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BR112019020853A2 - Vacinas à base de peptídeo, métodos de fabricação e usos das mesmas para induzir uma resposta imune - Google Patents

Vacinas à base de peptídeo, métodos de fabricação e usos das mesmas para induzir uma resposta imune Download PDF

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BR112019020853A2
BR112019020853A2 BR112019020853-4A BR112019020853A BR112019020853A2 BR 112019020853 A2 BR112019020853 A2 BR 112019020853A2 BR 112019020853 A BR112019020853 A BR 112019020853A BR 112019020853 A2 BR112019020853 A2 BR 112019020853A2
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BR
Brazil
Prior art keywords
peptide antigen
peptide
gly
fact
leu
Prior art date
Application number
BR112019020853-4A
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English (en)
Inventor
Lynn Geoffrey
Ishizuka Andrew
Original Assignee
Avidea Technologies, Inc.
The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Avidea Technologies, Inc., The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services filed Critical Avidea Technologies, Inc.
Publication of BR112019020853A2 publication Critical patent/BR112019020853A2/pt

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Abstract

a presente revelação se refere a vacinas à base de peptídeo novas, métodos de fabricar as vacinas à base de peptídeo novas e usos das mesmas para fornecer antígenos de peptídeo para induzir uma resposta imune, e em particular uma resposta de célula t a um indivíduo.

Description

VACINAS À BASE DE PEPTÍDEO, MÉTODOS DE FABRICAÇÃO E USOS DAS MESMAS PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE
Documento de prioridade
[001 ]O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de patente provisório US no. 62/481.432, depositado em 4 de abril de 2017 e do pedido de patente provisório US número 62/617.519, depositado em 15 de janeiro de 2018, os quais são ambos intitulados “PEPTÍDEO-BASED VACCINES, METHODS de MANUFACTURING, e USES THEREOF FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE”, cujos teores são pela presente incorporados por referência na íntegra.
[002]A presente invenção foi criada na execução de um Contrato de Desenvolvimento e Pesquisa cooperativa com o National Institutes of Health, um Órgão do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. O Governo dos Estados Unidos da América tem certos direitos sobre essa invenção.
Campo da revelação
[003]A presente revelação refereOse a vacinas à base de peptídeo novas, métodos de fabricação das vacinas à base de peptídeos novas e usos das mesmas para induzir uma resposta imune e em particular, uma resposta de célula T em um sujeito. As modalidades das vacinas à base de peptídeo da presente revelação podem ser usadas para prevenir ou tratar doenças infecciosas e câncer, bem como para induzir tolerância ou modular imunidade para prevenir ou tratar auto-imunidade e alergias.
Antecedentes
[004]Vacinas compreendendo composições imunogênicas de antígenos podem ser usadas para induzir uma resposta imune em um indivíduo, incluindo para o tratamento ou prevenção de cânceres ou doenças infecciosas, ou mesmo para induzir tolerância e/ou expressão imune para o tratamento ou prevenção de autoimunidade ou alergias. As composições de vacinas para induzir respostas imunes
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2/314 para o tratamento ou prevenção de canceres e doenças infecciosas contêm antígenos e tipos específicos de adjuvantes que induzem respostas de célula T citotóxicas e/ou anticorpos dirigidos ao antígeno que mediam clearance de patógeno ou morte de células cancerosas ou infectadas por via viral. Em contraste, as composições de vacinas para induzir respostas tolerogênicas ou supressivas podem conter um antígeno e um veículo (por exemplo, sistema de fornecimento como um veículo de partículas) e/ou compostos imune-supressivos, como inibidores mTOR, porém não terão adjuvantes específicos que induzem células T citotóxicas, e podem ao invés induzir tolerância de célula T ou ativação de células reguladoras, como células T reguladoras, que infra-regulam ou modulam as características qualitativas da resposta.
[005]Há um reconhecimento crescente de que o antecedente genético, particularmente a composição de alelos de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e ambiente de um paciente pode afetar sua suscetibilidade a câncer, doenças infecciosas, autoimunidade e alergias, bem como impactar sua resposta a vacinas usadas para tratar tais condições. O desenvolvimento contínuo de novos métodos informáticos e de diagnóstico que fornecem uma compreensão da base molecular da doença significou que informações específicas do paciente estão se tornando cada vez mais disponíveis. Desse modo, há interesse crescente em usar informações sobre os genes, proteínas e ambiente de um indivíduo para orientar o tratamento médico que o indivíduo recebe, incluindo a seleção de imunoterapias específicas, incluindo vacinas para tratar ou prevenir câncer, doenças infecciosas, autoimunidade e alergias.
[006]Em terapia de câncer, informações específicas sobre o tumor de um indivíduo podem ser usadas para ajudar a diagnosticar, planejar tratamento, descobrir quão bem o tratamento está funcionando ou fazer um prognóstico. Por exemplo, informações específicas sobre os genes, proteínas e ambiente de um
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 9/391
3/314 indivíduo podem ser usadas para moldar uma abordagem de prevenção ao tratamento de câncer por desenvolver vacinas com base nessas informações. Vacinas usadas para o tratamento imunológico ou prevenção de certos cânceres devem induzir uma resposta imune contra antígenos associados a tumor. Uma resposta imune preferida é uma resposta de célula TCD8 e/ou uma resposta de célula T CD4 que reconhece um antígeno associado a tumor.
[007]Similarmente, abordagens personalizadas para tratar auto-imunidade ou alergias é possível através da identificação dos antígenos próprios ou antígenos estranhos específicos, respectivamente, que são a causa de patologia imunemediada. Embora alguns auto-antigenos e alérgenos sejam conhecidos e comuns em pacientes, alguns auto-antigenos e alérgenos podem ser específicos ao paciente e desse modo o tratamento desses pacientes deve ser moldado. Os antígenos identificados como a causa da patologia podem ser administrados na forma de um peptídeo como uma vacina que é capaz de induzir tolerância contra os autoantigenos (isto é, antígenos próprios). Alternativamente, a resposta imune contra um antígeno estranho que origina alergias pode ser de um tipo específico de resposta imune que resulta em patologia. Desse modo, uma vacina contra tal antígeno estranho pode ser fornecida como uma vacina à base de peptídeo para mudar a resposta imune para um tipo qualitativamente distinto de resposta imune que não resulta em patologia.
Papel de células T em tratamento ou prevenção de câncer
[008]Células T são conhecidas por mediar regressão de tumor e melhorar a sobrevivência do paciente como foi mostrado usando imunoterapias à base de terapia de célula T adotiva e inibidores de ponto de controle imune. Vários estudos em seres humanos mostraram que infusão intravenosa de um número grande de células T CD8 e/ou CD4 expandidas que reconhecem um único antígeno associado a tumor podem mediar regressão de tumor e melhorar a sobrevivência (vide, E. Tran
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4/314 et al., N Engl J Med 375:2255-2262 , 2016; e E. Tran et al., Science 344: 641-645, 2014). Adicionalmente, o tratamento de certos canceres com Drogas que bloqueiam ou revertem a supressão de célula T, como anticorpos monoclonais que bloqueiam CTLA-4, PD-1 e/ou PD-L1 (denominados ‘inibidores de ponto de controle) resulta em regressão de tumor e melhora em sobrevivência geral (vide: D. M. Pardoll, Nat Rev Cancer, 12: 252-264, 2012; F. S. Hodi et al., N Engl J Med, 363:711 -723, 2010; e, M. Reck et al., N Engl J Med, 375:1823-1833, 2016; J. E. Rosenberg et al., Lancet 387:1909-1920, 2016). PD-1/PD-L1 é um par de receptor-ligando em que PD-1 é expresso em células T e PD-L1 é expresso em células no tumor. A interação de PD1/PD-L1 bloqueia células T de executar suas funções efetoras, que de outro modo resultariam e crescimento lento ou eliminação de células de tumor que expressam um antigeno associado a tumor reconhecido pela célula T. o bloqueio da interação PF-1/PD-L1 com um anticorpo monoclonal resulta em cessação do sinal supressivo, desse modo liberando células T para executar uma função efetora que resulta em crescimento lento de célula de tumor ou morte de célula de tumor (D. M. Pardoll, Nat Rev Cancer, 12: 252-264, 2012.)
[009]0 papel de células T na promoção de clearance de tumor em pacientes é apoiado por estudos em seres humanos mostrando que inibidores de ponto de controle têm eficácia mais alta (mortalidade mais baixa) em pacientes que têm um nível mais alto de infiltração de célula T presente na biópsia de seu tumor no momento em que o tratamento começa (vide: J. E. Rosenberg et al., Lancet 387:1909-1920, 2016). Além disso, também foi mostrado que inibidores de ponto de controle têm eficácia mais alta em pacientes cujos tumores têm um nível mais alto de mutações (vide: A. Snyder et al., N Engl J Med 371, 2189-2199 2014; e N. A. Rizvi et al., Science, 348:124-128, 2015) presumivelmente porque números crsecentes de mutações levam a um número maior de proteínas mjutantes desse modo fornecendo um número mais alto de alvos em potencial para os quais células
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T podem reconhecer as células de tumor e direcionar para as mesmas para eliminação.
[010]Entretanto, um maior desafio é que muitos tumores predominantes (por exemplo, canceres de próstata, mama e pancreático) têm baixa carga mutacional (vide: T. N. Schumacher, R. D. Schreiber, Science, 348: 69-74, 2015) e pacientes com esses canceres percebem pouco ou nenhum benefício a partir de inibidorse de ponto de controle. Além disso, mesmo entre tumores que têm alta carga mutacional, somente um subconjunto de pacientes se beneficiam de terapia de inibidor de ponto de controle porque a maioria dos indivíduos não tem a resposta de célula T específica de tumor preexisetnte exigida que é necessária para imunoterapias para mediar um efeito.
Vacinas que direcionam antigenos associados a tumor para tratamento ou prevenção de cancer
[011] Gerar respostas imune, particularmente respostas de célula T, para tratamento ou prevenção de câncer requer a identificação de antigenos associados a tumor adequados. Antigenos associados a tumor incluem antigenos próprios, que estão presentes em certas células saudáveis porém são preferencialmente expressas por células de tumor; antigenos derivados de patógeno a partir de patógenos microbianos oncogênicos; e/ou neoantígenos, que são proteínas aberrantes que são específicas para células de tumor e são frequentemente porém nem sempre exclusivas a pacientes individuais.
[012]Antígenos próprios adequados podem ser antigenos derivados de proteínas que não mais são expressos em indivíduos pós-parto. Por exemplo, antigenos próprios adequados podem incluir antigenos que são preferencialmente expressos por células de tumor, como NY-ESO-1 e MAGE-A3 (vide: N. N. Hunder et al., N Engl J Med, 358:2698-2703, 2008). Alternativamente, antigenos próprios podem incluir antigenos que são expressos em um tecido saudável em que uma
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6/314 resposta de célula T contra aquele tecido saudável não é excessivamente prejudicial ao paciente, por exemplo, fosfatase de ácido prostático (PAP) (vide: P. W. Kantoff et al., N Engl J Med 363:411 -422, 2010).
[013]Um antígeno associado a tumor pode ser um antígeno derivado de patógeno, como um vírus ou outro patógeno que é o acionador subjacente do processo neoplástico, por exemplo, proteínas a partir de vírus de papiloma humano (HPV) (vide: G. G. Kenter et al., N Engl J Med, 361:1838-1847, 2009).
[014]Neoantígenos são antígenos que são o resultado de mutações que estão presentes somente em células de tumor e não células normais (vide: T. N. Schumacher, R. D. Schreiber, Science, 348: 69-74, 2015). Neoantígenos podem ser criados por polimorfismos de nucleotídeo que resultam em alterações de aminoácido não conservativos. Neoantígenos podem ser criados por inserções e/ou deleções, que podem resultar em antígenos de peptídeo contendo uma inserção ou deleção ou uma mutação de deslocamento de quadro. Neoantígenos podem ser criados pela introdução de um códon de parada que em seu contexto novo não é reconhecido pela maquinaria de códon de parada, resultando no ribossomo pulando o códon e gerando um peptídeo que contém uma deleção de aminoácido única. Neoantígenos podem ser criados por mutações em sítios de união, que resultam em transcritos mRNA incorretamente unidos. Neoantígenos podem ser criados por inversões e/ou translocações cromossômicas que resultam em peptídeos de fusão.
[015]Finalmente, um antígeno associado a tumor pode conter novas modificações pós-translação de peptídeos não mudados ou mutantes em que as modificações pós-translação não estão persentes em tecido normal.
[016]Em resumo, um antígeno associado a tumor é qualquer antígeno que é produzido por uma célula neoplástica, que após ser dirigida por uma resposta de célula T, resulta idealmente em uma regressão significativa de crescimento de tumor, ou evita tumorigênese, com efeito limitado sobre células não cancerosas,
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7/314 saudáveis.
Desafios enfrentados pelo campo de vacina
[017]Para o tratamento de certos cânceres, a resposta imune preferida é uma resposta de célula T CD8 (vide: E. Tran et al., N Engl J Med 375:2255-2262 , 2016) e/ou resposta de célula T CD4 (e vide: E. Tran et al., Science 344: 641-645, 2014; e N. N. Hunder et al., N Engl J Med, 358:2698-2703, 2008) que reconhece um antigeno associado a tumor, que pode ser preferencialmente constante, alta magnitude e altamente funcional (alta qualidade) (L. Gattinoni et al., Nature Medicine, 17:1290-1297, 2011).
[018]Um meio de induzir uma respsota de célula T contra antigenos, por exemplo, antigenos associados a tumor, em um indivíduo é através da vacinação. Há inúmeras abordagens atualmente em investigação para induzir respostas de célula T CD8 e/ou CD4 contra antigenos associados a tumor, incluindo abordaegns baseadas em DNA/RNA, baseadas em vetor viral e baseadas em peptídeo (por exemplo, vide: L. M. Kranz et al., Nature 534, 396-401, 2016; e C. J. Melief, S. H. van der BurgNat Rev Cancer 8:351-360, 2008). Um desafio principal para gerar imunidade de célula T efetiva contra cânceres, entretatno, é que a maioria das abordagens de vacin atuais é limitada por imunogenicidade fraca para eliciar imunidade de célula T CD8 e variedade antigênica limitada de respsotas contra neoantígenos mais previstos (vide: S. Kreiter et al., Nature 520, 692-696, 2015).
[019]Muito esforço para induzir imunidade de célIa T antitumor foi focada em usar antigenos de peptídeo sintéticos simplesmente mistuardos com imunoestimulantes e/ou veículos diferentes (adjuvantes) (vide: C. J. Melief, S. H. van der Burg, Nat Rev Cancer 8:351-360, 2008; e M. S. Bijker et al., Eur J Immunol 38, 1033-1042, 2008) ou RNA (vide: Kranz LM, et al. Nature 534(7607):396-401, 2016 e Kreiter S, etal. Nature 520(7549):692-696, 2015).
[020]Entretanto, um desafio principal para gerar imunidade de célula T
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8/314 efetiva contra canceres é que as abordagens de vacina mais atuais baseadas em antígenos de peptídeo ou RNA foram prejudicadas por variedade antigênica limitada e de baixa magnitude de respostas contra antígenos associados a tumor, incluindo neoantígenos. Por exemplo, com relação à variedade antigênica, as abordagens de vacina baseada em peptídeo padrão-ouro atuais com base em antígenos de peptídeo (por exemplo, mistura de 25 peptídeos longos sintéticos de aminoácido com o adjuvante polylC:LC) ou RNA induzem respostas de célula T contra menos de 10% de neoantígenos previstos (vide: S. Kreiter et al., Nature 520, 692-696, 2015). Desse modo, abordagens de vacina aperfeiçoadas, particularmente abordagens de vacina á base de peptídeo são necessárias.
[021]Uma explicação completa para a variedade antigênica deficiente e de baixa magnitude de respostas de célula T por tecnologias de vacina contemporâneas permanece para ser determinada, e dese modo, um desafio contínuo é que não há atualmnete consenso em torno dos parametros ótimos para fornecer antígenos de peptídeo para assegurar sensibilização confiável de imunidade de célula T para tratmento e prevenção de cancer, bem como para outras aplicações, incluindo para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas. Similarmente, os parametros ótimos de vacinas à base de peptídeo para induzir superssão e tolerância permanecem desconhecidos.
Desafios atuais em torno de vacinas de célula T à base de peptídeo
[022]Um desafio principal ao desenvolvimento de vacinas para o tratamento ou prevenção de doenças infecciosas e câncer é que atualmente não há consenso em relação a melhor forma para construir uma vacina baseada em peptídeo para eliciar de modo confiável imunidade de célula T de alta magnitude contra a maioria dos antígenos. Similarmente, não há consenso sobre a melhor forma para construir uma vacina à base de peptídeo para induzir tolerância imune ou para mudar a resposta imune a partir daquelas que induzem alergias para um tipo de resposta
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9/314 inócua. Por exemplo, há ainda debate considerável com relação ao comprimento ótimo de antígeno de peptídeo, formato físico de fornecimento de antígeno de peptídeo (por exemplo, solúvel versus particulado) e tipo de estimulação imune inata (por exemplo, escolha de adjuvante) necessária para induzir imunidade de célula T ótima para o tratamento ou prevenção de câncer e doenças infecciosas, bem como para o tratamento ou prevenção de auto-imunidade e alergias. Realmente, o impacto de muitos parâmetros de vacinas à base de peptídeo, incluindo a influência de aminoácidos flanqueando epítopos de célula T CD4 e CD8, químicas de ligador usadas, carga etc., sobre respostas imunes permanece amplamente não explorado. Esse problema é particularmente acentuado ao considerar que abordagens de vacina personalizadas devem ser exclusivamente moldadas para cada paciente e desse modo abordagens de vacinas à base de peptídeo universais para eliciar de modo confiável imunidade, particularmente imunidade de célula T contra antígenos específicos ao paciente, são necessárias.
[023]Outro desafio principal enfrentado pelas abordagens de vacina à base de peptídeo atuais é que não respondem pela ampla faixa de possíveis características químicas e físicas de antígenos de peptídeo. Por exemplo, abordagens de vacina de câncer individualizadas exigirão que de cada paciente um conjunto exclusivo de antígenos de peptídeo é gerado que pode ter uma faixa ampla de características físicas e químicas possíveis. Com relação à auto-imunidade, múltiplos antígenos diferentes podem ser identificados como a causa de patologia. Desse modo, vacinas que induzem tolerância devem conter um conjunto de antígenos de peptídeo que são exclusivos para cada paciente. O problema é que variabilidade em composição de antígeno de peptídeo pode resultar em alguns antígenos baseados em peptídeo que são difíceis ou impossíveis de fabricar como o antígeno de peptídeo nativo, que é estimado ser aproximadamente 10 a 30% de antígenos à base de peptídeo de 25 ou mais aminoácidos em comprimento. Desse
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10/314 modo, muitos antígenos não podem ser atingidos por abordagens de vacina atuais porque o antígeno de peptídeo nativo não pode ser produzido eficientemente ou isolado após síntese. Adicionalmente, a variabilidade em composição de antígeno de peptídeo que impacta carga e solubilidade, que não é controlada em abordagens de vacina à base de peptídeo atuais, pode impactar vários atributos da formulação de vacina, incluindo carga de material de peptídeo e/ou levar a interações adversas de um antígeno de peptídeo com outros antígenos de peptídeo ou outros componentes da vacina.
[024]Desse modo, para superar as limitações de abordagens atuais de vacina à base de peptídeo, composições e m'todos novos de fabricar vacinas à base de peptídeo que (i) respondem pela variabilidade em propriedades físicas e químicas de antígenos de peptídeo durante fabricação bem como na formulação de vacina são necessárias para assegurar fornecimento ótimo de antígenos de peptídeo para (ii) induzir de forma confiável uma resposta imune, e em particular, uma resposta de célula T em um indivíduo, contra a maioria dos antígenos. Tais vacinas e métodos, que respondem por variabilidade de antígeno de peptídeo e são, portanto, generalizáveis para qualquer antígeno de peptídeo, seriam particularmente uteis no campo de tratamento personalizado de câncer, em que as características de antígenos de peptídeo usadas em uma vacina personalizada de câncer podem variar de paciente para paciente. Entretanto, a aplicabilidade das composições de vacina à base de peptídeo para qualquer antígeno de peptídeo significa que as composições podem ser também usadas em outros tratamentos de base imunológica personalizados, como para induzir tolerância ou para modular a resposta imune a alérgenos para o tratamento de auto-imunidade e alergias, respectivamente.
SUMÁRIO
[025]Os presentes inventores desenvolveram novas composições e métodos
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11/314 de fabricar vacinas à base de peptídeo que superam pelo menos uma das limitações de abordagens atuais de vacina à base de peptídeo. As novas composições de vacina à base de peptídeo e métodos de fabricação revelados na presente invenção respondem pela variabilidade nas propriedades físicas e químicas de antígenos de peptídeo e são, portanto, generalizáveis para qualquer antígeno de peptídeo. Além disso, as novas composições de vacina à base de peptídeo reveladas na presente invenção asseguram fornecimento opcional de uma gama de antígenos de peptídeo diferentes para induzir uma resposta imune em um indivíduo.
[026]As composições novas reveladas na presente invenção se referem a composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo. Os conjugados de antígeno de peptídeo compreendem um antígeno de peptídeo (A) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) que forma partículas ou uma Partícula pré-formada (P) direta ou indiretamente através de um Ligador opcional (L) e/ou uma extensão de N- ou C-terminal opcional (B1 ou B2) que é ligada a N- ou C-terminal do antígeno de peptídeo, respectivamente.
[027]Em algumas modalidades, partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo compreendem adicionalmente uma molécula carregada opcional (C). em algumas modalidades, a molécula carregada é ligada ao conjugado de antígeno de peptídeo para estabilizar as partículas em condições aquosas. Em outras modalidades, a molécula carregada (C) é fornecida em uma molécula separada e é incorporada em partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo.
[028]A adição de certas extensões de N- e/ou C-terminal (B1 e/ou B2) e/ou moléculas carregadas (C) resulta em aperfeiçoamentos inesperados em fabricação de vacina à base de peptídeo por síntese de fase sólida bem como facilidade aperfeiçoada de purificação através de solubilidade de solvente orgânico melhorada, bem como aperfeiçoamentos inesperados em controle sobre o tamanho e
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12/314 estabilidade das partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptideo. Essas composições apresentam aperfeiçoamentos inesperados em imunidade de célula T e clearance de tumor, particularmente em relação à magnitude e variedade de células T geradas contra antigenos associados a tumor.
[029]As modalidades da presente revelação incluem um conjugado de antígeno de peptideo compreendendo: um antígeno de peptideo (A); e uma molécula hidrofóbica (H) ou uma partícula (P), em que o antígeno de peptideo (A) é ligado à molécula hidrofóbica (H) ou à partícula (P) direta ou indiretamente através de uma extensão de N-terminal (B1) que é ligada ao N-terminus do antígeno de peptideo (A) ou uma extensão de C-terminal (B2) que é ligada ao C-terminus do antígeno de peptideo (A), modalidades adicionais da presente revelação incluem uma composição imunogênica compreendendo os conjugados de antígeno de peptideo. Modalidades ainda adicionais da presente revelação incluem um método de tratar um paciente sofrendo de uma doença que compreende administrar ao paciente que sofre da doença, o conjugado de antígeno de peptideo do mesmo ou a composição imunogênica.
[030]Em algumas modalidades, a vacina usada para tratamento de câncer pode ser usada individualmente ou em combinação com outras imunoterapias e modalidades de tratamento de câncer, incluindo, porém não limitado à quimioterapia, inibidores de ponto de controle, radiação e qualquer outra tecnologia usada para combater câncer.
[031]Desse modo, também é revelado na presente invenção um método de tratar um paciente que sofre de uma doença compreendendo administrar ao paciente que sofre da doença o conjugado de antígeno de peptideo ou a composição imunogênica da presente revelação.
[032]Além disso, é revelado na presente invenção o uso do conjugado de antígeno de peptideo ou a composição imunogênica da presente revelação na
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13/314 fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.
[033]As descobertas inesperadas reveladas na presente invenção se referem a:
(i) O comprimento ótimo de antígenos de peptídeo (A) usados em vacinas de câncer para assegurar sensibilização confiável de imunidade de célula T;
(ii) Uso de sequências de extensão de antigeno de peptídeo, isto é, extensões de N- ou C-terminal (B1 e/ou B2) e/ou moléculas carregadas opcionais (C) que facilitam fabricação de vacinas à base de peptídeo;
(iii) O modo como características da molécula hidrofóbica (H) compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo impacta a capacidade de fabricação bem como o tamanho e estabilidade de partículas e como esses parâmetros impactam a atividade biológica;
(iv) A composição de moléculas carregadas (C) e carga líquida de conjugados de antigeno de peptídeo necessárias para induzir e estabilizar partículas de um tamanho ótimo para promover imunidade de célula T;
(v) A composição de sequências de peptídeo degradável por enzima que promovem processamento eficiente de epítopos mínimos fornecidos no contexto do conjugado de antigeno de peptídeo; e/ou (vi) O modo como a potência e características qualitativas de Ligandos com propriedades adjuvantes (por exemplo, agonistas PRR) fornecidos em conjugados de antigeno de peptídeo transmitem sobre a variedade, magnitude e qualidade de respostas de célula T.
Breve descrição das figuras
[034]Figura 1: esquemático de desenho de certas modalidades de conjugados de antigeno de peptídeo.
[035]Figura 2:Esquema geral para a síntese de conjugados de antigeno de peptídeo por reagir um fragmento de antigeno de peptídeo compreendendo um
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14/314 precursor de ligador X1 contendo uma azida com urn precursor de ligador X2 contendo um DBCO para formar urn Ligador de triazol (L) que liga o antígeno de peptídeo (A) à molécula hidrofóbica (Η).
[036]Figura 3: Diagrama esquemático para a síntese do Composto 1.
[037]Figura 4: Peso molecular e comportamento hidrodinâmico de antígenos de peptídeo (A) e conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendidos de peptídeos longos sintéticos (SLP ou “LP”) ou epítopos de célula T CD8 mínimos (“Min”) derivados da linhagem de células de tumor MC38. Os antígenos de peptídeo (A) compreendidos de LPs foram ligados ao precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi deixado ou não ligado ou foi ligado com uma molécula hidrofóbica (H), compreendida de DBCO-W3 ou DBCO-2BXy3. Os antígenos de peptídeo (A) compreendidos de LPs foram ligados a uma extensão (B1) que foi ligada a um precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi deixado não ligado ou foi ligado a uma molécula hidrofóbica (H), compreendida de DBCO-W3 ou DBCO-2BXy3.
[038]Figura 5: Impacto de comprimento de antígeno de peptídeo (A), comportamento hidrodinâmico e fornecimento em conjunto de um agonista TLR-7/8 (TLR-7/8a) sobre a imunogenicidade de um neoantígeno baseado em peptídeo (Irgq). Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com composições imunogênicas diferentes compreendendo antígenos de peptídeo (A) com base no peptídeo longo sintético (LP, às vezes mencionado como “SLP”) ou 0 epitopo de célula T CD8 mínimo (Min, às vezes mencionados como ME) do antígeno Irgq derivado da linhagem de células de tumor MC38 como 0 antígeno de peptídeo (A) individualmente misturado com 0 adjuvante TLR-7/8a; como 0 antígeno de peptídeo (A) ligado a uma molécula hidrofóbica (H), W3, e misturado com 0 adjuvante TLR7/8a; ou como 0 antígeno de peptídeo (A) ligado a uma molécula hidrofóbica (H) fornecendo em conjunto um adjuvante TLR-7/8a, 2BXys. Os camundongos foram
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15/314 imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 específicas de antigeno (% IFNg+ de total de células T CD8) foram avaliadas a partir de sangue integral nos dias 0 e 25. Círculos abertos indicam que o antigeno de peptídeo (A) era solúvel (isto é, não particulado), ao passo que círculos fechados indicam que os camundongos receberam uma composição imunogênica particulada do antigeno de peptídeo (A).
[039]Figura 6: Impacto de comprimento de antigeno de peptídeo (A), comportamento hidrodinâmico e fornecimento em conjunto de um adjuvante TLR-7/8 sobre a imunogenicidade de um neoantígeno baseado em peptídeo (Cpnel). Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com composições imunogênicas diferentes compreendendo antigenos de peptídeo (A) com base no peptídeo longo sintético (LP) ou o epítopo de célula T CD8 mínimo (Min) do antigeno Cpnel derivado da linhagem de células de tumor MC38 como o antigeno de peptídeo (A) individualmente misturado com o adjuvante TLR-7/8a; como o antigeno de peptídeo (A) ligado a uma molécula hidrofóbica (H), W3, e misturado com o adjuvante TLR7/8a; ou como o antigeno de peptídeo (A) ligado a uma molécula hidrofóbica (H) fornecendo em conjunto um adjuvante TLR-7/8a, 2BXy3. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 específicas de antigeno (% IFNg+ de total de células T CD8) foram avaliadas a partir de sangue integral nos dias 0 e 25. Círculos abertos indicam que o antigeno de peptídeo (A) era solúvel (isto é, não particulado), ao passo que círculos fechados indicam que os camundongos receberam uma composição imunogênica particulada do antigeno de peptídeo (A).
[040]Figura 7: Peso molecular e comportamento hidrodinâmico de antigenos de peptídeo (A) e conjugados de antigeno de peptídeo fornecendo antigenos de peptídeo (A) compreendidos de peptídeos longos sintéticos (SLP ou “LP”) ou epítopos de célula T CD9 mínimos (“Min”) derivados da linhagem de célula de tumor
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B16. Os antígenos de peptídeo (A) compreendidos de LPs foram ligados ao precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi deixado não ligado a ligado a uma molécula hidrofóbica (H), compreendida de DBCO-W3 ou DBCO-BXys. Os antígenos de peptídeo (A) compreendidos de LPs foram ligados a uma extensão (B1) que foi ligada a um precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi deixado não ligado a ligado a uma molécula hidrofóbica (H), compreendida de DBCO-W3 ou DBCO-BXys.
[041]Figura 8: Impacto de comprimento de antígeno de peptídeo (A) e potência do TLR-7/8a ligado à molécula hidrofóbica (H) sobre a imunogenicidade de conjugados de antígeno de peptídeo. Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com composições imunogênicas diferentes compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo fornecendo 0 peptídeo longo sintético (LP), epítopo de célula T CD8 mínimo (Min) ou ambos 0 SLP e 0 Min de antígenos de peptídeo derivados de tumor B16 (A) ligados à molécula hidrofóbica (H) DBCO-2BXys ou DBCO-2B5. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 e CD4 específicas de antígeno (% IFNg+ de total) foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 24. Os gráficos de barra mostram a soma das respostas mediadas para cada antígeno de peptídeo (M47, M44, M30, M25, M33, M27 e M08).
[042]Figura 9: Impacto da potência do TLR-7/8a ligado à molécula hidrofóbica (H) sobre a imunogenicidade e variedade de respostas de célula T geradas contra uma biblioteca de neoantígenos de peptídeos. Os camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com composições imunogênicas compreendendo 4 conjugados de antígeno de peptídeo exclusivos fornecendo epítopos de célula T CD8 mínimos derivados de tumor MC38 distintos (40 epítopos no total) que foram ligados a moléculas hidrofóbicas (H) 2BXys ou 2Bs. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 específicas de antígeno (% IFNg+ de total de células T CD8) foram avaliadas a partir de sangue integral no dia
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24. As respostas de célula T CD8 contra cada dos 40 epítopos são mostradas. A proporção de antígenos de peptídeo (A) compreendendo epítopos de célula T CD8 mínimos que levaram a respostas de célula T CD8 é mostrada no gráfico de torta.
[043]Figura 10: Impacto do número e dose de antígenos de peptídeo (A) bem como o número de sítios de vacinação, sobre a imunogenicidade de neoantígenos baseados em peptídeo. Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo um único epítopo de célula T CD8 mínimo (Adpgk) ou conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo 4 epítopos de célula T CD8 mínimos diferentes (Dpagt, Cpnel, Adpgk e Aatf). A dose do antígeno de peptídeo (A) e número de sítios de vacinação foi variada para os grupos diferentes. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 específicas de antígeno (% IFNg+ de total de células T CD8) foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 24.
[044]Figura 11; Diagrama esquemático de um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V.
[045]Figura 12: impacto de extensões N- e C-terminal (B1 e B2) sobre a potência in vitro para ativação de célula T CD8. Uma cultura de esplenócito com APCs e células T CD8 específicas de neoantígeno (Cpne’) foi estimulada in vitro com epítopo de célula T CD8 mínimo (Cpnel) antígenos de peptídeo (A) ligados a extensões diferentes (B1 e B2) e avaliados em relação a sua capacidade de estimular produção de IFNg das células T CD8 específicas de Cpnel.
[046]Figura 13: Conjugados de antígeno de peptídeo avaliados na figura 12. Um antígeno de peptídeo (A) compreendido do epítopo mínimo, Cpnel (Ser-SerPro-Tyr-Leu-His-Tyr-Leu SEQ ID NO:1) foi ligado a qualquer uma ou a ambas extensões B1 e/ou B2 compreendendo um sítio de divagem imuno-proteassomal e catepsina, adicionalmente em que o antígeno de peptídeo (A) foi ligado diretamente ou através da extensão B2 a um precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi
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18/314 ligado a uma molécula de DBCO que foi ligada à molécula hidrofóbica (H), 2BXys.
[047]Figura 14: Impacto da molécula carregada (C) e extensões (B1 e/ou B2) sobre imunogenicidade in vivo de conjugados de antígeno de peptídeo fornecendo um antígeno de peptídeo (A) compreendido de um epítopo de célula T CD8 mínimo. Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo moléculas carregadas diferentes (C) e extensão(ões) (Bi e/ou B2) nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 específicas de antígeno (% IFNg+ de total de células T CD8) foram avaliadas a partir de sangue integral nos dias 10 (painel superior) e dia 24 (painel inferior).
[048]Figura 15: Impacto das extensões N- e C-terminal (B1 e B2) sobre a potência in vitro para ativação de célula T CD8. Um antígeno de peptídeo (A) de epítopo de célula T CD8 mínimo (Adpgk) foi ligado a extensões diferentes (B1 e B2) e avaliado em relação à capacidade de estimular a produção de IFNg a partir das células T CD8 específicas de Adpgk.
[049]Figura 16: A concentração efetiva em atividade meia máxima (EC50) é mostrada para os conjugados de antígeno de peptídeo diferentes avaliados na figura 15. Um EC50 mais baixo indica potência mais alta.
[050]Figura 17: impacto das extensões N- e C-terminal (B1 e B2) sobre a potência in vitro para ativação de célula T CD8 e potência in vivo para eliciar respostas de célula T CD8 de novo. (A) Um antígeno de peptídeo (A) de epítopo de célula T CD9 mínimo (Adpgk) foi ligado a extensões diferentes (B1 e B2) e avaliado em relação à capacidade de estimular a produção de IFNg a partir de células T CD8 específicas de Adpgk (B). A capacidade de conjugados de antígeno de peptídeo, com extensões N- e C-terminal diferentes (B1 e B2) ligadas à molécula hidrofóbica (H) 2B3W2 foi avaliada no dia 13 após uma única imunização.
[051]Figura 18: Impacto de carga líquida de conjugado de antígeno de peptídeo e composição de molécula hidrofóbica sobre 0 comportamento
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19/314 hidrodinâmico. O comportamento hidrodinâmico de uma gama de conjugados de antígeno de peptídeo diferentes da fórmula V em 0,1 mg/mL ou 0,5 mg/mL em PBS em um pH de 7.4 foi avaliado por dispersão de luz dinâmica. A carga líquida dos conjugados de antígeno de peptídeo e o número ou diâmetro de partícula médio de massa são reportados. Turbidez foi determinada por medir a absorbância da solução a 490 nm. Turbidez > 0.04 indica agregação.
[052]Figura 19: Impacto de carga líquida de conjugado de antígeno de peptídeo sobre comportamento hidrodinâmico. (A) O impacto de carga líquida sobre o comportamento hidrodinâmico de uma gama de conjugados de antígeno de peptídeo diferentes da Fórmula V suspensos em 0,1 mg/mL ou 0,5 mg/mL em PBS em um pH de 7.4 foi avaliado por dispersão de luz dinâmica. (B) O painel B da figura mostra uma lista depositada dos dados mostrados no painel (A) da figura. (C) Distribuição de frequência de GRAVY e (D) distribuição de frequência de carga dos antígenos fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo. (E) Tamanho de partícula de neoantígenos LP casados (n=39) preparados como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se montam eles próprios em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) com carga líquida +6 ou > +8. (F) Impacto de carga líquida de conjugado de antígeno de peptídeo e média grande de hidropatia (GRAVY) sobre o comportamento hidrodinâmico. O comportamento hidrodinâmico de uma gama de conjugados de antígenos de peptídeo diferentes suspensos em 0,1 mg/mL em PBS em um pH de 7.4 foi avaliado por dispersão de luz dinâmica. O diâmetro de partícula médio numérico como uma função de carga líquida e valor GRAVY é reportado.
[053]Figura 20: Impacto de carga líquida de conjugado de antígeno de peptídeo e comprimento de molécula hidrofóbica (H) e composição sobre o comportamento hidrodinâmico de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V. O comportamento hidrodinâmico de conjugados de antígeno de peptídeo diferentes
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20/314 suspenso em 0,1 mg/mL em PBS em um pH de 7.4 com carga líquida variável e composição de molécula hidrofóbica fornecendo um epítopo mínimo baseado em neoantígeno modelo (Min), Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser (SEQ ID NO: 2) (“Adpgk”) foi avaliado por dispersão de luz dinâmica. (A) o diâmetro de partícula médio numérico é reportado como uma função da carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo para 4 moléculas hidrofóbicas diferentes (2B2W8, 2BXys, 2B5, W5). (B) Dados de distribuição de tamanho são mostrados para um conjugado de antígeno de peptídeo com carga líquida +6 que se monta em nanopartículas (“Min-SNP-7/8a”) e um conjugado de antígeno de peptídeo forneceu 0 mesmo antígeno de peptídeo (A), porém com uma carga líquida de 0 que se monta em micropartículas / agregados (“Min-MP-7/8a”).
[054]Figura 21: Impacto de carga líquida sobre comportamento hidrodinâmico de um conjugado de antígeno de peptídeo da Fórmula V fornecendo um antígeno de peptídeo hidrofóbico. (A) Média grande de gráfico de distribuição de hidropatia (GRAVY) de 1.377 neoantígenos LP a partir de 4 modelos de tumor de murino (B16.F10, MC38, 3123 e Pane02). (B) O neoantígeno LP mais hidrofóbico identificado no painel (A) da figura (círculo fechado vermelho) foi preparado como um LP e Min fornecido como um conjugado de antígeno de peptídeo da Fórmula V que se monta em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) e avaliado em relação a impacto de carga líquida (valor absoluto) sobre 0 tamanho de partícula. O tamanho de partícula foi avaliado por dispersão de luz dinâmica com 0 conjugado de antígeno de peptídeo suspenso em 0,5 mg/mL em PBS em um pH de 7.4. O diâmetro de partícula médio de massa é reportado como uma função da carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo.
[055]Figura 22: Impacto de composição de molécula carregada (C ou “Bloco C”) e molécula hidrofóbica (H ou “Bloco H”) sobre imunogenicidade para gerar respostas de célula T CD8 para um epítopo mínimo de neoantígeno, Adpgk,
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21/314 fornecido como um conjugado de antígeno de peptideo da fórmula V. (A-E) Conjugados de antígeno de peptideo com composição de molécula carregada variável (poly(K), poly®, poly(D) ou nenhuma) e composição de molécula hidrofóbica (Ws, 2BXyaW2 ou 2B3W2) fornecendo um epítopo mínimo, Adpgk, foram administrados a camundongos (N=3 por grupo por dose) em doses diferentes nos dias 0, 14 e 28, e respostas de célula T CD8 específicas de neoantígeno (Adpgk) foram avaliadas a partir de sangue integral em pontos de tempo em série posteriormente.
[056]Figura 23: Impacto de composição de molécula carregada (C ou “Bloco C”) sobre imunogenicidade para gerar respostas de célula T CD8 para um epítopo mínimo de neoantígeno, Adpgk, fornecido como um conjugado de antígeno de peptideo da Fórmula V. (A) Conjugados de antígeno de peptideo com um bloco C baseado em poly(K)- poly(D) ou PEG fornecendo um epítopo mínimo, Adpgk, foram administrados a camundongos (N=3 por grupo por dose) em doses diferentes nos dias 0, 14 e 28, e respostas de célula T CD8 específicas de neoantígeno (Adpgk) foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 36 (B).
[057]Figura 24: Impacto da via de administração sobre as respostas de célula T CD8 geradas por conjugados de antígeno de peptideo (“SNP-7/8a”). Um conjugado de antígeno de peptideo com uma molécula carregada poly(K) (C) e uma molécula hidrofóbica 2B3W2 (H) fornecendo um epítopo mínimo de neoantígeno (Adpgk = Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met (SEQ ID NO: 77)) foi administrado a camundongos nos dias 0, 14 e 28 e respostas de célula T CD8 específicas de neoantígeno (Adpgk) foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 36.
[058]Figura 25: Impacto da composição da molécula hidrofóbica (H) e comportamento hidrodinâmico do conjugado de antígeno de peptideo sobre as respostas de célula T CD8 e CD4. Camundongos (N=5 por grupo) foram imunizados com composições imunogênicas compreendendo um epítopo de célula T CD8
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22/314 mínimo e um epítopo de célula T CD4 (epítopo PADRE) como micropartículas (MP) (>500 nm em diâmetro) ou micelas de nanopartícula (NP) (<200 nm em diâmetro) contendo quantidades variáveis e potência de agonistas TLR-7/8. Os camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 (A) específicas de antigeno (Adpgk) (% IFNg+ de total de células T CD8) e (B) respostas de célula T CD4 específicas de PADRE foram avaliadas de sangue integral no dia 24.
[059]Figura 26: Esquemático químico e de desenho de conjugados de antigeno de peptídeo com uma molécula carregada poly(K) (C) e uma molécula hidrofóbica baseada em 2B3W2 (H) fornecendo formas de epítopo Min ou LP de antígenos de peptídeo.
[060]Figura 27: Fornecimento particulado de neoantígenos de peptídeo aumenta as respostas de célula T CD8 dirigidas contra os neoantígenos baseados em antigeno de peptídeo (A). (A) Turbidez de neoantígenos diferentes como LPs nativos, LPs ligados a uma molécula hidrofóbica (2B3W2) que montam em micropartículas (“MP-7/8a”) ou LPs sintetizados como conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V que se monta em nanopartículas (“SNP-7/8a”). Turbidez > 0.05 OD indica agregação (B-E) Os camundongos foram imunizados com LPs nativos misturados com polylCLC, ou LPs fornecidos como MP-7/8a ou SNP-7/8a nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 28. Os dados em escala log são reportados como média geométrica com 95% Cl; comparação de múltiplos grupos em relação a significância estatística foi determinada usando ANOVA para 1 fator ou 2 fatores; ns = não significativo; *, p = 0.05;**, p = 0.01
[061]Figura 28: mecanismo respondendo pela imunogenicidade aperfeiçoada de conjugados de antigeno de peptídeo que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (SNP-7/8a). (A-C) O epítopo mínimo, Adpgk, foi rotulado de modo fluorescente e então administrado por via
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23/314 subcutânea patas traseiras de camundongos no dia 0 como um peptídeo solúvel misturado com uma molécula pequena TLR-7/8a (7/8a), um peptídeo solúvel misturado com MP-7/8a, ou ligado covalentemente com MP-7/8a ou SNP-7/8a. Linfonodos (N=5 por ponto de tempo por grupo) drenando o sítio de imunização foram coletados em pontos de tempo em série posteriormente e avaliados em relação à quantidade de peptídeo (E), absorção de peptídeo por lymphnode APCs em uma base por célula (F) e produção de citosina IL-12p40 (G). Os dados são reportados em média ± SEM. A comparação de múltiplos grupos em relação à significância estatística foi determinada usando ANOVA para 1 fator ou 2 fatores; ns = não significativo; *, p = 0,05; **, p = 0,01.
[062]Figura 29: Imunogenicidade de neoantígenos baseados em peptídeo fornecidos como LPs ou Mins como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP7/8a). Neoantígenos baseados em peptídeo diferentes foram preparados como LPs ou Mins fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo em que a molécula carregada (C) é poly(lisina) e a molécula hidrofóbica (H) é 2B3W2 que se monta em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (mencionado como “SNP-7/8a”). camundongos (N=7/grupo) foram imunizados com forma LP ou Min de neoantígenos baseados em peptídeo ligados a SNP-7/8a nos dias 0 e 14. (A) Respostas de célula T CD8 e (B) respostas de célula T CD4 foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 28. Os dados em escala log são reportados como média geométrica com 95% Cl; comparação de múltiplos grupos em relação à significância estatística foi determinada usando ANOVA para 1 fator ou 2 fatores; ns = não significativo; *, p = 0,05;**, p = 0,01.
[063]Figura 30: Imunogenicidade de neoantígenos baseados em peptídeo fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo baseados em LP da fórmula V, em que a molécula carregada (C) é poly(lisina) e a molécula hidrofóbica (H) é
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2B3W2 que se monta em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (mencionado como “SNP-7/8a”) em comparação com LPs nativos misturados com poly(ICLC. Camundongos foram imunizados nos dias 0 e 14 e respostas de célula T CD8 foram avaliadas a partir de sangue integral no dia 28.
[064]Figura 31: relação entre imunogenicidade e afinidade de ligação prevista. (A) Imunogenicidade de epítopos mínimos (N=179) para gerar respostas de célula T CD8 quando fornecidas como conjugados de antigeno de peptídeo, em que a molécula hidrofóbica (H) é um polímero-TLR-7/8a, traçado contra afinidade de ligação prevista usando 0 algoritmo de consenso do banco de dados de epitopo imune (IEDB). (B) Curvas de característica de operador receptor (ROC) para a sensibilidade e especificidade de algoritmos de previsão de ligação MHC-1 diferentes com base em um corte de 0.5 de score de consenso ou 500 nM como um aglutinante.
[065]Figura 32: antígenos próprios e neoantígenos fornecidos como antígenos de peptídeo (A) ou conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) eliciam clearance mediada por célula T CD4 e CD8 de um melanoma estabelecido. Os camundongos com tumores B16.F10 estabelecidos foram tratados com PD1 e SNP-7/8a fornecendo LP Adpgk (epitopo de célula T CD8 não presente em B16.F10), um antigeno próprio, Trp1, epitopo de célula T CD8 mínimo, ou um neoantígeno, M30 LP que tem um epitopo de célula T CD4, nos dias 2, 9 e 16.
[066]Figura 33: Neoantígenos fornecidos como conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) administrado por vias subcutânea e intravenosa eliciam clearance mediada por célula T CD8 robusta de um tumor estabelecido. Camundongos com tumores MC38 estabelecidos foram vacinados com Adpgk LPSNP-7/8a por via subcutânea ou intravenosa nos dias 9 e 16 e 0 volume do tumor foi
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25/314 avaliado em pontos de tempo em série posteriormente.
[067]Figura 34: neoantígenos fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) eliciam clearance mediada por célula T CD8 de um melanoma estabelecido. Os camundongos com tumores B16.F10 estabelecidos foram tratados com PDL1 e SNP-7/8a fornecendo Med12 (neoantígeno MC38 com um epítopo de célula T CD8), Trp1 (antígeno próprio B16 com um epítopo de célula T CD8) ou M39 (neoantígeno B16 com um epítopo de célula T CD8) nos dias 1,8 e 15. (A) O crescimento do tumor foi monitorado e (B) respostas de célula T CD8 foram avaliadas no dia 17.
[068]Figura 35: antígenos virais (HPV) fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) eliciam rejeição mediada por célula T CD8 de um tumor HPV+. (A & B) Camundongos foram imunizados com epítopos mínimos de peptídeo E6 e E7 diferentes (mins) derivados de HPV fornecido como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V, em que a molécula carregada (C) é poly(lisina) e a molécula hidrofóbica (H) é 2B3W2, que se monta em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (mencionado como “SNP-7/8a”) nos dias 0 e 14. (A) respostas de célula T CD8 foram avaliadas no dia 28 e os camundongos foram desafiados com uma linhagem de célula de câncer HPV+ (TC1) e (B) volume de tumor foi avaliado no dia 14 após desafio.
[069]Figura 36: Tamanho de partícula e estabilidade de partículas multiantígenos. (A) LPs de neoantígeno como antígenos de peptídeo (A) (A1 até A9) com uma faixa de carga (-6 a +6) e hidropatia (GRAVY de -2 a +2) foram (B) sintetizados como conjugados de antígeno de peptídeo da Fórmula V, em que a molécula carregada (C) é poly(K), B1 é VR, B2 é SPVZ, 0 precursor de ligador X1 é azidolisina (“X” também mencionado como K’) e a molécula hidrofóbica (H) é 2B3W2, que
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26/314 se montam em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (SNP-7/8a). Os conjugados de antígeno de peptídeo foram suspensos em 0,5 mg/mL em PBS pH 7.4 e avaliados em relação à turbidez (OD 490 nm) e tamanho de partícula (diâmetro, nm). (C) —Partículas de multi-antígeno compreendendo múltiplos conjugados de antígeno de peptídeo diferentes (A1-A9) foram misturadas juntas em razões diferentes em uma solução DMSO (cenários 1-7) e então suspensas em 0,5 mg/mL em PBS pH 7.4 e avaliadas em relação à turbidez (OD 490 nm) e tamanho de partícula (diâmetro, nm). A percentagem de cada conjugado de antígeno de peptídeo compreendendo as partículas de multi-antígenos para cada cenário é fornecida na tabela.
[070]Figura 37: mostra respostas de célula T induzidas por conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V fornecendo antígenos próprios associados a tumor, um antígeno de doença infecciosa (HIV) e um antígeno estranho.
[071]Figura 38: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas de carga diferente (C) ou moléculas hidrofóbicas diferentes (H) com base em poli(aminoácidos) da fórmula II ligadas a adjuvantes da fórmula III.
[072]Figura 39: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas hidrofóbicas diferentes (H) baseadas em poli(aminoácidos) da fórmula II ligadas a agonistas PRR diferentes.
[073]Figura 40: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V onde o antígeno de peptídeo (A) é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) usando químicas de ligador diferentes (amida e tio éter).
[074]Figura 41: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas
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27/314 hidrofóbicas diferentes (H) com base em ácidos graxos, lipídeos e colesterol.
[075]Figura 42: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV e V compreendidos de copolímeros dibloco tipo A-B baseados em moléculas hidrofóbicas diferentes (H).
[076]Figura 43: mostra o tamanho de partícula e estabilidade de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V baseados em antígenos de peptídeo (A) ligados a partículas pré-formadas (P).
[077]Figura 44: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo fornecendo auto-antígenos usados para induzir tolerância.
[078]Figura 45: mostra o tamanho de partícula e atividade biológica de partículas compreendidas de A-H + C-H ou A-H(C) (fórmula VI).
Descrição detalhada
[079]Detalhes de termos e métodos são fornecidos abaixo para fornecer maior clareza em relação a compostos, composições, métodos e o(s) uso(s) dos mesmos para induzir uma resposta imune em um indivíduo para fins de orientar aqueles com conhecimentos comuns na técnica na prática da presente revelação. A terminologia nessa revelação é entendida como sendo útil para fins de fornecer uma melhor descrição de modalidades específicas e não deve ser considerada limitadora.
[080]Aproximadamente: No contexto da presente revelação, “aproximadamente” significa mais ou menos 5% de uma quantidade definida. Por exemplo, “aproximadamente 10” se refere a 9.5 a 10.5. Uma razão de “aproximadamente 5:1 ” se refere a uma razão de 4.75:1 a 5.25:1.
[081]Adjuvante: qualquer material adicionado a vacinas para aumentar ou modificar a imunogenicidade de um antígeno. Adjuvantes podem ser sistemas de fornecimento, como partículas baseadas em sais inorgânicos (Por exemplo, sais de fosfato ou hidróxido de alumínio mencionados como alume), emulsões de água em
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28/314 óleo ou óleo em água ou partículas de polímero (por exemplo, PLGA) nas quais antigeno é simplesmente misturado com ou adsorvido, incorporado em ou ligado indireta ou diretamente através de interações covalentes. Alternativamente, adjuvantes podem ser moléculas quimicamente definidas que se ligam a receptores definidos e induzem vias de sinalização à jusante, incluindo agonistas de receptor de reconhecimento de padrão (PRR), como agonistas sintéticos ou de ocorrência natural de receptores do tipo Toll (TLRs), estimulador de genes de interferon (STING), receptores semelhantes a domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeo (NLRs), receptores semelhantes a gene-l induzíveis por ácido retinóico (RLRs) ou receptores de lectina do tipo C (CLRs), bem como moléculas biológicas (um “adjuvante biológico”) como IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL. Análogos de molécula pequena de bases de nucleotídeo, como hidroxiadenina e imidazoquinolinas, que se ligam a receptores-7 do tipo Toll (TLR-7) e TLR-7/8a, respectivamente, bem como agonistas de TLR-2/6, TLR-4, STING e NOD são usados como agonistas PRR exemplificadores na presente revelação. A pessoa com conhecimentos comuns na técnica está familiarizada com adjuvantes (vide: Perrie et al., Int J Pharm 364:272280, 2008 e Brito et al., Journal of controlled release, 1900:563-579, 2014). Em geral, qualquer agonista PRR ou adjuvante biológico listado na presente invenção pode ser unido ao conjugado de antigeno de peptídeo da presente revelação através de qualquer meio adequado.
[082]Administração: Fornecer ou dar a um indivíduo um agente, por exemplo, uma composição imunogênica compreendendo um conjugado de antigeno de peptídeo como descrito na presente invenção, por qualquer via eficaz.
[083]Vias de administração exemplificadoras incluem, porém não são limitadas a vias oral, injeção (como subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), transdérmica (por exemplo, tópica), intranasal, vagina
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29/314 e inalação.
[084]“Administração de” e “administrar um” composto deve ser entendido como significando fornecer um composto, um pró-medicamento de um composto, ou uma composição farmacêutica como descrito aqui. O composto ou composição pode ser administrado por outra pessoa ao sujeito ou pode ser auto-administrado pelo indivíduo.
[085]Célula que apresenta antígeno (APC): qualquer célula que apresente antígeno ligado a moléculas MHC classe I ou classe II para as células T, incluindo, porém não limitado a monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T e células Langherans.
[086]Antígeno: qualquer molécula que contenha um epítopo que se liga a um receptor de célula T ou célula B e possa estimular uma resposta imune, em particular, uma resposta de célula B e/ou uma resposta de célula T em um indivíduo. Os epítopos podem ser compreendidos de peptídeos, glicopeptídeos, lipídeos ou quaisquer moléculas adequadas que contêm um epítopo que possa interagir com os componentes das proteínas de célula T ou célula B específicas. Tais interações podem gerar uma resposta pela célula imune. “Epítopo” se refere à região de um antígeno de peptídeo ao qual proteínas de célula B e/ou T, isto é, receptores de célula-B e receptores de célula-T interagem.
[087]Antígenos usados em modalidades da presente revelação podem ser selecionados de patógenos, células cancerosas, auto-antigenos ou alérgenos. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um antígeno baseado em peptídeo que pode incluir uma região de um polipeptidio ou proteína a partir de um patógeno (como um vírus, bactéria ou fungos) ou um tecido de interesse (como uma célula cancerosa). Em outras modalidades, o antígeno pode ser uma proteína inteira ou glicoproteína derivada de um patógeno, ou um peptídeo ou fragmento de glicopeptídeo da proteína ou glicoproteína. Em outras modalidades, o antígeno pode
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30/314 ser uma proteína, ou fragmentos de peptídeo de uma proteína, que é expresso principalmente por tecido de tumor (porém não tecido saudável) e é um antígeno associado ao tumor. Em outras modalidades, o antígeno é proteína ou peptídeo que é associado a auto-imunidade. Ainda em outras modalidades, o antígeno é uma proteína ou glicoproteina que é associada a alergias.
[088]Muitos desses antígenos podem ser usados de acordo com modalidades da invenção e são discutidos em maior detalhe na presente invenção.
[089]Aromático: compostos aromáticos são anéis cíclicos insaturados com um número ímpar de pares de elétrons pi orbital que são deslocalizados entre os átomos de carbono ou nitrogênio formando o anel. Aminoácidos aromáticos incluem aqueles com uma cadeia secundária compreendendo um grupo aromático, como fenil alanina, tirosina ou triptofano. Benzeno, um anel 6-carbono contendo três ligações duplas é um composto aromático prototípico. Fenil alanina (Phc) e Triptofano (Trp) são aminoácidos aromáticos prototípicos. Arila pode se referir a um substituinte aromático e aril-amina pode se referir a um grupo aromático compreendendo uma amina. Uma amina aromática exemplificadora é anilina. Heterociclos aromáticos se referem a anéis aromáticos compreendendo estruturas de anel cíclico compreendendo carbono e outro átomo, como nitrogênio, oxigeno ou enxofre. Bases de nucleotídeo, como adenina e citosina, são heterociclos aromáticos exemplificadores.
[090]Biocompatível: Materiais são considerados biocompatíveis se exercerem efeitos de resposta hospedeira ou destrutiva mínimos enquanto em contato com fluidos corpóreos, células ou tecidos.
[091 ]Um grupo biocompatível pode conter frações químicas, incluindo a partir das seguintes classes: alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arila ou heteroarila. Entretanto, dependendo da composição molecular, tais frações nem sempre são biocompatíveis.
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[092]O termo “biocompatibilidade” é alternativamente tomado como significando interações mínimas com proteínas de reconhecimento e/ou outros componentes de sistemas biológicos (por exemplo, anticorpos de ocorrência natural, proteínas de célula incluindo glicoproteínas ou células); ou substâncias e grupos funcionais especificamente destinados a causar interações com componentes de sistemas biológicos (por exemplo, drogas e pró-medicamentos), de modo que o resultado das interações não seja substancialmente negativo ou destrutivo.
[093]CD4: cluster de diferenciação 4, uma glicoproteina de superfície que interage com moléculas MHC classe II persentes na superfície de outras células. Um subconjunto de células T expressa CD4 e essas células são comumente mencionadas como células T ajudantes.
[094]CD8: cluster de diferenciação 8, uma glicoproteina de superfície que interage com moléculas MHC classe I presentes na superfície de outras células. Um subconjunto de células T expressa CD8 e essas células são comumente mencionadas como células T citotóxicas ou células T assassinas.
[095]Carga: uma propriedade física de matéria que afeta suas interações com outros átomos e moléculas, incluindo solutos e solventes. Matéria carregada experimenta força eletrostática a partir de outros tipos de matéria carregada bem como moléculas que não contêm um valor inteiro total de carga, como moléculas polares. Duas moléculas carregadas de carga similar repelem uma à outra, ao passo que duas moléculas carregadas de carga diferente se atraem. A carga é frequentemente descrita em unidades inteiras positivas ou negativas.
[096]Molécula carregada (C): uma molécula carregada (C) se refere a qualquer molécula que tenha um ou mais grupos funcionais que são carregados positiva ou negativamente. Os grupos funcionais compreendendo a molécula carregada podem ser valores inteiros de carga, parciais ou totais. Uma molécula carregada pode ser uma molécula com um grupo funcional de carga única ou grupos
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32/314 funcionais de carga múltipla. Grupos funcionais podem ser permanentemente carregados ou os grupos funcionais compreendendo a molécula carregada podem ter carga dependendo do pH. A molécula carregada pode ser compreendida de grupos funcionais positivamente carregados, grupos funcionais negativamente carregados ou grupos funcionais tanto positiva como negativamente carregados. A carga líquida da molécula carregada pode ser positiva, negativa ou neutra. A carga de uma molécula pode ser prontamente estimada com base na estrutura Lewis de uma molécula e métodos aceitos conhecidos por aqueles versados na técnica. A carga pode resultar de efeitos indutivos, por exemplo, átomos ligados juntos com diferenças em afinidade de elétron podem resultar em uma ligação covalente polar resultando em um átomo parcialmente negativamente carregado e um átomo parcialmente positivamente carregado. Por exemplo, nitrogênio ligado a hidrogênio resulta em carga negativa parcial em nitrogênio e uma carga positiva parcial sobre o átomo de hidrogênio. Alternativamente, um átomo pode ser considerado como tendo um valor inteiro de carga total quando o número de elétrons atribuído àquele átomo é menor ou igual ao número atômico do átomo. A carga de um grupo funcional é determinada por somar a carga de cada átomo compreendendo o grupo funcional. A carga líquida da molécula carregada (C) é determinada por somar a carga de cada átomo compreendendo a molécula. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com o processo de estimar carga de uma molécula, ou grupos funcionais individuais, por somar a carga formal de cada átomo em uma molécula ou grupo funcional, respectivamente.
[097]Moléculas carregadas (C) podem compreender grupos funcionais negativamente carregados como aqueles que ocorrem como a base de conjugado de um ácido em pH fisiológico (por exemplo, grupos funcionais com um pKa menor que aproximadamente 6.5), por exemplo, em um pH de aproximadamente 7.4. Esses incluem, porém não são limitados a moléculas contendo carboxilatos,
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33/314 sulfatos, fosfatos, fosforamidatos e fosfonatos. Moléculas carregadas podem compreender grupos funcionais positivamente carregados como aqueles que ocorrem como o ácido conjugado de uma base em pH fisiológico (por exemplo, grupos funcionais em que o pKa do ácido conjugado de uma base é maior que aproximadamente 8.5). Esses incluem, porém não são limitados a moléculas contendo aminas primárias, secundárias e terciárias, bem como amônio, guanidínio. Moléculas carregadas podem compreender grupos funcionais com carga que é independente de pH, incluindo amônio quaternário, grupos funcionais de sulfônio e fosfônio. Em algumas modalidades, a molécula carregada é um poli(aminoácido) compreendido de aminoácidos negativa ou positivamente carregados, ou aminoácidos tanto negativa como positivamente carregados. Em algumas modalidades, o aminoácido negativamente carregado é ácido glutâmico ou ácido aspártico. Em outras modalidades, o aminoácido positivamente carregado é lisina ou arginina. Aqueles versados na técnica reconhecem que muitas dessas modalidades são possíveis.
[098]Reação química de click: pode se referir a uma reação bio-ortogonal que une dois compostos juntos em condições brandas em uma reação de rendimento alto que gera subprodutos mínimos, biocompatíveis e/ou inofensivos. Uma reação química de clique exemplificadora usada na presente revelação é a reação de um grupo azida fornecido em um precursor de ligador X1 com um alcino fornecido em um precursor de ligador X2 que forma um Ligador de triazol (L) através de adição de ciclo alcino-azida [3+2] promovida por tensão.
[099]Quantidade eficaz: a quantidade necessária para induzir uma resposta desejada. Por exemplo, a quantidade de um agente, individualmente ou com um ou mais agentes adicionais, necessária para induzir uma resposta imune, por exemplo, para um conjugado de antígeno de peptideo.
[0100]Extensão(ões): o termo extensão é usado na presente invenção para
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34/314 descrever moléculas ligadas ao N- ou C-terminal do antígeno de peptídeo (A) que são compreendidas de aminoácidos, aminoácidos não naturais; monômeros de óxidos de etileno hidrofílico (isto é, PEG); cadeias de alcano hidrofóbica; ou combinações dos mesmos e funcionam para modular a taxa de degradação do antígeno de peptídeo (A), extensões ligadas ao N-terminal do antígeno de peptídeo são mencionadas como B1 e extensões ligadas ao C-terminal do antígeno de peptídeo são mencionadas como B2. As extensões (B1 e B2) funcionam principalmente para controlar a taxa de degradação do antígeno de peptídeo, porém podem executar qualquer uma ou mais funções adicionais. Em algumas modalidades, extensões (B1 e/ou B2) podem ser ligadas a outra molécula, como uma molécula carregada (C) ou molécula hidrofóbica (H) e funcionam como um ligador bem como controlam a taxa de liberação do antígeno de peptídeo (A) a partir da outra molécula. Em modalidades adicionais, extensões (B1 e/ou B20 funcionam para fornecer distância, isto é, espaço, entre quaisquer duas moléculas heterólogas. Em outras modalidades, extensões (B1 e/ou B2) funcionam para transmitir propriedades hidrofóbicas ou hidrofílicas no conjugado de antígeno de peptídeo. Ainda em outras modalidades, as composições das extensões (B1 e/ou B2) usadas como um ligador podem ser selecionadas para transmitir rigidez ou flexibilidade entre o antígeno de peptídeo (A) e uma molécula heteróloga. Em modalidades preferidas, extensões (B1 e/ou B2) são sequências de peptídeo que são selecionadas para reconhecimento e hidrólise por enzimas, como proteases. Observe que as extensões B1 e B2 podem ser também mencionadas como ligadores B1 e B2 ou Bi e B2, respectivamente. Composições específicas de extensões que seriam adequadas para a prática da presente revelação são descritas do início ao fim.
[0101]Polímero de enxerto: pode ser descrito como um polímero que resulta a partir da ligação de um polímero de uma composição às cadeias secundárias de
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35/314 um segundo polímero de uma composição diferente. Um primeiro polímero ligado através de comonômeros a um segundo polímero é um copolímero de enxerto. Um primeiro polímero ligado através de um grupo final a um segundo polímero pode ser descrito como um polímero de bloco (por exemplo, dibloco do tipo A-B) ou um polímero enxertado final.
[0102]Valor GRAVY/índice de hidropatia: é um número representando as características hidrofóbicas ou hidrofílicas de um aminoácido. Há uma variedade de escalas que podem ser usadas para descrever as características hidrofóbicas e hidrofílicas relativas de aminoácidos compreendendo peptídeos. Na presente revelação, a escala de Hidropatia de Kyte e Doolittle (Kyte J, Doolittle RF, J. Mol. Biol 157: 105-32, 1983) é usada para calcular a média grande de valor de hidropatia (GRAVY), às vezes mencionado o score GRAVY, da sequência de aminoácidos compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo, incluindo o antígeno de peptídeo (A), extensões opcionais N- e C-terminal baseadas em peptídeo (B1 e B2) e a molécula carregada opcional (C). O valor GRAVY de um peptídeo é a soma dos valores de Hidropatia de todos os aminoácidos compreendendo o peptídeo dividido pelo comprimento (isto é, número de aminoácidos) do peptídeo. O valor GRAVY é um valor relativo. Quanto maior o valor GRAVY, mais hidrofóbica uma sequência de peptídeo é considerada, ao passo que quando menor o valor GRAVY, mais hidrofílica uma sequência de peptídeo é considerada.
