BR112013010262A2

BR112013010262A2 - processo para a caracterização de objetos transparentes em um meio transparente e programa de computador

Info

Publication number: BR112013010262A2
Application number: BR112013010262-4A
Authority: BR
Inventors: Frank Dubois; Catherine Yourassowsky
Original assignee: Universite Libre De Bruxelles
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2020-08-04
Also published as: BR112013010262B1; CN103238120A; US20130308135A1; EP2638435B1; CN103238120B; US9476694B2; CA2814321C; WO2012062805A1; JP6039570B2; EP2638435A1; CA2814321A1; KR101829947B1; KR20130102094A; JP2014503794A

Abstract

PROCESSO PARA A CARACTERIZAÇÃO DE OBJETOS TRANSPARENTES EM UM MEIO TRANSPARENTE E PROGRAMA DE COMPUTADOR A presente invenção tem por objeto um processo para a caracterização de objetos transparentes (2, 3) num meio transparente (1), apresentando os referidos objetos transparentes (2, 3) uma área focal óptica (5, 6) compreendendo o referido processo as etapas de: - iluminação de uma amostra que compreende os objetos (2, 3) a serem caracterizados por meio de uma fonte de luz direccional (7), induzindo assim picos de intensidade de luz (5,6) na área focal dos referidos objetos transparentes; - a determinação de pelo menos uma característica do pico de intensidade de luz (5,6) induzido pelo referido objeto a ser caracterizado, determinando, a partir do referido pico de intensidade de luz (5,6), pelo menos uma propriedade do referido objeto.

Description

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"PROCESSO PARA A CARACTERIZAÇÃO DE OBJETOS TRANSPARENTES EM UM MEIO TRANSPARENTE E PROGRAMA DE COMPUTADOR" Domínio da invenção A presente invenção tem por objeto um processo óptico 5 para a caracterização de part'culas.

Estado da técnica A contagem de pequenas partículas transparentes, num meio transparente, é um problema bem P conhecido em vários domínios técnicos.

Pode referir-se à contagem do número lO de partículas de uma fase dispersa em rnaterial cientifico, à contagem do número de células numa cultura biológica, à contagem do número de micelas num látex ern química ou na síntese de polímeros,... A primeira tentativa para resolver este problema consiste 15 rta utilização de grelhas-padrão transparentes (quadrículas), seguida da contagem manual, numa imagem de microscópio, do número de partículas em cada quadrado definido pela grelha.

Estes processos de contagem.manual sofrem de várias desvantagens.

A primeira de todas 20 consiste no facto de serem altamente consumidores de tempo, terem uma fraca validade estatística para os números pequenos e, normalmente, terern uma fíabilidade limitada.- Por isso, a análise de imagens é algumas vezes utilizada 25 para automatizar essa contagem.

Nesses processos, as imagens do microscÓpio são normalmente transformadas por µ processos normalizados, tais como a utilização do nível 'JYt limite, a segmentação, a dilatação e a transformação por erosão, a detecção de limites,... Contam-se então as 30 partículas individuais por meio de algoritmos rnais ou menos complexos.

Esses processos automatizados normalmente têm várias desvantagens.

Por exemplo, se a imagem obtida tiver um contrate limitado ou no caso de haver partículas que se sobrepõem, os algorítmos podem 35 não separar com precisão as diferentes partículas e a contagem tem uma fraca fiabilidade.

Outros processos conhecidos para a contagem de partículas f.T h .-. - l 2

V W " rr" · — —.

4 - que fluem num líquído baseiam-se no sombreado ou em efeitos da clifusão da luz. Esses processos, largamente utilizados, por exemplo, no campo farmacêutico, também têm várias desvantagens. A primeira de todas consiste no " 5 facto de normalmente não ser possível discriminar entre bol-has e partículas sólidas. Isto é particularmente . crítico quando se avalia a limpeza ou a pureza de soluções fisiológicas tamponadas contendo uma grande quantidade de CO2 dissolvido, o que perturba a medição. 10 Neste tipo de medição, não se tem qualquer infarmação sobre a natureza das partículas que possa ser extraída dos resultados. objectivos da invenção A presente invençào tem por objectivo providenciar um 15 processo de caracterização e/ou de contagem de partículas esferóides transparentes, num meio transparente, que não tenha as desvantagens da técnica anterior. As vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição que se segue. 20 Sumário da Invenção A presente invenção tem por objeto um processo para a caracterização de pelo menos uma propriedade de objetos transparentes que apresentem uma área focal (ponto do foco), estando o referido objeto num meio transparente, 25 compreendendo o referido processo as etapas de: iluminação de uma amostra que compreenda os objetos

