[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

BR112019002085A2 - triagem baseada em célula de alto rendimento para aptâmeros - Google Patents

triagem baseada em célula de alto rendimento para aptâmeros Download PDF

Info

Publication number
BR112019002085A2
BR112019002085A2 BR112019002085A BR112019002085A BR112019002085A2 BR 112019002085 A2 BR112019002085 A2 BR 112019002085A2 BR 112019002085 A BR112019002085 A BR 112019002085A BR 112019002085 A BR112019002085 A BR 112019002085A BR 112019002085 A2 BR112019002085 A2 BR 112019002085A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
library
exon
aptamer
fact
aptamers
Prior art date
Application number
BR112019002085A
Other languages
English (en)
Inventor
Forbes Alexandria
Feng Lei
Guo Xuecui
Original Assignee
Meiragtx Uk Ii Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiragtx Uk Ii Ltd filed Critical Meiragtx Uk Ii Ltd
Publication of BR112019002085A2 publication Critical patent/BR112019002085A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

a invenção fornece métodos de triagem baseada em célula eucariótica para identificar um aptâmero que se liga especificamente a um ligante, ou um ligante que se liga especificamente a um aptâmero, com o uso de um cassete de polinucleotídeo para a regulação da expressão de um gene repórter em que o cassete de polinucleotídeo contém um riboswitch no contexto de um íntron 3' de éxon alternativo de íntron 5'. o riboswitch compreende uma região efetora e um aptâmero de modo que, quando o aptâmero se ligar a um ligante, a expressão de gene repórter ocorra.

