BR112019023568A2

BR112019023568A2 - Conjugado de isotretinoína e peptídeo

Info

Publication number: BR112019023568A2
Application number: BR112019023568-0A
Authority: BR
Inventors: Ji Chung Yong; Mi Kim Eun
Original assignee: Caregen Co., Ltd.
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-06-02
Also published as: US11351266B2; EA201992544A1; WO2018208124A2; US20200246473A1; EP3613438A2; AU2018264739A1; EP3613438A4; US20220265840A1; JP2020519622A; US12005123B2; WO2018208124A3; MX2019013467A; PH12019502514A1; CN110612125B; KR20180124411A; CA3063268A1; AU2018264739B2; SA519410507B1; CN110612125A; CA3063268C

Abstract

a presente invenção refere-se a um composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína está ligada a um peptídeo por meio de uma ligação covalente e a uma composição farmacêutica ou cosmética antibiótica, anti-inflamatória ou antioxidante que o compreende. um composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína está ligada a um peptídeo por meio de uma ligação covalente, de acordo com a presente invenção, exibe excelente atividade fisiológica, tal como ações antibióticas, anti-inflamatórias ou antioxidantes, assim como tem propriedades extraordinárias, tais como solubilidade em água etc., e, desse modo, pode encontrar aplicações úteis em vários campos, incluindo medicamentos, cosméticos etc.

Description

CONJUGADO DE ISOTRETINOINA E PEPTÍDEO

Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um composto que tem uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente e ao seu uso.

Técnica Antecedente

[0002] A isotretinoina (ácido 13-cis-retinóico), que é um fármaco oral usado principalmente para tratar a acne, é conhecida como um dos fármacos mais eficazes para a acne, especialmente a acne nodulocística muito grave, visto que inibe toda a secreção de sebo, o comedão e as bactérias da acne Propíoníbacteríum acnes e a hiperceratose pilar e tem efeitos anti-inflamatórios (Patente Coreana Exposta No. 2002-0033751). Além disso, a isotretinoina é raramente usada para a prevenção ou o tratamento de certos cânceres de pele, tais como o carcinoma de células escamosas, ou outros cânceres, e pode ser usada para tratar a ictiose arlequim e a ictiose lamelar, que são uma das doenças fatais da pele. A isotretinoina é um retinóide associado à vitamina A, que é naturalmente encontrado no corpo em pequenas quantidades, e seu isômero tretinoína também é um agente terapêutico para a acne.

[0003] Tem sido relatado que o mecanismo de ação da isotretinoina trata os sintomas da acne normalizando o processo de ceratinização do epitélio folicular pequeno, reduzindo o número de sebócitos ao mesmo tempo reduzindo a síntese do sebo e reduzindo a Propíoníbacteríum acnes, um microrganismo que causa inflamação da acne. Visto que a isotretinoina é solúvel em gordura, a sua solubilidade em

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2/35 água é baixa, a sua absorção é aumentada quando ingerida com alimentos e a sua biodisponibilidade em jejum é cerca de 20%. Tem sido relatado que o tempo para atingir a maior concentração sanguínea após a administração oral é cerca de 2-4 horas e, em 6 horas após a administração, a concentração sanguínea do metabólito ativo 4-oxoisotretinoína é maior que a concentração sanguínea de isotretinoína (SK Yang et al., J. Kor. Pharm. Sci., Vol. 37, No. 4, 255-261, 2007) .

[0004] No entanto, o uso dessa isotretinoína pode causar efeitos colaterais, como a esfoliação da pele, a dermatite, a aspereza da pele, o prurido e a fraqueza da pele, que podem causar desconforto significativo após a aplicação na pele e, portanto, os usuários com uma pele sensível costumam ser danificados ao usar tal composto. Além disso, visto que a isotretinoína tem uma baixa solubilidade em água, é necessário adicionar vários solventes orgânicos para solubilizá-la, o que pode contribuir para a inconveniência da composição que contém isotretinoína.

[0005] Portanto, é necessário o desenvolvimento de novos compostos que possam melhorar os problemas da isotretinoína, como descrito acima, em particular uma baixa solubilidade em água, e que possam aumentar ainda mais a eficácia fisiológica da isotretinoína.

DIVULGAÇÃO

Problema Técnico

[0006] A presente invenção é para melhorar os problemas da isotretinoína convencional, como descrito acima, e é um objetivo técnico da presente invenção

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3/35 proporcionar uma substância que exiba atividade fisiológica idêntica ou superior em comparação com a do caso onde a isotretinoina natural está presente sozinha, ao mesmo tempo tendo excelentes propriedades como uma solubilidade em água.

Solução Técnica

[0007] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção proporciona um composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente.

[0008] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o peptídeo pode consistir na sequência de 2 a 30, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 8 a 15, mais preferivelmente 10 a 12 aminoácidos, porém não está limitado a isso.

[0009] De acordo com outra modalidade da presente invenção, o peptídeo é preferivelmente, porém não limitado a, um peptídeo solúvel em água. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, é preferido que a proporção de aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofílica no peptídeo solúvel em água seja tão alta quanto 50% ou mais, preferivelmente 60% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais e mais preferivelmente 100%. De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, o aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica no peptídeo solúvel em água está presente em 5 ou menos, preferivelmente 4 ou menos, mais preferivelmente 3 ou menos, mais preferivelmente 2 ou menos, mais preferivelmente 1 ou menos e mais

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4/35 preferivelmente nenhum.

[0010] De acordo com outra modalidade da presente invenção, o peptídeo pode ser um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, porém não está limitado a isso.

[0011] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica antibiótica, antiinflamatória ou antioxidante compreendendo qualquer um dos compostos como descritos acima.

[0012] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição cosmética antibiótica, antiinflamatória ou antioxidante compreendendo qualquer um dos compostos como descritos acima.

[0013] De acordo com uma modalidade da presente invenção, a composição cosmética pode ter a formulação, tal como um amaciante da pele, uma loção para nutrição, um creme para nutrição, um creme para massagem, uma essência, um creme para os olhos, um creme de limpeza, uma espuma de limpeza, uma água de limpeza, uma compressa, um spray, um pó, um tônico capilar, um creme para os cabelos, uma loção para os cabelos, um xampu para os cabelos, um enxágue para os cabelos, um condicionador para os cabelos, um spray para os cabelos, um aerossol para os cabelos, uma pomada, um sol-gel, uma emulsão, um óleo, uma cera e um aerossol, porém não está limitado a isso.

Efeitos Vantajosos

[0014] O composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente, de acordo com a presente invenção, exibe excelentes atividades fisiológicas, tais

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5/35 como ações antibióticas, anti-inflamatórias ou antioxidantes, assim como tem propriedades extraordinárias, tais como solubilidade em água e similares e, desse modo, pode ser utilizado em vários campos, como medicamentos, cosméticos e similares.

Descrição dos Desenhos

[0015] A Fig. 1 é uma fotografia que mostra a solubilidade dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína em água.