M que vão ser caracterizados por meio de uma fonte de luz direccional, induzindo assim picos de intensidade de luz » na área focal dos referidos objetos transparentes, 30 - determinação de pelo menos 'uma caracteristica dos picos de intensidade de Iuz, determinação, a partir daí de pelo menos uma característica dos picos de intensídade de luz e portanto, d-e pelo menos uma propriedade dos referidos 35 objetos. PQr objeto transparente, que apresenta uma área focal (ponto de foco), entende-se, no presente documento, um

— 3 m d 1 .

objeto capaz e concentrar Iuz na referida área focal quando é iluminado por uma fonte de luz direccíonal, fórmando a luz concentrada um pico de intensidade de luz. Na presente invenção, os referidos picos de intensidade ' 5 de luz são induzidos directamente pela interacção entre q objeto e a luz direccional, independentemente do aparelho q que produz a imagem (isto é, os picos de luz existem mesmo quando nào estão a ser observados). De acoLdo com modalídades particulares preferidas, o 10 processo da presente invenção compreende uma ou uma combínação apropríada de pelo menos duas das seguintes características: o processo compreende ainda a etapa de: o registo de urna representação holográfica da amostra 15 iluminada; Cj reconstrução, a partir da referída representação holográfica, de uma representação tridimensional da intensidade do campo de luz induzida pela referida amostra; 20 o rastreio da representação tridimensional da intensidade do carnpo de luz para a determinação da área dos picos de luz que apresentam uma intensidade superior a um limite pré-determinado, correspondendo cada um dos referidos picos de luz a uma partícula; 25 — pelo menos uma característica dos objetos compreende o número dos referidos objetos, compreendendo a

O característica dos picos de intensid.ade de' luz determinada o número de picos;

W os objetos seleccionam-se no grupo que consiste em 30 bc)lhas de gás, vesículas de líquido numa emulsão, pérolas sóli.das, células vivas, células mortas e as suas misturas; — os objetos seleccionam-se no grupo que consiste em células vivas, células mortas e as suas misturas; 35 — pelo menos uma das referidas características do pico compreende pelo menos uma característica do pico seleccionada no grupo que consiste em distância entre o

— - — . - . - - .

O pico de luz e o objeto correspondente, área do pico de luz e intensidade do pico de luz; — a caracteristica do pico é utilizada para classificar os referidos objetos em pelo menos dois 5 subconjuntos de objetos; — um subconjunto dos objetos corresponde a células vivas e um segundo subconjunto de objetos corresponde a células mortas; — o " pròcesso de caracterização realiza-se 10 dinamicamente em representações holográficas sucessivas; o rneio transparente consiste num líquido ern fluxo que transporta os objetos; a representação holográfica obtém-se por meio de um microscópio holográfíco; 15 — o microscópio é utilizado de acordo com um rnodo diferencial; — utiliza-se o microscópio no modo de campo escuro; a fonte de luz é parcialmente coerente; o microscópio é utilizado fora dos eixos. 20 Outro aspecto da presente invenção está relacionado coín um programa de computador que implementa o processo da presente invenção ou uma modalidade preferida da presente invenção- Breve descrição dos desenhos 25 A fig. , 1 representa, esquematicamente, os princípios básicos da presente invenção. A fig. 2 representa, esquematicamente, a medição dos ângulos de contact-o utilizando um processo de acordo com a presente invenção. 30 A fig. 3 representa, esquernaticamente, o microscópio holográfíco dígital utilizado para gerar os dados dos exemplos. A fig. 4a representa uma imagem de intensidade "no foco"" de células vivas. 35 A fig. 4b representa as áreas focais das células transparentes da figura 4-a que concentram os raios da luz de iluminaçào, que formam os picos de intensidade de

-

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5 ~. á= . _ . _ 0 W e .'C luz.

A fig. 5 representa um histograma do número de picos em função das dimensões dos picos (áreas) de uma cultura de células, arites e depois dos tratamentos térmicos que 5 induzern a morte celular.

Chave dos números 1: Meio tran"parente 2, 3: objetos esferóídes transparentes 4: Paredes transParerites do recipiente da-amostra 10 5, 6: Áreas focais dos objetos transparentes (2,3)

que concentram os raios de luz de iluminação (7), que formam os picos de intensidade de luz 7: Raios de luz de iluminação 8: Direcção do fluxo do meio transparente 15 Descrição detalhada da invenção A presente invenção tem por objeto processos analíticos que utilizam uma característica óptica comum a muitos objetos transparentes quando são iluminados pela luz.

