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BR112018015155B1 - Métodos para determinar a presença ou ausência de um microorganismo em uma amostra e para testar rapidamente uma matriz alimentar - Google Patents

Métodos para determinar a presença ou ausência de um microorganismo em uma amostra e para testar rapidamente uma matriz alimentar Download PDF

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BR112018015155B1
BR112018015155B1 BR112018015155-6A BR112018015155A BR112018015155B1 BR 112018015155 B1 BR112018015155 B1 BR 112018015155B1 BR 112018015155 A BR112018015155 A BR 112018015155A BR 112018015155 B1 BR112018015155 B1 BR 112018015155B1
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BR
Brazil
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droplets
water
oil
droplet
microorganisms
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BR112018015155-6A
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BR112018015155A2 (pt
Inventor
Christophe QUIRING
Christine Favier
Patrice Sarfati
Jean Francois Mouscadet
Ronald Lebofsky
Rebecca DIEVART
Original Assignee
Bio-Rad Europe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio-Rad Europe Gmbh filed Critical Bio-Rad Europe Gmbh
Priority claimed from PCT/IB2017/000086 external-priority patent/WO2017130059A1/en
Publication of BR112018015155A2 publication Critical patent/BR112018015155A2/pt
Publication of BR112018015155B1 publication Critical patent/BR112018015155B1/pt

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Abstract

Métodos, composições e kits são providos para analisar rapidamente crescimento microbiano e/ou número em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo.

Description

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Norte- Americano No. 62/286.897 depositado em 25 de janeiro de 2016, o qual está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[002] Identificar e/ou quantificar microrganismos é relevante para muitos campos. O cultivo de microrganismos é uma etapa em vários ensaios e leva um ou mais dias para ser realizado. Acelerar a etapa de cultivo seria uma melhoria útil para uma variedade de ensaios microbiológicos.
[003] A indústria alimentícia está sujeita a uma infinidade de requisitos para o monitoramento de inúmeros parâmetros de segurança alimentar. Por exemplo, os processadores de alimentos geralmente são obrigados a analisar e controlar perigos biológicos, químicos e físicos, desde a produção de matéria-prima, aquisição e manuseio até a fabricação, distribuição e consumo do produto alimentício acabado. Um aspecto desses requisitos envolve a enumeração de indicadores de qualidade de alimentos microbianos (QI). Tal enumeração de QI indica a qualidade higiênica do alimento testado. Esta informação de qualidade higiênica fornece uma indicação da probabilidade de organismos patogênicos estarem presentes nos alimentos, bem como da vida útil do alimento. Exemplos de técnicas de enumeração de QI incluem técnicas de contagem de colônias e número mais provável (NMP). Geralmente, tais técnicas podem ser propensas a erros humanos ou à variabilidade inerente do ensaio. Além disso, tais técnicas podem requerer reagentes especializados para enumeração de diferentes microrganismos alvo. Além disso, essas técnicas podem exigir longos períodos de incubação (por exemplo, de 18 a 24 horas ou até 5 dias) antes que um resultado seja obtido. Além disso, essas técnicas podem necessitar de uma quantidade indevida de intervenção manual.
[004] No cenário clínico, microrganismos patogênicos podem apresentar vários graus de suscetibilidade a agentes antimicrobianos. Assim, os clínicos geralmente se beneficiam da identificação tanto da espécie ou linhagem do patógeno quanto de sua suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos e suas combinações. Contudo, os métodos para a avaliação clínica de infecções microbianas que são utilizados na técnica tipicamente requerem pelo menos 16 a 48 h para determinar a susceptibilidade antimicrobiana. Além disso, os métodos típicos de teste de susceptibilidade antimicrobiana podem ser propensos a erros humanos ou à variabilidade inerente do ensaio. Além disso, tais técnicas podem requerer reagentes especializados para a avaliação de diferentes microrganismos alvo. Além disso, essas técnicas podem necessitar de uma quantidade indevida de intervenção manual.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] São aqui descritos métodos e composições para determinar a presença ou a ausência de um microrganismo em uma amostra. Também são aqui descritos métodos para testar rapidamente uma matriz alimentar para vários microrganismos alvo por unidade de massa ou volume. Adicionalmente, os métodos (por exemplo, testes de susceptibilidade) para testar rapidamente um microrganismo alvo para uma concentração inibitória mínima de um antimicrobiano de teste são descritos na presente invenção.
[006] Em uma modalidade, um método para determinar a presença ou ausência de um microrganismo em uma amostra compreende i) encapsular uma amostra em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo, em que as gotículas de emulsão de água em óleo encapsulam adicionalmente um meio de crescimento microbiológico; ii) incubar a pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo a uma temperatura permissiva de crescimento microbiológico e por um período de tempo suficiente para permitir que os microrganismos alvo passem por 5 a 45 vezes os tempos de duplicação; iii) identificar as gotículas de emulsão de água em óleo compreendendo os microrganismos alvo; e iv) responder à identificação do microrganismo alvo em pelo menos uma gotícula de emulsão de água em óleo, determinando que o microrganismo alvo está presente na amostra.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[007] As figuras 1A a 1J ilustram os resultados de um experimento de comprovação do conceito no qual células de E. coli foram divididas em gotículas, incubadas em um período de crescimento para os tempos indicados e observadas com microscopia visível ou fluorescente. Os resultados indicam que as bactérias podem ser detectadas em 6 horas ou menos e que uma autofluorescência forte pode ser detectada em 8 horas ou menos.
[008] As figuras 2A e 2B ilustram os resultados de um experimento em que as matrizes de alimentos indicadas foram testadas quanto à compatibilidade com a geração de gotículas.
[009] As figuras 3A a 3O ilustram a enumeração rápida de E. coli de uma matriz de presunto utilizando gotículas de água em óleo.
[0010] As figuras 4A a 4J ilustram a detecção rápida de várias bactérias usando gotículas de água em óleo.
[0011] As figuras 5A a 5F ilustram a detecção rápida de várias leveduras e mofos usando gotículas de água em óleo.
[0012] As figuras 6A e 6B ilustram a enumeração precisa de bactérias alvo através da contagem de gotículas positivas e negativas em um leitor de gotículas automatizado.
[0013] As figuras 7A e 7B ilustram a enumeração precisa de bactérias alvo através da contagem de gotículas positivas e negativas em um leitor de gotículas automatizado.
[0014] As figuras 8A a 8D ilustram o uso de um substrato de β- galactosidase para detectar e/ou enumerar especificamente um microrganismo alvo que expressa a enzima β-galactosidase.
[0015] As figuras 9A e 9B ilustram a detecção de C. albicans nas gotículas sem incubação.
[0016] As figuras 10A a 10C ilustram o equivalente de inóculo de C. albicans a 0,1 McFarland e que conjuga a 1/200 após 5 horas de incubação.
[0017] As figuras 11A a 11C ilustram o equivalente de inóculo de C. albicans a 0,1 McFarland e que conjuga a 1/200 após 24 horas.
[0018] As figuras 12A e 12B ilustram o equivalente de inóculo de C. parapsilosis a 1 McFarland e que conjuga a 1/200 sem incubação.
[0019] As figuras 13A a 13B são uma amostra de S. aureus (“SA”) positiva para o iodeto de propídio (“PI”) sem cefoxitina (“FOX”) após 6 horas de incubação.
[0020] As figuras 14A a 14C são uma amostra de SA + PI + 0,25 mg/L de FOX após 6 horas de incubação.
[0021] As figuras 15A a 15C são uma amostra de SA + PI + 0,5 mg/L de FOX após 6 horas de incubação.
[0022] As figuras 16A a 16C são uma amostra de SA + PI + 4 mg/L de FOX após 6 horas de incubação.
[0023] As figuras 17A a 17F ilustram o uso de iodeto de propídio e uma etapa de aquecimento para aumentar o sinal fluorescente detectado a partir de gotículas com crescimento bacteriano (G). As gotículas foram formadas a partir do caldo de água peptonada tamponada enriquecido com E. coli ATCC 25922 na ausência (figuras 17A e 17D) ou presença (figuras 17B e 17C e 17E e 17F) de iodeto de propídio. As gotículas foram incubadas 24 horas a 37 °C. As gotículas mostradas nas figuras 17C e 17F também foram aquecidas a 90 °C durante 5 minutos.
[0024] As figuras 18A a 18D ilustram o uso de um indicador de pH para detecção de microrganismos. As gotículas foram formadas a partir do caldo triptona-glicose enriquecido com E. coli ATCC 25922 na ausência (figuras 18A e 18C) ou presença (figuras 18B e 18D) de vermelho pHrodo®.
[0025] As figuras 19A a 19D ilustram o uso de um substrato de β- glicosídeo para detectar e/ou enumerar especificamente um microrganismo alvo que expressa a enzima β-glicosidase. As gotículas foram formadas a partir de caldo de água peptonada tamponada enriquecido com Enterobacter aerogenes ATCC 13048 na ausência (figuras 19A e 19C) ou presença (figuras 19B e 19D) de ALDOL®518-β-glicosideo.
[0026] As figuras 20A e 20B ilustram uma condição de controle em que nenhum composto antifúngico foi incluído na fase oleosa das gotículas de fase oleosa com esporos de mofo (isto é, Fusarium graminearum DSM 1096) na fase aquosa. Após 48 horas de incubação, hifas de mofo conseguiram atravessar as membranas das gotículas, causando a coalescência das gotículas (figura 20A). O crescimento adicional levou à esporulação (figura 20B).
[0027] As figuras 21A e 21B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 60 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 21A e 21B mostram o crescimento de Mucor racemosus CECT 20821 em caldo YCG após 48 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa.
[0028] As figuras 22A a 22D ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 40 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. O Mucor racemosus CECT 20821 em caldo YCG foi incubado durante 48 horas na presença de diclorano na fase oleosa. O substrato fluorogênico diacetato de 5,6-carboxifluoresceina (25 mg/dL) foi adicionado ao caldo para obter as imagens mostradas nas figuras 22C e 22D).
[0029] As figuras 23A e 23B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 80 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 23A e 23B mostram o crescimento de Aspergillus restrictus CECT 20807 em caldo YCG após 24 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa. Na figura 23A, a entrada da lâmina está no lado direito da figura.
[0030] As figuras 24A e 24B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 100 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 24A e 24B mostram o crescimento de Aspergillus restrictus CECT 20807 em caldo YCG após 48 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa. Na figura 24A, a entrada da lâmina está no lado direito da figura.
[0031] As figuras 25A e 25B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 80 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 25A e 25B mostram o crescimento de Penicillium hirsutum ATCC 16025 em caldo YCG após 24 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa. A entrada da lâmina corrediça está no lado esquerdo da figura 25A e no lado direito da figura 25B.
[0032] As figuras 26A e 26B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 60 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 26A e 26B mostram o crescimento de Erotium rubrum CECT 20807 em caldo YCG após 24 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa.
[0033] As figuras 27A e 27B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 80 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 27A e 27B mostram o crescimento de Erotium rubrum CECT 20807 em caldo YCG após 48 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa. Na figura 27A, a entrada da lâmina está no lado direito da figura.
[0034] As figuras 28A e 28B ilustram a inibição do crescimento de Erotium rubrum CECT 20807 fora da fase aquosa quando 80 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. O substrato fluorogênico diacetato de 5,6-carboxifluoresceína (25 mg/L) foi adicionado ao caldo.
[0035] As figuras 29A e 29B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 100 mg/L de diclorano é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 29A e 29B mostram o crescimento de Fusarium graminearum DSM 1096 em caldo YCG após 48 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de diclorano na fase oleosa. Na figura 29A, a entrada da lâmina está no lado direito da figura.
[0036] As figuras 30A e 30B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 150 mg/L de rosa bengala é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 30A e 304B mostram o crescimento de Aspergillus restrictus CECT 20807 após 48 horas de incubação na ausência ou na presença, respectivamente, de rosa bengala na fase oleosa.
[0037] As figuras 31A e 31B ilustram a inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa quando 0,5 mg/L de imazalil é incluído na fase oleosa das gotículas de água em óleo. As figuras 31A e 31B mostram o crescimento de Penicillium hirsutum ATCC 16025 após 48 horas de incubação na ausência ou presença, respectivamente, de imazalil na fase oleosa.
[0038] As figuras 32 a 35 ilustram o uso de lectina para detecção de microrganismos. A figura 32 é uma imagem de gotículas tendo C. glabrata e concanavalina A (ConA) marcada com fluoresceína. A figura 33 é uma imagem de gotículas tendo C. tropicalis e ConA. A figura 34 é uma imagem de gotículas tendo E. coli e ConA. A figura 35 é uma imagem mesclada de uma imagem visível e de uma imagem de fluorescência verde de gotículas contendo C. krusei e ConA.
[0039] As figuras 36A e 36B ilustram o crescimento de Candida albicans ATCC 10231 em uma gotícula não gelificada (figura 36A) e de uma gotícula gelificada (figura 36B).
[0040] As figuras 37A a 37D ilustram condições de controle para assegurar que a gelificação não ocorreu devido à presença de apenas agente gelificante. As gotículas continham Candida albicans ATCC 10231 em caldo YGC na fase aquosa e 0,1% (v/v) de ácido acético na fase oleosa. As setas mostram exemplos de gotículas positivas para Candida albicans.
[0041] As figuras 38A a 38D ilustram condições de controle para assegurar que a gelificação não ocorreu devido à presença de apenas agente gelificante. As gotículas continham Saccharomyces cerecisiae DSM 1333 em caldo YGC na fase aquosa e 0,1% (v/v) de ácido acético na fase oleosa. As setas mostram exemplos de gotículas positivas para Saccharomyces cerecisiae.
[0042] As figuras 39A a 39C e as figuras 40A a 40C ilustram a gelificação na presença da cepa de levedura acidificante Saccharomyces cerecisiae DSM 1333 (figuras 39B e 40B) e da cepa de levedura não acidificante Debaryomyces hansenii CLIB 197 (figuras 39C e 40C). As cepas foram cultivadas durante 24 horas em caldo YGC suplementado com 1 g/L de carbonato de cálcio. Não foi adicionado ácido acético ao óleo. As figuras 39A e 40A são controles negativos. As setas mostram exemplos de gotículas positivas para o microrganismo.
[0043] As figuras 41A a 41D ilustram a gelificação na ausência (figuras 41A e 41C) e na presença (figuras 41B e 41D) de ácido acético após gotículas contendo Saccharomyces cerecisiae DSM 1333 terem sido incubadas durante 24 horas.
[0044] As figuras 42A a 42D ilustram a gelificação na ausência (figuras 42A e 42C) e na presença (figuras 42B e 42D) de ácido acético após as gotículas contendo Candida albicans ATCC 10231 serem incubadas 48 horas.
[0045] As figuras 43A a 45B ilustram a utilização do substrato diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFDA) para detecção e/ou enumeração específica de microrganismos alvo que expressam a enzima esterase. As figuras 43A e 43B mostram a detecção de Candida albicans ATCC 10231 na ausência e presença, respectivamente, de CFDA. As figuras 44A e 44B mostram a detecção de Kluyveromyces lactis CLIB 196 na ausência e presença, respectivamente, de CFDA. As figuras 45A e 45B mostram a detecção de Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525 na ausência e presença, respectivamente, de CFDA. Em cada experimento, os microrganismos foram incubados 24 horas em caldo YGC com 25 mg/L de CFDA.
[0046] As figuras 46A a 46D ilustram a detecção e/ou enumeração específica de Mucor racemosus CECT 20821 na ausência (figuras 46A e 46B) e presença (figuras 46C e 46D), respectivamente, de 25 mg/L de CFDA após 48 horas de incubação em caldo YGC. O diclorano foi adicionado à fase oleosa para limitar o crescimento das hifas na fase aquosa.
[0047] As figuras 47A a 47D ilustram a detecção e/ou enumeração específica de Eurotium rubrum CECT 20808 na ausência (figuras 47A e 47B) e presença (figuras 47C e 47D), respectivamente, de 25 mg/L de CFDA após 24 horas de incubação em caldo YGC. O diclorano foi adicionado à fase oleosa para limitar o crescimento das hifas na fase aquosa.
[0048] As figuras 48A a 48D ilustram a detecção e/ou a enumeração de Fusarium graminearum DSM 1096 na ausência (figuras 48A e 48B) e presença (figuras 48C e 48D), respectivamente, de 25 mg/L de CFDA após 48 horas de incubação em caldo YGC. O diclorano foi adicionado à fase oleosa para limitar o crescimento das hifas na fase aquosa.
[0049] As figuras 49A e 49B ilustram a detecção e/ou enumeração específica de Candida tropicalis ATCC 750 na ausência (figuras 49A) e na presença (figuras 49B), respectivamente, de 50 mg/L de ALDOL® 515 fosfato após 24 horas de incubação em caldo YGC.
[0050] As figuras 50A e 50B ilustram a detecção e/ou enumeração específica de Sacchraromyces cerevisiae DSM 1333 na ausência (figuras 50A) e na presença (figuras 50B), respectivamente, de 50 mg/L de ALDOL® 515 fosfato após 24 horas de incubação em caldo YGC.
[0051] As figuras 51A a 51D ilustram a detecção e/ou a enumeração de Fusarium graminearum DSM 1096 na ausência (figuras 51A e 51B) e presença (figuras 51C e 51D), respectivamente, de 25 mg/L de ALDOL® 515 fosfato após 24 horas de incubação em caldo YGC. O diclorano foi adicionado à fase oleosa para limitar o crescimento das hifas na fase aquosa.
[0052] As figuras 52A a 52D ilustram a detecção e/ou enumeração específica de Mucor racemosus CECT 20821 na ausência (figuras 52A e 52B) e presença (figuras 52C e 52D), respectivamente, de 25 mg/L de ALDOL® 515 fosfato após 24 horas de incubação em caldo YGC. O diclorano foi adicionado à fase oleosa para limitar o crescimento das hifas na fase aquosa.
[0053] As figuras 53A a 539D ilustram o uso de um substrato de β- glucuronidase para detectar e/ou enumerar especificamente um microrganismo alvo que expressa a enzima β-glucuronidase. As gotículas foram formadas a partir do caldo de água peptonada tamponada enriquecido com E. coli ATCC 25922 na ausência (figuras 53A) ou presença (figura 53B) de resorufina-β-D-glucur0nico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Visão geral
[0054] São aqui descritos métodos, composições e kits onde tempos de duplicação mais curtos são requeridos em uma etapa de cultivo, permitindo analisar rapidamente a presença ou ausência de um microrganismo e/ou o crescimento ou o número de microrganismos em uma amostra. Esses métodos são úteis nas áreas de indicadores de qualidade (QI) para alimentos e meio ambiente e de diagnóstico clínico de infecções microbianas.
[0055] Ao analisar os alimentos, o método é realizado em qualquer matriz alimentar adequada, desde as matérias-primas até os produtos alimentícios acabados. Alimentos e produtos alimentícios incluem, mas não estão limitados a, alimentos sólidos e bebidas, incluindo água. A enumeração do QI de alimentos também inclui a análise do ambiente em que os alimentos são preparados, processados e armazenados. Essas amostras ambientais são amostras retiradas de equipamentos, superfícies, etc. onde o alimento está sendo preparado, processado e armazenado. Exemplos incluem swabs de balcões em uma cozinha e máquinas de corte.
[0056] Os métodos, composições e kits descritos também são úteis para determinar o QI do ambiente. Os ambientes a serem testados são qualquer tipo de ambiente onde microrganismos, se presentes, seriam prejudiciais para seres humanos ou animais. Tais ambientes podem ser internos ou externos e incluem, mas não estão limitados, à água usada em recreação (por exemplo, piscina, lagos), fazendas e superfícies em edifícios.
[0057] Os métodos, composições e kits aqui descritos também podem fornecer testes rápidos de suscetibilidade antimicrobiana e, opcionalmente, a identificação específica sem qualquer incubação ou dentro de um pequeno número de tempos de duplicação do(s) dito(s) microrganismo(s). O tempo de duplicação (também chamado de tempo médio de geração) é o tempo requerido para que uma dada população (n) duplique em número (2n) sob condições ideais de crescimento. Os tempos de duplicação para vários microrganismos são conhecidos e estão publicados na literatura. Opcionalmente, a identificação de microrganismos é realizada sem qualquer marcador sendo adicionado para aumentar o sinal do microrganismo identificado (por exemplo, por autofluorescência). Em outras modalidades, os reagentes se ligam ao microrganismo alvo para auxiliar na sua identificação e/ou quantificação.
[0058] Essa avaliação rápida da qualidade microbiana ou suscetibilidade antimicrobiana envolve particionar uma amostra contendo um ou mais microrganismos alvo em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo contendo um antibiótico ao qual a suscetibilidade deve ser testada, incubar as gotículas por, ou por pelo menos 1 a 35 (por exemplo, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 5 a 35, 5 a 30, 5 a 25, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20 ou 10 a 15) tempos de duplicação e detectar a presença ou ausência de microrganismos nas gotículas. Em modalidades em que a susceptibilidade antimicrobiana é avaliada, as gotículas contêm um antibiótico ou um antifúngico. Em algumas modalidades, diferentes concentrações de antimicrobianos são testadas. Sabe-se qual gota contém qual concentração de antibiótico pela adição de um identificador a cada gotícula. Tais identificadores podem ser corantes ou códigos de barras. Em algumas modalidades, nenhuma incubação é usada.
II. Composições
[0059] As químicas das gotículas de água em óleo aqui descritas incluem gotículas com peles e gotículas de tensoativo de fase dupla. Conforme utilizado na presente invenção, as gotículas de tensoativo de fase dupla contêm um óleo e um tensoativo de fase oleosa como a fase não aquosa e água, e um tensoativo de fase aquosa como a fase aquosa. Tais gotículas de água em óleo podem ser adaptadas para compatibilidade com: (i) crescimento microbiano e componentes do meio de cultura; (ii) matrizes alimentares; (iii) reagentes de detecção (por exemplo, um reagente de detecção fluorescente); (iv) antimicrobianos; (v) amostras clínicas; ou (vi) períodos de incubação prolongados (por exemplo, superiores a 4, 8, 24 ou 36 h) aumentando a estabilidade, ou uma combinação de dois, três, quatro ou cinco dos mesmos. Os inventores descobriram surpreendentemente que certas químicas de gotículas de água em óleo aqui descritas são compatíveis com uma grande variedade de matrizes alimentares ou clínicas. Além disso, os inventores verificaram surpreendentemente que certas químicas de gotículas de água em óleo e métodos de uso das mesmas podem proporcionar melhores resultados de enumeração de QI, identificação de microrganismos e/ou susceptibilidade antimicrobiana em um período de tempo reduzido. Além disso, surpreendentemente, certos microrganismos podem ser detectados através da detecção de autofluorescência de gotículas nas quais os microrganismos são cultivados, eliminando assim a necessidade de adição de um reagente de detecção. Alternativamente, um corante intercalante pode ser usado para detectar certos microrganismos. Surpreendentemente, certos corantes são eficazes sem lisar as células do microrganismo e não interrompem o crescimento celular.