Description

“TRIAGEM BASEADA EM CÉLULA DE ALTO RENDIMENTO PARA APTÂMEROS”
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção fornece métodos de triagem para identificar um aptâmero que se liga especificamente a um ligante, ou a ligante que se liga especificamente a um aptâmero, numa célula eucariótica com o uso de um cassete de polinucleotídeo para a regulação da expressão de um gene repórter em que o cassete de polinucleotídeo contém um riboswitch no contexto de um íntron 3' de éxon alternativo de íntron 5'. O riboswitch compreende uma região efetora e um aptâmero de modo que, quando o aptâmero se ligar a um ligante, a expressão de gene repórter ocorra.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] A emenda se refere ao processo pelo qual a sequência intrônica é removida do RNA pré-mensageiro nascente (pré-mRNA) e os éxons são unidos para formar o mRNA. Os locais de emenda são junções entre éxons e introns, e são definidos por sequências de consenso diferentes nas extremidades 5' e 3' do íntron (isto é, o doador de emenda e locais aceitantes de emenda, respectivamente). A emenda de pré-mRNA alternativa, ou emenda alternativa, é um processo disseminado que ocorre na maioria dos genes humanos que contêm múltiplos éxons. A mesma é executada por uma estrutura grande de múltiplos componentes chamada spliceossoma que é uma coletânea de ribonucleoproteínas nucleares pequenas (snRNPs) e um arranjo diverso de proteínas auxiliares. Reconhecendo-se várias sequências reguladoras cis, o spliceossoma define delimitações de éxon/íntron, remove sequências intrônicas e emenda os éxons numa mensagem traduzível final (isto é, o mRNA). No caso de emenda alternativa, certos éxons podem ser incluídos ou excluídos para variar a mensagem de codificação final, assim mudando a proteína expressada resultante.
[003] A presente invenção utiliza o controle mediado por ligante/aptâmero de emenda alternativa para identificar pares de aptâmero/ligante que se ligam no contexto de uma célula eucariótica-alvo. Antes da presente invenção, os aptâmeros foram gerados contra uma variedade de ligantes através de triagem in vitro, entretanto, poucos se demonstraram eficazes em células, o que destaca uma
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 7/78
2/55 necessidade por sistemas para triar aptâmeros que funcionam no organismo de escolha.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] Num aspecto, a presente invenção fornece um método para selecionar um aptâmero que se liga a um ligante em células eucarióticas que compreende as etapas de:
[005] (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros, [006] (b) introduzir membros da biblioteca de aptâmeros num cassete de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter para criar uma biblioteca de riboswitches, [007] (c) introduzir a biblioteca de riboswitches em células eucarióticas, e [008] (d) colocar as células eucarióticas em contato com um ligante, e [009] (e) medir a expressão do gene repórter, [010] em que o cassete de polinucleotídeo compreende um éxon alternativamente emendado, flanqueado por um íntron 5' e um íntron 3', e um riboswitch que compreende (I) uma região efetora que compreende um tronco que inclui o local de emenda 5' do íntron 3', e (li) um aptâmero, em que o éxon alternativamente emendado compreende um códon de parada que está em quadro com o gene repórter quando o éxon alternativamente emendado é emendado no mRNA de gene repórter.
[011] Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende aptâmeros que têm um ou mais nucleotídeos randomizados. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende aptâmeros que têm sequências completamente randomizadas. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende aptâmeros que têm entre cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende aptâmeros que têm entre cerca de 30 a cerca de 100 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende mais do que 100000 aptâmeros. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros compreende mais do que 1000000 aptâmeros.
[012] Numa modalidade, o ligante é uma molécula pequena. Numa modalidade, o ligante de molécula pequena é exógeno à célula eucariótica. Em
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 8/78
3/55 outra modalidade, o ligante é uma molécula produzida pela célula eucariótica incluindo, por exemplo, um metabolite, ácido nucleico, vitamina, cofator, lipídio, monossacarídeo e segundo mensageiro.
[013] Numa modalidade, a célula eucariótica é selecionada dentre uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de planta e uma célula de levedura. Numa modalidade, a célula eucariótica é derivada de um camundongo, um ser humano, uma mosca (por exemplo, Drosophila melanogaster), um peixe (por exemplo, Danio rerio) ou um verme de nemátodo (por exemplo, Caenorhabditis elegans).
[014] Numa modalidade, o gene repórter é selecionado do grupo que consiste numa proteína fluorescente, luciferase, β-galactosidase e rábano peroxidase. Numa modalidade, o gene repórter é uma citocina, uma molécula de sinalização, um hormônio de crescimento, um anticorpo, um RNA regulador, uma proteína terapêutica ou um peptídeo. Numa modalidade, a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 10 vezes mais alta quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente. Em modalidades adicionais, a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 20, 50, 100, 200, 500 ou 1000 vezes mais alta quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente.
[015] Numa modalidade, os introns 5' e 3' são derivados do intron 2 do gene de β-globina humano. Numa modalidade, o íntron 5' compreende um códon de parada em armação com o gene-alvo. Numa modalidade, os introns 5' e 3' são, cada um, independentemente, de cerca de 50 a cerca de 300 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, os introns 5' e 3' são, cada um, independentemente, de cerca de 125 a cerca de 240 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, os introns 5' e/ou 3' foram modificados para incluir ou alterar a sequência de um acentuador de emenda de íntron, um acentuador de emenda de íntron, um local de emenda 5', um local de emenda 3' ou a sequência de ponto de ramificação.
[016] Numa modalidade, o tronco de região efetora do riboswitch tem cerca de 7 a cerca de 20 pares de base em comprimento. Numa modalidade, o tronco de
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 9/78
4/55 região efetora tem 8 a 11 pares de base em comprimento.
[017] Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é derivado do éxon 2 do gene de di-hidrofolato redutase humano (DHFR), tumor Wilms humano mutante 1 éxon 5, éxon delta proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II de camundongo 16, ou éxon SIRT1 6. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é o éxon de DHFR modificado 2. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado foi modificado num ou mais do grupo que consiste em alterar a sequência de um silenciador de emenda de éxon, alterar a sequência de um acentuador de emenda de éxon, adicionar um acentuador de emenda de éxon, e adicionar um doador de emenda de éxon. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é sintético (isto é, não derivado de um éxon de ocorrência natural).
[018] Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros é dividida numa biblioteca de aptâmeros menor antes de introduzir a mesma nos cassetes de polinucleotídeo que compreendem as etapas:
[019] (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros randomizados, em que os aptâmeros na biblioteca compreendem múltiplas regiões constantes 5’ e 3’ e um ou mais nucleotídeos randomizados, [020] (b) realizar um PCR de dois ciclos com o uso da biblioteca de aptâmeros randomizados como o modelo e um primeiro iniciador e segundo iniciador que são complementares às regiões constantes 5’ e 3’, [021] (c) isolar os produtos do PCR de dois ciclos, e [022] (d) PCR amplificar um subconjunto dos produtos isolados do PCR de dois ciclos com o uso de múltiplos de iniciadores complementares a um subconjunto das regiões constantes 5’ e 3’ únicas.
[023] Numa modalidade, a biblioteca de riboswitches é dividida numa ou mais sub-bibliotecas de riboswitches antes de ser introduzido nas células eucarióticas. Numa modalidade, o método para dividir a biblioteca de riboswitch em sub-bibliotecas compreende as etapas de:
[024] (a) introduzir uma biblioteca de aptâmeros num plasmídeo que compreende um cassete de polinucleotídeo de regulação de gene para produzir a biblioteca de riboswitches;
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 10/78
5/55 [025] (b) introduzir a biblioteca de riboswitches nas bactérias (por exemplo, E. coli)·, e [026] (c) coletar clones bacterianos (por exemplo, selecionando-se colônias bacterianas) e extrair DNA de plasmídeo para obter sub-bibliotecas de plasmídeo de riboswitches (denominadas no presente documento como sub-bibliotecas primárias);
[027] Nas modalidades, as sub-bibliotecas secundárias de riboswitches são geradas a partir de uma sub-biblioteca primária de plasmídeos de riboswitches introduzindo-se uma sub-biblioteca primária em bactérias, coletando clones bacterianos e isolando o DNA de plasmídeo. A sub-biblioteca primária ou secundária é, então, introduzida em células eucarióticas, as células eucarióticas em contato com um ligante, e a expressão do gene repórter é medida para determinar a possibilidade de um ou mais aptâmeros na biblioteca se ligarem ao ligante no contexto da célula eucariótica.
[028] Numa modalidade, a presente invenção inclui um aptâmero que se liga a um ligante-alvo, em que o aptâmero é selecionado pelos métodos acima. Em modalidades da invenção, o aptâmero compreende a sequência da SEQ ID NO: 14 a 27. Numa modalidade, a sequência de aptâmero compreende a sequência da SEQ ID NO: 24.
[029] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar um ligante que se liga a um aptâmero numa célula eucariótica que compreende as etapas de:
[030] (a) fornecer uma biblioteca de ligantes, [031 ] (b) fornecer um cassete de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter, [032] (c) introduzir o cassete de polinucleotídeo na célula eucariótica, [033] (d) colocar grupos individuais da célula eucariótica em contato com membros da biblioteca de ligantes, e [034] (e) medir a expressão do gene repórter, [035] em que o cassete de polinucleotídeo compreende um éxon alternativamente emendado, flanqueado por um íntron 5' e um íntron 3', e um riboswitch que compreende (i) uma região efetora que compreende um tronco que
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 11/78
6/55 inclui o local de emenda 5' do intron 3', e (li) um aptâmero, em que o éxon alternativamente emendado compreende um códon de parada que está em quadro com o gene repórter quando o éxon alternativamente emendado é emendado no mRNA de gene repórter.
[036] Numa modalidade, o ligante é uma molécula pequena. Numa modalidade, o ligante de molécula pequena é exógeno à célula eucariótica. Em outra modalidade, o ligante é uma molécula produzida pela célula eucariótica incluindo, por exemplo, um metabólito, ácido nucleico, vitamina, cofator, lipídio, monossacarídeo e segundo mensageiro.
[037] Numa modalidade, a célula eucariótica é selecionada dentre uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de planta e uma célula de levedura. Numa modalidade, a célula eucariótica é derivada de um camundongo, um ser humano, uma mosca (por exemplo, Drosophila melanogaster), um peixe (por exemplo, Danio rerio) ou um verme de nemátodo (por exemplo, Caenorhabditis elegans).
[038] Numa modalidade, o gene repórter é selecionado do grupo que consiste numa proteína fluorescente, luciferase, β-galactosidase e rábano peroxidase. Numa modalidade, o gene repórter é uma citocina, uma molécula de sinalização, um hormônio de crescimento, um anticorpo, um RNA regulador, uma proteína terapêutica ou um peptídeo. Numa modalidade, a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 10 vezes mais alta quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente. Em modalidades adicionais, a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 20, 50, 100, 200, 500 ou 1000 vezes mais alta quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente.
[039] Numa modalidade, os introns 5' e 3' são derivados do intron 2 do gene de β-globina humano. Numa modalidade, o íntron 5' compreende um códon de parada em armação com o gene-alvo. Numa modalidade, os introns 5' e 3' são, cada um, independentemente, de cerca de 50 a cerca de 300 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, os introns 5' e 3' são, cada um, independentemente, de cerca de 125 a cerca de 240 nucleotídeos em
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 12/78
7/55 comprimento. Numa modalidade, os introns 5' e/ou 3' foram modificados para incluir ou alterar a sequência de um acentuador de emenda de intron, um acentuador de emenda de éxon, um local de emenda 5', um local de emenda 3' ou a sequência de ponto de ramificação.
[040] Numa modalidade, o tronco de região efetora do riboswitch tem cerca de 7 a cerca de 20 pares de base em comprimento. Numa modalidade, o tronco de região efetora tem 8 a 11 pares de base em comprimento.
[041] Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é derivado do éxon 2 do gene de di-hidrofolato redutase humano (DHFR), tumor Wilms humano mutante 1 éxon 5, éxon delta proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II de camundongo 16, ou éxon SIRT1 6. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é um éxon de DHFR modificado 2. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado foi modificado num ou mais do grupo que consiste em alterar a sequência de um silenciador de emenda de éxon, alterar a sequência de um acentuador de emenda de éxon, adicionar um acentuador de emenda de éxon, e adicionar um doador de emenda de éxon. Numa modalidade, o éxon alternativamente emendado é sintético (isto é, não derivado de um éxon de ocorrência natural).
[042] Numa modalidade, a presente invenção inclui um ligante selecionado pelos métodos acima.
[043] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para dividir uma biblioteca de aptâmeros randomizados em sub-bibliotecas de aptâmero menores que compreende as etapas:
[044] (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros randomizados, em que os aptâmeros na biblioteca compreendem múltiplas regiões constantes 5’ e 3’ e um ou mais nucleotídeos randomizados, [045] (b) realizar um PCR de dois ciclos com o uso da biblioteca de aptâmeros randomizados como o modelo e primeiros iniciadores e segundos iniciadores que são complementares ás regiões constantes 5' e 3', [046] (c) isolar os produtos do PCR de dois ciclos, e [047] (d) PCR amplificar um subconjunto dos produtos isolados do PCR de dois ciclos com o uso de iniciadores complementares a um subconjunto das regiões
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 13/78
8/55 constantes 5’ e 3’ únicas.
[048] Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende aptâmeros que têm um ou mais nucleotideos randomizados. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende mais do que cerca de 100000 aptâmeros. Numa modalidade, a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende mais do que cerca de 1000000 aptâmeros.
[049] Numa modalidade, o primeiro ou segundo iniciador no PCR de dois ciclos compreende um identificador selecionado do grupo que consiste em biotina, digoxigenina (DIG), bromodesoxiuridina (BrdU), fluoróforo, um grupo químico, por exemplo, grupo tiol, ou um grupo químico, por exemplo, azidas, usado na Química Click.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [050] Figura 1a. Esquemática do construto de riboswitch. Uma sequência de íntron de beta-globina truncada foi inserida na sequência de codificação do gene repórter, e um éxon de DHFR que contém códon de parada mutante 2 (mDHFR) foi colocado no íntron inserido formando, deste modo, uma plataforma de expressão de gene de três éxons pela qual a expressão de gene repórter é regulada por inclusão/exclusão do éxon de mDHFR. Uma estrutura em formato de grampo/tronco é formada incluindo o local de ligação U1 no íntron a jusante (3') do éxon de mDHFR com a sequência complementar projetado ao local de ligação U1, que bloqueia a ligação U1, assim levando à exclusão do códon de parada que contém o éxon de mDHFR e a expressão de gene-alvo. A sequência de aptâmero é enxertada entre o local de ligação U1 e sua sequência complementar, o que permite o controle de formação de grampo por ligação de aptâmero/ligante.
[051] Figura 1b. Respostas de dose de construtos com cassetes reguladores que contêm riboswitches baseados em aptâmero diferentes. Os riboswitches de guanina induziram a expressão de gene repórter respondendo-se não apenas à guanina, como também ao tratamento de guanosina.
[052] Figuras 1c e 1d. Gráfico que demonstra que o riboswitch xpt-G17 induz à atividade de luciferase mediante tratamento com análogos de guanina.
[053] Figura 1 e. Indução em vezes de atividade de luciferase por riboswitch xpt-G17 mediante tratamento com compostos.
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 14/78
9/55 [054] Figura 2. Esquemática de um modelo para gerar sequências de aptâmero randomizado. A sequência de aptâmero (barra branca) é flanqueada por regiões constantes (barras pretas) que contêm local de Bsal para facilitar a clonagem de aptâmero num cassete de regulação de gene para gerar riboswitches.
[055] Figuras 3a a 3e. Descrição esquemática do método para dividir biblioteca de aptâmeros randomizados grande em sub-bibliotecas menores.
[056] Figura 3a. O diagrama esquemático da estratégia de duas etapas para dividir uma biblioteca de aptâmeros grande. A primeira etapa é adicionar um par único de etiquetas de sequência a cada modelo de oligonucleotídeo de aptâmero. Após a primeira etapa, os modelos com sequências de etiqueta única são amplificados com o uso de iniciadores que são específicos a sequências etiquetadas.
[057] Figura 3b. Três abordagens para afixar sequências de etiqueta a modelos: sequências de etiqueta incorporadas através de PCR com o uso de iniciadores que contêm sequências de etiqueta na extremidade 5' de iniciadores (I); sequências de etiqueta afixadas ligando-se a sequência de modelo de filamento único com sequências de etiqueta com filamento único por T4 RNA ligase (II); as sequências de etiqueta ligadas a modelos ligando-se sequências de modelo de filamento duplo com sequência de etiqueta de filamento duplo por T4 DNA ligase (III).
[058] Figura 3c. Diagrama esquemático de PCR de dois ciclos. Para o ciclo 1, apenas os iniciadores reversos JR que contêm a sequência de etiqueta na extremidade 5'. Após o primeiro ciclo, o filamento recém-sintetizado tem uma etiqueta de sequência em sua extremidade 5'. Para o ciclo 2, o iniciador direto identificado por biotina JF é adicionado à reação de PCR, a qual pode usar apenas o filamento recém-sintetizado como modelo, gerando, deste modo, os modelos com sequências de etiqueta em ambas as extremidades 5' e 3' e uma molécula de biotina na extremidade 5'.
[059] Figura 3d. Geração de biblioteca de aptâmeros etiquetada. Após identificar os modelos com etiquetas de sequência e molécula de biotina, as microesferas de estreptavidina são usadas para separar os modelos com filamento único identificados/etiquetados do resto dos componentes de reação através da
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 15/78
10/55 desnaturação dos oligos e lavagem de microesferas. Então, os modelos etiquetados são amplificados e expandidos com o uso de uma mistura de iniciadores (iniciadores F e R) que são específicos às sequências etiquetadas gerando, deste modo, a biblioteca de aptâmeros etiquetada que está pronta para PCR subsequente com o uso de um único par de etiqueta iniciadores específicos de sequência de etiqueta para gerar sub-bibliotecas da biblioteca de aptâmeros original.
[060] Figura 3e. Sub-bibliotecas de aptâmeros são PCR amplificadas com o uso da estratégia de divisão. A biblioteca de aptâmeros (106, gerado como no Exemplo 2) foi etiquetada por PCR com o uso de 2 iniciadores diretos (JF1-2) e 8 iniciadores reversos (JR1 -8), com número de cópia de modelo em 1,2,3 ou 4,6. Os modelos etiquetados isolados foram expandidos por uma mistura de iniciadores específicos de etiqueta F1-2 e R1-8, e os produtos de PCR foram submetidos a PCR com iniciadores universais (painel esquerdo), par único de iniciadores específicos de etiqueta F1 e R1 (painel intermediário) ou iniciadores não relevantes de par único de F3 e R1 (painel direito). A água foi usada como controle em branco para modelos.
[061] Figura 4. Teste de sensibilidade em ensaio baseado em célula para triagem de biblioteca de riboswitches. O construto xpt-G17 foi misturado com o construto SR-mut em razões moleculares diferentes, e o DNA de construto misturado foi transfectado em células HEK-293 e tratado com guanina. A indução em vezes de atividade de luciferase foi calculada como atividade de luciferase induzida com guanina dividida por atividade de luciferase obtida sem tratamento de guanina.
[062] Figura 5a. Diagrama esquemático de construção de uma biblioteca de plasmídeo que contém riboswitch. Os oligos de aptâmero de filamento único são, primeiro, PCR amplificados com o uso de iniciadores universais para converter modelo de aptâmero com filamento único para com filamento duplo. Os oligos com filamento duplo são, então, digeridos com Bsal e ligados ao vetor digerido por Bsal para gerar construtos com riboswitches. O DNA de plasmídeo é, então, eletroporado em células de DH5a eletrocompetentes. Mais do que 5x106 colônias são colhidas para cobrir mais do que 99% da biblioteca de aptâmeros inicial (106).
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 16/78
11/55 [063] Figura 5b. Diagrama esquemático de biblioteca de plasmídeo de divisão de riboswitches para sub-bibliotecas. A biblioteca de plasmídeos de riboswitches é transformada em células DH5a quimicamente competentes. Então, as bactérias transformadas são transferidas para placa em placas de ágar. Certos números de colônias bacterianas são coletados de cada placa de ágar individual e o DNA de plasmídeo é extraído da coletânea de colônia individual separadamente. O DNA de plasmídeo obtido a partir de cada coletânea de colônias forma a subbiblioteca de riboswitch. A abordagem de divisão pode ser repetida até o tamanho desejado de sub-bibliotecas ser alcançado.
