BR112013029331B1

BR112013029331B1 - Proteína agonista de eda, composição farmacêutica e seus usos

Info

Publication number: BR112013029331B1
Application number: BR112013029331-4A
Authority: BR
Inventors: Pascal Schneider; Christine Kowalczyk
Original assignee: Espoirxlhed Sàrl
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2021-11-16
Also published as: KR20140043380A; US20180169188A1; EP2697258A1; CA2835882A1; AU2012256174A2; AU2012256174A1; EP3159356B1; US9925239B2; CN105999225B; EP3159356A1; JP6190921B2; CN105999225A; EP2697258B1; EP2697258A4; JP5955382B2; US20160184393A1; BR112013029331A2; AU2012256174B2; US9175085B2; JP2016185974A

Abstract

composições e métodos para a alteração dos fenótipos xlhed. a invenção refere-se aos métodos para a administração temporal dos agonistas eda, em particular edi200, que se correlacionam com as janelas de resposta terapêutica necessárias para a formação de quaisquer estruturas dependentes de eda como os anexos ectodérmicos. o uso dos métodos descritos permite a concepção de dosagens terapêuticas e regimes de administração direcionados a fim de corrigir ou alterar os fenótipos anormais associados a distúrbios genéticos, em particular, xlhed.

Description

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado 2003.1000PCT_SEQLST.txt, criado em 10 de maio de 2012, que possui tamanho de 3.610 bytes. As informações no formato eletrônico da listagem de sequências são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório Norte-Americano No. 61/485.677, depositado em 13 de maio de 2011, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se às composições, métodos, ensaios e kits para alterar e/ou modificar o fenótipo de um indivíduo diagnosticado com ou sofrendo de XLHED.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A displasia ectodérmica hipo-hidrótica ligada ao X (XLHED) é uma doença identificada em seres humanos, cães, camundongos e gado. Um subgrupo da doença humana foi atribuído a um defeito no gene EDA (anteriormente EDI) que codifica a proteína ectodisplasina (EDA, subtipo EDA-A1), que mostrou estar envolvida na morfogênese dos folículos pilosos e germes de dente durante o desenvolvimento inicial. O fenótipo da doença compreende cabelo esparso ou ausente, falta ou má formação de dentes, glândulas écrinas hipoplásicas, infecções benignas recorrentes e aumento da suscetibilidade a bronquite e a pneumonia (Reed et al., 1970; Nordgarden et al., 2001). Há significativa morbidade e mortalidade em crianças afetadas devido à hipertermia, causada pela incapacidade de suar. Morbidades significativas incluem aumento do risco de infecções do trato respiratório, doença ocular devido a olhos secos, bem como dificuldades com mastigação, retardo no crescimento, má aparência e fala comprometida resultantes de anormalidades do dente (dentição retardada, coroas de dente cônicas (dentes em forma de pino) e oligodontia). O primeiro modelo de XLHED foi identificado em camundongos selecionados da cepa Black 6 de grande porte, que resultou no aparecimento espontâneo de uma subcepa com desenvolvimento anormal de pelos e dentes. Os animais afetados (designados como "camundongos Tabby" devido à semelhança de padronização do pelo de fêmeas heterozigotas com o do gato tabby) não tinham a funcional EDA devido a uma mutação de estrutura resultando na ausência do domínio necessário para a ligação e sinalização do receptor que é crítica para a morfogênese dos dentes, pelos e glândulas sudoríparas normal (Ferguson et al., 1997; Srivastava et al., 1997). Consequentemente, estes camundongos não têm glândulas sudoríparas e não têm pelos na cauda. Os camundongos Tabby atualmente são um modelo amplamente utilizado para XLHED.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] O ligante da família de TNF ectodisplasina A (EDA) e seu receptor EDAR são necessários para o bom desenvolvimento de apêndices da pele, como cabelo, dentes e glândulas sudoríparas écrinas. Mutações EDA de "perda da função" causam displasia ectodérmica hipo-hidrótica ligada ao X (XLHED), uma condição que pode ser melhorada em camundongos e cães pela administração adequada de EDA recombinante.

[006] De acordo com a presente invenção, métodos são fornecidos para a administração temporal dos agonistas de EDA, em particular EDI200, que se correlacionam com a janela de resposta terapêutica necessária para a formação de quaisquer estruturas dependentes de EDA como anexos ectodérmicos.

[007] Diferentes estruturas dependentes de EDA podem ser induzidas em pontos de tempo distintos e podem requerer diferentes doses ou tempos de exposição. Curiosamente, algumas estruturas podem ser induzidas até vários dias após seu tempo de desenvolvimento normal. Esta propriedade é de interesse ao considerar agonistas EDAR para fins terapêuticos.

[008] Em uma modalidade, a forma recombinante de EDA- A1 (aqui referida como EDI200, Fc:EDA1 ou Fc-EDA) consistindo do domínio extracelular da proteína fundida a uma porção de uma imunoglobulina é usada para corrigir anormalidades do fenótipo do feto de mamíferos, bem como pós-natal. EDI200 contém o domínio de ligação do receptor da forma normalmente ativa necessária para a sinalização de EDA. Como um controle, EDAR-Fc, uma proteína recombinante consistindo no domínio extracelular do receptor EDA fundido à porção Fc de uma imunoglobulina foi usada como um inibidor de EDI200 a fim de controlar a duração da atividade EDI200 in vivo.

[009] Foi presentemente demonstrado que existe um curso da expressão do receptor de EDA (EDAR) em mamíferos e que há janelas de eficácia únicas para a administração de EDI200 (Fc:EDA1) a fim de corrigir os fenótipos anormais associados com a ausência de sinalização de EDA, tais como aqueles vistos em pacientes com XLHED.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[010] A FIGURA 1 é um painel 3x3 de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby, mostrando que os pelos de proteção são retomados quando os camundongos foram tratados no útero. Quadro A: camundongos do sexo feminino Tabby deficientes de EDA grávidas nos dias E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestação de filhotes Tabby recém-nascidos em P1 (dia do nascimento), P2, P3, P4 ou P5 receberam EDI200 a 1 mg Kg iv (nas mães) ou ip (nos recém- nascidos), após 24 h mais tarde por EDAR-Fc a 30 mg Kg para bloquear o EDI200 restante. Filhotes de mães tratadas ou filhotes tratados foram analisados ao desmamar quanto à presença de pelos protetores (terminados em setas - arrowheads). Espécimes tipo selvagem não tratados e controles Tabby são mostrados para finas de comparação. O tempo de tratamento é indicado no topo das figuras. Os momentos mais relevantes de tratamento em relação à indução de pelos protetores são mostrados. Quadro B: Representação esquemática dos resultados. O período relevante para o desenvolvimento dependente de EDA de anexos derivados da pele em camundongos Tabby é dividido em períodos de 24 h (retângulos) com o tempo indicado como dias de gestação embrionária (E11.5, E12.5, etc.) e dias de vida pós-natal (P1, P2, etc., com P1 sendo o dia de nascimento). As indicações nos retângulos referem-se ao grau em que o fenótipo Tabby foi revertido (-: ausência de reversão, como Tabby. +: algum grau de reversão. ++: extensa reversão, semelhante ao tipo selvagem. Nd: não determinado. A curva acima representa a janela de oportunidade de tratamento deduzida para a formação de pelos protetores em camundongos Tabby.

