BR112017021926B1 - Processo para a preparação de derivados de ácido galnac, sal de amina e processo para a preparação de conjugados de oligonucleotídeos galnac - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE ÁCIDO, SAL DE AMINA, USO DOS PROCESSOS E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS. A invenção compreende um novo processo para a preparação de derivados de GalNAc de fórmula I em que n é um número inteiro entre 0 e 10, e seus sais, enantiômeros e/ou isômeros ópticos correspondentes dos mesmos. O derivado de ácido GalNAc de fórmula I pode ser usado para a preparação de conjugados de oligonucleotídeos GalNAc terapeuticamente valiosos.

Description

[0001] A invenção refere-se a um novo processo para a preparação de derivados de GalNAc de fórmula I em que n é um número inteiro entre 0 e 10, e seus sais, enantiômeros e/ou isômeros ópticos correspondentes dos mesmos.

[0002] Derivados de GalNAc de fórmula I são geralmente o componente alvo de conjugados que compreendem o componente GalNAc e certos oligonucleotídeos. O componente GalNAc devido à sua afinidade ao receptor asialoglicoproteína que está localizado nas células do fígado permite a distribuição funcional de conjugados de oligonucleotídeos para a célula hepática. Esses conjugados antisense de aglomerado de GalNAc têm o potencial para agir como moduladores farmacocinéticos e são, por exemplo, descritos na publicação PCT documento WO 2012/083046 ou na publicação de pedido de patente US 2011/0207799. Embora essas publicações também divulguem processos para a preparação dos derivados de GalNAc, verificou-se que esses processos não atendem ao padrão para uma síntese de escala técnica.

[0003] O objeto da invenção é, portanto, fornecer um método aprimorado para a preparação dos derivados de GalNAc de fórmula I que atendam aos requisitos de um processo em escala industrial.

[0004] Um objeto adicional da invenção é o uso dos derivados do ácido GalNAc de fórmula I para a preparação de conjugados de oligonucleotídeos GalNAc terapeuticamente valiosos e de um processo para a preparação desses conjugados.

[0005] O objeto poderia ser alcançado com o processo da presente invenção que compreende: a) o acoplamento de um sal de triamina de fórmula II em que R1 é um grupo protetor de éster e X é um ânion de um ácido com um ácido tetrahidropirano de fórmula III em que n é conforme acima e R2 é um grupo protetor de hidróxi na presença de um agente acoplador de peptídeo, uma base amina e um solvente orgânico para formar o éster de GalNAc de fórmula IV em que n, R1 e R2 são conforme acima; b) a remoção do grupo protetor de éster R1 e dos grupos protetores de hidróxi R2 na presença de uma base mineral para formar o sal de ácido GalNAc de fórmula V em que n é conforme acima e M é um cátion metálico; e c) opcionalmente a transformação do sal de ácido GalNAc de fórmula V para o derivado de ácido GalNAc de fórmula I.

[0006] As seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos diversos termos usados para descrever a invenção no presente pedido.

[0007] Sempre que um carbono quiral estiver presente em uma estrutura química, o que se pretende é que todos os estereoisômeros associados com esse carbono quiral sejam englobados pela estrutura como estereoisômeros puros, bem como misturas dos mesmos.

[0008] O termo “alquila C1-7” denota um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente com 1 a 7 átomos de carbono, e em realizações mais particulares 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec-butila ou terc- butila.

[0009] O termo fenil-C1-7-alquila denota um grupo fenila que é fixado a um grupo alquila C1-7 conforme definido acima. Um exemplo particular é o grupo benzila.

[0010] O grupo fenila pode ser opcionalmente substituído por halogênio como cloro, bromo ou iodo com um grupo alquila C1-7 conforme definido acima.

[0011] O termo “grupo protetor de amino” denota grupos que pretendem proteger um grupo amino e inclui benzila, benziloxicarbonila, carbobenzilóxi (CBZ ou Z), 9-Fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), p- metoxibenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, terc-butoxicarbonila (BOC) e trifluoroacetila. Exemplos adicionais destes grupos são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2a ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova York, NY, 1991, capítulo 7; E. Haslam, “Protective Groups in Organic Chemistry”, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova York, NY, 1973, Capítulo 5, e T.W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, Nova York, NY, 1981. Os grupos protetores de amino preferenciais são FMOC e BOC.

[0012] O termo “grupo protetor de hidróxi” e o termo “grupo protetor de éster” denotam grupos que pretendem proteger um grupo hidróxi e incluem grupos formadores de éster e éter, em particular grupos tetrahidropiranila, benzoila, acetila, carbamoila, benzila e sililéteres (por exemplo, TBS, TBDPS). Exemplos adicionais destes grupos são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2a ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova York, NY, 1991, capítulos 2-3; E. Haslam, “Protective Groups in Organic Chemistry”, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova York, NY, 1973, Capítulo 5, e T.W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, Nova York, NY, 1981.

[0013] Em uma realização preferencial, o derivado de GalNAc tem a fórmula Ia em que n é conforme acima.

[0014] Do mesmo modo, de acordo com a fórmula Ia os intermediários II, III, IV, X, XI, XII, XIII, XIV, XX, XXI e XXII compartilham a mesma estereoquímica e seus centros quirais.

SÍNTESE DO SAL DE TRIAMINA DE FÓRMULA II (BLOCO DE CONSTRUÇÃO A)

[0015] O processo compreende: a1) transformar o ácido carboxílico de fórmula X em que R3’ e R4 são diferentes e independentes entre si e são um grupo protetor de amino, em um éster de fórmula XI b1) remover o grupo protetor de amino R4 e subsequente formação de um sal de amina da fórmula XII em que R1 e R3’ são conforme acima e X- é um ânion de ácido; c1) acoplar o sal de amina de fórmula XII com um derivado de ácido hexanoico de fórmula XIII em que R3’’ e R3’’’ são grupos protetores de amino para formar a triamina protegida de fórmula XIV em que R3’, R3’’, R3’’’e R1 são conforme acima; d1) converter a triamina protegida de fórmula XIV com um ácido no sal de triamina de fórmula II.

[0016] A etapa a1) compreende a transformação do ácido carboxílico de fórmula X com um álcool R1OH na presença de um agente ativador, uma catalisador de amina e um solvente orgânico para o respectivo éster de fórmula XI.

[0017] Uma vez que o grupo protetor de éster deve ser clivável sob condições básicas, alcoóis adequados R1OH são aqueles em que R1 é alquila C1-7 ou fenil-C1-7-alquila, em que o grupo fenila é opcionalmente substituído por halogênio ou alquila C1-7. Particularmente adequados são os alcoóis alifáticos C1-4 como metanol ou etanol ou álcool benzílico. Um álcool preferencial é o álcool benzílico.

[0018] É importante que os grupos protetores de amino R3’, R3’’ e R3’’’ sejam diferentes de R4 com relação às condições para sua remoção. Adequadamente, um grupo protetor de amino que é clivável sob condições ácidas como grupo Boc preferencial é selecionado para R3’, R3’’ e R3’’’.

[0019] Para grupos de proteção de amino R4 que são cliváveis sob condições básicas ou a título de hidrogenólise como FMOC (condições básicas) ou Z (hidrogenólis) são preferencialmente selecionáveis. FMOC é o grupo protetor de amino preferencial para R4.

[0020] Agentes de ativação adequados podem ser selecionados a partir das carbodiimidas conhecidas para o técnico no assunto como N,N’-diciclo carbodiimida (DCC), N,N’-diisopropil carbodiimida (DIC) ou 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil))carbodiimida (EDC), mas preferencialmente é usada DCC.

[0021] A presença de um catalisador amina, preferencialmente 4- (dimetilamino) piridina é vantajosa para a esterificação.

[0022] A esterificação é como uma regra realizada em uma temperatura de 20°C a 50°C em um solvente orgânico aprótico como hidrocarbonetos halogenados como diclorometano.

[0023] A etapa b1) em uma primeira etapa envolve a remoção do grupo protetor de amino R4, preferencialmente Fmoc com uma amina alifática na presença de um solvente orgânico.

[0024] Convenientemente, a amina alifática é uma amina alifática secundária como dimetilamina, dietilamina, morfolina ou piperazina. Preferencialmente é aplicada dietilamina.

