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BR112013012223A2 - 1h-pirazole-5-olato de sódio substituído - Google Patents

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BR112013012223A2
BR112013012223A2 BR112013012223-4A BR112013012223A BR112013012223A2 BR 112013012223 A2 BR112013012223 A2 BR 112013012223A2 BR 112013012223 A BR112013012223 A BR 112013012223A BR 112013012223 A2 BR112013012223 A2 BR 112013012223A2
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- Christian Militzer Hans
Gries Jörg
Koep Stefan
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Bayer Intellectual Property Gmbh
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Abstract

1h-pirazole-5-olato de sódio substituído ó presente pedido de ·patente · de invenção diz -respeito a 1-[6-(morfolina,.4-il)- pirimidina-4-il]-4-(1 h-1,2,3-triazol-1-il)-1 h-pirazol-5-olato de sódio, a processos para a sua preparação, ·à sua utilização para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças e à sua utilização para a preparação de medicamentos para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças, em particular de doenças cardiovasculares e hematológicas e doenças renais e para a promover a cura de feridas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:1H-PIRAZOLE-5-OLATO DE SÓDIO SUBSTITUÍDO.
o presente pedido de patente de invenção diz respeito a 1-[6-(morfolina-4-il)pirimidina-4-il]-4-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirazol-5-olato de sódio, a processos para a sua preparação, à sua utilização para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças e à sua utilização para a preparação de medicamentos para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças, em particular de doenças cardiovasculares e hematológicas e doenças renais, e para a promoção da cura de feridas.
O composto de fórmula estrutural (I), 1-[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1H-1,2,3triazol-1 -il)-1 H-pirazol-5-ol (forma enólica; fórmula estrutural (Ia)) ou 2-[6-(morfolina-4-il)pirimidina-4-il]-4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona (forma cetona; fórmula estrutural (Ib)), é conhecido a partir do documento WO 2008/067871.
Figure BR112013012223A2_D0001
Figure BR112013012223A2_D0002
O composto de fórmula estrutural (I) atua como um inibidor de HIF-prolil-4hidroxilases e, como resultado do seu mecanismos específico de ação, induz, após administração por via parentérica ou oral, a indução in vivo de genes alvo HIF, tais como, por exemplo, eritropoietina e de processos biológicos por tal desencadeados, tais como, por exemplo, eritropoiese.
O composto de fórmula estrutural (I) é higroscópico e, sob condições ambientais convencionais (20°C-35°C, pressão atmosférica), absorve até cerca de 6% em peso de água, mesmo a uma umidade atmosférica relativa superior a 20% hr. A uma umidade atmosférica de 30% hr, a absorção de 6% em peso de água é praticamente completa. Caso da umidade atmosférica diminua para um valor inferior a 30% hr, então o composto de fórmula estrutural (I) liberta parte da água que compreende. Esta absorção de água ou libertação de água, faz com que seja difícil o manuseamento do composto de fórmula estrutural (I), por exemplo, operações de pesagem, e a produção do composto de fórmula estrutural (I) numa forma uniforme, estável e definida para utilização em medicamentos ou para a produção de medicamentos que compreendam o composto de fórmula estrutural (I). Em particular, aumenta os custos técnicos durante a produção de formas de administração que compreendem o composto de fórmula estrutural (I), tais como, por exemplo, comprimidos, grânulos ou soluções para beber, visto que são necessárias medidas para o controle e regulação da umidade atmosférica para manter uma concentração uniforme do composto de fórmula estrutural (I).
2/27
Concluiu-se agora que é possível preparar, a partir do composto de fórmula estrutural (I), um sal de sódio que, em comparação com o composto de fórmula estrutural (I), apresenta vantagens decisivas.
A presente invenção proporciona o composto 1-[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirazol 5-olato de sódio, o qual corresponde ao composto de fórmula estrutural (II)
Figure BR112013012223A2_D0003
(H)
No contexto da presente invenção, 1-[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1H-1,2,3triazol-1-il)-1H-pirazol-5-olato de sódio (composto de fórmula estrutural (II)) está preferencialmente presente numa forma cristalina.
A utilização de acordo com a invenção do composto de fórmula estrutural (II) garante que, em comparação com o conhecido composto de fórmula estrutural (I), é obtido uma estabilidade significativamente superior no que diz respeito à absorção ou libertação de água em casos de umidade atmosférica variável. O 1-[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4(1H-1,2,3-triazol-1-11)-1 H-pirazol-5-olato de sódio (composto de fórmula estrutural (II)) compreende menos de 0,5% em peso de água e não é higroscópico, e, sob condições ambientais convencionais (20°C-35°C, pressão atmosférica), mesmo para uma umidade atmosférica elevada de até 90% hr, o seu teor em água apenas varia num grau mínimo, isto é, inferior a 0,5% em peso. Sob o ponto de vista técnico, isto é, durante operações de pesagem e, em particular, caso seja necessário garantir uma concentração uniforme do composto de fórmula estrutural (II) numa forma de administração, tal como, por exemplo, grânulos, uma solução para beber ou comprimidos, o composto de fórmula estrutural (II) é consideravelmente mais fácil de manusear. Além disso, em comparação com o composto de fórmula estrutural (I), o composto de fórmula estrutural (II) possui uma maior solubilidade em água.
A invenção proporciona ainda um processo para a preparação do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de se fazer reagir o composto de fórmula estrutural (I)
3/27
Figure BR112013012223A2_D0004
Figure BR112013012223A2_D0005
num solvente, com hidróxido de sódio ou uma solução aquosa de hidróxido de sódio ou um sal de sódio, se adequado com adição de uma base.
É preferível um processo para a preparação do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção que é caracterizado pelo fato de se fazer reagir o composto de fórmula estrutural (I) num solvente com uma solução aquosa de hidróxido de sodio, se adequado com a adição de uma base.
É mais preferível um processo para a preparação do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção que é caracterizado pelo fato de se fazer reagir o composto de fórmula estrutural (II) num solvente com uma solução aquosa de hidróxido de sódio, com adição de trietilamina.
De um modo geral, a reação com hidróxido de sódio ou com uma solução aquosa de hidróxido de sódio ou com um sal de sódio é efetuada num solvente, de preferência a uma temperatura compreendida entre 20°C e 120°C e mais preferencialmente a uma temperatura compreendida entre 40°C e 70°C, à pressão atmosférica. A partir da suspensão obtida, isola-se por filtração o composto de fórmula estrutural (II) a uma temperatura compreendida entre 0°C e 20°C, à pressão atmosférica, e depois seca-se.
No caso de a reação ser efetuada com adição de uma base, então dissolve-se, normalmente em primeiro lugar, o composto de fórmula estrutural (I) por dição de uma base orgânica num solvente a uma temperatura compreendida entre 20°C e 120°C e de preferência a uma temperatura compreendida entre 40°C e 70°C, à pressão atmosférica, e depois faz-se precipitar o composto de fórmula estrutural (II) por meio da adição de hidróxido de sódio ou de uma solução aquosa de hidróxido de sódio ou de um sal de sódio, a uma temperatura compreendida entre 20°C e 120°C e de preferência a uma temperatura compreendida entre 40°C e 70°C, à pressão atmosférica. A partir da suspensão obtida, isola-se por filtração o composto de fórmula estrutural (II) a uma temperatura compreendida entre -20°C e 80°C e de preferência a uma temperatura compreendida entre 0°C e 20°C, à pressão atmosférica, e depois seca-se.
O hidróxido de sódio, a solução aquosa de hidróxido de sódio e o sal de sódio são utilizados numa proporção molar compreendida entre 0,8 e 2 equivalentes molares em relação ao composto de fórmula estrutural (I). De preferência, o hidróxido de sódio, a solução aquosa de hidróxido de sódio e o sal de sódio são utilizados numa proporção molar
4/27 compreendida entre 1,0 e 1,4 equivalentes molares em relação ao composto de fórmula estrutural (I).