Esta característica comum consiste no facto de muitos 20 objetos transparentes actuarem como uma lente, concentrando a luz nurna área focal real posterior (5) ou numa área virtual anterior (6) do referido objeto.

Essa área focal pode ser induzida, por exemplo, por objetos com a forma de partículas esferóides ou 25 elipsóides transparentes (2-3) com urn indice de refracção diferente do meio circundante.

Essas partículas podem ser, por exemplo, gotículas de óleo dispersas numa solução aquosa, bolhas de gás (3) num líquido, células vivas ou mortas, gotículas de um l'quido num fluxo 30, gasoso,... Por transparente, entende-se, no presente documento, um meio que mantém a luz de uma forma direccional suficiente para se observar os picos de focalização.

Essa transparência pode ser caracterizada, por exemplo, 35 através da medição da neblina (ASTM D 1003). O problema aparece quando uma grande neblina constitui um amento da luz de fundo e uma dificuldade acrescida para discriminar

~ 6 - —

K Z W m: entre o fundo e os picos. Para observar os picos de intensidade de focalização da luz, as partículas de preferência têrn dimensões maiores do que o comprimento de onda da luz incidente, mais ' 5 preferencialmente, maiores do que três vezes o comprirnento de onda da luz. No caso da luz visivel, as 0 partículas têm, de preferência, dimensões maiores do que um micrómetro. As partículas transparentes que induzem -uma área focal. 10 não se limitam a partículas esferóides num fluxo livre, mas também incluem partículas fixas nurrta superficie lisa tais coino gotículas de líquido ou bolhas em contacto com c) vidro ou similar. Uma consequência da existência desses pontos focais/áreas 15 consiste no facto de cada uina dessas partículas, quando iluminada, produzir um pico de intensidade de luz que pode ser tacilmente detectado por rastreio em três dimensões da distribuição da intensidade da luz. Com varítagem, o processo da presente invenção realiza-se 20 registando primeiro uma representação holográfica digital de uma amostra iluminada que compreende as partículas a ser analisadas. O rastreío e a análise são então realizados, de preferência, numa representação de um campo de luz induzido pela amostra iluminada reconstruída

2.5 em 3D. Mesmo uma única partícula pode ser caracterizada pelo

D processo da presente invenção, e a possibílizada da automatização do processo torna particularmente .

apropriado para conjuntos grandes de partículas. As 30 partículas a serem caracterizadas podem estar presentes simultanearnente no campo da represent'ação ou podem estar presentes num tempo subsequente. De preferência, a representação holográfica digital é registada por um microscópio holográfico digital (MHD). O 35 referido MHD pode ser, com vantagem, do tipo descrito na EP1399730 que é aqui incorporada como referência. Numa modalidade preferida, o MHD pode ser um microscópio k e .

holográfico diferencial, tal como o descrito em EP1631788 que é aqui incorporada como referêncía. Corn vantagem, o MHD funciona num modo de campo escuro, tal como descrito em WO/2010/037861. A vantagern desse 5 modo em campo escuro consiste em facilitar a detecção do pico de luz por meio da redução do fundo de luz médio. A utilização de um MHD fora dos eixos tal como descrito no pedído de patente internacional com o número PCT/EP2010/64843 tem a vantagem de registar rapidamente 10 eventos dinârnicos, tais como partículas que fluem num fluido. De preferênci-a, a intensidade do pico de luz é determinada pela detecção da intensidade da luz de um limite pré-determinado no volume da representação ern 3D. 15 Uma prime ra aplicação dessa deterníinação do ponto de focalização é um processo para contar partículas esferóides num rneio que flui. Nesse processo, o número da intensidade do pico de luz corresponde ao número de partículas esferóides na amostra. Uma vantagem deste 20 processo de contagem consiste no facto da área de luz focada ser muito menor do que a dimensão da partícula, de tal modo que,, mesmo no caso de uma elevada densidade de partículas, os picos de luz serão facilmente resolvidos e bem separados. Esta é uma vantagem-chave em relação ao 25 processo de contagem de sobreposição de partículas numa representação em 2D. A contagern de partículas utiliza apenas a detecção dos picos, mas outras características do pico de luz, tais como forma, intensidade e posição, podem também ser 30 utilizadas com vantagem. Essas informações são característ'icas das lentes equivalentes a cada partícula. Essas características das lentes são elas próprias determinadas pela forma geométrica e o índice de refracção das partículas. 35 Por exemplo, as bolhas de gás num líquido irão actuar como lentes divergentes, dando origem a pontos focais à frente das bolhas, contrariamente a partículas corn um

- .. -

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elevado índice de refracção que vão actuar como lentes convergentes, dando origem a urn ponto focal atrás da partícula.