[011] A FIGURA 2 é um painel 3x3 de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby, mostrando as glândulas sudoríparas foram retomadas quando os camundongos foram tratados no útero e após o parto. Quadro A: camundongos do sexo feminino Tabby deficientes de EDA grávidas nos dias E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestação de filhotes Tabby recém-nascidos em P1 (dia do nascimento), P2, P3, P4 ou P5 receberam EDI200 a 1 mg Kg iv (nas mães) ou ip (nos recém-nascidos), após 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg Kg para bloquear o EDI200 restante. Filhotes de mães tratadas ou filhotes tratados foram analisados ao desmamar quanto à presença de glândulas sudoríparas usando um teste de suor de iodo/amido. As aberturas das glândulas sudoríparas são visualizadas como pontos pretos Espécimes tipo selvagem não tratados e controles Tabby são mostrados para finas de comparação. O tempo de tratamento é indicado no topo das figuras. Os momentos mais relevantes de tratamento em relação à indução de glândulas sudoríparas são mostrados. Quadro B: Representação esquemática dos resultados. O período relevante para o desenvolvimento dependente de EDA de anexos derivados da pele em camundongos Tabby é dividido em períodos de 24 h (retângulos) com o tempo indicado como dias de gestação embrionária (E11.5, E12.5, etc.) e dias de vida pós-natal (P1, P2, etc., com P1 sendo o dia de nascimento). As indicações nos retângulos referem-se ao grau em que o fenótipo Tabby foi revertido (-: ausência de reversão, como Tabby. +: algum grau de reversão. ++: extensa reversão, semelhante ao tipo selvagem. nd: não determinado). A curva acima representa a janela de oportunidade de tratamento deduzida para a formação de glândulas sudoríparas em camundongos Tabby.

[012] A FIGURA 3 é um painel 3x3 de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby, mostrando que os pelos da cauda foram recuperados quando os camundongos foram tratados no útero e após o parto. Quadro A: camundongos do sexo feminino Tabby deficientes de EDA grávidas nos dias E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestação de filhotes Tabby recém-nascidos em P1 (dia do nascimento), P2, P3, P4 ou P5 receberam EDI200 a 1 mg Kg iv (nas mães) ou ip (nos recém-nascidos), após 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg/Kg para bloquear o EDI200 restante. Filhotes de mães tratadas ou filhotes tratados foram analisados ao desmamar quanto à presença de glândulas sudoríparas usando um teste de suor de iodo/amido. Espécimes tipo selvagem não tratados e controles Tabby são mostrados para finas de comparação. O tempo de tratamento é indicado no topo das figuras. Os tempos mais relevantes de tratamento em relação à indução de pelos da cauda são mostrados. Quadro B: Representação esquemática dos resultados. O período relevante para o desenvolvimento dependente de EDA de anexos derivados da pele em camundongos Tabby é dividido em períodos de 24 h (retângulos) com o tempo indicado como dias de gestação embrionária (E11.5, E12.5, etc.) e dias de vida pós-natal (P1, P2, etc., com P1 sendo o dia de nascimento). As indicações nos retângulos referem-se ao grau em que o fenótipo Tabby foi revertido (-: ausência de reversão, como Tabby. +: algum grau de reversão. ++: extensa reversão, semelhante ao tipo selvagem. nd: não determinado). As curvas acima representam as janelas de oportunidade de tratamento deduzidas para a formação de pelos na cauda nos lados dorsal e ventral da cauda em camundongos Tabby, conforme indicado.

[013] A FIGURA 4 é um painel de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby, mostrando que os pelos protetores podem ser induzidos com vários dias de atraso. Quadro A: Fotos do rabo de um camundongo tipo selvagem foram WT foram tiradas diariamente desde o nascimento (P1) até o desmame (P21). As faces dorsal e ventral da cauda estão nos lados esquerdo e direito, respectivamente. O pelo na face dorsal da cauda é aparente pela primeira vez em P6 (seta). Apenas os tempos mais relevantes são mostrados. Quadro B: Fotos da cauda de um camundongo Tabby deficiente de EDA tratados em P1 com EDI200 e 24h depois com um excesso de EDAR-Fc foram tiradas diariamente desde o nascimento (P1) até o desmame (P21). O pelo na face dorsal da cauda é aparente pela primeira vez em P10 (seta), ou seja, cerca de 4 dias depois que em um camundongo tipo selvagem. Apenas os tempos mais relevantes são mostrados. Quadro C: Igual ao Quadro B da Figura 3, mostrando que cerca de 4 dias separam o E16.5, que é a primeira vez na qual o pelo da cauda dorsal pode ser induzido em camundongos Tabby, e P1, que é o tempo de início de tratamento no experimento mostrado no quadro B. Isto, juntamente com os resultados mostrados nos quadros A e B, sugerem a formação de pelo da cauda dorsal em camundongos Tabby tratados em P1 com EDI200 com um atraso de cerca de 4 dias em comparação com camundongos tipo selvagem.

[014] A FIGURA 5 é um painel 3x3 de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby mostrando que os olhos são recuperados quando os camundongos foram tratados no útero e após o parto. Quadro A: camundongos do sexo feminino Tabby deficientes de EDA grávidas nos dias E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestação de filhotes Tabby recém-nascidos em P1 (dia do nascimento), P2, P3, P4 ou P5 receberam EDI200 a 1 mg Kg iv (nas mães) ou ip (nos recém-nascidos), após 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg Kg para bloquear o EDI200 restante. Em um exemplo, um camundongo do sexo feminino grávida foi administrada EDI200 a 1 mg Kg a E18.5, e os filhotes novamente receberam EDI200 a 1 mg/Kg em P2, sem qualquer EDAR-Fc. Filhotes de mães tratadas ou filhotes tratados foram analisados ao desmamar quanto à aparência do olho. Espécimes tipo selvagem não tratados e controles Tabby são mostrados para finas de comparação. O tempo de tratamento é indicado no topo das figuras. Os momentos mais relevantes de tratamento em relação à reversão do olho são mostrados. Observe que para os camundongos tratados em E18.5 e P3, apenas um de três camundongos tinham um fenótipo de olho claramente revertido. Quadro B: Representação esquemática dos resultados. O período relevante para o desenvolvimento dependente de EDA de anexos derivados da pele em camundongos Tabby é dividido em períodos de 24 h (retângulos) com o tempo indicado como dias de gestação embrionária (E11.5, E12.5, etc.) e dias de vida pós-natal (P1, P2, etc., com P1 sendo o dia de nascimento). As indicações nos retângulos referem-se ao grau em que o fenótipo Tabby foi revertido (-: ausência de reversão, como Tabby. +: algum grau de reversão. ++: extensa reversão, semelhante ao tipo selvagem. nd: não determinado).

[015] A FIGURA 6 é um painel 3x3 de fotografias tiradas de camundongos tipo selvagem e Tabby mostrando que os vários dentes são recuperados em vários tempos quando os camundongos foram tratados no útero e após o parto. Quadro A: camundongos do sexo feminino Tabby deficientes de EDA grávidas nos dias E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestação ou filhotes Tabby recém-nascidos em P1 (dia do nascimento), P2, P3, P4 ou P5 receberam EDI200 a 1 mg Kg iv (nas mães) ou ip (nos recém-nascidos), após 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg/Kg para bloquear o EDI200 restante. Em um exemplo, um camundongo Tabby do sexo feminino grávida foi tratada em E14.5 com EDI200, mas sem injeção de EDAR-Fc 24h depois (E14.5 (sem parar)). Os filhotes de mães tratadas ou os filhotes tratados foram sacrificados com cerca de um mês de idade e analisados quanto à morfologia do dentre no maxilar inferior. Espécimes tipo selvagem não tratados e controles Tabby são mostrados para finas de comparação. O tempo de tratamento é indicado no topo das figuras. Os tempos mais relevantes de tratamento em relação à indução de dentes são mostrados. Ponta de seta branca cheia: forma característica do segundo molar do tipo selvagem. Ponta de seta aberta: porção anterior do primeiro molar. Ponta de seta fina: terceiro molar. É interessante notar que, em camundongos Tabby, o terceiro molar (pequeno molar do lado esquerdo das fotos) pode estar presente ou ausente. Quadro B: Representação esquemática dos resultados. O período relevante para o desenvolvimento de anexos derivados da pele em camundongos Tabby é dividido em períodos de 24 h (retângulos) com o tempo indicado como dias de gestação embrionária (E11.5, E12.5, etc.). e dias de vida pós-natal (P1, P2, etc..., com P1 sendo o dia de nascimento). As indicações nos retângulos referem-se ao grau em que o fenótipo Tabby foi revertido (-: ausência de reversão, como Tabby. +: algum grau de reversão. ++: extensa reversão, semelhante ou maior que a do tipo selvagem. nd: não determinado). As curvas acima representam as janelas de oportunidade de tratamento deduzidas para a formação de molares no maxilar inferior de camundongos Tabby. M1, M2, M3: molares 1, 2 e 3.