[064] Figura 5c. Composição de sequência única de sub-bibliotecas secundárias do riboswitch determinada por Sequenciamento de Próxima Geração. As sequências com mais do que 12 leituras da execução de sequenciamento foram consideradas sequências verdadeiras.
[065] Figura 5d. Comparação de composição de sequência única entre duas sub-bibliotecas secundárias que são geradas a partir da mesma sub-biblioteca primária P1S_003. Um gráfico circular indica o número de sequências únicas em cada sub-biblioteca e o número das sequências de sobreposição entre as duas bibliotecas de riboswitches.
[066] Figura 5e. Comparação de composição de sequência única entre duas sub-bibliotecas secundárias que são geradas a partir de sub-bibliotecas primárias diferentes, P1S_003 e P1S_007, respectivamente. Um gráfico circular indica o número de sequências únicas em cada sub-biblioteca e o número das sequências de sobreposição entre as duas bibliotecas de riboswitches.
[067] Figuras 6a e 6b. O DNA de plasmídeo de 6 dentre 100 sub-bibliotecas primárias (60k) (Figura 6a) ou 100 sub-bibliotecas secundárias (tamanho de 600) (Figura 6b) foi arranjado no formato de placa de 96 poços, e transfectado em células HEK-293. A indução em vezes de atividade de luciferase foi calculada como atividade de luciferase induzida com guanina dividida por atividade de luciferase obtida sem tratamento de guanina.
[068] Figura 6c. Resultados de triagem de sub-biblioteca de riboswitches com o uso de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+), como ligante. As subbibliotecas de biblioteca de riboswitches P2 foram dispostos em formato de 96
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 17/78
12/55 poços. As células HEK293 foram transferidas para placa em placa de 96 poços e transfectadas com DNAs de biblioteca de riboswitches. Quatro horas após transfecção, as células foram tratadas com NAD+ 100 μΜ. A atividade de luciferase foi medida 20 horas após tratamento de NAD+. A indução foi calculada como a razão entre a atividade de luciferase obtida a partir de células tratadas com NAD+ divididas pela atividade de luciferase obtida a partir de células sem tratamento de NAD+. Cada ponto no gráfico de pontos representa a indução em vezes de uma sub-biblioteca ou construto G17 conforme indicado.
[069] Figura 6d. Resultados de triagem de riboswitch com o uso de NAD+ como ligante. Cada construto de riboswitch individual foi disposto em formato de 96 poços. As células HEK 293 foram transferidas para placa em placa de 96 poços e transfectadas com construtos de riboswitch. 4 horas após transfecção, as células foram tratadas com NAD+ 100 μΜ. A atividade de luciferase foi medida 20 horas após tratamento de NAD+. A indução foi calculada como a razão entre a atividade de luciferase obtida a partir de células tratadas com NAD+ divididas pela atividade de luciferase obtida a partir de células sem tratamento de NAD+. Cada ponto no gráfico de pontos representa a indução em vezes de cada construto de riboswitch único ou construto G17 conforme indicado.
[070] Figura 6e e 6f. O construto com sequência de aptâmero nova mostra a resposta acentuada a tratamento de NAD+ de maneira dependente de dose em comparação com o riboswitch G17. As células HEK 293 foram transfectadas com o construto G17 ou #46 com sequência de aptâmero nova. 4 horas após a transfecção, as células foram tratadas com doses diferentes de NAD+. A atividade de luciferase foi medida 20 horas após tratamento de NAD+. A indução foi calculada como a razão entre a atividade de luciferase obtida a partir de células tratadas com NAD+ divididas pela atividade de luciferase obtida a partir de células sem tratamento de NAD+.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
MÉTODOS DE TRIAGEM DE APTÂMERO/LIGANTE [071] A presente invenção fornece métodos de triagem para identificar aptâmeros para se ligar a um ligante, e ligantes que se ligam a um aptâmero, no contexto de uma célula eucariótica, tecido ou organismo. Num aspecto, a presente
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 18/78
13/55 invenção fornece um método para selecionar um aptâmero que se liga a um ligante em células eucarióticas que compreende as etapas de:
[072] (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros, [073] (b) introduzir membros da biblioteca de aptâmeros em cassetes de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter, [074] (c) introduzir o aptâmero que contém cassetes de polinucleotídeo em células eucarióticas, e [075] (d) colocar as células eucarióticas em contato com um ligante, e [076] (e) medir a expressão do gene repórter.
[077] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar um ligante que se liga a um aptâmero numa célula eucariótica que compreende as etapas de:
[078] (a) fornecer uma biblioteca de ligantes, [079] (b) fornecer um cassete de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter, [080] (c) introduzir o cassete de polinucleotídeo na célula eucariótica, [081] (d) colocar grupos individuais da célula eucariótica em contato com membros da biblioteca de ligantes, e [082] (e) medir a expressão do gene repórter.
[083] Numa modalidade, a invenção fornece métodos para identificar aptâmeros que se ligam a moléculas intracelulares que compreendem as etapas de:
[084] (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros, [085] (b) introduzir membros da biblioteca de aptâmeros em cassetes de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter, [086] (c) introduzir o aptâmero que contém cassetes de polinucleotídeo em células eucarióticas, e [087] (d) medir a expressão do gene repórter.
[088] Os métodos de triagem da presente invenção utilizam os cassetes de polinucleotídeo de regulação de gene revelados no documento nQ PCT/US2016/016234, o qual é incorporado em sua totalidade ao presente documento, a título de referência. Estes cassetes de regulação de gene
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 19/78
14/55 compreendem um riboswitch no contexto de um intron 3' de éxon alternativo de intron 5'. O cassete de regulação de gene se refere a um construto de DNA recombinante que, quando incorporado ao DNA de um gene-alvo (por exemplo, um gene repórter), fornece a habilidade para regular a expressão do gene-alvo por emenda alternativa mediada por aptâmero/ligante do pré-mRNA resultante. O cassete de regulação de gene compreende adicionalmente um riboswitch que contém uma região de sensor (por exemplo, um aptâmero) e uma região efetora que são juntos responsáveis por detectar a presença de um ligante que se liga ao aptâmero e altera a emenda a um éxon alternativo. Estes riboswitches acionados por aptâmero fornecem a regulação de expressão de gene mamífero a uma indução de 2 a 2000 vezes, em resposta ao tratamento com o ligante que liga o aptâmero. A faixa reguladora dinâmica alta sem precedentes deste riboswitch sintético é usada nos métodos da presente invenção para fornecer sistemas de triagem para aptâmeros novos contra tipos desejados de ligantes, assim como para ligantes otimizados contra aptâmeros conhecidos e inovadores em células, tecidos e organismos.
RIBOSWITCH [089] O termo “riboswitch” conforme usado no presente documento se refere a um segmento regulador de um polinucleotídeo de RNA (ou o DNA que codifica o polinucleotídeo de RNA). Um riboswitch no contexto da presente invenção contém uma região de sensor (por exemplo, um aptâmero) e uma região efetora que, juntos, são responsáveis por detectar a presença de um ligante (por exemplo, uma molécula pequena) e alterar a emenda para um éxon alternativo. Numa modalidade, o riboswitch é recombinante, com a utilização de polinucleotideos a partir de duas ou mais fontes. O termo “sintético”, conforme usado no presente documento, no contexto de um riboswitch, se refere a um riboswitch que não é de ocorrência natural. Numa modalidade, as regiões de sensor e efetor são unidas por um ligante de polinucleotídeo. Numa modalidade, o ligante de polinucleotídeo forma um tronco de RNA (isto é, uma região do polinucleotídeo de RNA que tem filamento duplo).
[090] Uma biblioteca de riboswitches conforme descrito no presente documento compreende uma pluralidade de sequências de aptâmero que diferem
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 20/78
15/55 por um ou mais nucleotídeos no contexto dos cassetes de polinucleotídeo para a expressão mediada por ligante de um gene repórter. Deste modo, cada aptâmero na biblioteca, juntamente com uma região de sensor, está no contexto de um íntron 3' de éxon alternativo de íntron 5', conforme descrito no presente documento.
REGIÃO EFETORA [091 ] Numa modalidade, a região efetora compreende o local de emenda 5' (“5' ss”) sequência do íntron 3' (isto é, a sequência de local de emenda intrônica que é imediatamente 3' do éxon alternativo). A região efetora compreende a sequência 5' ss do íntron 3' e a sequência complementar à sequência 5' ss do íntron 3'. Quando o aptâmero se liga ao seu ligante, a região efetora forma um tronco e impede, deste modo, a emenda ao doador de local de emenda na extremidade 3' do éxon alternativo. Sob certas condições (por exemplo, quando o aptâmero não está ligado ao seu ligante), a região efetora está num contexto que fornece acesso ao doador de local de emenda na extremidade 3' do éxon alternativo que leva à inclusão do éxon alternativo no mRNA de gene-alvo.
[092] A porção de tronco da região efetora deve ser de um comprimento suficiente (e o teor de GC) para impedir substancialmente a emenda alternativa do éxon alternativo mediante o ligante que se liga ao aptâmero, enquanto também permite o acesso ao local de emenda quando o ligante não está presente em quantidades suficientes. Em modalidades da invenção, a porção de tronco da região efetora compreende a sequência de tronco além da sequência 5' ss do íntron 3' e sua sequência complementar. Em modalidades da invenção, esta sequência de tronco adicional compreende a sequência do tronco de aptâmero. O comprimento e a sequência da porção de tronco podem ser modificados com o uso de técnicas conhecidas a fim de identificar troncos que permitem a expressão antecedentes aceitável do gene-alvo quando nenhum ligante estiver presente e níveis de expressão aceitáveis do gene-alvo quando o ligante estiver presente. Se o tronco é, por exemplo, muito longo, o mesmo pode ocultar o acesso à sequência 5' ss do íntron 3' na presença ou ausência de ligante. Se o tronco for muito curto, o mesmo não pode formar um tronco estável com capacidade para sequestrar a sequência 5' ss do íntron 3', no caso em que o éxon alternativo será emendado à mensagem de gene-alvo na presença ou ausência de ligante. Numa modalidade, o
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 21/78
16/55 comprimento total do tronco de região efetora está entre cerca de 7 pares de base a cerca de 20 pares de base. Em algumas modalidades, o comprimento do tronco está entre cerca de 8 pares de base a cerca de 11 pares de base. Em algumas modalidades, o comprimento do tronco tem 8 pares de base a 11 pares de base. Além do comprimento do tronco, o teor de par de base GC do tronco pode ser alterado para modificar a estabilidade do tronco.
APTÂMERO/LIGANTE [093] O termo “aptâmero”, conforme usado no presente documento, se refere a um polinucleotídeo de RNA (ou o DNA que codifica o polinucleotídeo de RNA) que se liga especificamente a um ligante ou a um polinucleotídeo de RNA que é triado para identificar a ligação específica a um ligante (isto é, um aptâmero prospective). Uma biblioteca de aptâmeros é uma coletânea de aptâmeros prospectivos que compreende múltiplos aptâmeros prospectivos que têm uma sequência de nucleotídeo que difere de outros membros da biblioteca por pelo menos um nucleotídeo.
[094] O termo “ligante” se refere a uma molécula que é especificamente ligada por um aptâmero, ou a um ligante prospective que está sendo triado para a habilidade para se ligar a um ou mais aptâmeros. Uma biblioteca de ligantes é uma coletânea de ligantes e/ou ligantes prospectivos.
[095] Numa modalidade, o ligante é uma molécula de baixo peso molecular (menor do que cerca de 1.000 Daltons) incluindo, por exemplo, lipídios, monossacarídeos, segundos mensageiros, cofatores, íons de metal, outros produtos naturais e metabolites, ácidos nucleicos, assim como a maioria dos fármacos terapêuticos. Numa modalidade, o ligante é um polinucleotídeo com 2 ou mais bases de nucleotídeo.
[096] Numa modalidade, o ligante é selecionado do grupo que consiste em 8-azaguanina, 5'-monofosfato monoidratado de adenosina, anfotericina B, avermectina B1, azatioprina, acetato de clormadinona, mercaptopurina, cloridrato de moricizina, N6-metiladenosina, nadida, progesterona, cloridrato de promazina, pamoato de pirvínio, sulfaguanidina, propionato de testosterona, tioguanosina, Tiloxapol e Vorinostat.
[097] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção são
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 22/78
17/55 usados para identificar um ligante que é uma molécula intracelular que se liga ao aptâmero (isto é, um ligante endógeno) no cassete de polinucleotídeo assim causando a expressão do gene repórter. Por exemplo, as células com um gene repórter que contêm o cassete de polinucleotídeo para a expressão mediada por aptâmero/ligante, podem ser expostas a uma condição, como calor, crescimento, transformação ou mutação, levando às mudanças em moléculas de sinalização de célula, metabolites, peptídeos, lipídios, íons (por exemplo, Ca2+), etc. que pode se ligar ao aptâmero e causar expressão do gene repórter. Deste modo, os métodos da presente invenção, podem ser usados para identificar aptâmeros que se ligam a ligantes intracelulares em resposta às mudanças no estado de célula, incluindo, por exemplo, uma mudança na sinalização de célula, metabolismo de célula, ou mutações nas células. Em outra modalidade, a presente invenção é usada para identificar aptâmeros que se ligam a ligantes intracelulares presentes em células diferenciadas. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados para identificar os ligantes ou aptâmeros que se ligam aos ligantes que estão presentes em células de tronco pluripotentes induzidas. Numa modalidade, os métodos da presente invenção podem ser usados para triar para resposta à diferenciação de célula in vivo, ou mudanças fisiológicas de células in vivo.
[098] Os ligantes aptâmeros também podem ser componentes endógenos de célula que aumentam de modo significativo sob condições fisiológicas/patológicas específicas, como transformação oncogênica-os mesmos podem incluir segundas moléculas mensageiras, como GTP ou GDP, cálcio; ácidos graxos ou ácidos graxos que são incorretamente metabolizados como 13-HODE em câncer de mama (Flaherty, JT et al., Pios One, Volume 8, e63076, 2013, incorporado ao presente documento a título de referência); aminoácidos ou metabolites de aminoácido; metabólitos na via de glicólise que tem níveis usualmente mais altos em células de câncer ou em células normais em doenças metabólicas; e moléculas associadas a câncer, como Ras ou proteína de Ras mutante, EGFR mutante em câncer de pulmão, indolamina-2,3-desoxigenase (IDO) em muitos tipos de cânceres. Os ligantes endógenos incluem metabólitos de progesterona em câncer de mama, conforme revelado por JP Wiebe (EndocrineRelated Cancer (2006) 13:717 a 738, incorporado ao presente documento, a título
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 23/78
18/55 de referência). Os ligantes endógenos também incluem metabolites com níveis aumentados resultantes de mutações em enzimas metabólicas principais em câncer de rim, como lactato, glutationa, quinurenina, conforme revelado por Minton, DR e Nanus, DM (Nature Reviews, Urology, Volume 12, 2005, incorporado ao presente documento, a título de referência).
[099] A especificidade da ligação de um aptâmero a um ligante pode ser definida em termos de constantes de dissociação comparativa (Kd) do aptâmero para seu ligante em comparação com a constante de dissociação do aptâmero para moléculas não relacionadas. Deste modo, o ligante é uma molécula que se liga ao aptâmero com afinidade maior do que o material não relacionado. Tipicamente, o Kd para o aptâmero em relação a seu ligante será pelo menos cerca de 10 vezes menor do que o Kd para o aptâmero com moléculas não relacionadas. Em outras modalidades, o Kd será pelo menos cerca de 20 vezes menor, pelo menos cerca de 50 vezes menor, pelo menos cerca de 100 vezes menor, e pelo menos cerca de 200 vezes menor. Um aptâmero terá tipicamente entre cerca de 15 e cerca de 200 nucleotídeos em comprimento. Mais comumente, um aptâmero terá entre cerca de 30 e cerca de 100 nucleotídeos em comprimento.
[0100] Os aptâmeros que podem ser incorporados como parte do riboswitch e triado por métodos da presente invenção pode ser um aptâmero de ocorrência natural, ou modificações dos mesmos, ou aptâmeros que são projetados de novo ou triados de modo sintético através de evolução sistêmica de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX). Os exemplos de aptâmeros que se ligam a ligantes de molécula pequena incluem, mas sem limitação, teofilina, dopamina, sulforodamina B, e celobiose canamicina A, lividomicina, tobramicina, neomicina B, viomicina, cloramfenicol, estreptomicina, citocinas, moléculas de superfície de célula e metabólitos. Para uma revisão de aptâmeros que reconhecem moléculas pequenas, consultar, por exemplo, Famulok, Science 9:324 a 9.329 (1999) e McKeague, M. & DeRosa, M.C. J. Nuc. Aci. 2012. Em outra modalidade, o aptâmero é um polinucleotídeo complementar.
[0101] Numa modalidade, o aptâmero é pré-triado para se ligar a um ligante de molécula pequena particular in vitro. Tais métodos para projetar aptâmeros incluem, por exemplo, SELEX. Os métodos para projetar aptâmeros que ligam
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 24/78
19/55 seletivamente uma molécula pequena com o uso de SELEX são revelados, por exemplo, nas Patentes nQ U.S. 5.475.096, 5.270.163, e Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014, os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. As modificações de processo de SELEX são descritas nas Patentes nQ U.S. 5.580.737 e 5.567.588, que são incorporados ao presente documento, a título de referência.
[0102] As técnicas de seleção anteriores para identificar aptâmeros envolvem geralmente preparar um agrupamento grande de moléculas de DNA ou RNA do comprimento desejado que contém uma região que é randomizada ou mutageneizada. Por exemplo, um agrupamento de oligonucleotídeo para seleção de aptâmero pode conter uma região de 20 a 100 nucleotídeos randomizados flanqueados por regiões de sequência definida que têm cerca de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento e são úteis para a ligação de iniciadores de PCR. O agrupamento de oligonucleotídeo é amplificado com o uso de técnicas de PCR padrão, ou outros meios que permitem a amplificação de sequências de ácido nucleico selecionadas. O agrupamento de DNA pode ser transcrito in vitro para produzir um agrupamento de transcrições de RNA quando um aptâmero de RNA for desejado. O agrupamento de oligonucleotídeos de RNA ou DNA é, então, submetido a uma seleção com base em sua habilidade para se ligar especificamente ao ligante desejado. As técnicas de seleção incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade, embora qualquer protocolo que permita a seleção de ácidos nucleicos com base em sua habilidade para se ligar especificamente a outra molécula possa ser usado. As técnicas de seleção para identificar aptâmeros que se ligam a moléculas pequenas e funcionam numa célula podem envolver métodos de triagem baseado em célula. No caso de cromatografia de afinidade, os oligonucleotídeos fazem contato com o ligante-alvo que foi imobilizado num substrato numa coluna ou em microesferas magnéticas. O oligonucleotídeo é preferencialmente selecionado para ligação de ligante na presença de concentrações de sal, temperaturas, e outras condições que imitam as condições fisiológicas normais. Os oligonucleotídeos no agrupamento que se ligam ao ligante são retidos na coluna ou microesfera, e as sequências de não ligação são removidas por lavagem. Os oligonucleotídeos que se ligam ao ligante são, então,
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 25/78
20/55 amplificados (após transcrição reversa se transcrições de RNA foram utilizados) por PCR (usualmente após eluição). O processo de seleção é repetido nas sequências selecionadas por um total de cerca de três a dez rondas iterativas do procedimento de seleção. Os oligonucleotídeos resultantes são, então, amplificados, clonados e sequenciados com o uso de procedimentos padrão para identificar as sequências dos oligonucleotídeos que têm capacidade para se ligar ao ligante-alvo. Uma vez que uma sequência de aptâmero foi identificada, o aptâmero pode ser adicionalmente otimizado realizando-se rondas adicionais de seleção que começam a partir de um agrupamento de oligonucleotídeos que compreendem uma sequência de aptâmero mutageneizada.
[0103] Numa modalidade, o aptâmero ou biblioteca de aptâmeros para uso na presente invenção compreende um ou mais aptâmeros identificados numa triagem de aptâmero in vitro. Numa modalidade, os aptâmeros identificados na triagem de aptâmero in vitro têm um ou mais nucleotídeos randomizados para criar uma biblioteca de aptâmeros prospectiva para uso nos métodos da presente invenção.
O ÉXON ALTERNATIVO [0104] O éxon alternativo que é parte do cassete de polinucleotídeo de regulação de gene da presente invenção pode ser qualquer sequência de polinucleotídeo com capacidade para ser transcrita a um pré-mRNA e alternativamente emendada ao mRNA do gene-alvo. O éxon alternativo que é parte do cassete de regulação de gene da presente invenção contém pelo menos uma sequência que inibe a tradução de modo que, quando o éxon alternativo for incluído no mRNA de gene-alvo, a expressão do gene-alvo deste mRNA seja impedida ou reduzida. Numa modalidade preferencial, o éxon alternativo contém um códon de parada (TGA, TAA, TAG) que está em armação com o gene-alvo quando o éxon alternativo é incluído no mRNA de gene-alvo por emenda. Nas modalidades, o éxon alternativo compreende, além de um códon de parada, ou como uma alternativa a um códon de parada, outra sequência que reduz ou impede substancialmente a tradução quando o éxon alternativo é incorporado por emenda ao mRNA de genealvo incluindo, por exemplo, um local de ligação de microRNA, o que leva à degradação do mRNA. Numa modalidade, o éxon alternativo compreende uma
