BR112019027211A2

BR112019027211A2 - proteínas de ligação ao antígeno do papilomavírus anti-humano (hpv) e seus métodos de uso

Info

Publication number: BR112019027211A2
Application number: BR112019027211-9A
Authority: BR
Inventors: Kevin A. Bray; Frank DELFINO; Matthew C. Franklin; Elena S. Garnova; Jessica R. Kirshner; Douglas MacDonald; William Olson; Gavin Thurston
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2020-06-30
Also published as: CO2020000733A2; US20190000956A1; CA3066779A1; US20230270837A1; CN110914295A; IL271231A; US10806780B2; JP2024026308A; AU2018290856A1; EP3645562A1; KR20200022467A; PH12019502763A1; KR20240135065A; WO2019005897A1; MX2019015477A; MX2024002706A; IL271231B2; CL2019003802A1; JP2020529835A; SG11201912240QA

Abstract

A presente invenção refere-se a proteínas de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um peptídeo do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA, e a métodos terapêuticos e diagnósticos de uso dessas proteínas de ligação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍ- NAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO PAPILOMAVÍRUS ANTI- HUMANO (HPV) E SEUS MÉTODOS DE USO".

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Pa- tente Provisório US nº 62/525,937, depositado em 1º de maio de 2017, cujos conteúdos são expressamente incorporados por referência aqui em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequência que foi depositada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 27 de junho de 2018, é nomeado 10355WO01_seq- listing.txt e tem 253.600 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere a proteínas de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um peptídeo do papilomaví- rus humano (HPV) exibido pelo HLA, e a métodos terapêuticos e de diagnóstico de uso dessas proteínas de ligação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] O Papilomavírus Humano (HPV) é um grupo de pequenos vírus de DNA não envelopados que são extremamente comuns em todo o mundo. O HPV é transmitido principalmente através do contato sexual, e a maior parte das pessoas é infectada com HPV logo após o início da vida sexual.

[005] Existem mais de 170 tipos de HPV, alguns deles podem causar verrugas ou papilomas benignos, e outros, pelo menos 13 de- les, causam câncer (também conhecido como HPVs de alto risco), in- cluindo o câncer do colo do útero, câncer anogenital (cânceres de ânus, pênis, vagina e vulva), cânceres de cabeça/pescoço e cânceres da orofaringe, incluindo a parte de trás da garganta, a base da língua e as amígdalas. De fato, o HPV está presente em 20-40% de todos os carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) e em 100% dos cânceres cervicais.

[006] O câncer do colo do útero é o segundo câncer mais comum em mulheres que vivem em regiões menos desenvolvidas, com uma estimativa de 445.000 novos casos em 2012 (84% dos casos novos em todo o mundo). Em 2012, cerca de 270.000 mulheres morreram de câncer do colo do útero; mais de 85% destas mortes ocorrendo em países de renda baixa e média.

[007] Dois tipos de HPV (16 e 18) causam aproximadamente 70% de todos os cânceres do colo do útero e lesões pré-cancerosas do colo do útero. O desenvolvimento de câncer após infecção persis- tente com um subtipo do HPV de alto risco, como o HPV 16 ou 18, é principalmente atribuído à expressão de duas oncoproteínas virais, E6 e E7, que são continuamente expressas em lesões e apresentadas na superfície celular pelo MHC classe, mas não são expressas em células normais. E6 e E7 promovem a instabilidade genômica e a transforma- ção celular por degradação dos supressores tumorais p53 e Rb de um modo dependente do proteasoma. Os tumores surgem vários anos após os eventos imortalizantes celulares iniciais e a expressão contí- nua de E6 e E7 é necessária para manutenção do fenótipo transfor- mado e prevenção da parada do crescimento celular e/ou apoptose (McLaughlin-Drubin M.E. & Miinger K., Virology (2009) 384:335-344).

[008] Embora vacinas direcionadas às principais proteínas do capsídeo do HPV L1 e L2 dos subtipos HPV-6, -11, -16 e -18 tenham sido desenvolvidas para prevenir a infecção, essas vacinas não podem tratar indivíduos com lesões estabelecidas. Assim, o tratamento de in- divíduos com câncer do colo do útero continua sendo o uso de abor- dagens tradicionais que são altamente invasivas e mórbidas, como cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Além disso, embora esses tra- tamentos possam fornecer benefícios para indivíduos com câncer do colo do útero em estágio inicial, eles são de valor limitado para pacien- tes com câncer do colo do útero avançado ou recorrente.

[009] Assim, há uma necessidade insatisfeita na técnica de novas estratégias terapêuticas para atingir o HPV com alta especificidade e para tratar o câncer do colo do útero e outros cânceres causados por HPV.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antí- geno que se ligam especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido pelo HLA (HLA-A2:HPV16E7). As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam com um alto grau de especificidade ao HPV16E7 exibido pelo HLA e não se ligam a peptídeos exibidos pelo HLA que diferem em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos. As proteínas de ligação ao antígeno da invenção permitem alcançar especificamente as célu- las que apresentam peptídeos HPV16E7 (ou seja, células que apre- sentam em sua superfície um peptídeo HPV16E7 ligado a uma molé- cula MHC, por exemplo, HLA-A2), como células cancerosas que ex- pressam HPV16E7 e, em algumas modalidades, estimular a ativação de células T, por exemplo, estimular a morte dessas células mediada por células T. Além disso, quando fundidas a uma fração detectável, as proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção permitem o diagnóstico e o prognóstico de doenças ou distúrbios positivos para HPV16E7, com alta sensibilidade às alterações no número e distribui- ção de células que apresentam o peptídeo HPV16E7, uma medida mais relevante de progressão da doença do que os níveis de HPV na circulação.

[0011] As proteínas de ligação ao antígeno da invenção podem ser anticorpos, como anticorpos de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4), ou podem compreender apenas uma parte de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv), e podem ser modificadas para afetar a funciona- lidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno da invenção podem ser anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em algumas modalida- des, as proteínas de ligação ao antígeno podem ser biespecíficas.

[0012] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece pro- teínas de ligação ao antígeno recombinantes isoladas, que se ligam especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano exibido pelo HLA (HPV), como um peptídeo exibido pelo HLA compreendendo resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno são anticorpos. Em algumas modalidades, os anticorpos são totalmente humanos.

[0013] As proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção são listadas nas Tabelas 1 e 2 neste documento. A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequências de aminoáci- dos das regiões variáveis de cadeia pesada (HCVRs), regiões variá- veis da cadeia leve (LCVRs), regiões determinantes da complementa- ridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e regiões de- terminantes da complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) dos anticorpos anti-HLA-A2:HPV16E7 exemplificativos. A Ta- bela 2 apresenta os identificadores de sequências de ácido nucleico das HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 dos anticorpos anti-HLA-A2:HPV16E7 exemplificativos.

[0014] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antí- geno compreendendo uma HCVR composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 1, ou uma sua sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0015] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma LCVR composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência mui- to semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden- tidade de sequência com a mesma.

[0016] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências de aminoácidos de uma HCVR e uma LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 1 pareada com qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listada na Tabela 1. Segundo algumas modalidades, a presente inven- ção fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR contido em qualquer uma das proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o par de sequências de ami- noácidos HCVR/LCVR é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/202, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/290, 298/306, 314/322, 330/338, 346/354, 362/370, 378/386, 394/402, 410/418, 426/434, 442/450, 458/466, 474/482, 490/498, 506/514 e 522/530. Em algumas modalidades, o par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR é se- lecionado dentre umas das SEQ ID nos: 2/10 (por exemplo,

H4sH17364N), 34/42 (por exemplo, H4sH17670P), 82/90 (por exem- plo, H4sH17675P), 194/202 (por exemplo, H4sH17930N2), 282/290 (por exemplo, H4sH21064P) e 506/514 (por exemplo, H4sH17363N).

[0017] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreen- dendo uma HCVR e uma LCVR, a referida HCVR composta por uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1, não tendo mais do que cinco substituições de aminoácidos, e a referida LCVR composta por uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1, não tendo mais do que cinco substituições de aminoácidos. Por exemplo, a presente in- venção fornece proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a referida HCVR composta por uma sequência de aminoácidos SEQ ID nº: 194, não tendo mais do que cinco substituições de aminoácidos, e a referi- da LCVR composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 202, não tendo não mais do que cinco substituições de aminoácidos. Em outra modalidade exemplificativa, a presente invenção fornece pro- teínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a referida HCVR composta por uma sequên- cia de aminoácidos SEQ ID nº: 194, tendo pelo menos uma substitui- ção de aminoácidos, e a referida LCVR composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 202 com pelo menos uma substituição de aminoácido.

[0018] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (HCDR1) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR1 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0019] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR2 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0020] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR3 da cadeia pesada (HCDR3) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR3 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0021] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR1 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0022] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR2 da cadeia leve (LCDR2) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR2 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0023] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3)

composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR3 listadas na Tabela 1, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0024] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências de aminoácidos da HCRD3 e LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR3 listadas na Tabela 1 pareada com qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR3 listadas na Tabela 1. Segundo algumas modalidades, a presente invenção for- nece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo um par de se- quências de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contido em qualquer uma das proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o par de sequências de ami- noácidos HCDR3/ LCDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID nos: 8/16 (por exemplo, H4sH17364N), 40/48 (por exemplo, H4sH17670P), 88/96 (por exemplo, H4sH17675P), 200/208 (por exemplo, H4sH17930N2), 288/296 (por exemplo, H4sH21064P) e 512/520 (por exemplo, H4sH17363N).

[0025] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a referida HCVR composta pela HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere de uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1 em 1 aminoácido, pela HCDR2 compreendendo uma se- quência de aminoácidos que difere de uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1 em 1 aminoácido, e pela HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere de uma sequência de ami- noácidos listada na Tabela 1 em 1 aminoácido. Em algumas modali- dades, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a referida LCVR composta pela LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que dife- re de uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1 em 1 amino- ácido, pela LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere de uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1 em 1 aminoácido, e pela LCDR3 compreendendo uma sequência de amino- ácidos que difere de uma sequência de aminoácidos listada na Tabela 1 em 1 aminoácido Por exemplo, a presente invenção fornece proteí- nas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a referida HCVR compreendendo a HCDR1 composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 196 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID Nº: 196 em 1 aminoácido, a HCDR2 composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 198 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID nº: 198 em 1 aminoácido, e a HCDR3 composta por uma se- quência de aminoácidos da SEQ ID nº: 200 ou uma sequência de ami- noácidos que difere da SEQ ID nº: 200 em 1 aminoácido. Em outra modalidade exemplificativa, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo uma HCVR e uma LCVR, a refe- rida HCVR composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 204 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID nº: 204 em 1 aminoácido, a LCDR2 composta por uma sequência de ami- noácidos da SEQ ID nº: 206 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID nº: 206 em 1 aminoácido, e a LCDR3 composta por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID nº: 208 ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID nº: 208 em 1 aminoácido.

[0026] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas em qual- quer uma das proteínas de ligação ao antígeno listadas na Tabela 1.

Em algumas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 é selecionado a par- tir do grupo que consiste em SEQ ID nos: 4-6-8-12-14-16 (por exemplo, H4sH17364N), 36-38-40-44-46-48 (por exemplo, H4sH17670P), 84- 86-88-92-94-96 (por exemplo, H4sH17675P), 196-198-200-204-206- 208 (por exemplo, H4sH17930N2), 284-286-288-292-294-296 (por exemplo, H4sH21064P) e 508-510-512-516-518-520 (por exemplo, H4sH17363N).

[0027] Em uma modalidade, a presente invenção fornece proteí- nas de ligação ao antígeno compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) con- tido em um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR, como definido por qualquer uma das proteínas de ligação ao antígeno exemplificativas listadas na Tabela 1. Por exemplo, a presente inven- ção inclui proteínas de ligação ao antígeno compreendendo o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1- LCDR2-LCDR3 contido em um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2/10 (por exemplo, H4sH17364N), 34/42 (por exemplo, H4sH17670P), 82/90 (por exemplo, H4sH17675P), 194/202 (por exemplo, H4sH17930N2), 282/290 (por exemplo, H4sH21064P) e 506/514 (por exemplo, H4sH17363N).

[0028] Métodos e técnicas para identificação das CDRs dentro das sequências de aminoácidos das HCVR e LCVR são bem conhecidas na técnica e podem ser usados para identificar as CDRs dentro das sequências de aminoácidos das HCVR e/ou LCVR aqui descritas. Convenções exemplificativas que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a defini- ção Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de kabat se baseia na variabilidade da sequência, a definição de Chothia se baseia na localização das regiões de ciclo estrutural, e a definição de AbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat e Chothia. Veja, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al- Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificação das sequências de CDR dentro de uma proteína de ligação ao antígeno.

[0029] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 com um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosila- ção indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma porção fuco- se presente na cadeia de oligossacarídeos, por exemplo, para aumen- tar a função da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (veja Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplica- ções, a modificação da galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0030] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno da invenção são anticorpos monoclonais compreendendo um par de sequências de aminoácidos de uma HCVR e uma LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de ami- noácidos da HCVR listadas na Tabela 1 pareada com qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais compreendem um domínio Fc de um isotipo selecionado a partir do grupo que consiste em IgA, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM, uma variante de- le.

[0031] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antí- geno, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreendendo uma cadeia pesada composta por uma sequência de aminoácidos se-

lecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HC listadas na Tabela 3, ou uma sua sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0032] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreen- dendo uma cadeia leve composta por uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LC listadas na Tabela 3, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0033] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreen- dendo um par de sequências de aminoácidos de uma HC e uma LC (HC/LC) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoáci- dos da HC listadas na Tabela 3 pareada com qualquer uma das se- quências de aminoácidos da LC listadas na Tabela 3. Segundo algu- mas modalidades, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreen- dendo um par de sequências de aminoácidos HC/LC contido em qual- quer um dos anticorpos anti-PD-1 exemplificativos listados na Tabela

3. Em algumas modalidades, o par de sequências de aminoácidos HC/LC é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID nos: 578/579, 580/581, 582/583, 584/585, 586/587, 588/589, 590/591, e 592/593.

[0034] Em um aspecto, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a um complexo de peptídeos HLA, em que a proteína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno está em contato com pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo me-

nos 90% dos resíduos de aminoácidos do peptídeo que é compreendi- do no complexo de peptídeos HLA. Em algumas modalidades, a prote- ína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno "cobre" ou está em contato com todos os resíduos de aminoácidos compreendidos no complexo de peptídeos HLA. Em algumas modali- dades, a proteína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga a um complexo de peptídeos HLA com alta afini- dade e especificidade, em que a proteína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno está em contato com todo o comprimento do peptídeo exibido. "Contato", conforme usado neste documento, inclui ligações de hidrogênio diretas ou mediadas por água, interações carga a carga ou interações hidrofóbicas/de van der Waals. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao complexo de peptídeos 11-19 do HLA-A2-HPV16E7, em que a proteína de ligação ao antígeno se liga a pelo menos 6 de 10 resíduos de aminoácidos dos peptídeo 11-19 (SEQ ID Nº: 538) e a HLA-A2, de modo que cobre completa- mente o complexo de peptídeos HLA-A2. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antí- geno compreende as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que cada HCVR e LCVR tem uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir das sequências HCVR e LCVR listadas na Tabela 1. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno é totalmente humana. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antíge- no não são obtidas usando métodos e tecnologias de phage display. Em uma modalidade, as proteínas de ligação ao antígeno compreen- dem uma região variável da cadeia leve do sub-tipo IGKV1-39.

[0035] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam aos antígenos 11-19 HLA-A2:HPV16E7, em que a proteína de ligação ao antígeno se liga a um ou mais aminoácidos de SEQ ID nº: 538. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao an- tígeno se liga a pelo menos 6 aminoácidos da SEQ ID nº: 538. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno se liga a um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Y11, D14, L15, P17 e E18 da SEQ ID nº: 538.

[0036] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece a proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epí- topo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (peptídeo HPV16E7), em que o epítopo conformacional compreende um ou mais aminoácidos da SEQ ID nº:

538. Em algumas modalidades, o epítopo conformacional compreende um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Y11, D14, L15, P17 e E18 da SEQ ID nº: 538.

[0037] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno que competem por ligação específica ao HLA- A2:HPV16E7 com uma proteína de ligação ao antígeno compreenden- do as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que cada HCVR e LCVR tem uma sequência de aminoácidos selecionada a par- tir das sequências das HCVR e LCVR listadas na Tabela 1.

[0038] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno que competem cruzadamente pela ligação ao HLA- A2:HPV16E7 com uma proteína de ligação ao antígeno de referência compreendendo as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que cada HCVR e LCVR tem uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir das sequências das HCVR e LCVR listadas na Tabela

1.

[0039] A presente invenção também fornece proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo que uma proteína de li- gação ao antígeno de referência compreendendo as CDRs de uma

HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que cada HCVR e LCVR tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências das HCVR e LCVR listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo que uma proteína de ligação ao antígeno de referência compreendendo as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que a HCVR é selecionada a partir do grupo que con- siste em SEQ ID nos: 2, 34, 82, 194, 282 e 504, e a LCVR é seleciona- da a partir do grupo que consiste em SEQ ID nos: 10, 42, 90, 202, 290 e 514.

[0040] Em uma modalidade, a invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno recombinante isolada que se liga especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (peptídeo HPV16E7), em que a proteína de ligação ao antígeno tem uma propriedade selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) se liga ao peptídeo 11-19 HLA- A2:HPV16E7 monomérico com uma constante de equilíbrio de disso- ciação (kD) menor que 20nM, conforme medido em um ensaio de res- sonância plasmônica de superfície a 25 °C; (b) se liga ao peptídeo 82- 90 HLA-A2:HPV16E7 monomérico com uma constante de equilíbrio de dissociação (kD) inferior a cerca de 25nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25 °C; (c) se liga ao peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 que expressa células com um EC50 a menor do que cerca de 6 nM e não se liga a células que expressam peptídeos não alvo previsto, como determinado pelo ensaio de lumi- nescência; (d) se liga a células que expressam o peptídeo 82-90 HLA- A2:HPV16E7 com um CE50 a menor do que cerca de 1 nM e substan- cialmente não se liga a células que expressam peptídeos não alvo previsto, como determinado pelo ensaio de luminescência; (e) se liga a células que expressam o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um

EC50 inferior a cerca de 30 nM, conforme determinado pelo ensaio de citometria de fluxo; (f) se liga a células que expressam o peptídeo 82- 90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 75 nM, confor- me determinado pelo ensaio de citometria de fluxo; e (g) o epítopo conformacional compreende um ou mais aminoácidos da SEQ ID nº:

538. Conforme descrito em outro lugar neste documento, um "peptídeo não alvo" se refere a um peptídeo que difere em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos de um peptídeo-alvo (por exemplo, o peptídeo 11-19 HPV16 E7).

[0041] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece mo- léculas de ácido nucleico que codificam proteínas de ligação ao antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7. Por exemplo, a presente invenção forne- ce moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequên- cias de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 1; em algumas mo- dalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das sequên- cias de ácidos nucleicos das HCVR listadas na Tabela 2, ou uma se- quência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0042] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0043] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da HCDR1 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0044] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da HCDR2 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0045] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da HCDR3 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0046] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da LCDR1 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona-

da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0047] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da LCDR2 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0048] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da LCDR3 listadas na Tabela 1; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência com a mesma.

[0049] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 é como definido por qualquer das proteínas de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 exemplificativas listadas na Tabela 1.

[0050] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, LCDR1-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de sequências de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 é co- mo definido por qualquer das proteínas de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 exemplificativas listadas na Tabela 1.

[0051] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer das sequên- cias de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 1, e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos das sequências de ami- noácidos da LCVR listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleo- tídeos selecionada a partir de qualquer das sequências de ácidos nu- cleicos da HCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito seme- lhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma, e uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir de qualquer das sequências de ácidos nucleicos da LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência muito semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma. Em algumas modali- dades, de acordo com esse aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR e LCVR, em que as HCVR e LCVR são ambas derivadas da mesma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 listada na Tabela 1.

[0052] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da cadeia pe- sada listadas na Tabela 3. A presente invenção também fornece molé- culas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequências de aminoácidos da cadeia leve listadas na Tabela 3.

[0053] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam tanto uma cadeia pesada (HC) quanto uma cadeia leve (LC), em que a HC compreende uma sequência de amino- ácidos de qualquer das sequências de aminoácidos da HC listadas na Tabela 3, e em que a LC compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer das sequências de aminoácidos da LC listadas na Tabela

3.

[0054] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um poli- peptídeo compreendendo uma região variável da cadeia pesada e/ou leve de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recom- binantes compreendendo qualquer das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas acima, ou seja, moléculas de ácidos nucleicos que codi- ficam qualquer das sequências da HCVR, LCVR e/ou CDR, conforme estabelecido na Tabela 1. A presente invenção também fornece veto- res de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptí- deo compreendendo uma pesada e/ou cadeia leve de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, ou se- ja, moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer das sequên- cias de cadeia pesada ou cadeia leve, conforme estabelecido na Tabe- la 2. Também incluídas no âmbito de aplicação da presente invenção estão as células hospedeiras às quais esses vetores foram introduzi- dos, bem como métodos de produção das proteínas de ligação ao an- tígeno por cultura das células hospedeiras sob condições que permi- tem a produção de proteínas de ligação ao antígeno, e recuperação das proteínas de ligação ao antígeno assim produzidas.

[0055] Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno recombi- nante isolada, que se liga especificamente a um epítopo conformacio- nal de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2 (por exemplo, um peptídeo compreendendo resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7), e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma com- binação de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que seja vantajosa- mente combinado com uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7. Agentes exemplificativos que podem ser vantajosamen- te combinados com uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 incluem, sem limitação, outros agentes que se ligam e/ou modulam a replicação ou infecção por HPV (incluindo outros anti- corpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, etc.) e/ou agentes que modulam a ativação de células imunes. Terapias adicionais que podem ser usadas em combinação com as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção são descritas também neste documento.

[0056] Em um quarto aspecto, a invenção fornece métodos para tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio associado ao HPV, tal como um câncer positivo para HPV16E7. Os métodos incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção, ou uma composição farmacêutica da invenção ao indivíduo em sua necessidade. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que seja beneficiada, atenuada, inibida ou prevenida pelas proteínas de ligação ao antígeno e as composições aqui fornecidas. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno (ou composição far-

macêutica) da invenção é administrada em combinação com um se- gundo agente terapêutico ao indivíduo em sua necessidade. O segun- do agente terapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em um anticorpo a um coinibidor de células T, um anticorpo a um antígeno de células tumorais, um anticorpo a um receptor de células T, um anti- corpo a um epítopo em uma célula viralmente infectada, um agente citotóxico, um fármaco anticâncer, um medicamento antiviral, um fár- maco anti-inflamatório (por exemplo, corticosteroides), agente quimio- terapêutico, cirurgia, terapia de radiação, um imunossupressor e qual- quer outro fármaco ou terapia conhecida na técnica. Em algumas mo- dalidades, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que aju- da a neutralizar ou reduzir qualquer possível efeito(s) colateral(ais) as- sociado a uma proteína de ligação ao antígeno da invenção, se esses efeitos colaterais ocorrerem.

[0057] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos para suprimir o crescimento de um câncer associado ao HPV. Por exemplo, a presente invenção fornece métodos para suprimir o crescimento do tumor em decorrência de um tumor primário ou um tu- mor metastático em um indivíduo. Em algumas modalidades, a presen- te invenção fornece métodos para melhorar a sobrevivência (por exemplo, a sobrevivência livre de progressão e a sobrevida em geral) de um indivíduo com um câncer associado ao HPV. Exemplos de cân- ceres incluem, mas não se limitam a, carcinomas de células escamo- sas, como o carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, câncer do colo do útero, câncer anogenital, câncer de orofaringe.

[0058] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para inibir ou suprimir o crescimento de tumores estabeleci- dos. Os métodos compreendem administrar a um indivíduo em sua necessidade uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao an-

tígeno da presente invenção. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico.

[0059] A proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pode ser administrada por via subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intra- muscular ou intracraniana. A proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pode ser administrada a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

[0060] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR). O CAR pode incluir um domínio de ligação extra- celular que se liga especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA- A2 (o peptídeo HPV16E7), por exemplo, os resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7, um domínio transmembranar e um do- mínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular é uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 ou um seu fragmento de ligação ao antígeno. As proteí- nas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 exemplificativas da presente invenção são quaisquer das proteínas de ligação ao antígeno descritas neste documento.

[0061] Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno adequada para uso nos CARs da invenção com- preende três regiões determinantes da complementaridade da cadeia pesada (CDRs) (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qual- quer uma das sequências da região variável da cadeia pesada (HCVR) listadas na Tabela 1; e três CDRs da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências da região variável da cadeia leve (LCVR) listadas na Tabela 1.

[0062] Em outras modalidades, a proteína de ligação ao antígeno adequada para uso nos CARs da invenção compreende uma HCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te em sequências da HCVR listadas na Tabela 1; e/ou uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em sequências da LCVR listadas na Tabela 1.

[0063] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antíge- no adequada para uso nas CARs da invenção compreende (a) uma HCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em sequências da HCVR listadas na Tabela 1; e (b) uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em sequências da LCVR listadas na Tabela 1.

[0064] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno adequada para uso nos CARs da invenção compreende (a) um domí- nio da HCDR1 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508 e 524; (b) um domínio da HCDR2 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510 e 526; (c) um domínio da HCDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512 e 528; (d) um domínio da LCDR1 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340,

356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516 e 532; (e) um domínio da LCDR2 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158.174, 190, 206, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518 e 534; (e) um domínio da LCDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID nos 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144,160, 176, 192, 208, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520 e 536.

[0065] Em outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno adequada para uso nos CARs da invenção compreende um par de se- quências de aminoácidos das HCVR/LCVR selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/202, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/290, 298/306, 314/322, 330/338, 346/354, 362/370, 378/386, 394/402, 410/418, 426/434, 442/450, 458/466, 474/482, 490/498, 506/514 e 522/530, como um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR seleciona- das do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 2/10, 34/42, 82/90, 194/202, 282/290 e 506/514.

[0066] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antíge- no isolada para uso nos CARs da presente invenção é um scFv.

[0067] Em outros aspectos, a presente invenção fornece vetores que compreendem as moléculas de ácidos nucleicos do CAR isoladas; e células efetoras imunes compreendendo esses vetores.

[0068] Em ainda outros aspectos da presente invenção, são forne- cidos métodos para tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio associado ao HPV, como câncer positivo para HPV16E7, por exemplo, carcinoma de células escamosas, por exemplo, câncer do colo do úte- ro, carcinoma de pequenas células de cabeça e pescoço, câncer ano-

genital e câncer de orofaringe. Os métodos incluem administrar ao in- divíduo uma população de células efetoras imunes compreendendo um CAR da invenção.

[0069] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece métodos de detecção de células positivas para HPV16E7, por exemplo, em um indivíduo ou em uma amostra obtida a partir de um indivíduo. Os mé- todos incluem colocar uma célula em contato com, como uma amostra de células obtida de um indivíduo, ou administrar a um indivíduo uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreendendo uma porção detectável, e detectar a presença do porção detectável.

[0070] Outras modalidades se tornarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0071] Antes de os métodos serem descritos, será entendido que esta invenção não se limita aos métodos e condições experimentais particulares descritos, pois esses métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada tem a fina- lidade de descrever as modalidades particulares apenas, e não tem o objetivo de ser limitante, pois o escopo da presente invenção será limi- tado apenas pelas reivindicações anexas.