Como sais de sódio adequados refere-se, por exemplo, sais de ácidos orgânicos, tais como carboxilatos de sódio, tais como, por exemplo, acetato de sódio ou citrato de sódio, ou sais de ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, carbonato de sódio, bicarbonate de sódio, fosfato de sódio, hidrogeno-fosfato de sódio ou cloreto de sódio.
Como solventes adequados refere-se álcoois inferiores, tais como, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol, 1-pentanol ou tetra-hidrofurano ou acetonitrila ou tolueno ou 1,4-dioxano ou mistura dos solventes referidos ou misturas dos solventes referidos com água. É preferível a utilização de metanol, etanol, 2-propanol, tetra-hidrofurano ou misturas dos solventes referidos com água. É mais preferível a utilização de misturas de metanol com água ou de etanol com água numa proporção compreendida entre 1:1 e 50:1 (v/v) e ainda mais preferível de misturas de metanol com água numa proporção compreendida entre 7:3 e 30:1 (v/v).
Como bases orgânicas adequadas refere-se aminas terciários, tais como, por exemplo, trietilamina ou diisopropiletilamina. É preferível a utilização de trietilamina. A base orgânica é utilizada numa proporção compreendida entre 0 e 4 equivalentes molares em relação ao composto de fórmula estrutural (I). De preferência, a base orgânica é utilizada numa proporção compreendida entre 0,7 e 1,5 equivalentes molares em relação ao composto de fórmula estrutural (I).
A preparação do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser ilustrada pelo esquema de reação seguinte:
Esquema
Figure BR112013012223A2_D0006
Na
Figure BR112013012223A2_D0007
(Ib)
Explicação das figuras:
Figura 1: espectro de IV do composto de fórmula estrutural (II) e do composto de fórmula estrutural (I)
Figura 2: espectro de Raman do composto de fórmula estrutural (II) e do composto de fórmula estrutural (I)
Figura 3: espectro de UV/VIS do composto de fórmula estrutural (II) e do composto
5/27 de fórmula estrutural (I)
Figura 4:espectro de 1H NMR do composto de fórmula estrutural (II) -----Figura 5: espectro de1H NMR do composto de fórmula estrutural (I)
Figura 6: espectro de 13C NMR do composto de fórmula estrutural (II) Figura 7: espectro de 13C NMR do composto de fórmula estrutural (I) Figura 8: espectro de massa do composto de fórmula estrutural (II) Figura 9: espectro de massa do composto de fórmula estrutural (I) Figura 10: difratograma de raio-X do composto de fórmula estrutural (II) Figura 11: difratograma de raio-X do composto de fórmula estrutural (I) O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção apresenta um espectro ação farmacológica, útil e imprevisto. Assim sendo, é adequado para utilização enquanto medicamento para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças em seres humanos e em animais.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é reconhecido como um inibidor específico de HIF prolil-4-hidroxilases.
Com base nas suas propriedades farmacológicas, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser utilizado para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças cardiovasculares, em particular insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, angina peitoral, enfarte do miocárdio, apoplexia, arteriosclerose, hipertensão essencial, pulmonar e maligna e doença oclusiva arterial periférica.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é ainda adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de distúrbios da formação de sangue, tais como, por exemplo, anemias idiopáticas, anemia renal e anemias associadas a doença tumoral (em particular, anemia induzida por quimioterapia), a infecção (em particular, infecção com VIH) ou outra doença inflamatória, tal como, por exemplo, artrite reumatóide. Além do mais, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é adequado para o suporte ao tratamento de anemias provocadas por perda de sangue, anemia por deficiência em ferro, anemia por deficiência em vitamina {v.g., como resultado de deficiência em vitamina B12 ou como resultado de deficiência em ácido fólico), anemia hipoplásica ou aplásica ou anemia hemolítica, ou para o suporte ao tratamento de anemias como resultado de distúrbios de utilização de ferro (anemia sideroacréstica) ou anemias provocadas por outros distúrbios endócrinos (v.g., hipotireoidismo).
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é ainda adequado para o aumento de hematócritos com o objetivo de obter sangue para auto-doação de sangue antes de cirurgias.
Além disso, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser utilizado para o tratamento e/ou para a profilaxia de estados de isquemia associados a
6/27 cirurgias e seus sintomas consecutivos após intervenções cirúrgicas, em particular intervenções cardíacas utilizando uma máquina coração-pulmão (v.g., operaçoes-de derivação (bypass), implantes de válvulas cardíacas), intervenções nas artérias carótidas, intervenção na aorta e intervenções com abertura por instrumentos ou penetração da calota craniana. O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é ainda adequado para o tratamento e/ou profilaxia gerais no caso de intervenções cirúrgicas com o objetivo de auxiliara a cura de feridas e reduzir o tempo de convalescença.
Além do mais, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é adequado para o tratamento e para a profilaxia de sintomas consecutivos de estados de isquemia aguda e crônica do cérebro (v.g., apoplexia, asfixia durante o nascimento).
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ainda ser utilizado para o tratamento e/ou para a profilaxia de cancro e para o tratamento e/ou para a profilaxia de uma deterioração no estado de saúde que ocorre durante o tratamento de cancro, em particular, após terapia com citostáticos, antibióticos e irradiação.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é ainda adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças do tipo reumático e outras formas de doenças referidas como doenças autoimunes e, em particular, para o tratamento e/ou para a profilaxia de uma deterioração do estado de saúde que ocorre durante o tratamento com medicamentos de tais doenças.
Além disso, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser utilizado para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças do olho (v.g., glaucoma), do cérebro (v.g., doença de Parkinson, doença de Alzheimer, demência, sensação crônica de dor), de doenças renais crônicas, de insuficiência renal e de paragem renal aguda e para promover a cura de feridas.
Além do mais, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de fraqueza física geral, até caquexia, em particular, que ocorre, num grau mais elevado, numa idade mais tardia.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é ainda adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de disfunção sexual.
Além disso, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de diabetes mellitus e dos seus sintomas associados, tais como, por exemplo, macro- e micro-angiopatia diabética, nefropatia diabética e neuropatia.
Além do mais, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é adequado para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças fibróticas, por exemplo, do coração, dos pulmões e do fígado.
Em particular, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção
7/27 também é adequado para a profilaxia e para o tratamento de retinopatia em bebês prematuros (retinopatià prémátürã).
Além disso, a presente invenção proporciona a utilização do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças, em particular das doenças supramencionadas.
Além do mais, a presente invenção proporciona a utilização do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças, em particular das doenças supramencionadas.
Além disso, a presente invenção proporciona um método para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças, em particular das doenças supramencionadas, utilizando uma quantidade ativa do composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser utilizado por si só ou, se necessário, em combinação com outros ingredientes ativos. Além do mais, a presente invenção proporciona medicamentos que compreendem o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção e um ou mais compostos ativos diferentes, em particular para o tratamento e/ou para a prevenção das doenças supramencionadas. Como compostos ativos adequados na combinação é possível referir, a título exemplificative e preferencial: inibidores de ACE, antagonistas do receptor de angiotensina II, bloqueadores do receptor beta, antagonistas de cálcio, inibidores de PDE, antagonistas do receptor mineral-corticóide, diuréticos, aspirina, suplementos de ferro, vitamina B12 e suplementos de ácido fólico, estatinas, derivados de digitalis (digoxina), quimioterapêuticos tumorais e antibióticos.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um inibidor de ACE, tal como, a título exemplificative e preferencial, enalaprilo, captoprilo, lisinoprilo, ramiprilo, delaprilo, fosinoprilo, quinoprilo, perindoprilo ou trandoprilo.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um antagonista de angiotensina All, tal como, a título exemplificative e preferencial, losartano, candesartano, valsartano, telmisartano ou embusartano.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um bloqueador do receptor beta, tal como, a título exemplificativo e preferencial, propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, oxprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, carazalol, sotalol, metoprolol, betaxolol, celiprolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, labetalol, carvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol ou bucindolol.