[0025] A reação é como uma regra realizada em um solvente orgânico adequado como em solventes apróticos polares como tetrahidrofurano em temperaturas de reação entre 20°C e 50°C.

[0026] O excesso de amina pode ser adequadamente removido por destilação azeotrópica com um solvente adequado como, por exemplo, com acetonitrila.

[0027] Em uma segunda etapa da etapa b1) a amina livre é transformada em um sal de amina de fórmula XII com um ácido adequado.

[0028] Ácidos adequados são ácidos minerais, como ácido clorídrico, ácido fosfórico ou ácido sulfônico. Preferencialmente, podem ser usados ácidos sulfônicos como ácido metanosulfônico ou ácido p- toluenosulfônico e mais preferencialmente ácido metanosulfônico.

[0029] Consequentemente X representa o ânion do ácido aplicado.

[0030] Uma vez que a amina livre é como regra não isolada, a reação pode ocorrer na acetonitrila usada na etapa b1) geralmente à temperatura ambiente.

[0031] O sal de amina formado de fórmula XII pode ser, como regra, isolado por filtração.

[0032] O sal de amina de fórmula XII em que R1 e R3’ são grupos protetores de amina e X- é um ânion de um ácido são compostos conhecidos na técnica e, portanto, constituintes aõ uma realização adicional da presente invenção.

[0033] Em uma realização ainda mais preferencial, no sal de amina da fórmula XII R1 é benzila, R3’ é Boc e X é o ânion de ácido metanosulfônico.

[0034] A etapa c1) envolve o acoplamento do sal de amina de fórmula XII em que R1, R3 e X são conforme acima, mas preferencialmente em que R1 é benzila, R3’é Boc e X é o ânion de ácido metanosulfônico com o derivado de ácido hexanoico de fórmula XIII em que R3’’ e R3’’’ são conforme acima, mas preferencialmente são Boc com um agente de acoplamento na presença de uma base amina e um solvente orgânico e a formação da triamina protegida de fórmula XIV.

[0035] O acoplamento pode seguir os métodos clássicos conhecidos para o técnico no assunto com o uso de um agente de acoplamento de carbodiimida similar a DCC (N,N’-Diciclohexil carbodiimida), EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N’- etilcarbodiimida) ou EDC HCl cloridrato de (N-(3-dimetilaminopropil)-N’- etilcarbodiimida e um aditivo similar a HOBt (1-hidroxibenzitriazola), HOSu (N- hidroxisuccinimida), TBTU tetrafluoroborato de (N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(benzotriazol- 1-il)urônio, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato) ou HOAt (1-Hidróxi-7-azabenzotriazola e combinações comuns dos mesmos como TBTU/HOBt ou HBTU/HOAt.

[0036] Em uma realização preferencial, o anidrido de ácido n- propilfosfônico preferencial (T3P) é selecionado como agente acoplador juntamente com uma base amina terciária, similar a trietilamina ou N- etildiisopropilamina, mas preferencialmente com N-etildiisopropilamina.

[0037] Os derivados de ácido hexanoico de fórmula XIII, particularmente os derivado protegidos por BOC são compostos que são comercialmente disponíveis.

[0038] A reação de acoplamento geralmente ocorre em um solvente aprótico polar como acetonitrila ou tetrahidrofurano ou misturas dos mesmos em temperaturas de reação na faixa de 0°C e 50°C.

[0039] O isolamento da triamina protegida bruta de fórmula XIV pode acontecer por remoção dos solventes. A cristalização subsequente, por exemplo, com acetonitrila leva a um produto com alto grau de pureza que pode ser facilmente usado para a próxima etapa d1).

[0040] Em uma realização preferencial, na triamina protegida de fórmula XIV R1 é benzila e R3’, R3’’ e R3’’’ são Boc.

[0041] A etapa d1) envolve a conversão da triamina protegida de fórmula XIV em que R1, R3’, R3’’ e R3’’’ são conforme acima, preferencialmente em que R1 é benzila e R3’, R3’’ e R3’’’são Boc com um ácido na presença de um solvente orgânico no sal de triaminada de fórmula II.

[0042] Ácidos adequados são ácidos minerais como ácido clorídrico ou ácido fosfórico, ácido trifluoroacético ou ácido sulfônico. Preferencialmente, podem ser usados ácidos sulfônicos como ácido metanosulfônico ou ácido p-toluenosulfônico e mais preferencialmente ácido metanosulfônico.

[0043] Preferencialmente é usado um excesso de 4 eq a 10 eq do respectivo ácido.

[0044] A reação é geralmente realizada em um solvente aprótico adequado em uma temperatura de reação de 20°C a 80°C.

[0045] Em uma realização preferencial da presente invenção, a conversão é realizada em um solvente aprótico polar que impede que o sal de triamina resultante de fórmula II cristalize. O solvente particularmente preferencial é acetonitrila que deixa o sal de triamina resultante de fórmula II sob a forma de uma emulsão que pode ser facilmente usada para o acoplamento subsequente com o ácido tetrahidropirano de fórmula II na etapa a).

SÍNTESE DO ÁCIDO TETRAHIDROPIRANO DE FÓRMULA III (BLOCO DE CONSTRUÇÃO B)

[0046] O processo para produção do ácido tetrahidropirano de fórmula III compreende a2) a transformação de um diol de fórmula XX em que n é um número inteiro entre 0 e 10 no éster de álcool de fórmula XXI em que n é conforme acima e R5 é um grupo protetor de éster; b2) o acoplamento do éster de álcool de fórmula XXI com um derivado de tetrahidropirano de fórmula XXII em que R2 e R6 independentes entre si são grupos protetores de hidróxi para formar um éster de tetrahidropirano de fórmula XXIII em que R2 e R5 são conforme acima; c2) a remoção do grupo éster R5 para formar o ácido tetrahidropirano de fórmula III.

[0047] A etapa a2) necessita da transformação do diol de fórmula XX para o álcool de fórmula XXI.

[0048] O diol de fórmula XX é caracterizado por unidades de repetição n -(CH2-)-O-. O número inteiro n é como uma regra selecionado entre 0 e 10, mas preferencialmente, entre 0 e 5, mais preferencialmente entre 0 e 2. O diol preferencial é o comercialmente disponível 2-[2-(2-hidroxietóxi) etóxi]etanol (n = 1).

[0049] Em um primeira etapa da etapa a2) o diol de fórmula XX é desprotonado com um alcolato de metal alcalino.

[0050] Alcoolatos de metal alcalino adequados são alcoolatos terciários de sódio ou potássio como t-butilato de sódio ou potássio ou amilato de sódio ou potássio.

[0051] Para a desprotonação um solvente prótico polar ou solvente aprótico polar como N,N-dimetilformamida ou alcoóis terciários como t-butanol ou 2-metil-2-butanol podem estar presentes e a reação pode ocorrer em 50°C a 120°C.

[0052] Em uma segunda etapa da etapa a2) o componente ácido acético é introduzido com um ácido acético de halogênio ou com um sal adequado do mesmo.

[0053] O ácido acético de halogênio adequado é ácido acético de bromo ou de cloro ou os sais de metais alcalinos dos mesmos. Em uma realização preferencial, é empregado um sal do ácido acético de halogênio, mais preferencialmente é usado cloroacetato de sódio.

[0054] A reação pode ocorrer em um solvente prótico polar ou solvente aprótico polar, geralmente no mesmo solvente que na etapa anterior.

[0055] A temperatura de reação depende do solvente, mas como regra, é selecionada entre 50°C e 120°C.

[0056] Na terceira etapa da etapa a2) o sal de éster intermediário é sem o seu isolamento transformado para o éster de álcool de fórmula XXI.

[0057] A formação do éster de álcool significa a introdução do grupo de proteção de éster R5.

[0058] Embora a técnica conheça muitas possibilidades para proteger um éster, descobriu-se que o grupo benzila é o mais adequado. A sua introdução pode acontecer com um halogeneto de benzila ou um éster de sulfonil benzila com brometo de benzila.

[0059] A esterificação pode ocorrer em um solvente aprótico polar, geralmente no mesmo solvente que na etapa anterior em uma temperatura de reação de 20°C a 120°C.