[0103]Hidrofílico: se refere à tendência de um material dispersar livremente em meios aquosos. Um material é considerado hidrofílico se tiver uma preferência por interagir com outro material hidrofílico e evita interagir com material hidrofóbico. Em alguns casos, hidrofilicidade pode ser usada como um termo relativo, por exemplo, a mesma molécula pode ser descrita como hidrofílica ou não dependendo de com o que está sendo comparada. Moléculas hidrofílicas são frequentemente polares e/ou carregadas e têm boa solubilidade em água, por exemplo, são solúveis
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36/314 até 0,1 mg/mL ou mais.
[0104]Hidrofóbico: se refere à tendência de um material evitar contato com água. Um material é considerado hidrofóbico se tiver preferência por interagir com outro material hidrofóbico e evita interagir com material hidrofílico. Hidrofobicidade é um termo relativo; a mesma molécula pode ser descrita como hidrofóbica ou não dependendo de com o que está sendo comparada. Moléculas hidrofóbicas são frequentemente não polares e não carregadas e têm solubilidade ruim em água, por exemplo, são insolúveis até 0,1 mg/mL ou menos.
[0105]Ligando hidrofóbico: é uma molécula que se liga a receptores biológicos e tem características hidrofóbicas. Em algumas modalidades, ligandos hidrofóbicos são dispostos ao longo da estrutura de um polímero desse modo transmitindo propriedades hidrofóbicas ao polímero ao qual é ligado. Em algumas modalidades, o ligando hidrofóbico é um agonista de receptor de reconhecimento de padrão que tem solubilidade limitada em água e pode ser, portanto, descrito como hidrofóbico. Em modalidades adicionais, o ligando hidrofóbico é um agonista TLR-7 ou TLR-7/8, como imidazoquinolina.
[0106]Molécula hidrofóbica (H): na presente revelação, o termo “molécula hidrofóbica” (H) é usado como um termo geral para descrever uma molécula com solubilidade limitada em água, ou características anfifílicas, que pode ser ligada a antígenos de peptídeo resultando em um conjugado de antígeno de peptídeo que forma partículas em condições aquosas. A molécula hidrofóbica (H) nesse contexto promove montagem de partícula devido a sua solubilidade ruim, ou tendência a montar em partículas, em condições aquosas em certas temperaturas e faixas de pH.
[0107]Moléculas hidrofóbicas (H) como descrito aqui são inclusivas de moléculas anfifílicas que podem formar estruturas supramoleculares, como micelas ou estruturas lamelares de formação de bicamada ou multi-lamelares (por exemplo,
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37/314 lipossomas ou polimersomes) bem como compostos que são totalmente insolúveis e formam agregados individualmente. As características hidrofóbicas da molécula podem ser responsivas à temperatura e/ou pH. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que é solúvel em água em baixas temperaturas, porém é insolúvel, ou formação de micela, em temperaturas acima, por exemplo, 20°C, como 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 °C. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que é solúvel em água em baixo pH, por exemplo, em um pH abaixo de
6.5 porém insolúvel, por exemplo, em um pH acima de 6.5. Os exemplos de moléculas hidrofóbicas (H) incluem, porém não são limitadas a ácidos graxos, colesterol e seus derivados, alifáticos de cadeia longa, lipideos e vários polímeros, como poliestireno, poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), bem como poli(aminoácidos) compreendidos predominantemente de aminoácidos hidrofóbicos. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero hidrofílico com múltiplos ligandos hidrofóbicos fixados. Uma variedade de moléculas hidrofóbicas úteis para a prática da presente revelação é revelada na presente invenção.
[0108]Resposta imune: Uma alteração na atividade de uma célula do sistema imune, como uma célula B, célula T, ou monócito, como resultado de um estímulo, direta ou indiretamente, como através de um intermediário de citosina ou celular. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antigeno específico (uma “resposta específica de antigeno”). Em uma modalidade, uma resposta imune é uma respostas de célula T, como uma respostas de célula T CD4 ou uma resposta de célula T CD8. Em uma modalidade, uma resposta imune resulta na produção de progênie de célula T adicional. Em uma modalidade, uma resposta imune resulta no movimento de células T. Em outra modalidade, a resposta é uma resposta de célula B, e resulta na produção de anticorpos específicos ou na produção de progênie de célula B adicional. Em outras modalidades, a resposta é uma resposta de célula que
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38/314 apresenta antígeno. “Aumenta uma resposta imune” se refere à administração conjunta de um adjuvante e um agente imunogênico, como um antígeno de peptídeo, como parte de um conjugado de antígeno de peptídeo, em que o adjuvante aumenta a resposta imune desejada ao agente imunogênico em comparação com a administração do agente imunogênico ao indivíduo na ausência do adjuvante. Em algumas modalidades, um antígeno é usado para estimular uma resposta imune levando à ativação de células T citotóxicas que matam células infectadas por via viral ou células cancerosas. Em algumas modalidades, um antígeno é usado para induzir tolerância ou supressão imune. Uma resposta tolerogênica pode resultar a partir da não capacidade de resposta de uma célula T ou célula B a um antígeno. Uma resposta imune supressiva pode resultar a partir da ativação de células reguladoras, como células T reguladoras que infra-regulam a resposta imune, isto é, amortecem a resposta imune. Antígenos administrados a um paciente na ausência de um adjuvante são em geral tolerogênicos ou supressivos e antígenos administrados com um adjuvante são em geral estimuladores e levam ao recrutamento, expansão e ativação de células imunes.
[0109]Composição imunogênica: Uma formulação de materiais compreendendo um antígeno e opcionalmente um adjuvante que induz uma resposta imune mensurável contra o antígeno.
[0110]Ligando: é um termo geral para descrever qualquer molécula que se liga a um receptor biológico. Um agonista de receptor de reconhecimento de padrão é um tipo específico de Ligando que se liga a um receptor de reconhecimento de padrão e pode ser também mencionado como um adjuvante ou Ligando com propriedades adjuvantes. Por exemplo, um agonista de PRR é um Ligando que se liga a um PRR, como um TLR. Um Ligando que se lia a um PRR (ou PRRa) também ser também mencionado como um adjuvante, adjuvante molecular, molécula adjuvante ou Ligando com propriedades adjuvantes. Um Ligando que tem
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39/314 solubilidade limitada em água pode ser como um Ligando hidrofóbico, enquanto um ligando que é solúvel em água pode ser mencionado como um Ligando hidrofóbico. Um ligando hidrofóbico ou ligando hidrofílico que tem propriedades adjuvantes pode ser mencionado como um adjuvante hidrofóbico ou adjuvante hidrofílico, respectivamente.
[0111]Ligado ou acoplado: O termo “ligado” ou “acoplado” significa junto, direta ou indiretamente. Uma primeira fração pode ser covalentemente ou não covalentemente ligada a uma segunda fração. Em algumas modalidades, uma primeira molécula é ligada por uma ligação covalente a outra molécula. Em algumas modalidades, uma primeira molécula é liada por forças dipolo-dipolo (por exemplo, ligação por hidrogênio) a outra molécula. Em algumas modalidades, uma primeira molécula é ligada por forças van der Waals (também conhecidas como forças London) a outra molécula. Uma primeira molécula pode ser ligada por todas e quaisquer combinações de tais acoplamentos a outra molécula.
[0112]As moléculas podem ser ligadas indiretamente como por usar um ligador. As moléculas podem ser ligadas indiretamente por interposição de um componente que liga não covalentemente a ambas as moléculas independente.
[0113]Como usado aqui, “ligado” e variações do mesmo, se referem a manter moléculas em associação química ou física, incluindo após imunização, pelo menos até entrarem em contato com uma célula, particularmente uma célula imune.
[0114]Em algumas modalidades, componentes ligados são associados de modo que os componentes não sejam livremente dispersáveis um do outro, pelo menos até contatarem uma célula, como uma célula imune. Por exemplo, dois componentes podem ser covalentemente ligados entre si de modo que os dois componentes sejam compreendidos de antigenos de peptídeo (A) que são covalentemente ligados a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2). Conjugados de antigeno de
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40/314 peptídeo compreendendo uma molécula hidrofóbica (H) são montados em partículas em condições aquosas, em que dois ou mais conjugados de antígeno de peptídeo se associam para formar um estável onde os conjugados de antígeno de peptídeo individuais e componentes compreendendo os conjugados de antígeno de peptídeo são incapazes de dispersar ou difundir antes de encontrar uma célula, como uma célula imune.
[0115]A ligação é especificamente distinguida a partir de uma mistura única de antígeno e adjuvante como pode ser encontrado, por exemplo, em uma vacina convencional, por exemplo, uma vacina que contém um antígeno de peptídeo solúvel em água misturado com um adjuvante. Em uma mistura simples, os componentes podem ser livres para dispersar independentemente no tecido vacinado e além.
[0116]Ligadores, precursores de ligador e o Ligador (L): um ligador é uma molécula ou grupo de átomos que liga ou acopla ou une juntas duas ou mais frações. Os conjugados de antígeno de peptídeo revelados aqui são moléculas complexas que compreendem múltiplos componentes funcionais diferentes (antígeno de peptídeo (A), molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P), extensões opcionais (B1 e/ou B2), molécula carregada opcional (C), Ligador opcional L), ou adjuvante(s) opcional (is), etc.) que podem ser ligados, ou unidos juntos, através de qualquer meio adequado. Por exemplo, um antígeno de peptídeo (A) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) pode usar um ligador entre o antígeno de peptídeo (A) e a molécula hidrofóbica (Η). O antígeno de peptídeo (A) pode usar um ligador entre o antígeno de peptídeo (A) e a molécula hidrofóbica (Η). O antígeno de peptídeo (A) pode ser ligado à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) direta ou indiretamente através do ligador (L), extensões (B1 ou B2) ou a molécula carregada (C) através de qualquer meio adequado, incluindo qualquer ligador adequado. Em algumas modalidades, o ligador é covalentemente ligado a ambas as frações sendo
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41/314 acopladas. Em algumas modalidades, ligadores são bifuncionais, significando que o ligador inclui um grupo funcional em dois sítios, em que os grupos funcionais são usados para acoplar o ligador nas duas frações. Os dois grupos funcionais podem ser iguais (que seria considerado um ligador homobifuncional) ou diferente (que seria considerado um ligador heterobifuncional). Por exemplo, em algumas modalidades, um precursor de ligador X2 compreendendo um ligador heterobifuncional compreendendo ainda um alcino e um ácido é usado para ligar uma molécula hidrofóbica (H) contendo uma amina e um antígeno de peptídeo (A) ligado a um precursor de ligador X1 que contém uma azida; o ácido e alcino do precursor de ligador X2 são reagidos para formar ligações de amida e triazol com a amina e azida respectivamente, desse modo ligando as duas moléculas heterólogas. Em algumas modalidades, o precursor de ligador X2 compreendendo um ligador heterobifuncional é uma molécula de dibenzociclooctina (DBCO) ligado a um ácido. Em outras modalidades, o precursor de ligador é um ácido ligado a uma maleimida que une uma amina e tiol ou um bis(ácido carboxílico) que une duas aminas. Ainda em outras modalidades, um ligador tri- ou multifuncional pode ser usado, em que as ligações são iguais ou diferentes. Em outras modalidades, uma extensão de peptídeo N- ou C-terminal clivável (B1 ou B2) é usada para ligar um antígeno de peptídeo (A) a uma molécula hidrofóbica (H). Em algumas modalidades, a extensão de peptídeo clivável (B1 ou B2) é heterobifuncional, por exemplo, uma amina Nterminal de uma extensão B2 é ligada ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) e o grupo carboxila C-terminal da extensão B2 é ligado diretamente a uma molécula hidrofóbica (H). uma extensão (B1 ou B2) pode funcionar como um ligador porém nem todos os ligadores são extensões.
[0117]Ligadores (L) são subconjuntos específicos de ligadores que resultam da reação do precursor de ligador X1 com o precursor de ligador X2 e funcionam especificamente para unir o antígeno de peptídeo (A) a uma molécula hidrofóbica
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42/314 (H) ou Partícula (P) direta ou indiretamente através de uma extensão )B1 ou B2) ou molécula carregada (C). Ligadores executam a função específica de acoplar seletivamente no sítio, isto é, unir ou ligar juntos o antígeno de peptídeo (A) com uma molécula hidrofóbica (H) ou uma Partícula (P). Um precursor de ligador X1 pode ser ligado a um antígeno de peptídeo direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) tipicamente durante síntese de peptídeo de fase sólida. Observe que o precursor de ligador X1 ligado diretamente ao N- ou C-terminal do antígeno de peptídeo (A) não são consideradas extensões visto que não funcionam especificamente para modular a taxa de degradação do antígeno de peptídeo (A), o precursor de ligador X1 não é selecionado para modular a taxa de degradação do antígeno de peptídeo (A) ou sua liberação a partir de outras moléculas e ao invés funciona especificamente para unir o antígeno de peptídeo (A) à molécula hidrofóbica (H) ou partícula (P).
[0118]Em algumas modalidades, um precursor de ligador X1 pode ser ligado a um antígeno de peptídeo (A) durante síntese de peptídeo de fase sólida; a ligação pode ser direta, ou indireta através de uma extensão (B1 ou B2), incluindo um ligador de peptídeo degradável. Tipicamente, o precursor de ligador X1 ligado direta ou indiretamente ao antígeno de peptídeo (A) é selecionado para promover uma reação bioortogonal com um precursor de ligador X2 fornecido em uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). Reações bioortogonais permitem ligação seletiva de sítio do antígeno de peptídeo (A) com a molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) sem resultar na modificação de quaisquer aminoácidos compreendendo o antígeno de peptídeo (A). Precursores de ligador preferidos X1 quer permitem reações bioortogonais incluem aqueles contendo azidas ou alcinos. Precursores de ligador adicionais X1 que permitem a reatividade seletiva de sítio, dependendo da composição do antígeno, incluindo tióis, hidrazinas, cetonas e aldeídos. Em várias modalidades, o precursor de ligador tem um grupo funcional de azida. Em algumas
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43/314 modalidades, o precursor de ligador X1 é um aminoácido não natural contendo uma azida, por exemplo, azido-lisina Lys(N3). Em tais modalidades, um antigeno de peptídeo (A) ligado ao precursor de ligador X1 contendo uma funcionalidade de azida pode reagir com um alcino contendo precursor de ligador X2 fornecido em uma molécula hidrofóbica (H) resultando na formação de um Ligador de triazol que une o antigeno de peptídeo (A) e a molécula hidrofóbica (H). Vários precursores de ligador (X1 e X2) e Ligadores são descritos do início ao fim.
[0119]Na presente invenção, o Ligador e o precursor de ligador X1 pode tanto ser mencionado como um Tag(T), embora, o contexto do Tag(T) seja usado para discernir se o Tag(T) é um Ligador ou precursor de ligador (X1). Um Tag(T) que é ligado a um antigeno de peptídeo (A) direta ou indiretamente através da extensão opcional (B1 ou B2) ou a molécula carregada opcional (C) porém não é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P), também pode ser mencionado como um precursor de ligador X1. Um Tag(T) que liga o antigeno de peptídeo (A) a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) pode ser também mencionado como um Ligador (L). O precursor de ligador X2 reage com o precursor de ligador X1 para formar um Ligador. O precursor de ligador X1 pode às vezes ser mencionado como um Tag e o precursor de ligador X2 pode ser mencionado como uma fração reativa de tag ou molécula reativa de tag compreendendo um grupo funcional que é específico ou reativo em direção a Tag.
[0120]Carga líquida: A soma de cargas eletrostáticas carregadas por uma molécula ou, se especificado, uma seção de uma molécula.
[0121 JPartícula: Uma estrutura supramolecular de tamanho nano ou micro compreendida de um conjunto de moléculas. Conjugados de antigeno de peptídeo da presente revelação compreendem antígenos de peptídeo (A) ligados a Partículas pré-formadas (P) ou moléculas hidrofóbicas (H) que são montadas em micelas ou outras estruturas supramoleculares. Partículas compreendendo conjugados de
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44/314 antígeno de peptideo podem ser absorvidas em células (por exemplo, células imunes, como células que apresentam antígeno). Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno de peptideo forma uma partícula em solução aquosa. Em algumas modalidades, formação de partícula pelo conjugado de antígeno de peptideo é dependente de pH ou temperatura. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendidas de conjugados de antígeno de peptideo têm um diâmetro médio entre 5 nanômetros (nm) a 500 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendidas de conjugados de antígeno de peptideo podem ser maiores que 100 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendidas de conjugados de antígeno de peptideo são incluídas em estruturas de partícula maiores que são demasiadamente grandes para absorção por células imunes (por exemplo, partículas maiores que aproximadamente 5000 nm) e liberam lentamente as nanopartículas menores compreendendo o conjugado de antígeno de peptideo.
[0122]Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno de peptideo compreendendo uma molécula hidrofóbica (H) formam nanopartículas. As nanopartículas formam por associação de conjugados de antígeno de peptideo através de interações hidrofóbicas e podem, portanto, ser consideradas uma montagem supramolecular. Em algumas modalidades, a nanopartícula é uma micela. Em modalidades preferidas, as micelas de nanopartícula estão entre 5 e 50 nm em diâmetro. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno de peptideo forma micelas e a formação de micela é dependente de temperatura, de pH ou tanto de temperatura como de pH. Em algumas modalidades, as nanopartículas reveladas compreendem conjugados de antígeno de peptideo que são compreendidos de antigenos de peptideo (A) ligados a uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de polímeros ligados a um Ligando com propriedades adjuvantes, por exemplo, um agonista PRR; a ligação do antígeno de peptideo juntamente com o agonista PRR nas nanopartículas evita que o agonista PRR disperse livremente após
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45/314 administração em um indivíduo desse modo evitando toxicidade sistêmica.
[0123]A partícula pode ser formada por um conjunto de moléculas individuais compreendendo os conjugados de antígeno de peptídeo, ou no caso de conjugado de antígeno de peptídeo compreendido de um antígeno de peptídeo (A) ligado a uma Partícula pré-formada (P), a partícula pode ser reticulada através de interações covalentes ou não covalentes.
[0124]Partícula pré-formada (P)/Partícula (P) de uma fórmula: A partícula pré-formada (P) ou simplesmente ‘Partícula’ (P) descreve uma Partícula que já é formada antes da ligação a um antígeno de peptídeo (A). Desse modo, a Partícula (P) é usada para descrever a Partícula de uma fórmula e é distinta a partir das partículas formadas por montagem de dois ou mais conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo uma molécula hidrofóbica (H). Para clareza, as partículas formadas pela montagem de conjugados de antígenos de peptídeo são distintas de Partículas pré-formadas (P) ou Partículas (P) de uma fórmula. Em algumas modalidades, um antígeno de peptídeo (A) pode ser ligado diretamente ou indiretamente a uma Partícula (P) para formar um conjugado de antígeno de peptídeo, e o conjugado de antígeno de peptídeo pode ser uma partícula em condições aquosas.
[0125]Para delinear entre partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo e Partículas pré-formadas (P), a letra p é sempre em maiúscula em ‘Partícula’ seguido por uma letra maiúscula em parênteses ‘P’, isto é, “Partícula (P”, ao se referir a uma Partícula pré-formada ou Partícula (P) de uma fórmula. Em algumas modalidades, a Partícula (P) pode ser uma Partícula PLGA (P) que é formada em condições aquosas e então ligada a um antígeno de peptídeo (A) para formar um conjugado de antígeno de peptídeo que permanece como partículas em condições aquosas. Em algumas modalidades, a Partícula (P) pode ser compreendida de lipídeos, como uma Partícula lipossomal (P), que é formada em
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46/314 condições aquosas e então ligada a antígenos de peptídeo (A) para formar um conjugado de antígeno de peptídeo que permanecem como partículas em condições aquosas.
[0126]Receptores de reconhecimento de padrão (PRRs): Receptores expressos por várias populações de célula, particularmente células imunes inatas que se ligam a um grupo diverso de moléculas de ocorrência natural e sintéticas mencionadas como padrões moleculares associados a patógeno (PAMPS) bem como padrões moleculares associados a dano (DAMPs), PAMPs são motivos moleculares conservados persentes em certos organismos microbianos e vírus. DAMPs são componentes celulares que são liberados ou expressos durante morte de célula ou dano.
[0127]A ativação de PAMP ou DAMP de receptores de reconhecimento de padrão induz uma cascata de sinalização intracelular resultando na alteração da fisiologia de célula hospedeira. Tais alterações fisiológicas podem incluir alterações no perfil de transcrição da célula para induzir expressão de uma gama de genes próinflamatórios e pró-sobrevivência. A expressão coordenada desses genes pode aumentar imunidade adaptável.
[0128]Há várias classes de PRRs. Exemplos não limitadores de PRRs incluem receptores do tipo Toll (TLRs), receptores do tipo RIG-1 (RLRs), receptores do tipo NOD (NLRs), Estimulador de receptor de Genes de interferon (STING) e receptores de lectina do tipo C (CLRs). Agonistas de tais PRRs podem ser usados para aumentar uma resposta imune a um antígeno alvo.
[0129]Agonistas de PRRs são adjuvantes e podem ser mencionados como Ligandos ou Ligandos com propriedades adjuvantes. Em algumas modalidades da presente revelação, agonistas PRR são usados como adjuvantes para aumentar a resposta imune a um antígeno de peptídeo.
[0130]Receptores do tipo Toll (TLRs) 1-13 são PRRs de transmembrana que
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47/314 reconhecem uma gama diversa de PAMPs. Há duas categorias amplas de TLRs: aqueles que são localizados na superfície de célula e aqueles que são localizados no lúmen endossomal. TLRs que estão presentes na superfície de célula são tipicamente importantes em reconhecimento de bactérias. TLRs que estão persentes na superfície da célula são tipicamente importantes no reconhecimento de bactérias. TLRs que são localizados para o lúmen de endossomas, como TLRs 3, 7, 8 e 9, servem para reconhecer ácidos nucleicos e são desse modo tipicamente importantes no reconhecimento de vírus e, portanto, na promoção de respostas imunes antivirais. Ácido policitidílico-poliinosínico é um ligador para TLR-3. TLR-7 e TLR-8 reconhecem RNA de fita único bem como análogos de base de nucleotídeo e imidazoquinolinas. TLR-9 reconhece DNA desoxicitidilato-fosfato-desoxiguanilato (CpG), encontrado principalmente em bactérias.
[0131]Os receptores do tipo NOD (NLRs) e os receptores do tipo RIG-1 (RLRs) são localizados para o citoplasma. Exemplos não limitadores de RLRs incluem RIG-I, MDA5 e LGP2. Há 22 NLRs humanos que podem ser subdivididos nas cinco famílias NLR estruturalmente relacionadas A, B, C, P e X. Todos os NLRs têm três domínios: um domino N-terminal envolvido em sinalização, um domínio NOD de ligação de nucleotídeo e uma região rica em leucina C-terminal (LRR) importante para reconhecimento de ligando. Exemplos não limitadores de NLRs incluem NALP3 e NOD2.
[0132]Para mais informações sobre receptores de reconhecimento de padrão, vide Wales et al., Biochem Soc Trans 35:1501-1503, 2007.
[0133]Peptídeo ou polipeptidio: dois ou mais resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais que são unidos juntos através de uma ligação de amida. Os resíduos de aminoácido podem conter modificação(ões) pós-translação (por exemplo, glicosilação e/ou fosforilação). Tais modificações podem simular modificações pós-translação que ocorrem naturalmente in vivo ou podem ser não
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48/314 naturais. Qualquer um ou mais dos componentes do conjugado de antigeno de peptídeo podem ser compreendidos de peptídeos.
[0134]Não há limite superior conceptual sobre o comprimento de um peptídeo. O comprimento do peptídeo é tipicamente selecionado dependendo da aplicação. Em várias modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é compreendida de um peptídeo que pode estar entre 3 e 1.000 aminoácidos em comprimento, tipicamente não mais que 300 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades, a extensão N- e/ou C-terminal (B1 e/ou B2) é um peptídeo entre aproximadamente 1 e 8 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é um peptídeo compreendidos de aminoácidos positivamente, negativamente ou tanto positiva como negativamente carregados e tipicamente não tem mais de 16 aminoácidos em comprimento.
[0135]Em modalidades preferidas, o antigeno de peptídeo (A) é um peptídeo entre 5 e aproximadamente 50 aminoácidos, tipicamente aproximadamente 7 e 35 aminoácidos, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos. Em outras modalidades, o antigeno de peptídeo (A) tem aproximadamente 50 aminoácidos ou mais em comprimento. Desse modo, em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) pode ser considerado uma proteína.
[0136]Observe que o antigeno de peptídeo (A) pode ser um epitopo mínimo (às vezes mencionado como min ou ME) ou peptídeo longo (às vezes mencionado como LP ou SLP) que compreende um epitopo mínimo. Portanto, é entendido que quando se diz que um epitopo mínimo ou peptídeo longo é fornecido como um conjugado de antigeno de peptídeo, então o epitopo mínimo ou o peptídeo longo é o antigeno de peptídeo (A), a menos que dito de outro modo.
[0137]Em algumas modalidades, a molécula carregada opcional (C), antigeno (A), extensões opcionais (B1 e B2), e precursor de ligador X1 são
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49/314 aminoácidos e podem ser preparados por síntese de peptídeo de fase sólida como uma sequência de peptídeo contígua que é às vezes mencionada como um “fragmento de antígeno de peptídeo.” Observe que o cálculo da carga líquida ou GRAVY do fragmento de antígeno de peptídeo não inclui o precursor de ligador X1.
[0138]Sequências de peptídeo se referindo ao antígeno de peptídeo são designadas como “PA”, sequências de peptídeo se referindo à extensão N-terminal (B1) são designadas como “PN”, e sequências de peptídeo se referindo à extensão C-terminal (B2) são designadas como “PC”. Sequências de aminoácidos compreendendo antígenos de peptídeo (A) são representadas pela fórmula, PA1...PAn, onde PA representa qualquer resíduo de aminoácido compreendendo um antígeno de peptídeo (A) e n é um valor inteiro. Por exemplo, um antígeno de peptídeo de 8 aminoácidos (A) pode ser representado como PA1-PA2-PA3-PA4PA5-PA6-PA7-PA8. Sequências de aminoácidos compreendendo extensões Nterminal (B1) são representadas pela fórmula, PN... PNn, onde PN representa qualquer resíduo de aminoácido compreendendo uma extensão N-terminal e n é um valor inteiro. Sequências de aminoácidos compreendendo extensões C-terminal (B2) são representadas pela fórmula PC1... PCn, onde PC representa qualquer resíduo de aminoácido compreendendo uma extensão C-terminal e n é um valor inteiro.
[0139]Modificações de peptídeo: peptídeos podem ser alterados ou de outro modo sintetizados com uma ou mais de várias modificações como exposto abaixo. Além disso, análogos (moléculas orgânicas não peptídeo), derivados (moléculas de peptídeo quimicamente funcionalizadas obtidas iniciando de um peptídeo) e variantes (homólogos) desses peptídeos podem ser utilizados nos métodos descritos aqui. Os peptídeos descritos aqui são compreendidos de uma sequência de aminoácidos, análogos, derivados, e variantes, que podem ser versões L e/ou D. tais peptídeos podem conter peptídeos, análogos, derivados e variantes que são de ocorrência natural e de outro modo.
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[0140]Peptídeos podem ser modificados através de uma variedade de técnicas químicas para produzir derivados tendo essencialmente a mesma atividade como os peptídeos não modificados, e opcionalmente tendo outras propriedades desejáveis. Por exemplo, grupos de ácido carboxílico do peptídeo, quer no terminal carboxila ou em uma cadeia secundária, podem ser fornecidos na forma de um sal de um cátion farmaceuticamente aceitável ou esterificado para formar um éster CCiCC16, em que CC se refere a uma cadeia de carbono (e desse modo, CC1 se refere a um carbono único e CC16 se refere a 16 carbonos), ou convertidos em uma amina. Grupos amino do peptídeo, quer no terminal amino ou em uma cadeia secundária, podem estar na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, como o HCI, HBr, acético, trifluoroacético, fórmico, benzóico, tolueno sulfônico, maléico, tartárico e outros sais orgânicos, ou pode ser modificado ou convertido em uma amida.
[0141]Um aminoácido pode ser modificado de modo que contenha através de uma ligação covalente um agonista PRR, como agonista TLR, por exemplo, um agonista TLR-7 ou TLR-7/8 baseado em imidazoquinolina.
[0142]Peptídeos podem ser modificados para conter grupos substituintes que contêm uma carga positiva ou negativa ou ambas. A carga positiva e/ou negativa pode ser afetada pelo pH em que o peptídeo está presente.
[0143]Grupos hidroxila das cadeias secundárias de peptídeo podem ser convertidos em alcóxi CC1-CC16 ou em um éster CC1-CC16 usando técnicas bem conhecidas, ou os grupos hidroxila podem ser convertidos (por exemplo, sulfatados ou fosforilados) para introduzir carga negativa. Anéis fenólicos e fenila das cadeias secundárias de peptídeo podem ser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, como flúor, cloro, bromo ou iodo, ou com alquila CC1-CC16, alcóxi CC1CC16, ácidos carboxílicos e ésteres dos mesmos ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadeias secundárias de peptídeo podem ser
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51/314 estendidos para alquilenos CC2-CC4 homólogos. Tióis podem ser usados para formar ligações de dissulfeto ou tio éteres, por exemplo, através de reação com um maleimida. Tióis podem ser protegidos com qualquer de um número de grupos de proteção bem reconhecidos, como grupos acetamida. Aqueles versados na técnica também reconhecerão métodos para introduzir estruturas cíclicas nos peptídeos da presente invenção para selecionar e fornecer limitações de conformação para a estrutura que resultam em estabilidade aumentada. Pode-se fazer referência a Greene et al., “Greene’s Protective groups in Organic synthesis” quarta edição, John Wiley & Sons., Inc. 2006 para detalhes de modificações adicionais que podem ser feitas em grupos funcionais.
[0144]Modalidades peptidomiméticas e organomiméticas do antígeno de peptídeo (A) são previstas, pelo que a disposição tridimensional dos constituintes químicos de tais peptido- e organomimética simulam a disposição tridimensional da estrutura de peptídeo e cadeias secundárias de aminoácido componentes, resultando em tais peptido- e organomiméticas de um peptídeo imunogênico tendo capacidade mensurável para induzir tolerância ou supressão imune, ou capacidade aumentada de gerar uma resposta imune estimuladora, como resposta de anticorpo ou célula T citotóxica.
[0145]Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Carreadores (veículos) farmaceuticamente aceitáveis úteis na presente revelação são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, de E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15â edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para fornecimento farmacêutico de uma ou mais composições terapêuticas, como uma ou mais vacinas terapêuticas de câncer, e agentes farmacêuticos adicionais.
[0146]Em geral, a natureza do carreador dependerá do modo de administração específico sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais compreendem normalmente fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e
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52/314 fisiologicamente aceitáveis como água, solução salina fisiológica, soluções equilibradas de sal, dextrose aquosa, glicerol ou similar como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, pó, pílula, tablete, ou formas de cápsula), carreadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de carreadores biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsionantes, preservativos, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
[0147]Polar: uma descrição das propriedades de matéria. Polar é um termo relativo, e pode descrever uma molécula ou uma porção de uma molécula que tem carga parcial que se origina de diferenças em eletronegatividade entre átomos ligados juntos em uma molécula, como a ligação entre nitrogênio e hidrogênio. Moléculas polares têm uma preferência para interagir com outras moléculas polares e tipicamente não associam com moléculas não polares. Em casos não limitadores específicos, um grupo polar pode conter um grupo hidroxila, ou um grupo amino, ou um grupo carboxila, ou um grupo carregado. Em casos não limitadores, específicos, um grupo polar pode ter uma preferência para interagir com um solvente polar como água. Em casos não limitadores específicos, introdução de grupos polares adicionais pode aumentar a solubilidade de uma porção de uma molécula.
[0148]Polímero: uma molécula contendo unidades estruturais de repetição (monômeros). Como descrito em maior detalhe do início ao fim da revelação, polímeros podem ser usados para qualquer número de componentes do conjugado de antigeno de peptídeo e podem ser naturais ou sintéticos. Em modalidades preferidas, um polímero hidrofóbico ou anfifílico é usado como a molécula hidrofóbica (H) e aciona a montagem de partícula dos conjugados de antigeno de
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53/314 peptideo. Em algumas modalidades, o antígeno de peptideo (A) é um polímero compreendendo aminoácidos. Em algumas modalidades, as extensões (B1 e B2) compreendem polímeros, como, por exemplo, PEG, poli(amino ácidos) ou combinações dos mesmos. Os polímeros incluídos nas modalidades reveladas podem formar nanopartículas de polímero que podem ser administrados a um indivíduo sem causar efeitos colaterais adversos. Os polímeros incluídos nas modalidades reveladas podem formar nanopartículas de polímero que podem ser administrados a um indivíduo para causar uma resposta imune ou tratar e/ou melhorar uma doença. Os polímeros incluídos nas modalidades reveladas podem incluir uma cadeia secundária com um grupo funcional que pode ser utilizado, por exemplo, para facilitar ligação a um adjuvante ou uma molécula usada para induzir supressão imune ou tolerância, como macrolídeos, por exemplo, rapamicina. Em várias modalidades, o polímero pode conter dois ou mais blocos de polímero ligados através de um ligador para criar um copolímero de bloco, como um copolímero dibloco anfifílico. Em várias modalidades, um bloco de polímero pode ser predominantemente de caráter hidrofóbico. Em várias modalidades, o polímero consiste em peptideos, seus análogos, derivados e variantes. Várias composições de polímeros úteis para a prática da invenção são discutidos em maior detalhe em outra parte.
[0149]Polimerização: uma reação química, normalmente realizada com um catalisador, calor ou luz, na qual monômeros combinam para formar uma macromolécula semelhante à cadeia, ou reticulada (um polímero). As Cadeias podem ser combinadas adicionalmente por síntese química adicional usando os grupos substituintes apropriados e reações químicas. Os monômeros podem conter substâncias reativas. A polimerização ocorre comumente por adição ou condensação. Polimerização de adição ocorre quando um iniciador, normalmente um radical livre, reage com uma ligação dupla no monômero. O radical livre adiciona
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54/314 a um lado da ligação dupla, produzindo um elétron livre no outro lado. Esse elétron livre então reage com outro monômero, e a cadeia se torna de auto propagação, desse modo adicionando uma unidade de monômero em um tempo na extremidade de uma cadeia em crescimento. Polimerização por condensação envolve a reação de dois monômeros resultando na divisão de uma molécula de água. Em outras formas de polimerização, um monômero é adicionado um de cada vez a uma cadeia de crescimento através da introdução em estágios de monômeros ativos, como durante síntese de peptídeo de fase sólida.
[0150]Purificado: ter uma composição que é relativamente isenta de impurezas ou substâncias que adulteram ou contaminam uma substância. O termo purificado é um termo relativo e não requer pureza absoluta. Desse modo, por exemplo, um preparado de peptídeo purificado é um no qual o peptídeo ou proteína é mais enriquecido do que o peptídeo ou proteína está em seu ambiente natural, por exemplo, em uma célula. Em uma modalidade, um preparado é purificado de modo que o conjugado de antígeno de peptídeo representa pelo menos 50% do teor total do preparado. Purificação substancial indica purificação de outras proteínas ou componentes celulares. Uma proteína substancialmente purificada é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% puro. Desse modo, em um exemplo não limitador, específico, uma proteína substancialmente purificada é 99% isenta de outras proteínas ou componentes celulares ou peptídeos de contaminação.
[0151 ]Solúvel: capaz de se tornar molecular ou ionicamente disperso em um solvente para formar uma solução homogênea. Ao se referir a um peptídeo, um peptídeo solúvel é entendido como sendo uma molécula única em solução que não se monta em multímeros ou outras estruturas supramoleculares através de interações hidrofóbicas ou outras não covalentes. Uma molécula solúvel é entendida como sendo livremente dispersa como moléculas únicas em solução. Em várias modalidades, um antígeno de peptídeo pode ser um antígeno de peptídeo solúvel
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55/314 que dissolve até pelo menos 0,1 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato, pH 7.4 em temperatura ambiente. Em outras modalidades, um conjugado de antígeno de peptídeo pode ser solúvel em sulfóxido de dimetila e/ou outro(s) solvente(s) orgânico(s) em temperatura ambiente, porém pode não ser solúvel em solvente(s) aquoso(s), como solução salina tamponada com fosfato, em pH 7.4 em temperatura ambiente. Moléculas hidrofóbicas descritas na presente invenção são insolúveis até aproximadamente 0,1 mg/mL. Solubilidade pode ser determinada por inspeção visual, por medições de turbidez ou por dispersão de luz dinâmica.
[0152]lndivíduo: se refere a animais tanto humanos como não humanos, incluindo pássaros e mamíferos não humanos, como roedores (por exemplo, camundongos e ratos), primatas não humanos (por exemplo, macacos rhesus), animais de companhia (por exemplo cães e gatos domesticados), animais domésticos (por exemplo, porcos, ovelhas, vacas, lhamas e camelos) bem como animais não domesticados (por exemplo, grandes felinos).
[0153]Supramolecular: se refere a duas ou mais moléculas que se associam através de interações não covalentes. Em algumas modalidades, as moléculas se associam devido a interações hidrofóbicas. Em algumas modalidades, as moléculas se associam devido a interações eletrostáticas. A associação confere uma nova propriedade ao complexo supramolecular que não era compartilhado por qualquer uma das moléculas constituintes, como tamanho aumentando, que afeta as interações de materiais com o sistema imune e respostas imunes diferentes. Por exemplo, conjugados de antígeno de peptídeo podem agregar para formar complexos supramoleculares.
[0154]Célula T: um tipo de glóbulo branco que faz parte do sistema imune e pode participar em uma resposta imune. Células T incluem, porém não são limitadas a células T CD4 e células T CD8. Uma célula T CD4 exibe a glicoproteína CD4 em sua superfície e essas células são frequentemente mencionadas como células T
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56/314 auxiliares. Essas células frequentemente coordenam respostas imunes, incluindo respostas de anticorpo e respostas de célula T citotóxicas, entretanto, células T CD4 podem também suprimir respostas imunes ou células T CD4 podem atuar como células T citotóxicas. Uma célula T CD8 exibe a glicoproteina CD* em sua superfície e essas células são frequentemente mencionadas como células T assassinas ou citotóxicas, entretanto, células T CD8 também podem suprimir respostas imunes.
[0155]Telecélico: é usado para descrever um polímero que tem uma ou duas extremidades reativas que podem ser iguais ou diferentes. A palavra é derivada de telos e chele, as palavras gregas para extremidade e garra, respectivamente. Um polímero semi-telecélico descreve um polímero com somente um grupo final único, como um grupo funcional reativo que pode ser submetido a reações adicionais, como polimerização. Um polímero hetero-telecélico descreve um polímero com dois grupos finais, como grupos funcionais reativos, que têm propriedades reativas diferentes.
[0156]Aqui, moléculas hidrofóbicas (H) podem ser compreendidas de polímeros com grupos reativos em uma ou ambas as extremidades. Em algumas modalidades, um adjuvante é colocado em uma extremidade do polímero e a outra extremidade do polímero pode ser reagida com um ligador que é ligado a um antigeno de peptídeo diretamente ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) ou um Ligador (L). Nesse exemplo, o polímero é semi-telecélico com relação ao adjuvante, significando o adjuvante é ligado a somente uma extremidade da cadeia de polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H).
[0157]Tratar, prevenir ou melhorar uma doença: “Tratar” se refere a uma intervenção que reduz um sinal ou sintoma ou marcador de uma doença ou condição patológica após ter começado a desenvolver. Por exemplo, tratar uma doença pode resultar em uma redução em carga de tumor, significando uma doença no número ou tamanho de tumores e/ou metástases, ou tratar uma doença pode
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57/314 resultar em tolerância imune que reduz sistemas associados à auto-imunidade. “Prevenir” uma doença se refere à inibição do desenvolvimento total de uma doença. Uma doença pode ser impedida de se desenvolver. Uma doença pode ser impedida de se desenvolver em gravidade ou extensão ou tipo. “Melhorar” se refere à redução no número ou gravidade de sinais ou sintomas ou marcador de uma doença, como câncer.
[0158]Reduzir um sinal ou sintoma ou marcador de uma doença ou condição patológica relacionada a uma doença, se refere a qualquer efeito benéfico observável do tratamento e/ou qualquer efeito observável em um ponto final substituto, proximal, por exemplo, volume de tumor, quer sintomático ou não. Reduzir um sinal ou sintoma associado a um tumor ou infecção viral pode ser evidenciado, por exemplo, por um início retardado de sintomas clínicos da doença em um indivíduo suscetível (como um indivíduo tendo um tumor que não apresentou metástase ainda, ou um indivíduo que pode ser exposto a uma infecção viral), uma redução em gravidade de alguns ou todos os sintomas clínicos da doença, um avanço mais lento da doença (por exemplo, por prolongar a vida de um indivíduo tendo um tumor ou infecção viral), uma redução no número de relapsos da doença, uma melhora na saúde geral ou bem-estar do indivíduo, ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica (por exemplo, que são específicos a um tumor específico ou infecção viral). Um tratamento “profilático” é um tratamento administrado a um indivíduo que não apresenta sinais de uma doença ou apresenta somente sinais prematuros para fins de diminuir o risco ou gravidade de patologia em desenvolvimento.
[0159]Em um exemplo, uma resposta desejada é induzir uma resposta imune que leva a uma redução no tamanho, volume, taxa de crescimento, ou número (como metástase) de um tumor em um indivíduo. Por exemplo, o agente ou agentes podem induzir uma resposta imune que diminui o tamanho, volume, ou
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58/314 número de tumores por uma quantidade desejada, por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% em comparação com uma resposta na ausência do agente.
[0160]Tumor ou câncer ou neoplástico: um crescimento anormal de células, que podem ser benignas ou malignas, frequentemente porém nem sempre causa sintomas clínicos. Crescimento de célula “neoplásica” se refere ao crescimento de células que não é responsivo a sugestões fisiológicas, como crescimento e fatores inibidores.
[0161]Um “tumor” é uma coleção de células neoplásicas. Na maioria dos casos, tumor se refere a uma coleção de células neoplásicas que forma uma massa sólida. Tais tumores podem ser mencionados como tumores sólidos. Em alguns casos, células neoplásicas podem não formar uma massa sólida, como o caso com algumas leucemias. Em tais casos, a coleção de células neoplásicas pode ser mencionada como um câncer líquido.
[0162]Câncer se refere a um crescimento maligno de células neoplásicas, sendo sólido ou líquido. Características de um câncer que definem o mesmo como maligno incluem metástase, interferência com o funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citosinas ou outros produtos secretores em níveis anormais e supressão ou agravação de resposta(s) inflamatória(s) ou imunológica(s), invasão de tecidos ou órgãos circundantes ou distantes, como linfonodos, etc.
[0163]Um tumor que não apresenta sintomas clínicos adversos substanciais e/ou tem crescimento lento é mencionado como “benigno”.
[0164]“Maligno” significa causar, ou provável de causar no futuro, sintomas clínicos significativos. Um tumor que invade o tecido circundante e/ou apresenta metástase e/ou produz sintomas clínicos substanciais através da produção e secreção de mediadores químicos tendo um efeito em sistemas próximos ou
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59/314 distantes do corpo é mencionado como “maligno”.
[0165]“Doença metastática” se refere a células de câncer que saíram do sítio originado do tumor e migraram para outras partes do corpo, por exemplo, através a corrente sanguínea, através do sistema linfático, ou através de cavidades do corpo, como a cavidade peritoneal ou cavidade torácica.
[0166]A quantidade de um tumor em um indivíduo é a “carga de tumor”. A carga de tumor pode ser medida como o número, volume ou massa do tumor, e é frequentemente avaliada por exame físico, ímageamento radiológico ou exame patológico.
[0167]Um tumor “estabelecido” ou “existente” é um tumor que existe quando uma terapia é iniciada. Frequentemente, um tumor estabelecido pode ser discernido por testes de diagnóstico. Em algumas modalidades, um tumor estabelecido pode ser palpado. Em algumas modalidades, um tumor estabelecido é pelo menos 500 mm3, como pelo menos 600 mm3, pelo menos 700 mm3, ou pelo menos 800 mm3 em tamanho. Em outras modalidades, o tumor tem pelo menos 1 cm de comprimento. Com relação a um tumor sólido, um tumor estabelecido tem em geral um fornecimento de sangue recentemente estabelecido e robusto, e pode ter induzido as células T reguladoras (Tregs) e células supressoras derivadas de mieloide (MDSC).
[0168]Uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica reconhecería que as definições fornecidas acima não pretendem incluir padrões de substituição não permissíveis (por exemplo, metila substituída com 5 grupos diferentes, e similares). Tais padrões de substituição não permissível são facilmente reconhecidos por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica. Qualquer grupo funcional revelado aqui e/ou definido acima pode ser substituído ou não substituído, a menos que de outro modo indicado na presente invenção. A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como
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60/314 comumente entendido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica à qual essa revelação pertence. Os termos singulares “um”, “uma” e “o, a” inclui referentes no plural a menos que o contexto claramente indique de outro modo. O termo “compreende” significa “inclui”. Portanto, compreendendo “A” ou “B” se refere a incluindo A, incluindo B, ou incluindo tanto A como B. Deve ser adicionalmente entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídios são aproximados, e são fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente revelação, métodos e materiais adequados são descritos aqui. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicação de termos, regerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos somente e não pretendem ser limitadores.
Composições imunogênicas
[0169]São descritas aqui composições imunogênicas novas compreendendo partículas que compreendem um conjugado de antígeno de peptídeo que compreende ainda um antígeno de peptídeo (A) ligado a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H). Conjugado de antígeno de peptídeo se refere ao composto que resulta de ligação, por exemplo, covalentemente unindo ou de outro modo, o antígeno de peptídeo (A) à Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H). a molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) induz o conjugado de antígeno de peptídeo a montar nas partículas que leva a um aperfeiçoamento inesperado em respostas imunes dirigidas contra o antígeno de peptídeo (A), o conjugado de antígeno de peptídeo pode compreender adicionalmente uma extensão N-terminal opcional )B1_ e/ou extensão C-terminal (B2) ligada aos N- e C terminais do antígeno de peptídeo (A), respectivamente que fornecem aperfeiçoamentos inesperados em fabricação e atividade biológica; uma molécula carregada opcional (C) que fornece
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61/314 aperfeiçoamentos inesperados na estabilidade de partículas formadas por conjugados de antigeno de peptídeo, desse modo levando à fabricação aperfeiçoada e atividade biológica aperfeiçoada; e um Ligador (L) opcional que resulta da reação de precursor de ligador X1 ligado ao antigeno de peptídeo (A) com o precursor de ligador X2 fornecido na molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P), desse modo unindo o antigeno de peptídeo (A) e molécula hidrofóbica (H) e Partícula (P) em um processo eficiente que leva a aperfeiçoamentos inesperados em eficiência de fabricação de conjugados de antigeno de peptídeo. Os componentes compreendendo o conjugado de antigeno de peptídeo podem ser ligados através de qualquer meio adequado, e são descritos em maior detalhe do início ao fim.
[0170]Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é ligado diretamente a uma molécula hidrofóbica (H) ou partícula (P) para formar um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula A-H ou A-P. Em outras modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é liado a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) através de um Ligador (L) para formar um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula A-L-H ou A-L-P. Ainda em outras modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é ligado a uma extensão (B1 ou B2) que é ligado diretamente ou através de um Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) para formar um conjugado de antigeno de peptídeo de qualquer uma das fórmulas, A-B2-H, A-B2-LH, H-B1-A, H-L-B1-A, A-B2-P, A-B2-L-P, P-B1-A ou P-L-B1-P. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 e B2) a um precursor de ligador X1 para formar um fragmento de antigeno de peptídeo da fórmula A-X1, A-B2-X1, X1-A ou X1-B1-A, que reage com um precursor de ligador X2 em uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P), isto é, X2-H ou X2-P, para formar um Ligador (L) que une o antigeno de peptídeo (A) à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) resultando em um conjugado de antigeno de peptídeo de qualquer uma das fórmulas, isto é, A-L-H, A-L-P, A-B2-L-H, A-B2-L
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P, H-L-A, P-L-A, H-B1-A, ou P-B1-A. Na presente revelação, tais modalidades são mostradas formando partículas em condições aquosas que são mostradas como sendo úteis para induzir uma resposta imune em um indivíduo.
[0171]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é ligado a ambas as extensões (B1 e B2). Tais modalidades incluem conjugados de antígeno de peptídeo das fórmulas B1-A-B2-H, B1-A-B2-L-H, B1-A-B2-P, B1-A-B2-L-P, H-B1A-B2, H-L-B1-A-B2, P-B1-A-B2, ouP-L-B1-A-B2. Na presente revelação, tais modalidades são mostradas formando partículas em condições aquosas que são demonstradas como sendo úteis para induzir uma resposta imune em um indivíduo.
[0172]Em algumas modalidades, moléculas que contêm grupos funcionais que transmitem carga eletrostática, isto é, moléculas carregadas (C) são ligadas direta ou indiretamente através de extensões opcionais (B1 e/ou B2), o Ligador opcional (L) ou a molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) ao antígeno de peptídeo (A). A carga transmitida no conjugado de antígeno de peptídeo pela molécula carregada estabiliza as estruturas supramoleculares formadas em condições aquosas. Exemplos não limitadores de conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo moléculas carregadas (C) incluem C-A-H, C-B1-A-H, C-A-B2-H, CB1-A-B2-H, A-H(C), A-B2-H(C), B1-A-H(C), B1-A-B2-H(C), C1-A-H(C2), C1-A-B2H(C2), C1-B1-A-H(C2), C1-B1-A-B2-H(C2), H-A-C, H-B1-A-C, H-A-B2-C, H-B1-AB2-C, H(C)-A, H(C)-B1-A, H(C)-A-B2, H(C)-B1-A-B2, H(C1)-A-C2, H(C1)-B1-A-C2, H(C1)-A-B2-C2, H(C1)-B1-A-B2-C2, C-A-L-H, C-B1-A-L-H, C-A-B2-L-H, C-B1-A-B2L-H, A-L-H(C), A-B2-L-H(C), B1-A-L-H(C), B1-A-B2-L-H(C), C1-A-L-H(C2), C1-A-B2L-H(C2), C1-B1-A-L-H(C2), C1-B1-A-B2-L-H(C2), H-L-A-C, H-L-B1-A-C, H-L-A-B2-C, H-L-B1-A-B2-C, H(C)-L-A, H(C)-L-B1-A, H(C)-L-A-B2, H(C)-L-B1-A-B2, H(C1)-L-AC2, H(C1)-L-B1-A-C2, H(C1)-L-A-B2-C2, H(C1)-L-B1-A-B2-C2, C-A-P, C-B1-A-P, CA-B2-P, C-B1-A-B2-P, A-P(C), A-B2-P(C), B1-A-P(C), B1 -A-B2-P(C), C1-A-P(C2), C1-A-B2-P(C2), C1-B1-A-P(C2), C1-B1-A-B2-P(C2), P-A-C, P-B1-A-C, P-A-B2-C, P
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B1-A-B2-C, P(C)-A, P(C)-B1-A, P(C)-A-B2, P(C)-B1-A-B2, P(C1)-A-C2, P(C1)-B1-AC2, P(C1)-A-B2-C2, P(C1)-B1-A-B2-C2, C-A-L-P, C-B1-A-L-P, C-A-B2-L-P, C-B1-AB2-L-P, A-L-P(C), A-B2-L-P(C), B1-A-L-P(C), B1-A-B2-L-P(C), C1-A-L-P(C2), C1-AB2-L-P(C2), C1-B1-A-L-P(C2), C1-B1-A-B2-L-P(C2), P-L-A-C, P-L-B1-A-C, P-L-AB2-C, P-L-B1-A-B2-C, P(C)-L-A, P(C)-L-B1-A, P(C)-L-A-B2, P(C)-L-B1-A-B2, P(C1)L-A-C2, P(C1)-L-B1-A-C2, P(C1 )-L-A-B2-C2 ou P(C1)-L-B1-A-B2-C2.
[0173]A molécula carregada (C) estabiliza as partículas formadas por conjugados de antígeno de peptideo. A molécula carregada (C) pode ser ligada diretamente ao conjugado de antígeno de peptideo. Alternativamente, a molécula carregada (C) pode ser fornecida em uma molécula separada que associa às partículas formadas por conjugados de antígeno de peptideo. Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é ligada a uma molécula hidrofóbica (H) para formar um conjugado de molécula carregada da fórmula C-H, ou C-A’-H (em que A’ é um antígeno conservado), que é misturado com um conjugado de antígeno de peptideo da fórmula [C]-[B1 ]-A-[B2]-[L]-H, onde [ ] indica que o grupo é opcional, em condições aquosas e as partículas resultantes compreendem C-H ou C-A’-H e o conjugado de antígeno de peptideo.
[0174]A molécula hidrofóbica (H) pode compreender qualquer molécula adequada que induza o conjugado de antígeno de peptideo para montar em partículas em condições aquosas. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreendendo um conjugado de antígeno de peptideo é um polímero com solubilidade limitada em água. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero responsivo à temperatura ou pH que tem solubilidade limitada em água em temperaturas específicas ou valores de pH específicos. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um lipídeo, ácido graxo ou colesterol. Muitas moléculas hidrofóbicas (H) são úteis para a presente revelação e são descritas em maior detalhe do início ao fim.
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[0175]As partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo revelados aqui são úteis para induzir uma resposta imune em um indivíduo. Em algumas modalidades, partículas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo que compreendem um antígeno associado a tumor são fornecidas a um indivíduo para induzir uma resposta de célula T, como uma resposta de célula T CD4 ou CD8 citotóxica para o tratamento ou prevenção de câncer. Em algumas modalidades, partículas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo que compreendem um antígeno de doença infecciosa são fornecidas a um indivíduo para induzir uma resposta de célula T, como uma resposta de célula T CD4 ou CD8 citotóxica ou resposta de anticorpo para o tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa. Em algumas modalidades, partículas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo que compreendem um auto-antigeno são fornecidas a um indivíduo para induzir uma resposta de célula T supressiva ou tolerogênica para o tratamento de uma doença auto-imune.
[0176]O conjugado de antígeno de peptídeo compreende um antígeno de peptídeo (A), extensões N- e/ou C terminal opcionais (B1 e/ou B2), Ligador opcional (L), Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) e molécula(s) carregada(s) opcional(is) (C). Cada desses componentes é descrito abaixo e em maior detalhe do início ao fim.
Antígeno de peptídeo (A)
[0177]O antígeno de peptídeo (A) pode ser qualquer antígeno que é útil para induzir uma resposta imune em um indivíduo. O antígeno de peptídeo (A) pode ser usado para induzir uma resposta imune pro-inflamatória ou tolerogênica dependendo da natureza da resposta imune exigida para a aplicação. Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é um antígeno associado a tumor, como um antígeno próprio, neoantígeno ou antígeno viral associado a tumor (por exemplo, HPV E6/E7). Em outras modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é um antígeno de doença
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65/314 infecciosa, como um peptídeo derivado de uma proteína isolada de um vírus, bactéria, fungos ou patógenos microbianos protozoários. Ainda em outras modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é um peptídeo derivado de um alérgeno ou um auto antígeno, que é conhecido ou suspeito de causar alergias ou autoimunidade.
[0178]O antígeno de peptídeo (A) é compreendido de uma sequência de aminoácidos ou uma mimética de peptídeo que pode induzir uma resposta imune, como uma resposta de célula B ou célula T em um indivíduo. Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) compreende um aminoácido ou aminoácidos com uma modificação pós-translação, aminoácidos não-naturais ou mimética de peptídeo. O antígeno de peptídeo pode ser qualquer sequência de aminoácidos naturais, não naturais ou modificados pós-translação, miméticas de peptídeo, ou qualquer combinação dos mesmos, que têm um antígeno ou antígeno previsto, isto é, um antígeno com um epitopo de célula T ou célula B.
[0179]Composições imunogênicas podem compreender um ou mais conjugados de antígeno de peptídeo diferentes cada tendo uma composição de antígeno de peptídeo (A) diferente. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas compreendem partículas com até 50 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes cada tendo uma composição de antígeno de peptídeo (A) exclusiva. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas compreendem partículas de mosaico que compreendem 20 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes. Em outras modalidades, as composições imunogênicas compreendem partículas de mosaico que compreendem 5 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas compreendem 20 composições de partícula diferentes cada montada de um conjugado de antígeno de peptídeo exclusivo (isto é, cada partícula contém uma composição de conjugado de antígeno de peptídeo única). Em outras modalidades, as composições
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66/314 imunogênicas compreendem 5 composições de partículas diferentes cada montada de um conjugado de antigeno de peptídeo exclusivo (isto é, cada partícula contém uma composição de conjugado de antigeno de peptídeo única). Ainda em outras modalidades, as composições imunogênicas compreendem uma composição de partícula única compreendida de uma composição de conjugado de antigeno de peptídeo única.
[0180]O comprimento do antigeno de peptídeo (A) depende da aplicação específica e é tipicamente entre aproximadamente 5 e aproximadamente 50 aminoácidos. Em modalidades preferidas, o antigeno de peptídeo (A) está entre aproximadamente 7 e 35 aminos, por exemplo, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 aminoácidos. Em outras modalidades, o antigeno de peptídeo é um fragmento de um polipeptídio. Ainda em outros casos, o antigeno de peptídeo é um polipeptídio de comprimento total, como um antigeno de proteína que pode ser expresso de modo recombinante. Antígenos de peptídeo (A) baseados em antígenos associados a tumor, antígenos de doenças infecciosas, alérgenos ou auto antígenos podem ser fornecidos como a sequência de comprimento total, embora preferivelmente não mais que 50 aminoácidos em comprimento. Em modalidades preferidas, o antigeno de peptídeo (A) é 7 a 35 aminoácidos, tipicamente aproximadamente 25. Desse modo, para um antigeno associado a tumor, antigeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antigeno com comprimento maior que 25 aminoácidos, por exemplo, um antigeno de 100 aminoácidos, o antigeno pode ser divido em 7 a 35 aminoácidos, por exemplo, 25 aminoácidos, antígenos de peptídeo (A) em que cada antigeno de peptídeo (A) contém uma composição exclusiva de aminoácidos; ou, os antígenos de peptídeo (A) podem ser pools de peptídeo de sobreposição em que um antigeno é dividido em um número definido de 7 a 35 aminoácidos, por exemplo, 25 aminoácidos, antígenos de peptídeo (A) que têm sequências de sobreposição. Por exemplo, um
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67/314 pool de peptídeo de sobreposição compreendendo um antígeno de 100 aminoácidos pode ser dividido em oito antígenos de peptídeo de 25 aminoácidos (A) que são cada deslocado por 12 aminoácidos (isto é, cada peptídeo de 25 aminoácidos subsequente compreendendo uma sequência de peptídeo de 100 aminoácidos inicia na 13â posição de aminoácido a partir do peptídeo anterior). Aqueles versados na técnica entendem que muitas permutações existem para geração de um pool de peptídeo a partir de um antígeno.
[0181]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é um epítopo de célula T CD8 ou CD4 que compreende as porções de um antígeno associado a tumor, antígeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antígeno que são previstos in silico (ou medidos empiricamente) para ligar moléculas MHC-I ou MHC-II. Para antígenos associados a tumor, o antígeno de peptídeo (A) que é um epítopo de célula T CD8 ou CD4 que é previsto in silico (ou medido empiricamente) para ligar moléculas MHC-I ou MHC-II deve ser também uma sequência de aminoácidos que é exclusiva para a célula de tumor. Algoritmos para prever ligação MHC-I ou MHC-II são amplamente disponíveis (vide Lundegaard et al., Nucleic Acids Res., 36:W509W512, 2008 e http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)· Em algumas modalidades de uma terapia personalizada para um indivíduo específico (por exemplo, paciente), o antígeno de peptídeo (A) compreendendo um conjugado de antígeno de peptídeo pode compreender um epítopo de célula T CD8 mínimo a partir de um antígeno associado a tumor, antígeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antígeno que é tipicamente um peptídeo de 7-13 aminoácidos que é previsto ter afinidade de ligação < 1.000 nM para um alelo MHC-I específico que é expresso por aquele indivíduo. Em algumas modalidades de uma terapia personalizada para um indivíduo específico (por exemplo, paciente), o antígeno de peptídeo (A) pode compreender um epítopo de célula T CD4 mínimo a partir de um antígeno associado a tumor, antígeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antígeno que é um peptídeo 10-16 aminoácidos
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68/314 que é previsto ter afinidade de ligação M 1.000 nM para um alelo MHC-II específico que é expresso por aquele indivíduo. Em uma modalidade preferida, quando um epítopo de célula T CD8 ou CD4 mínimo não pode ser identificado para um antígeno associado a tumor, antígeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antígeno, ou quando o antígeno associado a tumor, antígeno de doença infecciosa, alérgeno ou auto antígeno contém múltiplos epítopos de célula T CD8 e CD4, o antígeno de peptídeo (A) pode estar entre 16-35 aminoácidos pode ser até 50 aminoácidos, por exemplo, até 35 aminoácidos, até 25 aminoácidos, ou até 20 aminoácidos, ou até 16 aminoácidos de modo que possa conter todos os epítopos de célula T CD8 ou CD4 possíveis.
[0182]Em algumas modalidades da presente revelação, o antígeno de peptídeo (A) é derivado de antígenos associados a tumor. Antígenos associados a tumor podem ser antígenos próprios que estão presentes em células saudáveis, porém são preferencialmente expressos por células de tumor, ou neoantígenos, que são proteínas aberrantes que são específicas em células de tumor e são exclusivas para pacientes individuais. Antígenos próprios adequados incluem antígenos que são preferivelmente expressos por células de tumor, como CLPP, Ciclina-A1, MAGEA1, MAGE-C1, MAGE-C2, SSX2, XAgE1 b/GAGED2a, Melan-A/MART-1, TRP-1, Tirosinase,CD45, glipican-3, IGF2B3, Kallikrein 4, KIF20A, Lengsin, Meloe, MUC5AC, fosfatase de ácido prostático, sobrevivente, NY-ESO-1 e MAGE-A3. Neoantígenos se originam da instabilidade genética inerente de canceres, que pode levar a mutações em DNA, variantes de união de RNA e alterações em modificação pós-translacional, tudo levando potencialmente a produtos de proteína de novo que são mencionados coletivamente como neoantígenos ou às vezes neoantígenos previstos. Mutações de DNA incluem alterações no DNA incluindo mutações de troca de sentido não sinônimas, mutações sem sentido, inserções, deleções, inversões cromossômicas e translocações cromossômicas, tudo resultando
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69/314 potencialmente em produtos de gene novel e, portanto, neoantígenos. Alterações de sítio de união de RNA podem resultar em produtos de proteína novel e mutações de troca de sentido podem introduzir aminoácidos permissivos a modificações póstranslacionais (por exemplo, fosforilação) que podem ser antigênicas. A instabilidade de células de tumor pode resultar, adicionalmente, em alterações epigenéticas e a ativação de certos fatores de transcrição que podem resultar em expressão seletiva de certos antígenos por células de tumor que não são expressos por células não cancerosas, saudáveis.
[0183]Conjugados de antígeno de peptídeo usados em vacinas personalizadas para câncer devem incluir antígenos de peptídeo (A) que compreendem as porções de antígenos associados a tumor que são exclusivos a células de tumor. Antígenos de peptídeos (A) compreendendo neoantígenos que se originam de uma mutação de troca de sentido devem abranger a alteração de aminoácido codificada por 1 ou mais polimorfismos de nucleotídeo. Antígenos de peptídeo (A) compreendendo neoantígenos que se originam de mutações de deslocamento de quadro, variantes de sítio de união, inserções, inversões e deleções devem abranger as sequências de peptídeo novas e junções de sequências de peptídeo novas. Antígenos de peptídeos (A) compreendendo neoantígenos com modificações pós-translacionais novel devem abranger os aminoácidos contendo a(s) modificação(ões) pós-translacional(is), como um fosfato ou glicano. Em modalidades preferidas, o antígeno de peptídeo (A) compreende 025 aminoácidos em cada lado flanqueando a alteração de aminoácido ou junção nova que se origina devido a uma mutação. Em uma modalidade, o antígeno de peptídeo (A) é uma sequência de neoantígeno que compreende os 12 aminoácidos em cada lado flanqueando a alteração de aminoácido que se origina de um polimorfismo de nucleotídeo único, por exemplo, um peptídeo de 25 aminoácidos, em que o 13Q aminoácido é o resíduo de aminoácido resultando do polimorfismo de
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70/314 nucleotídeo único. Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é uma sequência de neoantígeno que compreende os 12 aminoácidos em cada lado flanqueando um aminoácido com uma modificação pós-translacional nova, por exemplo, um peptídeo 25 aminoácidos, em que o 13Q aminoácido é o resíduo de aminoácido resultando do sítio de modificação pós-translacional nova. Em outras modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é uma sequência de neoantígeno que compreende 0-12 aminoácidos em cada lado flanqueando uma junção nova criada por uma inserção, deleção ou inversão. Em alguns casos, o antígeno de peptídeo (A) compreendendo neoantígenos resultando de sequências novas pode abranger a sequência nova inteira, incluindo 0-25 aminoácidos em cada lado de junções novas que podem também se originar.
