tal mutação de resíduo de aminoácido pode aumentar a potência da neurotoxina para músculo liso humano.

[0074] Em uma modalidade mais preferida, o domínio HCC de uma neurotoxina BoNT/B compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido que aumenta a afinidade de ligação do dito domínio HCC para Syt II humano quando comparada com o domínio HCC natural de BoNT/B. Ainda, preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido aumenta a afinidade de ligação do dito domínio HCC para Syt II humano em pelo menos 50% quando comparada com domínio HCC natural de BoNT/B.

[0075] Tais mutações de resíduo de aminoácido adequado no domínio HCC de BoNT/B foram descritas na técnica na WO2013180799 e WO2016154534, ambas aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0076] Em particular, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido adequada para aumentar a afinidade de ligação do domínio HCC de BoNT/B para Syt II humano em pelo menos 50% quando comparada ao domínio HCC natural de BoNT/B é uma substituição, adição ou deleção de resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: 1118M, 1183M, 1191M, 1191I, 1191Q, 1191T, 1199Y, 1199F, 1199L, 1201V, 1191C, 1191V, 1191L, 1191Y, 1199W, 1199E, 1199H, 1178Y, 1178Q, 1178A, 1178S, 1183C, 1183P e quaisquer combinações das mesmas. Preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste de duas substituições, adições ou deleções de resíduo de aminoácido selecionadas do grupo consistindo de: 1191M e 1199L, 1191M e 1199Y, 1191M e 1199F, 1191Q e 1199L, 1191Q e 1199Y, 1191Q e 1199F, 1191M e 1199W, 1191M e 1178Q, 1191C e 1199W, 1191C e 1199Y, 1191C e 1178Q, 1191Q e 1199W, 1191V e 1199W, 1191V e 1199Y ou 1191V e 1178Q. Ainda preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste de três substituições, adições ou deleções de resíduo de aminoácido: 1191M, 1199W e 1178Q. Mais preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste das duas substituições, adições ou deleções de resíduo de aminoácido: 1191M e 1199Y.

[0077] Em uma modalidade mais preferida, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido adequada para aumentar a afinidade de ligação do domínio HCC de BoN/B para Syt II humano em pelo menos 50% quando comparada com o domínio HCC natural de BoNT/B é uma substituição de resíduo de aminoácido selecionada do grupo consistindo de: V1118M, Y1183M, E1191M, E1191I, E1191Q, E1191T, S1199Y, S1199F, S1199L, S1201V, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P e quaisquer combinações das mesmas. Preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste de duas substituições de resíduo de aminoácido selecionadas do grupo consistindo de: E1191M e S1199L, E1191M e S1199Y, E1191M e S1199F, E1191Q e S1199L, E1191Q e S1199Y, E1191Q e S1199F, E1191M e S1199W, E1191M e W1178Q, E1191C e S1199W, E1191C e S1199Y, E1191C e W1178Q, E1191Q e S1199W, E1191V e S1199W, E1191V e S1199Y ou E1191V e W1178Q. Ainda preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste de três substituições de resíduo de aminoácido: E1191M, S1199W e W1178Q. Mais preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido no domínio HCC de BoNT/B consiste das duas substituições de resíduo de aminoácido: E1191M e S1199Y.

[0078] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC de BoNT/B a ser modificado corresponde aos resíduos de aminoácido 1082 a 1291 da SEQ ID NO: 2 (domínio HCC natural de BoNT/B) ou a uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0079] Em uma modalidade mais preferida, a neurotoxina clostridial modificada da presente invenção compreende a (ou consiste da) sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0080] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC de uma neurotoxina BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C BoNT/F ou BoNT/G compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido que aumenta a afinidade de ligação do dito domínio HCC a um ou mais gangliosídeos quando comparada com o domínio HCC natural de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F ou BoNT/G.

[0081] Em uma modalidade mais preferida, o dito domínio HCC de uma BoNT/F compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido aumentando a afinidade de ligação do dito domínio Hcc a um ou mais gangliosídeos quando comparada com o domínio HCC natural de BoNT/F.

[0082] Em uma modalidade preferida, os ditos gangliosídeos são selecionados de GD1a e/ou GM1a.

[0083] As mutações de resíduo de aminoácido adequadas para aumentar a afinidade de ligação de um domínio HCC de BoNT/F aos gangliosídeos, tais como GD1a e/ou GM1a, quando comparada com um domínio HCC natural de BoNT/F, incluem, mas não são limitadas à mutação de aminoácido 1241K, tal como uma substituição, adição ou deleção de aminoácido. Mais preferivelmente, a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido aumentando a afinidade de ligação do dito domínio HCC de BoNT/F quando comparada com um domínio Hcc natural de BoNT/F é a substituição de aminoácido H1241K.

[0084] Em uma modalidade preferida, o domínio HCC de BoNT/F a ser modificado corresponde aos resíduos de aminoácido 1088 a 1278 da SEQ ID NO: 6 ou aos resíduos de aminoácido 1077 a 1268 da SEQ ID NO: 11 (domínios HCC naturais de BoNT/F) ou a uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0085] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina quimérica clostridial da presente invenção compreende a (ou consiste da) sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0086] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial da presente invenção pode ser tanto quimérica quanto modificada, como descrito acima. Por exemplo, em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial compreende a (ou consiste da) sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0087] A neurotoxina clostridial da presente invenção pode ser produzida usando tecnologias recombinantes. Assim, em uma modalidade, a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina clostridial recombinante.

[0088] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial está associada com proteínas de complexação de BoNT, também conhecidas como proteínas associadas com neurotoxina não tóxica (NAP). Em outras palavras, a neurotoxina clostridial é administrada ao paciente humano em associação com ou combinada com proteínas de complexação de BoNT. Consequentemente, em uma modalidade a neurotoxina clostridial é complexada com uma ou mais proteínas de complexação de BoNT.

[0089] Em uma outra modalidade, a neurotoxina clostridial é livre de (ou não associada com ou combinada com) proteínas de complexação de BoNT. Em outras palavras, a neurotoxina clostridial é administrada ao paciente humano sem estar associada com ou combinada com proteínas de complexação de BoNT.

[0090] Preferivelmente, a neurotoxina clostridial (por exemplo, para o uso como aqui descrito) é parte de uma composição farmacêutica junto com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. Por “carreador farmaceuticamente aceitável”, é aqui intencionado qualquer componente que seja compatível com os outros ingredientes da composição farmacêutica, em particular com a neurotoxina clostridial e que não seja deletério ao paciente humano. O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado com base na via desejada de administração, de acordo com as práticas farmacêuticas padrão e incluem, sem limitação, excipientes, diluentes, adjuvantes, propelentes e sais.