A. Gotícula com composições de peles
[0060] As gotículas de emulsão de água em óleo aqui descritas incluem, mas não estão limitadas, àquelas que contêm uma “película” ou casca em uma interface entre uma fase aquosa e uma fase não aquosa. Essas peles são compostas por componentes formadores de película. Um componente formador da película é qualquer substância ou combinação de substâncias que promove a formação de uma película próximo ou em uma interface aquosa/não aquosa.
i. proteínas formadoras de película
[0061] Um componente formador de película pode incluir pelo menos uma proteína formadora de película. A proteína formadora de película pode ser disponibilizada em uma fase aquosa antes da combinação com uma fase não aquosa para formar gotículas. Alternativamente, o componente formador da película pode ser relativamente hidrófobo e pode, por conseguinte, ser disponibilizado em uma fase não aquosa antes de se combinar com uma fase aquosa para formar gotículas. Após combinar as fases aquosa e não aquosa, a proteína formadora de película pode ser recrutada para a interface aquosa/não aquosa antes ou durante a formação da película.
[0062] A proteína formadora de película pode estar presente em uma concentração eficaz para a formação de película detectável sob condições de formação de película (por exemplo, aquecimento). Concentrações eficazes exemplares incluem, mas não se limitam, a pelo menos cerca de 0,01% ou 0,03%, 0,03% a 3%, 0,05% a 2%, 0,1% a 1% ou cerca de 0,1% em peso. A proteína pode ser uma proteína formadora de película “bloqueadora não específica” ou uma proteína formadora de película “de ligação não específica”. A frase “bloqueio não específico” ou “ligação não específica”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se geralmente a uma capacidade de se ligar não específica a superfícies, ou seja, a superfícies hidrofóbicas e/ou hidrofílicas, por vezes com o auxílio de aquecimento. As proteínas de bloqueio/ligação não específicas são tipicamente proteínas solúveis em água, podem ser proteínas do soro ou do leite relativamente grandes (entre outras) e/ou podem não interagir com qualquer um dos outros componentes da fase aquosa se ligando especificamente. Exemplos de proteínas de bloqueio/ligação não específicas que podem ser adequadas como proteínas formadoras de película incluem, mas não se limitam, a albuminas (tais como albumina sérica (por exemplo, de boi (BSA), humana, de coelho, caprina, de ovelha ou cavalo, entre outras)), globulinas (por exemplo, beta- lactoglobulina), caseína e gelatina (por exemplo, gelatina de pele bovina tipo B) e fragmentos (por exemplo, fragmentos proteolíticos) das mesmas.
ii. tensoativos de fase aquosa
[0063] As gotículas de emulsão água em óleo que contêm uma película podem ser formadas com uma fase aquosa que contém um tensoativo, uma substância tensoativa capaz de reduzir a tensão superficial de um líquido em que está presente. Um tensoativo pode ser um detergente e/ou um agente umectante. Em algumas modalidades, o tensoativo contém uma porção hidrofílica e hidrofóbica e, portanto, é anfipático. A fase aquosa pode incluir pelo menos um tensoativo não iônico, pelo menos um tensoativo iônico ou pelo menos um não iônico e pelo menos um tensoativo iônico. Tensoativos exemplares incluem, mas não se limitam, a copolímeros em bloco de óxido de polipropileno e óxido de polietileno (por exemplo, poloxâmeros). Poloxâmeros exemplares incluem, mas não se limitam, àqueles vendidos sob com os nomes comerciais PLURONIC® e TETRONIC®. Em algumas modalidades, a fase aquosa inclui o tensoativo PLURONIC® F-68. Em algumas modalidades, a fase aquosa inclui um fluortensoativo hidrossolúvel e/ou hidrofílico. Em alguns casos, a fase aquosa inclui um fluortensoativo vendido sob o nome comercial ZONYL®, tal como o fluortensoativo ZONYL® FSN. Em alguns casos, a fase aquosa pode incluir o tensoativo polissorbato 20.
[0064] A concentração de um determinado tensoativo ou tensoativo total de uma fase aquosa antes, durante ou depois da combinação com uma fase não aquosa para formar gotículas de emulsão de água em óleo com películas pode ser selecionada para estabilizar as gotículas de emulsão antes da formação da película (por exemplo, aquecimento). Uma concentração exemplar de tensoativo de fase aquosa inclui, mas não se limita, a cerca de 0,01% a cerca de 10%, 0,05% a cerca de 5%, 0,1% a cerca de 1% ou 0,5% p/p, p/v ou v/v.
iii. fase oleosa
[0065] As gotículas de emulsão água em óleo que contêm uma película podem ser formadas em, e/ou formadas pela combinação de uma fase aquosa com uma fase não aquosa. A fase não aquosa pode ser um fluido carreador imiscível em água de fase contínua. Alternativamente, a fase não aquosa pode ser uma fase dispersa. A fase não aquosa pode ser aqui referida como uma fase oleosa contendo pelo menos um óleo, mas pode incluir compostos líquidos adicionais (ou liquefiáveis) ou misturas que são imiscíveis com água. O óleo pode ser sintético ou natural. O óleo pode ser um óleo à base de carbono (por exemplo, alquila) e/ou à base de silício (por exemplo, à base de siloxano). O óleo pode ser um hidrocarboneto e/ou um óleo de silicone. O óleo pode ser parcialmente ou totalmente fluorado. O óleo pode ser geralmente miscível ou imiscível com uma ou mais classes de solventes orgânicos. Óleos exemplares incluem, mas não estão limitados a, pelo menos, um óleo de silicone (por exemplo, polidimetilsiloxano), óleo mineral, óleo fluorcarbonado, óleo vegetal ou uma combinação dos mesmos.
[0066] Em uma modalidade exemplar, o óleo é um óleo fluorado ou perfluorado. Um óleo fluorado pode ser um óleo primário ou um aditivo para um óleo primário. Óleos fluorados exemplares incluem, mas não se limitam, àqueles vendidos com o nome comercial FLUORINERT®, tais como o líquido eletrônico FLUORINERT® FC-3283, FC-40, FC-43, FC-70 ou combinações dos mesmos. Óleos fluorados exemplificativos adicionais ou alternativos incluem, mas não se limitam, àqueles vendidos sob o nome comercial NOVEC®, incluindo o fluido projetado NOVEC® HFE 7500.
B. Gotículas de Tensoativo de Fase Dupla
[0067] Os métodos e as composições de gotícula de tensoativo em fase dupla incluem, mas não se limitam, àquelas que empregam uma fase oleosa contendo um fluortensoativo e uma fase aquosa contendo um fluortensoativo não iônico. Em alguns casos, o óleo é um óleo fluoroso. Em alguns casos, o fluortensoativo é não iônico.
i. fluortensoativos de fase oleosa
[0068] Em alguns casos, o fluortensoativo da fase oleosa (por exemplo, o fluortensoativo de uma fase oleosa contendo um óleo fluoroso) é um copolímero tribloco de fórmula I:
[0069] A fórmula I é um copolímero tribloco contendo polímero de polietilenoglicol (PEG) covalentemente ligado a um poli-hexafluorpropileno (PFPE) em ambas as extremidades. Em uma modalidade, a ligação covalente entre o bloco de PEG e os blocos de PFPE em ambas as extremidades é uma ligação amida (A e B são nitrogênio). Em outra modalidade, a ligação entre o bloco de PEG e os dois blocos de PFPE é uma ligação éster (A e B são oxigênio). Em outro exemplo, uma extremidade pode ser uma ligação éster e uma extremidade uma ligação amida (A é O e B é N; ou A é N e B é O).
[0070] Os comprimentos das cadeias de PFPE e do bloco de PEG podem afetar as propriedades do fluortensoativo de fórmula I. Em alguns aspectos da presente revelação, tanto m1 como m2 estão independentemente em uma faixa de cerca de 10 a 100. Em alguns casos, tanto m1 como m2 estão independentemente na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50; cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100. Em alguns casos, m1 está na faixa de cerca de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50; cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100. Em alguns casos, m2 está na faixa de cerca de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50; cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100.
[0071] O valor de “n” da fórmula I pode estar em uma faixa de cerca de 10 a 60. Em alguns casos, o valor de “n” está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 15 a 20, cerca de 15 a 30, cerca de 15 a 40, cerca de 15 a 50, cerca de 15 a 60, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 25 a 30, cerca de 25 a 40, cerca de 25 a 50, cerca de 25 a 60, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 35 a 40, cerca de 35 a 50, cerca de 35 a 60, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 45 a 50, cerca de 45 a 60, cerca de 50 a 50 ou cerca de 55 a 60. Em algumas modalidades, cada um de m1 e m2 é cerca de 35 e “n” é cerca de 22.
[0072] Em alguns casos, o fluortensoativo da fase oleosa (por exemplo, o fluortensoativo de uma fase oleosa contendo um óleo fluoroso) é um polímero de fórmula II:
[0073] O tensoativo da fórmula II é um copolímero dibloco de PEG e PFPE. O valor de m3, que representa o comprimento do bloco de PFPE, está em uma faixa de cerca de 10 a 100. Em alguns aspectos, m3 está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50; cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100. O comprimento da unidade PEG, “n2”, está na faixa de cerca de 10 a 60. Em alguns casos, o valor de “n2” está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 15 a 20, cerca de 15 a 30, cerca de 15 a 40, cerca de 15 a 50, cerca de 15 a 60, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 25 a 30, cerca de 25 a 40, cerca de 25 a 50, cerca de 25 a 60, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 35 a 40, cerca de 35 a 50, cerca de 35 a 60, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 45 a 50, cerca de 45 a 60, cerca de 50 a 50 ou cerca de 55 a 60. A extremidade do bloco PEG, -OR, pode ser um grupo hidroxila (ou seja, -OH), um grupo alcóxi ou uma amina (R pode ser hidrogénio, um grupo alquila ou uma amina).
[0074] Em alguns casos, o fluortensoativo da fase oleosa (por exemplo, o fluortensoativo de uma fase oleosa contendo um óleo fluoroso) é um polímero de fórmula III:
[0075] O tensoativo da Fórmula III é um copolímero tribloco em que duas unidades de PEG (de comprimento igual ou diferente) e uma unidade de PFPE estão ligadas por um ligante fosfato (PO4). O comprimento da cadeia de PFPE m4 está em uma faixa de cerca de 10 a 100. Em alguns casos, m4 está na faixa de cerca de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50; cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100. Os comprimentos das duas unidades de PEG, n3 e n4, estão independentemente em uma faixa de cerca de 10 a 60. Em alguns casos, n3 e n4 estão independentemente na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 15 a 20, cerca de 15 a 30, cerca de 15 a 40, cerca de 15 a 50, cerca de 15 a 60, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 25 a 30, cerca de 25 a 40, cerca de 25 a 50, cerca de 25 a 60, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 35 a 40, cerca de 35 a 50, cerca de 35 a 60, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 45 a 50, cerca de 45 a 60, cerca de 50 a 50 ou de cerca de 55 a 60. Em alguns casos, “n3” está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 15 a 20, cerca de 15 a 30, cerca de 15 a 40, 15 a 50, cerca de 15 a 60, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 25 a 30, cerca de 25 a 40, cerca de 25 a 50, cerca de 25 a 60, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 35 a 40, cerca de 35 a 50, cerca de 35 a 60, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 45 a 50, cerca de 45 a 60, cerca de 50 a 50 ou cerca de 55 a 60. Em alguns casos, “n4” está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 15 a 20, cerca de 15 a 30, cerca de 15 a 40, cerca de 15 a 50, cerca de 15 a 60, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 25 a 30, cerca de 25 a 40, cerca de 25 a 50, cerca de 25 a 60, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 35 a 40, cerca de 35 a 50, cerca de 35 a 60, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 45 a 50, cerca de 45 a 60, cerca de 50 a 50 ou cerca de 55 a 60. O espaçador CH2 (n5) pode ter 0, 1, 2 ou 3 carbonos de comprimento.
[0076] Em alguns casos, o fluortensoativo contém uma mistura de fórmula I, fórmula II e/ou fórmula III. Em alguns casos, o fluortensoativo contém uma mistura de fórmula I e fórmula II, uma mistura de fórmula I e fórmula III ou uma mistura de fórmula II e fórmula III. Em alguns exemplos, o fluortensoativo pode compreender pelo menos cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5% ou cerca de 99,9% (p/p) de uma mistura de fórmula I e fórmula II. Por exemplo, o tensoativo flúor pode compreender pelo menos cerca de 80%, cerca de 90% ou 95% (p/p) de uma mistura de fórmula I e fórmula II.
[0077] Além disso, a mistura de fórmula I e fórmula II pode estar em uma razão de mais do que cerca de 1:199, cerca de 1:99, cerca de 2:98, cerca de 3:97, cerca de 4:96, cerca de 5:95, cerca de 10:90, cerca de 15:85, cerca de 20:80, cerca de 25:75, cerca de 30:70, cerca de 35:65, cerca de 40:60, cerca de 45:55, cerca de 50:50, cerca de 55:45, cerca de 60:40, cerca de 65:35, cerca de 70:30, cerca de 75:25, cerca de 80:20, cerca de 85:15, cerca de 90:10, cerca de 95:5, cerca de 96:4, cerca de 97:3, cerca de 98:2, cerca de 99:1 ou cerca de 199:1 (p/p). Por exemplo, a mistura de fórmula I e fórmula II pode estar em uma razão de mais do que cerca de 80:20, cerca de 90:10 ou cerca de 95:5 (p/p).
[0078] Em certos exemplos, a mistura pode ainda conter um composto de Fórmula XI: em que n pode ser cerca de 10 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 80, cerca de 15 a 50 ou cerca de 20 a 50.
[0079] Por exemplo, a mistura de fluortensoativo pode conter cerca de 0,1% a 50%, cerca de 0,1% a 20%, cerca de 0,2% a 20%, cerca de 0,2% a 10%, cerca de 0,5% a 10%, cerca de 0,5% a 5% ou cerca de 1% a 5% (p/p) da fórmula XI.
[0080] Além disso, a mistura de fluortensoativo pode compreender mais do que cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 3,5%, cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 6% cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% (p/p ) da fórmula XI. Por exemplo, a mistura de fluortensoativo pode compreender mais do que cerca de 0,1% a cerca de 0,5%, mais do que cerca de 1%, mais do que cerca de 2% ou cerca de 5% (p/p) da fórmula XI.
[0081] Alternativamente, a mistura de fluortensoativo pode compreender menos do que cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 3,5%, cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% (p/p) da fórmula XI. Por exemplo, a mistura de fluortensoativo pode compreender menos do que cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 5%, cerca de 10% ou cerca de 20% (p/p) da fórmula XI.
[0082] Em certos casos, a formulação de óleo pode compreender menos do que cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 3,5%, cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% (p/p) da fórmula XI. Por exemplo, a formulação de óleo pode compreender menos do que cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 5%, cerca de 10% ou cerca de 20% (p/p) da fórmula XI.
[0083] Em outros casos, a formulação de óleo pode compreender mais do que cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 1,5%, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 3,5%, cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% (p/p) da fórmula XI. Por exemplo, a formulação de óleo pode compreender aproximadamente mais do que cerca de 0,1%, cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2% ou cerca de 5% (p/p) da fórmula XI.
[0084] Um tensoativo pode ser distinguido de acordo com um valor de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB), que pode ser definido como a razão do peso molecular (PM) da porção hidrofílica do composto em relação ao PM total do composto. O HLB pode ser controlado variando os comprimentos/PMs da porção hidrofóbica (PFPE) e da porção hidrofílica (PEG) da molécula. Em algumas modalidades, as gotículas que têm fluortensoativos de fase oleosa possuindo cadeias de perfluorpoliéter mais longas (maior PM) podem ter resistência aumentada à coalescência de gotículas termicamente induzida.
[0085] Em algumas modalidades, o PM da cadeia de perfluorpoliéter é de pelo menos cerca de 3000, pelo menos cerca de 4000, pelo menos cerca de 5000, pelo menos cerca de 6000, pelo menos cerca de 7000, pelo menos cerca de 8000, pelo menos cerca de 9000 ou pelo menos cerca de 10000. Em algumas outras modalidades, o PM da cadeia de perfluorpoliéter é de cerca de 3000, cerca de 4000, cerca de 5000, cerca de 6000, cerca de 7000, cerca de 8000, cerca de 9000 ou cerca de 10000.
[0086] Em alguns aspectos da presente revelação, o valor de HLB do fluortensoativo está na faixa de cerca de 0 a 20. Em alguns casos, os valores de HLB do tensoativo não iônico variam de cerca de 0 a 10, cerca de 0 a 20, cerca de 5 a 10, cerca de 5 a 15, cerca de 5 a 20 ou cerca de 10 a 20. Em alguns aspectos adicionais, o valor de HLB do fluorotensoativo é de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19 ou cerca de 20.
[0087] Em geral, os fluortensoativos obtidos na presente revelação são fluortensoativos de elevado grau de pureza e podem ser usados com sucesso em ensaios de número e/ou crescimento microbiano, evitando a lixiviação do reagente de detecção e/ou a inibição detectável ou substancial do crescimento microbiano. A inibição do crescimento microbiano pode ser detectada comparando os tempos de duplicação de um microrganismo alvo em meio a granel da mesma composição e temperatura que o meio e a temperatura utilizados na fase aquosa de uma gotícula. Geralmente, os níveis adequados de crescimento estão dentro de pelo menos cerca de 10% do tempo de duplicação em massa.
[0088] Em alguns casos, os fluortensoativos podem ter mais do que cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 85,5%, cerca de 86%, cerca de 86,5%, cerca de 87%, cerca de 87,5%, cerca de 89%, cerca de 89,5%, cerca de 90%, cerca de 90,5%, cerca de 91,5%, cerca de 92%, cerca de 92,5%, cerca de 93%, cerca de 93,5%, cerca de 94%, cerca de 94,5%, cerca de 95%, cerca de 96,5%, cerca de 97%, cerca de 97,5%, cerca de 98%, cerca de 98,5%, cerca de 99% ou cerca de 99,5% de pureza em peso (p/p). Em alguns exemplos, os fluortensoativos tem pureza maior do que cerca de 90% em peso (p/p). Por exemplo, os fluortensoativos podem compreender pelo menos 90% (p/p) de uma mistura de Fórmula I e Fórmula II. Em alguns casos, a pureza porcentual em peso do fluortensoativo está na faixa de cerca de 90% a 91% p/p, cerca de 90% a 92% p/p, cerca de 90% a 93% p/p, cerca de 90% a 94% p/p, cerca de 90% a 95% p/p, cerca de 90% a 96% p/p, cerca de 90% a 97% p/p, cerca de 90% a 98% p/p, cerca de 90% a 99% p/p, cerca de 91% a 92% p/p, cerca de 91% a 93% p/p, cerca de 91% a 94% p/p, cerca de 91% a 95% p/p, cerca de 91% a 96% p/p, cerca de 91% a 97% p/p, cerca de 91% a 98% p/p, 91% a 99% p/p, cerca de 92% a 93% p/p, cerca de 92% a 94% p/p, cerca de 92% a 95% p/p, cerca de 92% a 96% p/p, cerca de 92% a 97% p/p, cerca de 92% a 98% p/p, cerca de 92% a 99% p/p, cerca de 93% a 94% p/p, cerca de 93% a 95% p/p, cerca de 93% a 96% p/p, cerca de 93% a 97% p/p, cerca de 93% a 98% p/p, cerca de 93% a 99% p/p, cerca de 94% a 95% p/p, cerca de 94% a 96% p/p, cerca de 94% a 97% p/p, cerca de 94% a 98% p/p ou cerca de 94% a 99% p/p.
[0089] Em alguns casos, os fluortensoativos têm pureza superior a cerca de 95% (porcentagem em peso). Por exemplo, os fluortensoativos podem compreender pelo menos 95% (p/p) de uma mistura de Fórmula I e Fórmula II. Em alguns casos, a pureza porcentual em peso do fluortensoativo está na faixa de cerca de 95% a 96% p/p, cerca de 95% a 97% p/p, cerca de 95% a 98% p/p, cerca de 95% a 99% p/p, cerca de 96% a 97% p/p, cerca de 96% a 98% p/p, cerca de 96% a 99% p/p, cerca de 97% a 98% p/p, cerca de 97% a 99% p/p ou cerca de 98% a 99% p/p. Em alguns casos, os fluortensoativos podem ter uma pureza porcentual em peso de cerca de 90% p/p, cerca de 91% p/p, cerca de 92% p/p, cerca de 93% p/p, cerca de 94% p/p, cerca de 95% p/p, cerca de 96% p/p, cerca de 97% p/p, cerca de 98% p/p ou cerca de 99% p/p.