[0060] O isolamento do éster de álcool a partir da mistura de reação pode acontecer por meio da extração com um solvente adequado como éter de t-butil metila e remoção do solvente. A etapa b2) necessita da reação do éster de álcool de fórmula XXI com o derivado de tetrahidropirano de fórmula XXII na presença de um ácido e de um solvente orgânico para formar o éster de tetrahidropirano de fórmula XXIII.

[0061] Embora a técnica conheça muitos grupos protetores de hidróxi, R2 e R6 são preferencialmente acetila.

[0062] O derivado de tetrahidropirano de fórmula XXII, particularmente os derivados de acetila são compostos que são comercialmente disponíveis.

[0063] Ácidos adequados são ácidos sulfônicos halogenados como o ácido trifluometanosulfônico preferencial.

[0064] A reação é geralmente realizada na presença de solvente aprótico polar como diclorometano nas temperaturas de reação de 0°C a 40°C.

[0065] Em uma realização preferencial, o ácido acético gerado é continuamente destilado no curso da reação.

[0066] Após a neutralização da mistura de reação, o éster de tetrahidropirano de fórmula XXIII pode ser isolado por remoção dos solventes. O produto bruto pode ser purificado por cromatografia de sílica com n- heptano/acetona ou preferencialmente éter de terc-butil metila/acetona como fase móvel.

[0067] Em uma realização preferencial, no éster de tetrahidropirano de fórmula XXIII, R2 é acetila e R6 é benzila.

[0068] A etapa c2) refere-se à extração do grupo éster R6.

[0069] A remoção de um grupo éster é, em princípio, conhecida para os técnicos no assunto e bem descrita na literatura.

[0070] Como uma realização preferencial a etapa c2) envolve uma hidrogenação catalítica com hidrogênio na presença de um catalisador de hidrogenação para remover o grupo benzila e a formação do ácido tetrahidropirano de fórmula III.

[0071] A hidrogenação típica de catalisador para a remoção do grupo benzila é o paládio em carbono (Pd/C).

[0072] A reação é geralmente realizada na presença de solvente polar aprótico como tetrahidrofurano nas temperaturas de reação entre 10°C e 30°C e em uma pressão de hidrogênio de 1 bar a 5 bar.

[0073] O ácido tetrahidropirano de fórmula III pode, após filtragem do catalisador, ser diretamente usado na solução para o acoplamento subsequente na etapa a) do processo da presente invenção.

[0074] No ácido tetrahidropirano preferencial de fórmula III R2 é acetila.

[0075] Em uma outra realização, o éster de álcool de fórmula XXI podem ser preparado com um processo que compreende as etapas. a3) a diazotização de um acetato 2-amino de fórmula XXV em que R5 é conforme acima e X é um átomo de halogênio com um sal de nitrito para formar o composto 2-diazo de fórmula XXVI em que R5 is conforme acima; e b3) a transformação do composto 2-diazo de fórmula XXVI com o diol de fórmula XX para o éster de álcool desejado de fórmula XXI.

[0076] A etapa a3) necessita da diazotização de amino do acetato de 2-amino de fórmula XXV e a formação do composto 2-diazo de fórmula XXVI.

[0077] O acetato de amino de fórmula XXV é um composto comercialmente disponível que é adequadamente aplicado como cloridrato (X = Cl).

[0078] A diazotização é, como regra, realizada com um nitrito alcalino, preferencialmente com nitrito de sódio na presença de uma mistura de solventes de água e um solvente aprótico não polar em uma temperatura de reação de -10°C a 10°C, preferencialmente a 0°C a 5°C.

[0079] Solventes apróticos não polares adequados podem ser selecionados a partir de terc-metila, butil éter, tetrahidrofurano, 2-metil tetrahidrofurano, ciclopentil metil éter, diclorometano e tolueno. Preferencialmente é usado tolueno em uma mistura com água 1:1 v/v.

[0080] O composto 2-diazo de fórmula XXVI obtido é mantido dissolvido na fase orgânica para a subsequente transformação na etapa b3).

[0081] A etapa b3) necessita da transformação do composto 2-diazo de fórmula XXVI com o diol de fórmula XX.

[0082] Conforme esboçado acima, o diol de fórmula XX é caracterizado por unidades de repetição n -(CH2-)-O-. O número inteiro n é como uma regra selecionado entre 0 e 10, mas preferencialmente, entre 0 e 5, mais preferencialmente entre 0 e 2. O diol preferencial é o comercialmente disponível 2-[2-(2-hidroxietóxi) etóxi] etanol (n = 1).

[0083] A reação pode ser realizada na presença de um ácido de Lewis e um solvente aprótico não polar em -10°C a 10°C, preferencialmente 0°C a 5°C.

[0084] O solvente aprótico não polar é, como regra, o mesmo que o usado na etpa a3).

[0085] Ácidos de Lewis típicos podem ser selecionados a partir de trihalogenetos de boro, como trifluoreto de boro e seus adutos comercialmente disponíveis como eterato de dietil trifluoreto de boro, ou acetato de ródio (II) ou trifluorometanosulfonato de cobre (II). Preferencialmente é eplicado o trifluoreto de boro sob a forma do eterato de dietila.

[0086] O éster de álcool de fórmula XXI pode ser isolado a partir da mistura de reação por procedimentos de trabalho comum que envolvem separar a camada orgânica, remover o solvente por evaporação e opcionalmente ainda purificar o bruto através de cromatografia.

[0087] O éster de álcool de fórmula XXI pode ser ainda prontamente usado para a subsequente etapa b2).

MONTAGEM DO BLOCO DE CONSTRUÇÃO A E B

[0088] A etapa a) necessita da acoplamento do sal de triamina de fórmula II com o ácido de tetrahidropirano de fórmula III na presença de um agente acoplador de peptídeo, uma base amina e um solvente orgânico para formar o éster de GalNAc de fórmula IV.

[0089] Conforme descrito acima tanto os sais de triamina de fórmula II como o ácido tetrahidropirano de fórmula III podem ser preferencialmente usados sem isolamento da mistura de reação resultante a partir de sua síntese.

[0090] Conforme esboçado acima, no ácido tetrahidropirano preferencial de da fórmula III R2 é acetila e no sal de triamina preferencial de da fórmula II R1 é benzila e X é o ânion de ácido metanosulfônico.

[0091] O acoplamento pode seguir os métodos clássicos conhecidos para o técnico no assunto com o uso de um agente de acoplamento de carbodiimida similar a DCC e um aditivo similar a HOBt (1-hidroxibenzitriazola), HOSu (N- hidroxisuccinimida), TBTU tetrafluoroborato de (N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(benzotriazol- 1-il)urônio, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato) ou HOAt (1-Hidróxi-7-azabenzotriazola e combinações comuns dos mesmos como TBTU/HOBt ou HBTU/HOAt.

[0092] Em uma realização preferencial, o anidrido de ácido n- propilfosfônico preferencial (T3P) é selecionado como agente acoplador juntamente com uma base amina terciária, similar a trietilamina ou N-etildiisopropilamina, mas preferencialmente N-etildiisopropilamina.

[0093] A reação de acoplamento geralmente ocorre em um solvente aprótico polar como acetonitrila ou tetrahidrofurano ou misturas dos mesmos em temperaturas de reação na faixa de 20°C e 70°C.

[0094] O ácido metanosulfônico formado e o excesso de base amina e agente acoplador podem ser, após a conclusão da reação de acoplamento, removidos precipitando o produto bruto em um solvente orgânico adequado como em 2-propanol.

[0095] Em alternativa e etapas de realização preferencial a) e b) podem ser combinados e realizados em uma etapa sem isolamento do éster GalNAc de fórmula IV Consequentemente a reação de mistura da etapa a) pode ser tratada diretamente com a base mineral conforme descrito na etapa b) abaixo.

[0096] No éster GalNAc preferencial de fórmula IV R1 é benzila e R2 é acetila.

[0097] A etapa b) necessita da remoção do grupo protetor de éster R1 e dos grupos protetores de hidróxi R2 na presença de uma base mineral para formar o sal de ácido GalNAc de fórmula V.

[0098] Como regra o éster de GalNAc de fórmula IV é dissolvido em solvente orgânico polar, particularmente em um álcool como metanol.

[0099] M representa um cátion metálico, geralmente um cátion de metal alcalino ou terroso como lítio, sódio, potássio, rubídio, cálcio ou magnésio, mas preferencialmente sódio, potássio ou cálcio, mais preferencialmente sódio.