[016] A FIGURA 7 é um diagrama do procedimento geral dos experimentos descritos neste documento. Quadro A. Em organismos deficientes de EDA (neste caso camundongos), EDA endógena não é feito ou é inativo, mas o receptor de EDA permanece expressado em uma forma de sinalização competente. Fornecer o EDA recombinante sob a forma de Fc- EDA é suficiente para ativar a via de sinalização EDAR e resgatar alguns ou todos do fenótipo deficiente de EDA. O tratamento é eficaz se aplicado nos momento quando o EDAR endógeno pode responder. Quadro B. A administração de EDA- Fc pode ser feita diretamente em camundongos deficientes de EDA recém-nascidos ou indiretamente em fetos pela administração da mãe grávida com Fc-EDA. A porção Fc permite a transferência transplacentária e, portanto, acesso aos fetos. A dose e o tempo de administração de Fc- EDA podem ser escolhidos. Painel C: a ação de Fc-EDA em animais deficientes de EDA tratados pode ser bloqueada após o intervalo de tempo desejado pela administração de um excesso de EDAR-Fc. EDAR-Fc também pode alcançar a circulação fetal pelo sistema de transporte transplacentário.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[017] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica a que esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento podem ser usados na prática ou teste dos métodos apresentados na invenção, materiais e métodos adequados são descritos abaixo.

Definições

[018] Para fins de conveniência, o significado de certos termos e frases utilizados no relatório descritivo, exemplos e reivindicações em anexo são fornecidos abaixo. As definições não são destinadas a ser de natureza limitante e servem para fornecer uma compreensão mais clara de certos aspectos da presente invenção.

[019] O termo "ativação", como usado neste documento, refere-se a qualquer alteração de uma via de sinalização ou resposta biológica incluindo, por exemplo, aumentos acima dos níveis basais, restabelecimento dos níveis basais de um estado inibido e estimulação da via acima dos níveis basais.

[020] O termo "janela de desenvolvimento alinhada" significa os seus períodos de tempo correlativos entre duas ou mais espécies em seus desenvolvimentos de um fenótipo. Janelas de desenvolvimento alinhadas podem refletir as janelas de tratamento onde o desenvolvimento de duas espécies está em concordância. As janelas de desenvolvimento alinhadas também podem fornecer a base na qual se definem as janelas de tratamento “principal”, “retardada” ou “expandida”. O uso do termo "alinhado" neste documento não é para implicar que os pontos de início e parada da janela correspondem de maneira exata. Uma pessoa versada na técnica percebe que o desenvolvimento entre quaisquer dois organismos (mesmo da mesma espécie) não ocorrerá exatamente da mesma maneira exatamente ao mesmo tempo. Portanto, é notado que as variações intra e interespaços ocorrem e que "alinhado" refere-se a aquelas janelas de desenvolvimento alinhadas (inclusive as ligeiras variações) aceitas por uma pessoa versada na técnica.

[021] O termo "amostra biológica - biological sample" ou "amostra biológica - biologic sample" refere-se a uma amostra Obtida de um organismo (por exemplo, um paciente humano) ou de componentes (por exemplo, células) ou de fluidos corporais (por exemplo, sangue, soro, escarro, urina, etc.) de um organismo. A amostra pode ser de qualquer tecido biológico, órgão, sistema de órgão ou fluido. A amostra pode ser uma "amostra clínica", que é uma amostra derivada de um paciente. Tais amostras incluem, mas não se limitam, a escarro, sangue, células sanguíneas (por exemplo, leucócitos), líquido amniótico, plasma, sêmen, medula óssea e tecido ou amostras de biópsia de núcleo, finas ou de agulha por punção, urina, líquido peritoneal e líquido pleural, ou células destes. Amostras biológicas também podem incluir partes de tecidos, como partes congeladas tomadas para fins histológicos. Uma amostra biológica também pode ser referida como uma "amostra do paciente".

[022] O termo “correlato” ou “correlação”, como usado neste documento, refere-se a uma relação entre duas ou mais variáveis aleatórias ou valores de dados observados. Uma correlação pode ser estatística, se, mediante análise por meios ou testes estatísticos, for verificado que a relação satisfaz o limiar de significância do teste estatístico utilizado.

[023] Uma “janela de desenvolvimento” é um período de tempo para o qual um ou mais fenótipos geralmente se desenvolvem em um organismo.

[024] O termo "embrião" significa uma descendência que não nasceu no processo de desenvolvimento.

[025] O termo "estágio embrionário" refere-se a qualquer uma das fases através da qual um embrião passa no desenvolvimento. Os estágios embrionários foram classificados por vários métodos, incluindo o sistema de estágio Carnegie e o sistema de estágio Theiler.

[026] O termo "tipo celular" refere-se a uma célula de uma determinada fonte (por exemplo, um tecido, órgão) ou uma célula em um determinado estado de diferenciação, ou uma célula associada com uma determinada patologia ou composição genética.

[027] O termo "condição" refere-se ao status de qualquer célula, órgão, sistema de órgão ou organismo. As condições podem refletir um estado de doença ou simplesmente a apresentação fisiológica ou situação de uma entidade. As condições podem ser caracterizadas como condições fenotípicas, tal como a apresentação macroscópica de uma doença, ou condições genotípicas, como o gene ou perfis de expressão de proteína subjacentes associados com a condição. As condições podem ser benignas ou malignas.

[028] O termo "detectável" refere-se a um padrão de expressão de RNA que é detectável através das técnicas padrão da reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR da transcriptase reversa - (RT)PCR, exibição diferencial e análises Northern, ou qualquer método que seja bem conhecido para as pessoas versadas na técnica. Da mesma forma, padrões de expressão de proteínas podem ser "detectados" através de técnicas padrão, como Western blots.

[029] "Mamífero", para fins de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda e animais de zoológico, esportes ou de estimação, como cães, cavalos, gatos, vacas, macacos etc. Preferencialmente, o mamífero é um ser humano.

[030] A frase "um método de tratamento" ou sua equivalente, quando aplicada, por exemplo, a XLHED, refere- se a um procedimento ou curso de ação que é projetado para reduzir, eliminar ou alterar a apresentação fenotípica e/ou efeitos colaterais associados com uma doença ou condição em um indivíduo, ou para aliviar os sintomas da dita doença ou condição. "Um método de tratamento" de uma doença ou distúrbio não significa necessariamente que a doença ou distúrbio será, de fato, completamente eliminada, ou que os sintomas da doença ou distúrbio serão, de fato, completamente aliviados. Muitas vezes, um método de tratamento de câncer será realizado mesmo com uma baixa probabilidade de sucesso, mas que, no entanto, dado o histórico médico e expectativa de sobrevivência estimada de um indivíduo é considerado um curso de ação geral benéfico.

[031] A frase “administração parenteral” e “administrado parenteralmente”, para uso na presente invenção, significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intrastemal.

[032] O termo "pré-natal" significa antes do nascimento ou durante a gravidez.

[033] O termo "pós-natal" significa após o nascimento.

[034] O termo "apresentação fenotípica" refere-se à apresentação de uma doença.

[035] O termo "prevendo" significa uma declaração ou afirmação de que um evento particular irá, ou é muito provável de ocorrer no futuro.

[036] O termo "prognosticando" significa uma declaração ou afirmação de que um evento biológico particular irá, ou é muito provável de ocorrer no futuro.

[037] O termo "progressão" ou "progressão da doença" significa o avanço ou o agravamento de ou para uma doença ou condição.

[038] O termo "indivíduo" refere-se a pacientes humanos ou outros vertebrados, em particular mamíferos, e inclui qualquer pessoa que se deseja examinar ou tratar usando os métodos de acordo com a presente invenção. No entanto, será entendido que "paciente" não implica automaticamente que os sintomas ou doenças estão presentes. Como usado aqui, o termo "paciente" de preferência refere- se a um ser humano que necessita de tratamento.