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 26/78
21/55 sequência de ligação de mlRNA que resulta em degradação do mRNA. Numa modalidade, o éxon alternativo codifica uma sequência de polipeptídeo que reduz a estabilidade da proteína que contém esta sequência de polipeptídeo. Numa modalidade, o éxon alternativo codifica uma sequência de polipeptídeo que direciona a proteína que contém esta sequência de polipeptídeo para degradação.
[0105] O nível basal ou de fundo de emenda do éxon alternativo pode ser otimizado alterando-se as sequências de acentuador de emenda de éxon (ESE) e as sequências de supressor de emenda de éxon (ESS) e/ou introduzindo-se sequências ESE ou ESS no éxon alternativo. Tais mudanças à sequência do éxon alternativo podem ser alcançadas com o uso de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitação, mutagênese sítio-dirigida. Alternativamente, os oligonucleotídeos de uma sequência desejada (por exemplo, que compreendem todos ou parte do éxon alternativo) podem ser obtidos a partir de fontes comerciais e clonados no cassete de regulação de gene. A identificação de sequências ESS e ESE podem ser alcançadas por métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, com o uso de ESEfinder 3.0 (Cartegni, L. et al. ESEfinder: a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acid Research, 2003, 31 (13): 3568 a 3571) e/ou outros recursos disponíveis.
[0106] Numa modalidade, o éxon alternativo é exógeno ao gene-alvo, embora possa ser derivado de uma sequência que origina do organismo em que o gene-alvo será expressado. Numa modalidade, o éxon alternativo é uma sequência sintética. Numa modalidade, o éxon alternativo é um éxon de ocorrência natural. Em outra modalidade, o éxon alternativo é derivado de todo ou parte de um éxon conhecido. Neste contexto, “derivado” se refere ao éxon alternativo que contém a sequência que é substancialmente homóloga a um éxon de ocorrência natural, ou uma porção da mesma, mas pode conter várias mutações, por exemplo, para introduzir um códon de parada que estará em armação com a sequência de gene repórter-alvo, ou para introduzir ou deletar um acentuador de emenda de éxon, e/ou introduzir ou deletar um supressor de emenda de éxon. Numa modalidade, o éxon alternativo é derivado do éxon 2 do gene de di-hidrofolato redutase humano (DHFR), tumor Wilms humano mutante 1 éxon 5, éxon delta proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II de camundongo 16, ou éxon SIRT1 6.
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 27/78
22/55
SEQUÊNCIAS INTRÔNICAS 5' E 3' [0107] O éxon alternativo é flanqueado por sequências intrônicas 5' e 3'. As sequências intrônicas 5' e 3' que podem ser usadas no cassete de regulação de gene podem ser qualquer sequência que pode ser emendada do gene-alvo que cria o mRNA de gene-alvo ou o gene-alvo que compreende o éxon alternativo no mRNA, dependendo da presença ou ausência de um ligante que se liga ao aptâmero. Os introns 5' e 3' têm, cada um, as sequências necessárias para a emenda ocorrer, isto é, doador de emenda, aceitante de emenda e sequências de ponto de ramificação. Numa modalidade, as sequências intrônicas 5' e 3' do cassete de regulação de gene são derivadas de um ou mais introns de ocorrência natural ou uma porção dos mesmos. Numa modalidade, as sequências intrônicas 5' e 3' são derivadas de um íntron de beta-globina humana truncada 2 (IVS2A). Em outras modalidades, as sequências intrônicas 5' e 3' são derivadas do íntron de mRNA SV40 (usado no vetor pCMV-LacZ de Clontech), íntron 6 de gene triose fosfato isomerase (TPI) humano (Nott Ajit, et al. RNA. 2003, 9:6070617), ou um íntron de fator humano IX (Sumiko Kurachi et al. J. Bio. Chem. 1995,270(10), 5276), o próprio íntron endógeno do gene-alvo, ou qualquer fragmento genômico ou introns sintéticos (Yi Lai, et al. Hum Gene Ther. 2006:17(10):1036) que contêm elementos que são suficientes para emenda regulada (Thomas A. Cooper, Methods 2005 (37):331).
[0108] Numa modalidade, o éxon alternativo e riboswitch da presente invenção são projetados para estar num íntron endógeno de um gene-alvo. Isto é, o íntron (ou sequência intrônica substancialmente similar) ocorre naturalmente nesta posição do gene-alvo. Neste caso, a sequência intrônica imediatamente a montante do éxon alternativo é denominada como o íntron 5' ou sequência intrônica 5', e a sequência intrônica imediatamente a jusante do éxon alternativo é denominada como o íntron 3' ou sequência intrônica 3'. Neste caso, o íntron endógeno é modificado para conter uma sequência aceitante de emenda e sequência de doador de emenda que flanqueia as extremidades 5' e 3' do éxon alternativo.
[0109] O doador de emenda e locais aceitantes de emenda no cassete de regulação de gene da presente invenção podem ser modificados para serem
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 28/78
23/55 reforçados ou enfraquecidos. Isto é, os locais de emenda podem ser modificados para estarem mais próximos do consenso para um doador de emenda ou aceitante por métodos de clonagem padrão, mutagênese sítio-dirigida e semelhantes. Os locais de emenda que são mais similares ao consenso de emenda tendem a promover emenda e são, deste modo, reforçados. Os locais de emenda que são menos similares ao consenso de emenda tendem a impedir emenda e são, deste modo, enfraquecidos. O consenso para o doador de emenda da classe mais comum de introns (U2) é A/C A G || G T A/G A G T (em que || denota a delimitação de éxon/íntron). O consenso para o aceitante de emenda é C A G || G (em que || denota a delimitação de éxon/íntron). A frequência de nucleotídeos particulares no doador de emenda e locais aceitantes são descritas na técnica (consultar, por exemplo, Zhang, M.Q., Hum Mol Genet. 1988. 7(5):919 a 932). A força de locais de emenda 5' e 3' pode ser ajustada para modular a emenda do éxon alternativo.
[0110] As modificações adicionais aos introns 5' e 3' no cassete de regulação de gene podem ser feitas para modular a emenda incluindo modificar, deletar e/ou adicionar elementos acentuadores de emenda intrônica e/ou elementos supressores de emenda intrônica, e/ou modificar a sequência de local de ramificação.
[0111] Numa modalidade, o íntron 5' foi modificado para conter um códon de parada que estará em armação com o gene repórter. As sequências intrônicas 5' e 3' também podem ser modificadas para remover locais de emenda críptica, os quais podem ser identificados com software publicamente disponível (consultar, por exemplo, Kapustin, Y. et al. Nucl. Acids Res. 2011. 1 a 8). Os comprimentos das sequências intrônicas 5' e 3' podem ser ajustados a fim de, por exemplo, satisfazer as necessidades de tamanho para construtos de expressão viral. Numa modalidade, as sequências intrônicas 5' e 3' têm independentemente de cerca de 50 a cerca de 300 nucleotídeos em comprimento. Numa modalidade, as sequências intrônicas 5' e 3' têm independentemente de cerca de 125 a cerca de 240 nucleotídeos em comprimento.
GENES REPÓRTERES [0112] Os métodos de triagem da presente invenção utilizam um cassete de regulação de gene que é usado para regular a expressão de um gene-alvo (por
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 29/78
24/55 exemplo, um gene repórter) que pode ser expressado numa célula-alvo, tecido ou organismo. O gene repórter pode ser qualquer gene cuja expressão pode ser usada para detectar a interação específica de um ligante com o aptâmero no cassete de regulação de gene. Numa modalidade, o gene repórter codifica uma proteína fluorescente, incluindo, por exemplo, uma proteína fluorescente verde (GFP), uma proteína fluorescente ciano, uma proteína fluorescente amarela, uma proteína fluorescente laranja, uma proteína fluorescente vermelha ou uma proteína fluorescente substituível. Em outra modalidade, o gene repórter codifica uma enzima luciferase incluindo, por exemplo, luciferase de vagalume, luciferase de Renilla ou luciferase de secreção de Gaussia. Numa modalidade, o gene repórter é β-galactosidase. Numa modalidade, o repórter é rábano peroxidase (HRP). Numa modalidade, o gene repórter é selecionado do grupo que consiste numa proteína nuclear, transportador, proteína de membrana de célula, proteína de citoesqueleto, receptor, hormônio de crescimento, citocina, molécula de sinalização, RNA regulador, anticorpo, e proteínas ou peptídeos terapêuticos.
CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO [0113] A presente invenção contempla o uso de um vetor recombinante para introdução em células-alvo de um polinucleotídeo que codifica um gene repórter e que contém o cassete de regulação de gene da presente invenção. Em muitas modalidades, o construto de DNA recombinante desta invenção inclui elementos de DNA adicionais incluindo segmentos de DNA que fornecem a replicação do DNA numa célula hospedeira e expressão do gene-alvo nesta célula em níveis apropriados. A pessoa de habilidade comum observa que as sequências de controle de expressão (promotores, acentuadores e semelhantes) são selecionados com base em sua habilidade para promover a expressão do gene repórter na célula-alvo. “Vetor” significa um plasmídeo recombinante, cromossomo artificial de levedura (YAC), minicromossomo, minicírculo de DNA ou vírus (incluindo sequências derivadas de vírus) que compreende um polinucleotídeo para ser entregue numa célula hospedeira, in vitro ou in vivo. Numa modalidade, o vetor recombinante é um vetor viral ou uma combinação de múltiplos vetores virais. Os vetores virais para a expressão mediada por aptâmero de um gene repórter numa célula-alvo são conhecidos na técnica e incluem vetores adenovirais (AV), vetores
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 30/78
25/55 de virus adeno-associados (AAV), vetores retrovirais e lentivirais e vetores de Herpes simplex tipo 1 (HSV1).
MÉTODOS PARA DIVIDIR BIBLIOTECAS DE APTÂMERO EM SUBBIBLIOTECAS [0114] Outro aspecto da presente invenção fornece métodos para dividir bibliotecas de oligonucleotídeo grandes em sub-bibliotecas menores e abordagens para produzir bibliotecas de plasmídeo triáveis por ensaio celular de riboswitches sintéticos baseados em aptâmero. Um aspecto da invenção fornece um método para dividir uma biblioteca de oligonucleotídeos em sub-bibliotecas menores que compreende as etapas:
[0115] (a) fornecer uma biblioteca de oligonucleotídeos, em que os oligonucleotídeos na biblioteca compreendem múltiplas regiões constantes 5' e 3', [0116] (b) realizar um PCR de dois ciclos com o uso da biblioteca de oligonucleotídeos como o modelo e primeiros iniciadores e segundos iniciadores que são complementares às regiões constantes 5' e 3', [0117] (c) isolar os produtos do PCR de dois ciclos, e [0118] (d) PCR amplificar um subconjunto dos produtos isolados do PCR de dois ciclos com o uso de iniciadores complementares a um subconjunto das regiões constantes 5’ e 3’ únicas.
[0119] Numa modalidade, a biblioteca de oligonucleotídeos é uma biblioteca de aptâmeros randomizados que contém um ou mais nucleotídeos randomizados. As sequências de aptâmero são flanqueadas por uma região constante esquerda e direita, que contêm um local de restrição para clonagem subsequente.
[0120] Numa modalidade, o primeiro ou segundo iniciador no PCR de dois ciclos compreende um identificador selecionado do grupo que consiste em biotina, digoxigenina (DIG), bromodesoxiuridina (BrdU), fluoróforo, um grupo químico, por exemplo, grupo tiol, ou um grupo químico, por exemplo, azidas, usado na Química Click. Estas moléculas podem ser ligadas aos oligonucleotídeos, e suas moléculas de interação, como estreptavidina ou formas modificadas de avidina para biotina, anticorpos contra DIG ou BrdU ou fluoróforo, ou um segundo grupo tiol para formar dissulfeto, grupo alquino para azidas, podem ser imobilizados numa superfície sólida para facilitar o isolamento de oligonucleotídeos identificados.
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 31/78
26/55 [0121] Uma vez que uma biblioteca de aptâmeros é dividida em subbibliotecas de aptâmeros, os aptâmeros numa ou mais sub-bibliotecas são introduzidos no cassete de polinucleotídeo de regulação de gene para gerar uma biblioteca de riboswitches e tríades para ligação de ligante pelos métodos fornecidos no presente documento.
MÉTODOS PARA DIVIDIR BIBLIOTECAS DE RIBOSWITCHES EM SUBBIBLIOTECAS [0122] Num aspecto, a presente invenção fornece um método para dividir uma biblioteca de riboswitches em sub-bibliotecas. Uma biblioteca de riboswitches conforme usado no presente documento é uma biblioteca de plasmídeo que compreende um cassete de polinucleotídeo de regulação de gene, por exemplo, conforme descrito no presente documento, e no documento nQ PCT/US2016/016234, que compreende uma pluralidade de aptâmeros em que os membros individuais da biblioteca compreendem sequências de aptâmero que são diferentes de outros membros da biblioteca. Nas modalidades, os aptâmeros na biblioteca de riboswitches compreendem um ou mais nucleotideos randomizados. Em modalidades, a biblioteca de plasmídeo de riboswitches foi gerada a partir de uma sub-biblioteca de aptâmeros criada pelos métodos descritos no presente documento.
[0123] O método para dividir a biblioteca de riboswitches em sub-bibliotecas compreende as etapas de:
[0124] (a) introduzir uma biblioteca de aptâmeros num plasmídeo que compreende um cassete de polinucleotídeo de regulação de gene descrito no presente documento para produzir uma biblioteca de riboswitches;
[0125] (b) introduzir a biblioteca de riboswitches em bactérias (por exemplo, E. coli)· [0126] (c) coletar clones bacterianos (por exemplo, selecionando-se colônias bacterianas) e extrair DNA de plasmídeo para obter sub-bibliotecas de plasmídeo de riboswitches (denominadas no presente documento como sub-bibliotecas primárias);
[0127] (d) opcionalmente, gerar sub-bibliotecas secundárias de riboswitches de uma sub-biblioteca primária de plasmídeos de riboswitches introduzindo-se uma
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 32/78
27/55 sub-biblioteca primária em bactérias, coletando clones bacterianos e isolando o DNA de plasmídeo.
[0128] Os métodos para introduzir sequências em plasmídeos para gerar uma biblioteca são conhecidos na técnica, assim como métodos para introduzir plasmídeos em bactérias e obter clones bacterianos. Os clones bacterianos que contêm um membro da biblioteca de plasmídeo de riboswitches pode ser coletado transferindo-se bactérias para placas e selecionando colônias individuais. Os plasmídeos agrupados a partir destes clones formam a sub-biblioteca. O número de clones bacterianos coletados determina o tamanho (número de membros únicos) da sub-biblioteca de riboswitches e múltiplas sub-bibliotecas pode ser gerado. Uma ou mais sub-bibliotecas primárias podem ser adicionalmente divididas para criar sub-bibliotecas secundárias para reduzir adicionalmente o tamanho das sub-bibliotecas. As sub-bibliotecas são tríadas com o uso dos métodos descritos no presente documento introduzindo-se uma ou mais sub-bibliotecas em células eucarióticas, expondo-se as células a um ligante de interesse, e medindo a expressão do gene repórter a partir do cassete de polinucleotídeo de regulação de gene. O aumento em expressão de gene repórter em resposta ao ligante indica que um ou mais membros da biblioteca compreendem um aptâmero que se liga ao ligante no contexto do riboswitch. Deste modo, o tamanho da sub-biblioteca que pode ser tríada pode ser determinado pela sensibilidade do ensaio para medir a expressão de gene repórter. Nas modalidades da invenção, uma sub-biblioteca compreende cerca de 50 a cerca de 600 membros únicos (embora alguns membros possam ser repetidos em outras sub-bibliotecas).
[0129] Deve ser entendido e esperado que a variação nos princípios da invenção no presente documento revelada pode ser feita por um indivíduo de habilidade comum na técnica e pretende-se que tais modificações sejam incluídas no escopo da presente invenção. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção, mas devem ser interpretados por limitar o escopo da invenção.
EXEMPLO 1 [0130] A triagem baseada em mamífero para aptâmero/ligantes com o uso
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 33/78
28/55 de riboswitches de regulação de gene baseado em emenda.
[0131] Procedimentos:
[0132] Construção de riboswitches: Os riboswitches foram construídos conforme descrito no documento nQ PCT/US2016/016234 (em particular, os Exemplos 3 a 6), incorporado ao presente documento a título de referência. Uma sequência de íntron de beta-globina humana truncada foi sintetizada e inserida na sequência de codificação de um gene de luciferase de vagalume. Um éxon de DHFR humano mutante 2 foi sintetizado e inserido no meio desta sequência de íntron de beta-globina truncada com o uso de estratégia de clonagem Golden gate. Os aptâmeros incluindo xpt-G/A1, ydhl-G/A2, yxj3, add4, gdg6-G/A5 (as citações para os aptâmeros são incorporadas ao presente documento a título de referência) foram sintetizados como oligonucleotídeos (“oligos”) com 4 cadeias secundárias de nucleotídeo na extremidade 5' que são complementares a dois locais de Bsal diferentes individualmente (IDT), anelados e ligados ao vetor de mDHFR-Luciaceitante digerido por Bsal.
[0133]Transfecção: 3,5 x104 células HEK 293 foram transferidas para placa numa placa de fundo plano de 96 poços no dia antes da transfecção. O DNA de plasmídeo (500 ng) foi adicionado a um tubo ou uma placa de fundo em U de 96 poços. Separadamente, o reagente TranslT-293 (Mirus; 1,4 pl) foi adicionado a 50 μΙ de meios Opti-mem I (Life Technologies), e permitiu-se que repousasse por 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Então, 50 μΙ deste reagente de transfecção diluído foram adicionados ao DNA, misturados e incubados à RT por 20 min. Finalmente, 7 μΙ desta solução foram adicionados a um poço de células na placa de 96 poços.
[0134] Ensaio de luciferase de vagalume de células cultivadas: 24 horas após a mudança de meios, as placas foram removidas da incubadora, e equilibradas à RT por diversos minutos numa bancada de laboratório, então, aspiradas. O tampão de lise de Glo (Promega, 100 μΙ, RT) foi adicionado, e as placas mantidas à RT por pelo menos 5 minutos. Então, os conteúdos de poços foram misturados por titulação de 50 μΙ, e 20 μΙ de cada amostra foram misturados com 20 μΙ de reagente bright-glo (Promega) que foi diluído a 10% em tampão glolysis. 96 poços foram separados numa placa de 384 poços branca opaca. Após
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 34/78
29/55 uma incubação de 5 min à RT, a luminescência foi medida com o uso de uma máquina Tecan com tempo de leitura de 500 ms. A atividade de luciferase foi expressada como unidade de luz relativa média (RLU)±S.D., e a indução em vezes foi calculada como a atividade de luciferase obtida com guanina tratamento dividida pela atividade de luciferase obtida sem tratamento de guanina.
[0135] Resultados:
[0136] Começando com luciferase como um gene repórter, uma plataforma de expressão de gene foi criada inserindo-se um íntron de □-globina humana no meio da sequência de codificação de luciferase de vagalume e um éxon de DHFR humano 2 que contém códon de parada mutante na porção de íntron. A expressão de gene repórter é, deste modo, controlada pela inclusão ou exclusão do éxon de mDHFR que contém um códon de parada que está em armação com o gene repórter. Neste sistema, uma estrutura de grampo no mRNA formada por local de ligação U1 e uma sequência complementar inserida bloqueia a inclusão de éxon de mDHFR, portanto, que possibilita a expressão de gene-alvo (Figura 1 a). Para tornar a formação de estrutura de grampo regulável, deste modo, a expressão de genealvo controlável por moléculas pequenas, foram enxertados aptâmeros sintéticos (teofilina) ou aptâmeros naturais (aptâmeros xpt-G/A, yxj, ydhl-A/G, add-A/G) ou aptâmero híbrido gdg6-G/A) a esta plataforma de regulação de gene baseada em emenda entre o local de ligação U1 e sua sequência complementar, e os riboswitches sintéticos gerados que regulam a expressão de gene em células de mamíferos. Usando-se o cassete de regulação de gene baseado em emenda e inserindo aptâmeros diferentes no construto de riboswitch sintético, foram demonstradas respostas funcionais diferentes ao ligante no contexto de células de mamíferos. Estes riboswitches com aptâmeros de guanina respondem à guanina, assim como guanosina, conforme mostrado na Figura 1 b. O riboswitch xpt-guanina, xpt-G17 (revelado no documento nQ PCT/US2016/016234, consultar, por exemplo, SEQ ID NO.:15, incorporado ao presente documento, a título de referência), rendeu alta faixa dinâmica de indução de expressão de gene repórter em resposta ao ligante com seu tratamento de ligante natural.
[0137] Embora os baseados em aptâmero naturais tenham alta faixa dinâmica na regulação de expressão de gene em células de mamíferos, a natureza
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 35/78
30/55 dos ligantes para estes aptâmeros naturais limita sua aplicabilidade ln vivo. Ao tomar vantagem da plataforma de regulação de gene altamente dinâmica com riboswitches, primeiro, foi escolhida uma lista de análogos de guanina que têm grupos químicos diferentes na posição N2 para testar suas atividades em riboswitch xpt-G17. Conforme mostrado na Figura 1c, na concentração 500 μΜ, diversos compostos N2 induziram a atividade de luciferase em células com construto de xptG17, com N2-fenoxiacetil guanina sendo o mais potente (indução em 1303 vezes) conforme mostrado na Figura 1d. Para expandir a lista de compostos para uso como ligantes potenciais, a biblioteca de Prestwick (uma coletânea de 1280 fármacos clinicamente aprovados) foi usado em 100 μΜ para triar por ligantes otimizados para ativar aptâmeros conhecidos no contexto de células de mamíferos. Conforme mostrado na Figura 1e a partir de uma triagem preliminar, o riboswitch de guanina xpt-G17 respondeu não apenas à guanina, como também à 8azaguanina, Nadida, N6-metiladenosina, Propionate de testosterona, 5’monofosfato monoidratado de adenosina, anfotericina B, Tioguanina, Tiloxapol, Progesteron e Acetato de clormadinona, conforme mostrado na Figura 1e, assim como um número de outros compostos, conforme listado na Tabela 1. De modo intrigante, alguns destes compostos que mostraram atividade sem riboswitch xptG17 são estruturalmente muito diferentes de guanina ou guanosina. A biblioteca de Prestwick foi adicionalmente tríada com outros 8 riboswitches de purina, e vários compostos que podem ativar os riboswitches na indução de atividade de luciferase foram obtidos (Tabela 1). Estes resultados demonstram o uso importante do sistema de riboswitch na constatação de ligantes otimizados potenciais para aptâmero conhecido em ambiente celular, destacando adicionalmente a importância de gerar aptâmeros no contexto das células nas quais o riboswitch será necessário para funcionar.