[0091] Consequentemente, a presente invenção se refere adicionalmente a uma composição farmacêutica para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a dita composição compreende a neurotoxina clostridial da invenção e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável e a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é como descrita acima. Também são abrangidos usos e métodos correspondentes de tratar um distúrbio autonômico compreendendo administrar uma composição farmacêutica da invenção a um paciente humano.

[0092] A neurotoxina clostridial da presente invenção pode ser formulada para a administração oral, parenteral (isto é, injeção), infusão contínua, inalação ou tópica. As composições farmacêuticas adequadas para injeção podem estar na forma de soluções, suspensões ou emulsões ou pós secos que são dissolvidos ou colocados em suspensão em um veículo adequado antes do uso.

[0093] No caso de uma neurotoxina que deva ser distribuída localmente, a neurotoxina pode ser formulada como um creme (por exemplo, para aplicação tópica) ou para injeção subdérmica.

[0094] Os meios de distribuição local podem incluir um aerossol ou outra pulverização (por exemplo, um nebulizador). A este respeito, uma formulação aerossol de uma neurotoxina permite a distribuição aos pulmões e/ou outras passagens nasais e/ou brônquicas ou das vias aéreas.

[0095] As neurotoxinas clostridiais da invenção também podem ser administradas a um paciente pela injeção intratecal ou epidural na coluna espinhal ao nível do segmento espinhal envolvido na inervação de um órgão afetado.

[0096] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial ou composição farmacêutica é para administração intramuscular, intradérmica ou subcutânea.

[0097] Em uma modalidade, a neurotoxina clostridial ou composição farmacêutica é para a administração tópica, por exemplo pela instilação.

[0098] Uma via preferida de administração é por intermédio da injeção intramuscular.

[0099] Não obstante também é possível administrar a neurotoxina clostridial a um músculo sem usar nenhuma injeção. Por exemplo, para tratar distúrbios urinários, a neurotoxina clostridial pode ser administrada à bexiga pela infusão da bexiga dos pacientes com um formulação líquida ou semissólida da neurotoxina clostridial; depositando uma formulação em gel contendo a neurotoxina clostridial no local apropriado da bexiga do paciente; pulverizando uma formulação de pulverização contendo a neurotoxina clostridial no local apropriado da bexiga dos pacientes; ou topicamente aplicando uma formulação da toxina botulínica sólida (por exemplo, liofilizada), semissólida ou líquida que é colocada ou espalhada sobre as paredes externas de um balão que é depois inflado na bexiga de modo a estar em contato com a dita parede da bexiga, como descrito na WO2005053733 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0100] Como indicado acima, a dose da neurotoxina clostridial que é adequada para se alcançar o efeito terapêutico desejado em um paciente humano sofrendo de um distúrbio autonômico, ou, em outras palavras, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial, é equivalente a ou mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico.

[0101] Preferivelmente, a dita BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico é uma BoNT/A purificada. Como aqui usado, o termo “BoNT/A purificada” significa uma neurotoxina botulínica tipo A purificada de uma cepa clostridial que naturalmente a produz (cepa clostridial de ocorrência natural). A BoNT/A purificada pode estar associada com proteínas de complexação ou livre de proteínas de complexação. Os exemplos de BoNT/A purificada comercialmente disponíveis incluem Botox®, Dysport® e Xeomin®.

[0102] Em uma modalidade, a dose da neurotoxina clostridial a ser administrada para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano (dose terapêutica) é cerca de 1,1 vez a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vezes a cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

[0103] Em uma modalidade preferida, quando a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 1,1 vez a cerca de 20 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vezes a cerca de 19,8 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Por exemplo, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina BoNT/B natural, tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 1,1 vez a cerca de 1,5 vezes, preferivelmente cerca de 1,3 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Como um exemplo adicional, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina BoNT/B modificada tendo uma afinidade de ligação aumentada para o receptor de SytII humano (quando comparada com a BoNT/B natural), tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 15 vezes a cerca de 20 vezes, preferivelmente cerca de 19,8 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Ainda, como um outro exemplo, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina quimérica BoNT/B modificada tendo uma afinidade de ligação aumentada para o receptor de SytII humano, tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes, preferivelmente cerca de 3,5 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico.

[0104] Em uma modalidade preferida, quando a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/F, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 60 vezes a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 61,2 vezes a cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Por exemplo, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina BoNT/F natural, tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 60 vezes a cerca de 65 vezes, preferivelmente cerca de 61,2 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Como um exemplo adicional, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina BoNT/F modificada tendo uma afinidade de ligação aumentada para um ou mais gangliosídeos (quando comparada com a BoNT/F natural), tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 60 vezes a cerca de 65 vezes, preferivelmente cerca de 61,2 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico. Ainda, como um outro exemplo, quando a neurotoxina clostridial da invenção é uma neurotoxina quimérica BoNT/F, tal como a neurotoxina da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13, a dose terapêutica da dita neurotoxina clostridial é cerca de 85 vezes a cerca de 100 vezes, preferivelmente cerca de 90 vezes, mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o mesmo distúrbio autonômico.

[0105] Como indicado acima, as doses de BoNT/A tratando distúrbios autonômicos são bem conhecidas na técnica (https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112).

[0106] As doses de neurotoxina clostridial são aqui preferivelmente medidas em nanogramas.

[0107] As doses de neurotoxina clostridial de acordo com a invenção devem ser entendidas como doses de neurotoxina clostridial de cadeia dupla ativa, isto é, sem incluir a quantidade de proteínas de complexação com as quais a neurotoxina pode estar associada. Em outras palavras, as mesmas se referem às doses de neurotoxina clostridial de cadeia dupla ativa, se a dita neurotoxina é administrada ao paciente em associação com ou sem proteínas de complexação. Como bem conhecido pelo técnico versado, uma neurotoxina clostridial de cadeia dupla ativa é capaz de ligação a um receptor neuronal, translocando a cadeia leve dentro do citoplasma e de clivar uma proteína SNARE, embora as proteínas de complexação não exibam tal atividade biológica (isto é, não são “ativas”). No caso de neurotoxinas botulínicas, o tamanho total da cadeia dupla ativa é geralmente de cerca de 150 kD.