[0100] Consequentemente, uma base mineral adequada é um hidróxido de metal alcalino ou alcalino terroso selecionado a partir de hidróxido de sódio, potássio ou cálcio, tipicamente aplicado sob a forma de uma solução aquosa. Preferencialmente, hidróxido de sódio aquoso é usado em um excesso de 11 eq a 25 eq.

[0101] A reação pode ser realizada a uma temperatura de 0°C a 40°C.

[0102] O produto bruto pode ser isolado por ser isolado por evaporação do solvente. Purificação adicional do produto pode ser alcançada por cromatografia de fase reversa preparativa com o uso de uma fase estacionária polar e uma fase móvel polar.

[0103] Descobriu-se que uma fase móvel polar preferencial são misturas aquosas de hidrogenocarbonato de sódio e acetonitrila que foram aplicados com gradientes de troca.

[0104] A concentração das frações selecionadas da cromatografia fornece um sal de ácido GalNAc puro de fórmula V.

[0105] No sal de ácido GalNAc preferencial de fórmula IV R1 é benzila, R2 é acetila e M é sódio.

[0106] A concentração não é necessária no caso do sal de GalNAc de fórmula V ser submetido à etapa opcional c) que compreende a transformação do sal de ácido GalNAc de fórmula V no derivado de ácido GalNAc de fórmula I.

[0107] A transformação pode ser efetuada por troca iônica com uma troca catiônica adequada ou alternativamente por neutralização com um ácido adequado, por exemplo, ácido fosfórico ou ácidos sulfônicos como ácido metanosulfônico.

[0108] No caso do derivado de ácido GalNAc desejado de fórmula I ser isolado da transformação, pode ocorrer preferencialmente em uma solução metanólica. A remoção do solvente torna o produto desejado com alto rendimento e pureza.

[0109] Alternativamente, no caso do derivado de ácido GalNAc de fórmula I ser diretamente submetido à conjugação com oligonucleotídeos, a transformação é realizada de forma adequada em um solvente aprótico polar como N,N’-dimetilformamida.

[0110] Como mais uma alternativa, os derivados de ácido GalNAc de fórmula I podem ser transformados de volta em um sal de GalNAc de fórmula V na presença de uma base mineral adequada, conforme esboçado acima. Essa alternativa em princípio permitiria alterar o cátion metálico.

[0111] O termo “sal” no contexto do derivado de ácido GalNAc de fórmula I, consequentemente significa um sal de metal alcalino ou terroso com um cátion selecionado a partir de lítio, sódio, potássio, rubídio, cálcio ou magnésio, mas preferencialmente sódio, potássio ou cálcio, mais preferencialmente sódio.

CONJUGAÇÃO A OLIGONUCLEOTÍDEOS

[0112] O derivado de ácido GalNAc de fórmula I ou o sal de ácido GalNAc de fórmula V pode ser usado como inicialmente descrito para a preparação de conjugados de oligonucleotídeos GalNAc terapeuticamente valiosos.

[0113] O termo oligonucleotídeo como usado no presente pedido é definido como é geralmente entendido pelo técnico no assunto como uma molécula que compreende dois ou mais nucleosídeos ligados covalentemente. Para uso como um oligonucleotídeo terapeuticamente valioso, oligonucleotídeos são tipicamente sintetizados como 7 a 30 nucleotídeos de comprimento.

[0114] Os oligonucleotídeos podem consistir em DNA, RNA, RNA modificado ou monômeros de nucleosídeos de LNA ou combinações dos mesmos. Os monômeros de nucleosídeos de LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo ligante (citado como um biradiclo ou uma ponte) entre C2’ e C4’ do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo. Estes nucleosídeos são também designados ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura.

[0115] Os oligonucleotídeos também podem conter ligantes amino na extremidade 5’ do oligonucleotídeo como, por exemplo, um ligante C-6-.

[0116] A preparação de conjugados de polinucleotídeos GalNAc compreendem as etapas: a3) preparar o derivado de ácido GalNAc de fórmula I ou o sal de ácido GalNAc de fórmula V de acordo com a presente invenção conforme descrito acima, e b3) conjugar o derivado de ácido GalNAc de fórmula I ou o sal de ácido GalNAc de fórmula V sob condições de acoplamento de peptídeo com um polinucleotídeo.

[0117] A conjugação com o sal de ácido GalNAc de fórmula V é preferencial.

[0118] As condições de acoplamento do peptídeo são métodos clássicos conhecidos na técnica com o uso de um agente de acoplamento de carbodiimida similar a DCC (N,N’-Diciclohexilcarbodiimida), EDC (N-(3- dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida) ou EDC HCl cloridrato de (N-(3- dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida e um aditivo similar a HOBt (1- hidroxibenzitriazola), HOSu (N-hidroxisuccinimida), TBTU tetrafluoroborato de (N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)urônio, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato) ou HOAt (1-Hidróxi-7-azabenzotriazola e combinações comuns dos mesmos como TBTU/HOBt ou HBTU/HOAt.

[0119] A título de exemplo, o pedido de publicação de patente US 2011/0207799 pode ser citado para referência de uma conjugação de derivados de GalNAc para oligonucleotídeos. EXEMPLOS - Abreviações: - AcOH ácido acético - DMAP 4-(dimetilamino)-piridina - DMF N, N’-dimetilformamida - EtOH etanol - MeOH metanol - rt temperatura ambiente - THF tetrahidrofurano - TBME éter metil terc.-butílico BLOCO DE CONSTRUÇÃO A EXEMPLO 1 BENZIL (2S)-6-(TERC-BUTOXICARBONILAMINO)-2-(9H-FLUOREN-9- YIMETOXICARBONILAMINO)HEXANOATO

[0120] 234,0 g (500,0 mmol) de ácido (2S)-6-(terc- butoxicarbonilamino)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)hexanoico foi suspenso em 500 mL de diclorometano, foram adicionados 62,0 mL de álcool benzílico (600 mmol, 1,2 eq) e 3,05 g de DMAP (25,0 mmol, 0,05 eq). A solução foi resfriada a 0 a 5°C no decorrer de 40 min, a solução de 108,0 g (525,0 mmol, 1,05 eq) N,N’- diciclohexil carbodiimida em 500 mL diclorometano, foi adicionada por go.tejamento. A suspensão branca foi agitada por 1h a 0 a 5°C e, em seguida, por 15h à temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada através de um filtro de vidro G3, a torta de filtro branco foi lavada em pequenas porções com total de 250 mL de diclorometano. O filtrado foi evaporado em 650 a 10 mbar/1h para obter um óleo amarelo, que foi dissolvido em 2,0 L de acetato de etila, extraído com 2,0 L de ácido clorídrico 0,5 M, 2,0 L de NaHCO3 1 M e 1,0 L de salmoura, a camada orgânica foi evaporada até secura a 40°C/150 a 10 mbar/5h para obter 291,1 g de hexanoato de benzil (2S)-6- (terc-butoxicarbonilamino)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino) bruto como um sólido branco 104% de rendimento e 96,4% pureza (área de HPLC - %, contém cerca de álcool benzílico 5%). O material foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. MS: m/z = 459,22735 (M-boc+H)+. EXEMPLO 2