[039] O termo "tratando", como usado neste documento, a menos que seja indicado de outra forma, significa inversão, alívio, inibição do progresso ou prevenção, parcialmente ou totalmente, das manifestações fenotípicas de uma doença ou condição. O termo "tratamento", como usado neste documento, a menos que seja indicado de outra forma, refere-se ao ato de tratamento.

[040] O termo "resultado do tratamento" significa o resultado de um ou mais tratamentos. Os resultados de tratamento podem ser positivos ou negativos. A natureza do resultado do tratamento, tal como um resultado "positivo", pode ser medida objetivamente ou subjetivamente. Por exemplo, um resultado positivo pode ser refletido na caracterização subjetiva do paciente de sua condição (por exemplo, o "sentir" melhor), ou pode ser representado por uma medida objetiva do distúrbio (por exemplo, um aumento no crescimento de pelos, morfologia do dente ou capacidade de suar).

[041] O termo "janela de tratamento", como usado neste documento, refere-se ao período de tempo no qual a administração de uma composição farmacêutica irá exercer pelo menos certo resultado positivo de tratamento. As janelas de tratamento podem ser medidas em horas, dias, semanas, meses ou anos. Elas também podem ocorrer em um momento logo após a fertilização, mas antes da implantação do embrião, quando o organismo está no útero ou em qualquer momento antes do nascimento, ou depois. Para este fim, segue-se que uma janela de tratamento para um organismo da concepção ao nascimento (inclusive no útero) pode ser caracterizada em termos de tratamento da mãe. Neste caso, colocar a mãe em contato com a composição farmacêutica é análogo ao "tratamento" do embrião ou do feto, mesmo que referido como tratamento da mãe. as janelas de tratamento podem coincidir com "janelas de desenvolvimento alinhadas." As janelas de tratamento podem ser do tipo principal, atrasada ou expandida.

[042] O termo “janela de tratamento expandida” significa um período de tempo durante o qual o um tratamento pode ser administrado que é mais longo em termos de duração do que uma janela de tratamento baseada somente em uma janela de desenvolvimento alinhada. Janelas de tratamento expandidas podem começar ou terminar coincidentes com o início ou final de uma janela de desenvolvimento alinhada e se antes ou depois no tempo. Elas também podem ser mais longas do que uma janela de desenvolvimento alinhada e se estender antes ou depois em termos de tempo, desse modo, sendo inclusivas de uma ou mais janelas de desenvolvimento alinhadas. As janelas de tratamento expandidas podem ser medidas em horas, dias, semanas, meses ou anos. As janelas de tratamento expandidas podem ser de 1 a 20%, de 2 a 30%, de 5 a 50% ou mais longas do que a janela de desenvolvimento normal que constitui a janela de desenvolvimento alinhada. Elas podem ser 3x, 4x, 5x ou mais longas.

[043] O termo "janela de tratamento atrasada" significa um período de tempo durante o qual pode ser administrado tratamento que começa mais tarde no tempo depois que uma janela de tratamento baseada somente em uma janela de desenvolvimento alinhadas. As janelas de tratamento atrasadas iniciam em algum ponto de tempo após uma janela de desenvolvimento alinhada esperada e se estendem mais tarde no tempo. Elas podem se estender indefinidamente e podem abranger uma ou mais janelas de desenvolvimento alinhadas subsequentes. As janelas de tratamento atrasadas podem ser medidas em horas, dias, semanas, meses ou anos. As janelas de tratamento atrasadas podem ser de 1 a 20%, de 2 a 30%, de 5 a 50% ou mais longas do que a janela de desenvolvimento normal que constitui a janela de desenvolvimento alinhada. Elas podem ser 3x, 4x, 5x ou mais longas. Se elas forem mais longas do que uma janela de desenvolvimento alinhada, então, por definição, a janela de tratamento atrasada é uma janela de tratamento expandida que simplesmente inicia em um tempo posterior.

[044] O termo “janela de tratamento principal” significa um período de tempo durante o qual pode ser administrado tratamento que começa mais cedo no tempo do que uma janela de tratamento baseada somente em uma janela de desenvolvimento alinhadas. As janelas de tratamento principais começam antes do início de uma janela de desenvolvimento alinhada esperada. Elas também podem ser mais longas do que uma janela de desenvolvimento alinhada e se estendem em e além de uma ou mais janelas de desenvolvimento alinhadas. As janelas de tratamento principais podem ser expressas em termos de horas, dias, semanas, meses ou anos. As janelas de tratamento principais podem ser de 1 a 20%, de 2 a 30%, de 5 a 50% ou mais longas do que a janela de desenvolvimento normal que constitui a janela de desenvolvimento alinhada. Elas podem ser 3x, 4x, 5x ou mais longas. Se elas forem mais longas do que uma janela de desenvolvimento alinhada, então, por definição, a janela de tratamento principal é uma janela de tratamento expandida que simplesmente inicia em um tempo anterior.

[045] O termo "agente terapeuticamente eficaz" significa uma composição que irá provocar a resposta biológica ou médica de um tecido, órgão, sistema, organismo, animal ou ser humano que está sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

[046] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou “quantidade eficaz" significa a quantidade do composto em questão ou combinação que irá provocar a resposta biológica ou médica de um tecido, órgão, sistema, organismo, animal ou ser humano que está sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. Neste contexto, uma resposta biológica ou médica inclui os resultados do tratamento.

Alteração ou modificação de apresentação fenotípica

[047] A presente invenção fornece métodos para a correção, alteração ou mitigação de várias apresentações fenotípicas associadas com displasia ectodérmica, especificamente XLHED. As apresentações fenotípicas de displasia ectodérmica incluem, mas não se limitam, a dentes faltantes ou com formato anormal (incluindo, mas sem se limitar, a qualquer um dentre o primeiro, segundo ou terceiros molares, ou o primeiro ou segundo pré-molar, caninos ou primeiro ou segundo incisores), morfologia anormal ou falta de glândulas sudoríparas, glândulas de Meibomius, glândulas do trato respiratório superior, glândulas sebáceas, glândulas salivares e outras glândulas, morfologia ausente ou anormal de vários tipos de pelo e alopecia.

[048] A correção, alteração e/ou mitigação das apresentações fenotípicas associadas com XLHED são realizadas pela administração de uma forma recombinante do ligante ao receptor de EDA. Tais composições EDA recombinantes incluem aquelas descritas detalhadamente no Pedido de Patente Norte-Americano USSN 12/756.268, depositado em 8 de abril de 2010, que é uma continuação do pedido de patente Norte-Americano USSN 10/503.999, depositado em 25 de outubro de 2004, atualmente Patente Norte-Americana concedida 7.736.657, que é um patentes dos EUA, que é um Pedido de Entrada em Fase Nacional da Seção 371 35 U.S.C. No. PCT/EP2002/009354, depositado em 21 de agosto de 2002, que designa os Estados Unidos, e que reivindica o benefício de prioridade do Pedido Alemão No. 10205368.5, depositado em 10 de fevereiro de 2002, e o Pedido Alemão No. 10205583.1, depositado em 11 de fevereiro de 2002, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em suas totalidades.

[049] Em uma modalidade da invenção, a proteína de fusão recombinante é EDI200 (a.k.a., Fc-EDA, Fc:EDA1). EDI200 é uma proteína de fusão Fc totalmente humanizada consistindo na região Fc da IgG1 humana e o domínio de ligação do receptor (domínio do Fator de Necrose Tumoral (TNF)) de EDA-A1. A proteína biologicamente ativa é glicosilada e existe principalmente como um hexâmero, que compreende seis espécies monoméricas Fc:EDA-A1 idênticas. A sequência de aminoácidos 380 da espécie monomérica é aqui apresentada como SEQ ID No: 1.

Administração e dosagem

[050] Quando o organismo a ser tratado é um mamífero como um ser humano, a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas sem se limitar, às vias oral, intraperitoneal ou parenteral, incluindo intracraniana (por exemplo, intraventricular, difuso intraparenquinal e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, vias aéreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em determinadas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa.