[0108] De fato, como bem conhecido pelo técnico versado, a potência de uma neurotoxina clostridial está relacionada com a quantidade (por exemplo, nanogramas) de neurotoxina requerida para se alcançar uma unidade LD50 (dose letal 50); uma unidade LD50 sendo definida como a dose intraperitoneal letal média (como medida em camundongos). Entretanto, as preparações farmacêuticas de BoNT correntemente no mercado contêm quantidades diferentes de neurotoxina de 150 kD, mas também de Unidades LD50. Além disso, nestas preparações, a neurotoxina pode ou estar associada ou não com (isto é, combinada com) proteínas associadas com a neurotoxina não tóxica (NAP), também conhecidas como proteínas de complexação. Para facilidade de conversão: - 100 Unidades de Botox® (também conhecido como Onabotulinumtoxina A) contêm cerca de 0,73 ng de BoNT/A de 150 kD, assim como proteínas de complexação; - 100 Unidades de Dysport® (também conhecido como Abobotulinumtoxina A) contêm cerca de 0,65 ng de BoNT/A de 150 kD, assim como proteínas de complexação; - 100 Unidades de Xeomin® (também conhecido como Incobotulinumtoxina A) contêm cerca de 0,44 ng de BoNT/A de 150 kD, sem nenhuma das proteínas de complexação; - 100 Unidades de Neurobloc/Myobloc® (também conhecido como Rimabotulinumtoxina B) contêm cerca de 0,2 ng a cerca de 1 ng de BoNT/B de 150 kD, assim como proteínas de complexação.

[0109] A quantidade de neurotoxina clostridial pode ser medida pelo técnico versado de acordo com métodos convencionalmente usados na técnica para quantificar proteínas preferivelmente ao nível de nanogramas, incluindo, entre outras, espectroscopia de massa tal como espectroscopia de massa de diluição isotópica (Muñoz et al., Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotope dilution mass spectrometry, Anal. Biochem. 2011, 408, 124–131), ou ensaio fluorimétrico (Poras et al., Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type

A by a Novel Rapid In Vitro Fluorimetric Assay, Appl Environ Microbiol. julho de 2009; 75(13): 4382–4390).

[0110] Onde uma faixa de valores é aqui provida, deve ser entendido que, a menos que o contexto claramente imponha de outro modo, cada valor interveniente até o décimo da unidade entre os limites superior e inferior desta faixa também é especificamente divulgado. Cada faixa menor entre qualquer valor estabelecido ou valor interveniente em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nesta faixa estabelecida é abrangido dentro desta divulgação. Deve ser entendido ainda que qualquer faixa de valores numéricos aqui indicados pela expressão “de a até b” significa a faixa de valores numéricos estendendo-se de a até b (isto é, incluindo os estritos pontos finais a e b).

[0111] Além disso, o termo “cerca de” deve ser aqui entendido como mais ou menos (±) 5%, preferivelmente ± 4%, ± 3%, ± 2%, ± 1%, ± 0,5%, ± 0,1%, do valor numérico do número com o qual o mesmo está sendo usado.

[0112] Em uma modalidade preferida, a dose da neurotoxina clostridial da invenção a ser administrada para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano (isto é, a dose terapêutica) está variando de cerca de 0,00025 ng a cerca de 3 ng.

[0113] Em uma modalidade preferida, a dose terapêutica da neurotoxina clostridial está variando de cerca de 0,0003 ng a cerca de 2 ng, preferivelmente de cerca de 0,0004 ng a cerca de 1,5 ng, de cerca de 0,0005 ng a cerca de 1 ng, ainda preferivelmente de cerca de 0,0006 ng a cerca de 0,5 ng da dita neurotoxina clostridial.

[0114] Em uma modalidade preferida, a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de BoNT/B ou um domínio HCC de BoNT/F e deve ser administrada ao paciente humano em qualquer uma das doses aqui descritas da dita neurotoxina clostridial, para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico, como descrito acima.

[0115] Em uma modalidade mais preferida, a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de BoNT/B ou um domínio HCC de BoNT/F e deve ser administrada ao paciente humano em qualquer uma das doses aqui descritas da dita neurotoxina clostridial, para o uso no tratamento de um distúrbio de músculo liso, como descrito acima. Mais preferivelmente, o dito distúrbio de músculo liso é selecionado do grupo consistindo de distúrbios urinários, distúrbios gastrointestinais, distúrbios vasculares e cardiovasculares, distúrbios prostáticos e distúrbios sexuais.

[0116] Por exemplo, a dose terapêutica da neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de BoNT/B está preferivelmente variando de cerca de 0,001 ng a cerca de 2 ng.

[0117] Já, por exemplo, a dose terapêutica da neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de BoNT/B está preferivelmente variando de cerca de 0,0003 ng a cerca de 0,05 ng.

[0118] Não obstante será avaliado que a faixa de dose requerida depende da natureza precisa da neurotoxina clostridial, do distúrbio autonômico, da via de administração, da natureza da formulação, da idade do paciente, da natureza, grau ou severidade da condição do paciente, contraindicações, se alguma e o julgamento do médico responsável. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotinas empíricas padrão para otimização.

[0119] Como uma referência, exemplos de doses adequadas de BoNT/A natural (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1), para tratar alguns distúrbios autonômicos específicos, são providos abaixo: - NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 1,46 ng de BoNT/A natural dentro do músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,73 ng de BoNT/A natural no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,365 ng de BoNT/A natural em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular em pacientes com Doença de Parkinson: 0,146 ng de BoNT/A natural por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,073 ng de BoNT/A natural por glândula submandibular e/ou parótida.

[0120] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/B natural (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2), para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são:

- NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,5 ng a 2 ng de BoNT/B natural no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,25 ng a 1 ng de BoNT/B natural no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,125 ng a 0,5 ng de BoNT/B natural em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular em pacientes com Doença Parkinson: 0,05 ng a 0,2 ng de BoNT/B natural por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,025 ng a 0,1 ng de BoNT/B natural por glândula submandibular e/ou parótida.

[0121] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/B modificada tendo uma afinidade de ligação aumentada para o receptor SytII humano (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9), para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são: - NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,025 ng a 0,2 ng de BoNT/B modificada no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,0125 ng a 0,1 ng de BoNT/B modificada no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,0075 ng a 0,05 ng de BoNT/B modificada em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular pacientes com Doença de Parkinson: 0,0025 ng a 0,02 ng de BoNT/B modificada por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,001 ng a 0,01 ng de BoNT/B modificada por glândula submandibular e/ou parótida.

[0122] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/B modificada quimérica tendo uma afinidade de ligação aumentada para o receptor SytII humana (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10), para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são:

- NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,2 ng a 1 ng de BoNT/B modificada quimérica no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,1 ng a 0,5 ng de BoNT/B modificada quimérica no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,05 ng a 0,2 ng de BoNT/B modificada quimérica em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular pacientes com Doença de Parkinson: 0,02 ng a 0,1 ng de BoNT/B modificada quimérica por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,01 ng a 0,05 ng de BoNT/B modificada quimérica por glândula submandibular e/ou parótida.

[0123] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/F natural (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11), para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são: - NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,01 ng a 0,05 ng de BoNT/F natural no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,005 ng a 0,025 ng de BoNT/F natural no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,0025 ng a 0,01 ng de BoNT/F natural em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular pacientes com Doença de Parkinson: 0,001 ng a 0,005 ng de BoNT/F natural por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,0005 ng a 0,0025 ng de BoNT/F natural por glândula submandibular e/ou parótida.