[0121] 291,1 g de hexonoato de benzil (500,0 mmol) (2S)-6-(terc- butoxicarbonilamino)-2-(9H-fluoren-9-ilmetóxicarbonilamino) hexanoato (pureza de HPLC; 95,8%; contém cerca de álcool benzílico 5%) foram dissolvidos em 1,4 L de THF à temperatura ambiente. Dentro de 10 min, foram adicionados 1,04 L de dietilamina (10,0 mol, 20 eq), a solução amarela clara foi agitada por 2h à temperatura ambiente e em seguida evaporada a 40°C/200 a 10 mbar, 200 mL de acetonitrila foi adicionado e evaporado novamente para remover dietilamina de modo eficiente a 40°C/100 a 10 mbar/1h. Finalmente, foi obtido 268,1 g de um óleo amarelo, que foi dissolvido em 2,5 L de acetonitrila, agitado por 10 min à temperatura ambiente. Partículas insolúveis foram filtradas através de um filtro de fibra de vidro e lavadas com 500 mL de acetonitrila. O filtrado foi tratado por gotejamento no decorrer de 10 min com 34,0 mL de ácido metanosulfônico a 20°C a 25°C. A suspensão branca formada foi agitada por 17h à temperatura ambiente e filtrada sobre um filtro de vidro G3. A torta de filtro foi lavada em pequenas porções com 500 mL de acetonitrila. Os cristais brancos foram secos a 40°C/15 mbar/4h para obter 195,8 g de sal de ácido metanosulfônico benzil (2S)-2-amino-6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoato como cristais brancos em 91% de rendimento (2 etapas) e 99,3% de pureza (área de HPLC - %). MS: m/z = 337,2149 (M+H)+. EXEMPLO 3 HEXANOATO DE BENZIL (2S)-2-[[(2S)-2,6-BIS(TERT- BUTOXICARBONILAMINO)HEXANOIL]AMINO]-6-(TERC-BUTOXICARBONILAMINO)

[0122] 190,0 g (439,0 mmol) sal de ácido metanosulfônico benzil (2S)- 2-amino-6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoato foi suspenso em 1,9 L de THF à temperatura ambiente. 335 mL (1,98 mol, 4,5 eq) N-etildiisopropilamina foram suspensos de modo que a temperatura diminuiu ligeiramente para 15°C. Depois, foi adicionado 213 g (615 mmol, 1,4 eq) de ácido (S)-2,6-bis((terc- butoxicarbonil)amino)hexanoico e a suspensão branca foi agitada à temperatura ambiente por 20 min. 390 mL de anidrido de ácido n-propilfosfônico (T3P como trímero cíclico 50% em acetato de etila, 659 mmol, 1,5 eq) foram adicionados por gotejamento no decorrer de 20 min a 20 a 25°C (resfriado em um banho de água fria). A solução turva amarela clara resultante, foi agitada à temperatura ambiente por 1,5h, transferidos para um funil de separação, diluída com 1,9 L de TBME e extraída com 1,9 L de água, 1,9 L de ácido clorídrico 0,5 M, 1,9 L de NaOH 0,5 M, 1,9 L de água e 1,9 L de salmoura. A camada orgânica ainda turva, separada foi filtrada através de um filtro de fibra de vidro, o filtro foi lavado com 100 mL de TBME e os filtrados combinados foram evaporados a 40°C/100 mbar/1 h, 1,0 L de TBME (para remover a água azeotrópica) foi adicionado novamente e evaporado a 40°C/250 a 10 mbar/1h para obter 296,4 g de bruto como resíduo sólido branco.

[0123] O sólido bruto foi tratado com 500 mL de acetonitrila e a solução turva foi aquecida a 60 a 65°C por 10 min. A mistura foi resfriada a 20 a 25°C, agitada por 10 min, filtrada através de um filtro de fibra de vidro e lavada com 50 mL de acetonitrila. A solução amarela clara foi evaporada a 40°C/100 a 10 mbar/4h para obter 295 g de hexanoato de benzil (2S)-2-[[(2S)-2,6-bis(terc- butoxicarbonilamino)hexanoil]amino]-6-(terc-butoxicarbonilamino) como sólido quase branco em um rendimento de 101% (pureza de HPLC: 100%, pureza de diastereômero (SS) 98,6%) que foi usada sem purificação adicional na próxima etapa. MS: m/z = 565,3741 (M-boc+H)+. EXEMPLO 4 SAL DE ÁCIDO TRI-METANOSULFÔNICO BENZIL (2S)-6-AMINO-2-[[(2S)-2,6- DIAMINOHEXANOIL]AMINO]HEXANOATO

[0124] 124,0 g (187 mmol) de benzil (2S)-2-[[(2S)-2,6-bis(terc- butoxicarbonilamino)hexanoil]amino]-6-(terc- butoxicarbonilamino)hexanoato foram suspensos em 1,25 L de acetonitrila. 61,0 mL (935,0 mmol, 5,0 eq) de ácido metanosulfônico foram adicionados a 20 a 25°C no decorrer de 10 min (evolução de gás). A suspensão laranja resultante foi aquecida em 40 min a 55 a 60°C e agitada por mais1 h a 55 a 60°C. A emulsão vermelho alaranjada foi resfriada até temperatura ambiente (a retirada de Boc foi controlada por 1H-NMR) e usada sem purificação adicional na etapa de montagem A+B, Exemplo 8. MS: m/z = 365,2558 (M+H)+. BLOCO DE CONSTRUÇÃO B EXEMPLO 5A ACETATO DE BENZIL 2-[2-[2-(2-HIDROXIETÓXI)ETÓXI]ETÓXI]

[0125] 30,0 g (200,0 mmol), 2-[2-(2-Hidroxietóxi)etóxi]etanol foram dissolvidos em 50 mL de DMF, a 20 a 25°C, em seguida, foram adicionados 46,0 mL de metóxido de sódio 25% (200,0 mmol, 1,0 eq) em metanol. A solução formada foi evaporada a 40°C/50mbar/0,5h (remoção de 40 mL de solvente), 50 mL de DMF foi adicionado novamente e evaporado a 40°C/20mbar/0,5h (remoção de 15 mL solvente). A suspensão de uma solução ligeiramente gelatinosa de 13,9 g de ácido bromoacético (100 mmol, 0,5 eq) em 50 mL de DMF foi adicionada a 20 a 25°C e a mistura foi agitada por 6h. 11,9 mL de brometo de benzila (100 mmol, 0,5 eq) foram adicionados e a mistura agitada para outras 16h a 20 a 25°C. A mistura de reação foi então tratada com 200 mL de salmoura e extraída com 200 mL de TBME. A camada de TBME separada foi extraída com 200 mL de salmoura, a camada de TBME separada foi então seca com sulfato de sódio anidro e filtrada e evaporada a 40°C/300 a 10 mbar/1h para obter 23,9 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etóxi] bruto.

[0126] Após cromatografia (600 g de sílica 60 (0,063 a 0,2 mm), fase móvel: acetato de etila) um total de 7,85 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2- hidroxietóxi)etóxi]etóxi] como óleo incolor foram isolados em 13% de rendimento e 99,0% de pureza (área de HPLC-%). MS: m/z = 299,1517 (M+H)+. EXEMPLO 5B ACETATO DE BENZIL 2-[2-[2-(2-HIDROXIETÓXI)ETÓXI]ETÓXI]

[0127] 11,2 g de terc.-butilato (100,0 mmol, 0,5 eq) foram suspensos em 70 mL de 2-metil-2-butanol (luz exotérmica 35°C), em seguida, 30,0 g (200,0 mmol) de 2-[2-(2-Hidroxietóxi)etoxi]etanol foram adicionados por gotejamento no decorrer de 5 min, o funil de gotejamento foi lavado com 10 mL de 2-metil-2-butanol (a temp. aumenta para 45°C), a solução foi aquecida a 60 a 65°C, 11,6 g (100 mmol, 0,5 eq) de cloroacetato de sódio foram adicionados e agitado por 16h a 60 a 65°C, em seguida, 11,9 mL de brometo de benzila (100 mmol, 0,5 eq) foram adicionados e a mistura agitada por mais 16h a 60 a 65°C. A reação de mistura foi resfriada à rt, em seguida tratada com 50 mL de água e extraída com 80 mL de TBME e 40 mL de TBME. A camada TBME combinada foi lavada com 50 mL de salmoura meio saturada, a camada orgânica foi evaporada a 40°C/300-10mbar/1h para obter 27,0 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etóxi].