[0016] As Figs. 2A e 2B são fotografias de RTPCR e Western Blot mostrando o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a expressão de genes associados à sinalização de formação de sebo expressos em sebócitos.

[0017] As Figs. 3A e 3B são fotografias de RTPCR e de coloração com Oil Red O mostrando o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a expressão de genes associados à lipogênese nos pré-adipócitos 3T3 LI.

[0018] A Fig. 4 é uma fotografia de eletroforese de RT-PCR mostrando o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a expressão de genes associados à inflamação nos queratinócitos HaCaT.

[0019] A Fig. 5 é uma fotografia eletroforética e um gráfico mostrando o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a atividade da metaloproteinase de matriz (MMP) nos queratinócitos HaCaT.

[0020] A Fig. 6 é um gráfico que mostra o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre o teor de espécies reativas

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6/35 intracelulares de oxigênio em sebócitos.

[0021] A Fig. 7 é um gráfico que mostra o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a liberação de glicerol livre nos préadipócitos 3T3 LI.

[0022] As Figs. 8A e 8B são fotografias de RTPCR e de coloração com Oil Red O mostrando o efeito dos compostos de acordo com a presente invenção e da isotretinoína sobre a expressão de genes associados à lipólise nos pré-adipócitos 3T3 LI.

Melhor Modo

[0023] A fim de atingir o objetivo acima mencionado, a presente invenção proporciona um composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptideo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente.

[0024] A isotretinoína representa um ácido 13cis-retinóico tendo uma estrutura química representada pela seguinte fórmula química:

Fórmula química

[0025] Como usado neste documento, o termo peptideo refere-se a uma molécula linear que é formada pela ligação dos aminoácidos entre si por meio de uma ligação peptídica. Os peptídeos podem ser preparados de acordo com métodos convencionais de síntese biológica ou

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7/35 química conhecidos na técnica, em particular as práticas de síntese em fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-54 (1963); Stewart et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co. Rockford, 111 (1984)).

[0026] O peptídeo é preferivelmente para aumentar a solubilidade em água da isotretinoína e, nesse aspecto, o peptídeo é preferivelmente, porém não limitado a, um peptídeo solúvel em água. De acordo com uma modalidade da presente invenção, o peptídeo pode consistir na sequência de 2 a 30, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 8 a 15, mais preferivelmente 10 a 12 aminoácidos. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, é preferido que a proporção de aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofílica no peptídeo seja tão alta quanto 50% ou mais, preferivelmente 60% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais e mais preferivelmente 100%. Por outro lado, é preferido que a proporção de aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofóbica no peptídeo seja tão baixa quanto menos do que 50%, preferivelmente 40% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos, mais preferivelmente 20% ou menos, mais preferivelmente 10% ou menos e mais preferivelmente 0%. Como usado neste documento, o termo aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofílica representa, porém não está limitado à, arginina (Arg), histidina (His), lisina (Lys), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), serina (Ser), treonina (Thr), asparagina (Asn), glutamina (Gin), cisteína (Cys), selenocisteína (See), glicina (Gly) e prolina (Pro); o termo aminoácidos

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8/35 tendo uma cadeia lateral hidrofóbica representa, porém não está limitado à, alanina (Ala), valina (Vai), isoleucina (lie), leucina (Leu), metionina (Met), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) e triptofano (Trp) ; e, além dos aminoácidos presentes na natureza como descritos acima, as suas modificações podem ser usadas sem limitação. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, os aminoácidos tendo a cadeia lateral hidrofóbica no peptídeo estão presentes em 5 ou menos, preferivelmente 4 ou menos, mais preferivelmente 3 ou menos, mais preferivelmente 2 ou menos, mais preferivelmente 1 ou menos e mais preferivelmente nenhum. De acordo com uma modalidade da presente invenção, o peptídeo é preferivelmente, porém não está limitado a, um peptídeo que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 a 4.

[0027] De acordo com uma modalidade da presente invenção, os compostos da presente invenção podem ter excelente solubilidade em água (ver a Fig. 1) e reduzir também notavelmente a expressão de genes e proteínas de sinalização associados à formação de sebo (ver as Figs. 2A e 2B). De acordo com outra modalidade da presente invenção, os compostos da presente invenção podem reduzir notavelmente a expressão de genes associados à lipogênese e reduzir também o acúmulo de gordura nas células em uma forma dependente da concentração (ver as Figs. 3A e 3B). De acordo com outra modalidade da presente invenção, os compostos da presente invenção podem reduzir notavelmente a expressão de genes associados à inflamação e formação de rugas na pele e à formação de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ver as Figs. 4 a 6). De acordo

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9/35 com outra modalidade da presente invenção, foi confirmado que, além dos efeitos do tratamento da acne da isotretinoína, como conhecidos na técnica, os compostos da presente invenção podem não apenas aumentar notavelmente a liberação de glicerol devida à lipólise e à expressão de genes associados à lipólise, como também reduzir o acúmulo de gordura nas células (Figs. 7, 8A e 8B).

[0028] O composto da presente invenção tem excelente estabilidade em si mesmo, porém pode melhorar ainda mais a estabilidade modificando qualquer aminoácido que constitua o peptídeo ligado ao composto. De acordo com uma modalidade da invenção, a extremidade de N do peptídeo pode ser combinada com o grupo protetor selecionado do grupo que consiste em grupo acetila, grupo fluorenilmetóxi carbonila, grupo formila, grupo palmitoíla, grupo miristila, grupo estearila e polietileno glicol (PEG), para melhorar ainda mais a estabilidade. De acordo com outra modalidade da invenção, o peptídeo pode ser combinado com o grupo protetor selecionado do grupo que consiste em grupo acetila, grupo fluorenilmetóxi carbonila, grupo formila, grupo palmitoíla, grupo miristila, grupo estearila e polietileno glicol (PEG), para melhorar ainda mais a estabilidade.

[0029] As modificações de aminoácidos como descrito acima atuam para melhorar muito a estabilidade dos compostos da presente invenção. Como utilizado neste documento, o termo estabilidade é usado como um significado que inclui não apenas a estabilidade in vivo, como também a estabilidade in vitro, tal como a estabilidade no armazenamento (por exemplo, estabilidade no

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10/35 armazenamento na temperatura ambiente). Além disso, o grupo protetor mencionado acima atua para proteger os compostos da presente invenção contra o ataque de uma enzima de clivagem de proteínas in vivo e in vitro.

[0030] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição antibiótica, anti-inflamatória ou antioxidante compreendendo o composto como um ingrediente ativo. De acordo com outra modalidade da presente invenção, a presente invenção proporciona uma composição para melhorar a condição da pele, compreendendo o composto como um ingrediente ativo. Na presente invenção, a composição pode estar na forma de uma composição farmacêutica ou composição cosmética, porém não está limitada a elas. Além disso, de acordo com uma modalidade da presente invenção, as condições da pele melhoradas pelos compostos da presente invenção podem ser acne melhorada, ruga melhorada, elasticidade da pele melhorada, envelhecimento da pele evitado, hidratação da pele melhorada, feridas removidas ou feridas regeneradas, porém não estão limitadas a isso.