[0090] A concentração do fluortensoativo pode afetar a estabilidade das gotículas. Em alguns casos, a concentração do fluortensoativo pode estar na faixa de 0,1 a 10,0 mM. Em algumas modalidades, a concentração do fluortensoativo está em uma faixa de cerca de 0,1 mM a 1,0 mM, cerca de 0,1 mM a 2,0 mM, cerca de 0,1 mM a 3,0 mM, cerca de 0,1 mM a 4,0 mM, cerca de 0,1 mM a 5,0 mM, cerca de 0,1 mM a 6,0 mM, cerca de 0,1 mM a 7,0 mM, cerca de 0,1 mM a 8,0 mM, cerca de 0,1 mM a 9,0 mM, cerca de 0,5 mM a 1,0 mM, cerca de 0,5 mM a 2,0 mM, cerca de 0,5 mM a 3,0 mM, cerca de 0,5 mM a 4,0 mM, cerca de 0,5 mM a 5,0 mM, cerca de 0,5 mM a 6,0 mM, cerca de 0,5 mM a 7,0 mM, cerca de 0,5 mM a 8,0 mM, cerca de 0,5 mM a 9,0 mM, cerca de 0,5 mM a 10,0 mM, cerca de 1,0 mM a 2,0 mM, cerca de 1,0 mM a 3,0 mM, cerca de 1,0 mM a 4,0 mM, cerca de 1,0 mM a 5,0 mM, cerca de 1,0 mM a 6,0 mM, cerca de 1,0 mM a 7,0 mM, cerca de 1,0 mM a 8,0 mM, cerca de 1,0 mM a 9,0 mM, cerca de 1,0 mM a 10,0 mM, cerca de 1,5 mM a 2,0 mM, cerca de 1,5 mM a 3,0 mM, cerca de 1,5 mM a 4,0 mM, cerca de 1,5 mM a 5,0 mM, cerca de 1,5 mM a 6,0 mM, cerca de 1,5 mM a 7,0 mM, cerca de 1,5 mM a 8,0 mM, cerca de 1,5 mM a 9,0 mM, cerca de 1,5 mM a 10,0 mM, cerca de 2,0 mM a 3,0 mM, cerca de 2,0 mM a 4,0 mM, cerca de 2,0 mM a 5,0 mM, cerca de 2,0 mM a 6,0 mM, cerca de 2,0 mM a 7,0 mM, cerca de 2,0 mM a 8,0 mM, cerca de 2,0 mM a 9,0 mM, cerca de 2,0 mM a 10,0 mM, cerca de 2,5 mM a 3,0 mM, cerca de 2,5 mM a 4,0 mM, cerca de 2,5 mM a 5,0 mM, cerca de 2,5 mM a 6,0 mM, cerca de 2,5 mM a 7,0 mM, cerca de 2,5 mM a 8,0 mM, cerca de 2,5 mM a 9,0 mM, cerca de 2,5 mM a 10,0 mM, cerca de 3,0 mM a 4,0 mM, cerca de 3,0 mM a 5,0 mM, cerca de 3,0 mM a 6,0 mM, cerca de 3,0 mM a 7,0 mM, cerca de 3,0 mM a 8,0 mM, cerca de 3,0 mM a 9,0 mM, cerca de 3,0 mM a 10,0 mM, cerca de 3,5 mM a 4,0 mM, cerca de 3,5 mM a 5,0 mM, cerca de 3,5 mM a 6,0 mM, cerca de 3,5 mM a 7,0 mM, cerca de 3,5 mM a 8,0 mM, cerca de 3,5 mM a 9,0 mM, cerca de 3,5 mM a 10,0 mM, cerca de 4,0 mM a 5,0 mM, cerca de 4,0 mM a 6,0 mM, cerca de 4,0 mM a 7,0 mM, cerca de 4,0 mM a 8,0 mM, cerca de 4,0 mM a 9,0 mM, cerca de 4,0 mM a 10,0 mM, cerca de 4,5 mM a 5,0 mM, cerca de 4,5 mM a 6,0 mM, cerca de 4,5 mM a 7,0 mM, cerca de 4,5 mM a 8,0 mM, cerca de 4,5 mM a 9,0 mM, cerca de 4,5 mM a 10,0 mM, cerca de 5,0 mM a 6,0 mM, cerca de 5,0 mM a 7,0 mM, cerca de 5,0 mM a 8,0 mM, cerca de 5,0 mM a 9,0 mM, cerca de 5,0 mM a 10,0 mM, cerca de 5,5 mM a 6,0 mM, cerca de 5,5 mM a 7,0 mM, cerca de 5,5 mM a 8,0 mM, cerca de 5,5 mM a 9,0 mM, cerca de 5,5 mM a 10,0 mM, cerca de 6,0 mM a 7,0 mM, cerca de 6,0 mM a 8,0 mM, cerca de 6,0 mM a 9,0 mM, cerca de 6,0 mM a 10,0 mM, cerca de 6,5 mM a 7,0 mM, cerca de 6,5 mM a 8,0 mM, cerca de 6,5 mM a 9,0 mM, cerca de 6,5 mM a 10,0 mM, cerca de 7,0 mM a 8,0 mM, cerca de 7,0 mM a 9,0 mM, cerca de 7,0 mM a 10,0 mM, cerca de 7,5 mM a 8,0 mM, cerca de 7,5 mM a 9,0 mM, cerca de 7,5 mM a 10,0 mM, cerca de 8,0 mM a 9,0 mM, cerca de 8,0 mM a 10,0 mM, cerca de 8,5 mM a 9,0 mM, cerca de 8,5 mM a 10,0 mM, cerca de 9,0 mM a 10,0 mM ou cerca de 9,5 mM a 10,0 mM. Em algumas modalidades, a concentração do fluortensoativo é de cerca de 0,5 mM, cerca de 1,0 mM, cerca de 1,5 mM, cerca de 2,0 mM, cerca de 2,5 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 3,5 mM, cerca de 4,0 mM, cerca de 4,5 mM, cerca de, 5,0 mM, cerca de 5,5 mM, cerca de 6,0 mM, cerca de 6,5 mM, cerca de 7,0 mM, cerca de 7,5 mM, cerca de 8,0 mM, cerca de 8,5 mM, cerca de 9,0 mM ou cerca de 9,5 mM.
ii. fase oleosa
[0091] A fase oleosa ou a fase contínua usada para as gotículas de água em óleo de fase dupla pode ser qualquer composto líquido ou mistura de compostos líquidos que seja imiscível com água. O óleo usado pode ser ou incluir, mas não está limitado a, pelo menos, um óleo de silicone, óleo mineral, óleo de hidrocarboneto, óleo de fluorcarbono, óleo vegetal ou uma combinação dos mesmos. Quaisquer outros componentes adequados também podem estar presentes na fase oleosa, tal como pelo menos um tensoativo, reagente, outro aditivo, conservante, partículas ou qualquer combinação dos mesmos.
[0092] Em alguns casos, o óleo é óleo fluorado. O óleo fluorado pode ser qualquer composto orgânico fluorado. Em alguns casos, o óleo fluorado é perfluorcarbono, tal como perfluoroctano ou perflúor-hexano. Em alguns casos, o composto contendo flúor é um hidrocarboneto parcialmente fluorado, tal como 1,1,1-trifluoroctano ou 1,1,1,2,2-petantafluordecano. Os orgânicos fluorados podem ser lineares, cíclicos ou heterocíclicos. Além do carbono e do flúor, o composto orgânico fluorado pode ainda conter átomos de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre, cloro ou bromo, ou combinações dos mesmos.
[0093] Em alguns casos, o óleo fluorado é um éter perfluoralquílico como o éter metilnonafluorisobutílico vendido como o fluido desenvolvido NOVEC™ HFE-7100. Em alguns casos, o composto contendo flúor é um etoxinonafluorbutano, ou a mistura de etoxinonafluorbutano, vendido como o fluido desenvolvido NOVEC ™ HFE-7200. Em alguns casos, o composto contendo flúor é 3-etóxi- 1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodecaflúor-2-trifluormetil- hexano, vendido como o fluido desenvolvido NOVEC ™ HFE-7500. Em alguns casos, o composto contendo flúor pode ser 1,1,1,2,2,3,4,5,5,5- decaflúor-3-metoxi-4-trifluormetilpentano, vendido como o fluido desenvolvido NOVEC ™ HFE-7300.
[0094] Em algumas modalidades, os fluortensoativos estão principalmente na fase oleosa. Em alguns casos, pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% do fluortensoativo está na fase oleosa.
iii. Fase Aquosa
[0095] A fase aquosa pode conter qualquer componente líquido ou liquefiável que, quando misturado com água à temperatura ambiente, forma uma solução aquosa estável monofásica. Em algumas modalidades, a fase aquosa pode compreender um ou mais reagentes e/ou solventes fisiologicamente aceitáveis, etc. a uma concentração que é compatível com o crescimento microbiano e/ou enumeração. Alguns exemplos não limitantes dos componentes da fase aquosa incluem água, DMF, DMSO, metanol ou etanol. A fase aquosa também pode incluir um agente tamponante, como descrito abaixo. Em algumas modalidades, a fase aquosa pode incluir partículas, como esferas. A fase aquosa também pode incluir veículos que proporcionam a liberação retardada dos reagentes.
iv. Não fluortensoativo não iônico
[0096] A fase aquosa das gotículas de água em óleo de fase dupla pode conter um não fluortensoativo não iônico. Em algumas modalidades, o não fluortensoativo não iônico é um tensoativo de copolímero em bloco de óxido de polialquileno. Em alguns casos, o não fluortensoativo não iônico é um copolímero em bloco de polipropilenoglicol (H-(O-CH(CH3)-CH2)n- OH, PPG) e polietilenoglicol (H-(O-CH2-CH2)n-OH, PEG) com a fórmula geral [PPGn-PEGm].
[0097] O não fluortensoativo não iônico pode ser um polímero de di, tri, tetra, pentabloco ou com mais blocos de PEG e PPG. Em alguns casos, o não fluortensoativo não iônico é um copolímero alternado com unidades regulares alternadas de PEG e PPG de fórmula geral (PEG-PPG)x, em que x está na faixa de cerca de 10 a 100. Em alguns casos, x está na faixa de cerca de 10 a 20, cerca de 10 a 30, cerca de 10 a 40, cerca de 10 a 50, cerca de 10 a 60, cerca de 10 a 70, cerca de 10 a 80, cerca de 10 a 90, cerca de 20 a 30, cerca de 20 a 40, cerca de 20 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 20 a 70, cerca de 20 a 80, cerca de 20 a 90, cerca de 20 a 100, cerca de 30 a 40, cerca de 30 a 50, cerca de 30 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 30 a 80, cerca de 30 a 90, cerca de 30 a 100, cerca de 40 a 50, cerca de 40 a 60, cerca de 40 a 70, cerca de 40 a 80, cerca de 40 a 90, cerca de 40 a 100, cerca de 50 a 60, cerca de 50 a 70, cerca de 50 a 80, cerca de 50 a 90, cerca de 50 a 100, cerca de 60 a 70, cerca de 60 a 80, cerca de 60 a 90, cerca de 60 a 100, cerca de 70 a 80, cerca de 70 a 90, cerca de 70 a 100, cerca de 80 a 90, cerca de 80 a 100 ou cerca de 90 a 100. Em alguns casos, o não fluortensoativo não iônico é um copolímero aleatório de PEG e PPG com os blocos monoméricos PEG e PPG ligados em uma sequência aleatória.
[0098] Em alguns casos, o peso molecular do copolímero em bloco de PEG e PPG está na faixa de cerca de 4.000 daltons (“Da”) a 25.000 Da. Em alguns casos, o peso molecular do não fluortensoativo não iônico não fluorado não-iônico está na faixa de cerca de 10.000 Da a 25.000 Da; cerca de 15.000 Da a 25.000 Da; cerca de 20.000 Da a 25.000 Da; cerca de 4.000 Da a 20.000 Da; cerca de 10.000 Da a 20000 Da; cerca de 15.000 Da a 20.000 Da; cerca de 4.000 Da a 15.000 Da; cerca de 10.000 Da a 15.000 Da; ou cerca de 4.000 Da a 10.000 Da. Em alguns casos, o peso molecular do não fluortensoativo não iônico é de cerca de 4000 Da; cerca de 4.500 Da; cerca de 5.000 Da; cerca de 5.500 Da; cerca de 6.000 Da; cerca de 6.500 Da; cerca de 7.000 Da; cerca de 7.500 Da; cerca de 8.000 Da; cerca de 8.500 Da; cerca de 9.000 Da; cerca de 9.500 Da; cerca de 10.000 Da; cerca de 10 500 Da; cerca de 11.000 Da; cerca de 11.500 Da; cerca de 12.000 Da; cerca de 12.500 Da; cerca de 13.000 Da; cerca de 13.500 Da; cerca de 14.000 Da; cerca de 14 500 Da; cerca de 15.000 Da; cerca de 15.500 Da; cerca de 16.000 Da; cerca de 16 500 Da; cerca de 17.000 Da; cerca de 17.500 Da; cerca de 18.000 Da; cerca de 18.500 Da; cerca de 19.000 Da; cerca de 19 500 Da; cerca de 20.000 Da; cerca de 20 500 Da; cerca de 21.000 Da; cerca de 21 500 Da; cerca de 22.000 Da; cerca de 22 500 Da; cerca de 23.000 Da; cerca de 23 500 Da; cerca de 24.000 Da; cerca de 24 500 Da; ou cerca de 25.000 Da.
[0099] Em alguns casos, o não fluortensoativo não iônico é um copolímero tribloco de óxido de polipropileno e óxido de polietileno, conhecido como poloxâmero. Em alguns casos, o não fluortensoativo não iônico é um poloxâmero vendido com o nome comercial PLURONIC® ou TETRONIC®. Em algumas modalidades, o tensoativo Pluronic® é Pluronic® F-38, Pluronic® F-68, Pluronic® F-77, Pluronic® F-87, Pluronic® F-88, Pluronic®F-98, Pluronic® F-108 ou Pluronic® F-127 (a = 101, b = 56).
[00100] Em algumas modalidades, o tensoativo não fluorado não iônico é Nonidet® P40. A estrutura geral do Nonidet® inclui uma cadeia de polietileno hidrofílica e um grupo lipofílico de hidrocarboneto aromático, conforme representado na Fórmula VII:
[00101] Em alguns casos, o tensoativo não fluorado não iônico pode ser um derivado de polietilenoglicol. Em alguns casos, o tensoativo não fluorado não iônico é um derivado de polietilenoglicol de fórmula VIII:
[00102] Tensoativos derivados de polietilenoglicol não fluorados e não iônicos exemplares de fórmula VIII incluem, mas não se limitam, aos tensoativos Triton®. Tensoativos Triton® exemplares incluem, mas não se limitam, a Triton® X-15 (x=1,5 em média), Triton® X-35 (x=3 em média), Triton® X- 45 (x=4,5 em média), Triton® X-100 (x=9,5 em média), Triton® X-102 (x=12 em média), Triton® X-114 (x=7,5 em média), Triton® X-165 (x=16 em média), Triton® X-305 (x=30 em média), Triton® X-405 (x=35 em média), ou Triton® X- 705 (x=1,5 em média).
[00103] Em algumas modalidades, o tensoativo não fluorado não iônico é um derivado de polioxietileno de monolaurato de sorbitano de fórmula IX:
[00104] Derivados de polioxietileno exemplares de monolaurato de sorbitano de Fórmula IX incluem, mas não se limitam, àqueles comercialmente disponíveis sob o nome comercial Tween®. Em alguns casos, o tensoativo não fluorado não iônico é Tween® 20 (R = CH2(CH2)9CH3)), Tween® 40 (R = CH2(CH2)13CH3), Tween® 60 (R=CH2(CH2)15CH3) ou Tween®-80 (R= (CH2)7CH=CH(CH2)8.
[00105] A concentração de não fluortensoativo não iônico pode estar em uma faixa de cerca de 0,1 a 5,0% por cento em peso. Em algumas modalidades, a concentração do agente não fluortensoativo não iônico é inferior a cerca de 1,5% em peso (“p/p”). Em alguns casos, a concentração de Pluronic® é menor do que cerca de 1,4% p/p, cerca de 1,3% p/p, cerca de 1,2% p/p, cerca de 1,1% p/p, cerca de 1,0% p/p, cerca de 0,9% p/p, cerca de 0,8% p/p, cerca de 0,7% p/p, cerca de 0,6% p/p, cerca de 0,5% p/p, cerca de 0,4% p/p, cerca de 0,3% p/p, cerca de 0,2% p/p ou cerca de 0,1% p/p. Em algumas modalidades, a concentração de Pluronic® F-98 está na faixa de cerca de 0,50% p/p a 1,5% p/p. Em algumas modalidades, a concentração de Pluronic® F-98 está na faixa de cerca de 0,50% p/p a 0,60% p/p, cerca de 0,50% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,50% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,60% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,75% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,75% p/p, cerca de 0,65% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,65% p/p a 0,75% p/p, ou cerca de 0,70% p/p a 0,75% p/p. Em algumas modalidades adicionais, a concentração do tensoativo não fluorado não iônico pode ser ajustada para otimizar a estabilidade da gotícula e o tamanho da gotícula sem inibir a contagem microbiana ou o crescimento microbiano.
[00106] Em algumas modalidades, a concentração do fluortensoativo está em uma faixa de cerca de 1,0 a 6,0 mM e a concentração do não fluortensoativo não iônico está em uma faixa de cerca de 0,1% a 3,0% por cento em peso. Em uma modalidade adicional, o fluortensoativo tem uma estrutura de fórmula I e uma concentração de cerca de 2,5 mM, e o não fluortensoativo não iônico é Pluronic® F-98 e tem uma concentração de cerca de 0,5% p/p a 1,5% p/p. Em alguns casos, o fluortensoativo tem uma estrutura de Fórmula I e uma concentração de cerca de 2,5 mM, e o não fluortensoativo não iônico é Pluronic® F-98 e tem uma concentração de cerca de 0,50% p/p a 0,60% p/p, cerca de 0,50% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,50% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,60% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,55% p/p a 0,75% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,65% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,60% p/p a 0,75% p/p, cerca de 0,65% p/p a 0,70% p/p, cerca de 0,65% p/p a 0,75% p/p, ou cerca de 0,70% p/p a 0,75% p/p.
[00107] Em algumas modalidades, os tensoativos não fluorados não iônicos ficam essencialmente na fase aquosa. Em alguns casos, pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% do tensoativo não fluorado não iônico está na fase oleosa das gotículas de emulsão de água em óleo.
C. Sais e agentes de tamponamento em gotículas
[00108] A fase aquosa das gotículas de água em óleo aqui descritas (por exemplo, gotículas com películas e/ou gotículas de fase dupla) pode incluir uma variedade de sais, agentes tamponantes, componentes de meio de crescimento microbianos, reagentes de detecção (por exemplo, corantes, sondas ou substratos fluorogênicos ou colorimétricos), microrganismos, matrizes alimentares e/ou quaisquer componentes adicionais necessários para determinar o crescimento e/ou números microbianos. Todos esses componentes adicionais podem ser selecionados para serem compatíveis com o ensaio pretendido.
[00109] O(s) tampão/tampões ou agente(s) tamponante(s) adequados pode(m) estar presente(s) na fase aquosa. O tampão ou o agente tamponante pode ser configurado para manter o pH da fase aquosa próximo ou em qualquer pH adequado, tal como um pH próximo ou no qual o crescimento microbiano e/ou a detecção seja ideal. Por exemplo, o pH pode ser selecionado para estar em ou perto de um pH ideal para uma atividade enzimática que possa ser detectada por um substrato ou colorimétrico. Como outro exemplo, o pH pode ser selecionado para estar em ou perto de um pH ideal para o crescimento de um microrganismo alvo. Como ainda outro exemplo, o pH, o agente tamponante e/ou a concentração do agente tamponante pode ser selecionado para proporcionar uma redução de pH detectável causada pelo crescimento microbiano, por exemplo, com um fluoróforo sensível ao pH. De modo semelhante, sais adequados que podem estar presentes na fase aquosa incluem, mas não estão limitados, aos sais compatíveis com o crescimento e/ou detecção microbianos. Sais exemplares incluem, mas não estão limitados, a qualquer um ou combinação de NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, sais de fosfato e semelhantes.
[00110] Em alguns casos, a concentração de sal de potássio (por exemplo, KCl) e/ou de sal de sódio (por exemplo, NaCl) pode ser de cerca de, maior do que cerca de ou menor do que cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, cerca de 30 mM, cerca de 40 mM, cerca de 50 mM, cerca de 60 mM, cerca de 80 mM, cerca de 100 mM ou cerca de 200 mM. Em alguns casos, a concentração de sal de magnésio (por exemplo, MgCl2) está em uma concentração de cerca de, maior do que cerca de ou menor do que cerca de 1,0 mM, cerca de 2,0 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 4,0 mM ou cerca de 5,0 mM. Em alguns casos, o agente tamponante é cerca de, maior do que cerca de ou menor do que cerca de 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 80 mM, 160 mM ou 200 mM.
[00111] Em alguns casos, o pH pode, por exemplo, se aproximar de um pH fisiológico, como cerca de 5 a 9, 5 a 6,5, 6,5 a 8,5, 7 a 8 ou cerca de 7,5, entre outros. Pode ser selecionado um agente tamponante particular que tenha um pKa relativamente próximo do pH desejado para ser mantido e que seja compatível com a(s) reação/reações a ser(em) realizada(s). O agente tamponante pode ser fisiologicamente compatível. Agentes tamponantes exemplares que podem ser adequados incluem, mas não estão limitados, a tris(2-amino-2- hidroximetilpropano-1,3-diol), MES (ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico), MOPS (ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico), HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico) e similares. Em alguns casos, o agente tamponante é, ou inclui, um tampão fosfato, tal como um tampão fosfato de sódio ou potássio mono, di ou tribásico, ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, um agente tamponante é inerentemente fornecido por um ou mais componentes de um meio microbiano mínimo, complexo, definido e/ou indefinido. Por exemplo, componentes de triptonas, várias peptonas, fitonas, misturas de aminoácidos, sais fisiológicos sais de sódio, potássio ou magnésio, etc., podem proporcionar uma capacidade tamponante suficiente para os métodos e composições da presente invenção. Alternativamente, em alguns casos, embora meios microbianos mínimos, complexos, definidos e/ou indefinidos possam proporcionar capacidade de tamponamento, um agente tamponante adicional, tal como um ou mais dos agentes tamponantes precedentes, é incluído na fase aquosa das gotículas de água em óleo.
F. Meios de crescimento de gotículas
[00112] Uma grande variedade de meios de crescimento pode ser selecionada como um componente da fase aquosa das gotículas de água em óleo. A palavra meio (também referida como meio de crescimento ou cultura), conforme utilizada na presente invenção, inclui qualquer meio utilizado para o cultivo microbiológico, incluindo componentes definidos e indefinidos. Tipicamente, é selecionado um meio de crescimento adequado, compatível ou ideal para o crescimento de um ou mais microrganismos alvo a serem enumerados ou analisados quanto à susceptibilidade antimicrobiana. Geralmente, o meio de crescimento conterá uma fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono e vários elementos essenciais.
[00113] A fonte de nitrogênio pode ser, ou incluir, uma proteína ou mistura de proteínas. Por exemplo, a fonte de nitrogênio pode ser extrato de carne ou extrato de levedura. A fonte de nitrogênio pode ser, ou incluir, uma proteína ou mistura de proteínas parcialmente ou totalmente hidrolisada, como peptona, triptona, casaminoácidos, etc. A fonte de nitrogênio pode ser, ou incluir, um aminoácido ou mistura de aminoácidos. Em alguns casos, a fonte de nitrogênio é um sal de nitrogênio (por exemplo, nitrato), como o sulfato de amônio.
[00114] A fonte de carbono pode ser, ou incluir, glicose, galactose, arabinose, succinato, glicerol, piruvato, glutamato, xilose ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, em meios complexos contendo uma ou mais fontes de nitrogênio indefinidas (por exemplo, extrato de carne, extrato de levedura, triptona ou peptona), a fonte de carbono é um componente inerente da fonte de nitrogênio indefinida. Elementos essenciais incluem, mas não estão limitados, ao sódio, potássio, cálcio, magnésio, ferro, nitrogênio, fósforo e enxofre.