[0128] Após cromatografia ( 270 g de sílica 60 (0,063-0,2 mm), fase móvel: começa com acetato de etila/n-heptano 1/1, quando os produtos puros são visíveis, a fase móvel foi trocada para acetato de etila 100%, 11,4 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etóxi] total como óleo próximo a incolor foram isolados em 19% de rendimento (38% de cloroacetato de sódio) e 99,0% de pureza (% de área de HPLC). EXEMPLO 5C ACETATO DE BENZIL 2-[2-[2-(2-HIDROXIETÓXI)ETÓXI]ETÓXI]

[0129] 40,3 g (200,0 mmol) de cloridrato de benzil 2-aminoacetato foram dissolvidos em 340 mL de água e 340 mL de tolueno resfriado a 0 a 5°C, no decorrer de 60 min a solução de 16,5 g (240 mmol, 1,2 eq) de nitrito de sódio em 50 mL de água foram adicionados por gotejamento a 0 a 5°C sob agitação vigorosa. A mistura de reação foi agitada por 3 horas a 0 a 5°C. A camada de tolueno amarela foi separada e lavada com 340 mL de NaHCO3 1 M e 340 mL de salmoura, a camada de tolueno separada foi tratada com 60 g de sulfato de sódio e agitada por 1 hora a 20 a 25°C. A suspensão amarela foi filtrada e lavada com 50 mL de tolueno. A solução de tolueno amarela clara contém no máximo 200,0 mmol de benzil 2-diazoacetato (aproximadamente 8,5% em tolueno). Esta solução foi adicionada por gotejamento no decorrer de 60 min até resfriar a 0 a 5°C e a mistura bem agitada de 60,0 g (400 mmol) trietileno glicol e 465 μL (3,67 mmol, 0,02 eq) trifluoreto de boro dietil eterato em 170 mL de tolueno sob envolvimento de gás nitrogênio. A mistura de reação amarela foi agitada por 90 min a 20 a 25°C na qual uma solução incolor foi formada. A solução foi extraída com 250 mL de salmoura, a camada orgânica separada foi seca com 60 g de sulfato de sódio, filtrada, lavada com 100 mL de tolueno e evaporada a 40°C/40 a 10mbar/1 h para obter 49,9 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2- hidroxietóxi)etóxi]etóxi] bruto. Foi realizada cromatografia com um Teledyne Isco CombiFlash (330 g de sílica 60 (0,035 a 0,070 mm de Teledyne Isco Cat. n° 69-2203330), fase móvel: gradiente com acetona 15%, n-heptano 85% em 45 min a 30% e 70%, tamanho da fração 20 mL. A fração combinada deu 33,88 g de acetato de benzil 2-[2-[2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etóxi] como óleo incolor e com um rendimento total de 57% e 99,0% pureza (% de área de HPLC). EXEMPLO 6 ACETATO DE BENZIL 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5- DIACETÓXI-6-(ACETOXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2-IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]

[0130] 268,0 g de acetato de benzil 2-(2-(2-(2- hidroxietóxi)etóxi)etóxi) (900 mol) foram dissolvidos em 2,4 L de diclorometano. 385,0 g de triacetato (2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-6- (acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2,4,5-triil (990 mmol, 1,1 eq) e 12,0 mL de ácido trifluorometanosulfônico (135 mmol, 0,15 eq) foram adicionados. A suspensão foi aquecida até refluxo com um separador de Dean-Stark (50 mL, para remover AcOH). Após 1h, 4,50 mL de ácido trifluorometanosulfônico (50,7 mmol, 0,05 eq) e 50 mL de diclorometano foram adicionados à suspensão laranja, o solvente (50 mL) foi descarregado a partir do separador de Dean-Stark. A cada meia hora este procedimento foi repetido, total de 6 vezes (3h). Após um total de 4,5h, a solução vermelha foi resfriada até 10 a 15°C e adicionada dentro de 30 min a 20 a 25°C a uma solução de 1,8 L de hidrogênio carbonato de sódio 1M (1,8 mol, 2,0 eq) (evolução em CO2, pH 7-8). A camada orgânica amarela foi separada e evaporada a 40°C/600 a 10 mbar/3h para obter 585,4 g de acetato de benzil 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi- 6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi] como óleo amarelo (pureza de HPLC: 87%). O produto bruto foi dissolvido em 700 mL de acetona e carregado em uma coluna de sílica pré-carregada (3,0 kg de sílica 60; 0,063 a 0,2 mm). A cromatografia foi conduzida com o uso de n- heptano/acetona como fase móvel (gradiente de 5:1 a 1:2). As frações coletadas combinadas foram evaporadas a 40°C/600 a 10 mbar e secas a 20 a 25°C/0,3 mbar/3h para obter 465,0 g de acetato de benzil 2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6-(acetoximetil)tetrahidro- piran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi] como óleo amarelo em 83% de rendimento e 100% de pureza (% de área de HPLC). MS: m/z = 628,2627 (M+H)+. EXEMPLO 7 ÁCIDO 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIACETÓXI-6- (ACETOXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2-IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACÉTICO

[0131] Sob atmosfera de argônio, 456,0 g de acetato de benzil 2-[2-[2- [2-[(2R, 3R, 4R, 5R, 6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6-(acetoximetil)tetrahidro-piran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi] (727 mmol) foram dissolvidos em 1,4 L de THF. 4,56 g de Pd/C 10% foram adicionados e a atmosfera de argônio foi substituída por hidrogênio (1 bar). A suspensão preta foi hidrogenada a 20 a 25°C por 2h. A atmosfera de hidrogênio foi substituídos por argônio, a suspensão preta foi filtrada e a torta de filtro foi lavada em pequenas porções com 400 mL de THF total. O filtrado incolor (pureza de HPLC: 71% e 27% de tolueno) foi usado sem qualquer purificação na etapa de montagem A+B, Exemplo 8. MS: m/z = 538,2191 (M+H)+. MONTAGEM DO BLOCO DE CONSTRUÇÃO A E B EXEMPLO 8A HEXANOATO DE BENZIL (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5- DIACETÓXI-6-(ACETOXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- lL|OxiETÓxi]ETÓxr|ETÓxi]AcETiL|AMiNO]-2-[[(2S)-2,6-Bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIACETÓXI-6-(ACETOXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN- 2—I L|OxiETóxi]ETóxi] ETÓXI]ACETIL|AMINO]H EXANOIL]AMINO]

[0132]A solução vermelho alaranjada (aproximadamente 1,4 L) de tri-metanosulfonato de hexanoato de benzil (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2,6- diaminohexanoil]amino] (180,0 mmol) do Exemplo 4 foi diluída com 3,60 L de acetonitrila. A 20 a 25°C, foram adicionados 365,0 mL de N- etildiisopropilamina (2,16 mol, 12,0 eq) dentro de 5 min. A pasta fluida pegajosa formada, uma solução (aproximadamente 2,25 L) de ácido 2-[2- [2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acético (720 mmol, 4,0 eq) do Exemplo 7 foram adicionadas a 20 a 25°C dentro de 10 min, de modo que a temperatura aumentou ligeiramente até 40°C. A 45 a 50°C, foi adicionada uma solução de 425 mL de anidrido de ácido n-propilfosfônico (T3P, trímero 50% em acetato de etila, 720 mmol, 4,0 eq) dentro de 10 min. A solução de reação foi agitada por 1 h a 45-50°C. A solução amarela clara foi resfriada a 20 a 25°C e evaporada a 40°C/10mbar/6h para obter 1,06 kg de hexanoato de benzil (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido- 4,5-diacetóxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino] bruto (pureza de HPLC: 24,1%). O produto bruto foi precipitado em três porções para remover ácido metanosulfônico, N-etildiisopropilamina e T3P residual. 353 g de produto bruto foram dissolvidas em 7,0 L de 2-propanol, resfriada em 1h a -25°C, agitada por 1 h a -25°C, filtrada através de um filtro de vidro G3 pré-resfriado (-25°C) (sem enxague), uma parte do produto precipitado depositado sobre a parede de vidro do reator. Todos os precipitados foram dissolvidos em pequenas porções a partir do filtro e da parede de vidro com um total de 1,0 L de THF. As soluções combinadas foram evaporadas a 40°C/20 mbar/6h para obter 390,0 g de hexanoato de benzil (2S)-6-[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)- 2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino] (pureza de HPLC: 71,9%) que foram usadas sem purificação adicional na próxima etapa. MS: m/z = 1923,8438 (M+H)+. EXEMPLO 8B SÓDIO; HEXANOATO DE (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO- 4,5-DIIDRÓXI-6-(HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL]AMINO]-2-[[(2S)-2,6-BIS[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIIDRÓXI-6- (HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL]AMINO]HEXANOIL]AMINO]

[0133]A solução vermelho alaranjada (aproximadamente 95 mL) de tri-metanosulfonato de hexanoato de benzil (2S)-6-amino-2-[[(2S)- 2,6-diaminohexanoil]amino] (12,2 mmol) 4 foi diluída com 240 mL de acetonitrila. A 20 a 25°C, foram adicionados 30,0 mL de N- etildiisopropilamina (2,16 mol, 14,5 eq) dentro de 5 min. A pasta fluida pegajosa formada, uma solução (aproximadamente 150 mL) de ácido 2-[2- [2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acético (48,8 mmol, 4,0 eq) foram adicionadas a 20 a 25°C dentro de 10 min, de modo que a temperatura aumentou ligeiramente até 40°C. A 45 a 50°C, foi adicionada uma solução de 28,8 mL de anidrido de ácido n-propilfosfônico (T3P, trímero 50% em acetato de etila, 48,8 mmol, 4,0 eq) dentro de 10 min. A solução de reação foi agitada por 1 h a 45-50°C. A solução amarela clara foi resfriada a 20 a 25°C e evaporada a 40°C/10 mbar/6h para obter 73,6 g de hexanoato de benzil (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi- 6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)- 2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino] bruto (pureza de HPLC: 32% de área).