[051] Em geral, uma dose adequada de EDI200 estará na faixa de 0,01 a 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor, paciente ou indivíduo por dia, geralmente na faixa de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, EDI200 pode ser administrada a 0,05 mg/Kg, 0,5 mg/Kg, 1 mg/Kg, 1,5 mg/Kg, 2 mg/Kg, 3 mg/Kg, 3,5 mg/Kg, 7 mg/Kg, 10 mg/Kg, 20 mg/Kg, 30 mg/kg, 40 mg/Kg ou 50 mg/Kg por dose única. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez ao dia, ou pode ser administrada como duas, três ou mais subdoses em intervalos adequados durante todo o dia, ou mesmo utilizando infusão contínua ou administração através de uma formulação de liberação controlada. Nesse caso, o EDI200 contido em cada subdose deve ser correspondentemente menor para atingir a dose total diária. A dosagem pode também ser de acordo com esquemas de dosagem múltipla de uma, duas, três ou mais doses. A unidade de dosagem também pode ser combinada para administração durante vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação sustentada convencional que fornece a liberação sustentada ao longo de um período de vários dias. Formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a liberação dos agentes em um determinado sítio, como poderia ser usado com os agentes da presente invenção. Nesta modalidade, a dose unitária contém um múltiplo correspondente da dose diária.

[052] O efeito de uma dose única em qualquer determinado fenótipo ou sintoma particular pode ser de longa duração, de modo que doses subsequentes sejam administradas em intervalos de no máximo 3, 4 ou 5 dias, ou em no máximo intervalos de 1, 2, 3 ou 4 semanas.

[053] O profissional versado na técnica perceberá que determinados fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, mas sem se limitar, à severidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, o estado geral de saúde e/ou a idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um tratamento único ou uma série de tratamentos. Estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para as composições farmacêuticas individuais englobadas pela invenção podem ser feitas utilizando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado.

[054] A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos EDI200 apresentados na invenção. A presente invenção também contempla o uso de combinações de compostos ou combinações de regimes de tratamento, cada um dos quais tendo como um componente a administração de componente de uma composição farmacêutica compreendendo EDI200. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias formas, dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por um emplastro transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulização; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intraarterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subcutânea, por exemplo, por meio de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparenquinal, intratecal ou intraventricular. EDI200 pode ser administrada de modo a alvejar um tecido particular.

[055] Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos, bases aquosas, em pó ou oleosas farmacêuticas convencionais espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e afins também podem ser úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas em que o EDI200 está misturado com um agente de administração tópica como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos.

[056] Em uma modalidade da invenção, o sujeito, paciente ou indivíduo recebendo tratamento com uma composição farmacêutica compreendendo EDI200 é a mãe do indivíduo expressando o fenótipo anormal. Neste exemplo, ela pode ser tratada em qualquer momento após a concepção (fecundação).

[057] Em uma modalidade, a mãe é tratada dentro de 3 dias após a fecundação. Em outra modalidade, a mãe é tratada antes da implantação do embrião. Em uma modalidade, a mãe é tratada após a implantação do embrião. A mãe pode ser tratada em qualquer momento durante a gestação do embrião, ou após o parto. Se for tratada durante a gestação, o tratamento pode ser contínuo ao longo de uma série de horas, dias ou semanas. O tratamento pode ser descontínuo ou intermitente. Se for tratada durante a gestação de seu embrião, o tratamento pode ser durante um ou mais estágios de Carnegie especificados de seu embrião, sequencialmente ou em separado no tempo. Em uma modalidade, a mãe é tratada no momento em que a sua descendência pode receber uma quantidade eficaz de EDI200 da mãe quando ela está em período de lactação. Nesta modalidade, a mãe pode ser tratada em qualquer momento antes (ou depois) o nascimento da descendência, em que EDI200 pode ser encontrado em fluidos de lactação (por exemplo, leite materno) da mãe.

[058] Em uma modalidade, a mãe entra em contato com uma composição farmacêutica compreendendo EDI200 em uma ou mais vezes dentro dos estágios de Carnegie 17 a 23. Em uma modalidade, a mãe é tratada entre o estágio de Carnegie 17 e 22. Em uma modalidade, a mãe é tratada durante um dos estágios de Carnegie 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23. Tratamento também pode abranger um ou mais estágios, na íntegra ou parcialmente.

[059] A determinação da janela de tratamento para seres humanos pode ser realizada através de dados correlativos a partir de um ou mais modelos animais onde os estágios de desenvolvimento foram alinhados. Tais alinhamentos aceitados na técnica são aqueles dos estágios de Carnegie e Thieler. Além disso e de acordo com a presente invenção, a faixa de tais janelas de tratamento alinhados pode variar. As variações podem ser baseadas em outras evidências de diferenças no processo de desenvolvimento conhecidas na técnica. Por exemplo, caso seja demonstrado que um fenótipo é resgatado fora de uma janela de desenvolvimento alinhada, a janela de tratamento pode ser ajustada para representar esses dados. Em um exemplo, sabe-se que o início dos pelos protetores em camundongos pode ainda ocorrer 4 dias após o desenvolvimento normal quando os animais foram tratados com EDI200. Nesse caso, a janela de tratamento poderia coincidir com um estágio de Carnegie ou Theiler posterior e, portanto, ser uma janela de tratamento atrasada ou ampliada. Portanto, deve ser compreendido que, de acordo com a presente invenção, as janelas de tratamento podem ser aumentadas por diferenças de desenvolvimento, de modo que o tratamento pode ser necessário antes do processo de desenvolvimento normal do fenótipo em questão, após o processo de desenvolvimento normal do fenótipo em questão ou ao longo de um cronograma de dosagem que é expandido para englobar mais de uma única janela de desenvolvimento ou janela de desenvolvimento alinhada.

[060] A determinação da janela de tratamento disponível para a mãe que irá alterar ou modificar um fenótipo anormal na prole nascida pode ser feita medindo os marcadores no sangue ou soro das gestantes que fornecem correlações com a idade do embrião. Tais medidas incluem, mas não se limitam, a gonadotrofina coriônica humana (hCG), hormônios como o estrogênio, testosterona, progesterona, outros bioindicadores da mãe ou o estado do feto, incluindo glicose, proteínas e similares. As medições físicas do embrião ou do feto também podem informar as janelas de tratamento adequadas. Estas medições têm a vantagem de não serem invasivas e ainda assim precisas. Tal método inclui medições fetais obtidas através de ultrassom.

[061] Continua a ser o caso em que caso o embrião ou o feto necessitem de tratamento com as composições da presente invenção, como EDI200, métodos estão disponíveis para entregar as composições diretamente ao embrião através de técnicas endoscópicas, cirúrgicas ou microcirúrgicas. A administração por tais métodos pode ser para uma célula, tecido, órgão ou sistema de órgão do feto ou ao líquido amniótico que envolve o feto.

[062] A presente invenção também prevê o tratamento da descendência após o nascimento. Dependendo do fenótipo a ser alterado, certas janelas de tratamento permanecem abertas após o nascimento. O tratamento da descendência pode ser a qualquer momento após o nascimento, mas de preferência ocorre no primeiro ano de vida.

[063] Em uma modalidade, onde a morfologia do dente é anormal, é possível o tratamento posterior com composições farmacêuticas compreendendo EDI200.