[00115] Meios de crescimento exemplares para uso em uma fase aquosa de gotículas de emulsão de água em óleo incluem, mas não estão limitados a, caldo triptona soja (TSB), água peptonada tamponada (por exemplo, meio BAM M192) e combinações dos mesmos. Em alguns casos, um meio seletivo é usado como um componente da fase aquosa das gotículas de emulsão de água em óleo. Esses meios seletivos incluem, mas não estão limitados, aos meios cromogênicos, BairdParker, ágar púrpura de bromocresol (“BCP”), ágar bile-esculina (“BEA”), meio de Bryant e Burkey, água peptonada tamponada, meio chapman, ágar chocolate, ágar cistina lactose eletrólito deficiente (“CLED”), coletsos, ágar columbia, ágar Drigalski, Fraser, Granada, ágar GVPC, ágar Hektoen, king A e B, Lowenstein-Jensen, LT100, ágar mac conkey, caldo ou ágar MRS, caldo ou ágar Müeller Hinton, Müller-Kauffmann, base de ágar de identificação listeria (“PALCAM”), PCB, RPMI, RVS, ágar ou caldo Sabouraud, Schaedler, caldo selenito, meio de Slanetz e Bartley, ágar SPS, TGY, TSB, TSI, TTC tergitol, VRBG, XLD, etc.
G. Antimicrobianos de gotícula
[00116] Em alguns aspectos, a fase aquosa das gotículas de emulsão água em óleo pode conter um antimicrobiano. O antimicrobiano pode ser incluído para garantir que o ensaio não seja confundido pela presença de microrganismos confusos. Por exemplo, se a enumeração do QI for desejada, onde os microrganismos alvo são bactérias, então um agente antifúngico pode ser incluído na fase aquosa para evitar o crescimento de fungos que são organismos não alvo. Como outro exemplo, se a enumeração do QI for desejada, onde os microrganismos alvo são fungos ou mofos, então um agente antibacteriano pode ser incluído na fase aquosa. Alternativamente, o antimicrobiano pode ser incluído para avaliar a susceptibilidade antimicrobiana de um microrganismo alvo, ou classe de microrganismos alvo. Por exemplo, uma concentração inibitória mínima (MIC) contra um antimicrobiano pode ser determinada testando o crescimento do(s) microrganismo(s) alvo(s) com pelo menos duas (por exemplo, 3 a 10) concentrações diferentes do antimicrobiano de teste na fase aquosa. Também pode haver muito mais concentrações diferentes, como quando se utiliza um gradiente de concentrações antimicrobianas nas gotículas. O gradiente de concentrações pode ser linear ou não linear. Em outro exemplo, uma concentração é usada para determinar se um microrganismo é suscetível ao teste antimicrobiano. A única concentração selecionada é uma concentração do ponto de parada que diferencia os organismos suscetíveis daqueles que não são suscetíveis.
[00117] Uma ampla variedade de antimicrobianos pode ser empregada na fase aquosa das gotículas de emulsão água em óleo. Geralmente, os antimicrobianos são selecionados para não atrapalhar a existência das gotículas. Por exemplo, os antimicrobianos que residem essencialmente na fase aquosa e não se dividem substancialmente na fase não aquosa podem ser selecionados. Alternativamente, o particionamento parcial do antimicrobiano para a fase oleosa pode ser contabilizado antes de determinar a MIC do antimicrobiano. Ainda como outra alternativa, o antimicrobiano pode ser incluído tanto na fase oleosa como na fase aquosa, se o antimicrobiano apresentar substancial solubilidade em ambas as fases. Como ainda outra alternativa, a química das gotículas pode ser ajustada para minimizar essa divisão não aquosa do antimicrobiano. Por exemplo, um sistema de fase dupla pode ser substituído por gotículas com sistema de película, ou vice-versa, ou um agente tensoativo (por exemplo, um não fluortensoativo não iônico, ou um fluortensoativo) com HLB maior ou menor pode ser utilizado.
[00118] Antimicrobianos exemplares incluem, mas não estão limitados, aos antimicrobianos e-lactâmicos, antimicrobianos de cefamicina, antimicrobianos de cefalosporina, antimicrobianos de quinolona, antimicrobianos de fluoroquinolona, antimicrobianos de naftiridina, antimicrobianos policetídeos, inibidores da di-hidrofolato redutase, antimicrobianos de polimixina, antimicrobianos de nitrofurano, antimicrobianos da classe do anfenicol, antimicrobianos aminoglicosídicos, antimicrobianos glicopeptídicos, antifúngicos poliênicos, antifúngicos de imidazol ou triazol, como inibidores da classe do imidazol ou triazol da lanosterol 14α-desmetilase fúngica, antifúngicos tiazólicos, antifúngicos de alilamina, antifúngicos equinocandinas, antifúngicos da 5-fluorcitosina ou combinações dos mesmos. Em alguns casos, o antimicrobiano é cefoxitina, piperacilina, ácido nalidíxico, tetraciclina, vancomicina, trimetoprima, nitrofurantoína, colistina, nitrofurano, cloranfenicol, gentamicina, anfotericina B, fluconazol ou uma combinação dos mesmos.
H. Antifúngicos de gotícula
[00119] Em alguns aspectos, a fase oleosa das gotículas de emulsão água em óleo pode conter um ou mais agentes antifúngicos. O agente antifúngico pode ser incluído para evitar que os microrganismos cresçam fora da fase aquosa ou para criar uma “cerca” ao redor da fase aquosa. Para que os agentes antifúngicos possam ser incluídos na fase oleosa para evitar que o mofo cresça fora da fase aquosa. Agentes antifúngicos exemplares incluem, mas não estão limitados, à 2,6-dicloro-4-nitroanilina (ou diclorano), 4,5,6,7- tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceína (ou rosa bengala), (RS)-1-[2- (alilóxi)-2-(2,4-diclorofenil)etil]-1H-imidazol (ou imazalil, cloramizol) e/ou quitosana.
[00120] Em certas modalidades, a fase oleosa compreende diclorano em uma concentração de cerca de 5 mg/L a cerca de 200 mg/L, cerca de 10 mg/L a cerca de 100 mg/L, cerca de 20 mg/L a cerca de 100 mg/L, cerca de 40 mg/L a cerca de 100 mg/L ou cerca de 20 mg/L a cerca de 200 mg/L. Em algumas modalidades, a fase oleosa compreende diclorano a uma concentração de cerca de 5 mg/L, cerca de 10 mg/L, cerca de 20 mg/L, cerca de 25 mg/L, cerca de 30 mg/L, cerca de 40 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 60 mg/L, cerca de 70 mg/L, cerca de 80 mg/L, cerca de 90 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L ou cerca de 200 mg/L.
[00121] Em certas modalidades, a fase oleosa compreende rosa bengala a uma concentração de cerca de 50 mg/L a cerca de 375 mg/L, cerca de 100 mg/L a cerca de 200 mg/L ou cerca de 50 mg/L a cerca de 150 mg/L. Em algumas modalidades, a fase oleosa compreende rosa bengala a uma concentração de cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 300 mg/L, cerca de 350 mg/L ou cerca de 375 mg/L.
[00122] Em algumas modalidades, a fase oleosa compreende imazalila a uma concentração de cerca de 0,1 mg/L a cerca de 2,5 g/L, cerca de 0,1 mg/L a cerca de 1,0 g/L, cerca de 0,5 a cerca de 1,0 g/L ou cerca de 0,5 mg/L a cerca de 2,5 g/L. Em algumas modalidades, a fase oleosa compreende imazalila a uma concentração de cerca de 0,1 mg/L, 0,25 mg/L, 0,5 mg/L, 0,75 mg/L, cerca de 1 mg/L, cerca de 2 mg/L, cerca de 5 mg/L, cerca de 10 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 1,0 g/L ou cerca de 2,5 g/L.
[00123] Em algumas modalidades, a fase oleosa compreende quitosana e a concentração de quitosana na fase oleosa é cerca de 0,3% ou menos.
I. Agentes Gelificantes de Gotículas
[00124] Em alguns aspectos, a fase aquosa ou a fase oleosa das gotículas de emulsão água em óleo compreendem um ou mais agentes gelificantes. Em algumas modalidades nas quais o microrganismo alvo é levedura, um agente gelificante pode ser incluído na fase aquosa para evitar uma alteração no tamanho da gotícula (por exemplo, para evitar uma redução no tamanho da gotícula). Em uma modalidade, a fase aquosa compreende um hidrogel, tal como o ácido algínico, que pode ser gelificado pela adição de íons de cálcio. Em um processo de gelificação, o alginato e o carbonato de cálcio estão incluídos na fase aquosa das gotículas e o ácido acético está incluído na fase oleosa das gotículas. Durante o processo de gelificação, os íons H+ do ácido acético se difundem da fase oleosa para a fase aquosa da gotícula causando uma diminuição no pH da fase aquosa e a dissociação de íons de cálcio do carbonato de cálcio de acordo com a seguinte equação: CaCO3 + 2H+ --> CaHCO3 + H+ --> Ca2 + H2O + CO2
[00125] Em algumas modalidades, a concentração de alginato na fase aquosa é de cerca de 3,5 gramas/litro ou menos. Em certas modalidades, a concentração de alginato na fase aquosa é de cerca de 1, 2, 2,5, 3 ou 3,5 gramas/litro. Em algumas modalidades, a concentração de íons de cálcio na fase aquosa é de cerca de 1 grama/litro ou menos. Em algumas modalidades, a concentração de íons de cálcio na fase aquosa é de cerca de 0,25, 0,5, 0,75 ou 1 grama/litro.
[00126] Outros materiais poliméricos exemplares que podem ser usados como agentes gelificantes incluem, mas não estão limitados a, kappa- carragenina, iota-carragenina, furcelarano, zeína, zeína succinilada, celulose succinilada e/ou celulose etil succinilada. Materiais poliméricos solúveis em água sintéticos exemplares que podem ser utilizados como agentes gelificantes incluem, mas não se limitam, àqueles formados a partir de vinilpirrolidona, copolímero de 2-metil-5-vinil piridina-metil acrilato-ácido metacrílico, álcool vinílico, vinilpiridina e copolímero de vinil piridina- estireno.
J. Reagentes de Detecção de Gotícula
[00127] As gotículas de emulsão de água em óleo podem conter um ou mais reagentes de detecção. Os reagentes de detecção podem ser reagentes de detecção de ácido nucleico específicos de genótipo, proteínas (por exemplo, anticorpos, lectinas, fibrinogênio) e outras moléculas. Reagentes de detecção de ácido nucleico específicos de genótipo incluem, mas não se limitam, a sondas de ácido nucleico. Os reagentes de detecção específicos de genótipo podem ser específicos para um determinado gênero, espécie ou cepa de microrganismo. Sondas de ácido nucleico exemplares incluem, mas não se limitam, a sondas de fita dupla, como as sondas de fita dupla descritas nas Patentes Norte-Americanas Nos. 5.928.862; ou 9.194.007; sondas da Molecular Beacon, como as descritas no documento WO 98/10096; sondas TaqMan, como as descritas nas Patentes Norte-Americanas Nos. 5.210.015; 5.487.972; 5.538.848; 5.723.591; e 6.258.569; sondas scorpion; sondas light cycler; sondas LUX; e sondas ampifluor. Essas sondas podem ser utilizadas para detecção, por exemplo, por incubação das gotículas contendo as sondas sob condições de crescimento do(s) microrganismo(s) alvo, depois de lise dos microrganismos alvo após incubação, por exemplo, por aquecimento, amplificação opcional de um locus alvo e detecção a presença ou ausência de um genótipo com a sonda de ácido nucleico. Em algumas modalidades, anticorpos marcados ou outras moléculas específicas para microrganismos particulares são usados. Tais moléculas marcadas podem ser específicas também para cepas de microrganismos, permitindo a identificação dos microrganismos que são suscetíveis a um agente antimicrobiano particular.
[00128] Os reagentes de detecção podem ser reagentes de detecção de ácido nucleico genotípicos não específicos e incluem, mas não se limitam, a corantes intercalantes. Os corantes intercalantes são geralmente cátions aromáticos com estruturas planas que se inserem entre pares de bases empilhadas no duplex de DNA, um arranjo que proporciona uma melhoria de fluorescência ambientalmente dependente para moléculas de corante e cria um grande aumento no sinal de fluorescência relativo ao corante livre em solução. A melhoria de sinal proporciona uma resposta proporcional, permitindo medições diretas de DNA quantitativas. Os corantes intercalantes preferidos na presente revelação incluem corantes fluorescentes. O corante pode ser um corante intercalante de cianina ou não cianina. Em alguns casos, o corante intercalante é um corante de cianina. Em alguns casos, o corante de cianina pode ser laranja Tiazol, SYBR® (por exemplo, Sybr Green I, Syber Green II, Sybr Gold, SYBR DX), Óleo Verde, CyQuant GR, SYTOX Green, SYT09, SYTO10, SYT017, SYBR14, Amarelo Oxazile, Laranja Tiazona, SYTO, TOTO, YOYO, BOBO e POPO. Em alguns casos, o corante é um corante que não é cianina. Em alguns casos, o corante que não é cianina é pentaceno, antraceno, naftaleno, ferroceno, metil viologeno, trimorfolmoamônio, propídio (por exemplo, iodeto de propídio) ou outro derivado aromático ou heteroaromático. Em alguns casos, o corante intercalante é selecionado do grupo que consiste em DAPI (4',6-diamidino-2- fenilindol), laranja de acridina, monoazida de etídio (EMA), monoazida de propídio (PMA), SYBR® Green I, SYBR® Gold, brometo de etídio, brometo de propídio, Pico Green, Hoechst 33258, YO-PRO-I e YO-YO-I, SYTO®9, LC Green®, LC Green® Plus+ e EvaGreen®. Em alguns casos, o corante intercalante é EvaGreen®. Esses corantes intercalantes podem ser utilizados para detecção, por exemplo, por incubação das gotículas contendo as sondas sob condições de crescimento do(s) microrganismo(s) alvo, então lisando os microrganismos alvo após incubação, por exemplo, por aquecimento, amplificação opcional de um locus alvo e detecção a presença ou ausência de um ácido nucleico de fita dupla com o corante intercalante. Em algumas modalidades, nenhuma incubação é necessária. Alternativamente, as células não precisam ser lisadas para detectar o microrganismo alvo e monitorar o crescimento do microrganismo alvo.
[00129] O reagente de detecção pode ser específico para o fenótipo. Por exemplo, o reagente de detecção pode ser um reagente que detecta a presença de uma atividade enzimática indicativa da presença de um organismo que produz tal enzima. Consequentemente, o reagente de detecção pode ser um cromóforo ou fluoróforo sensível ao pH que altere a absorvância (por exemplo, da luz visível) e/ou a fluorescência como resultado de uma alteração no pH. Um exemplo de sonda fluorescente sensível ao pH é detectavelmente fluorescente a um comprimento de onda de detecção em uma solução aquosa com um pH inferior a cerca de 5 e não é detectavelmente fluorescente ao comprimento de onda de detecção em uma solução aquosa com um pH superior a cerca de 6,5.
[00130] Por exemplo, microrganismos, como certas bactérias, como Enterobacteriaceae, que são conhecidos por reduzir drasticamente o pH dos meios nos quais são cultivados na ausência de um agente tamponante forte em concentração suficiente, podem ser detectados com um marcador (por exemplo, sonda ou outro identificador) que muda de cor ou fluoresce em pH baixo. Alternativamente, o reagente de detecção pode ser um substrato de uma enzima indicativa de um microrganismo ou classe de microrganismos. Em algumas modalidades, o reagente de detecção é um produto de uma reação entre um substrato e uma enzima produzida pelo microrganismo alvo. O substrato pode ser colorimétrico ou fluorogênico. Enzimas exemplares, microrganismos exemplares e substratos correspondentes incluem, mas não estão limitados, aos descritos na tabela I. Tabela I:
[00131] Geralmente, os reagentes de detecção são selecionados para serem compatíveis com a química da gotícula empregada. Por exemplo, os reagentes de detecção que residem essencialmente na fase aquosa e não se dividem substancialmente na fase não aquosa podem ser selecionados. Em alguns casos, a química das gotículas pode ser ajustada para minimizar o particionamento não aquoso do reagente de detecção. Por exemplo, um sistema de fase dupla pode ser substituído por gotículas com sistema de película, ou vice-versa, ou um agente tensoativo (por exemplo, um não fluortensoativo não iônico, ou um fluortensoativo) com HLB maior ou menor pode ser utilizado.
J. Amostras
[00132] As amostras para particionamento em gotículas de água em óleo podem incluir qualquer amostra conhecida ou suspeita de conter um microrganismo alvo. Para enumeração de QI, a amostra pode ser ou conter alimentos (por exemplo, alimentos para seres humanos ou animais), amostras ambientais tiradas de superfícies ou equipamentos. As amostras podem conter um ou mais microrganismos alvos. O(s) microrganismo(s) alvo(s) pode(m) ser ou incluir bactérias, leveduras ou mofos. As amostras clínicas incluem vários fluidos corporais ou amostras diluídas.
[00133] Qualquer microrganismo pode ser identificado usando os métodos divulgados. São exemplos de microrganismos alvos podem ser ou incluir bactérias gram positivas e gram negativas os seguintes: Enterobacteriaceae (Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia marscescens, e Citrobacter spp., Shigella spp., Salmonella spp., Cronobacter spp., ...), Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Campylobacter spp., Staphylococcus spp., Legionella spp., Corynebacterium spp., Listeria spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Bacillus spp., Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Debaromyces spp., Geotrichum spp., Hanseniaspora spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp., Rhodotula spp., Saccharomyces spp., Trichosporon spp., Zygosaccharomyces spp., Alternaria spp., Fusarium spp., Mucor spp., Penicillium spp., Pullularia spp., Trichothecium spp. ou uma combinação dos mesmos.
[00134] O(s) microrganismo(s) alvo(s) pode(m) ser ou incluir Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus mitis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Mycobacterium tuberculosis, Cryptococcus albidus, Debaromyces hansenii, Geotrichum candidum, Hanseniaspora guillermonii, Kluyveromyces lactis, Pichia angusta, Rhodotula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon pullulans, Zygosaccharomyces rouxii, Alternaria alternata, Fusarium graminearum, Mucor miehei, Penicillium patulum, Pullularia pullulans, Trichothecium roseum, Aspergillus niger, ou Aspergillus fumigatus, ou uma combinação dos mesmos.
i. Matrizes Alimentares
[00135] A matriz alimentícia pode ser um alimento para ser humano ou um alimento para animais, como um alimento para um animal de estimação ou para o gado. Os inventores descobriram surpreendentemente que as químicas das gotículas de água em óleo e os métodos de utilização aqui descritos são compatíveis com uma grande variedade de matrizes alimentares. Matrizes alimentares exemplares incluem, mas não estão limitadas a, aquelas que contêm alimentos de origem animal (por exemplo, carne como carne de boi ou presunto; derivados do leite como leite ou queijo) ou alimento à base de plantas (por exemplo, vegetais ou frutas), bebidas ou combinação dos mesmos. Em alguns casos, a carne contendo a matriz alimentar é carne moída (por exemplo, 85% ou 95% de carne moída magra). Em alguns casos, o leite contendo a matriz alimentar é leite integral, nata, leite meio a meio, de 2%, 1% ou leite desnatado (sem gordura).
[00136] Uma ampla variedade de conteúdo de gordura da matriz alimentar é compatível com as químicas de água em óleo descritas na presente invenção. Surpreendentemente, determinou-se que quantidades substanciais de gordura podem estar na matriz alimentar e não atrapalhar a formação das gotículas. Os teores possíveis de gordura incluem cerca de 0%, menos de cerca de 0,5%, cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50% ou cerca de 60%. Em alguns casos, o teor de gordura é de cerca de 0% a cerca de 20%, ou de cerca de 0% a cerca de 25%, ou de cerca de 20 a 45%.
[00137] Geralmente, a matriz alimentar é suspensa, misturada, combinada ou homogeneizada em um ou mais, ou todos, os componentes da fase aquosa das gotículas de água em óleo. Por exemplo, a matriz alimentar humana pode ser misturada com um ou mais, ou todos, os componentes da fase aquosa das gotículas de água em óleo a uma razão de cerca de 1:10, cerca de 10:90, cerca de 15:85, cerca de 20:80 ou cerca de 25:75 em peso da matriz alimentar em relação ao volume total dos componentes da fase aquosa.
ii. Amostras Ambientais
[00138] Ao analisar o ambiente, as amostras são de qualquer ambiente que seja de interesse, seja interno ou externo. Exemplos de ambientes para os quais o QI é relevante incluem água de ambientes recreacionais, areia de praia e superfícies. Um exemplo adicional é o ambiente em uma fazenda, matadouro ou qualquer outro local onde o alimento é processado (por exemplo, instalações de embalagem). Amostras de uma fazenda incluem amostras de solo, superfícies em edifícios agrícolas e equipamentos agrícolas. Água de ambientes recreacionais é qualquer água na qual a recreação ocorre e inclui corpos de água recreacionais, como piscinas, lagos, rios, oceanos, etc. As superfícies são relevantes, particularmente em hospitais, escolas, instalações de processamento de alimentos, etc. As amostras seriam swabs retirados de superfícies, e o swab é, em seguida, introduzido no meio do qual as gotículas são criadas.
iii. Amostras Clínicas
[00139] Descreve-se aqui métodos e composições para detectar a presença, ausência ou susceptibilidade antimicrobiana de um ou mais microrganismos alvo em uma amostra clínica. Em alguns casos, a amostra é uma amostra de um indivíduo (por exemplo, de um indivíduo humano) conhecido ou suspeito de estar infectado por um microrganismo patogênico. A amostra pode ser sangue, ou uma fração do mesmo, como plasma ou soro; tecido, urina, saliva; fluidos pericárdicos, pleurais ou da coluna; expectoração, concentrado de células tronco da medula óssea, concentrado de plaquetas; swabs nasais, retais, vaginais ou inguinais; feridas; amostras de pele, boca, língua, garganta; ascites; fezes e similares. Tais amostras podem ser analisadas para determinar um número microbiano e, portanto, avaliar a probabilidade de infecção patogênica.
[00140] Alternativamente, a amostra clínica pode ser uma cultura pura ou substancialmente pura de um microrganismo alvo de identidade conhecida. Tal cultura pura ou cultura substancialmente pura de um microrganismo alvo de identidade conhecida pode ser analisada pelos métodos divulgados para susceptibilidade antimicrobiana. Por exemplo, uma amostra de um indivíduo pode ser fornecida ou obtida e avaliada quanto à presença ou ausência de microrganismos alvo, por exemplo, plaqueando uma amostra de um indivíduo ou uma amostra cultivada de um indivíduo em um meio adequado. Uma única colônia ou pluralidade de colônias de microrganismos alvo pode ser selecionada, opcionalmente cultivada e particionada em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo que contêm um antimicrobiano de teste. O antimicrobiano de teste pode estar em uma concentração ou em uma pluralidade de concentrações na pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo.