[0072] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente entendido por aqueles especialistas na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são in- corporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0073] O termo "vírus do papiloma humano" ("HPV") se refere a um pequeno vírus não envelopado do ácido desoxirribonucleico (DNA)

que infecta as células da mucosa ou da pele. Um genoma viral circular de duplo filamento tem aproximadamente 8 kb de comprimento. O ge- noma codifica 6 proteínas precoces responsáveis pela replicação viral e 2 proteínas tardias, L1 e L2, que são as proteínas estruturais virais. Existem mais de 170 tipos de HPV que foram identificados, e são de- signados por números. Alguns tipos de HPV, como o HPV-5, podem estabelecer infecções que persistem por toda a vida do indivíduo sem nunca manifestar quaisquer sintomas clínicos. Os tipos 1 e 2 do HPV podem causar verrugas comuns em alguns indivíduos infectados. Os tipos 6 e 11 do HPV podem causar verrugas genitais e papilomatose respiratória. Os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82 do HPV são considerados cancerígenos.

[0074] O termo "HPV16E7" se refere ao gene precoce tipo 16 do HPV, designado E7, e a proteína traduzida do gene.

[0075] A sequência de aminoácidos do HPV16E7 de comprimento total é fornecida no GenBank como número de acesso NP_041326.1 (SEQ ID nº: 537). O termo "HPV16E7" inclui HPV16E7 recombinante ou um seu fragmento. O termo também abrange o HPV16E7 ou um seu fragmento acoplado a, por exemplo, etiqueta de histidina, Fc de camundongo ou humano, ou uma sequência sinal como ROR1. Em algumas modalidades, o termo compreende o HPV16E7 ou um seu fragmento no contexto do HLA-A2, ligado ao HLA-A2 ou como exibido por HLA-A2.

[0076] O termo "HLA" se refere ao complexo ou sistema antígeno leucocitário humano (HLA), que é um complexo de genes que codifi- cam as proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em seres humanos. Essas proteínas da superfície celular são respon- sáveis pela regulação do sistema imune em seres humanos. Os HLAs correspondentes à classe I do MHC (A, B, e C) apresentam peptídeos dentro da célula.

[0077] O termo "HLA-A" se refere ao grupo de antígenos leucocitá- rios humanos (HLA) que são codificados pelo locus HLA-A. O HLA-A é um dos três principais tipos de receptores da superfície celular do MHC classe I humano. O receptor é um heterodímero, e é composto por uma cadeia pesada α e uma cadeia menor β. A cadeia α é codifi- cada por um gene HLA-A variante, e a cadeia β (β2-microglobulina) é uma molécula β2-microglobulina invariante.

[0078] O termo "HLA-A2" é um grupo particular de alelos do com- plexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I no locus HLA-A; a cadeia α é codificada pelo gene HLA-A*02 e a cadeia β é codificada pela β2-microglobulina ou locus B2M.

[0079] O termo "proteína de ligação ao antígeno", "proteína de li- gação" ou "molécula de ligação", como usado neste documento, inclui moléculas que contêm pelo menos um sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente a uma molécula de interesse, como um epíto- po conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (o peptídeo HPV16E7), por exemplo, um peptídeo exibido pelo HLA-A2 compreendendo os resíduos de amino- ácidos 11-19 ou 82-90. A proteína de ligação pode ser um anticorpo, como um anticorpo de comprimento total, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, ou um receptor quimérico de antígenos (CAR), ou qualquer outro polipeptídeo, por exemplo, uma proteína re- ceptor-anticorpo (Rab).

[0080] O termo "proteína de ligação ao antígeno HLA-A2:HPV16E7" ou "proteína de ligação ao antígeno HLA-A2:HPV16E7", ou similar, se refere a uma proteína de ligação ao antígeno, como um anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno, que se liga especificamente a um epítopo conformacional através da apresentação de um fragmento de peptídeo do HPV16E7, por exemplo, resíduos de aminoácidos 11-19 ou resíduos de aminoácidos 82-90), pelo HLA-A2. Em algumas moda-

lidades, o epítopo conformacional é criado na superfície de uma célula pelo peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2.

[0081] O termo "epítopo" se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma proteína de ligação ao antígeno conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, di- ferentes proteínas de ligação ao antígeno podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo "epítopo" também se refere a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. Também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por uma proteína de ligação ao antígeno. Os epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Epítopos funcionais geralmente são um subconjunto dos epítopos estruturais e têm os resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da inte- ração. Os epítopos também podem ser "conformacionais", isto é, com- postos de aminoácidos não lineares. Em algumas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de molé- culas quimicamente ativos em superfície, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em algumas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais es- pecíficas, e/ou características específicas de carga.

[0082] Em algumas modalidades da invenção, uma proteína de ligação é um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo de comprimento total ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0083] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, se refere a moléculas de imunoglobulinas compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) in- terligadas por ligações dissulfeto (isto é, "moléculas de anticorpo intei- ras"), bem como seus multímeros (por exemplo, IgM) ou seus frag-

mentos de ligação ao antígeno. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável da cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante da cadeia pesada (composta de domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é composta de uma região variável da cadeia leve ("LCVR" ou "VL") e uma região constante da cadeia leve (CL). As regi- ões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabi- lidade, denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denomi- nadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal car- bóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em algumas modalidades da invenção, as FRs do anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) podem ser idênticas às sequências germinativas humanas, ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser defi- nida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0084] Também é possível a substituição de um ou mais resíduos de CDR ou a omissão de uma ou mais CDRs. As proteínas de ligação ao antígeno, como os anticorpos, foram descritas na literatura científi- ca, em que uma ou duas CDRs podem ser dispensadas para ligação. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analisaram as regiões de contato entre os anticorpos e seus antígenos, com base nas estruturas cristalinas publicadas, e concluíram que apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos da CDR realmente fazem contato com o antí- geno. Padlan também encontrou muitos anticorpos nos quais uma ou duas CDRs não tinham aminoácidos em contato com um antígeno (ve- ja também Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).

[0085] Os resíduos da CDR sem contato com o antígeno podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60-H65 na CDRH2 são muitas vezes desnecessários), de regiões das CDRs de Kabat situadas fora das CDRs de Chothia CDRs, por modelagem molecular e/ou empiricamente. Se uma CDR ou seu(s) resíduo(s) for omitida, ela é geralmente substituída por um aminoácido que ocupa a posição correspondente em outra sequência de anticorpo humano ou uma consenso dessas sequências. Posições para substi- tuição dentro das CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionados empiricamente. Substituições empíricas podem ser substituições conservadoras ou não conservadoras.

[0086] As proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-HLA-A2:HPV16E7 inteira- mente humanos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou CARs, aqui descritas podem incluir uma ou mais substituições, inser- ções e/ou eliminações de aminoácidos nas regiões framework e/ou CDR dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve, em compara- ção às sequências germinativas correspondentes. Essas mutações podem ser facilmente verificadas comparando-se as sequências de aminoácidos descritas neste documento às sequências germinativas disponíveis a partir de, por exemplo, bancos de dados públicos de se- quências de anticorpos. A presente invenção inclui proteínas de liga- ção ao antígeno, por exemplo, anticorpos, ou seus fragmentos de liga- ção ao antígeno, ou CARs, que são derivadas de qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões framework e/ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequên- cia germinativa da qual foi derivada a proteína de ligação ao antígeno, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência germina- tiva humana, ou para uma substituição de aminoácidos conservadora do(s) resíduo(s) germinativo(s) correspondente(s) (essas mudanças de sequências são aqui referidas coletivamente como "mutações germi- nativas"). Um versado na técnica, começando com as sequências da região variável das cadeias pesada e leve aqui descritas, pode facil- mente produzir inúmeras proteínas de ligação ao antígeno, por exem- plo, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou CARS, que compreendem uma ou mais mutações germinativas individuais ou suas combinações.

Em algumas modalidades, todos os resíduos fra- mework e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência germinativa original da qual foi derivada a proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, o anticorpo.

Em outras modalidades, apenas determinados resíduos são mutados de volta à sequência germinativa original, por exemplo, ape- nas os resíduos mutados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoá- cidos da FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos da FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro da CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos framework e/ou da CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma se- quência germinativa diferente (ou seja, uma sequência germinativa que é diferente da sequência germinativa da qual o anticorpo foi deri- vado originalmente). Além disso, as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antíge- no, ou CARs, da presente invenção podem conter qualquer combina- ção de duas ou mais mutações germinativas dentro das regiões fra- mework e/ou CDR, por exemplo, em que alguns resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma determinada se- quência germinativa, enquanto alguns outros resíduos que diferem da sequência germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência germinativa diferente.

Uma vez obtidas, as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anti- corpos e fragmentos de ligação ao antígeno, que contêm uma ou mais mutações germinativas podem ser facilmente testadas para uma ou mais propriedades desejadas, como aumento da especificidade de li-

gação, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonis- tas ou agonistas melhoradas ou aumentadas (conforme aplicável), re- dução da imunogenicidade, etc. As proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou CARs, obtidas dessa forma são, em geral, abrangidas pela presen- te invenção.

[0087] A presente invenção inclui também proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-HLA-A2:HPV16E7 totalmente humanos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou CARs, compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR, LCVR, e/ou CDR aqui descritas, com uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 tendo sequências de aminoácidos das HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservadoras de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos das HCVR, LCVR e/ou CDR aqui descritas.

[0088] O termo "anticorpo humano", conforme usado neste docu- mento, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas germinativas humanas. Os anticorpos monoclonais humanos (mAbs) da invenção podem in- cluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imu- noglobulinas germinativas humanas (por exemplo, mutações introduzi- das por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por muta- ção somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, a CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, não pretende incluir mAbs nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífe- ros (por exemplo, camundongo) foram enxertadas em sequências FR humanas . O termo inclui anticorpos produzidos de forma recombinan- te em um mamífero não humano, ou em células de um mamífero não humano. O termo não pretende incluir anticorpos isolados de ou gera- dos em um indivíduo humano.

[0089] O termo "recombinante", conforme usado neste documento, se refere a proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, da invenção criados, ex- pressos, isoladas ou obtidos por tecnologias ou métodos conhecidos na técnica como tecnologia de DNA recombinante que inclui, por exemplo, emenda de DNA e expressão transgênica. O termo se refere a proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos expressos em um mamífero não humano (incluindo mamíferos não humanos transgênicos, por exemplo, camundongos transgênicos), ou um siste- ma de expressão de células (por exemplo, células CHO) ou isolados de uma biblioteca de anticorpos combinatórios humanos.

[0090] Como usado neste documento, os termos "receptor quimé- rico de antígenos" e "CAR", usados como sinônimos neste documento, se referem a uma proteína recombinante fundida compreendendo um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno (por exemplo, um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2 , por exemplo, um peptídeo compreendendo os resíduos de aminoáci- dos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7), um domínio transmembranar e pelo menos um domínio de sinalização intracelular.

[0091] Uma "célula efetora imune", conforme usado neste docu- mento, se refere a qualquer célula do sistema imunológico que tem uma ou mais funções efetoras (por exemplo, atividade de eliminação de células citotóxicas, secreção de citocinas, indução de ADCC e/ou CDC). Em uma modalidade, as células efetoras imunes usadas com os CARs aqui descritos são os linfócitos T, em particular as células T citotóxicas (CTLs; células T CD8+) e células T auxiliares (HTLs; célu-

las T CD4+). Outras populações de células T são também úteis aqui, por exemplo, células T nativas e células T de memória. Como seria entendido pelo versado na técnica, outras células também podem ser usadas como células efetoras imunes com os carros aqui descritos. Em particular, as células efetoras imunes também incluem células NK, células NKT, neutrófilos e macrófagos. As células efetoras imunes também incluem progenitores de células efetoras, em que essas célu- las progenitoras podem ser induzidas para diferenciação em células efetoras imunes in vivo ou in vitro. Assim, a esse respeito, a célula efe- tora imune inclui progenitores de células efetoras imunes, como célu- las estaminais hematopoiéticas (HSCs) contidas na população de célu- las CD34+ derivadas do cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico mobilizado que, mediante a administração em um indivíduo, se diferenciam em células efetoras imunes maduras, ou que podem ser induzidas in vitro para diferencição em células efetoras imunes maduras.

[0092] Conforme descrito neste documento, o termo "peptídeo não alvo" se refere a um peptídeo que difere em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais ami- noácidos de um peptídeo-alvo (por exemplo, os peptídeos 11-19 do HPV16 E7). Em algumas modalidades, o termo inclui um peptídeo que difere em menos ou 3 aminoácidos do peptídeo-alvo. Por exemplo, para um peptídeo 9-mer, se 1, 2 ou 3 aminoácidos não forem idênticos ao peptídeo-alvo, ele é considerado um peptídeo "não alvo". Em algu- mas modalidades, a identidade de aminoácidos é expressa em termos de ‘grau de semelhança’ (DoS). Se seis ou mais aminoácidos dentro de um peptídeo 9-mer forem idênticos, o DoS é de 6. Em algumas modalidades, um peptídeo com DoS ≤ 6 é considerado um peptídeo "não alvo". O termo peptídeo "não alvo" também se refere a um peptí- deo que é semelhante ao peptídeo-alvo com base na homologia de sequência, é previsto para ligação ao HLA-A2 e está compreendido em uma proteína que é expressa em tecidos normais, essenciais.

[0093] O termo "se liga especificamente" ou "se liga especifica- mente a", ou similares, significa que uma proteína de ligação ao antí- geno, por exemplo, anticorpo, ou seus fragmentos de ligação ao antí- geno, ou CAR, forma um complexo com um antígeno que é relativa- mente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10-8 M ou menos (por exemplo, uma KD menor denota uma ligação mais firme). Métodos para determinar se duas mo- léculas se ligam especificamente são bem conhecidas na arte e inclu- em, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de su- perfície, e similares. Como descrito no presente documento, as prote- ínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, foram identifica- das por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACO- RE™, que se ligam especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA- A2 (o peptídeo HPV16E7), por exemplo, um peptídeo composto pelos resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7.

[0094] O termo proteína de ligação ao antígeno de "alta afinidade", por exemplo, anticorpo, se refere a essas proteínas de ligação ao antí- geno, por exemplo, mAbs, com uma afinidade de ligação ao epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, por exemplo, um peptídeo compreendendo os resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7, expressa em KD, de pelo menos 10-8 M; de preferência 10-9 M; mais preferivelmente 10-10M, ainda mais preferi- velmente 10-11 M, ainda mais preferivelmente 10-12 M, medida por res- sonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORE™ ou ELI- SA com afinidade de solução.

[0095] Pelo termo "taxa de dissociação lenta", "koff" ou "kd", deve ser entendido que uma proteína de ligação ao antígeno se dissocia do

HLA-A2:HPV16E7 a uma constante de taxa de 1 x 10-3 s-1 ou menos, de preferência de 1 x 10-4 s-1 ou menos, como determinado por resso- nância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORE™.

[0096] Os termos "parte de ligação ao antígeno" de uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo), "fragmento de ligação ao antígeno" de uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) e similares, como usado neste documento, incluem qual- quer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtida enzi- maticamente, sintética ou geneticamente engenheirada, que se liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo", conforme usado neste documento, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar a um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, por exemplo, um peptídeo compreendendo resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 de HPV16E7 acoplados ao HLA-A2.

[0097] Em modalidades específicas, as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmentos de anticorpos, ou CARs, da invenção podem ser conjugadas a uma porção, como um ligante, uma porção detectável ou uma porção terapêutico ("imunocon- jugado"), como uma citotoxina, uma segunda proteína de ligação antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7, um anticorpo para um antígeno tumor- específico, um fármaco anticâncer ou qualquer outro porção terapêuti- co útil no tratamento de uma doença ou condição incluindo doença ou distúrbio associado ao HPV, como um câncer positivo para HPV16E7 ou infecção por HPV, incluindo a infecção crônica por HPV.

[0098] Uma "proteína de ligação ao antígeno isolada", por exem- plo, um anticorpo isolado, como usado neste documento, pretende se referir a uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, que é substancialmente livre de outras proteínas de ligação ao antíge-

no, por exemplo, anticorpos (ABS), com diferentes especificidades an- tigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente HLA-A2:HPV16E7, ou um seu fragmento), é substancialmente isenta de proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, que li- gam especificamente antígenos diferentes de um epítopo conformaci- onal de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2.

[0099] O termo "ressonância plasmônica de superfície", conforme usado neste documento, se refere a um fenômeno óptico que permite a análise de interações biomoleculares em tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ).

[00100] O termo "KD", como aqui usado, pretende se referir à cons- tante de dissociação de equilíbrio de uma determinada interação prote- ína-antígeno de ligação ao antígeno.

[00101] O termo "competir cruzadamente", conforme usado neste documento, significa que uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga a um antígeno e inibe ou bloqueia a ligação de outra proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. O termo também inclui a competição entre duas proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, em ambas as orienta- ções, ou seja, uma primeira proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, que se liga e bloqueia a ligação da segunda prote- ína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, e vice-versa. Em algumas modalidades, a primeira proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, e a segunda proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, podem se ligar ao mesmo epítopo. Como alterna- tiva, a primeira e a segunda proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, podem se ligar a epítopos diferentes, porém so-

brepostos, de tal forma que a ligação de um inibe ou bloqueia a liga- ção do segundo, por exemplo, via impedimento estérico. A competição cruzada entre proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticor- pos, pode ser medida por métodos conhecidos na arte, por exemplo, através de um teste de interferometria em biocamada, livre de marca- dor, em tempo real. A competição cruzada entre duas proteínas de li- gação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, pode ser expressa como a ligação da segunda proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, que é inferior ao sinal de fundo devido à autoligação (em que a primeira e a segunda proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, são a mesma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo). A competição cruzada entre duas proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, pode ser expressa, por exemplo, como o % de ligação da segunda proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, que é inferior à autoligação de fundo de referência (em que a primeira e a segunda proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, são a mesma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo).

[00102] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou seu fragmento, in- dica que, quando perfeitamente alinhado às inserções ou deleções de nucleotídeos com outro ácido nucléico (ou seu filamento complemen- tar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 90% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotídicas, medida por qualquer algoritmo conhecido de identidade de sequência, como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico, com identidade substancial a uma molécu- la de ácido nucleico de referência pode, em alguns casos, codificar um polipeptídeo com a mesma sequência de aminoácidos ou substanci- almente semelhante ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[00103] A identidade de sequência pode ser calculada usando um algoritmo, por exemplo, o algoritmo Needleman Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48: 443-453) para alinhamento global, ou o algoritmo Waterman Smith (Smith e Waterman, 1981 J. Mol. Biol. 147: 195-197) para alinhamento local. Outro algoritmo preferido é descrito por Dufresne et al em Nature Biotechnology em 2002 (volume 20, pá- ginas 1269-71) e é usado no software GenePast (GQ Life Sciences, Inc., Boston, MA).

[00104] Quando aplicado a polipeptídeos, o termo "substancial se- melhança" ou "substancialmente idêntico" significa que duas sequên- cias peptídicas, quando perfeitamente alinhadas, como pelos progra- mas GAP e BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferivel- mente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência. De preferência, as posições de resíduos, que não são idênti- cas, diferem em substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em que um resí- duo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido ten- do uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhan- tes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substitui- ção conservadora de aminoácidos não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si em substituições conservadoras, o percentual ou grau de semelhança pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para realizar esse ajuste são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, va- lina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas de hidroxila: se- rina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glu- tamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofa- no; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituições conservadoras preferidas de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e aspara- gina-glutamina. Como alternativa, uma substituição conservadora é qualquer alteração com um valor positivo na matriz de log-veros- similhança PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992), Science 256: 1443 45, aqui incorporado por referência. Uma substituição "modera- damente conservadora" é qualquer alteração tendo um valor não ne- gativo na matriz de log-verossimilhança PAM250.

[00105] A semelhança entre sequências de polipeptídeos normal- mente é medida usando o software de análise de sequência. O softwa- re de análise de proteína corresponde a sequências semelhantes usando medidas de semelhança atribuídas a várias substituições, su- pressões e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como GAP e BESTFIT, que podem ser usados com parâmetros pa- dronizados para determinar a homologia entre sequências ou a identi- dade de sequência entre polipeptídeos estreitamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma sua muteína. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros padronizados ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e percentuais de identidade de sequência das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de pesquisa e de busca (Pearson (2000) supra). Outro al- goritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção de uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especial- mente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padronizados. Veja, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, cada um deles é aqui incorporado por referência.

[00106] A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual é adminis- trada. A quantidade exata dependerá da finalidade do tratamento e poderá ser verificada por uma pessoa versada na técnica usando téc- nicas conhecidas (veja, por exemplo, Lloyd (1999), The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[00107] Como usado neste documento, o termo "indivíduo" se refe- re a um animal, de preferência um mamífero, em necessidade de ate- nuação, prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio, como a infecção por HPV, ou uma doença ou distúrbio associado ao HPV, como um câncer associado ao HPV (por exemplo, um câncer positivo para HPV16E7). O termo inclui indivíduos humanos que têm ou estão em risco de ter doença ou distúrbio associado ao HPV, como um cân- cer associado ao HPV, câncer metastático associado ao HPV ou in- fecção por HPV.

[00108] Como usado neste documento, "fármaco anticâncer" signi- fica qualquer agente útil para tratar ou atenuar ou inibir o câncer, inclu- indo, mas não limitado a, citotoxinas e agentes como, antimetabólitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, procarbazina, hidroxiureia, asparaginase, corticosteroides, ciclofosfa- mida, mitotano (O,P’-(DDD)), agentes biológicos (por exemplo, anti-

corpos e interferons) e agentes radioativos. Como usado neste docu- mento, "uma citotoxina ou agente citotóxico" também se refere a um agente quimioterapêutico e significa qualquer agente que seja prejudi- cial para as células. Exemplos incluem o Taxol® (paclitaxel), temozo- lamida, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, cis- platina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,1-desidrotestosterona, gli- cocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromici- na, e seus análogos ou homólogos.

[00109] Como usado neste documento, o termo "fármacos antivi- rais" se refere a qualquer fármaco ou terapia usada para tratar, preve- nir ou atenuar uma infecção viral em um indivíduo. O termo "fármaco antiviral" inclui, mas não se limita a, zidovudina, lamivudina, abacavir, ribavirina, lopinavir, efavirenz, cobicistat, tenofovir, rilpivirina, analgési- cos e corticosteroides.

[00110] Um imunogênio compreendendo qualquer um dos seguin- tes pode ser usado para gerar proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, para um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, por exemplo, um peptídeo compreen- dendo resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 resíduos do HPV16E7 ligado ao HLA-A2. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos, da invenção são obtidas de ca- mundongos imunizados com uma proteína HPV16E7 nativa de com- primento total (veja o número de acesso NCBI NP_041326.1) (SEQ ID nº: 537) ou com um peptídeo HPV16E7 recombinante, como um peptí- deo compreendendo os resíduos de aminoácidos 11-19 (YMLDLQP ET; SEQ ID nº: 538) do Acesso ao GenBank NP_041326.1 (SEQ ID nº: 537) ou os resíduos de aminoácidos 82-90 (LLMGTLGIV; SEQ ID nº: 539) do Acesso ao GenBank NP_041326.1 (SEQ ID nº: 537), liga-

da ao HLA-A2.

[00111] Alternativamente, o HPV16E7 ou um seu fragmento pode ser produzido utilizando técnicas bioquímicas padronizadas e modifi- cado no contexto do HLA-A2 e usado como imunogênio.

[00112] Em algumas modalidades, o imunogênio pode ser um pep- tídeo HPV16E7 recombinante expresso em E. coli ou em quaisquer outras células eucarióticas ou de mamíferos, como as células do ová- rio de hamster chinês (CHO).

[00113] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno que se ligam especificamente um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2 podem ser preparadas usando fragmentos das regiões acima, ou peptídeos que se estendem além das regiões designadas em cerca de 5 a cerca de 20 resíduos de ami- noácidos de uma, ou ambas, as extremidades terminais N ou C das regiões aqui descritas. Em algumas modalidades, qualquer combina- ção das regiões acima ou seus fragmentos pode ser usada na prepa- ração de proteínas de ligação ao antígeno HLA-A2:HPV16E7 específi- cas, por exemplo, anticorpos.

[00114] Os peptídeos podem ser modificados para incluir a adição ou a substituição de determinados resíduos para marcação ou para fins de conjugação a moléculas carreadoras, como KLH. Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada à extremidade do terminal N ou ter- minal C de um peptídeo, ou uma sequência ligante pode ser adiciona- da para preparar o peptídeo para conjugação a, por exemplo, KLH pa- ra imunização.

[00115] Ensaios in vitro exemplificativos e não limitantes para medi- ção da atividade de ligação são ilustrados nos exemplos aqui. No Exemplo 4, as afinidades de ligação e constantes cinéticas das proteí- nas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 específicas, por exemplo, anticorpos, foram determinadas por ressonância plasmônica de superfície e as medições foram conduzidas em um instrumento Bi- acore 4000 ou T200. Os Exemplos 6 e 7 descrevem a ligação dos an- ticorpos a células que sobre-expressam fragmentos do HPV16E7.

[00116] As proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticor- pos, específicas para HLA-A2:HPV16E7 podem não conter etiquetas ou radicais adicionais, ou elas podem conter uma etiqueta ou porção N-terminal ou C-terminal. Em uma modalidade, a etiqueta ou porção é a biotina. Em um ensaio de ligação, a localização de uma etiqueta (se aplicável) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à su- perfície à qual o peptídeo está ligado. Por exemplo, se uma superfície é revestida com avidina, um peptídeo contendo uma biotina N-terminal será orientado de modo que a parte C-terminal do peptídeo será distal à superfície. Em uma modalidade, a etiqueta pode ser um radionuclí- deo, um corante fluorescente ou uma etiqueta detectável por MRI. Em algumas modalidades, essas proteínas de ligação ao antígeno marca- das podem ser usadas em ensaios diagnósticos, incluindo ensaios de formação de imagem.

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[00117] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antí- geno que incluem anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antí- geno, e CARs (por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codifi- cam um CAR da invenção) (descritas abaixo). Salvo se especifica- mente indicado em contrário, o termo "anticorpo", conforme usado nes- te documento, deve ser entendido como abrangendo moléculas de an- ticorpo compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, "moléculas de anticorpos inteiras") , bem como seus fragmentos de ligação ao antígeno. Os ter- mos "parte de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similares, como usados neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocor-

rência natural, obtida enzimaticamente, sintética ou geneticamente en- genheirada, que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo", conforme usado neste docu- mento, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2. Uma proteína de liga- ção ao antígeno, como um fragmento de anticorpo, pode incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um fragmento dAb, um fragmento contendo uma CDR, ou uma CDR isolada. As pro- teínas de ligação ao antígeno, como fragmentos de ligação ao antíge- no de um anticorpo, podem ser derivadas, por exemplo, de moléculas de anticorpo totais usando quaisquer técnicas padronizadas adequa- das, como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante que envolvam a manipulação e a expressão de domí- nios variáveis e (opcionalmente) constantes de anticorpos que codifi- cam DNA. Esse DNA é conhecido e/ou é facilmente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fagos-anticorpos), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pelo uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar uma ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração ade- quada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou excluir aminoácidos, etc.

[00118] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antí- geno de um anticorpo incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de ca- deia única (scFv); (vi) fragmentos dAb e (vii) unidades mínimas de re- conhecimento compostas dos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região deter-

minante da complementaridade (CDR) isolada, como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas en- genheiradas, como os anticorpos específicos para domínios, anticor- pos de domínio único, anticorpos excluídos em domínio, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos mono- valentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imunofármacos mo- dulares (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, também são abrangidas pela expressão "fragmento de ligação ao antígeno", con- forme usado neste documento.

[00119] Um fragmento de ligação ao antígeno de uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) compreenderá normal- mente pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e, em geral, compreenderá pelo menos uma CDR, que é adjacente a ou em quadro com uma ou mais sequências framework. Nas proteínas de ligação ao antígeno com um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem ser situados em relação um ao outro em qualquer ar- ranjo adequado. Por exemplo, a variável região pode ser dimérica e conter dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Como alternativa, o frag- mento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domí- nio VH ou VL monomérico.