8/27
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um antagonista de cálcio, tal como, a título exemplificative e preferencial, nifedipina, amlopidina, verapamilo ou diltiazem.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um inibidor de fosfodiesterase (PDE), tal como, a título exemplificative e preferencial, milrinona, amrinona, pimobendano, cilostazol, sildenafilo, vardenafilo ou tadalafilo.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural 10 (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um antagonista do receptor mineral-corticóide, tal como, a título exemplificative e preferencial, espironolactona, eplerenona, canrenona ou canrenoato de potássio.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um diurético, tal como, a 15 título exemplificative e preferencial, furosemida, bumetanida, torsemida, bendroflumetiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, politiazida, triclorometiazida, clorotalidona, indapamida, metolazona, quinetazona, acetazolamida, diclorofenamida, metazolamida, glicerina, isosorbida, manitol, amilorida ou triamtereno.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural 20 (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um inibidor de HMG-CoA reductase da classe das estatinas, tal como, a título exemplificativo e preferencial, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina, cerivastatina ou pitavastatina.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural 25 (II) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um quimioterapêutico tumoral, tal como, a título exemplificativo e preferencial, do conjunto constituído por complexos de platina, tais como, por exemplo, cisplatina e carboplatina, os agentes de alquilação, tais como, por exemplo, ciclofosfamida e clorambucilo, os antimetabolitos, tais como, por exemplo, 5-fluorouracilo e metotrexato, os inibidores de topoisomerase, tais 30 como, por exemplo, etopósido e camptotecina, os antibióticos, tais como, por exemplo, doxorrubicina e daunorrubicina, ou os inibidores de cinase, tais como, por exemplo, sorafenib e sunitinib.
De acordo com uma variante preferida da invenção, o composto de fórmula estrutural (li) de acordo com a invenção é administrado em combinação com um antibiótico, a título 35 exemplificativo e preferencial, selecionado entre o conjunto constituído por penicilinas, cefalosporinas ou quinolonas, tais como, por exemplo, ciprofloxacina e moxifloxacina.
Além do mais, a presente invenção proporciona medicamentos que compreendem o
9/27 composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção, em conjunto, convencionalmente, com uma ou mais substâncias auxiliares inertes, não tóxicas e farmaceuticamente adequadas e a sua utilização para os propósitos supramencionados.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode atuar sistemicamente e/ou localmente. Pode ser administrado de um modo adequada para este propósito, tal como, por exemplo, por via oral, parentérica, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, retal, dérmica, transdérmica, conjuntival, óptica ou sob a forma de um implante ou endoprótese.
Para estas vias de administração, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser administrado em formas de administração adequadas.
As formas de administração que atuam de acordo com a técnica anterior, libertam o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção rapidamente e/ou de um modo modificado e compreendem os compostos de acordo com a invenção numa forma cristalina e/ou amorfa e/ou dissolvida são adequadas para administração por via oral, tais como, por exemplo, comprimidos (comprimidos revestidos e não revestidos, por exemplo, revestimentos resistentes ao suco gástrico ou que se dissolvem de um modo retardado ou que são insolúveis e controlam a libertação do composto de acordo com a invenção), comprimidos ou películas/oblatos, películas/liofilizados ou cápsulas que se desintegrem rapidamente na cavidade oral (por exemplo, cápsulas de gelatina dura ou mole), drageias, grânulos, pós, emulsões, suspensões, aerossóis ou soluções.
A administração por via parentérica pode ser efetuada na ausência de um passo de absorção (v.g., por via intravenosa, intra-arterial, intracardíaca, intra-espinal ou intralombar) ou com a inclusão de um passo de absorção (v.g., intramuscular, subcutânea, intracutânea, percutânea ou intraperitoneal). Como formas de administração adequadas para administração por via parentérica refere-se, inter alia, formulações para injeção e infusão sob a forma de soluções, suspensões, emulsões, liofilizados ou pós estéreis.
Para as outras vias de administração são adequadas, v.g., formas de medicamentos para inalação (inter alia, inaladores de pó, nebulizadores), gotas nasais, soluções ou pulverizações, comprimidos, películas/oblatos ou cápsulas para administração por via lingual, sublingual ou bucal, supositórios, preparações para os ouvidos ou olhos, cápsulas vaginais, suspensões aquosas (loções, mistura agitadas), suspensões lipofilicas, unguentos, cremes, sistemas terapêuticos transdérmicos (v.g., adesivos), leites, pastas, espumas, pós dispersáveis, implantes ou endopróteses.
É preferível a administração por via oral e parentérica, em particular a administração por via oral e intravenosa.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção pode ser convertido nas formas de administração referidas. Tal pode ser efetuado de um modo conhecido per se
10/27 por mistura com substâncias inertes, não tóxicas e farmaceuticamente adequadas. Tais substâncias auxiliares compreendem, inter alia, veículos (por exemplo, celulose microcristalina, lactose, manitol), solventes (v.g., glicóis de polietileno líquidos), emulsionantes e agentes dispersantes e umectantes (por exemplo, dodecil-sulfato de sodio, oleato de polioxisorbitano), aglutinantes (por exemplo, polivinilpirrolidona), polímeros naturais e sintéticos (por exemplo, albumina), estabilizadores (v.g., antioxidantes, tais como, por exemplo, ácido ascórbico), corantes (v.g., pigmentos inorgânicos, tais como óxidos de ferro) e corretores de paladar e/ou de odor.
De um modo geral, concluiu-se ser vantajoso, no caso da administração por via parentérica, administrar quantidades compreendidas entre cerca de 0,001 e 1 mg/kg e de preferência entre cerca de 0,01 e 0,5 mg/kg de peso corporal, para se alcançar resultados eficazes. No caso da administração por via oral, a dosagem está compreendida entre cerca de 0,01 e 100 mg/kg, de preferência entre cerca de 0,01 e 20 mg/kg e mais preferencialmente entre 0,1 e 10 mg/kg de peso corporal.
No entanto, poderá ser necessário utilizar quantidades diferentes das referidas, em particular em função do peso corporal, da via de administração, do comportamento individual face ao composto ativo, da natureza da formulação e do momento ou intervalo de tempo para o qual tem lugar a administração. Assim, em alguns casos poderá ser suficiente utilizar menos do que a quantidade mínima supramencionada, ao passo que em outros casos poderá ser necessário exceder o limite superior referido. No caso de se administrar quantidades relativamente grandes, poderá ser aconselhável distribuí-las em várias doses individuais ao longo do dia.
Os seguintes exemplos de trabalho ilustram a invenção. A invenção não é limitada aos exemplos.
Os dados em percentagem nos testes e exemplos seguintes são percentagens em peso, salvo quando indicado de outro modo; as partes são partes em peso. As proporções de solvente, proporções de diluição e dados de concentrações de soluções líquido/líquido dizem respeito, em cada caso, ao volume.