Análise de Amostra
[00141] As amostras podem ser analisadas com um substrato fluorogênico ou colorimétrico na fase aquosa das gotículas de água em óleo para determinar a presença ou ausência de um microrganismo alvo que expressa uma enzima que reconhece o substrato, diagnosticando assim uma presença ou ausência de um género ou espécie ou classe de microrganismo(s) alvo. Alternativamente, um parceiro de ligação específico para o microrganismo de interesse (por exemplo, um anticorpo) é usado para determinar a presença ou ausência de um microrganismo alvo. Em outra modalidade, um microrganismo alvo é identificado como presente se o interior da gotícula for turvo. As amostras podem ser analisadas em paralelo com ou sem um teste de susceptibilidade antimicrobiana e, opcionalmente, em múltiplas concentrações antimicrobianas diferentes, para avaliar simultaneamente a susceptibilidade antimicrobiana do(s) microrganismo(s) alvo.
[00142] O volume total de componentes da fase aquosa é uma função do número de gotículas que o sistema gera e do volume de cada gotícula. Em alguns casos, o volume total de componentes da fase aquosa que é usado para gerar gotículas é 5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, 100 μL, 150 μL, 175 μL, 200 μL, 225 μL, 250 μL, 275 μL, 300 μL, 325 μL, 350 μL, 375 μL, 400 μL, 425 μL, 450 μL, 475 μL, 500 μL, 500 μL, 550 μL, 600 μL, 650 μL, 700 μL, 750 μL, 800 μL, 850 μL, 900 μL, 950 μL, 1 mL, 2 mL, 3 mL ou 4 mL. Em alguns casos, o volume total de componentes da fase aquosa, incluindo, mas não limitado à amostra clínica ou cultura pura de uma amostra clínica, que é usada para gerar gotículas, é de cerca de 10 μL a cerca de 1 mL, de cerca de 20 μL a cerca de 1 mL, de cerca de 25 μL a cerca de 500 μL, de cerca de 50 μL a cerca de 400 μL, de cerca de 75 μL a cerca de 300 μL ou de cerca de 100 μL a cerca de 200 μL.
[00143] Em alguns casos, o número total de gotículas de uma pluralidade de gotículas (por exemplo, contendo uma matriz alimentar humana ou amostra clínica) é de pelo menos cerca de 1.000; 2,000; 3,000; 4,000; 5000; 6,000; 7.000; 8.000; 9.000; 10.000; 15.000; 20.000; 25.000; 30.000; 35.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; ou 100.000. Em outras modalidades, até um milhão de gotas são formadas. Em alguns casos, o número total de gotículas de uma pluralidade de gotículas (por exemplo, contendo uma matriz alimentar humana ou amostra clínica) é de cerca de 1.000 a cerca de 100.000; de cerca de 2.000 a cerca de 90.000; de cerca de 3.000 a cerca de 80.000; de cerca de 4.000 a cerca de 70.000; de cerca de 5.000 a cerca de 60.000; de cerca de 7.500 a cerca de 50.000; de cerca de 10.000 a cerca de 40.000; de cerca de 15.000 a cerca de 30.000. ou de cerca de 20.000.
III. Métodos:
[00144] Descreve-se aqui métodos para analisar rapidamente o crescimento ou o número de um ou mais microrganismos alvo em uma amostra particionando a amostra em uma pluralidade de gotículas de emulsão água-em-óleo, incubando as gotículas durante, pelo menos, 1 a 50 (por exemplo, 5 a 20) tempos de duplicação e detectando a presença ou ausência dos microrganismos alvo nas gotículas.
[00145] Em geral, os métodos descritos incluem encapsular uma amostra em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo, em que as gotículas de emulsão de água em óleo encapsulam adicionalmente um meio de crescimento microbiológico; incubar a pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo a uma temperatura permissiva de crescimento microbiológico e por um período de tempo suficiente para permitir que os microrganismos alvo passem por 5 a 45 vezes os tempos de duplicação; identificar as gotículas de emulsão de água em óleo compreendendo os microrganismos alvo; responder à identificação do microrganismo alvo em pelo menos uma gotícula de emulsão de água em óleo, determinando que o microrganismo alvo está presente na amostra. Em algumas modalidades, a incubação não é utilizada e as gotículas são analisadas sem incubar primeiro.
[00146] Em algumas modalidades, as gotículas de água em óleo incluem adicionalmente um ou mais dentre: corante intercalante, proteína marcada (por exemplo, anticorpo, lectina ou fibrinogênio) ou albumina de soro bovino.
[00147] Um método geral para analisar uma matriz alimentar para determinar o número de um microrganismos alvos compreende as etapas de: homogeneizar uma porção da matriz alimentar, em que a porção da matriz possui uma massa ou volume conhecido; incubar a pluralidade de gotículas de emulsão água em óleo a uma temperatura que permite o crescimento microbiológico, e por um período de tempo suficiente para permitir que os microrganismos alvo dupliquem de 5 a 45 vezes; determinar a partir das gotículas de emulsão de água em óleo incubadas: um número de gotículas de emulsão água em óleo que contém microrganismos, determinando assim um número de gotículas positivas; e um número de gotículas de emulsão água em óleo que não contém microrganismos, determinando assim um número de gotículas negativas; e determinar a partir do número de gotículas positivas e de gotículas negativas um número total de microrganismos alvos, determinando assim o número de microrganismos alvos por unidade de massa ou volume da matriz alimentar. Os meios de crescimento microbiológico exemplares incluem proteínas parcialmente digeridas (por exemplo, da digestão tríptica parcial de caseína, da digestão papaica particular de farinha de soja, ou uma combinação dos mesmos). As gotículas de água em óleo contêm ainda opcionalmente uma ou mais dentre água peptonada tamponada (tal como meio BAM M192) e um tensoativo. Por exemplo, o tensoativo pode ser não iônico, como o poloxâmero. Um exemplo de poloxâmero tem um peso molecular de cerca de 1.800 g/mol. Em algumas modalidades, o poloxâmero compreende cerca de 80% de polioxietileno. Os tensoativos podem estar a concentrações de pelo menos cerca de 0,01% e não mais do que cerca de 5% ou cerca de 1%. O meio de crescimento microbiológico encapsulado tem um pH de cerca de 7,2, em algumas modalidades.
[00148] Um método geral para testar um microrganismo alvo para uma concentração inibitória mínima de um antimicrobiano teste compreende: (i) encapsular uma pluralidade dos microrganismos alvo em uma pluralidade de gotículas de emulsão água em óleo compreendendo meio de crescimento microbiológico, em que as gotículas de emulsão água em óleo encapsulam ainda um meio de crescimento microbiológico; uma primeira porção das gotículas água em óleo encapsulam o antimicrobiano de teste a uma primeira concentração, ou não encapsulam o antimicrobiano de teste; uma segunda porção das gotículas água em óleo encapsula o antimicrobiano de teste a uma segunda concentração diferente da primeira concentração; e, opcionalmente, até, quatro porções adicionais das gotículas água em óleo encapsulam diferentes concentrações adicionais do antimicrobiano de teste; (ii) incubar a pluralidade de gotículas de emulsão água em óleo a uma temperatura permissiva de crescimento microbiológico na ausência do antimicrobiano de teste, e por um período de tempo suficiente para permitir que os microrganismos alvo, se não estiverem inibidos pelo antimicrobiano de teste, dividam de 5 a 20 vezes, ou mais; iii) determinar, para cada porção das gotículas de emulsão água em óleo incubadas: um número de gotículas de emulsão água em óleo compreendendo o microrganismo alvo acima de um número limiar, determinando assim um número de gotículas positivas; e um número de gotículas de emulsão água em óleo compreendendo o microrganismo alvo abaixo do número limiar, determinando assim um número de gotículas negativas; e iv) determinar a concentração inibitória mínima do antimicrobiano de teste das gotículas positivas e negativas para cada porção de gotículas. Em algumas modalidades, existem seis porções de gotículas de emulsão água em óleo e as primeiras quintas porções têm concentrações de antimicrobiano de teste que são diluições de duas vezes em série da concentração da sexta porção.
[00149] Em algumas modalidades, a determinação do número de gotículas positivas e a determinação do número de gotículas negativas compreende a detecção da presença ou ausência de esporos bacterianos ou hifas de levedura ou mofo nas gotículas por imageamento visual ou computadorizado, em que o número de gotículas positivas é o número de gotículas que exibem a presença de esporos bacterianos ou hifas de levedura ou mofo na pluralidade de gotículas água em óleo e o número de gotículas negativas é o número de gotículas que exibem a ausência de esporos bacterianos ou hifas de levedura ou mofo na pluralidade de gotículas água em óleo.
A. Tratamento de Fase Aquosa e/ou Amostra
[00150] A amostra e/ou a fase aquosa podem ser tratadas, antes da geração de gotículas, para facilitar a formação de gotículas. O tratamento pode ser particularmente adequado com uma concentração relativamente elevada e/ou filamentos fúngicos relativamente longos ou aglomerados microbianos na fase aquosa. Quando as gotículas são formadas sob condições padrão, a fase aquosa pode ser submetida a uma diminuição rápida na área da seção transversal, alongamento, seguido por separação e formação da gotícula. Quando microrganismos estão presentes acima de certas concentrações ou em certas morfologias (por exemplo, como flocos, hifas, etc.)a capacidade de formar gotículas pode ser prejudicada. Por exemplo, estes microrganismos podem ficar emaranhados uns com os outros no rápido processo de formação de gotículas, e podem não ter tempo suficiente para se separarem através da difusão, formando assim um cordão que faz com que as gotículas não se formem eficientemente. O cordão pode resultar em jateamento, microssatélites e coalescência, além de outras características de má formação de emulsões. Alternativamente, ou além disso, os microrganismos podem interagir com a interface das gotículas, diminuindo a tensão superficial e impedindo a formação de gotículas.
[00151] Em alguns casos, é necessária uma estratégia para superar esse efeito na formação de gotículas. Uma abordagem exemplar é retardar a taxa de formação de gotículas de modo que a gotícula tenha tempo de se separar e se formar. Outra solução mecânica pode ser redesenhar o gerador de gotículas para forçar a formação das mesmas sob essas condições de alta concentração. Outra abordagem exemplar é tratar a amostra a ser incorporada na fase aquosa para reduzir a aglomeração, agregação, floculação, o comprimento das hifas, etc. Em alguns casos, essa redução pode ser realizada por tratamento térmico da amostra até pelo menos cerca de 40 a 50 °C durante pelo menos cerca de 1, 2, 5, 10, 15 ou 30 minutos, entre outros. A temperatura aplicada é determinada com base na estabilidade ao calor do microrganismo a ser analisado.
[00152] Outra abordagem exemplar é separar mecanicamente grandes aglomerados, agregados, estruturas de hifas, etc. Tal separação mecânica pode ser realizada como uma etapa separada, ou durante a homogeneização ou mistura de uma amostra (por exemplo, matriz alimentar) com outros componentes da fase aquosa. Por exemplo, uma amostra de matriz alimentar pode ser homogeneizada ou misturada com componentes da fase aquosa com um digestor, batedeira de esferas, vórtice ou outro aparelho adequado, em que tal homogeneização ou mistura também separa os aglomerados, agregados, estruturas de hifas e similares de um ou mais microrganismos alvos. Como outro exemplo, uma amostra, tal como uma cultura pura de um microrganismo alvo, pode ser brevemente sujeita a agitação mecânica (por exemplo, utilizando um misturador de vórtice) antes ou depois da combinação com um ou mais componentes de uma fase aquosa.
B. Formação de gotículas
[00153] As fases aquosa e não aquosa contendo os componentes discutidos acima, incluindo, mas sem se limitar, aos microrganismos alvos, meios de cultura e, opcionalmente, um antimicrobiano de teste, podem ser fornecidas (por exemplo, obtidas e/ou preparadas), e depois utilizadas para formar uma emulsão, gerando assim uma pluralidade de gotículas de água em óleo contendo microrganismos alvo.
[00154] Uma emulsão geralmente inclui gotículas de uma fase dispersa (por exemplo, uma fase aquosa) dispostas em uma fase contínua imiscível (por exemplo, uma fase não aquosa, como uma fase oleosa) que serve como fluido carreador para as gotículas. Ambas as fases dispersa e contínua geralmente são pelo menos predominantemente líquidas.
[00155] Qualquer método e estrutura adequados podem ser usados para formar a emulsão. Geralmente, é necessário fornecer energia para formar a emulsão, tal como agitação, mistura, ultrassom, combinação ou, de outro modo, homogeneização da emulsão. No entanto, essas abordagens podem produzir emulsões polidispersas, nas quais as gotículas exibem uma faixa de tamanhos, pela geração substancialmente descontrolada de gotículas. Alternativamente, emulsões monodispersas (com tamanho de gotas altamente uniforme) podem ser criadas por geração controlada de gotículas em série com pelo menos um gerador de gotículas. Em modalidades exemplares, o gerador de gotículas opera por focagem de fluxo em microcanais para gerar uma emulsão de gotículas monodispersas. Outras abordagens e estruturas para a geração de gotículas que podem ser adequadas são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. de série 61/341.218, depositado em 25 de março de 2010; no Pedido de Patente Provisório Norte- Americano No. de série 61/409.106, depositado em 1° de novembro de 2010; no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. de Série 61/409.473, depositado em 2 de novembro de 2010; no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. de série 61/410.769, depositado em 5 de novembro de 2010; no pedido de patente Norte-Americano No. de série 12/862.542, depositado em 24 de agosto de 2010; na Publicação do Pedido de Patente Norte-Americano No. 2010/0.173.394 A1, publicado em 8 de julho de 2010; 2014/0.179.544; e nas Publicações dos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 2014/138.711; e WO 2011/109.546, cujos conteúdos de cada um deles são aqui incorporados na totalidade para todos os efeitos, e em particular para divulgação relacionada com a geração de gotículas, química de gotículas, manipulação de gotículas microfluídicas, modulação da temperatura da gotícula e métodos de detecção.
[00156] Um tensoativo presente na fase aquosa pode auxiliar na formação de gotículas aquosas dentro de uma fase não aquosa. O tensoativo pode fazê-lo interagindo fisicamente com a fase não aquosa e com a fase aquosa, estabilizando a interface entre as fases e formando uma camada interfacial automontada. O tensoativo pode aumentar a estabilidade cinética das gotículas, reduzir a coalescência das gotículas, reduzir a agregação das gotículas ou uma combinação dos mesmos. As gotículas podem ser relativamente estáveis para as forças de cisalhamento criadas pelo fluxo do fluido durante a manipulação fluídica. Por exemplo, as gotículas podem ser estáveis a taxas de fluxo de pelo menos 40 L/min ou 50 L/min em um canal de 100 μm ou 200 μm utilizando combinações selecionadas de formulações de fase aquosa e não aquosa. As gotículas resultantes podem ter qualquer forma e tamanho adequados. As gotículas podem ser esféricas, quando a forma não é limitada. O diâmetro médio das gotículas pode ser de cerca de 1 a 500 μm, 5 a 500 μm ou 50 a 500 μm, e o volume mio das gotículas pode ser de cerca de 50 pL a 500 nL, 100 pL a 10 nL, 200 pL a 5 nL, de cerca de 0,5 nL, cerca de 1 nL, cerca de 2 nL, cerca de 3 nL ou cerca de 5 nL. O número de gotículas geradas pode depender de uma variedade de fatores, incluindo, mas sem se limitar, à instrumentação utilizada e à maneira de geração da gotícula (por exemplo, agitação a granel ou geração serial), a química da gotícula, o volume da gotícula, o volume das fases aquosa e/ou não aquosa consumidas durante a geração da gotícula, o volume da amostra analisada e o número de microrganismos alvo a serem particionados.
[00157] As gotículas podem ser formadas e, em seguida, coletadas como uma emulsão em um reservatório, como um frasco, um tubo de ensaio, um poço de placa, uma câmara ou algo similar. Em algumas modalidades, as gotículas podem ser coletadas como uma emulsão em um tubo de PCR ou microplaca, que é então incubada em uma incubadora configurada para conter um ou mais tubos de PCR ou microplacas. Alternativamente, ou adicionalmente, as gotículas podem ser coletadas em um reservatório e, em seguida, transferidas para um recipiente diferente para incubação a uma temperatura de crescimento microbiana e/ou podem ser manipuladas e/ou transportadas através de fluidos, como microfluidos, para uma posição de incubadora. Em uma modalidade alternativa, as gotículas são formadas e entram num canal microfluídico. Em tal modalidade, uma linha de gotículas de uma única fila se forma no canal.
[00158] Não há necessidade de uma concentração específica de microrganismos na fase aquosa antes da geração de gotículas. De modo a obter substancialmente todas as gotículas com não mais do que um microrganismo na geração de gotículas, a fase aquosa de partida está em uma concentração em que uma em dez gotículas contém um microrganismo. Em outras modalidades, mais do que um microrganismo pode estar em cada gotícula.
[00159] As gotículas podem ser dispersadas em um fluido de espaçamento. Em alguns casos, o fluido de espaçamento pode facilitar a manipulação fluídica de gotículas que são densamente empacotadas e/ou que facilitam a dispersão de gotículas ou cápsulas pegajosas. Por exemplo, gotículas podem ser geradas, opcionalmente transformadas em cápsulas, incubadas em uma ou mais temperaturas (por exemplo, em temperaturas de crescimento microbiano e/ou temperaturas de detecção), e, em seguida, dispersas em um fluido de espaçamento. Alternativamente, as gotículas podem ser dispersas em um fluido de espaçamento antes de uma ou mais das incubações. Em alguns casos, o fluido de espaçamento contém o componente da fase oleosa da fase não aquosa usada para gerar as gotículas. Em alguns casos, o fluido de espaçamento contém a fase oleosa, mas não o tensoativo não aquoso usado para gerar as gotículas.
D. Transformação de gotículas
[00160] As químicas das gotículas contendo um ou mais componentes formadores de película (por exemplo, proteínas formadoras da pele) podem ser transformadas de gotículas para cápsulas para alcançar uma maior estabilidade. Tal transformação pode ser útil para análise de microrganismos de crescimento lento. Em tais casos, a coalescência ou agregação de gotículas durante a incubação prolongada a uma temperatura de crescimento microbiana pode ser reduzida ou eliminada. Além disso, em alguns casos, o crescimento de hifas de um microrganismo alvo pode penetrar nas paredes das gotículas não transformadas, diminuindo a estabilidade das gotículas. Em tais casos, a transformação de gotículas em cápsulas pode ser útil para reduzir ou eliminar essa penetração de hifas. Alternativamente, a formação de cápsulas pode ser realizada após a incubação de gotículas a uma temperatura de crescimento microbiana. Tal formação de cápsula pode, por exemplo, permitir a formação de cápsulas e a morte simultânea dos microrganismos alvos. Tais cápsulas podem ser opcionalmente armazenadas e/ou posteriormente analisadas. Em alguns casos, a formação de cápsulas por aquecimento após a incubação de gotículas a uma temperatura de crescimento microbiana pode ser realizada para revelar o epítopo interno ou para liberar o ácido nucléico dos microrganismos nas gotículas, se presente, e detectar o ácido nucléico com uma ou mais sondas ou corantes intercalantes.
[00161] Geralmente, as gotículas são transformadas por aquecimento. As gotículas, a fase contínua e/ou a emulsão podem ser aquecidas a uma temperatura suficiente para formar a película e durante um tempo suficiente para produzir a película. Uma relação inversa pode existir entre a temperatura e o tempo suficiente para que tal conversão ocorra. Isto é, aquecer as gotículas a uma temperatura relativamente baixa pode requerer um tempo de aquecimento mais longo do que aquecer as gotículas a uma temperatura relativamente mais alta. No entanto, a formação da película pode ocorrer rapidamente acima de uma temperatura limiar e muito mais lentamente alguns graus abaixo da temperatura limiar. Por exemplo, a formação da película pode ocorrer ou ser concluída em menos de cerca de cinco minutos ou menos do que cerca de um minuto quando a emulsão é aquecida acima da temperatura limiar. A transformação de gotículas em cápsulas pode diminuir a solubilidade de uma ou mais proteínas formadoras da película (e/ou outros componentes formadores de película) na fase aquosa, de tal forma que o(s) componente(s) formador(es) da película se tornam menos solúveis (por exemplo, se tornam substancialmente insolúveis) na fase aquosa. Por conseguinte, a película pode ser substancialmente insolúvel na fase aquosa.
[00162] Em algumas modalidades, a temperatura limiar pode corresponder à temperatura de desnaturação de uma proteína formadora de pele na fase aquosa. Por conseguinte, a formação da película pode ser uma consequência da desnaturação da proteína que ocorre muito mais rapidamente acima da temperatura limiar do que abaixo. Como exemplo, foi relatado que a BSA desnaturou a cerca de 50 °C a 55 °C, e as gotículas que incorporam BSA como uma proteína formadora de película podem ser induzidas para formar uma película rapidamente a aproximadamente a mesma temperatura. Por conseguinte, o uso de outra proteína formadora de película com uma temperatura de desnaturação diferente pode requerer aquecimento a uma temperatura diferente correspondente antes da formação da pele.
[00163] Em alguns casos, um componente formador de película com uma temperatura de formação de película (por exemplo, desnaturação) compatível com a viabilidade de um microrganismo alvo pode ser selecionado. Por exemplo, uma temperatura de formação de película relativamente baixa pode ser selecionada para a formação de cápsulas de gotículas, de modo que o microrganismo alvo possa permanecer substancialmente viável após a incubação durante, pelo menos, 1 a 5 minutos na temperatura de formação de película do componente formador da película. Alternativamente, um componente formador de película com uma temperatura de formação de película (por exemplo, desnaturação) que seja compatível com a morte dos microrganismos alvo ou que libera ácido nucleico dos microrganismos alvo pode ser selecionado. Por exemplo, uma temperatura de formação de película relativamente alta pode ser selecionada para a formação de cápsulas de gotículas, de modo que o microrganismo alvo possa ser substancialmente morto ou lisado após a incubação durante, pelo menos, cerca de 1 a 30 minutos na temperatura de formação de película do componente formador da película.
[00164] O aquecimento das gotículas a uma temperatura acima da temperatura de formação da película pode converter uma camada interfacial automontada em uma película interfacial. A película pode ser composta de proteína, ou de proteína e tensoativo, dentre outros. Em alguns casos, as gotículas podem ser aquecidas através de ciclos térmicos, tal como é realizado durante a amplificação por PCR. O perfil do ciclo térmico pode incluir variações de temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 99 °C. As gotículas podem ser opcionalmente aquecidas através de ciclos térmicos, como resultado do transporte das gotículas através de um sistema de termociclagem baseado em fluxo. Outros aspectos de um sistema de termociclagem baseado em fluxo exemplar são divulgados na Publicação do Pedido de Patente Norte- Americano No. 2010/0.173.394 A1, publicado em 8 de julho de 2010, que é aqui incorporado por referência.