Estágios do embrião humano

[064] Durante os primeiros 60 dias de gestação humana, 23 estágios de “Carnegie” morfológicos distintos (assim chamados porque o trabalho foi iniciado na Instituição Carnegie) foram identificados com base nas médias de tais características como número de metâmeros e comprimento embrionário. A um embrião é atribuído um estágio de Carnegie (numerado de 1 a 23) com base em suas características externas. Os estágios são baseados no desenvolvimento morfológico externo e/ou interno do embrião vertebrado e não são diretamente dependentes da idade ou tamanho. O período embrionário humano adequado é dividido em 23 etapas de Carnegie. Estas estão resumidas na Tabela 1. Tabela 1: Estágios de Carnegie do Desenvolvimento Embrionário Humano

Estágios de embrião do camundongo

[065] Os embriões de camundongo podem ser divididos em estágios de acordo com uma variedade de critérios, o mais geral dos quais sendo aqueles descritos por Theiler em “The House Mouse: Atlas of Mouse Development” (Springer-Verlag, Nova Iorque, 1989). Os dados na Tabela 2 referem-se aos embriões de cruzamentos entre os camundongos híbridos F1 (C57BL X CBA). A tabela foi extraída do Projeto de Atlas eMouse EMAP (http://www.emouseatlas.org). A coluna "dpc" representa dias após a concepção, com a manhã após o rolhão vaginal ser encontrado sendo designada como 0,5 dpc (ou E0,5). Tabela 2: Estágios de Theiler do Desenvolvimento Embrionário do Camundongo

Comparações dos estágios de embrião

[066] Ao nascer, o camundongo contém os mesmos tipos de células diferenciados e tecidos como um ser humano, embora o filhote de camundongo seja totalmente desenvolvido e nascido em apenas 19 dias após a fertilização do óvulo, em comparação com cerca de 266 dias para o ser humano. Durante cerca de 100 horas iniciais de desenvolvimento após a fertilização, no entanto, os embriões humanos e de camundongo são virtualmente visualmente indistinguíveis entre si. Essas semelhanças foram documentadas várias vezes com correlações e comparações sendo atualizadas ao longo dos anos.

[067] Consequentemente, é bem estabelecido para uma pessoa versada que certas janelas de desenvolvimento, ou janelas de desenvolvimento alinhadas entre roedores (camundongos e ratos) e seres humanos existem, e que estas janelas fornecem uma excelente correlação do tempo de desenvolvimento em toda a espécie. Como tal, as janelas de tratamento identificadas nas espécies não humanas podem ser convertidas em uma janela de tratamento para a espécie humana. Isto não é muito diferente da dependência colocada em modelos animais na previsão da eficácia em seres humanos. A Tabela 3 fornece uma comparação entre seres humanos, camundongos e ratos, mas outras espécies foram examinadas e os estágios foram calculados. Tabela 3: Estágios de Carnegie em Várias Espécies (9 a 15)

Tabela 3b: Estágios de Carnegie em Várias Espécies (16 a 23)

[068] Outros meios para identificar janelas de tratamento para indivíduos humanos incluem o uso de marcadores diretos e/ou indiretos de desenvolvimento. Em uma modalidade da invenção, marcadores de idade gestacional podem ser usados para determinar o tempo de administração de EDI200. Por exemplo, após a implantação, as células dentro da placenta em desenvolvimento (sinciciotrofoblasto) sintetizam e secretam gonadotrofina coriônica humana (hCG) na corrente sanguínea materna. A principal função da hCG do soro é manter o corpo lúteo no ovário materno e, portanto, manter o início da gravidez. No entanto, como pode ser observado partir da Tabela 4, os níveis de hCG no soro materno fornecem uma indicação da faixa de idade gestacional do embrião ou do feto. A tabela foi adaptada do sítio do Dr. Mark Hill na Universidade de Nova Gales do Sul (UNSW). Tabela 4: Níveis de hCG no soro

[069] Com base na tabela, fica evidente que as medições de hCG podem informar um clínico quanto ao estágio de desenvolvimento do embrião e, portanto, o tempo da administração de EDI200 pode ser determinado para fornecer os resultados ideais para a alteração do fenótipo.

[070] Outras formas de determinar a janela terapêutica de administração mais apropriada incluem métodos tais como aqueles revistos e descrito por O'Rahilly (O'Rahilly R, et al, Developmental Stages in Human Embryos: Revised and New Measurements. Cells Tissues Organs 2010; 192:73-84), os conteúdos de cada um sendo incorporados neste documento] em suas totalidades. Nestes métodos, o maior comprimento ou GL (GL; definido como o comprimento de um embrião ou um feto excluindo os membros inferiores) foi medido através de ultrassom e correlacionado com os dias de gestação ou a fase de Carnegie. A tabela 5 resume os resultados de O'Rahilly. Portanto, além dos gráficos de Theiler e Carnegie, medições reais podem ser feitas através do ultrassom do embrião ou do feto e da administração de EDI200 feita em um momento no qual poderia fornecer a maior eficácia terapêutica, como ensinado pela presente invenção. Tabela 5: Uso do Maior Comprimento como Guia de Janela de Tratamento

[071] Janelas de tratamento ou desenvolvimento também podem ser definidas como "durante a gestação", em um momento relacionado com desde a maturidade até o nascimento, um tempo relacionado ao tempo de independência, um tempo de aparecimento ou término da dentição primária ou na dentição permanente. Os tempos comparativos estão listados para camundongo, cachorro e ser humano na Tabela 6. Tabela 6: Janelas de Tratamento Adicionais

[072] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1. Mapeamento da capacidade de resposta do tecido ao EDA recombinante (Fc:EDA1)

[073] O ligante da família de TNF ectodisplasina A (EDA) e seu receptor EDAR são necessários para o bom desenvolvimento de apêndices da pele, como cabelo, dentes e glândulas sudoríparas écrinas. Mutações EDA de "perda da função" causam displasia ectodérmica hipo-hidrótica ligada ao X (XLHED), uma condição que pode ser melhorada em camundongos e cães pela administração adequada de EDA recombinante ou de EDI200.

[074] Em um esforço para determinar a capacidade de resposta temporal dos tecidos ao EDI200, bem como a dose necessária e a duração da sinalização de EDI200 necessária para a formação de quaisquer estruturas dependentes de EDA, como anexos ectodérmicos, os seguintes experimentos foram realizados.

[075] Resumidamente, o método consiste na administração de um animal deficiente de EDA (por exemplo, a cepa de camundongo Tabby) com uma proteína de fusão Fc- EDA biologicamente ativa, EDI200, em uma dose escolhida (por exemplo, 1 mg/Kg) e em um ponto de tempo específico no desenvolvimento, seguido, após um certo intervalo de tempo (por exemplo, 24 h), por um excesso de um inibidor de EDA (por exemplo, a proteína de fusão EDAR-Fc a 30 mg/Kg). O método era aplicável tanto no útero quanto após o nascimento. Assim, o método prevê o controle do tempo de administração, a duração da exposição e a dose do agonista EDAR (EDI200) em camundongos deficientes de EDA. Os resultados dos estudos foram impressionantes. Determinou-se que diferentes estruturas dependentes de EDA podem ser induzidas em pontos de tempo distintos e podem requerer diferentes doses ou tempos de exposição. Curiosamente, algumas estruturas podem ser induzidas até vários dias após seu tempo de desenvolvimento normal. Esta verificação é de grande interesse ao considerar agonistas EDAR e janelas de eficácia para fins terapêuticos.

Animais de Estudo

[076] Camundongos Tabby e seus correlativos tipo selvagem foram utilizados na avaliação in vivo de EDI200. A cepa de camundongo Tabby foi a cutia-de-barriga-branca B6CBAa Aw-J/A-EdaTa/J (000314; Jackson Laboratory) criada como mutantes EdaTa/EdaTa e EdaTa/Y. A cepa de camundongo tipo selvagem estava no mesmo contexto genético criada como controles +/+ e +/Y.

[077] O fenótipo Tabby em camundongos foi o resultado da deficiência de Ectodisplasina-A1 (Srivastava et al. 1997). Esta cepa de camundongo foi o modelo animal de XLHED e foi usada para a estudos de expressão gênica e de eficácia de EDI200. Os camundongos da cepa tipo selvagem eram os animais de controle para os camundongos da cepa Tabby. Animais machos e fêmeas foram aleatoriamente distribuídos nos grupos de teste. Os camundongos foram manipulados de acordo com as diretrizes institucionais e do Serviço Veterinário Federal da Suíça, com a autorização de "office veterinaire cantonal du canton de Vaud."