[0184]Antígenos associados a tumor adequados como antígenos de peptídeo (A) par composições imunogênicas da presente revelação podem ser identificados através de várias técnicas que são familiares para uma pessoa versada na técnica. Antígenos associados a tumor podem ser identificados por avaliar expressão de proteína de células de tumor em comparação com células saudáveis, isto é, células não cancerosas a partir de um indivíduo. Métodos adequados para avaliar expressão de proteína incluem, porém não são limitados a imunoistoquímica, imunofluorescência, western blot, cromatografia (isto é, cromatografia de exclusão de tamanho), ELISA, citometria de fluxo e espectrometria de massa. Proteínas preferencialmente expressas por células de tumor porém não células saudáveis ou por um número limitado de células saudáveis (por exemplo, CD20) são antígenos associados a tumor adequados. Sequenciamento de RNA e DNA de biopsias de tumor de paciente seguido por bioinformática para identificar mutações em DNA de codificação de proteína que são expressas como RNA e produzem peptídeos previstos para ligar com aletos MHC-I ou MHC-II em células que apresentam antígeno em pacientes (APCs), também podem ser usadas para identificar
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71/314 antígenos associados a tumor que são adequados como antígenos de peptídeo (A) para composições imunogênicas da presente revelação.
[0185]Em modalidades preferidas, antígenos associados a tumor adequados como antígenos de peptídeo (A) para composições imunogênicas são identificados usando espectrometria de massa. Antígenos de peptídeo adequados (A) são peptídeos identificados por espectrometria d emassa após eluição a partir das moléculas MHC a partir de biopsias de tumor de paciente, porém não de tecidos saudáveis a partir do mesmo indivíduo (isto é, os antígenos de peptídeo estão somente persentes em células de tumor, porém não células saudáveis do mesmo indivíduo). Espectrometria de massa pode ser usada individualmente ou em combinação com outras técnicas para identificar antígenos associados a tumor. Aqueles versados na técnica reconhecem que há muitos métodos para identificar antígenos associados a tumor, como neoantígenos (vide Yadav et al, Nature, 515:572-576, 2014) que são adequados como antígenos de peptídeo (A) para a prática da invenção revelada.
[0186]Em modalidades preferidas, os antígenos associados a tumor usados como antígenos de peptídeo (A) são clonais ou quase clonais na população de células neoplásicas, que podem ser considerados heterogêneos em outros aspectos.
[0187]Antígenos associados a tumor selecionados para uso como antígenos de peptídeo (A) em esquemas de vacinação personalizada contra câncer podem ser selecionados com base em confirmação de espectrometria de massa de afinidade de ligação de peptídeoOMHC e/ou ligação de MHC prevista in silico e níveis de expressão de RNA em tumores. Esses dados fornecem informação sobre se um antigeno associado a tumor é expresso ou não é apresentado por células de tumor e seria, portanto, um alvo adequado para células T. Tais critérios podem ser usados para selecionar os antígenos de peptídeo (A) usados em uma vacina personalizada
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72/314 contra câncer.
[0188]Vacinas personalizadas contra câncer com base em composições imunogênicas podem compreender um ou mais conjugados de antígeno de peptídeo diferentes cada tendo uma composição exclusiva de antígeno de peptídeo (A). Em algumas modalidades, vacinas personalizadas contra câncer podem conter 10-50 composições diferentes de conjugado de antígeno de peptídeo que tem, cada, um antígeno de peptídeo exclusivo (A), em modalidades preferidas, composições imunogênicas compreendem 20 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes cada compreendendo antígenos de peptídeo (A) entre 7-35 aminoácidos em comprimento, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, ou 35 aminoácidos, tipicamente não mais que 50. Em um exemplo não limitador, composições imunogênicas compreendidas de partículas formadas de 20 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes compreendidas de antígenos de peptídeo (A) com comprimento de 8 aminoácidos são usados como uma vacina personalizada contra câncer. Em outro exemplo não limitador, composições imunogênicas compreendidas de partículas formadas de 20 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes compreendidos de antígenos de peptídeo (A) de 25 aminoácidos em comprimento são usados como uma vacina personalizada contra câncer.
[0189]Para pacientes com tumores altamente mudados que têm mais de 50 neoantígenos associados a tumor, um processo de infra-seleção pode ser usado para selecionar antígenos de peptídeo (A) para uso em vacinas personalizadas contra câncer compreendidas de conjugados de antígeno de peptídeo. Em algumas modalidades, um processo de infra-seleção é usado para selecionar antígenos de peptídeo (A) compreendendo epítopos previstos ter a afinidade de ligação de MHC mais alta e níveis de expressão RNA em células de tumor. Critérios adicionais podem ser aplicados para a seleção de antígenos próprios associados a tumor ou
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73/314 neoantígenos. Por exemplo, imunogenicidade prevista ou capacidade prevista do antigeno de peptídeo (A) para levar a células T que reagem com outros antígenos próprios, que podem levar a auto-imunidade, são critérios adicionais considerados. Por exemplo, antígenos de peptídeo (A) que compreendem antígenos associados a tumor e têm imunogenicidade prevista alta, porém também baixo potencial para levar a auto-imunidade são critérios usados para selecionar antígenos de peptídeo em potencial (A) para uso em vacinas personalizadas contra câncer. Em algumas modalidades, neoantígenos que seriam esperados resultar em células T ou respostas de anticorpo que reagem com antígenos próprios encontrados em células saudável não são selecionados para uso como antígenos de peptídeo (A). Para pacientes com menos de, por exemplo, 20-50 neoantígenos previstos, um processo de infra-seleção pode não ser crítico e assim todos os 20-50 neoantígenos previstos poderíam ser usados como antígenos de peptídeos (A) em uma vacina personalizada contra câncer.
[0190]Vacinas contra câncer podem incluir antígenos de peptídeo (A) que compreendem antígenos associados a tumor que são antígenos específicos de paciente e/ou associados a tumor que são compartilhados entre pacientes. Por exemplo, o antigeno associado a tumor pode ser um antigeno próprio conservado, como NY-ESO-1 (câncer testicular) ou gp100 (melanoma), ou o antigeno pode ser um epítopo críptico, como Na17 (melanoma) que não é tipicamente expresso por células saudáveis, porém é conservado entre pacientes. Composições imunogênicas da presente revelação podem incluir antígenos de peptídeo (A) que se originam das denominadas mutações hot-spot que são mutações frequentes em certos genes ou regiões de gene que ocorrem mais frequentemente do que seria previsto por acaso. Exemplos não limitadores das mutações hot spot incluem a mutação V600E em proteína BRAF, que é comum a carcinomas de melanoma, tiroide papilar e colorretal, ou mutações KRAS G12, que estão entre as mutações mais comuns,
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74/314 como KRAS G12C. Diversos antígenos próprios adequados bem como neoantígenos que se originam de mutações hotspot são conhecidas e são incorporadas aqui por referência: vide Chang et al., Nature Biotechnology, 34:155163, 2016; Vigneron, N., et al, Cancer Immunology, 13:15-20, 2013.
[0191]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) pode ser de um tumor hematológico. Exemplos não limitadores de tumores hematológicos incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (como leucemia aguda 11q23-positiva, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieolícita aguda, leucemia mielogenosa aguda e meroblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (como leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mielogenosa crônica e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin (formas de tipo alto e indolente), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.
[0192]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) pode ser de um tumor sólido. Exemplos não limitadores de tumores sólidos, como sarcomas e carcinomas, incluem fibrosarcoma, mixossarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, malignidade linfoide, câncer pancreático, câncer de mama (incluindo carcinoma de mama basal, carcinoma ductal e carcinoma de mama lobular), canceres de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudoripara, carcinoma de tiroide medular, carcinoma de tiroide papilar, carcinoma de glândula sebácea feocromocitomas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto de bile, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor
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75/314 testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, e tumores CNS (como um glioma, astrocitoma, medulobastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma). Em vários exemplos, um tumor é melanoma, câncer de pulmão, câncer de mama linfoma ou câncer de cólon.
[0193]Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de mama, como um carcinoma ductal ou um carcinoma lobular. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor a partir de um câncer de próstata. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é o antigeno associado a tumor de um câncer de pele, como um carcinoma de célula basal, um carcinoma de célula escamosa, um sarcoma de Kaposi, ou um melanoma. Em algumas modalidades, ο antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de pulmão, como um adenocarcinoma, um carcinoma bronquiolaveolar, um carcinoma de célula grande ou um carcinoma de célula pequena. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de cérebro, como um glioblastoma ou um meningioma. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de cólon. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de fígado, como um carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, ο antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer pancreático. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer de rim, como um carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor de um câncer testicular.
[0194]Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é um antigeno associado a tumor derivado de condições pré-malignas, como variantes de
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76/314 carcinoma in situ, ou neoplasia intraepitelial vulvar, neoplasia intraepitelial cervical ou neoplasia intraepitelial vaginal.
[0195]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é um antígeno a partir de um agente infeccioso, como um vírus, uma bactéria ou um fungo. Em modalidades adicionais, o antígeno de peptídeo (A) é um peptídeo ou glicopeptídeo derivado de um agente infeccioso; por exemplo, o peptídeo de fusão de Envelope HIV ou um glicopeptídeo V3 ou V1/V2 de HIV.
[0196] Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) representa um auto antígeno. O auto antígeno pode ser identificado e selecionado com base em triagem das próprias células T de um indivíduo para auto reatividade contra antígenos próprios apresentados nas próprias moléculas MHC-I de um paciente. Alternativamente, os antígenos de peptídeo podem ser selecionados usando métodos in silico para prever auto antígenos em potencial que (i) têm uma afinidade alta prevista para ligar as próprias moléculas MHC-I de um indivíduo e (ii) são expressos e/ou conhecidos como sendo associados à patologia respondendo pela síndrome auto-imune de um indivíduo. Em outras modalidades, o antígeno de peptídeo representa um epitopo CD4 derivado de um alérgeno e é selecionado com base nos antígenos de peptídeo tendo uma afinidade de ligação alta para as próprias moléculas MHC-II de um paciente.
[0197]Aqueles versados na técnica reconhecem que qualquer peptídeo, proteína ou proteína modificada pós-translacional (por exemplo, glicoproteína) que leva a uma resposta imune e é útil na prevenção ou tratamento de uma doença pode ser selecionado para uso como um antígeno de peptídeo (A) para uso nas composições imunogênicas da presente invenção.
Extensões (B1 e B2):
[0198]As extensões N- e C-terminal opcionais (B1 e B2) indicam moléculas ligadas ao N- e C-terminal do antígeno de peptídeo (A), respectivamente. As
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77/314 extensões N- e C-terminal B1 e B2 podem ser compreendidas de qualquer um ou mais dos seguintes: aminoácidos, incluindo aminoácidos não naturais; monômeros de oxido de etileno hidrofílico (por exemplo, PEG); cadeias de alcano hidrofóbico; ou similares; ou combinações dos mesmos. As extensões N- e C-terminal B1 e B2 são ligadas ao antígeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado, por exemplo, através de ligações de amida estáveis.
[0199]Em algumas modalidades, as extensões (B1 e B2) funcionam para controlar a taxa de degradação do antígeno de peptídeo (A) porém podem também executar qualquer uma ou mais funções adicionais. Em algumas modalidades, a extensão N- ou C-terminal (B1 ou B2) pode ser livre (em que uma extremidade da extensão N- ou C-terminal é ligada ao antígeno de peptídeo (A) e a outra extremidade não é ligada a outra molécula) e servem para diminuir a degradação do antígeno de peptídeo; por exemplo, uma extensão baseada em peptídeo B1 pode ser ligada ao N-terminal do antígeno de peptídeo através de uma ligação de amida para diminuir a degradação. Em outras modalidades, as extensões de N- e/ou Cterminal (B1 e/ou B2) podem ser ligadas a uma molécula heteróloga e podem funcionar como um ligador bem como degradação de antígeno de peptídeo (A). As extensões N- e/ou C-terminal que fornecem uma função ligadora podem ligar o antígeno de peptídeo diretamente ou indiretamente através de um Ligador (L), a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) e/ou uma molécula carregada (C).
[0200]Em algumas modalidades, as extensões (B1 e/ou B2) funcionam para fornecer distância, isto é, espaço, entre quaisquer duas moléculas heterólogas. Em outras modalidades, as extensões (B1 e/ou B2) funcionam para transmitir propriedades hidrofóbicas ou hidrofílicas ao conjugado de antígeno de peptídeo. Ainda em outras modalidades, a composição das extensões (B1 e/ou B2) pode ser selecionada para transmitir rigidez ou flexibilidade. Em outras modalidades, as extensões N- e/ou C-terminal (B1 e/ou B2) podem ajudar a estabilizar as partículas
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78/314 formadas pelo conjugado de antígeno de peptídeo.
[0201 ]Em algumas modalidades, as extensões (B1 e/ou B2) são compreendidas de grupos funcionais carregados, por exemplo, resíduos de aminoácido carregado (por exemplo, Arginina, Lisina) que transmitem carga eletrostática em pH fisiológico. O número de resíduos carregados persentes na extensão pode ser usado para modular a carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo. Um algoritmo é revelado aqui que descreve um processo sistemático para selecionar extensões baseadas em peptídeo (B1 e/ou B2) que são reconhecidas por proteases e transmite uma carga eletrostática específica que funciona para estabilizar as partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo.
[0202]Adicionalmente, em algumas modalidades, extensões de C-terminal (B2) adicionadas a antígenos de peptídeo (A) são selecionadas para facilitar fabricação de um peptídeo compreendendo [C]-[B1]-A-B2-[X1], em que [ ] indica o grupo é opcional, por incorporar sequências de aminoácidos em B2 que rompem a formação de folha-β e evitam truncamento de sequência durante síntese de peptídeo de fase sólida. Em um exemplo não limitador, um ligador di-peptídeo C-terminal (B2), Gly-Ser, é incorporado durante síntese de peptídeo de fase sólida como um dipeptídeo pseudoprolina (por exemplo, Gly-Ser(Psi(Me,Me)pro)). Em modalidades adicionais, uma prolina é incluída na sequência de extensão de C-terminal (B2) clivável por catepsina, por exemplo, Ser-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 21); pelo que a prolina é incubada tanto para facilitar fabricação como promover processamento da extensão por proteases endossomais.
[0203]Em algumas modalidades, o antígeno de peptídeo (A) é ligado no Cterminal a uma extensão B2 que é ligada direta ou indiretamente através de um Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). Em algumas modalidades, uma extensão B1 é ligada ao N-terminal do antígeno de peptídeo e uma extensão B2 é ligada no C-terminal do antígeno de peptídeo (A), em que B1 ou
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B2 é ligado diretamente ou através de um Ligador (L) a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H). Em outras modalidades, um antigeno de peptídeo (A) é ligado ao N-terminal a uma extensão B2 que é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) a uma Partícula ou molécula hidrofóbica (H). Em algumas modalidades, uma molécula carregada (C) é ligada a uma extensão, B1 ou B2, que é ligada ao Nou C-terminal do antigeno de peptídeo (A), respectivamente, em que a extensão que não é ligada à molécula carregada (C) é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). Em modalidades adicionais, moléculas carregadas (C) são ligadas a ambas as extensões B1 e B2 que são ligadas a ambos os N- e C-terminais do antigeno de peptídeo (A), respectivamente. Em modalidades adicionais, moléculas carregadas (C) são ligadas à extensão B1 ligada ao N-terminal do antigeno de peptídeo (A), porém não à extensão B2 ligada ao C-terminal do antigeno de peptídeo (A), que pode ser ligado diretamente ou através de um ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). Um precursor de ligador X1 ou Ligador (L) pode ser ligado a qualquer uma das extensões (B1 ou B2) através de qualquer meio adequado, como uma ligação de amida. Em modalidades preferidas, as extensões (B1 e B2) são sequências de peptídeo que são selecionadas para reconhecimento e hidrólise por enzimas, como proteases. As extensões (B1 e B2) são preferivelmente peptídeos cliváveis, incluindo aminoácidos reconhecidos por qualquer uma ou ambas proteases endossomais ou a imuno-proteassoma.
[0204]Como descrito em maior detalhe aqui, a composição das extensões (B1 ou B2) compreendida de peptídeos degradáveis é dependente de se a extensão é ligada ao N-terminal (B1) ou C-terminal (B2) do antigeno de peptídeo (A).
[0205]Em algumas modalidades, a extensão N-terminal (B1) é uma sequência de peptídeo entre aproximadamente 1 a 8 aminoácidos em comprimento, como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos, tipicamente não mais que 10 aminoácidos
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80/314 em comprimento que é ligado ao antígeno de peptídeo (A) através, por exemplo, de uma ligação de amida formada entre um grupo carboxila da extensão (B1) e a alfa amina do resíduo N-terminal do antígeno de peptídeo (A). A ligação de amida entre B1 e o antígeno de peptídeo (A) pode ser clivada por enzimas. É entendido que é costumeiro numerar as posições de aminoácido em ordem de proximal para distal a partir do sítio de divagem, com posições de aminoácido C-terminal para o sítio de divagem indicadas pelo símbolo de plica (por exemplo, Pri). Por exemplo, para uma extensão de tetrapeptídeo (PN4-PN3-PN2-PN1) ligada ao N-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é um octapeptídeo (PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’PA7’-PA8’), por exemplo, PN4-PN3-PN2-PN1-PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’-PA7’PA8’, a ligação de amida entre PN1-PA1’ é reconhecida e hidrolisada por uma enzima.
[0206]Em algumas modalidades, a extensão N-terminal (B1) é um tetrapeptídeo degradável por enzima que é reconhecido por proteases endossomais, em que a posição PN1 de uma extensão de tetrapeptídeo (por exemplo, PN4-PN3PN2-PN1) é preferivelmente selecionada de arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina, por exemplo, PN4-PN3-PN2-Arg; PN2 é selecionado de glicina, valina, leucina ou isoleucina; PN3 é selecionado de glicina, serina, alanina, prolina ou leucina; e PN4 é selecionado de glicina, serina, arginina, lisina, ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em algumas modalidades, a extensão Nterminal (B1) é um tripeptideo degradável por enzima que é reconhecido por proteases endossomais, em que a posição PN1 de uma extensão de tripeptideo (por exemplo, PN3-PN2-PN1) é preferivelmente selecionada entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina; PN2 é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina; e PN3 é selecionado entre glicina, serina, alanina, prolina ou leucina. Em algumas modalidades, a extensão N-terminal (B1) é um dipeptídeo degradável por enzima que é reconhecido por proteases
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81/314 endossomais, em que a posição PN1 de uma extensão de dipeptídeo (por exemplo, PN2-PN1) é preferivelmente selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina; e PN2 é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina. Ainda em modalidades adicionais, a extensão N-terminal (B1)é um aminoácido que é reconhecido por proteases endossomais, em que a posição PN1 é preferivelmente selecionada entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina.
[0207]Em outras modalidades, a extensão N-terminal (B1) é um peptídeo degradável por enzima que é reconhecido pela imuno-proteassoma, em que a posição P1 de uma extensão de tetrapeptídeo (PN4-PN3-PN2-PN1) é preferivelmente selecionada entre isoleucina, leucina, norleucina ou valina, por exemplo, PN4-PN3-PN2-Leu.
[0208] Em modalidades adicionais, a extensão N-terminal (B1) é um peptídeo degradável por enzima que é reconhecido tanto por proteases endossomais como por imuno-proteassoma, em que as posições PN5 e PN1 de uma extensão de octapeptídeo (PN8-PN7-PN6-PN5-PN4-PN3-PN2-PN1) são selecionadas entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina para a posição PN5 reconhecida por catepsinas, e isoleucina, leucina, norleucina ou valina para a posição PN1 reconhecida pela imuno-proteassoma; por exemplo, PN8-PN7-PN6-Arg-PN4-PN3-PN2-Leu. Um exemplo não limitador de uma extensão N-terminal (B1) reconhecida por catepsinas e a imuno-proteassoma é LysPro-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu (SEQ ID NO: 3).
[0209] Exemplos não limitadores de extensões N-terminal de tetrapeptídeo (B1) que são reconhecidos pela imuno-proteassoma incluem: Ser-Leu-Val-Cit, SerLeu-Val-Leu (SEQ ID NO: 4), Ser-Pro-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 5), SerPro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6), Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7), Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8), Lys-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 9), Glu-Leu-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Leu
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82/314 (SEQ ID NO: 10), Glu-Pro-Val-Cit e Lys-Pro-Val-Cit. Exemplos não limitadores de extensões N-terminal de tripeptídeo (B1) incluem: Leu-Val-Cit, Leu-Val-Leu, Pro-ValCit, Leu-Val-Arg, Pro-Val-Arg, Pro-Leu-Arg, Gly-Val-Ser. Exemplos não limitadores de extensões de N-terminal dipeptídeo (B1) incluem: Val-Cit, Val-Leu, Val-Arg, LeuArg. Exemplos não limitadores de extensões N-terminal de aminoácido único (B1) incluem Cit, Arg, Leu ou Lys. Nos exemplos acima, Arg pode ser substituído com Lys; Lys pode ser substituído com Arg; Glu pode ser substituído com Asp; e Asp pode ser substituído com Glu. Observe que Cit = citrulina.
[0210]Em algumas modalidades, a extensão (B2) é um peptídeo degradável ligado ao resíduo C-terminal do antigeno de peptídeo (A) e é compreendido de sequências de aminoácido que são reconhecidas e hidrolisadas por certas proteases. Em algumas modalidades, a extensão C-terminal (B2) é uma sequência de peptídeo entre aproximadamente 1 e 8 aminoácidos em comprimento, como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos, tipicamente não mais que 10 aminoácidos. Em modalidades preferidas, a extensão C-terminal (B2) é ligada ao antigeno de peptídeo (A) através de uma ligação de amida formada entre o grupo carboxila Cterminal do antigeno de peptídeo (A) e a alfa amina do resíduo N-terminal da extensão (B2). A ligação de amida entre B2 e o antigeno de peptídeo (A) pode ser clivada por enzimas. Observe que é costumeiro numerar as posições de aminoácido em ordem de proximal para distal a partir do sítio de divagem, com posições de aminoácido C-terminal para o sítio de divagem indicadas pelo símbolo de plica (por exemplo, Pri). Por exemplo, para uma extensão de tetrapeptídeo (PC1’-PC2’-PC3’PC4’) ligada ao C-terminal de um antigeno de octapeptídeo (PA8-PA7-PA6-PA5PA4-PA3-PA2-PA1), por exemplo, PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1’PC2’-PC3’-PC4’, a ligação de amina entre PA1-PC1’ é reconhecida e hidrolisada por uma enzima.
[0211]Em modalidades preferidas, extensões de C-terminal (B2) são
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83/314 sequências de aminoácido que são selecionadas para promover reconhecimento e divagem de imuno-proteassoma e opcionalmente reconhecimento de protease endossomal. Como antígenos de peptídeo (A) contêm tipicamente um resíduo Cterminal, por exemplo, leucina, que promove hidrólise pela imuno-proteassoma, por exemplo, na ligação de amida proximal ao resíduo C-terminal do antígeno de peptídeo (A), extensões ligadas ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) devem ser selecionadas para promover reconhecimento e divagem de imuno-proteassoma na ligação de amida proximal ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A), a imunoproteassoma favorece aminoácidos pequenos, não carregados na posição PC1’ adjacente ao aminoácido C-terminal, PA1, do antígeno de peptídeo (A), por exemplo, a ligação de amida entre PA1-PAT. Entretanto, proteases endossomais, favorecem aminoácidos hidrofóbicos volumosos (por exemplo, leucina, norleucina, metionina ou glutamina) e aminoácidos básicos (isto é, arginina e lisina). Portanto, extensões de C-terminal podem ser selecionadas para promover reconhecimento por qualquer uma ou ambas as classes de proteases.
[0212]Em algumas modalidades, um antígeno de peptídeo (A) com a sequência PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1 é ligado a uma extensão de peptídeo C-terminal (B2) com a sequência PC1’ ...PCri, em que n é um valor inteiro de 1 a 8, por exemplo, PA8-PA7-PA6-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1 ’...PCri. A composição da extensão C-terminal (B2) depende do comprimento da sequência de extensão usada. Em algumas modalidades, a extensão C-terminal, B2, é um aminoácido único PC1’ selecionado entre Gly, Ala, Ser, Arg, Lys, Cit, Gin, Thr, Leu, Nle ou Met. Em modalidades adicionais, a extensão C-terminal, B2, é um dipeptídeo, PC1’-PC2’, em que PC1’ é selecionado entre Gly, Ala ou Ser; e PC2’ é selecionado entre Gly, Ala, Ser, Pro, Arg, Lys, Cit, Gin, Thr, Leu, Nle, ou Met. Em modalidades adicionais, a extensão C-terminal, B2, é um tripeptídeo, PCT-PC2’-PC3’, em que PT é selecionado entre Gly, Ala, ou Ser; PC2’ é selecionado entre Gly, Ala, Ser, ou Pro;
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84/314 e PC3’ é selecionado entre Gly, Ser, Arg, Lys, Cit, Gin, Thr, Leu, Nle ou Met.
[0213]Em modalidades adicionais, a extensão C-terminal, B2, é uma extensão de tetrapeptídeo, PC1’-PC2’-PC3’-PC4’, em que PC1’ é selecionado entre glicina, alanina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, alanina, serina, prolina ou leucina; PC3’ é selecionado entre glicina, alanina, serina, valina, leucina ou isoleucina; e PC4’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina. Em modalidades adicionais, a extensão C-terminal, B2, é um pentapeptídeo, PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’, em que PC1’ é selecionado entre glicina, alanina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, alanina, serina, prolina, arginina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; PC3’ é selecionado entre glicina, alanina, serina, prolina ou leucina; PC4’ é selecionado entre glicina, alanina, valina, leucina ou isoleucina; e PC5’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina. Em modalidades adicionais, a extensão C-terminal, B2, é um hexapeptídeo, PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’, em que PC1’ é selecionado entre glicina, alanina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, alanina, serina ou prolina; PC3’ é selecionado entre glicina, serina, prolina, arginina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; PC4’ é selecionado entre prolina ou leucina; PC5’ é selecionado entre glicina, alanina, valina, leucina ou isoleucina; e PC6’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina.
[0214]Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal de hexapeptídeo (B2) incluem Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 11), Gly-Gly-LysPro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 12), Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 13), Gly-GlySer-Leu-Val-Cit; Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit, Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 14), Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 15), Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 16). Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal pentapeptídeo (B2) incluem Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 17), Gly-Ser-Leu-Val-Cit, Gly-Lys-Pro-Val
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Cit, Gly-Lys-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 18), Gly-Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 19), Gly-Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 20). Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal de tetrapeptídeo (B2) incluem Ser-Leu-Val-Cit, Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 4), Ser-Pro-Val-Cit, Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 5), Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6), Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7), Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8), Glu-LeuVal-Cit, Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 10), Glu-Pro-Val-Cit, Glu-Gly-Val-Cit. Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal de tripeptídeo (B2) incluem Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Arg, Gly-Ser-Leu, Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Gly, Gly-Pro-Arg, GlyPro-Leu, Gly-Pro-Cit. Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal de dipeptídeo (B2) incluem Gly-Ser; Gly-Pro, Val-Cit, Gly-Arg Gly-Cit. Exemplos não limitadores de extensões de C-terminal de aminoácido único (B2) incluem Gly, Ser, Ala, Arg, Lys, Cit, Vai, Leu, Met, Thr, Gin ou Nle. Nos exemplos acima, Arg pode ser substituído com Lys; Lys pode ser substituído com Arg; Glu pode ser substituído com Asp; e Asp pode ser substituído com Glu.
[0215]O ligador de C-terminal (B2) ligado ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) pode ser selecionado para reconhecimento (isto é, hidrólise) tanto por imuno-proteassoma como proteases endossomais. Em um exemplo não limitador, um antígeno de peptídeo (A) com a sequência PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2PA1 é ligado no C-terminal a uma extensão de tetrapeptídeo C-terminal (B2) com a sequência PC1’-PC2’-PC3’-PC4’, em que PC1’ é selecionado entre glicina, alanina ou serina e PC4’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina, por exemplo, Ser-P3-P2-Arg. Em algumas modalidades, um antígeno com a sequência PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1 é ligado no C-terminal a uma extensão de hexapeptídeo C-terminal (B2) com a sequência PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’, em que PC1’ e PC2’ são selecionados entre glicina, alanina, prolina ou serina e PC6’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina, por exemplo, Gly
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Gly-PC3’-PC4’-PC5’-Arg. Um exemplo não limitador de uma extensão de C-terminal (B2) que promove processamento tanto por imuno-proteassoma como catepsinas que é ligado ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) é Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 12). Um exemplo não limitador adicional de uma extensão C-terminal (B2) que é ligado no C-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que favorece processamento pela imuno-proteassoma e catepsinas é Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit ou Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit.
Ligadores (L) e precursores de ligadores (X1 e X2)
[0216]Um subconjunto de ligadores que executam a função específica de acoplamento seletivamente em sítio, isto é, unir ou ligar juntos o antígeno de peptídeo (A) com uma molécula hidrofóbica (H) ou uma Partícula (P) são mencionados como “Ligadores (L).” O Ligador (L) forma como resultado da reação entre um precursor de ligador X1 e um precursor de ligador X2. Por exemplo, um precursor de ligador X1 que é ligado diretamente, ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) ou molécula carregada (C) ao antígeno de peptídeo (A) pode reagir com um precursor de ligador X2 ligado à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) para formar um Ligador (L) que liga o antígeno de peptídeo (A) à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). O precursor de ligador X1 permite ligação seletiva de sítio do antígeno de peptídeo (A) a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H). Em algumas modalidades, um antígeno de peptídeo (A) ligado quer diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) a um precursor de ligador X1 pode ser produzido e isolado e então adicionado separadamente a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) que contém um precursor de ligador X2 que seletivamente reage para formar um Ligador (L) unindo o antígeno de peptídeo (A) e a Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H).
[0217]Um Ligador (L) ou precursor de ligador X1 pode ser ligado a um antígeno de peptídeo (A) no N- ou C-terminal do antígeno de peptídeo direta ou
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87/314 indiretamente através de uma extensão N-terminal (B1) ou extensão C-terminal (B2), respectivamente. Em modalidades preferidas, o Ligador (L) ou precursor de ligador X1 é ligado ao antigeno de peptídeo (A) ou uma extensão (B1 ou B2) através de uma ligação de amida. Observe que um Ligador (L) ou precursor de ligador X1 ligado diretamente ao N- ou C-terminal do antigeno de peptídeo não é considerado uma extensão.
[0218]Precursores de ligador adequados X1 são aqueles que reagem seletivamente cum um precursor de ligador X2 na Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) sem ligações ocorrendo em qualquer outro sítio do antigeno de peptídeo (A) ou extensões opcionais (B1 e/ou B2) ou molécula carregada opcional (C). Essa seletividade é importante para assegurar que uma ligação pode ser formada entre o antigeno de peptídeo (A) e uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) sem modificação para o antigeno de peptídeo (A). O Ligador (L) pode ligar um antigeno de peptídeo (A) diretamente ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) através de interações covalentes e/ou de afinidade elevada. Em modalidades preferidas, o precursor de ligador X1 forma uma ligação covalente com um precursor de ligador X2 na Partícula molécula hidrofóbica (H).
[0219]Em modalidades preferidas, o Ligador (L) é formado como resultado de uma reação de “química de clique” bio-ortogonal entre os precursores de ligador X1 e X2. Em algumas modalidades, a reação de química de clique é uma reação de química de clique isenta de catalisador, como uma reação de cicloadição de alcino de azida promovida por tensão que não requer o uso de cobre ou qualquer catalisador. Exemplos não limitadores de precursores de ligador X1 que permitem reações bio-ortogonais incluem moléculas compreendendo grupos funcionais selecionados de azidas, alcinos, tetrazinas e transciclooctenos. Em algumas modalidades, um precursor de ligador X1 compreendendo uma azida reage com um
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88/314 precursor de ligador X2 para formar urn Ligador de triazol. Em outras modalidades, urn precursor de ligador X1 compreendendo uma tetrazina reage com urn precursor de ligador X2 compreendendo uma transicloocteno (TCO) para formar urn Ligador compreendendo o produto de ligação Diels-Alder de demanda inversa. Em modalidades preferidas, o precursor de ligador X1 é um aminoácido não natural contendo um grupo funcional de azida que reage com um precursor de ligador X2 compreendendo um alcino presente que é submetido a cicloadição de 1,3-dipolar para formar um anel de triazol estável. Em modalidades preferidas, o precursor de ligador X2 ligado à partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) compreende um alcino que é submetido a cicloadição promovida por tensão, como dibenzociclooctina (DBCO). Em modalidades adicionais, o precursor de ligador X1 é um alcino que reage com um precursor de ligador X2 compreendendo uma azida que está presente na Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H).
[0220]Em outras modalidades, precursores de ligador X1 que permitem reatividade seletiva de sítio dependendo da composição do antígeno de peptídeo (A) podem compreender grupos funcionais que incluem tióis, hidrazinas, cetonas e aldeídos. Em algumas modalidades, um precursor de ligador X1 compreendendo um tiol reage com um precursor de ligador X2 compreendendo um dissulfeto de piridila ou maleimida para formar um Ligador de dissulfeto ou tio éter, respectivamente. Em outras modalidades, um precursor de ligador X1 compreendendo uma hidrazina reage com um precursor de ligador X2 compreendendo uma cetona ou aldeído para formar um Ligador de hidrazona. Em algumas modalidades, o precursor de ligador X1 é um resíduo de aminoácido natural ou não natural com um grupo funcional de tiol, como uma cisteína, que reage com um precursor de ligador X2 compreendendo um grupo funcional reativo de tiol como maleimida ou dissulfeto de piridila.
[0221 ]Em algumas modalidades, o precursor de ligador X1 é uma sequência de peptídeo que é ligada a outra sequência de peptídeo compreendendo o precursor
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89/314 de ligador X2 fornecido na Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H). Em outras modalidades, o precursor de ligador X1 se liga a uma molécula complementar compreendendo o precursor de ligador X2 na Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) através de interações não covalentes, de afinidade alta, por exemplo, através de interações de coiled-coil ou interações eletrostáticas. Em outras modalidades, o precursor de ligador X1 se liga a uma proteína, por exemplo, biotina, que forma interações de afinidade alta com uma proteína, por exemplo, estreptavidina.
[0222]Aqueles versados na técnica reconhecem que pares adequados de grupos funcionais, ou moléculas complementares, selecionados para precursores de ligador X1 e X2 podem ser transponíveis entre X1 e X2. Por exemplo, um Ligador compreendido de um triazol pode ser formado de precursores de ligador X1 e X2 compreendendo uma azida e alcino, respectivamente, ou de precursores de ligador X1 e X2 compreendendo um alcino e azida, respectivamente. Desse modo qualquer par de grupos funcionais adequados resultando em um Ligador pode ser colocado em X1 ou X2.
[0223]Precursores de ligador específicos (X1 e X2) e Ligadores (L) apresentados na presente revelação fornecem aperfeiçoamentos inesperados em capacidade de fabricação e aperfeiçoamentos em atividade biológica. Muitos desses precursores de ligador (X1 e X2) e Ligadores (L) podem ser adequados para a prática da invenção e são descritos em maior detalhe do início ao fim.
[0224]O precursor de ligador (X1) pode ser ligado ao N- ou C-terminal do antígeno de peptídeo (A) direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) ou molécula carregada (C).
[0225]Em algumas modalidades, o precursor de ligador X1 é um aminoácido ligado ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) direta ou indiretamente através de uma extensão B2 ou molécula carregada (C) e tem a fórmula:
Em que o grupo funcional (FG) é selecionado para reagir especificamente
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90/314 com um FG no precursor de ligador X2
O
Figure BR112019020853A2_D0001
FG
R1
E é tipicamente selecionado entre amida, azida, hidrazina ou tiol; R1 é tipicamente selecionado de OH ou NH2 e y1 é qualquer número inteiro, como 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8; e a alfa amina do aminoácido é tipicamente ligado ao aminoácido C-terminal da extensão B2 ou 0 aminoácido C-terminal do antigeno de peptídeo (A) se não houver extensão B2.
[0226]Em outras modalidades, 0 precursor de ligador X1 é ligado ao Nterminal do antigeno de peptídeo (A) direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) ou molécula carregada (C) e tem a fórmula:
O
Figure BR112019020853A2_D0002
Em que 0 grupo funcional (FG) é selecionado para reagir com 0 precursor de ligador X2 e é tipicamente selecionado entre amina, azida, hidrazina ou tiol; y2 é qualquer inteiro, tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; e a carbonila é tipicamente ligada a alfa amina do aminoácido N-terminal da extensão B1 ou 0 antigeno de peptídeo (A) quando B1 não está presente.
[0227]O precursor de ligador X2 fornecido na molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) compreende um grupo funcional que é selecionado para permitir uma reação seletiva com 0 precursor de ligador X1 para formar 0 Ligador (L). Em algumas modalidades, grupos funcionais compreendendo X2 incluem carbonilas, como ácidos carboxílicos/ésteres ativados ou cetonas que reagem com aminas ou
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91/314 hidrazinas fornecidas no precursor de ligador X1 para formar Ligadores (L) compreendendo uma amida ou hidrazona. Em outras modalidades, grupos funcionais compreendendo X2 incluem azidas que reagem com alcinos fornecidas no precursor de ligador X1 para formar triazois. Ainda em outras modalidades, o grupo funcional compreendendo X2 é selecionado entre maleimidas ou dissulfetos que reagem com tióis fornecidos no precursor de ligador X1 para formar Ligadores (L) compreendendo tioéteres ou dissulfetos. O precursor de ligador X2 pode ser ligado à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) através de qualquer meio adequado. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreende um peptídeo e X2 é ligado ao N-terminal da molécula hidrofóbica baseada em peptídeo (H).
[0228]O Ligador (L) pode compreender um triazol formado entre precursores de ligador X1 e X2 compreendendo uma azida e um alcino, respectivamente. Em algumas modalidades, o Ligador compreendendo um triazol resulta da reação de um precursor de ligador contendo azido X1 e um precursor de ligador contendo alcino (por exemplo, ciclooctina). Em algumas modalidades, o precursor de ligador contendo azido, X1, é um aminoácido não natural contendo um grupo funcional de azida que é ligado ao N-terminal de antígeno de peptídeo (A) ou extensão (B1) ou o C-terminal do antígeno de peptídeo (A) ou extensão (B2). O grupo funcional de azida fornece um handle reativo que é ligado diretamente ao antígeno de peptídeo (A) ou indiretamente através da extensão de N-terminal (B1) ou a extensão de C-terminal (B2) e seletivamente reage com um alcino (por exemplo, ciclooctina) contendo precursor de ligador X2 que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P), desse modo formando um Ligador de triazol (L) que une o antígeno de peptídeo (A) à molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P).
[0229]Em algumas modalidades, o precursor de ligador X1 é um aminoácido de azido ligado ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) diretamente ou
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92/314 indiretamente através de uma extensão B2 ou molécula carregada (C) e tem a fórmula:
O
H H
----N---c--------R1
Figure BR112019020853A2_D0003
N3
Em que a alfa amina do aminoácido é ligada ao aminoácido de C-terminal de B2, ou o antígeno de peptideo (A) se não houver extensão B2, R1 é selecionado entre OH ou NH2 e n é qualquer inteiro, como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7,
8. Exemplos não limitadores de precursores de ligador contendo azido X1 são 5-azido-2-amino ácido pentanóico, 4-azido-2-amino ácido butanoico e 3azido-2-amino ácido propanoico.
[0230]Em outras modalidades quando 0 precursor de ligador contendo azido X1 é ligado à extensão N-terminal (B1), ou diretamente ao N-terminal do antígeno de peptideo (A) quando B1 não está presente, 0 precursor de ligador X’ tem a fórmula:
Em que a carbonila é tipicamente ligada à alfa amina do aminoácido Nterminal da extensão
O
Figure BR112019020853A2_D0004
B1 ou 0 antígeno de peptideo (A) quando B1 não está presente; e y2 é qualquer inteiro, tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Exemplos não limitadores de precursores de ligador contendo azido incluem 6-azido-ácido hexanóico, 5-azido-ácido pentanóico, 4-azido-ácido butanoico e 3-azidoPetição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 99/391
93/314 ácido propanoico.
[0231 ]Em algumas modalidades, em que o precursor de ligador X1 compreende uma azida, o precursor de ligador X2 compreende uma fração de alcino. Exemplos não limitadores de alcinos incluem alcinos alifáticos, ciclooctinas, como dibenzilciclooctina (DBCO ou DIBO), difluorooctina (DIFO) e biarilazaciclooctinona (BARAC). Em algumas modalidades específicas, o precursor de ligador contendo alcino X2 compreende uma molécula de DBCO.
[0232]Em algumas modalidades, a extensão de C-terminal (B2) é ligada ao antígeno de peptídeo (A) através de uma ligação de amida no C-terminal do antígeno de peptídeo (A) que, por sua vez, é ligado através do Ligador (L) ao bloco hidrofóbico (H). Um exemplo de tal conjugado de antígeno de peptídeo ligado por Cterminal é (A)?-35-B2-L-H, onde (A)z-35 representa um antígeno de peptídeo compreendendo 7 a 35 aminoácidos. Em um exemplo não limitador, um antígeno de peptídeo (A) com a sequência de octapeptídeo PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2PA1 é ligado no C-terminal a uma extensão de tetrapeptídeo (B2), por exemplo, Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) que é ligado ao precursor de ligador contendo azido (X1) azido-lisina (6-azido 2-amino ácido hexanóico, Lys(N3)) que por sua vez reage com a fração de dibenzociclooctina (DBCO) do precursor de ligador contendo ciclooctina (X2) que é ligado à molécula hidrofóbica (H) para produzir PA8-PA7-PA6PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H).
[0233]Em algumas modalidades alternativas, o antígeno de peptídeo (A) é ligado à extensão N-terminal (B1) ou N-terminal do antígeno de peptídeo (A) que, por sua vez, é ligado través do Ligador (L) ao bloco hidrofóbico (H). Em um exemplo não limitador, um antígeno de peptídeo com a sequência PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’PA6’-PA7’-PA8’ é ligado no N-terminal a uma extensão de tetrapeptídeo (PN4-PN3PN2-PN1), por exemplo, Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) que é ligada a azido-ácido pentanóico (Azp) que por sua vez reage com a fração de dibenzociclooctina
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94/314 (DBCO) do precursor de ligador contendo ciclooctina (X2) que é ligado à molécula hidrofóbica (H): H-DBCO-Azp-Ser-Leu-Val-Arg-PA1 ’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’PA7’-PA8’.
Outros ligadores e ligações
[0234]Ligadores se referem em geral a quaisquer moléculas que unem quaisquer duas ou mais moléculas heterólogas do conjugado de antigeno de peptídeo e podem executar adicionalmente qualquer uma ou mais das funções a seguir: I) aumentar ou diminuir solubilidade em água; II) aumentar a distância entre quaisquer dois componentes, isto é, moléculas heterólogas, do conjugado de antigeno de peptídeo; III) transmitir rigidez ou flexibilidade; ou IV) controlar / modular a taxa de degradação /hidrólise da ligação entre quaisquer duas ou mais moléculas heterólogas. Tipos de ligadores específicos usados aqui são citados. Ligadores (L) são um tipo específico de molécula de ligador usada para ligar especificamente em sítio o antigeno de peptídeo (A) a uma Partícula (P) ou uma molécula hidrofóbica (H) direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2). Observe que as extensões N- e C-terminal, B1 e B2, colocadas no N e C-terminal de um antigeno de peptídeo (A), respectivamente, podem ser ligadas a uma molécula heteróloga, como uma molécula carregada (C), Ligador (L), Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) ou qualquer molécula heteróloga, e, portanto, funciona como um ligador. Para clareza, embora qualquer molécula colocada no N- ou C-terminal do antigeno de peptídeo (A) seja uma extensão de N- ou C-terminal (B1 ou B2), a extensão também pode servir como um ligador quando é ligada a outra molécula, por exemplo, molécula carregada (C). Desse modo, como definido aqui, um ligador no N- ou Cterminal de um antigeno é sempre uma extensão (B1 ou B2), porém uma extensão nem sempre é um ligador.
[0235]Os ligadores usados para unir quaisquer dois componentes do conjugado de antigeno de peptídeo, por exemplo, um antigeno de peptídeo (A)
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95/314 ligado a uma molécula hidrofóbica (H) indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) pode ser através de qualquer meio adequado. O ligador pode usar meio covalente ou não covalente para unir quaisquer dois ou mais componentes, isto é, moléculas heterólogas, por exemplo, um antígeno de peptídeo (A) e molécula hidrofóbica (H).
[0236]Em modalidades preferidas, um ligador pode unir, isto é, ligar quaisquer dois componentes do conjugado de antígeno de peptídeo através de uma ligação covalente. Ligações covalentes são as ligações preferidas usadas para unir quaisquer dois componentes, isto é, moléculas heterólogas, do conjugado de antígeno de peptídeo e assegurar que nenhum componente seja capaz de imediatamente dispersar a partir dos outros componentes, por exemplo, o antígeno de peptídeo e molécula hidrofóbica (H), após administração a um indivíduo. Além disso, ligações covalentes fornecem tipicamente maior estabilidade em relação a ligações não covalentes e ajudam a assegurar que cada componente do conjugado de antígeno de peptídeo seja fornecido em conjunto às células que apresentam antígeno em ou perto das proporções de cada componente que foi administrado.
[0237]Em um exemplo não limitador de uma ligação covalente, uma reação química de clique pode resultar em um triazol que liga, isto é, une juntos, quaisquer dois componentes do conjugado de antígeno de peptídeo. Em várias modalidades, a reação química de clique é uma reação de ciclo-adição de alcino-azida [3+2] promovida por tensão. Um grupo alcino e um grupo azida podem ser fornecidos em moléculas respectivas compreendendo o conjugado de antígeno de peptídeo a ser ligado por “química de clique”. Em algumas modalidades, um ligando, como um agonista TLR, contendo um grupo funcional de azida é acoplado a uma molécula hidrofóbica (H) tendo um grupo reativo apropriado, como um alcino, por exemplo, um dibenzilciclooctina (DBCO). Em modalidades adicionais, um precursor de ligador X1 contendo um grupo funcional de tiol é ligado diretamente ou através de uma
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96/314 extensão de N- ou C-terminal (B1 ou B2) ao antigeno de peptídeo (A), o tiol pode ser ligado a uma molécula hidrofóbica (H) tendo um grupo reativo apropriado como um alcino, alqueno, maleimida, resultando em uma ligação de tio éter, ou o tiol pode ser reagido com um dissulfeto de piridila, por exemplo, resultando em uma ligação de dissulfeto. Em algumas modalidades, uma amina é fornecida em uma molécula e pode ser ligada a outra molécula por reagir a amina com qualquer grupo eletrofílico adequado como ácidos carboxílicos, cloretos de ácido ou ésteres ativados (por exemplo, éster NHS) que resulta em uma formação de ligação de amida, ou a amina pode ser reagida com alquenos (via adição Michael), aldeídos, e cetonas (via base Schiff). Em modalidades preferidas, o precursor de ligador X1, extensões N- e Cterminal opcionais (B1 e B2), molécula carregada opcional (C) e antigeno de peptídeo (A) são ligadas juntas através de ligações de amida como uma sequência de peptídeo único produzida por síntese de peptídeo de fase sólida. Há diversas reações adequadas disponíveis que resultam em uma ligação covalente, isto é, ligam, que será familiar para a pessoa versada.
[0238]O tipo de ligador usado para unir quaisquer duas ou mais moléculas heterólogas, isto é, componentes distintos do conjugado de antigeno de peptídeo, pode ser selecionado para executar funções específicas e atender exigências específicas da aplicação. Tipicamente, o ligador é capaz de formar ligações covalentes entre duas ou mais moléculas heterólogas do conjugado de antigeno de peptídeo, em que os componentes são um antigeno de peptídeo (A), Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H), extensões N- e C-terminal opcionais (B1 e B2), Ligador opcional (L); molécula carregada opcional (C); segundo polímero opcional (que é ligado à molécula hidrofóbica (H); e Ligando opcional, como um agonista PRR.
[0239]Há muitos ligadores adequados que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém não são limitados a, ligadores de carbono de cadeia reta ou ramificada, ligadores de carbono heterocíclico, ligadores aromáticos
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97/314 rígidos, ligadores de óxido de etileno flexível, ligadores de peptídeo, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o ligador de carbono pode incluir um ligador de alcano C1-C18, como uma alquila inferior C4; os ligadores de alcano podem servir para aumentar o espaço entre duas ou mais moléculas heterólogas, enquanto ligadores de alcano de cadeia mais longa podem ser usados para transmitir características hidrofóbicas. Alternativamente, ligadores hidrofílicos, como ligadores de óxido de etileno, podem ser usados no lugar de ligadores de alcano para aumentar o espaço entre quaisquer duas ou mais moléculas heterólogas e aumentar solubilidade em água. Em outras modalidades, o ligador pode ser um composto aromático, ou composto poli(aromático) que transmite rigidez. A molécula de ligador pode compreender um ligador hidrofílico ou hidrofóbico. Em várias modalidades, o ligador inclui uma sequência de peptídeo degradável que é clivável por uma enzima intracelular (como uma catepsina ou a imuno-proteassoma).
[0240]Em algumas modalidades, o ligador pode ser compreendido de poli(óxido de etileno) (PEG). O comprimento do ligador depende da finalidade do ligador. Por exemplo, o comprimento do ligador, como um ligador PEG, pode ser aumentado para separar componentes de uma composição imunogênica, por exemplo, reduzir impedimento estérico ou no caso de um ligador PEG hidrofílico pode ser usado para melhorar a solubilidade em água. O ligador, como PEG, pode ser um ligador curto que pode ter pelo menos 2 monômeros em comprimento. O ligador, como PEG, pode estar entre aproximadamente 4 e aproximadamente 24 monômeros em comprimento, como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 monômeros em comprimento ou mais. Em algumas modalidades, um Ligando é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) através de um ligador PEG.
[0241 ]Em algumas modalidades, onde o ligador compreende uma cadeia de
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98/314 carbono, o ligador pode compreender uma cadeia entre aproximadamente 1 ou 2 e aproximadamente 18 carbonos, como , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 carbonos em comprimento ou mais. Em algumas modalidades, onde o ligador compreende uma cadeia de carbono, o ligador pode compreender uma cadeia entre aproximadamente 12 e aproximadamente 20 carbonos. Em algumas modalidades, onde o ligador compreende uma cadeia de carbono, o ligador pode compreender uma cadeia entre não mais que 18 carbonos. Em algumas modalidades, um Ligando, como um agonista PRR, é ligado à molécula hidrofóbica (H) através de uma alquila inferior.
[0242]Em algumas modalidades, o ligador é clivável sob condições intracelulares, de modo que divagem do ligador resulta na liberação de qualquer componente ligado ao ligador, por exemplo, um antigeno de peptídeo.
[0243]Por exemplo, o ligador pode ser clivável por enzimas localizadas em vesículas intracelulares (por exemplo, em um lisossomo ou endossoma ou caveolea) ou por enzimas, no citosol, como a proteassoma, ou imuno-proteassoma. O ligador pode ser, por exemplo, um ligador de peptídeo que é clivado por enzimas de protease, incluindo, porém não limitado a proteases que são localizadas em vesículas intracelulares, como catepsinas no compartimento endossomal ou lisossomal. O ligador de peptídeo está tipicamente entre 1-10 aminoácidos, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais (como até 20) aminoácidos de comprimento, como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos de comprimento. Certos dipeptídeos são conhecidos como sendo hidrolisados por proteases que incluem catepsinas, como catepsinas B e D e plasmina, (vide, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Por exemplo, um ligador de peptídeo que é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, pode ser usado (por exemplo, um Phe-Leu ou um ligador Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 23)). Outros exemplos de tais ligadores são descritos, por exemplo, na patente US no.
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6,214,345, incorporada aqui por referência. Em uma modalidade específica, o ligador de peptídeo clivável por uma protease intracelular é um ligador Val-Cit ou um ligador Phe-Lys (vide, por exemplo, patente US no. 6,214,345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligador Val-Cit).
[0244]Sequencias específicas para o peptídeo clivável no ligador podem ser usadas para promover processamento por células imunes após absorção intracelular. Por exemplo, várias modalidades das composições imunogênicas reveladas aqui formam partículas em condições aquosas, que são internalizadas por células imunes, como células que apresentam antígeno(por exemplo, células dendríticas). O ligador de peptídeo clivável pode ser selecionado para promover processamento (isto é, hidrólise) do ligador de peptídeo após absorção intracelular pelas células imunes. A sequência do ligador de peptídeo clivável pode ser selecionada para promover processamento por proteases intracelulares, como catepsinas em vesículas intracelulares ou a proteassoma ou imuno-proteassoma no espaço citosólico.
[0245]Em várias modalidades, ligadores compreendidos de sequências de peptídeo da fórmula Pn...P4-P3-P2-P1 são usadas para promover reconhecimento por catepsinas, em que P1 é selecionado de arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina; P2 é selecionado de glicina, leucina, valina ou isoleucina; P3 é selecionado de glicina, serina, alanina, prolina ou leucina; e P4 é selecionado de glicina, serina, arginina, lisina ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em um exemplo não limitador, um ligador de tetrapeptídeo da fórmula P4P3-P2-P1 ligado através de uma ligação de amida a uma molécula heteróloga e tem a sequência Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8). Para clareza, os resíduos de aminoácido (Pn) são numerados de proximal para distal a partir do sítio de divagem, que é C-terminal para o resíduo P1, por exemplo, a ligação de amida entre P1-P1’ é hidrolisada. Sequências de peptídeo adequadas que promovem divagem por
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100/314 proteases endossomais e lisossomais, como catepsina, são em descritos na literatura (vide Choe, et al., J. Biol. Chem., 281:12824-12832, 2006).
[0246]Em várias modalidades, ligadores compreendidos de sequências de peptídeo são selecionados para promover reconhecimento pela proteassoma ou imuno-proteassoma. Sequências de peptídeo da fórmula Pn...P4-P3-P2-P1 são selecionados para promover reconhecimento por proteassoma ou imunoproteassoma, em que P1 é selecionado de resíduos básicos e resíduos ramificados, hidrofóbicos, como arginina, lisina, leucina, isoleucina e valina; P2, P3 e P4 são opcionalmente selecionados entre leucina, isoleucina, valina, lisina e tirosina. Em um exemplo não limitador, um ligador clivável da fórmula P4-P3-P2-P1 que é reconhecido pela proteassoma é ligado através de uma ligação de amida em Pl a uma molécula heteróloga e tem a sequência Tyr-Leu-Leu-Leu (SEQ ID NO: 24). Sequências que promovem degradação pela proteassoma ou imuno-proteassoma podem ser usadas individualmente ou em combinação com ligadores cliváveis por catepsina. Em algumas modalidades, aminoácidos que promovem processamento de imuno-proteassoma são ligados a ligadores que promovem processamento por proteases endossomais. Diversas sequências adequadas para promover divagem pela imuno-proteassoma são bem descritas na literatura (vide: Kloetzel, et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2:179-187), 2001, Huber, et al., Cell, 148:727-738, 2012, e Harris et al., Chem. Biol., 8:1131-1141,2001).
[0247]Em modalidades preferidas, as extensões N- e C-terminal (B1 e B2) que são ligadas aos N- e C-terminais do antígeno de peptídeo (A), respectivamente, são ligadas a moléculas adicionais, por exemplo, uma molécula carregada (C) e molécula hidrofóbica (H), respectivamente, e são compreendidas de peptídeos cliváveis. Em várias modalidades, extensões de peptídeo cliváveis são colocadas em qualquer um ou ambos os N- e/ou C-terminais do antígeno de peptídeo (A). Extensões de peptídeo cliváveis colocadas no N-terminal do antígeno de peptídeo
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101/314 (A) são extensões N-terminal (Bi), porém podem adicionalmente funcionar como ligadores quando a extensão é ligada a outra molécula, por exemplo, uma molécula carregada (C), além do antígeno de peptideo. Extensões colocadas no C-terminal do antígeno de peptideo (A) são extensões C-terminal (B2), uma molécula hidrofóbica (H). As sequências preferidas de peptideos cliváveis compreendendo os ligadores no N- ou C-terminal (Bi e B2) são distintos e são descritos em maior detalhe do início ao fim.
[0248]Em outras modalidades, quaisquer dois ou mais componentes dos conjugados de antígeno de peptideo podem ser unidos através de um ligador sensível a pH que é sensível à hidrólise em condições ácidas. Diversas ligações sensíveis a pH são familiares para aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similar (vide, por exemplo, as patentes US nos. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Em modalidades preferidas, a ligação é estável em pH fisiológico, por exemplo, em um pH de aproximadamente 7.4, porém é submetido à hidrólise em pH lisossomal, ~ pH 5-6.5. Em algumas modalidades, um Ligando, como um agonista TLR-7/8, é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) através de um FG que forma uma ligação sensível a pH, como a reação entre uma cetona e uma hidrazina para formar uma ligação de hidrazona instável a pH. Em outras modalidades, um antígeno de peptideo (A) é ligado direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) a um precursor de ligador X1 que contém um grupo cetona e é ligado a um precursor de ligador X2 compreendendo uma hidrazina em uma molécula hidrofóbica (H). Uma ligação sensível a pH, como uma hidrazona, fornece a vantagem de que a ligação é estável em pH fisiológico, em aproximadamente pH 7.4, porém é hidrolisado em valores de pH mais baixos, como 0 pH de vesículas intracelulares.
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[0249]Em outras modalidades, o ligador compreende uma ligação que é clivável em condições de redução, como uma ligação de dissulfeto redutível. Muitos ligadores diferentes usados para introduzir ligações de dissulfeto são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., em Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68:92809290, 2008). Vide, também a patente US No. 4,880,935.). Em algumas modalidades, um antígeno de peptídeo (A) é ligado direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) a um precursor de ligador X1 que contém um grupo funcional de tiol que forma uma ligação de dissulfeto com um precursor de ligador X2 compreendendo um dissulfeto de piridila ligado a uma molécula hidrofóbica (H).
[0250]Ainda em modalidades adicionais a ligação entre quaisquer dois componentes do conjugado de antígeno de peptídeo pode ser formada por uma reação enzimática, como ligação de proteína expressa ou por sortase (vide: Fierer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 111 :W1176-1181, 2014 e Theile et al., Nat. Protoc., 8:1800-1807, 2013.) reações quimio-enzimáticas (Smith, et al., Bioconjug. Chem., 25:788-795, 2014) ou interações de afinidade alta não covalentes, como por exemplo, interações de biotina-avidina e coiled-coil (Pechar, et al., Biotechnol. Adv., 31:90-96, 2013) ou qualquer meio adequado que seja conhecido por aqueles versados na técnica (vide: Chalker, et al., Acc. Chem. Res., 44:730-741, 2011, Dumas, et al., Agnew Chem. Int. Ed. Engl., 52:3916-3921,2013).
Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H)
[0251]Composições imunogênicas da presente revelação compreendem conjugados de antígeno de peptídeo que compreendem ainda uma Partícula (P) ou uma molécula hidrofóbica (H), pré-formada. Conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo uma Partícula (P) ocorrem como partículas em condições aquosas.
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Em algumas modalidades, conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) podem ocorrer como moléculas solúveis únicas em solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) porém se reúnem em partículas em condições aquosas. Em outras modalidades, conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) podem ocorrer como moléculas solúveis únicas em solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) e em condições aquosas em certas faixas de temperatura e pH, porém se reúnem em partículas em condições aquosas em certas faixas de temperatura e pH, por exemplo, em pH e temperatura fisiológica.
[0252]A finalidade da Partícula P (ou molécula hidrofóbica (H) é fornecer o conjugado de antígeno de peptídeo em um formato particulado como um meio para modular farmacocinética e promover absorção por células que apresentam antígeno. As partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo devem ter um tamanho entre aproximadamente 10 nm e 10.000 nm de diâmetro. Em modalidades preferidas, as partículas são nanopartículas que têm um tamanho que pode ser absorvido no sistema endossomal de células (como células imunes). As nanopartículas podem estar em uma faixa de tamanho médio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 500 nm em diâmetro. Desse modo, as nanopartículas podem ter em média aproximadamente 10 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 40 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm ou 500 nm em diâmetro. Em outras modalidades, as nanopartículas podem ter em média de aproximadamente 10-50 nm, ou aproximadamente 10-100 nm, ou aproximadamente 10-200 nm ou aproximadamente 10-500 nm em diâmetro. Em modalidades preferidas, o tamanho de partícula varia de aproximadamente 20-200 nm em diâmetro. As partículas na composição podem variar em tamanho, porém estarão em geral compreendidas nas faixas de tamanho expostas na presente invenção. Por exemplo, mais que 50%,
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104/314 mais que 55%, mais que 60%, mais que 65%, mais que 70%, mais que 75%, mais que 80%, mais que 85%, mais que 90%, mais que 91%, mais que 92%, mais que 93%, mais que 94%, mais que 95%, mais que 96%, mais que 97%, mais que 98% ou mais que 99% das partículas na composição estarão compreendidas nas faixas de tamanho expostas na presente invenção. Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) pode ser ligado a uma extensão (B1 ou B2) que é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) a Partículas (P) ou moléculas hidrofóbicas (H) que se reúnem em partículas que são demasiadamente grandes para absorção por células imunes (por exemplo, partículas maiores que aproximadamente 5.000 nm) e que formam um depósito no sítio de injeção.
[0253]Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) é ligado a uma Partícula (P) pré-formada. A Partícula (P) pode ser compreendida de materiais hidrofóbicos, como polímeros ou lipideos, polímeros hidrofílicos reticulados, como hidrogéis, ou polímeros hidrofóbicos reticulados, como poliestireno reticulado, que retêm estrutura em condições aquosas. Exemplos não limitadores de Partículas (P) incluem, partículas de polímero, como poli(láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), polimersomas ou polaxmers; micelas baseadas em lipídeo, lipossomas, ou vesículas multilamelares; emulsões de óleo em água, como emulsões de óleo mineral em água e água em óleo mineral; e partículas de sal inorgânico, como fosfato de alumínio ou partículas de sal de hidróxido de alumínio (isto é, Alume). Em algumas modalidades, a Partícula (P) é uma nanopartícula lipossomal. Em outras modalidades, a Partícula (P) é uma partícula de ferro. Ainda em outras modalidades, a Partícula (P) é uma partícula de polímero.
[0254]A eficiência de ligação de antigeno de peptídeo (A) a Partículas (P) pré-formadas depende da natureza do antigeno de peptídeo e tipo de ligação usada. Por exemplo, antígenos de peptídeo (A) podem ser adsorvidos ou incorporados dentro das Partículas (P) e a eficiência desse processo pode ser empiricamente
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105/314 determinada para cada antigeno de peptídeo (A), visto que a natureza do antigeno de peptídeo (A) pode influenciar adsorção e incorporação. Antígenos de peptídeo (A) podem ser ligados à Partícula (P) através de interações de afinidade alta (por exemplo, eletrostática) ou uma ligação covalente, em que uma Partícula (P) tem um número definido de sítios reativos que determinará o número de antígenos de peptídeo (A) que podem ser ligados à Partícula (P). Para composições imunogênicas compreendendo múltiplos antígenos de peptídeo diferentes (A), por exemplo, 20 antígenos de peptídeo diferentes (A), múltiplas cópias de cada tipo de antigeno de peptídeo (A) podem ser fornecidas em Partículas (P) separadas ou múltiplas cópias de todos os 20 tipos de antígenos de peptídeo (A) podem ser fornecidas na mesma partícula (P).
[0255]Uma limitação de Partículas (P) pré-formadas é que a razão de antigeno para Partícula (P) não pode ser facilmente controlada. Alternativamente, em modalidades preferidas o antigeno de peptídeo (A) é ligado diretamente ou através de um Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) que promove montagem de partículas em condições aquosas. O conjugado de antigeno de peptídeo compreendido de um antigeno de peptídeo (A) opcionalmente ligado através de uma extensão (B1 ou B2) que é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) é uma entidade molecularmente definida e a razão de antígenos de peptídeo (A) para a molécula hidrofóbica (H) pode ser precisamente controlada. Em modalidades preferidas, a razão é 1:1 de antigeno de peptídeo (A) parar molécula hidrofóbica (H). Em exemplos não limitadores adicionais, a razão pode ser de 1:3 a 3:1 de antígenos de peptídeo (A) para moléculas hidrofóbicas (H).
[0256]Em contraste com partículas pré-formadas, o conjugado de antigeno de peptídeo pode ser formado por ligação do antigeno de peptídeo (A) direta ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2) e/ou um Ligador (L) a um bloco hidrofóbico (H) que produz uma molécula única quimicamente definida. A molécula
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106/314 hidrofóbica (H) é uma molécula com solubilidade em água substancialmente limitada, ou é anfifílica em propriedades, e capaz de montar em estruturas supramoleculares, por exemplo, micelar, nano- ou micropartículas em condições aquosas. Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) é insolúvel, ou forma micelas, em condições aquosas até aproximadamente 0,1 mg/mL ou aproximadamente 0,01 mg/mL.
[0257]A molécula hidrofóbica (H) pode ser escolhida de quaisquer moléculas compreendendo alcanos superiores, aromáticos cíclicos, ácidos graxos, compostos derivando de terpenos/isoprenos ou polímeros que têm solubilidade limitada em água e/ou características anfifílicas que resultam nas moléculas se reunindo em partículas em condições aquosas. Alcanos superiores exemplificadores incluem, porém não são limitados a octano, nonano, decano, undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano e octadecano. Aromáticos cíclicos exemplificadores incluem, porém não são limitadas a estruturas de benzeno e anel de benzeno fundido ou moléculas aromáticas heterocíclicas. Ácidos graxos saturados e insaturados exemplificadores incluem, porém não são limitados a ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido oleico. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um ácido graxo, por exemplo, ácido mirístico. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreende um lipídeo de diacila, como 1,2-dioleoíla-sn-glicero-3-fosfoetanol amina ou 1,2-distearoíla-sn-glicero-3fosfoetanolamina ou um lipopeptídeo, por exemplo, Pam2Cys. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica baseada em lipídeo ou ácido graxo (H) pode compreender ainda um PEG. Compostos exemplificadores derivando de terpenos/isopreno incluem derivados de esterol, como colesterol e esqualeno. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreende colesterol.