D. Incubação
[00165] Após a formação de gotículas ou cápsulas, as gotículas ou cápsulas podem ser incubadas a uma temperatura ou temperaturas selecionadas. Por exemplo, as gotículas ou cápsulas podem ser incubadas a uma ou mais temperaturas adequadas para crescimento microbiano, lise, processamento enzimático de um substrato colorimétrico ou fluorogênico ou detecção de ácido nucleico, ou uma combinação dos mesmos. Substratos fluorogênicos sofrem condensação aldólica intramolecular após clivagem com uma enzima do microrganismo alvo, produzindo assim um composto indicador fluorescente. Temperaturas de crescimento microbiano exemplares incluem, mas não estão limitadas, a 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C, 37 °C, 40 °C, 41 °C, 41,5 °C, 42 °C, 43 °C, 44 °C, 45 °C ou 50 °C. Em alguns casos, a temperatura de crescimento microbiano é otimizada para um microrganismo alvo ou classe de microrganismos alvo específico. Por exemplo, se o microrganismo alvo for E. coli, então a temperatura de crescimento microbiano pode ser de 37 °C. Alternativamente, pode ser selecionada uma temperatura de crescimento microbiano que é adequada para o crescimento de múltiplos microrganismos tendo múltiplas temperaturas de crescimento ideais diferentes. Por exemplo, o crescimento de leveduras, mofos e bactérias pode ser analisado simultaneamente utilizando uma temperatura de crescimento microbiana de 25 °C, 30 °C, 35 °C ou 37 °C.
[00166] As gotículas ou cápsulas podem ser incubadas a uma temperatura de crescimento microbiano durante um número selecionado de tempos de duplicação. Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que os métodos e composições descritos na presente invenção podem fornecer números microbianos precisos ou resultados de susceptibilidade antimicrobiana após nenhum tempo para duplicação ou um número relativamente pequeno de tempos de duplicação (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45, 5 a 45, 10 a 40, 15 a 30, 20 a 25, 10 a 20, 10 a 15 ou 5 a 15), possibilitando assim um rápido ensaio em comparação com a cultura padrão em técnicas líquidas (caldo) e/ou de plaqueamento. Uma pessoa versada na técnica compreenderá que um microrganismo alvo que é incubado durante um número selecionado de tempos de duplicação a uma temperatura de crescimento microbiano não necessariamente duplica em quantidade o número de vezes selecionado devido à fase lag, à fase de aceleração, à fase exponencial, à estacionária fase, à fase de desaceleração ou à fase de morte, ou combinações das mesmas que os microrganismos tipicamente exibem.
[00167] Esses números selecionados de tempos de duplicação podem corresponder a pelo menos cerca de 15 min, 20 min, 30 min,... 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 9 h, 10 h, 11 h, 12 h, 13 h, 14 h, 15 h, 16 h, 17 h, 18 h, 19 h, 20 h, 21 h, 22 h, 23 h, 24 h, 25 h, 26 h, 27 h, 28 h, 29 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 44 h, 48 h, 52 h, 58 h, 60 h, 66 h ou 72 h.
[00168] Os números selecionados de tempos de duplicação podem corresponder a: • de pelo menos cerca de 4 h e não mais do que cerca de 16 h ou pelo menos cerca de 4 h e não mais do que cerca de 8 h para bactérias; • de pelo menos cerca de 6 h e não mais do que cerca de 12 h ou de pelo menos cerca de 8 h e não mais do que cerca de 12 h para levedura; • de pelo menos cerca de 8 horas e não mais do que cerca de 36 horas ou de pelo menos cerca de 8 horas e não mais do que cerca de 24 horas para mofos; • de cerca de 2 h a cerca de 8 h, de 2 h a cerca de 6 h, de cerca de 4 h a cerca de 8 h ou de cerca de 4 h a cerca de 12 h para um microrganismo de crescimento rápido, tal como de E. coli a ou perto de uma temperatura de crescimento ideal, como 37 °C; de cerca de 4 h a cerca de 12 h, de cerca de 4 h a cerca de 16 h, de cerca de 4 h a cerca de 18 h, de cerca de 4 h a cerca de 24 h, de cerca de 4 h a cerca de 48 h, de cerca de 6 h a cerca de 12 h, de cerca de 6 h a cerca de 16 h, de cerca de 6 h a cerca de 18 h, de cerca de 6 h a cerca de 24 h, de cerca de 6 h a cerca de 48 h, de cerca de 8 h a cerca de 16 h, de cerca de 8 h a cerca de 18 h, de cerca de 8 h a cerca de 24 h ou de cerca de 8 h a cerca de 48 h para um microrganismo de crescimento mais lento, tal como Listeria spp., a ou próximo de uma temperatura de crescimento ideal, como 37 °C; • de cerca de 4 h a cerca de 12 h, de cerca de 6 h a cerca de 12 h, de cerca de 6 h a cerca de 16 h, de cerca de 6 h a cerca de 18 h, de cerca de 6 h a cerca de 24 h, de cerca de 6 h a cerca de 48 h, de cerca de 8 h a cerca de 12 h, de cerca de 8 h a cerca de 16 h, de cerca de 8 h a cerca de 18 h, de cerca de 8 h a cerca de 24 h, de cerca de 8 h a cerca de 48 h, de cerca de 12 h a cerca de 16 h, de cerca de 12 h a cerca de 18 h, de cerca de 12 h a cerca de 24 h ou de cerca de 12 h a cerca de 48 h para uma levedura ou mofo.
[00169] Em alguns casos, após a incubação à temperatura de crescimento microbiano, gotículas ou cápsulas são incubadas a uma segunda temperatura. A segunda temperatura pode ser menor (por exemplo, 4 °C) para armazenamento a curto prazo. A segunda temperatura pode ser mais alta (por exemplo, 65 °C ou 95 °C) para formar cápsulas, lisar microrganismos alvos, liberar ácido nucleico e/ou iniciar amplificação e/ou detecção por termociclagem. Em alguns casos, após incubação à temperatura de crescimento microbiano, as gotículas ou cápsulas são incubadas a uma temperatura selecionada para detecção fluorogênica ou colorimétrica de uma enzima que não é substancialmente ativa contra um substrato fluorogênico ou colorimétrico à temperatura de crescimento microbiano. Alternativamente, a enzima pode ser ativa na temperatura de crescimento microbiano e temperaturas de incubação adicionais não são necessárias. Em alguns casos, embora a enzima possa estar ativa na temperatura de crescimento microbiano, ela é sequestrada dentro das células do microrganismo alvo. Em tais casos, uma etapa de incubação a alta temperatura após o crescimento microbiano pode ser realizada para liberar uma fração da enzima para detecção subsequente.
E. Detecção
[00170] A presença ou ausência de microrganismos alvos em uma pluralidade de gotículas ou cápsulas pode ser detectada por uma variedade de métodos. Por exemplo, os inventores verificaram surpreendentemente que gotículas contendo acima de uma concentração limite de certos microrganismos alvo (por exemplo, após incubação de gotículas para um número adequado de tempos de duplicação ou divisões do microrganismo alvo) apresentam uma autofluorescência detectável. Por conseguinte, após incubação a uma temperatura de crescimento microbiana, as gotículas podem ser analisadas quanto à presença ou ausência de autofluorescência, em que a autofluorescência é indicativa da presença do microrganismo alvo.
[00171] Em alguns casos, a detecção pode ser a detecção de turbidez nas gotículas. Assim, gotículas nas quais microrganismos encapsulados foram substancialmente divididos podem ser detectadas. Em alguns casos, a detecção pode ser detecção de fluorescência ou absorvância de um fluoróforo ou cromóforo. Por exemplo, uma digestão de um substrato fluorogênico ou colorimétrico, tal como um dos substratos da Tabela I, pode ser detectada através da detecção de gotículas que exibem absorvância ou fluorescência características. Como outro exemplo, sondas fluorogênicas ou corantes intercalantes podem ser utilizados para detectar, respectivamente, a presença ou ausência de uma sequência de ácido nucleico ou ácido nucleico de cadeia dupla em geral. Ainda como outro exemplo, um cromóforo ou fluoróforo sensível ao pH pode ser utilizado para detectar a presença ou ausência de uma alteração no pH nas gotículas, indicando uma presença ou ausência de microrganismos alvo nas gotículas, respectivamente. Em outras modalidades, uma porção detectável que se liga especificamente ao microrganismo de interesse é usada para identificar a presença ou ausência do microrganismo. Tal porção detectável pode ser uma proteína marcada (por exemplo, um anticorpo, uma lectina, fibrinogênio). Marcadores como estes podem ser usados com e sem agentes de lise.
[00172] Geralmente, as gotículas são identificadas como positivas ou negativas. As gotículas positivas são aquelas que contêm microrganismos ou contêm acima de um número limiar de microrganismos, e as gotículas negativas são aquelas que não contêm microrganismos ou contêm abaixo de um número limiar de microrganismos. Em alguns ensaios, as gotículas são analisadas antes e depois da incubação. Em tal ensaio, as gotículas positivas são aquelas para as quais o número de microrganismos aumentou a partir da análise inicial e as gotículas negativas são aquelas para as quais o número de microrganismos não aumentou a partir da análise inicial. A análise pode ser realizada manualmente, por exemplo, usando um microscópio óptico ou de forma automatizada. Em alguns casos, a detecção automatizada é realizada pelo fluxo em série das gotículas através de uma região de detecção configurada para detectar a absorvância, a transmissão ou a emissão (por exemplo, fluorescência) em um ou mais comprimentos de onda. Em alguns casos, um fluido de espaçamento é adicionado a gotículas que fluem em um canal para uma região de detecção que é operativamente disposta em relação a um detector e/ou a uma fonte de luz de excitação. Em alguns casos, a detecção automatizada é realizada por um sistema de contagem de partículas 3D de alto rendimento em um volume de gotículas, conforme é descrito em Nature Communications 5, Artigo número: 5427, doi:10.1038/ncomms6427. 13 de novembro de 2014. Por exemplo, a contagem de partículas 3D de alto rendimento pode ser usada para detectar uma única gotícula fluorescente em um conjunto de gotículas não fluorescentes de vários mililitros.
[00173] A amostra pode ser testada quanto à carga microbiana total, carga bacteriana total, coliformes totais, leveduras, mofos ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, microrganismos específicos são identificados e, opcionalmente, quantificados.
F. Determinação do Número de Microrganismos
[00174] Após a detecção de gotículas quanto à presença ou ausência de microrganismos, obtendo assim um número de gotículas positivas e um número de gotículas negativas, os dados podem ser analisados para determinar um resultado quantitativo, como a carga microbiana de uma amostra de matriz alimentar ou a presença de um microrganismo alvo em uma amostra clínica. Em alguns casos, a fração de gotículas positivas (isto é, a razão de gotículas positivas em relação às gotículas totais) é calculada a partir do número de gotículas positivas e negativas. Em alguns casos, a fração é corrigida ajustando a fração a uma distribuição de Poisson. A consideração da correção de Poisson assume que microrganismos alvos são aleatoriamente particionados em gotículas durante a formação das gotículas e, portanto, múltiplos microrganismos alvos podem particionar em uma única gotícula com uma probabilidade finita, dependente da concentração e previsível. Em alguns casos, o valor de ln(1-p), onde p é a fração de gotículas positivas, determina o número de microrganismos alvo por gotícula e, portanto, o número de microrganismos alvo na amostra da qual as gotículas foram geradas.
IV. Kits
[00175] São aqui descritos kits para enumeração de um ou mais microrganismos alvo, determinando a susceptibilidade antimicrobiana de um microrganismo alvo, ou uma combinação destes. Os kits podem incluir reagentes de fase não aquosa para formar gotículas de fase dupla e/ou gotículas com películas, tais como óleo (por exemplo, óleo fluoroso) e tensoativo não aquoso (por exemplo, um fluortensoativo ou mistura contendo um ou mais fluortensoativos). O kit pode incluir reagentes de fase aquosa, tais como componentes formadores de película (por exemplo, BSA). Reagentes de fase aquosa adicionais ou alternativos incluem um tensoativo aquoso (por exemplo, um não fluortensoativo não iônico ou uma mistura contendo um não fluortensoativo não iônico). O kit pode incluir reagentes de fase oleosa, tais como agentes antifúngicos (por exemplo, diclorano, rosa bengala e/ou quitosana). O kit pode incluir reagentes de detecção incluindo, mas sem se limitar, a um ou mais substratos enzimáticos da tabela I, um corante intercalante, um anticorpo, uma lectina, fibrinogênio ou uma sonda de ácido nucleico. O kit pode incluir um ou mais microrganismos de controle. O kit pode incluir um ou mais antimicrobianos de teste. O kit pode incluir instruções para realizar os métodos descritos na presente invenção.
EXEMPLOS Exemplo I: Detecção de Suscetibilidade Antimicrobiana Materiais e Métodos
[00176] Cepas com concentrações inibitórias mínimas bem distinguidas (CIMs) contra uma grande variedade de fármacos (CLSI: M100S21. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011) foram escolhidas entre isolados obtidos da Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC®). Elas compreendiam Escherichia coli (ATCC®25922TM), Staphylococcus aureus (ATCC®29212TM), Enterococcus faecalis (ATCC®29212TM) e Candida albicans (ATCC®24433TM). Outra cepa de S. aureus ATCC®43300 foi estudada, para a qual a CIM não foi distinguida no documento do CLSI, mas determinada por Witte et al. (Clin Microbiol Infect 2007; 13: 408-412). Esta cepa é conhecida por carregar um fenótipo de resistência heterogênea que também foi usado com ou sem indução com cefalosporinas.
[00177] Cada cepa foi armazenada como estoque congelado a -80 °C. Exceto quando indicado, após culturas de um dia para o outro em caldo tripto- caseína-soja (TCS; Bio-Rad, Marnes la Coquette, França), todas as cepas bacterianas iniciaram a partir da mesma turbidez ajustada, que era equivalente a 1:100 de 0,5 McFarland em TCS. Para a Candida albicans, a turbidez inicial foi equivalente a 1:10 de 0,1 McFarland.
Teste de Susceptibilidade
[00178] As gotículas foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad) usando o óleo de geração de gotículas QX200 ™ para EvaGreen (+tensoativo) com os parâmetros de mistura ajustados para o volume de amostra e o número aproximado de microrganismos. As culturas com turvação ajustada foram diluídas em reagentes de fase aquosa com uma concentração conhecida de antibióticos ou agentes antifúngicos em uma razão de 1:1 de cultura de TCS para reagentes de fase aquosa (v/v, 10 μL/10 μL).
[00179] Os antibióticos e antifúngicos testados compreendiam cefoxitina, piperacilina, ácido nalidíxico, tetraciclina, vancomicina, trimetoprima, nitrofurantoína, colistina, nitrofurano, cloranfenicol, gentamicina, anfotericina B e fluconazol.
[00180] Assim que as gotículas foram preparadas, os cartuchos, protegidos por um filme adesivo, foram diretamente incubados a 37 °C (a 30 °C para a C. albicans).
[00181] Após 4 e 6 horas de incubação, as gotículas foram pipetadas e introduzidas nas lâminas de contagem de células (Bio-Rad). Os microrganismos foram, em seguida, observados nas gotículas usando um microscópio (objetiva 100x ou 400x). As contagens aproximadas das gotículas transportando microrganismos como o seu crescimento dentro das gotículas foram relatadas.
[00182] A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada como a menor concentração de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visível de um microrganismo (ou seja, a ausência total de bactérias ou ausência total de crescimento fúngico observável em gotículas utilizando o microscópio). Resultados I. E. coli ATCC®25922 1- Piperacilina: CIM prevista (CLSI): 1 a 4 mg/L CIM observada: 2 mg/L 2- Ácido Nalidíxico: CIM Esperada (CLSI): 1 a 4 mg/L CIM observada: 4 mg/L 3 - Tetraciclina: CIM Esperada (CLSI): 0,5 a 2 mg/L CIM observada: 0,5 mg/L 4 - trimetoprima: CIM esperada (CLSI): 0,5 a 2 mg/L CIM observada: 1 mg/L (4 h) ou 2 mg/L (6 h) 5 - Colistina: CIM Esperada (CLSI): 0,5 a 2 mg/L CIM observada: 1 mg/L 6 - Nitrofurano: CIM esperada (CLSI): 4 a 16 mg/L 7 - Cloranfenicol: CIM prevista (CLSI): 2 a 8 mg/L CIM observada: 2 a 4 mg/L 8 - Gentamicina: CIM esperada (CLSI): 0,25 a 1 mg/L CIM observada: 2 mg/L II. S. aureus ATCC®29213TM 1 - Vancomicina: CIM prevista (CLSI): 0,25 a 1 mg/L CIM observada: 1 mg/L 2- Cefoxitina: CIM esperada (CLSI): 1 a 4 mg/L CIM observada: 2 mg/L III. E. faecalis ATCC®29212TM 1 - Vancomicina: CIM prevista (CLSI): 1 a 4 mg/L CIM observada: 1 a 2 mg/L IV. C. albicans ATCC®24433TM 1 - Anfotericina B: CIM prevista (CLSI): 0,25 a 1 mg/L CIM observada: 2 a 4 mg/L 2 - Fluconazol: CIM prevista (CLSI): 0,25 a 1 mg/L CIM observada: 8 mg/L V. S. aureus ATCC®43300TM: CIM esperada (JCM) : 16 a 32 mg/L
[00183] A indução da resistência foi realizada inoculando esta cepa em MRSASELECTII (Bio-Rad), seguido por uma incubação de um dia para o outro. As colônias foram coletadas para preparar a suspensão bacteriana em TCS. CIM observada: 2 a 4 mg/L usando cepa não induzida CIM observada: 16 a 32 mg/L com cepa induzida
[00184] Como ilustrado nos resultados anteriores, as CIMs contra uma variedade de antimicrobianos de teste podem ser determinadas com precisão e rapidez para uma variedade de microrganismos alvo usando composições de gotículas de água em óleo e os métodos descritos na presente invenção.
Exemplo II: Enumeração dos Microrganismos 1. Encapsulamento e Crescimento
[00185] Objetivo: Investigar se i) células bacterianas podem ser encapsuladas em gotículas usando a química de gotículas de água em óleo, ii) células bacterianas podem crescer dentro das gotículas e iii) células bacterianas pode metabolizar um substrato nas gotículas, a fim de gerar um sinal fluorescente. Para este efeito, uma cultura pura de células de Escherichia coli foi encapsulada em gotículas na presença de 4-metilumbeliferil-β-D- flucuronídeo e incubada a 37 °C durante vários tempos. As gotículas foram, em seguida, observadas com microscopia no visível ou fluorescente.
Materiais e Métodos:
[00186] • E. coli ATCC 25922 foi cultivada de um dia para o outro em caldo triptona soja.
[00187] • A cultura foi diluída para obter: O Cultura de gotículas: Uma suspensão bacteriana de 105 ufc/mL em água peptonada tamponada suplementada com 4-metilumbeliferil-β-D-flucuronideo (100 mg/L) e Pluronic F-98 (1%). 20 μL dessa suspensão foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200™ para EvaGreen (+ tensoativo) (disponível junto à Bio-Rad Laboratories) com o sistema gerador de gotículas Bio-Rad. As gotículas foram então transferidas para uma microplaca de 96 poços.
[00188] O Reação a granel: Uma suspensão bacteriana de 50 ufc/mL em 5 mL de água peptonada tamponada suplementada com 4-metilumbeliferil-β-D-flucuromdeo (100 mg/L) e Pluronic F-98 (1%).
[00189] • Ambas as microplacas e tubos foram incubados a 37 ± 1 °C durante 24 horas.
[00190] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação: O Observou-se uma amostra de gotículas com o dispositivo de imageamento de células fluorescentes ZOE (Bio-Rad) no canal visível e no canal de fluorescência azul.
[00191] O Uma amostra de gotículas foi testada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00192] O Ao mesmo tempo, o tubo de 5 mL foi observado sob luz ultravioleta usando uma lâmpada Wood a 365 nm.
[00193] Resultados: Como mostrado na figura 1, o crescimento bacteriano pode ser detectado a partir de 6 h após a encapsulação. O crescimento pode ser seguido pela observação direta de gotículas cheias de bactérias ou devido à emissão de uma fluorescência azul. Experimentos controle sem substrato MUG (não mostrado), bem como experimentos com outras bactérias (ver 4) demonstraram que esta fluorescência azul foi devido à autofluorescência da gotícula carregada com bactérias. O substrato provavelmente foi lixiviado para a fase oleosa. Por outro lado, a metabolização do substrato foi observada na reação a granel (não mostrada). Essa falta de metabolização foi confirmada com Listeria. No entanto, este experimento indicou que é possível encapsular e cultivar bactérias dentro de gotículas em um curto espaço de tempo. O fenômeno de autofluorescência em gotículas não foi descrito anteriormente.
2. Matrizes Alimentares
[00194] Objetivo: Investigar se a geração de gotículas é compatível com uma suspensão obtida de uma matriz alimentar diluída 10 vezes em água peptonada tamponada. Diversas matrizes foram usadas para um experimento de comprovação do conceito.
Materiais e Métodos:
[00195] • 25 g de uma matriz alimentar (carne moída com 5% e 15% de teor de gordura, presunto, leite cru, camenbert de leite cru e cenouras raladas) foram pesados em um saco digestor contendo um filtro de 280 μm.
[00196] • 225 mL de água peptonada tamponada suplementada com 4- metilumbeliferil-β-D-flucuromdeo (100 mg/L) e Pluronic F-98 (1%) foram adicionados ao digestor.
[00197] • A amostra de alimento foi suspensa no caldo usando um sistema digestor por 2 minutos.
[00198] • 20 μL da suspensão alimentar foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200™ para EvaGreen (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas Bio-Rad.
[00199] • As suspensões alimentares e as gotículas obtidas foram observadas com o visualizador de células fluorescentes ZOE no canal visível.
[00200] Resultados: A inspeção visual das gotículas (microscopia visível) mostrou que as gotículas foram realmente geradas em qualquer matriz alimentar. Todas as gotículas eram homogêneas em tamanho e suas estabilidades ao longo do tempo eram comparáveis. Este resultado indicou que o protocolo padrão para preparação de amostras a partir de matrizes alimentares é compatível com a geração de gotículas dentro dos limites das matrizes testadas até agora (figura 2).
3. Tempo até o resultado
[00201] Objetivo: Determinar se o crescimento de bactérias encapsuladas a partir de uma suspensão alimentar pode ser detectado mais cedo do que quando a mesma suspensão é estriada em uma placa de Petri. Para este propósito, uma matriz de presunto foi contaminada com E. coli, e uma amostra da matriz homogeneizada foi encapsulada ou semeada em uma placa de Petri antes da incubação a 37 °C durante vários tempos.
Materiais e Métodos:
[00202] • 25 g de presunto foram suspensos em 225 mL de água peptonada tamponada e Pluronic F-98 (1%) em um saco digestor com um filtro de 280 μm utilizando o sistema digestor durante 2 minutos.