TABELA 1.
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
xpt-G17 8-azaguanina 131,0
xpt-G17 Azatioprina 6,2
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 36/78
31/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
xpt-G17 Cinarizina 3,5
xpt-G17 Maleato de pimetixeno 4,7
xpt-G17 N6-metiladenosina 30,7
xpt-G17 tioguanosina 21,0
xpt-G17 5’-monofosfato monoidratado de adenosina 28,4
xpt-G17 Anfotericina B 21,5
xpt-G17 Propionate de testosterona 29,0
xpt-G17 Haloprogina 5,1
xpt-G17 Idebenona 3,3
xpt-G17 Zotepina 4,3
xpt-G17 Progesterona 12,0
xpt-G17 Tenatoprazol 3,2
xpt-G17 Sal de maleato de acetopromazina 4,5
xpt-G17 Etofenamato 7,5
xpt-G17 Mercaptopurina 3,6
xpt-G17 Avermectina B1 4,0
xpt-G17 Cloridrato de promazina 3,7
xpt-G17 Nadida 40,9
xpt-G17 Tartrato de trimeprazina 4,9
xpt-G17 Cloridrato de prometazina 5,3
xpt-G17 Tiloxapol 16,2
xpt-G17 Acetato de clormadinona 10,3
xpt-G17 Pamoato de pirvínio 5,1
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 37/78
32/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
gdg6-A8 8-azaguanina 305,9
gdg6-A8 Cimetidina 3,0
gdg6-A8 Azatioprina 19,9
gdg6-A8 Cloridrato de diperodon 3,0
gdg6-A8 Maleato de pimetixeno 9,2
gdg6-A8 tioguanosina 20,1
gdg6-A8 Sal de maleato de acetopromazina 8,6
gdg6-A8 Mercaptopurina 17,2
gdg6-A8 Dicloridrato de opipramol 3,1
gdg6-A8 Cloridrato de promazina 12,6
gdg6-A8 Sal de maleato de metotrimeprazina 5,0
gdg6-A8 Dienestrol 4,3
gdg6-A8 Sal de maleato de trimipramina 5,3
gdg6-A8 Tartrate de trimeprazina 8,7
gdg6-A8 Cloridrato de prometazina 4,8
gdg6-A8 Vorinostat 6,4
gdg6-A8 Metiazol 3,8
yxj-A6 8-azaguanina 55,6
yxj-A6 Azatioprina 6,6
yxj-A6 Maleato de pimetixeno 4,9
yxj-A6 tioguanosina 10,2
yxj-A6 Sal de maleato de acetopromazina 3,1
yxj-A6 Mercaptopurina 10,0
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 38/78
33/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
yxj-A6 Cloridrato de promazina 6,6
yxj-A6 Sulfaquinoxalina sódica 3,4
yxj-A6 Sal de maleato de trimipramina 3,3
yxj-A6 Tartrate de trimeprazina 7,0
yxj-A6 Cloridrato de prometazina 7,9
yxj-A6 Mesilato de pirlindol 3,2
add-A6 8-azaguanina 22,1
add-A6 Azatioprina 6,5
add-A6 Maleato de pimetixeno 4,2
add-A6 tioguanosina 5,9
add-A6 Sal de maleato de acetopromazina 3,5
add-A6 Mercaptopurina 15,0
add-A6 Dicloridrato de opipramol 4,3
add-A6 Cloridrato de promazina 10,5
add-A6 Sulfaquinoxalina sódica 3,3
add-A6 Cloridrato de terazosina 3,5
add-A6 Sal de maleato de trimipramina 3,4
add-A6 Tartrato de trimeprazina 4,0
add-A6 Cloridrato de prometazina 4,5
add-A6 Citrato de ceptropina 3,3
add-A6 Cloreto de alcurônio 4,2
ydhl-A6 Hidroclorotiazida 3,3
ydhl-A6 8-azaguanina 3,7
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 39/78
34/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
ydhl-A6 Cloridrato de ticlopidina 3,1
ydhl-A6 Sal de citrato de alverina 4,2
ydhl-A6 Vincamina 3,3
ydhl-A6 Idebenona 3,5
ydhl-A6 Pepstatina A 4,0
ydhl-A6 Modafinil 3,8
ydhl-A6 Benperidol 3,1
ydhl-A6 Digoxigenina 4,5
ydhl-A6 Digoxigenina 3,3
ydhl-A6 Cloridrato de moricizina 10,3
ydhl-A6 Cloridrato de pivmecillinam 3,2
ydhl-A6 Cloridrato de piperidolato 3,4
ydhl-A6 Oxaprozina 3,4
ydhl-A6 Imidureia 4,3
ydhl-A6 Cloridrato de mecamilamina 3,2
xpt-A8 8-azaguanina 95,1
xpt-A8 Azatioprina 5,9
xpt-A8 Maleato de pimetixeno 3,3
xpt-A8 tioguanosina 11,8
xpt-A8 Mercaptopurina 3,4
xpt-A8 Cloridrato de promazina 4,1
xpt-A8 Cloridrato de prometazina 5,4
gdg6-G8 8-azaguanina 42,3
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 40/78
35/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
gdg6-G8 Azatioprina 16,2
gdg6-G8 Maleato de pimetixeno 5,1
gdg6-G8 tioguanosina 15,9
gdg6-G8 Anfotericina B 3,8
gdg6-G8 Sal de maleato de acetopromazina 3,2
gdg6-G8 Mercaptopurina 16,2
gdg6-G8 Cloridrato de promazina 6,2
gdg6-G8 Sal de maleato de trimipramina 3,3
gdg6-G8 Tartrate de trimeprazina 6,2
gdg6-G8 Cloridrato de prometazina 6,5
gdg6-G8 Sulfato de penbutolol 3,3
gdg6-G8 Vorinostat 10,2
gdg6-G8 Metiazol 3,3
gdg6-G8 Estriol 4,3
add-G6 8-azaguanina 47,9
add-G6 Niclosamida 3,0
add-G6 Azatioprina 11,4
add-G6 Linestrenol 3,8
add-G6 Cloridrato de R(-)apomorfina hemi-hidratado 3,4
add-G6 Danazol 3,7
add-G6 Camptotecina (S, +) 5,7
add-G6 Cinarizina 3,6
add-G6 Maleato de pimetixeno 6,6
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 41/78
36/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
add-G6 Dicloridrato de flunarizina 4,7
add-G6 N6-metiladenosina 20,8
add-G6 tioguanosina 7,9
add-G6 5’-monofosfato monoidratado de adenosina 9,4
add-G6 Cloridrato de bepridila 4,4
add-G6 Anfotericina B 10,7
add-G6 Propionato de testosterona 8,8
add-G6 Haloprogina 5,9
add-G6 Idebenona 6,7
add-G6 Sulfossalicilato de meclociclina 3,4
add-G6 Progesterona 6,0
add-G6 Sal de maleato de acetopromazina 5,0
add-G6 Etofenamato 5,1
add-G6 Mercaptopurina 14,3
add-G6 Cloridrato de benzamil 3,0
add-G6 Avermectina B1 11,8
add-G6 Cloridrato de promazina 5,4
add-G6 Nadida 30,8
add-G6 Sal de maleato de trimipramina 3,4
add-G6 Tartrato de trimeprazina 6,2
add-G6 Simvastatina 6,2
add-G6 Cloridrato de prometazina 6,7
add-G6 Cloridrato de protriptilina 5,0
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 42/78
37/55
Riboswitch Nome de composto Indução em vezes
add-G6 Acetato de clormadinona 26,1
add-G6 Acetato de nomegestrol 3,5
add-G6 Pamoato de pirvínio 15,8
add-G6 Nitrato de Sertaconazol 6,5
add-G6 Vorinostat 3,6
ydhl-G8 Sulfaguanidina 13,9
ydhl-G8 8-azaguanina 35,6
ydhl-G8 N6-metiladenosina 10,7
ydhl-G8 tioguanosina 7,5
ydhl-G8 5’-monofosfato monoidratado de adenosina 5,9
ydhl-G8 Anfotericina B 6,5
ydhl-G8 Cloridrato de tetracaína 3,6
ydhl-G8 Sal de maleate de acetopromazina 3,9
ydhl-G8 Cloridrato de azelastina 3,0
ydhl-G8 Etofenamato 4,8
ydhl-G8 Mercaptopurina 3,6
ydhl-G8 Cloridrato de promazina 5,2
ydhl-G8 Nadida 11,7
ydhl-G8 Tartrate de trimeprazina 5,0
ydhl-G8 Acetato de clormadinona 10,4
ydhl-G8 Pamoato de pirvínio 5,5
ydhl-G8 Vorinostat 3,0
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 43/78
38/55 [0138] As sequências para riboswitches usadas na triagem de biblioteca Prestwick são fornecidas abaixo com as sequências de tronco em letras maiúsculas, e as sequências de aptâmero em letras minúsculas:
[0139]xpt-A8 (SEQ ID NO: 1):
[0140] GT AAT GT ataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgatt ACATTAC [0141]add-G6 (SEQ ID NO: 2):
[0142] GT AAT GT Gtataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgact aCACATTAC [0143] add-A6 (SEQ ID NO: 3):
[0144] GT AAT GT Gtataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgatt aCACATTAC [0145] gdg6-A8 (SEQ ID NO: 4):
[0146] GT AAT GT acagggtagcataatgggctactgaccccgccgggaaacctatttcccgattA CATTAC [0147] gdg6-G8 (SEQ ID NO: 5):
[0148] GT AAT GT acagggtagcataatgggctactgaccccgccgggaaacctatttcccgactA CATTAC [0149] Ydhl-G8 (SEQ ID NO: 6):
[0150] GT AAT GT ataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctgact ACATTAC [0151] Ydhl-A6 (SEQ ID NO: 7):
[0152] GT AAT GT Gtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctg attaCACATTAC [0153] yxj-A6 (SEQ ID NO: 8):
[0154] GT AAT GT Gtatatgatcagtaatatggtctgattgtttctacctagtaaccgtaaaaaactag attaCACATTAC
EXEMPLO 2 [0155] Projeto e síntese de biblioteca de aptâmeros.
[0156] Procedimento [0157] Para gerar uma biblioteca de aptâmeros, os nucleotídeos em posições no aptâmero que são identificadas a partir da estrutura cristalina6 7 conforme
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 44/78
39/55 potencialmente envolvida na ligação de ligante foram randomizados. A fim de facilitar a construção de aptâmeros em riboswitches, a região de aptâmero foi flanqueada por regiões constantes com locais de corte de enzima de restrição de tipo lis (por exemplo, Bsal). Estes oligonucleotídeos ultrâmero de 153 bp que contêm a sequência de aptâmero com bases randomizadas foram sintetizados por IDT: GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATGT ATANNNGCGTGGATATGGCACGCNNGNNNNCNCCGGGCACCGTAAATGTCC GACTACATTACGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGAAGAGACCAGACGG (N representa nucleotídeos aleatórios) (SEQ ID NO: 9). Para gerar mais diversidade de sequência na biblioteca de aptâmeros, bases em mais posições podem ser randomizadas. Uma sequência completamente randômica também pode ser usada para gerar a biblioteca de aptâmeros.
[0158] Resultados [0159] Conforme descrito no Exemplo 1, foram construídos de modo bemsucedido riboswitches sintéticos que regulam a expressão de gene de mamífero em resposta ao tratamento de ligante de molécula pequena. Um dos riboswitches xpt-G17 que contém aptâmero de guanina xpt-G no cassete de expressão de gene baseado em emenda. Com o uso de luciferase como um gene repórter, foi alcançada uma faixa dinâmica de regulação de gene em resposta ao tratamento de guanina, com indução em vezes de 2000 em alta concentração de guanina. Esta faixa dinâmica sem precedentes de atividade de regulação de gene pelos construtos de emenda alternativa mediada por aptâmero/ligante fornece um sistema para triar por aptâmeros contra um ligante desejado em células de mamíferos, ou triar por ligantes que se ligam e ativam aptâmeros conhecidos.
[0160] O xpt-G17 foi selecionado como uma plataforma para construir uma biblioteca de riboswitches inicial. A configuração de sequência de oligonucleotídeo foi projetada para substituir o aptâmero de guanina xpt-G original nas etapas de clonagem a seguir. Os nucleotídeos no aptâmero de guanina xpt-G nas posições que são conhecidas por serem críticas para ligação de guanina baseada em análise de cristalografia foram randomizados. Inicialmente, 10 posições foram randomizadas, as quais geraram uma biblioteca de 1.048.576 sequências de
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 45/78
40/55 aptâmero. Quando mais do que 10 posições são randomizadas, as bibliotecas maiores do que 106 sequências podem ser geradas. Embora a sequência de cadeia principal de aptâmero de guanina xpt-G tenha sido usada aqui seletivamente para randomização, uma abordagem similar pode ser usada para gerar bibliotecas de aptâmero com outros aptâmeros conhecidos, ou até mesmo sequências completamente aleatórias sem ligantes conhecidos. Embora xpt-G17 seja escolhido como plataforma aqui, é importante observar que os riboswitches com aptâmeros diferentes, ou riboswitches com base em mecanismos diferentes de emenda também podem ser usados como uma plataforma inicial para gerar sequências de aptâmero randomizado.
EXEMPLO 3 [0161] Dividir biblioteca grande de aptâmeros randomizados em subbibliotecas menores de aptâmero.
[0162] Procedimentos [0163]Oligonucleotídeos (oligos): O conjunto JF ou JR de iniciadores tem sequência complementar de porção 3’ a regiões constantes nos oligos de aptâmero sintetizado e sequência de porção 5’ que contém sequências de oligo de 20 mer randomizadas. O conjunto F ou R de iniciadores é complementar às sequências de oligo 20 mer randomizadas nos iniciadores JF ou JR. Todos os iniciadores são sintetizados em IDT. Os iniciadores JF foram identificados com biotina na extremidade 5’ (IDT). Os oligos sintetizados foram suspensos em DNase e água livre de RNase a 100 μΜ como solução de estoque, e diluídos à concentração desejada e quantificados com o uso de máquina Nanodrop ou do método OliGreen (ThermoFisher).
[0164] Amplificação de PCR de Dois Ciclos: Para adicionar a oligoetiqueta biotinilada, a amplificação de PCR de dois ciclos foi realizada com o uso de kit de PCR de Platina Pfx seguindo o protocolo do fabricante num volume de reação de 10 μΙ. Os modelos de oligo foram usados em números de cópia desejados em reação de PCR (1 a 5 cópias por sequência de oligo na biblioteca de aptâmeros). Para o primeiro ciclo de amplificação, apenas iniciadores reversos JR foram incluídos. A amplificação foi executada a 94 °C por 2 minutos, então, 94 °C por 10 segundos, em anelamento com um programa de touch-down de 66 °C a 52 °C
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 46/78
41/55 decrescente a 0,5 °C por minuto. Então, a reação de polimerase foi estendida a 68 °C por 20 segundos, seguida por resfriamento a 4 °C. Então, 10 pl de mistura de PCR sem modelo, mas contendo iniciadores diretos biotinilados (biotina-JF) foram adicionados ao primeiro tubo de PCR de ciclo para o segundo ciclo de amplificação com o uso das mesmas etapas de PCR. Os produtos de PCR estiveram prontos para incubação com microesferas de estreptavidina.
[0165] Isolamento de oligonucleotídeos biotinilados (oligos): O tampão de Ligação e Lavagem 2x (tampão BW) foi feito de tampão TE 1x (Ambion) com NaCI 2M. Estreptavidina Dynabeads M-270 (ThermoFisher) (microesferas SA) foi bloqueada com solução de tRNA de levedura 20 μΜ (Ambion) por 10 minutos à temperatura ambiente, e lavada com tampão BW 1x duas vezes, e ressuspensa no mesmo volume de tampão BW 2x que o volume inicial de microesferas usadas. 50 μΙ destas microesferas tratadas foram adicionadas aos produtos de PCR junto com 100 μΙ de tampão BW 2x e 30 μΙ de água. Os 200 μΙ de oligos biotinilados e mistura de microesferas SA foram incubados à temperatura ambiente por 60 minutos, então, as microesferas foram desnaturadas a 95 °C por 5 minutos, resfriadas imediatamente em gelo e lavadas uma vez com tampão BW 1x, duas vezes com água por 5 minutos seguindo o protocolo do fabricante. A solução de lavagem foi removida o máximo possível, e as microesferas lavadas foram prontas para a reação de PCR.
[0166] PCRs específicos de etiqueta de sequência de oligo: As microesferas com produtos de PCR biotinilados foram adicionados a 50 μΙ total de mistura de PCR com o uso de kit de PCR de Platina Pfx. Os iniciadores são uma mistura de iniciadores definidos F e R. O PCR foi pré-aquecido a 94 °C por 2 minutos, submetido a 28 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 62 °C por 30 segundos, 68 °C por 20 segundos, e uma extensão adicional a 68 °C por 2 min. O produto de PCR foi resfriado a 12 °C e pronto para a segunda ronda de PCR. Para a segunda ronda de amplificação de PCR, 1 μΙ do produto de PCR da primeira ronda de PCR foi usado como modelo, e um único par de iniciadores F e R foi usado para amplificar modelos etiquetados com as sequências complementares. A reação de PCR foi pré-aquecida a 94 °C, e amplificada com 25 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 60 °C por 30 segundos, 68 °C por 20 segundos, e uma extensão adicional a 68 °C por
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 47/78
42/55 minutos.
[0167] Resultados [0168] Embora a seleção in vitro com o uso de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX)8’9 foi extensivamente aplicada a bibliotecas grandes de aptâmeros de triagem usualmente com 1013 a 1014 sequências para gerar vários aptâmeros contra uma faixa ampla de ligantes incluindo metabolites, cofatores de vitamina, íons de metal, proteínas e até mesmo células inteiras10, os métodos para triagens baseadas em célula de tais bibliotecas grandes de aptâmeros randomizados não foram desenvolvidos. Além disto, poucos aptâmeros gerados por SELEX se demonstraram eficazes num ambiente celular, destacando a importância de aptâmeros de triagem no ambiente celular em que será necessário que funcionem. A fim de os aptâmeros selecionados trabalharem nas células, a ligação do aptâmero específico a seu ligante deve ter consequência funcional - a qual não pode ser testada por meio de SELEX, o qual seleciona aptâmeros apenas baseados em ligação de ligante sob condições in vitro. Um desafio para desenvolver triagens baseadas em célula de mamífero para aptâmeros é a faixa reguladora de gene dinâmica baixa de riboswitches baseados em aptâmero em resposta ao tratamento de ligante. Além desta limitação fundamental, a eficácia de transdução de gene baixa intrínseca em células de mamífero impõe outra barreira a bibliotecas de triagem maiores do que 105 sequências. Entretanto, foram desenvolvidos riboswitches sintéticos que podem gerar indução em até diversas milhares de vezes a expressão de gene mediante tratamento de ligante. Esta alta faixa dinâmica de regulação de gene fornece a base de um sistema baseado em célula para aptâmero/ligantes de triagem. A fim de selecionar aptâmeros em células eucarióticas a partir de bibliotecas de aptâmeros que têm alta diversidade de sequência, a presente invenção fornece múltiplas estratégias e abordagens para repartir/dividir bibliotecas grandes de aptâmeros em sub-bibliotecas menores que podem ser clonadas em cassete de riboswitch para gerar bibliotecas de plasmídeo que são triáveis através de ensaios baseados em célula de mamífero.
[0169] A estratégia de dividir bibliotecas grandes de aptâmeros é, primeiro, adicionar um par de sequências únicas tanto nas extremidades 5' quanto 3' das
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 48/78
43/55 sequências de oligo de aptâmero randomizado sintetizado (conforme descrito no Exemplo 2). Na segunda etapa desta estratégia, as sequências de aptâmero afixadas (etiquetadas/identificadas) com sequências de oligo únicas podem ser amplificadas com o uso de um par único de iniciadores complementares para cada par de etiquetas de sequência, gerando, deste modo, sub-bibliotecas diferentes de aptâmeros (Figura 3a). Este processo de duas etapas de etiquetagem e PCR pode ser iterado para dividir a biblioteca aos tamanhos desejados.
[0170] Para fixar pares de sequência únicos ao modelo, foram desenvolvidas múltiplas abordagens (Figura 3b). Uma abordagem é usar PCR para incorporar sequências únicas aos modelos (abordagem de PCR). Outras abordagens incluem ligar a etiqueta de sequência de filamento único ao modelo de filamento único com o uso de T4 RNA ligase e ligação por etiquetas de sequência de filamento duplo de T4 DNA ligase aos modelos de filamento duplo que são gerados por amplificação de PCR de modelos de oligonucleotídeo de filamento único (abordagem de ligação). Uma abordagem de PCR de dois ciclos foi desenvolvida e testada (Figura 3c) e atualmente as abordagens de ligação estão num processo para adicionar etiquetas de sequências únicas.
[0171] Para usar a abordagem de PCR para afixar etiquetas de sequência para gerar a biblioteca etiquetada de aptâmero, um conjunto de iniciadores de PCR (JF e JR) foi projetado. Este conjunto de iniciadores contém a sequência de etiqueta na porção 5’ dos iniciadores, e na porção 3’ de iniciadores, a sequência que é complementar à região constante nos oligos de aptâmero sintetizado. A fim de evitar a heterogeneidade gerada por PCR convencional de múltiplos ciclos 11 com o uso de altos números cópias de modelos, um PCR de dois ciclos foi desenvolvido para afixar a etiqueta de sequência numa extremidade do modelo em cada ciclo (Figura 3c). Neste PCR de dois ciclos, o número de cópia dos modelos de oligo randomizado foi mantido no mínimo para diminuir a chance para cada modelo ser afixado com mais do que um par de sequências de etiqueta. A fim de isolar e purificar os modelos etiquetados, foram identificados os iniciadores JF com moléculas biotinas, para que as microesferas de estreptavidina magnética possam ser usadas para separar modelos etiquetados biotinilados do resto dos componentes de reação (Figura 3d). Devido ao baixo número de cópia de modelos,
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 49/78
44/55 se iniciou com a etiquetagem de PCR, os modelos etiquetados biotinilados isolados foram amplificados e expandidos por PCR com o uso de uma mistura de um conjunto de iniciadores (iniciadores J e F) que são específicos às sequências de etiqueta afixadas aos modelos, gerando a biblioteca de aptâmeros que têm par único de sequências nas extremidades (biblioteca etiquetada de aptâmeros randomizados). Este produto de PCR serve, então, como modelo para PCR com um par único de iniciadores J e R para amplificar cada modelo etiquetado gerando, deste modo, as sub-bibliotecas da biblioteca original de aptâmeros.
[0172] Num estudo piloto em que os 2 iniciadores JF identificados por biotina (JF1 e JF2) e 8 iniciadores JR reversos (JR1 a JR8) foram usados, os mesmos resultam no total de 16 pares únicos de etiquetas de sequência. Após gerar a biblioteca etiquetada por PCR com modelos em 1, 2,3 ou 4,6 cópias que representam 63%, 90% ou 99% da biblioteca inicial de aptâmeros randomizados, respectivamente, iniciadores diferentes foram usados para testar a estratégia de divisão. Conforme mostrado no painel esquerdo da Figura 3e, os modelos etiquetados foram amplificados por iniciadores complementares à região constante (iniciadores universais) no aptâmero, que amplificam todo modelo na biblioteca. Quando um par único de iniciadores (F1 e R1) que são específicos às sequências de etiqueta adicionadas (painel intermediário), mas não o par de iniciadores (F3 e R1) que não foram incluídos na etiquetagem (painel direito) foi usado, os modelos etiquetados foram amplificados em quantidade muito mais baixa em comparação com o produto amplificado com iniciador universal, indicando que apenas uma porção (1/16) da biblioteca foi amplificada. Deste modo, a biblioteca original foi dividida em sub-bibliotecas menores.
EXEMPLO 4 [0173] A sensibilidade de ensaio baseado em célula para triagem de biblioteca.
[0174] Procedimentos:
[0175] Construtos de DNA: Os construtos de DNA de plasmídeo que contêm riboswitch xpt-G17 foram diluídos em SR-Mut de construto de DNA em razão diferente destes dois construtos de DNA. Os construtos misturados G17 e DNA de plasmídeos SR-mut foram, então, transfectados a células HEK 293. A transfecção