[0124] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/F modificada tendo uma afinidade de ligação aumentada para um ou mais gangliosídeos (tais como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são:

- NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,01 ng a 0,05 ng de modificada BoNT/F no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,005 ng a 0,025 ng de BoNT/F modificada no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,0025 ng a 0,01 ng de BoNT/F modificada em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular pacientes com Doença de Parkinson: 0,001 ng a 0,005 ng de BoNT/F modificada por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,0005 ng a 0,0025 ng de BoNT/F modificada por glândula submandibular e/ou parótida.

[0125] Os exemplos de faixas de dose adequadas de BoNT/F quimérico (tal como a neurotoxina tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13), para tratar os distúrbios mencionados acima de acordo com a invenção, são: - NDO (hiperatividade detrusora neurogênica): 0,007 ng a 0,03 ng de BoNT/F quimérico no músculo detrusor; - OAB (bexiga hiperativa): 0,003 ng a 0,0015 ng de BoNT/F quimérico no músculo detrusor; - hiper-hidrose das axilas: 0,001 ng a 0,007 ng de BoNT/F quimérico em cada axila; - sialorreia em pacientes adultos, em particular pacientes com Doença de Parkinson: 0,0007 ng a 0,003 ng de BoNT/F quimérico por glândula submandibular e/ou parótida; - sialorreia em pacientes pediátricos com paralisia cerebral: 0,0003 ng a 0,0015 ng de BoNT/F quimérico por glândula submandibular e/ou parótida.

[0126] Esta divulgação não é limitada pelos métodos e materiais exemplares aqui divulgados e quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou teste de modalidades desta divulgação. A menos que de outro modo indicado, qualquer sequência de aminoácidos é escrita da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente.

[0127] Deve ser mencionado adicionalmente que como aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma neurotoxina clostridial” inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e referência a “a neurotoxina clostridial” inclui referência a uma ou mais neurotoxinas clostridiais e equivalentes das mesmas conhecidos por aqueles habilitados na técnica e assim por diante.

[0128] A invenção será agora descrita, apenas por via de exemplo, com referência às seguintes Figuras e Exemplos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0129] Figura 1 - Respostas contráteis de tira de bexiga para contrações induzidas por EFS a seguir de 3 estímulos aplicados em intervalo de 1 min seguido por 3 min de repouso.

[0130] Figura 2A - Tempo para inibição de 50% (T50) da contração EFS máxima em termos de amplitude a 1, 3, 5 ou 10 nM de nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY e rBoNT/ABMY.

[0131] Figura 2B - Tempo para inibição de 50% (T50) de contração EFS máxima em termos de amplitude a 0,1, 1 ou 10 nM de nBoNT/F, mrBoNT/F e mrBoNT/F7-1.

[0132] Figura 3 – Curvas de resposta de concentração de nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F e mrBoNT/F7-1. O tempo para inibição de 50% (T50) foi plotado contra a concentração de proteína da toxina botulínica e as funções logarítmicas foram ajustadas produzindo excelentes valores R2.

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

[0133] ● SEQ ID NO: 1 - BoNT/A1, número de acesso A5HZZ9, sequência de aminoácidos

[0134] MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDT

FTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTILSTDNEKDNILKGVTKLFERIYSTDLGRMLL TSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSF GHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHEL IHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEF RLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKILLSEDTSGKFSVDKLKFDK LYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTILNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAA NFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKV NNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYILTFNFDNEPENISI ENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHILRAQEFEHGKSRIALTNSVNEA LLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIII PYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTID NALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQ YTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSILMNSMIPYGVKRLEDFD ASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIK NIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIV YNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQ EIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASN NIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDILQYDK PYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMILKGPRGSVMTTNIILNSSLYRGTKFIIKKYAS GNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMK SKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGC SWEFIPVDDGWGERPL

[0135] ● SEQ ID NO: 2 - BoNT/B1, número de acesso B1INP5, sequência de aminoácidos

[0136] MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTF

GYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDILNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLE MIINGIPILGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNEN ETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALIL MHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKS IYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDME KEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFS DDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQ PAIKKIFTDENTIFQILYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVV EAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAF EIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQW LSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGI NQAIDNINNFINGCSVSILMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLILIGSAEYE KSKVNKILKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKV EVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQ NYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFF VTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTE LSQSNIEERYKIQSYSEILKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILT RSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIILDFFNLNQEWRVYT YKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHR FYESGIVFEEYKDYFCISKWILKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

[0137] ● SEQ ID NO: 3 - BoNT/C1, número de acesso P18640, sequência de aminoácidos

[0138] MPITINNFNYSDPVDNKNILILDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSR

NSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNILSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLST DIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPET STFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILM HELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARK YFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRN KFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIILSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSN LNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLILFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTD LPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSE SEILPGENQVFYDNRTQNVDILNSYYILESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYT YFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNIS NSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIK RWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKE NIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTILFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLI NLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSL QNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNS MYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSIN FSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEIN KIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYN KEYYMVNIDILNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDI LYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTY YYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNILVPTVKQGNYASLLESTSTH WGFVPVSE

[0139] ● SEQ ID NO: 4 - BoNT/D, número de acesso P19321, sequência de aminoácidos

[0140] MTWPVKDFNYSDPVNDNDILILRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSS

DTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSILSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINILVV GSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTAS LTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMH ELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERS QLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDK FNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHILPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNK GFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYV ADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPL NLPGEEIVFYDDITKYVDILNSYYILESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPS LAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSAL RGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRW KDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIK SQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTILFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLI DSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQN KKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSS VSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSE SLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENID ENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDR YIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMII RDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFREN TMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

[0141] ● SEQ ID NO: 5 - BoNT/E1, número de acesso WP_003372387, sequência de aminoácidos

[0142] MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTP

QDFHPPTSLKNGDSSYYDPNILQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKAN PILGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNN YMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGIT TKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKV QVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKC RQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVK KIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYEN DLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFILDA QKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDF TTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPT ILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKE QMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRF LTESSISILMKLINEVKINKLREYDENVKTILLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNN SIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYK YPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTII NCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITN DRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETE IQTLYSNEPNTNILKDFWGNILLYDKEYILLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLAN RLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKIS SSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDH TNSNGCFWNFISEEHGWQEK

[0143] ● SEQ ID NO: 6 - BoNT/F1, número de acesso Q57236, sequência de aminoácidos

[0144] MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNT

IGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNILTTDAEKDRILKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEI SYAKPILGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVR KLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELI HALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNN LLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYK KLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQ NIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNE NDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDS NGTSEIEEHNVVDLNVFFILHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTI NKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFK EAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYS WIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNI NNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFILMKLINEAKVSKLREYDEGVKEILLDYISEHR SILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNK FIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWV RIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMI SISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYV GIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNILLYNKRYILLNLLRTDKSITQNS NFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVD RDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGL LGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