[0134]68,0 g (11,0 mmol) do produto bruto foi dissolvido em 340 mL de metanol, 20,0 mL (220 mmol, 20 eq) de NaOH 10,8 M foram adicionados à solução amarela clara, a temperatura aumentou até 32°C, a reação de mistura foi agitada por 2,5h à rt, de modo que a suspensão foi formada (pH 12,0). The suspensão foi filtrada e a torta de filtro foi lavada com 100,0 mL de metanol, o filtrado foi evaporado a 40°C/250 a 10mbar/2h para obter 41,5 g de hexanoato de sódio (2S)-6-[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran- 2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran- 2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino], que foi então purificado por cromatografia de fase reversa preparativa, para condições consulte o experimento 9. EXEMPLO 9 SÓDIO; HEXANOATO DE (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO- 4,5-DIIDRÓXI-6-(HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL|OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL|AMINO]-2-[[(2S)-2,6-BIS[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIIDRÓXI-6- (HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL|OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL|AMINO]HEXANOIL|AMINO]

[0135]378,0 g (197,0 mmol, bruto) hexanoato de benzil (2S)-6- [[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)- 2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetóxi-6- (acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil] amino]hexanoil]amino] foi dissolvido em 1,9 L de metanol. Dentro de 10 min, foram adicionados 200,0 mL de solução de hidróxido de sódio 10,8 M (2,16 mol, 11,0 eq) a 20 a 25°C. Assim a temperatura aumentou para 31°C. A solução amarela clara foi agitada por 2h a 20 a 25°C (pH 13,4), em seguida, 80,0 mL de solução de cloreto de amônio 5 M foram adicionados (pH 10,7). A solução amarela clara foi então evaporada a 20 a 25°C/100 a 20mbar/5h e seca a 20 a 0,5 mbar/1h para obter 543 g de hexanoato de sódio (2S)-6- [[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6- (hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)- 2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6- (hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino] bruto (pureza de HPLC: 40,1%), que foi então purificada por cromatografia de fase reversa preparativa.

[0136]Coluna: Triart C18-120 26 x 15 cm; 10 um.

[0137] Fase móvel: A: NaHCO3 2 mM / B: Acetonitrila.

[0138]Gradiente.

[0139]Termoestabilização: temperatura ambiente.

[0140] Detecção: 220 nm.

[0141]Solução: 543 g dissolvido em 4500 mL de NaHCO3 2mM e filtrado (GF5)( = 5000 mL (109 mg/mL).

[0142]Solução de amostra / Injeção: Por corrida 200 mL de amostra = 21,8 g (25 corridas).

[0143] Concentração: As frações combinadas (46 L) foram diluídas com 110 L de água, estas soluções foram bombeadas em 3 porções para uma coluna RP C18 e lavadas com água/MeOH 98/2, em seguida, com MeOH eluído e concentrado em um evaporador rotatório para obter 1,18 kg de solução metanólica. Um quarto dos 1,18 kg de solução metanólica da etapa de purificação por HPLC preparativa, isto é, 295 g foram evaporados a 40°C/20 mbar/1h e, em seguida, a 20-25°C/0,35 mbar/14h até secar para obter 43,5 g sódio; hexanoato de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3- acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran- 2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil] amino] como pó branco amorfo, 99,88% de pureza de HPLC. Os três quartos restantes da solução acima (885 g) foram usados na próxima etapa.MS: m/z = 1452,684 (M-H)-. EXEMPLO 10 ÁCIDO (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIIDRÓXI-6- (HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2-IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL]AMINO]- 2-[[(2S)-2,6-BIS[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIIDRÓXI- 6-(HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL|OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL|AMINO]HEXANOIL|AMINO]HEXANOICO

[0144]A solução de metanol (885 g) do Exemplo 9 foi tratada a 20 a 25°C com 47,9 g de Dowex (50 x 8 trocador catiônico; H3O+ conc. 2,57 mmol/g) agitada por 1h (pH 3,1), filtrada e lavada com 200 mL de metanol. O filtrado foi evaporado a 20 a 25°C/15 a 50 mbar e seco a 20 a 25°C/0,01 mbar/2h para obter 128,0 g de ácido (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)- 3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran- 2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil]amino]hexanoico como um pó amorfo branco, 99,77% de pureza de HPLC. MS: m/z = 1452,684 (M-H)-. EXEMPLO 11 CÁLCIO; HEXANOATO DE (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO- 4,5-DIIDRÓXI-6-(HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL]AMINO]-2-[[(2S)-2,6-BIS[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5-DIIDRÓXI-6- (HIDROXIMETIL)TETRAHIDROPIRAN-2- IL]OXIETÓXI]ETÓXI]ETÓXI]ACETIL]AMINO]HEXANOIL]AMINO]

[0145] 0,10 g (0,068 mmol), ácido (2S)-6-[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3- acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil] amino]hexanoil] amino]hexanoico, foi dissolvido em 3,0 mL de metanol e 0,30 mL de água, 2,60 mg (0,034 mmol, 0,5 eq) de hidróxido de cálcio foram adicionados e a mistura foi agitada por 1h à temperatura ambiente. A solução clara turva foi evaporada a 40°C/200 a 10mbar/1h para obter 0,11 g como sólido branco. 99,60% de pureza de HPLC. MS: m/z = 1452,684 (M-H)-.

CONJUGAÇÃO A OLIGONUCLEOTÍDEO EXEMPLO 11 (DE ACORDO COM O EXEMPLO 15 DA PUBLICAÇÃO DE PEDIDO DE PATENTE US 2011/0207799)

[0146] (20 mg, 0,014 mmol) ácido (2S)-6-[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2- [(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diidróxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2- il]oxietóxi]etóxi]etóxi]acetil]amino]hexanoil] amino]hexanoico (GalNAc ácido) foi coevaporado com piridina e diclorometano. O resíduo foi dissolvido em DMF seco (0,9 mL) e a solução de N-Hidroxisuccinimida (HOSu) em DMF (1,6 mg, 0,014 mmol) foi adicionada enquanto agitando sob uma atmosfera de argônio. A 0°C a solução de N,N’-Diciclohexilcarbodiimida (DCC) em DMF (3,2 mg, 0,016 mmol) foi lentamente adicionada. Deixou-se aquecer a reação à temperatura ambiente e agitou-se durante a noite. O éster de N-hidroxisuccinimida GalNAc formado foi usado sem purificação adicional para conjugação a RNA.

[0147] O RNA usado foi um RNA amino-modificado que tem a sequência: 5’-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3’ (SEQ ID 1) em que u e c são os respectivos nucleotídeos 2’-O-metila das bases correspondentes e s significa fosforotioato.