[00120] Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao an- tígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável ligado de forma covalente a pelo menos um domínio constante. Confi- gurações exemplificativas e não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de uma proteína de ligação ao antígeno da pre- sente invenção incluem: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH - CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -

CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3 e (xiv) VL -CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados por uma região ligante ou de charneira total ou parcial. Uma região de charneira pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, o que resulta em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios adjacentes variáveis e/ou constantes em uma única molécula polipeptídica. Além disso, um fragmento de liga- ção ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compre- ender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qual- quer uma das configurações de domínios constantes e variáveis lista- das acima, em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por liga- ção(ões) dissulfeto).

[00121] Assim como acontece com as moléculas de anticorpo intei- ras, as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo, podem ser monoespecíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas). Um fragmento de li- gação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá normalmente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antí- geno separado ou a um epítopo diferente do mesmo antígeno. Qual- quer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecíficos exemplificativos aqui descritos, pode ser adap- tado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção, usando técnicas de rotina disponí- vel na arte.

PREPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[00122] São conhecidos na técnica métodos para geração de prote- ínas de ligação ao antígeno, como anticorpos humanos, em camun- dongos transgênicos. Qualquer desses métodos conhecidos pode ser usado no contexto da presente invenção para produzir anticorpos hu- manos que se ligam especificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA- A2 (o peptídeo HPV16E7).

[00123] Com o uso da tecnologia VELOCIMMUNE® (veja, por exemplo, o Documento US nº 6,596,541. Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para geração de proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos mono- clonais, as proteínas de ligação ao antígeno de alta afinidade, por exemplo, anticorpos quiméricos, a epítopos conformacionais de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, são inicialmente isoladas com uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo transgênico com um genoma que compreende regiões variáveis de cadeias pesadas e leves ligadas de forma operativa a loci da região constante de camundongo endógena, de modo que o camundongo produz uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, compreen- dendo uma região variável humana e uma região constante de ca- mundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e ligado de forma operativa ao DNA que codifica as regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas. O DNA é, então, expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo humano plenamente.

[00124] Em geral, um camundongo VELOCIMMUNE® mouse é de- safiado com o antígeno de interesse, e as células linfáticas (como as células B) são recuperadas dos camundongos que expressam proteí- nas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos. As células linfáti-

cas podem ser fundidas com uma linhagem celular do mieloma para preparar linhagens celulares imortais de hibridomas, e essas linhagens celulares de hibridomas são triadas e selecionadas para identificar as linhagens celulares de hibridomas que produzem anticorpos específi- cos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões vari- áveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Essa proteína de ligação ao antígeno pode ser produzida em uma célula, como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codi- fica as proteínas de ligação a antígenos específicas para o antígeno, por exemplo, anticorpos quiméricos, ou os domínios variáveis das ca- deias leves e pesados podem ser isolados diretamente dos linfócitos específicos para o antígeno.

[00125] Inicialmente, as proteínas de ligação de alta afinidade, por exemplo, anticorpos quiméricos, são isoladas com uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Assim como na se- ção experimental abaixo, as proteínas de ligação ao antígeno são ca- racterizadas e selecionadas para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopos, etc. As regiões constantes do ca- mundongo são substituídas por uma região constante humana deseja- da para gerar as proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anti- corpos totalmente humanos, da invenção, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificado. Embora a região constante selecio- nada possa variar de acordo com o uso específico, as características de ligação ao antígeno de alta afinidade e especificidade ao alvo estão presentes na região variável.

BIOEQUIVALENTES

[00126] As proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção abrangem as proteínas tendo as sequências de aminoácidos que variam das sequências das proteínas de ligação ao antígeno descritas, por exemplo, anticorpos, mas que retêm a capaci- dade de se ligar a um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2. Essas proteínas de ligação ao antígeno variantes compreendem uma ou mais adições, eliminações ou substi- tuições de aminoácidos, quando comparadas à sequência original, mas apresentam atividade biológica que é essencialmente equivalente à das proteínas de ligação ao antígeno descritas. Da mesma forma, as sequências de DNA que codificam a proteína de ligação ao antígeno da presente invenção abrangem as sequências que compreendem uma ou mais adições, eliminações, ou substituições de nucleotídeos, quando comparadas à sequência descrita, mas que codificam uma proteína de ligação ao antígeno que é essencialmente bioequivalente a uma proteína de ligação ao antígeno da invenção.

[00127] Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas forem equivalen- tes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas, cuja taxa e medida de absorção não mostram uma diferença significativa quando administra- da à mesma dose molar, nas mesmas condições experimentais, tanto em dose única quanto em doses múltiplas. Algumas proteínas de liga- ção ao antígeno ou anticorpos serão consideradas alternativas equiva- lentes ou farmacêuticas se elas forem equivalentes na medida de sua absorção, mas não na sua taxa de absorção, e podem ainda ser con- sideradas bioequivalentes porque essas diferenças na taxa de absor- ção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para alcançar as concentrações eficazes de fármaco no corpo, por exemplo, em uso crônico, e são consideradas clinicamente insignifi- cantes para o produto fármaco particular em estudo.

[00128] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antíge- no (ou anticorpos) são bioequivalentes se não houver diferenças clini- camente significativas em sua segurança, pureza, ou potência.

[00129] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antíge- no (ou anticorpos) são bioequivalentes se um paciente puder alternar uma ou mais vezes entre produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado do risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficá- cia diminuída em relação à terapia continuada sem a alternância.

[00130] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antíge- no (ou anticorpos) são bioequivalentes se ambas atuarem por um me- canismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condi- ções de uso, na medida em que esses mecanismos forem conhecidos.

[00131] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro. As medidas da bioequivalência incluem, por exem- plo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração da proteína de ligação ao antígeno ou seus meta- bólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outros fluidos biológicos como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlaciona- do com e é razoavelmente preditivo de dados da biodisponibilidade in vivo em seres humanos; (c) um teste in vivo em seres humanos e ou- tros mamíferos, no qual o efeito farmacológico agudo apropriado da proteína de ligação ao antígeno (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que esta- belece a segurança, a eficácia, ou a biodisponibilidade ou a bioequiva- lência de uma proteína de ligação ao antígeno.

[00132] Variantes bioequivalentes das proteínas de ligação ao antí- geno (ou anticorpos) da invenção podem ser construídas, por exem- plo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências, ou exclu- são de terminal ou resíduos internos ou sequências não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não es- senciais para a atividade biológica podem ser excluídos ou substituí- dos por outros aminoácidos para prevenir a formação de pontes dissul-

feto intramoleculares desnecessárias ou incorretas mediante renatura- ção. Em outros contextos, as proteínas de ligação ao antígeno bioe- quivalentes podem incluir variantes das proteínas de ligação ao antí- geno compreendendo mudanças de aminoácidos, que modificam as características de glicosilação das proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, as mutações que eliminam ou removem a glicosilação.

[00133] PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO ANTI-HLA- A2:HPV16E7 COMPREENDENDO VARIANTES DO FC

[00134] De acordo com algumas modalidades da presente inven- ção, são fornecidas proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7, por exemplo, anticorpos, compreendendo um domínio Fc que compreende uma ou mais mutações que aumentam ou dimi- nuem a ligação da proteína de ligação ao antígeno ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação ao pH neutro. Por exem- plo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 compreendendo uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(s) aumenta a afinidade do domínio Fc ao FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um en- dossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mu- tações podem resultar em um aumento da meia-vida sérica da proteí- na de ligação de ligação ao antígeno quando administrado a um ani- mal. Exemplos não limitantes dessas modificações do Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modifica-

ção nas 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação nas 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação na 433K (por exemplo, H433K) e uma na 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação nas 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação nas 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação na 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Em ainda outra modalidade, a modifica- ção compreende uma modificação na 265A (por exemplo, D265A) e/ou uma na 297A (por exemplo, N297A).

[00135] Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de liga- ção ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreendendo um domínio Fc que compreende um ou mais pares ou grupos de mutações seleci- onados do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); 257I e 311I (por exem- plo, P257I e Q311I); 257I e 434H (por exemplo, P257I e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, E380A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Em uma modalidade, a presente invenção inclui pro- teínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreendendo um domínio Fc que compreende uma mutação S108P na região de charneira do IgG4 para promover a estabilização do dímero. Todas as combinações possíveis das mutações no domínio Fc acima e outras mutações dentro dos domínios variáveis da proteína de ligação ao an- tígeno aqui descritas são contempladas no âmbito de aplicação da presente invenção.

[00136] A presente invenção também inclui as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 compreendendo uma região cons- tante (CH) da cadeia pesada quimérica, em que a região CH quimérica compreende segmentos derivados das regiões CH de mais de um iso-

tipo de imunoglobulina. Por exemplo, as proteínas de ligação ao antí- geno da invenção podem incluir uma região CH quimérica compreen- dendo uma parte ou a totalidade de um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humano, IgG2 humano ou IgG4 humano, combinada com uma parte ou a totalidade de um domínio CH3 derivado de uma molécula de IgG1 humano, IgG2 humano ou IgG4 humano. Segundo algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno da inven- ção compreendem uma região CH quimérica tendo uma região de charneira quimérica. Por exemplo, uma charneira quimérica pode in- cluir uma sequência de aminoácidos (resíduos de aminoácidos das posições 216 a 227, de acordo com a numeração EU) da "charneira superior", derivada da região de charneira de um IgG1 humano, um IgG2 humano ou um IgG4 humano, combinada com uma sequência (resíduos de aminoácidos das posições 228 a 236, de acordo com a numeração EU) da charneira inferior, derivada da região de charneira de um IgG1 humano, um IgG2 humano ou um IgG4 humano. Segundo algumas modalidades, a região de charneira quimérica é composta por resíduos de aminoácidos derivados da região de charneira de um IgG1 humano ou um IgG4 humano e resíduos de aminoácidos derivados de uma charneira inferior do IgG2 humano. Uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo uma região CH quimérica como aqui descrita pode, em algumas modalidades, apresentar funções efetoras do Fc modificado sem afetar adversamente as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas da proteína de ligação ao antígeno. (Veja, por exem- plo, a Publicação de Patente US nº 20140243504, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade).

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[00137] Em geral, as proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção funcionam por ligação a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (o peptídeo HPV16E7).

[00138] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 que se ligam ao HPV16E7 no contexto do HLA- A2, com alta especificidade. As proteínas de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 não se ligam ao peptídeo HPV16E7 na ausência do HLA-A2. Adicionalmente, as proteínas de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 não se ligam a um peptídeo não alvo no contexto do HLA-A2.

[00139] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 que se ligam ao peptídeo 11-19 HLA- A2:HPV16E7 monomérico com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao pep- tídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 monomérico (por exemplo, a 25 ºC ou 37 ºC), com uma KD inferior a cerca de 20nM, medida por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 4 deste documento. Em algumas modalida- des, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam ao peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 monomérico, com uma KD inferior a cerca de 15nM, inferior a cerca de 12 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 0,5 nM, inferior a cerca de 0,1 nM, inferior a cerca de 0,05 nM ou inferior a cerca de 0,04 nM, medida por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 4 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar.

[00140] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 monomérico (por exemplo, a 25 ºC ou 37 ºC), com uma KD inferior a cerca de 25 nM, medida por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usan- do o formato de ensaio como definido no Exemplo 4 deste documento,

ou um ensaio substancialmente similar. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam ao peptídeo 82-90 HLA- A2:HPV16E7 monomérico com uma KD inferior a cerca de 20 nM, infe- rior a cerca de 15 nM, inferior a cerca de 12 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 0,5 nM, inferior a cerca de 0,1 nM, inferior a cerca de 0,05 nM ou inferior a cerca de 0,04 nM, medida por resso- nância plasmônica de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 4 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar.

[00141] A presente invenção inclui também proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 6 nM, e não se li- gam a células que expressam peptídeos não alvo previstos, determi- nado por ensaio de luminescência, como definido no Exemplo 6 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar. Em algumas mo- dalidades, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 infe- rior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM ou inferior a cerca de 0,5 nM, e não se ligam a células que expressam peptídeos não alvo previstos, determinado pelo ensaio de luminescência, como definido no Exemplo 6 deste documen- to, ou um ensaio substancialmente similar, por exemplo, usando o formato de ensaio em Exemplo 6 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar.

[00142] A presente invenção também inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 1 nM, e não se li- gam a células que expressam peptídeos não alvo previstos, determi- nado pelo ensaio de luminescência, como definido no Exemplo 6 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar. Em algumas mo- dalidades, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 infe- rior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 0,5 nM, inferior a cerca de 0,2 nM ou inferior a cerca de 0,01 nM, e não se ligam a células que ex- pressam peptídeos não alvo previstos, determinado pelo ensaio de luminescência, como definido no Exemplo 6 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar, por exemplo, usando o formato de ensaio no Exemplo 6 deste documento, ou um ensaio substancialmen- te similar.

[00143] A presente invenção também inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 30 nM, medido por um ensaio de citometria de fluxo como definido no Exemplo 7 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar. Em algumas mo- dalidades, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 infe- rior a cerca de 25 nM, inferior a cerca de 20 nM, inferior a cerca de 15 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM ou inferior a cerca de 0,5 nM, medido por um ensaio de citometria de fluxo, por exemplo, usando o formato de ensaio no Exemplo 7 deste documento, ou um ensaio substancial- mente similar.

[00144] A presente invenção também inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 75 nM, medido por um ensaio de citometria de fluxo, como definido no Exemplo 7 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar. Em algumas mo- dalidades, as proteínas de ligação ao antígeno se ligam a uma célula que expressa um peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 infe-

rior a cerca de 75 nM, inferior a cerca de 70 nM, inferior a cerca de 65 nM, inferior a cerca de 60 nM, inferior a cerca de 55 nM, inferior a cer- ca de 50 nM, inferior a cerca de 45 nM, inferior a cerca de 40 nM, infe- rior a cerca de 35 nM, inferior a cerca de 30 nM, inferior a cerca de 25 nM, inferior a cerca de 20 nM, inferior a cerca de 15 nM, inferior a cer- ca de 10 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM ou inferior a cerca de 0,5 nM, medido por um ensaio de citometria de fluxo, por exemplo, usando o formato de ensaio no Exemplo 7 deste documento, ou um ensaio substancialmente similar.

[00145] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno da presente invenção são úteis na inibição do crescimento de um tumor ou retardo da progressão do câncer, quando administradas pro- filaticamente a um indivíduo em sua necessidade, e podem aumentar a sobrevida do indivíduo. Por exemplo, a administração de uma prote- ína de ligação ao antígeno da presente invenção pode levar à diminui- ção de um tumor principal, e pode prevenir a metástase ou o desen- volvimento de tumores secundários. Em algumas modalidades, as pro- teínas de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis na inibi- ção do crescimento de um tumor quando administrado terapeutica- mente a um indivíduo em sua necessidade, e pode aumentar a sobre- vida do indivíduo. Por exemplo, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno da invenção a um indivíduo pode levar à diminuição e ao desaparecimen- to de um tumor estabelecido no indivíduo.

[00146] Em uma modalidade, a invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno recombinante isolada, que se liga a um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, em que a proteína de ligação ao antígeno apresenta uma ou mais das seguin- tes características: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 2,

18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506 e 522, ou uma sua sequência substancialmente seme- lhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de ami- noácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514 e 530, ou uma sua sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio HCDR3 ten- do uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512 e 528, ou uma sua sequência substanci- almente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144,160, 176, 192, 208, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520 e 536, ou uma sua sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequên- cia; (iv) compreende um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508 e 524, ou uma sua sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequên- cia; um domínio LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos seleci- onada do grupo que consiste em SEQ ID nº: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, e 532, ou uma sua sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domí- nio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID nº: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158,174, 190, 206, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518 e 534, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) se liga a um peptídeo 11-19 HLA- A2:HPV16E7 monomérico com uma constante de equilíbrio de disso- ciação (KD) inferior a cerca de 20 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25 °C; (vi) se liga a um peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a cerca de 25 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25 °C; (vii) se liga a células que expressam o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 6 nM e não se ligam a células que expressam peptídeos não alvo previstos, como determinado pelo ensaio de lumi- nescência; (viii) se liga a células que expressam o peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 1 nM e pratica- mente são se ligam a células que expressam peptídeos não alvo pre- vistos, como determinado pelo ensaio de luminescência; (ix) se liga a células que expressam o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um

EC50 inferior a cerca de 30 nM, conforme determinado pelo ensaio de citometria de fluxo; (x) se liga a células que expressam o peptídeo 82- 90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 75 nM, como determinado pelo ensaio de citometria de fluxo; (xi) não se liga a um peptídeo não alvo exibido por HLA-A2, em que o peptídeo difere em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos da SEQ ID nº: 538; e (xii) não se liga a um peptídeo não alvo exibido por HLA-A2, em que o peptídeo difere em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos da SEQ ID nº: 539.

[00147] As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas menciona- das acima, ou suas combinações. Outras características biológicas das proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção serão evi- dentes para uma pessoa com conhecimento habitual na técnica a par- tir de uma revisão do presente documento, incluindo os exemplos de trabalho aqui mencionados.

MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS E TECNOLOGIAS RELACIONADAS

[00148] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro de um ou mais domínios do peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2. O epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localiza- dos dentro de um ou ambos os referidos domínios da molécula HPV16E7 (por exemplo, um epítopo conformacional).

[00149] Várias técnicas conhecidas para aqueles versados na téc- nica podem ser usadas para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um poli- peptídeo ou proteína. Técnicas exemplificativas incluem, por exemplo, ensaios de rotina de bloqueio cruzado, tal como o descrito em Antibo- dies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Outros métodos incluem a análise mutacional de varredura de alanina, a análise blot de peptídeos (Reineke (2004) Methods Mol. Bi- ol. 248: 443-63), estudos cristalográficos de análises da clivagem de peptídeos e análises RMN. Além disso, métodos como a excisão de epítopos, extração de epítopos e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual uma proteína de ligação ao antígeno inte- rage é a troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a marcação da proteína de interesse com deutério, seguida por ligação da proteína de ligação ao antígeno à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/proteína de ligação ao antígeno é transferido para água, e os prótons que podem ser troca- dos dentro dos aminoácidos que são protegidos pelo complexo da pro- teína de ligação ao antígeno sofrem troca de volta do deutério para hidrogênio, em uma velocidade mais lenta do que os prótons que po- dem ser trocados dentro dos aminoácidos que não são parte da inter- face. Como resultado, os aminoácidos que fazem parte da interface proteína/proteína de ligação ao antígeno podem reter o deutério e, por conseguinte, exibir massa relativamente mais alta em comparação aos aminoácidos não incluídos na interface. Após dissociação da proteína de ligação ao antígeno, a proteína-alvo é submetida à clivagem de pro- teases e análise por espectrometria de massa, assim revelando os re- síduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais interage a proteína de ligação ao antígeno. Veja, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252- 259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

[00150] O termo "epítopo" se refere a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. Epítopos das células B podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos, justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são geralmente mantidos em exposição a solventes desnaturantes, ao passo que epí- topos formados por dobramento terciário são geralmente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo normalmente inclui pelo menos 3 e, mais usualmente, pelo menos 5 ou 8 a 10 ami- noácidos em uma única conformação espacial.

[00151] A perfilagem assistida por modificação (MAPA), também conhecida como Perfilagem de Anticorpos com base na Estrutura do Antígeno (ASAP), é um método que categoriza um grande número de proteínas de ligação ao antígeno monoclonais, por exemplo, anticor- pos (MAbs), dirigidas contra o mesmo antígeno, de acordo com as semelhanças do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies de antígenos quimicamente ou enzimaticamente modificados (veja o Do- cumento US 2004/0101920, aqui especificamente incorporado em sua totalidade). Cada categoria pode refletir um epítopo exclusivo ou distin- tamente diferente de ou parcialmente sobreposto a epítopo represen- tado por outra categoria. Essa tecnologia permite a filtragem rápida de proteínas de ligação ao antígeno geneticamente idêntica, de modo que a caracterização pode ser concentrada em proteínas de ligação ao an- tígeno geneticamente distintas. Quando aplicada a triagem de hibri- domas, a MAP pode facilitar a identificação de clones de hibridoma raros que produzem proteínas de ligação ao antígeno tendo as carac- terísticas desejadas. A MAP pode ser usada para classificar as proteí- nas de ligação ao antígeno da invenção em grupos de proteínas de ligação ao antígeno que ligam diferentes epítopos.

[00152] A presente invenção inclui as proteínas de ligação ao antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7 que se ligam ao mesmo epítopo, ou uma parte do epítopo, como qualquer das proteínas de ligação ao antígeno exemplificativas específicas aqui descritas na Tabela 1, ou uma prote-

ína de ligação ao antígeno com as sequências de CDR de qualquer das proteínas de ligação ao antígeno exemplificativas descritas na Ta- bela 1. Da mesma forma, a presente invenção também inclui as prote- ínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 que competem por ligação à HLA-A2:HPV16E7 ou um seu fragmento, com qualquer das proteínas de ligação ao antígeno exemplificativas específicas descritas na Tabela 1, ou uma proteína de ligação ao antígeno tendo as se- quências da CDR de qualquer das proteínas de ligação ao antígeno exemplificativas descritas na Tabela 1.

[00153] É possível determinar facilmente se uma proteína de liga- ção ao antígeno se liga ao mesmo epítopo que, ou compete por liga- ção com uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 de referência usando os métodos de rotina conhecido na técnica. Por exemplo, para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno de teste se liga ao mesmo epítopo que uma proteína de ligação ao antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7 de referência da invenção, é permitida a ligação da proteína de ligação ao antígeno de referência a uma proteí- na ou peptídeo HLA-A2:HPV16E7 sob condições de saturação. Em seguida, é avaliada a capacidade de ligação de uma proteína de liga- ção ao antígeno de teste à molécula HLA-A2:HPV16E7. Se a proteína de ligação ao antígeno de teste for capaz de se ligar à HLA- A2:HPV16E7 após a ligação por saturação com a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 de referência, pode-se concluir que a proteína de ligação ao antígeno de teste se liga a um epítopo diferente da proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 de referência. Por outro lado, se a proteína de ligação ao antígeno de tes- te não for capaz de se ligar à proteína HLA-A2:HPV16E7 após a liga- ção de saturação com a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7, então a proteína de ligação ao antígeno de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pela proteína de liga-

ção ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 de referência da invenção.

[00154] Para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete por ligação com uma proteína de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 de referência, a metodologia de ligação acima des- crita é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, é permitida a ligação da proteína de ligação ao antígeno de referência a uma proteína HLA-A2:HPV16E7 sob condições de saturação, seguida de avaliação da ligação da proteína de ligação ao antígeno de teste à molécula HLA-A2:HPV16E7. Em uma segunda orientação, é permitida a ligação proteína de ligação ao antígeno de teste a uma molécula HLA-A2:HPV16E7 sob condições de saturação, seguida de avaliação da ligação da proteína de ligação ao antígeno de referência à molécula HLA-A2:HPV16E7. Se, em ambas as orientações, apenas a primeira (saturação) proteína de ligação ao antígeno for capaz de ligação à mo- lécula HLA-A2:HPV16E7, então se conclui que a proteína de ligação ao antígeno de teste e a proteína de ligação ao antígeno de referência competem pela ligação ao HLA-A2:HPV16E7. Como será apreciado por aquele versado na técnica, uma proteína de ligação ao antígeno que compete pela ligação a uma proteína de ligação ao antígeno de referência pode não necessariamente se ligar ao epítopo idêntico à proteína de ligação ao antígeno de referência, mas pode não bloquear estericamente a ligação da proteína de ligação ao antígeno de refe- rência, ligando-se a um epítopo sobreposto ou adjacente.

[00155] Duas proteínas de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo ou sobreposto se cada uma inibir competitivamente (bloquear) a ligação da outra ao antígeno. Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de uma proteína de ligação ao antígeno inibe a ligação da outra em pelo menos 50%, mas de preferência em 75%, 90% ou mesmo 99%, como medido em um ensaio de ligação competitiva (veja, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alter-

nativamente, duas proteínas de ligação ao antígeno têm o mesmo epí- topo, se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzi- rem ou eliminarem a ligação da outra. Duas proteínas de ligação ao antígeno têm epítopos sobrepostos, se algumas mutações de aminoá- cidos que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzirem ou eliminarem a ligação da outra.

[00156] Experimentação de rotina adicional (por exemplo, a muta- ção de peptídeos e análise de ligação) pode ser realizada para confir- mar se a falta de ligação observada da proteína de ligação ao antígeno de teste for, de fato, devido à ligação ao mesmo epítopo que a proteí- na de ligação ao antígeno de referência, ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) for responsável pela falta de ligação observada. Ex- perimentos desse tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, res- sonância plasmônica de superfície, citometria de fluxo ou qualquer ou- tro ensaio quantitativo ou qualitativo de ligação à proteína e ligação ao antígeno disponível na técnica.

IMUNOCONJUGADOS

[00157] A invenção abrange as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 conjugadas a uma porção terapêutico ("imu- noconjugado"), como uma citotoxina ou um agente quimioterapêutico para tratamento do câncer. Como usado neste documento, o termo "imunoconjugado" se refere a uma proteína de ligação ao antígeno que é quimicamente ou biologicamente ligada a uma citotoxina, um agente radioativo, uma citocina, um interferon, uma porção-alvo ou re- pórter, como uma porção detectável, uma enzima, uma toxina, um peptídeo ou proteína ou um agente terapêutico. A proteína de ligação ao antígeno pode estar ligada à citotoxina, agente radioativo, citocina, interferon, porção-alvo ou repórter, enzima, toxina, peptídeos ou agen- te terapêutico em qualquer local ao longo da molécula, desde que seja capaz de se ligar o seu alvo. Exemplos de imunoconjugados incluem conjugados proteína de ligação ao antígeno-fármaco e proteína de li- gação ao antígeno-proteínas de fusão de toxina. Em uma modalidade, o agente pode ser um segundo anticorpo diferente para HPV16E7 ou HLA-A2:HPV16E7. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno pode ser conjugada a um agente específico para uma célula tumoral ou uma célula viralmente infectada, ou seja, uma célula infec- tada por HPV. O tipo de porção terapêutico que pode ser conjugado à proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 e levará em conta a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Exemplos de agentes adequados para a formação de imu- noconjugados são conhecidos na técnica; veja, por exemplo, a Publi- cação do Pedido PCT n° WO 05/103081. RECEPTORES QUIMÉRICOS DE ANTÍGENOS (CAR)

[00158] Os receptores quiméricos de antígenos (CARs) redirecio- nam a especificidade das células T para os antígenos reconhecidos pelo anticorpo, expressos na superfície das células cancerosas, en- quanto os receptores das células T (TCRs) ampliam o alcance dos al- vos para incluir antígenos tumorais intracelulares. Células T redirecio- nadas por CAR para o antígeno de diferenciação de células B CD19 têm mostrado grande eficácia no tratamento de neoplasias de células B, enquanto as células T redirecionadas por TCR têm mostrado bene- fícios em pacientes que sofrem de câncer sólido. Stauss et al. descre- vem estratégias para modificar CARs e TCRs terapêuticos, para uso no tratamento de cânceres, por exemplo, para melhorar a função efe- tora específica para o antígeno e limitar a toxicidade das células T en- genheiradas (Current Opinion in Pharmacology 24:113-118, 2015).

[00159] Um aspecto da invenção inclui um receptor quimérico de antígenos (CAR) que é específico para um peptídeo HPV16E7 exibido na superfície de células tumorais por HLA-A2, como um peptídeo compreendendo resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7. Em uma modalidade da presente invenção, um CAR, como descrito no presente documento, compreende um domínio de ligação específica ao alvo extracelular, um domínio transmembranar, um do- mínio de sinalização intracelular (como um domínio de sinalização de- rivado de CD3zeta ou FcRgamma) e/ou um ou mais domínios de sina- lização coestimulatórios derivados de uma molécula coestimulatória, tal como, mas não limitada a, CD28, CD137, CD134 ou CD278. Em uma modalidade, o CAR inclui uma região de charneira ou espaçadora entre o domínio de ligação extracelular e o domínio transmembranar, como uma charneira CD8alfa. Em outra modalidade da presente in- venção, um CAR como descrito no presente documento compreende um domínio de ligação específica ao alvo extracelular, e um domínio constante do receptor de células T ("construto de corpo T").