[0031] Uma vez que a composição da presente invenção compreende o composto da presente invenção como descrito acima como um ingrediente ativo, o teor comum entre os dois é omitido, a fim de evitar complexidade excessiva do presente relatório descritivo.

[0032] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a composição da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo: (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz do composto da presente invenção como descrito acima; e (b) um veículo farmaceuticamente

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11/35 aceitável.

[0033] Como utilizado neste documento, o termo uma quantidade farmaceuticamente eficaz significa uma quantidade suficiente para atingir a eficácia ou a atividade do composto da invenção como descrito acima.

[0034] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis compreendidos na composição farmacêutica da presente invenção são aqueles convencionalmente usados na formulação e incluem, porém não estão limitados à, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, metilcelulose, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um lubrificante, um agente umedecedor, um adoçante, um agente aromatizante, um emulsificante, um agente de suspensão, um conservante e similares, além dos ingredientes como descritos acima. Os veículos e os agentes farmaceuticamente aceitáveis adequados são descritos em detalhe em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a. ed., 1995).

[0035] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada em uma forma de dose unitária formulando o composto da presente invenção com um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, de acordo com métodos que podem ser facilmente executados por aqueles versados na técnica, ou preparada incorporando-o em um recipiente de doses múltiplas. Em que a formulação pode estar na forma de uma solução, suspensão ou emulsão em um

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12/35 meio oleoso ou aquoso, ou na forma de um extrato, um pó, um grânulo, um comprimido, uma cápsula ou um gel (por exemplo, um hidrogel) e pode ainda compreender um agente dispersante e/ou um estabilizador.

[0036] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada de modo oral ou parenteral na administração clínica e usada na forma de formulação farmacêutica geral. Ou seja, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em uma variedade de formulações orais e parenterais na administração clínica real e é preparada usando diluentes ou excipientes, tal como uma carga, um diluente, um aglutinante, um agente umedecedor, um agente desintegrante e um tensoativo, que normalmente são usados quando formulados. As formulações sólidas para administração oral incluem um comprimido, uma pílula, um pó, um grânulo, uma cápsula e semelhantes, e essas formulações sólidas são preparadas misturando pelo menos um excipiente, tal como o amido, o carbonato de cálcio, a sacarose ou a lactose e a gelatina, com o extrato de ervas ou o produto de fermentação de ervas. Além de excipientes simples, também são utilizados lubrificantes, como o estearato de magnésio e o talco. As formulações líquidas para administração oral incluem uma suspensão, uma solução para uso interno, uma emulsão e um xarope e semelhantes, e podem incluir vários excipientes, tais como um agente umedecedor, um adoçante, um agente aromatizante, um conservante e semelhantes, além dos diluentes simples comumente usados, como a água e a parafina líquida. As formulações para administração parenteral incluem uma solução aquosa estéril, uma solução

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13/35 não aquosa, uma suspensão, uma emulsão, uma formulação liofilizada e um supositório. Como o solvente não aquoso e solvente de suspensão, podem ser utilizados o propileno glicol, o polietileno glicol, os óleos vegetais, tais como o azeite de oliva, os ésteres injetáveis, tais como o oleato de etila, e similares. Como a base do supositório, podem ser utilizados o witepsol, o macrogol, o tween 61, a manteiga de cacau, a laurina, o glicerol, a gelatina e similares.

[0037] A unidade de dosagem pode conter, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 vezes, ou 1/2, 1/3 ou 1/4 vez a dosagem individual. As dosagens individuais contêm uma quantidade na qual um fármaco ativo é administrado ao mesmo tempo e normalmente correspondem a todas, 1/2, 1/3 ou 1/4 vez a dose diária.

[0038] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada em uma forma de dose unitária formulando o composto da presente invenção com um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, de acordo com métodos que podem ser facilmente executados por aqueles versados na técnica, ou preparada incorporando-o em um recipiente de doses múltiplas. Em que a formulação pode estar na forma de uma solução, suspensão ou emulsão em um meio oleoso ou aquoso, ou na forma de um extrato, um pó, um grânulo, um comprimido, uma cápsula ou um gel (por exemplo, um hidrogel) e pode ainda compreender um agente dispersante e/ou um estabilizador.

[0039] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a composição da presente invenção pode ser uma composição cosmética compreendendo: (a) uma

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14/35 quantidade cosmeticamente eficaz do composto da presente invenção como descrito acima; e (b) um veículo cosmeticamente aceitável.

[0040] Como utilizado neste documento, o termo uma quantidade cosmeticamente eficaz significa uma quantidade suficiente para atingir a eficácia de melhoria da pele da composição da presente invenção, como descrito acima.

[0041] A composição cosmética da presente invenção também pode ser preparada em quaisquer formulações convencionalmente preparadas na técnica e pode ser formulada em, por exemplo, uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma pasta, um gel, um creme, uma loção, um pó, um sabão, um agente de limpeza contendo tensoativo, um óleo, uma base de pó, uma base de emulsão, uma base de cera, um spray e semelhantes, porém não está limitada a eles. Mais especificamente, ela pode ser preparada em várias formas, tais como um amaciante da pele, uma loção para nutrição, um creme para nutrição, um creme para massagem, uma essência, um creme para os olhos, um creme de limpeza, uma espuma de limpeza, uma água de limpeza, uma compressa, um spray, um pó, um tônico capilar, um creme para os cabelos, uma loção para os cabelos, um xampu para os cabelos, um enxágue para os cabelos, um condicionador para os cabelos, um spray para os cabelos, um aerossol para os cabelos, uma pomada, um gel, um sol-gel, uma emulsão, um óleo, uma cera, um aerossol e similares, porém não está limitado a eles.

[0042] Quando a formulação da presente invenção for uma pasta, um creme ou um gel, podem ser utilizados o óleo animal, o óleo vegetal, a cera, a parafina, o amido, o

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15/35 tragacanto, o derivado de celulose, o polietileno glicol, o silicone, a bentonita, a silica, o talco ou o óxido de zinco e similares como o ingrediente veículo.

[0043] Quando a formulação da presente invenção for um pó ou um spray, pode ser usada a lactose, o talco, a silica, o hidróxido de alumínio, o silicato de cálcio ou o pó de poliamida como o ingrediente veículo e, em particular, no caso de um spray, um propulsor, tal como o cloroflúor-hidrocarboneto, o propano/butano ou o éter dimetílico, pode ser adicionalmente incluído, porém não está limitado a eles.

[0044] Quando a formulação da presente invenção for uma solução ou uma emulsão, é usado um solvente, um solubilizador ou um emulsificante como o ingrediente veículo e, por exemplo, a água, o etanol, o isopropanol, o carbonato de etila, o acetato de etila, o álcool benzílico, o benzoato de benzila, o propileno glicol, o óleo de 1,3butilglicol, o éster alifático de glicerol, o polietileno glicol ou o éster de ácido graxo de sorbitan pode ser utilizado, porém não está limitado a eles.