A. Exemplos
Abreviaturas
ACN acetonitrila
Sir singleto largo (no espectro de NMR)
D dupleto (no espectro de NMR)
DSC calorimetria diferencial de varrimento
% em peso percentagem em peso
M multipleto (no espectro de NMR)
n.d. não detectado
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NMR ressonância magnética nuclear
hr umidade relativa
S singleto (no espectro de NMR)
seg T segundos tripleto (no espectro de NMR)
v/v δ volume/volume vibrações deformacionais
V vibrações de alongamento
Materiais de partida
Exemplo 1A
2- (1H-1,2,3-Triazol-1-il)-acrilato de metila
Dissolveu-se 450 g de 2-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-acetato de etila em 3,5 L de metanol, adicionou-se 30 g de trietilamina e agitou-se a mistura a 22°C durante 16 horas. Removeuse então por destilação todos os solventes sob pressão reduzida. Obteve-se 410 g do composto em epígrafe com o aspecto de um óleo.
Exemplo 2A
3- (Dimetilamino)-2-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-acrilato de metila
Adicionou-se 522 g de dimetilformamida-dimetil-acetal a 400 g de 2-(1 H-1,2,3-triazol1-il)-acrilato de metila e levou-se a mistura à ebulição. Removeu-se por destilação os componentes de baixo ponto de ebulição. Decorridas 4 horas, arrefeceu-se a mistura até 55°C e introduziu-se 1050 ml_ de éter metil-terc-butílico/ /2-propanol (3:1 v/v). Arrefeceu-se a suspensão resultante até 22°C e filtrou-se. Lavou-se repetidamente a massa resultante de filtração com éter metil-terc-butílico e secou-se sob pressão reduzida a 40°C. Obteve-se 493 g do composto em epígrafe com o aspecto de um sólido.
Exemplo 3A
-[6-(Morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -11)-1 H-pirazol-5-ol (forma enóllca; fórmula estrutural (Ia)) ou 2-[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1H-1,2,3triazol-1-il)-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona (forma ceto; fórmula estrutural (lb))
Adicionou-se 5,84 g de ácido trifluoroacético a 20 g de 4-(6-hidrazinopirimidina-4-il)morfolina e 24,6 g de (2E/Z)-3-(dimetilamino)-2-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-acrilato de metila em 210 mL de acetato de etila e agitou-se a mistura ao refluxo durante 24 horas. Arrefeceu-se a suspensão obtida até 0°C e filtrou-se. Lavou-se a massa resultante de filtração com acetato de etila, removeu-se por filtração com sucção elevada e depois colocou-se em suspensão em 160 mL de água. Ajustou-se o pH da solução até cerca de 5 por meio da adição de 4,5 mL de ácido acético, agitou-se durante mais 15 minutos e filtrou-se. Lavou-se duas vezes a massa resultante de filtração com 50 mL de água e depois secou-se sob pressão reduzida a 40°C. Rendimento: 26,0 g (79,4% de rendimento teórico) do composto em epígrafe.
12/27
A preparação dos compostos 4-(6-hidrazinopirimidina-4-il)-morfolina (exemplo n° 16A), 2-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-acetato de etila (exemplo n° 39A) e 3-(dimetilamino)-2-(1H1,2,3-triazol-1-il)-acrilato de etila (exemplo n° 3A) foi já descrita no documento WO 2008/067871.
A preparação do composto 2-(6-morfolina-4-ilpirimidina-4-il)-4-(1 H-1,2,3-triazol-1-il)1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona a partir de 4-(6-hidrazinopirimidina-4-il)-morfolina e de 3(dimetilamino)-2-(1 H-1,2,3-triazol-1-il)-acrilato de etila também foi já descrita no documento WO 2008/067871 (exemplo n° 71).
Exemplos de trabalho
Exemplo 1
-[6-(Morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-1 H-pirazol-5-olato de sódio (composto de fórmula estrutural (II))
Exemplo 1.1
Colocou-se em suspensão 10 g do composto do exemplo 3A em 50 mL de metanol/água (9:1 v/v). Sob agitação, adicionou-se 3,4 g de uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 45% à suspensão e adicionou-se mais 50 mL de metanol/ /água (9:1 v/v). Aqueceu-se a suspensão até 50°C e agitou-se a 50°C durante 2 horas. Arrefeceu-se então a mistura até 0°C, agitou-se a 0°C durante mais 1 hora e filtrou-se. Lavou-se a massa resultante de filtração obtida com metanol/água (9:1 v/v) e secou-se. Rendimento: 10,1 g do composto de fórmula estrutural (II); 6,8% em peso de Na.
Exemplo 1.2
Colocou-se em suspensão 5 g do composto do exemplo 3A em 60 mL de etanol/água (1:1 v/v) e adicionou-se 1,41 g de uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 45%, a 22°C. Agitou-se a suspensão a 50°C durante 3 dias e a 20°C durante 2 horas. Removeu-se o sólido por filtração, lavou-se com 10 mL de água e secou-se. Rendimento: 4 g do composto de fórmula estrutural (II).
Exemplo 1.3
Colocou-se em suspensão 30,25 g do composto do exemplo 3A em 150 mL de metanol/água (9:1 v/v), a 22°C. Adicionou-se 13,3 mL de trietilamina e aqueceu-se a mistura até 60°C. Decorridos 15 minutos, filtrou-se a solução praticamente límpida obtida, lavou-se o filtro com 10 mL de metanol/água (9:1 v/v) e, a 60°C, adicionou-se lentamente 10,3 g de uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 45% ao filtrado recolhido. Adicionou-se alguns cristais do composto de fórmula estrutural (II) à suspensão obtida, agitou-se a mistura a 60°C, depois arrefeceu-se a mistura lentamente até 0°C e filtrou-se. Lavou-se a massa resultante de filtração com 15 mL de metanol/água (9:1 v/v) e secou-se a 40°C sob pressão reduzida. Rendimento: 25,1 g do composto de fórmula estrutural (II).
Exemplo 1.4
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Colocou-se em suspensão 25 g do composto do exemplo 3A em 150 mL de metanol/água (1:1 v/v) e adicionou-se 11 mL de trietilamina. Aqueceu-se a solução_obiida até 60°C e adicionou-se 8,5 g de uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 45%. Arrefeceu-se lentamente a suspensão obtida até 22°C, agitou-se a 22°C durante 2 horas e depois agitou-se a 0°C-5°C durante 1 hora. Após filtração, lavou-se a massa resultante de filtração com 15 mL de metanol/água (1:1 v/v) e secou-se a 40°C sob pressão reduzida. Rendimento: 26 g do composto de fórmula estrutural (II).
Calorimetria diferencial de varrimento (DSC)
Os termogramas foram obtidos utilizando um calorímetro diferencial de varrimento DSC 7 ou Pyris-1 e um analisador termogravimétrico TGA 7 da Perkin-Elmer.
Calorímetro diferencial de varrimento DSC 7 ou Pyris-1; fabricante: Perkin-Elmer, taxa de aquecimento: 2 e 20 K/minuto: gás de purga: nitrogênio; cadinho: cadinho de alumínio (não estanque a gás); preparação da amostra: nenhuma.
Analisador termogravimétrico TGA 7; fabricante: Perkin-Elmer; taxa de aquecimento: 10 Km in-1; gás de purga: nitrogênio, 20-30 mL/minuto; cadinho: cadinho de platina aberto, preparação da amostra: nenhuma.
O 1 -[6-(morfolina-4-il)-pirimidina-4-il]-4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -11)-1 H-pirazol-5-olato de sódio (composto de fórmula estrutural (II)) decompõe-se a uma temperatura superior a 300°C sem se fundir.
Adsorção de vapor e dessorção de vapor
A isotérmica de sorção de umidade foi registada utilizando um analisador de sorção de vapor dinâmico IGA Sorp da Hiden Analytical. A temperatura de medição foi de 25°C. Não foi efetuada qualquer preparação da amostra.