[00160] Deve ser entendido que, para uso em qualquer dos CARs aqui descritos, o domínio de ligação específica ao alvo extracelular pode incluir um fab, um Fab’, um (Fab’)2, um Fv, ou um Fv de cadeia única (scFv) de uma proteína de ligação ao antígeno da invenção.

[00161] Como usado neste documento, o domínio de ligação ou o domínio extracelular do CAR fornece ao CAR a capacidade de se ligar ao antígeno-alvo de interesse. Um domínio de ligação pode ser qual- quer proteína, polipeptídeo, oligopeptídeo ou peptídeo que possua a capacidade de reconhecer e se ligar especificamente a uma molécula biológica (por exemplo, um receptor da superfície celular ou proteína tumoral, ou um seu componente). Um domínio de ligação inclui qual- quer parceiro de ligação de ocorrência natural, sintético, semissintético ou produzido de forma recombinante para uma molécula biológica de interesse. Por exemplo, e na forma descrita neste documento, um do- mínio de ligação pode ser regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos, ou as regiões variáveis das cadeias leve e pe-

sada podem ser unidas em uma única cadeia e em qualquer orienta- ção (por exemplo, VL-VH ou VH-VL). Vários ensaios são conhecidos para a identificação de domínios de ligação da presente invenção, que se ligam especificamente com um determinado alvo, incluindo Western blot, ELISA, citometria de fluxo, análise por ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, usando análise BIACORE), e são aqui descri- tos. O alvo pode ser qualquer antígeno de interesse clínico, contra o que seria desejável desencadear uma resposta imune efetora tumor que resulte em morte do tumor. Em uma modalidade, o antígeno-alvo do domínio de ligação do receptor quimérico de antígeno é um epítopo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2 na su- perfície de células tumorais, como um peptídeo compreendendo resí- duos de aminoácidos 11-19 ou 82-90 do HPV16E7.

[00162] Domínios de ligação ilustrativos incluem proteínas de liga- ção ao antígeno, como fragmentos de ligação ao antígeno de um anti- corpo, como scFv, scTCR, domínios extracelulares de receptores, li- gantes para moléculas/receptores da superfície celular, ou seus domí- nios de ligação ao receptor, e proteínas de ligação a tumores. Em al- gumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno incluídos em um CAR da invenção pode ser uma região variável (Fv), uma CDR, um FAB, um ScFv, uma VH, uma VL, um anticorpo de domínio variante (dAb), um anticorpo camelídeo (VHH), um domínio da fibronectina 3 variante, uma repetição de anquirina variante e outro domínio de liga- ção antígeno-específico derivado de outras estruturas proteicas.

[00163] Em uma modalidade, o domínio de ligação do CAR é um anticorpo de cadeia única anti-HLA-A2:HPV16E7 (scFv), e pode ser um scFv murino, humano ou humanizado. Anticorpos de cadeia única podem ser clonados a partir dos genes da região V de um hibridoma específico para um alvo desejado. Uma técnica que pode ser usada para clonar a cadeia pesada da região variável (VH) e a cadeia leve da região variável (VL) foi descrita, por exemplo, em Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833-3837. Assim, em algumas modalidades, um domínio de ligação compreende um domínio de ligação derivado de anticorpo, mas pode ser um domínio de ligação não derivado de anticorpo. Um domínio de ligação derivado de anticorpo pode ser um fragmento de um anticorpo ou um produto geneticamente engenheirado de um ou mais fragmentos do anticorpo, cujo fragmento está envolvido na liga- ção com o antígeno.

[00164] Em algumas modalidades, os CARs da presente invenção podem compreender um ligante entre os vários domínios, adicionados para espaçamento e conformação apropriados da molécula. Por exemplo, em uma modalidade, pode haver um ligante entre o domínio de ligação VH ou VL, que pode ter entre 1-10 aminoácidos de compri- mento. Em outras modalidades, o ligante entre qualquer um dos domí- nios do receptor quimérico de antígeno pode ter entre 1-20 ou 20 ami- noácidos de comprimento. A este respeito, o ligante pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o ligante pode ter 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento. Os interva- los, incluindo os números aqui descritos, também estão incluídos neste documento, por exemplo, um ligante com 10-30 aminoácidos de com- primento.

[00165] Em algumas modalidades, os ligantes adequados para uso no CAR aqui descrito são ligantes flexíveis. Ligantes adequados po- dem ser facilmente selecionados e podem ser de qualquer um dos comprimentos diferentes, como de 1 aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoáci- dos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, e pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ami-

noácidos.

[00166] Ligantes flexíveis exemplificativos incluem polímeros de gli- cina (G)n, polímeros de glicina-serina, em que n é um número inteiro de pelo menos um, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina- serina e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, por- tanto, podem servir como um link neutro entre domínios de proteínas de fusão, como os CARs aqui descritos. A glicina acessa significativa- mente mais espaço phi-phi do que a alanina, e é muito menos restrita do que os resíduos com cadeias laterais mais longas (veja Scheraga, Rev. Chem Computacional. 11173-142 (1992)). O versado na técnica irá reconhecer que o projeto de um CAR pode incluir ligantes que são total ou parcialmente flexíveis, de tal forma que o ligante pode incluir um ligante flexível, bem como uma ou mais partes que conferem me- nos estrutura flexível para fornecer uma estrutura de CAR desejada.

[00167] O domínio de ligação do CAR pode ser seguido por um "espaçador" ou "charneira", que se refere à região que move o domínio de ligação ao antígeno para longe da superfície de células efetoras, para permitir um contato célula a célula adequado, ligação ao antínego e ativação (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). A região de charneira em um CAR é geralmente entre a transmembrana (TM) e o domínio de ligação. Em algumas modalidades, uma região de charnei- ra é uma região de charneira da imunoglobulina, e pode ser uma regi- ão de charneira da imunoglobulina do tipo selvagem região, ou uma região de charneira da imunoglobulina do tipo selvagem alterada. Ou- tras regiões de charneira exemplificativas usadas nos CARs aqui des- critos incluem a região de charneira derivada das regiões extracelular das proteínas de membrana do tipo 1, como CD8alpha, CD4, CD28 e CD7, que podem ser regiões de charneira do tipo selvagem dessas moléculas ou podem ser alteradas. Em uma modalidade, a região de charneira compreende uma charneira CD8alfa.

[00168] A região ou domínio transmembranar é a parte do CAR que ancora a parte de ligação extracelular à membrana plasmática da célu- la efetora imune, e facilita a ligação do domínio de ligação ao antíge- no-alvo. O domínio transmembranar pode ser um domínio transmem- branar CD3zeta; no entanto, outros domínios transmembranares que podem ser empregadas incluem aqueles obtidos de CD8alpha, CD4, CD28, CD45, CD9, CD16, CD22, CD33, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em uma modalidade, o domínio transmembranar é o domínio transmembrana da CD137. Em algumas modalidades, o do- mínio transmembranar é sintético, caso em que compreenderia pre- dominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina.

[00169] O "domínio de sinalização intracelular" se refere à parte da proteína do receptor quimérico de antígeno que participa na transdu- ção da mensagem do CAR efetivo, que se liga a um antígeno-alvo dentro da célula efetora imune para provocar a função efetora da célu- la, por exemplo, ativação, produção de citocinas, proliferação e ativi- dade citotóxica, incluindo a liberação de fatores citotóxicos para a célu- la-alvo ligada ao CAR, ou outras respostas celulares provocadas com a ligação ao antígeno para o domínio do CAR extracelular. O termo "função efetora" se refere a uma função especializada da célula. A função efetora da célula T, por exemplo, pode ser a atividade citolítica ou auxiliar, ou atividade incluindo a secreção de uma citocina. Assim, o termo "domínio de sinalização intracelular" se refere à parte de uma proteína que transduz o sinal da função efetora e que direciona a célu- la para realizar uma função específica. Embora geralmente todo o do- mínio de sinalização intracelular possa ser empregado, em muitos ca- sos não é necessário usar todo o domínio. Na medida em que uma parte truncada de um domínio de sinalização intracelular é usado, es- sa parte truncada pode ser usada no lugar de todo o domínio, desde que transduza o sinal da função efetora. O termo domínio de sinaliza- ção intracelular deve incluir qualquer parte truncada do domínio de si- nalização intracelular, suficiente para transduzir o sinal da função efe- tora. O domínio de sinalização intracelular também é conhecido como o "domínio de transdução de sinal", e geralmente é derivado de partes das cadeias da CD3 ou FcRy humana.

[00170] Sabe-se que os sinais gerados através do receptor de célu- las T sozinhos não são suficientes para a plena ativação das células T, e que também é necessário um sinal secundário ou coestimulatório. Assim, pode-se dizer que a ativação de células T é mediada por duas classes distintas de sequências de sinalização citoplasmática: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do receptor de células T (sequências principais de sinalização citoplasmá- tica) e aquelas que agem de forma independente do antígeno, para fornecer um sinal coestimulatório ou secundário (sequências secundá- rias de sinalização citoplasmática). As sequências primárias de sinali- zação citoplasmática regulam a ativação principal do complexo recep- tor de células T de maneira inibitória ou inibitória. As sequências pri- márias de sinalização citoplasmática que agem de maneira coestimu- latória podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivo de ativação com base no imunorreceptor da tirosina ou ITAMs.

[00171] Exemplos de ITAM contendo sequências primárias de sina- lização citoplasmática que são de particular uso na invenção incluem aqueles derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em al- gumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular dos CARS anti-HLA-A2:HPV16E7 descritos aqui são derivados de CD3zeta ou FcRgamma.

[00172] Como usado neste documento, o termo "domínio de sinali- zação coestimulatório", ou "domínio coestimulatório", se refere à parte do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula coes- timulatória. As moléculas coestimulatórias são moléculas da superfície celular diferentes dos receptores de antígenos ou receptores Fc, que fornecem um segundo sinal necessário para uma eficiente ativação e função de linfócitos T mediante ligação ao antígeno. Exemplos dessas moléculas coestimulatórias incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKD2C, B7-H2 e um ligante que se liga especificamente à CD83. Por conseguinte, embora a presente invenção forneça domínios coestimulatórios exemplificativos derivados das CD3zeta e 4-1BB, ou- tros domínios coestimulatórios são previstos para uso com os CARs aqui descritos. A inclusão de um ou mais domínios de sinalização co- estimulatórios pode melhorar a eficácia e a expansão das células T que expressam os receptores CAR. A sinalização intracelular e os do- mínios de sinalização coestimulatórios podem ser ligados em qualquer ordem, em tandem ao terminal carboxila do domínio transmembranar.

[00173] Embora tenha sido mostrado que os CARs com base em scFv, engenheirados para conter um domínio de sinalização de CD3 ou FcRgama, entreguem um sinal potente para a ativação de células T e a função efetora, eles não são suficientes para provocar sinais que promover a sobrevivência e a expansão de células T na ausência de um sinal coestimulatório concomitante. Outros CARs contendo um domínio de ligação, uma charneira, uma transmembrana e o domínio de sinalização derivado de CD3zeta ou FcRgama juntamente com um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios (por exemplo, domí- nios coestimulatórios intracelulares derivados de CD28, CD137, CD134 e CD278) podem direcionar de forma mais eficaz a atividade antitumoral, bem como o aumento na secreção de citocinas, atividade lítica, sobrevivência e proliferação em células T que expressam CAR in vitro, e em modelos animais e pacientes com câncer (Milone et al., Mo-

lecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464; Zhong et al., Molecular The- rapy, 2010; 18: 413-420; Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360- 3365).

[00174] Em uma modalidade, os CARs HLA-A2:HPV16E7 da inven- ção compreendem (a) um scFv anti-HLA-A2:HPV16E7 como um do- mínio de ligação (por exemplo, um scFv tendo regiões de ligação (por exemplo, CDRs ou domínios variáveis) de qualquer um ou mais dos anticorpos HLA-A2:HPV16E7 descritos na Tabela 1); b) uma região de charneira derivada da CD8alfa humana; (c) um domínio transmembra- nar da CD8alfa, e (d) um domínio de sinalização intracelular da cadeia CD3 zeta (CD3) do receptor de células T humanas, e opcionalmente um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios derivadas de CD28, CD137, CD134 e CD278. Em uma modalidade, os diferentes domínios de proteínas são organizados do terminal amino para a car- boxila na seguinte ordem: domínio de ligação, região de charneira e domínio transmembranar. O domínio de sinalização intracelular e os domínios de sinalização coestimulatórios opcionais são ligados ao terminal carbóxi transmembranar em qualquer ordem, em tandem para formar um polipeptídeo quimérico de cadeia única. Em uma modalida- de, um construto de ácido nucleico que codifica um CAR HLA- A2:HPV16E7 é uma molécula de ácido nucleico quimérica compreen- dendo uma molécula de ácido nucleico que compreende diferentes sequências de codificação, por exemplo, as sequências de codificação (5’ a 3’) de uma scFv anti-HLA-A2:HPV16E7, uma CD8alfa-charneira humana, um domínio transmembranar da CD8alfa humana e um do- mínio de sinalização intracelular da CD3zeta. Em outra modalidade, um construto de ácido nucleico que codifica um CAR HLA- A2:HPV16E7 é uma molécula de ácido nucleico quimérica constituída por uma molécula de ácido nucleico compreendendo diferentes se- quências de codificação, por exemplo, as sequências de codificação

(5’ a 3’) de uma scFv anti-HLA-A2:HPV16E7, uma CD8alfa-charneira humana, um domínio transmembranar da CD8alfa humana, um domí- nio coestimulatório da CD137 e um domínio coestimulatório da CD3zeta. Em algumas modalidades, um construto de ácido nucleico que codifica um CAR HLA-A2:HPV16E7 é uma molécula de ácido nu- cleico quimérica constituída por uma molécula de ácido nucleico com- preendendo diferentes sequências de codificação, por exemplo, as se- quências de codificação (5’ a 3’) de uma scFv anti-HLA-A2:HPV16E7, uma CD8alfa-charneira humana, um domínio transmembranar da CD8alfa humana, um domínio coestimulatório da CD137 e um domínio coestimulatório da CD3zeta, em que a scFv anti-HLA-A2:HPV16E7 compreende uma VH selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2, 34, 82, 194, 282 e 506, e uma VL selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 10, 42, 90, 202, 290 e 514. Em algumas mo- dalidades, a presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica um CAR HLA-A2:HPV16E7 selecionado do grupo que consiste em SEQ ID nos: 540, 541, 542, 543, 544 e 545.

[00175] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o CAR aqui descrito é inserido em um vetor. O termo "vetor", conforme usado neste documento, se refere a um veículo ao qual pode ser cova- lentemente inserido um polinucleotídeo que codifica uma proteína, de forma a provocar a expressão dessa proteína e/ou a clonagem do po- linucleotídeo. Esses vetores também podem ser referidos como "veto- res de expressão". O polinucleotídeo isolado pode ser inserido em um vetor usando quaisquer métodos adequados conhecidos na arte, por exemplo, mas sem limitação, o vetor pode ser digerido com enzimas de restrição adequadas e, em seguida, pode ser ligado com o polinu- cleotídeo isolado que tem extremidades de restrição correspondentes. Os vetores de expressão têm a capacidade de incorporar e expressar sequências de ácidos nucleicos heterólogas ou modificadas, que codi-

ficam pelo menos parte de um produto gênico susceptível de transcri- ção em uma célula. Na maioria dos casos, as moléculas de RNA são, então, traduzidas em uma proteína. Os vetores de expressão podem conter uma variedade de sequências de controle, que se referem a sequências de ácidos nucleicos necessárias para a transcrição e, pos- sivelmente, a tradução de uma sequência de codificação operativa- mente ligada em um determinado organismo hospedeiro. Além de se- quências de controle que regulam a transcrição e a tradução, vetores e vetores de expressão também podem conter sequências de ácidos nucleicos que servem outras funções e são discutidas abaixo. Um ve- tor de expressão pode compreender elementos adicionais, por exem- plo, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação, assim permitindo que seja mantido em dois organismos, por exemplo, em células humanas para expressão e em um hospedeiro procariótico pa- ra clonagem e amplificação.

[00176] O vetor de expressão pode ter os elementos regulatórios 5’ a montante e 3’ a jusante necessários, como sequências promotoras, como os promotores CMV, PGK e EF1alfa, reconhecimento de ribos- somos e caixa TATA de ligação, e a sequência de terminação de transcrição AAUAAA 3’ UTR para a transcrição e a tradução eficientes de genes em sua respectiva célula hospedeira. Outros promotores adequados incluem o promotor constitutivo do promotor precoce do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongos (MMTV), promotor LTR HIV, promotor MoMuLV, promotor do vírus da leucemia aviária, promotor precoce imediato EBV e promotor do vírus do sarcoma de rous. Promotores de genes humanos também podem ser usados, incluindo, mas não limitados a, o promotor da actina, o promotor da miosina, o promotor da hemoglobina e o promotor da cre- atina quinase. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis são também contemplados como parte dos vetores que expressam o re-

ceptor de antígeno quimérico. Isso fornece uma troca molecular capaz de iniciar a expressão da sequência de polinucleotídeos de interesse ou desligar a expressão. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não de limitam a, um promotor da metalotionina, um promotor do glicocorticoide, um promotor da progesterona ou um promotor da te- traciclina.

[00177] O vetor de expressão pode ter sequências adicionais, como 6x-histidina, c-Myc, e etiquetas FLAG que são incorporadas aos CARs expressos. Assim, o vetor de expressão pode ser engenheirado para conter as sequências reguladoras não traduzidas 5’ e 3’ que, às vezes, podem funcionar como sequências potenciadoras, regiões promotoras e/ou sequências terminadoras que podem facilitar ou melhorar a efici- ência da transcrição do(s) ácido(s) nucleico(s) de interesse realizada no vetor de expressão. Um vetor de expressão também pode ser en- genheirado para a funcionalidade de replicação e/ou expressão (por exemplo, transcrição e tradução) em um determinado tipo de célula, local de célula ou tipo de tecido. Os vetores de expressão podem in- cluir um marcador selecionável para manutenção do vetor na célula hospedeira ou recipiente.

[00178] Exemplos de vetores são plasmídeos, sequências de repli- cação autônoma e elementos transponíveis. Vetores exemplificativos adicionais incluem, sem limitação, plasmídeos, fagemídeos, cosmí- deos, cromossomos artificiais, como o cromossomo artificial de levedu- ra (YAC), o cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou o cromossomo artificial P1-derivado (PAC), bacteriófagos como fago lambda ou fago M13, e vírus animais. Exemplos de categorias de vírus animais úteis como vetores incluem, sem limitação, retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociado, herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus, papovavírus (por exemplo, SV40). Exemplos de vetores de expressão são os veto-

res Bicistronic Expression System (Neo) Lenti-XTM (Clontrch), vetores pClneo (Promega) para expressão em células de mamíferos; pLen- ti4/V5-DEST.TM., pLenti6/V5-DEST.TM. e pLenti6.2N5-GW/lacZ (Invi- trogen) para expressão e transferência gênica mediada por lentívirus em células de mamíferos. As sequências de codificação dos CARs aqui descritos podem ser ligadas a esses vetores de expressão para a expressão da proteína quimérica em células de mamíferos.

[00179] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codifi- cam o CAR da presente invenção são fornecidos em um vetor viral. Um vetor viral pode ser aquele derivado de retrovírus, lentivírus ou ví- rus espumoso. Como usado neste documento, o termo "vetor viral" se refere a um construto do vetor de ácido nucleico que inclui pelo menos um elemento de origem viral e tem a capacidade de ser empacotado em uma partícula de vetor viral. O vetor viral pode conter a sequência de codificação para as várias proteínas quiméricas aqui descritas, em lugar de genes virais não essenciais. O vetor e/ou a partícula pode ser usada para fins de transferência de DNA, RNA ou outros ácidos nu- cleicos em células in vitro ou in vivo. Inúmeras formas de vetores virais são conhecidas na técnica.

[00180] Em algumas modalidades, o vetor viral contendo a se- quência de codificação para um CAR aqui descrito é um vetor retrovi- ral ou um vetor lentiviral. O termo "vetor retroviral" se refere a um vetor contendo elementos genéticos estruturais e funcionais que são princi- palmente derivados de um retrovírus. O termo "vetor lentiviral" se refe- re a um vetor contendo elementos genéticos estruturais e funcionais fora dos LTRs que são principalmente derivados de um lentivírus.

[00181] Os vetores retrovirais para uso neste documento podem ser derivados de qualquer retrovírus conhecido (por exemplo, retrovírus do tipo c, como o vírus do sarcoma murino de Moloney (MoMSV), o vírus do sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), o vírus do tumor mamário murino (MuMTV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da leucemia felina (FLV), espumavírus, Friend, o Vírus das Células Esta- minais Murinas (MSCV) e o Vírus do Sarcoma Rous (RSV)). Os "retro- vírus" da invenção também incluem o vírus da leucemia de células T humanas, vírus HTLV-1 e HTLV-2, e a família lentiviral de retrovírus, como o Vírus da Imunodeficiência Humana, HIV-1, HIV-2, o vírus da imunodeficiência símia (SIV), o vírus da imunodeficiência felina (FIV), o vírus da imunodeficiência equina (EIV), e outras classes de retroví- rus.

[00182] Um vetor lentiviral para uso neste documento se refere a um vetor derivado de um lentivirus, um grupo (ou gênero) de retrovírus que dá origem a doenças lentamente desenvolvidas. Os vírus incluí- dos nesse grupo incluem HIV (vírus da imunodeficiência humana; in- cluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2); visna-maedi; um vírus da artrite- encefalite caprina; vírus da anemia infecciosa equina; vírus da imuno- deficiência felina (FIV); vírus da imunodeficiência bovina (BIV); e vírus da imunodeficiência símia (SIV). A preparação do lentivirus recombi- nante pode ser alcançada usando os métodos de acordo com Dull et al e Zufferey et al. (Dull et al., J. Virol., 1998; 72: 8463-8471 e Zufferey et al., J. Virol. 1998; 72:9873-9880).

[00183] Os vetores retrovirais (ou seja, tanto lentivirais quanto não lentivirais) para uso na presente invenção podem ser formados usando técnicas de clonagem padronizadas, combinando as sequências de DNA desejadas na ordem e orientação descritas neste documento (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Seções 9.10-9.14 e outros ma- nuais laboratoriais padronizados; Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos e Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039- 8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol 150:4104- 4115; Patente US nº 4,868,116; Patente US nº 4,980,286; Pedido PCT publicação nº WO 89/07136; Pedido PCT publicação nº WO 89/02468; Pedido PCT publicação nº 89/05345; e Pedido PCT publicação WO 92/07573).

[00184] Fontes apropriadas para obtenção de sequências retrovirais (ou seja, tanto lentivirais quanto não lentivirais) para uso na formação dos vetores incluem, por exemplo, RNA genômico e cDNAs disponí- veis a partir de fontes comercialmente disponíveis, incluindo a Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland. As sequências tam- bém podem ser sintetizadas quimicamente.

[00185] Para a expressão de um CAR HLA-A2:HPV16E7, o vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira para permitir a expres- são do polipeptídeo dentro da célula hospedeira. Os vetores de ex- pressão podem conter uma variedade de elementos para controle da expressão, incluindo, sem limitação, sequências promotoras, sequên- cias de iniciação da transcrição, sequências potenciadoras, marcado- res selecionáveis e sequências de sinal. Esses elementos podem ser selecionados conforme apropriado por uma pessoa com conhecimento comum na técnica, como descrito acima. Por exemplo, as sequências promotoras podem ser selecionadas para promover a transcrição do polinucleotídeo no vetor. Sequências promotoras adequadas incluem, sem limitação, promotora de T7, promotora de T3, promotora de SP6, promotora da beta-actina, promotora de EF1a, promotora do CMV e promotora do SV40. As sequências potenciadoras podem ser selecio-

nadas para aumentar a transcrição do polinucleotídeo. Os marcadores selecionáveis podem ser selecionados para permitir a seleção das cé- lulas hospedeiras inseridas no vetor dentre aquelas que não são, por exemplo, os marcadores selecionáveis podem ser genes que confe- rem resistência a antibióticos. As sequências de sinal podem ser sele- cionadas para permitir que o polipeptídeo expresso seja transportado para fora da célula hospedeira.

[00186] Para clonagem do polinucleotídeo, o vetor pode ser intro- duzido em uma célula hospedeira (uma célula hospedeira isolada) pa- ra permitir a replicação do vetor em si e, assim, ampliar as cópias do oolinucleotídeo aí contidos. Os vetores de clonagem podem conter componentes de sequência que geralmente incluem, sem limitação, uma origem de replicação, sequências promotoras, sequências de ini- ciação da transcrição, sequências potenciadoras e marcadores seleci- onáveis. Esses elementos podem ser selecionados conforme apropri- ado por uma pessoa com conhecimento comum na técnica. Por exem- plo, a origem da replicação pode ser selecionada para promover a re- plicação autônoma do vetor na célula hospedeira.

[00187] Em outro aspecto, a presente invenção fornece células hospedeiras isoladas contendo os vetores aqui fornecidos. As células hospedeiras contendo o vetor podem ser úteis na expressão ou clona- gem dos polinucleotídeos contidos no vetor. As células hospedeiras adequadas podem incluir, sem limitação, células procarióticas, células fúngicas, células de leveduras ou células eucarióticas superiores, co- mo células de mamíferos. Células procarióticas adequadas para este fim incluem, sem limitação, eubactérias, como organismos gram- negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, como

B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, como P. aeruginosa e Streptomyces.

[00188] Os CARs da presente invenção são introduzidos em uma célula hospedeira usando técnicas de transfecção e/ou transdução co- nhecidas na arte. Como usado neste documento, os termos "transfec- ção" e "transdução" se referem aos processos pelos quais uma se- quência de ácidos nucleicos exógena é introduzida em uma célula hospedeira. O ácido nucleico pode ser integrado ao DNA da célula hospedeira ou pode ser mantido de forma extracromossômica. O ácido nucleico pode ser mantido transitoriamente, ou pode ser uma introdu- ção estável. A transfecção pode ser realizada por uma variedade de meios conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, copreci- pitação de DNA por fosfato de cálcio, transfecção mediada por dextra- no-DEAE, transfecção mediada por polibreno, eletroporação, microin- jeção, fusão de lipossomos, lipofecção, fusão de protoplastos, infecção retroviral e biolística. A transdução se refere à entrega de um ou mais genes usando um vetor viral ou retroviral por meio de infecção viral, em vez de transfecção. Em algumas modalidades, os vetores retrovi- rais são transduzidos por empacotamento dos vetores em vírions, an- tes do contato com uma célula. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um CAR anti-HLA-A2:HPV16E7 transportado por um vetor re- troviral pode ser transduzido em uma célula através de infecção e in- tegração pró-vírus.

[00189] Como usado neste documento, o termo "geneticamente en- genheirado" ou "geneticamente modificado" se refere à adição de ma- terial genético extra na forma de DNA ou RNA ao material genético total em uma célula. Os termos "células geneticamente modificadas", "células modificadas" e "células redirecionadas" são usados como si- nônimos.

[00190] Em particular, o CAR da presente invenção é introduzido e expresso em células efetoras imunes, de modo a reorientar a sua es- pecificidade para um antígeno-alvo de interesse, por exemplo, um epí- topo conformacional de um peptídeo HPV16E7 exibido por HLA-A2, por exemplo, resíduos de aminoácidos 11-19 ou 82-90.