[0148] O RNA (2,54 μmol) equipado com um ligante amino C-6 na extremidade 5’ foi liofilizado e dissolvido em 250 μL de tampão de borato de sódio (0,1 mol/L de borato de sódio, pH 8,5, 0,1 mol/L KCl) e 1,1 mL de DMSO. Após a adição de 8 μL de N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA), a solução do éster N-hidroxisuccinimida GalNAc (teoricamente 0,014 mmol) em DMF foi lentamente adicionada sob contínua agitação para a solução de RNA. A mistura de reação foi agitada a 35°C durante a noite. A mistura de reação foi monitorada com o uso de RP-HPLC (Resource RPC de 3 mL, tampão: A: Acetato de trietilamônio 100 mM (TEAA, 2,0 M, pH 7,0) em água, B: TEAA 100 mM em acetonitrila 95%, gradiente: B 5% a B 22% em 20 CV). Após precipitação de RNA com o uso de acetato de sódio (3 M) em EtOH a -20°C, o RNA conjugado foi purificado usando- se as condições descritas acima. As frações puras foram agrupadas e o conjugado desejado foi precipitado com o uso de acetato de sódio/EtOH para dar o conjugado de RNA puro. O conjugado foi isolado em 59% de rendimento (1,50 μmol). A pureza do conjugado foi analisada por HPLC de troca aniônica (pureza: 85,5%) e a identidade foi confirmada por ESI-MS ([M+H]1+ calculada: 8374.4; [M+H]1+ medida: 8376,0.

Claims (30)

1. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE ÁCIDO GalNAc de fórmula I em que n é um número inteiro entre 0 e 10, e seus sais, em que o processo é caracterizado por compreender: a) acoplamento de um sal de triamina de fórmula II em que R1 é um grupo protetor de éster e X é um ânion de um ácido com um ácido tetrahidropirano de fórmula III em que R2 é um grupo protetor de hidróxi e n é como acima, na presença de um agente acoplador de peptídeo, uma base amina e um solvent orgânico para formar o éster de GalNAc de fórmula IV em que R1 e R2 e n são como acima; b) remoção do grupo protetor de éster R1 e dos grupos protetores de hidróxi R2 na presença de uma base mineral para formar o sal de ácido GalNAc de fórmula V em que n é como acima e M é um cátion metálico; e c) opcionalmente transformar o sal de ácido GalNAc de fórmula V no derivado de ácido GalNAc de fórmula I.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por n ser um número inteiro entre 0 e 5 e o grupo protetor de éster R1 ser alquila C1-7 ou fenil-C1-7-alquila, em que o grupo fenila é opcionalmente substituído com halogênio ou alquila C1-7, o grupo protetor de hidróxi R2 é acetila e X é selecionado a partir do ânion de um ácido sulfônico.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo agente acoplador de peptídeo ser anidrido de ácido n-propilfosfônico e a base amina ser uma amina terciária.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo acoplamento na etapa a) ocorrer em um solvente orgânico, que é um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 20°C a 70°C.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela base mineral para a remoção do grupo protetor de éster R1 na etapa b) ser um hidróxido alcalino.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas etapas a) e b) serem combinadas e realizadas em uma etapa sem isolamento do éster de GalNAc de fórmula V.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela transformação opcional do sal de ácido GalNAc de fórmula V no derivado de ácido GalNAc de fórmula I ser realizada por meio da troca de cátions ou por meio de tratamento com um ácido.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo derivado de ácido GalNAc de fórmula I ser um enantiômero de fórmula Ia em que n é como acima, ou um sal do mesmo.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo processo para produzir a triamina de fórmula II compreender as etapas: a1) transformar o ácido carboxílico de fórmula X em que R3’ e R4 são diferentes e independentes entre si e são grupos protetores de amino, em um éster de fórmula XI em que R1 é um grupo protetor de éster, e R3’ e R4 são como acima; b1) remover o grupo protetor de amino R4 e subsequentemente formar um sal de amina de fórmula XII em que R1 e R3’ são como acima e X- é um ânion de ácido; c1) acoplar o sal de amina de fórmula XII com um derivado de ácido hexanoico de fórmula XIII em que R3’’ e R3’’’ são grupos protetores de amino para formar a triamina protegida de fórmula XIV em que R3’, R3’’, R3’’’ e R1 são como acima; d1) converter a triamina protegida de fórmula XIV com um ácido no sal de triamina de fórmula II.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado porR3’, R3’’ e R3’’’serem os mesmos e serem grupos protetores que são cliváveis sob condições ácidas, e R4 ser um grupo protetor que é clivável sob condições básicas ou por meio de hidrogenólise.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por R3’, R3’’ e R3’’’serem Boc e R4 ser FMOC.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pela transformação na etapa a1) ocorrer com álcool benzílico na presença de um agente ativador, um catalisador de amina e um solvente orgânico aprótico em uma temperatura de reação de 20°C a 50°C.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo grupo protetor de amino R4 ser FMOC e sua remoção na etapa b1) ser realizada com uma amina alifática secundária em um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 20°C a 50°C.

14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pela formação subsequente do sal de amina de fórmula XII na etapa b1) ser efetuada com um ácido sulfônico.

15. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo acoplamento na etapa c1) ser realizado com anidrido de ácido n-propilfosfônico como agente de acoplamento na presença de uma amina terciária e um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 20°C a 50°C.

16. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por, na etapa d1), o sal de triamina de fórmula II ser formado com um ácido sulfônico em um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 20°C a 80°C.

17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo um solvente aprótico polar ser selecionado, o qual previne que o sal de triamina de fórmula II cristalize.

18. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo processo para produzir o ácido tetrahidropirano de fórmula III compreender a2) a transformação do diol de fórmula XX em que n é como acima, no éster de álcool de fórmula XXI em que n é como acima e R5 é um grupo protetor de éster; b2) o acoplamento do éster de álcool de fórmula XXI com um derivado de tetrahidropirano de fórmula XXII em que R2 e R6 independentes entre si são grupos protetores de hidróxi para formar um éster de tetrahidropirano de fórmula XXIII em que n, R2 e R5 são como acima; c2) a remoção do grupo éster para formar o ácido tetrahidropirano de fórmula III.

19. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo grupo protetor de hidróxi R2 ser acetila, o grupo protetor de éster R5 ser benzila e o grupo protetor de hidróxi R6 ser acetila.

20. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado por, na primeira etapa da etapa a2), o diol de fórmula XX ser desprotonado com um alcoolato de metal alcalino na presença de um solvente prótico polar ou aprótico polar em uma temperatura de reação de 50°C a 120°C.

21. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado por, na segunda etapa da etapa a2), uma porção de ácido acético ser introduzida com um ácido acético de halogênio ou com um sal do mesmo na presença de um solvente prótico polar ou aprótico polar em uma temperatura de reação de 50°C a 120°C.

22. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado por, na terceira etapa da etapa a2), o éster de álcool de fórmula XXI em que R5 é benzila ser formado com halogeneto de benzila ou um éster de sulfonil benzila em um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 20°C a 120°C.

23. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado por, na etapa b2), o éster de álcool de fórmula XXI ser acoplado com o derivado de tetrahidropirano de fórmula XXII na presença de um ácido sulfônico halogenado na presença de um solvente aprótico polar em uma temperatura de reação de 0°C a 140°C.

24. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado por, na etapa c2), o grupo benziléster ser removido por uma hidrogenação catalítica com hidrogênio na presença de um catalisador de hidrogenação.

25. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela formação do éster de álcool de fórmula XXI compreender: a3) a diazotização de um acetato 2-amino de fórmula XXV em que R5 é como acima e X é um átomo de halogênio com um sal de nitrito para formar o composto 2-diazo de fórmula XXVI em que R5 é como acima; e b3) a transformação do composto 2-diazo de fórmula XXVI com o diol de fórmula XX.

26. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela diazotização na etapa a3) ser realizada com um nitrito alcalino na presença de uma mistura de solvente de água e um solvente aprótico não polar em uma temperatura de reação de -10°C a 10°C.

27. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pela transformação do composto 2-diazo com o diol de fórmula XX na etapa b3) ser realizada na presença de um ácido de Lewis e um solvente aprótico não polar em uma temperatura de reação de - 10°C a 10°C.

28. SAL DE AMINA, caracterizado por ser de fórmula XII, em que R1 é benzila, R3’ é Boc e X é o ânion de ácido metanosulfônico.

29. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS GalNAc, caracterizado por compreender as etapas: a3) preparar o derivado de ácido GalNAc de fórmula I ou o sal de ácido GalNAc de fórmula V, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, e b3) conjugar o derivado de ácido GalNAc de fórmula I ou o sal de ácido GalNAc da fórmula V sob condições de acoplamento peptídico com um oligonucleotídeo.

30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo sal de ácido GalNAc de fórmula V ser usado.