[0258]Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero com solubilidade limitada em água ou é anfifílica e capaz de se reunir em partículas,
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107/314 por exemplo, micelas em condições aquosas. Polímeros exemplificadores incluem, porém não são limitados a PLGA, poli(aminoácidos) hidrofóbicos, poli(glutamato de benzila), poliestireno, polaxmers com base em monômeros de óxido de propileno óxido de etileno e polímeros responsivos à temperatura, como poli(N,N’-dietil acrilamida), poli(N-n-propilacrilamida), Poli(N-isopropilacrilamida), éter de metila poli[di(etileno glicol)metacrilato] e certos poli(aminoácidos) PEGUIIados, como Ροϋ(γ(2-metoxietoxi)esteril-L-glutamato). Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um poli(aminoácido) compreendido de aminoácidos hidrofóbicos. Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) compreendendo um poli(aminoácido é compreendido de aminoácidos que compreendem anéis aromáticos. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um poli(aminoácido) que é ligado a Ligandos, como agonistas PRR. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero di-bloco tipo A-B. em algumas modalidades, o copolímero dibloco é responsivo à temperatura e é capaz de se reunir em partículas em resposta a uma mudança de temperatura. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreendendo um copolímero dibloco tipo A-B compreende ainda Ligandos, como agonista PRR, ligado a um bloco do copolímero di-bloco. Polímeros úteis como moléculas hidrofóbicas (H) para conjugados de antigeno de peptídeo são descritos em maior detalhe abaixo.
Polímeros
[0259]A molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) pode compreender um polímero linear ou ramificado. O polímero pode ser um homopolímero, um copolímero ou um terpolímero. O polímero pode ser compreendido de um ou muitos tipos diferentes de unidades de monômero. O polímero pode ser um copolímero estatístico ou copolímero alternado. O polímero pode ser um copolímero de bloco, como o tipo A-B, ou o polímero pode ser compreendido de um copolímero enxertado, pelo que dois polímeros são ligados através de reação análoga de
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108/314 polímero.
[0260]A molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) pode compreender polímeros compreendendo monômeros de ocorrência natural e/ou não natural e combinações dos mesmos. Biopolímeros naturais podem incluir peptídeos compreendidos de aminoácidos (às vezes mencionados como poli(aminoácidos)); um exemplo específico é poli(triptofano). O biopolímero natural pode ser quimicamente modificado. Por exemplo, biopolímeros compreendidos de ácido glutâmico ou resíduos de lisina podem ser modificados nos grupos gama carboxila ou épsilon amina, respectivamente, para a fixação de um Ligando. Biopolímeros podem ser polissacarídeos, que podem incluir, porém não são limitados a glicogênio, celulose e dextrano. Exemplos adicionais incluem polissacarídeos que ocorrem na natureza, incluindo alginato e quitosana. Polímeros também podem ser compreendidos de moléculas pequenas de ocorrência natural, como ácido láctico ou ácido glicólico, ou podem ser um copolímero dos dois (isto é, PLGA).
[0261 ]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) é compreendida de um polímero aniônico (por exemplo, poli(ácido)) ou polímero catiônico (por exemplo, poli(básico)) ou combinações de polímeros aniônico e catiônico. Polímeros catiônicos podem se ligar a peptídeos negativamente carregados por interação eletrostática ou podem ser úteis para complexar ácidos nucleicos negativamente carregados, como DNA e RNA. Em algumas modalidades, o polímero é um zwiterion insolúvel em água em pH 7.4, porém carrega uma carga positiva líquida em pH menor que aproximadamente 6 e é solúvel em água. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) compreendendo um primeiro polímero carrega uma carga positiva ou negativa que é complementar à carga negativa ou positiva, respectivamente, em um segundo polímero e o primeiro e segundo polímeros formam um complexo eletrostático através de neutralização de carga que torna o complexo insolúvel. Em algumas modalidades, o polímero
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109/314 catiônico pode ser uma poli(amina) de ocorrência natural ou sintética, como poli(lisina) poli(etileno imina) (PEI). Em modalidades adicionais, o polímero catiônico pode ser uma poli(amido amina) (PAA) ou poli(beta amino éster) (PBAE) produzida a partir da reação de adição Michael de aminas com bis(acrilamidas) ou bis(acril ésteres). Exemplos não limitadores de polímeros catiônicos que podem ser usados nas modalidades preferidas incluem poli(etileno imina), poli(cloridrato de alil ânion; PAH), putrescina, cadaverina, poli(lisina) (PL), poli(arginina), poli(trimetileno imina), poli(tetrametileno imina), poli(propileno imina), aminoglicosídeo-poliamina, dideoxidiamino-b-ciclodextrina, espermina, espermidina, cadaverina, poli(2-dimetilamino)etil metacrilato, poli(histidina), gelatina cationizada, dendrímeros, quitosana e qualquer combinação dos mesmos. O polímero catiônico pode conter um grupo de amônio quaternário, como aquele presente em quitosana metilada. Alternativamente, o polímero pode ser um polímero aniônico. Em alguns exemplos não limitadores o polímero polianiônico é poli(ácido glutâmico). Em modalidades alternativas o polímero polianiônico é poli(ácido aspártico). O polímero pode ser um polímero baseado em polifosfoéster. O polímero pode compreender polissacarídeos aniônicos naturais, incluindo, por exemplo, ácido algínico, compreendido de 1 -4)-ligado β-Dmanuronato e ácido gulurônico. O polímero pode compreender nucleotideos. Outros polímeros polianiônicos podem ser igualmente adequados.
[0262]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero catiônico solúvel em água em certas faixas de pH, porém é não carregado e insolúvel em água em faixas de pH em torno de pH 7.4 fisiológico. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que compreende aminas aromáticas em que o pKa do ácido conjugado da amina aromática é menor que 7.5. Em pH abaixo do pKa das aminas aromáticas, a mina aromática é protonada e, portanto, dota o polímero de carga positiva. Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero compreendendo aminas
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110/314 aromáticas é poli(fenil alanina amina). Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que compreende heterociclos de nitrogênio em que o pKa de um átomo de nitrogênio compreendendo o heterociclo é menor que 7.5. Em pH abaixo do pKa de um átomo de nitrogênio compreendendo o heterociclo, o nitrogênio é protonado e dota o polímero de carga positiva. Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero compreendendo um heterociclo com átomos de nitrogênio protonáveis (isto é, básicos) é poli(histidina). Aqui, os requerentes reportam a descoberta inesperada de que moléculas hidrofóbicas compreendidas de polímeros que compreendem um nitrogênio protonável (por exemplo, amina aromática) fornecem aperfeiçoamentos inesperados em fabricação, estabilidade de partícula e atividade biológica.
[0263]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) pode ser um polímero baseado em poli(dietileno glicol metil éter metacrilato)-(DEGMA). Em modalidades adicionais, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que pode incluir monômeros de (met)acrilatos, (met)acrilamidas, frações de vinil e estirila. Exemplos específicos de (met)acrilatos, (met)acrilamidas, bem como monômeros baseados em vinil e estirila incluem N-2-hidroxipropil(metacrilamida) (HPMA), hidroxi etil(metacrilato) (HEMA), estireno e vinil pirrolidona (PVP), respectivamente. O polímero pode ser um polímero termorresponsivo compreendido de monômeros de ΛΖ-isopropil acrilamida (NIPAAm); ΛΖ-isopropil metacrilamida (NIPMAm); Λ/,Λ/’-dietil acrilamida (DEAAm); A/-(L)-(1 -hidroxi metil) propil metacrilamida (HMPMAm); N,N’dimetil etil metacrilato (DMEMA), 2-(2-metoxi etóxi) etil metacrilato (DEGMA). Em algumas modalidades, o polímero hidrofóbico é um polímero compreendendo HPMA ou monômeros DEGMA HPMA. Em algumas modalidades, o polímero compreendendo monômeros DEGMA e HPMA é um polímero di-bloco tipo A-B. Uma descoberta inesperada relatada na presente invenção é que antígenos de peptídeo (A) ligados a copolímeros di-bloco tipo A-B compreendendo um bloco hidrofílico
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HPMA se reúnem em micelas de nanopartícula de tamanho uniforme independente da composição de antígeno de peptídeo (A).
[0264]A molécula hidrofóbica (H) também pode compreender polímeros baseados em monômeros cíclicos que incluem uretanos cíclicos, éteres cíclicos, amidas cíclicas, ésteres cíclicos, anidridos cíclicos, sulfetos cíclicos e aminas cíclicas.
[0265]Moléculas hidrofóbicas (H) baseadas em polímeros compreendendo monômeros cíclicos podem ser produzidas por polimerização de abertura de anel e incluem poliésteres, poliéteres, poliaminas, policarbonatos, poliamidas, poliuretanos e polifosfatos; exemplos específicos podem incluir, porém não são limitados a policaprolactona e poli(etileno imina) (PEI). Polímeros adequados podem ser também produzidos através de reações de condensação e incluem poliamidas, poliacetais e poliésteres.
[0266]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que pode incluir de 3 a 10.000 unidades de monômero. Em modalidades preferidas, o polímero inclui de aproximadamente 3 a 300 unidades de monômero, como de 3 a 10, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 unidades de monômero; ou de aproximadamente 10 a 100 unidades de monômero, por exemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100; ou de aproximadamente 100 a 200 unidades de monômero; ou de aproximadamente 200 a 300 unidades de monômero, tipicamente não mais que 1,000 unidades de monômero. Em algumas modalidades, o polímero pode compreender até 1.000 a 10.000 unidades de monômero. Tipicamente, pelo menos cinco monômeros são necessários para formar um tamanho suficiente da molécula hidrofóbica (H) para promover formação de partícula do conjugado de antígeno de peptídeo, embora, inesperadamente, moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de polímero com tão pouco quanto 3 monômeros que incluem anéis aromáticos fossem suficientes para acionar a montagem de partícula de conjugados de antígeno de
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112/314 peptideo. O aumento do comprimento do polímero de3a5e5a10 monômeros aumenta a Resistência das forças que promovem a formação de partícula, levando a partículas de tamanho maior e mais estáveis formadas pelos conjugados de antígeno de peptideo. Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) compreendendo o conjugado de antígeno de peptideo é um polímero compreendido entre 5-100 monômeros, que resulta na formação de partículas com aproximadamente 10-300 nm de diâmetro em condições aquosas. Em modalidades adicionais, o polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H) é compreendido de aproximadamente 300 monômeros e resulta em conjugados de antígeno de peptideo que se reúnem em partículas entre aproximadamente 20 e 500 nm, ou aproximadamente 100-500 nm.
[0267]Em algumas modalidades, o peso molecular médio do polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H) pode estar entre aproximadamente 1.000 e 1.000.000 g/mol. Em modalidades preferidas, o peso molecular médio do polímero está entre aproximadamente 1,000 e 60,000 g/mol. Em algumas modalidades, o peso molecular de polímero está entre aproximadamente 1,000 e 5,000, ou entre aproximadamente 5,000 e 10,000, ou entre aproximadamente 10,000 e 20,000, ou entre aproximadamente 20,000 e 30,000, ou entre aproximadamente 25,000, e 60,000. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um Polímero di-bloco tipo A-B com um peso molecular médio entre aproximadamente 10.000 g/mol e aproximadamente 60.000 g/mol, como aproximadamente 10.000 g/mol, 20.000 g/mol, 30.000 g/mol, 40.000 g/mol, 50.000 g/mol ou 60.000 g/mol. Em algumas modalidades, o polímero é um Polímero dibloco tipo A-B em que a razão dos pesos moleculares do bloco A e blocos B é aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1. Em exemplos não limitadores o Polímero di-bloco tipo A-B com um peso molecular médio de aproximadamente 60.000 g/mol é compreendido de um bloco A com um peso molecular médio de
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113/314 aproximadamente 10.000 g/mol e um bloco B com um peso molecular médio de aproximadamente 50.000 g/mol; um bloco A com um peso molecular médio de aproximadamente 20.000 g/mol e um bloco B com um peso molecular médio de aproximadamente 40.000 g/mol; um bloco A com um peso molecular médio de aproximadamente 30.000 g/mol e um bloco B com um peso molecular médio de aproximadamente 30.000 g/mol; um bloco A com um peso molecular médio de aproximadamente 40.000 g/mol e um bloco B com um peso molecular médio de aproximadamente 20.000 g/mol; um bloco A com um peso molecular médio de aproximadamente 50.000 g/mol e um bloco B com um peso molecular médio de aproximadamente 10.000 g/mol.
[0268]A polidispersão, Mw/Mn, do polímero pode variar de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 5.0. Polímeros podem ser formados por uma variedade de técnicas de polimerização. Polímeros baseados em nucleotídeo e peptídeo podem ser preparados por síntese de fase sólida e terão polidispersão de 1.0 visto que os polímeros são molecularmente definidos. Polímeros formados por polimerização de crescimento de cadeia terão polidispersões > 1.0. Polímeros podem ser sintetizados por técnicas de polimerização viva ou polimerização de radical livre de solução. Em modalidades preferidas, biopolímeros baseados em peptídeo são sintetizados por síntese de peptídeo de fase sólida. Polímeros baseados em peptídeo (ou “poli(aminoácido”) compreendendo aminoácidos com anéis aromáticos, como triptofano, embora hidrofóbicos em condições aquosas, forneceram aperfeiçoamentos inesperados na fabricação por síntese de fase sólida em comparação com peptídeos (ou “poli(aminoácidos)”) sem anéis aromáticos. Desse modo, em modalidades preferidas, moléculas hidrofóbicas (H) baseadas em peptídeos produzidos por síntese de fase sólida incluem aminoácidos compreendendo anéis aromáticos. Em modalidades adicionais, polímeros baseados em acrilamida e acrilato são sintetizados por polimerização de transferência de
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114/314 cadeia de fragmentação de adição reversível (RAFT). Em modalidades adicionais, poli(aminoácidos) e poli(fosfoésteres) são sintetizados por polimerização de abertura de anel.
[0269]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) pode compreender um polímero que compreende ainda um Ligando ou Ligandos, como agonistas PRR. Em algumas modalidades, as moléculas hidrofóbicas baseadas em polímero (H) podem incluir monômeros que compreendem pelo menos um grupo funcional que pode ser acoplado a um Ligando, ou a um ligador que pode ser acoplado a um Liando. Em outras modalidades, a molécula hidrofóbica (H) baseada em polímero pode compreender Ligandos que são ligados às extremidades e/ou cadeias secundárias do polímero.
[0270]Em modalidades preferidas de composições imunogênicas para o tratamento ou prevenção de câncer e doenças infecciosas, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero que é ligado a Ligandos. Em algumas modalidades, o Ligando que é ligado à molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) compreende uma estrutura de anel aromático. Em algumas modalidades, o Ligando ligado ao polímero é hidrofóbico e promove estabilidade aumentada das partículas formadas pelo conjugado de antigeno de peptídeo em condições aquosas. Em outras modalidades, o Ligando que é ligado à molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) compreende um anel aromático heterocíclico. Em algumas modalidades, o ligando que é ligado à molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) compreende um anel aromático adicionalmente compreendendo um aril amina. Em algumas modalidades, o ligando fixado na molécula hidrofóbica (H) é um ligando hidrofóbico compreendendo um anel aromático heterocíclico, opcionalmente em que o Ligando hidrofóbico compreende ainda uma amina aromática (isto é, Ar-NHh). Em modalidades, em que a molécula hidrofóbica (H) compreende um Ligando que compreende um grupo aromático, opcionalmente compreendendo um heterociclo
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115/314 e/ou aril amina, os requerentes relatam a descoberta inesperada de que tal molécula hidrofóbica (H) é altamente solúvel em solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, como DMSO e etanol, porém solúvel em tampões aquosos.
[0271 ]Em algumas modalidades, o Ligando ligado à molécula hidrofóbica (H) baseada em polímero é um agonista de receptor de reconhecimento de padrão (PRRa), como um agonista de STING, receptores NOD ou TLRs que tem propriedades adjuvantes. O Ligando com propriedades adjuvantes ligado ao polímero pode ser, ou ser derivado de, qualquer composto adjuvante adequado, como um agonista PRR. Ligandos adequados com propriedades adjuvantes incluem compostos que incluem moléculas orgânicas pequenas, isto é, moléculas tendo um peso molecular menor que aproximadamente 3.000 Daltons, embora em algumas modalidades o adjuvante possa ter um peso molecular menor que aproximadamente 700 Daltons e em alguns casos o adjuvante possa ter um peso molecular de aproximadamente 200 Daltons a aproximadamente 700 Daltons.
[0272]A molécula hidrofóbica (H) em modalidades preferidas de composições imunogênicas usadas para o tratamento ou prevenção de câncer ou doenças infecciosas é um polímero ligado a Ligandos com propriedades adjuvantes. Os ligandos com propriedades adjuvantes, como agonistas PRR, podem ser ligados às cadeias secundárias ou grupos extremos do polímero através de qualquer ligador adequado. Em algumas modalidades, monômeros compreendendo uma molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) compreendem uma cadeia secundária compreendendo pelo menos um grupo funcional que pode ser acoplado a um Ligando com propriedades adjuvantes, ou a um ligador que pode ser acoplado a um Ligando com propriedades adjuvantes. Em algumas modalidades, em que a molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) compreende um Ligando com propriedades adjuvantes, todos os monômeros do polímero são ligados ao Ligando com propriedades adjuvantes. Em outras modalidades, em que a molécula
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116/314 hidrofóbica (H) compreende um Ligando com propriedades adjuvantes, nem todos os monômeros no polímero são ligados ao adjuvante.
[0273]Em algumas modalidades em que a molécula hidrofóbica (H) compreende um polímero ligado a um Ligando com propriedades adjuvantes através de unidades de monômero distribuídas ao longo da estrutura do polímero, aumentando a densidade do Ligando no polímero leva a um aperfeiçoamento inesperado em respostas imunes para o antígeno de peptídeo (H).
[0274]Em certas modalidades, a razão molar de Ligandos com propriedades adjuvantes, como agonistas PRR, para monômeros do polímero pode ser selecionada de aproximadamente 1:100 a 1:1 mol/mol (ou aproximadamente 1% mol a aproximadamente 100%mol) como de 1:2.5 a 1:1 mol/mol.
[0275]A densidade do Ligando com propriedades adjuvantes, como agonistas PRR, ligado ao polímero pode variar conforme necessário para aplicações específicas. O Ligando com propriedades adjuvantes, como agonistas PRR, pode ser ligado ao polímero de 1 a 100% mol, como de 1 a 10% mol ou de 50-100% mol. %mol se refere à percentagem de monômeros compreendendo o polímero que são ligados ao Ligando com propriedades adjuvantes, como agonistas PRR. Por exemplo, 10% mol de ligando (por exemplo, agonistas PRR) é igual a 10 unidades de monômero ligadas ao Ligando a partir de um total de 100 unidades de monômero. As 90 restantes podem ser unidades monoméricas de formação de macromolécula, que não são ligadas ao Ligando.
[0276]A densidade de Ligandos, como Ligandos com propriedades adjuvantes, ligados a uma molécula hidrofóbica baseada em polímero (H) deve ser selecionada para assegurar que o conjugado de antígeno de peptídeo (i) seja solúvel em solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, como DMSO; (ii) pode formar nanopartículas estáveis em condições aquosas em pH e temperatura fisiológica; e/ou (ii) é capaz de induzir uma resposta imune, particularmente uma
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117/314 resposta de célula-T, em um indivíduo.
[0277]A densidade ótima de Ligandos, como agonistas PRR, ligados ao polímero depende da composição de polímero, comprimento de polímero, bem como a composição do Ligando. Quando o ligando é uma molécula hidrofóbica / anfifílica com baixa solubilidade em água, como um agonista receptor do tipo Toll -7 e -8 baseado em imidazoquinolina (TLR-7/8a) e o polímero sozinho é solúvel em água (isto é, o polímero não ligado ao Ligando é solúvel em água), o Ligando é tipicamente ligado ao polímero em uma densidade de aproximadamente 20-100 mol% quando o polímero é compreendido entre aproximadamente 5-30 unidades de monômero; 10-50 mol% quando o polímero é compreendido entre 30-100 unidades de monômero; ou em uma densidade entre 5-20 mol% quando o polímero é compreendido entre 100-300 unidades de monômero. Em geral, a %mol do Ligando com propriedades adjuvantes é mais alta para polímeros mais curtos e mais baixa para polímeros mais longos.
[0278]A densidade ótima do Ligando com propriedades adjuvantes, por exemplo, PRRa, ligado a polímeros hidrofílicos ou responsivos à temperatura que são maiores que 10.000 g/mol e baseado em comonômeros selecionados entre N-2-hidroxi propil (metacrilamida) (HPMA), hidroxi etil(metacrilato) (HEMA), estireno, vinil pirrolidona (PVP), ΛΖ-isopropil acrilamida (NIPAAm); ΛΖ-isopropil metacrilamida (NIPMAm); Λ/,Λ/’-dietil acrilamida (DEAAm); A/-(L)-(1 -hidroxi metil)propil metacrilamida (HMPMAm); A/,A/’-dimetil etil metacrilamida (DMEMA), 2-(2-metoxi etoxi)etil metacrilato (DEGMA) ou poli(fosfoésteres) substituídos é de 1 a 25%, por exemplo, a densidade do adjuvante ligado ao polímero pode ser aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%,
aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%,
aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%;
aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%
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aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%
aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%
aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%
aproximadamente 23%, aproximadamente 24% ou aproximadamente 25%.
[0279]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero di-bloco tipo A-B anfifílico em que um bloco é hidrofóbico e o outro bloco é hidrofílico. Em algumas modalidades, onde a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero di-bloco tipo A-B anfifílico e o Ligando é hidrofóbico, como um agonista TLR-7/8 de imidazoquinolina, o Ligando é preferivelmente ligado ao bloco hidrofóbico em uma densidade entre aproximadamente 1 e 50% mol, tipicamente aproximadamente 1 a 20%mol. Em algumas modalidades, onde a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero di-bloco tipo A-B anfifílico e o Ligando é hidrofílico, o Ligando é preferivelmente ligado ao bloco hidrofílico em uma densidade entre aproximadamente 1 e 20% mol, ou na extremidade hidrofílica do bloco hidrofílico e, portanto, o copolímero dibloco tipo A-B é semi-telecélico com relação ao Ligando. Em um exemplo não limitador, a molécula hidrofóbica (H) compreende um copolímero di-bloco tipo A-B responsivo à temperatura compreendendo um bloco HPMA e um bloco DEGMA e um agonista TLR-7/8 de imidazoquinolina é ligado ao bloco DEGMA em uma densidade entre aproximadamente 1 e 5% mol. Em um exemplo não limitador adicional, a molécula hidrofóbica (H) compreende um polímero di-bloco tipo A-B compreendendo um bloco hidrofóbico de copolímero HPMA e um bloco hidrofílico de homopolímero HPMA e um agonista TLR-7/8 de imidazoquinolina é ligado ao bloco hidrofóbico de copolímero HPMA em uma densidade entre aproximadamente 20%mol. Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica é um copolímero tri-bloco, por exemplo, A-B-A ou outras composições de copolimeros de multiblocos.
[0280]Uma descoberta inesperada reportada na presente invenção é que
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119/314 antigenos de peptideo (A) ligados a copolimeros di-bloco do tipo A-B compreendendo um bloco hidrofílico HPMA ligado a Ligandos com propriedades adjuvantes se reúnem em micelas de nanopartículas de tamanho uniforme independente da composição de antígeno de peptideo (A) e essa confiabilidade melhorada de formação de micela de nanopartícula foi associada à magnitude aumentada de imunidade de célula T. Em um exemplo não limitador,, um antígeno de peptideo (A) é ligado a um copolímero di-bloco compreendido de um bloco hidrofóbico de copolímero HPMA (isto é, p[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]) e um bloco hidrofílico de homopolímero HPMA (isto é, p(HPMA)) através de um ligador de triazol (Lys(N3)-DBCO) para formar um conjugado de antígeno de peptideo p{[(HPMA)-co(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A, em que 2B é um TLR-7/8a também mencionado como Composto 1. Em modalidades adicionais, um antígeno de peptideo (A) é ligado a um copolímero di-bloco compreendido de um bloco hidrofóbico de copolímero DEGMA (isto é, p[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]) e um bloco hidrofílico de homopolímero HPMA (isto é, p(HPMA)) através de um ligador de triazol (Lys(N3)-DBCO) para formar um conjugado de antígeno de peptideo p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A, em que 2B é um TLR-7/8a também mencionado como Composto 1. Em outras modalidades, um antígeno de peptideo (A) é ligado a um copolímero di-bloco compreendido de um homopolímero DEGMA ligado a um ligando com propriedades adjuvantes (isto é, 2BXy-p[(DEGMA)) e um bloco hidrofílico de homopolímero HPMA (isto é, p(HPMA)) através de um ligador de triazol (Lys(N3)-DBCO) para formar um conjugado de antígeno de peptideo 2BXy-p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO(Lys(N3))-A, em que o antígeno de peptideo (A) e 2BXy (TLR-7/8a também mencionado como Composto 2) são ligados em um sítio único em extremidades opostas do polímero, que tornam o polímero hetero-telecélico.
[0281 ]Em várias modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero
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120/314 baseado em poli(aminoácido) que é compreendido de comonômeros de ácido glutâmico ou ácido aspártico e aminoácidos aromáticos e/ou hidrofóbicos, como fenil alanina, amino fenil alanina amina (ou “fenil alanina amina”), triptofano, tirosina, glutamato de benzila, histidina, leucina, isoleucina, norleucina e valina, e um ou mais Ligandos com propriedades adjuvantes, por exemplo, PRRa, são ligados ao polímero através do ácido carboxílico gama do ácido glutâmico ou ácido carboxílico beta de ácido aspártico. Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) compreendido de comonômeros de ácido glutâmico e triptofano, em que um ou mais Ligandos com propriedades adjuvantes, por exemplo, PRRa, são ligados aos resíduos de ácido glutâmico através do ácido carboxílico gama. Em modalidades adicionais, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) comprometido de comonômeros de lisina e aminoácidos aromáticos e/ou hidrofóbicos, como fenil alanina, amino fenil alanina, histidina, triptofano, tirosina, glutamato de benzila, leucina, isoleucina, norleucina e valina, em que um ou mais Ligandos com propriedades adjuvantes, por exemplo PRRa, são ligados ao polímero através de épsilon amina de lisina. Em modalidades preferidas, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) compreendido de comonômeros de lisina e triptofano, em que um ou mais Ligandos com propriedades adjuvantes, por exemplo, PRRa, são ligados a lisina através de épsilon amina. Em modalidades preferidas, em que a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero de poli(aminoácido) ligado a um ou mais Ligandos com propriedades adjuvantes, por exemplo, PRRa, o polímero está entre 5-30% aminoácidos em comprimento e o adjuvante é ligado em uma densidade de 20 a 100% mol, como 30%, 50%, 60%, 80% e 100% mol. Em modalidades adicionais, o Ligando é fixado somente em uma extremidade única do polímero de poli(aminoácido), isto é, um polímero semi-telecélico. Aqui, os requerentes reportam a descoberta inesperada de que moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de copolímeros baseados em
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121/314 poli(aminoácido) que compreendem ainda grupos aromáticos, como aminoácidos aromáticos (por exemplo, fenil alanina, amino fenil alanina, histidina, triptofano, tirosina, glutamato de benzila) ou Ligandos aromáticos (por exemplo, imidazoquinolinas) ligados ao polímero, resultam em aperfeiçoamentos inesperados em capacidade de fabricação, através de solubilidade de solvente orgânico aperfeiçoada, e estabilidade melhorada de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo, em comparação com poli(aminoácidos) predominantemente compreendidos de aminoácidos alifáticos ou Ligandos alifáticos. Desse modo, em modalidades preferidas, moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de poli(aminoácidos) ou outras classes de polímeros, incluem um ou mais aminoácidos aromáticos e/ou Ligandos que compreendem um grupo aromático.
[0282]Em modalidades adicionais, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) compreendido totalmente de ácido glutâmico, ácido aspártico ou resíduos de aminoácido não natural contendo um ácido carboxílico em que o Ligando com propriedades adjuvantes é ligado a todos entre ácido glutâmico, ácido aspártico ou resíduos de aminoácido não natural, isto é, o Ligando com propriedades adjuvantes é ligado em uma densidade de 100% mol. Em modalidades adicionais, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido compreendido totalmente de Lisina ou aminoácidos não naturais contendo uma amina livre e o Ligando com propriedades adjuvantes é ligado a todos da lisina ou resíduos de aminoácido não natural, isto é, o adjuvante é ligado em uma densidade de 100% mol. Em modalidades adicionais, comonômeros PEGuilados, como y-(2metoxietoxi)estéril-L-glutamato) são incluídos para dotar o copolímero de propriedades responsivas à temperatura. Em outras modalidades, polímeros responsivos à temperatura podem ser enxertados às cadeias secundárias pendentes do poli(aminoácido) para formar o copolímero de enxerto. Em modalidades adicionais, um polímero responsive à temperatura pode ser ligado à extremidade
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122/314 dos polímeros de poli(aminoácido) para formar um polímero di-bloco responsivo à temperatura. Ainda em modalidades adicionais, um segundo polímero que é hidrofóbico pode ser ligado ao polímero poli(aminoácido) que é ligado a ligandos com propriedades adjuvantes através de grupos secundários pendentes para formar um copolímero de enxerto, ou à extremidade do poli(aminoácido) para formar um copolímero di-bloco.
[0283]Em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) ligado a um Ligando, como um Ligando hidrofóbico com propriedades adjuvantes, e tem a fórmula:
o /·< ll\ \ ' | ^3 4
X
Ligando
Fórmula I
[0284] Na fórmula I, R2 é tipicamente selecionado de um entre hidrogênio, hidroxila ou amina. Em algumas modalidades, R2 é ligado a um Ligando ou outro polímero através de qualquer molécula de ligador adequada. O número de unidades de metileno, y3, é tipicamente 1 a 6, como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A amina N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula 1 é tipicamente ligada ao precursor de ligador X2 ou pode ser ligada ao antigeno de peptídeo (A) diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2). O número de repetições de monômero é indicado por k, e é tipicamente entre 3 e 300. Qualquer ligador adequado, X, é usado para ligar o Ligando, como um Ligando hidrofóbico com propriedades adjuvantes, à estrutura de poli(aminoácido). Em algumas modalidades, o ligador X pode ser ligado a um segundo polímero que é ligado a Ligandos. Em algumas modalidades, os monômeros k podem ser ligados a dois ou mais ligandos diferentes.
[0285]Em algumas modalidades, os polímeros baseados em
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123/314 poli(aminoácido) da fórmula I são:
ο
Figure BR112019020853A2_D0005
FG
Em que y4 é qualquer inteiro, como 0 a 6, por exemplo, 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6. O Ligando pode ser ligado aos grupos funcionais (FG) através de qualquer meio adequado e o FG é qualquer grupo funcional adequado, incluindo amina, ácido carboxílico, tiol, hidroxila, azida, alcino, hidrazina, aldeído ou cetona para fixação, isto é, ligação, de um Ligando, diretamente ou através de um ligador.
[0286]Quando y3 é igual a 1, os polímeros baseados em poli(aminoácido) da fórmula I são:
Figure BR112019020853A2_D0006
FG
[0287]O N-terminal do poli(aminoácido) da Fórmula I pode ser ligado através do Ligador (L) ao antigeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado. Em algumas modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula I é ligado diretamente ao C-terminal do antigeno de peptídeo (A) ou ao C-terminal da extensão B2 através de uma ligação de amida. Em outras modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula I é ligado a um precursor de ligador (X2) que reage com um precursor de ligador (X1) que é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) ao antigeno de peptídeo (A). Em algumas modalidades, uma ciclooctina (por exemplo, DBCO) contendo precursor de ligador (X2) é fixada ao N-terminal do
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124/314 poli(aminoácido) da Fórmula I e reage com um precursor de ligador contendo azido (X1) para formar uma ligação de triazol.
[0288]Em algumas modalidades, molécula hidrofóbica baseada em poli(aminoácido (H) pode compreende aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, aminoácidos aromáticos) ou aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, aminoácidos aromáticos) e aminoácidos ligados a Ligandos, bem como aminoácidos adicionais, como aminoácidos carregados ou hidrofílicos, que são úteis para compensar ou modular as características químicas e físicas da molécula hidrofóbica (H) para produzir um material que é preferivelmente solúvel durante fabricação em solventes orgânicos, porém é capaz de formar partículas em condições aquosas. Desse modo, em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) é um polímero baseado em poli(aminoácido) que tem a fórmula:
Figure BR112019020853A2_D0007
Fórmula II
[0289]O polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende tipicamente o monômero, I, e monômeros opcionais, m, n e o. R3 é tipicamente selecionado de um entre hidrogênio, hidroxila ou amina. Em algumas modalidades, R3 é um Ligando, como um Ligando com propriedades adjuvantes, ou outro polímero que é ligado à molécula hidrofóbica (H) através de qualquer molécula de ligador adequada. O número de unidades de metileno indicado por y5, y6, y7 e y8 é tipicamente 1 a 6, como 1,2, 3, 4, 5 ou 6. A amina N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula I é tipicamente ligada ao precursor de ligador X2 ou pode ser liada ao antígeno de peptídeo (A) diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2). Em modalidades típicas, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II
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125/314 compreende monômeros, I, que são selecionados de qualquer aminoácido natural ou não natural em que R4 é selecionado de alquila inferior ou grupos aromáticos e dota a estrutura de polímero de propriedades hidrofóbicas. Em algumas
Figure BR112019020853A2_D0008
Figure BR112019020853A2_D0009
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126/314
Figure BR112019020853A2_D0010
Em que X de R4 é qualquer ligador adequado.
[0290]Em algumas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende comonômeros opcionais, m, que são selecionados de qualquer aminoácido natural ou não natural, como um espaçador de aminoácido PEG (por exemplo, m da fórmula II é -NH-(CH2-CH2-0)y9-(CH2)yio-(CO)-, em que y9 é um inteiro tipicamente entre 1 e 24 e y10 é um inteiro tipicamente entre 1 e 3) ou um aminoácido com um substituinte pequeno em que, por exemplo, R5 é selecionado de Hidrogênio, alquila inferior ou uma alquila inferior compreendendo uma hidroxila e é fornecido para aumentar o espaçamento ou flexibilidade da
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127/314 estrutura de polímero. Em algumas modalidades, o R5 incluído na fórmula II pode ser / M
-----c 4-oh b
θΏ,-de to w 1 -s S
ΓΊ-Ι selecionado de: H, 3,
[0291 ]Em algumas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende comonômeros opcionais, n, que são selecionados de qualquer aminoácido natural ou não natural, em que R6 é selecionado de qualquer grupo compreendendo um grupo funcional que carrega carga permanentemente ou em um pH específico. Em algumas modalidades, o R6 incluído na fórmula II pode ser selecionado de
NH , f H l]
-f—c 4- -4—C -4-COOH V G 7h l d osrie d = 1 e 6 - s a = i a 6
Figure BR112019020853A2_D0011
O
Figure BR112019020853A2_D0012
iisde d=À a 6
[0292]Em algumas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende comonômeros opcionais, o, que são selecionados de qualquer aminoácido natural ou não natural, em que um Ligando é ligado através de qualquer ligador, adequado, X, ao monômero, o. O Ligando pode ser um Ligando com propriedades adjuvantes. O Ligando ligado a poli(aminoácidos) da fórmula II pode ser hidrofóbico, hidrofílico, anfifílico, carregado ou neutro em propriedades. O polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreendendo monômero o pode compreender adicionalmente unidades de monômero, I, m e n, que compensam as propriedades do Ligando ligado ao monômero o.
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[0293]Em polímeros baseados em poli(aminoácido) da fórmula II, o número de repetições de monômero é indicado por I, m, n e o, em que a soma de I, m, n e o é tipicamente qualquer inteiro entre 3 e 300. Cada dos tipos diferentes de monômeros I, m, n ou o, pode ser igual ou diferente. Os monômeros indicados por “1” dotam o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II com propriedades hidrofóbicas, isto é, tornar o polímero uma molécula hidrofóbica insolúvel em água (H). Os monômeros hidrofóbicos, I, podem ser iguais ou diferentes e tipicamente compreendem um anel aromático. Em modalidades preferidas, os monômeros hidrofóbicos, I, compreendem um anel aromático heterocíclico e /ou substituído por amina. Os comonômeros opcionais indicados por “m” podem ser usados para aumentar a flexibilidade ou espaçamento de monômeros diferentes compreendendo a estrutura de polímero. Os comonômeros opcionais indicados por “n” compreendem grupos funcionais carregados. O comonômero opcional indicado por “o” é usado para a fixação de um Ligando, como um agonista PRR. Em algumas modalidades, o Ligando ligado ao monômero, o, através de qualquer ligador adequado é um agonista PRR. Em algumas modalidades, o monômero, o, é ligado a um Ligando que carrega uma carga positiva ou negativa e é adjacente a um monômero, n, da carga oposta. Em algumas modalidades, um comonômero carregado, n, é colocado adjacente a um comonômero, o, compreendendo um grupo funcional da carga oposta do grupo funcional compreendendo o comonômero n e as cargas opostas resultam em carga líquida zero, desse modo o monômero n funciona para neutralizar carga carregada pelo Ligado fixado ao monômero o.
[0294]A percentagem de monômeros, I, m, n, e o compreendendo o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II depende da aplicação específica. Em algumas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II é compreendido totalmente do monômero I. em outras modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II é compreendido de comonômeros, I e o,
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129/314 como entre 5 e 95% mol de monômero I e aproximadamente 95 a 5% mol de monômero o. em algumas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende comonômeros, I e m, em que m fornece espaço, isto é, distância, entre os monômeros hidrofóbicos, I, e pode reduzir rigidez de polímero. Em outras modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido da fórmula II compreende monômeros I, m e o, em que monômeros m fornecem espaço entre os substituintes volumosos compreendendo monômeros I e o. em outras modalidades o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende monômeros, I e o, e opcionalmente monômeros m e n, em que o monômero n é usado para modular a carga da estrutura de polímero. Em certas modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II é compreendido totalmente de monômeros m e o. Em outras modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II é compreendido totalmente de monômeros m, n e o, ou apenas n e o. ainda em outras modalidades, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende monômeros I, m, n e o.
[0295]Onde o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II compreende um adjuvante, a percentagem de monômeros compreendendo o polímero representado pelo monômero o, que é ligado a um adjuvante através de qualquer ligador adequado é tipicamente 10 a 60%, por exemplo, entre 2 e 12 aminoácidos de um polímero que tem 20 aminoácidos de comprimento são monômero o. em algumas modalidades dos polímeros de poli(aminoácido) da fórmula II, I é a unidade de monômero da maioria. Em modalidades adicionais, o polímero baseado em poli(aminoácido) da fórmula II é compreendido totalmente do monômero I, isto é, todos os monômeros são o monômero I, opcionalmente em que o adjuvante é fixado na extremidade do poli(aminoácido) direta ou indiretamente através de um segundo polímero ou através de qualquer molécula de ligador adequada.
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[0296]Onde o polímero da fórmula II é um copolímero compreendendo monômeros o, o Ligando pode ser ligado a grupos funcionais pendentes (FG) distribuídos ao longo da estrutura do polímero como mostrado aqui:
0 0 0
Figure BR112019020853A2_D0013
FG
Em que y11 indica o número de unidades de metileno e é qualquer inteiro, como 0 a 6, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. O grupo funcional (FG) é qualquer grupo funcional adequado, incluindo amina, ácido carboxílico, tiol, hidroxila, azida, alcino, hidrazina, aldeído ou cetona que permitem fixação, isto é, ligação, de um Ligando, diretamente ou através de um ligador.
[0297]Em algumas modalidades, y5, y6, y7 e y8 são iguais a 1 e o polímero da fórmula II é:
Figure BR112019020853A2_D0014
Ligando
[0298]Ligandos com propriedades adjuvantes podem ser ligados a qualquer uma das moléculas hidrofóbicas (H) da presente revelação. Em certas modalidades, Ligandos com propriedades adjuvantes são ligadas a polímeros da fórmula II. Ligandos com propriedades adjuvantes podem ser ligados a polímeros baseados em
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131/314 poli(aminoácido) da fórmula II através de grupos funcionais pendentes (FG) nos monômeros o; nas extremidades do polímero, ou indiretamente através de outra molécula ou polímero que é enxertado aos grupos funcionais pendentes (FG) ou nas extremidades do polímero. Em modalidades preferidas, o grupo funcional (FG) de monômeros o ligam os Ligandos com propriedades adjuvantes, ou outras moléculas de Ligando, à estrutura de poli(aminoácido) através de uma ligação covalente. Em algumas modalidades, o FG compreendendo monômero o de fórmula II pode ser ligado a um segundo polímero. O FG incluído na fórmula II pode ser selecionado entre ácido carboxílico, aldeído, cetona, amina, hidrazina, tiol, azida ou alcino, ou qualquer grupo funcional adequado que pode ser usado para ligar um Ligando ou outro polímero à estrutura de polímero.
[0299]Em modalidades preferidas, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II é ligado através do Ligador (L) ao antígeno de peptídeo (A), diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) através da reação dos precursores de ligador X1 e X2. Em algumas modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II é ligado diretamente (isto é, nenhum Ligador (L) está presente) ao Cterminal do antígeno de peptídeo (A) ou ao C-terminal da extensão B2 através de uma ligação de amida. Em outras modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II é ligado a precursor de ligador (X2) contendo ciclooctina (DBCO) que reage com precursor de ligador contendo azido (X1) que é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A).
[0300]0 poli(aminoácido) da fórmula II é uma molécula hidrofóbica (H) que pode ser ligada através da amina N-terminal, ácido carboxílico C-terminal ou através de cadeias secundárias opcionais, por exemplo, através dos grupos funcionais de comonômeros, direta ou indiretamente através de um Ligador (L) ou uma extensão (B1 ou B2) a um antígeno de peptídeo (A). Em algumas modalidades, o poli(aminoácido) da fórmula I ou fórmula II é uma molécula hidrofóbica (H) que é
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132/314 liada a um antígeno de peptídeo (A) resultando em um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula [C]-[B1 ]-A-[B2]-[L]-H, ou [B1]-A-[B2]-[L]-H(C)em que [ ] indica que o grupo é opcional.
[0301 ]Em modalidades preferidas, o poli(aminoácido) da fórmula I ou fórmula II é uma molécula hidrofóbica (H) que é ligada no N-terminal a um Ligador (L) que é ligado a uma extensão C-terminal (B2) que é ligada ao C-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é ligado no N-terminal a uma extensão N-terminal (B1\0 que é ligada a uma molécula carregada (C).
[0302] Por exemplo: C-B1-A-B2-T-H
[0303]Em modalidades adicionais, a molécula carregada (C) pode ser ligada diretamente à molécula hidrofóbica (H) compreendida de um poli(aminoácido) da fórmula I ou fórmula II, ou através de um Ligador (L) que é ligado ao antígeno de peptídeo (A) através de uma extensão. Aqui, para A-B2-L(C)-H, pretende-se que a notação em parênteses indique que L é ligado tanto a C como a H.
[0304]Por exemplo: A-B2-L(C)-H ou A-B2-L-H(C)
[0305]Em modalidades adicionais, o poli(aminoácido) da fórmula I ou fórmula II é uma molécula hidrofóbica (H) que é ligada ao N-terminal a um Ligador (L) que é liado tanto à molécula carregada opcional (C) como a uma extensão C-terminal (B2) que é liada ao C-terminal de um antígeno de peptídeo (A).
[0306]Por exemplo: A-B2-(C-L)-H
[0307]Em modalidades preferidas, o bloco hidrofóbico compreende um poli(aminoácido) em que um Ligando com propriedades adjuvantes é fixado a grupos secundários distribuídos ao longo da estrutura do poli(aminoácido). O Ligando com propriedades adjuvantes pode ser hidrofóbico ou hidrofílico, carregado ou não carregado em propriedades. Em modalidades preferidas, o Ligando com propriedades adjuvantes é um agonista PRR.
[0308]Em várias modalidades, o Ligando com propriedades adjuvantes pode
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133/314 ser um agonista de receptor de reconhecimento de padrão (PRR). Exemplos não limitadores de agonistas de receptor de reconhecimento de padrão (PRR) incluem agonistas TLR-1/2/6 (por exemplo, lipopeptídeos e glicolipídios, como lipopeptideos Pam2cys ou Pam3cys); agonistas TLR-3 (por exemplo, dsRNA, como PolyLC e análogos de base de nucleotídeo); agonistas TLR-4 (por exemplo, derivados de lipopolissacarídeo (LPS), por exemplo, lipídeo de monofosforila A (MPL) e molécula pequena é um derivado ou análogo de pirimidoindol; agonistas TLR5 (por exemplo, Flagellin); agonistas TLR-7 & 8 (por exemplo, ssRNA e análogos de base de nucleotídeo, incluindo derivados de imidazoquinolinas, hidroxi-adenina, benzonaftiridina e loxoribina); e agonistas TLR-9 (por exemplo CpG não metilado); Estimulador de agonistas de Genes Interferon (STING) (por exemplo, dinucleotideos cíclicos, como monofosfato diadenilato cíclico); agonistas de receptor de lectina tipoC (CLR) (como vários açucares mono, di, tri e poliméricos que podem ser lineares ou ramificados, por exemplo, manose, Lewis-X trissacarídeos, etc.); agonistas de receptor do tipo RIG-I (RLR) e agonistas de receptor do tipo NOD (NLR) (como peptidoglicanos e motivos estruturais de bactérias, por exemplo, ácido mesodiaminopimélico e dipeptídeo de muramila); e combinações dos mesmos. Em várias modalidades, o agonista de receptor de reconhecimento de padrão pode ser um agonista TLR, como um agonista TLR-7/8 baseado em imidazoquinolina. Por exemplo, o Ligando com propriedades adjuvantes pode ser Imiquimod (R837) ou Resiquimod (R848) que são aprovados pela FDA para uso humano.
[0309]Em várias modalidades, o Ligando com propriedades adjuvantes pode ser um agonista TLR-7, um agonista TLR-8 e/ou um agonista TLER-7/8. Inúmeros desses agonistas são conhecidos, incluindo muitos compostos de imidazoquinolina diferentes.
[0310]lmidazoquinolinas são de uso nos métodos revelados aqui. Imidazoquinolinas são drogas imunomoduladores sintéticas que atuam por ligar
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134/314 receptores do tipo Toll 7 e 8 (TLR-7/TLR-8) em células que apresentam antígeno (por exemplo, células dendríticas), simulando estruturalmente o ligando natural desses receptores, RNA de fita única viral. Imidazoquinolinas são compostos heterocíclicos compreendendo um esqueleto de quinolina-imidazol fundido. Derivados, sais (incluindo hidratos, solvatos e N-óxidos) e pró-medicamentos dos mesmos também são considerados pela presente revelação. Compostos de imidazoquinolina específicos são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, a patente US no. 6.518.265; e patente US no. 4.689.338. Em algumas modalidades não limitadores, o composto de imidazoquinolina não é imiquimod e/ou não é resiquimod.
[0311]Em algumas modalidades, o Ligando com propriedades adjuvantes pode ser uma molécula pequena tendo um 2-aminopiridina fundida com um anel heterocíclico contendo nitrogênio de cinco membros, incluindo, porém não limitado a aminas de imidazoquinolina e amidas de imidazoquinolina substituída como, por exemplo, aminas de imidazoquinolina substituídas por amida, aminas de imidazoquinolina substituídas por sulfonamida, aminas de imidazoquinolina substituídas por ureia, aminas de imidazoquinolina substituídas por éter de arila, aminas de imidazoquinolina substituídas por éter heterocíclico, aminas de imidazoquinolina substituídas por amido éter, aminas de imidazoquinolina substituídas por sulfonamido éter, éteres de imidazoquinolina substituídos por ureia, aminas de imidazoquinolina substituídas por tio éter, aminas de imidazoquinolina substituídas por hidroxialamina, aminas de imidazoquinolina substituídas por oxima,
6-, 7-, 8- ou 9-arila, heteroarila, ariloxi ou aminas de imidazoquinolina substituídas por arilalquilenoóxi, e diaminas de imidazoquinolina; aminas tetraidroimidazoquinolina incluindo, porém não limitado a aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por amida, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por sulfonamida, aminas de
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135/314 tetraidroimidazoquinolina substituídas por ureia, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por éter de arila, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por éter heterocíclico, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por amido éter, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por sulfonamido, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por ureia, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por tio éter, aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por hidroxilamina aminas de tetraidroimidazoquinolina substituídas por oxima e diaminas de tetraidroimidazoquinolina; aminas imidazopiridina incluindo, porém não limitado a, aminas imidazopiridina substituídas por amida. Aminas imidazopiridina substituídas por sulfonamida, aminas imidazopiridina substituídas por ureia, aminas imidazopiridina substituídas por éter de arila, aminas imidazopiridina substituídas por éter heterocíclico, aminas imidazopiridina substituídas por éter amido, aminas imidazopiridina substituídas por éter sulfonamido, éteres imidazopiridina substituídos por ureia, e aminas imidazopiridina substituídas por tioéter; aminas imidazoquinolina 1,2-ligadas; aminas cicloalquilimidazopiridina 6,7-fundidas, aminas imidazonaftiridina; aminas tetraidroimidazonaftiridina; aminas oxazoloquinolina; aminas tiazoloquinolina; aminas oxazolopiridina; aminas tiazolopiridina; aminas oxazolonaftiridina; aminas tiazolonaftiridina; aminas pirazolopiridina; aminas pirazoloquinolina; aminas tetraidropirazoloquinolina; aminas pirazolonftiridina; aminas tetraidropirazolonaftiridina; e dímeros 1H-imidazo dimers fundidos com aminas de piridina, aminas quinolina, aminas tetraidroquinolina, aminas naftiridina ou aminas tetraidronaftiridina.
[0312]Em algumas modalidades, o ligando com propriedades adjuvantes é uma imidazoquinolina com a fórmula:
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136/314
Figure BR112019020853A2_D0015
Fórmula III
[0313]Na Fórmula III, R7 é selecionado de um de hidrogênio, alquila inferior opcionalmente substituída, ou éter inferior opcionalmente substituído; e R8 é selecionado de um de arilamina opcionalmente substituída, ou alquilamina inferior opcionalmente substituída. R8 pode ser opcionalmente substituída em um ligador que se liga a um polímero. Uma descoberta inesperada foi que em alguns compostos em que R8 foi selecionado a partir de uma alquil amina inferior, embora o composto fosse menos potente que R8 selecionado de uma aril amina, a qualidade de resposta foi melhorada. Desse modo, Adjuvantes de potência moderada da fórmula III levaram a respostas de qualidade melhor. Observação: Adjuvantes da fórmula III são um tipo de Ligando e podem ser mencionados como Adjuvantes da fórmula III ou Ligandos com propriedades adjuvantes.
[0314]Em algumas modalidades, o R7 incluído na fórmula III pode ser selecionado de hidrogênio,
-yC rCH3 h2 H2 3 , OU —C -O-C CH3 .
[0315]Em algumas modalidades, R8 pode ser selecionado de
Figure BR112019020853A2_D0016
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137/314 h2 —c
Figure BR112019020853A2_D0017
Em que e indica que o número de unidades de metileno é um inteiro de 1 a
4.
[0316]Em algumas modalidades, R8 pode
[0317]Em algumas modalidades, R8 pode ser ser
Figure BR112019020853A2_D0018
[0318]Em algumas modalidades, R8 pode h2 c -nh2
Figure BR112019020853A2_D0019
ser /ch3 3 e R8 pode ser
[0319]Exemplos não limitadores de moléculas hidrofóbicas (Η) compreendidas de poli(aminoácidos) da fórmula I ligados a adjuvantes da fórmula III incluem:
Figure BR112019020853A2_D0020
Figure BR112019020853A2_D0021
Em que k está entre 3-300. Por exemplo, quando k = 5, o peptídeo é compreendido de 5 aminoácidos ligados a adjuvantes da fórmula III. Em algumas modalidades, moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de poli(aminoácidos) da
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138/314 fórmula I ligados a adjuvantes da fórmula III podem ser ligadas direta ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) a um antígeno de peptídeo (A) que é opcionalmente ligado a uma molécula carregada (C) através de qualquer meio adequado para formar um conjugado de antígeno de peptídeo. Em algumas modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula I ligado a adjuvantes da fórmula III é ligado diretamente ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) ou ao C-terminal da extensão B2 através de uma ligação de amida. Em outras modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido da fórmula I ligado a adjuvantes da fórmula III é ligado a um precursor de ligador clicável X2, por exemplo, alcino ou DBCO, ou um precursor de ligador reativo com tiol X2, por exemplo, maleimida, que reage com um precursor de ligador X2 que é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A). Em modalidades preferidas, um precursor de ligador DBCO X1 é fixado ao N-terminal do poli(aminoácido da fórmula I ligado a adjuvantes na Fórmula III e é usado para reagir com um precursor de ligador contendo azida X2 que é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) a um antígeno de peptídeo (A).
[0320]Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de poli(aminoácidos) da fórmula II ligados a adjuvantes da fórmula III inclui:
Figure BR112019020853A2_D0022
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139/314
Por exemplo:
Figure BR112019020853A2_D0023
[0321 ]Em que o comonômero 1 é tipicamente um inteiro entre 3-300, e o comonômero opcional o é tipicamente um inteiro entre 3-300 resíduos de aminoácido, em que a soma de 1 e o é tipicamente entre aproximadamente 3-300. Alternativamente, o é 0 e o polímero é totalmente compreendido de 1, isto é, o polímero é um polímero poli(triptofano) que não é ligado a adjuvantes. Em algumas modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da Fórmula II ligado a Adjuvantes da fórmula III é ligado direta ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) a um antígeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado. Em algumas modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II ligado a adjuvantes da fórmula III é ligado diretamente ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A) ou ao C-terminal da extensão B2 através de uma ligação de amida. Em outras modalidades, o N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II ligado a adjuvantes da fórmula III é ligado a um precursor de ligador clicável X2, por exemplo, DBCO ou um precursor de ligador reativo com tiol X2, por exemplo, maleimida, que reage com um precursor de ligador X1 que é ligado diretamente ou através de uma extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A), em modalidades preferidas, um precursor de
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140/314 ligador de DBCO X2 é fixado ao N-terminal do poli(aminoácido) da fórmula II ligada a adjuvantes da fórmula III e é usado para reagir com urn precursor de ligador X2 que contém um grupo funcional de azida.
[0322]Uma descoberta inesperada revelada aqui é que o comprimento, isto é, o número de unidades de monômero, de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligadas a adjuvantes da fórmula III compreendendo a molécula hidrofóbica (H) de conjugados de antigeno de peptídeo é um principal determinante que impacta a magnitude de respostas de célula T geradas contra o antigeno de peptídeo (A). Por conseguinte, verificou-se que conjugados de antigeno de peptídeo compreendidos de moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II com 5 ou mais unidades de monômeros promovem qualidade e magnitude mais altas de respostas de célula T em comparação com poli(aminoácidos) da mesma fórmula que têm menos de 5 aminoácidos em comprimento. Uma descoberta adicional foi que o número de adjuvantes da fórmula III ligados a poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II teve também um impacto sobre a magnitude da resposta imune gerada, com conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula I ou II compreendendo 3 ou mais adjuvantes da fórmula III levando a respostas de célula T de magnitude mais alta em comparação com conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula I ou II compreendendo menos de 3 adjuvantes da fórmula III. Explicações não limitadoras para essas descobertas são que o comprimento aumentado da molécula hidrofóbica (H) da fórmula I ou fórmula II ligada a adjuvantes da fórmula III assegura a formação de micelas ou outras estruturas supramoleculares quando ligadas a antígenos de peptídeo menos hidrofílicos e que tal formação de partícula leva a respostas imunes aperfeiçoadas, possivelmente através de farmacocinética e absorção celular aperfeiçoadas que é atribuída a partículas, porém não materiais solúveis. Uma
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141/314 explicação não limitadora adicional é que comprimentos crescentes da molécula hidrofóbica (H) compreendida de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligada a adjuvantes da fórmula III leva a estabilidade aperfeiçoada, por exemplo, estabilidade cinética, das partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptideo em tampão aquoso; estabilidade aperfeiçoada das partículas assegura que a partícula permanece intacta, desse modo retardando clearance (renal ou hepática) dos conjugados de antígeno de peptideo compreendendo as partículas e promovendo absorção por células que apresentam antígeno.
[0323]Uma descoberta inesperada adicional revelada na presente invenção é que verificou-se que a potência do adjuvante da fórmula III ligado a poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II compreendendo as moléculas hidrofóbicas (H) de conjugados de antígeno de peptideo era inversamente relacionada à magnitude e variedade de respostas de célula T geradas contra antigenos de peptideo após imunização múltipla. Por conseguinte, revelado aqui, os requerentes mostram que poli(aminoácidos) da fórmula I ligada a adjuvantes da ( ( H2^
-\-c/ch3 -\-c/-nh2 fórmula III, em que R7 = 2 3 e R8 = 4 , mencionados como
Composto 1, levam a magnitude e variedade maiores das respostas de célula T em comparação com poli(aminoácidos) da fórmula I ligados a adjuvantes da fórmula III em que R7 =
Figure BR112019020853A2_D0024
Figure BR112019020853A2_D0025
, mencionados como composto
2.
[0324]Uma explicação não limitadora é que a potência mais baixa de adjuvantes da fórmula III, em que R7 = adjuvantes da fórmula III em que R7 =
Figure BR112019020853A2_D0026
leva a menos inflamação do que
Figure BR112019020853A2_D0027
e que a inflamação moderada induzida pelos agonistas de potência mais baixa leva a menos exaustão de respostas de célula T, fonrecendo magnitude e variedade maiorse de rspostas de
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142/314 célula T em geral.
[0325]Com base nessas descobertas uma modalidade preferida para moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de um poli(aminoácido) da fórmula I ligadas a adjuvantes da fórmula (III) é:
Figure BR112019020853A2_D0028
[0326]Revelado aqui, os requerentes relatam a descoberta inesperada de que moléculas hidrofóbicas (H) baseadas em poli(aminoácidos) da fórmula II ligados a adjuvantes da fórmula III levam a um aumento significativo na magnitude e qualidade de respostas de célula T quando o polímero de poli(aminoácido) é compreendido entre 5-10 aminoácidos, em que entre 60-100% do copolímero são compreendidos de comonômero o ligado a adjuvantes da fórmula III em que R7 = ( IH2^
-/ch3 -Yc/NH2 3 e R8 = 4 composto 1. Em modalidades preferidas, o comonomero 0 compreende entre 20-60% de unidades de monomero de poli(aminoacidos) da fórmula II, por exemplo, 60%.
Por exemplo:
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143/314
Figure BR112019020853A2_D0029
[0327]Os dados inesperados revelados na presente invenção revelam que o comprimento do polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H) e o número e potência de Ligandos com propriedades adjuvantes (isto é, agonistas TLR-7/8 da fórmula III) fixados são principais determinantes da magnitude e qualidade de respostas imunes geradas contra antígenos de peptídeo (A) fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo. Esses dados sugerem que as moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de poli(aminoácidos) que são compreendidos de aminoácidos hidrofóbicos e/ou aminoácidos ligados a Ligandos devem ser suficientemente longas para permitir a formação de partícula quando ligadas a qualquer antígeno de peptídeo (A), incluindo antígenos de peptídeo altamente hidrofílicos (A) que contrariará a tendência da molécula hidrofóbica baseada em poli(aminoácido (H) a acionar a montagem de partículas. Poli(aminoácidos) de comprimento insuficiente, por exemplo, menos 3 aminoácidos em comprimento, podem não fornecer área superficial hidrofóbica suficiente para promover formação de partícula em condições aquosas quando ligados a certos antígenos de peptídeo, particularmente antígenos de peptídeo hidrofílicos com densidade de carga alta. Portanto, como revelado na presente invenção, poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II devem ter mais de 3 aminoácidos em comprimento, preferivelmente entre 5-30 aminoácidos em comprimento, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 ou 30 aminoácidos em comprimento. Poli(aminoácidos) mais longos, como poli(aminoácidos) com mais de 30 aminoácidos, como aproximadamente 30, 40, ou 50 aminoácidos em
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144/314 comprimento podem ser gerados, por exemplo, por síntese de peptídeo de fase sólida. Como alternativa à síntese de peptídeo de fase sólida, reações de polimerização de solução podem ser usadas para gerar poli(aminoácidos) de cadeia longa compreendidos de monômeros hidrofóbicos.
[0328]Os requerentes revelam aqui uma descoberta inesperada adicional de que o Composto 1, que tem uma potência determinada in vitro para atividade TLR-7 (isto é, EC50) de 108 mmolar leva a respostas de célula T aperfeiçoadas após imunizações de repetição em comparação com um agonista mais potente, Composto 2, que tem uma potência determinada in vitro para atividade TLR-7 (isto é, EC50) de 18.7 mmolar. Esses dados sugerem que a potência de adjuvantes incluídos na composição imunogênica pode ser modulada para otimizar respostas imunes e que ativação imune inata pelo adjuvante pode ser moderada para fornecer o nível apropriado de estimulação necessária para otimizar imunidade de célula T. O nível de estimulação imune inata pode ser moderado por fornecer múltiplos, por exemplo, 3 ou mais, agonistas de potência moderada (isto é, agonistas com EC50 > 100 mmolar) nos conjugados de antigeno de peptídeo ou por fornecer menos de 3 agonistas de potência alta (isto é, agonistas com EC50 < 100 mmolar).
[0329]A potência de vários agonistas TLR-7, TLR-8 e TLR-7 & 8 combinados pode ser prontamente determinada a partir da literatura. Agonistas TLR-7 e TLR-7/8 baseados em imidazoquinolina e adenina foram descritos (vide: Shukla, et al. J. Med. Chem., 53:4450-4465, 2010 e Gerster, et al., J. Med. Chem., 2005, patente U.S. No. 6,069,149 e Hirota, et al., J. Med. Chem., 45:5419-5422, 2002 que são incorporados por referência na persente invenção) e revelam que ligadores aromáticos, como ligadores de benzila e xilila, selecionados para R2 de adjuvantes da fórmula III resultam em compostos com potência aumentada para TLR-7 em comparação com o composto onde R2 de adjuvantes da fórmula III é selecionado a partir de uma alquila inferior.
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[0330]Com base nas descobertas inesperadas descritas aqui, modalidades preferidas de moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligadas a adjuvantes da fórmula III têm tipicamente entre 5-30 aminoácidos em comprimento, em que a densidade dos comonômeros ligados a adjuvantes da fórmula III está entre 20-100% mol. Opcionalmente, quando o adjuvante da fórmula III inclui R8 selecionado de uma alquila inferior, por exemplo, composto 1, a densidade de aminoácidos ligados a composto 1 deve estar entre 40100%, como 60%. Opcionalmente, quando o adjuvante da fórmula III inclui R8 selecionado de um aromático, por exemplo, Composto 2, a densidade de aminoácidos ligados ao composto 2 deve ser menor que 20%, ou entre 1-2 moléculas do composto 2 fornecido em cada polímero.
[0331 ]Em modalidades preferidas, a densidade de adjuvantes da fórmula III ligados a polímeros com pesos moleculares menores que aproximadamente 10.000 g/mol e com base em comonômeros selecionados de N-2-hidroxi propil(metacrilamida) (HPMA), hidroxi etil(metacrilato) (HEMA), estireno, vinil pirrolidona (PVP), ΛΖ-isopropil acrilamida (NIPAAm); ΛΖ-isopropil metacrilamida (NIPMAm); Λ/,Λ/’-dietil acrilamida (DEAAm); A/-(L)-(1 -hidroxi metil)propil metacrilamida (HMPMAm); A/,A/-dimetil etil metacrilato (DMEMA), 2-(2-metoxi etóxi)etil metacrilato (DEGMA) ou poli(fosfoésteres) substituídos é de aproximadamente 5 a 100 mol%, por exemplo, a densidade do adjuvante fixado ao polímero pode ser aproximadamente 5-6%, aproximadamente 6-7%, aproximadamente 8-9%, aproximadamente 9-10%, aproximadamente 10-11%, aproximadamente 11-12%, aproximadamente 12-13%, aproximadamente 13-14%, aproximadamente 15-16%, aproximadamente 17-18%, aproximadamente 18-20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%.
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146/314
[0332]Em modalidades preferidas, a densidade de adjuvantes da fórmula III ligados a polímeros com pesos moleculares maiores que 10.000 g/mol e baseados em comonômeros selecionados entre N-2-hidroxipropil(metacrilamida) (HPMA), hidroxietil(metacrilato) (HEMA), estireno, vinil pirrolidona (PVP), ΛΖ-isopropil acrilamida (NIPAAm); ZV-isopropil metacrilamida (NIPMAm); Λ/,Λ/’-dietil acrilamida (DEAAm); A/-(L)-(1 -hidroxi metil)propil metacrilamida (HMPMAm); Λ/,Λ/’-dimetil etil metacrilamida (DMEMA), 2-(2-metoxi etoxi)etil metacrilato (DEGMA) ou poli(fosfoésteres) substituídos é de aproximadamente 1 a 25 mol%, por exemplo, a densidade do adjuvante fixado ao polímero pode ser aproximadamente 1-2%, aproximadamente 2-3%, aproximadamente 3-4% aproximadamente 5-6%, aproximadamente 6-7%, aproximadamente 7-8%, aproximadamente 8-9%, aproximadamente 9-10%, aproximadamente 10-11%, aproximadamente 11-12%, aproximadamente 13-14%, aproximadamente 14-15%, aproximadamente 16-17%, aproximadamente 17-18%, aproximadamente 19-20%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, ou aproximadamente 25%.
[0333]Em modalidades adicionais, um segundo polímero, que é compreendido de monômeros hidrofóbicos e/ou responsivos à temperatura, é ligado a grupos extremos ou secundários de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligados a adjuvantes da fórmula III.
[0334]Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero baseado em DEGMA responsive à temperatura enxertado em um poli(aminoácido) da fórmula I ligada a adjuvantes da fórmula III é fornecido aqui para clareza:
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Figure BR112019020853A2_D0030
[0335]Em que o comonômero k é tipicamente um número inteiro entre 3-300 e o comonômero k’ é tipicamente um número inteiro entre 3-300 resíduos de aminoácidos, em que a soma de k e k’ está tipicamente entre aproximadamente 3300. Em modalidades preferidas, k está entre aproximadamente 3-10 e k está entre aproximadamente 1-10. O ligador, X, pode ser qualquer molécula de Igiador adequada e m é tipicamente aproximadamente 10-300 unidades de monômero. O Nterminal do poli(aminoácido é ligado direta ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado para formar um conjugado de antígeno de peptídeo que pode compreender adicionalmente uma molécula carregada (C).