Quadro 1: adsorção de vapor e dessorção de vapor de 1-[6-(morfolina-4-il)pirimidina-4-il]-4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-1 H-pirazol-5-olato de sódio (composto de fórmula estrutural (II))
Composto de fórmula estrutural (ll) Composto de fórmula estrutural (I)
Umidade relativa Adsorção Dessorção Adsorção Dessorção
0% hr 0% 0% 0,1% 0,1% (5% hr)
10% hr 0% 0% 0,2% 0,1%
20% hr 0,1% 0% 0,3% 0,2%
30% hr 0,1% 0,1% 4,8% 4,7%
40% hr 0,2% 0,2% 5,1% 5,2%
50% hr 0,2% 0,3% 5,3% 5,4%
60% hr 0,2% 0,3% 5,4% 5,6%
70% hr 0,4% 0,4% 5,6% 5,6%
14/27
80% hr 0,4% 0,5% 5,7% 5,7%
90% hr 0.8% 0.8% 5.9% 5.9%..................... _
Dados de solubilidade:
Método: preparou-se soluções saturadas da substância de teste por meio agitação de uma suspensão em água a 26°C durante 16 horas. Flltrou-se então as suspensões obtidas e determinou-se o conteúdo no filtrado por HPLC.
Quadro 2: solubilidades em água
---—--- Composto de fórmula estrutural (II) Composto de fórmula estrutural (I)
Solubilidade em água a 25°C [mg/100 mL] 2800 ’ 14,3
Espectroscopia de IV e de Raman:
Para a medição dos espectros de IV e de Raman do composto de fórmula estrutural (II), utilizou-se um espectrômetro FT/IR Bruker IPS 66V e um espectrômetro FT/Raman
Bruker 'MultiRAM' com os parâmetros seguintes.
[---------—‘-------------- IV Raman
Resolução do espectro 2 cm’1 2 cm-1
Número de medições individuais (pesquisas) 32 64
Intervalo do número de onda 4000 - 500 cm1 3500 - 200 cm1
Preparação da amostra Disco de KBr nenhuma Acrontrnc do IR
Quadro 3: atribuição das bandas vibracionais características nos espectros de IR e de do composto de fórmula estrutural (II)
Elemento estrutural Posição das bandas de IV (cnr 1) Posição das bandas de Raman (cm1)
v =C-H 3153-3006 3153-3010
vC-H 2976 - 2855 2978 - 2856
v C=C, v C=N 1630-1439 1623-1401
vC-N 1241 1244
,vC-0 1112 1118
Ô =C-H em fase 987 988
------Para a medição dos espectros de IV e de Raman do composto de fórmula estrutural (I), utilizou-se um espectrômetro FT/IV 'Vertex 80v' e um espectrômetro FT/Raman Bruker 'MultiRAM' com os parâmetros seguintes.
------ IV Raman
Resolução do espectro 2 cm1 2 cm1
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Número de medições individuais (pesquisas) 32 64
Intervalo do número de onda 4000 - 500 cm1 3500-100 cm1
Preparação da amostra Disco de KBr no x/thrarrinnaift r.arahtAnst nenhuma ícas nos espectros de IR
e de do composto de fórmula estrutural (I)
Elemento estrutural Posição das bandas de IV (cm· 1) Posição das bandas de Raman (cm1)
vO-H 3441 -
v =C-H 3135-3108 3134-3006
vC-H 2965 - 2884 2967 - 2884
v C=C, v C=N, δ C-H 1636-1345 1650-1345
V COéter 1257 1259
Espectroscopia UV/VIS
Os espectros UV/VIS foram determinados num espectrômetro da Perkin Elmer (Lambda 40P), utilizando as condições ou parâmetros seguintes: tina: comprimento do caminho 1 cm; vidro de quartzo intervalo do número de onda: 200 - 800 nm largura da fenda: 1 nm preparação da amostra: cerca de 1 mg/100 mL de acetonitrila/água a 1.1 bandas: 285; 249 nm para o composto de fórmula estrutural (II) e 289,3; 248,2 nm para o composto de fórmula estrutural (I)
Quadro 5: cálculo da absorção específica e do coeficiente molar de absorção
Composto de fórmula estrutural Solvente Comprimento de onda (nm) Absorção específica A1%1 Cm (litro/g * cm) Coeficiente de absorção molar ε (litro/mol * cm)
(I) acetonitrila/ /água a 1:1 249 1111 34928
(II) acetonitrila/ /água a 1:1 284 501.2 16855
Espectroscopia de NMR
Os espectros de NMR foram registados num espectrômetro de NMR Bruker (Advance), utilizando as condições ou parâmetros seguintes
Composto de fórmula Espectro de1H NMR Espectro de 13C NMR estrutural (II) ___________________________________
Frequência de 500.13 MHz 125.76 MHz
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funcionamento
Solvente Ácido trifluoroãcético Acido trifluoroãcético -
Concentração 6,84 mg/ml 42.7 mg/ml
Padrão interno Tetrametilsilano (TMS) Tetrametilsilano (I MS)
Diâmetro do tubo da amostra 5 mm 5 mm
Temperatura 25°C 25°C
Técnica Técnica da transformada de Técnica da transformada
Fourier de Fourier
Largura do espectro 20,65 p.p.m. 245,41 p.p.m.
Resolução digital 0,079 Hz/Pt 0,4710 Hz/Pt
Duração do ciclo 2,83 psec, ângulo de 9,1 psec, ângulo de
excitação de 30° excitação de 90°
Tempo de registo 6,399 segundos 1,06 segundos
Tempo de relaxamento 0,5 segundo 4 segundos
n° de declínios de indução livres 32 128
Composto de fórmula estrutural (I) Espectro de1H NMR Espectro de13C NMR
Frequência de funcionamento 500,13 MHz 125,76 MHz
Solvente Sulfóxido de dimetila-de Sulfóxido de dimetila-d6
(DMSO) (DMSO)
Concentração 6,3 mg/ml 35,8 mg/ml
Padrão interno Tetrametilsilano (TMS) Tetrametilsilano (TMS)
Diâmetro do tubo da amostra 5 mm 5 mm
Temperatura 25°C 27°C
Técnica Técnica da transformada de Técnica da transformada
Fourier de Fourier
Largura do espectro 20,65 p.p.m. 240,89 p.p.m.
Resolução digital 0,079 Hz/Pt 0,9248 Hz/Pt
Duração do ciclo 3.1 psec, ângulo de 7.0 psec, ângulo de
excitação de 30° excitação de 90°
Tempo de registo 6,344 segundos 1,08 segundos
Tempo de relaxamento 0,5 segundo 4 segundos
n° de declínios de indução livres 32 1024
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Fórmulas estruturais do composto de fórmula estrutural (II) e do composto de fórmula
Figure BR112013012223A2_D0008
(II) o
Quadro 6: espectro de 1H NMR do composto de fórmula estrutural (II) - desvio químico, multiplicidade de sinal, número relativo de prótons (a numeração dos átomos de H é baseada na fórmula estrutural para a atribuição dos sinais de NMR respectivos)
Átomos de H Desvio químico δ (p.p.m.) Multiplicidade e constantes de acoplamento Número de prótons/molécula
1-[6-(morfolina-4-il) de sódio H-2; H-3; H-5; H-6 4,00-4,25 M 8
pirimidina-4-il]- H-2 8,72 S 1
H-5 7,77 S 1
4-(1H-1,2,3-triazol-1-il)- H-4 8,64 D J= 1,4 Hz 1
H-5 8,98; D J= 1,4 Hz 1
1 H-pirazol-5-olato H-3 8,68 : S 1
Quadro 7: espectro de 1H NMR do composto de fórmula estrutural (I) - desvio
químico, multiplicidade de sinal, número relativo de prótons (a numeração dos átomos de H é baseada na fórmula estrutural para a atribuição dos sinais de NMR respectivos)
Átomos de H Desvio químico δ Multiplicidade e Número de
(p.p.m.) constantes de prótons/molécula
acoplamento
-[6-(morfoíina-4-il)
18/27
Átomos de H Desvio químico δ (p.p.m.) Multiplicidade e constantes de acoplamento Número de prótons/molécula
H-2; H-3; H-5; H-6 3,71 S 8
pirimidina-4-il]-
H-2 8,55 S 1
H-5 7,42 S 1
4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-
H-4 7,86 D (0,6 Hz) 1
H-5 8,38 D (0,6 Hz) 1
1 H-pirazol-5-ol
H-3 8,27 S 1
5-OH n.d (c) n.d. 1
------Quadro 8; eSpectro de 13C NMR do composto de fórmula estrutural (II) - desvio químico, multiplicidade de sinal, número de C no núcleo no composto de fórmula estrutural (II) (a numeração dos átomos de C é baseada na fórmula estrutural para a atribuição dos sinais de NMR respectivos) _______________
Átomos de C Desvio químico δ Multiplicidade e constantes de acoplamento Número de C no núcleo/molécula
(p.p.m.)