[0045] Quando a formulação da presente invenção for uma suspensão, podem ser utilizados diluentes líquidos, tais como a água, o etanol ou o propileno glicol, agentes de suspensão, tais como o álcool isoestearílico etoxilado, o éster de polioxietileno sorbitol e o éster de polioxietilenossorbitan, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar, ou tragacanto e semelhantes como o ingrediente veículo, porém não estão limitados a eles.

[0046] Quando a formulação da presente invenção

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16/35 for um agente de limpeza contendo tensoativo, podem ser utilizados o sulfato de álcool alifático, o sulfato de éter de álcool alifático, o monoéster de ácido sulfossuccínico, o isetionato, o derivado de imidazolínio, o taurato de metila, o sarcosinato, o sulfato de éter de amida de ácido graxo, a alquilamidobetaína, o álcool alifático, o glicerídeo de ácido graxo, a dietanolamida de ácido graxo, o óleo vegetal, o derivado de lanolina ou o éster de ácido graxo de glicerol etoxilado e similares como o ingrediente veículo, porém não estão limitados a eles.

[0047] Quando a formulação da presente invenção for um xampu para os cabelos, os compostos da presente invenção são misturados com ingredientes bases para a formulação de xampus, como espessantes, tensoativos, modificadores da viscosidade, hidratantes, ajustadores de pH, conservantes, óleos essenciais e similares. O CDE pode ser usado como os espessantes; o LES, um tensoativo aniônico, e a cocobetaína, um tensoativo anfotérico, podem ser usados como os tensoativos; o polyquater pode ser usado como o modificador da viscosidade; a glicerina pode ser usada como os hidratantes; os ácidos cítricos e os hidróxidos de sódio podem ser usados como os ajustadores de pH; os extratos de toranja podem ser usados como os conservantes; além disso, podem ser adicionados óleos essenciais, tais como madeira de cedro, hortelã-pimenta, alecrim e similares, aminoácido da seda, pentaol, vitamina E. De acordo com uma modalidade da presente invenção, o composto da presente invenção como descrito acima pode ser misturado com 5 a 10 partes em peso de CDE, 30 a 40 partes em peso de LES, 10 a 20 partes em peso de cocobetaína, 0,1

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17/35 a 0,2 parte em peso de polyquarter, 5 a 10 partes em peso de glicerina, 0,1 a 1,01 parte em peso de extrato de toranja, 0,5 a 1 parte em peso de aminoácido de seda, 0,5 a 1 parte em peso de pentaol, 0,5 a 2 partes em peso de vitamina E e 0,01 a 0,1 parte em peso de qualquer um de madeira de cedro, hortelã-pimenta e alecrim como óleos essenciais, com base em 100 partes em peso do composto da presente invenção, porém não se limita a isso.

[0048] Os ingredientes incluídos na composição cosmética da presente invenção compreendem ingredientes convencionalmente usados em composições cosméticas, além do composto da presente invenção como um ingrediente ativo e os ingredientes veículos, e podem compreender adjuvantes convencionais, como, por exemplo, um antioxidante, um estabilizador, um solubilizador, uma vitamina, um pigmento e um perfume, porém não estão limitados a eles.

EXEMPLOS

[0049] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhe através de exemplos.

[0050] No entanto, os exemplos a seguir são apenas para ilustrar a presente invenção, e o conteúdo da presente invenção não está limitado aos exemplos a seguir.

Exemplo 1. Síntese dos Compostos da Presente Invenção <1 —1> Síntese dos Peptídeos de SEQ ID NO: 1 [0051] 700 mg de resina de cloreto de clorotritila (resina de CTL; Nova biochem [0064] Cat No. 01-64-0021) foram colocados em um vaso de reação e, em seguida, 10 ml de cloreto de metileno (MC) foram adicionados a ele e agitados por 3 minutos. Após remoção da solução, 10 ml de dimetilformamida (DME) foram adicionados

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18/35 a ele e agitados por 3 minutos e, depois, o solvente foi removido novamente. 10 ml de uma solução de diclorometano foram colocados no reator e, subsequentemente, 200 mmol de Fmoc-Met-OH (Bachem, Suíça) e 400 mmol de diisopropiletilamina (DIEA) foram colocados nele e agitados para serem bem dissolvidos e então a reação foi realizada com agitação por 1 hora. Após a conclusão da reação, a lavagem foi realizada e o metanol e a DIEA (2:1) foram dissolvidos em diclorometano (DCM) e reagidos por 10 minutos, e então a lavagem foi realizada com um excesso de DCM/DMF (1:1) . Depois disso, a solução foi removida, 10 ml de dimetilformamida (DMF) foram colocados nela e agitados por 3 minutos e, em seguida, o solvente foi removido novamente. 10 ml de uma solução de desproteção (20% de piperidina/DMF) foram colocados no vaso de reação e agitados na temperatura ambiente, por 10 minutos, e, em seguida, a solução foi removida. Posteriormente, a mesma quantidade de solução de desproteção foi colocada nele para manter a reação por 10 minutos novamente e, em seguida, a solução foi removida e a lavagem foi realizada duas vezes com DMF, uma vez com MC e uma vez com DMF por 3 minutos, respectivamente, para dar as resinas de Met-CTL.

[0052] 10 ml de uma solução de DMF foram colocados em um novo reator e 200 mmol de Fmoc-Val-OH (Bachem, Suíça) , 200 mmol de HoBt e 200 mmol de Bop foram colocados nele e depois bem dissolvidos por agitação. 400 mmol de DIEA foram colocados no reator duas vezes em frações e agitados por pelo menos 5 minutos até todos os sólidos se dissolverem. A solução da mistura de aminoácidos dissolvida foi colocada no vaso de reação contendo as

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19/35 resinas desprotegidas e reagiu-se com agitação na temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi removida e agitada três vezes a cada 5 minutos com uma solução de DMF e depois removida. Uma pequena quantidade da resina reagida foi coletada e o grau de reação foi verificado usando um teste de Kaiser (Teste de Ninidrina). A reação de desproteção foi realizada duas vezes, como descrito acima, com a solução de desproteção para preparar uma resina de Val-Met-CTL. A resina foi suficientemente lavada com DMF e MC e submetida ao teste de Kaiser mais uma vez para realizar uma experiência de ligação de aminoácidos abaixo na mesma forma como descrito acima.