Tratamento no útero

[078] Camundongos Tabby machos e fêmeas foram acasalados de um dia para o outro e, em seguida, separados. Os camundongos foram pesados diariamente para monitorar o ganho de peso. Os camundongos do sexo feminino grávidas foram injetadas por via intravenosa (i.v.) com Fc-EDA1 (EDI200; em 150 μL de PBS) a 1 mg/Kg (por exemplo, 25 mg para um camundongo do sexo feminino de 25 g). Vinte e quatro horas (24) depois, as últimas fêmeas foram injetadas i.v. com hEDAR-Fc a 25 a 30 mg/Kg (por exemplo, 750 de EDAR-Fc em 4,3 mg/mL em 200 μL para uma fêmea de 25 g).

[079] As datas de nascimento foram gravadas e posteriormente fotografias diárias foram tiradas da cauda e dos olhos. Ao desmamar (21 dias após o nascimento), fotografias foram tiradas da cauda, da ponta da cauda, dos pelos protetores, da região retroauricular e do olho. Um teste de suor, conforme descrito na publicação PCT WO 2010/113117 e seu documento de prioridade, o conteúdo de cada uma dos quais sendo incorporado neste documento por referência na sua totalidade, também foi realizado.

[080] No dia 30 após o nascimento, os animais foram sacrificados e a histologia da traqueia (coloração de Alcian blue e colorações com hematoxilina/eosina (H&E)), das pálpebras (H&E) e das patas (H&E) foi realizada. Os crânios foram coletados e preparados, e fotografias foram tiradas dos molares superiores e inferiores.

Tratamento pós-natal

[081] No nascimento, os filhotes foram marcados por punção de uma planta da pata com uma agulha calibre 30, mergulhados em nanquim. FC-EDA a 1 mg/Kg foi injetado intraperitonealmente em 15 μL de PBS no dia do nascimento (P1) ou em P2, P3, P4 ou P5. hEDAR-Fc foi administrado pela mesma via 24 horas depois. A análise dos camundongos foi realizada conforme descrito acima para tratamentos no útero.

Avaliação da correção do fenótipo

[082] Os animais foram visualmente avaliados (animais vivos ou crânios isolados ou seções de tecido) para correção do fenótipo Tabby em relação à presença de glândulas sudoríparas, glândulas traqueais, molares, glândulas de Meibomius, cauda, pelo da cauda, pelos atrás das orelhas, torcida da cauda e aparência do olho.

Teste de suor

[083] As patas traseiras foram pintadas com uma solução de iodo de 3% (p/v) em etanol. Depois de secas, as patas foram pintadas com uma suspensão de 40% (p/v) de amido em óleo mineral. Fotos foram tiradas de um a dois minutos depois. O teste com amido e iodo foi determinado como sendo positivo quando os pontos pretos estavam visíveis, o que é indicativo da presença de meio líquido e consistente com a presença de glândulas sudoríparas.

Visão geral das Conclusões

[084] A exposição de vinte e quatro (24) horas ao EDI200 nos últimos dias antes do nascimento ou nos 7 dias após o nascimento indicou que diferentes processos de desenvolvimento dependentes de EDA têm diferentes janelas de oportunidade de tratamento. Enquanto alguns processos requerem exposição curta ao EDI200 para a restauração do fenótipo tipo selvagem, outros parecem necessitar de maior tempo de exposição. Isto pode ser devido à ocorrência de processos de desenvolvimento de múltiplos estágios. Também foi determinado que um tratamento de 24h, realizado a qualquer momento durante o desenvolvimento, só pode resgatar um conjunto limitado de fenótipos dependentes de EDA, sugerindo que as múltiplas administrações também podem ser úteis e fornecem aplicação mais ampla em relação a vários fenótipos. Consequentemente, seria esperado que vários tratamentos com EDI200 distribuídos em toda a fase de desenvolvimento, quando EDA1 está ativo, alcançassem a restauração máxima do fenótipo tipo selvagem.

[085] Em relação à dosagem, em camundongos, foi determinado que EDI200 a 1 mg/Kg permanece ativo durante mais de 24 horas. Também foi verificado anteriormente que > 3,5 horas de exposição dos camundongos Tabby recém-nascidos a 2 μg de EDI200 administrada por via intravenosa é suficiente para corrigir o crescimento de pelos na cauda (Swee et al., 2009). Considerando que a meia-vida de eliminação de EDI200 (45 horas) é estimada como sendo pelo menos 10 vezes mais longa do que o período de exposição necessário para obter um efeito biológico, a meia-vida de eliminação de EDI200 não é um fator limitante em relação à atividade/eficácia terapêutica, pelo menos quando a indução do pelo da cauda é considerada.

Exemplo 2: Correção do fenótipo pré e pós-natal

[086] A fim de avaliar um amplo período de tempo quanto à capacidade de EDI200 para corrigir aspectos do fenótipo Tabby pela exposição de camundongos pré-natal à EDI200, camundongos fêmeas Tabby grávidas receberam, por via intravenosa, uma dose eficaz de EDI200 em um dia embrionário de desenvolvimento escolhido. Vinte e quatro (24) horas depois, os camundongos receberam por via intravenosa um excesso de EDAR-Fc para interromper/neutralizar o restante da EDI200 circulante.

[087] Para avaliar a capacidade de EDI200 para corrigir os aspectos do fenótipo Tabby pela exposição de camundongos neonatos à EDI200, foi administrada aos filhotes Tabby uma dose eficaz de EDI200 por via intraperitoneal em vários dias após o nascimento. Vinte e quatro (24) horas depois, os camundongos receberam um excesso de EDAR-Fc pela via intraperitoneal para interromper/neutralizar o restante da EDI200 circulante. Consulte a Figura 7 para uma abordagem geral.

[088] A concepção do estudo foi a seguinte: Camundongos fêmeas Tabby grávidas foram tratadas iv no dia embrionário indicado (E11.5, E13.5, E14.5, E16.5 ou E17.5) com EDI200 a 1 mg/Kg, seguido 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg/Kg. Alternativamente, filhotes Tabby recém-nascidos foram injetados ip com EDI200 a 1 mg/Kg (em P1, P2, P3, P4 ou P5), seguido 24 h depois por EDAR-Fc a 30 mg/Kg. Em alguns casos, EDI200 foi administrada, mas EDAR-Fc foi omitida (por exemplo, em E14.5 ou em P1). Quando indicado, a EDI200 foi administrada repetidamente em diferentes pontos de tempo (E18.5 e P3) e EDAR-Fc foi omitida. Em um grupo de controle negativo, no dia embrionário E13.5, camundongos fêmeas Tabby grávidas receberam por administração intravenosa tanto 1 mg/Kg de EDI200 quanto 30 mg/Kg de EDAR-Fc. Camundongos tipo selvagem não tratados foram incluídos como controles. O desenvolvimento do pelo da cauda foi monitorado diariamente durante três semanas e uma avaliação geral da correção do fenótipo Tabby foi realizada aproximadamente no dia P23 pós-natal para a avaliação externa do fenótipo, aproximadamente em P30 para a avaliação da morfologia do dente e análise de seções de tecido. Três filhotes por litro foram analisados para avaliar o efeito da exposição pré-natal à EDI200, e três animais de cada grupo foram analisados para avaliar os efeitos da exposição pós-natal à EDI200. Os animais foram visualmente avaliados (animais vivos, seções de tecido ou crânios isolados) para correção do fenótipo Tabby em relação à presença de glândulas sudoríparas, glândulas traqueais, molares, glândulas de Meibomius, pelo da cauda, pelos atrás das orelhas, torcida da cauda e aparência do olho.