1 -[6-(morfolina-4-il) de sódio
C-2; C-6 67,80 T 2
C-3; C-5 48,21 T 2
pirimidina-4-il]-
C-2 151,65 D 1
C-4 152,01 S 1
C-5 91,48 D 1
C-6 159,90 S 1
4-(1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-
C-4 130,93 D 1
C-5 129,57 D 1
19/27
Átomos de C Desvio químico δ (p.p.m.) Multiplicidade e constantes de acoplamento Número de C no núcleo/molécula.
1 H-pirazol-5-olato C-3 138,03 D 1
C-4 106,99 S 1
C-5 157,43 S 1
------Quadro 9: eSpectro de 13C NMR do composto de fórmula estrutural (I) - desvio químico, multiplicidade de sinal, número de C no núcleo no composto de fórmula estrutural (I) (a numeração dos átomos de C é baseada na fórmula estrutural para a atribuição dos sinais de NMR respectivos)
Átomos de C Desvio químico δ (p.p.m.) Multiplicidade e constantes de acoplamento Número de C no núcleo/molécula
1 -[6-(morfolina-4-il)
C-2; C-6 65,56 T 2
C-3, C-5 44,29 T 2
pirimidina-4-il]-
C-2 154,08 D 1
C-4 152,43 S 1
C-5 85,62 D 1
C-6 161,99 S 1
4-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-
C-4 132,94 D 1
C-5 123,68 D 1
1 H-pirazol-5-ol
C-3 135,84 D 1
C-4 102,82 S 1
C-5 154,70 S 1
Espectroscopia de massa
O espectro de massa foi registado num espectrômetro de massa Waters (ZQ), utilizando as condições ou os parâmetros seguintes.
Método de ionização ESI (ionização por pulverização electrónica)
Solventes acetonitrila/água
20/27
Quadro 10: interpretação do composto de fórmula estrutural (II) —— ——....... ~ Número de massa (A)
Formação do ion M+H Formação do íon M+Na C13H14N8O2 + H C13H14N8O2 + Na 315 337
Quadro 11: interpretação do espectro de massa do composto de formula estrururai yj
-- ' Número de massa (A)
Formação do íon M+H C13H15N8O2 315
Análise elementar
Quadro 12: resultados da análise elementar do composto de fórmula estrutural (II)
Elemento Medido (%) Calculado (%) Diferença (%)
C 46,1 46,4 0,3
H 4,0 3,9 0,1
N 33,1 33,3 0,2
Quadro 13: resultados da análise elementar do composto de fórmula usliutuial (I)
Elemento Medido (%) Calculado (%) Diferença (%)
C 49,5 49,7 0,2
H 4,4 4,5 0,1
N 35,5 35,7 0,2
O 12,6 10,2 2,4
'PANalytical X'Pert PRO' com contador PIXcel
Difratometria de raios-X
Difratômetro de transmissão (multicanal):
radiação: monocromador primário: comprimento de onda (K1): comprimento de onda (K2): parâmetros do gerador: intervalo de medição: condições ambientais:
cobre, K alfa espelho de raios-X focado
1,5406 Â
1.5444 Â kV, 40 mA
2°-38°
25°C, 40% - 60% hr ou sistema de difração de pó STOE:
Difratômetro: monocromador: transmissão germânio curvado (111)
gerador: comprimento de onda: 45 kV, 35 mA 1,540598 Cu
detector: PSD linear
modo de pesquisa: transmissão/PSD em movimento/omega fixo
21/27 tipo de pesquisa: 2 teta:omega condições ambientais: 25°C, 40% - 60% hr
Quadro 14: Difratometrià do dó no raio-X do composto de fórmula estrutural (H)
Composto de fórmula estrutural (II) Reflexos [2 teta]
5,7 23,6
11,5 25,3
13,2 26,4
13,7 26,9
15,8 27,7
16,4 27,7
18,4 29,4
18,9 29,9
19,3 30,0
21,0 30,7
22,0 31,5
23,1 31,6
Quadro 15: Difratometria do pó no raio-X do composto de fórmula estrutural (1)
Composto de formula estrutural tl)
Reflexos [2 teta]
5,6 24,6
14,4 24,8
14,9 25,1
16,3 26,3
16,5 26,8
17,6 28
17,8 28,5
18,2 29
18,5 29,9
19 32,4
19,7 32,7
21,6 33,2
22 33,8
22,4 34,7
22,9 35,7
24 36,4
24,5 36,7
22/27
B. Avaliação da atividade farmacolóqica
As propriedades farmacológicas dos compostos de acordo com a invenção podem ser demonstradas através dos ensaios seguintes.
Abreviaturas
DMEM Meio de Egle modificado por Dulbecco
FCS Soro feral de bovino
TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano
1, Testas in vitro para a determinação de atividade e seletividade de inibidores de HIF prolil-4-hidroxilase
1.a) Inibição da atividade de HIF prolil-hidroxilase
HIF hidroxilado liga-se especificamente ao complexo de proteína von Hippel-Lindau elongina B-elongina C (complexo VBC). Esta interação apenas tem lugar caso HIF seja hidroxilado num radical prolilo conservado. Tal constitui a base para a determinação bioquímica da atividade de HIF prolil-hidroxilase. O teste é efetuado conforme descrito [Oehme F., Jonghaus W., Narouz-Ott L., Huetter J., Flamme I., Anal. Biochem. 330 (1), 7480 (2004)].
Mantém-se a incubar uma placa de microtitulação límpida com 86 cavidades revestida com NeutrAvidin HBC (Pierce) com caseína bloqueadora, durante 30 minutos. Lava-se então a placa três vezes com 200 pL, de cada vez, de tampão de lavagem (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCI 100 mM, 10% (v/v) de caseína bloqueadora, 0,05% (v/v) de Tween 20), por cavidade. Adiciona-se o peptídeo biotina-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (Eurogentec, 4102 Seraing, Bélgica) numa concentração de 400 nM em 100 pL de tampão de lavagem. Este peptídeo atua como substrato para a hidroxilação de prolilo e está ligado à placa de microtitulação. Após incubação durante 60 minutos, lava-se a placa três vezes com tampão de lavagem, mantém-se a incubar com biotina 1 mM em caseína bloqueadora durante 30 minutos e depois lava-se novamente três vezes com tampão de lavagem.
Para se efetuar a reação de prolil-hidroxilase, mantém-se a incubar o substrato peptídico ligado à placa com um lisado celular que contém prolil-hidroxilase durante 1 a 60 minutos. A reação tem lugar em 100 pL de tampão de reação (Tris 20 mM, pH 7,5, KCI 5 mM, MgCI2 1,5 mM, 2-oxoglutarato 1 pM - 1 mM, FeSO4 10 pM, ascorbato 2 mM), à temperatura ambiente. Além disso, a mistura de reação contém várias concentrações do inibidor de prolil-hidroxilase que se pretende testar. A substância de teste é preferencialmente, mas não exclusivamente, utilizada a concentrações compreendidas entre 1 nM e 100 pM. A reação é parada por lavagem da placa três vezes com tampão de lavagem.