[00191] A presente invenção fornece métodos para a produção de células efetoras imunes que expressam o CAR conforme descrito nes- te documento. Em uma modalidade, o método compreende transfectar ou transduzir células efetoras imunes isoladas de um indivíduo, como um indivíduo com uma doença ou distúrbio associado ao HPV16E7, de tal forma que as células efetoras imunes expressem um ou mais CARs como aqui descritos. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes são isoladas de um indivíduo e geneticamente modificadas manipulação in vitro adicional. Essas células podem, então, ser dire- tamente readministradas ao indivíduo. Em outras modalidades, as cé- lulas efetoras imunes são, primeiro, ativadas e estimuladas para proli- feração in vitro antes de serem geneticamente modificadas para ex- pressar um CAR. A esse respeito, as células efetoras imunes podem ser cultivadas antes ou depois de serem geneticamente modificadas (ou seja, transduzidas ou transfectadas para expressar um CAR como descrito neste documento).

[00192] Antes da manipulação in vitro ou modificação genética das células efetoras imunes aqui descritas, a fonte de células pode ser ob- tida a partir de um indivíduo. Em particular, as células efetoras imunes para uso com os CARs aqui descritos compreendem células T. Essas células T recombinantes são aqui mencionadas como "corpos T".

[00193] Em uma modalidade da presente invenção, um corpo T in- clui um CAR da invenção, compreendendo um domínio de ligação es- pecífica ao alvo extracelular, um domínio transmembranar, um domínio de sinalização intracelular (como um domínio de sinalização derivado de CD3zeta ou FcRgamma) e/ou um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios derivados de uma molécula coestimulatória, tal como, mas não limitada a, CD28, CD137, CD134 ou CD278. Em outra moda- lidade da presente invenção, um corpo T inclui um CAR da invenção, compreendendo um domínio de ligação específica ao alvo extracelular, um domínio transmembranar, uma região de charneira ou espaçadora entre o domínio de ligação extracelular e o domínio transmembranar, um domínio de sinalização intracelular (como um domínio de sinaliza- ção derivado de CD3zeta ou FcRgama) e/ou um ou mais domínios si- nalização coestimulatórios derivados de uma molécula coestimulatória. Em ainda outra modalidade da presente invenção, um corpo T inclui um CAR do contruto de corpo T compreendendo um domínio de liga- ção específica ao alvo extracelular, e um domínio constante do recep- tor de células T. O domínio de ligação específica ao alvo extracelular adequado para uso em um corpo T compreendendo qualquer dos CARs aqui descritos pode incluir um fab, um Fab’, um (Fab’)2, um Fv, ou um Fv de cadeia única (scFv) de uma proteína de ligação ao antí- geno da invenção.

[00194] As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido dos linfonodos, cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de in- fecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada do indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo verado an técnica, tal como a separação FICOLL. Em uma modalidade, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto da aférese contém normalmente linfóci- tos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros gló- bulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em uma modalidade, as células coletadas por aférese podem ser lavadas para remover a fração de plasma e para colocar as células em tampão apropriado ou meio para posterior processamento. Em uma modalida- de da invenção, as células são lavadas com PBS. Em uma modalidade alternativa, a solução lavada carece de cálcio e pode ter falta de mag- nésio ou podem ter falta de muitos, se não todos, os cátions divalen- tes. Como seria apreciado por aqueles versados na técnica, uma eta- pa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos para aque- les com conhecimento na arte, usando uma centrífuga de fluxo semi- automática. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis ou outra solução salina com ou sem tampão. Em algumas modalidades, os componentes in- desejáveis de amostra por aférese podem ser removidos nos meios de cultura diretamente ressuspensos na célula.

[00195] Em algumas modalidades, as células T são isoladas das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por lise das cé- lulas vermelhas do sangue e esgotando os monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLLTM. Uma determi- nada subpopulação de células T, como as células CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e CD45RO+, pode ser isolada por meio de técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, o enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser feito com uma combinação de anticorpos direcionados para marcadores de su- perfície únicos para as células selecionadas negativamente. Um méto- do para uso aqui é a classificação e/ou seleção de células por imuno- aderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um co- quetel de anticorpos monoclonais direcionados para marcadores da superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente. Por exemplo, para o enriquecimento das células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. A cito- metria de fluxo e a classificação de células também podem ser usadas para isolar populações de células de interesse para uso na presente invenção.

[00196] PBMC podem ser usadas diretamente para modificação genética com os CARs, usando os métodos conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, após isolamento das PBMC, os linfócitos T são ainda isolados e, em algumas modalidades, tanto os linfócitos T auxiliares quanto os citotóxicos podem ser classificados em subpopulações de células T do tipo selvagem, de memória e efetoras antes ou depois da modificação genética e/ou expansão. As células CD8+ podem ser obtidas usando métodos padronizados. Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda classificadas em células to tipo selvagem, da memória central e efetoras, através da identificação de antígenos da superfície celular que são associados a cada um des- ses tipos de células CD8+. Em modalidades, as células T da memória estão presentes em ambos os subconjuntos CD62L+ e CD62L- de lin- fócitos do sangue periférico CD8+. As PBMC são classificadas em fra- ções CD62L-CD8+ e CD62L+CD8+ após coloração com os anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores fenotípicos de TCM da memória central inclui CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e CD127, e é negativa para granzima B. Em algumas modalidades, as células T da memória central são células T CD45RO+, CD62L+, CD8+. Em algumas modalidades, as células T efetoras são negativas para CD62L, CCR7, CD28 e CD127, e positi- vas para granzima B e perforina. Em algumas modalidades, linfócitos T CD8+ do tipo selvagem são caracterizados pela expressão de mar- cadores fenotípicos de células T do tipo selvagem, incluindo CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 e CD45RA.

[00197] Em algumas modalidades, as células T CD4+ são ainda classificadas em subpopulações. Por exemplo, as células T auxiliares CD4+ podem ser classificadas em células do tipo selvagem, da memó-

ria central e efetoras através da identificação de populações de células que têm antígenos da superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos usando métodos padronizados. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ do tipo selvagem são células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ da memória central são CD62L positivas e CD45RO negativas. Em algumas modalidades, as células CD4+ efetoras são CD62L e CD45RO negativas.

[00198] As células efetoras imunes, como as células T, podem ser geneticamente modificadas após o isolamento por meio de métodos conhecidos, ou as células efetoras imunes podem ser ativadas e ex- pandidas (ou diferenciadas, no caso de progenitores) in vitro antes de serem geneticamente modificadas. Em outra modalidade, as células efetoras imunes, como as células T, são geneticamente modificadas com os receptores quiméricos de antígeno descritos neste documento (por exemplo, transduzidas com um vetor viral compreendendo um ácido nucléico que codifica um CAR) e, em seguida, são ativadas e expandidas in vitro. Métodos de ativação e expansão de células T são conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, na Patente US n° 6,905,874; Patente US n° 6,867,041; Patente US n° 6,797,514; Pedido PCT publicação nº WO2012079000, Documento US 2016/0175358. Em geral, esses métodos incluem colocar PBMC ou células T isoladas em contato com um agente estimulatório e agente coestimulatório, como os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, geralmente ligados a uma esfera ou outra superfície, em um meio de cultura com citocinas apro- priadas, como IL-2. Os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 ligados à mesma esfera servem como uma célula apresentadora de antígeno (APC) "substituta". Em outras modalidades, as células T podem ser ativadas e estimuladas para proliferação com as células alimentadoras e anticorpos e citocinas adequados, usando métodos como aquelas descritos na Patente US n° 6,040,177; Patente US n° 5,827,642; e Pe- dido PCT publicação nº WO2012129514.

[00199] A invenção fornece uma população de células efetoras imunes modificadas, para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado ao HPV, por exemplo, câncer, as células efetoras imunes modificadas compreendendo um CAR HLA-A2:HPV16E7 como aqui descrito.

[00200] As células efetoras imunes que expressam CAR prepara- das como descrito neste documento podem ser usadas nos métodos e composições para imunoterapia adotiva de acordo com técnicas co- nhecidas, ou suas variações que serão evidentes para aqueles versa- dos na técnica com base na presente invenção. Veja, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US nº 2003/0170238 de Gruenberg et al; veja também a Patente US n° 4.690.915 de Rosenberg.

[00201] Em algumas modalidades, as células são formuladas, pri- meiro, colhendo-as de seu meio de cultura e, em seguida, lavando e concentrando as células em um meio e sistema recipiente adequado para administração (um veículo "farmaceuticamente aceitável") em uma quantidade eficaz para tratamento. O meio de infusão adequado pode ser qualquer formulação de meio isotônica, normalmente solução salina comum, Normosol R (Abbott) ou Plasma-Lyte A (Baxter), mas também pode ser usada dextrose a 5% em água ou lactato de Ringer. O meio de infusão pode ser suplementado com albumina sérica hu- mana.

[00202] Uma quantidade eficaz para tratamento de células na com- posição é de pelo menos 2 células (por exemplo, pelo menos 1 célula T da memória central CD8+, e pelo menos 1 subconjunto de células T auxiliares CD4+) ou é mais comumente superior a 102 células, e até 106 até e incluindo 108 ou 109 células, e pode ser mais de 1010 células. O número de células dependerá do uso final para o qual a composição se destina, assim como o tipo de células aí incluídas.

[00203] As células podem ser autólogas ou heterólogas para o pa- ciente submetido a terapia. Se desejado, o tratamento também pode incluir a administração de mitógenos (por exemplo, PHA) ou linfocinas, citocinas e/ou quimiocinas (por exemplo, IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-α, IL- 18, e TNF-β, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α, etc.), co- mo descrito no presente documento para melhorar a indução da res- posta imune.

[00204] As populações de células efetoras imunes que expressam CAR da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes, como IL-2 e outras citocinas ou popu- lações de células. Em resumo, as composições farmacêuticas da pre- sente invenção podem compreender uma população de células efeto- ras imunes que expressam CAR, como as células T, como descrito no presente documento, em combinação com um ou mais veículos, dilu- entes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Essas composi- ções podem compreender tampões como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos como glicose, manose, sacarose ou dextrans, manitol; proteínas; poli- peptídeos ou aminoácidos como a glicina; antioxidantes; agentes que- lantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, o hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são preferivelmente formuladas para administração intravenosa.

[00205] A resposta imune antitumoral induzida em um indivíduo pe- la administração de células T que expressam CAR aqui descritas usando os métodos descritos aqui, ou outros métodos conhecidos na arte, pode incluir respostas imunes celulares mediadas por células T citotóxicas capazes de matar as células infectadas, células T regulató- rias e as respostas das células T auxiliares. Também podem ser indu-

zidas as resposta imunes humorais, mediadas principalmente por célu- las T auxiliares capazes de ativar as células B, assim levando à produ- ção de anticorpos. Várias técnicas podem ser usadas para analisar o tipo de respostas imunes induzidas pelas composições da presente invenção, que são bem descritas na arte; por exemplo, Current Proto- cols in Immunology, editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y..

[00206] Assim, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo com diagnóstico ou suspeito de ter, ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio associado ao HPV, por exemplo, câncer positivo para HPV16E7, compreendendo administrar ao indiví- duo uma quantidade terapeuticamente eficaz das células efetoras imunes que expressam CAR, conforme descrito neste documento.

[00207] Em uma modalidade, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo com diagnóstico de câncer positivo para HPV16E7, compreendendo remover as células efetoras imunes de um indivíduo com diagnóstico de câncer positivo para HPV16E7; modificar geneticamente as referidas células efetoras imunes com um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno da presente invenção, assim produzindo uma população de células efetoras imunes modificadas, e administrar a população de células efetoras imunes modificadas ao mesmo indivíduo. Em uma modalidade, as células efetoras imunes compreendem as células T.

[00208] Os métodos de administração das composições de células descritas neste documento incluem qualquer método que seja eficaz para resultar na reintrodução de células efetoras imunes geneticamen- te modificadas ex vivo que ou expressam diretamente um CAR da in- venção no indivíduo, ou na reintrodução dos progenitores genetica- mente modificados de células efetoras imunes que, mediante a intro-

dução em um indivíduo, se diferenciam em células efetoras imunes maduras que expressam o CAR. Um método compreende a transdu- ção de células T do sangue periférico ex vivo com um construto de ácido nucleico de acordo com a invenção, e a retorno das células transduzidas ao indivíduo.

ADMINISTRAÇÃO E FORMULAÇÕES TERAPÊUTICAS

[00209] A invenção fornece composições terapêuticas compreen- dendo as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou CARs, da presente invenção. As composições terapêuticas de acordo com a invenção serão administradas com veículos, excipientes e ou- tros agentes adequados que são incorporados a formulações para proporcionar melhores transferência, entrega, tolerância e similares. Um grande número de formulações adequadas pode ser encontrado no formulário de consulta conhecido de todos os químicos farmacêuti- cos: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Com- pany, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pas- tas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídios, vesículas contendo lipí- dios (aniônicos ou catiônicos) (como LIPOFECTIN™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água e água- em-óleo, Emulsões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos mole- culares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo Car- bowax. Veja também Powell et al. "Compendium of excipients for par- enteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[00210] A dose da proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pode variar de- pendendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, da doença-alvo, condições, via de administração e similares. Quando uma proteína de ligação ao antígeno da presente invenção é usada para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um paciente adulto,

ou para prevenir essa doença, é vantajoso administrar a proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, da presente invenção normalmente a uma única dose de cerca de 0,1 a cerca de 60 mg/kg de peso corporal, de preferência de cerca de 5 a cerca de 60, de cerca de 20 a cerca de 50, de cerca de 10 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 10, ou de cerca de 0,8 a cerca de 11 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajusta- das. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, da invenção pode ser administrada como uma dose inicial de pelo menos cerca de 0,1 mg a de cerca de 800 mg, de cerca de 1 a cerca de 500 mg, de cerca de 5 a cerca de 300 mg de cerca de 10 a cerca de 200 mg, a cerca de 100 mg, ou a cerca de 50 mg. Em algumas modalida- des, a dose inicial pode ser seguida por administração de uma segun- da ou uma pluralidade de doses subsequentes da proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mes- ma ou inferior à dose inicial, em que as doses subsequentes são sepa- radas em pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos 2 semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 sema- nas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas ou pelo menos 14 semanas.

[00211] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcáp- sulas, células recombinantes capazes de expressar vírus mutantes, endocitose mediada por receptores (veja, por exemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução in-

cluem, mas não se limitam a, vias intradérmica, transdérmica, intra- muscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, peridu- ral e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via con- veniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bólus, por absorção pelos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamen- te com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. A composição farmacêutica também pode ser entregue em uma vesícula, em particular um liposoma (veja, por exemplo, Langer (1990), Science 249:1527-1533).

[00212] O uso de nanopartículas para entregar as proteínas de liga- ção ao antígeno, por exemplo, anticorpos, ou seus fragmentos de liga- ção ao antígeno, da presente invenção também é contemplado neste documento. Nanopartículas conjugadas a proteínas de ligação ao an- tígeno podem ser usadas tanto para aplicações de diagnóstico quanto terapêuticas. Nanopartículas conjugadas a proteínas de ligação ao an- tígeno e os métodos de preparação e uso são descritos em detalhes por Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications", em J. Nanomat. Volume 2009, ID de Artigo 439389, 24 páginas, doi: 10.1155/2009/439389), aqui incorporados por referência. As nanopartículas podem ser desenvolvidas e conjugadas a proteínas de ligação ao antígeno contidas em composições farma- cêuticas para atacar células tumorais ou células do tecido autoimune ou células viralmente infectadas. As nanopartículas para a entrega de fármacos também foram descritas, por exemplo, na Patente US nº 8,257,740 ou Patente US nº 8,246,995, cada uma aqui incorporada em sua totalidade.

[00213] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser entregue em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser usada uma bomba. Em outra modalidade, po-

dem ser usados materiais poliméricos. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade ao alvo da composição, exigindo, portanto, apenas uma fração da dose sistêmica.

[00214] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosa- gem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas, intracra- nianas, intraperitoneais e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis po- dem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação da proteína de ligação ao antígeno ou seu sal descrito acima, em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencional- mente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, exis- tem, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante adequado como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, poli- etilenoglicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícimo hidrogena- do)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, como benzoato de benzila, álcool benzí- lico, etc. A injeção assim preparada é preferencialmente colocada em uma ampola apropriada.

[00215] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser entregue por via subcutânea ou intravenosa com uma agulha e se- ringa padronizadas. Além disso, no que diz respeito à entrega subcu- tânea, um dispositivo de entrega em caneta tem facilmente aplicações na entrega de uma composição farmacêutica da presente invenção. Esse dispositivo de entrega em caneta pode ser reutilizável ou descar-

tável. Um dispositivo de entrega em caneta reutilizável geralmente usa um cartucho substituível, que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser facil- mente descartado e substituído por um novo cartucho que contenha a composição farmacêutica. O dispositivo de entrega em caneta pode, então, ser reutilizado. Em um dispositivo de entrega em caneta descar- tável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de en- trega em caneta descartável vem cheio com a composição farmacêuti- ca mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.

[00216] Vários dispositivos de entrega autoinjetores e em caneta reutilizáveis têm aplicações na entrega subcutânea de uma composi- ção farmacêutica da presente invenção. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzer- land), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Fran- klin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STAR- LET™, e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar alguns apenas. Exemplos de dispositivos de entrega em caneta des- cartáveis com aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não se limitam às canetas SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e KWIKPEN™ (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICK™ (Amgen, Thou- sand Oaks, CA), as canetas PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alema- nha), EPIPEN (Dey, L.P.) e HUMIRA™ (Abbott Laboratórios, Abbott

Park, IL), para citar alguns apenas.

[00217] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso parenteral ou oral acima descritas são preparadas em formas de do- sagem em uma dose unitária adequada para ajuste a uma dose dos ingredientes ativos. Essas formas de dosagem em dose unitária inclu- em, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade da proteína de ligação ao antígeno contida é geralmente de cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; em especial sob a forma de injeção, é preferível que a proteína de ligação ao antígeno seja contida em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. USOS TERAPÊUTICOS DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍ-

GENO

[00218] Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para o tra- tamento, a prevenção e/ou a atenuação de qualquer doença ou distúr- bio associado a ou mediado por HPV16. Por exemplo, a presente in- venção fornece métodos para o tratamento de uma doença ou distúr- bio associado ao HPV, como um câncer associado ao HPV (por exemplo, um câncer positivo para HPV16E7) (inibição do crescimento tumoral) e/ou infecções por HPV através da administração de uma pro- teína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 (ou composição farmacêutica compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7) como descrita no presente documento a um paciente em necessidade de um tratamento desse tipo, e as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 (ou composição farma- cêutica compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7) para uso no tratamento de um câncer associado ao HPV (inibição do crescimento tumoral) e/ou infecções por HPV. Os proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para o tratamento, prevenção e/ou atenuação da doença ou distúrbio ou condição, como um câncer associado ao HPV, ou uma infecção por HPV, e/ou para atenuação de pelo menos um sintoma associado a es- sa doença, distúrbio ou condição. No contexto dos métodos de trata- mento aqui descritos, a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 pode ser administrada como uma monoterapia (isto é, como o único agente terapêutico) ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (cujos exemplos são descritos neste documento).

[00219] Em algumas modalidades da invenção, os anticorpos aqui descritos são úteis para o tratamento de sujeitos que sofrem de câncer primário ou recorrente, incluindo, mas não limitado a, câncer associa- do ao HPV, por exemplo, carcinomas de células escamosas, como o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer do colo do útero, câncer anogenital, câncer de orofaringe.

[00220] As proteínas de ligação ao antígeno podem ser usadas pa- ra os sintomas da fase precoce ou fase tardia do câncer associado ao HPV. Em uma modalidade, um anticorpo ou seu fragmento da inven- ção pode ser usado para tratar o câncer avançado ou metastático. As proteínas de ligação ao antígeno são úteis na redução ou inibição ou diminuição do crescimento do tumor. Em algumas modalidades, o tra- tamento com uma proteína de ligação ao antígeno da invenção leva a mais de 40% de regressão, mais de 50% de regressão, mais de 60% de regressão, mais de 70% de regressão, mais de 80% de regressão ou mais de 90% de regressão de um tumor em um indivíduo. Em al- gumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno podem ser usadas para prevenir a recidiva de um tumor. Em algumas modalida- des, as proteínas de ligação ao antígeno são úteis para prolongar a sobrevivência livre de progressão ou sobrevida global em um indivíduo com câncer associado ao HPV. Em algumas modalidades, os anticor-

pos são úteis na redução da toxicidade devido à quimioterapia ou radi- oterapia, ao mesmo tempo mantendo a sobrevida em longo prazo em um paciente que sofre de câncer associado ao HPV.

[00221] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno da invenção são úteis para o tratamento de indivíduos que so- frem de uma doença crônica por HPV. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno da invenção são úteis na redução dos títulos virais no hospedeiro.

[00222] Um ou mais anticorpos da presente invenção podem ser administrados para aliviar ou prevenir ou diminuir a gravidade de um ou mais dos sintomas ou condições da doença ou distúrbio.

[00223] É também contemplado neste documento o uso de um ou mais anticorpos da presente invenção profilaticamente, em pacientes em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio como doença ou distúrbio associado ao HPV, como câncer associado ao HPV e infec- ção por HPV.

[00224] Em outra modalidade da invenção, os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de pacientes que sofrem de doença ou distúrbio associa- do ao HPV, como um câncer associado ao HPV ou infecção por HPV. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos apresentados são usados como terapia adjunta com qualquer outro agente ou qualquer outra terapia conhecida para aqueles versados na técnica, útil para o tratamento de câncer associado ao HPV ou infecção por HPV.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO E FORMULAÇÕES

[00225] As terapias de combinação podem incluir uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção, como um CAR da invenção (por exemplo, uma célula efetora imune compreen- dendo um CAR da invenção) ou uma composição farmacêutica da in- venção, e qualquer agente terapêutico adicional que possa ser vanta-

josamente combinado com uma proteína de ligação ao antígeno da invenção. As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser combinadas de forma sinérgica com um ou mais fármacos anticâncer ou terapia usada para tratar ou inibir uma doença ou distúr- bio associado ao HPV16E7, como câncer positivo para HPV, por exemplo, o carcinoma de células escamosas, câncer do colo do útero, câncer anogenital, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de orofarin- ge.

[00226] É contemplado neste documento o uso das proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção em combina- ção com terapias imunoestimulatórias e/ou imunossuportadas para inibir o crescimento tumoral e/ou aumentar a sobrevida de pacientes com câncer. As terapias imunoestimulatórias incluem terapias imu- noestimulatórias diretas para aumentar a atividade das células imunes ou "freiando" as células imunes suprimidas ou "acelerando" a ativação de uma resposta imune. Os exemplos incluem visar outros receptores checkpoint, vacinação e adjuvantes. As modalidades imunossuporta- das podem aumentar a antigenicidade do tumor imunogênico com a promoção da morte celular, inflamação, ou ter outros efeitos indiretos que promovam uma resposta imune antitumoral. Os exemplos incluem radiação, quimioterapia, agentes antiangiogênicos e cirurgia.

[00227] Em várias modalidades, uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser usadas em combinação com um inibidor de PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 como nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, BGB-A317 ou REGN2810), um inibidor de PD-L1 (por exemplo, um anticorpo anti- PD-L1 como avelumabe, atezolizumabe, durvalumabe, MDX-1105 ou REGN3504), um inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibi- dor de CD47, um inibidor de GITR, um antagonista de outro coinibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo para CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor da indoleamina- 2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endote- lial vascular (VEGF) [por exemplo, um "VEGF-Trap", como aflibercept ou outra proteína de fusão inibidora do VEGF, conforme estabelecido no Documento US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno (por exemplo, bevacizumabe ou ranibi- zumabe) ou um inibidor de quinase de pequenas moléculas do recep- tor do VEGF (por exemplo, sunitinibe, sorafenibe ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumabe), um inibidor do fator de crescimento transformador beta (TGFβ), um inibidor do fator de cres- cimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como rituxi- mabe), um anticorpo para um antígeno específico do tumor [por exem- plo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antí- geno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1, MART-1 e CA19-9], uma vaci- na (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina contra o cân- cer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, o fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, o anticorpo biespecífico CD3xCD20 ou o anticorpo biespecífico PSMAxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomi- de, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, pa- clitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, cirurgia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumabe), um inibidor de IL-4R (por exem- plo, dupilumabe), um inibidor da IL-10, uma citocina, como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15, um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) (por exemplo, ADC anti-CD19-DM4 e ADC anti-DS6-DM4), um fármaco anti-

inflamatório (por exemplo, corticosteroides e fármacos anti- inflamatórios não esteroidais), um suplemento dietético, como antioxi- dantes, ou qualquer outro cuidado terapêutico para o tratamento do câncer.

Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção pode ser usada em com- binação com uma vacina para HPV.

Vacinas contra HPV exemplificati- vas incluem Gardasil, Gardasil 9, e Cervarix, Lm-LLo-E7 (ADXS11- 001; ADXS-HPV; Advaxis, Inc.); GLBL101c (GENOLAC BL Corp); TA- HPV (Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento de Câncer (EORTC)); TG4001 (Transgene/Roche); MVA E2 (Instituto Mexicano del Seguro Social); HPV16-SLP (ISA Pharmaceuticals); GL-0810 (Gliknik Inc.); Pepcan + Candin (Universidade do Arkansas); GTL001 (ProCervix; Genticel); TA-CIN (Xenova Research Limited); TA- CIN + TA-HPV (Celtic Pharma); pNGVL4a-sig/E7(detox)/HSP70 + TA- HPV (Centro de Câncer Compreensivo Sidney Kimmel); pNGVL4a- CRT/E7(detox) (Centro de Câncer Compreensivo Sidney Kimmel); GX- 188E (Genexine, Inc); VGX-3100 (Inovio Pharmaceuticals); Células Dendríticas pulsadas com HPV-16 e HPV-18 E7 e hemocianina de la- pa tipo buraco de fechadura (Institutos Nacionais de Saúde); DC pul- sada com lisado tumoral HPV+ (Departmento de Biotecnologia (DBT, Governo da Índia)); PDS0101 (PDS Biotechnology Corp); ProCervix (Genticel); GX-188E (Genexine, Inc); pNGVL4a-CRT/E7(detox) (Cen- tro de Câncer Compreensivo Sidney Kimmel); pNGVL4a- sig/E7(detox)/HSP70 + TA-HPV (Centro de Câncer Compreensivo Sid- ney Kimmel); TVGV-1 + GPI-0100 (THEVAX Genetics Vaccine Co.); Pepcan + Candin (Universidade do Arkansas); ISA101 (SLP-HPV-01; HPV16-SLP; ISA Pharmaceuticals); ADXS11-001 (Lm-LLo-E7; Adva- xis, Inc.); ISA101 (SLP-HPV-01; HPV16-SLP; ISA Pharmaceuticals); DPX-E7 (Instituto do Câncer Dana-Farber); ADXS11-001 (Lm-LLo-E7; Advaxis, Inc.); INO-3112 (VGX-3100 + INO-9012; Inovio Pharmaceuti-

cals); ADXS11-001 (Lm-LLo-E7; Advaxis, Inc.); INO-3112 (VGX- 3100 + INO-9012; Inovio Pharmaceuticals); ISA101 (SLP-HPV-01; HPV16-SLP; ISA Pharmaceuticals) e TA-CIN + GPI-0100 (Centro de Câncer Compreensivo Sidney Kimmel). Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção pode ser usada em combinação com vacinas contra o cân- cer, incluindo vacinas de células dendríticas, vírus oncolíticas, vacinas com células tumorais, etc. para aumentar a resposta antitumoral. Exemplos de vacinas contra o câncer que podem ser usadas em com- binação com as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 da presente invenção incluem a vacina MAGE3 para me- lanoma e câncer de bexiga, a vacina MUC1 para o câncer da mama, EGFRv3 (por exemplo, Rindopepimute) para câncer cerebral (incluindo glioblastoma multiforme), ou ALVAC-CEA (para cânceres CEA+).