[0053] Com base nas sequências de aminoácidos selecionadas, a reação em cadeia foi realizada na ordem de Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf) e Fmoc-Arg(Pbf). O grupo protetor de Fmoc foi reagido duas vezes com uma solução de desproteção durante 10 minutos e depois bem lavado e removido. Após o anidrido acético, a DIEA e o HoBt serem colocados nele para realizar a acetilação por 1 hora, a resina de peptidila preparada foi lavada três vezes com

DMF, MC e metanol, respectivamente, e seca fluindo lentamente ar com nitrogênio e depois completamente seca sob vácuo em pressão reduzida sobre P2O5, 30 ml de uma solução de saída (95% de ácido trifluoracético, 2,5% de água destilada e 2,5% de tioanisol) foram colocados nela e a reação foi mantida por 2 horas enquanto se agitava ocasionalmente na temperatura ambiente. A resina foi filtrada por filtração e lavada com um pequeno volume de

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20/35 solução de TEA e depois foi combinada com o licor mãe. A destilação foi realizada utilizando uma pressão reduzida, de modo que o volume total permanecesse na metade, e foram adicionados 50 ml de éter gelado para induzir a precipitação, a qual centrifugou para coletar o precipitado e lavada mais duas vezes com éter gelado. Após remover o licor mãe e secar suficientemente sob uma atmosfera de nitrogênio, foi sintetizado 1,49 g do peptideo prépurificado NRRLIDRTNANFLVM (SEQ ID NO: 1) (rendimento: 86,5%). O peso molecular de 1719,1 (valor teórico: 1719,2) foi obtido quando medido usando o instrumento de medição de peso molecular.

Tabela 1

SEQ ID NO	Sequência de Aminoácidos	Valor Analítico (Espectrofotômetro de Massa)
Valor Analítico	Valor Teórico
1	RRLIDRTNANFLVM	1719,1	1719,2

<l-2> Síntese dos Compostos da Presente Invenção [0054] O peptideo desprotegido (1 mmol) e 10 ml de dimetilformamida (DMF) foram colocados em um reator de peptideo e, em seguida, 270 mg (2,0 equivalentes) de 1hidroxibenzotriazol (HOBt), 1,04 g (2,0 equivalentes) de hexafluorfosfonato de (benzotriazol-1ilóxi)tripirrolidinopostpônio (PyBOP) e 277 mg (2,0 equivalentes) de isotretinoína foram adicionados a ele e reagidos por 30 minutos. 388 mg (3 equivalentes) de N,N-diisopropiletilamina (DIEA) foram adicionados a ele e reagidos na temperatura ambiente por 2 a 4 horas, e depois a recristalização foi realizada usando 10 ml (10 mmol) de

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21/35 éter dietílico e a filtração foi realizada para obter um peptídeo híbrido.

Exemplo Experimental 1. Teste de Solubilidade dos Compostos da Presente Invenção

[0055] O composto de isotretinoína-peptídeo preparado no Exemplo <l-2> acima e a isotretinoina foram dissolvidos em água destilada a uma concentração de 10 mg/ml, respectivamente.

[0056] Como resultado, em contraste com a isotretinoina propriamente dita que dificilmente é dissolvida em água, foi confirmado que o composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção foi completamente dissolvido em água (Fig. 1).

Exemplo Experimental 2. Efeito Inibidor dos Compostos da Presente Invenção sobre a Expressão de Genes de Sinalização Formadores do Sebo

[0057] A análise por RT-PCR foi realizada para confirmar o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a expressão de genes de sinalização associados à formação de sebo. Especificamente, os sebócitos foram estimulados por tratamento com 100 μΜ de ácido araquidônico como um estimulante, subsequentemente tratados com 1 ou 10 μΜ de composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção ou isotretinoina, e cultivados por 24 horas, e então o RNA foi isolado das células cultivadas na forma descrita abaixo, e o efeito dos compostos sobre a expressão das moléculas sinalizadoras cEBPa, PPARy e SREBPlc, envolvidas na formação do sebo, foi confirmado usando os primers descritos na Tabela 2 abaixo. O kit de extração de RNA (kit

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Qiagen RNeasy) foi usado para extrair o RNA total das células e, em seguida, 3 pg de RNA, 2 pg de hexâmero aleatório e água tratada com DEPC foram adicionados a ele e reagidos a 65°C, por 5 minutos, para sintetizar o DNA de fita simples a partir do RNA. 5χ tampão de primeira fita, DTT a 0,1 M, dNTP a 10 mM e transcriptase reversa foram colocados nele para compor um total de 20 ml e reagidos a 42°C por 1 hora. Após aquecimento a 95°C por 5 minutos novamente, foram adicionados 20 ml de água destilada a ele para compor 40 ml finais de cDNA. A reação em cadeia por polimerase (PCR) foi realizada pela mistura de 10 pmol de iniciador, 10* tampão Tag, dNTP a 10 mM e i-Tag DNA polimerase, como mostrado na Tabela 2 abaixo, específicos para cada um de 3 pl de genes de cDNA, cEBPa, PPARy,

SREBPlc e GAPDH. A condição de reação da PCR foi 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55-56°C e 30 segundos a °C. Os genes do número de ciclos foram analisados sob condições nas quais os resultados da PCR podiam ser amplificados exponencialmente. 5 ml do produto de PCR obtido foram submetidos à eletroforese sobre gel de agarose a 1% e tingidos com brometo de etídio para confirmar os níveis de mRNA dos genes de sinalização formadores do sebo cEBPa, PPARy e SREBPlc.

Tabela 2

Fator	Sequência de Primers	SEQ ID NO
cEBP α	Forward	(5’	) TCGGTGGACAAGAACAGCAA	(3’ )	2
Reverse	(5’	) CCTTGACCAAGGAGCTCTCA	(3’ )	3
PPAR y	Forward	(5’	) TTCGCTGATGCACTGCCTAT	(3’ )	4
Reverse	(5’	) ACAGACTCGGCACTCAATGG	(3’ )	5
SREBPlc	Forward	(5’	) GACCGACATCGAAGGTGAAG	(3’ )	6
Reverse	(5’ )	AAGAGAGGAGCTCAATGTGGC	(3’ )	7

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GAPDH	Forward	(5’	GGAGCCAAAAGGGTCATCAT	(3’ )	8
Reverse	(5’	GTGATGGCATGGACTGTGGT	(3’ )	9

[0058] Além disso, os sebócitos foram estimulados por tratamento com as bactérias da acne Propíoníbacteríum acnes (100 pg/ml) como um estimulante, por 48 horas, posteriormente tratados com 1 ou 10 μΜ de composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção ou isotretinoina, e a expressão das proteínas de sinalização CEBPa e PPARy associadas à formação de sebo foi confirmada por análise de Western blot. Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente, de acordo com a presente invenção, pode reduzir mais notavelmente a expressão de genes e proteínas de sinalização associados à formação de sebo, mesmo em uma concentração muito mais baixa, em comparação com a isotretinoina (Figs. 2A e 2B).