[00203] • Uma cultura de um dia para o outro de E. coli ATCC 25922 em caldo triptona soja foi diluída de modo a fortificar a suspensão de presunto ao nível de 105 ufc/mL.
[00204] • 20 μL dessa suspensão foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200™ para EvaGreen (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas Bio-Rad. As gotículas foram transferidas para uma microplaca Eppendorf.
[00205] • Diluições em série da suspensão de presunto foram realizadas e espalhadas em ágar TBX.
[00206] • A microplaca Eppendorf e as placas TBX foram incubadas a 37 ± 1 °C por 24 horas.
[00207] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação: O Observou-se uma amostra de gotículas com o dispositivo de imageamento de células fluorescentes ZOE (Bio-Rad) no canal visível e no canal de fluorescência azul.
[00208] O Uma amostra de gotículas foi testada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00209] • Ao mesmo tempo, as placas de ágar TBX foram observadas.
[00210] Resultados: O crescimento das bactérias encapsuladas em gotículas foi prontamente detectável por microscopia visível ou por microscopia de fluorescência devido ao fenômeno de autofluorescência descrito acima. As bactérias foram detectadas desde as 6 horas após o encapsulamento, enquanto as colônias não foram detectadas antes de 24 horas na placa de Petri. A enumeração visual direta das gotículas positivas ou a leitura das gotículas positivas com o leitor QX resultou em uma estimativa próxima ao número esperado de bactérias e correspondendo à enumeração visual na placa de Petri. Juntos, esses resultados demonstraram que o encapsulamento das gotículas pode ser usado para enumerar as bactérias presentes em uma suspensão de uma amostra de alimento (figura 3).
4. Outras bactérias, leveduras e mofos
[00211] Objetivo: provar que o princípio da detecção precoce do crescimento bacteriano na gotícula pode ser estendido a outras bactérias e microrganismos.
Materiais e Métodos (Bactérias e Leveduras):
[00212] • Enterobacter cloacae ATCC 13047, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Citrobacter freundii ATCC 8090, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Candida albicans ATCC 10231 foram cultivadas de um dia para o outro em caldo triptona-soja.
[00213] • As culturas foram, em seguida, diluídas de modo a obter uma suspensão de células de 105 ufc/mL em água peptonada tamponada suplementada com Pluronic F-98 (1%). 20 μL dessas suspensões foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200 ™ para Eva Green (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas da Bio-Rad. As gotículas obtidas foram transferidas em um poço de uma microplaca Eppendorf.
[00214] • A microplaca foi incubada a 37 ± 1 °C por 24 horas.
[00215] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação: O Uma amostra de gotículas com o visualizador de células fluorescentes ZOE (Bio-Rad) no canal visível e no canal de fluorescência azul.
[00216] O Uma amostra de gotículas foi enumerada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00217] Resultados: Todas as bactérias (gram negativas e gram positivas) e leveduras puderam ser detectadas pelo exame visual de gotículas em vários momentos após o encapsulamento (consulte as figuras 4 e 5). A autofluorescência foi detectada, embora com várias intensidades. Enterobacteriaceae deram origem a uma forte autofluorescência dentro de 8 h, embora 24 horas foram necessárias para obter um sinal semelhante para Bacillus subtilis. O Staphylococcus aureus provocou um sinal fraco e a Listeria (consulte também 6) não deu origem a um sinal de fluorescência. Todos os microrganismos poderiam ser enumerados utilizando o leitor QX200, embora as intensidades das gotículas positivas tenham variado em função da intensidade de autofluorescência (consulte as figuras 6 e 7).
Materiais e Métodos (Mofo):
[00218] • O Aspergillus niger T646 (número de coleta da cepa interna da Bio-Rad) foi cultivado durante 5 dias em ágar sabouraud.
[00219] • Os esporos foram então coletados com uma alça e foram suspensos em água peptonada tamponada.
[00220] • A suspensão de esporos foi diluída de modo a obter uma suspensão de esporos de 105 ufc/mL em água peptonada tamponada suplementada com Pluronic F-98 (1%). 20 μL dessas suspensões foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200 ™ para EvaGreen (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas da Bio-Rad. As gotículas obtidas foram transferidas em um poço de uma microplaca Eppendorf.
[00221] • A microplaca foi incubada a 37 ± 1 °C por 24 horas.
[00222] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação:
[00223] O uma amostra de gotículas foi observada com o visualizador de células fluorescentes ZOE da Bio-Rad no canal visível e no canal de fluorescência azul.
[00224] O Uma amostra de gotículas foi testada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00225] Resultados: O crescimento de mofo pode ser observado nas gotículas, embora, ao contrário de bactérias e leveduras, o crescimento do mofo tenha levado a uma quantidade observável de coalescência, provavelmente devido à protrusão das hifas através da membrana das gotículas (figura 5). Químicas de gotículas alternativas podem ser usadas para evitar esse efeito de fusão. O crescimento de mofo deu origem a uma autofluorescência fraca, porém detectável.
5. Espécie Listeria
[00226] Objetivo: A listeria é uma bactéria de crescimento lento. Esse experimento foi realizado para determinar se o crescimento de Listeria na gota pode ser detectado dentro de 24 h. Além disso, também estudamos se um substrato específico pode ser usado para detecção. Três espécies de Listeria foram misturadas para representar uma população de Listeria spp. e foram cultivadas em gotículas na presença de 4-metilumbeliferil-β-D-glicosideo.
Materiais e Métodos:
[00227] • Listeria monocytogenes ATCC 13932, Listeria innocua ATCC 33090 e Listeria grayi ATCC 19120 foram cultivadas de um dia para o outro em caldo triptona soja.
[00228] • As culturas foram então diluídas para obter: O uma suspensão bacteriana de 105 ufc/mL em água peptonada tamponada suplementada com 4- metilumbeliferil-β-D-glicosideo (100 mg/L) e Pluronic F- 98 (1%). 20 μL dessa suspensão foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200™ para EvaGreen (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas QX200™ da Bio-Rad. As gotículas obtidas foram transferidas para um poço de uma microplaca.
[00229] O uma suspensão bacteriana de 50 ufc/mL em 5 mL de água peptonada tamponada suplementada com 4- metilumbeliferil-e-D-glicosídeo (100 mg/L) e Pluronic F- 98 (1%).
[00230] • A microplaca e os tubos foram incubados a 37 ± 1 °C por 24 horas.
[00231] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação: O Uma amostra de gotículas foi observada com o visualizador de células fluorescentes ZOE no canal visível e no canal de fluorescência azul.
[00232] O Uma amostra de gotículas foi testada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00233] • Ao mesmo tempo, o tubo de 5 mL foi observado sob luz ultravioleta usando uma lâmpada Wood a 365 nm.
[00234] Resultados: Como mostrado na figura 4, no painel inferior direito, o crescimento bacteriano pode ser detectado dentro de 24 h por observação direta de gotículas cheias de bactérias. Nenhuma fluorescência foi detectada, indicando assim que i) nenhuma autofluorescência foi gerada pelo crescimento de Listeria e ii) o substrato MUG não foi metabolizado ou não foi metabolizado o suficiente para gerar um sinal detectável, como já observado com E. coli. O crescimento pode, da mesma forma, ser detectado em um tempo menor sob condições otimizadas. Substratos mais sensíveis podem ser facilmente triados. Além disso, este experimento foi realizado com um meio que não é otimizada para o crescimento de Listeria. Melhores resultados são esperados com um caldo dedicado.
6. Uso de um substrato ALDOL® para Detecção de Bactérias Coliformes (E. coli)
[00235] Objetivo: Substrato de fluorescência verde específico para coliformes que expressam β-galactosidase, como E. coli, foi realizado para avaliar se substratos alternativos poderiam ter um melhor desempenho que a MUG.
Materiais e Métodos (Bactérias e Leveduras):
[00236] • E. coli ATCC 25922 foi cultivada de um dia para o outro em caldo triptona soja.
[00237] • A cultura foi diluída de modo a obter uma suspensão bacteriana de 105 ufc/mL em água peptonada tamponada suplementada com Aldol®458-β-D-galactosideo (100 mg/L) e Pluronic F-98 (1%). 20 μL dessa suspensão foram misturados com 50 μL de óleo de geração de gotículas QX200™ para EvaGreen (+ tensoativo) com o sistema gerador de gotículas QX200™ da Bio-Rad. As gotículas obtidas foram transferidas para um poço de uma microplaca.
[00238] • A microplaca foi incubada a 37 ± 1 °C por 24 horas.
[00239] • Após 0, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação: O uma amostra de gotículas foi observada com o visualizador de células fluorescentes ZOE da Bio-Rad no canal visível e no canal de fluorescência verde.
[00240] O uma amostra foi testada com o leitor de gotículas QX200 da Bio-Rad.
[00241] Resultados: Após 6 h, um sinal fluorescente verde claro foi observado (consulte a figura 8). Esse sinal foi diferente da fluorescência azul obtida em condições semelhantes na ausência do substrato. A fluorescência podia ser lida no canal FAM do leitor QX (não mostrado) e deu origem a uma fluorescência mais forte do que a autofluorescência azul, demonstrando assim que um substrato específico pode ser utilizado para identificar bactérias nas gotículas.
7. Detecção de Microrganismos Usando um Anticorpo como Marcador
[00242] Um anticorpo anticândida Ac EBCA1 (Bio-Rad Laboratories) que reconhece C. albicans foi marcado utilizando o Kit Lynx LNK024RPE (Abd Serotec). Após o cultivo de um dia para o outro em ágar sabouraud (Bio-Rad Laboratories), as gotículas foram primeiro feitas adicionando uma mistura (v/v) de C. albicans ATCC®24433TM (1McFarland) até diluições do conjugado de 1/25 a 1/200. As amostras foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories). As figuras 9A e 9B mostram clara fluorescência em (T0) utilizando um inóculo equivalente a 1McFarland e conjugado a 1/200.
[00243] Em um experimento adicional, as gotículas foram feitas adicionando uma mistura (v/v) de um inóculo reduzido de C. albicans ATCC®24433TM (0,1 McFarland) a diluições do conjugado de 1/25 a 1/200, e depois foram incubadas a 30 °C. As amostras foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories) após 5h ou 24h. As figuras 10A a 10C são imagens do inóculo equivalente a 0,1 McFarland e conjugado a 1/200 após 5 horas. As figuras 11A a 11C são imagens do inóculo equivalente a 0,1 McFarland e conjugado a 1/200 após 24 horas.
[00244] C. parapsilosis (ATCC®22019TM), ao qual o anticorpo não se liga especificamente, foi estudada da mesma forma que a C. albicans acima. As figuras 12A e 12B são imagens de inóculo equivalentes a 1McFarland e conjugadas a 1/200 em T0. Nenhum microrganismo é visível, como seria de esperar, pois o anticorpo não se liga especificamente ao C. parapsilosis.
[00245] Em outro experimento, um anticorpo anti-PBP2a (clone M0071933 da Biosource) que reconhece PBP2a indicativo da resistência contra a meticilina em Staphylococcus aureus (SA) foi marcado usando o kit Lynx LNK174PETR (Abd Serotec). Após as culturas ficarem de um dia para o outro em placas de ágar sangue (Bio-Rad Laboratories), as gotículas foram primeiro feitas pela adição de colônias de cada uma das 4 cepas testadas de MSSA e MRSA (1/50 de 0,5 McFarland, equivalente a aproximadamente 1 a 10 células bacterianas em 20 gotas) ao conjugado a 1/200 suplementado com albumina de soro bovino (BSA) +/- cefoxitina (FOX a 0 ou 2 mg/L) em caldo. Após incubação a 37 °C durante 3 horas, as amostras foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories). As tabelas abaixo mostram o crescimento (visível) e a marcação (com fluorescência) obtidos para as cepas testadas de MSSA e MRSA.
[00246] BSA foi adicionado ao caldo para aumentar o crescimento e auxiliar a identificação das cepas SA. A adição de BSA promove a produção de uma microcolônia de células bacterianas (ou seja, as células bacterianas formam um cluster em vez de permanecerem isoladas) o que, por sua vez, emite um sinal de detecção mais forte, auxiliando na detecção dos microrganismos.
[00247] O anticorpo detectou tanto MRSA como MSSA quando supunha-se ser específico para MRSA, FOX foi então adicionado para inibir especificamente o crescimento de MSSA e para obter um sinal fluorescente limitado ao MRSA. O ruído de fundo (BN) foi observado devido à fluorescência não relacionada às células bacterianas. A concentração do anticorpo pode ser ajustada para reduzir a fluorescência de fundo.
[00248] Os resultados mostram que MRSA poderia ser detectado em gotículas mesmo em baixa concentração dentro de 3 horas, usando uma combinação de anticorpo marcado, BSA e cefamicina.
8. Detecção de Microrganismos Usando Fibrinogênio como Marcador
[00249] Fibrinogênio (Sigma Aldrich) que se liga ao Staphylococcus aureus (proteínas de superfície expressas em células de S. aureus que promovem a ligação às proteínas hospedeiras, como fibronectina) foi marcado usando o Kit Lynx LNK174PETR (Abd Serotec). Após as culturas ficarem de um dia para o outro em placas de ágar sangue (Bio-Rad Laboratories), as gotículas foram primeiro feitas pela adição de uma suspensão de colônias de cada uma das 4 cepas testadas de MSSA e MRSA (1/50 de 0,5 McFarland, equivalente a aproximadamente 1 a 10 células bacterianas em 20 gotículas) ao conjugado a 1/200 suplementado com albumina de soro bovino (BSA) +/- cefoxitina (FOX a 0 ou 2 mg/L) em caldo. Após incubação a 37 °C durante 3 horas, as amostras foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories). As tabelas abaixo mostram o crescimento (visível) e a marcação (com fluorescência) obtidos para as cepas testadas de MSSA e MRSA.
[00250] Os resultados mostram que MRSA poderia ser detectado em gotículas mesmo em baixa concentração dentro de 3 horas, usando uma combinação de fibrinogênio marcado, BSA e cefamicina.
9. Detecção de Microrganismos Usando um Agente Intercalante como Marcador
[00251] Uma solução de 1 mg/mL de iodeto de propídio (“PI” da Sigma Aldrich) foi preparada e 400 μL foram adicionados a 9 mL de caldo TCS (Bio-Rad Laboratories) previamente fortificado com S. aureus ATCC®29213TM (“SA”) a 0,005 McFarland. 10 μL desta mistura com 10 μL de várias concentrações de cefoxitina (“FOX”) foram usados para preparar gotículas. As amostras foram lidas usando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories) ao longo do tempo até 8h. Os resultados demonstram que o PI pode ser usado para identificar a presença ou ausência de um microrganismo particular em uma amostra sem que um agente de lise seja adicionado à reação.
[00252] As figuras 13A e 13B são uma amostra de SA + PI sem FOX após 6 h de incubação. As figuras 14A a 14C são SA + PI + 0,25 mg/L de FOX após 6 horas de incubação. As figuras 15A a 15C são SA + PI + 0,5 mg/L de FOX após 6 horas de incubação. As figuras 16A a 16C são SA + PI + 4 mg/L de FOX após 6 horas de incubação. O PI é excluído de células viáveis e penetra nas membranas celulares de células mortas ou agonizantes. Surpreendentemente, o PI marcou todas as células viáveis neste experimento. Os agentes de intercalação são considerados tóxicos para o crescimento celular porque reagem com o DNA, bloqueando a replicação das células. No entanto, acompanhando a turbidez de uma cultura bacteriana ao longo do tempo na presença e ausência de PI, os inventores observaram que o PI permitiu o crescimento de bactérias ou leveduras com apenas impacto limitado.
10. Detecção de microrganismos usando um agente intercalante como marcador e usando uma etapa adicional de aquecimento
[00253] Objetivo: Determinar se o uso de um agente intercalante junto com uma etapa de aquecimento adicional aumenta o sinal fluorescente detectado a partir de gotículas que possuem células bacterianas. Materiais e Métodos: • Caldo de água peptonada tamponada sem e com iodeto de propídio 15 μM (PI) foi contaminado com Escherichia coli ATCC 25922.
[00254] • As gotículas foram, em seguida, produzidas com o gerador de gotículas QX200™ da Bio-Rad e o óleo EvaGreen, de tal forma que uma em cada dez gotículas continha uma única célula bacteriana. As gotículas foram transferidas para um micropoço e foram incubadas por 24 horas a 37 °C.
[00255] • Uma porção das gotículas contendo iodeto de propídio também foi aquecida a 90 °C por 5 minutos.
[00256] • As gotículas foram, então, visualizadas com um visualizador de células fluorescentes ZOE™ utilizando um canal de campo claro (figuras 17A a 17C) ou com um filtro fluorescente vermelho (figuras 17D A 17F).
[00257] Resultados: Conforme ilustrado nas figuras 17A a 17C, o crescimento bacteriano (G) foi observado em água peptonada tamponada sem PI, com PI, e com PI mais uma etapa de aquecimento adicional. No entanto, nenhum sinal de fluorescência foi observado a partir de qualquer uma das gotículas quando não havia PI (figura 17D). Um sinal fluorescente fraco foi observado a partir de gotículas com bactérias e PI (figura 17E), indicando que o PI pode ser utilizado para diferenciar entre gotículas com crescimento bacteriano de gotículas vazias. Conforme ilustrado na figura 17F, aquecer gotículas com bactérias e PI a 90 °C durante 5 minutos aumenta o sinal de fluorescência.
11.Detecção de microrganismos usando Vermelho pHrodo® como indicador de pH
[00258] Objetivo: Determinar se microrganismos podem ser detectados com Vermelho pHrodo®.
Materiais e Métodos (Bactérias e Leveduras):
[00259] • Caldo de triptona-glicose sem e com vermelho pHrodo® 5 μM foram misturados com E. coli ATCC®25922.
[00260] • As gotículas foram, em seguida, produzidas com o gerador de gotículas QX200™ da Bio-Rad e o óleo EvaGreen, de tal forma que uma em cada dez gotículas continha uma única célula bacteriana. As gotículas foram transferidas para um micropoço e foram incubadas por 24 horas a 37 °C.
[00261] • As gotículas foram, então, visualizadas com um visualizador de células fluorescentes ZOE™ utilizando um canal de campo claro (figuras 18A e 18C) ou com um filtro fluorescente vermelho (figuras 18B e 18D).
[00262] Resultados: Na ausência de vermelho pHrodo®, nenhuma fluorescência foi observada em gotículas com crescimento bacteriano G (figura 18B). Na presença de vermelho pHrodo®, gotículas com crescimento bacteriano produzem fluorescência vermelha devido a uma alteração nas propriedades indicadoras de pH na presença de ácido após a fermentação de glicose (figura 18D), demonstrando assim que um indicador de pH pode ser utilizado para identificar bactérias em gotículas.
12. Uso de um substrato ALDOL518® para a Detecção de Bactérias Coliformes (Enterobacter aerogenes)
[00263] Objetivo: Um substrato fluorescente vermelho específico para coliformes que expressam β-glicosidase, como Enterobacter aerogenes ATCC 13048, foi usado para avaliar se substratos alternativos poderiam ter um desempenho melhor do que o MUG.
Materiais e Métodos:
[00264] • O caldo de água peptonada tamponada sem e com ALDOL518®-β-glicosideo a 250 mg/L foi fortificado com Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
[00265] • As gotículas foram produzidas com o Gerador de Gotículas QX200™ da Bio-Rad e o óleo EvaGreen para obter 10.000 bactérias por gotícula. Essas gotículas foram, em seguida, diluídas com gotículas contendo o mesmo caldo, mas sem bactérias. As gotículas obtidas foram transferidas para um poço de uma microplaca.
[00266] • A microplaca foi incubada a 37 ± 1 °C por 24 horas. As gotículas foram visualizadas com um visualizador de células fluorescentes ZOE™ utilizando um canal de campo claro (figuras 19A e 19B) ou com um filtro fluorescente vermelho (figuras 19C e 19D).
[00267] Resultados: Na ausência de ALDOL518®-β-glicosideo, não foi observada fluorescência em gotículas com crescimento bacteriano (figura 19C). Na presença de ALDOL518®-e-glicosídeo, a atividade da β-glicosidase de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 hidrolisa o substrato e liberta um composto ALDOL fluorescente, de tal modo que gotículas com crescimento bacteriano produzem fluorescência vermelha (figura 19D), demonstrando assim que um substrato específico pode ser utilizado para identificar bactérias nas gotículas.
13. Inibição do crescimento do mofo fora da fase aquosa da gotícula usando Dicloran
[00268] Objetivo: Determinar se incluir um agente antifúngico (por exemplo, diclorano) na fase oleosa da gotícula inibe o crescimento do mofo fora da fase aquosa da gotícula. Materiais:
Métodos: Preparação de suspensões estoque de esporos
[00269] Cepas de mofo comuns de alimentos foram cultivadas até o estado de esporulação (geralmente por 5 a 7 dias) no meio de cultura apropriado a 28 °C. Os esporos foram, em seguida, removidos em solução estéril Tween 80 a 0,05%. As suspensões coletadas foram filtradas em várias camadas de gaze comprimida para eliminar a maioria das hifas e fragmentos de micélio. Quando necessário, as suspensões foram mantidas sob agitação no escuro e à temperatura ambiente antes da etapa de filtração para assegurar a liberação ideal de esporos das estruturas fúngicas. A concentração de esporos foi determinada em uma câmara de hemocitômetro e/ou por plaqueamento em placas de Petri em ágar.
[00270] As suspensões foram, então, centrifugadas por 5 minutos a 10.000 rpm e os sobrenadantes foram descartados. Os péletes foram ressuspensos com o volume adequado de caldo YGC contendo 30% de glicerol e as alíquotas foram armazenadas a -20 °C durante até 6 meses.
Preparação de amostras para geração de gotículas
[00271] Alíquotas foram descongeladas à temperatura ambiente e lavadas uma vez em caldo YGC para remover o glicerol. Os esporos foram, então, diluídos até a concentração de 105 esporos/mL em caldo YGC contendo 5% de tensoativo Pluronic F68.
[00272] Para o ensaio de detecção, o substrato fluorogênico CFDA (diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína) foi adicionado ao caldo YGC. O substrato foi preparado dissolvendo 10 mg em 1 mL de DMSO (dimetilsulfóxido) e adicionou-se 28,75 desta solução a 10 mL de caldo YGC.
[00273] O CFDA foi usado na concentração final de 25 mg/L levando em consideração o fator de diluição de 15% devido aos volumes de tensoativo e de inóculo.
Adição de Dicloran ao óleo Eva Green
[00274] A solução de carga de diclorano foi preparada a 40 mg/mL em acetona. A solução de carga foi, a seguir, diluída para produzir soluções de trabalho de acordo com a tabela abaixo.