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 50/78
45/55 e ensaio de luciferase foram realizados conforme descrito no Exemplo 1.
[0176] Resultados:
[0177] A sensibilidade de ensaio baseado em célula para triagem de biblioteca determina o quão complexo ou grande o tamanho de biblioteca de plasmídeos de aptâmero-riboswitch pode ser a fim de no mínimo 1 correspondência se destacar do resto da biblioteca na triagem. O ensaio pode ser para atividade de luciferase, intensidade de fluorescência de proteína fluorescente ou liberação de hormônio de crescimento/citocina, dependendo do gene repórter escolhido, e os elementos genéticos podem ser entregues por transfecção transiente ou por transdução viral, por exemplo, AAV, Adenovirus, lentivírus, etc.
[0178] Aqui, é escolhida a transfecção transiente para entregar DNA de plasmídeo, e usada a luciferase de vagalume como gene repórter com o uso de construto xpt-G17 como vetor de controle de riboswitch positivo, um ensaio que foi extensivamente testado e usado durante o desenvolvimento de riboswitch xpt-G17 em células de mamíferos. O construto SR-mut foi usado como vetor de controle negativo, o qual tem os mesmos elementos genéticos que o construto xpt-G17, exceto por não haver sequência de aptâmero de guanina, portanto, não ativa a expressão de gene em resposta ao tratamento de guanina. Estes dois construtos foram misturados juntos para imitar uma situação de biblioteca agrupada, embora a biblioteca de riboswitches real seja mais complexa devido à grande diversidade molecular gerada por randomização de nucleotideo. As células transfectadas com 100% de DNA de construto xpt-G17 rendeu a indução de 2000 vezes a atividade de luciferase mediante tratamento com 500 μΜ de guanina quando em comparação células não tratadas. Quando o DNA de construto xpt-G17 foi diluído com DNA de construto SR-mut, as células transfectadas com o DNA misturado mostraram indução mais baixa em vezes de atividade de luciferase. Conforme mostrado na Figura 3, a indução em vezes diminuiu quando a razão entre construto xpt-G17 de resposta à guanina e construto SR-mut negativo de não resposta diminuiu, mas ainda pode gerar uma indução em 2,3 vezes quando há 1 construto positivo dentre 2000 moléculas, o que indica a probabilidade de recuperar 1 riboswitch de resposta ao ligante de uma mistura de riboswitches de não resposta a ligante.
[0179] Para ensaios diferentes do descrito acima, as sensibilidades do
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 51/78
46/55 ensaio deveríam ser testadas para fornecer a orientação para determinar o tamanho dos agrupamentos de sub-biblioteca a serem triados.
EXEMPLO 5 [0180] Construção de biblioteca de plasmídeo de riboswitch baseado em aptâmero agrupado e divisão de biblioteca maior de riboswitches para subbibliotecas menores triáveis.
[0181] Procedimentos:
[0182] Construção de biblioteca de plasmídeo agrupada de riboswitches: Oligos Ultrâmero que contêm sequências de aptâmero com bases randomizadas (consultar Exemplo 2 para projeto e composição de sequência) foram PCR amplificados com o uso de kit Platinum Pfx (Invitrogen) para gerar fragmentos de DNA com filamento duplo, e o produto de PCR gerado foi executado em 4% de gel de agarose. O DNA com tamanho de 153 bp foi purificado de gel (Qiagen) e digerido com enzima de Bsal (NEB). O fragmento de DNA digerido por Bsal foi, então, ligado ao vetor aceitante digerido por Bsal (mDHFR-Luci-Aceitante) conforme descrito no Exemplo 1 com uma razão 1:5 de vetor para inserir com o uso de uma T4 DNA ligase (Roche). As células competentes ElectroMAX DH5a-E foram transformadas seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen) com o produto de ligação e transferidas para placa em placas de ágar. As colônias bacterianas foram agrupadas e coletadas, e o DNA foi extraído para obter a biblioteca de plasmídeo de riboswitches (P1).
[0183] Uma abordagem similar foi usada para gerar uma biblioteca de plasmídeo de riboswitches menor (P2) em que as bases de nucleotídeo em posições 5 no aptâmero foram randomizadas gerando um total de 1024 sequências de aptâmero diferentes (em que N denota uma posição randomizada): GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATGT ATANNNGCGTGGATATGGCACGCNNGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCCG ACTACATTACGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGAAGAGACCAGACGG (SEQ ID NO: 10) [0184] Transformação de DH5a quimicamente competente: 227 pg de DNA de plasmídeo foram usados para transformar 50 pl de células competentes para obter a razão 1:10 de DNA de plasmídeo e células bacterianas. As células
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 52/78
47/55 transformadas foram transferidas para placa em placas de ágar após serem incubadas a 37 °C sem agitação por 30 minutos, e as colônias foram agrupadas e coletadas para extração de DNA com o uso de kit miniprep de formato 96 (Qiagen) para obter sub-bibliotecas de plasmídeos agrupadas de riboswitches.
[0185] Sequenciamento de Próxima Geração (NGS): O DNA de plasmídeo de sub-bibliotecas de riboswitches secundárias ou terciárias foi usado como modelos, e os iniciadores a seguir foram usados para gerar amplicons de PCR que contêm as sequências de aptâmero randomizadas: DHFR_F: 5'GACTTCGGTCTCATCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGGTAATG3' (SEQ ID NO: 11); IVS_R: 5'CCGTCTGGTCTCTTCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCG-3' (SEQ ID NO: 12). Os produtos de PCR foram submetidos a NGS com o uso de plataforma de extremidade emparelhada Illumina MiSeq 2x150bp para gerar aproximadamente 700K de leituras para cada amostra e análise de bioinformática subsequente para identificação de sequência única e cálculo de abundância relativa (Serviço fornecido por Genewiz). As sequências que mostraram 12, ou mais do que 12, leituras de uma execução de sequenciamento são consideradas sequências verdadeiras.
[0186] Resultados [0187] Para triar os aptâmeros por um ensaio baseado em célula, uma biblioteca de plasmídeo de riboswitches foi gerada clonando-se a biblioteca de aptâmeros em vetor mDHFR-Luci-Aceitante (Figura 5a). Os construtos gerados contêm a mesma configuração de elemento genético que no construto xpt-G17, com a única diferença sendo as sequências de aptâmero. Se iniciou com uma biblioteca de aptâmeros gerada conforme descrito no Exemplo 2, uma biblioteca de aptâmeros randomizados que compreende 106 sequências únicas. Para garantir mais do que 99,9% de representação da biblioteca inicial de aptâmeros, um total de 7,5x106 colônias, que é 7,5 vezes o número de sequências na biblioteca de aptâmeros, foram coletadas das placas de ágar. O DNA de plasmídeo extraído das colônias coletadas forma a biblioteca de plasmídeo (P1) que consiste em 106 riboswitches únicos.
[0188] Para dividir as bibliotecas de plasmídeo em sub-bibliotecas que são
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 53/78
48/55 pequenas o suficiente para serem tríadas com o uso do ensaio baseado em célula desenvolvido, uma estratégia foi utilizada, conforme destacado na Figura 5b, que envolve o agrupamento de números menores de colônias bacterianas transformadas e extrair DNA para produzir sub-bibliotecas de plasmídeo de riboswitches. Este processo para dividir bibliotecas de plasmídeo pode ser realizado por diversas rondas para obter o tamanho necessário das sub-bibliotecas em que um evento positivo único (isto é, ligação de aptâmero/ligante específica que leva à expressão de gene repórter) pode ser detectado baseado na sensibilidade do ensaio baseado em célula desenvolvido para triar a biblioteca, gerar subbibliotecas primárias, secundárias ou terciárias, respectivamente. O tamanho de sub-bibliotecas foi calculado como n(sub-biblioteca) = m (representação em vezes) * N (tamanho de biblioteca inicial)/d (vezes de divisão). A expressão “vezes de divisão” representa o número total de sub-bibliotecas a obter, e pode ser qualquer número, conforme desejado. Aqui, foi escolhido 100 como as vezes de divisão para a facilidade de cálculo. Para a primeira ronda de divisão, 6x106 colônias foram coletadas, o que é 6 vezes o número de riboswitches na biblioteca de plasmídeo inicial para obter maios do que 99% de representação (106). Para a segunda ronda de divisão, a representação em 1 vez da sub-biblioteca primária foi escolhida. Para a biblioteca de plasmídeo com 106 riboswitches, foi construído (P1), em que N=106, m=6, d=100, o tamanho de cada sub-biblioteca individual é n=6x104. Um total de 6x106 colônias bacterianas foi coletado em 100 tubos individuais e o DNA extraído de cada tubo individual para gerar sub-biblioteca de plasmídeo primário de riboswitches (P1S_001 a P1S_100). Com o uso da mesma estratégia e iniciando com sub-biblioteca P1S_001, como exemplo, a sub-biblioteca primária foi adicionalmente dividida em 100 sub-bibliotecas secundárias ainda menores nomeadas P1S_001_001 a P1S_001_100. Deste modo, realizando-se duas rondas de divisão, as sub-bibliotecas de plasmídeo secundárias foram geradas com 600 riboswitches em cada uma. As sub-bibliotecas de riboswitches podem ser adicionalmente divididas pela 3ã ronda de processos de divisão para gerar subbibliotecas de plasmídeo terciárias.
[0189] A mesma abordagem foi usada para dividir a biblioteca de plasmídeo de riboswitches P2 que contém 1024 sequências de aptâmero únicas. Coletando
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 54/78
49/55 se 100 porções de um total de 5000 colônias, 100 sub-bibliotecas primárias P2S_001 a P2S_100 foram geradas, com cada sub-biblioteca contendo aproximadamente 50 riboswitches.
[0190] Para determinar a composição e a qualidade das bibliotecas de riboswitches geradas acima, o sequenciamento de próxima geração (NGS) foi realizado nas sub-bibliotecas de plasmídeo secundário de riboswitches que contém presumivelmente 600 sequências de riboswitch em cada sub-biblioteca. Quatro sub-bibliotecas secundárias foram selecionadas em randomização, em que duas das sub-bibliotecas secundárias foram geradas a partir da sub-biblioteca primária P1S_003, e as outras duas sub-bibliotecas secundárias foram geradas a partir de sub-bibliotecas primárias P1S_007 e P1SJ348, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 5c, cada uma das sub-bibliotecas secundárias contém aproximadamente 500 ou 600 sequências únicas, coerentes com o número de colônias que foram coletadas para gerar sub-bibliotecas secundárias. Uma análise adicional dos dados de NGS indica que entre as duas sub-bibliotecas secundárias (P1S_003_004 e P1S_003_041) que foram geradas a partir da mesma subbiblioteca primária (P1S_003), 39 sequências são contidas em ambas as bibliotecas (Figura 5d). Durante a comparação de duas sub-bibliotecas secundárias, P1S_003_004 e P1S_007_021, que foram derivadas de subbibliotecas primárias diferentes, P1SJ303 e P1SJ307, apenas 3 sequências são compartilhadas por ambas as sub-bibliotecas (Figura 5e). Estes resultados indicam que, com o uso da estratégia descrita acima, as sub-bibliotecas de riboswitches de plasmídeo foram geradas com o número desejado de sequências únicas que estão prontas para triagem baseada em célula de mamífero.
EXEMPLO 6 [0191] Triagem baseada em célula de mamífero para novos aptâmeros contra ligantes de escolha.
[0192] Conforme descrito no Exemplo 5, 100 sub-bibliotecas de plasmídeo primárias (P1SJ301 a P1S_100) que compreendem 60k riboswitches em cada agrupamento foram construídas, e 100 sub-bibliotecas de plasmídeo secundárias (P1S_001_001 a P1S_001_100) que consistem em 600 riboswitches em cada uma foram geradas dividindo-se adicionalmente a sub-biblioteca primária P1 S_001 com
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 55/78
50/55 o uso da mesma estratégia. As bibliotecas agrupadas podem ser dispostas em formato de 96 poços para facilitar a triagem de alta produtividade. Uma triagem preliminar foi realizada com o uso do ensaio repórter de luciferase, conforme descrito no Exemplo 1, em sub-bibliotecas primárias P1S_001 a 006 assim como as sub-bibliotecas de P1S_001, contra guanina, que está contra a sequência de aptâmero inicial, como o ligante testado. O nível basal de atividade de luciferase gerado por construtos de sub-bibliotecas primárias ou sub-bibliotecas secundárias variou significativamente daquele do construto xpt-G17 (dados não mostrados), o que sugere que as mudanças na sequência de aptâmero randomizando-se as bases nas posições selecionadas teve impacto na inclusão/exclusão do éxon que contém códon de parada a vários pontos, assim afetando a expressão de luciferase basal. Após o tratamento de guanina, embora as células transfectadas com a subbiblioteca primária 60k P1S_005 geraram indução de 1,8 vez a atividade de luciferase em comparação com células não tratadas (Figura 6a), mais do que 2 vezes a indução de luciferase não foram constatadas durante o uso de guanina como o ligante. Entretanto, 7 das 100 sub-bibliotecas secundárias renderam mais do que 2 vezes a indução de atividade de luciferase mediante tratamento de guanina, com sub-biblioteca P1S_001_075 que gera indução em 7,8 vezes (Figura 6b). No ensaio de sensibilidade descrito no Exemplo 4, a indução em 6,3 vezes foi detectada quando houve 1 riboswitch xpt-G17 dentre 500 moléculas de resposta de não ligante. Com base neste teste de sensibilidade, o resultado (7,8 vezes) a partir desta triagem preliminar da sub-biblioteca P1S_001_075 sugere que há 1 riboswitch de 600 que é funcionalmente equivalente a xpt-G17, ou há diversos riboswitches mais fracos cuja soma de atividade de luciferase induzida é comparável àquela de xpt-G17.
[0193] Para demonstrar adicionalmente a aplicabilidade da triagem baseada em célula de mamífero da presente invenção para riboswitches que contêm aptâmeros funcionais e para constatar novos aptâmeros com atividade melhorada na resposta a um ligante desejado, as sub-bibliotecas de biblioteca de plasmídeo de riboswitches P2 foram tríadas num formato de 96 poços com NAD+. As bases de nucleotídeo nas posições randomizadas no aptâmero de xpt-guanina foram ligadas à sintonização de atividade de riboswitch e nomeadas caixa de sintonização
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 56/78
51/55 (“tune box”) (Stoddard, et al. J Mol Biol. 27 de maio de 2013 27;425(10):1.596 a 1.611). Portanto, mudanças de nucleotídeos nestas posições geram potencialmente as sequências que têm atividade de riboswitch alterada em resposta ao tratamento de ligante. Devido à natureza de guanina e sua baixa aplicabilidade in vivo, NAD+ foi escolhido como ligante para aptâmeros novos potenciais. Esta escolha de ligante foi baseada nos resultados acima de triagem da biblioteca de composto de Prestwick contra o riboswitch xpt-G17 parental e constatação de que NAD+ pode regular o riboswitch de guanina, gerando aproximadamente indução de 40 vezes em concentração 100 μΜ. Numa tentativa de gerar sequências de aptâmero que têm atividade de riboswitch melhorada contra NAD+, as sub-bibliotecas de P2 foram geradas e tríadas (que têm mudanças de nucleotídeos nas posições 5 mencionadas acima no aptâmero) com o uso de luciferase como gene repórter. Conforme mostrado na Figura 6c, múltiplas subbibliotecas, aproximadamente 50 riboswitches em cada uma, renderam mais do que 10 vezes a indução de expressão de luciferase em resposta ao tratamento de NAD+ 100 μΜ, com uma das sub-bibliotecas, P2S_002, gerando 37 vezes a indução, enquanto um único construto de riboswitch xpt-G17 mostrou indução de 32 vezes em resposta ao tratamento de NAD+ na mesma concentração.
[0194] Estes resultados de triagem indicam que, entre os aproximadamente 50 riboswitches nas sub-bibliotecas que renderam mais do que 10 vezes a indução de expressão de luciferase, há riboswitches que podem produzir minimamente 10 vezes a indução, supondo que todos os riboswitches na biblioteca respondem ao tratamento de NAD+. Na sub-biblioteca P2S_002 que rendeu indução em 37 vezes, que é mais alta do que as vezes a indução gerada por G17, há pelo menos 1 riboswitch que funciona muito melhor do que G17. Para provar adicionalmente isto, 96 construtos únicos derivados de sub-biblioteca P2S_002 foram tríades. Conforme mostrado na Figura 6d, através de múltiplos construtos perdidos ou que produziram menos indução do que G17, vários construtos únicos produziram indução em vezes mais alta do que o construto G17, o que indica que as mudanças de nucleotídeo na caixa de sintonização afetam drasticamente a atividade de riboswitch na resposta ao tratamento de ligante em células. Com o uso desta abordagem, foram identificadas várias sequências de caixa de sintonização diferentes (conforme
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 57/78
52/55 mostrado na Tabela 2), com as quais os riboswitches produziram indução em vezes mais alta de luciferase do que o construto G17 mediante tratamento de NAD+, com múltiplas sequências de aptâmero que produzem mais do que 100 vezes a indução.
TABELA 2. RIBOSWITCHES COM EXPRESSÃO DE GENE REPÓRTER MELHORADA EM CÉLULAS DE MAMÍFERO EM RESPOSTA AO LIGANTE, NAD+. AS SEQUÊNCIAS DE CAIXA DE SINTONIZAÇÃO SÃO SUBLINHADAS.
SEQ ID NO: Construt 0 Sequência
13 G17 ATAATCGCGTGGATATGGCACGCAAG I I I CIACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
14 #02 ATAACCGCGTGGATATGGCACGCGGG I I I C I'ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
15 #16 ATAGCCGCGTGGATATGGCACGCGGG I I I C I'ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
16 #17 ATAAGGGCGTGGATATGGCACGCTCG I I I Cl ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
17 #21 ATAAATGCGTGGATATGGCACGCATG I I I CI ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
18 #26 ATAAGCGCGTGGATATGGCACGCGCG I I I C I'ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
19 #29 ATAGTGGCGTGGATATGGCACGCCAG I I I ClACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
20 #31 ATAAAGGCGTGGATATGGCACGCCGG I I I C I'ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
21 #33 ATAGTTGCGTGGATATGGCACGCAAG I I I CI ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
22 #36 ATAGCGGCGTGGATATGGCACGCTGG I I I C I'ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 58/78
53/55
SEQ ID NO: Construt 0 Sequência
23 #41 ATAATGGCGTGGATATGGCACGCTAG I I I CIACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
24 #46 ATAATTGCGTGGATATGGCACGCAAG I I I CI ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
25 #54 ATAATTGCGTGGATATGGCACGCGAG I I I CI ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
26 #61 ATAATCGCGTGGATATGGCACGCGAG I I I CI ACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
27 #69 ATAACTGCGTGGATATGGCACGCGGG I I I ClACCGGGC ACCGTAAATGTCCGACT
[0195] Um dos construtos novos, #46, foi adicionalmente testado. Conforme mostrado na Figura 6e e na Figura 6f, o construto novo #46 respondeu ao tratamento de NAD+ de maneira dependente de dose e mostrou melhora superior no nível de expressão de gene repórter induzida, assim como na indução em vezes em comparação com o construto G17. Os construtos novos também têm regulação de gene melhorada em resposta ao tratamento de guanina (dados não mostrados).
[0196] Deste modo, a presente invenção fornece uma abordagem em que uma biblioteca relativamente grande de riboswitches pode ser dividida em subbiblioteca menor de riboswitches que é triável através de um ensaio baseado em célula de mamífero. Além disto, a partir da biblioteca de riboswitches, sequências novas que melhoraram as atividades de riboswitch em células de mamífero foram constatadas.
[0197] Referências:
[0198] 1. Mandai, Maumita, Benjamin Boese, Jeffrey E. Barrick, Wade C. Winkler e Ronald R. Breaker. “Riboswitches Control Fundamental Biochemical Pathways in Bacillus Subtilis and Other Bacteria. Cell 113, nQ 5 (30 de maio de 2003): 577 a 586.
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 59/78
54/55 [0199] 2. Mandai, Maumita e Ronald R. Breaker. “Adenine Riboswitches and Gene Activation by Disruption of a Transcription Terminator. Nature Structural & Molecular Biology 11, nQ 1 (Janeiro de 2004): 29 a 35. doi: 10.1038/nsmb710.
[0200] 3. Mulhbacher, Jerome e Daniel A. Lafontaine. “Ligand Recognition Determinants of Guanine Riboswitches. Nucleic Acids Research 35, nQ 16 (2007): 5568 a 5580. doi:10.1093/nar/gkm572.
[0201] 4. Serganov, Alexander, Yu-Ren Yuan, Olga Pikovskaya, Anna Polonskaia, Lucy Malinina, Anh Tuan Phan, Claudia Hobartner, Ronald Micura, Ronald R. Breaker e Dinshaw J. Patel. “Structural Basis for Discriminative Regulation of Gene Expression by Adenine- and Guanine-Sensing mRNAs. Chemistry & Biology 11, nQ 12 (dezembro de 2004): 1729 a 1741. doi:10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
[0202] 5. Edwards, Andrea L. e Robert T. Batey. “A Structural Basis for the Recognition of 2’-deoxyguanosine by the Purine Riboswitch. Journal of Molecular Biology 385, nQ 3 (23 de janeiro de 2009): 938 a 948. doi:10.1016/j.jmb.2008.10.074.
[0203] 6. Batey, Robert T., Sunny D. Gilbert e Rebecca K. Montange. “Structure of a Natural Guanine-Responsive Riboswitch Complexed with the Metabolite Hypoxanthine. Nature 432, nQ 7015 (18 de novembro de 2004): 411 a 415. doi:10.1038/nature03037.
[0204] 7. Serganov, Alexander, Yu-Ren Yuan, Olga Pikovskaya, Anna Polonskaia, Lucy Malinina, Anh Tuan Phan, Claudia Hobartner, Ronald Micura, Ronald R. Breaker e Dinshaw J. Patel. “Structural Basis for Discriminative Regulation of Gene Expression by Adenine- and Guanine-Sensing mRNAs. Chemistry & Biology 11, nQ 12 (dezembro de 2004): 1729 a 1741. doi :10.1016/j.chembiol.2004.11.018.
[0205] 8. Ellington, A. D. e J. W. Szostak. “In Vitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands. Nature 346, nQ 6287 (quinta-feira, 30 de agosto de 1990): 818 a 822. doi:10.1038/346818a0.
[0206] 9. Tuerk, C., e L. Gold. “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase. Science (New York, N.Y.) 249, nQ 4968 (3 de agosto de 1990): 505 a 510.
[0207] 10. Ozer, Abdullah, John M. Pagano e John T. Lis. “New Technologies
Petição 870190065285, de 11/07/2019, pág. 60/78
55/55
Provide Quantum Changes in the Scale, Speed, and Success of SELEX Methods and Aptamer Characterization”. Molecular Therapy. Nucleic Acids 3 (2014): e183. doi:10.1038/mtna.2014.34.
[0208] 11. Kebschull, Justus M. e Anthony M. Zador. “Sources of PCRInduced Distortions in High-Throughput Sequencing Data Sets”. Nucleic Acids Research 43, nQ 21 (2 de dezembro de 2015): e143. doi:10.1093/nar/gkv717.