[0145] ● SEQ ID NO: 7 - BoNT/G, número de acesso WP_039635782, sequência de aminoácidos

[0146] MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFT

YGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTILKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRL LDMIVDAIPILGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLS DNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADP ALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPS TDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDK DKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEILPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIA SKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDL FFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNF DDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEILHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFF STNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGN ETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQK WTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNI NIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISILMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYI DTNELILLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYR GGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDN FSINFWVRTPKYNNNDIQTILQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSI FFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLIN CTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYILFNQ GMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLILGLRFIIKKASNSRNINNDNIVRE GDYIILNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQ ILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWILRRISENINKLRLGCNWQF IPVDEGWTE

[0147] ● SEQ ID NO: 8 - BoNT/DC, número de acesso BAM65681, sequência de aminoácidos

[0148] MTWPVKDFNYSDPVNDNDILILRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSS

DTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSILSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINILVV GSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTAS LTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMH ELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGSDVEIIPQIERL QLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWSSNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNID KFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSKHILPVFANILDDNIYTIINGFNLTTK GFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTRNSRDDSTCIQVKNNTLPYV ADKDSISQEIFESQIITDETNVENYSDNFSLDESILDAKVPTNPEAVDPLLPNVNMEPL NVPGEEEVFYDDITKDVDILNSYYILEAQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNIGNSA LRGNFKQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRW KDSYQWMVSNWLSRITTQFNHISYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIK SQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTILFKNMLPKVIDELNKFDLKTKTELINLI DSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTIPFNIFSYTNNSLLKDMINEYFNSINDSKILSLQN KKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAM YESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFS YDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKI PNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYDKE YYMINVNYMNRYMSKKGNGIVFNTRKNNNDFNEGYKIIIKRIIGNTNDTRVRGENVLY FNTTIDNKQYSLGMYKPSRNLGTDLVPLGALDQPMDEIRKYGSFIIQPCNTFDYYAS QLFLSSNATTNRIGILSIGSYSFKLGDDYWFNHEILIPVIKIEHYASLLESTSTHWVFVP ASE

[0149] ● SEQ ID NO: 9 - BoNT/BMY, sequência de aminoácidos MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPER 49 YTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDILNTNDKKNIFLQTMIKLFNRI 99 KSKPLGEKLLEMIINGIPILGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVE 149 RKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEY 199 VSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPI 249 VPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGI 299 VDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLY 349 KSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFN 399 ISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDV 449 DNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLIS 499 KIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQILYSQTFPLD 549 IRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVN 599 DFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGAS 649 ILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGL 699 IVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNI 749 NIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSILMKKMIPLAVEKLLDFD 799 NTLKKNLLNYIDENKLILIGSAEYEKSKVNKILKTIMPFDLSIYTNDTIL 849 IEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQF 899

KLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNE 949 YTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYI 999 NRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDID 1049 RTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEILKDFWGNPLMYNKEYY 1099 MFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRR 1149 KSNSQSINDDIVRKEDYIILDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIY 1199 DSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIV 1249 FEEYKDYFCISKWILKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE 1291

[0150] ● SEQ ID NO: 10 - BoNT/ABMY, sequência de aminoácidos MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERD49 TFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTILSTDNEKDNILKGVTKLFERIY99 STDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEEL149 NLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEES199 LEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNA249 YYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNK299 AKSIVGTTASLQYMKNVFKEKILLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIY349 TEDNFVKFFKVLNRKTILNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAA399 NFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKA449 LNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLI499 QQYILTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYT549 MFHILRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATE599 AAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYK649 DDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNAL699 SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINY749 QYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSILMNS799 MIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDI849 PFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVE899 VYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPK949 YKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVF999 FEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIA 1049

NGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEILKD 1099 FWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINY 1149 RDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIILDFFNLNQEWRVYTYKYF 1199 KKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIG 1249 LIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWILKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKD 1299 EGWTE 1304

[0151] ● SEQ ID NO: 11 - BoNT/F7, sequência de aminoácidos

[0152] MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNII

GKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNILTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEI KNGKPILGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFP VRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGL YGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYT AIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTE CDLAQKFQVKNRSNILFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRI VGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKE IDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEY TVDKLNVFFILYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAAL FISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAG ILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRI NTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKV SLAMQNIDRFLTESSISILMKLINEAKINKLSEYDKRVNQILLNYILENSSTLGTSSVQE LNNLVSNTLNNSIPFELSEY

[0153] TNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSGYGSNISINGDIYIYSTN

RNQFGIYSSRLSEVNITQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKYNNLKNLNNEYTIINCM RNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISDYINKWTFVTITNNRLG HSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKIFNMELDKTEIET LYHSEPDSTILKDFWGNILLYNKKYILLNLLKPNMSVTKNSDILNINRQRGIYSKTNIFS NARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGNSEYQLYADVSTSAVEK TIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNCTMNFKTNNGNDIGLLGFHLNNLVASSWYYK NIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE

[0154] ● SEQ ID NO: 12 - BoNT/F1 (H1241K), sequência de aminoácidos.

[0155] MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNT

IGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNILTTDAEKDRILKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEI SYAKPILGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVR KLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELI HALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNN LLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYK KLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQ NIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNE NDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDS NGTSEIEEHNVVDLNVFFILHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTI NKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFK EAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYS WIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNI NNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFILMKLINEAKVSKLREYDEGVKEILLDYISEHR SILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNK FIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWV RIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMI SISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYV GIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNILLYNKRYILLNLLRTDKSITQNS NFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVD RDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGL LGFKSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

[0156] ● SEQ ID NO: 13 - BoNT/F7-1, sequência de aminoácidos

[0157] MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNII

GKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNILTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEI KNGKPILGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFP VRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGL YGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYT AIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTE CDLAQKFQVKNRSNILFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRI VGPIPDNGLVERFVGLCKSVIPRKGTKAPPRLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSP KEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIK EYTVDKLNVFFILYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQA ALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLG AGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWL TRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELN KKVSLAMQNIDRFLTESSISILMKLINEAKINKLSEYDKRVNQILLNYILENSSTLGTSS VQELNNLVSNTLNNSIPFELSEYTNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSG YGSNISINGDIYIYSTNRNQFGIYSSRLSEVNITQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKY NNLKNLNNEYTIINCMRNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISD YINKWTFVTITNNRLGHSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGI RYFKIFNMELDKTEIETLYHSEPDSTILKDFWGNILLYNKKYILLNLLKPNMSVTKNSDI LNINRQRGIYSKTNIFSNARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGN SEYQLYADVSTSAVEKTIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNCTMNFKTNNGNDIGLL GFHLNNLVASSWYYKNIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE

[0158] ● SEQ ID NO: 14 - alça de ativação, sequência de aminoácidos

[0159] KSVIPRKGTKAPPRL

EXEMPLOS

[0160] Os seguintes Exemplos servem para ilustrar modalidades particulares da invenção e não limitam de nenhum modo o escopo da invenção definida nas reivindicações.