Para a determinação quantitativa da hidroxilação de prolilo, adiciona-se uma proteína
23/27 de fusão que contém tioredoxina de E. coli e o complexo VBC em 80 pL de tampão de ligação (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCI 120 mM). Decorridos 15 minutos, adiciona-se10 pL de uma solução de anticorpos anti-tioredozina policlonais de coelho em tampao de ligação. Decorridos mais 30 minutos, adiciona-se 10 pL de uma solução de anti-imunoglobulina de coelho acoplada a peroxidase de rábano em tampão de ligação. Depois de se manter a incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos, lava-se a placa três vezes com tampao de lavagem para se remover o complexo de VBC não ligado e os anticorpos. Para se determinar a quantidade de complexo de VBC ligado, mantém-se a placa a incubar com TMB durante 15 minutos. A reação colorida é terminada por meio da adição de 100 pL de ácido sulfúrico 1 Μ. A quantidade de complexo de VBC ligado é determinada através da medição da densidade óptica a 450 nm. Esta é proporcional à quantidade de prolina hidroxilada no substrato peptídico.
Em alternativa, é possível utilizar um complexo de VBC acoplado a európio (Perkin Elmer) para a deteção da hidroxilação de prolilo. Neste caso, a quantidade de complexo de VBC ligado é determinada pela fluorescência em termos de tempo. Além disso, é ainda possível a utilização de complexo de VBC marcado com [35S]-metionina. Para tal, é possível preparar um complexo de VBC marcado radioativamente por transcrição-tradução in vitro em lisado de reticulócito.
O composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção inibe a atividade de HIF prolil-hidroxilase neste teste com um valor de CI50 de 0,47 pM (média para EGLN2/PHD1) ou de 0,14 μΜ (média para EGLN1/PHD2).
.b) Teste celular, funcional in vitro
A atividade dos compostos de acordo com a invenção é quantificada com o auxílio de uma linhagem celular recombinante. A célula é originalmente obtida a partir de uma linhagem celular de carcinoma do pulmão humano (A549, ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, USA). A linhagem celular de teste é transfectada de um modo estável com um vector que contém o gene repórter de luciferase de Photinus pyralis (a seguir designada como luciferase), sob o controle de um promotor minimal artificial. O promotor minimal compreende dois elementos responsáveis por hipóxia a montante de uma caixa TATA [Oehme F., Ellinghaus P., Kolkhof P., Smith T.J., Ramakrishnan S., Hütter J., Schramm M., Flamme I., Biochem. Biophys. Res. Commun. 296 (2), 343-9 (2002)]. Sob o efeito de hipóxia (v.g., cultura na presença de 1% de oxigênio durante 24 horas) ou sob a ação de inibidores de dioxigenase não seletivos (v.g., desferroxamina numa concentração de 100 pM, cloreto de cobalto numa concentração de 100 pM ou éster dietílico de Noxalilglicina numa concentração de 1 mM), a linhagem celular de teste produz luciferase, a qual pode ser detectada e quantificada com o auxílio de reagentes bioluminescentes adequados (v.g., sistema de ensaio de luciferase Steady-Gio®, Promega Corporation,
24/27
Madison, Wl 53711, USA) e de um luminômetro adequado.
Procedimento do teste: no dia antes do teste, coloca-se as células em placas numa quantidade calculada com exatidão de meio de cultura (DMEM, 10% de FCS, glutamina 2 mM) em placas de microtitulação com 384 ou 1536 cavidades e mantem-se numa incubadora de células (96% de umidade atmosférica, 5% v/v de CO2, 37°C). No dia do teste, adiciona-se as substâncias de teste ao meio de cultura em concentrações graduadas. Nao se adiciona substância de teste aos lotes que servem como controles negativos. Como controle positivo para a determinação da sensibilidade da célula para os inibidores, v.g., adiciona-se desferroxamina numa concentração final de 100 μΜ. Seis a 24 horas após a transferência das substâncias de teste para as cavidades das placas de microtitulação, mede-se o sinal luminoso resultante no luminômetro. Representa-se graficamente uma relação dose/efeito com o auxílio dos valores medidos, a qual serve como base para a determinação da concentração ativa para um valor de metade do máximo (designado valor CES0).
No teste aqui descrito, o composto de fórmula estrutural (II) de acordo com a invenção possui um valor CE50 de 7 μΜ.
1.c) Teste celular, funcional in vitro da modificação da expressão de gene
Para se investigar a modificação da expressão de ARNm específico em linhagens celulares humanas após tratamento com as substâncias de teste, desenvolve-se em cultura as seguintes linhagens celulares em placas com 6 ou 24 cavidades: células de hepatoma humano (HUH, JCRB Cell Bank, Japão), fibroblastos de rim embrional humanos (HEK/293, ATCC, Manassas, VA 20108, USA), células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC, Manassas, VA 20108, USA), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC, Cambrex, East Rutherford, New Jersey 07073, USA). Decorridas 24 horas após a adição das substâncias de teste, lava-se as células com soluto salino tamponado com fosfato e obtém-se 0 ARN total a partir destas utilizando um método adequado (v.g., reagente Trizol®, Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe, Alemanha).
Para uma experiência de análise típica, digere-se 1 pg de cada ARN total obtido deste modo com DNase I e transplanta-se em ADN complementar (ADNc), utilizando uma reação de transcriptase inversa adequada (sistema de transcrição inversa ImProm-ll, Promega Corporation, Madison, Wl 53711, USA). Em cada caso, utiliza-se 2,5% do lote de ADNc obtido deste modo para a reação em cadeia da polimerase. Investiga-se o nível de expressão do ARNm dos genes em investigação por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real [TaqMan-PCR; Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M., Genome Res. 6 (10), 986-94 (1996)], utilizando um instrumento de deteção de sequências ΆΒΙ Prism 7700' (Applied Biosystems, Inc.). As combinações iniciador-sonda aqui utilizadas são geradas por meio da aplicação informática 'Primer Express 1.5 (Applied
25/27
Biosystems, Inc.). De um modo mais específico, investiga-se ARNm de eritropoietina, carboanidrase IX, lactato desidrogenase A e fator de crescimento celular endotelial-vascular.
2. Testes /n vivo oara a detecão da acão no sistema cardiovascular
2.a) Teste in vivo da modificação da expressão de gene
Os compostos de teste dissolvidos em solventes adequados são administrados a murganhos ou ratos por via oral, por administração num tubo para o estomago, por via intraperitoneal ou intravenosa. As dosagens típicas são de 0,1,0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de peso corporal e por administração. Os animais de controle recebem apenas solvente. Decorridas 4, 8 ou 24 horas após a administração da substância de teste, sacrifica-se os animais com uma sobredose de isoflurano e subsequente fratura do pescoço e remove-se os órgãos que se pretende investigar. Partes dos orgãos são congeladas rapidamente em nitrogênio líquido. O ARN total é obtido a partir das partes de órgãos descritas na alínea B.1.a), sendo tal traduzido em ADNc. Investiga-se o nível de expressão de ARNm dos genes sob investigação através de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real |TaqMan-PCR; Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M., Genome Res. 6 (10), 986-94 (1996)], utilizando um instrumento de deteção de sequências ΆΒΙ Prism 7700' (Applied Biosystems, Inc.).
A substância de acordo com a presente invenção proporciona um aumento dependente da dose significativo no ARNm de eritropoietina no rim após administração por via oral ou parentética em comparação com o controle com placebo.