Exemplo Experimental 3. Efeito Inibidor dos Compostos da Presente Invenção sobre a Lipogênese

[0059] A análise por RT-PCR foi realizada para confirmar o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a expressão de genes associados à lipogênese. Especificamente, os pré-adipócitos 3T3 LI foram inoculados em placas de 24 poços a 2><10⁴ células/poço e cultivados e depois foi feita a troca com um meio de diferenciação contendo IBMX a 0,5 mM, dexametasona a 0,25 μΜ e 1 pg/ml de insulina e as células foram cultivadas por 10 dias com 10 μΜ do composto de isotretinoína-peptídeo da presente

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24/35 invenção ou a isotretinoína e, em seguida, foram confirmados os efeitos dos compostos sobre a expressão dos genes PPARy, ACC e aP2 envolvidos na lipogênese. Para este fim, a RT-PCR foi realizada na mesma forma que no Exemplo Experimental 2 acima, exceto que os primers, como mostrado na Tabela 3 abaixo, foram utilizados como primers específicos para PPARy, ACC e aP2.

Tabela 3

Fator	Sequência de Primers	SEQ ID NO
PPAR y	Forward	(5’	TTCGCTGATGCACTGCCTAT	(3’ )	4
Reverse	(5’	ACAGACTCGGCACTCAATGG	(3’ )	5
ACC	Forward	(5’ )	GAATGTTTGGGGATATTTCAG	(3’ )	10
Reverse	(5’ )	TTCTGCTATCAGTCTGTCCAG	(3’ )	11
aP2	Forward	(5’	CATCAGCGTAAATGGGGATT	(3’ )	12
Reverse	(5’	ACACATTCGAGGAGGAGCTT	(3’ )	13

[0060] Além disso, para medir o efeito da inibição do acúmulo de gordura pelo composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, as células 3T3-L1 foram inoculadas em placas de 24 poços a 2><10⁴células/poço e cultivadas e depois foi feita a troca com um meio de diferenciação contendo 10 pg/ml de insulina, dexametasona a 0,1 μΜ e IBMX a 0,5 μΜ e as células foram tratadas com o composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção ou a isotretinoína. Posteriormente, foi feita a troca com um meio contendo 10 pg/ml de insulina a cada 2 dias, e uma análise de coloração com Oil Red O foi realizada no dia 9 de indução da diferenciação. Para este fim, as células foram lavadas com PBS e depois fixadas por tratamento com paraformaldeído a 4% por 10 minutos, lavadas com água destilada e depois incubadas com isopropanol a 60%

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25/35 por 5 a 10 minutos. As células fixas foram tingidas com solução de Oil Red [1% de Oil Red em isopropanol foi diluído em dH2O em uma razão de volume de 6:4] por 30 minutos e depois lavadas novamente com PBS. As células tingidas foram observadas sob um microscópio óptico e depois lavadas com água destilada, misturadas com 1 ml de isopropanol 100% a 4 °C e então quantificadas em um comprimento de ondas de 510 nm no dia seguinte. Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de ligação covalente, de acordo com a presente invenção, reduziu notavelmente a expressão de genes associados à lipogênese (Fig. 3A) em comparação com a isotretinoína e também diminuiu o grau de acúmulo de gordura intracelular dependente do composto (Fig. 3B) .

Exemplo Experimental 4. Efeito Inibidor dos Compostos da Presente Invenção sobre a Inflamação

[0061] A análise por RT-PCR foi realizada para confirmar o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a inflamação induzida por bactérias da acne. Especificamente, 300.000 células de queratinócitos HaCaT foram inoculadas em cada poço de placas de 6 poços e depois cultivadas em caldo de cultura DMEM (Gibco, EUA) contendo 10% de FBS, por 24 horas, sob 37°C e 5% de CO2. Após ser feita a troca com um meio novo, as células foram tratadas com 50 pg/ml de bactérias da acne (P. acnes), 50 μΜ de ácido salicílico e 10 μΜ ou 50 μΜ de CG-Dinfla, e a bactéria da acne tratada foi tratada com o composto de isotretinoína-peptídeo da

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26/35 presente invenção e a isotretinoína, usada como um grupo de controle positivo, em uma concentração de 1 ou 10 μΜ e, em seguida, cultivada por 24 horas sob as mesmas condições descritas acima e, em seguida, foram confirmados os efeitos dos compostos sobre a expressão dos genes de IFN-γ, IL-Ιβ, IL-6, IL-17A e TNF-a, envolvidos na formação da inflamação. Para este fim, a RT-PCR foi realizada na mesma forma que no Exemplo Experimental 2 acima, exceto que os primers, como mostrados na Tabela 4 abaixo, foram utilizados como primers específicos para ΙΕΝ-γ, IL-Ιβ, IL-6, IL-17A e TNF-a.

Tabela 4

Fator	Sequência de Primers	SEQ ID NO
ΙΕΝ-γ	Forward	(5’	GAGGTCAACAACCCACAGGT	(3’ )	14
Reverse	(5’	GGGACAATCTCTTCCCCACC	(3’ )	15
IL-Ιβ	Forward	(5’	TTCGACACATGGGATAACGA	(3’ )	16
Reverse	(5’	T C T T T CAACACGCAGGACAG	(3’ )	17
IL-6	Forward	(5’	AAAGAGGCAC T GCCAGAAAA	(3’ )	18
Reverse	(5’	ATCTGAGGTGCCCATGCTAC	(3’ )	19
	Forward	(5’	) GGTCAACCTCAAAGTCTTTAACTC ( Q 1 \	20
IL-17A
Reverse	(5’	) TTAAAAATGCAAGTAAGTTTGCTG (3’ )	21
TNF-a	Forward	(5’ )	AACATCCAACCTTCCCAAACG	(3’ )	22
Reverse	(5’ )	GACCCTAAGCCCCCAATTCTC	(3’ )	23

[0062] Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de ligação covalente, de acordo com a presente invenção, pode reduzir mais notavelmente a expressão de genes associados à formação de inflamação, mesmo em uma concentração muito menor, comparado à isotretinoína (Fig. 4).

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Exemplo Experimental 5. Efeito Inibidor dos Compostos da Presente Invenção sobre a Atividade da MMP

[0063] O efeito do composto de isotretinoínapeptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <12>, sobre a atividade da MMP induzida pelas bactérias da acne foi confirmado. Especificamente, os queratinócitos HaCaT foram cultivados e, em seguida, as células foram prétratadas com 1 ou 10 μΜ de composto de isotretinoínapeptídeo da presente invenção ou isotretinoína e, 30 minutos depois, tratados com as bactérias da acne (P. acnes) como um estimulante. O caldo de cultura foi coletado após 48 horas de cultura, e o caldo de cultura e o tampão de zimografia (Sigma Aldrich) foram reagidos em uma razão de 1:1 e, em seguida, 20 μΐ da solução de reação foram submetidos à eletroforese sobre gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida a 8% (SDS-PAGE) (gelatina a 10%) . Depois disso, o gel foi lavado três vezes por 10 minutos em tampão Triton X-100 a 0,1% (Sigma Aldrich), ativado em tampão TNCB (Sigma Aldrich) e tingido com azul de Coomassie e, em seguida, a intensidade da banda foi medida.

[0064] Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptideo estão ligados um ao outro por meio de ligação covalente, de acordo com a presente invenção, pode reduzir mais notavelmente a expressão do gene de MMP-9 associado à formação de rugas na pele, mesmo em uma concentração muito menor, em comparação com a isotretinoína (Fig. 5).