[0161] Exemplo 1 – Estudo de amostras de tecido de bexiga humana

[0162] Em resumo, as amostras de tecido de bexiga humana foram obtidas de pacientes que passaram pela cistectomia para câncer de bexiga sem nenhuma disfunção de bexiga conhecida de acordo com seu prontuário médico, garantindo que a coleta e uso de qualquer tecido ou outras amostras fossem realizados de acordo com todas as leis, regulamentações e códigos relevantes da prática, incluindo a obtenção de consentimento informado dos pacientes por escrito (mencionando as obrigações de privacidade de dados), assim como o histórico médico do paciente.

[0163] Depois do procedimento cirúrgico, as amostras foram imediatamente transportadas da sala de operação para as instalações do patologista onde um pedaço normal da cúpula da bexiga, isto é, sem nenhum tecido tumoral macroscópico, foi selecionado para os experimentos. Imediatamente depois da remoção, as amostras de tecido foram armazenadas a 4°C em tampão de Krebs-HEPES (com a seguinte composição em mM: NaCl 118,0; KCl 4,7; MgSO4 1,2; KH2PO4 1,2; CaCl2 2,5; NaHCO3 4,2; glicose 11,1; HEPES 20,8; pH 7,4) contendo penicilina (100 IU/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml) para conservação ideal até o uso (dentro de um máximo de 24 horas) e transportado para as instalações de pesquisa.

[0164] De modo a preparar as tiras, o urotélio foi cuidadosamente removido e oito seções de detrusor (4x2x2 mm) foram excisadas da bexiga de cada doador para cada experimento. O tecido de bexiga remanescente foi pesado, dividido em 2 criotubos e imediatamente congelado em nitrogênio líquido, depois armazenado a -80°C para análise futura.

[0165] Experimentos ex vivo foram realizados usando um arranjo colocado sob uma capela de laboratório (Captair Chem Filtair XL1346A) composta de câmaras de órgãos cheias com tampão de Krebs-HEPES mantido a 37°C e continuamente borbulhado com 95% de O2 e 5% de CO2 para manter um pH em 7,4. As tiras de bexiga foram suspensas em câmaras de órgãos de 5 ml e foram conectadas a transdutores de força para registro da tensão isométrica (Pioden controls Ltd, UK). Uma tensão inicial de 1 g foi aplicada. A seguir da amplificação, as mudanças na tensão foram digitalizadas por intermédio de um Mac Lab TM/8 usando o software Chart TM 5 (AD Instruments Ltd). Depois de lavagens extensivas, as tiras foram contraídas pela estimulação de campo elétrico (EFS) por intermédio de dois eletrodos de platina situados nas laterais das tiras e conectados a um estimulador (Bionic System Nozay, França).

[0166] A tensão foi ajustada durante um período de equilíbrio de 60 min para atingir uma tensão latente de 1g, tempo durante o qual a solução tampão foi renovada a cada 15 min.

[0167] A seguir do período de equilíbrio, as tiras do músculo liso detrusor foram preparadas adicionando-se sequencialmente ao banho de órgãos KCl (100 mM, 10 min) depois carbacol (3,10-6 M, 10 min) com etapas de lavagem entre cada adição de composto. Uma injeção de 0,5 % de gelatina foi depois realizada dentro do banho de órgãos antes da aplicação de série EFS.

[0168] As séries EFS (20 Hz, 1 ms de duração de pulso, 5 s de duração de série, 300 mA) foram continuamente realizadas pelos grupos de 3 estimulações aplicadas em intervalo de 1 min e seguidas por um período de 3 min de repouso (condições de estimulação com base em nossa experiência com tecido de bexiga humana e selecionadas para dar contrações robustas e estáveis em tiras de bexiga humana). As estimulações foram continuadas até que respostas estáveis fossem obtidas (uma resposta foi considerada estável quando a porcentagem de variação da amplitude das contrações EFS calculadas para pelo menos três grupos de contração EFS durante o período de estabilização foi ≥ 90% ou ≤ 110%).

[0169] As tiras individuais foram incubadas com veículo (Krebs com 0,5 % de gelatina), 0,1, 1, 3, 5 ou 10 nM de uma neurotoxina botulínica e as estimulações EFS foram continuadas durante 3 horas. No final do experimento, as tiras de bexiga foram contraídas pela ativação direta do receptor muscarínico pela adição de carbacol (3,10- 6 M, 10 min) ao banho de órgãos. A comparação das contrações de tira induzidas pelo carbacol antes e depois da incubação com neurotoxinas botulínicas atua como um teste de viabilidade das tiras durante o experimento.

Tabela 2 – Protocolo para estudos de amostra de tecido de bexiga humana Tira 7 Tira 8 Tira 1 Tira 2 Tira 3 Tira 4 Tira 5 Tira 6 quando quando possível possível Equilíbrio 60 min KCl (100 mM, 10 min) Lavagem Carbacol (3,10-6 M, 10 min)

Lavagem Injeção de gelatina** dentro do banho: 25 µl/5 ml EFS Repetitivo (20 Hz – 1 ms, duração da série 5 s, 300 mA, intervalo de 3 min) até que respostas estáveis sejam obtidas Incubação durante 3 horas com Veículo, BoNT (1, 3, 5, 10 nM) EFS Repetitivo (20 Hz – 1 ms, duração da série 5s, 300 mA, intervalo de 3 min) durante 3 h Carbacol (3,10-6 M, 10 min) ** Gelatina Priorex® Altamente Purificada Tipo A.

[0170] Oito neurotoxinas botulínicas não complexadas foram testadas: - nBoNT/A, uma neurotoxina botulínica tipo A natural obtida da List Biological Laboratories, Inc. (SEQ ID NO: 1); - nBoNT/B, uma neurotoxina botulínica tipo B natural obtida da List Biological Laboratories, Inc. (SEQ ID NO: 2); - rBoNT/BMY, uma neurotoxina botulínica tipo B recombinante compreendendo duas mutações no domínio HC, E1191M e S1199Y (SEQ ID NO: 9); - rBoNT/ABMY, uma neurotoxina botulínica quimérica recombinante (Domínio LHN de BoNT/A e domínio HC de BoNT/B) compreendendo duas mutações no domínio HC, E1191M e S1199Y (SEQ ID NO: 10); - nBoNT/F, uma neurotoxina botulínica natural subtipo F1 obtida da Metabiologics Inc. (SEQ ID NO: 6); - mrBoNT/F, uma neurotoxina botulínica recombinante subtipo F1 compreendendo uma mutação pontual única no domínio HCC, H1241K (SEQ ID NO: 12); - mrBoNT/F7-1, uma neurotoxina botulínica quimérica recombinante subtipo F7, na qual a alça de ativação BoNT/F7 nativa foi substituída com a alça de ativação de BoNT/F1 (SEQ ID NO: 13).