2.b) Determinação do nível de eritropoietina no soro
A substância de teste num solvente adequado é administrada a murganhos ou ratos, por via intraperitoneal ou oral, uma vez ou duas vezes ao dia. As dosagens típicas são de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de peso corporal e por administração. Os animais de controle com placebo recebem apenas solvente. Antes da administração e quatro horas após a última administração de substância, é recolhido sangue dos animais a partir do plexo venoso retroorbital ou da veia da cauda, sob narcose curta. Torna-se o sangue não coagulável por meio da adição de heparina de lítio. Obtém-se o plasma sanguíneo por centrifugação. O teor em eritropoietina no plasma sanguíneo é determinado com o auxílio de um ELISA-eritropoietina (imunoensaio Epo de murganho Quantikine®, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA), em conformidade com as instruções do fabricante. Os valores medidos são convertidos em pg/mL com o auxílio de um registo de medições de referência para eritropoietina de murganho.
As substâncias de acordo com a invenção proporcionam um aumento dependente da dose significativo na eritropoietina no plasma após administração por via oral e parentérica em comparação com o valor inicial e com o controle com placebo.
2.c) Determinação da composição celular de sangue periférico
26/27
A substância de teste num solvente adequado é administrada a murganhos ou ratos, por via intraperitoneal ou oral, uma ou duas vezes ao dia, ao longo de vários dias. As dosagens típicas são, v.g., 0,1, 0,5, 1,5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de peso corporal e por administração. Os animais de controle recebem apenas solvente. No fim do estudo, recolhe-se sangue dos animais a partir do plexo venoso do canto do olho ou da veia caudal, sob narcose curta, tornando-o não coagulável por meio da adiçao de citrato de sódio. Determina-se as concentrações de eritrócitos, leucócitos e trombócitos nas amostras de sangue num aparelho de medição electrónico adequado. Determina-se a concentração de reticulócitos por varrimento microscópico de 1000 eritrócitos, em cada caso, com o auxílio de colheitas de sangue manchadas com uma solução de produção de manchas adequada para este propósito (ΚΑΒΕ Labortechnik, Nümbrecht). Para a determinação do hematócrito, recolhe-se sangue a partir do plexo venoso retroorbital por meio de um capilar hematócrito e lê-se manualmente o valor hematócrito após centrifugaçâo do capilar numa centrifugadora adequada para este propósito.
A substância de acordo com a invenção proporciona um aumento dependente da dose significativo no hematócrito, na contagem de eritrócitos e de reticulócitos, após administração por via oral e parentérica, em comparação com o valor inicial e com o controle com placebo.
C. Exemolos de trabalho para composições farmacêuticas
Os compostos de acordo com a invenção podem ser convertidos em formulações farmacêuticas do modo seguinte.
Comprimido
Composição
100 mg do composto de acordo com a invenção, 50 mg de lactose (mono-hidrato), 50 mg de amido de milho (nativo), 10 mg de polivinilpirrolidona (PVP 25) (BASF, Ludwigshafen, Alemanha) e 2 mg de estearato de magnésio.
Peso do comprimido 212 mg. Diâmetro 8 mm, raio de curvatura 12 mm.
Preparação:
Submete-se a granulação a mistura do composto de acordo com a invenção, lactose e amido com uma solução a 5% (p/p) de PVP em água. Após secagem, mistura-se os grânulos com o estearato de magnésio durante 5 minutos. Comprime-se esta mistura com uma compressora convencional de comprimidos (ver antes para o formato do comprimido). É utilizada uma força de compressão de 15 kN, como valor recomendado para a compressão.
Suspensão para administração por via oral
Composição
1000 mg do composto de acordo com a invenção, 1000 mg de etanol (a 96/o),
27/27
400 mg de Rhodigel® (goma de xantano de FMC, Pennsylvania, USA) e 99 g de água.
mL de suspensão oral correspondem a uma dose individual de 100 mg do composto de acordo com a invenção.
Preparação
Coloca-se em suspensão o Rhodigel em etanol e adiciona-se o composto de acordo com a invenção à suspensão. Adiciona-se a água sob agitação. Agita-se a mistura durante aproximadamente 6 horas, até terminar a dilatação do Rhodigel.
Solução para administração por via oral
Composição
500 mg do composto de acordo com a invenção, 2,5 g de polissorbato e 97 g de polietileno glicol 400. 20 g da solução oral correspondem a uma dose individual de 100 mg do composto de acordo com a invenção.
Preparação
Coloca-se em suspensão o composto de acordo com a invenção numa mistura de polietileno glicol e polissorbato, sob agitação. Mantém-se sob agitação até se completar a dissolução do composto de acordo com a invenção.
Solução i.v.
Dissolve-se o composto de acordo com a invenção numa concentração inferior à solubilidade de saturação num solvente fisiologicamente aceitável (v.g., solução de soluto salino isotônica, solução de glicose a 5% e/ou solução de PEG 400 a 30%). Submete-se a solução a filtração estéril e transfere-se para recipientes para injeção estéreis e isentos de pirogênio.

Claims (10)

  1. RBIVIHDICAÇÕES
    1. Composto carasierixador peto fato de ser o t46”(Morfolína4iO-plnmtoína4-
    8)-4-(1 H-LS^-tnazaMOFiH-pteoi-S-olato de sódio quo cerrespcnde ao composto da fórmula estrutural (li)
    Figure BR112013012223A2_C0001
  2. 2, Composto de fórmula estrutural (II) da acordo com a reivindicação 1< csractorixado peto feto de o composto do fórmula estruturai (II) estar presente em uma forma |||||||||to||||||||||||||||||||||l|||||||||||l
  3. 3.. Processo psrs a preparação do composto de fórmula estrutural (II) de acordo
    10 com a reivindicação 1 < caraaferlzsda peto fato de se fazer reagir o composto de fórmula estrutural (I)
    Figure BR112013012223A2_C0002
    em um solvents com hidróxido de sódio ou com uma solução aquosa de hidróxido de sódia ou com um sai de sódio, se adequado com a adição de uma base.
    |Í(|IOII|l|l|l|Í||l||ÍfoÓlÍÍÍi|liÍ(Í(ÍfoÍBÍ||Í(ÍÍíÍÍÍi|ÍÍíÍ(ÍÍ)IÍBÍBlÍÍÍiÈBÍBÍ oom a reivindicação 3; caracterizado pele fato de so fazer reagir o composto de fórmula estruturai (I) em um solvente com uma solução aquosa de hidróxido de sódio, se adequado com a adição de uma base.
  4. 5, Processo pare a preparação do composto do fórmula estruturai (II) de acordo 20 com e reivindicação 3, camctorizado paio fato de se fazer reagir o composto de fórmula estrutural (I) em um solvente com uma solução aquasa de hidróxido de sódio, com a adição de trletilamina.
  5. 6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2< caracterizado pato fato de ser para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças.
    25
  6. 7. Utilização do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
    2 caracterizada peto fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento
  7. 8. Utilização do composto corno definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
    2/2
    2 caracterizada peto fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou para a profiíaxia de doenças cardtovascuíares, insuficiência cardíaca, anemia, doenças renais crônicas e insuficiência renal.
  8. 9. Medicamento carastemado pele fato de compreender o composta como 5 definido na reivindicação 1 ου 2 em combinação cem um auxiliar inerte, não tóxico >s fermaceuticemente adequado.
  9. 10.. Medicamento csractorixado peto feto de compreender o composto de como definida na reivindicação 1 eu .2 em combinação com um entro composto ativo.
  10. 11. Medicamento de acordo com s reivindicação 9 ou 10 caractorfeado peto fato
    10 de ser para e tratamento e/ou para a profiíaxia de doenças cardtovasculares, insuficiência cardíaca, anemia. doenças renais eréníoas e msuúcmncia recaí.
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