Por isso, num processo preferido, ' as partículas são classificadas de acordo com a posição 0

5 relativa da correspondente área do pico de Iuz.

Esta classificação permite discriminar com facilidade entre . classes diferentes de partículas tais como bolhas e partículas com índice de refracção elevado.

Por índice de refracçã_o elevado, ou bai_xo, entende-se, no 10 presente docurnento, respectivamente, índice de refracção mais elevado ou menos elevaclo do que o índice de refracção do meio circundante das partículas.

Como outro exemplo de partículas que diferem nas suas propriedades ópticas, demonstrou-se, surpreendentemente, 15 que o processo da presente invençào foi capaz de discriminar entre células vivas e mortas que fluem num meio líquido, com base nas características dos pi.cos de luz que correspondem às células.

No exemplo experimental que se mostra a seguir, tal como 20 na fig. 5, a dimensão do pico foi utilizada como critério de discríminação (isto é, o volume ou a área em que a intensidade da luz é superior à do limite). Também se verificou que se podem utilizar outros critérios, tais como intensidade absoluta do pico (isto é, a intensidade 25 máxima ou a intensídade integral da luz dentro do pico). Como o processo pode ser facílmente automatizado e m realízado automaticamente em séries de tempo consecutivas, o processo da presente invenção pode ser ;"_" " utilizado, com vantagem, para estudar a deslocação de 30 células individuais.

Ainda como uma aplicação dinâmica da presente invenção, podem estudar-se processos de secagem por pulverização, utilizando . várías características do pico.

Nesses estudos, as partículas pulverizadas são contadas pelo 35 processo aqui descrito antes, os seus movimentos individuais no fluxo podem ser determinados com preci-são, a dimensão das partículas, errt função do tempo, pode ser

.

— 0' ||j a: V 9 )4 " f ' " " " "" " ' " """ g ' determinada si-multaneamente por análise da partícula reconstruída (imagem "no foco") e pode calcular-se a concentração da solução a partir do índice de refracção das partículas, determinado a partir da correlação entre 5 a form.a da partícula e a posição do pico de intensidade de luz na área focal. Uma das vantagens trazida por este método seria, por exemplo, a capacidade de determinar o fenómeno de super-saturação e os correspondentes processos de nucleação e crescimento. 10 Outra aplícação vantajosa da determinação do ponto focal de objetos transparentes consiste na determinação precísa de parâmetros geométricos de gotículas líquídas numa superfície plana transparente. Esses parâmetros geométricos podem então ser utilizados para calcular com 15 precisão, por exemplo, ângulos de contacto. De uma forma mais geral, os parâmetros que se seguem podem ser de interesse: número de picos, formas dos picos e dimensões dos picos, intensidades dos picos (integral e/ou valor máximo), posições relativas a partir das 20 partículas correspondentes. Esses parârnetros dos picos podem ser correl-acíonados, corn vantagern, com a forma e a posição da partícula correspondente. As correlações com dados de fluorescência 25 correspondentes, originados nas partículas podem taInbém ser utilizadas com vantagem para caracterizar as partículas. Essa correlação de fluorescência pode utilizar o processo descrito no documento US 2004/156098 que é incorporado aqui como referência. 30 A partir destes parâmetros, podem ser inferidas, com vantagem, as características que se seguem: viabilidade de células vivas, concentração de solução, tipo de 'células, movimento de partículas, etc.

EXEMPLO 35 Têm-se caracterizado culturas de células utilizando o processo da presente invenção. Utilizou-se um inicroscópio, tal como representado ria fig.

I· d

V

10

3 para registar hologramas digitais.

A taxa de amostragem do holograma foi de 2,5 Hz e fizeram-se 200 hologramas numa sequência.

Tal como representado na fig. 1, o suporte da amostra 4 5 foi uma célula num fluxo em que as amostras líquidas no fluxo 8 e as partículas foram observadas dinamicamente.

A figura 4a representa uma imagem reconstruída de um dos _registos holográficos obtidos.

A figura -4b- rep-resenta -a projecção correspondente dos picos de focalização.