[0336]Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero baseado em DEGMA responsivo à temperatura ligado à extremidade de um poli(aminoácido) da fórmula I ligado a adjuvantes da fórmula III é fornecido aqui para clareza:
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Figure BR112019020853A2_D0031
/
[0337]Em que o comonômero k é tipicamente um número inteiro entre 3-100 unidades de monômero. O ligador, X, pode ser qualquer molécula de ligador adequada. Em modalidades preferidas, k’ está entre aproximadamente 3-10 unidades de monômero. O N-terminal do poli(aminoácido) é ligado direta ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado para formar um conjugado de antígeno de peptídeo que pode compreender adicionalmente uma molécula carregada (C).
[0338]Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero baseado em poli-fosfoéster ligado à extremidade de um poli(aminoácido) da fórmula I ligado a adjuvantes da fórmula III é fornecido aqui para clareza:
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149/314
Figure BR112019020853A2_D0032
ÇHS
Figure BR112019020853A2_D0033
Figure BR112019020853A2_D0034
[0339]Em que o comonômero k é tipicamente um número inteiro entre 3-100 unidades de monômero. O ligador, X, pode ser qualquer molécula de ligador adequada. Em modalidades preferidas, k está entre aproximadamente 5-10 unidades de monômero e m está entre aproximadamente 10-300 unidades de monômero. O N-terminal do poli(aminoácido) é ligado diretamente ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) ao antígeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado para formar um conjugado de antígeno de peptídeo que pode compreender adicionalmente uma molécula carregada (C).
[0340]Um exemplo não limitador de uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um polímero baseado em poli(glutamato de benzila) ligado à extremidade de um poli(aminoácido) da fórmula I ligado a adjuvantes da fórmula III é fornecido aqui para clareza:
Figure BR112019020853A2_D0035
Figure BR112019020853A2_D0036
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150/314
[0341 ]Em que o comonômero k é tipicamente um número inteiro entre 3-100 unidades de monômero e m é tipicamente um número inteiro entre 50=300 resíduos de aminoácidos. O ligador pode ser qualquer molécula de ligador adequada. Em modalidades preferidas, x está entre aproximadamente 5-10 unidades de monômero e m está entre aproximadamente 10-300 unidades de monômero. O n-terminal do poli(aminoácido) é ligado direta ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) ao antigeno de peptídeo (A) através de qualquer meio adequado para formar um conjugado de antigeno de peptídeo que pode compreender adicionalmente uma molécula carregada (C).
[0342]Em um exemplo não limitador, um antigeno de peptídeo (A) é ligado a uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) e pode compreender adicionalmente extensões opcionais (B1 e/ou B2) e um Ligador opcional (L) para fornecer um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula IV, em que [ ] indica que o grupo é opcional:
[B1]-A-[B2]-[L]-P, [B1]-A-[B2]-[L]-H, P-[L]-[B1]-A-[B2] ou H-[L]-[B1]-A-[B2]
Fórmula IV
[0343]O antigeno de peptídeo (A) da fórmula IV é compreendido de um número inteiro de aminoácidos, n, em que n está tipicamente entre 7-35, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, ou 35 aminoácidos, e a molécula hidrofóbica (H) é tipicamente um poli(aminoácido) da fórmula I ou II ligado a um adjuvante da fórmula III.
[0344]Um exemplo não limitador de um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula IV compreendido de um antigeno de peptídeo (A) que é opcionalmente ligado ao N-terminal a uma extensão de tetrapeptídeo clivável por catepsina (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO: 8) e no C-terminal a uma extensão de hexapeptídeo clivável por catepsina e imuno-proteassoma combinada (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-ValArg SEQ ID NO: 13) que é liada a um Ligador de triazol (L) que é ligado a uma
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151/314 molécula hidrofóbica (H) compreendida de um poli(aminoácido) da fórmula I que é ligado a um adjuvante da fórmula III é mostrado aqui como um exemplo: L ___O
H lí ly» Pro Leu Arg C”** Gly Ser Leu W &g --N•—CH-O—NHS i
CH, i
CH2
J
N~N H
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Figure BR112019020853A2_D0037
Molécula carregada opcional (C)
[0345]Os conjugados de antigeno de peptídeo revelados na presente invenção são compreendidos de antígenos de peptídeo (A) ligados a uma Partícula (P) ou uma molécula hidrofóbica (H) e podem compreender adicionalmente extensões opcionais (B1 e/ou B2), um Ligador opcional (L) e uma molécula carregada opcional (C), onde C = indica uma molécula carregada contendo grupos funcionais que transmitem carga eletrostática. As composições imunogênicas reveladas na presente invenção compreendendo antígenos de peptídeo ligados a uma Partícula (P) ou a uma molécula hidrofóbica (H) que se reúnem em partículas em condições aquosas podem flocular sem carga de superfície suficiente para estabilizar as partículas. Desse modo, moléculas carregadas (C) podem ser opcionalmente ligadas a conjugados de antigeno de peptídeo, como meio para estabilizar as partículas e evitar floculação; ou alternativamente, moléculas carregadas (C) podem ser incorporadas em partículas compreendendo conjugados
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152/314 de antígeno de peptídeo como um meio para partículas estabilizadas. Desse modo a finalidade da molécula carregada (C) é controlar a carga líquida de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo como meio para promover estabilidade daquelas partículas.
[0346]Uma molécula carregada (C) se refere a qualquer molécula que tenha um ou mais grupos funcionais que são positiva ou negativamente carregados em tampões aquosos em um pH de aproximadamente 7.4. Os grupos funcionais compreendendo a molécula carregada (C) podem ser valores de carga inteiros parciais ou totais. Uma molécula carregada (C) pode ser uma molécula com um grupo funcional de carga única ou grupos funcionais de carga múltipla. A carga líquida da molécula carregada (C) pode ser positiva, negativa ou neutra. A carga de grupos funcionais compreendendo a molécula carregada (C) pode ser dependente ou independente do pH da solução na qual a molécula carregada (C) é dispersa, como é o caso, por exemplo, para aminas terciárias e compostos de amônio quaternário que são dependentes de pH e independes de pH, respectivamente. A carga de uma molécula pode ser prontamente estimada com base na estrutura Lewis da molécula e métodos aceitos conhecidos por aqueles versados na técnica. A carga pode resultar de efeitos indutivos, por exemplo, átomos ligados juntos com diferenças em afinidade de elétron podem resultar em uma ligação covalente polar resultando em um átomo parcialmente negativamente carregado e um átomo parcialmente positivamente carregado. Por exemplo, nitrogênio ligado a hidrogênio resulta em carga negativa parcial em nitrogênio e uma carga positiva parcial no átomo de hidrogênio. Alternativamente, um átomo em uma molécula pode ser considerado como tendo um valor de carga inteiro total quando o número de elétrons atribuídos àquele átomo é menor ou igual ao número atômico do átomo. A carga da molécula é determinada por somar a carga de cada átomo compreendendo a molécula. Aqueles versados na técnica são familiares com o processo de estimar
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153/314 carga de uma molécula por somar a carga formal de cada átomo em uma molécula.
[0347]A molécula carregada (C) pode carregar uma carga negativa líquida, positiva líquida ou neutra e depende da carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo necessário para a aplicação específica da invenção revelada na presente invenção. Por exemplo, a maioria das superfícies de célula é conhecida por carregar uma carga negativa líquida. Desse modo, partículas de carga positiva líquida podem interagir com todas as superfícies de célula sem um alto grau de especificidade. Em contraste, partículas negativamente carregadas líquidas serão eletrostaticamente repulsadas a partir da maioria das superfícies de célula, porém foram mostradas como promovendo absorção seletiva por certas populações de célula que apresentam antígeno. Por exemplo, verificou-se que partículas positivamente carregadas fornecidas por via intravenosa na circulação acumulam no fígado e pulmões bem como nas células que apresentam antígeno no baço, ao passo que se verificou que partículas negativamente carregadas acumulam preferencialmente em células que apresentam antígeno no baço após administração intravenosa. Desse modo, a carga líquida da molécula carregada (C) pode ser ajustada para atender as demandas específicas da aplicação.
[0348]Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) tem uma carga negativa líquida e é compreendida de grupos funcionais que carregam uma carga negativa em pH fisiológico, em um pH de aproximadamente 7.4. Moléculas carregadas adequadas (C) que carregam uma carga negativa líquida incluem moléculas contendo grupos funcionais (por exemplo, grupos funcionais com um pKa menor que aproximadamente 6.5) que ocorrem como a base de conjugado de um ácido em pH fisiológico, em um pH de aproximadamente 7.4. Esses incluem, porém não são limitados a moléculas contendo carboxilatos, sulfatos, fosfatos, fosforamidatos e fosfonatos. A molécula carregada (C) contendo um carboxilato pode ser, porém não é limitada a ácido glutâmico, ácido aspártico, ácido pirúvico,
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154/314 ácido láctico, ácido glicólico, ácido glucurônico, citrato, isocitrato, alfa-ceto-glutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato e derivados dos mesmos. Em modalidades preferidas, a molécula negativamente carregada (C) é compreendida de uma molécula com entre 1-20 grupos funcionais negativamente carregados, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 grupos funcionais negativamente carregados, embora, tipicamente não mais de 16 grupos funcionais negativamente carregados. Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é um peptídeo poli(ácido glutâmico) entre 2-6 aminoácidos em comprimento. Uma sequência de poli(ácido glutâmico) compreendida de 1,2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos seria esperada carregar uma carga negativa de -1, -2, -3, -4, -5 e 6 em pH 7.4, respectivamente. Em modalidades adicionais, a molecular carregada (C) é fosfoserina ou sulfoserina.
[0349]Em certas modalidades, a molécula carregada (C) tem uma carga negativa líquida e é compreendida de 1 ou mais aminoácidos negativamente carregados. Em modalidades preferidas, a molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida é compreendida entre 1 e 20 aminoácidos negativamente carregados, por exemplo, 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em um exemplo não limitador, uma molécula carregada (C) é compreendida de 16 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-AspAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 25), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -16; uma molécula carregada (C) compreendida de 15 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 26), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -15; uma molécula carregada (C) compreendida de 14 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-AspAsp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 27), é usada para preparar uma molécula carregada (C)
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155/314 com uma carga negativa líquida de -14; uma molécula carregada (C) compreendida de 13 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-AspAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 28), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -13; uma molécula carregada (C) compreendida de 12 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-AspAsp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 29), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -12; uma molécula carregada (C) compreendida de 11 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 30), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -11; uma molécula carregada (C) compreendida de 10 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 31), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -10; uma molécula carregada (C) compreendida de 9 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 32), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -9; uma molécula carregada (C) compreendida de 8 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 33), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -8; uma molécula carregada (C) compreendida de 7 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 34), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -7; uma molécula carregada (C) compreendida de 6 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, AspAsp-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 35), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -6; uma molécula carregada (C) compreendida de 5 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-AspAsp (SEQ ID NO: 36), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma
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156/314 carga negativa líquida de -5; uma molécula carregada (C) compreendida de 4 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 37), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -4; uma molécula carregada (C) compreendida de 3 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp-Asp, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -3; uma molécula carregada (C) compreendida de 2 monômeros de ácido aspártico, por exemplo, Asp-Asp, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -2; uma molécula carregada (C) compreendida de 1 monômero de ácido aspártico, por exemplo, Asp, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida de -1. Nos exemplos acima, ácido aspártico (Asp) pode ser substituído com qualquer aminoácido negativamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a ácido glutâmico, sulfo-serina, ou fósforo-serina, em que os aminoácidos negativamente carregados podem ser iguais ou diferentes.
[0350]Em algumas modalidades a molécula carregada (C) tem uma carga positiva líquida e é compreendida de grupos funcionais positivamente carregados. Moléculas positivamente carregadas adequadas (C) incluem aquelas com grupos funcionais que carregam carga positiva em pH fisiológico, em um pH de aproximadamente 7.4, como o ácido conjugado de bases fracas, em que o pKa do ácido conjugado da base é maior que aproximadamente 8.5. Moléculas positivamente carregadas (C) adequadas incluem, porém não são limitadas a moléculas contendo aminas primárias, secundárias e terciárias, bem como grupos funcionais de amônio quaternário, guanidínio, fosfônio e sulfônico. Moléculas adequadas contendo grupos funcionais de amônio incluem, por exemplo, compostos de imidazólio e tetra-alquil amônio. Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é compreendida de compostos de amônio quaternário que carregam uma carga positiva permanente que é independente de pH.
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157/314
[0351]Exemplos não limitadores de grupos funcionais positivamente carregados que têm carga independente de pH incluem:
Figure BR112019020853A2_D0038
-anis R — ’ = 1x8 R ·= in:eii:r .inferior·
Em que X’ é qualquer contra ânion adequado.
[0352]Em modalidades adicionais, a molécula carregada (C) é compreendida de grupos funcionais que ocorrem como o ácido conjugado de uma base em pH fisiológico, como, por exemplo, aminas primárias, secundárias e terciárias. Em modalidades preferidas, a molécula positivamente carregada (C) é compreendida entre 1-20 grupos funcionais positivamente carregados, como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 grupos funcionais positivamente carregados, embora, tipicamente não mais que 16 grupos funcionais carregados. Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é um peptídeo de poli(lisina) entre 1-6 aminoácidos em comprimento. Uma sequência de poli(lisina) compreendida de 1,2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos seria esperada carregar uma carga positiva de +1, +2, +3, +4, +5 ou +6 respectivamente, em pH 7.4. Em modalidades adicionais, a molécula carregada (C) é um peptídeo poli(arginina) entre 2-6 aminoácidos em comprimento.
[0353]Em certas modalidades, a molécula carregada (C) tem uma carga positiva líquida e é compreendida de 1 ou mais aminoácidos positivamente carregados. Em modalidades preferidas, a molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida é compreendida entre 1 e 20 aminoácidos positivamente carregados, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em um exemplo não limitador, uma molécula carregada (C) compreendida de 16 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 38), é usada para preparar uma molécula
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158/314 carregada (C) com uma carga positiva líquida de +16; uma molécula carregada (C) compreendida de 15 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 39), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +15; uma molécula carregada (C) compreendida de 14 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 40), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +14; uma molécula carregada (C) compreendida de 13 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 41), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +13; uma molécula carregada (C) compreendida de 12 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 42), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +12; uma molécula carregada (C) compreendida de 11 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 43), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +11; uma molécula carregada (C) compreendida de 10 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 44), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +10; uma molécula carregada (C) compreendida de 9 monômeros de lisina, por exemplo, LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 45), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +9; uma molécula carregada (C) compreendida de 8 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-LysLys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 46), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +8; uma molécula carregada (C) compreendida de 7 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 47), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma
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159/314 carga positiva líquida de +7; uma molécula carregada (C) compreendida de 6 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 48), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +6; uma molécula carregada (C) compreendida de 5 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 49), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +5; uma molécula carregada (C) compreendida de 4 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-LysLys (SEQ ID NO: 50), é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +4; uma molécula carregada (C) compreendida de 3 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys-Lys, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +3; uma molécula carregada (C) compreendida de 2 monômeros de lisina, por exemplo, Lys-Lys, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +2; uma molécula carregada (C) compreendida de 1 lisina, por exemplo, Lys, é usada para preparar uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida de +1. Nos exemplos acima, Lisina (Lys) pode ser substituída com qualquer aminoácido positivamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a trimetil-lisina ou arginina, em que os aminoácidos positivamente carregados podem ser iguais ou diferentes.
[0354]Moléculas carregadas (C) podem compreender adicionalmente aminoácidos hidrofílicos, não carregados pequenos, ou ligadores hidrofílicos, por exemplo, óxido de etileno que funcionam para i) melhorar a solubilidade em água e ii) aumentar a distância entre grupos funcionais carregados para evitar ionização incompleta. Por exemplo, ionização de um grupo funcional em um polímero pode impactar o pKa de grupos funcionais vizinhos através de efeitos locais. Por exemplo, protonação de uma amina em proximidade estreita com uma segunda amina pode diminuir o pKa do ácido conjugado da segunda amina. Para reduzir o impacto de
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160/314 efeitos locais sobre o potencial de ionização de grupos funcionais vizinhos, uma molécula de ligador pode ser usada para aumentar a distância entre grupos funcionais carregados compreendendo a molécula carregada. A molécula de ligador pode compreender entre 2-5 aminoácidos hidrofílicos não carregados, pequenos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 e 5 aminoácidos. Alternativamente, o ligador pode compreender um ligador de óxido de etileno (isto é, PEG) entre 1-4 unidades de monômeros, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 monômeros de óxido de etileno em comprimento. Em modalidades preferidas, 1 a 2 aminoácidos hidrofílicos não carregados pequenos são colocados entre aminoácidos carregados vizinhos compreendendo a molécula carregada (C) em que os aminoácidos são ligados através de ligações de amida. Em certas modalidades, uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado compreendendo uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida. Em modalidades preferidas, a molécula carregada (C) é compreendida de dipeptídeos de repetição de lisina e serina, isto é, (Lys-Ser)n, onde n é tipicamente qualquer número inteiro entre 1 -20, por exemplo, 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Como outros exemplos, uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada de tripeptideo (C) com uma carga +2 líquida, por exemplo, Lys-Ser-Lys; uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada com 5 aminoácidos (C) com uma carga +3 líquida; por exemplo, Lys-Ser-Lys-Ser-Lys (SEQ ID NO: 51); uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada com 7 aminoácidos (C) com uma carga +4 líquida, por exemplo, Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys (SEQ ID NO: 52). Nos exemplos acima, Lisina (Lys) pode ser substituída com qualquer aminoácido positivamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a trimetil-lisina ou arginina, em que os aminoácidos positivamente carregados podem ser iguais ou diferentes.
[0355]Em certas modalidades, uma serina é colocada entre cada aminoácido
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161/314 carregado compreendendo uma molécula carregada (C) com uma carga negativa líquida. Em modalidades preferidas, a molécula carregada é compreendida de dipeptídeos de repetição de ácido aspártico e serina, isto é, (Asp-Ser)n, onde n é tipicamente qualquer número inteiro entre 1-20, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Por exemplo, uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada de tripeptídeo (C) com uma carga -2 líquida, por exemplo, Asp-Ser-Asp; uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada de 5 aminoácidos (C) com uma carga -3 líquida, por exemplo, Asp-Ser-Asp-Ser-Asp (SEQ ID NO: 53); uma serina é colocada entre cada aminoácido carregado de uma molécula carregada de 7 aminoácidos (C) com uma carga -4 líquida, por exemplo, Asp-Ser-Asp-Ser-AspSer-Asp (SEQ ID NO: 54). Nos exemplos acima, ácido aspártico (Asp) pode ser substituído com qualquer aminoácido negativamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a, ácido glutâmico, sulfo-serina, ou fosfo-serina, em que os aminoácidos negativamente carregados podem ser iguais ou diferentes.
[0356]Em modalidades adicionais, a molécula carregada (C) é compreendida de aminoácidos tanto negativa como positivamente carregados. Di-peptídeos compreendidos de aminoácidos de carga oposta, por exemplo, Lys-Asp, são mencionados como dipeptídeos de zwitterion porque são previstos ter uma carga neutra líquida, 0, em pH 7.4. Um ou mais dipeptídeos de zwiterion podem ser incluídos na molécula carregada (C) como um meio parar i) melhorar a solubilidade em água, e ii) fornecer uma carga predominante (por exemplo, negativa líquida ou positiva líquida) em certas faixas de pH. Por exemplo, um di-peptídeo de zwitterion pode ser usado para aumentar o caráter hidrofílico de uma sequência de peptídeo sem aumentar ou diminuir a carga de uma sequência de peptídeo em pH 7.4. Entretanto, o zwitterion pode ser usado para transmitir uma carga líquida em um pH específico. Por exemplo, excluindo a contribuição da amina N-terminal e o ácido
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162/314 carboxílico C-terminal nesse exemplo, o di-peptídeo zwitterion, Lys-Asp, tem uma carga líquida de 0 em pH 7.4, porém uma carga líquida de +1 em pH < 4 e uma carga líquida de -1 em pH > 10. Um ou mais di-peptídeos de zwitterion podem ser adicionados à sequência de moléculas carregadas (C); por exemplo, um di-peptídeo, Lys-Asp; dois di-peptídeos Lys-Asp-Lys-Asp (SEQ ID NO: 55); três di-peptídeos, Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp (SEQ ID NO: 56) e etc. Nos exemplos acima, Lisina (Lys) pode ser substituída com qualquer aminoácido positivamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a trimetil-lisina ou arginina, e ácido aspártico (Asp) pode ser substituído com qualquer aminoácido negativamente carregado adequado, incluindo, porém não limitado a ácido glutâmico, sulfo-serina, ou fosfo-serina, em que os aminoácidos positiva ou negativamente carregados podem ser iguais ou diferentes.
[0357]A composição da molécula carregada (C) é selecionada para fornecer a carga líquida necessária de um conjugado de antígeno de peptideo para a aplicação específica. Em várias modalidades reveladas aqui, a molécula carregada (C) é um poli(aminoácido) positivamente carregado compreendido de lisinas ou argininas, ou lisinas ou argininas e aminoácidos não carregados. Em algumas modalidades, a fração carregada compreendida de grupos funcionais de sulfônio ou amônio quaternário que carregam carga positiva independente de pH. Em várias modalidades reveladas na presente invenção, a molécula carregada (C) é um poli(aminoácido) negativamente carregado compreendido de ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou ácido glutâmico ou ácido aspártico e aminoácidos não carregados. Em algumas modalidades a fração carregada compreende grupos de fosfato ou sulfato, como sulfoserina ou fosfoserina. Em modalidades adicionais, a molécula carregada é compreendida de lisinas ou argininas e ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou lisinas ou argininas e ácido glutâmico ou ácido aspártico bem como aminoácidos não carregados. Grupos funcionais tanto positiva como
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163/314 negativamente carregados podem ser incluídos na mesma molécula carregada (C). A molécula carregada (C) pode ser positiva, negativa ou neutra porém a carga líquida do conjugado de antigeno de peptídeo deve ser não zero, por exemplo, maior que cargas líquidas +3 ou menor que -3 são preferidas e dependem da aplicação específica.
[0358]Uma consideração adicional em relação a moléculas carregadas (C) é o contra-íon selecionado. Exemplos não limitadores de moléculas carreadas (C) contendo grupos funcionais com carga positiva incluem, porém não são limitados a haletos, incluindo ânions de cloreto, brometo e iodeto, e bases conjugadas de ácidos, incluindo, fosfato, sulfatos, sulfitos e ânions de carboxilato incluindo formato, succinato, acetato e trifluoroacetato. Contra-íons adequados para moléculas carregadas (C) contendo grupos funcionais com carga negativa incluem, porém não são limitados a hidrogênio e metais alcalinos e alcalino terrosos, incluindo, por exemplo, sódio, potássio, magnésio e cálcio, ou ácidos conjugados de bases fracas, como compostos de amônio.
[0359]A molécula carregada (C) pode ser ligada diretamente ao antigeno de peptídeo (A) diretamente ou indiretamente através de uma extensão (B1 ou B2), um Ligador (L), um Ligador e extensão (B1 ou B2), ou uma Partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) que é ligada diretamente ou indiretamente através de um Ligador (L) e/ou extensão (B1 ou B2) ao antigeno de peptídeo.
[0360]Em algumas modalidades, a molécula carregada (C) é ligada a uma extensão N- ou C-terminal opcional (B1 ou B2) que é liada ao N- ou C-terminal, respectivamente, de um antigeno de peptídeo (A) que é ligado no C- ou N-terminal, respectivamente, a uma extensão opcional (B2) que é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) a uma partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) para fornecer um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V, em que [ ] indica que o grupo é opcional:
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164/314
C-[B1]-A-[B2]-[L]-P, C-[B1]-A-[B2]-[L]-H, P-[L]-[B1]-A-[B2]-C, ou H-[L]-[B1]-A[B2]-C
Fórmula V
[0361 ]Em várias modalidades, a molécula carregada (C) é colocada no Nterminal de um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V, em que a molécula carregada (C) é ligada a uma extensão N-terminal (B1) compreendida de uma extensão de tetrapeptídeo clivável com catepsina (B1 = = PN4-PN3-PN2-PN1) que é ligada ao N-terminal de um antigeno de peptídeo (A) que é ligado ao C-terminal a uma extensão de C-terminal (B2) compreendida de uma extensão de hexapeptídeo clivável com catepsina e imuno-proteassoma combinada (B2 = PC1’-PC2’-PC3’PC4’-PC5’-PC6’) que é ligada a um Ligador (L) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P). O antigeno de peptídeo (A) de um conjugado de antigeno de peptídeo da Fórmula V é compreendido de um número inteiro de aminoácidos, n, em que n é tipicamente entre 7-35 aminoácidos e a molécula hidrofóbica (H) é tipicamente um poli(aminoácido) da Fórmula I ou II ligado a um adjuvante da fórmula III.
[0362]Um exemplo não limitador de um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V compreendendo uma molécula carregada (C= Lys-Lys) ligada a uma extensão de tetrapeptídeo clivável por catepsina (Bi = Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO: 8) no N-terminal de um antigeno de peptídeo (A) que é ligado no C-terminal a uma extensão de hexapeptídeo clivável por catepsina (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 13) que é ligado a um Ligador de triazol (L) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de um poli(aminoácido de Fórmula I que é ligado a um adjuvante da fórmula III é fornecido aqui:
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L
C A ΒΪ ---------.... ........................................ 0
H 8
Lys-Lys-tvs Ptal.su Arg- (==313=^.=8^-. ss^ Set tjau %! Atg-U—CH-C—NHa
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[0363]Em modalidades adicionais, uma molécula carregada (C; ou C1 e C2 quando há duas moléculas carregadas presentes) pode ser ligada diretamente à molécula hidrofóbica (H) ou ao Ligador (L) que é ligado à extensão de C-terminal (B2) que é ligada ao C-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é opcionalmente ligado ao N-terminal a uma extensão N-terminal (B1) que é opcionalmente ligada a uma fração carregada opcional adicional (C1); ou a molécula carregada (C; ou C1 e C2 quando há duas moléculas carregadas presentes) pode ser ligada diretamente à molécula hidrofóbica (H) ou ao Ligador (L) que é ligado à extensão N-terminal (B1) que é ligado ao N-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é opcionalmente ligado a C-terminal a uma extensão de C-terminal (B2) que é opcionalmente ligada a uma fração carregada opcional adicional (C2) para fornecer um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI, em que [ ] indica que o grupo é opcional:
[B1]-A-[B2]-L(C)-H, [B1]-A-[B2]-L-H(C), [C1]-[B1]-A-[B2]-L(C2)-H, [C1]-[B1]A-[B2]-L-H(C2), H-L(C)-[B1]-A-[B2], H(C)-[B1]-A-[B2], H-L(C1)-[B1]-A-[B2]-C2 ou
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H(C1)-[B1]-A-[B2]-C2
Fórmula VI
[0364]Em várias modalidades, a molécula carregada (C) é colocada no exterminai de um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI, em que a molécula carregada (C) é ligada a um Ligador (L) que é opcionalmente ligado a uma extensão C-terminal (B2) compreendida de uma imuno-proteassoma, catepsina ou extensão clivável por catepsina e imuno-proteassoma combinada tipicamente entre 1 e 6 aminoácidos em comprimento (B2 = PC1’, PC1’-PC2’, PC1’-PC2’-PC3’, PC1’PC2’-PC3’-PC4’, PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’, ou PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’PC6’)que é ligado ao C-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é opcionalmente ligado no N-terminal a uma extensão clivável por catepsina tipicamente entre 1 e 4 aminoácidos em comprimento (B1 = PN1, PN2-PN1, PN3PN2-PN1 ou PN4-PN3-PN2-PN1), em que o Ligador (L) é adicionalmente ligado a uma molécula hidrofóbica (H), mostrado aqui:
A S2 c
-------------------------------------------------I mw-pffâ-tw-pNi- («neigerfj pci ·PC2‘ -per-w -pcs1- per-l~h
A accittOjicidcar'
[0365]O antígeno de peptídeo (A) do conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI é compreendido de um número inteiro de aminoácidos, n, em que n é tipicamente entre 7-35 aminoácidos, ou até 50 aminoácidos, e a molécula hidrofóbica é tipicamente um poli(aminoácido) da fórmula I ou II ligado a um adjuvante da fórmula III.
[0366]Um exemplo não limitador de um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI compreendido de uma molécula carregada (por exemplo, C = Lys-Lys) ligado através de uma ligação de amida ao C-terminal de um Ligador (L) que é ligado a uma extensão de C-terminal de hexapeptídeo clivável por catepsina e
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167/314 imuno-proteassoma combinada (por exemplo, B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 13) que é ligada ao C-terminal de um antígeno de peptídeo (A) que é ligado no N-terminal a uma extensão N-terminal de tetrapeptídeo clivável por catepsina (por exemplo, B1 = Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO: 8), em que o Ligador (L) é adicionalmente ligado a uma molécula hidrofóbica (H) que é compreendida de um poli(aminoácido) da fórmula I que é ligado a um adjuvante da fórmula III é fornecido: L
A B2 c
................................. ................................................... o --------------Ly s Pro Lfiii Âtg (=lltiiEellI,)Gly'Gíy Ser Leti'^ tÁrg-N—CH-C—tys-Lys CHS
CH,
I ch,
ÇHS n-n
N _>Y'· 3
CH C i /5
ÇHí
ÇH2 ν~/Ί νΎ
[0367]Um exemplo não limitador adicional de um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI, B1-A-B2-L-H(C), é uma fração carregada (C = Lys-Lys-LysLys-Lys SEQ ID NO: 49) ligada através de um ligador a uma molécula hidrofóbica (H) que é compreendida de um poli(aminoácido) da fórmula I que é ligado a um adjuvante da fórmula III que é ligado a um Ligador (L) que é ligado a uma extensão de C-terminal de hexapeptídeo clivável por catepsina e imuno-proteassoma combinada (B2 = Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 13) que é ligada ao C
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168/314 terminal de um antígeno de peptídeo (A) e o N-terminal do antígeno de peptídeo (A) é ligado a uma extensão N-terminal de tetrapeptídeo clivável por catepsina (B1 =
Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO: 8):
-MS
ÇH? o ______
K—CH-C— H ¢8¼ •èw2 •CK· ·£>
ÍNH, /•5 c~o tt· ,K ’ft'
[0368]Em um exemplo não limitador de um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI, B1-(A)7-35-B2-L(-C)-H, um antígeno de peptídeo (A) com a sequência Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO: 22) é ligado a uma extensão N-terminal (B1) com a sequência Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) e uma extensão de C-terminal (B2) com a sequência Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) que é ligada a um precursor de ligador X1, por exemplo,, Lys(N3), que é ligado tanto a uma fração carregada (C) compreendida de um dipeptídeo com a sequência Glu-Lys e um precursor de ligador X2, compreendendo uma molécula DBCO que é ligada à molécula hidrofóbica (H), por exemplo: Ser-Leu-Val-Arg-Ala
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Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBC0H)-Glu-Lys, em que a sequência Glu-Lys é ligada ao C-terminal do Ligador (L) (Lys(N3-DBCO), resultando em um conjugado de antígeno de peptídeo com uma carga líquida prevista de +4 em pH 7.4. Aqui, a molécula hidrofóbica (H) é assumida como tendo uma contribuição negligenciável à carga do conjugado de antígeno de peptídeo. Observe que a composição da fração carregada (C) e sequências de extensão (B1 e B2) podem ser selecionadas para fornecer um número específico de resíduos carregados que fornecem a carga líquida desejada e hidropatia da sequência de peptídeo compreendendo o conjugado de antígeno de peptídeo como descrito em maior detalhe abaixo. Em modalidades preferidas, o número de grupos funcionais carregados compreendendo a fração carregada (C) é modulado de modo que a carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo compreendendo a fração carregada (C), antígeno de peptídeo (A), extensões opcionais (B1 e/ou B2), Ligador (L) e molécula hidrofóbica (H) está entre aproximadamente -3 e -10 ou entre +3 e +10.
[0369]Conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula VI, em que a fração carregada (C) é ligada à molécula hidrofóbica (H), podem ser vantajosos para a produção rápida de terapias personalizadas, como vacinas personalizadas contra câncer. A molécula hidrofóbica (H) que é ligada a uma molécula carregada (C) e um precursor de ligador X2 (por exemplo, X2 compreendendo uma citooctina) pode ser preparada em volume e então facilmente combinada com qualquer antígeno de peptídeo (A) contendo um precursor de ligador X1 (por exemplo, X1 compreendendo uma azida) para formar um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI, [C1 ][B1 ]-A-[B2]-L-H(C2), ou H(C)-L-[B1 ]-A-[B2]-[C2], em que [ ] indica que o grupo é opcional.
[0370]A função da fração carregada (C) é estabilizar nanopartículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo em condições aquosas. Embora
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170/314 a molécula hidrofóbica (H) induza formação de partícula de conjugados de antígeno de peptideo, a molécula carregada opcional (C) fornece uma força compensatória que evita floculação e, em algumas modalidades, aciona os conjugados de antígeno de peptideos a se reunir em micelas de nanopartículas com uma carga de superfície fornecida pela fração carregada (C).
[0371 ]Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno de peptideo não compreende uma molécula carregada, como [B1 ]-A-[B2]-[L]-H, onde [ ] indica que o grupo é opcional. Exemplos não limitadores incluem, A-H, A-L-H, A-B2-H, A-B2-L-H, B1-A-B2-L-H. Conjugados de antígeno de peptideo que não compreendem uma molécula carregada (C) podem ser submetidos à agregação em condições aquosas. Para melhorar a estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptideo que não compreendem uma fração carregada (C), uma molécula carregada ou anfifílica pode ser adicionada. Em algumas modalidades, um primeiro conjugado de antígeno de peptideo que não compreende uma fração carregada (C), (isto é, [B1 ]-A-[B2]-[L]-H) é misturado com um segundo conjugado de antígeno de peptideo que compreende uma fração carregada (por exemplo, C-[B1 ]-A-[B2]-[L]-H) em uma solução de DMSO e então suspenso novamente em condições aquosas para formar nanopartículas estáveis. Em outras modalidades, um conjugado de antígeno de peptideo que não compreende uma molécula carregada (C) (isto é, [B1 ]-A-[B2]-[L]H) ié mistuardo com uma molécula hidrofóbica (H) ligada a uma molécula carregada (C), como C-H, em uma solução DMSO e então suspenso novamente em condições aquosas para formar nanopartículas estáveis.
[0372]Em algumas modalidades, um conjugado de antígeno de peptideo que não compreende uma molécula carregada (C), como [B1 ]-A-[B2]-[L]-H, onde [ ] indica que o grupo é opcional, é combinado com um veículo anfifílico, C-[B1 ]-[A’][B2]-[L]-H, em que [ ] indica que o grupo é opcional e A’ opcional é um antígeno conservado (isto é, não específico do paciente). Em algumas modalidades, um
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171/314 conjugado de antígeno de peptídeo compreendendo uma molécula carregada (C) é combinada com um veículo anfifílico. O veículo anfifílico serve para estabilizar nanopartículas, como micelas de nanopartículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo.
Seleção da molécula carregada e extensões (B1 e B2)
[0373]A composição das extensões opcionais, B1 e B2, ligadas no N- e Cterminal do antígeno de peptídeo (A), respectivamente, juntamente com a(s) molécula(s) carregada(s) opcional(is) (C), deve ser selecionada para I) obter a carga líquida apropriada e equilíbrio de características hidrofílica e hidrofóbica que são necessárias para estabilizar as partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo em tampões aquosas em temperatura fisiológica e pH de aproximadamente 7.4; e II) assegurar que os antígenos de peptídeo (A) fornecidos no contexto do conjugado de antígeno de peptídeo possam ser processados para liberar epítopos de célula T CD4 e/ou CD8 mínimos fornecidos no antígeno de peptídeo (A), de modo que os epítopos possam ser apresentados no contexto de moléculas MHC de classe I e classe II. A seguinte descrição revela composições específicas de extensões B1 e B2 juntamente com moléculas carregadas (C) que levam a aperfeiçoamentos inesperados no controle sobre o tamanho e estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo e/ou aperfeiçoamentos no processamento e apresentação dos epítopos de célula T CD4 e/ou CD8 fornecidos como antígenos de peptídeo (A) naquelas partículas que levam a respostas de célula T significativamente aperfeiçoadas.
[0374]Uma descoberta inesperada revelada na presente invenção é que os antígenos de peptídeo (A) contendo epítopos de célula T CD8 mínimos fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo, por exemplo, conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV, V e VI são mais eficientemente processados in vitro e levam a respostas de célula T CD8 mais altas in vivo quando uma extensão degradável por
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172/314 enzima C-terminal (B2) é usada no C-terminal entre o antigeno de peptídeo (A) e uma molécula hidrofóbica (H) e/ou quando uma extensão degradável por enzima Nterminal (B1) é usada entre o N-terminal do antigeno de peptídeo (A) e uma molécula carregada (C). Em algumas modalidades, incluindo uma extensão B1 que compreende um sítio clivável por catepsina entre a molécula carregada (C) e o antigeno de peptídeo (A), (por exemplo, C-B1-A-[B2]-[L]-H, onde [ ] indica que o grupo é opcional), levou ao processamento mais eficiente do epítopo de célula T mínimo a partir do conjugado de antigeno de peptídeo que foi associado a resposta de célula T de magnitude mais alta in vivo. Desse modo, modalidades preferidas da fórmula V e VI devem usar sequências cliváveis por catepsina como extensões Nterminal (B1) e C-terminal (B2), para permitir processamento eficiente e apresentação dos antígenos de peptídeo (A) fornecidos como partículas compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo.
[0375]Uma descoberta inesperada adicional refere-se à identificação da carga líquida necessária para estabilizar partículas formadas por algumas modalidades de conjugados de antigeno de peptídeo. Antígenos de peptídeo altamente hidrofóbicos (A) fornecidos como conjugados de antigeno de peptídeo têm a propensão de agregar em condições aquosas. Para neutralizar essa tendência, moléculas carregadas (C) e certas extensões (B1 ou B2) podem ser selecionadas para fixação aos conjugados de antigeno de peptídeo, por exemplo, vide as fórmulas V e VI, ou um conjugado compreendendo uma molécula carregada (por exemplo, C[A’]-[L]-H, onde A’ é um antigeno conservado e [ ] indica que o grupo é opcional) pode ser adicionado a partículas compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo. Uma descoberta inesperada revelada na presente invenção é que a quantidade de carga (isto é, carga líquida) necessária para estabilizar as partículas formadas por algumas modalidades de conjugados de antigeno de peptídeo, por exemplo, conjugados de antigeno de peptídeo das fórmulas V e VI compreendendo
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173/314 uma molécula hidrofóbica (H) baseada em poli(aminoácido) , depende da hidropatia (isto é, propriedades hidrofóbicas) do fragmento de antígeno de peptídeo, que compreende o antígeno de peptídeo (A), moléculas carregadas opcionais (C) e extensões opcionais (B1 e B20. Os requerentes relatam a descoberta inesperada que a carga líquida útil para estabilizar partículas formadas por certas modalidades dos conjugados de antígeno de peptídeo pode ser determinada com base na hidropatia do antígeno de peptídeo (A) ou fragmento de antígeno de peptídeo. Desse modo, em modalidades preferidas, a carga líquida de um conjugado de antígeno de peptídeo é selecionado com base na hidropatia calculada do antígeno de peptídeo (A) e é modulada pela molécula carregada (C) e opcionalmente as extensões (B1 e/ou B2). Em outras modalidades, a carga líquida de um conjugado de antígeno de peptídeo é selecionada com base na hidropatia calculada do fragmento de antígeno de peptídeo e é modulada pela molécula carregada (C). Para clareza, os precursores de ligador (X1 e X2), Ligador (L) e molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) não são considerados na determinação do valor de hidropatia para antígenos de peptídeo (A) ou fragmentos de antígeno de peptídeo usados para selecionar carga líquida de conjugados de antígeno de peptídeo. Desse modo, a hidropatia de um conjugado de antígeno de peptídeo é equivalente à hidropatia do fragmento de antígeno de peptídeo.
[0376]A hidropatia do antígeno de peptídeo (A) ou fragmento de antígeno de peptídeo, inclusive do antígeno de peptídeo (A), molécula carregada opcional (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) pode ser calculada usando qualquer um de uma variedade de métodos disponíveis para determinar as características hidrofóbicas /hidrofílicas de um peptídeo. Como exemplo não limitador, um método para determinar a hidropatia de antígenos de peptídeo (A) ou o fragmento de antígeno de peptídeo é calcular a média grande de valor de hidropatia (GRAVY) usando o método de Kyte e Doolittle como descrito abaixo. Os seguintes valores de
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Hidropatia, com estimativas fornecidas para aminoácidos não naturais 9isto é, citrulina, sulfoserina, fosfoserina e trimetil lisina), foram baseados no método de Kyte e Doolittle e são usados para calcular valores GRAVY na presente invenção:
Aminoácido Código Valores de hidropatia Carga
Isoleucina (Ile) I 4.5 0
Valina (Vai) V 4.2 0
Leucina (Leu) L 3.8 0
Fenil alanina (Phe) F 2.8 0
cisteína (Cys) C 2.5 0
metionina (Met) M 1.9 0
Alanina (Ala) A 1.8 0
glicina (Gly) G -0.4 0
Treonina (Thr) T -0.7 0
Triptofano(Trp) w -0.9 0
Serina (Ser) s -0.8 0
tirosina (Tyr) Y -1.3 0
Prolina (Pro) P -1.6 0
Histidina (His) H -3.2 0.1
Ácido glutâmico (Glu) E -3.5 -1
Glutamina (Gin) Q -3.5 0
Ácido aspártico (Asp) D -3.5 -1
Asparagina (Asn) N -3.5 0
lisina (Lys) K -3.9 1
Citrulina (Cit) z -4 0
Arginina (Arg) R -4.5 1
Trimetil lisina K(Me)3 -4.5 1
fosfoserina S-Phospho -4.5 -1
Sulfoserina S-Sulfo -4.5 -1
[0377]O processo para determinar o valor GRAVY de um peptídeo é somar os valores de Hidropatia de cada aminoácido individual compreendendo o peptídeo e então dividir pelo comprimento total do peptídeo. Por exemplo, um antigeno de peptídeo de 9 aminoácidos (A) com a sequência Val-Val-lle-Ala-lle-Phe-lle-lle-Leu (SEQ ID NO: 57) tem um valor GRAVY de 3.86 (por exemplo, (4.2 + 4.2 + 4.5 + 1.8 +
4.5 + 2.8 + 4.5 + 4.5 + 3.8)/9 aminoácidos). Como exemplo não limitador, o mesmo
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175/314 antígeno de peptídeo (A) isto é, Val-Val-lle-Ala-lle-Phe-lle-lle-Leu (SEQ ID NO: 57) preparado como um fragmento de antígeno de peptídeo por síntese de peptídeo de fase sólida, em que uma molécula carregada (C = Lys-Ser-Lys-Gly-Gly SEQ ID NO: 58) é ligada a uma extensão N-terminal (B1 = Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO: 8) no Nterminal do antígeno de peptídeo e a uma extensão C-terminal (B2 = Gly-Gly-LysLeu-Val-Arg SEQ ID NO: 11) no C-terminal que é ligado a um precursor de ligador X1 (em que X1 é Lys(N3)-NH2) é: Ac-Lys-Ser-Lys-Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg-Val-Vallle-Ala-lle-Phe-lle-lle-Leu-Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg-Lys(N3)-NH2 e tem um valor GRAVY de 0.75 e uma carga líquida de +6.
[0378]A determinação do valor GRAVY do fragmento de antígeno de peptídeo ou peptídeo (A) fornece uma descrição das características hidrofóbicas / hidrofílicas de uma sequência de peptídeo. Em geral, valores GRAVY menores que zero indicam tipicamente que um peptídeo é compreendido principalmente de aminoácidos hidrofílicos, ao passo que valores GRAVY maiores que zero indicam que um peptídeo é compreendido de resíduos de aminoácido principalmente hidrofóbicos. Uma descoberta inesperada relatada na presente invenção é que quando o valor GRAVY de um antígeno de peptídeo (A) ou fragmento de antígeno de peptídeo aumenta, a magnitude de carga líquida (positiva ou negativa) necessária para estabilizar partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo o antígeno de peptídeo (A) (ou fragmento de antígeno de peptídeo) também aumenta. Desse modo, antígenos de peptídeo (A) ou fragmentos de antígeno de peptídeo, com valores GRAVY mais altos exigem tipicamente uma carga líquido mais alta para assegurar estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo.
[0379]Q valor GRAVY de um antígeno de peptídeo (A) ou o fragmento de antígeno de peptídeo, que é calculado com base na composição de aminoácido do antígeno de peptídeo (A) uma molécula carregada opcional (C) e/ou extensões
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176/314 opcionais (B1 e/ou B2) (e exclui contribuição de quaisquer aminoácidos que podem compreender os precursores de ligador (X1 e X2), Ligador (L) e molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (PP), pode ser calculado para determinar a carga líquida necessária para assegurar formação estável de partícula por algumas modalidades de conjugados de antígeno de peptídeo. Observação: o GRAVY do conjugado de antígeno de peptídeo é considerado como sendo equivalente ao GRAVY do fragmento de antígeno de peptídeo; desse modo o valor GRAVY de um fragmento de antígeno de peptídeo pode se referir também ao valor GRAVY do conjugado de antígeno de peptídeo.
[0380]Em algumas modalidades, o valor GRAVY do antígeno de peptídeo (A) é usado para determinar a carga líquida necessária para estabilizar partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo. Como exemplo não limitador, o conjugado de antígeno de peptídeo deve ter uma carga líquida de > (maior que ou igual a) + 6 ou < (menor que ou igual a) -6 quando o valor GRAVY para o antígeno de peptídeo (A) é maior que 0.75; a carga líquida deve ser > (maior que ou igual a) + 5 ou < (menor que ou igual a) -5 quando o valor GRAVY está entre 0.25-0.75; a carga líquido deve ser > (maior que ou igual a) + 4 ou < (menor que ou igual a) -4 quando o valor GRAVY és menor que 0.25. Em modalidades preferidas, a carga líquida é maior que ou igual a + 4 ou menor que ou igual a -4, dependendo de se uma carga positiva líquida ou negativa líquida é necessária, respectivamente. Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo (A) com um valor GRAVY menor que 0.25 são sintetizados como conjugados de antígeno de peptídeo com uma carga positiva líquida de aproximadamente +4 a +15, por exemplo, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14 ou +15, embora tipicamente entre aproximadamente +4 e +12; ou com uma carga negativa de aproximadamente -4 e -15, por exemplo, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 ou -15, embora tipicamente entre aproximadamente -4 e -12. Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo (A)
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177/314 com urn valor GRAVY entre 0.25-0.75 são sintetizados como conjugados de antigeno de peptídeo com uma carga positiva líquida de aproximadamente +5 a +15, por exemplo, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, embora tipicamente entre aproximadamente +5 e +12; ou com uma carga negativa líquida de aproximadamente -5 e -15, por exemplo, -5, -6, -7, -8, -9, -10,-11, -12, -13, -14 ou 15, embora tipicamente entre aproximadamente -5 e -15. Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo (A) com um valor GRAVY maior que 0.75 são sintetizados como conjugados de antigeno de peptídeo com uma carga positiva líquida de aproximadamente +6 a +15, por exemplo, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, embora tipicamente entre aproximadamente +6 a +12;ou com uma carga negativa líquida de aproximadamente -6 a -15, por exemplo, -6, -7, -8, -9, -10,-11,12, -13, -14 ou -15, embora tipicamente entre aproximadamente -6 a -12.
[0381 ]Em uma modalidade do processo para selecionar a molécula carregada (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) para produzir um conjugado de antigeno de peptídeo de carga líquida desejada, o processo pode compreender as etapas de (i) determinar o GRAVY e a carga do antigeno de peptídeo (A); e (ii) selecionar uma molécula carregada (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) para obter um número suficiente de grupos funcionais carregados para atingir a carga líquida desejada. Em um exemplo não limitador, a carga liquida necessária para um conjugado de antigeno de peptídeo pode variar dependendo da hidropatia de antigeno de peptídeo (A) de acordo com os seguintes critérios: maior que ou igual a carga de +6 é necessário para antígenos de peptídeo de 25 a 35 aminoácidos (A) com um Valor GRAVY maior que 0.75; maior que ou igual a carga de +5 é necessário para antígenos de peptídeo de 25 a 35 aminoácidos (A) com Valores GRAVY entre 0.25 e 0.75; e maior que ou igual a carga de +4 é necessário para antígenos de peptídeo de 25 a 35 aminoácidos (A) com GRAVY menor que 0.25. Desse modo, nesse exemplo não limitador, um antigeno de peptídeo 25
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178/314 aminoácidos (A) com um Valor GRAVY de 2.0 e carga de +2 deve ser combinado com uma molécula carregada (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) compreendendo a carga líquida de pelo menos +4 para obter a carga líquida do conjugado de antígeno de peptideo de +6. Em um exemplo não limitador adicional, a carga líquida necessária para um conjugado de antígeno de peptideo pode variar dependendo da hidropatia de antígeno de peptideo (A) de acordo com os seguintes critérios: menor que ou igual a carga de -6 é necessário para antigenos de peptideo de 25 a 35 aminoácidos (A) com um Valor GRAVY maior que 0.75; menor que ou igual a carga de -5 é necessário para antigenos de peptideo de 25 a 35 aminoácidos (A) com Valores GRAVY entre 0.25 e 0.75; e menor que ou igual a carga de -4 é necessário para antigenos de peptideo de 25 a 35 aminoácidos (A) com GRAVY menor que 0.25. Desse modo, nesse exemplo não limitador, um antígeno de peptideo (A) com um Valor GRAVY de 2.0 e carga de +2 deve ser combinado com uma molécula carregada (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) compreendendo a carga líquida de -8 para obter a carga líquida do conjugado de antígeno de peptideo de -6.
[0382]Em algumas modalidades, a determinação do valor GRAVY para o fragmento de antígeno de peptideo, incluindo a molécula carregada opcional (C), extensões opcionais (B1 e/ou B2) e antígeno de peptideo (A) é usada para determinar a carga líquida necessária para estabilizar partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptideo. Como exemplo não limitador, o conjugado de antígeno de peptideo deve ter uma carga líquida de > (maior que ou igual a) + 6 ou < (menor que ou igual a) -6 quando o valor GRAVY do fragmento de antígeno de peptideo é maior que 0.75; a carga líquida deve ser > (maior que ou igual a) + 5 ou < (menor que ou igual a) -5 quando o valor GRAVY está entre 0.25-0.75; a carga líquida deve ser > (maior que ou igual a) + 4 ou < (menor que ou igual a) -4 quando o valor GRAVY é menor que 0.25. Em modalidades preferidas, a carga líquida é
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179/314 maior que ou igual a + 4 ou menor que ou igual a -4, dependendo de se a carga positiva líquida ou negativa líquida é necessária, respectivamente. Em algumas modalidades , fragmentos de antigeno de peptídeo com um valor GRAVY menor que 0.25 têm uma carga positiva líquida de aproximadamente +4 a +15, por exemplo, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14 ou +15, embora, tipicamente entre aproximadamente +4 e +12; ou uma carga negativa líquida de aproximadamente -4 a -15, por exemplo, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 ou -15, embora, tipicamente entre aproximadamente -4 e -12. Em algumas modalidades , fragmentos de antigeno de peptídeo com um valor GRAVY entre 0.25-0.75 têm uma carga positiva líquida de aproximadamente +5 e +15, por exemplo, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, embora, tipicamente entre aproximadamente +5 e +12; ou uma carga negativa líquida de aproximadamente -5 a -15, por exemplo, -5, 6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 ou -15, embora, tipicamente entre aproximadamente -5 e -12. Em algumas modalidades , fragmentos de antigeno de peptídeo com um valor GRAVY maior que 0.75 têm uma carga positiva líquida de aproximadamente +6 a +15, por exemplo, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, embora, tipicamente entre aproximadamente +6 e +12; ou uma carga negativa líquida de aproximadamente -6 a-15, por exemplo, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, 14 ou -15, embora, tipicamente entre aproximadamente -6 e -12.
[0383]Uma descoberta inesperada adicional é que a magnitude de carga líquida necessária para estabilizar partículas formadas por certas modalidades de conjugados de antigeno de peptídeo, por exemplo, conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V e fórmula VI, aumenta em geral com o comprimento do antigeno de peptídeo (A). Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo de 7 a aminoácidos (A) são sintetizados como conjugados de antigeno de peptídeo com carga líquida maior ou igual a +6 ou menor ou igual a -6; antígenos de peptídeo de a 24 aminoácidos (A) são sintetizados como conjugados de antigeno de peptídeo
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180/314 com carga líquida maior ou igual a +7 ou menor ou igual a -7; e antígenos de peptídeo de 25 a 35 aminoácidos (A) são sintetizados como conjugados de antígeno de peptídeo com carga líquida maior ou igual a +8 ou menor ou igual a -8.
[0384]Em algumas modalidades, composições imunogênicas compreendem partículas compreendidas de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula [B1 ]-A[B2]-[L]-H e conjugados de molécula carregada (C) da fórmula C-[A’]-[L]-H, em que [ ] indica que o grupo é opcional e A’ é um antígeno conservado opcional (isto é, não específico do paciente) adicionalmente em que a razão molar de [B1 ]-A-[B2]-[L]-H para C-[A’]-[L]-H é selecionada de uma faixa de 1:20 a 20:1, como 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1 e 20:1, e a carga líquida de C-[A’]-[L]-H é negativa e selecionada de -2 a -20, como -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11,-12, -13, -14, -15, 16, -17, -18, -19 ou -20, tipicamente aproximadamente -4 a aproximadamente -12 ou positiva e selecionada de +2 a +20, como +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11,+12, +13, +15, +16, +17, +18, +19 ou +20, tipicamente aproximadamente +4 e +12. Em um exemplo não limitador, uma composição imunogênica compreende partículas compreendendo 1 molar equivalente de um conjugado de antígeno de peptídeo, Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Lys(N3-DBCO-H)-NH2, que carrega uma carga líquida de 0 (observe que o fragmento de peptídeo tem uma amida C-terminal), e 1 molar equivalente de um conjugado de molécula carregada (C) compreendida de (Lys)s -Lys(N3-DBCO-NH)-NH2, que carrega uma carga líquida de +6; a razão de conjugado de antígeno de peptídeo para conjugado de molécula carregada é 1:1 e a carga líquida de cada conjunto daquelas duas moléculas é +6. Desse modo, a carga líquida das partículas pode ser ajustada por modular a razão do conjugado de antígeno de peptídeo para o conjugado de molécula carregada (C) ou por modular a carga líquida do conjugado de molécula carregada. Em modalidades preferidas, a razão do conjugado de antígeno de peptídeo para molécula carregada é de aproximadamente 1:4 a 4:1 e a carga líquida da molécula
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181/314 carregada é selecionada de modo que a carga líquida média de moléculas compreendendo as partículas é aproximadamente +4 a aproximadamente +12 ou aproximadamente -4 a aproximadamente -12. Por exemplo, uma partícula compreendendo uma razão molar 1:1 de conjugados de antigeno de peptídeo para conjugados de molécula carregada (C), em que o conjugado de antigeno de peptídeo tem uma carga líquida de 0, a carga líquida média de moléculas é +4 quando a carga líquida do conjugado de molécula carregada (C) é +8 .
[0385] Para certas aplicações, conjugados de antigeno de peptídeo positivamente carregados podem ser úteis. Em algumas modalidades, um conjugado de antigeno de peptídeo pode compreender um antigeno de peptídeo (A), uma molécula carregada (C) compreendendo grupos funcionais positivamente carregados, uma molécula hidrofóbica (H) ou Partículas (P), extensões opcionais (B1 e/ou B2) e um Ligador opcional (L). A composição de moléculas carregadas (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) é selecionada para maximizar a estabilidade de partícula e atividade biológica dos conjugados de antigeno de peptídeo. Em algumas modalidades, um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V compreendida de uma molécula carregada (C) com uma carga positiva líquida é ligada a uma extensão de peptídeo N-terminal (B1) que é ligada a um antigeno de peptídeo (A) que é ligada a uma extensão de peptídeo C-terminal (B2) que é ligada diretamente ou através de m Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) e o conjugado de antigeno de peptídeo resultante tem uma carga positiva líquida. Nesse exemplo, a molécula hidrofóbica (H) ligada através do C-terminal do antigeno de peptídeo (A) funciona para induzir formação de partícula e a molécula carregada (C) ligada através do N-terminal do antigeno de peptídeo (A) funciona para estabilizar as partículas através de densidade de carga positiva alta na superfície daquelas partículas. Desse modo, extensões B2 opcionais colocadas próximas à molécula hidrofóbica (H) de conjugados de antigeno de peptídeo positivamente carregados da
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182/314 fórmula V, em que a molécula carregada (C) é ligada através do N-terminal do antígeno de peptídeo (A), são preferivelmente compreendidos de aminoácidos hidrofóbicos e não carregados que ajudam a promover formação de partícula e são tipicamente selecionados de aminoácidos únicos, como glicina, serina, citrulina, leucina, norleucina ou metionina; diipeptídeos como Gly-Cit, Gly-Ser ou Gly-Leu; tripeptídeos, como Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Cit, ou Gly-Pro-Gly; tetrapeptídeos, como Ser-Pro-Val-Cit ou Gly-Pro-Gly-Cit; pentapeptídeos, como Gly-Ser-Val-Leu-Cit, GlyPro-Val-Leu-Cit; ou hexapeptídeos, como Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit, ou Gly-Gly-SerPro-Val-Cit. Em algumas modalidades, uma extensão C-terminal (B2) que inclui um aminoácido de carga única é usado e é tipicamente selecionado de aminoácidos únicos, como arginina ou lisina; dipeptídeos, como Gly-Arg ou Gly-Lys; tripeptídeos, como Gly-Ser-Arg ou Gly-Ser-Lys; tetrapeptídeos como Gly-Pro-Gly-Arg (SEQ ID NO: 59), Gly-Ser-Val-Arg (SEQ ID NO: 60) ou Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) (onde Arg pode ser substituído com Lys); pentapeptídeos, como Gly-Ser-Leu-ValArg (SEQ ID NO: 17) (onde Arg pode ser substituído com Lys); e hexapeptídeos como Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 13) ou Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 61) (onde Arg pode ser substituído com Lys). Extensões B1 colocadas proximais à molécula carregada (C) de conjugados de antígeno de peptídeo positivamente carregados da Fórmula V, em que a molécula carregada (C) é ligada através do N-terminal do antígeno de peptídeo (A), preferivelmente contêm um aminoácido carregado, como um Arg ou Lys, e são tipicamente selecionados de aminoácidos únicos selecionados de Arg ou Lys; dipeptídeos selecionados de ValArg ou Leu-Arg (onde Arg pode ser substituído com Lys); tripeptídeos selecionados de Pro-Val-Arg ou Gly-Val-Arg (onde Arg pode ser substituído com Lys); ou tetrapeptídeos selecionados de Lys-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 62), Lys-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 9), Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8), Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7) e Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6) (onde Arg pode ser substituído com Lys). As
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183/314 extensões diferentes, B1 e B2 podem ser combinadas com qualquer molécula carregada (C), antigeno de peptídeo (A), molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) e Ligador (L) para obter o valor médio grande de hidropatia (GRAVY)e carga líquida do conjugado de antigeno de peptídeo necessária para a aplicação pretendida.
[0386]Em algumas modalidades, um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula V com carga positiva líquida compreende uma molécula carregada (C), tipicamente compreendendo entre 4 e 12 grupos funcionais positivamente carregados, por exemplo (Lys)4-12, que é ligado a uma extensão N-terminal de dipeptídeo (B1), por exemplo, Val-Arg que é ligado a um antigeno de peptídeo (A), que compreende tipicamente entre 7 e 35 aminoácidos, que é ligado a uma extensão de C-terminal (B2), por exemplo, Ser-Pro-Val-Cit, que é ligado a um Ligador (Lys(N3)-DBCO) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligada a adjuvantes da fórmula III.
[0387] Para certas aplicações conjugados de antigeno de peptídeo negativamente carregados são necessários. Em algumas modalidades, um conjugado de antigeno de peptídeo pode compreender um antigeno de peptídeo (A); uma molécula carregada (C) compreendendo grupos funcionais negativamente carregados, uma molécula hidrofóbica (H) ou Partículas (P), extensões opcionais (B1 e/ou B2) e um Ligador opcional (L). A composição de moléculas carregadas (C) e extensões opcionais (B1 e/ou B2) são selecionadas para maximizar estabilidade em partícula e atividade biológica dos conjugados de antigeno de peptídeo. Em algumas modalidades, um conjugado de antigeno de peptídeo da fórmula F compreendido de uma molécula carregada (C) com carga negativa líquida é ligado a uma extensão de peptídeo N-terminal (B1) que é ligada a um antigeno de peptídeo (A) que é ligado a uma extensão de peptídeo de C-terminal (B20 que é ligada diretamente ou através de um Ligador (L) a uma molécula hidrofóbica (H) e o conjugado de antigeno de peptídeo resultante tem uma carga negativa líquida.
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Desse modo, a extensão B3 colocada proximal à molécula hidrofóbica (H) dos conjugados de antígeno de peptideo negativamente carregados líquidos da fórmula V, em que a molécula carregada (C) é ligada através da extensão B1 no N-terminal do antígeno de peptideo (A), são preferivelmente compreendidos de aminoácidos hidrofóbicos e não carregados que ajudam a promover a formação de partícula e são tipicamente selecionados de aminoácidos únicos, como glicina, serina, citrulina, leucina, norleucina ou metionina; dipeptídeos, como Gly-Ser, Gly-Cit ou Gly-Leu; tripeptídeos, como Gly-Ser-Cit, Gly-Pro-Cit, ou Gly-Pro-Gly; tetrapeptídeos, como Ser-Pro-Val-Cit, Ser-Pro-Val-Cit ou Gly-Pro-Gly-Cit; pentapeptídeos, como Gly-SerVal-Leu-Cit, Gly-Pro-Val-Leu-Cit; ou hexapeptídeos, como Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit, ou Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit ou Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit. Em algumas modalidades, uma extensão de C-terminal (B2) que inclui um aminoácido carregado único é usado e é tipicamente selecionado de aminoácidos únicos, como arginina ou lisina; dipeptídeos, Gly-Arg (onde Arg pode ser substituído com Lys); tripeptídeos, como Gly-Ser-Arg (onde Arg pode ser substituído com Lys); tetrapeptídeos como Gly-ProGly-Arg (SEQ ID NO: 59), Gly-Ser-Val-Arg (SEQ ID NO: 60), Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7), Asp-Leu-Val-Cit ou Asp-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 63) (onde Asp pode ser substituído com Glu e Arg pode ser substituído com Lys); pentapeptídeos, como GlySer-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 17) ou Gly-Asp-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 64) ou GlyAsp-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 65); e hexapeptídeos como Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 13) ou Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 61) onde Asp pode ser substituído com Glu e Arg pode ser substituído com Lys); ou Gly-Ser-Glu-Leu-ValArg (SEQ ID NO: 66) ou Gly-Gly-Asp-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 67) (onde Asp pode ser substituído com Glu e Arg pode ser substituído com Lys). Extensões B1 colocadas proximais à molécula carregada (C) de conjugados de antígeno de peptideo negativamente carregado líquido da fórmula V, onde a molécula carregada (C) é ligada através do N-terminal do antígeno de peptideo através da extensão B1
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185/314 preferivelmente contêm um aminoácido carregado, como um Asp ou Glu, e são tipicamente selecionados de aminoácidos únicos como Cit, Leu, Arg ou Lys; dipeptídeos selecionados de Val-Cit, Leu-Cit, Val-Arg ou Leu-Arg (onde Arg pode ser substituído com Lys); tripeptídeos selecionados de Pro-Val-Arg, Pro-Val-Cit, Gly-ValArg ou Gly-Val-Cit (onde Arg pode ser substituído com Lys); ou tetrapeptídeos selecionados de Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7), Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6), Ser-Pro-Leu-Cit, Ser-Leu-Val-Cit, Ser-Pro-Val-Cit, Asp-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 68), Asp-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 69), Asp-Leu-Val-Cit, Asp-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 63), Ser-Gly-Val-Cit ou Asp-Pro-Val-Cit (onde Arg pode ser substituído com Lys e Asp pode ser substituído com Glu). As extensões diferentes, B1 e B2 podem ser combinadas com qualquer molécula carregada (C), antígeno de peptídeo (A) e molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P) para obter o valor médio grande de hidropatia (GRAVY) e carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo necessários.
[0388]Em algumas modalidades, um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V com carga negativa líquida compreende uma molécula carregada (C), tipicamente compreendendo entre 6 e 14 grupos funcionais de carga negativa, por exemplo, (Glu)e-14, que é ligado a uma extensão N-terminal de di-peptídeo (BI), por exemplo, Val-Cit, que é ligado a um antígeno de peptídeo (A), que tipicamente compreende entre 7 e 35 aminoácidos que é ligado a uma extensão C-terminal (B2), por exemplo, Ser-Pro-Val-Cit, que é ligado a um ligador (Lys(N3)-DBCO) que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) compreendida de poli(aminoácidos) da fórmula I ou fórmula II ligados a adjuvantes da fórmula III.
[0389]Em várias modalidades, a adição de uma molécula carregada (C) e/ou extensões (B1 e B2) reduziu o valor GRAVY do fragmento de antígeno de peptídeo compreendendo o antígeno de peptídeo (A) e aumentou a carga líquida da sequência, que foi associada a aperfeiçoamentos inesperados na fabricação do
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186/314 fragmento de antigeno de peptídeo. Em várias modalidades, a adição de uma molécula carregada (C) compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido de lisinas (Lys) ou arginina (Arg) levou à síntese bem sucedida e purificação HPLC de um fragmento de antigeno de peptídeo compreendendo um antigeno de peptídeo (A) que não era de outro modo fabricável como o antigeno de peptídeo nativo (isto é, o antigeno de peptídeo nativo sem outras modificações). Em várias modalidades, um antigeno de peptídeo (A) ligado a uma extensão de C-terminal (B2) compreendida de um ou mais aminoácidos prolina, pseudo prolina (Pro), arginina (Arg) ou lisina (Lys) levou à síntese bem sucedida de um fragmento de antigeno de peptídeo compreendendo um antigeno de peptídeo (A) que não era de outro modo fabricável como o antigeno de peptídeo nativo (isto é, o antigeno de peptídeo nativo sem outras modificações). Em várias modalidades, a adição de uma ou mais aminas aromáticas, como fenil alanina amina, a um fragmento de antigeno de peptídeo ou conjugado de antigeno de peptídeo produzido totalmente por sínese de peptídeo de fase sólida levou à síntese bem sucedida do fragmento de antigeno de peptídeo ou conjugado de antigeno de peptídeo compreendendo um antigeno de peptídeo (A) que não era de outro modo fabricável como o antigeno de peptídeo nativo (isto é, o antigeno de peptídeo nativo sem outras modificações).