Claims (46)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para selecionar um aptâmero que se liga a um ligante em células eucarióticas caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) fornecer uma biblioteca de aptâmeros, (b) introduzir os membros da biblioteca de aptâmeros num cassete de polinucleotídeo para a expressão ligada por ligante de um gene repórter para criar uma biblioteca de riboswitches, (c) introduzir a biblioteca de riboswitches em células eucarióticas, e (d) colocar as células eucarióticas em contato com um ligante, e (e) medir a expressão do gene repórter, em que o cassete de polinucleotídeo compreende um éxon alternativamente emendado, flanqueado por um íntron 5' e um íntron 3', e um riboswitch que compreende (i) uma região efetora que compreende um tronco que inclui o local de emenda 5' do íntron 3', e (ii) um aptâmero, em que o éxon alternativamente emendado compreende um códon de parada que está em armação com o gene repórter quando o éxon alternativamente emendado é emendado no mRNA de gene repórter.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de aptâmeros compreende aptâmeros que têm um ou mais nucleotideos randomizados.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante é uma molécula pequena.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ligante é uma molécula produzida pela célula eucariótica selecionada a partir do grupo que consiste num metabolite, ácido nucleico, vitamina, cofator, lipídio, monossacarídeo e segundo mensageiro.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o eucariótico é selecionado dentre uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula vegetal e uma célula de levedura.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene repórter é selecionado a partir do grupo que consiste numa proteína fluorescente, luciferase, β-galactosidase e rábano peroxidase.
    Petição 870190010770, de 01/02/2019, pág. 20/27
    2/7
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 10 vezes maior quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, os introns 5' e 3' são derivados do intron 2 do gene de β-globina humano.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os introns 5' e 3' têm, cada um, independentemente, de cerca de 50 a cerca de 300 nucleotídeos de comprimento.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os introns 5' e 3' são cada um, independentemente, de cerca de 125 a cerca de 240 nucleotídeos de comprimento.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região efetora tronco é cerca de 7 a cerca de 20 pares de base de comprimento.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região efetora tronco é 8 a 11 pares de base de comprimento.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado é derivado do grupo que consiste em éxon 2 do gene de di-hidrofolato redutase humano, tumor Wilms humano mutante 1 éxon 5, éxon delta proteína dependente de cálcio/calmodulinaquinase II de camundongo 16, e éxon SIRT1 6.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado é o éxon modificado 2 de DHFR humano.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, em que o éxon alternativamente emendado é sintético.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado foi modificado por um ou mais dentre o grupo que consiste em alterar a sequência de um acentuador de emenda de éxon, alterar a sequência de silenciador de emenda de éxon, adicionar um acentuador de emenda de éxon e adicionar um silenciador de emenda de éxon.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de
    Petição 870190010770, de 01/02/2019, pág. 21/27
    3/7 que a biblioteca de aptâmeros é dividido uma biblioteca de aptâmeros menor antes de introduzir os cassetes de polinucleotídeo que compreendem as etapas:
    a. fornecer uma biblioteca de aptâmeros randomizados em que os aptâmeros na biblioteca compreendem regiões constantes de 5' e 3' múltiplas e um ou mais nucleotideos randomizados,
    b. realizar um PCR de dois ciclos com o uso de biblioteca de aptâmeros randomizados como o modelo e um primeiro iniciador e segundo iniciador que são complementares às regiões constantes de 5' e 3',
    c. isolar os produtos do PCR de dois ciclos, e
    d. PCR amplificar um subconjunto dos produtos isolados do PCR de dois ciclos com o uso de iniciadores complementares a um subconjunto das regiões constantes de 5' e 3' exclusivas.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo iniciadores na PCR de dois ciclos compreende um rótulo selecionado a partir do grupo que consiste em biotina, digoxigenina (DIG), bromodeoxiuridina (BrdU), fluoróforo e um grupo químico usado na química click.
  19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de riboswitches é dividida numa ou mais sub-bibliotecas de riboswitches antes de ser introduzida nas células eucarióticas.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de riboswitches é subdividida em sub-bibliotecas que compreendem as etapas de:
    (a) introduzir a biblioteca de riboswitches nas bactérias;
    (b) coletar clones bacterianos e extrair DNA de plasmídeo para obter subbibliotecas de plasmídeos de riboswitches para gerar um ou mais sub-bibliotecas primárias;
    (c) opcionalmente, gerar sub-bibliotecas secundárias de riboswitches de uma sub-biblioteca de plasmídeos primária de riboswitches introduzindo-se uma sub-biblioteca primária em bactérias, coletando clones bacterianos e isolando o DNA de plasmídeo.
  21. 21. Método para selecionar um ligante que se liga a um aptâmero numa
    Petição 870190010770, de 01/02/2019, pág. 22/27
    4/7 célula eucariótica caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) fornecer uma biblioteca de ligantes, (b) fornecer um cassete de polinucleotídeo para a expressão ligada por ligante de um gene repórter, (c) introduzir o cassete de polinucleotídeo na célula eucariótica, (d) colocar grupos individuais da célula eucariótica em contato com membros da biblioteca de ligantes, e (e) medir a expressão do gene repórter, em que o cassete de polinucleotídeo compreende um éxon alternativamente emendado, flanqueado por um íntron 5' e um íntron 3', e um riboswitch que compreende (i) uma região efetora que compreende um tronco que inclui o local de emenda 5' do íntron 3', e (ii) um aptâmero, em que o éxon alternativamente emendado compreende um códon de parada que está em armação com o gene repórter quando o éxon alternativamente emendado é emendado no mRNA de gene repórter.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ligante é uma molécula pequena.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o ligante é uma molécula produzida pela célula eucariótica.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ligante é um metabolite, ácido nucleico, vitamina, cofator, lipídio, monossacarídeo e segundo mensageiro
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica é selecionada a partir do grupo que consiste numa célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula vegetal e uma célula de levedura.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o gene repórter é selecionado a partir do grupo que consiste numa proteína fluorescente, luciferase, β-galactosidase e rábano peroxidase.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o gene repórter é selecionado a partir do grupo que consiste numa citocina, uma molécula de sinalização, um hormônio de crescimento, um antibiótico, um RNA regulador, uma proteína terapêutica ou um peptídeo.
    Petição 870190010770, de 01/02/2019, pág. 23/27
    5/7
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene repórter é maior do que cerca de 10 vezes maior quando o ligante se liga especificamente ao aptâmero do que os níveis de expressão de gene repórter quando o ligante é ausente.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que, os introns 5' e 3' são derivados do íntron 2 do gene de β-globina humano.
  30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os introns 5' e 3' têm, cada um, independentemente, de cerca de 50 a cerca de 300 nucleotídeos de comprimento.
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os introns 5' e 3' são cada um, independentemente, de cerca de 125 a cerca de 240 nucleotídeos de comprimento.
  32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a região efetora tronco é cerca de 7 a cerca de 20 pares de base de comprimento.
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a região efetora tronco é 8 a 11 pares de base de comprimento.
  34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado é derivado do grupo que consiste em éxon 2 do gene de di-hidrofolato redutase humano, tumor Wilms humano mutante 1 éxon 5, éxon delta proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II de camundongo 16, e éxon SIRT1 6.
  35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado é o éxon modificado 2 de DHFR humano.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que, em que o éxon alternativamente emendado é sintético.
  37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o éxon alternativamente emendado foi modificado por um ou mais dentre o grupo que consiste em alterar a sequência de um acentuador de emenda de éxon, alterar a sequência de silenciador de emenda de éxon, adicionar um acentuador de emenda de éxon e adicionar um silenciador de emenda de éxon.
  38. 38. Método para dividir uma biblioteca de aptâmeros randomizados em sub
    Petição 870190010770, de 01/02/2019, pág. 24/27
    6/7 bibliotecas de aptâmeros menores caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:
    a. fornecer uma biblioteca de aptâmeros randomizados em que os aptâmeros na biblioteca compreendem regiões constantes de 5' e 3' múltiplas e um ou mais nucleotídeos randomizados,
    b. realizar um PCR de dois ciclos com o uso da biblioteca de aptâmeros randomizados como modelo e primeiros iniciadores e segundos iniciadores que são complementares às regiões constantes de 5' e 3',
    c. isolar os produtos do PCR de dois ciclos, e
    d. PCR amplificar um subconjunto dos produtos isolados do PCR de dois ciclos com o uso de iniciadores complementares a um subconjunto das regiões constantes de 5' e 3' exclusivas.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende aptâmeros que têm um ou mais nucleotídeos randomizados.
  40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende mais do que cerca de 100000 aptâmeros.
  41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de aptâmeros randomizados compreende mais do que cerca de 1000000 aptâmeros.
  42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo iniciadores na PCR de dois ciclos compreende um rótulo selecionado a partir do grupo que consiste em biotina, digoxigenina (DIG), bromodeoxiuridina (BrdU), fluoróforo e um grupo químico usado na química click.
  43. 43. Aptâmero caracterizado pelo fato de que é selecionado pelos métodos, conforme definido nas reivindicações 1 a 20.
  44. 44. Ligante caracterizado pelo fato de que é selecionado pelos métodos, conforme definido nas reivindicações 21 a 37.
  45. 45. Aptâmero codificado por uma sequência caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 a 27.
  46. 46. Aptâmero codificado por uma sequência caracterizado pelo fato de que
BR112019002085A 2016-08-03 2017-08-03 triagem baseada em célula de alto rendimento para aptâmeros BR112019002085A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662370599P 2016-08-03 2016-08-03
PCT/IB2017/001113 WO2018025085A2 (en) 2016-08-03 2017-08-03 High throughput cell-based screening for aptamers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019002085A2 true BR112019002085A2 (pt) 2019-08-06