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Exemplo Experimental 6. Efeito Inibidor dos Compostos da Presente Invenção sobre Espécies Reativas Intracelulares de Oxigênio

[0065] Foi confirmado o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares, induzida por bactérias da acne. Especificamente, os sebócitos foram inoculados em placas de 6 poços a IxlO⁶ células/poço e cultivados durante a noite. As células foram pré-tratadas com o composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção ou a isotretinoína e, 30 minutos depois, tratadas com as bactérias da acne (P. acmes') como um estimulante, a uma concentração de 100 pg/ml, e cultivadas por 48 horas. As células foram tratadas com DCF-DH e, 30 minutos depois, a atividade oxidativa foi medida pelo grau de fluorescência usando FACS.

[0066] Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de ligação covalente, de acordo com a presente invenção, pode reduzir mais notavelmente a formação de ROS intracelulares induzida por bactérias da acne, em comparação com a isotretinoína (Fig. 6).

Exemplo Experimental 7. Efeito dos Compostos da Presente Invenção sobre a Lipólise (1)

[0067] Os adipócitos armazenam energia extra na forma de gorduras neutras nas gotículas lipídicas, porém, quando for necessária energia, eles são decompostos em ácidos graxos e glicerol por enzimas, tais como a adipose

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29/35 triglicerideo lipase, HSL, e a monoglicerideo lipase, para produzir energia ou serem usados para a sinalização celular ou a síntese de gordura. Assim, os presentes inventores efetuaram a liberação de glicerol livre e a análise do teor intracelular de triglicerol para confirmar o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a lipólise. Especificamente, as células 3T3-L1 foram inoculadas em placas de 24 poços a 2><10⁴ células/poço (DMEM, 10% de BCS) e cultivadas por 2 dias. Foi feita a troca com o meio DMEM contendo 10% de FBS e, em seguida, as células foram cultivadas por 2 dias e, além disso, cultivadas por 2 dias em DMEM (10% de FBS) contendo IBMX a 0,5 mM, dexametasona a 0,25 μΜ e 10 pg/ml de insulina. Posteriormente, as células foram cultivadas por 2 dias em DMEM (10% de FBS) contendo 1 pg/ml de insulina e, em seguida, cultivadas novamente por 3 dias em DMEM (10% de FBS) contendo 1 pg/ml de insulina. Quando foi feita a troca com o meio de FBS, as células foram tratadas com o composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção ou a isotretinoína, e o caldo de cultura foi coletado no dia 8 de diferenciação para realizar a análise de glicerol usando um kit de análise colorimétrica de glicerol (Cayman).

[0068] Como resultado, o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoína e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de ligação covalente, de acordo com a presente invenção, aumentou notavelmente a liberação de glicerol devida à lipólise, em comparação com a isotretinoína (Fig. 7).

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Exemplo Experimental 8. Efeito dos Compostos da Presente Invenção sobre a Lipólise (2)

[0069] A análise por RT-PCR e a coloração com Oil Red O foram realizadas na mesma forma descrita no Exemplo Experimental 3, para confirmar o efeito do composto de isotretinoína-peptídeo da presente invenção, sintetizado no Exemplo <l-2>, sobre a expressão de genes associados à lipólise. Em que CPTla, Acox, HSL e ATGL foram utilizados como os genes envolvidos na lipólise, e os primers, como mostrados na Tabela 5 abaixo, foram utilizados como primers específicos para os genes. No caso do TNF-α usado como um grupo de controle, o seu efeito lipolítico é em geral conhecido e ele tem a função tal como a fosforilação do fator lipolítico HSL e expressão aumentada de ATGL e, desse modo, foi utilizado como um grupo de controle para comparar os efeitos dos compostos da presente invenção.

Tabela 5

Fator	Sequência de Primers	SEQ ID NO
CPTla	Forward	(5’ )	CGTACCAAGTAGCCAAGGCA	(3’ )	24
Reverse	(5’ )	CAGGAACGCACAGTCTCAGT	(3’ )	25
Acox	Forward	(5’ )	C C G C C GAGAGAT C GAGAAC	(3’ )	26
Reverse	(5’ )	CAGTTGCCTGGTGAAGCAAG	(3’ )	27
HSL	Forward	(5’	) GGACACACACACACCTG (	3’ )	28
Reverse	(5’ )	CCCTTTCGCAGCAACTTTAG	(3’ )	29
ATGL	Forward	(5’ )	TCGTGGATGTTGGTGGAGCT	(3’ )	30
Reverse	(5’ )	TGTGGCCTCATTCCTCCTA	(3’ )	31

[0070] Como resultado, foi confirmado que o composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente, de acordo com a presente invenção, pode aumentar

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31/35 notavelmente a expressão de genes associados à lipólise, em comparação com a isotretinoína (Fig. 8A), e também reduzir o acúmulo de gordura intracelular (Fig. 8B).

Exemplo de Formulação 1. Amaciante da Pele

[0071] Um amaciante da pele compreendendo o composto da presente invenção, preparado no Exemplo <l-2> acima, e consistindo na composição abaixo foi preparado de acordo com o método geral para a preparação de loções.

Tabela 6

Ingrediente	Teor (% em peso)
Composto da presente invenção	2,5
1,3-Butileno glicol	6
Glicerina	4
PEG 1500	1
Hialuronato de sódio	1
Polissorbato 20	0,5
Etanol	8
Conservante, pigmento	quantidade adequada
Benzofenona-9	0, 05
Fragrância	quantidade muito pequena
água purificada	quantidade restante
Soma	100

Exemplo de Formulação 2. Creme para Nutrição [0072] Um creme para nutrição compreendendo o composto da presente invenção, preparado no Exemplo <l-2> acima, e consistindo na composição abaixo foi preparado de acordo com o método geral para a preparação de cremes para nutrição.

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Tabela 7

Ingrediente	Teor (% em peso)
Composto da presente invenção	2,5
Óleo de Limnanto	3
Álcool cetearílico	1,5
Ácido esteárico	1,5
Estearato de glicerila	1,5
Parafina líquida	10
Cera de abelha	2
Polissorbato 60	0, 6
Sesquioleato de sorbitan	2,5
Esqualano	3
1,3-Butileno glicol	3
Glicerina	5
Trietanolamina	0,5
Acetato de tocoferila	0,5
Conservante, pigmento	quantidade adequada
Fragrância	quantidade adequada
água purificada	quantidade restante
Soma	100

Exemplo de Formulação 3. Loção para Nutrição [0073] Uma loção para nutrição compreendendo o composto da presente invenção, preparado no Exemplo <l-2> acima, e consistindo na composição abaixo foi preparada de acordo com o método geral para a preparação de loções.