Seleção de antígenos de peptídeo (A) para uso em vacinas personalizadas contra câncer
[0390]Em algumas modalidades, o antigeno de peptídeo (A) compreendendo o conjugado de antigeno de peptídeo é específico a um paciente individual. O conjugado de antigeno de peptídeo compreendendo antígenos de peptídeo (A) que são específicos a pacientes individuais pode ser usado para terapias personalizadas, como para uso como uma vacina personalizada contra câncer ou uma vacina personalizada para induzir tolerância ou supressão para tratar autoimunidade ou alergias.
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[0391 ]A seleção de antígenos de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer é um processo de multi-etapas, em que algumas etapas podem ser dispensáveis.
[0392]A primeira etapa envolve a identificação de antígenos associados a tumor que são específicos do tumor ou em relação a tecido normal, são superexpressos pelo tumor. Por conseguinte, tecido de tumor e tecido normal são obtidos. Tecido de tumor e tecido normal podem ser fixados em formalina e embebidos em parafina, ou podem ser tecido recentemente isolado. Tecido normal pode ser sangue contendo leucócitos. O tecido de tumor e o tecido normal são processados para isolar DNA. O DNA é adicionalmente processado e sequenciado para identificar diferenças entre o DNA de tumor e o DNA de tecido normal. Essas diferenças de DNA podem ser alterações de nucleotídeo de ordem única ou di- ou superior que resultam em uma mutação não sinônima, inserções e deleções que resultam em mutações de deslocamento de quadro, mutações de sítio de união que resultam em variantes de união alternadas, ou códons de parada que podem ser lidos através resultando em deleções de aminoácido único. Mutações adicionais podem ser possíveis através de translocações cromossômicas ou inversões ou duplicações. Há inúmeros modos que alterações no nível de DNA podem original sequências de peptídeo aberrantes e/ou peptídeos com modificações póstranslacionais aberrantes que são específicas de tumor e podem ser mencionadas como neoantígenos ou neoantígenos previstos.
[0393]A segunda etapa envolve a determinação de se os antígenos associados a tumor identificados na etapa 1 são ou não na realidade expressos pelo tumor. RNA de tumor é isolado, processado e sequenciado para determinar se mutações identificadas pela etapa 1 são expressas como RNA pelas células de tumor. Antígenos de peptídeo (A) compreendendo mutações identificadas a partir de sequenciamento de DNA de tumor e tecido normal podem ser selecionados para
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188/314 inclusão em uma vacina personalizada contra câncer com base em nível de expressão de RNA. Adicionalmente, antigenos próprios associados a tumor que produzem níveis mais altos de RNA em tumor em comparação com tecidos não cancerosos podem ser selecionados como antigenos de peptídeo (A) para inclusão. Mutações em que nenhum transcrito de RNA é identificado não são em geral selecionadas como um antigeno de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina. Antigenos de peptídeo (A) compreendendo mutações ou antigenos próprios associados a tumor podem ser priorizados com base em nível de expressão de RNA do peptídeo mutante (isto é, neoantígeno) ou antigenos próprios associados a tumor, por exemplo, mutações mais altamente expressas ou antigenos próprios associados a tumor podem ser priorizados. Múltiplos critérios podem ser usados simultaneamente na seleção de antigenos de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer. Por exemplo, nível de expressão de RNA e afinidade de ligação de MHC previsto de epítopos contidos por um peptídeo mutante (isto é, neoantígeno) ou antigeno próprio associado a tumor podem ser usados juntos para selecionar o conjunto ótimo de antigenos de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer. Em tal cenário, um antigeno de peptídeo (A) contendo um epítopo de célula T com afinidade de ligação moderada que é muito altamente expressa pode ser priorizado em relação a um antigeno de peptídeo diferente (A) contendo um epítopo de célula T que tem uma afinidade de ligação mais alta, porém é expresso pelo tumor como um nível muito baixo.
[0394]Outra consideração é quanto clonal, ou conservada, uma mutação ou antigeno próprio associado a tumor está através de células de tumor diferentes que compreendem um tumor. A clonalidade de uma mutação é avaliada por comparar a frequência da mutação com a frequência da variante de tipo selvagem no DNA isolado de tumor. Neoantígenos associados a tumor ou antigenos próprios podem ser selecionados para uso como antigenos de peptídeo (A) para inclusão em
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189/314 vacinas personalizadas contra câncer compreendidas de conjugados de antígeno de peptídeo com base em clonalidade ou quase clonalidade da mutação que os mesmos compreendem. Por exemplo, antígenos de peptídeo (A) podem ser priorizados para inclusão se forem previstos como estando presentes em >50% de células de tumor, >75% de células de tumor, >85% de células de tumor, >95% de células de tumor, ou >99% de células de tumor.
[0395]Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer compreendidos de conjugados de antígeno de peptídeo podem ser adicionalmente priorizados com base na ligação prevista dos epítopos contidos no antígeno para uma molécula MHC classe I e/ou classe II dada como determinado por um algoritmo de ligação in silico. Em um exemplo não limitador, o tipo MHC de cada indivíduo é primeiramente identificado através de sequenciamento. A seguir, cada peptídeo mutante (isto é, neoantígeno) ou antígeno próprio associado a tumor identificado por qualquer meio adequado (por exemplo, sequenciamento de DNA, expressão de RNA ou espectrometria de massa) é testado para ligação prevista de cada molécula MHC presente no indivíduo que, no caso de pacientes humanos, por exemplo, pode ser até 6 alelos MHC classe I, exclusivos. Há vários algoritmos disponíveis ao público que podem ser usados para prever ligação de MHC, incluindo a rede neural artificial netMHC, o método de matriz estabilizada, e o algoritmo Immune Epitope Database (IEDB) Analysis Resource Consensus. Algoritmos não públicos também podem ser usados. Antígenos de peptídeo (A) que contêm um epítopo com uma afinidade de ligação prevista alta são mais prováveis de induzir uma resposta imune do que antígenos de peptídeo (A) contendo epítopos com uma afinidade de ligação previstas baixa. Uma descoberta inesperada revelada na presente invenção é que mais de 50% de antígenos de peptídeo (A), incluindo neoantígenos previstos, que têm um epítopo com afinidade de ligação prevista de menos de 0.5 percentil pelo algoritmo de consenso IEDB são
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190/314 capazes de gerar respostas de células T (isto é, respostas de célula T CD8) quando administrados usando composições imunogênicas compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo descritos aqui. Com base nessa descoberta inesperada, antígenos de peptídeo (A), incluindo antígenos de peptídeo (A) compreendendo neoantígenos previstos, que contém um epítopo com uma afinidade de ligação menor que 0.5 percentil com o algoritmo de consenso IEDB podem ser selecionados para uso nas vacinas personalizadas contra câncer compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo.
[0396]Adicionalmente, confirmação de espectrometria de massa de ligação de antigeno a MHC, ou algoritmos treinados em ligação de espectrometria de massa de antígenos a MHC, pode ser usada para selecionar antígenos de peptídeo (A) para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer. Nesse cenário, tecido de tumor é processado para identificar peptídeos que são ligados a moléculas MHC. Peptídeos que são identificados na superfície de células de tumor porém não células normais, que podem ser peptídeos mutantes (isto é, neoantígenos), variantes de união proteassomal ou antígenos próprios associados a tumor, podem ser priorizados para inclusão em uma vacina personalizada contra câncer. Uma descoberta inesperada revelada aqui é que uma alta proporção (isto é, 7 de 7) de neoantígenos previstos, que foram selecionados para uso em uma vacina personalizada contra câncer com base em ligação confirmada por espectrometria de massa a MHC-1 em células de tumor, levou a respostas de célula T CD8 de magnitude alta quando fornecida como um antigeno de peptídeo (A) em composições imunogênicas compreendendo um conjugado de antigeno de peptídeo, sugerindo que espectrometria de massa, ou algoritmos preditivos com base em espectrometria de massa, podem ser filtros confiáveis para selecionar neoantígenos para uso como antígenos de peptídeo (A) em vacinas personalizadas contra câncer compreendidas de conjugados de antigeno de peptídeo.
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[0397]Antígenos de peptídeo (A) também podem ser selecionados para inclusão com base em um ensaio de reconhecimento de célula T. por exemplo, pode-se usar um ensaio onde peptídeos sintéticos (ou sistemas de expressão que produzem o peptídeo in situ) compreendendo neoantígenos previstos ou antígenos próprios associados a tumor são adicionados a uma cultura in vitro de células T derivadas do sangue, tecido de tumor, ou outro tecido a partir de um indivíduo. Reconhecimento de célula T de um dado peptídeo pode ser avaliado, por exemplo, por um ensaio ELISpot, ou por citometria de fluxo. Antígenos reconhecidos em um ensaio de célula T in vitro podem ser priorizados para inclusão como um antigeno de peptídeo (A) em uma vacina personalizada compreendida de conjugados de antigeno de peptídeo.
[0398]Finalmente, antígenos de peptídeo (A) podem ser selecionados com base em qualquer número de algoritmos preditivos. Antígenos de peptídeo (A) que são previstos como sendo imunogênicos ou eficazes com base em algoritmos preditivos treinados em conjuntos de dados grandes podem ser usados. Adicionalmente, algoritmos preditivos podem ser usados para selecionar neoantígenos de peptídeo que são previstos levar a respostas de célula T que são específicas para o epitopo mutante, porém não o epitopo do tipo selvagem, isto é, células T que não são reativas cruzadas para antígenos próprios.
[0399]Qqualquer combinação dos métodos acima pode ser usada para a identificação e seleção de antígenos de peptídeo (A) compreendendo neoantígenos ou antígenos próprios associados a tumor ou similares para uso em uma vacina personalizada contra câncer compreendida de conjugados de antigeno de peptídeo.
[0400]Comprimento de Antigeno de peptídeo (A) e efeitos sobre a indução de respostas de célula T CD8 e CD4 para vacinas personalizadas contra câncer
[0401 ]Um polimorfismo de nucleotídeo único que resulta em uma substituição de aminoácido não sinônima pode aparecer em qualquer posição em
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192/314 um epítopo de peptídeo que se lia a MHC classe I, que têm tipicamente 8-13 aminoácidos em comprimento. Portanto, para cobrir todos os epítopos possíveis que podem ligar um MHC de classe I dado, um antígeno de peptídeo (A) compreendendo um neoantígeno para uso em uma vacina personalizada contra câncer pode incluir 12 aminoácidos em cada lado da mutação não sinônima, fazendo um peptídeo com 25 aminoácidos de comprimento, com o aminoácido mutante como o resíduo do meio (13Q). Alternativamente, um antígeno de peptídeo (A) pode incluir somente o epítopo mínimo (8-13 aminoácidos em comprimento) que é previsto ligar com MHC classe I. alternativamente, vacina personalizada contra câncer pode conter tanto um antígeno de peptídeo (A) compreendendo o neoantígeno de 25 aminoácidos e um antígeno de peptídeo (A) compreendendo somente o epítopo mínimo previsto de um neoantígeno.
[0402]0 pocket de ligação de peptídeo de MHC classe II se liga tipicamente a peptídeos de 12-16 aminoácidos e em alguns tanto quanto 20 ou mais aminoácidos. Portanto, uma vacina personalizada contra câncer que é compreendida de antígenos de peptídeo (A) que contêm somente os epítopos mínimos de ligação de Classe I previstos (que têm tipicamente 8-13 aminoácidos em comprimento) é improvável de induzir respostas de célula T CD4. Entretanto, uma vacina contra câncer que contém antígenos de peptídeo de 25 aminoácidos (ou “25mer”) (A) pode, porém nem sempre induz respostas de célula T CD4 direcionadas a uma mutação dada.
[0403]Um antígeno de peptídeo de 25 aminoácidos (ou “25 mer”) (A) em uma vacina contra câncer pode induzir respostas de célula T CD8 de nível mais baixo em comparação com um antígeno de peptídeo (A) compreendendo o epítopo mínimo de ~7 a 12 aminoácidos exato, possivelmente devido a diferenças na eficiência de processamento e apresentação de comprimentos diferentes de antígenos de peptídeo. Desse modo, antígenos de peptídeo de 25 aminoácidos (A)
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193/314 incluídos em uma vacina contra câncer podem resultar em respostas de célula T CD8 de magnitude mais baixa em comparação com aquelas induzidas por antígenos de peptídeo (A) compreendendo epítopos mínimos. Por conseguinte, em algumas modalidades, um antígeno de peptídeo de 25 aminoácidos (A) incluído em uma vacina contra câncer compreendida de conjugados de antígeno de peptídeo resulta em respostas de célula T CD8 não detectáveis, ao passo que o antígeno de peptídeo de 7 a 12 aminoácidos (A) compreendendo o epítopo mínimo exato resulta em respostas de célula T CD8 detectáveis. Em modalidades adicionais, um antígeno de peptídeo de 25 aminoácidos (A) incluído em uma vacina contra câncer compreendida de conjugados de antígeno de peptídeo resulta em respostas de célula T CD4 detectáveis, um antígeno de peptídeo de 7 a 12 aminoácidos (A) compreendendo o epítopo mínimo exato resulta em respostas de célula T CD4 não detectáveis. Com base nessas descobertas inesperadas, em algumas modalidades, dois comprimentos de antígenos de peptídeo (A) compreendendo o mesmo epítopo, tanto o epítopo de célula T CD8 mínimo (mencionado como o “Min” ou epítopo mínimo (ME)) e o peptídeo de 25 aminoácidos (mencionado como um peptídeo longo sintético (SLP) ou peptídeo longo), pode ser incluído como antígenos de peptídeo (A) em vacinas personalizadas contra câncer compreendidas de conjugados de antígeno de peptídeo. Em algumas modalidades, antígenos de peptídeo (A) que consistem em epítopos de célula T CD4 e CD8 mínimos são incluídos em uma vacina personalizada contra câncer compreendida de conjugados de antígeno de peptídeo. Em modalidades adicionais, antígenos de peptídeo (A) consistindo em antígenos de peptídeo e célula T CD8 mínimos (A) compreendendo um epítopo de célula T CD4 universal e opcionalmente antígenos de peptídeo (A) consistindo em epítopos de célula T CD4 mínimos são incluídos em vacinas personalizadas contra câncer compreendidas de conjugados de antígeno de peptídeo. Em modalidades preferidas, antígenos de peptídeo (A) incluídos em uma
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194/314 vacina personalizada compreendida de conjugados de antigeno de peptídeo é 7 a 35 aminoácidos, tipicamente 15 a 35 aminoácidos, por exemplo, 25 aminoácidos.
Imunoterapia de combinação
[0404]0s conjugados de antigeno de peptídeo revelados na presente invenção podem ser usados em composições imunogênicas para tratar tumores ou doenças infecciosas. Os conjugados de antigeno de peptídeo podem ser usados individualmente ou em combinação com outras terapias. Para o tratamento de cânceres, composições imunogênicas compreendidas de conjugados de antigeno de peptídeo podem ser usadas antes de, durante ou após qualquer forma de tratamento, como cirurgia, terapia por radiação ou quimioterapia. Em modalidades preferidas, as composições imunogênicas compreendendo os conjugados de antigeno de peptídeo são usadas em combinação com imuno-moduladores, como citocinas (por exemplo, IL-2), anticorpos anti-tumor, inibidores de ponto de controle (como anti-PD1) anticorpos, ou outras moléculas pequenas ou biologias que revertem a imune-supressão, diretamente matam as células de tumor ou potenciam a resposta imune contra o tumor. Em modalidades preferidas, uma vacina contra câncer baseada em conjugados de antigeno de peptídeo é fornecida a um indivíduo tendo um tumor em combinação com um inibidor de ponto de controle (por exemplo, anti-PD1, anti-PDL1 anti-CTLA4). Em modalidades preferidas, a vacina contra câncer, por exemplo, vacina personalizada contra câncer é fornecida a um indivíduo antes de administração do inibidor de ponto de controle. Os conjugados de antigeno de peptídeo revelados na presente invenção também podem ser usados em imunizações de prime-reforço heterólogas, como uma sensibilização ou reforço com um conjugado de antigeno de peptídeo e uma sensibilização ou reforço com uma vacina heteróloga, como um vetor viral.
Formulação de composição
[0405]As composições imunogênicas compreendidas de conjugados de
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195/314 antígeno de peptídeo revelados na presente invenção podem ser formuladas como composições farmacêuticas preparadas para administração a um indivíduo e que incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos imunógenos como descrito aqui. A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto revelado dependerá da via de administração, a espécie de indivíduo e as características físicas do indivíduo sendo tratado. Fatores específicos que podem ser considerados incluem gravidade e estágio da doença, peso, dieta e medicações simultâneas. A relação desses fatores para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos revelados é entendida por aqueles versados na técnica.
[0406]Composições imunogênicas para administração a um sujeito podem ser composições farmacêuticas e podem incluir pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável adicional como veículos, espessantes, diluentes, tampões, preservativos, agentes ativos superficiais e similares além da molécula de escolha. Composições imunogênicas também podem incluir um ou mais ingredientes ativos adicionais como agentes antimicrobianos, anestésicos e similares. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis para essas formulações são convencionais. Flemington’s Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19â edição (1995) descreve composições e formulações adequadas para aplicação farmacêutica dos compostos aqui revelados.
[0407]Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo de administração específico sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais contêm normalmente fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis como água, solução salina fisiológica, soluções de sal equilibrado, dextrose aquosa, glicerol ou similar como um veículo. Além de veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsionantes, preservativos, e agentes de tamponamento de pH e
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196/314 similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
[0408]Para formular as composições imunogênicas, os componentes de nanopartícula revelados ou uma solução contendo os componentes de nanopartícula revelados podem ser combinados com vários aditivos farmaceuticamente aceitáveis, bem como uma base ou veículo para dispersão das nanopartículas. Aditivos desejados incluem, porém não são limitados a, agentes de controle de pH„ como arginina, hidróxido de sódio, glicina, ácido clorídrico, ácido cítrico e similares. Além disso, anestésicos locais (por exemplo, álcool de benzila), agentes de isotonização (por exemplo, cloreto de sódio, manitol, sorbitol), inibidores de adsorção (por exemplo, Tween 80 ou Miglyol 812), agentes de aumento de solubilidade ( por exemplo, ciclodextrinas e derivados das mesmas), estabilizadores (por exemplo, albumina de soro), e agentes redutores (por exemplo, glutationa) podem ser incluídos. Adjuvantes como hidróxido de alumínio (por exemplo, Amphogel, Wyeth Laboratories, Madison, NJ), adjuvante de Freund, MPL™ (lipideo de monofosforila desacilado-3-0 A; Corixa, Hamilton, IN) e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), entre muitos outros adjuvantes adequados bem conhecidos na técnica, podem ser incluídos nas composições. Quando a composição é um líquido, a tonicidade da formulação, como medido com referência a tonicidade de 0,9% (peso/v) de solução salina fisiológica tomada como unidade, é tipicamente ajustada a um valor no qual nenhum dano ao tecido substancial, irreversível será induzido no sítio de administração. Em geral, a tonicidade da solução é ajustada a um valor de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3,0, como aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 ou aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,7.
[0409]As composições imunogênicas da revelação são tipicamente estéreis e estáveis em condições de fabricação, armazenagem e uso. Soluções estéreis podem ser preparadas por incorporar o composto na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aqui,
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197/314 como exigido, seguido por esterilização filtrada. Em geral, dispersões são preparadas por incorporar o composto e/ou outro agente biologicamente ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básica e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados na presente invenção. No caso de pós estéreis, métodos de preparação incluem secagem a vácuo e liofilização que fornece um pó do composto mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução filtrada anteriormente estéril do mesmo. A prevenção da ação de microorganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares.
[0410]A presente revelação também inclui kits, embalagens e unidades de múltiplos recipientes contendo as composições imunogênicas aqui descritas, ingredientes ativos e/ou meio para administrar as mesmas para uso na prevenção e tratamento de doenças e outras condições em indivíduos mamíferos. Em uma modalidade, esses kits incluem um recipiente ou formulação que contém uma ou mais das composições imunogênicas descritas na presente invenção. Em um exemplo, a composição imunogênica é opcionalmente contida em um recipiente ou unidade de dispensar volume ou forma de dosagem de múltiplas unidades. Meios de dispensar opcionais podem ser fornecidos, por exemplo, um aplicador de pulverização intranasal ou pulmonar. Materiais de embalagem incluem opcionalmente um rótulo ou instrução indicando para quais finalidades de tratamento e/ou em qual modo o agente farmacêutico embalado com os mesmos pode ser usado.
Métodos de induzir uma resposta imune
[0411]As composições imunogênicas incluindo um antigeno de peptídeo (A) como descrito aqui podem ser usadas para eliciar a resposta imune para o antigeno de peptídeo (A) em um indivíduo. Indivíduos que podem ser beneficiar dos métodos
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198/314 revelados incluem sujeitos veterinários e humanos.
[0412]Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento que te, ou está em risco, de desenvolver uma infecção com um agente infeccioso que compreende o antígeno de peptídeo, por exemplo, devido à exposição ou a possibilidade de exposição ao agente infeccioso. Após administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica revelada, o indivíduo pode ser monitorado para a infecção, sintomas associados à infecção ou ambos.
[0413]Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento que tem, ou está em risco de desenvolver um câncer, como um tumor maligno. Após administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um imunógeno revelado, o indivíduo pode ser monitorado em relação a presença do câncer, uma redução em carga de tumor, qualquer sintoma apropriado do câncer, ou uma combinação dos mesmos.
[0414]Indivíduos típicos destinados ao tratamento com a terapêutica e métodos da presente revelação incluem seres humanos, bem como primatas não humanos e outros animais. Para identificar indivíduos para profilaxia ou tratamento de acordo com os métodos da relação, métodos de triagem aceitos são empregados para determinar fatores de risco associados a uma doença ou condição alvo ou suspeita, ou determinar o status de uma doença ou condição existente em um indivíduo. Esses métodos de triagem incluem, por exemplo, elaborações convencionais para determinar fatores ambientais, familiares, ocupacionais e outros tais fatores de risco, que podem ser associados à condição ou doença alvo ou suspeita, e outros desses fatores de risco que podem ser associados a condição ou doença alvo ou suspeita, bem como métodos de diagnóstico, como vários métodos ELISA e outros métodos de imunoensaio, que são disponíveis e bem conhecidos na técnica para detectar e/ou caracterizar a doença ou condição. Esses e outros
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199/314 métodos de rotina permitem que o clínico selecione pacientes necessitando de terapia usando os métodos e composições farmacêuticas da revelação. De acordo com esses métodos e princípios, uma composição pode ser administrada de acordo com os ensinamentos da presente invenção, ou outros métodos convencionais conhecidos pela pessoa com conhecimentos comuns na técnica, como um programa de tratamento ou profilaxia independente, ou como um regime de tratamento de acompanhamento, adjunto ou coordenado a outros tratamentos.
[0415]A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica incluindo um antigeno de peptídeo como revelado na presente invenção pode ser para fins profiláticos ou terapêuticos. Quando fornecido de modo profilático, a composição imunogênica é fornecida antecipadamente de qualquer sintoma, por exemplo antecipadamente de infecção ou desenvolvimento de um tumor. A administração profilática da composição imunogênica serve para evitar ou melhorar desenvolvimento subsequente da doença ou condição. Consequentemente, em algumas modalidades os métodos envolvem selecionar um indivíduo em risco de contrair uma infecção ou desenvolver um tumor, e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma quantidade terapeuticamente eficaz revelada de uma composição imunogênica revelada. A composição imunogênica pode ser desse modo fornecida antes da exposição prevista ao agente infeccioso, ou desenvolvimento do tumor, de modo a atenuar a gravidade prevista, duração ou extensão de uma infecção ou tumor, e/ou quaisquer sintomas associados de doença.
[0416]Quando fornecida terapeuticamente, a composição imunogênica revelada pode ser fornecida em ou após o início de um sintoma de doença ou condição, por exemplo, após desenvolvimento de um sintoma de infecção, ou diagnóstico de infecção, ou desenvolvimento de um sintoma de um tumor, ou diagnóstico de um tumor. Tratamento da infecção ou tumor pode incluir retardar e/ou
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200/314 reduzir sinais ou sintomas da infecção ou tumor no indivíduo. Em alguns exemplos, tratamento usando os métodos revelados na presente invenção prolonga o tempo de sobrevivência do indivíduo.
[0417]A composição imunogênica pode ser usada em protocolos de imunização ou formulações combinatórias, coordenados.
[0418]Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica revelada pode ser administrada a um indivíduo para tratar ou inibir um agente infeccioso em um indivíduo. Um agente infeccioso é uma gente que pode infectar um indivíduo, incluindo, porém não limitado a vírus, bactérias e fungos. O indivíduo pode ser selecionado para tratamento que tem, é suspeito de ter ou está em risco de desenvolver uma infecção com o agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um vírus, uma bactéria ou um fungo como descrito acima, e o antígeno de peptídeo inclui um antígeno a partir do vírus, bactéria ou fungo específico.
[0419]Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica revelada pode ser administrada a um indivíduo para tratar ou inibir um tumor e/ou um câncer em um indivíduo. O indivíduo pode ser selecionado para tratamento que tem, é suspeito de ter ou está em risco de desenvolver o tumor e/ou câncer. Em algumas modalidades, tratar o tumor e/ou câncer no indivíduo diminui crescimento e/ou proliferação do tumor. O tumor pode ser qualquer tumor de interesse e pode ser benigno ou maligno.
[0420]0 tratamento do tumor é em geral iniciado após o diagnóstico do tumor, ou após a iniciação de uma condição de precursor (como displasia ou desenvolvimento de um tumor benigno). O tratamento pode ser iniciado nos estágios iniciais de câncer, por exemplo, pode ser iniciado antes de um indivíduo manifestar sintomas de uma condição, como durante um diagnóstico de estágio I no momento em que displasia é diagnosticada. Entretanto, o tratamento pode ser iniciado durante
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201/314 qualquer estágio da doença, como, porém não limitado a canceres em estágio I, estágio II, estágio III e estágio IV. Em alguns exemplos, o tratamento é administrado a esses indivíduos com um tumor benigno que pode se converter em maligno ou mesmo tumor metastático.
[0421 ]O tratamento iniciado após o desenvolvimento de uma condição, como câncer maligno, pode resultar em diminuir a gravidade dos sintomas de uma das condições, ou remover totalmente os sintomas, ou reduzir metástase, volume de tumor ou número de tumores. Em alguns exemplos, o tumor se torna não detectável após o tratamento. Em um aspecto da revelação, a formação de tumores, como metástase, é retardada, evitada ou diminuída. Em outro aspecto, o tamanho do tumor primário é diminuído. Em um aspecto adicional, um sintoma do tumor é diminuído. Ainda em outro aspecto, volume de tumor é diminuído.
[0422]lndivíduos podem ser selecionados antes de iniciarem as terapias reveladas, por exemplo, para determinar se o indivíduo tem um tumor. A presença de um tumor pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, e incluem tipicamente avaliação citológica e morfológica. O tumor pode ser um tumor estabelecido. As células podem estar in vivo ou ex vivo, incluindo células obtidas de uma biopsia. A presença de um tumor indica que o tumor pode ser tratado usando os métodos fornecidos na presente invenção.
[0423]A quantidade terapeuticamente eficaz dependerá da gravidade da doença e do estado geral da saúde do paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que fornece alívio subjetivo de um sintoma(s) ou uma melhora objetivamente identificável como observado pelo médico ou outro observador qualificado. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade necessária para inibir o crescimento do tumor, ou a quantidade que é eficaz na redução de um sinal ou um sintoma do tumor. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade necessária para inibir infecção
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202/314 por um agente infeccioso, ou a quantidade que é eficaz na redução de um sinal ou um sintoma da infecção. A quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes administrados pode variar dependendo dos efeitos desejados e do indivíduo a ser tratado. Em alguns exemplos, quantidades terapêuticas são quantidades que eliminam ou reduzem a carga de tumor do paciente, ou que evitam ou reduzem a proliferação de células metastáticas, ou que reduzem a carga de agente infeccioso no indivíduo.
[0424]A dosagem efetiva da composição imunogênica variará de acordo com fatores como a indicação da doença e status específico do indivíduo (por exemplo, a idade do indivíduo, tamanho, fitness, extensão de sintomas, fatores de suscetibilidade e similares), horário e via de administração, outras drogas ou tratamentos sendo administrados simultaneamente, bem como a farmacologia específica do composto para eliciara atividade ou resposta biológica desejada no indivíduo. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer uma resposta profilática ou terapêutica ótima. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos colaterais tóxicos ou prejudiciais do composto e/ou outro agente biologicamente ativo são superados em termos clínicos por efeitos terapeuticamente benéficos.
[0425]A dosagem pode ser variada pelo médico atendente para manter uma concentração desejada em um sítio alvo (por exemplo, os pulmões ou circulação sistêmica). Concentrações mais altas ou mais baixas podem ser selecionadas com base no modo de aplicação, por exemplo, aplicação trans-epidérmica, retal, oral, pulmonar, intraóssea, ou intranasal versus aplicação intravenosa ou subcutânea ou intramuscular. A dosagem também pode ser ajustada com base na taxa de liberação da formulação administrada, por exemplo, de uma pulverização intrapulmonar versus pó, oral de liberação constante versus formulações de aplicação transdérmica ou particulada injetada etc.
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[0426]Qualquer método de administração pode ser usado para os agentes terapêuticos revelados, incluindo administração local e sistêmica. Por exemplo, administração tópica, oral, intravascular como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradérmica, intratecal e subcutânea pode ser usada. O modo de administração específico e o regime de dosagem serão selecionados pelo médico atendente, levando em conta os detalhes do caso (por exemplo, o indivíduo, a doença, o estado de doença envolvida, e se o tratamento é profilático). Em casos nos quais mais de um agente ou composição está sendo administrado, uma ou mais vias de administração podem ser usadas.
[0427]Os agentes terapêuticos revelados podem ser formulados em forma de dosagem unitária adequada para administração individual de dosagens precisas. Além disso, os agentes terapêuticos revelados podem ser administrados em uma dose única ou em um programa de múltiplas doses. Um programa de múltiplas doses é um no qual um curso de tratamento primário pode ser com mais de uma dose separada, por exemplo, 1-10 doses, seguido por outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes conforme necessário para manter ou reforçar a ação das composições. O tratamento pode envolver doses diárias ou multidiariamente de composto(s) durante um período de alguns dias a meses, ou mesmo anos. Desse modo, o regime de dosagem também, pelo menos em parte, será determinado com base nas necessidades específicas do indivíduo a ser tratado e será dependente da decisão do técnico administrador.
EXEMPLOS
Composto 1
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Figure BR112019020853A2_D0041
[0423]Composto 1, 1 -(4-ami nobuti l)-2-buti 1-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4amina, mencionado como 2B, foi sintetizado de acordo com o esquema mostrado na Figura 3.
[0424]1-c. Iniciando a partir de 2,4-quinolinadiol, o intermediário, 1-b, foi preparado como anteriormente descrito (Lynn GM, et al., Nat Biotechnol 33(11 ):1201 -1210, 2015). A 21 g de 1 -b (87.8 mmol, 1 eq) em 210 mL de trietilamina (TEA) (10% peso/peso) foi adicionado 16,34 g (87.8 mmol, 1 eq) de N-boc-1,4butanodiamina durante agitação vigorosa. A mistura de reação foi aquecida a 70°C e monitorada por HPLC, que confirmou que a reação estava completa após 2 horas. A trietilamina foi removida a vácuo e o óleo resultante foi dissolvido em 200 mL de diclorometano e então lavado com 3x100 mL Dl H2O. A camada orgânica foi seca com NazSCk e então removida a vácuo e 0 óleo resultante foi triturado com 1:1 (v:v) hexano e éter de dietila para fornecer 30,7 g de cristais amarelos do intermediário 1 c. MS (APCI) calculado para C18H23CIN4O4, m/z 394.1 encontrado, 394.9.
[0425]1-d. 30,7 g (76.4 mmol) do intermediário 1-c foi dissolvido em 300 mL de acetato de etila em um recipiente de Reator Parr que foi borbulhado com argônio, seguido pela adição de 3 g de 10% platina em carbono. O recipiente de reação foi mantido sob argônio e então evacuado e pressurizado com H2(g) várias vezes antes de pressurizar a 55 PSI H2(g) durante agitação vigorosa. O H2(g) foi continuamente adicionado até que a pressão estabilizou em 55 PSI, em cujo ponto a reação foi
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205/314 determinada como estando completa. A mistura de reação a partir do Reator Parr foi então filtrada através de celite e evaporada até secura para obter um óleo amarelo que foi triturado com 1:1 hexanos / éter para fornecer cristais brancos que foram coletados por filtração para obter 27,4 g de cristais brancos espectroscopicamente puros de 1-d. MS (APCI) calculado para C18H25CIN4O2, m/z 364.2, encontrado 365.2.
[0426]1-e. A 10 g (27.4 mmol, 1 eq) de 1-d em 50 mL de THF foi adicionado 7.7 mL de trietilamina (54.8 mmol, 2 eq) seguido pela adição em gotas de 3,6 g de cloreto de valeroíla (30.1 mmol, 1.1 eq) em 30 mL de THF durante agitação vigorosa enquanto a mistura de reação estava em gelo. Após 90 minutos, 0 banho de gelo foi removido e 0 THF foi removido a vácuo, resultando em um óleo amarelo que foi dissolvido em 100 mL de diclorometano (DCM) que foi lavado com 3x50 mL de pH
5.5 100 mM tampão de acetato. O DCM foi removido a vácuo em um óleo que foi triturado com acetato de etila para obter 10,4 g de um sólido branco que foi dissolvido em metanol com 1 g de CaO (s), que foi aquecido a 100°C por 5 horas durante agitação vigorosa. A mistura de reação foi filtrada e seca para fornecer 10,2 g de um sólido esbranquiçado, intermediário, 1-e. MS (ESI) calculado para C23H31CIN4O2, m/z 430.21, encontrado 431.2.
[0427]1 -f. A 10,2 g (23.7 mmol, 1 eq) de 1-e foram adicionados 30,4 g (284 mmol, 12 eq) de benzilamina líquida, que foi aquecida a 110°C durante agitação vigorosa. A reação foi concluída após 10 horas e a mistura de reação foi adicionada à 200 mL de acetato de etila e lavada 4x100 mL com 1 M HCI. A camada orgânica foi seca com Na2SO4 e então removida a vácuo e 0 óleo resultante foi recristalizado a partir de acetato de etila para obter 10,8 g de cristais brancos espectroscopicamente puros do intermediário, 1-f. MS (ESI) calculado para C30H39N5O2, m/z 501.31, encontrado 502.3
[0428]Composto 1. 10,8g (21.5 mmol) de 1-f foram dissolvidos em 54 mL de (>98%) H2SO4 concentrado e a mistura de reação foi agitada vigorosamente por 3
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206/314 horas. Após 3 horas, mistura de reação vermelha viscosa foi lentamente adicionada à 500 mL de Dl H2O durante agitação vigorosa. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos e então filtrada através de Celite, seguido por adição de 10 M NaOH até que 0 pH da solução era ~ pH 10. A camada aquosa foi então extraída com 6x200 mL de DCM e a camada orgânica resultante foi seca com Na2ÔO4 e reduzida a vácuo para fornecer um sólido branco espectroscopicamente puro. 1H NMR (400 MHZ, DMSO-d6) δ 8.03 (d, J = 8.1 HZ, 1H), 7.59 (d, J = 8.1Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.41 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.47 (s, 2H), 4.49 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 7.78 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.64 Hz, 1H), 1.80 (m, 4H), 1.46 (sep, J= 7.75 Hz, 4H), 0.96 (t, J = 7.4 Hz, 3H). MS (ESI) calculado para C18H25N5, m/z 311.21, encontrado 312.3.
Composto 2
NH
NH2
[0429]Composto 2, 1 -(4-(aminometil)benzil)-2-butil-1 H-imidazo[4,5c]quinolin-4-amina, mencionado como 2BXy, foi descrito anteriormente (vide: Lynn GM, et al., In vivo characterization de the physicochemical properties de polymerlinked TLR agonists that enhance vaccine immunogenicity. Nat Biotechnol 33(11):1201-1210, 2015, e Shukla NM, et al. Syntheses de fluorescent imidazoquinoline conjugates as probes de Toll-like receptor 7. Bioorg Med Chem Lett 20(22):6384-6386, 2010). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz,
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207/314
Η), 7.55 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.35 - 7.28 (m, 1H), 7.25 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.06
- 6.98 (m, 1H), 6.94 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.50 (s, 2H), 5.81 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 2.92
2.84 (m, 2H), 2.15 (s, 2H), 1.71 (q, J = 7.5Hz, 2H), 1.36 (q, J = 7.4Hz, 2H), 0.85 (t, J = 7.4 Hz, 3H). MS (APCI) calculado para C22H25N5 m/z 359.2, encontrado 360.3
Figure BR112019020853A2_D0042
H II \
N—CH-C—t-NHo
I '3 ch2
I ch2
Figure BR112019020853A2_D0043
[0430]Composto 3, mencionado como DBCO-2BXy3, 2BXys ou DBCO(Glu(2BXy)3), foi sintetizado iniciando a partir de urn precursor Fmoc-(Glu)3-NH2 preparado por síntese de peptídeo de fase sólida. 50 mg de Fmoc-(Glu)3-NH2 (0.08 mmol, 1 eq), 143 mg do Composto 2 (0.40 mmol, 5 eq), 84 mg de 2-cloro-4,6dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) (0.48 mmol, 6 eq) e 48.5 mg de 4-metilmorfolina (NMM) (0.48 mmol, 6 eq) foram adicionados a 3.25 mL de DMSO durante agitação vigorosa em temperatura ambiente sob ar ambiente. O progresso da reação foi monitorado por HPLC (AUC 254 nm). 1 equivalente adicional do Composto 2 e 2 equivalentes adicionais de ambos CDMT e NMM foram adicionados após 30 minutos. Após 2 horas, a reação foi concluída e a mistura de reação foi adicionada à 50 mL de uma solução 1M HCI para precipitar 0 intermediário protegido por Fmoc,
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208/314 que foi coletado por centrifugar a solução a 3000g a 4°C por 10 minutos. A solução de HCI foi descartada e o intermediário protegido por Fmoc foi coletado como uma pelota branca sólida. O sólido branco foi suspenso novamente em 50 mL de uma solução 1M HCI e girado a 3000g a 4°C por 5 minutos; a solução 1 M HCI foi descartada e o produto foi coletado como uma pelota sólida. Esse processo foi repetido e então o sólido foi coletado e seco a vácuo para fornecer 156,1 mg do produto protegido por Fmoc em rendimento quantitativo. O produto protegido por Fmoc foi então adicionado a 1,5 mL de uma piperidina a 20% em solução DMF por 30 minutos em temperatura ambiente para fornecer o produto desprotegido que foi então precipitado a partir de 50 mL de éter e centrifugado a 3000g a 4°C por 30 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido por secagem a vácuo para fornecer 126,4 mg do intermediário. 60 mg do intermediário resultante, NH2-(Glu-2BXy)3-NH2, (0.042 mmol, 1 eq) foram então reagidos com 18,6 mg (0.046 mmol, 1.1 eq) de éster de DBCO-NHS (Scottsdale, Arizona, EUA) e 8.5 uL de trietilamina (0.084 mmol, 2 eq) em 1 mL de DMSO por 6 horas em temperatura ambiente. O produto resultante, Composto 3, foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-70% acetonitrlla/H20 (0,05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmrn, 5 pm. O produto eluiu em 7.0 minuto e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 40,12 mg (55,7% de rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C100H106N20O8 m/z 1714.85, encontrado 858.9 (M/2)+
Composto 4
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209/314
Figure BR112019020853A2_D0044
[0431]Composto 4, mencionado como DBC0-2BXys, 2BXys ou DBCO(Glu(2BXy)õ), foi sintetizado usando o mesmo procedimento como descrito para o Composto 3, exceto que Fmoc-(Glu)5-NH2 foi usado como o material de partida para conjugação do Composto 2. O Composto 4 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 38-48% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a 8.0 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 45,9 mg (63.4% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C154H166N32O12 m/z 2655.34, encontrado 886.6 (M/3)+.
Composto 5
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210/314
Figure BR112019020853A2_D0045
[0432]Composto 5, mencionado como DBCO-2B5, 2Bs ou DBCO-(Glu(2B)s), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para 0 Composto 3, exceto que Fmoc-(Glu)5-NH2 foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 5 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 33-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a ~ 10.0 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 25.2 mg (62,6% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C134H166N32O12 m/z 2415.34, encontrado 1209.3 (M/2)+.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 217/391
211/314
Composto 6
Figure BR112019020853A2_D0046
[0433]Composto 6, mencionado como DBCO-2B3W2, 2B3W2 ou DBCO(Glu(2B)3(Trp)2), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para 0 Composto 3, exceto que Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2 foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 6 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 33-47% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a ~ 8 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 197 mg (50,6% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C110H126N24O10 m/z 1943.01, encontrado 973.0 (M/2)+.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 218/391
212/314
Composto 7
Figure BR112019020853A2_D0047
[0434]Composto 7, mencionado como DBCO-2B2W3, 2B2W3 ou DBCO(Glu(2B)2(Trp)3), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para Composto 3, exceto que Fmoc-Trp-Glu-Trp-Glu-Trp-NH2 foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 7 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 35-65% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x100 mm, 5 pm. O produto eluiu a ~ 9 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 11.6 mg (62,5% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C98H106N20O9 m/z 1706.85, encontrado 854.9 (M/2)+.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 219/391
213/314
Figure BR112019020853A2_D0048
[0435]Composto 8, mencionado como DBCO-2B2W8, 2B2W8 ou DBCO(Glu(2B)2(Trp)s), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para Composto 3, exceto que Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2 foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 8 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 35-85% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a ~ 8.0 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 3.3 mg (16,3% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C153H156N30O14 m/z 2637.24, encontrado 1320.2 (M/2)+.
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214/314
Figure BR112019020853A2_D0049
[0436]Composto 9 mencionado como DBCO-2B1W4, 2BiW4 ou DBCO(Glu(2B)i(Trp)4), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para Composto 3, exceto que Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NHh foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 9 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 50-55% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a 8.9 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 9.7 mg (55.4% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C86H86N16O8 m/z 1470.68, encontrado 736.6 (M/2)+.
Composto 10
Figure BR112019020853A2_D0050
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 221/391
215/314
[0437]Composto 10, mencionado como DBCO-W3, W3 ou DBC0-(Trp)3, foi sintetizado por reagir 50,2 mg (0.08 mmol, 1 eq) de um precursor de tri-peptídeo NH2-(Trp)3-NH2 que foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida com 35 mg de DBCO-NHS (0.096 mmol, 1.1 eq) e 44 mg de trietilamina (0.44 mmol, 5 eq) em
1.5 mL de DMSO. O Composto 10 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-95% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmrn, 5 pm. O produto eluiu a ~ 9 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 31.2 mg (41.5% rendimento) de um espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm) .
Composto 11
Figure BR112019020853A2_D0051
[°438lComposto 11, mencionado como DBCO-Ws, W5 ou DBCO-(Trp)s, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como para 0 Composto 10 exceto que NH2-(Trp)õ-NH2 (SEQ ID NO: 70) foi usado como 0 precursor de peptídeo para conjugação com DBCO-NHS. O Composto 11 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-95% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 222/391
216/314 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a ~ minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 28.7 mg (44,1% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C74H66N12O7 m/z 1234.52, encontrado 1235.6 (M+H)+
Composto 12
Figure BR112019020853A2_D0052
[0439]Composto 12, mencionado como DBCO-2BXy3W2, 2BXysW2 ou DBCO-(Glu(2BXy)3(Trp)2), foi preparado usando Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2 e Composto 2 como os materiais de partida. 500 mg de Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-GluNH2 (0.5 mmol, 1 eq), 595,6 mg de Tiazolina-2-Thiol (TT) (5 mmol, 10 eq), e 575,7 mg de 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (3 mmol, 6 eq) foram suspensos em 26 mL de DCM. 18,3 mg de 4-(Dimetilamino)piridina (DMAP) (0.2 mmol, 0.3 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por HPLC analítico. Após 4 horas, um adicional de quatro equivalentes de TT e dois equivalentes de EDC foram adicionados. Após agitação durante a noite, dois equivalentes de TT e meio equivalente de EDC foram adicionados. Após 6 horas, a reação estava complete. O DCM foi removido a vácuo e 0 sólido foi absorvido em 6 mL de DMSO seco. 539,3
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217/314 mg do Composto 2 (1.5 mmol, 3 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. O intermediário conjugado foi então precipitado a partir de 300 mL de 1 M HCI e centrifugado a 3000g a 4°C por 10 minutos. A pelota foi coletada e Lavada mais uma vez com 1 M HCI e uma vez com água Dl. A pelota coletada final foi congelada e seca a vácuo. 809,06 mg de Fmoc2BXy3W2-NH2 (0.4 mmol, 1 eq)) foram dissolvidos em 4 mL de piperidina a 20% em DMF. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. O intermediário desprotegido foi então precipitado a partir de 100 mL de éter e centrifugado a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido por secagem a vácuo para fornecer o intermediário. 729 mg NH2-2BXy3W2-NH2 (0.4 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 6 mL de DMSO seco. 488,8 mg de DBCO-NHS (1.2 mmol, 3 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. O produto resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 36-46% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 50x100mm, 5 um. As frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para fornecer 239 mg (38,1% de rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) Calculado para C122H126N24O10 m/z 2087.65 encontrado 697 (m/3)+.
Composto 13
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218/314
Figure BR112019020853A2_D0053
[0440]Composto 13, mencionado como DBCO-2BeW4, 2BeW4 ou DBCO(Glu(2B)e(Trp)4), foi sintetizado usando o mesmo procedimento como descrito para o Composto 3, exceto que Fmoc-(Glu-Trp-Glu-Trp-Glu)2-NH2foi usado como o material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 13 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 24-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C201H236N46O18 m/z 3582.4, encontrado 717.7 (M/5)+.
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219/314
Composto 14
Figure BR112019020853A2_D0054
[0441]Composto 14, mencionado como DBCO-2B4W6, 2B4W6 ou DBCO(Glu(2B)4(Trp)e), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento como descrito para 0 Composto 3, exceto que Fmoc-(Trp-Glu-Trp-Glu-Trp)2-NH2foi usado como 0 material de partida para conjugação do Composto 1. O Composto 14 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 24-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C177H196N38O16 m/z 3111.7, encontrado 777.5 (M/4)+.
Composto 15
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220/314
Figure BR112019020853A2_D0055
[0442]Composto 15, mencionado como DBCO-2BXyiW4, 2BXyiW4 ou DBCO-(Glu(2BXy)i(Trp)4), foi preparado usando o mesmo procedimento como descrito para o Composto 3, exceto que Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NHh foi usado como o material de partida. O Composto 15 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 40-70% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 16 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30 x 100 mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 3,4 mg (73.3% de rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C90H85N15O9 m/z 1519.67, encontrado 760.5 (M/2)+.
Composto 16
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221/314
Figure BR112019020853A2_D0056
Figure BR112019020853A2_D0057
NH
Figure BR112019020853A2_D0058
[0443]Composto 16, mencionado como DBCO-(GG2B)s, 2B5G10 ou DBCO(Glu(2B)5(Gly)io), foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento descrito para 0 Composto 3, exceto que Fmoc-(Gly-Gly-Glu)5-NH2 e 0 Composto 1 foram usados como os materiais de partida. O Composto 16 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 22-42% acetonitrila/H20 (0,05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a 7 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 22.8 mg (36.2% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado C154H196N42O22 por m/z 2985.51, encontrado 598.5 (M/5)+.
Composto 17
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222/314
Figure BR112019020853A2_D0059
[0444]Composto
17, mencionado como DBCO-(GG2BGGW)2GG2B,
2B3W2G10 ou DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2(Gly)io), foi sintetizado a partir de precursor de Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 preparado por síntese de peptídeo de fase sólida e Composto 1. 235,4 mg de Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-GluNH2 (0.15 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 2 mL de piperidina a 20% em DMF. Após 30 minutos a reação foi concluída e 0 produto foi precipitado a partir de 100 mL de éter e centrifugado a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido por secagem a vácuo até ~ 200 mg do intermediário desprotegido. 200 mg (0.15 mmol, 1 eq) de NH2-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 foram dissolvidos em 2 mL de DMSO seco e 89,73 mg de DBCO-NHS (0.22 mmol, 1.5 eq) foram adicionados seguido por
TEA (0.22 mmol, 1.5 eq). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. O intermediário DBCO resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-50% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 50x100mm, 5 um. As frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para fornecer 0 intermediário. 25 mg de DBCO-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2 (0.015
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223/314 mmol, 1 eq) e 17.11 mg do Composto 1 (0.055 mmol, 3.6 eq) foram dissolvidos em 1.2 mL de DMSO seco. TEA (0.183 mmol, 12 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 5 minutos. 19,17 mg de HATU (0.05 mmol, 3.3 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LC-MS. 1.2 equivalentes adicionais do Composto 1 e 1.1 equivalentes de HATU foram adicionados após 1 hora. Após 2 horas, a reação estava completa. O produto resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-60% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. As frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para fornecer um pó branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) Calculado para C130H156N34O20 m/z 2515.96 encontrado 839 (m/3)+.
Composto 18
Figure BR112019020853A2_D0060
[0445]Composto 18, mencionado como Bis(TT), foi sintetizado usando ácido subérico e 2-tiazolina-2-tiol (TT) como materiais de partida. Em resumo, 500 mg de ácido subérico (2.87 mmol, 1 eq), 752.7 mg de TT (6.31 mmol, 2.2 eq) e 1.431 g de EDC (7.46 mmol, 2.6 eq) foram dissolvidos em 17,5 mL de DMSO seco. 70,15 mg de DMAP (0.57 mmol, 0.2 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi diluída com DCM e lavada duas vezes com 1 M HCI e uma vez com água Dl. As frações orgânicas foram
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224/314 secas com sulfato de sódio e evaporadas sob pressão reduzida para fornecer um sólido amarelo em rendimento quantitativo.
Composto 19
NHS
[0446]Composto 19, mencionado como 2B-TT, foi sintetizado usando o Composto 18 e o Composto 1 como materiais de partida. Brevemente, 50 mg (0.16 mmol, 1 eq) do Composto 1 foram dissolvidos em 0,6 mL de metanol e adicionados em gotas a uma solução de agitação vigorosa de 301,1 mg do Composto 18 (0.8 mmol, 5 eq) em 1,93 mL de DCM. Após 30 minutos, a mistura de reação foi injetada diretamente sobre uma coluna e purificada por cromatografia instantânea usando um gradiente de 2 etapas: 5% de metanol sobre 5 volumes de coluna (CVs), seguido por 5-50% de metanol em gradiente de DCM sobre 20 CVs. As frações foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo. MS (ESI) calculado para C29H40N6O2S2 m/z 568.27 encontrado 569.3 (m+H)+.
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225/314
Composto 20
Figure BR112019020853A2_D0061
HN
Figure BR112019020853A2_D0062
NH
Figure BR112019020853A2_D0063
H2N
[0447]Composto 20 mencionado como DBCO-(2BGWGWG)s, 2B5W10G15 ou DBCO-(Glu(2B)5(Trp)io(Gly)i5), foi sintetizado a partir de um precursor de peptídeo Fmoc-(Lys-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly)5-NH2 que foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida e 0 Composto 19. 49,8 mg (0.01 mmol, 1 eq) de Fmoc-(Lys-Gly-Trp-GlyTrp-Gly)õ-NH2 foram dissolvidos em 0,5 mL de DMSO seco. A essa solução foi adicionado 0,492 mL do Composto 19 (0.03 mmol, 2.5 eq) como uma solução de reserva de 40 mg/mL em DMSO seco. TEA (0.01 mmol, 1 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 4 horas. HPLC analítico
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226/314 usando um gradiente de 45-65% acetonitrila/H20 (0,05%TFA) durante 10 minutos mostrou conversão completa no intermediário penta-substituído. A reação foi resfriada bruscamente pela adição de amino-2-propanol (0.03 mmol, 2.5 eq) e então 0,5 mL de piperidina a 20% em DMF foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi adicionada à 50 mL de éter e centrifugada a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido por secagem a vácuo para fornecer o intermediário desprotegido. . 73,4 mg do intermediário desprotegido (0.0131 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,5 mL de DMSO seco, seguido pela adição de 0,066 mL (0,0196 mmol, 1.5 eq) de DBCO-NHS (40 mg/mL) e TEA (0.0131 mmol, 1 eq). A reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente e então resfriada bruscamente pela adição de amino-2propanol (0.0196 mmol, 1.5 eq). O produto foi então precipitado a partir de 50 mL de 1 M HCI e centrifugado a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais uma vez com 1 M HCI e mais uma vez com água Dl. A pelota coletada final foi seca a vácuo para fornecer 15,1 mg (26% rendimento)do produto final. MS (ESI) calculado para C319H396N72O42 m/z 5909.1 encontrado 1183(m/5)+.
Composto 21
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227/314
Figure BR112019020853A2_D0064
[0448]Composto 21, mencionado como Mal-2B3W2 ou Mal-(Glu(2B)3(Trp)2), foi sintetizado começando de um Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2 e Composto 1. 100 mg de Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2 (0,1 mmol 1 eq) e 112.1 mg do Composto 1 (0.36 mmol, 3.6 eq) foram dissolvidos em 8 mL de DMF seco. TEA (1.2 mmol, 12 eq) foi adicionado e a solução foi resfriada com um banho de gelo durante agitação por 5 minutos. HATU (0.33 mmol, 3.3 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada a 4 C por 1 hora. A mistura de ração foi então adicionada à 50 mL de 1 M HCI e centrifugada a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais uma vez com 1 M HCI e mais uma vez com água Dl para fornecer o intermediário conjugado. 188 mg de Fmoc-2B3W2-NH2 (0.1 mmol, 1 eq) foram então dissolvidos em 2 mL de piperidina a 20% em solução de DMF e agitados por 30 minutos em temperatura ambiente. O intermediário desprotegido foi precipitado a partir de 100 mL de éter e centrifugado a 3000g a 4°C por 30 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido
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228/314 por secagem a vácuo para fornecer o produto desprotegido. 30 mg de NH2-2B3W2NH2 (0.018 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,3 mL de DMSO seco, seguido pela adição de 22 mg de Succinimidil 6-((beta-maleimideopropionamido)hexanoato (SMPH) (0.058 mmol, 3.2 eq). A mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente e 0 produto resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-50% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 50x100mm, 5 um. O produto eluiu a 4.75 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para fornecer 23 mg (66.7% rendimento) de um pó branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) calculado para C104H129N25O12 1921.33, encontrado 961 (m/2)+.
Composto 22
Figure BR112019020853A2_D0065
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 235/391
229/314
[0449]Composto 22, mencionado como NHS-2B3W2, foi sintetizado por reagir 125 ug (0.0004 mmol, 1 eq) de ácido 3-Azidopropiônicod Sulfo-NHS éster (AzNHS, Click Chemistry Tools) com 0,8 mg de (0.0004 mmol, 1.0 eq) Composto 6 em DMSO seco. HPLC mostrou conversão total ao composto ativado por NHS, que foi usado imediatamente para conjugação de peptídeos contendo uma amina reativa.. MS (ESI) calculado para C117H133N28O17S m/z 2234 encontrado 1119 (m/2)+.
Composto 23
Figure BR112019020853A2_D0066
[0450]Composto 23, mencionado como DBCO-2BXy, foi sintetizado por reagir 5,0 mg (0.01 mmol, 1 eq) de DBCO-NHS com 4.91 mg (0.011 mmol, 1.1 eq) do Composto 2 em DMSO seco. A solução de DMSO foi dissolvida em acetato de etila e então lavada com 1M HCI. A camada orgânica foi removida a vácuo para obter ~ 3 mg de um sólido branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) calculado C41H40N6O2 por 646.31, encontrado 647.3 (m/2)+.
Composto 24
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 236/391
230/314
Figure BR112019020853A2_D0067
[0451]Composto 24, mencionado como DBCO-WWTTWW ou W4TT, foi preparando usando NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2 preparado por síntese de peptídeo de fase sólida. 32,8 mg de NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2 (0.04 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0.5 mL de DMSO seco e 15,5 mg (0.04 mmol, 1 eq) de DBCO-NHS foram adicionados seguido por adição de TEA (0.04 mmol, 1 eq). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. O intermediário DBCO resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 40-70% acetonitrila/H20 (0,05% TFA) durante 16 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. As frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas. Para ativar TT 0 DBCO-peptídeo, 6,1 mg de DBCO-Trp-Trp-Glu-TrpTrp-NH2 (0.005 mmol, 1 eq), 0,68 mg de TT (0.006 mmol, 1.1 eq) e 1,26 mg de EDC (0.007 mmol, 1.3 eq) foram dissolvidos em 0,2 mL de uma solução 1:1 de DMSO e DCM. A uma mistura de reação foi adicionado 0,06 mg de DMAP (0.001 mmol, 0.1 eq) durante agitação vigorosa em temperatura ambiente. Após 2 horas, um adicional de 3.3 equivalentes de TT, 4.0 equivalentes de EDC e 0.1 equivalente de DMAP foram adicionados e a reação foi concluída após um total de 3 horas. The DBCOWWTTWW foi usado como um intermediário em etapas subsequentes.
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231/314
Composto 25
Figure BR112019020853A2_D0068
[0452]Composto 25, mencionado como DBCO-WWPIWW, WW(PI)WW ou PIW4. Primido-indol-Peg4-NH2 (PI-NH2, agonista TLR-4) foi preparado como anteriormente descrito (Lynn GM, et al., In vivo characterization of the physicochemical properties of polymer-linked TLR agonists that enhance vaccine immunogenicity. Nat Biotechnol 33(11 ):1201 -1210, 2015). A 3,6 mg de PINH2 (0.005 mmol, 2 eq) foram adicionados 3,31 mg do Composto 33 (0.0026 mmol, 1 eq) e TEA (0.003 mmol, 1.1 eq) em DMSO e foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O produto resultante foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 45-75% acetonitrila/H20 (0,05% TFA) durante 16 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. As frações resultantes foram
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 238/391
232/314 combinadas, congeladas e liofilizadas. MS (ESI) calculado para C103H107N17O15S m/z
1854.77, encontrado 928.6 (m/2)+.
Composto 26
Figure BR112019020853A2_D0069
[0453]Composto 26, mencionado como Pam2Cys-TT ou P2C-TT, que é um agonista TLR-2/6, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 24, exceto que Fmoc-Pam2Cys-Acid foi usado como 0 material de partida e a reação foi monitorada com TLC (1% metanol em DCM). O procedimento produziu um sólido amarelo em rendimento quantitativo que foi usado como intermediário em etapas de reação subsequentes.
Composto 27
Figure BR112019020853A2_D0070
Figure BR112019020853A2_D0071
233/314
[0454]Composto 27, mencionado como DBCO-WWPam2CysWW, WW(P2C)WW ou P2C(W)4, foi preparado usando Composto 24, PEG2-diamina, e Composto 26 como materiais de partida. Primeiramente, 1,15 mg de Peg2-diamina (0.008 mmol, 3 eq) foi adicionado a uma mistura de reação contendo 3,31 mg de Composto 24 (0.0026 mmol, 1 eq) e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. A mistura de reação foi adicionada à 15 mL de água Dl e centrifugada. A pelota foi coletada e adicionalmente lavada três vezes com água Dl e liofilizada. O intermediário (DBCO-WWPeg2NH2WW) foi absorvido em 0,1 mL de DMSO seco e 2,58 mg de Composto 26 (0.0026 mmol, 1 eq) foram adicionados como uma solução de reserva de 100 mg/mL em DCM. A mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente e então DCM foi removida a vácuo seguido pela adição de 0,2mL de piperidina a 20% em DMF. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente então diluída com DCM e lavada três vezes com água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada. O óleo resultante foi dissolvido em DMSO e purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 70-100% lsopropanol/H20 (0.05% TFA) durante 16 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 9.4x100mm, 5 um. As frações resultantes foram combinadas e evaporadas para fornecer o produto, DBCOWWPam2CysWW. O peso molecular do produto verificado com base no MS (ESI+) por conjugados de antigeno de peptídeo do Composto 27.
Composto 28
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234/314
Figure BR112019020853A2_D0072
[0455]Composto 28, mencionado como NH2-GK(DBCO)GWs, foi sintetizado usando Fmoc-Gly-Lys-Gly-(Trp)5-NH2 preparado por síntese de peptídeo de fase sólida e DBCO-NHS como os materiais de partida. 50 mg de Fmoc-Gly-Lys-Gly(Trp)õ-NH2 (0.04 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,25 mL de DMSO seco. TEA (0.04 mmol, 1 eq) foi adicionado e a solução foi agitada em temperatura ambiente por 5 minutos. 14,24 mg de DBCO-NHS (0.04 mmol, 1 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. A reação foi resfriada bruscamente com amino-2-propanol (0.04 mmol, 1 eq) e 0,5 mL de piperidina a 20% em DMF foi adicionado. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. O produto foi então precipitado a partir de 50 mL de éter e centrifugado a 3000g a 4°C por 10 minutos. O produto foi coletado como uma pelota sólida e então lavado mais duas vezes com éter, seguido por
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235/314 secagem a vácuo. O produto foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 9.4 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas obter a
Figure BR112019020853A2_D0073
Figure BR112019020853A2_D0074
n3
Figure BR112019020853A2_D0075
NH
Figure BR112019020853A2_D0076
[0456]Composto 29, mencionado como CL264-Azide, hidroxiadenina-Azida ou TLR-7-azida, que é um agonista TLR-7, foi sintetizado usando CL264 (Invigogen, San Diego, CA, EUA) e Azido-propil-amina como materiais de partida. 5 mg de CL264 (0.012 mmol, 1 eq) e 6.1 mg de Azido-propil-amina (0.061 mmol, 5 eq) foram dissolvidos em DMF seco. TEA (0.073 mmol, 6 eq) foi adicionado e a solução foi resfriada a 0C com um banho de gelo. 27,6 mg de HATU (0.073 mmol, 6 eq) foi adicionado e a reação foi agitada a 0C por 1 hora. O Composto 29 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 20-40% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 5 minutos e as frações resultantes foram combinadas,
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 242/391
236/314 congeladas e liofilizadas. MS (ESI) calculado para C22H29N11O3 m/z 495.25 encontrado 496.3 (m+H)+.
Composto 30
Figure BR112019020853A2_D0077
Figure BR112019020853A2_D0078
[0457]Composto 30, mencionado como DBCO-GK(CL264)G-Ws, CI264-(W)s ou DBCO-Gly-Lys(DBCO-CL264)-Gly-(Trp)5-NH2 foi sintetizado usando Compostos e 29 como os materiais de partida. 5 mg de Composto 28 (0.0034 mmol, 1 eq)
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237/314 foram dissolvidos em 0,25 mL de DMSO seco e 1,68 mg de Composto 29 (0.0034 mmol, 1 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por 2 horas, seguido pela adição de 1,5 mg de DBCO-NHS (0.0037 mmol, 1.1 eq) e 0.5 eq de TEA. A mistura de reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente e então o produto foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-55% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 9.4 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para obter um sólido branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) calculado para C125H128N28O15 m/z 2261.01 encontrado 1132.2 (m/2)+.
Composto 31
Figure BR112019020853A2_D0079
[0458]Composto 31, mencionado como DMXAA-Azida, que é um agonista STING, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento as Composto 29, exceto que DMXAA (Invivogen) foi usado como 0 material de partida. O Composto 31 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 35-65% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 6 minutos e as frações resultantes foram
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 244/391
238/314 combinadas, congeladas e liofilizadas para espectroscopicamente puro. MS (ESI) calculado obter um solido branco para C20H22N4O3 m/z 366.42 encontrado 365.2.
Composto 32
Figure BR112019020853A2_D0080
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 245/391
239/314
[0459]Composto 32, mencionado como DBCO-GK (DMXAA)-G-Ws, DMXAA(W)5, DMXAA-W5 ou DBCO-Gly-Lys(DBCO-DMXAA)-Gly-(Trp)5-NH2 foi sintetizado usando o mesmo procedimento que o Composto 30, exceto que o Composto 31 foi usado como a carga agonista. O Composto 32 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 45-85% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. MS (ESI) calculado para C123H121N21O15 m/z 2131.94 encontrado 1067.6 (m/2)+.
Composto 33
Figure BR112019020853A2_D0081
NH
Figure BR112019020853A2_D0082
Figure BR112019020853A2_D0083
Figure BR112019020853A2_D0084
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240/314
[0460]Composto 33, mencionado como NH2-GRK(DBCO)GWs, NH2-Gly-ArgLys(DBCO)-Gly-(Trp)5-NH2 foi sintetizado usando o mesmo procedimento que o Composto 28, exceto Fmoc-GRKGWs-NHU que foi produzido por síntese de peptideo de fase sólida, foi usado como o material de partida. O Composto 33 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-55% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 7.5 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas. MS (ESI) calculado para C90H96N20O11 m/z 1633.74 encontrado 817.5 (m/2)+.
Composto 34
Figure BR112019020853A2_D0085
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 247/391
241/314
[0461]Composto 34, mencionado como azida de muramila que é um agonista NOD 2, foi sintetizado usando tri-lisina de muramila (M-TriLys, Invivogen) e ácido Azido propiônico sulfo NHS como materiais de partida. 5 mg de tri-lisina de muramila (0,008 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,5 mL de DMSO seco com TEA (0.02 mmol, 2.5 eq) e 2,2 mg de ácido Azido propiônico sulfo NHS (0.008 mmol, 1 eq) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi resfriada bruscamente com amino-2-propanol (0.008 mmol, 1 eq) e o intermediário foi usado imediatamente para reação.