[00228] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção podem ser administradas em combinação com a terapia de radiação, em métodos para gerar res- postas antitumorais duradouras de longo prazo e/ou melhorar a sobre- vida de pacientes com câncer. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção podem ser administradas antes, concomitantemente ou após a administração da terapia de radiação a um paciente com câncer. Por exemplo, a terapia de radiação pode ser administrada em uma ou mais doses a lesões tumorais, seguida pela administração de uma ou mais doses de prote- ínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção. Em algumas modalidades, a terapia de radiação pode ser administrada localmente a uma lesão tumoral para melhorar a imunogenicidade lo- cal de um tumor do paciente (radiação adjuvante) e/ou para matar cé- lulas tumorais (radiação ablativa), seguida por administração sistêmica de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da in-

venção. Por exemplo, a radiação intracraniana pode ser administrada a um paciente com câncer cerebral (por exemplo, glioblastoma multi- forme) em combinação com a administração sistêmica de uma proteí- na de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção. Em al- gumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 da invenção podem ser administradas em combinação com a terapia de radiação e um agente quimioterapêutico (por exem- plo, temozolomide) ou um antagonista do VEGF (por exemplo, afliber- cept).

[00229] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais fármacos antivirais para tratar a infecção crônica por HPV. Exemplos de fármacos antivirais incluem, mas não se limitam a, zidovudina, lamivudina, abacavir, ribavirina, lopinavir, efavirenz, cobicistat, tenofovir, rilpivirina e corticosteroides.

[00230] O(s) agente(s)/componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) pode ser administrado antes, concomitante a ou após a administração das proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 da presente invenção. Para efeitos da presente inven- ção, esses regimes de administração são considerados a administra- ção de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 "em combinação com" um segundo componente terapeuticamente ati- vo.

[00231] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) pode ser administrado a um indivíduo antes da administração de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção. Por exemplo, um primeiro componente pode ser considera- do para administração "anterior" a um segundo componente se o pri- meiro componente for administrado 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas an- tes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes, 10 minutos antes, 5 minutos antes ou menos de 1 minuto antes da administração do segundo componente.

Em outras modalidades, o(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) pode ser admi- nistrado a um indivíduo após a administração de uma proteína de liga- ção ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção.

Por exemplo, um primeiro componente pode ser considerado para admi- nistração "depois" de um segundo componente se o primeiro compo- nente for administrado 1 minuto depois, 5 minutos depois, 10 minutos depois, 15 minutos depois, 30 minutos depois, 1 hora depois, 2 horas depois, 3 horas depois, 4 horas depois, 5 horas depois, 6 horas de- pois, 12 horas depois, 24 horas depois, 36 horas depois, 48 horas de- pois, 60 horas depois, 72 horas depois da administração do segundo componente.

Em ainda outras modalidades, o(s) componente(s) tera- peuticamente ativo(s) adicional(ais) pode ser administrado a um indiví- duo simultaneamente à administração de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção.

A "administra- ção" simultânea, para fins da presente invenção, inclui, por exemplo, a administração de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 e um componente ativo terapeuticamente adicional a um indivíduo em uma única forma de dosagem (por exemplo, coformula- dos), ou em formas de dosagem separadas administradas ao indivíduo dentro de cerca de 30 minutos ou menos uma da outra.

Se administra- dos em formas de dosagem diferentes, cada forma de dosagem pode ser administrada pela mesma via (por exemplo, tanto a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 quanto o componente te- rapeuticamente ativo adicional podem ser administrados por via intra- venosa, subcutânea, etc.); alternativamente, cada forma de dosagem pode ser administrada por uma via diferente (por exemplo, a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 pode ser administrada por via intravenosa, e o componente terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado por via subcutânea). Em todo caso, as adminis- trações dos componentes em uma forma de dosagem única, em for- mas de dosagem separadas pela mesma via, ou em formas de dosa- gem separadas por vias diferentes são todas consideradas "adminis- tração simultânea", para efeitos da presente invenção. Para efeitos da presente invenção, a administração de uma proteína de ligação ao an- tígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 "antes", "simultaneamente a" ou "de- pois" (como os termos são aqui definidos acima) da administração de um componente terapeuticamente ativo adicional é considerada a ad- ministração de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional).

[00232] A presente invenção inclui composições farmacêuticas, em que uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção é coformulada com um ou mais dos componentes terapeuticamente ativos como já descrito neste documento, usando uma variedade de combinações de dosagem.

ESQUEMAS DE ADMINISTRAÇÃO

[00233] De acordo com algumas modalidades da presente inven- ção, doses múltiplas de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 (ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adi- cionais aqui mencionados) podem ser administradas a um indivíduo ao longo de um período de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem a administração sequencial a um indivíduo de várias doses de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção. Como usado neste documento,

"administração sequencial" significa que cada dose da proteína de li- gação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 é administrada ao indivíduo em um ponto diferente no tempo, por exemplo, em dias diferentes, se- parados por um intervalo de tempo predeterminado (por exemplo, ho- ras, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma úni- ca dose inicial de uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7, seguida de uma ou mais doses secundárias da proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 e, opcionalmente, se- guidas de uma ou mais doses terciárias da proteína de ligação ao an- tígeno anti-HLA-A2:HPV16E7. A proteína de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7 pode ser administrada a uma dose entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

[00234] Os termos "dose inicial", "doses secundárias" e "doses ter- ciárias" se referem à sequência temporal de administração da proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção. Assim, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do esquema tera- pêutico (também referida como a "dose basal"); as "doses secundá- rias" são as doses que são administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses que são administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem, todas, conter a mesma quantidade da proteína de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7, mas geralmente podem diferir uma da outra em termos de frequência de administração. Em algumas modalidades, no entanto, a quantidade da proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária varia uma da outra (por exemplo, ajustada para cima ou para baixo, confor- me o caso) durante o curso do tratamento. Em algumas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do esquema de tratamento como doses "de carga", seguidas por doses subsequentes que são administradas com menor frequência (por exemplo, "doses de manutenção").

[00235] Em algumas modalidades, a quantidade da proteína de li- gação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária podem ser subideais ou subterapêuticas. Como usado neste documento, os termos "subterapêutico" e "subide- al" se referem a uma dose de anticorpo administrada a um nível muito baixo para produzir um efeito terapêutico, ou abaixo do nível necessá- rio para tratar uma doença como o câncer.

[00236] Em algumas modalidades exemplificativas da presente in- venção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ ou mais) semanas após a dose imediatamente ante- rior. A expressão "a dose imediatamente anterior", conforme usado neste documento, significa, em uma sequência de várias administra- ções, a dose da proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7 que é administrada a um paciente antes da administra- ção da próxima dose na sequência, sem doses intermediárias.

[00237] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção po- dem incluir administrar a um paciente qualquer número de doses se- cundárias e/ou terciárias de uma proteína de ligação ao antígeno anti- HLA-A2:HPV16E7. Por exemplo, em algumas modalidades, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Da mesma forma, em algumas modalidades, apenas uma única dose terciária é adminis- trada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.

[00238] Em modalidades envolvendo várias doses secundárias, ca- da dose secundária pode ser administrada com a mesma frequência das outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas ou 1 a 2 meses após a dose imediatamente anterior. Da mesma forma, em modalida- des envolvendo várias doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada com a mesma frequência das outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 12 semanas após a dose imediatamente anterior. Em algumas modalida- des da invenção, a frequência na qual as doses secundárias e/ou ter- ciárias são administradas a um paciente pode variar ao longo do es- quema de tratamento. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso do tratamento por um médico, de acordo com as necessidades de cada paciente após exame clínico. USOS DIAGNÓSTICOS DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍ-

GENO

[00239] As proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da presente invenção podem ser usadas para detectar e/ou medir o HPV16E7 em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Al- gumas modalidades contemplam o uso de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção em ensaios para detectar uma doença ou distúrbio, como doença ou distúrbio associado ao HPV, como câncer positivo para HPV16E7, ou infecção por HPV. En- saios diagnósticos exemplificativos para HPV16E7 podem incluir, por exemplo, colocar uma amostra, obtida de um indivíduo (por exemplo, um paciente), em contato com uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção, em que a proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 é marcada com um marcador detec- tável ou molécula reporter ou usada como um ligante de captura para isolar seletivamente o HPV16E7 das amostras do indivíduo. Alternati- vamente, uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 não marcada pode ser usada em aplicações de diagnóstico em combi- nação com uma proteína de ligação antígeno secundária, por exemplo, que, por sua vez, é marcada de forma detectável. A etiqueta detectá- vel ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, como 3H, 14 C, 32 P, 35 125 S ou I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente como o isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima como a fos- fatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou lu- ciferase. Ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir a HPV16E7 em uma amostra incluem o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e a classificação de células ativada por fluorescência (FACS).

[00240] Amostras que podem ser usadas em ensaios diagnósticos da HPV16E7 de acordo com a presente invenção incluem qualquer tecido ou amostra de fluido que pode ser obtida de um indivíduo, que contém quantidades detectáveis da proteína HPV16E7 ou seus frag- mentos, em condições normais ou patológicas. Geralmente, os níveis da HPV16E7 em uma determinada amostra obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente que não sofre de uma doença ou distúrbio associado à HPV16E7, por exemplo, câncer positivo para HPV16E7) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível ba- sal, ou padrão, da HPV16E7. Esse nível basal da HPV16E7 pode, en- tão, ser comparado com os níveis da HPV16E7 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de terem uma condição relacionada ao câncer, ou sintomas associados a essa condição.

[00241] As proteínas de ligação ao antígeno específicas para HPV16E7 podem não conter etiquetas ou radicais adicionais, ou elas podem conter uma etiqueta ou porção N-terminal ou C-terminal. Em uma modalidade, a etiqueta ou porção é a biotina. Em um ensaio de ligação, a localização de uma etiqueta (se aplicável) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à superfície à qual o peptídeo está ligado. Por exemplo, se uma superfície é revestida com avidina, um peptídeo contendo uma biotina N-terminal será orientado de modo que a parte C-terminal do peptídeo será distal à superfície.

[00242] Aspectos da invenção se referem ao uso das proteínas de ligação ao antígeno descritas como marcadores para antecipar o prognóstico de câncer positivo para HPV16E7 ou infecção por HPV em pacientes. As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser usadas em ensaios diagnósticos para avaliar o prognóstico de câncer em um paciente e para prever a sobrevida.

EXEMPLOS

[00243] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a forne- cer aos especialistas no assunto uma descrição completa de como produzir e usar os métodos e as composições da invenção, e não têm a intenção de limitar o âmbito de aplicação daquilo que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus Celsius, a temperatura ambiente é de cerca de 25 ºC, e a pressão é igual ou próxima da pressão atmosférica. EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS PARA HLA- A2:HPV16E7

[00244] Anticorpos humanos para HLA-A2:HPV16E7 foram gerados usando os fragmentos peptídicos da HPV16E7, que incluem os ami- noácidos 11-19 (YMLDLQPET; SEQ ID nº: 538) do Acesso ao Gen- Bank NP_041326.1 (SEQ ID nº: 537) ou os resíduos de aminoácidos 82-90 (LLMGTLGIV; SEQ ID nº: 539) do Acesso ao GenBank

NP_041326.1 (SEQ ID nº: 537), ligados ao HLA-A2. O imunogênio foi administrado diretamente, com um adjuvante para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE® (ou seja, um camundongo engenheirado compreendendo o DNA que codifica regiões variáveis das cadeias leve kappa e pesada da imunoglobulina humana), por exemplo, conforme descrito na Patente US nº 8,502,018. A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico para HLA-A2:HPV16E7. Quando uma resposta imune desejada foi alcança- da, os esplenócitos foram colhidos e fundidos com células do mieloma de camundongo para preservar a sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridomas. As linhagens celulares hibridomas foram tria- das e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos para HLA-A2:HPV16E7. Usando essa técnica, e o imunogênio descrito acima, foram obtidos vários anticorpos quiméri- cos anti-HPV16E7(ou seja, anticorpos que possuem domínios variá- veis humanos possuindo e domínios constantes de camundongo). Os anticorpos exemplificativos gerados dessa forma foram designados como a seguir: H4sH17364N; H4sH17368N2; H4sH17930N; H4sH17930N2; H4sH17363N e H4sH17368N3.

[00245] Os anticorpos anti-HLA-A2:HPV16E7 também foram isola- dos diretamente de células B positivas para o antígeno (ou dos ca- mundongos imunizados) sem fusão a células do mieloma, conforme descrito na Patente US 7,582,298, aqui incorporada especificamente em sua totalidade. Usando esse método, foram obtidos vários anticor- pos anti-HLA-A2:HPV16E7 totalmente humanos (ou seja, anticorpos que possuem domínios variáveis e domínios constante humanos).

[00246] Anticorpos exemplificativos gerados de acordo com os mé- todos anteriores foram designados como a seguir: H4sH17670P; H4sH17672P; H4sH17673P; H4sH17675P; H4sH17680P; H4sH17697P; H4sH17707P; H4sH17715P; H4sH17726P;

H4sH17730P; H4sH21051P; H4sH21054P; H4sH21055P; H4sH21058P; H4sH21064P; H4sH21073P; H4sH21077P; H4sH21079P; H4sH21080P; H4sH21083P; H4sH21086P; H4sH21090P; H4sH21091P; H4sH21093P; H4sH21099P; H4sH21100P; H4sH21103P e H4sH21104P.

[00247] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplificativos gerados em conformidade com os métodos deste Exemplo são descri- tas em detalhes nos Exemplos apresentados abaixo.

[00248] EXEMPLO 2: SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E AMI-

NOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DAS CADEIAS LEVE E PESADA

[00249] A Tabela 1 apresenta os identificadores das sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve e CDRs de anticorpos anti-HLA-A2:HPV16E7 selecionados da invenção. Os identificadores das sequências de ácidos nucleicos correspondentes são apresentados na Tabela 2. TABELA 1: IDENTIFICADORES DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCI-

DOS SEQ ID nos: Designação do HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo H4sH17364N 2 4 6 8 10 12 14 16 H4sH17368N2 18 20 22 24 26 28 30 32 H4sH17670P 34 36 38 40 42 44 46 48 H4sH17672P 50 52 54 56 58 60 62 64 H4sH17673P 66 68 70 72 74 76 78 80 H4sH17675P 82 84 86 88 90 92 94 96 H4sH17680P 98 100 102 104 106 108 110 112 H4sH17697P 114 116 118 120 122 124 126 128 H4sH17707P 130 132 134 136 138 140 142 144 H4sH17715P 146 148 150 152 154 156 158 160 H4sH17726P 162 164 166 168 170 172 174 176 H4sH17730P 178 180 182 184 186 188 190 192 H4sH17930N 210 212 214 216 202 204 206 208 H4sH17930N2 194 196 198 200 202 204 206 208 H4sH21051P 218 220 222 224 226 228 230 232 H4sH21054P 234 236 238 240 242 244 246 248 H4sH21055P 250 252 254 256 258 260 262 264 H4sH21058P 266 268 270 272 274 276 278 280 H4sH21064P 282 284 286 288 290 292 294 296 H4sH21073P 298 300 302 304 306 308 310 312 H4sH21077P 314 316 318 320 322 324 326 328 H4sH21079P 330 332 334 336 338 340 342 344 H4sH21080P 346 348 350 352 354 356 358 360 H4sH21083P 362 364 366 368 370 372 374 376 H4sH21086P 378 380 382 384 386 388 390 392 H4sH21090P 394 396 398 400 402 404 406 408 H4sH21091P 410 412 414 416 418 420 422 424 H4sH21093P 426 428 430 432 434 436 438 440

H4sH21099P 442 444 446 448 450 452 454 456 H4sH21100P 458 460 462 464 466 468 470 472 H4sH21103P 474 476 478 480 482 484 486 488 H4sH21104P 490 492 494 496 498 500 502 504 H4sH17363N 506 508 510 512 514 516 518 520 H4sH17368N3 522 524 526 528 530 532 534 536 TABELA 2: IDENTIFICADORES DAS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS

NUCLEICOS SEQ ID nos: Designação do HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo H4sH17364N 1 3 5 7 9 11 13 15 H4sH17368N2 17 19 21 23 25 27 29 31 H4sH17670P 33 35 37 39 41 43 45 47 H4sH17672P 49 51 53 55 57 59 61 63 H4sH17673P 65 67 69 71 73 75 77 79 H4sH17675P 81 83 85 87 89 91 93 95 H4sH17680P 97 99 101 103 105 107 109 111 H4sH17697P 113 115 117 119 121 123 125 127 H4sH17707P 129 131 133 135 137 139 141 143 H4sH17715P 145 147 149 151 153 155 157 159 H4sH17726P 161 163 165 167 169 171 173 175 H4sH17730P 177 179 181 183 185 187 189 191 H4sH17930N 209 211 213 215 201 203 205 207 H4sH17930N2 193 195 197 199 201 203 205 207 H4sH21051P 217 219 221 223 225 227 229 231 H4sH21054P 233 235 237 239 241 243 245 247 H4sH21055P 249 251 253 255 257 259 261 263 H4sH21058P 265 267 269 271 273 275 277 279 H4sH21064P 281 283 285 287 289 291 293 295 H4sH21073P 297 299 301 303 305 307 309 311 H4sH21077P 313 315 317 319 321 323 325 327 H4sH21079P 329 331 333 335 337 339 341 343 H4sH21080P 345 347 349 351 353 355 357 359 H4sH21083P 361 363 365 367 369 371 373 375 H4sH21086P 377 379 381 383 385 387 389 391 H4sH21090P 393 395 397 399 401 403 405 407 H4sH21091P 409 411 413 415 417 419 421 423 H4sH21093P 425 427 429 431 433 435 437 439 H4sH21099P 441 443 445 447 449 451 453 455 H4sH21100P 457 459 461 463 465 467 469 471 H4sH21103P 473 475 477 479 481 483 485 487 H4sH21104P 489 491 493 495 497 499 501 503 H4sH17363N 505 507 509 511 513 515 517 519 H4sH17368N3 521 523 525 527 529 531 533 535

[00250] Os anticorpos são normalmente referidos neste documento de acordo com a seguinte nomenclatura: O prefixo Fc (por exemplo, "H1M", "H4sH", "H4H", etc.), seguido por um identificador numérico (por exemplo, "17670", "17930", etc., conforme mostrado na Tabela 1), seguido de um sufixo "P", "N" ou "N2". Assim, segundo essa nomen- clatura, um anticorpo pode ser aqui referido como, por exemplo, "H4sH17670P", "H4sH17930N", "H4sH17368N2", etc. Os prefixos H4sH e H4H nas denominações dos anticorpos usados aqui indicam o isotipo da região Fc particular do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo "H4sH" tem um fc IgG4 humano com 2 ou mais alterações de aminoá- cidos, como descrito na Publicação de Patente US nº 20140243504 (aqui incluída em sua totalidade), um anticorpo "H4H" tem um Fc IgG4 humano com uma mutação de serina para prolina na região de char- neira (S108P), um anticorpo "H1M" tem um Fc IgG1 de camundongo, e um anticorpo "H2M" tem um Fc IgG2 de camundongo (todas as regi- ões variáveis são totalmente humanas, como indicado pelo primeiro "H" na designação dos anticorpos). Como será apreciado por uma pessoa com conhecimento na arte, um anticorpo tendo um determina- do isotipo Fc pode ser convertido em um anticorpo com um isotipo Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um Fc IgG1 de camundongo pode ser convertido em um anticorpo com um IgG4 humano, etc.), mas, em todo caso, os domínios variáveis (incluindo as CDRs), que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1, permanecerão os mesmos, e se espera que as propriedades de liga- ção ao antígeno sejam idênticas ou substancialmente semelhantes, independentemente da natureza do domínio Fc.

[00251] Em algumas modalidades, anticorpos selecionados com um Fc IgG1 de camundongo foram convertidos em anticorpos com Fc IgG4 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um Fc IgG4 humano com 2 ou mais alterações de aminoácidos, como descrito na Publicação de Pedido de Patente US nº 20100331527 (aqui incluído em sua totalidade). Em uma modalidade, o domínio Fc IgG4 compreende uma mutação de serina para prolina na região de charneira (S108P) para promover a estabilização do dímero.

[00252] A Tabela 3 apresenta os identificadores das sequências de aminoácidos das sequências da cadeia pesada e cadeia leve de anti- corpos selecionados da invenção.

TABELA 3: IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIAS DA CADEIA LEVE

E CADEIA PESADA SEQ ID nos: Designação do Anticorpo Cadeia Pesada Cadeia Leve H4sH17363N 578 579 H4sH17364N 580 581 H4sH17670P 582 583 H4sH17675P 584 585 H4sH17930N2 586 587 H4sH21058P 588 589 H4sH21064P 590 591 H4sH21104P 592 593 EXEMPLO 3: ANÁLISE DO USO DE GENES VARIÁVEIS

[00253] Para analisar a estrutura dos anticorpos produzidos, os áci- dos nucleicos que codificam as regiões variáveis do anticorpo foram clonados e sequenciados. A partir da sequência de ácidos nucleicos e da sequência de aminoácidos prevista dos anticorpos, foi identificado o uso de genes para cada região variável da cadeia pesada (HCVR) e região variável da cadeia leve (LCVR) (Tabela 4). TABELA 4. HCVR (HPV) LCVR (HPV) Designação do

VH DH JH VH JH Anticorpo H4sH17363N V3-23 D6-6 J6 V1-39 J5 H4sH17364N V3-23 D6-6 J6 V1-39 J5 H4sH17368N2 V3-23 D3-9 J4 V1-39 J5 H4sH17368N3 V3-23 D3-9 J4 V1-39 J5 H4sH17670P V3-64 D1-26 J6 V1-39 J5 H4sH17672P V3-64 D1-26 J6 V1-39 J5 H4sH17673P V3-23 D4-11 J6 V1-39 J5 H4sH17675P V3-64 D1-26 J6 V1-39 J5 H4sH17680P V3-23 D4-23 J6 V1-39 J5 H4sH17697P V3-11 D6-13 J4 V1-39 J2 H4sH17707P V3-23 D1-20 J4 V1-39 J5 H4sH17715P V6-1 D1-7 J3 V1-39 J2 H4sH17726P V1-18 D1-7 J4 V3-15 J4 H4sH17730P V3-11 D1-7 J4 V1-17 J2 H4sH17930N V3-64 D2-2 J6 V1-39 J5 H4sH17930N2 V3-64 D2-2 J6 V1-39 J5 H4sH21051P V3-23 D7-27 J4 V1-39 J5 H4sH21054P V3-23 D1-7 J4 V1-39 J5 H4sH21055P V3-11 D7-27 J2 V1-39 J2 H4sH21058P V3-20 D2-2 J5 V1-39 J2 H4sH21064P V3-64 D6-6 J6 V1-39 J5 H4sH21073P V3-43 D6-19 J3 V1-39 J2 H4sH21077P V3-23 D6-19 J3 V1-39 J2 H4sH21079P V3-15 D1-7 J4 V1-39 J2 H4sH21080P V3-23 D1-7 J6 V2-28 J1 H4sH21083P V3-23 D1-7 J2 V3-15 J5 H4sH21086P V3-33 D2-21 J6 V4-1 J5

H4sH21090P V3-23 D1-20 J4 V3-15 J4 H4sH21091P V3-15 D6-19 J6 V1-17 J4 H4sH21093P V3-33 D3-3 J3 V1-6 J2 H4sH21099P V3-9 D1-1 J6 V1-39 J5 H4sH21100P V3-9 D1-7 J3 V1-39 J5 H4sH21103P V3-15 D1-7 J4 V1-39 J5 H4sH21104P V3-11 D3-10 J3 V1-39 J5 EXEMPLO 4: AFINIDADES DE LIGAÇÃO E CONSTANTES CINÉTI- CAS DERIVADAS POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPER- FÍCIE DE ANTICORPOS MONOESPECÍFICOS ANTI-HLA-A2:HPV16E7

MONOCLONAIS HUMANOS

[00254] As afinidades de ligação e constantes cinéticas de anticor- pos anti-HLA-A2/HPV16E7 humanos foram determinadas por resso- nância plasmônica de superfície em tempo real (SPR; Biacore 4000 ou Biacore T-200, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) a 25 ºC. Os anticorpos foram capturados em uma superfície do sensor CM5 Biacore (GE Healthcare Life Sciences) derivatizada via acoplamento de amina com um anticorpo Fc anti-humano monoclonal (GE, # BR- 1008-39). Diferentes concentrações do HLA-A2 monomérico: O com- plexo peptídico HPV16E7 contendo o peptídeo E7:11-19 (SEQ ID nº: 538) ou o peptídeo E7:82-90 (SEQ ID nº: 539) foi injetado sobre a su- perfície capturada do anticorpo anti-HLA-A2:HPV16E7 a uma taxa de fluxo de 50L/minuto (Biacore T-200) ou 30L/minuto (Biacore 4000). A associação anticorpo-reagente foi monitorada por 4 a 5 minutos e a dissociação foi monitorada por 10 min. Todos os estudos de ligação foram realizados em tampão HBS-ET (HEPES a 0,01M pH 7,4; NaCl a 0,15 M, 0,05% v/v de Tensoativo P20).

[00255] As constantes da taxa de associação (ka) e dissociação (kd) cinéticas foram determinadas por ajuste dos sensorgramas em tempo real a um modelo de ligação 1:1 usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (kD) e meias-vidas dissociativas (t1/2) foram calculadas a partir das constantes de taxa de cinética, como:

KD (M) = e t½ (min) = .

[00256] Os parâmetros cinéticos de ligação para os anticorpos anti- HLA-A2:HPV16E7 monoespecíficos para o complexo peptídeo HLA- A2/HPV16E7 monomérico são mostrados abaixo nas Tabelas 5 e 6. TABELA 5: AFINIDADES DE LIGAÇÃO BIACORE DOS ANTICOR- POS ANTI-HLA-A2/HPV16E7 A 25 ºC HLA-A2:HPV16E7(11-19) Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t1/2 (min) H4sH17670P 8,16E+04 1,43E-03 1,75E-08 8,1 H4sH17672P 1,29E+05 8,19E-04 6,37E-09 14,1 H4sH17673P NB NB NB NB H4sH17675P 5,99E+04 1,38E-03 2,31E-08 8,4 H4sH17680P NB NB NB NB H4sH17697P NB NB NB NB H4sH17707P NB NB NB NB H4sH17715P NB NB NB NB H4sH17726P NB NB NB NB H4sH17730P NB NB NB NB H4sH17363N 8,72E+04 1,54E-03 1,76E-08 7,5 H4sH17364N 8,56E+04 1,57E-03 1,83E-08 7,4 H4sH17368N2 NB NB NB NB H4sH17368N3 NB NB NB NB H4sH17930N 7,84E+04 7,96E-04 1,02E-08 14,5 H4sH17930N2 8,28E+04 7,92E-04 9,57E-09 14,6 H4sH21051P NB NB NB NB H4sH21054P NB NB NB NB H4sH21055P NB NB NB NB H4sH21058P NB NB NB NB H4sH21064P 5,47E+04 7,91E-04 1,44E-08 14,6 H4sH21073P NB NB NB NB H4sH21077P NB NB NB NB H4sH21079P 3,74E+04 1,09E-02 2,90E-07 1,1 H4sH21080P 1,79E+05 3,90E-02 2,18E-07 0,3 H4sH21083P NB NB NB NB H4sH21086P NB NB NB NB H4sH21090P NB NB NB NB H4sH21091P NB NB NB NB H4sH21093P NB NB NB NB H4sH21099P NB NB NB NB H4sH21100P NB NB NB NB H4sH21103P NB NB NB NB H4sH21104P NB NB NB NB *NB indica que, sob condições experimentais, o reagente peptídico HLA-A2:HPV16E7(11-19) não se liga ao anticorpo monoclonal anti- HLA-A2:HPV16E7 capturado.