Pode- lO se ver na fig. 4b, que mesmo que as células em contacto estejam bem resolvidas quando se considera o pico de luz em vez da representação correspondente das células.

É de notar que para facilidade de representação, os picos têm sido representados a duas dimensões.

Na representação real, eles estão resolvidos em profundidade.

O número de células, conforme determinado pelo presente processo, foi de 3,72 milhões de células/mL.

Em comparação, num Bürker de contagem de células foi de 3,71 milhões de células/mL.

Esta concordância muito boa foi confirmada mesmo no caso de concentrações de células muito elevadas.

Neste último caso, os processos de contagem automatizados usuais dão resultados pouco precisos.

Numa outra experiência, o processo da presente invenção foi utilizado primeiro para contar o número de células numa cultura.

Numa segunda etapa, submeteu-se o meio de cultura a um tratamento térmico de 3 h, a 42,5 °C.

Esse tratamento é conhecido por reduzir a viabilidade das células.

A distribuição da dimensão dos picos de luz observados foi então determinada antes e depois do tratamento térmico.

Os resultados estão ilustrados na fig. 5.Como se pode ver nessa figura, a distribuição da dimensão dos picos está fortemente correlacionada com a viabilidade das células.

Claims

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REIVINDICAÇÕES 1, Processo para a caracterização de objetos transparentes em um meio transparente, ditos os referidos 'objetos transparentes (2,3) apresentam uma área Óptica m 5' focal (5,6), em que o referido processo é çaracterizado pelo fato de compreender as etapas de: q iluminação de uma amostra que compreende os objetos (2,3) que vão ser caracterízados por meio de uma fonte de .. luz direccional (7), induzindo assim picos de intensidade 10 'de luz (5,6) na área focal dos referidos objetos transparentes; determinação de pelo menos uma característica dos picos de intensidade de luz induzidos (5,6), determinação, de pelo menos uma propriedade dos referidos 15 objetos (2,3), a partir de pelo menos uma das características dos picos de intensidade de luz (5,6).

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de cornpreender ainda as etapas de: 20 - registro de uma representação holográfica da amostra iluminada; - reconstrução, a partir da referida representação holográfica, de uma representação tridimensional da intensidade do campo de luz induzida pela referida 25 amostra; rastreio da representação tridimensional da 0 intensidade do campo de luz para a determinação dos picos de intensidade de luz (5,6) que apresentam uma 0 intensidade superior a um limite pré-determinado, 30 correspondendo cada um dos referidos picos de luz (5,6) a um objeto (2,3).

3, Processo, de acordo com a reivíndicação 2, caracterizado pelo fato de se obter a representação holográfica por meio de um microscópio holográfico. 35

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o referído microscópio funcionar de acordo com um modo diferencial.

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5. Processo, de acordo corri a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de o referido rnicroscópio funcionar num modo de campo escuro.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das 5 reivindicações de 3 a 5, caracterizado pelo fato de a referida fonte de luz ser parcialmente coerente.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o referido microscÓpio ser operado em relação aos eixos. IO

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de pelo rnenos uma característica das partículas compreender c) número dos referidos objetos.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das 15 reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de os referidos objetos se seleccionarem no grupo que consiste em bolhas de gás, vesículas líquidas numa em-ulsão, pérolas sólidas, células vivas, células mortas e as respectivas misturas. 20

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado. pelo ütQ de os referidos objetos se seleccionarem no grupo que consiste em células vivas, células mortas e as suas misturas.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de se determinar pelo menos uma característica do pico, sendo a referida característica do pico seleccionada no grupo que consiste em distância entre o pico de intensidade de luz e o objeto correspondente, área do pico de intensidade de 30 luz e intensidade do pico de intensidade de luz.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a referida caracteristica do pico ser utilizada para classificar os referidos objetos ern pelo menos dois subconjuntos de objetos. 35 13. E'rocesso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de um subconjunto de objetos corresponder a células vivas e um segundo subconjunto de

~ 3 b p A 0, objetos corresponder a células rnortas.

14. Processo, de acordo corn qualquer urna das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de o referido proce"so de caracterização ser realizado 5 dinamicamente numa representação holográfica sucessiva.

15. Programa de computador, aravado num meio que pode ser lido por computador, para a contagem de objetos transparentes, que apresentam uma área focal óptica numa representação holográfica digital de urna - amostra 10 transparente que contenha os referidos objetos, caracterizado pelo fato de o referido programa de computador, quando carregado num computador, deterrnínar o número de picos de intensidade de luz na representação holográfica.

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