[0171] A incubação de neurotoxinas botulínicas no banho de órgãos foi realizada pela adição de 0,75 µl, 7,5 µl, 22,5 µl, 37,5 µl ou 75 µl de soluções de estoque da toxina botulínica (a 666 nM) a 5 ml de tampão de Krebs-HEPES com 0,5% de gelatina para se obter 0,1, 1, 3, 5 ou 10 nM respectivamente como concentração final no banho de órgãos.

[0172] As respostas contráteis aos agentes farmacológicos foram quantificadas em termos de tensão média desenvolvida. A tensão média desenvolvida (mg, correspondendo às médias de pontos de dados em um traçado selecionado) foi medido durante uma seção de 1 minuto antes e no final da resposta estabilizada de cada tira a seguir da adição de KCl ou carbacol.

[0173] As respostas contráteis para as contrações induzidas por EFS foram quantificadas como segue. Em resumo, 3 estimulações foram aplicadas em intervalo de 1 min seguidas por 3 min de repouso, como mostrado na Figura 1.

[0174] Cada resposta induzida por EFS foi analisada durante o período entre 2 estimulações consecutivas, isto é, 60 segundos. Esta análise foi realizada nas últimas duas respostas de cada grupo de estimulação durante 3 horas.

[0175] Para cada grupo de estimulação, os valores obtidos nas últimas duas respostas (picos 2 e 3) foram calculados em média.

[0176] Para quantificar as respostas induzidas por EFS, a amplitude da contração induzida por EFS (mg) foi calculada como a diferença entre a tensão desenvolvida antes da estimulação e a tensão desenvolvida máxima durante a resposta ao EFS, isto é, a diferença entre os pontos de dados maiores (Max) e os menores (Min) na seleção.

[0177] Estes valores de amplitude foram expressos como uma porcentagem do valor correspondendo à contração pelo EFS máxima medida durante a última série de estímulo durante o período de estabilização antes da adição de neurotoxinas botulínicas.

[0178] Os efeitos inibidores de neurotoxinas botulínicas foram avaliados determinando-se os valores do tempo de paralisia 50 (T50) (min) isto é, o tempo necessário para inibir 50% da resposta máxima. Estes valores foram computados usando o modelo de inclinação variável GraphPad Prism 6.05 (Y = Fundo + (Topo- Fundo)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope)). O mesmo também é chamado de uma curva logística de dose-resposta de quatro parâmetros.

[0179] Os resultados são apresentados na tabela 3 e na Figura 2.

Tabela 3 – Efeitos inibidores de neurotoxinas botulínicas sobre a contração de tecido de bexiga humana avaliada pelo T50 (min) de Inibição da Contração de Amplitude BoNT Concentração T50 (min) da Inibição da N (nM) Contração de Amplitude nBoNT/F 0,1 73,0 ± 10,0 4 mrBoNT/F7-1 0,1 71,4 ± 3,2 6 nBoNT/A 1 117,8 ± 6,3 6 nBoNT/B 1 108,8 ± 5,8 6 rBoNT/BMY 1 64,9 ± 1,9* 6 rBoNT/ABMY 1 85,8 ± 3,0 6 nBoNT/F 1 58,9 ± 7,1*; $ 6 mrBoNT/F 1 58,0 ± 4,0** ; $$ 5 mrBoNT/F7-1 1 48,5 ± 1,5*** ; $$$ 6 nBoNT/A 3 87,0 ± 10. 6 nBoNT/B 3 79,6 ± 5,2 6 rBoNT/BMY 3 56,2 ± 8,1* 6 rBoNT/ABMY 3 68,9 ± 5,5 6 nBoNT/A 5 93,5 ± 4,0 6 nBoNT/B 5 85,6 ± 5,9 4 rBoNT/BMY 5 55,5 ± 8,6* 6 rBoNT/ABMY 5 53,8 ± 4,8* 5 nBoNT/A 10 72,5 ± 8,7 6 nBoNT/B 10 71,3 ± 7,7 6 rBoNT/BMY 10 44,7 ± 2,9 5

BoNT Concentração T50 (min) da Inibição da N (nM) Contração de Amplitude rBoNT/ABMY 10 53,1 ± 6,6 6 nBoNT/F 10 43,1 ± 2,4 6 mrBoNT/F 10 42,5 ± 3,1 6 mrBoNT/F7-1 10 29,0 ± 2,2***; $$$ 6 Teste de Kruskal-Wallis: *, **, *** = p<0,05, p<0,01, p<0,001 versus nBoNT/A. Teste de Kruskal-Wallis: $, $$, $$$ = p<0,05, p<0,01, p<0,001 versus nBoNT/B.

[0180] nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F, mrBoNT/F e mrBoNT/F7-1 exibiram uma inibição dependente da concentração de resposta contrátil induzida por EFS em termos de amplitude. nBoNT/A e nBoNT/B induziram efeitos inibidores comparáveis sobre as contrações induzidas por EFS de tiras de bexiga humana na mesma concentração. Além disso, em todas as doses, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F, mrBoNT/F e mrBoNT/F7-1 induziram uma redução mais alta de contrações evocadas por EFS de tiras de bexiga humana comparadas com nBoNT/A e/ou nBoNT/B. Todas as BoNT/Fs testadas assim como rBoNT/BMY e rBoNT/ABMY pareceram requerer uma concentração mais baixa para alcançar a mesma redução de contrações do que nBoNT/A ou nBoNT/B. De todas as BoNTs testadas, mrBoNT/F7-1 foi a única a induzir a maior redução de contrações.

[0181] Com base nas observações acima, a potência das toxinas botulínicas testadas no tecido de bexiga humana foi quantificada de acordo com o método descrito por Weisemann et al. (Generation and Characterization of Six Recombinant Botulinum Neurotoxins as Reference Material to Serve in an International Proficiency Test, Toxins, 2015, 7(12): 5035–5054; doi:10.3390/toxins7124861), em particular plotando-se o T50 contra a concentração de proteína da toxina botulínica e as funções logarítmicas foram adaptadas produzindo excelentes valores R2, como mostrado na tabela 4 abaixo e Figura 3.