TABELA 6: AFINIDADES DE LIGAÇÃO BIACORE DOS ANTICOR- POS ANTI-HLA-A2/HPV16E7 (82-90) A 25 ºC HLA-A2:HPV16E7(82-90) Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t1/2 (min) H4sH17670P H4sH17670P NB NB NB H4sH17672P H4sH17672P NB NB NB H4sH17673P H4sH17673P NB NB NB H4sH17675P H4sH17675P NB NB NB H4sH17680P H4sH17680P NB NB NB H4sH17697P H4sH17697P NB NB NB H4sH17707P H4sH17707P 7,15E+04 3,61E-04 5,05E-09 H4sH17715P H4sH17715P 4,58E+04 5,68E-04 1,24E-08 H4sH17726P H4sH17726P 5,17E+04 4,19E-04 8,10E-09 H4sH17730P H4sH17730P NB NB NB H4sH17363N H4sH17363N NB NB NB H4sH17364N H4sH17364N NB NB NB H4sH17368N2 H4sH17368N2 8,31E+05 1,92E-03 2,30E-09 H4sH17368N3 H4sH17368N3 7,12E+05 1,22E-03 1,71E-09 H4sH17930N H4sH17930N NB NB NB H4sH17930N2 H4sH17930N2 NB NB NB H4sH21051P H4sH21051P 1,37E+04 3,31E-04 2,41E-08 H4sH21054P H4sH21054P 1,98E+05 7,65E-04 3,86E-09 H4sH21055P H4sH21055P 1,56E+05 1,21E-03 7,76E-09 H4sH21058P H4sH21058P 2,46E+05 2,60E-04- 1,06E-09 H4sH21064P H4sH21064P NB NB NB H4sH21073P H4sH21073P 5,77E+05 1,15E-04 2,00E-10 H4sH21077P H4sH21077P NB NB NB H4sH21079P H4sH21079P NB NB NB H4sH21080P H4sH21080P NB NB NB H4sH21083P H4sH21083P 5,38E+04 2,12E-04 3,94E-09 H4sH21086P H4sH21086P 6,97E+04 1,14E-03 1,63E-08 H4sH21090P H4sH21090P 8,11E+04 1,91E-04 2,35E-09 H4sH21091P H4sH21091P 1,74E+05 1,46E-04 8,42E-10 H4sH21093P H4sH21093P 1,18E+05 1,92E-03 1,63E-08 H4sH21099P H4sH21099P 1,24E+05 9,79E-05 7,88E-10 H4sH21100P H4sH21100P 2,90E+05 1,82E-04 6,26E-10 H4sH21103P H4sH21103P 8,35E+05 3,22E-03 3,86E-09 H4sH21104P H4sH21104P 4,36E+04 2,15E-04 4,94E-09 *NB indica que, sob condições experimentais, o reagente peptídico HLA-A2:HPV16E7(82-90) não se liga ao anticorpo monoclonal anti- HLA-A2:HPV16E7 capturado.

[00257] Os dados mostram que a maior parte dos anticorpos anti- HLA-A2/HPV16E7 desta invenção se ligaram seletivamente ao com- plexo peptídeo HLA-A2/HPV16E7 solúvel, alguns exibindo afinidade subnanomolar. Alguns anticorpos, no entanto, não apresentaram liga- ção ao complexo HLA-A2/HPV16E7. EXEMPLO 5: PREVISÃO DE POTENCIAIS PEPTÍDEOS NÃO ALVO

[00258] Dado um complexo peptídeo-HLA-A2 9-mer alvo, um po-

tencial peptídeo não alvo associado é definido com base em três crité- rios: A) o peptídeo é um 9-mer e é prevista sua ligação ao HLA-A2, B) o peptídeo é semelhante ao peptídeo-alvo com base na homologia de sequência e C) o peptídeo é derivado de um gene que é expresso em tecidos normais, essenciais. Portanto, para prever possíveis peptídeos não alvo associados a YMLDLQPET (HPV16 E711-19; SEQ ID nº: 538) e LLMGTLGIV (HPV16 E782-90; SEQ ID nº: 539), a seguinte me- todologia foi usada (em geral, consulte Dhanik, Ankur, et al. (2016), BMC Bioinformatics 17(1):286).

[00259] Como uma primeira etapa, as sequências de proteínas hu- manas canônicas foram baixadas do banco de dados UniprotKB (ver- são de setembro de 2014) (Magrane, Michele e UniProt Consortium. Database 2011 (2011): bar009) e todos os 9-mers foram extraídos. Isso resultou em 11.118.076 peptídeos de 20.014 sequências de pro- teínas.

[00260] Em seguida, as afinidades de ligação dos peptídeos com HLA-A2 foram calculadas usando NetMHCstab webserver (versão 1.0) (Jørgensen, W. Kasper, et al. (2014) Immunology 141(1):18-26). Foi previsto que os peptídeos com valor de afinidade < 500 nM se ligam ao HLA-A2, e o restante foi descartado, resultando nos 338.452 peptí- deos restantes.

[00261] As sequências peptídicas foram, então, avaliadas quanto à homologia da sequência com o peptídeo-alvo. Para cada peptídeo, seu grau de similaridade (DoS) foi calculado para o peptídeo-alvo. O valor DoS representa o número de aminoácidos idênticos em posições idênticas entre os dois peptídeos. Os peptídeos com valor DoS < 6 fo- ram rejeitados, resultando nos 21 peptídeos restantes no caso do HLA-A2/HPV16E7:11-19, e 78 peptídeos no caso do HLA- A2/HPV16E7: 82-90.

[00262] Os genes correspondentes aos 21 peptídeos foram verifi-

cados quanto à sua expressão nos tecidos essencial normais. A avali- ação quanto à expressão foi feita usando os dados da expressão gêni- ca provenientes dos bancos de dados GTEx (Gene Tissue Expression) e TCGA (The Cancer Genoma Atlas), fornecidos por OmicSoft (Hu, Jun, et al. Bioinformatics (2012) 28(14):1933-1934). Os dados foram disponibilizados em valores de RPKM (Leituras por Kilobase por Mi- lhão) a partir de 497 amostras normais adjacentes do TCGA (entre 15 tipos de tecidos essenciais), e 2.928 amostras normais do GTEx (entre 22 tipos de tecidos essenciais). Outros tecidos além da mama, colo do útero, trompas de falópio, testículos, útero e vagina foram considera- dos essenciais. Um gene foi considerado como expresso nos tecidos normais essenciais se o máximo da expressão do percentil 95 em ca- da tipo de tecido normal essencial nos bancos de dados GTEx e TCGA for de >= 0,5 RPKM. Para HLA-A2/HPV16E7:11-19 (YMLDLQ PET), dos 21 peptídeos, 10 peptídeos foram derivados de genes que são expres- sos nos tecidos normais essenciais. Para HLA-A2/ HPV16E7:82-90 (LLMGTLGIV), dos 78 peptídeos, 49 peptídeos foram derivados de ge- nes que são expressos nos tecidos normais essenciais.

[00263] Os 10 peptídeos constituem os não alvos previstos associ- ados ao complexo YMLDLQPET-HLA-A2-alvo (Tabela 7). Dos 49 pep- tídeos potenciais previstos como parte de possíveis não alvos associ- ados ao complexo LLMGTLGIV- HLA-A2, 13 foram escolhidos aleato- riamente para validação experimental e estão listados na Tabela 8. TABELA 7: PEPTÍDEOS NÃO ALVO PREVISTOS SEMELHANTES AO HLA-A2/HPV16E7:11-19 (YMLDLQPET; SEQ ID Nº: 538) Nº Sequência de Peptídeos Nome do Peptídeo Gene IC50 (nM) Previsto 1 YMLDLQKQL (SEQ ID nº: 546) SH3GLB1:244-252 SH3GLB1 9,2 2 KMLDKNPET (SEQ ID nº: 547) CAMKK1:388-396 CAMKK1 107,9 3 YMFDLLLET (SEQ ID nº: 548) USP47:691-699 USP47 3,5 4 YTLDLQLEA (SEQ ID nº: 549) CHPF:463:471 CHPF 132,8 5 MMLILQAET (SEQ ID nº: 550) PKD1:2694-2702 PKD1 244,3 6 LMLPLQPCT (SEQ ID nº: 551) NBR1:357-365 NBR1 487,8 7 YILDLLPDT (SEQ ID nº: 552) CBL:83-91 CBL 145,9 8 YMEDLQELT (SEQ ID nº: 553) PPP4R4:20-28 PPP4R4 482,1 9 GLLDLDPET (SEQ ID nº: 554) SBK3:285-293 SBK3 91,6 10 VMKDLLPET (SEQ ID nº: 555) FNDC3B:921-929 FNDC3B 379,9

TABELA 8: PEPTÍDEOS NÃO ALVO PREVISTOS SEMELHANTES AO HLA-A2/HPV16E7:82-90 (LLMGTLGIV; SEQ ID Nº: 539) Nº Sequência de Peptídeos Nome do Peptídeo Gene IC50 (nM) Previsto 1 LLMGTFLSV (SEQ ID nº: 556) VPREB3:9-17 VPREB3 5,9 2 LLGGTLERV (SEQ ID nº: 557) B4GALT2:4-12 B4GALT2 93,6 3 LLMGSNTIV (SEQ ID nº: 558) GCAT:312-320 GCAT 13,2 4 LLQATLDIV (SEQ ID nº: 559) CYP39A1:246-254 CYP39A1 88,7 5 LLLTFLGIV (SEQ ID nº: 560) ALDH3A2:467-475 ALDH3A2 85,4 6 LLAGTLAGV (SEQ ID nº: 561) CLCN4:79-87 CLCN4 11,0 7 LLQDTLGHV (SEQ ID nº: 562) ZHX2:234-242 ZHX2 50,5 8 LLLAVLGIV (SEQ ID nº: 563) GRM6:590-598 GRM6 64,4 9 LVMETLCIV (SEQ ID nº: 564) IPO9:582-590 IPO9 18,8 10 LLNETLGEV (SEQ ID nº: 565) IPO4:163-171 IPO4 25,8 11 KLMGHLGVV (SEQ ID nº: 566) SF3B1:969-977 SF3B1 11,2 12 LLMCYLYIV (SEQ ID nº: 567) DOCK11:1282-1290 DOCK11 2,7 CNOT1:1962-1970 13 LLNKVLGIV (SEQ ID nº: 568) CNOT1 247,8 humano EXEMPLO 6: PULSAÇÃO COM O PEPTÍDEO T2 PARA DETERMI- NAR A ESPECIFICIDADE HLA-A2/HPV16E7 M

[00264] Para determinar a especificidade do anticorpo monoclonal anti-HLA-A2/HPV16E7, foram usadas células T2 pulsadas com peptí- deo carregadas com peptídeos-alvo ou não alvo ou fora do alvo (iden- tificados no exemplo anterior). Os experimentos foram realizados da seguinte forma: Para a carga exógena de peptídeos-alvo ou não alvo HPV16E7, as células T2 foram lavadas em Meio AIM V e contadas com um contador de células CellometerTM Auto T4 (Nexcelom Biosci- ence). Cerca de 6 milhões de células T2 por frasco T-75 foram cultiva- das por 24 horas a 26 ºC em 9mL do Meio AIM V contendo 10g de b2m humano e 100g do peptídeo HPV16E7 ou peptídeo não alvo (Tabelas 6 e 7). Células T2 carregadas com peptídeo foram lavadas uma vez com PBS sem Ca2+/Mg2+ e contadas. Aproximadamente

10.000 células por poço das T2 carregadas com peptídeo ou T2 não tratadas em tampão de lavagem de células foram semeadas em pla- cas de eletrodos de carbono de 96 poços (placa de alta ligação MUL- TI-ARRAY, MSD) e incubadas por 1 hora a 37ºC para permitir a ade- rência das células à placa. Sítios de ligação não específicos foram bloqueados usando 2% de BSA (p/v) em PBS por 1 hora à temperatu- ra ambiente. Para as células ligadas à placa, foram adicionadas solu-

ções de anti-HLA-A2/HPV16E7:11-19, anti-HLA-A2/HPV16E7:82-90 ou anticorpo de controle em diluições séricas variando de 1,7 pM a 100 nM, bem como soluções sem anticorpos.

As placas foram incuba- das por 1 hora à temperatura ambiente; em seguida, lavadas para re- mover o anticorpo não ligado usando uma solução de lavagem de pla- ca AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Os anticorpos liga- dos à placa foram detectados com o anticorpo Ig anti-humano policlo- nal de cabra conjugado a GSULFO-TAG, específico para o fragmen- to Fc gamma (Jackson Immunoresearch, Meso Scale Discovery) por 1 hora à temperatura ambiente.

Após as lavagens, as placas foram de- senvolvidas com Tampão de Leitura (MSD) de acordo com o procedi- mento recomendado pelo fabricante, e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Discovery). A intensidade da luminescência, medida em unidades rela- tivas de luz (RLU), foi registrada para indicar a intensidade da ligação de cada anticorpo no intervalo de concentrações.

A razão do sinal de ligação das células para cada anticorpo anti-HLA-A2/HPV16E7 em comparação ao controle de isotipo a 11nM é relatada nas Tabelas 8 e 9 e é uma indicação da especificidade.

À concentração de 11nM, a maioria dos anticorpos exibiu a ligação mínima a células T2 não trata- das.

Nem todos os anticorpos foram testados com todos os corres- pondentes peptídeos não alvo relacionados.

Aqueles não testados são marcados como NT para "não testado". Os anticorpos com uma razão de ligação superior a 15 são marcados (+++); com uma razão igual ou inferior a 15, porém maior ou igual a 10, são marcados (++); com uma razão inferior a 10, porém maior que 3, são marcados (+), e os anti- corpos com uma razão inferior a 3 foram classificados como não aglomerantes e designados como (-). Além disso, os sinais de ligação direta (em RLU) foram analisados em função da concentração de anti- corpos e dados ajustados a um modelo de resposta à dose sigmoidal

(logística de 4 parâmetros) usando GraphPad Prism™. Os valores EC50 , definidos como a concentração de anticorpos em que se detecta 50% do sinal de ligação máxima nas células, foram determinados, sempre que possível, para indicar a potência de cada anticorpo. Os valores EC50 para ligação ao HLA-A2/HPV16E7:11-19 ou HLA- A2/HPV16E7:82-90 da superfície celular também são reportados nas Tabelas 9 e 10.

[00265] Dez dos treze anticorpos anti-HLA-A2/HPV16E7:11-19 da invenção se ligam ao complexo HLA-A2/peptídeo da superfície de cé- lulas T2. Sete desses anticorpos (H4sH17670P; H4sH17675P; H4sH17363N; H4sH17364N; H4sH17930N; H4sH17930N2 e H4sH21064P são específicos para o complexo HLA-A2/HPV16E7:11-

19. Três anticorpos (H4sH17672P, H4sH21079P, H4sH21080P) apre- sentaram maior potência exibida com valores de EC50 abaixo de 1,1 nM. Três anticorpos (H4sH17673P, H4sH17680P, H4sH17697P) não se ligaram à células carregadas com o peptídeo T2 e estão indicados com um (-) na primeira coluna da Tabela 9.

[00266] Os resultados da ligação de células em células T2 carrega- das com os peptídeos alvo HPV16E7:82-90 e não alvo previstos são resumidos na Tabela 9. Dezesseis dos vinte e um mAbs anti-HLA- A2/HPV16E7:82-90 da invenção se ligam ao complexo HLA- A2/peptídeo da superfície de células T2. Apenas dois mAbs desse grupo (H4sH17368N2, H4sH21086P) mostraram especificidade ao complexo HLA-A2/HPV16E7 82-90. Cinco anticorpos (H4sH17730P, H4sH21051P, H4sH21054P, H4sH21055P, H4sH21077P) não se liga- ram às células carregadas com o peptídeo T2 e estão indicados com um (-) na Tabela 10.

TABELA 9: ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-HLA-A2/HPV16E7:11-19 EC50 (M) da Especificidade da Ligação das Células com o Peptídeo T2+ em comparação ao Ligação Isotipo hIgG4s de Controle Irrelevante a 11 nM das Células

PK NB SB Não SH3G CAM USP CHP D1 CB T2+HPV HPV1 R1 PPP4 K3 tra- LB1 KK1 47 F 269 L AbPID 16E7 11- 6E7 357 R4 285 tadas 244- 388- 691- 463: 4- 83- 19 11-19 - 20-28 - com 252 396 699 471 270 91 365 293 T2 2 H4sH176 70P 1.3E-09 ++ - - - - - - - - - - H4sH176 72P 4.5E-10 ++ - - + - - - - - - - H4sH176 73P - - - - - - - - - - - - H4sH176 75P 1.1E-09 + - - - - - - - - - - H4sH176 80P - - - - - - - - - - - - H4sH176 97P - - - - - - - - - - - - H4sH173 63N 2.1E-09 ++ - - - - - - - - - - H4sH173 64N 2.0E-09 ++ - - - - - - - - - - H4sH179 30N 3.1E-09 ++ - - - - - - - - - - H4sH179 30N2 5.8E-09 ++ - - - - - - - - - - H4sH210 64P 2.2E-09 +++ NT NT NT - NT - - NT NT - H4sH210 79P 1.1E-09 +++ NT NT NT + NT - + NT NT - H4sH210 80P 2.2E-10 ++ NT NT NT + NT - + NT NT - Sinal de ligação das células a 11 nM, RLU Controle 110 112 11 de - 1029 976 772 1077 820 1038 945 847 2 3 04 Isotipo

TABELA 10: ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-HLA-A2/HPV16E7:82-90 EC50 (M) da Liga- Especificidade da Ligação das Células com o Peptídeo T2+ em comparação ao Isotipo hIgG4s de Controle Irrelevante a 11 nM ção das Células ZHX2 GRM6 IPO9 IPO4 SF3B1 DOCK11 CNOT1 Não Pul- T2+HPV1 HPV16E VPREB B4GALT GCAT CYP39A ALDH3A2 CLCN4 AbPID 6E7 82-90 7 82-90 3 9-17 2 4-12 312-320 1 246-254 467-475 79-87 234- 590- 582- 163- 969- 1282- 1962- sadas 242 598 590 171 977 1290 1970 com T2 H4sH17707P 2,3E-08 + - - - - - - + - - - - - - - H4sH17715P 2,9E-10 ++ - - - - + - - ++ - - + - + - H4sH17726P 4,1E-10 ++ +++ ++ - ++ + ++ + ++ + - + + + - H4sH17730P - - - - - - - - - - - - - - - - H4sH17368N2 7,5E-10 ++ - - - - - - - - - - - - - - H4sH17368N3 1,8E-10 ++ - - - - - + - - - - - - - -

127/141 H4sH21051P - - - - NT NT NT NT - NT NT NT NT NT NT - H4sH21054P - - - - NT NT NT NT - NT NT NT NT NT NT - H4sH21055P - - - - NT NT NT NT - NT NT NT NT NT NT - H4sH21077P - - - - NT NT NT NT - NT NT NT NT NT NT - H4sH21086P 5,0E-10 +++ - - NT NT NT NT - NT NT NT NT NT NT - H4sH21090P 5,6E-10 +++ - - NT NT NT NT +++ NT NT NT NT NT NT - H4sH21091P 1,7E-10 +++ - - NT NT NT NT +++ NT NT NT NT NT NT - H4sH21093P 3,0E-10 ++ - - NT NT NT NT + NT NT NT NT NT NT - H4sH21058P 1,9E-10 ++ - - - - - - - + - - + - - - H4sH21073P 9,0E-11 ++ - - - - - - - + - - - - - - H4sH21083P 3,3E-10 ++ - - - - + - - + - - ++ - + - H4sH21099P 8,7E-11 ++ - - - - + - - + - - + - + - H4sH21100P 9,6E-11 ++ - - - - - - - + - - + - - - H4sH21103P 4,5E-11 ++ - - - - + - - + ++ + +++ ++ ++ - H4sH21104P 4,8E-10 ++ - - - + - - - - - - + - - - Sinal de ligação das células a 11 nM, RLU Controle de - 835 871 926 872 562 856 725 797 807 768 1067 702 776 780 860 Isotipo

[00267] Como mostrado nas tabelas 9 e 10, as proteínas de ligação ao antígeno anti-HLA-A2:HPV16E7 da invenção se ligaram com alta especificidade apenas ao peptídeo HPV específico (SEQ ID nº: 538 na Tabela 9, ou a SEQ ID nº: 539 na Tabela 10), como exibido por HLA- A2, e não se ligaram a nenhum peptídeo não alvo exibido por HLA-A2.

[00268] EXEMPLO 7: ANÁLISE DA ESPECIFICIDADE DA LIGA- ÇÃO USANDO CÉLULAS T2 PULSADAS COM PEPTÍDEO & ANÁLI-

SE POR FACS

[00269] A ligação e a especificidade relativas dos anticorpos HPV16E7 foram avaliadas por citometria de fluxo em células HIH3T3 que expressam o complexo que apresenta o peptídeo HPV 11-19 (3T3/HLA.A2/hB2M/HPV16E7:11-19) ou peptídeo HPV 82-90 (3T3/ HLA.A2/hB2M/HPV16E7 (82-90). As células NIH3T3 que expressam o complexo HLA foram geradas por transfecção de HLA-A2 humano (número de acesso P01892), B2M humano (número de acesso NP_004039.1) e um cassete de peptídeos ubiquitina (Lévy, F. et al. (1996) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(10):4907-4912; Valmori D, et al. (1999), Journal of Experimental Medicine 189(6):895-906) compreendendo ou os ami- noácidos 11-19 do HPV16E7 (SEQ ID nº 538) ou os aminoácidos 82- 90 (SEQ ID nº: 539) (número de AKI85233) usando lipofectomina 2000 (Invitrogen, Cat nº 11668) seguido por seleção durante pelo menos 2 semanas em puromicina a 1 µg/ml, G418 a 500 µg/ml e higromicina a 100 µg/ml. Para marcação, as células foram colhidas usando tampão de dissociação de células (Millipore, Cat# S-004-C) e contadas. As cé- lulas foram plaqueadas em tampão de marcação (PBS, sem Cálcio e Magnésio (Irving 9240) + FBS a 2% (ATCC 30-2020) a uma densidade de 200.000 células por poço em uma placa de fundo em V com 96 po- ços, e marcadas com três diluições em série (1,7 pM - 100 nM) de an- ticorpos primários por 30 min a 4 ºC. Após a incubação do anticorpo primário, as células foram lavadas em tampão de marcação, e marca- das com um anticorpo secundário conjugado a Alexa-Flour 647 (Jack- son ImmunoResearch, Cat nº 109-606-170) a 10 g/ml por 30 minutos a 4 ºC.

As células foram, em seguida, lavadas e fixadas com uma so- lução a 50% de BD Cytofix (BD, Cat nº 554655) diluída em tampão de marcação.

As amostras foram executadas e analisadas em um citôme- tro de fluxo intellicyt iQue para calcular a intensidade de fluorescência média (IFM). Os valores de MFI foram plotados em Graphpad Prism usando uma equação logística de quatro parâmetros através de uma curva de resposta de 12 pontos para calcular os valores EC50. O anti- corpo secundário apenas (ou seja, nenhum anticorpo primário) para cada curva de resposta à dose também está incluído na análise como uma continuação das três diluições em série e é representado como a menor dose.

Os valores EC50 (M) e a dobra de ligação máxima (dobra alterada da dose mais alta para a dose mais baixa) são mostrados na Tabela 11. Diversos anticorpos especificamente ligados à linhagem celular 3T3/HLA.A2/hB2M/HPV16E7:11-19 ou 3T3/HLA.A2/hB2M/ HPV16E7: 82-90. Os valores EC50 variaram de 5-500 nM e a dobra de ligação variou de 1,0X a 43,8X.

TABELA 11: LIGAÇÃO POR FACS DOS ANTICORPOS HPV16E7 3T3/HLA.A2/hB2M/HPV16E7 3T3/HLA.A2/hB2M/HPV1 HEK293 (11-19) 6E7 (82-90) Designação do Dobra Dobra Dobra EC50 EC50 EC50 Anticorpo Máxima Máxima Máxima *H4sH17363N 1,40E-08 11,4 ND 1,7 ND 1,3 *H4sH17364N 2,40E-08 11,4 2,91E-08 2,3 ND 1,2 H4sH17368N2 ND 1,8 1,94E-07 9,1 ND 1,8 H4sH17368N3 ND 1,1 3,26E-08 6,1 ND 1,7 *H4sH17670P 2,37E-08 6,7 ND 1,5 ND 0,8 H4sH17672P 3,72E-08 10,2 ND 1,4 ND 1,6 H4sH17673P ND 1,8 ND 1,3 ND 1,6 *H4sH17675P 1,27E-08 5,1 ND 1,3 ND 0,65 H4sH17680P ND 1,5 ND 1,1 ND 1 H4sH17697P ND 1,2 ND 1,5 ND 1,1 H4sH17707P ND 1,5 ND 1,8 ND 2 H4sH17715P ND 1,7 6,60E-06 6,7 3,47E-08 3,1 H4sH17726P 5,20E-08 28,11 7,19E-08 43,8 ND 2,0 H4sH17730P ND 0,9 5,80E-08 2,9 ND 0,9 H4sH17930N 1,73E-08 13,5 6,62E-08 10,3 1,53E-07 4,3 *H4sH17930N2 2,78E-08 11,4 7,48E-08 3 3,93E-08 3 H4sH21051P ND 1,2 ND 2,0 ND 1,2 H4sH21054P ND 3,8 ND 4,9 3,51E-08 3,6 H4sH21055P ND 1,4 ND 1,5 ND 1,9 H4sH21058P ND 1,3 1,01E-08 8,6 ND 0,9

*H4sH21064P 2,05E-08 12,3 6,60E-08 2,2 ND 0,7 H4sH21073P ND 0,9 4,09E-08 6,5 ND 0,9 H4sH21077P ND 2,0 ND 1,5 ND 1,6 H4sH21079P 4,02-08 26,6 5,40E-08 20,5 ND 1,3 H4sH21080P 3,10E-08 11,7 2,11E-08 7,4 5,19E-08 4,4 H4sH21083P ND 1,5 3,31E-09 8,5 ND 1,4 H4sH21086P 5,537E-07 14,6 3,49E-07 22 ND 1,3 H4sH21090P ND 1,6 1,85E-09 6,25 ND 1,1 H4sH21091P ND 1,5 3,74E-10 5,6 ND 1,6 H4sH21093P ND 1,9 2,95E-08 3,9 ND 1,4 H4sH21099P ND 1 1,19E-09 4,8 ND 2 H4sH21100P 3,55E-08 4,4 1,19E-08 10,3 ND 0,7 H4sH21103P ND 1,6 9,20E-09 6,3 ND 1,5 H4sH21104P ND 1,6 5,481E-09 8,5 ND 1 Controle de Isotipo ND 1 ND 1 ND 1,2

[00270] A especificidade de seis anticorpos HPV16E7:11-19 foi ain- da caracterizada por avaliação da ligação a células T2 (174 CEM.T2) pulsadas com HPV16E7:11-19, HPV16E7:82-90 ou peptídeos não alvo previstos (Tabela 7). Para pulsar, T2 (174 CEM.T2) foram ressuspen- sas em meio AIM V a uma densidade de 1x106 células/ml (Gibco. Cat nº 31035-025). As células foram pulsadas por adição de 10 g/ml de hB2M (EMD Millipore Cat nº 475828) e 100 g/ml do peptídeo indica- do. As células T2 foram, então, incubadas a 26C, lavadas em tampão de marcação e marcadas com os anticorpos indicados a uma concen- tração de 10 g/ml, seguindo o protocolo descrito acima. Foram calcu- lados os valores de MFI e apresentados como alteração de dobra em relação às células não marcadas. A ligação relativa dos seis anticor- pos HPV16E7:11-19 em células T2 pulsadas com HPV16E7:11-19 va- ria de 986-1200 vezes acima das células não marcadas. Não foi ob- servada ligação significativa acima do controle de isotipo nas células T2 pulsadas com os outros peptídeos (Tabela 12).