[00275] Um volume de 10 μL da solução de trabalho apropriada foi então adicionado a 2 mL de óleo para Eva Green para atingir as concentrações finais tencionadas (0,5% v/v) (consulte a tabela abaixo).
Geração e análise de gotículas
[00276] Para gerar gotículas usando o gerador de gotículas QX200TM, os poços de “amostra” e “óleo” de um cartucho DG8 foram respectivamente preenchidos com 20 μL da suspensão de esporos preparada (com ou sem CFDA) e 70 μL do óleo para Eva Green (com ou sem Diclorano). Após o processo de geração, as emulsões de gotículas (30 a 35 μL/poço) foram transferidas para uma placa Eppendorf de 96 poços e colocadas a 28 °C durante 24 a 48 horas. Para análise, as emulsões de gotículas (20 μL/amostra) foram observadas com o visualizador de células fluorescentes ZOE™.
[00277] Resultados: Na ausência do composto antifúngico (condição de controle), as hifas de mofo foram capazes de atravessar as membranas das gotículas e se propagar através da amostra, resultando na coalescência das gotículas (figura 20A). O crescimento adicional levou à esporulação da cepa e os esporos puderam ser observados aleatoriamente em gotículas maiores (figura 20B). Em alguns casos, as cepas produziram micélios que foram responsáveis pela obstrução na entrada da amostra da lâmina de observação.
[00278] Quando o diclorano foi adicionado ao óleo para EvaGreen em concentrações que variaram de 40 a 100 mg/L, o espalhamento das hifas foi inibido e o crescimento do mofo ficou confinado dentro da gotícula. As figuras 21A a 29B mostram exemplos da inibição da propagação do molde pelo diclorano para várias cepas de mofo alimentares comuns (por exemplo, Fusarium graminearum DSM 1096, Mucor racemosus CECT 20821, Aspergillus restrictus CECT 20807, Penicillium hirsutum ATCC 16025 e Eurotium rubrum CECT 20807). As figuras 22 e 28 ilustram como o confinamento das hifas na gotícula melhorou a detecção de gotículas positivas para o mofo quando o substrato fluorogênico CFDA foi adicionado ao caldo YGC. Note-se que, como a solução de diclorano foi preparada em acetona, a ausência de inibição da cepa apenas pela acetona (0,5% v/v) foi verificada para cada cepa de mofo testada.
14. Inibição do crescimento de mofo fora da fase aquosa da gotícula com rosa bengala ou Imazalil
[00279] Objetivo: Determinar se incluir um agente antifúngico (por exemplo, rosa bengala ou imazalil) na fase oleosa das gotículas inibe o crescimento do mofo fora da fase aquosa da gotícula. Materiais: Métodos:
[00280] • A rosa bengala foi dissolvida em etanol e adicionada ao Óleo para Eva Green na concentração de 150 mg/L. A concentração final de etanol na fase oleosa foi 0,5% (v/v).
[00281] • O imazalil foi preparado em acetona e adicionado ao óleo para Eva Green na concentração de 0,5 mg/L. A concentração final de acetona na fase oleosa foi de 0,1% (v/v).
[00282] • As suspensões de esporos foram encapsuladas na concentração de 105 esporos/mL no caldo YGC para atingir a razão de 1 gotícula positiva (contendo 1 célula) de 10. As emulsões de gotículas foram preparadas com óleo para Eva Green suplementado com o fungicida apropriado.
[00283] • As gotículas foram em seguida transferidas a 28 °C durante 24 a 48 horas.
[00284] • Após a incubação, foram observadas amostras de gotículas com o visualizador de células fluorescentes ZOE™.
[00285] • Note-se que a ausência de um efeito de etanol sobre o crescimento das cepas usadas para testar rosa bengala foi verificada como foi a ausência de um efeito de acetona no crescimento das cepas usadas para testar imazalil.
[00286] Resultados: Na ausência do composto antifúngico (condição de controle), as hifas de mofo foram capazes de atravessar as membranas das gotículas e se propagar através da amostra, resultando na coalescência das gotículas (figuras 30A e 31A). Quando 150 mg/L de rosa bengala (figura 30B) ou 0,5 mg/L de imazalil (figura 31B) foram adicionados ao óleo para EvaGreen, o espalhamento das hifas foi inibido e o crescimento do mofo ficou confinado dentro da gotícula.
15. Detecção de microrganismos usando uma lectina como marcador
[00287] Uma solução de 5 mg/mL de Concanavalina A (“ConA” da Thermofisher) marcada com fluoresceína em bicarbonato de sódio foi diluída em caldo TCS (Bio-Rad Laboratories) ou RPMI previamente fortificado com cepas (a 1 McFarland para leveduras e 0,5 McFarland para bactérias) pertencentes às seguintes espécies: Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, Cryptococcus neoformans, Bacillus subtilis, E. coli e S. aureus. Utilizaram-se 20 μL desta mistura para preparar gotículas que foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories) sem qualquer tempo de incubação.
[00288] Os resultados (Figuras 32, 33 e 34 para C. glabrata, C. tropicalis, e E. Coli, respectivamente) e a tabela abaixo mostraram que Candida (ou seja, C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata) pode ser direta e especificamente detectada, enquanto que bactérias como E. coli não fluoresceram e não podem ser detectadas.
[00289] Em outro ensaio usando C. krusei, até 10% de sangue foi adicionado antes da etapa de produção de gotículas. As amostras foram lidas utilizando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ (Bio-Rad Laboratories) a T0. A figura 35 é uma imagem mesclada de uma imagem visível e uma imagem de fluorescência verde da amostra. Na figura 35, as hemácias eram cinzentos e as células de Candida krusei eram fluorescentes verdes. Os resultados demonstram que o ConA pode ser usado para detectar especificamente a presença de espécies de Candida em uma amostra, mesmo que contenha 10% de sangue.
16. Gelificação das gotículas
[00290] Objetivo: Determinar se a inclusão de um agente gelificante evita uma redução no tamanho da gotícula, pois as cepas de leveduras são cultivadas nas gotículas. Materiais: Métodos: • Caldo YGC estéril suplementado com carbonato de cálcio (0, 0,5 ou 1 g/L) e alginato de sódio (0, 2,5 ou 3,5 g/L) foi usado como meio de cultura.
[00291] • Células de Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 e Debaryomyces hansenii CLIB 197 foram encapsuladas para observar a gelificação efetiva das gotículas.
[00292] • As gotículas foram geradas com óleo para Eva Green contendo 0,1% (v/v) de ácido acético, a menos que seja indicado de outra forma.
[00293] • As emulsões de gotículas foram incubadas durante 22 a 48 horas a 28 °C e observadas com um visualizador de células ZOE™.
[00294] Resultados: As figuras 36A a 42D ilustram os resultados da gelificação das gotículas. As figuras 36A e 36B ilustram o crescimento de Candida albicans ATCC 10231 em uma gotícula não gelificada (figura 36A) e em uma gotícula gelificada (figura 36B) após 22 horas de incubação. A gelificação foi obtida suplementando o caldo de cultura YGC com 3,5 g/L de alginato de sódio e 1 g/L de carbonato de cálcio. As gotículas gelificadas não mostraram modificação da forma. A gelificação foi visível apenas com o crescimento celular. As células se moveram e espalharam nas gotículas não gelificadas. As células pareciam estar incorporadas e cresceram como microcolônias nas gotículas gelatinosas.
[00295] Para garantir que a presença de alginato de sódio ou carbonato de cálcio sozinho não causa gelificação, alginato de sódio e carbonato de cálcio foram testados separadamente em um ensaio de controle com Candida albicans ATCC 10231 (Figuras 37A a 37D) ou Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 (Figuras 38A - 38D). As figuras 37A a 37D e as figuras 38A a 38D mostram o crescimento dos microrganismos em gotículas após 24 horas de incubação. O crescimento dos microrganismos foi em (A) caldo YGC; (B) YGC suplementado com 2,5 g/L de alginato; (C) YGC suplementado com 0,5 g/L de carbonato de cálcio; ou (D) YGC suplementado com 2,5 g/L de alginato e 0,5 g/L de carbonato de cálcio. A gelificação das gotículas ocorreu apenas quando o alginato de sódio e o carbonato de cálcio estavam presentes simultaneamente, como mostrado pela formação de microcolônias nas gotículas positivas (figuras 37D e 38D). Nos outros ensaios (figuras 37A a 37C e 38A a 38C), as células eram móveis e estavam espalhadas. As setas mostram exemplos de gotículas positivas.
[00296] As figuras 39A a 39C e 40A a 40C mostram os resultados de experimentos utilizando cepas de leveduras acidificantes e não acidificantes, e sem ácido acético adicionado na fase oleosa. As figuras 39A e 40A são controles negativos. Saccharomyces cerevisiae DSM 1333 (figuras 39B e 40B) ou Debaryomyces hansenii CLIB 197 (figuras 39C e 40C) foram cultivadas em caldo YGC suplementado com 1 g/L de carbonato de cálcio após 24 horas de incubação. O carbonato de cálcio foi parcialmente dissociado na presença apenas da cepa acidificante de Saccharomyces. Com a cepa não acidificante de Debaryomyces, as partículas de carbonato de cálcio foram observadas como no controle negativo. As setas mostram exemplos de gotículas positivas.
[00297] As figuras 41A a 41D mostram os resultados de um experimento de gelificação na ausência (figuras 41A e 41C) e na presença (figuras 41B e 41D) de ácido acético após gotículas contendo Saccharomyces cerecisiae DSM 1333 terem sido incubadas durante 24 horas. Nas Figuras 41A e 41B, a cepa de Saccharomyces foi cultivada apenas em caldo YGC. Nas Figuras 41C e 41B, a cepa de Saccharomyces foi cultivada em caldo YGC suplementado com 2,5 g/L de alginato e 0,5 g/L de carbonato de cálcio. A gelificação ocorreu na presença ou ausência de ácido acético.
[00298] As figuras 42A a 42D mostram os resultados de um experimento de gelificação na ausência (figuras 42A e 42C) e na presença (figuras 42B e 42D) de ácido acético após as gotículas contendo Candida albicans ATCC 10231 serem incubadas 24 horas. Nas Figuras 42A e 42B, a cepa de Candida foi cultivada apenas em caldo YGC. Nas Figuras 42C e 42B, a cepa de Candida foi cultivada em caldo YGC suplementado com 2,5 g/L de alginato e 0,5 g/L de carbonato de cálcio. A gelificação ocorreu na presença ou ausência de ácido acético.
[00299] Os resultados demonstram que um agente gelificante pode evitar uma redução no tamanho da gotícula quando a levedura é cultivada nas gotículas. Os resultados também mostram que o ácido acético não é requerido na fase oleosa quando as cepas de levedura acidificantes são cultivadas em caldo YGC suplementado com alginato e carbonato de cálcio. 17. Uso de um substrato de esterase ou um substrato de fosfatase para detecção de várias cepas de levedura e mofo Materiais: Métodos:
[00300] • Os substratos CFDA e de ALDOL®515 fosfato foram dissolvidos em DMSO e adicionados ao caldo YGC na concentração final de 25 mg/L. Alguns experimentos também foram realizados com 50 mg/L de ALDOL®515 fosfato.
[00301] • A concentração de DMSO foi de 0,14% (v/v).
[00302] • As suspensões de células foram encapsuladas na concentração de 105 células ou esporos/mL no caldo YGC para atingir a razão de 1 gotícula positiva (contendo 1 célula) de 10. As emulsões de gotículas foram preparadas com óleo para Eva Green suplementado com diclorano para ensaios de mofos (para confinar o crescimento de hifas nas gotículas).
[00303] • As gotículas foram em seguida transferidas a 28 °C durante 24 horas (figuras 43A e 45B; 47A a 47D; 49A a 52D) ou 48 horas (figuras 46A A 46D; 48A A 48D).
[00304] • Após a incubação, observaram-se amostras de gotículas usando o visualizador de células fluorescentes ZOE™ para a detecção das atividades de esterase (hidrólise de CFDA) ou fosfatase (hidrólise de ALDOL®515 fosfato).
[00305] Resultados: As figuras 43A a 48D mostram imagens de várias cepas de levedura e mofo crescidas na ausência ou presença de 25 mg/L de CFDA. Consulte a tabela acima de cepas de leveduras e de mofo para a figura que possui o dado microrganismo. Na ausência de CFDA, não foi observada fluorescência em gotículas com crescimento de levedura ou mofos. Na presença de CFDA, a atividade esterase do microrganismo hidrolisa o substrato e libera um composto fluorescente de tal modo que as gotículas com crescimento de levedura ou mofos produzem fluorescência verde, demonstrando assim que um substrato específico pode ser utilizado para identificar o microrganismo nas gotículas.
[00306] As figuras 49A a 52D mostram imagens de várias cepas de levedura e mofo crescidas na ausência ou na presença de 50 mg/L de ALDOL® 515 fosfato (figuras 49A a 50B) ou 25 mg/L de ALDOL® 515 fosfato (figuras 52A a 52D). Consulte a tabela acima de cepas de leveduras e de mofo para a figura que possui o dado microrganismo. Na ausência de ALDOL® 515 fosfato, não foi observada fluorescência em gotículas com crescimento de levedura ou mofos. Na presença de ALDOL® 515 fosfato, a atividade fosfatase do microrganismo hidrolisa o substrato e libera um composto fluorescente de tal modo que as gotículas com crescimento de levedura ou mofos produzem fluorescência vermelha, demonstrando assim que um substrato específico pode ser utilizado para identificar o microrganismo nas gotículas.
18. Uso de um substrato de glucuronidase para detecção de E. coli Materiais e Métodos:
[00307] • Um caldo de peptona-alginato-sal suplementado com resorfurina-beta-D-éster metílico do ácido glucurônico™ a 100 mg/L foi fortificado com Escherichia coli ATCC 25922.
[00308] • As gotículas foram então produzidas com o gerador de gotículas Bio-Rad e o óleo EvaGreen para obter 1/10 de gotículas contendo 1 única célula bacteriana.
[00309] • As gotículas foram incubadas em uma monocamada durante 6 horas a 37 °C e depois visualizadas com o sistema de captura de imagem de células fluorescentes ZOE™ utilizando um canal de campo claro (figura 53A) ou utilizando um filtro de fluorescência vermelho (figura 53B).
[00310] Resultados: As gotículas que mostraram crescimento bacteriano (G) produziram uma fluorescência vermelha brilhante devido à clivagem do substrato de resorfurina-beta-D-éster metílico do ácido glucurônico™ pela glucuronidase da cepa de E. coli. Isso demonstra que um substrato específico pode ser usado para identificar o microrganismo nas gotículas.
[00311] Embora a invenção supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustrações e exemplos para fins de clareza de entendimento, um elemento versado na técnica compreenderá que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo. Além disso, cada referência aqui fornecida, tais como patentes, pedidos de patentes, publicações de patentes, periódicos, livros, artigos e conteúdo da web ao longo desta divulgação, é incorporada por referência em sua totalidade e para todos os propósitos na mesma medida como se cada referência fosse incorporada individualmente por referência. Onde houver um conflito entre este pedido e uma referência aqui fornecida, este pedido prevalecerá.
[00312] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas do singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referências no plural, a menos que o conteúdo claramente estabeleça de outra forma. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “cerca de” refere-se ao número recitado e qualquer valor dentro de 10% do número citado. Assim, “cerca de 5” refere-se a qualquer valor entre 4,5 e 5,5, incluindo 4,5 e 5,5.

Claims (27)

1. Método para determinar a presença ou ausência de um micro-organismo em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende: i) encapsular uma amostra compreendendo dito microorganismo em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo em que as gotículas de emulsão de água em óleo encapsulam adicionalmente um meio de crescimento microbiológico; ii) incubar a pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo a uma temperatura permissiva de crescimento microbiológico, e por um período de tempo suficiente para permitir que os micro-organismos alvos passem por 5 a 45 tempos de duplicação; iii) identificar gotículas de emulsão de água em óleo compreendendo micro-organismos alvo; e iv) em resposta à identificação de micro-organismos em pelo menos uma gotícula de emulsão de água em óleo, determinar que o microorganismo está presente na amostra, em que a etapa de identificação da etapa iii) compreende detectar autofluorescência na pluralidade de gotículas de água em óleo, em que a autofluorescência é indicativa da presença de gotículas compreendendo micro-organismos, em que os micro-organismos alvo são selecionados a partir de leveduras e mofos e em que a etapa de incubação é realizada por um período de tempo que corresponde a: pelo menos 6 horas e não mais do que 12 horas quando os micro-organismos alvo são leveduras; e pelo menos 8 horas e não mais do que 36 horas quando os micro-organismos alvo são mofos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a gotícula de água em óleo compreende adicionalmente proteína rotulada; a gotícula de água em óleo não compreende um agente lisante; e identificar gotículas de água em óleo compreendendo microorganismos alvo compreende detectar a proteína rotulada, preferencialmente a gotícula de água em óleo compreendendo ainda albumina sérica bovina.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra ambiental, uma amostra de água de um corpo recreacional de água, uma amostra de uma superfície, uma amostra clínica, ou uma matriz alimentar.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento microbiológico compreende (a) proteína parcialmente digerida; ou (b) água peptonada tamponada (BAM Media m192); ou (c) um tensoativo.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: (i) o tensoativo é um tensoativo não iônico, preferencialmente o tensoativo não iônico é um poloxâmero, mais preferencialmente o poloxâmero tem um peso molecular de 1.800 g/mol, mais preferencialmente ainda o poloxâmero compreende 80% de polioxietileno; ou (ii) o meio de crescimento microbiológico compreende tensoativo a uma concentração de pelo menos 0,01% e não mais do que 5%.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que antes da incubação, o meio de crescimento microbiológico encapsulado tem um pH de 7,2.
7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a matriz alimentar compreende proteína animal, um laticínio, queijo, carne moída, presunto, leite não pasteurizado, matéria vegetal, ou 20 a 45% de gordura.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que (a) a determinação do número de gotículas positivas e a determinação do número de gotículas negativas compreende a detecção de autofluorescência na pluralidade de gotículas de água em óleo, em que o número de gotículas positivas é o número de gotículas exibindo a presença de autofluorescência e o número de gotículas negativas é o número de gotículas exibindo a ausência de autofluorescência; ou (b) a determinação do número de gotículas positivas compreende ainda a correção do número aplicando uma correção de distribuição de Poisson para contabilizar a incorporação de múltiplos microorganismos alvo em uma única gotícula.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a determinação de números de gotículas positivas e negativas compreende a coleta de dados a partir de gotículas que viajem em série através da região de detecção de um dispositivo de detecção.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo alvo é mofo e a fase de óleo compreende pelo menos um agente antifúngico, preferencialmente o pelo menos um agente antifúngico é selecionado de 2,6-dicloro-4-nitroanilina, 4,5,6,7- tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceína, (RS) -1 -[2 -(alilóxi) -2 -(2,4 - diclorofenil) etil] -1H -imidazol e quitosana, mais preferencialmente a) a concentração de 2,6-dicloro-4-nitroanilina varia de 5 mg/L a 200 mg/L; b) a concentração de 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'- tetraiodofluoresceína varia de 50 mg/L a 375 mg/L; ou c) a concentração de (RS) -1 -[2 -(alilóxi) -2 -(2,4 - diclorofenil) etil] -1H -imidazol varia de 0,1 a 2,5 g/L.
11. Método para testar rapidamente uma matriz alimentar para um número de micro-organismos alvo por unidade de massa ou volume, o método caracterizado pelo fato de que compreende: i) homogeneizar uma porção da matriz alimentar, em que a porção da matriz tem uma massa ou volume conhecido; ii) encapsular a matriz homogeneizada em uma pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo, em que as gotículas de emulsão de água em óleo encapsulam adicionalmente um meio de crescimento microbiológico; e iii) incubar a pluralidade de gotículas de emulsão de água em óleo a uma temperatura permissiva de crescimento microbiológico e por um período de tempo suficiente para permitir que os micro-organismos alvo dobrem de 5 a 45 vezes; e iv) detectar autofluorescência em cada uma da pluralidade de gotículas de água em óleo e determinar a partir das gotículas de emulsão de água em óleo incubadas: um número de gotículas de emulsão de água em óleo que contém micro-organismos, em que o número de gotículas que contém microorganismos é o número de gotículas exibindo autofluorescência, determinando assim um número de gotículas positivas; e um número de gotículas de emulsão de água em óleo que não contém micro-organismos, em que o número de gotículas que não contém micro-organismos é o número de gotículas exibindo a ausência de fluorescência, determinando assim um número de gotículas negativas; e v) determinar a partir do número de gotículas positivas e gotículas negativas um número total de micro-organismos alvo, determinando assim o número de micro-organismos alvo por unidade de massa ou volume da matriz alimentar.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos alvo são selecionados a partir do grupo que consiste em bactérias, leveduras e mofos e em que a incubação é realizada bactéria; leveduras; e mofos.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento microbiológico compreende proteína parcialmente digerida.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento microbiológico compreende: a) água peptonada tamponada; ou b) um tensoativo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é um tensoativo não iônico.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tensoativo não iônico é um poloxâmero.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero tem um peso molecular de 1.800 g/mol.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o poloxâmero compreende 80% de polioxietileno.
19. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento microbiológico compreende tensoativo a uma concentração de 0,01% e não mais do que 5%.
20. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que antes da incubação, o meio de crescimento microbiológico encapsulado tem um pH de 7,2.
21. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a matriz alimentar compreende proteína animal, um laticínio, queijo, carne moída, presunto, leite não pasteurizado, matéria vegetal, ou 20 a 45% de gordura.
22. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a determinação do número de gotículas positivas e negativas compreende a coleta de dados a partir de gotículas que viajem em série através da região de detecção de um dispositivo de detecção.
23. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a determinação do número de gotículas positivas e negativas compreende formar por imagem a pluralidade de gotículas de água em óleo em paralelo.
24. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a determinação do número de gotículas positivas compreende ainda a correção do número aplicando uma correção de distribuição de Poisson para contabilizar a incorporação de múltiplos micro-organismos alvo em uma única gotícula.
25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo alvo é mofo e a fase de óleo das ditas gotículas compreende ainda pelo menos um agente antifúngico.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente antifúngico é selecionado do grupo consistindo em 2,6-dicloro-4-nitroanilina, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'- tetraiodofluoresceína, (RS) -1 -[2 -(alilóxi) -2 -(2,4 -diclorofenil) etil] -1H - imidazol e quitosana.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a) a concentração de 2,6-dicloro-4-nitroanilina varia de 5 mg/L a 200 mg/L; b) a concentração de 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'- tetraiodofluoresceína varia de 50 mg/L a 375 mg/L; ou c) a concentração de (RS) -1 -[2 -(alilóxi) -2 -(2,4 - diclorofenil) etil] -1H -imidazol varia de 0,1 a 2,5 g/L.
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