Family

ID=60182820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019002085A BR112019002085A2 (pt) 2016-08-03 2017-08-03 triagem baseada em célula de alto rendimento para aptâmeros

Country Status (25)

Country Link
US (2) US11371077B2 (pt)
EP (1) EP3494229B1 (pt)
JP (2) JP7089502B2 (pt)
KR (1) KR102491566B1 (pt)
CN (1) CN110199030B (pt)
AU (2) AU2017306657B2 (pt)
BR (1) BR112019002085A2 (pt)
CA (1) CA3066654C (pt)
DK (1) DK3494229T3 (pt)
EA (1) EA201990423A1 (pt)
ES (1) ES2971123T3 (pt)
FI (1) FI3494229T3 (pt)
HR (1) HRP20240183T1 (pt)
HU (1) HUE065801T2 (pt)
IL (1) IL264490B2 (pt)
LT (1) LT3494229T (pt)
MX (1) MX2019001239A (pt)
MY (1) MY196527A (pt)
PH (1) PH12019500239A1 (pt)
PL (1) PL3494229T3 (pt)
PT (1) PT3494229T (pt)
RS (1) RS65228B1 (pt)
SG (1) SG11201900851QA (pt)
SM (1) SMT202400091T1 (pt)
WO (1) WO2018025085A2 (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017136591A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Meiragtx Uk Ii Limited Regulation of gene expression through aptamer-modulated polyadenylation
DK3494229T3 (da) * 2016-08-03 2024-01-29 Meiragtx Uk Ii Ltd Cellebaseret højkapacitetsscreening til aptamerer
BR112019017444A2 (pt) 2017-02-21 2020-04-14 Meiragtx Uk Ii Ltd regulação da expressão gênica por acessibilidade mediada por aptâmero de sinais de poliadenilação
CN112020559A (zh) 2018-02-21 2020-12-01 百时美施贵宝公司 Camk2d反义寡核苷酸及其用途

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
EP0786469B1 (en) 1990-06-11 2006-03-01 Gilead Sciences, Inc. Methods of use of nucleic acid ligands
US6867289B1 (en) * 1998-10-26 2005-03-15 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Thio-modified aptamer synthetic methods and compositions
US8008071B2 (en) * 1999-11-08 2011-08-30 University Of South Florida Compositions and methods for detecting intracellular glucose and analogs thereof
US20040126882A1 (en) 2000-06-15 2004-07-01 Ellington Andrew D Regulatable, catalytically active nucleic acids
EP1546733A2 (en) 2002-09-27 2005-06-29 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modification of splicing of pre-mrna
US20050136439A1 (en) * 2003-09-12 2005-06-23 North Carolina State University Novel methods of inorganic compound discovery and synthesis
US20080269258A1 (en) * 2004-11-08 2008-10-30 Breaker Ronald R Riboswitches, Structure-Based Compound Design with Riboswitches, and Methods and Compositions for Use of and with Riboswitches
WO2006084868A2 (en) * 2005-02-09 2006-08-17 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
US8367627B2 (en) * 2005-09-15 2013-02-05 Duke University Focused libraries, functional profiling, laser SELEX, and DESELEX
CN101801185A (zh) 2007-03-22 2010-08-11 耶鲁大学 与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物
JP2010528616A (ja) 2007-05-29 2010-08-26 イェール ユニバーシティー オルタナティブスプライシングとｒｎａのスプライシングを調節するリボスイッチに関連する方法と組成物
US8604176B2 (en) 2009-11-10 2013-12-10 California Institute Of Technology Protein-responsive RNA control devices and uses thereof
WO2013178674A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Novozymes A/S Improved selection in fungi
CA2897390A1 (en) * 2013-01-10 2014-07-17 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Templates, libraries, kits and methods for generating molecules
KR20240133774A (ko) * 2015-02-02 2024-09-04 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 압타머-매개된 조정된 선택적 스플라이싱에 의한 유전자 발현 제어
GB201506440D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Riboswitch-controlled screening and selection of desired biocatalysts
DK3494229T3 (da) * 2016-08-03 2024-01-29 Meiragtx Uk Ii Ltd Cellebaseret højkapacitetsscreening til aptamerer
US10011870B2 (en) * 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules

Also Published As

Publication number Publication date
LT3494229T (lt) 2024-02-12
PT3494229T (pt) 2024-02-20
EP3494229A2 (en) 2019-06-12
SMT202400091T1 (it) 2024-05-14
WO2018025085A2 (en) 2018-02-08
NZ750917A (en) 2023-08-25
IL264490B1 (en) 2024-02-01
ES2971123T3 (es) 2024-06-03
CA3066654A1 (en) 2018-02-08
US20200239940A1 (en) 2020-07-30
KR102491566B1 (ko) 2023-01-26
CN110199030A (zh) 2019-09-03
KR20190058461A (ko) 2019-05-29
AU2023201431A1 (en) 2023-04-13
JP7089502B2 (ja) 2022-06-22
AU2017306657A1 (en) 2019-03-14
RS65228B1 (sr) 2024-03-29
JP2019523013A (ja) 2019-08-22
US20230065720A1 (en) 2023-03-02
SG11201900851QA (en) 2019-02-27
CN110199030B (zh) 2023-12-12
WO2018025085A3 (en) 2018-04-12
FI3494229T3 (fi) 2024-01-29
PL3494229T3 (pl) 2024-03-25
HRP20240183T1 (hr) 2024-04-26
DK3494229T3 (da) 2024-01-29
HUE065801T2 (hu) 2024-06-28
CA3066654C (en) 2023-07-18
MX2019001239A (es) 2019-07-04
IL264490A (en) 2019-02-28
EP3494229B1 (en) 2023-10-25
AU2017306657B2 (en) 2022-12-08
PH12019500239A1 (en) 2019-07-29
US11371077B2 (en) 2022-06-28
EA201990423A1 (ru) 2019-09-30
JP2022113773A (ja) 2022-08-04
IL264490B2 (en) 2024-06-01
MY196527A (en) 2023-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nielsen et al. Best practice standards for circular RNA research
Breslow et al. A CRISPR-based screen for Hedgehog signaling provides insights into ciliary function and ciliopathies
US20230065720A1 (en) High Throughput Cell-Based Screening for Aptamers
Zünd et al. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs
Dönertas et al. Drosophila Gtsf1 is an essential component of the Piwi-mediated transcriptional silencing complex
AU2014316676B2 (en) Site-specific nuclease single-cell assay targeting gene regulatory elements to silence gene expression
Jaffrey RNA-based fluorescent biosensors for detecting metabolites in vitro and in living cells
Kaur et al. Building the bacterial orisome: high‐affinity DnaA recognition plays a role in setting the conformation of oriC DNA
Desideri et al. Intronic determinants coordinate charme lncRNA nuclear activity through the interaction with MATR3 and PTBP1
Iwamoto et al. Transcription-dependent nucleolar cap localization and possible nuclear function of DExH RNA helicase RHAU
Ueberschär et al. BEN-solo factors partition active chromatin to ensure proper gene activation in Drosophila
Liu et al. NAP-seq reveals multiple classes of structured noncoding RNAs with regulatory functions
Zhang et al. Reconstitution of Mycobacterium marinum nonhomologous DNA end joining pathway in Leishmania
EA047916B1 (ru) Высокопроизводительный клеточный скрининг на аптамеры
Niu et al. DNA 5-methylcytosine regulates genome-wide formation of G-quadruplex structures
NZ790928A (en) High throughput cell-based screening for aptamers
Tsotakos et al. Regulation of translation by upstream translation initiation codons of surfactant protein A1 splice variants
NZ750917B2 (en) High throughput cell-based screening for aptamers
Hebert The SWI/SNF Related Protein SMARCA3 Is a Histone H3K23 Ubiquitin Ligase that Regulates H3K9ME3 in Cancer
Rong et al. DNA binding domain undergoes dynamic and selective protein–protein interactions to facilitate CTCF insulation
Remes-Lenicov et al. Identification of novel transcriptional regulators in the nervous system
Jeandard RNA import into mitochondria of human cells: large-scale identification and therapeutic applications
Liu The regulation of alternative pre-mRNA splicing, activity-induced splicing and adaptive splicing by DNA methylation
Targa Human cells can adaptively evolve to hypomorphic mutations in an essential gene of the nuclear pore complex
Fagg IV Quaking RNA binding proteins regulate tissue-specific gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]