TABELA 12: LIGAÇÃO POR FACS DE ANTICORPOS HPV16E7 A CÉLULAS PULSADAS COM T2. (MUDANÇA DA DOBRA EM RELAÇÃO ÀS NÃO MARCADAS) HPV16 E7:11-19 SH3GLB1 CAMKK1 USP47 CHPF PKD1 NBR1 CBL PPP4R4 SBK3 Células Não YMLDLQPET 244-252 388-396 691-699 463:471 2694-2702 357-365 83-91 20-28 285-293 Pulsadas H4sH17363N 1001,4 13,6 2,0 0,6 7,4 1,2 3,6 19,5 6,1 0,4 8,5 H4sH17364N 986,1 15,2 1,0 1,3 10,9 1,0 3,0 23,9 9,0 0,8 11,7 H4sH17670P 1005,5 3,7 2,9 5,3 3,6 3,5 2,2 2,0 2,9 2,6 5,0 H4sH17675P 1204,2 10,5 2,4 13,3 5,0 2,9 2,2 4,9 5,5 2,9 7,2 H4sH17930N2 1166,7 28,2 2,6 8,9 7,5 3,3 3,3 4,6 7,3 3,0 6,7 H4sH21064P 1204,2 10,5 2,4 13,3 5,0 2,9 2,2 4,9 5,5 2,9 7,2 Controle de Isotipo 17,1 8,5 6,3 11,5 9,9 9,8 8,7 9,0 8,0 6,8 10,2

131/141 Secundário Apenas 14,2 3,7 5,8 5,2 4,8 4,4 3,7 4,4 4,0 4,1 6,5 Não Marcados 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

EXEMPLO 8: ANÁLISE DE EPÍTOPOS USANDO PEPTÍDEOS DE

VARREDURA DE ALANINA

[00271] A varredura de alanina foi realizada para determinar quais resíduos no peptídeo HPV16E7:11-19 eram críticos para a ligação dos anticorpos. As células T2 foram pulsadas com peptídeos de varredura de alanina e marcadas com os anticorpos HPV16E7:11-19, como des- crito acima. Foram usados os seguintes peptídeos de varredura de alanina (Tabela 13). TABELA 13: PEPTÍDEOS DE VARREDURA DE ALANINA USADOS

NO ESTUDO SEQ ID nº: Peptídeo Substituição com Ala 569 AMLDLQPET Y11A 570 YALDLQPET M12A 571 YMADLQPET L13A 572 YMLALQPET D14A 573 YMLDAQPET L15A 574 YMLDLAPET Q16A 575 YMLDLQAET P17A 576 YMLDLQPAT E18A 577 YMLDLQPEA T19A

[00272] A conversão do aspartato 14 em alanina (D14A) e glutami- na 16 em alanina (Q16A) reduziu acentuadamente a ligação dos anti- corpos para todos os anticorpos testados. A conversão da tirosina 11 em alanina (Y11A) reduziu a ligação de H4sH17670P, H4sH17675P, H4sH21064P e H4sH17930N2; porém não de H4sH17363N ou H4sH17364N. A conversão da leucina 13 em alanina (L13A) e da pro- lina 17 em alanina (P17A) reduziu a ligação dos anticorpos em geral (Tabela 14).

[00273] Para resumir, D14 e T16 são resíduos críticos para a liga- ção dos anticorpos.

TABELA 14: LIGAÇÃO POR FACS DOS ANTICORPOS HPV16E7 A CÉLULAS T2 PULSADAS COM PEPTÍDEOS DE

VARREDURA DE ALANINA

AMLDLQPET YALDLQPET YMADLQPET YMLALQPET YMLDAQPET YMLDLAPET YMLDLQAET YMLDLQPAT YMLDLQPEA (Y11A) (M12A) (L13A) (D14A) (L15A) (Q16A) (P17A) (E18A) (T19) H4sH17363N 694,8 998,5 529,9 58,2 1019,3 13,3 401,8 775,7 1034,3 H4sH17364N 708,3 997,9 489,9 69,7 1008,4 13,2 384,8 756,2 1075,7 H4sH17670P 8,1 670,3 374,9 10,7 1062,8 6,2 168,8 614,7 1150,1 H4sH17675P 19,0 823,8 527,2 6,3 1153,1 5,8 371,1 808,3 1165,0 H4sH17930N2 39,0 972,9 665,7 5,8 1245,9 6,8 531,9 1035,4 1330,3 H4sH21064P 19,0 823,8 527,2 6,3 1153,1 5,8 371,1 808,3 1165,0 Controle de 14,4 10,9 8,4 9,9 8,1 9,0 8,2 9,1 9,6 Isotipo Secundário 9,7 6,9 4,9 6,4 6,3 5,5 4,6 4,5 6,5 Apenas 134/141 Não Marcados 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

EXEMPLO 9: REFORMATAÇÃO DOS ANTICORPOS HLA-A2/ HPV16E7 EM SCFV PARA USO EM RECEPTORES QUIMÉRICOS

DE ANTÍGENO

[00274] Seis anticorpos HLA-A2/HPV16E7:11-19 (17363N, 17364N, 17670P, 17675P, 17930N2 e 21064P) foram reformatados em frag- mentos variáveis de cadeia única VL-VH (ScFv) e colocados em um construto do receptor quimérico de antígeno (CAR) construir que usou um domínio de charneira e transmembranar CD8, domínio estimula- tório 4-1BB e um domínio coestimulatório CD3 (SEQ ID nos: 540 – 545). Os CARs específicos para HLA-A2/HPV16E7:11-19 foram clo- nados em um vetor de expressão lentiviral (Lenti-X™ Bicistronic Ex- pression System (Neo), Clontech Cat# 632181) e partículas lentivirais foram geradas através do sistema Lenti-X Packaging Single-Shot (VSV-G) (Clontech Cat nº 631276), de acordo com os protocolos do fabricante. As células Jurkat engenheiradas para expressar um repór- ter NFAT-luciferase (Jurkat/NFATLuc cl.3C7) foram transduzidas com os seis construtos de CAR diferentes, usando Pratos Pré-Revestivos RetroNectin (Clontech, Cat nº T110a), de acordo com os protocolos do fabricante. Após a seleção por pelo menos 2 semanas em 500 g/ml de G418 (Gibco, Cat nº 11811-098), foram geradas linhagens celulares CAR-T.

[00275] A atividade das linhagens CAR-T foi avaliada em um bioen- saio CAR-T/Célula Apresentadora de Antígeno (APC).

[00276] Para realizar o bioensaio, 50.000 células Jurkat/NFATLuc cl. 3C7 CAR-T foram adicionadas às placas brancas com 96 poços Thermo-Nunc 96 (Thermo Scientific, Cat nº 136101) em 50 l de meio de ensaio (meio RPMI com 10% de FBS e 1% de P/S/G) seguido pela adição de 3 diluições em série de APCs (150.000 células a 200 célu- las) em 50 l de meios de ensaio. As seguintes APCs foram usadas: Células CASKI (HLA-A2+/HPV16+), CASKI, que sobre-expressam uma versão de cadeia única do HLA-A2 que apresenta o peptídeo 11- 19 ou 82-90, HEK293 (HLA-A2+/HPV16-) ou c33a (HLA-A2+/HPV16-). A mistura de células foi incubada em uma incubadora umidificada a 37C, C02 a 5%, por 5 horas.

A atividade NFAT-Luciferase foi medida usando Promega One-Glo (Cat# E6130) e um leitor de placa Perkin Elmer Envision.

Unidades relativas de luciferase (RLU) foram geradas e plotadas em Graphpad Prism usando uma equação logística de qua- tro parâmetros através de uma curva de resposta de 8 pontos para calcular os valores EC50. A condição de zero APC para cada curva de resposta à dose também está incluída na análise como uma continua- ção das três diluições em série e é representada como a menor dose.

A ativação da dobra máxima foi determinada tomando-se a razão das RLU mais altas na curva para as mais baixas.

Todas as seis linhagens celulares HLA-A2/HPV16E7:11-19 CAR-T foram ativadas por células CASKI que sobre-expressaram o peptídeo HPV16E7:11-19 com ativa- ções de dobra máximas entre 2,5-32,3 vezes.

Nenhuma linhagem ce- lular CAR-T foi ativada pelas APCs que sobre-expressaram o peptídeo HPV16E7:82-90 ou as células HEK293 e C33a.

Curiosamente, uma linhagem celular CAR-T, que usou o ScFv do anticorpo 17675P, foi ativada por células CASKI do tipo selvagem, com uma ativação de do- bra de 4,1 e um EC50 das células 68654 (Tabela 15).

TABELA 15: ATIVAÇÃO DE CAR-T DO HPV16E7(11-19) EM UM BIOENSAIO CAR-T/APC 17363N 17364N 17670P 17675P 17930N2 21064P EC50 Ativação EC50 Ativação EC50 Ativação EC50 Ativação EC50 Ativação EC50 Ativação

APC (células) da Dobra (células) da Dobra (células) da Dobra (células) da Dobra (células) da Dobra (células) da Dobra CASKI ND 0,9 ND 1 ND 0,8 68654 4,1 ND 0,9 ND 1,2 CASKI 11-19 5108 2,5 6632 10,4 4145 8,5 9703 32,3 7885 16,8 7220 20,7 CASKI 82-90 ND 0,9 ND 1 ND 0,9 ND 1,5 ND 0,7 ND 0,9 HEK293 ND 0,8 ND 0,9 ND 0,8 ND 0,7 ND 0,7 ND 0,8 C33a ND 0,7 ND 1,2 ND 0,8 ND 0,6 ND 0,6 ND 0,4 ND = EC50 Não determinado quando a dobra de ligação máxima foi inferior ou igual a 2 vezes.

136/141

[00277] O aumento da quantidade de peptídeo HLA-A2 apresenta- do por HPV16E7:11-19 deve resultar em um aumento na ativação dos CARs HLA-HPV16E7:11-19. Foi reportado que o interferon gama pode aumentar a apresentação do antígeno por moléculas de MHC da clas- se 1, apesar da regulação positiva do proteasoma (Früh K. e Yang Y. (1999) Curr Opin Immunol. 11(1):76-81). Com base nessa observação, foi determinado se as células CASKI ou células HEK293 do tipo selva- gem pré-tratadas com interferon gama poderiam resultar em maior ati- vação das linhagens celulares CAR-T. As células CASKI e as células HEK293 foram pré-tratadas com 500 unidades/ml de IFN- humano recombinante (Peprotech Cat nº 300-02) por 48 horas e, em seguida, usadas no bioensaio CAR-T/APC, como descrito acima (Tabela 16). Células CASKI pré-tratadas com IFN ativam todas as seis linhagens celulares CAR-T do HPV16E7:11-19 com uma ativação de dobra vari- ando de 2,4-10,6. TABELA 16: ATIVAÇÃO DE CAR-T DO HPV16E7(11-19) NA PRE- SENÇA DE IFN- CASKI CASKI + IFN-g HEK293 HEK293 + IFN-g Jurkat/NFAT EC50 Dobra EC50 Dobra EC50 Dobra EC50 Máx Luc CART (células) Máxima (células) Máxima (células) Máxima (células) Dobra 17363N ND 1,0 51837 2,4 ND 1,0 ND 0,81 17364N ND 1,0 6440 5,6 ND 0,86 ND 0,75 17670P ND 1,0 51360 2,7 ND 0,77 ND 0,78 17675P 13844 1,77 64903 10,6 ND 0,81 ND 0,71 17930N2 ND 0,97 57186 8,1 ND 0,75 ND 0,71 21064P ND 1,0 55863 8,97 ND 0,8 ND 0,7

[00278] Para avaliar adicionalmente a especificidade das linhagens CAR-T do HPV16E7:11-19 no ensaio da luciferase, foram usadas célu- las T2 como a APC e pulsadas com peptídeos não alvo previstos (Ta- bela 17). Brevemente, as células T2 foram pulsadas com três diluições em série dos peptídeos indicados (1,7 pg/ml a 100 ng/ml). Após a pul- sação, 50.000 células CAR-T foram adicionadas às placas brancas de

96 poços Thermo-Nunc (Thermo Scientific, Cat nº 136101) em 50 L de meio de ensaio.

Então, 50.000 células pulsadas com T2 foram adi- cionadas às placas em 50 L do meio de ensaio.

A mistura de células foi incubada em uma incubadora umidificada a 37C, C02 a 5%, por 5 horas.

A atividade NFAT-Luciferase foi determinada usando Promega One-Glo (Cat nº E6130) e um leitor de placa Perkin Elmer Envision.

RLU foram plotadas em Graphpad Prism usando uma equação logísti- ca de quatro parâmetros através de uma curva de resposta de 12 pon- tos para calcular os valores EC50. A condição não pulsada para cada curva de resposta à dose também está incluída na análise como uma continuação das três diluições em série e é representada como a me- nor dose.

A ativação de dobra máxima foi determinada como descrito anteriormente.

Todas as linhagens celulares CAR-T foram ativadas por células T2 pulsadas com o peptídeo HPV16E7:11-19. A linhagem CART Jurkat/NFATLuc usando o ScFv do anticorpo 17364N foi ativada de forma não específica por células T2 pulsadas com Endofilina- B1(SH3GLB1:244-252), condroitina sulfato sintase 2 (CHPF:463:471) e ligase da proteína ubiquitina E3 CBL (CBL:83-91). Todas as outras linhagens celulares CAR-T não tiveram ativação significativa com ne- nhum peptídeo não alvo.

TABELA 17: ATIVAÇÃO DE DOBRA MÁXIMA DE CAR-T DO HPV16E7 (11-19) CONTRA CÉLULAS PULSADAS COM T2 Construto do Receptor Quimérico de Antígeno Jurkat/NFATLuc Peptídeo 17363N 17364N 17670P 17675P 17930N2 21064P Ativação de Dobra Máxima HPV16E7:11-19 6,5 10,9 1,9 10,6 7,8 12,9 HPV16E7:82-90 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 SH3GLB1:244-252 1,3 6,1 0,9 1,1 1,4 3,4 CAMKK1:388-396 0,9 1,0 0,9 0,9 0,9 0,8 USP47:691-699 1,0 0,9 0,9 1,0 0,9 1,1 CHPF:463:471 1,1 5,2 0,9 1,0 0,9 1,1 PKD1:2694-2702 0,8 0,9 1,0 1,0 0,9 0,9 NBR1:357-365 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 CBL:83-91 1,3 7,2 0,9 1,1 0,9 1,5 PPP4R4:20-28 0,9 0,9 1,0 1,0 0,9 0,9 SBK3:285-293 1,0 0,9 1,0 1,0 0,9 0,9

EXEMPLO 10: ANÁLISE ESTRUTURAL DA LIGAÇÃO DO FAB AO

PEPTÍDEO HLA-A2 + HPV16E7:11-19

[00279] Em um esforço para melhor compreender as interações es- pecíficas entre anticorpo e complexo HLA-peptídeo, foram determina- das as estruturas cristalinas de raio-X de um fragmento Fab de anti- corpo ligado a HLA-A2/b2m exibindo o peptídeo HPV16E7:11-19. Uma estrutura contém o Fab 17670P, e a outra estrutura contém o Fab 17363N; juntas, essas duas estruturas cobrem o espaço de sequên- cias dos seis anticorpos apresentados acima (por exemplo, a Tabela 11 e a Tabela 12). Todos os nove resíduos do peptídeo HPV16E7:11- 19 exibido por HLA são claramente visíveis nos mapas da densidade eletrônica para ambas as estruturas 17670P e 17363N. Mesmo a 2,9 Å (a resolução da estrutura 17670P), a posição e a identidade dos resí- duos peptídicos são inequívocas, e as interações resíduo-resíduo po- dem ser determinadas com precisão. A estrutura 17363P tem 2,6 Å, permitindo maior precisão.

[00280] Os Fabs 17670P e 17363N Fabs se ligam ao topo do com- plexo HLA-peptídeo, de maneira muito semelhante ao modo como a TCR se liga. Os FABS são posicionados e orientados de forma quase idêntica um ao outro; ambos são alinhados em paralelo aos "trilhos" que limitam o sulco de ligação ao peptídeo, e ambos são centralizados no peptídeo ligado, com as CDRs da cadeia pesada em contato com a metade N terminal do peptídeo ligado, e as CDRs da cadeia leve em contato com a metade C terminal do peptídeo. Outras estruturas publi- cadas do complexo de anticorpos (por exemplo, códigos PDB 1W72 e 4WUU) revelam que o anticorpo não tem que cobrir todo o peptídeo exibido por HLA. No entanto, esses anticorpos com cobertura apenas parcial do peptídeo tem baixa especificidade, tolerando mudanças ex- tensas na parte do peptídeo que não está em contato, com pouca per- da de afinidade.

[00281] As estruturas mostram que as cadeias pesadas do Fab

17670P e 17363N fazem contato com os resíduos 11, 14, 15 no peptí- deo HPV16E7, enquanto as cadeias leves do Fab fazem contato com os resíduos 15, 17, 18. Nenhum contato com o Fab é feito com as ca- deias laterais dos resíduos 12, 13, 16 ou 19, visto que elas apontam para a molécula HLA. O peptídeo ligado é numerado de acordo com as posições do resíduo na proteína HPV16 E7 original, como a seguir:

[00282] A maioria dos contatos com o Fab são feitos com as cadei- as laterais do peptídeo, não a estrutura principal.

[00283] Os contatos do peptídeo feitos por 17670P são concentra- dos quase exclusivamente em LCDR1 e HCDR3 das CDRs, particu- larmente HCDR3. Em particular, os resíduos da cadeia pesada do Fab 100, 101, 102, 105, 109, 110 da SEQ ID nº: 34 e os resíduos da cadeia leve 30, 31, 32, 50 da SEQ ID nº: 42 fazem contato com o peptídeo ligado, enquanto os resíduos da cadeia pesada do Fab 28, 31, 32, 100, 102, 104, 109, 110, 113 da SEQ ID nº: 34 e os resíduos da cadeia leve 31, 50, 52, 53, 54, 55, 92 da SEQ ID nº: 42 fazem contato com o HLA. "Contato" aqui pode envolver ligações de hidrogênio diretas ou mediadas por água, interações carga a carga ou interações hidrofóbi- cas/de van der Waals. Para 17363N, os resíduos da cadeia pesada do Fab 102, 103, 108, 111, 112 da SEQ ID nº: 506 e os resíduos da ca- deia leve 28, 30, 32, 50, 68 da SEQ ID nº: 514 fazem contato com o peptídeo ligado, enquanto os resíduos da cadeia pesada do Fab 28, 32, 100, 102, 103, 107, 112 da SEQ ID nº: 506 e os resíduos da cadeia leve 31, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 92 da SEQ ID nº: 514 fazem contato com a molécula HLA.

[00284] Dos seis anticorpos anti-HLA-A2:HPV16E7:11-19, o 17675P é o mais semelhante ao 17670P nas sequências da CDR que determinam a ligação do peptídeo, com 21064P 17930N2 também compartilhando um alto grau de similaridade nas regiões CDR da liga-

ção ao peptídeo. Os principais contatos entre 17670P e o complexo HLA-peptídeo são, na sua maioria, conservados em 17675P, 21064P e 17930N2, portanto, o modo de ligação desses anticorpos é provável de ser o mesmo do 17670P.

[00285] Inversamente, CDR H3 do 17363N tem uma sequência muito diferente em comparação à CDR H3 do 17670P, e essa diferen- ça na sequência se traduz em uma diferença estrutural da CDRH3, alterando os contatos com o complexo HLA-peptídeo nessa região. Por exemplo, a Tyr 100 da pesada cadeia em 17670P faz contato com a Tyr 11 do peptídeo ligado. O resíduo equivalente em 17363N é o Tyr 102 (essa CDR H3 do anticorpo é dois resíduos mais longa), e esse resíduo não faz em contato com a Tyr 11 do peptídeo. Em vez disso, a Tyr 102 se reorientou para fazer contatos com a molécula HLA próxi- ma.

[00286] O anticorpo 17364N à frente tem uma sequência muito se- melhante ao 17363N, e é idêntico em todos os resíduos que fazem contato com o complexo HLA-peptídeo. Esse anticorpo deve ter um modo de ligação muito semelhante ao 17363N, e, portanto, diferente dos 17670P 17675P, 17930N2 e 21064P.

[00287] A presente invenção não deve ser limitada no âmbito de aplicação pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, diver- sas modificações da invenção, além daquelas aqui descritas, se torna- rão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição acima e das figuras anexas. Essas modificações fazem parte do âmbi- to de aplicação das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de ligação ao antígeno isolada que se liga es- pecificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (peptídeo HPV16E7), caracterizada pelo fato de que o epítopo conformacional compreende um ou mais aminoácidos da SEQ ID nº: 537, seleciona- dos do grupo que consiste em Y11, D14, L15, P17 e E18.

2. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno tem uma propriedade selecionada do grupo consistindo em: (a) liga o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 monomérico com uma constante de equilíbrio de dissociação (kD) inferior a cerca de 20nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25 °C; (b) liga o peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 monomérico com uma constante de equilíbrio de dissociação (kD) inferior a cerca de 25 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25 °C; (c) liga-se a células que expressam o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 a inferior a cerca de 6 nM e não se liga a células que expressam os peptídeos não alvo previstos, confor- me determinado por ensaio de luminescência; (d) liga-se a células que expressam o peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 a inferior a cerca de 1 nM e não se liga substancialmente a células que expressam peptídeos fora do alvo previstos, conforme determinado por ensaio de luminescência; (e) liga-se a células que expressam o peptídeo 11-19 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 30 nM, conforme determinado por ensaio de citometria de fluxo; e

(f) liga-se a células que expressam o peptídeo 82-90 HLA-A2:HPV16E7 com um EC50 inferior a cerca de 75nM, conforme determinado por ensaio de citometria de fluxo.

3. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo HPV16E7 compreende a sequência de aminoácidos da YMLDLQPET (SEQ ID nº: 538).

4. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo de comprimento to- tal, um Fab, um Fab’, um (Fab’)2, um Fv, um Fv de cadeia única (scFv), um contruto de Corpo T ou um CAR.

5. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal humano, ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

6. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende três regiões determinantes da complementaridade da ca- deia pesada (CDRs) (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências da região variável da cadeia pesada (HCVR) listadas na Tabela 1; e três CDRs da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências da região variável da cadeia leve (LCVR) listadas na Tabela 1.

7. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende uma HCVR com uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas sequências da HCVR listadas na Ta- bela 1.

8. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas sequências da LCVR listadas na Ta- bela 1.

9. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma HCVR com uma sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste nas sequências da HCVR listadas na Tabela 1; e (b) uma LCVR com uma sequência de aminoácidos seleci- onada do grupo que consiste nas sequências da LCVR listadas na Ta- bela 1.

10. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um domínio da HCDR1 com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508 e 524; (b) um domínio da HCDR2 com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510 e 526; (c) um domínio da HCDR3 com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512 e 528; (d) um domínio da LCDR1 com uma sequência de amino-

ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 204, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516 e 532; (e) um domínio da LCDR2 com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158,174, 190, 206, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518 e 534; e (f) um domínio da LCDR3 com uma sequência de amino- ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144,160, 176, 192, 208, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520 e

536.

11. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/202, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/290, 298/306, 314/322, 330/338, 346/354, 362/370, 378/386, 394/402, 410/418, 426/434, 442/450, 458/466, 474/482, 490/498, 506/514 e 522/530.

12. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID nos: 2/10, 34/42, 82/90, 194/202, 282/290 e 506/514.

13. Proteína de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compete por ligação a uma proteína de ligação ao an- tígeno como definida na reivindicação 11.

14. Proteína de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo que a proteína de ligação ao antígeno como definida na reivindicação 11.

15. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende uma porção detectável.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação ao antígeno isolada que se liga ao HLA-A2:HPV16E7, como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 15, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitá- vel.

17. Molécula polinucleotídica isolada, caracterizada pelo fa- to de que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma HCVR de uma proteína de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

18. Molécula polinucleotídica isolada, caracterizada pelo fa- to de que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma LCVR de uma proteína de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

19. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula polinucleotídica como definida na reivindicação 17 ou 18.

20. Célula, caracterizada pelo fato de que expressa o vetor como definido na reivindicação 19.

21. Método de tratamento de um indivíduo com uma doen- ça ou distúrbio associado ao HPV16E7, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz da proteína de ligação ao antígeno como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 15, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 16, assim tratando o indivíduo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza-

do pelo fato de que a doença ou distúrbio associado ao HPV16E7 é câncer associado ao HPV.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que o câncer associado ao HPV é o carcinoma de célu- las escamosas.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que o câncer associado ao HPV é câncer do colo do útero, câncer anogenital, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de orofaringe.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é administrada ao indivíduo em combinação com um segun- do agente terapêutico.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um inibidor de PD-1, um inibidor de CTLA-4, um anticorpo para um antígeno específico de tumor, um anticorpo para um antígeno de célula viralmente infectada, um inibidor de PD-L1, um inibidor de CD20, um anticorpo biespecífico contra CD20 e CD3, um suplemento dietético como um antioxidante, um antagonista de VEGF, um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, cirurgia, radiação, um NSAID, um corticosteroide, uma vacina anti-HPV, e qualquer outra terapia útil para atenuar pelo menos um sintoma associado à doença ou distúrbio.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 26, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é administrada por via subcutânea, endovenosa, intradérmi- ca, intraperitoneal, oral, intramuscular ou intracraniana.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é administrada a uma dose de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

29. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica um re- ceptor quimérico de antígeno (CAR), caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação extracelular que se liga es- pecificamente a um epítopo conformacional de um peptídeo 16 E7 do papilomavírus humano (HPV) exibido por HLA-A2 (o peptídeo HPV16E7), um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular.

30. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação extracelular é uma proteína de ligação ao antígeno anti-HLA- A2:HPV16E7.

31. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende três regiões determinantes da com- plementaridade da cadeia pesada (CDRs) (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências da região variável da cadeia pesada (HCVR) listadas na Tabela 1; e três CDRs da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências da região variável da cadeia leve (LCVR) listadas na Tabe- la 1.

32. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma HCVR com uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas se- quências da HCVR listadas na Tabela 1.

33. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te nas sequências da LCVR listadas na Tabela 1.

34. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende (a) uma HCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências da HCVR listadas na Tabela 1; e (b) uma LCVR com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências da LCVR listadas na Tabela 1.

35. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: (a) um domínio da HCDR1 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508 e 524; (b) um domínio da HCDR2 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510 e 526; (c) um domínio da HCDR3 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512 e 528; (d) um domínio da LCDR1 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 204, 228, 244, 260, 276,

292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516 e 532; (e) um domínio da LCDR2 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158,174, 190, 206, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518 e 534; e (f) um domínio da LCDR3 com uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID nos: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144,160, 176, 192, 208, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520 e

536.

36. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID nos: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/202, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/290, 298/306, 314/322, 330/338, 346/354, 362/370, 378/386, 394/402, 410/418, 426/434, 442/450, 458/466, 474/482, 490/498, 506/514 e 522/530.

37. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionadas dos grupo que consiste nas SEQ ID nos: 2/10, 34/42, 82/90, 194/202, 282/290 e 506/514.

38. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID nos: 540, 541, 542, 543,

544 ou 545.

39. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 38, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno isolada é um scFv.

40. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 30 a 39.

41. Célula efetora imune isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 40.

42. Célula efetora imune isolada, de acordo com a reivindi- cação 41, caracterizada pelo fato de que é um corpo-T.

43. Método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio associado ao HPV, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a célula efetora imune como de- finida na reivindicação 41 ou 42.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio associado ao HPV é câncer associado ao HPV.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o câncer associado ao HPV é o carcinoma de célu- las escamosas.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que o câncer associado ao HPV é câncer do colo do útero, câncer anogenital, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de orofaringe.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 46, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é administrada ao indivíduo em combinação com um segun- do agente terapêutico.