Tabela 8

Ingrediente	Teor	(% em peso)
Composto da presente invenção	2,5
1,3-Butileno glicol	4
Glicerina	4
Álcool de cetearila	0, 8
Estearato de glicerila	1
Trietanolamina	0, 13

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Acetato de tocoferila	0,3
Parafina líquida	5
Esqualano	3
Óleo de noz de macadâmia	2
Polissorbato 60	1,5
Sesquioleato de sorbitan	0,5
Polímero de carboxivinila	1
Conservante, pigmento	quantidade adequada
Fragrância	quantidade adequada
Água purificada	quantidade restante
Soma	100

Exemplo de Formulação 4. Essência

[0074] Uma essência compreendendo o composto da presente invenção, preparado no Exemplo <l-2> acima, e consistindo na composição abaixo foi preparada de acordo com o método geral para a preparação de essências.

Tabela 9

Ingrediente	Teor (% em peso)
Composto da presente invenção	2,5
Glicerina	10
1,3-Butileno glicol	5
PEG 1500	2
Alantoína	0, 1
DL-Pantenol	0,3
EDTA-2Na	0, 02
Hidroxietil celulose	0, 1
Hialuronato de sódio	8
Polímero de carboxivinila	0,2
Trietanolamina	0, 18
Octyldodeceth-16	0,4
Etanol	6
Fragrância, conservante, pigmento	quantidade adequada
Água Purificada	quantidade restante
Soma	100

Petição 870190115056, de 08/11/2019, pág. 38/58

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Disponibilidade Industrial

[0075] O composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente, de acordo com a presente invenção, exibe excelentes atividades fisiológicas, tais como ações antibióticas, anti-inflamatórias ou antioxidantes, bem como tem propriedades extraordinárias, tais como solubilidade em água e similares, e, desse modo, pode ser aplicado a vários campos industriais, tais como medicamentos ou cosméticos.

Texto da Listagem de Sequências

SEQ ID NO: 1: ArgArgLeu lie Asp ArgThrAsn Ala AsnPheLeu Vai Met

SEQ	ID	NO:	2 :	tcggtggaca agaacagca
SEQ	ID	NO:	3 :	ccttgaccaa ggagctctca
SEQ	ID	NO:	4 :	ttcgctgatg cactgcctat
SEQ	ID	NO:	5:	acagactcgg cactcaatgg
SEQ	ID	NO:	6:	gaccgacatc gaaggtgaag
SEQ	ID	NO:	7 :	aagagaggag ctcaatgtgg c
SEQ	ID	NO:	8 :	ggagccaaaa gggtcatcat
SEQ	ID	NO:	9:	gtgatggcat ggactgtggt
SEQ	ID	NO:	10 :	: gaatgtttgg ggatatttca g
SEQ	ID	NO:	11:	: ttctgctatc agtctgtcca g
SEQ	ID	NO:	12 :	: catcagcgta aatggggatt
SEQ	ID	NO:	13 :	: acacattcca ccaccagctt
SEQ	ID	NO:	14 :	: gaggtcaaca acccacaggt
SEQ	ID	NO:	15:	: gggacaatct cttccccacc
SEQ	ID	NO:	16:	: ttcgacacat gggataacga
SEQ	ID	NO:	17 :	: tctttcaaca cgcaggacag

Petição 870190115056, de 08/11/2019, pág. 39/58

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SEQ	ID	NO:	18 :	aaagaggcac	tgccagaaaa
SEQ	ID	NO:	19:	atctgaggtg	cccatgctac
SEQ	ID	NO:	20 :	ggtcaacctc	aaagtcttta	actc
SEQ	ID	NO:	21:	ttaaaaatgc	aagtaagttt	gctg
SEQ	ID	NO:	22 :	aacatccaac	cttcccaaac	g
SEQ	ID	NO:	23 :	gaccctaagc	ccccaattct	c
SEQ	ID	NO:	24 :	cgtaccaagt	agccaaggca
SEQ	ID	NO:	25:	caggaacgca	cagtctcagt
SEQ	ID	NO:	26:	ccgccgagag	atcgagaac
SEQ	ID	NO:	27 :	cagttgcctg	gtgaagcaag
SEQ	ID	NO:	28 :	ggacacacac	acacctg
SEQ	ID	NO:	29:	ccctttcgca	gcaactttag
SEQ	ID	NO:	30 :	tcgtggatgt	tggtggagct
SEQ	ID	NO:	31:	tgtggcctca	ttcctccta

Petição 870190115056, de 08/11/2019, pág. 40/58

Claims

1. Um composto tendo uma estrutura na qual a isotretinoina e um peptídeo estão ligados um ao outro por meio de uma ligação covalente.

2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo consiste na sequência de 2 a 30 aminoácidos.

3. O composto de acordo com a reivindicação 2, em que o peptídeo consiste na sequência de 8 a 15 aminoácidos.

4. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é um peptídeo solúvel em água.

5. O composto de acordo com a reivindicação 4, em que a proporção de aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofílica no peptídeo solúvel em água é 50% ou mais.

6. O composto de acordo com a reivindicação 5, em que a proporção de aminoácidos tendo a cadeia lateral hidrofílica no peptídeo solúvel em água é 70% ou mais.

7. O composto de acordo com a reivindicação 6, em que a proporção de aminoácidos tendo a cadeia lateral hidrofílica no peptídeo solúvel em água é 90% ou mais.

8. O composto de acordo com a reivindicação 5, em que os aminoácidos tendo a cadeia lateral hidrofílica são selecionados a partir do grupo que consiste em arginina (Arg), histidina (His), lisina (Lys), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), serina (Ser), treonina (Thr), asparagina (Asn), glutamina (Gin), cisteína (Cys), selenocisteína (See), glicina (Gly) e prolina (Pro).

9. O composto de acordo com a reivindicação 4, em que o aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica no peptídeo solúvel em água é 5 ou menos.

10. O composto de acordo com a reivindicação 9,

Petição 870190115056, de 08/11/2019, pág. 41/58

2/2 em que o aminoácido tendo a cadeia lateral hidrofóbica no peptídeo solúvel em água é 3 ou menos.

11. 0 composto de acordo com a reivindicação 9, em que os aminoácidos tendo a cadeia lateral hidrofóbica são selecionados a partir do grupo que consiste em alanina (Ala), valina (Vai), isoleucina (Ile), leucina (Leu), metionina (Met), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) e triptofano (Trp).

12. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 1.

13. Uma composição farmacêutica antibiótica, anti-inflamatória ou antioxidante que compreende o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Uma composição cosmética antibiótica, antiinflamatória ou antioxidante que compreende o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

15. A composição cosmética de acordo com a reivindicação 14, tendo a formulação selecionada a partir do grupo que consiste em um amaciante da pele, uma loção para nutrição, um creme para nutrição, um creme para massagem, uma essência, um creme para os olhos, um creme de limpeza, uma espuma de limpeza, uma água de limpeza, uma compressa, um spray, um pó, um tônico capilar, um creme para os cabelos, uma loção para os cabelos, um xampu para os cabelos, um enxágue para os cabelos, um condicionador para os cabelos, um spray para os cabelos, um aerossol para os cabelos, uma pomada, um sol-gel, uma emulsão, um óleo, uma cera e um aerossol.