Composto 35
Figure BR112019020853A2_D0086
242/314
[0462]Composto 35, mencionado como DBCO-GRK(Muramil)GWs, MuramilW5 ou DBCO(Muramil)W5 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento do Composto 30, exceto que os Compostos 33 e 34 foram usados como material de partida. O Composto 35 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 35-65% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 4.6 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas. MS (ESI) calculado para C137H158N30O26 m/z 2639.2 encontrado 1319.5 (m/2)+.
Composto 36
Figure BR112019020853A2_D0087
[0463]Composto 36, mencionado como NH2-GGRK(DBCO)RGGWs, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que
Composto 28, exceto FmocPetição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 249/391
243/314
GGRKRGGW5-NH2, que foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida, foi usado como 0 material de partida. O Composto 36 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x1 OOmm, 5 pm. O produto eluiu a 7.8 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C100H114N26O14 m/z 1902.9, encontrado 951.4 (m/2)+.
Composto 37
Figure BR112019020853A2_D0088
Figure BR112019020853A2_D0089
[0464]Composto 37, mencionado como
DBCO-GGRK(AMP)RGW5 ou
DBCO(AMP)Wõ foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 30, exceto Compostos 36 e monofosfato de adenosina 8-(6-Aminohexil)amino adenosina 5' monofosfato (Sigma-Aldrich) substituído com azido-ácido propiônico
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 250/391
244/314 foram usados como materiais de partida. O Composto 37 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-60% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep C-18, 30x100mm, 5 um. O produto eluiu a 5.2 minutos e as frações resultantes foram combinadas, congeladas e liofilizadas para obter um sólido branco espectroscopicamente puro. MS (ESI) calculado para C138H158N37O24P 2748.2 encontrado 917.5 (m/3)+.
Composto 38
Figure BR112019020853A2_D0090
[0465]Composto 38, mencionado como NH2-GRRK (DBCO)-RGWs, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 28, exceto que FmocGRRKRGW5-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 38 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-55% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x1 OOmrn, 5 pm. O produto eluiu a 5.1 minutos e as frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 251/391
245/314 espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm).
MS (ESI) calculado para
C102H120N28O13 m/z 1944.96, encontrado 973.4 (m/2) +.
Composto 39
Figure BR112019020853A2_D0091
Figure BR112019020853A2_D0092
HN
Figure BR112019020853A2_D0093
Figure BR112019020853A2_D0094
[0466]Composto 39, mencionado como NH2-GK(DBCO)[GGK(DBCO)]2GW5, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 28, exceto que Fmoc-GK(GGK)2GW5-NH2 foi usado como 0 material de partida e três equivalentes
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 252/391
246/314 adicionais de TEA e DBCO-NHS foram usados. O Composto 39 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 45-85% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter o composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C142H146N26O20 m/z 2535.12 encontrado 1269 (m/2)+.
Composto 40
Figure BR112019020853A2_D0095
Figure BR112019020853A2_D0096
[0467]Composto 40, mencionado como NH2-[GRK(DBCO)RG]3-Ws, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento as Composto 39, exceto NH2[GRK(DBCO)RG]3-Wõfoi usado como 0 material de partida. O Composto 40 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 35-65% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para C178H218N50O26 m/z 3471.31, encontrado 695.6 (m/5)+.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 253/391
247/314
Composto 41
Figure BR112019020853A2_D0097
[0468]Composto 41, mencionado como E10-2B3W2, foi sintetizado usando Azido-(Glu)io-NH2 e Composto 6 como os materiais de partida. 5 mg de Azido(Glu) 10-NH2 (0.0035 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em DMSO seco e 6,77 mg de Composto 6 (0.0035 mmol, 1 eq) como uma solução de 40 mg/mL em DMSO seco foram adicionados. A mistura de reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O Composto 41 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 25-45% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 11,8 mg de um pó branco
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 254/391
248/314 espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm) em rendimento quantitativo. MS (ESI) calculado para m/z 3377.31, encontrado 1127 (M/3)+.
Composto 42
Figure BR112019020853A2_D0098
Figure BR112019020853A2_D0099
Figure BR112019020853A2_D0100
[0469]Composto 42, mencionado como K10-2B3W2 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 41, exceto que Azido-(Lys)io-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 42 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 20-40% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm) em rendimento quantitativo. MS (ESI) calculado para m/z 3367.58, encontrado 482 (M/7)+.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 255/391
249/314
Composto 43
Figure BR112019020853A2_D0101
Figure BR112019020853A2_D0102
[0470]Composto 43, mencionado como DBCO-G5-2B3W2-G5-D9 ou DBCO2B3W2(D)9 foi sintetizado usando NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)g-NH2, Composto 6 e DBCO-NHS como materiais de partida. 5 mg de NH2-(Gly)s- Lys(N3)-(Gly)s-(Asp)9NH2 (0.0028 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,1 mL de DMSO seco e 6.56 mg do Composto 6 (0.0034 mmol, 1.2 eq) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. 3,55 mg de DBCO-NHS (0.0084 mmol, 3 eq) foi adicionado seguido por TEA (0.0028 mmol, 1 eq). A mistura de reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. O Composto 43 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-40% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 3.8
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 256/391
250/314 mg (33.7% rendimento) do composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 4008.31, encontrado 1003.3 (m/4)+.
[0471]Composto 44, mencionado como DBCO-G5-2B3W2-G5-D8 ou DBCO2BsW2(D)8 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 43, exceto que NH2-(Gly)5-Lys(Ns)-(Gly)5-(Asp)8-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 44 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 30-40% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 0 composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 3894.52, encontrado 974.6 (m/4)+.
[0472]Composto 45, mencionado como DBCO-G5-2B3W2-G5-D7 ou DBCO2B3W2(D)7 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 43, exceto que NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)7-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 45 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 29-39% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 0 composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 3779.43, encontrado 945.8 (m/4)+.
[0473]Composto 46, mencionado como DBCO-G5-2B3W2-G5-D6 ou DBCO2B3W2(D)6 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 43, exceto que NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)6-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 46 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 29-39% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas,
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 257/391
251/314 congeladas e então liofilizadas para obter o composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 3664.35, encontrado 917.1 (m/4)+.
[0474]Composto 47, mencionado como DBCO-G5-2B3W2-G5-D5 ou DBCO2B3W2(D)5 foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento que 0 Composto 43, exceto que NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)5-NH2 foi usado como 0 material de partida. O Composto 47 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 29-41% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 0 composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 3549.26, encontrado 1184.1 (m/3)+.
Composto 48
[0475]Composto
48, mencionado como DBCO-2B3W2-R6 ou DBCO-
Figure BR112019020853A2_D0103
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 258/391
252/314
2BaW2(R)6 foi sintetizado usando o mesmo procedimento que o Composto 43, exceto que NH2-Lys(N3)-(Arg)e-NH2 foi usado como o material de partida. O Composto 48 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 26-36% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 17.8 mg (51.8% rendimento) do composto título como um pó branco espectroscopicamente puro (> 95% AUC a 254 nm). MS (ESI) calculado para m/z 3338.19, encontrado 478.1 (m/7)+.
Composto 49
Figure BR112019020853A2_D0104
[0476]Composto 49, mencionado como Myr-DBCO ou C14-DBCO foi preparado a partir de cloreto de miristoíla e DBCO-Amina. 50 mg de DBCO-Amina (0.18 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0,5 mL de DCM. TEA (0.22 mmol, 1.2 eq) foi adicionado e a solução foi agitada por 5 minutos em temperatura ambiente. Cloreto de miristoíla (0.16 mmol, 0.9 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. TLC (2.5% metanol em DCM) mostrou um novo ponto com rf de 0.5 por Myr-DBCO. A mistura de reação foi injetada em uma coluna de cromatografia instantânea e purificada usando um gradiente de 0-3% metanol em DCM sobre 12 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer 86 mg de Myr-DBCO em rendimento quantitativo. MS (ESI) calculado para C32H42N2O2 m/z 486.32 encontrado 487.3 (m+H)+.
Composto 50
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 259/391
253/314
Figure BR112019020853A2_D0105
[0477]Composto 50, mencionado como Val-DBCO ou C5-DBCO foi preparado usando o mesmo procedimento descrito para o Composto 49, exceto que cloreto de valeroíla foi usado como o material de partida. Val-DBCO foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 40-60% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30 x 100 mm, 5 pm. As frações resultantes foram coletadas, congeladas e então liofilizadas para obter 80 mg de Val-DBCO em rendimento quantitativo. MS (ESI) calculado para C23H24N2O2 m/z 360.18 encontrado 361.2 (m+H)+.
Composto 51
Figure BR112019020853A2_D0106
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 260/391
254/314
[0478]Composto 51, mencionado como Plm-DBCO ou C16-DBCO foi preparado usando o mesmo procedimento descrito para o Composto 49, exceto que cloreto de palmitoíla foi usado como o material de partida. O Composto 51 foi purificado por cromatografia instantânea usando um gradiente de 0-3% metanol em DCM sobre 12 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer 80 mg de Plm-DBCO em rendimento quantitativo. MS (ESI) calculado para C34H46N2O2 m/z 514.36 encontrado 515.3 (m+H)+.
Composto 52
Figure BR112019020853A2_D0107
[0479]Composto 52, mencionado como Myr-Pegn-DBCO ou C14-PEG11DBCO foi sintetizado usando cloreto de miristoíla, Boc-Pegn-Amina e DBCO-NHS como materiais de partida. 116.06 mg Boc-Pegn-Amina (0.18 mmol, 1 eq) foi dissolvido em 0.5 mL de DCM. TEA (0.22 mmol, 1.2 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 5 minutos em temperatura ambiente. Cloreto de miristoíla foi adicionado e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi diluída com DCM e lavada duas vezes com 1 M HCI e uma vez com Dl água. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada. O intermediário foi dissolvido em 0.35 mL de DCM e 0.15 mL de TFA foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente então seca
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 261/391
255/314 por soprar com ar e adicionalmente seca em vácuo alto. 122,5 mg do óleo (0.162 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0.5 mL de DCM. TEA (0.49 mmol, 3 eq) foi adicionado e a solução foi agitada por 5 minutos em temperatura ambiente. 65.19 mg de DBCO-NHS (0.162 mmol, 1 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. A mistura de reação foi injetada em uma coluna de cromatografia instantânea e purificada usando um gradiente de ΟΙ 5% de metanol em DCM sobre 15 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer Myr-Pegn-DBCO. O peso molecular do produto verificado baseado no MS (ESI+) para conjugados de antígeno de peptídeo de Composto 52.
Composto 53
Figure BR112019020853A2_D0108
[0480]Composto 53, mencionado como Plm-Pegn-DBCO ou C16-PEG11DBCO foi sintetizado usando o mesmo procedimento do Composto 52, exceto que cloreto de palmitoíla foi usado como o material de partida. Plm-Pegn-DBCO foi purificado por cromatografia instantânea usando um gradiente de 0-15% metanol em DCM sobre 15 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer Plm-PegnDBCO. Peso molecular de produto verificado com base no MS (ESI+) para conjugados de antígeno de peptídeo do Composto 53.
Composto 54
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 262/391
256/314
Figure BR112019020853A2_D0109
[0481]Composto 54, mencionado como NH2-Pam2Cys-DBCO, foi sintetizado usando Composto 26 e DBCO-Amina como materiais de partida. 30 mg do Composto 26 (0.03 mmol, 1 eq) foi preparado como uma solução de reserva de 100 mg/mL em DCM. A essa solução de reserva foram adicionados 8,34 mg de DBCOAmina (0.03 mmol, 1 eq) também como uma solução de reserva de 100 mg/mL em DCM. A mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente então injetada em uma coluna de cromatografia instantânea e purificada. O gradiente usado foi um gradiente em etapas de 0-5% metanol em DCM (5CV retenção, 1CV para aumentar a concentração de metanol em 1%). As frações foram coletadas e secas para fornecer o intermediário DBCO. 26 mg de Fmoc-Pam2Cys-DBCO (0.023 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 1 mL de piperidina a 20% em DMF e agitados por 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM e lavada três vezes com água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada. O sólido foi absorvido em 0,5 mL de DCM e injetado em uma coluna de cromatografia instantânea e purificado. O gradiente usado foi um gradiente em etapas a partir de 0-5% metanol em DCM. As frações foram coletadas e secas para fornecer NH2-Pam2Cys-DBCO. O peso molecular do produto verificado com base no MS (ESI+) para conjugados de antígeno de peptídeo do Composto 54.
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 263/391
257/314
Composto 55
Figure BR112019020853A2_D0110
[0482]Composto 55, mencionado como NH2-Pam2Cys-Pegn-DBCO, foi sintetizado usando o Composto 26, Boc-Pegn-Amina, e DBCO NHS como materiais de partida. 60 mg de Composto 26 (0.06 mmol, 1 eq) foi dissolvido em 0.6 mL de DCM. 38.9 mg de Boc-Pegn-Amina (0.06 mmol, 1 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. O DCM foi removido a vácuo e o óleo foi absorvido em DMSO e adicionado a Água Dl. A água foi centrifugado a 3000g por 5 minutos e a pelota foi coletada e seca a vácuo. O intermediário PEGuilado foi dissolvido em 0.35 mL de DCM e 0.15 mL de TFA foi adicionado. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos então soprada seca com ar e adicionalmente seca em alto vácuo. 71,76 mg do óleo desprotegido Boc (0,05 mmol, 1 eq) foi dissolvido em 1 mL de DMSO e TEA (0.1 mmol, 2eq) foi adicionado seguido por 20,3 mg de DBCO-NHS (0.05 mmol, 1 eq). A mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. 0.5 mL de piperidina a 20% em DMF foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM e lavada três vezes com bicarbonato de sódio em pH 9.5. O camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada. O sólido foi absorvido em 0.5 mL de DCM e injetado em uma coluna de cromatografia instantânea e purificado. O gradiente usado foi 0-10% metanol em DCM sobre 30 CVs. Isto forneceu o produto em 6,7%
Petição 870190126945, de 02/12/2019, pág. 264/391
258/314 de rendimento total. Peso molecular de produto verificado com base no MS (ESI+) para conjugados de antigeno de peptídeo do Composto 55.
Composto 56
Figure BR112019020853A2_D0111
[0483]Composto 56, mencionado como Chol-TT, foi preparado usando hemisuccinato de colesterila e TT como materiais de partida. 100 mg de hemisuccinato de colesterila (0.21 mmol, 1 eq), 26,94 mg de TT (0.23 mmol, 1.1 eq), e 51.20 mg de EDC (0.27 mmol, 1.3 eq) foram dissolvidos em 1 mL de DCM. 2.51 mg de DMAP (0.02 mmol, 0.1 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente. Após 1 hora, a mistura de reação amarelo brilhante foi diluída com DCM e lavada duas vezes com DCM e lavada duas vezes com 1 M HCI e uma vez com Água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada para fornecer 120 mg de um sólido amarelo em rendimento quantificado. O peso molecular do produto verificado com base no MS (ESI+) para conjugados de antigeno de peptídeo de Composto 56.
Composto 57
Figure BR112019020853A2_D0112
259/314
[0484]Composto 57, mencionado como Chol-DBCO, foi preparado a partir do Composto 56 e DBCO-Amina. 106.28 mg do Composto 56 (0.18 mmol, 1 eq) e 50 mg de DBCO-Amina (0.18 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0.5 mL de DCM e agitados em temperatura ambiente. Durante o curso de uma hora a cor amarelo brilhante da solução desvaneceu e TLC em DCM indicou ausência completa do Composto 56. A mistura de reação foi injetada em uma coluna de cromatografia instantânea e purificada usando um gradiente de 0-3% metanol em DCM sobre 12 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer 139 mg de Chol-DBCO em rendimento quantitativo. Peso molecular do produto verificado com base no MS (ESI+) para conjugados de antígeno de peptídeo de Composto 57.
Composto 58
Figure BR112019020853A2_D0113
[0485]Composto 58, mencionado como Chol-Pegn-DBCO, foi preparado a partir do Composto 56, Boc-Pegn-amina e DBCO-NHS. 50 mg do Composto 56 (0.085 mmol, 1 eq) foi dissolvido em 0.5 mL de DCM. 60.38 mg de Boc-Pegn-amina (0.09 mmol, 1.1 eq) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura
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260/314 ambiente. Durante o curso de uma hora a cor amarelo brilhante da solução desvaneceu e TLC em DCM mostrou ausência total do Composto 56. A uma mistura de reação foram adicionados 150 uL de TFA para fazer uma solução a 30% em DCM. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente então seca por soprar com ar e adicionalmente seca a vácuo elevado. 86,25 mg do óleo (0.085 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 0.5 mL de DCM. TEA (0.26 mmol, 3 eq) foi adicionado e a solução foi agitada por 5 minutos em temperatura ambiente. 34,26 mg de DBCO-NHS (0.085 mmol, 1 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. A mistura de reação foi injetada em uma coluna de cromatografia instantânea e purificada usando um gradiente de 0-15% metanol em DCM sobre 15 CVs. As frações foram coletadas e secas para fornecer Chol-Pegn-DBCO.
Composto 59
[0486]Composto 59, mencionado como LA-TT, foi sintetizado usando ácido levulínico e TT como os materiais de partida. 500 mg de ácido levulínico (4.3 mmol, 1 eq), 564.7 mg de TT (4.7 mmol, 1.1 eq), e 1,032 g de EDC (5.4 mmol, 1.3 eq) foram dissolvidos em 10 mL de DMSO seco. 52,6 mg de DMAP (0.4 mmol, 0.1 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. O Composto 59 foi elaborado por diluir em Acetato de etila e lavar duas vezes com 1 M HCI e uma vez com Água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e removida a vácuo. O sólido foi recristalizado a partir de Acetato de etila. MS (ESI) calculado para C8H11NO2S2, m/z, 217.02, encontrado 218 (M+H)+.
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261/314
Composto 60
Figure BR112019020853A2_D0114
[0487]Composto 60, mencionado como LA-2BXy, foi sintetizado usando o Composto 59 e o Composto 2 como materiais de partida. 50 mg do Composto 59 (0.23 mmol, 1 eq) e 82,62 mg do Composto 2 (0.23 mmol, 1 eq) foram dissolvidos em 1 mL de DMSO. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. TLC (35% acetato de etila em hexano) mostrou desaparecimento dos dois materiais de partida. O Composto 60 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 15-30% acetonitrila/H20 (0,05% TFA) sobre 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100 mm, 5 pm. MS (ESI) calculado para C27H31N5O2, m/z, 457.25, encontrado 458.3 (M+H)+.
Composto 61
Figure BR112019020853A2_D0115
[0488]Composto 61, mencionado como CTA-TT, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento do Composto 59, exceto que 4-Ciano-4-(tiobenzoiltio)ácido
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262/314 pentanóico (CTA) foi usado como o material de partida e DCM foi usado como o solvente. O Composto 61 foi elaborado por diluir em DCM e lavar duas vezes com 1 M HCI e uma vez com Água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e removida a vácuo. O sólido foi recristalizado a partir de Acetato de etila. MS (ESI) calculado para C16H16N2OS4, m/z, 380.01, encontrado 381.1 (M+H)+.
Composto 62
Figure BR112019020853A2_D0116
[0489]Composto 62, mencionado como CTA-DBCO, foi sintetizado a partir de “CTA-NHS” éster de (4-Ciano-4-(fenilcarbonotioíltio)ácido pentanóico Nsuccinimidil, Sigma-Aldrich) e DBCO-Amina (Click Chemistry Tools). 210 mg de CTA-NHS (0.56 mmol, 1 eq) e 167.8 mg de DBCO-Amina (0.61 mmol, 1.1 eq) foram dissolvidos em 2 mL de DMSO seco e agitados em temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi diluída com DCM e lavada duas vezes com 1M HCI e uma vez com Água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e evaporada. O Composto 62 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 50-70% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100 mm, 5 pm. MS (ESI) calculado para C31H27N3O2S2 m/z 537.7, encontrado 538.2 (M+H)+.
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263/314
Composto 63
Figure BR112019020853A2_D0117
[0490]Composto 63, mencionado como CTA-2BXY, foi sintetizado usando o mesmo procedimento do Composto 60, exceto que o Composto 61 e o Composto 2 foram usados como materiais de partida. O Composto 63 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 40-50% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 12 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x100 mm, 5 pm. MS (ESI) calculado para C35H36N6OS2 m/z 620.83, encontrado 621.2 (M+H)+.
Composto 64
Figure BR112019020853A2_D0118
Figure BR112019020853A2_D0119
[0491]Composto 66, mencionado como ACVA-TT, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento do Composto 59, exceto que 4,4’-Azobis(4-ácido cianovalérico) foi usado como 0 material de partida e os equivalentes de TT, EDC, e DMAP foram dobrados para refletir uma duplicação de sítios ativos. O Composto 66 foi elaborado por diluir em Acetato de etila e lavar duas vezes com 1 M HCI e uma vez com Água Dl. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e removida a
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264/314 vácuo. O sólido foi recristalizado a partir de
DCM:Éter. MS (ESI) calculado para
C18H22N6O2S4, m/z, 482.65, encontrado 483.1 (M+H)+.
Composto 65
Figure BR112019020853A2_D0120
[0492]Composto 65, mencionado como ACVA-2BXy, foi sintetizado usando 0 mesmo procedimento do Composto 60, exceto que 0 Composto 64 foi usado como 0 material de partida e os equivalentes do Composto 2 foram dobrados para refletir uma duplicação de sítios ativos. O Composto 65 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 28-48% acetonitrila/H20 (0.05% TFA) durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 50x100 mm, 5 pm. MS (ESI) calculado para C56H62N14O2 m/z 963.21, encontrado 482.4 (M/2)+.
Composto 66
Figure BR112019020853A2_D0121
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265/314
[0493]Composto 66, mencionado como ACVA-DBCO, foi sintetizado usando o mesmo procedimento do Composto 60, exceto que o Composto 64 e DBCO-Amina (Click Chemistry Tools) foram usados como os materiais de partida. O Composto 66 foi purificado por cromatografia instantânea usando um gradiente de 0-3% metanol em DCM sobre 15 CVs. MS (ESI) calculado para C48H44N8O4 m/z 796.93, encontrado 797.3 (M+H)+.
[0494]Composto 67
O
Figure BR112019020853A2_D0122
[0495]Composto 67, mencionado como Azp-2BXY, foi sintetizado a partir de 5-Azido-ácido pentanóico (Azp) e Composto 2. 16.2 mg de Azp (0.114 mmol, 1.1 eq), 12.3 mg de TT (0.103 mmol, 1 eq) e 27.2 mg de EDC (0.142 mmol, 1.3 eq) foram dissolvidos em 0.5 mL de DMSO seco. 1,4 mg de DMAP foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. 37,09 mg de Composto 2 (0.103 mmol, 1 eq) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. O Composto 67 foi purificado em um sistema HPLC preparatório usando um gradiente de 22-42% acetonitrila/H20 (0.05% TFA)
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266/314 durante 10 minutos em uma coluna Agilent Prep-C18, 30x100 mm, 5 pm. MS (ESI) calculado para C27H32N8O m/z 484.27, encontrado 485.3 (M+H)+.
Composto 68
CN
I
HgC--ΟΙ
CH3
Figure BR112019020853A2_D0123
[0496]Composto 68 também mencionado como (HPMA-2B)-b-(HPMA)DBCO ou p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO. O copolímero di-bloco de formação de micela (tipo A-B) foi produzido por polimerização RAFT em duas etapas sintéticas usando os precursores HPMA e MA-b-Ala-TT preparados como anteriormente descrito (vide: Lynn GM, et al. Nat Biotechnol 33(11):1201-1210, 2015), bem como 2-Ciano-2-propil benzoditioato (“CTA-ABIN,” Sigma Aldrich) Azobisisobutironitrila (“AIBN, Sigma Aldrich), Composto 1 e Composto 66. O bloco hidrofóbico A foi preparado por copolimerizar HPMA com MA-b-Ala-TT usando 0 CTA-AIBN como um agente de transferência de cadeia e AIBN como um iniciador a 70°C por 16 h em uma mistura de álcool de terc-butila / DMSO. O bloco hidrofóbico B foi subsequentemente submetido a uma polimerização de extensão de cadeia através do mecanismo RAFT por adicionar HPMA na presença de AIBN a
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70°C por um período adicional de 16 horas. O copolímero di-bloco A-B, p{[HPMA)co-(MA-b-TT)]-b-p(HPMA)}-DTB foi isolado por precipitação para fornecer um sólido verde. O grupo DTB em uma extremidade do copolímero foi substituído por reagir com o Composto 66 a 80°C por 2 horas em DMSO, seguido pela adição do Composto 1. O produto foi precipitado e então purificado por LH-20 para fornecer o Composto 68, que foi então usado para reação com antígenos de peptídeo para fornecer tipos diferentes de conjugados de antígeno de peptídeo, por exemplo, p{[(HPMA)CO-(MA-b-Ala2B)]-b“p(HPMA)}-DBCO-(antígeno de peptídeo) que são totalmente descritos abaixo.
Composto 69
Figure BR112019020853A2_D0124
[0497]Composto 69 também mencionado como (HPMA-NHNH-2BXy)-b(HPMA)-DBCO ou p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN-CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO. O copolímero di-bloco de formação de micela (tipo A-B) foi produzido por polimerização RAFT em duas etapas sintéticas usando os precursores HPMA e MAAcap-NHNH-Boc preparados como anteriormente descrito (vide: Lynn GM, et al. Nat Biotechnol 33(11):1201-1210, 2015), bem como 2-Ciano-2-propil benzoditioato (“CTA-ABIN,” Sigma Aldrich) Azobisisobutironitrila (“AIBN, Sigma Aldrich), Composto 60 e Composto 66. O bloco hidrofóbico A foi preparado por copolimerizar HPMA com
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MA-Acap-NHNH-Boc usando o CTA-AIBN como um agente de transferência de cadeia e AIBN como um iniciador a 70°C por 16 h em uma mistura de álcool tercbutila / DMSO. O bloco hidrofóbico B foi subsequentemente submetido a uma polimerização de extensão de cadeia através do mecanismo RAFT por adicionar HPMA na presença de AIBN a 70°C por um período adicional de 16 horas. O copolímero di-bloco A-B, p p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN=CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}DTB foi isolado por precipitação e então desprotegido por Boc em ácido trifluoroacético a 30% TFA/DCM. O TFA/DCM foi removido a vácuo e então grupo DTB em uma extremidade do copolímero foi substituído por reagir com o Composto 66 a 80°C por 2 horas em DMSO, seguido pela adição do Composto 60. O produto foi precipitado e então purificado por LH-20 para fornecer o Composto 69, que foi então usado por reações com antígenos de peptídeo para fornecer tipos diferentes de conjugados de antigeno de peptídeo, por exemplo, p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(antígeno de peptídeo) que são totalmente descritos abaixo.
Composto 70
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269/314
Figure BR112019020853A2_D0125
Composto 70 também mencionado como (DEGMA-2B)-b-(HPMA)-DBCO ou p{[(DEGMA)-co-(MAb-Ala2B)]-bp(HPMA)}-DBCO. O copolímero di-bloco de formação de micela responsive à temperatura (tipo A-B) foi produzido por polimerização RAFT em duas etapas sintéticas usando os precursores DEGMA, HPMA e MA-b-Ala-TT preparados como anteriormente descrito (vide: Lynn GM, etal. Nat Biotechnol 33(11):1201-1210, 2015), bem como 2-ciano-2-propil benzoditioato (“CTA-ABIN,” Sigma Aldrich) Azobisisobutironitrila (“AIBN, Sigma Aldrich), Composto 1 e Composto 66. O bloco hidrofóbico responsivo à temperatura A foi preparado por copolimerizar DEGMA com MA-b-Ala-TT usando o CTA-AIBN como um agente de transferência de cadeia e AIBN como um iniciador a 70°C por 16 h em uma mistura de álcool terc-butila / DMSO. O bloco hidrofóbico B oi subsequentemente submetido a uma polimerização de extensão de cadeia através do mecanismo RAFT por adicionar HPMA na presença de AIBN a 70°C por um período adicional de 16 horas. O copolímero di-bloco A-B, p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala2B)]-bp(HPMA)}DTB foi isolado por precipitação para fornecer um sólido verde. O grupo DTB em uma
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270/314 extremidade do copolímero foi substituído por reagir com Composto 66 a 80°C por 2 horas em DMSO, seguido pela adição do Composto 1. O produto foi precipitado e então purificado por LH-20 para fornecer o Composto 70, que foi então usado por reação com antígenos de peptídeo para fornecer tipos diferentes de conjugados de antígeno de peptídeo, por exemplo, p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}DBCO-íantígeno de peptídeo) que são totalmente descritos abaixo.
Composto 71
Figure BR112019020853A2_D0126
Figure BR112019020853A2_D0127
[0498]Composto 71 também mencionado como (DEGMA-2BXy)-b-(HPMA)DBCO ou p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO foi preparado usando o mesmo procedimento do Composto 70, exceto que o composto 2 foi usado como o Ligando. O produto foi precipitado e então purificado por LH-20 para fornecer o Composto 68, que foi então usado por reação com antígenos de peptídeo para formar tipos diferentes de conjugados de antígeno de peptídeo, por exemplo,
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271/314 p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(antígeno de peptídeo) que são totalmente descritos abaixo.
Composto 72
Figure BR112019020853A2_D0128
[0499]Composto 72 também mencionado como 2BXy-DEGMA-b-HPMADBCO. O copolímero di-bloco de formação de micela (tipo A-B) foi produzido por polimerização RAFT em duas etapas sintéticas usando os precursores DEGMA, HPMA, Composto 63, Composto 65 e Composto 66. O bloco hidrofóbico A foi preparado por copolimerizar DEGMA usando o Composto 63 como um agente de transferência de cadeia e o Composto 65 como um iniciador a 70°C por 16 h em uma mistura de álcool terc-butila / DMSO. O bloco hidrofóbico B foi subsequentemente submetido a uma polimerização de extensão de cadeia através do mecanismo RAFT por adicionar HPMA na presença de AIB a 70°C por um período adicional de 16 horas. O copolímero di-bloco A-B, 2BXy-[p(DEGMA)-bp(HPMA)]-DTB foi isolado por precipitação e o grupo DTB em uma extremidade do copolímero foi substituído por reagir com o Composto 66 a 80°C por 2 horas em DMSO. O produto foi precipitado e então purificado por LH-20 para fornecer o Composto 72 que foi então usado para reação com antígenos de peptídeo para fornecer tipos diferentes de conjugados de antígeno de peptídeo, por exemplo, 2BXy-p[(DEGMA)-b-p(HPMA)]-DBCO-(antígeno de peptídeo) que são totalmente descritos abaixo.
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Exemplo 2: Reação de um fragmento de antigeno de peptídeo e uma molécula hidrofóbica (H) para produzir um conjugado de antigeno de peptídeo
[0500]Um fragmento de antigeno de peptídeo compreendido de um antigeno de peptídeo (A), molécula carregada opcional (C), extensões opcionais (B1 e/ou B2) e precursor de ligador X1, por exemplo, [C]-[B1 ]-A-[B2]-X1, onde [ ] indica que o grupo é opcional nesse exemplo, pode ser reagido com X2 ligado a uma molécula hidrofóbica (H), por exemplo, X2-H, para fornecer um conjugado de antigeno de peptídeo, por exemplo, [C]-[B1]-A-[B2]-L-H. Em que um fragmento de antigeno de peptídeo compreende um precursor de ligador X1 compreendendo uma azida, por exemplo, azido-lisina (Lys(N3)) às vezes mencionado como K’, o fragmento de antigeno de peptídeo pode ser reagido com um precursor de ligador X2 compreendendo um alkyne, e como DBCO, que é ligado a uma molécula hidrofóbica (H) para formar um Ligador de triazol (L). Como exemplos não limitadores, os Compostos 3 a 5 são exemplos de moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula ‘ contendo um precursor de ligador de DBCO X2 que são adicionalmente ligadas a adjuvantes da fórmula III (isto é, TLR07/8a); os compostos 6 a 11 são exemplos de moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula I contendo um precursor de ligador de DBCO X2 que são adicionalmente ligadas a adjuvantes da fórmula III (isto é, TLR-7/8a); e Compostos 10 a 11 são exemplos de moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula II contendo um precursor de ligador de DBCO X2, porém não contêm um Ligando com propriedades adjuvantes.
[0501 ]Um exemplo não limitador mostrado na figura 2 é a reação de uma molécula hidrofóbica (H) ligada a um precursor de ligador X2 compreendendo um DBCO que é reagido em uma razão molar de 1.1 para 1 com um fragmento de antigeno de peptídeo compreendendo um precursor de ligador contendo azida X1. Como indicado no cromatograma HPLC, o DBCO na molécula hidrofóbica (H) reage com um precursor de ligador X1 compreendendo uma azida, resultando em um
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Ligador de triazol (L) que é ligado a uma extensão B2 que liga a um antígeno de peptídeo (A) que é ligado a uma extensão B1 que é ligada a uma molécula carregada (C), desse modo unindo o antígeno de peptídeo (A) e molécula hidrofóbica (H) para fornecer um conjugado de antígeno de peptídeo. Centenas de exemplos de conjugados de antígeno de peptídeo diferentes formados pela reação de um fragmento de antígeno de peptídeo contendo azida com uma molécula hidrofóbica contendo DBCO (H) são descritos do início ao fim. Como a reação da azida e DBCO é confiável e compatível através de todos os conjugados de antígeno de peptídeo produzidos, uma descrição completa da reação usada para formar os conjugados bem como sua caracterização não é fornecida. Observação: que o peso molecular dos conjugados de antígeno de peptídeo se originam da cicloadição é a soma da massa dos materiais de partida.
[0502]Em que um fragmento de antígeno de peptídeo compreende um precursor de ligador X1 compreendendo um tiol, por exemplo, cisteína (Cys) às vezes mencionado como C, o fragmento de antígeno de peptídeo pode ser reagido com uma molécula hidrofóbica (H) contendo um precursor de ligador X2 compreendendo uma maleimida, por exemplo, Composto 21, que resulta em um Ligador baseado em tio-éter (L). Em que um fragmento de antígeno de peptídeo compreende um precursor de ligador X1 compreendendo uma amina, por exemplo, Lisina (Lys) às vezes mencionada como K, o fragmento de antígeno de peptídeo pode ser reagido com uma molécula hidrofóbica (H) contendo um precursor de ligador X2 compreendendo um éster ativado, como um NHS, por exemplo, Composto 22, que resulta na formação de uma ligação de amida.
[0503]Estudos anteriores reportaram o fornecimento de epítopos de célula T como peptídeos “longos” sintéticos com -20-40 aminoácidos (SLPs ou LP) combinados com vários adjuvantes de vacina como meio para induzir respostas de célula T CD8. Entretanto, o impacto de comprimento de peptídeo e comportamento
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274/314 hidrodinâmico, bem como fornecimento em conjunto do peptídeo com imunoestimulantes, como TLRa, sobre a imunogenicidade não foram adequadamente estudados. Para fornecer insights maiores sobre como parâmetros diferentes de antigenos baseados em peptídeo impactam imunidade de célula T, os requerentes avaliaram sistematicamente como propriedades diferentes dos conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula IV descrita aqui impactam as respostas de célula T CD4 e CD8 in vivo.
Impacto de comportamento hidrodinâmico de antigeno de peptídeo, comprimento de antigeno de peptídeo (A) e fornecimento em conjunto de um TLR7/8a sobre respostas de célula T CD8
[0504]Não foi claro a priori como o comprimento do antigeno de peptídeo (A) fornecido como conjugados de antigeno de peptídeo da presente revelação impactaria a imunogenicidade, especificamente, a magnitude e qualidade da resposta de célula T CD8 e/ou CD4 gerada.
[0505]Para investigar sistematicamente como o comprimento do antigeno de peptídeo (A) impacta a imunogenicidade de conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula IV, dois epítopos de célula T CD8 de neoantígeno modelo, Irgq e Cpnel, derivados do modelo de tumor de murino, MC38, foram produzidos como conjugados de antigeno de peptídeo, em que os antigenos de peptídeo (A) eram o peptídeo longo sintético de 26 aminoácidos (SLPs ou “LP”) ou o epítopo mínimo de 10 aminoácidos (ME ou “Min”) (figura 4). Os antigenos de peptídeo baseados em SLP (A) foram ligados no C-terminal a um precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que foi ligado a um precursor de ligador X2, DBCO, que era ligado ao N-terminal de uma molécula hidrofóbica (H); ao passo que os antigenos de peptídeo de epítopo mínimo (A) eram ligados a uma extensão C-terminal (B2) que era ligada a um precursor de ligador X2, DBCO, que era ligado ao N-terminal de uma molécula hidrofóbica (H) para gerar conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula IV
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275/314 resumida na figura 4.
[0506]0 esquema geral para a síntese dos conjugados de antígeno de peptídeo foi reagir 1.0 equivalente do fragmento de antígeno de peptídeo contendo uma azida reativa com 1.2 equivalentes da molécula hidrofóbica contendo DBCO (H) em DMSO em temperatura ambiente. A reação foi concluída após 24 horas e não exigiu purificação adicional.
[0507]0s requerentes primeiramente avaliariam o comportamento hidrodinâmico dos antígenos de peptídeo (A) e conjugados de antígeno de peptídeo (figura 4). Notavelmente, verificou-se que os antígenos de peptídeo (A) compreendendo os epítopos mínimos (Mins) e LPs tanto de Irgq como Cpnel são solúveis em água até 0,1 mg/mL, entretanto, a fixação dos antígenos de peptídeo (A) a qualquer uma das duas moléculas hidrofóbicas (H), W3 ou 2BXya, levou aos conjugados de antígeno de peptídeo resultantes sendo submetidos á formação de partícula, com a exceção do conjugado de antígeno de peptídeo que fornece 0 antígeno de peptídeo (A) compreendendo 0 LP de Cpnel fixado em W3. Esses resultados indicam que conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV induzem formação de partícula de peptídeos solúveis em água e que 0 aumento do comprimento da molécula hidrofóbica (H) ou uso de mais monômeros hidrofóbicos (por exemplo, Glu(2BXy) versus Triptofano) melhora a confiabilidade de formação de partícula.
[0508]Por conseguinte, verificou-se inesperadamente que uma maioria dos conjugados de antígeno de peptídeo testados formaram partículas quando a molécula hidrofóbica (H) da fórmula I era compreendida de 5 ou mais unidades de monômero ligadas a adjuvantes da fórmula III, enquanto moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula I ou II com menos de 5 unidades de monômero, como 1 ou 3 unidades de monômero, induziram menos confiavelmente a formação de partículas. Com base nesses dados, modalidades preferidas das moléculas hidrofóbicas (H) usadas em
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276/314 conjugados de antígeno de peptideo são compreendidas de 5 ou mais unidades de monômero para assegurar formação de partícula de antigenos de peptideo altamente hidrofílicos e/ou carregados (A). Embora, em algumas modalidades, a molécula hidrofóbica (H) possa ter 3 ou mais unidades de monômero, como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou mais unidades de monômero, tipicamente até aproximadamente 300 unidades de monômero em comprimento.
[0509]0s requerentes avaliaram a seguir como o comportamento hidrodinâmico do conjugado de antígeno de peptideo, bem como o comprimento de antígeno de peptideo (A) e fornecimento em conjunto de um adjuvante TLR-7/8a compreendendo o conjugado de antígeno de peptideo impacta a imunogenicidade in vivo. Conjugados de antígeno de peptideo que fornecem antigenos de peptideo (A) compreendidos de peptideos com 26 aminoácidos de comprimento (LP) ou epítopos mínimos com 10 aminoácidos (Mins) foram misturados com a molécula pequena TLR-7/8a, Composto 2, mencionada como 2BXy; ligados à molécula hidrofóbica (H), W3, e misturados com 2BXy; ou os antigenos de peptideo (A) foram ligados à molécula hidrofóbica (H), 2BXy, que forma partículas e assegura fornecimento em conjunto do antígeno de peptideo (A) com 0 adjuvante TLR-7/8a (vide as figuras 46). Os camundongos imunizados com os conjugados de antígeno de peptideo que fornecem antigenos de peptideo (A) compreendidos de epítopos mínimos ligados à molécula hidrofóbica (H), 2BXys, forneceram as respostas de célula T CD8 de maior magnitude (>1% IFNg+ células T CD8 do total) após uma única imunização, indicando que 0 fornecimento em conjunto do epítopo mínimo com 0 TLR-7/8a em um formato de partícula é uma abordagem eficiente para eliciar respostas de célula T CD8. Notavelmente, 0 epítopo mínimo solúvel e LP solúvel misturado com TLR7/8a induziram as respostas de célula T CD8 mais baixas que não foram estatisticamente significativas em comparação com os grupos naive, indicando que a forma solúvel do antígeno de peptideo (A) é 0 menos imunogênico (figuras 5 e 6).
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Finalmente, embora os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendidos de epítopos mínimos de Irgq ou LP de Irgq ligado à molécula hidrofóbica (H), 2BXya, fornecessem magnitude comparável de respostas de célula T CD8, os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígeno de peptídeo (A) compreendidos do epítopo mínimo Cpnel induziram respostas de célula T CD8 quase 10 vezes mais altas em comparação com conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem Cpnel como o LP.
[0510]Para investigar adicionalmente o papel do comprimento do antígeno de peptídeo (A) sobre a imunogenicidade para promover imunidade de célula T CD4 e CD8 para conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV, 7 epítopos de célula T CD8 mínimos previstos (isto é, neoantígenos previstos), derivados do modelo de tumor de murino, B16, foram fornecidos como peptídeos longos sintéticos com 27 aminoácidos (LPs) ou epítopos mínimos com 10 aminoácidos (mencionados como ME ou Min) como antígenos de peptídeo (A) compreendendo os conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula (IV) (vide a figura 7). Os antígenos de peptídeo baseados em LP (A) foram ligados diretamente no C-terminal a um precursor de ligador X1, azido-lisina (K’) que era ligado a um precursor de ligador X2, DBCO, que era ligado ao N-terminal de uma molécula hidrofóbica (H); ao passo que os antígenos de peptídeo de epítopo mínimos (A) eram ligados a uma extensão de Cterminal (B2) que era ligada a um precursor de ligador X2, DBCO, que era ligado ao N-terminal de uma molécula hidrofóbica (H) para gerar conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV resumida na figura 7. Os antígenos de peptídeo (A) eram ligados a moléculas hidrofóbicas (H) 2BXys ou 2Bs para formar conjugados de antígeno de peptídeo. Comparando 2BXys com 2Bs, que são estruturalmente similares porém diferem em termos de potência para TLR-7, permitiu a avaliação de como a inflamação impacta imunogenicidade. Os camundongos foram imunizados com composições imunogênicas compreendidas de conjugados de antígeno de
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278/314 peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) como os epítopos mínimos (Mins), os LPs ou ambos os epítopos mínimos e os LPs. A magnitude de respostas de célula T CD4 e CD8 foi avaliada 2 semanas após 2 imunizações (figura 8).
[0511]Uma descoberta surpreendente e inesperada foi que os camundongos que receberam os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendendo epítopos mínimos (“Min”) induziram as respostas de célula T CD8 de magnitude mais alta, ao passo que os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendendo os LPs induziram as respostas de célula T CD8 de nível mais baixo. Essa tendência foi evidente para ambas as moléculas hidrofóbicas (H), 2BXys e 2Bs. Por conseguinte, para os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem o antígeno de peptídeo (A) compreendendo o LP ligado à molécula hidrofóbica (H), 2BXys e 2Bs as respostas de célula T CD8 foram -0,35% e as respostas de célula T CD4 foram -0,25% (figura 8). Em contraste, para o grupo de camundongos que recebeu os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem o antígeno de peptídeo (A) compreendendo o epitopo mínimo ligado à molécula hidrofóbica, 2BXys as respostas de célula T CD8 eram -1,9% e as respostas de célula T CD4 eram -0,1%, fornecendo aproximadamente um aumento de 6 vezes em respostas de célula T CD8 em relação aos conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem o LP, porém não detectável em respostas de célula T CD4. No grupo de camundongos que recebeu os conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendendo tanto o epitopo mínimo como LP (“LP + min”), as respostas de célula T CD8 foram -0,8% e as respostas de célula T CD4 forma -0,5%, fornecendo um equilíbrio de ambas as células T CD4 e CD8 (figura 8).
[0512]Uma tendência similar foi observada para os conjugados de antígeno de peptídeo usando a molécula hidrofóbica 2Bs (H), que inclui o agonista TLR-7/8 menos potente, 2B, em comparação com a molécula hidrofóbica (H), 2BXys, que
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279/314 inclui 2BXy. Por conseguinte, no grupo que recebeu conjugados de antigeno de peptídeo que incluiu a molécula hidrofóbica 2Bs (H) e antígenos de peptídeo (A) compreendendo LP, havia respostas de célula T CD8 detectadas em -1,0% e respostas de célula T CD4 em -0,75%, ao passo que no grupo que recebeu conjugados de antigeno de peptídeo fornecendo antígenos de peptídeo (A) compreendendo Min sozinho, houve respostas de célula T CD8 em ~4,5% e respostas de célula T CD4 em -0,1%, um aumento de quase 4 vezes em respostas de célula T CD8 porém não detectável em respostas de célula T CD4. No grupo que recebeu uma vacina que compreendida conjugados de antigeno de peptídeo fornecendo antígenos de peptídeo (A) compreendendo o epítopo mínimo e LP ligado à molécula hidrofóbica (H), 2Bs, as respostas de célula T CD8 foram -2,2% e as respostas de célula T CD4 foram -0,95% (figura 8).
[0513]Em resumo, o uso do ME (u “Min”) como o antigeno de peptídeo (A) dos conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula IV levou a um aumento inesperado e acentuado na resposta de célula T CD8 em comparação com o antigeno de peptídeo (A) compreendendo o LP. Entretanto, isso também levou a uma redução nas respostas de célula T CD4. De modo importante, a inclusão de conjugados de antigeno de peptídeo que fornecem o LP e Min como antígenos de peptídeo (A) em composições imunogênicas administradas aos camundongos levou a uma recuperação da resposta de célula T CD4 e uma resposta de célula T CD8 inesperadamente mais alta em comparação com conjugados de antigeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) compreendidos de LP sozinho. Outra descoberta importante foi que a quantidade de inflamação teve um impacto acentuado sobre a imunogenicidade. A molécula hidrofóbica (H), 2Bs, contém o TLR7/8a, composto 1, que é quase 10 vezes menos potente do que o composto 2, 2BXy, fornecido na molécula hidrofóbica (H), 2BXys. Portanto, o aumento de quase 3 a 4 vezes em respostas de célula T CD4 e CD8 para conjugados de antigeno de
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280/314 peptídeo compreendendo a molécula hidrofóbica (H), 2Bs, em comparação com aqueles usando 2BXys, sugerem que a moderação da quantidade de inflamação através da modulação de potência de adjuvante pode ser preferida para obter o nível ótimo de imunogenicidade para conjugados de antígeno de peptídeo da presente revelação. Realmente, em uma triagem da imunogenicidade de 40 neoantígenos baseados em peptídeo diferentes derivados de linhagem de célula de tumor de murino NC38, vacinas personalizadas contra câncer com base em conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeos (A) compreendidos de epítopos mínimos ligados à molécula hidrofóbica (H), 2Bs, levaram a uma melhora de 6 vezes na variedade de respostas de célula T CD8 obtidas em comparação com conjugados de antígeno de peptídeo compreendidos de epítopos mínimos ligados à molécula hidrofóbica (H), 2BXys (figura 9).
[0514]Uma descoberta inesperada adicional relacionada a estudos que buscam identificar o meio ótimo de dosar múltiplos epítopos de células T diferentes como conjugados de antígeno de peptídeo. Estudos anteriores sugeriram que a dosagem de múltiplos epítopos de células T no mesmo local que ligam a mesma molécula MHC podem competir por ligar a moléculas MHC em APCs e que isso pode resultar em competição para apresentação a células T, desse modo diminuindo a magnitude de respostas de célula T a epítopos fornecidos juntos, em comparação com epítopos fornecidos individualmente como um epítopo único por local de imunização. Embora os requerentes observassem que a administração de composições imunogênicas incluindo conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo um epítopo único a camundongos resultassem em uma resposta de célula T de magnitude mais alta contra aquele epítopo, em comparação com a administração conjunta do mesmo epítopo com 3 conjugados de antígenos de peptídeo diferentes compreendendo epítopos diferentes que ligam todos a mesma molécula MHC em 1 ou 4 locais (figura 10), uma descoberta inesperada que foi o
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281/314 fornecimento daqueles mesmos 4 epítopos em 4 locais separados (isto é, 1 epítopo exclusivo por local) no mesmo animal levou a respostas mais baixas do que o fornecimento de todos os 4 epítopos juntos em 4 locais (figura 10). Isso foi inesperado e paradoxal para o paradigma atual, que sugeriría que é melhor dosar múltiplos epítopos em locais distintos para evitar competição entre epítopos, ao invés de fornecer múltiplos epítopos juntos em múltiplos locais. Esses dados sugerem um novo paradigma para fornecer múltiplos epítopos diferentes com base em maximizar o número de locais onde cada epítopo é administrado. Portanto, em modalidades preferidas de induzir uma resposta imune, composições imunogênicas compreendendo múltiplos antígenos de peptídeo diferentes (A) são dosados em múltiplos locais para maximizar a resposta imune.
Exemplo 3: Conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V
[0515]Os dados anteriores demonstram como os parâmetros de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV impactam a imunogenicidade. Esses dados mostram que conjugados de antígeno de peptídeo que asseguram o fornecimento conjunto de antígenos de peptídeo (A) com TLR-7/8a em partículas é uma modalidade preferida para induzir imunidade de célula T CD8. Uma limitação de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula IV é que as partículas formadas por essa abordagem possam ter tamanho e estabilidade variáveis devido à variabilidade na composição dos antígenos de peptídeo (A) ligados às moléculas hidrofóbicas (H). Um meio possível de estabilizar as partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo é por introduzir carga de superfície que evita agregação de partícula e estabiliza as partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo em meios aquosos.
[0516]Conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V permitem que partículas estáveis de um tamanho definido sejam formadas por anexar uma molécula carregada (C) a um antígeno de peptídeo (A) que é ligado a uma molécula
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282/314 hidrofóbica (H) (figura 11). Entretanto, conjugar diretamente uma molécula carregada (C) e/ou uma molécula hidrofóbica (H) imediatamente adjacente a um antigeno de peptídeo (A) pode causar interferência no processamento e evitar maquinaria do APC que permite apresentação de epítopos mínimos no contexto de MHC-I e MHC-II. Desse modo, para assegurar processamento eficiente de antigenos de peptídeo (A) com base em epítopos mínimos (Mins) ou LPs fornecidos usando conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V, os requerentes avaliaram o uso de extensões degradáveis de enzima (B1 e B2) ligando o antigeno de peptídeo (A) à molécula carregada (C) e molécula hidrofóbica (H) no N- e C-terminais, respectivamente (figura 11).
[0517]Para avaliar o impacto das extensões (B1 e B2) sobre o processamento de epítopos de célula T CD8 mínimos a partir de conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V, os requerentes sintetizaram uma série de peptídeos em que uma molécula carregada (C) foi ligada a uma extensão opcional (B1) no N-terminal de um epítopo mínimo, Cpnel, que foi ligado a uma extensão opcional (B2) no C-terminal a um precursor de ligador X1 (Lys(N3)) e avaliaram como a molécula carregada (C) e extensões (B1 e/ou B2) impactaram a potência in vitro dos antigenos de peptídeo (A) para ativar células T CD8 específicas de Cpnel. Como mostrado na figura 12, sequências de peptídeo foram preparadas usando extensões cliváveis por catepsina, ou extensões imuno-proteassomal e clivável por catepsina, em qualquer um ou ambos dos N- e C-terminais (B1 e/ou B) dos epítopos mínimos. Essas sequências de antigeno de peptídeo (A) ligadas a extensões (B1 e/ou B2) foram adicionadas a culturas de esplenócito em concentrações diferentes para avaliar a eficiência das construções diferentes para promover absorção e apresentação do epítopo mínimo, Cpnel, por APCs.
[0518]Como esperado, o epítopo mínimo ( , figura 12) que não requer processamento e pode ser diretamente carregado no contexto de MHC-I e
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283/314 apresentado a APCs foi o mais eficiente e forneceu a potência mais alta (EC50 mais baixo) in vitro. Entretanto, a adição de um a molécula carregada (C) (Glu-Lys-Glu-LysGlu-Lys SEQ ID NO: 71) diretamente ao N-terminal do epítopo mínimo (♦) sem o uso de uma extensão degradável (B1) levou a uma diminuição quase 10.000 vezes em potência em comparação com o epítopo mínimo usando individualmente. Notavelmente, a atividade do epítopo mínimo foi recuperada simplesmente por colocar uma extensão de tetrapeptídeo degradável por enzima (B1) (isto é, Ser-LeuVal-Arg SEQ ID NO: 7) entre a molécula carregada (C) e o epítopo mínimo (hexágonos, figura 12). A colocação de uma extensão clivável por catepsina adicional (B2) no C-terminal (isto é, Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 7), ou combinação de uma sequência degradável por imuno-proteassoma com a extensão clivável por catepsina no N-terminal (B1) (Ser-Leu-Val-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu SEQ ID NO: 72) ou C-terminal (B2) (Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 13) teve impacto adicional mínimo sobre a potência em comparação com 0 uso de uma extensão de tetrapeptídeo única (B1) entre a molécula carregada (C) e 0 antígeno de peptídeo de epítopo mínimo (A).
[0519]Qs estudos seguintes buscaram avaliar 0 impacto das extensões degradáveis por enzima (B1 e B2) sobre a eficiência de apresentação cruzada de antígeno in vivo usando conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V, em que a molécula hidrofóbica (H) era 2BXya.
[0520]Q esquema geral para a síntese dos conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V foi atingir 1.0 equivalente do antígeno de peptídeo contendo uma azida reativa com 1.2 equivalentes da molécula hidrofóbica contendo DBCO (H) em temperatura ambiente. A reação foi concluída após 24 horas e não exigiu purificação adicional.
[0521]Como mostrado na figura 13, conjugados de antígeno de peptídeo foram sintetizados com moléculas carregadas diferentes (C), (por exemplo, Lys-Ser
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Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO: 73, Glu-Ser-Glu-Ser-Glu-Ser SEQ ID NO: 74 e GluLys-Glu-Lys-Glu-Lys SEQ ID NO: 71) usando combinações diferentes de extensões degradáveis por enzima nos N- e C-terminais (B1 e B20) do epitopo mínimo, Cpnel. Os camundongos foram vacinados com as composições imunogênicas diferentes reportadas na figura 13 em 0 e 14 dias e respostas de célula T foram avaliadas a partir de sangue integral nos dias 10 (figura 13A) e 28 (figura 14B). Compatível com os dados in vitro a partir da figura 12, a colocação de qualquer uma das três moléculas carregadas (C) no N-terminal do epitopo mínimo, sem uso de uma extensão B1, resultou em ab-rogação completa de respostas de célula T CD8 (-0,1% IFN-y+ de total de células T CD8+) após avaliar respostas em sangue integral de animais sensibilizados com uma imunização única (figura 14). Entretanto, a colocação de uma extensão clivável por catepsina (B1) entre a molécula carregada (C) e o N-terminal do antigeno de peptídeo (A) compreendido do epitopo mínimo resultou em um aumento de quase 10 vezes em respostas de célula T CD8 dos conjugados de antigeno de peptídeo usando a molécula positivamente carregada (C) (Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO: 73) e uma melhora modesta em respostas de célula T CD8 para os conjugados de antigeno de peptídeo com as moléculas carregadas ES e EK (C) (figura 14). Entre os grupos vacinados com conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo uma molécula positivamente carregada (C) (Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO: 73), a adição de uma extensão clivável por catepsina tanto N-terminal como C-terminal (B1 e B2) resultou em respostas de célula T CD8 de aproximadamente 3,5% após uma imunização única, enquanto a adição de sequências imunoproteassomais em B1 e/ou B2, além das sequências cliváveis por catepsina, levou somente a um aumento adicional modesto na magnitude das respostas de célula T CD8 (figura 14). Tendências foram compatíveis nos dados após 2 imunizações para os conjugados de antigeno de peptídeo usando todos os 3 conjuntos de moléculas carregadas (C): incluindo extensões cliváveis por
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285/314 catepsina N- e C-terminal (B1 e B2) entre a molécula carregada (C) e moléculas hidrofóbicas (H), respectivamente, levaram em geral às respostas de magnitude mais alta, com pouca ou nenhuma melhora em respostas por adição de um ligador imuno-proteassomal.
[0522]Esses dados exemplificam a descoberta inesperada de que uma extensão de peptídeo clivável por catepsina (B1), por exemplo, como Ser-Leu-ValArg (SEQ ID NO: 7), colocado no N-terminal de antígenos de peptídeo dos conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V é uma modalidade preferida para promover apresentação de antígeno in vitro e sensibilização cruzada de células T CD8 in vivo. Melhoras adicionais modestas em respostas de célula T CD8 foram vistas quando extensões de peptídeo cliváveis por catepsina foram colocadas em ambos os N- e C-terminais e quando a extensão clivável por catepsina (B2) no Cterminal foi combinado com uma sequência que favorece adicionalmente processamento de imuno-proteassoma (por exemplo, o dipeptídeo, Gly-Gly, de GlyGly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO: 13). Em resumo, modalidades preferidas de conjugados de antígeno de peptídeo incluem uma extensão clivável por catepsina (B1) entre o N-terminal do antígeno de peptídeo (A) e quaisquer componentes adicionais, por exemplo, moléculas carregadas (C); e opcionalmente uma catepsina ou extensão degradável por imuno-proteassoma e catepsina combinada (B20 no Cterminal.
[0523]Para estender essas descobertas, os requerentes sintetizaram conjugados de antígeno de peptídeo com combinações diferentes e composições de extensões degradáveis por catepsina nos N- e C-terminais (B1 e B2) do epítopo mínimo, Adpgk (figura 15). As composições diferentes de peptídeos mostradas na figura 15 foram adicionadas a culturas de esplenócito em concentrações diferentes para avaliar a eficiência das construções diferentes para promover absorção e apresentação do epítopo mínimo, Adpgk, por APCs. A potência determinada in vitro
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286/314 (EC50) para o antígeno de peptídeo, Adpgk, com combinações e composições diferentes de extensões degradáveis por catepsina nos N- e C-terminais (B1 e B2) é mostrada na figura 16. Para confirmar as descobertas in vitro, um subconjunto das sequências, com base na fórmula C-B1-A-B2-X1, mostrada na figura 15 foi ligado à molécula hidrofóbica (H), 2B3W3, e então administrado a camundongos. Respostas de célula T CD8 foram avaliadas no dia 13 (figura 17) e são compatíveis com os resultados a partir das triagens in vitro, confirmando que extensões degradáveis por catepsina ligando 0 antígeno de peptídeo (A) à molécula carregada (C) e molécula hidrofóbica (H) nos N- e C-terminais, respectivamente, podem levar a apresentação melhorada de antígeno in vitro bem como eficiência melhorada de apresentação cruzada de antígeno in vivo.
Impacto de carga líquida e sequência de extensão (B1 e B2) sobre 0 tamanho de partícula
[0524]Embora seja entendido que a carga de superfície de partículas influencie sua estabilidade em solução, 0 impacto de densidade de carga e carga líquida de conjugados de antígeno de peptídeo sobre 0 tamanho e estabilidade de montagens supramoleculares daqueles conjugados de antígeno de peptídeo em soluções aquosas não foi bem estudado.
[0525]Para fornecer um maior entendimento de como a densidade de carga e a carga líquida de macromoléculas anfifílicas impacta 0 comportamento hidrodinâmico de partículas de automontagem, os requerentes sintetizaram uma série de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V (figura 18) com composição variável de antígenos de peptídeo (A), moléculas carregadas (C), extensões (B1 e B2) e moléculas hidrofóbicas (H) e avaliaram como esses parâmetros impactam 0 tamanho e estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo suspensos em soluções aquosas em um pH de aproximadamente 7.4 (figura 18).
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[0526]Os estudos iniciais dos requerentes investigaram como o aumento da carga líquida impacta o tamanho de partícula e estabilidade de conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V (figuras 18 e 19). Os resultados dos requerentes mostram uma relação inversa entre a magnitude de carga e o tamanho das partículas formadas com conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V fornecendo uma ampla gama de antigenos de peptideo diferentes (A) (N=754), com aproximadamente 90% de antigenos de peptideo (A) fornecidos como conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V com uma carga líquida (valor absoluto) > 6 montando em micelas de nanopartícula de ~20 - 40 nm. Notavelmente, a magnitude de carga líquida necessária para assegurar micelização de nanopartícula era altamente dependente do comprimento e hidropatia do antígeno de peptideo (A), com a maioria dos conjugados de antígeno de peptideo fornecendo antigenos de peptideo baseados em LP (A) formando micelas como conjugados de antígeno de peptideo com uma carga líquida de +8 ou mais alta, ou -8 ou mais baixa, porém com os antigenos mais altamente hidrofóbicos exigindo uma carga líquida de até +10 ou mais alta, ou -10 ou mais baixa, para assegurar formação estável de micela de nanopartícula.
[0527]Um desafio maior para PCVs baseados em peptideo é que devem assegurar consistência de formulação usando qualquer antígeno de peptideo possível que pode resultar a partir do genoma humano. Para avaliar a capacidade de generalização de SP-7/8a como um PCV, os requerentes primeiramente computaram a carga e distribuição de frequência de hidropatia de todos os peptideos de 25 aminoácidos possíveis (11.3M 25-mers) resultando de transcritos canônicos, incluindo todas as possíveis mutações de troca de sentido (72.6M 24mers). Inesperadamente, os resultados dos requerentes sugerem que mais de 98% de neoantígenos baseados em peptideo de 25 aminoácidos terão uma carga entre 6 e +6 (em pH 7.4) e uma média grande de hidropatia (GRAVY) entre +2 e -2. Esses
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288/314 resultados indicam que a carga e distribuição de hidropatia dos neoantígenos de camundongos usados na presente invenção são representativos das características dos neoantígenos humanos previstos in silico (figura 19 C&D). Notavelmente, aumentos mesmo modestos de aproximadamente 2 a 4 unidades inteiras de carga líquida resultam em estabilidade acentuadamente melhorada das partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V. Por conseguinte, embora aproximadamente 25% ou mais de neoantígenos LP fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V com uma carga líquida de +6 agregado, os mesmos neoantígenos LP fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V com uma carga líquida maior ou igual a +8 reunida em micelas de nanopartículas estáveis (figura 19 E). Esses resultados mostram que Mins e antígenos de peptídeo LP fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V com carga líquida maior ou igual a +6 e +8 (ou menos que ou igual a -6 e -8), respectivamente, se reúnem de modo confiável em micelas de nanopartículas. De modo importante, essas descobertas inesperadas sugerem que conjugados de antígeno de peptídeo devem ser capazes de acomodar antígenos de peptídeo de 25 aminoácidos (A) com uma faixa de carga de aproximadamente -6 e aproximadamente +6 para assegurar que uma carga líquida suficiente é aplicada a 98% de neoantígenos de 25 aminoácidos possíveis; portanto, pelo menos 13 combinações de molécula carregada exclusiva (C) e extensão (B1 e/ou B2) opcional são necessárias para assegurar que uma quantidade suficiente de carga seja adicionada (por exemplo, contendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14 grupos funcionais carregados) ao antígeno de peptídeo (A) para obter a carga líquida necessária do conjugado de antígeno de peptídeo.
[0528]Para examinar mais completamente a tendência entre a carga líquida de conjugados de antígeno de peptídeo e o tamanho e estabilidade de partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo em tampões aquosos, os
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289/314 requerentes investigaram a interação entre o valor de média grande de hidropatia (GRAVY) da sequência de peptídeo compreendendo os conjugados de antigeno de peptídeo (por exemplo, o fragmento de antigeno de peptídeo, inclusive da molécula carregada baseada em peptídeo (C), extensões de peptídeo (B1 e B2) e antigeno de peptídeo (A)) e o tamanho e estabilidade de partículas formadas (figura 19F). houve uma interdependência forte entre o valor GRAVY, carga líquida e tamanho de partícula. Por conseguinte, muitos dos conjugados de antigeno de peptídeo com uma carga líquida de +4 e um valor de média grande de hidropatia (GRAVY) menor que 0 formaram partículas estáveis (figura 19F). em contraste, aproximadamente 25% de conjugados de antigeno de peptídeo com uma carga líquida de +4 e um valor GRAVY maior que 0 formaram agregados, enquanto poucos conjugados de antigeno de peptídeo com uma carga líquida de +6 e um valor GRAVY maior que 0 formaram agregados. Esses dados indicam que, em modalidades preferidas, a magnitude de carga líquida deve ser selecionada para compensar o valor GRAVY do antigeno de peptídeo (A) fornecido. Em modalidades preferidas, a composição da molécula carregada (C) e extensões (B1 e B2) são selecionadas para fornecer conjugados de antigeno de peptídeo com carga líquida maior ou igual a +4, ou carga menor ou igual a -4 para promover a formação de partículas estáveis formadas por conjugados de antigeno de peptídeo, com carga líquida maior que +6 ou menor que -6 usada para assegurar formação estável de nanopartículas mesmo dos antígenos de peptídeo mais hidrofóbicos (A) (figura 19 F). Realmente, antígenos baseados em LP altamente hidrofóbicos podem exigir valor absoluto ainda maior de carga líquida. Como tal, conjugados de antigeno de peptídeo devem ter carga líquida: maior ou igual a +8, ou menor ou igual a -8, para antígenos de peptídeo LP (A) com um valor GRAVY menor que 0.25; maior ou igual a +9, ou menor ou igual a -9, para antígenos de peptídeo LP (A) com um valor GRAVY entre aproximadamente 0.25 e 0.75; e maior ou igual a +10, ou menor ou igual a -10, para antígenos de peptídeo LP (A)
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290/314 com urn valor GRAVY maior que 0.75, em que LP é usado para se referir a um antígeno de peptídeo (A) que é mais longo que um epitopo mínimo, por exemplo, um antígeno de peptídeo maior que 15 aminoácidos, tipicamente 20 ou mais, como 25 aminoácidos.