[089] Nesta investigação em relação à exposição durante 24 horas à 1 mg/Kg de EDI200 nos primeiros 8 dias antes do nascimento ou nos 5 dias após o nascimento, verificou-se que os seguintes fenótipos dos camundongos Tabby foram corrigidos pelo tratamento com EDI200 no intervalo de tempo indicado. Fotografias representativas dos efeitos do tratamento com EDI200 em comparação com os animais controle são apresentadas nas Figuras 1-6 e mostram o seguinte: a. Nenhum fenótipos Tabby foi corrigidos na descendência de camundongos fêmeas Tabby grávidas administrados com EDI200 e EDAR no dia E13.5 (dados não mostrados). b. Exposição à EDI200 dos embriões em E14.5 sem posterior exposição à EDAR-Fc restaurou as características tipo selvagem adicionais (algumas glândulas sudoríparas, certa quantidade de pelo da cauda, pelos atrás das orelhas, morfologia dos molares) em comparação com o mesmo tratamento, onde EDAR-Fc foi subsequentemente administrado em E15.5 (Figura 6 e dados não mostrados). c. Desenvolvimento de pelos de proteção (E13.5 a E15.5). Os pelos protetores foram restabelecidos por tratamento com EDI200 em E14.5, não interrompido, e pela exposição durante 24 h e E14.5 (3/3 camundongos). 24 h de exposição em E13.5 resgatou apenas alguns pelos de proteção (em 2/3 camundongos). Nenhum efeito foi observado nos pontos de tempo iniciais ou finais examinados. Consulte a Figura 1. D. Desenvolvimento das glândulas sudoríparas (E17.5 a P5). Algumas glândulas sudoríparas foram resgatadas pelo tratamento com EDI200 em E14.5, não interrompido, e várias glândulas sudoríparas foram resgatadas por tratamento com ED 1200 em P1, não interrompido. Nenhuma glândula sudorípara foi resgatada por exposição de 24 h em E16.5 ou antes. As glândulas sudoríparas foram resgatadas pela exposição durante 24 h à EDI200 em E17.5 (algumas glândulas sudoríparas) ou em P1 a P5 (várias glândulas sudoríparas). Consulte a Figura 2. e. Desenvolvimento dos dentes (E13.5 a E16.5). O primeiro molar foi resgatado pelo tratamento com EDI200 a E14.5, não interrompido. Para os grupos de tratamento de estímulo durante 24 h, um efeito foi observado em E14, com o molar parcialmente alargado (2/3 camundongos). O 2° molar (inferior) foi recuperado por tratamento em E14.5 ou E16.5 (3/3 camundongos em cada ponto de tempo). Consulte a Figura 6. f. Desenvolvimento do pelo da cauda (E16.5 a P4). Os pelos da cauda foram resgatados na face dorsal de um tratamento com EDI200 em E14.5, não interrompido e por tratamento com EDI200 em P1, não interrompido. O pelo da cauda dorsal também foi recuperado pela exposição de 24 h em E16.5, E17.5, P1 ou P2. Os pelos da cauda foram recuperados na face dorsal por um tratamento com EDI200 em E14.5, não interrompido, e por tratamento em P1, não interrompido. O pelo da cauda ventral também foi recuperado pela exposição durante 24 h em P1, P2 ou P3. Nenhum efeito foi observado nos pontos de tempo iniciais ou finais. Consulte a Figura 4. g. A reversão do olho nos camundongos Tabby parece não ser recuperada em qualquer período de 24 h com a dose utilizada neste experimento, nem pelo tratamento em E14.5 ou P1, não interrompido. No entanto, a reversão de olho poderia ser alcançada por um tratamento com EDI200 mais longo (E18.5 e P3, sem interrupção com EDAR-Fc. Mas neste caso, apenas 1/3 dos filhotes tinham revertido a aparência do olho). Consulte a Figura 5. h. Desenvolvimento de pelos atrás da orelha (E14.5 a E16.5). Os pelos atrás das orelhas foram recuperados pelo tratamento com EDI200 a E14.5 e não interrompido. Houve certo grau de recuperação por exposição durante 24 h a E14.5 e uma pequena recuperação em E16.5 (dados não mostrados). i. Nenhum impacto evidente do tratamento com EDI200 na dobradura da cauda foi estabelecido.

Exemplo 3: Determinação da dosagem

[090] A fim de determinar o tempo de exposição mínimo necessário para obter a atividade terapêutica completa de EDI200 para alterar ou corrigir o fenótipo, os métodos de Swee et al. foram realizados (Swee LK, Ingold-Salamin K, Tardivel A, Willen L, Gaide O, Favre M, Demotz S, Mikkola M, Schneider P. (2009) J. Biol. Chem. 284: 27567-27576).

[091] Como em estudos anteriores, verificou-se que a injeção de EDAR-Fc antes de 3,5 horas após a administração de 2 μg de EDI200 evitou o crescimento de pelos na cauda, enquanto que EDAR-Fc não era mais eficaz quando injetado > 3,5 horas após o tratamento com EDI200.

[092] Considerando que a meia-vida de eliminação de EDI200 (45 horas) é estimada como sendo pelo menos 10 vezes mais longa do que o período de exposição necessário para obter um efeito biológico, a meia-vida de eliminação de EDI200 não é um fator limitante em relação à atividade terapêutica, pelo menos quando a indução do pelo da cauda é considerada.

Claims

1. Proteína, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 1.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é um hexâmero de seis espécies idênticas das quais a sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID No: 1.

3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a proteína é glicosilada.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender ainda um tensoativo.

6. Uso de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 4 ou 5 para tratar displasia ectodérmica, em que o tratamento consiste na administração de 0,01 a 200,0 mg da referida proteína por Kg de peso corporal do receptor por dia, em que opcionalmente a dita administração é realizada uma vez por dia e/ou em 0,05 mg/Kg, 0,5 mg/Kg, 1 mg/Kg, 1,5 mg/Kg, 2 mg/Kg, 3 mg/Kg, 3,5 mg/Kg, 7 mg/Kg, 10 mg/Kg, 20 mg/Kg, 30 mg/kg, 40 mg/Kg e 50 mg/Kg por dose única.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser adaptado para administração por infusão intravenosa e/ou por infusão contínua.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento de displasia ectodérmica é para alterar uma ou mais apresentações fenotípicas de displasia ectodérmica em um organismo mamífero diagnosticado ou com suspeita de ter displasia ectodérmica, em que a apresentação fenotípica da displasia ectodérmica é selecionada do grupo consistindo em: dentes faltantes, dentes com formato anormal, morfologia anormal ou ausência de glândulas sudoríparas, ausência de glândulas de Meibomius, ausência de glândulas do trato respiratório superior, ausência de glândulas sebáceas, ausência de glândulas salivares, ausência ou morfologia anormal de vários tipos de pelo e alopecia, e em que o dito método compreende administrar a dita composição ao dito organismo mamífero durante a gestação do dito organismo mamífero, em que opcionalmente, a displasia ectodérmica é displasia ectodérmica hipo-hidrótica.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou proteína é administrada ao organismo pelo tratamento da mãe.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento da mãe é por via parenteral através de um método selecionado a partir do grupo escolhido dentre uma injeção no útero, injeção intravenosa ou injeção intra-arterial.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a displasia ectodérmica é displasia ectodérmica hipo-hidrótica e a composição farmacêutica é administrada em um período de tempo durante a gestação selecionado do grupo consistindo em: após a fertilização e antes da implantação, após a implantação, entre as semanas 5 e 9 de gestação; entre as semanas 6 e 8 de gestação, durante a semana 6 de gestação, durante a semana 7 de gestação, durante a semana 8 de gestação e depois da semana 8 de gestação.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a displasia ectodérmica é displasia ectodérmica hipo-hidrótica e em que a apresentação fenotípica é ausência ou morfologia anormal de vários tipos de pelo ou alopecia e a administração ocorre entre as semanas 6 e 8 de gestação ou durante uma janela de tratamento iniciando em um momento posterior de gestação, em que, opcionalmente, a dita janela de tratamento compreende de 4 a 10 dias.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a displasia ectodérmica é displasia ectodérmica hipo-hidrótica e a apresentação fenotípica é (i) morfologia anormal ou ausência de glândulas sudoríparas e a administração ocorre após a semana 8 de gestação; ou (ii) dentes faltantes ou com formato anormal e a administração ocorre entre as semanas 5 e 9 de gestação, em que opcionalmente os ditos dentes faltantes ou com formato anormal incluem um ou mais dentre o primeiro, segundo ou terceiro molares, ou o primeiro ou segundo pré-molar, caninos ou o primeiro ou segundo incisivos.