Tabela 4 – Potência normalizada das neurotoxinas botulínicas

[BoNT] Calculada Potência Potência (nM) dando Relativa relativa BoNT Yint Inclinação R2 um T50 de 70 versus versus min nBoNT/A nBoNT/B nBoNT/A 116 -43,35 0,8669 11,511 1,0 0,8 nBoNT/B 106 -37,82 0,9529 8,951 1,3 1,0 mrBoNT/B 65,23 -20,23 0,9971 0,581 19,8 15,4 mrBoNT/AB 86,37 -31,49 0,9836 3,310 3,5 2,7 nBoNT/F 59,73 -14,15 0,9993 0,188 61,2 47,6 mrBoNT/F7-1 51,33 -20,9 0,9973 0,128 90,0 70,0

[0182] Os resultados mostram que a potência de BoNT/F foi a mais alta no tecido de bexiga humana, seguida por BoNT/B, depois BoNT/A. Em particular, nBoNT/B foi cerca de 1,5 vezes mais potente do que nBoNT/A; mrBoNT/B cerca de 20 vezes mais potente do que nBoNT/A e cerca de 15 mais potente do que nBoNT/B; mrBoNT/AB cerca de 4 vezes mais potente do que nBoNT/A e cerca de 3 vezes mais potente do que nBoNT/B; nBoNT/F cerca de 60 vezes mais potente do que nBoNT/A e cerca de 50 vezes mais potente do que nBoNT/B; e mrBoNT/F7-1 cerca de 90 vezes mais potente do que nBoNT/A e cerca de 70 vezes mais potente do que nBoNT/B. Além disso, mrBoNT/F exibiu os mesmos valores T50 a 1 nM e 10 nM como nBoNT/F: pode ser razoavelmente deduzido que mrBoNT/F é tão potente quanto nBoNT/F.

[0183] Consequentemente, com base nos surpreendentes dados aqui divulgados, as neurotoxinas BoNT/B e BoNT/F, assim como as neurotoxinas clostridiais que exibem propriedades similares de ligação, captação, translocação e/ou clivagem de SNARE, tais como BoNT/D, BoNT/D-C ou BoNT/G, podem ser usadas para tratar distúrbios do sistema autonômico em seres humanos, tais como distúrbios de músculo liso em particular distúrbios urinários (NOD, OAB, etc.), em uma dose mais baixa do que ou equivalente àquela BoNT/A usada para tratar os mesmos distúrbios. Os valores de potência relativa identificados na tabela 4 pode notavelmente ser invocados para determinar a quantidade terapêutica de neurotoxina clostridial BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D-C ou BoNT/G a administrar nos ditos sujeitos, com base nas doses conhecidas que são capazes de tratar o mesmo distúrbio autonômico com BoNT/A.

[0184] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência.

Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da presente invenção estarão evidentes àqueles versados na técnica sem divergir do escopo e espírito da presente invenção.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas preferidas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas.

De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que sejam óbvias para aqueles habilitados na bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados são intencionados a estar dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Neurotoxina clostridial para o uso no tratamento de um distúrbio autonômico em um paciente humano, caracterizada pelo fato de que a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D- C ou BoNT/G e em que a dose da dita neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é mais baixa do que ou equivalente à dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

2. Uso de uma neurotoxina clostridial caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano, em que a neurotoxina clostridial compreende um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D-C ou BoNT/G e em que a dose da dita neurotoxina clostridial a ser administrada ao paciente é mais baixa do que ou equivalente à dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

3. Método para tratar um distúrbio autonômico em um paciente humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao paciente uma neurotoxina clostridial compreendendo um domínio HCC de uma BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D-C ou BoNT/G, em uma dose que é mais baixa do que ou equivalente à dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico.

4. Neurotoxina clostridial para o uso de acordo com a reivindicação 1, o uso de acordo com a reivindicação 2 ou o método de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dose da dita neurotoxina clostridial é cerca de 1,1 vez a cerca de 100 vezes mais baixa do que a dose de BoNT/A tratando o dito distúrbio autonômico, a dita dose sendo preferivelmente quantificada em nanogramas.

5. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a dose da dita neurotoxina clostridial está variando de cerca de 0,00025 ng a cerca de 3 ng.

6. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o dito distúrbio autonômico é selecionado de distúrbios de músculo liso, distúrbios hipersecretores, distúrbios respiratórios, distúrbios inflamatórios com um componente autonômico, distúrbios neuroendócrino e outros distúrbios autonômicos diretamente associados com um distúrbio neurológico central.

7. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o dito domínio HCC é um domínio HCC de BoNT/B ou um domínio HCC de BoNT/F.

8. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o dito domínio HCC de BoNT/B compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido aumentando a sua afinidade de ligação ao receptor de Syt II humano em pelo menos 50 % quando comparada com o domínio HCC de BoNT/B natural.

9. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido é selecionado do grupo consistindo de 1118M, 1183M, 1191M, 1191I, 1191Q, 1191T, 1199Y, 1199F, 1199L, 1201V, 1191C, 1191V, 1191L, 1191Y, 1199W, 1199E, 1199H, 1178Y, 1178Q, 1178A, 1178S, 1183C, 1183P e quaisquer combinações das mesmas.

10. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que a dita pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido consiste das duas mutações de aminoácido 1191M e 1199Y.

11. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o dito domínio HCC de BoNT/F compreende pelo menos uma mutação de resíduo de aminoácido aumentando a sua afinidade de ligação a um ou mais gangliosídeos quando comparado com domínio Hcc de BoNT/F natural.

12. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que os ditos gangliosídeos são selecionados de GD1a e/ou GM1a e/ou a dita mutação de resíduo de aminoácido é 1241K.

13. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a dita neurotoxina clostridial é uma neurotoxina BoNT/B.

14. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a dita neurotoxina clostridial é uma neurotoxina BoNT/F.

15. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a dita neurotoxina clostridial é uma neurotoxina quimérica.

16. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita neurotoxina quimérica compreende um domínio HC de BoNT/B e um domínio LHN de BoNT/A.

17. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita neurotoxina quimérica compreende um domínio LHN de uma primeira BoNT/subtipo F e uma alça de ativação de uma segunda BoNT/subtipo F e em que a dita segunda BoNT/subtipo F difere da dita primeira BoNT/subtipo F.

18. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o dito domínio LHN é um domínio LHN da BoNT/F7 e/ou a dita alça de ativação é uma alça de ativação da BoNT/F1.

19. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a neurotoxina clostridial compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das da SEQ ID NOs: 2 a 13 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com as mesmas, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com as mesmas.

20. Neurotoxina clostridial para o uso, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a neurotoxina clostridial compreende: a. uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma,

preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma; ou b. uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma; ou c. uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma; ou d. uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma; ou e. uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com a mesma.

Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 1 Pico 2 Pico 3 Zoom Zoom Petição 870200034968, de 16/03/2020, pág. 74/79 (figura 4) (figura 4) 1/4 FIGURA 1 Tensão desenvolvida (mg) min 11min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min janela janeladede janela de janela de janela de janela de janela de análise análise análise análise análise análise análise análise análise análise análise análise 3 min de repouso 3 min de repouso 1o estímulo 2o estímulo 3o estímulo 1o estímulo 2o estímulo 3o estímulo

EFS EFS EFS EFS EFS EFS

FIGURA 2A

FIGURA 2B

0,1

FIGURA 3