[0529]Deve ser observado que a análise dos requerentes incluiu antígenos de peptídeo com extremos de composições, em termos de carga e hidropatia. Por conseguinte, 3 antígenos de peptídeo exclusivos representando o mais - isto é, o 90Q percentil ou mais alto de - hidrofóbico (Val-Val-lle-Ala-lle-Phe-lle-lle-Leu (SEQ ID NO: 57)), positivamente carregado (Lys-Asn-His-Arg-Asn-Arg-QIn-Val-lle SEQ ID NO: 75), e negativamente carregado (Ser-Pro-Glu-Arg-Asn-Asp-Trp-Glu-Pro-Leu SEQ ID NO: 76)—sequências entre um total de 1.377 neoantígenos previstos tirados de 4 linhagens de célula de tumor de murino, bem como um epitopo de célula T CD8 validado (Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser (SEQ ID NO: 2)), foram selecionados para avaliação. Um antígeno de peptídeo (A) compreendendo um epitopo de célula T CD4 validado (PADRE = Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-LeuLys-Ala-Ala-Ala SEQ ID NO: 22) foi também incluído na análise como um epitopo de célula T CD4 universal conhecido (figura 18).
Impacto de comprimento e composição de molécula hidrofóbica (H) sobre o tamanho de partícula
[0530]Embora a carga líquida sobre os conjugados de antígeno de peptídeo fosse verificada ser crítica para promover estabilidade das partículas formadas, os requerentes exploraram a seguir fatores adicionais que impactam o tamanho de partícula. Estudos anteriores mostraram que o comprimento de macromoléculas compreendendo micelas, lipossomas e polimersomas pode ser modulado para variar os tamanhos de partículas formadas. Desse modo, usando um epitopo de célula T CD8 de modelo como o antígeno de peptídeo (A) fornecido como um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V, os requerentes avaliaram como o comprimento e
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291/314 composição da molécula hidrofóbica (H) impacta o tamanho de partícula (figura 20). Compatível com os dados anteriores, os requerentes verificaram que o tamanho e a estabilidade das partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo eram altamente dependentes da carga líquida do conjugado de antígeno de peptídeo através de uma gama de moléculas hidrofóbicas diferentes (H) usadas (figura 20). Usando uma carga líquida de +4 ou mais alta, a molécula hidrofóbica menor (H), Ws, compreendida de 5 unidades de triptofano, levou às partículas menores com um diâmetro médio de -10 nm, enquanto a molécula hidrofóbica maior (H) usada nesse exemplo, 2B2W8, levou a partículas com diâmetro entre 30-100 nm (figura 20). Notavelmente, as moléculas hidrofóbicas de tamanho intermediário (H), 2B5 e 2BXys levaram a partículas de tamanho intermediário de partículas com diâmetro no tamanho -10-30 nm, quando a carga líquida era maior ou igual a +4.
[0531 ]No total, esses resultados fornecem as descobertas inesperadas de quão precisamente definidos parâmetros químicos da molécula carregada (C) e molécula hidrofóbica (H) podem ser usados para sintonizar 0 tamanho e estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo.
Impacto de carga líquida sobre tamanho e estabilidade de partícula de conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo altamente hidrofóbicos (A)
[0532] Para demonstrar a capacidade de tolerância de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V para fornecer antígenos de peptídeo (A) que são altamente hidrofóbicos, os requerentes selecionaram 0 neoantígeno LP mais hidrofóbico entre uma biblioteca de 1.377 neoantígenos de peptídeo a partir de 4 linhagens de tumor de murino e sintetizaram 0 antígeno de peptídeo como 0 LP ou Min fornecido como um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V que auto reúne em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) (figura 21). Embora carga líquida igual ou maior que 8 fosse necessária para estabilizar 0
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Min hidrofóbico (GRAVY = 3.96) fornecido como SNP-7/8a, uma carga líquida igual ou maior que 10 era necessária para estabilizar o LP hidrofóbico (GRAVY = 2.0) fornecido como SNP-7/8a (figura 21). Uma descoberta inesperada adicional foi que o LP nativo e min não eram fabricáveis por síntese de peptídeo de fase sólida; entretanto, adicionar a molecular carregada (C) e extensões (B1 e B2) ao antígeno de peptídeo (A) na resina durante síntese de peptídeo de fase sólida melhorou a fabricação por evitar truncamento de sequência e permitir purificação de HPLC devido à solubilidade aperfeiçoada em solventes orgânicos e aquosos.
Impacto de composição de molécula hidrofóbica (H) e molécula carregada com conjugado de antígeno de peptídeo, (C), sobre imunogenicidade
[0533]Os resultados acima dos requerentes indicam que a carga líquida é crítica para estabilizar micelas de nanopartícula formadas por conjugados de antígeno de peptídeo. Os requerentes investigaram a seguir o impacto das composições de molécula carregada (C) e molécula hidrofóbica (H) sobre a imunogenicidade de conjugados de antígeno de peptídeo fornecendo um epítopo mínimo, Adpgk (figuras 22 a 24). Embora o conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V sem um adjuvante não induziu respostas de célula T CD8 (figura 22), todas as outras composições de conjugados de antígeno de peptídeo ligados a um TLR-7/8a induziram respostas de célula T CD8 robustas (figura 22). Notavelmente, enquanto o conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula IV, sem a molécula carregada (C) e os conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V com moléculas carregadas (C) baseadas em lisina (isto é, poli(K)) ou arginina (isto é, poli(R)) induziram respostas de célula T CD8 robustas mesmo quando administradas em doses de 0,25 mmol, o mesmo neoantígeno administrado como um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula V com um ácido aspártico (isto é, molécula carregada (C) baseada em poli(D)) não induziu respostas de célula T CD8 quando administrada em 0,25 ou 1 mmol, porém induziu respostas de célula T CD8 de
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293/314 magnitude alta quando administradas em 4 e 16 mmol. Notavelmente, o conjugado de antígeno de peptídeo negativamente carregado (figura 22) induziu as respostas de célula T CD8 de magnitude mais alta após múltiplas imunizações (-30% IFNg+ de total de células T CD8), aproximadamente 1.5-2x mais alto que as respostas de célula T CD8 induzidas por conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula IV ou conjugados de antígeno de peptídeo positivamente carregados da figura V. Esses resultados sugerem que embora conjugados de antígeno de peptídeo que se auto reúnem em micropartículas (figura 22) ou nanopartículas positivamente carregadas (figura 22) sejam mais potentes para induzir respostas de célula T CD8 em comparação com conjugados de antígeno de peptídeo negativamente carregados, conjugados de antígeno de peptídeo negativamente carregados que auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (SNP-7/8a) podem induzir respostas de célula T CD8 que são mais reforçáveis, fornecendo respostas de magnitude mais alta após múltiplas imunizações.
[0534] Para estender as descobertas dos requerentes, os mesmos avaliaram como a composição de molécula carregada (C) de conjugados de antígeno de peptídeo impacta respostas de célula T CD8 após a via de administração subcutânea (figura 23). Notavelmente, os conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V com moléculas carregadas baseadas em poli(aminoácido) negativa ou positivamente carregado (C), poli(L) ou poli(D), respectivamente, induziram respostas de célula T CD8 de magnitude mais alta do que conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V, com uma extensão B1 baseada em PEG, neutra, (figura 23).
[0535]De modo importante, conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (SNP-7/8a) foram verificados ser altamente imunogênicos para eliciar respostas de célula T CD8 após vias de vacinação comuns (intramuscular (IM), subcutânea (SC) bem como a
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294/314 via intravenosa (figura 24).
Impacto de tamanho de partícula de conjugado de antígeno de peptídeo e potência de adjuvante e composição sobre imunogenicidade
[0536]Era anteriormente desconhecido como o tamanho de partícula e a quantidade e potência de agonistas TLR impactam as respostas de célula T após uma única ou após múltiplas imunizações (‘reforço’). O estado da técnica anterior sugeriría que quantidades crescentes ou potência de imuno-estimulante levariam a respostas de célula T CD8 mais altas ou pelo menos não inferiores; entretanto, o impacto de imuno-estimulante, por exemplo, agonista TLR, quantidade e potência sobre sensibilização e reforço de respostas de célula T CD8 in vivo não foi bem estudado. Portanto, estudos seguintes dos requerentes para avaliar como o tamanho de partícula e a quantidade e potência de agonista fornecido em conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V impactam a imunogenicidade.
[0537]Para determinar como o tamanho de partícula e composição de agonista afetaram a imunogenicidade, os camundongos foram vacinados com composições imunogênicas compreendendo dois conjugados de antígeno de peptídeo, um fornecendo um antígeno de peptídeo (A) compreendendo um epítopo de célula T CD8 mínimo e o outro fornecendo um antígeno de peptídeo (A) compreendendo um epítopo de célula T CD4 mínimo (figura 25). Os conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V foram distinguidos com base em se formam partículas pequenas (nanopartículas com diâmetro de -20-100 nm (NP) ou grandes (micropartículas com diâmetro -1.000 m (MP)) fornecendo quantidades diferentes e potências de agonistas TLR-7/8. Em cada conjunto de partículas pequenas ou grandes, os conjugados de antígeno de peptídeo compreenderam uma molécula hidrofóbica (H) que continha 1, 2, 3 ou 5 moléculas do composto 1, 2B ou 5 moléculas do agonista de potência mais alta, composto 2, 2BXy. Os camundongos foram vacinados duas vezes com uma composição imunogênica dada e respostas
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295/314 de célula T foram medidas no sangue 1 semana após cada vacinação.
[0538]Uma descoberta surpreendente e inesperada foi que para partículas tanto pequenas (20-100 nm) como grandes (-1000 nm), quantidades crescentes do agonista 2B ligado à molécula hidrofóbica (H), levaram a respostas de célula T CD4 e CD8 aumentadas, com conjugados de antigeno de peptídeo ligados a moléculas hidrofóbicas (H) compreendendo somente uma única molécula 2B, levando às respostas de célula T CD4 e CD8 mais baixas. As respostas de célula T tanto CD4 como CD8 aumentaram por adicionar duas moléculas 2B, com um aumento adicional modesto após adição de 3 ou 5 moléculas 2B às moléculas hidrofóbicas (H). Compatível com os dados anteriores e inesperados dos requerentes (figuras 6 e 7) mostrando que conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) fornecendo e ou mais moléculas do agonista mais potente TLR7/8a, 2BXy, resultaram em respostas de célula T CD8 após múltiplas imunizações em comparação com conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo moléculas hidrofóbicas (H) fornecendo 3 ou mais moléculas do agonista menos potente, 2B, os resultados da figura 25 mostram que 2BXys resultam em respostas de célula T CD8 e CD4 inferiores em comparação com o uso da molécula hidrofóbica (H) fornecendo o agonista de potência moderada, 2Bs. Essa descoberta inesperada - em que um agonista de potência mais alta resulta em respostas imunes mais baixas - não teria sido prevista com base em descobertas anteriores na literatura.
[0539]Em resumo, o aumento do número do agonista, composto 1,2B, para os conjugados de antigeno de peptídeo resultou em respostas de célula T CD8 em geral mais altas, porém essas respostas diminuíram em magnitude quando o estimulante inato mudou para um agonista de potência mais alta. Portanto, modalidades preferidas usam densidades altas de agonistas TLR-7/8a de potência moderada ou baixas densidades de TLR-7/8a de potência alta para induzir resposta
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296/314 de célula T CD4 e CD8 ótima utilizando composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo.
Tamanho de partícula
[0540]0utra descoberta surpreendente e inesperada foi que as composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo que formaram partículas pequenas, partículas com ~10 - 200 nm de diâmetro, levaram a respostas de célula T CD4 e CD8 de magnitude mais alta em comparação com conjugados de antígeno de peptídeo que formaram partículas maiores (diâmetro > 1.000 nm). Por exemplo, no grupo que recebeu composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo ligados à molécula hidrofóbica (H) 2Bs e que formaram partículas pequenas, as respostas de célula T CD8 eram aproximadamente -2,5% em comparação com -0,5% para o grupo que recebeu composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo ligados à molécula hidrofóbica (H) 2Bs que firmaram partículas grandes (figura 25). Similarmente, respostas de célula T CD8 no grupo que recebeu composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo ligados à molécula hidrofóbica (H) 2B3W2 como uma partícula pequena foram aproximadamente 10 vezes mais altas que 0 grupo que recebeu composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptídeo ligados à molécula hidrofóbica (H) 2B3W2 como uma partícula grande.
[0541 ]Em resumo, esses dados mostram que 0 tamanho das partículas formadas pelos conjugados de antígeno de peptídeo usados em composições imunogênicas teve um impacto grande e inesperado sobre a resposta de célula T CD8. Portanto, conjugados de antígeno de peptídeo que formam partículas de 20100 nm são a modalidade preferida para uso em composições imunogênicas para eliciar imunidade de célula T ótima.
[0542]No total, esses estudos elucidam os parâmetros físicos e químicos
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297/314 precisos que são ótimos para maximizar as respostas de célula T CD4 e CD8 usando conjugados de antigeno de peptídeo da presente revelação.
[0543]Uma descoberta inesperada adicional foi que o comportamento hidrodinâmico e estabilidade das partículas formadas pelos conjugados de antigeno de peptídeo dependiam tanto da carga líquida como do valor de média grande de hidropatia (GRAVY), como determinado usando os métodos de Kyte e Doolittle (vide: Kyte J, Doolittle RF, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol 157: 105-32, 1983), da sequência de peptídeo compreendendo ο conjugado de antigeno de peptídeo. Observação: o valor GRAVY e determinação de carga excluíram as contribuições do Ligador (L) e da molécula hidrofóbica (H) ou Partícula (P).
[0544]Por conseguinte, conjugados de antigeno de peptídeo que fornecem: antígenos de peptídeo altamente hidrofóbicos (A) com valores GRAVY > 0.75 formaram de modo confiável partículas estáveis em tampões aquosos em pH aproximadamente pH 7.4 quando a carga líquida do conjugado de antigeno de peptídeo era > (maior que ou igual) a + 6 ou < (menor que ou igual) a -6; antígenos de peptídeo moderadamente hidrofóbicos (A), com valores GRAVY entre 0.25-0.75 formaram de modo confiável partículas estáveis em tampões aquosas em pH aproximadamente pH 7.4 quando a carga líquida do conjugado de antigeno de peptídeo era > (maior que ou igual a) + 5 ou < (menor que ou igual a) -5; e antígenos de peptídeo (A) com valores GRAVY menores que 0.25 formaram de modo confiável partícula estáveis em tampões aquosos em pH aproximadamente pH 7.4 quando a carga líquida era > (maior que ou igual a) + 4 ou < (menor que ou igual a) -4. Desse modo, com base nas descobertas inesperadas dos requerentes, a composição apropriada de moléculas carregadas (C) e sequências de extensão (B1 e B2) pode ser selecionada para modular a carga como um meio para promover a formação de partícula estável de conjugados de antigeno de peptídeo fornecendo qualquer
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298/314 composição de antígeno de peptídeo (A).
Impacto do comportamento hidrodinâmico do neoantígeno de peptídeo sobre imunogenicidade
[0545]Os requerentes avaliaram a seguir se formulações mais compatíveis usando conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto um TLR-7/8a (SNP-7/8a) (figura 26) traduziríam em imunogenicidade aperfeiçoada de respostas de CTL em comparação com a ligação de neoantígenos LP a um polímero hidrofóbico -TLR-7/8a sem estabilização de carga que resulta em micropartícula/agregados (MP-7/8a) ou a abordagem mais convencional de misturar neoantígenos LP com um CLC) (figura 27). Os requerentes selecionaram três neoantígenos LP para avaliação, Adpgk, Cpnd e Irgq. Embora Adpgk se reúna em partículas como o LP nativo, tanto os LPs Cpnel como Irgq são solúveis em água (figura 27A).
[0546]Compatível com as descobertas anteriores dos requerentes, somente os LPs de neoantígeno fornecidos como partículas induziram respostas de célula T CD8 in vivo (figura 27 B&C). Por conseguinte, os LPs solúveis Cpnel e irgq misturados com pICLC não induziram respostas de célula T CD8, enquanto os mesmos neoantígenos fornecidos como um MP-7/8a (micropartícula/agregados) ou SNP-7/8a (nanopartícula) levaram à geração de imunidade de célula T CD8 de magnitude alta (figura 27 B-E). embora LPs solúveis misturados com pICLC fossem inativos, como descrito anteriormente, o LP de partícula, Adpgk, induziu um aumento significativo em respostas de célula T CD8 em relação ao antecedente, indicando que a forma física do neoantígeno de peptídeo porém não o adjuvante, isto é, pICLC, provavelmente respondeu pelas respostas de célula T fracas por LPs Cpnel e Irgq misturados com pICLC.
[0547]Entre as formulações que fornecem neoantígenos em um formato de partícula, a micela de nanopartícula (SNP-7/8a), com base em conjugados de
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299/314 antígeno de peptideo da fórmula V, forneceu as respostas de magnitude mais alta, seguido pelas formulações de micropartícula (MP-7/8a) e finalmente o LP sozinho misturado com adjuvante (figura 27 B-E). notavelmente, as respostas pela micela de nanopartícula (SNP-7/8a) após uma imunização única foram significativamente (~510 vezes) mais altas que as respostas pelas formulações de micropartículas, enquanto as respostas após duas ou três imunizações foram comparáveis, indicando que as micelas de nanopartícula menores têm uma cinética mais rápida de indução de célula T em comparação com as micropartículas.
[0548]Estudos mecanistas para considerar as diferenças observadas em imunogenicidade revelaram que os conjugados de antígeno de peptideo que formam micelas de nanopartículas estáveis resultaram na quantidade mais alta de absorção de neoantígeno em linfonodos de drenagem com um pico prematuro em concentrações e absorção por APCs de linfonodo no dia 1, enquanto a micropartícula mostrou absorção mais lenta em linfonodos, com concentrações tendo pico no dia 7, o que pode responder pela cinética mais lenta de respostas de célula T CD8 resultando de micropartícula (figura 28). Em contraste, o neoantígeno solúvel misturado com adjuvante de partícula ou solúvel mostrou absorção limitada de neoantígeno em linfonodos de drenagem. Apesar de todas as formulações de partícula de adjuvante induzindo magnitude comparável e cinética de ativação imune inata em linfonodos, somente as formas de partícula de antígeno resultaram em respostas de célula T CD8. Acúmulo limitado do neoantígeno solúvel em linfonodos provavelmente responde por sua incapacidade de induzir respostas de célula T CD8.
Impacto de comprimento de peptideo sobre imunogenicidade
[0549]Comprimento de peptideo é considerado um fator principal que impacta a imunogenicidade de antígeno de peptideo (A), os requerentes investigaram, portanto, como o comprimento de neoantígenos de peptideo fornecidos como conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V que auto reúnem
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300/314 em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) impacta a magnitude de respostas de célula T CD4 e CD8 geradas in vivo (figura 29). Sete neoantígenos de peptídeo derivados da linhagem de célula de tumor MC38 foram preparados como epítopo mínimo (mins) ou antígenos de peptídeo baseados em LP (A) fornecidos como conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V, mencionados como SNP-7/8a aqui, e então administrados a camundongos. Os resultados dos requerentes mostram que as formas tanto min como LP de neoantígenos fornecidas como SNP-7/8a eliciam magnitude comparável de respostas de célula T CD8 que são aproximadamente 10-100 vezes mais altas que o antecedente, incluindo contra 4 neoantígenos reportados anteriormente como sendo não imunogênicos (figura 29 A), como esperado, entretanto, os LPs eliciaram respostas de célula T CD4 significativamente mais altas em comparação com os mins, provavelmente porque os mins são demasiadamente curtos para codificar o epítopo CD4 (figura 29 B). De modo importante, esses resultando indicam que o comprimento de peptídeo tem impacto mínimo sobre as respostas de célula T CD8 e sugere que peptídeos curtos (7-14 aminoácidos) contendo os epítopos CD4 ou CD8 mínimos, que são mais eficientes de se fabrica, quando adequadamente formulados em partículas, podem ser preferidos para uso em vacinas em relação a LPs (> 20 aminoácidos). Realmente, aperfeiçoamentos em algoritmos de predição MHC-II devem permitir o uso de epítopos mínimos para eliciar respostas de célula tanto CD4 como CD8 desse modo evitando a necessidade de usar LPs.
Avaliação comparativa imunogenicidade de neoantígenos de peptídeo fornecidos como conjugados de antigeno de peptídeo em comparação com abordagens convencionais
[0550]0s requerentes, a seguir, compararam a atividade dos seus conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V que auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) com uma abordagem
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301/314 de vacina baseada em peptídeo convencional de misturar LPs nativos com o adjuvante particulado polilCLC (figura 30). Compatível com as descobertas de Yadav et al (Yadav M, et al. Nature 515(7528):572-576 (2014), somente 2 dos 7 neoantígenos previstos validados por espectrometria de massa (Repsl e Adpgk, os quais são ambos particulados) eram imunogênicos quando combinados com pICLC; entretanto, todos os 7 dos neoantígenos LP eliciaram respostas de célula T CD* de magnitude alta como SNP-7/8a, isto é, como antígenos de peptídeo (A) fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V (figura 30). Notavelmente, todos os 7 dos neoantígenos mostrados na figura 30 foram confirmados como ligando MHC-I de tumor por espectrometria de massa, que fornece a descoberta inesperada de que espec. de massa é um filtro confiável para prever imunogenicidade de antígenos de peptídeo (A), por exemplo, neoantígenos.
[0551]Relação entre imunogenicidade e afinidade de ligação prevista por epítopo mínimo
[0552]Os resultados dos requerentes mostram que os neoantígenos baseados em peptídeo fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) são uma abordagem altamente eficiente para eliciar respostas de célula T CD4 e CD8. Através de eficiência aperfeiçoada da plataforma de vacina, pode ser possível refinar algoritmos de previsão para imunogenicidade. Realmente, os requerentes observaram uma correlação forte entre ligação de MHC-I previsto e imunogenicidade após triagem de 192 epítopos de célula T CD8 exclusivos in vivo com SNP-7/8a, com quase 50% dos epítopos de alta afinidade (IEDB Score de consenso < 0.5 percentil) levando a respostas de célula T CD8, que é um aumento de quase 5 vezes na eficiência de sensibilização de respostas de célula T CD8 em comparação com respostas publicadas (figura 31). Esses resultados mostram que afinidade de ligação prevista in silico, particularmente o score de consenso IEDB é
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302/314 altamente preditivo de imunogenicidade de antígeno de peptídeo (A).
Conjugados de antígeno de peptídeo eliciam respostas de célula T CD8 e CD4 específicas-(antígeno próprio, neoantígeno e antígeno viral) associadas a tumor robusto que mediam clearance de tumor in vivo
[0553]Os requerentes investigaram se as respostas de célula T CD8 contra epítopos não imunogênicos anteriormente reportados poderíam levar a clearance melhorado de tumores estabelecidos (figuras 32-33). Os resultados dos requerentes mostram que vários neoantígenos levaram a clearance de tumores estabelecidos quando fornecidos como conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) . Notavelmente, embora Kreiter et al reportassem anteriormente que respostas de célula T CD4 específicas de neoantígeno mediassem principalmente clearance de tumores B16.F10 estabelecidos, os requerentes observaram que a eficiência aperfeiçoada da vacina pode mobilizar ambas as respostas de célula T CD4 e CD8 específicas de neoantígeno para mediar clearance de B16.F10 (figuras 32 e 34). De modo importante, essas descobertas estenderam além do uso de neoantígenos, visto que tanto antígenos virais (HPV E6 e E7, figura 35) como antígenos próprios (Trp1, figura 32) fornecidos como SNP-7/8a eliciaram respostas de célula T CD8 de magnitude alta que foi associada a clearance de tumor aperfeiçoada.
Partículas compreendendo múltiplos conjugados de antígeno de peptídeo diferentes são estáveis e exibem tamanho uniforme de partícula
[0554]Abordagens de PCV provavelmente exigirão administração de múltiplos epítopos diferentes a pacientes para aumentar a variedade de respostas de célula T. Portanto, os requerentes avaliaram a tolerância de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V que se auto reúnem em nanopartículas fornecendo em conjunto TLR-7/8a (“SNP-7/8a”) para uso em vacinas de partícula de múltiplos antígenos compreendendo múltiplos conjugados de antígeno de peptídeo
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303/314 diferentes (figura 36). Partícula compreendendo múltiplos conjugados de antígeno de peptídeo diferentes forneceu tamanho de partícula compatível, entre 20-40 nm, independente da composição de LP de neoantígeno (figura 36).
Conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V fornecendo antígenos próprios associados a tumor ou antígenos de doença infecciosa
[0555]Para estender as descobertas dos requerentes acima, os mesmos avaliaram a capacidade de generalização de usar conjugados de antígeno de peptídeo como uma plataforma de vacina universal para induzir imunidade de célula T. Como mostrado na figura 37, conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V fornecendo antígenos de peptídeo (A) compreendendo um oncogene (Kras), um peptídeo derivado de um vírus (HIV) e um antígeno estranho (isto é, ovalbumina) todos formaram nanopartículas estáveis e induziram respostas de célula T de magnitude alta in vivo.
Tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas carregadas diferentes (C) ou moléculas hidrofóbicas diferentes (H) com base em poli(aminoácidos) da fórmula II ligadas a adjuvantes da fórmula III
[0556]Como demonstrado acima, vacinas de conjugado de antígeno de peptídeo são uma plataforma modular que pode permitir ampla gama de composições diferentes de cada dos componentes, por exemplo, moléculas carregadas (C), extensões (B1 e B2), antígenos de peptídeo (A), Ligadores (L), e moléculas hidrofóbicas (H). Em algumas modalidades, pode ser importante incluir uma molécula carregada (C) que compreende grupos funcionais que são independentes de pH em relação as faixas de pH mais fisiologicamente relevantes, por exemplo, de pH 4.5 a aproximadamente pH 8.5. Portanto, os requerentes sintetizaram conjugados de antígeno de peptídeo com carga negativa líquida ou positiva líquida usando moléculas carregadas (C) que compreendiam aminoácidos
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304/314 de fosfoserina ou trimetil-lisina (amônio quaternário independente de pH), respectivamente (figura 38). Os resultados dos requerentes mostram que os conjugados de antígeno de peptídeo incluindo moléculas carregadas baseadas em trimetil-lisina ou fosfoserina (C)m formam nanopartículas estáveis e induzem respostas de célula T de magnitude alta, ao passo que conjugados de antígeno de peptídeo sem uma molécula carregada (C) formam agregados.
[0557]Para estender essas descobertas, os requerentes produziram conjugados de antígeno de peptídeo com comprimentos diferentes, 30 aminoácidos (composto 20 mencionado como 2B5W10G10) e 15 aminoácidos (composto 16 mencionado como 2B5G10) de moléculas hidrofóbicas contendo DBCO (H) baseadas em poli(aminoácidos) da fórmula II ligados a adjuvante da fórmula III. Uma descoberta inesperada foi que o aumento do teor de grupos aromáticos e de amina sobre os blocos hidrofóbicos levou a solubilidade melhorada de solvente orgânico e, portanto, fabricação melhorada em comparação com blocos hidrofóbicos com menos grupos aromáticos ou aminas. Por conseguinte, apesar de ser uma cadeia mais longa, 2B5W10G10 e seus precursores de peptídeo eram mais eficientes de se fabricar do que 2B5G10 e seus precursores.
[0558]As duas moléculas hidrofóbicas diferentes (H), 2B5W10G10 e 2B5G10 foram ligadas a fragmentos de antígeno de peptídeo, compreendendo neoantígenos baseados em peptídeo longo como o antígeno de peptídeo (A), através de um Ligador de triazol (L) para formar conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V. Compatível com as descobertas anteriores dos requerentes, formação estável de nanopartícula era dependente da carga liquida dos conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo as moléculas hidrofóbicas diferentes (H) (figura 38). Inesperadamente, apesar da alta densidade de grupos hidrofóbicos sobre as moléculas hidrofóbicas (H), ambos os conjugados de antígeno de peptídeo formaram micelas de nanopartículas estáveis e induziram respostas de célula T de
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305/314 magnitude alta in vivo (figura 38). Em algumas modalidades, uma molécula hidrofóbica mais longa (H) é usada para melhorar a estabilidade cinética dos conjugados de antígeno de peptídeo, como pode ser necesa'rio para vacinas fornecidas pela via intravenosa.
Tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas hidrofóbicas diferentes (H) com base em poli(aminoácidos) da fórmula II liados a agonistas PRR diferentes
[0559]Embora os exemplos acima de composições imunogênicas usassem principalmente conjugados de antígeno de peptídeo compreendidos de moléculas hidrofóbicas (H) ligadas a um TLR-7/8a (por exemplo, adjuvantes da fórmula III) ou não ligados a um Ligando, moléculas hidrofóbicas (H) podem ser ligadas a qualquer Ligando. Em algumas modalidades, um Ligando com propriedades adjuvantes é incluído na molécula hidrofóbica (H), enquanto em outras modalidades, um Ligando que não tem propriedades adjuvantes é incluído na molécula hidrofóbica. Para demonstrar a capacidade de generalização de conjugados de antígeno de peptídeo que fornecem Ligandos diferentes com propriedades adjuvantes, os requerentes sintetizaram conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas hidrofóbicas (H) da fórmula II liadas a Ligandos diferentes, incluindo um agonista TLR-4 (isto é, WW(PI)WW), um agonista TLR-2/6 (isto é, WW(PI)WW), um agonista TLR-7 (isto é, CL264-Ws), um agonista NOD (muramila-Ws) e um agonista de STING (isto é, DMXAA-Ws). Compatível com as descobertas anteriores dos requerentes, a formação de nanopartícula estável era dependente da carga líquida dos conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo as moléculas hidrofóbicas diferentes (figura 39) com todas as composições imunogênicas diferentes com base em moléculas hidrofóbicas (H) compreendendo Ligandos diferentes com propriedades adjuvantes induzindo imunidade de célula T mensurável. De modo notável, o agonista TLR-7 induziu as respostas de magnitude mais alta e portanto,
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306/314 agonistas TLR-7 ou TLR-7/8 são usados em modalidades preferidas de conjugados de antigeno de peptídeo para induzir respostas de célula T para a prevenção ou tratamento de câncer ou doenças infecciosas.
Fixação do antigeno de peptídeo (A) a uma molécula hidrofóbica (H) usando químicas de ligador diferentes (amida e tio-éter)
[0560]Embora modalidades preferidas de conjugados de antigeno de peptídeo usem química de clique para formar um Ligador (L) a partir de precursor de ligador X1 e precursor de ligador X2, outros tipos de química de ligador são adequados. Desse modo, conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V foram ligados a moléculas hidrofóbicas (H) usando Ligadores à base de amida ou tio-éter (L), em que o Ligador (L) era ligado através do N- ou C-terminal do antigeno de peptídeo (A). Os resultados dos requerentes mostram que antigenos de peptídeo (A) ligados através do N- ou C-terminal da extensão de antigeno de peptídeo (através de B1 ou B2)) a um Ligador (L) compreendendo uma amida ou tio-éter levaram a conjugados de antigeno de peptídeo que formaram nanopartículas estáveis e induziram respostas de célula T de alta magnitude in vivo (figura 40), embora antigenos de peptídeo (A) ligados através de um Ligador de amida (L) à molécula hidrofóbica (B) induzissem respostas de magnitude mais alta em comparação com aqueles ligados usando um Ligador de tio éter (L). Desse modo, em modalidades preferidas, Ligadores de triazol ou amida estáveis (L) são usados para ligar antigenos de peptídeo (A) a moléculas hidrofóbicas (H) diretamente ou através de extensões (B1 ou B2).
Tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V compreendidos de moléculas hidrofóbicas diferentes (H) com base em ácidos graxos, lipideos e colesterol
[0561]Embora modalidades preferidas de conjugados de antigeno de peptídeo usem moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de polímeros, por
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307/314 exemplo, poli(aminoácidos) ou copolímeros di-bloco tipo A-B, moléculas hidrofóbicas (H) podem ser baseadas em uma variedade de outros moléculas hidrofóbicas, como ácidos graxos, lipídeos e colesterol. Desse modo, conjugados de antígeno de peptídeo da fórmula V foram ligados a moléculas hidrofóbicas (H) com base em ácido mirístico (MYr ou C14, compostos 49 e 52), ácido palmítico (Palm ou C16, compostos 51 e 53), colesterol (Chol, compostos 57 e 58) e um lipídeo de diacila (Pam2Cys, compostos 54 e 55). Compatível com as descobertas anteriores dos requerentes, formação de nanopartícula estável era dependente da carga líquida dos conjugados de antígeno de peptídeo compreendendo as moléculas hidrofóbicas diferentes (figura 41), com carga líquida maior ou igual a +6 levando à formação de nanopartícula estável. De modo importante, composições imunogênicas de conjugados de antígeno de peptídeo com base no ácido graxo, colesterol e moléculas hidrofóbicas baseadas em lipídeo (H) induziram respostas de célula T de magnitude alta in vivo (figura 41). Embora partículas baseadas em ácido graxo, colesterol e lipídeo demonstrassem desempenho adequado em termos de formação de partícula e atividade biológica como conjugados de antígeno de peptídeo, uma limitação é que moléculas hidrofóbicas (H) com base em ácidos graxos, colesterol e lipídeos são mais difíceis de se fabricar devido à solubilidade limitada desses materiais em muitos solventes (por exemplo, solubilidade ruim em DMSO, DMF e muitos álcoois) desse modo exigindo solventes dorados biologicamente mais severos (por exemplo, diclorometano e clorofórmio), o que torna a caracterização e purificação mais desafiadoras, especialmente para estratégias de vacina personalizada, e aumenta os riscos de segurança, em comparação, por exemplo, com moléculas hidrofóbicas (H) compreendidas de polímeros compreendendo grupos aromáticos que são solúveis na maioria dos solventes orgânicos (por exemplo, DMSO, metanol, etanol, acetonitrila, etc.).
Tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antígeno de
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308/314 peptideo da fórmula IV e V compreendidos de copolímeros di-bloco tipo A-B baseados em moléculas hidrofóbicas diferentes (Η)
[0562]Conjugados de antígeno de peptideo da fórmula IV e V foram preparados por fixar antigenos de peptideo (A) em copolímeros di-bloco baseados em HPMA (vide: Compostos 68 a 72). Inesperadamente, os copolímeros di-bloco de formação de micela formaram micelas de nanopartícula altamente estáveis independente da carga líquida do fragmento de antígeno de peptideo (figura 42). Desse modo, em algumas modalidades em que a molécula hidrofóbica (H) é um copolímero di-bloco compreendido de monômeros HPMA, conjugados de antígeno de peptideo da fórmula IV podem ser preferidos. O di-bloco pode formar partícula em condições aquosas independente de temperatura, ou formação de partícula pode ser dependente de temperatura. Além disso, um Ligando pode ser incluído em qualquer um dos dois blocos, quer nas extremidades ou nos grupos secundários do copolímero di-bloco. Os resultados dos requerentes mostram que o polímero dibloco do tipo A-B compreendido de monômeros HPMA assegura formação estável de nanopartículas e resulta em respostas de célula T de alta magnitude quando incluído como uma molécula hidrofóbica (H) de composições imunogênicas compreendendo conjugados de antígeno de peptideo. (Figura 42).
Tamanho de partícula e estabilidade de conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V com base em antigenos de peptideo (A) ligados a partículas
[0563]Em modalidades preferidas, o conjugado de antígeno de peptideo compreende uma molécula hidrofóbica (H); entretanto, em algumas modalidades, o conjugado de antígeno de peptideo compreende uma Partícula (P) pré-formada. A dependência da carga do fragmento de antígeno de peptideo sobre a estabilidade de partículas com base em conjugados de antígeno de peptideo da fórmula V compreendendo uma Partícula (P) foi avaliada por fixar fragmentos de antígeno de peptideo (C-B1-A-B2-) com carga líquida diferente em Partículas (P) pré-formadas
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309/314 com base em lipossomas, poliestireno, partículas de óxido de ferro e silico. Compatível com as descobertas anteriores dos requerentes, formação estável de nanopartículas era dependente da carga líquida dos conjugados de antigeno de peptídeo compreendendo as moléculas hidrofóbicas diferentes. (Figura 43).
Tamanho de partícula e atividade biológica de conjugados de antigeno de peptídeo que fornecem auto-antígenos usados para induzir tolerância
[0564]Conjugados de antigeno de peptídeo também podem ser usados para induzir tolerância ou células T reguladoras supressivas. Em modalidades preferidas para induzir tolerância ou supressão imune, um Ligando com propriedades adjuvantes tipicamente não é incluído. Ao invés, o conjugado de antigeno de peptídeo deve compreender uma partícula compreendendo o antigeno de peptídeo (A), uma molécula hidrofóbica (HO ou Partícula (P) e Ligador opcional (L), molécula carregada (C) e extensões (B1 e/ou B2) em que um Ligando com propriedades adjuvantes não é incluído. Para avaliar a capacidade de generalização dos conjugados de antigeno de peptídeo descritos na presente invenção para uso para induzir tolerância ou supressão, auto-antígenos de modelo para induzir artrite (isto é, colágeno II) e uma sindrome de CNS que lembra MS (isto é, glicoproteina de oligodendrócito mielina, “MOG”) foram produzidos como antígenos de peptídeo (A) em conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V. compatível com os resultados anteriores dos requerentes, auto-antígenos fornecidos em conjugados de antigeno de peptídeo da fórmula V se reuniram em nanopartículas estáveis e induziram respostas de célula T reguladoras de baixo nível (figura 44).
Tamanho de partícula e atividade biológica de partículas compreendidas de A-H + C-H ou A-H(C) (fórmula VI)
[0565]Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende uma partícula compreendida de conjugados de antigeno de peptídeo sem moléculas carregadas (por exemplo, A-[B2]-[L]-H) misturados com conjugados de molécula
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310/314 carregada (por exemplo, C-[A’]-[L]-H]. Por exemplo, um conjugado de antígeno de peptídeo compreendido de um neoantígeno LP (Adpgk) foi ligado através de um Ligador de triazol (L) à molécula hidrofóbica 2B3W2, para formar um conjugado de antígeno de peptídeo (A-L-H) que foi misturado com um conjugado de molécula carregada (C-H), Composto 42 (K10-2B3W2) para formar nanopartículas estáveis que induziram imunidade de célula T de alta magnitude (figura 45). Em outra modalidade, um conjugado de antígeno de peptídeo compreendido de um neoantígeno LP (Adpgk) foi ligado através de um Ligador de triazol (L) à molécula hidrofóbica 2B3W2, para formar um conjugado de antígeno de peptídeo (A-L-H) que foi misturado com um conjugado de molécula carregada compreendendo adicionalmente um antígeno conservado A’ (isto é, C-A’-H) para formar nanopartículas estáveis que induziram imunidade de célula T de alta magnitude (figura 45).
[0566]Alternativamente, a molécula carregada (C) pode ser ligada à molécula hidrofóbica (H) que é ligada a um antígeno de peptídeo (A) para formar um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula VI. Em um exemplo não limitador, um neoantígeno de peptídeo (Adpgk) é fornecido como um antígeno de peptídeo (A) em um conjugado de antígeno de peptídeo da fórmula A-[L]-H(C) e 0 conjugado resultante foi verificado formar nanopartículas estáveis e imunidade de célula T de alta magnitude. Desse modo, em modalidades preferidas de composições imunogênicas compreendendo partículas, uma molécula carregada (C) pode ser fornecida através de uma ligação direta ou indireta ao antígeno de peptídeo (A) ou em uma molécula separada que associa com partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo.
[0567]De modo importante, a presente revelação descreve abordagens novas de vacinas baseadas em peptídeos, mencionadas como conjugados de antígeno de peptídeo, que levam a aperfeiçoamentos inesperados na magnitude e
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311/314 variedade de células T geradas contra antígenos de peptídeo (A), incluindo antígenos associados a tumor (antígenos próprios, neoantígenos e antígenos virais), antígenos de doenças infecciosas e antígenos estranhos. Composições imunogênicas compreendendo conjugados de antigeno de peptídeo que excluem adjuvantes também foram verificados induzir respostas tolerogênicas /supressivas baixas contra auto antígenos, que podem ser úteis para tratamento de autoimunidade e/ou alergias.
[0568]Na presente revelação, os requerentes demonstram uma descoberta inesperada de que antígenos de peptídeo (A) compreendendo o epítopo mínimo (ME) pode resultar em respostas de célula T CD8 de magnitude maior do que o mesmo ME fornecido como um peptídeo longo sintético (SLP) quando ambos são normalizados para farmacocinética por fornecer ambos como nanopartículas compreendidas de conjugados de antigeno de peptídeo. Adicionalmente, os requerentes fornecem exemplos onde um ME fornecido em um SLP como um conjugado de antigeno de peptídeo não leva a respostas de célula T CD8 após uma imunização única, porém o ME fornecido como um conjugado de antigeno de peptídeo o faz, presumivelmente através de processamento mais eficiente que leva à apresentação aumentada de superfície de célula do ME no contexto de moléculas MHC I por APCs. Tais vacinas baseadas em ME foram verificadas expandir a variedade de respostas de célula T, que foram adicionalmente mostradas como sendo funcionais no contexto de reduzir o crescimento de tumores estabelecidos. Portanto, com base em descobertas inesperadas dos requerentes, modalidades preferidas de composições imunogênicas usam conjugados de antigeno de peptídeo que fornecem antígenos de peptídeo (A) com base em epítopos mínimos, ou uma combinação de MEs com SLPs. Embora, em algumas modalidades o antigeno de peptídeo (A) seja um SLP (ou “LP”).
[0569]Além disso, para fornecer controle aperfeiçoado sobre carga de
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312/314 material e tamanho e estabilidade de partículas fornecendo antígenos de peptídeo (A) com uma gama de propriedades, os requerentes revelam na presente invenção uma abordagem nova para fornecer antígenos de peptídeo (A) como conjugados de antígeno de peptídeo que se reúnem em associados supramoleculares micelares e de nanotamanho em tampões aquosos. De modo importante, os requerentes mostram como a composição de conjugados de antígeno de peptídeo, incluindo molécula carregada de estabilização de partícula opcional (C), molécula hidrofóbica (H) (Ligador) opcional e sequências de extensão (B1 e B2) opcionais podem ser otimizadas para assegurar que partículas estáveis de tamanhos definidos podem ser obtidas para qualquer antígeno de peptídeo possível (A). Os requerentes mostram que a formação confiável de partícula e estabilidade aperfeiçoada podem ser obtidos por sintonizar comprimento e as características hidrofóbicas da molécula hidrofóbica (H) bem como por modular a carga de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo.
[0570]Como meio para aperfeiçoar o processamento de epítopos de célula T compreendendo o conjugado de antígeno de peptídeo, os requerentes demonstram a utilidade de usar extensões N- e C-terminal (B1 e B2 ou ‘extensões’) que são estáveis em condições aquosas, porém são preferivelmente hidrolisadas por enzimas nos endossomas de células que apresentam antígeno, desse modo limitando o processamento e apresentação do antígeno a tais células, e promovendo liberação eficiente do epítopo de célula T CD8 e/ou CD4 mínimo nos AOCs.
[0571]Finalmente, na presente revelação, os requerentes avaliaram sistematicamente a composição ótima, número e potência de imuno-estimulantes baseados em agonista PRR necessários para promover imunidade de célula T. Os requerentes fornecem dados que o aumento progressivo no número e potência de agonistas TLR que induzem a produção de IL-12 e IFNs tipo I resulta inicialmente em magnitude aperfeiçoada das respostas de célula T, porém em uma descoberta
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313/314 nova e inesperada, que aumentos adicionais resultam em variedade antigênica mais estreita e magnitude mais baixa de respostas de células T. portanto, os requerentes reportam a composição, número e potência de imuno-estimulantes (isto é, agonistas PRR) ligados à molécula hidrofóbica (H) que são preferidos para fornecer a magnitude, qualidade e variedade ótimas de imunidade de célula T.
[0572]Em resumo, as descobertas inesperadas reveladas na presente invenção se referem a:
i. O comprimento ótimo de antígenos de peptídeo (A) usados em vacinas contra câncer para assegurar sensibilização confiável de imunidade de célula T, ii. Uso de sequências de extensão de antígeno de peptídeo, isto é, extensões N e/ou C-terminal (B1 e /ou B2) que facilitam fabricação de vacinas à base de peptídeo, promovem estabilidade de partícula e facilitam processamento para permitir apresentação eficiente por APCs.
iii. A composição de moléculas carregadas (C) e carga líquida de conjugados de antígeno de peptídeo necessários para induzir e estabilizar partículas de um tamanho ótimo para promover imunidade de célula T.
iv. Como o comprimento de molécula hidrofóbica (H) e composição transmitem no tamanho e estabilidade de partículas formadas por conjugados de antígeno de peptídeo, bem como sua imunogenicidade in vivo,
v. Como as características de potência e qualitativas do Ligando (por exemplo, agonista PRR) incluído nas moléculas hidrofóbicas (H) transmitem na variedade, magnitude e qualidade de respostas de célula T.
[0573]Em todo o relatório descritivo e reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outro modo, as palavras “compreendem” e “incluem” e variações como “compreendendo” e “incluindo” serão entendidas como sugerindo a inclusão de um número inteiro mencionado ou grupo de números inteiros, porém não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros, ou a
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314/314 inclusão de uma composição ou composições mencionadas, porém não a exclusão de qualquer outra composição ou composições.
[0574]A referência a qualquer técnica anterior nesse relatório descritivo não é e não deve ser tomada como, uma confirmação de qualquer forma de sugestão que tal técnica anterior faça parte do conhecimento geral comum.
[0575]Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a invenção não é limitada em seu uso à aplicação específica descrita. Nem a presente invenção é limitada em sua modalidade preferida com relação aos elementos específicos e/ou características descritas ou mostradas na presente invenção. Será reconhecido que a invenção não é limitada à modalidade ou modalidades reveladas, porém é capaz de inúmeros reorganizações, modificações e substituições sem se afastar do escopo da invenção como exposto e definido reivindicações a seguir.

Claims (57)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Conjugado de antígeno de peptídeo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender:
    a. um antígeno de peptídeo (A);
    e
    b. uma molécula hidrofóbica (H) ou uma partícula (P), em que o antígeno de peptídeo (A) é ligado à molécula hidrofóbica (H) ou à partícula (P) diretamente ou indiretamente através de uma extensão N-terminal opcional (B1) que é ligada ao N-terminal do antígeno de peptídeo (A) ou uma extensão C-terminal opcional (B2) que é ligada ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A), opcionalmente em que a molécula hidrofóbica (H) ou partícula (P) é ligada à extensão (B1 ou B2) indiretamente através de um ligador (L).
  2. 2. Conjugado de antígeno de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda uma molécula carregada (C).
  3. 3. Conjugado de antígeno de peptídeo, de acordo com a reivindicação 2 CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de antígeno de peptídeo tem uma carga eletrostática líquida maior ou igual a aproximadamente +3 ou menor ou igual a aproximadamente -3 em um tampão aquoso em um pH de aproximadamente 7.4.
  4. 4. Conjugado de antígeno de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula carregada (C) e a molécula hidrofóbica (H) ou a partícula (P) são ambas fixadas no N-terminal ou Cterminal do antígeno de peptídeo (A) diretamente ou através da extensão N-terminal opcional (B1) ou extensão C-terminal opcional (B2), respectivamente.
  5. 5. Conjugado de antígeno de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula carregada (C) e a molécula hidrofóbica (H) ou a partícula (P) são fixadas em extremidades opostas do antígeno de peptídeo (A).
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    2/17
  6. 6. Conjugado de antígeno de peptídeo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que (i) a molécula carregada (C) é fixada ao Nterminal do antígeno de peptídeo (A) através da extensão N-terminal (B1) e (ii) a molécula hidrofóbica (H) ou a partícula (P) é fixada através da extensão C-terminal (B2) ao C-terminal do antígeno de peptídeo (A).
  7. 7. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a extensão de N-terminal (B1) compreende uma sequência de peptídeo degradável por enzima compreendendo um aminoácido PN1, em que PN1 é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina, ou metionina.
  8. 8. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de peptídeo degradável por enzima compreendendo o aminoácido PN1 adicionalmente compreende pelo menos um dos seguintes:
    a. um aminoácido PN2 que é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina;
    b. um aminoácido PN3 que é selecionado entre glicina, serina, prolina ou leucina;
    c. um aminoácido PN4 que é selecionado entre arginina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, glicina ou serina; ou
    d. quaisquer das combinações de a-c.
  9. 9. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de peptídeo degradável por enzima compreende um tetrapeptídeo selecionado de:
    a. Ser-Leu-Val-Cit;
    b. Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 4);
    c. Ser-Pro-Val-Cit;
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    3/17
    d. Gly-Pro-Val-Cit;
    e. Gly-Pro-Leu-Cit;
    f. Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 5);
    g. Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6);
    h. Ser-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 21);
    i. Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7);
    j. Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8);
    k. Glu-Leu-Val-Cit;
    LGIu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 10);
    m. Glu-Pro-Val-Cit; or
    n. Glu-Gly-Val-Cit, em que Glu pode ser substituído por Asp; e/ou em que Arg pode ser substituído por Lys.
  10. 10. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a extensão de C-terminal (B2) compreende uma sequência de peptídeo degradável por enzima compreendendo:
    i. Um único aminoácido PCT selecionado entre glicina, serina, arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina;
    ii. um dipeptídeo, em que PCT é selecionado de glicina ou serina; e PC2’ é selecionado entre glicina, serina, prolina arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina;
    iii. um tripeptídeo em que PCT é selecionado de glicina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, serina, ou prolina; e PC3’ é selecionado entre glicina, serina, arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina;
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    4/17 iv. um tetrapeptídeo em que PC1’ é selecionado de glicina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, serina, prolina ou leucina; PC3’ é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina; e PC4’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina;
    v. um pentapeptídeo em que PC1’ é selecionado de glicina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, serina, prolina, arginina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; PC3’ é selecionado entre glicina, serina, prolina ou leucina; PC4’ é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina; e PC5’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina; ou vi. um hexapeptídeo, em que PC1’ é selecionado de glicina ou serina; PC2’ é selecionado entre glicina, serina ou prolina; PC3’ é selecionado entre glicina, serina, prolina, arginina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; PC4’ é selecionado de prolina ou leucina; PC5’ é selecionado entre glicina, valina, leucina ou isoleucina; e PC6’ é selecionado entre arginina, lisina, citrulina, glutamina, treonina, leucina, norleucina ou metionina.
  11. 11. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a extensão de C-terminal (B2) compreende uma sequência de peptídeo degradável por enzima compreendendo:
    a.um hexapeptídeo selecionado entre:
    i. Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 11);
    ii. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 13);
    iii. Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 61);
    iv. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit;
    v. Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit;
    vi. Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit;
    vii. Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 14);
    viii. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 15);
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    5/17 ix. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 16);
    x. Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Cit; e em que, Glu pode ser substituído por Asp; e/ou em que Arg pode ser substituído por Lys; ou
    b. Um pentapeptídeo selecionado entre:
    i. Gly-Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 17);
    ii. Gly-Ser-Pro-Val-Cit;
    iii. Gly-Ser-Pro-Leu-Cit;
    iv. Gly-Ser-Leu-Val-Cit;
    v. Gly-Lys-Pro-Val-Cit;
    vi. Gly-Lys-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 18);
    vii. Gly-Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 19);
    viii. Gly-Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 20); and em que, Glu pode ser substituído por Asp; e/ou em que Arg pode ser substituído por Lys; ou
    c. Um tetrapeptídeo selecionado entre:
    i. Ser-Leu-Val-Cit;
    ii. Ser-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 4);
    iii. Ser-Pro-Val-Cit;
    iv. Ser-Pro-Leu-Cit;
    v. Glu-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 5);
    vi. Ser-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 6);
    vii. Ser-Leu-Val-Arg (SEQ ID NO: 7);
    viii. Lys-Pro-Leu-Arg (SEQ ID NO: 8);
    ix. Glu-Leu-Val-Cit;
    x. Glu-Leu-Val-Leu (SEQ ID NO: 10);
    xi. Glu-Pro-Val-Cit; ou
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    6/17 xii.Glu-Gly-Val-Cit, and em que, Glu pode ser substituído por Asp; e/ou em que Arg pode ser substituído por Lys; ou
    d. Um tri-peptídeo selecionado entre:
    i. Gly-Ser-Gly;
    ii. Gly-Ser-Arg;
    iii. Gly-Ser-Leu;
    iv. Gly-Ser-Cit;
    v. Gly-Pro-Gly;
    vi. Gly-Pro-Arg;
    vii. Gly-Pro-Leu;
    viii. Gly-Pro-Cit; ou
    e. um di-peptídeo selecionado entre
    i. Gly-Ser;
    ii. Gly-Pro;
    iii. Gly-Arg;
    iv. Gly-Cit; or
    f. Um aminoácido único selecionado do grupo que consiste em Gly, Ser, Ala, Arg, Lys, Cit, Vai, Leu, Met, Thr, Gin ou Nle.
  12. 12. Conjugado de antígeno de peptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a partícula (P) compreende poliestireno, poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), lipossomas, sais minerais de alumínio ou emulsões.
  13. 13. Conjugado de antígeno de peptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) é uma molécula alifática cíclica ou cadeia longa, ramificada, ou um ácido graxo,
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    7/17 lipídeo ou derivado de esterol que é insolúvel até aproximadamente 0,1 mg/mL em um tampão aquoso aproximadamente em um pH de 7.4.
  14. 14. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica compreende um polímero baseado em unidades de monômero selecionadas entre acrilatos, acrilamidas, met(acrilatos), met(acrilamidas), monômeros de estirila, monômeros de vinila, dioxofosfolanos, ésteres cíclicos, aminoácidos naturais ou não naturais e polímeros que se originam de reações de diois ou diaminas com di- ou poli-isociantos, opcionalmente em que um adjuvante é ligado a um ou mais monômeros compreendendo o polímero.
  15. 15. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) é um poli(aminoácido) da Fórmula I:
    o
    Figure BR112019020853A2_C0001
    X 'Ligando
    Fórmula I em que R2 é selecionado de um de hidrogênio, hidroxila ou amina, x está entre 3 e 300; y3 é de 1 a 8 e o Ligando é ligado através de um ligador X através de qualquer meio adequado.
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    8/17
  16. 16. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) é um poli(aminoácido) baseado na Fórmula II:
    CB
    Figure BR112019020853A2_C0002
    FG
    Ligando
    Fórmula II em que I está entre 3-300 e o está entre 0-300; R3 é selecionado de um de hidrogênio, hidroxila ou amina; R4 é selecionado de um de hidrogênio, alquila inferior,
    CH2-OH
    Figure BR112019020853A2_C0003
    Figure BR112019020853A2_C0004
    Figure BR112019020853A2_C0005
    Figure BR112019020853A2_C0006
    Figure BR112019020853A2_C0007
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    9/17 y11 tipicamente selecionado de 1 a 8, e FG é um grupo funcional selecionado entre ácido carboxílico, aldeído, cetona, amina, tiol, azida ou alquino que é ligado a um Ligando com propriedades adjuvantes; e o N-terminal é ligado diretamente através de uma ligação de amida ou indiretamente através de um ligador diretamente ao antígeno de peptídeo ou através extensão (B1 ou B2) e / ou Ligador (L) ou molécula carregada (C).
  17. 17. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) compreende um homopolímero ou copolímero consistindo em poli(leucina), poli(triptofano), poli(yglutamil éter monometílico de dietileno glicol), poli(y-glutamato de benzila), poli(Nisopropilacrilamida) (NIPAM), poli[2(2-metoxietoxi)etilmetacrilato)] (DEGMA) ou poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) (HPMA).
  18. 18. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 15 CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) compreendendo poli(aminoácidos) da fórmula I é enxertada ou ligada na extremidade a um segundo polímero baseado em poli(leucina), poli(triptofano), poli(y-glutamil éter monometílico de dietileno glicol), poli(y-glutamato de benzila), poli(N-isopropilacrilamida) (NIPAM), poli[2(2-metoxietoxi)etilmetacrilato)] (DEGMA) ou poli[N-(2hidroxipropil)metacrilamida) (HPMA).
  19. 19. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula hidrofóbica (H) compreendendo poli(aminoácidos) da fórmula II é enxertada ou ligada na extremidade a um segundo polímero baseado em poli(leucina), poli(triptofano), poli(y-glutamil éter monometílico de dietileno glicol), poli(y-glutamato de benzila), poli(N-isopropilacrilamida) (NIPAM), poli[2(2-metoxietoxi)etilmetacrilato)] (DEGMA) ou poli[N-(2hidroxipropil)metacrilamida) (HPMA).
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    10/17
  20. 20. Conjugado de antígeno de peptídeos de acordo com a reivindicação 18 ou a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo polímero compreende uma pluralidade de unidades de monômero de aproximadamente 30 a 500 unidades de monômero.
  21. 21. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais adjuvantes são ligados como um grupo secundário pendente ao polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H).
  22. 22. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais adjuvantes são ligados a uma extremidade do polímero (semi-telecélico).
  23. 23. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o adjuvante é um agonista receptor do tipo Toll ou um agonista STING.
  24. 24. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o agonista receptor do tipo Toll é um agonista do receptor do tipo Toll-7 e/ou -8.
  25. 25. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o adjuvante é uma imidazoquinolina da fórmula III:
    Figure BR112019020853A2_C0008
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    11/17
    Fórmula III em que R7 é selecionado de um entre hidrogênio, alquila inferior opcionalmente substituída ou éter inferior opcionalmente substituído; e R8 é selecionado de um entre acrilamina opcionalmente substituída ou alquil amina inferior opcionalmente substituída.
  26. 26. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que três ou mais moléculas de imidazoquinolina da fórmula III são ligadas ao polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H) e R8 é selecionado de um de alquilamina inferior opcionalmente substituída.
  27. 27. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que três ou menos moléculas de imidazoquinolina da fórmula III são ligadas ao polímero compreendendo a molécula hidrofóbica (H) e R8 é selecionado de um de arilamina opcionalmente substituída.
  28. 28. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a partícula (P) ou molécula hidrofóbica (H) é insolúvel até 0,1 mg/mL em um tampão aquoso em um pH de aproximadamente 7.4 e em temperaturas entre aproximadamente 20°C e 40°C.
  29. 29. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de antígeno de peptídeo é montado em partículas compreendidas de micelas ou outros tipos de associados supramoleculares de tamanho nano ou micro compreendendo 2 ou mais conjugados de antígeno de peptídeo e são maiores que 5 mm em diâmetro em um tampão aquoso em um pH de aproximadamente 7.4.
  30. 30. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de antígeno de peptídeo é
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    12/17 montado em micelas entre aproximadamente 5 e 200 nm em diâmetro em um tampão aquoso em um pH de aproximadamente 7.4.
  31. 31. Conjugado de antigeno de peptídeos de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de antigeno de peptídeo é um agregado em um tampão aquoso em um pH de aproximadamente 7.4.
  32. 32. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que um precursor de ligador X1 é ligado diretamente ou através de uma extensão de C-terminal (B2) ao antigeno de peptídeo (A) e forma uma ligação com um precursor de ligador X2 em uma molécula hidrofóbica (H) ou partícula (P).
  33. 33. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 32,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o precursor de ligador X1 tem a fórmula:
    O
    Η H ----N---C----U----R1 (
    FG
    Em que a amina N-terminal do tag é ligada diretamente ou através da extensão C-terminal B2 a um antigeno de peptídeo (A); R1 é selecionado de um entre hidrogênio, hidroxila ou amina; y1 é um inteiro de 1 a 8; e FG é selecionado de um entre tiol, amina, azida ou alquino (ou DBCO).
  34. 34. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o FG é uma azida e y1 é 4, adicionalmente em que a azida se liga a uma molécula DBCO que é ligada a uma partícula (P) ou a uma molécula hidrofóbica (H).
  35. 35. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que um precursor de ligador X1 é ligado à extensão N-terminal (B1) e tem a fórmula:
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    13/17
    Ο
    Figure BR112019020853A2_C0009
    em que a carbonila do tag é ligado diretamente ou através de uma extensão B1 ao N-terminal de um antígeno de peptídeo (A); y2 é um inteiro de 1 a 8; e FG é selecionado de um entre tiol, amina, azida ou alquino (ou DBCO).
  36. 36. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de peptídeo (P), a extensão N-terminal opcional (B1), a extensão C-terminal opcional (B2), e a molécula carregada opcional (C) e precursor de ligador opcional X1 são sintetizados como um peptídeo único por síntese de peptídeo de fase sólida e em que a extensão C-terminal (B2) contém uma prolina (ou pseudoprolina durante síntese de peptídeo de fase sólida enquanto a sequência é ligada à resina usada para sintetizar o peptídeo).
  37. 37. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula carregada (C) compreende um ou mais grupos funcionais selecionados de uma amina primária, uma amina secundária, uma amina terciária, uma amina quaternária, guanidínio, imidazólio, amônio, sulfônico, fosfônio, um carboxilato, um sulfato, um fosfato, um fosforamidato ou um fosfonato.
  38. 38. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula carregada (C) compreende grupos funcionais tanto negativa como positivamente carregados.
  39. 39. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de grupos funcionais carregados compreendendo a molécula carregada (C) é ajustado para o seguinte:
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    14/17
    a. a carga eletrostática líquida de conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor positivo maior que ou igual a aproximadamente +6 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia maior que ou igual a aproximadamente 0.75;
    b. a carga eletrostática líquida de conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor positivo maior que ou igual a aproximadamente +5 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia maior que ou igual a aproximadamente 0.25 e menor que aproximadamente 0.75;
    c. a carga eletrostática líquida de conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor positivo maior que ou igual a aproximadamente +4 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia menor que aproximadamente 0.25;
    d. a carga eletrostática líquida de conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor negativo menor que ou igual a aproximadamente -6 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia maior que ou igual a aproximadamente 0.75;
    e. a carga eletrostática líquida de conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor negativo menor que ou igual a aproximadamente -5 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia maior que ou igual a aproximadamente 0.25 e menor que aproximadamente 0.75; ou
    f. a carga eletrostática líquida de Conjugado de antígeno de peptídeo compreende um valor positivo maior que ou igual a aproximadamente -4 quando o antígeno peptídeo (A) tem uma média grande de valor de hidropatia menor que aproximadamente 0.25.
  40. 40. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de peptídeo (A), a extensão Nterminal (B1), extensão C-terminal (B2), molécula carregada (C) e precursor de
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    15/17 ligador X1 são produzidos como um peptídeo único que é solúvel em tampão aquoso até aproximadamente 1.0 mg/mL em um pH de aproximadamente 7.4.
  41. 41. Partícula, CARACTERIZADA pelo fato de compreender conjugado de antigeno de peptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40.
  42. 42. Partícula, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pelo fato de que a partícula compreende uma pluralidade de conjugados de antigeno de peptídeo diferentes.
  43. 43. Composição imunogênica CARACTERIZADA pelo fato de compreender conjugado de antigeno de peptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40 ou as partículas de acordo com as reivindicações 41 a 42.
  44. 44. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADA pelo fato de compreender ainda um adjuvante de vacina.
  45. 45. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 43 ou reivindicação 44, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma pluralidade de conjugados de antigeno de peptídeo diferentes.
  46. 46. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 e 42 ou composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o antigeno de peptídeo (A) compreende antígenos associados a tumor.
  47. 47. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 46, partícula de acordo com a reivindicação 46 ou composição imunogênica de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o antigeno associado a tumor é um neoantígeno.
  48. 48. Conjugado de antigeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40 e 46 a 47, partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42 e 46 a 47, ou composição imunogênica de acordo com
    Petição 870190099285, de 03/10/2019, pág. 24/27
    16/17 qualquer uma das reivindicações 43-47, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de peptídeo (A) é um epítopo de célula T CD4 ou CD8 T mínimo.
  49. 49. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição imunogênica compreende de 10 a 50 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes compreendidos de antígenos de peptídeo (A) selecionados de epítopos de célula T CD4 T mínimos, epítopos de célula T CD8 ou epítopos de célula T tanto CD4 como CD8 mínimos.
  50. 50. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição imunogênica compreende 10-50 conjugados de antígeno de peptídeo diferentes compreendidos de antígenos de peptídeo (A) selecionados de ambos os epítopos de célula T CD4 mínimos, epítopos de célula T CD8 mínimos ou epítopos de célula T tanto CD4 como CD8 mínimos, bem como 15 a 35 aminoácidos peptídeos longos sintéticos compreendendo um epítopo de célula T CD8 e/ou epítopo de célula T CD4.
  51. 51. Conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com a reivindicação 48, partícula de acordo com a reivindicação 48, ou composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que os epítopos de célula T CD8 ou célula T CD4 mínimos têm uma afinidade de ligação prevista menor ou igual a 0,5 percentil do algoritmo de consenso IEDB para as moléculas MHC casadas com o indivíduo.
  52. 52. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 51 adicionalmente compreendendo um conjugado de antígeno de peptídeo, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno de peptídeo (A) é um epítopo de célula T CD4 universal.
    Petição 870190099285, de 03/10/2019, pág. 25/27
    17/17
  53. 53. Método de tratar um paciente que sofre de uma doença, CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar ao paciente que sofre da doença, o conjugado de antígeno de peptídeo do mesmo ou a composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
  54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda administrar uma modalidade imunoterapêutica adicional, incluindo inibidores de checkpoint imune, como anticorpos anti-PD1, anti-PD-L1 ou anti-CTLA-4; terapias baseadas em célula T de receptor de antígeno quimérico e linfocítico de infiltração de tumor; anticorpos biespecíficos; anticorpos antitumor; ou drogas proejadas para superar supressão imune.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende um esquema de imunização heterólogo, em que as composições imunogênicas ou conjugado de antígeno de peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores é usado como um iniciador ou um reforço com uma vacina heteróloga.
  56. 56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento é usado em combinação com terapia de radiação, quimioterapia ou cirurgia.
  57. 57. Uso do conjugado de antígeno de peptídeo, partícula, ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.
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